CN101380468A - 猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗及其制备方法，属于生物疫苗制备技术领域。该疫苗可通过在PRRSV GP5和M蛋白之间插入一具有自我裂解的FMDV 2A基因相连接，构建成GP5－2A－M融合蛋白基因，并与腺病毒骨架载体pAdEasy－1同源重组，经酶切后，转染HEK－293A细胞，得重组腺病毒rAd－GP5－2A－M，经纯化、扩增等工艺、步骤制备成二价重组腺病毒疫苗而获得。本发明构建的聚合蛋白GP5－2A－M在表达后即自我裂解为GP5和M蛋白，发挥出GP5的病毒中和与M蛋白的免疫功能；其疫苗效价稳定，毒价在10^10.43TCID₅₀/1.0ml，兼有常规弱毒疫苗的复制特性和灭活疫苗的安全性；可在猪繁殖与呼吸综合征的防治工作中推广应用。

Description

猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物疫苗技术领域，尤其属于对猪繁殖与呼吸综合征进行免疫保护的二价重组腺病毒疫苗及其制备方法。

技术背景

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的，以妊娠母猪流产、死胎、弱仔等繁殖障碍及仔猪的呼吸道征状和高死亡率为特征的传染病。

自1987年在北美首次报道以来，至今几乎扩散到全球所有养猪业发达的国家和地区，给养猪业及其产品贸易造成了巨大的经济损失，已成为养猪业的主要病毒性疾病之一。我国于1995年底爆发该病，随后迅速蔓延到全国大部分省份。近年来PRRS疫情又有加重趋势，且混合感染和持续性感染状况严重。目前用于预防PRRS的疫苗主要是传统疫苗—弱毒苗和灭活疫苗。尽管弱毒苗能提供较好的免疫保护，但存在毒力返强和散毒的危险；而灭活苗诱导产生的抗体水平很低，且极不稳定。因此，研制更安全、更有效的疫苗来预防和控制该病的发生与流行已迫在眉睫。

PRRSV是一种单股正链的RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arterividae)动脉炎病毒属(Artervirus)，同属的还有马动脉炎病毒(EAV)、小鼠乳酸脱氢酶增高征病毒(LDV)和猴出血热病毒(SHFV)。其基因组大小约15kb，具有9个开放阅读框架(0RFs)，且彼此相互嵌套。ORF1(包括ORF1a和ORF1b)编码病毒的复制酶，其大小约占全基因组的3/4；ORFs2～4分别编码病毒的GP2a、GP2b、GP3和GP44种次要结构蛋白，ORFs 5～7编码3种主要结构蛋白GP5、M和N。GP5为囊膜糖蛋白，是一种多功能蛋白，参与细胞免疫与体液免疫，尤其是中和抗体的产生，是基因工程疫苗设计的主要靶抗原；M蛋白是非糖基化膜蛋白，具有较强的免疫原性，可诱导产生一定的中和抗体和特异性细胞免疫应答，在介导病毒的吸附和诱导细胞免疫中具有重要作用；而GP5与M蛋白可通过二硫键形成GP5/M异源二聚体，对病毒装配起重要作用，并介导病毒吸附宿主细胞过程。

目前，大多数研究者为了发挥GP5的病毒中和优势作用和M蛋白的细胞免疫作用及两者所形成的二聚体对病毒进入靶组织和细胞的作用，通过不同的表达系统共表达和融合表达此二者，即在同一表达系统中使用双启动子(Yunbo Jianget al.，2006，Vaccine，24，2869-2879；Qisheng Zheng et al.，2007，Virus Genes，35，585-595)；或在GP5和M蛋白基因之间引入内部核糖体进入位点(IRES)(李俊等，2006，动物医学进展，27(10):78-81)；或通过一柔性多肽Linker序列(Wenming Jiang et al.，2006，Veterinary Immunology and Immunopathology，113，169-180)将GP5和M蛋白基因连接一起的表达策略。但这些策略存在一些缺陷，比如被表达的基因起始效率低、上游基因与下游基因的表达严重不平衡、启动子之间相互干扰、被表达蛋白性质与其天然蛋白的性质不尽相同等问题。

发明内容

本发明目的是，针对以往为利用GP5和M蛋白基因功能，所采用的双启动子、或引入内部核糖体、或通过一柔性多肽序列等将两者相连接表达策略所存在的被表达基因起始效率低、上游基因与下游基因表达严重不平衡、启动子之间相互干扰、或被表达蛋白性质与其天然蛋白性质不尽相同等缺陷，研制一种能克服上述缺陷的，并使受体猪能产生针对PRRSV特异性的中和抗体和较强的细胞免疫力，以达到有效控制、治疗猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的新型二价重组腺病毒基因工程疫苗；本发明的另一目的是提出该疫苗的制备方法。

本发明目的通过以下技术方案得以实现：

猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗，该疫苗可通过在PRRSV GP5和M蛋白之间插入一具有自我裂解的FMDV2A基因相连接，构建成GP5-2A-M融合蛋白基因，并与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组，将重组病毒DNA经酶切，转染HEK-293A细胞后，得重组腺病毒rAd-GP5-2A-M，经腺病毒纯化、扩增等工艺、步骤，制备成二价重组腺病毒疫苗而获得。

猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗的制备方法，该方法按以下步骤进行：

(1)GP5-2A-M融合基因的构建：根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332和FMDV China/99 O型毒株的基因序列，各设计一对针对PRRSV国内分离株NB/04毒株GP5、M和2A基因的特异性融合引物，引物序列如下：

AdGP5：5’-CGC GGT ACC CCA CCA TGG TGG GGA AAT GCT TG-3’

AdGP5-2A:5’-AAC GTC TCC TGC TAA CTT CAA AAG ATC AAA GTT CGT GAG

ACG ACC CCA-3’

AdM-2A:5’-TTA GCA GGA GAC GTT GAG TCC AAC CCC GGA CCC ATG GGG TCG

TCT CTA-3’

AdM:5’-TAT GCG GCC GCT TAT TTG GCA TAT TTA AC-3’

以Marc-145细胞增殖NB/04毒株，提取其RNA，以AdM引物作RT；然后以cDNA产物为模板，应用PCR技术扩增出NB/04毒株含FMDV 2A基因的GP5和M全基因，再通过融合PCR技术，以AdGP5和AdM引物将GP5、2A和M蛋白基因融合为GP5-2A-M融合基因；

(2)穿梭载体pShuttle-CMV-GP5-2A-M的构建：在步骤(1)融合基因GP5-2A-M的GP5的上游和M的下游引物的5′端引入相应的限制性内切酶KpnI和NotI，通过这两个酶切位点，把GP5-2A-M融合基因克隆入穿梭载体pShuttle-CMV中，通过酶切和PCR鉴定，获得含有GP5-2A-M融合基因的穿梭载体pShuttle-CMV-GP5-2A-M；

(3)穿梭载体pShutt le-CMV-GP5-2A-M与腺病毒骨架载体pAdEasy-1的同源重组与纯化：将步骤(2)鉴定含有GP5-2A-M融合基因的穿梭载体pShuttle-CMV-GP5-2A-M用酶切、去磷酸化后，电转化至已转入腺病毒骨架载体pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌细胞，进行菌内同源重组；用卡那霉素筛选获得重组病毒DNA，PacI酶切鉴定，将其中正确的重组病毒DNA再转化XL10—Gold超级感受态细胞，以纯化重组腺病毒DNA；

(4)重组腺病毒rAd-GP5-2A-M的获得与鉴定：鉴定好的重组腺病毒DNA经过PacI酶切线性化后，转染HEK-293A细胞内，重组腺病毒DNA在胞内包装成完整的重组腺病毒rAd-GP5-2A-M；通过噬斑纯化后，采用RT-PCR、IFA和Western blot方法检测GP5-2A-M聚合蛋白的基因转录、表达及蛋白裂解；

(5)重组腺病毒的扩繁与检测：将步骤(4)鉴定、纯化后的重组腺病毒rAd-GP5-2A-M在HEK-293A细胞内连续传代30次，其中，每5代检查一次重组腺病毒对GP5-2A-M融合蛋白基因的转录、表达与裂解情况，同时测定其TCID₅₀，从中筛选出表达稳定，接毒后细胞病变(CPE)稳定，种毒毒价稳定在10^10.43TCID₅₀/1.0ml的重组腺病毒，-80℃保存；

(6)二价重组腺病毒疫苗的制备：取步骤(5)重组腺病毒，按10¹⁰TCID₅₀接种于HEK-293A细胞上，进行扩大病毒培养；当细胞病变达70-90％时收毒，经冻融3次即可获得PRRSV重组腺病毒rAd-GP5-2A-M疫苗，经质检、分装、包装后即成。

本发明有益效果:

1、本发明在表达的GP5和M蛋白之间插入一具有自我裂解功能的FMDV2A基因，构建成一个表达框内可同时表达PRRSV GP5和M蛋白的多顺反子重组腺病毒，并使聚合蛋白GP5-2A-M在表达后裂解为GP5和M蛋白，即时发挥出GP5的病毒中和优势作用和M蛋白的细胞免疫功能；该技术突破了以往多基因表达一般多通过效率低、工作量大的多个携带单基因独立载体表达系统；或通过基因起始效率低，上游基因与下游基因表达严重不平衡的在基因之间引入内部核糖体进入位点，或多启动子及表达融合基因等方法。

2、本发明采用人腺病毒血清5型载体为表达载体，可对目的蛋白进行有效的表达，对人、猪等动物没有致病性，感染动物后不出现临床征状。

3、本发明重组腺病毒疫苗其效价稳定，种毒毒价稳定在10^10.43TCID₅₀/1.0ml，兼有常规弱毒疫苗的复制特性和灭活疫苗的安全性，通过小鼠免疫试验和中和试验，证明该重组腺病毒产生了针对PRRSV的中和抗体和较强的细胞免疫，其中和抗体效价为1:128，改变了PRRSV感染猪后其中和抗体产生量少且慢的不足；这为当前难以防治的猪繁殖与呼吸综合征提供了一种优质、高效的二价重组腺病毒疫苗。

附图说明

图1 重组穿梭载体rShuttle-CMV-GP5-2A-M构建示意图

图2 重组腺病毒rAd-GP5-2A-M的构建与获得示意图

图3 PRRSV-NB/04 GP5和M蛋白基因的PCR产物电泳图

1：250bp DNA Marker；2：M蛋白基因PCR片段；

3：GP5蛋白基因PCR片段；

图4 GP5-2A-M基因的融合PCR产物电泳图

1：DL2000 DNA Marker；2：GP5-2A-M基因融合PCR片段；

图5 重组Shuttle-CMV-GP5-2A-M质粒KpnI/NotI酶切鉴定结果电泳图

1：DL15000 DNA Marker；2：重组质粒KpnI/NotI酶切产物；

图6 重组质粒DNA电泳图

1：DL15000 DNA Marker；2—5：4个不同重组质粒DNA克隆；

图7 重组质粒DNA的PacI酶切鉴定电泳图

1：DL15000 DNA Marker；2：重组质粒pAd-GP5-2A-M的PacI酶切；

图8 重组腺病毒表达GP5-2A-M聚合蛋白的mRNA的检测电泳图

1：250bp DNA Marker；2：感染重组腺病毒的HEK-293A细胞提取总

RNA的RT-PCR；

图9 重组腺病毒rAd-GP5-2A-M感染HEK-293A细胞的间接免疫荧光抗体染色结果图

A：感染重组腺病毒的HEK-293细胞，有明显的荧光；

B：未感染重组腺病毒的HEK-293细胞，没有荧光；

图10 各重组腺病毒DNA转染HEK-293A细胞的western blot分析化学发光图

1：接种rAd-GP5-2A-M的HEK-293A细胞裂解物；

2：接种rAd-GP5-M的HEK-293A细胞裂解物；

3：接种rAd-M的HEK-293A细胞裂解物；

4：接种rAd-GP5的HEK-293A细胞裂解物；

5：接种野腺病毒的HEK-293A细胞裂解物。

具体实施方式

通过以下实施例将对本发明作进一步的详细说明，但本发明并不受以下内容所限制。

对有关材料的说明：

PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332：GenBank登陆号为PRU87392；

FMDV China/99 O型毒株：GenBank登陆号为AF506822；

PRRSV国内分离株NB/04毒株：浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所动病组实验室分离、保存并提供。

实施例1：(猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗的制备方法)

该疫苗制备按以下步骤进行：

(1)GP5-2A-M融合蛋白基因的构建：

1.1 PCR引物设计合成：根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332和FMDVChina/99 O型毒株的基因序列，各设计一对针对PRRSV国内分离株NB/04毒株GP5、M和2A基因的特异性融合引物，引物序列如下：

AdGP5：5’-CGC GGT ACC CCA CCATGG TGG GGA AAT GCT TG-3’

AdGP5-2A:5’-AAC GTC TCC TGC TAA CTT CAA AAG ATC AAA GTT CGT GAG

ACG ACC CCA-3’

AdM-2A:5’-TTA GCA GGA GAC GTT GAG TCC AAC CCC GGA CCC ATG GGG TCG

TCT CTA-3’

AdM:5’-TAT GCG GCC GCT TAT TTG GCA TAT TTA AC-3’

1.2 NB/04毒株感染Marc-145细胞及总RNA的提取将PRRSV分离株NB/04接种Marc-145，到细胞病变达80％左右收取细胞，冻融3次；取1ml细胞液，用RNA提取试剂盒(Sangon公司)提取细胞总RNA；

1.3 以AdM引物作反转录取AdM引物1.5μl，细胞总RNA10.0μl，10mMdNTPs1.5μl，5x反转录酶缓冲液5.0μl，AMV1.0μl，用DEPC水补加至总体积25.0μl，充分混匀后，置37℃1.0h，其产物cDNA作为PCR反应的模板；

1.4 PCR扩增扩增PRRSV GP5-2A基因，取cDNA 2.0μl，AdGP5 1.0μl，AdGP5-2A 1.0μl，2.5mM dNTPs 4.0μl，含Mg⁺⁺10xExTaq缓冲液5.0μl，ExTaq聚合酶0.25μl，用无菌双蒸水补至总体积50.0μl；循环参数为：94℃ 5min；94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 45s，30个循环；72℃ 10min；扩增PRRSVM-2A基因，取cDNA 2.0μl，AdM-2A 1.0μl，AdM 1.0μl，2.5mM dNTPs 4.0μl，含Mg⁺⁺10 x ExTaq缓冲液5.0μl，ExTaq聚合酶0.25μl，用无菌双蒸水补至总体积50.0μl；循环参数为：94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 45s，30个循环；72℃ 10min。融合GP5-2A-M基因，AdGP5 1.0μl，AdM 1.0μl，2.5mMdNTPs 4.0μl，含Mg⁺⁺10 x ExTaq缓冲液5.0μl，ExTaq聚合酶0.25μl，用无菌双蒸水补至总体积50.0μl；循环参数为：94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 90s，30个循环；72℃ 10min。PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳；

1.5 融合PCR产物的克隆通过融合PCR技术，以AdGP5和AdM引物将GP5、2A和M基因融合为GP5-2A-M融合基因；

1.5.1 融合PCR产物回收与纯化融合PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切下含目的条带的琼脂凝胶，用DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa公司)回收凝胶中的目的片段，具体步骤见试剂盒说明书；

1.5.2 融合PCR产物酶切与纯化10xK Buffer 2.5μl，BSA 5.0μl，DNA25.0μl，KpnI 2.0μl，NotI 2.0μl，用双蒸灭菌水补至总体积50.0μl；37℃，2.0h，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，方法同上；

1.5.3 pShuttle-CMV酶切纯化10xK Buffer 2.5μl，BSA 5.0μl，DNA25.0μl，KpnI 2.0μl，NotI 2.0μl，用双蒸灭菌水补至总体积50.0μl；37℃，2.0h，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，方法同上；

(2)穿梭载体pShuttle-CMV-GP5-2A-M的构建：

2.1.1 目的片段与pShuttle-CMV的连接反应10xT4 Ligation Buffer2.5μl，酶切回收DNA 10.0μl，酶切回收pShuttle-CMV载体1.5μl，T4连接酶1.0μl，用灭菌双蒸水补足总体积25.0μl；混匀后16℃连接过夜，连接产物转化DH5 α，涂卡那霉素(50μg/ml)琼脂平板，37℃过夜培养；

2.1.2 大肠杆菌DH5 α感受态细菌的制备和转化DH5 α感受态细菌的制备与转化见分子克隆；

2.1.3 重组质粒的提取和鉴定质粒提取应用常规的碱裂解法，提取后的重组质粒采用PCR和双酶切鉴定，电泳后都可见目的条带；

2.2 目的片段序列分析合成一对pShuttle-CMV测序引物(宝生物工程(大连)有限公司合成)，引物序列为Adseql：5-GGT ATA TAT AAG CAG AGC TG-3；Adseq2：5-GTG GTA TGG CTG ATT ATG ATC AG-3，送宝生物工程(大连)有限公司进行双向测序；测序结果使用DNAstar软件进行拼接，然后与PRRSV NB/04毒株的GP5和M基因进行同源性比对，结果所克隆入的基因序列与NB/04毒株同源性100％，而且其读码框无误；

(3)穿梭载体pShuttle-CMV-GP5-2A-M与腺病毒载体pAdEasy-1的同源重组与纯化：

3.1 pShuttle-CMV-GP5-2A-M PmeI线性化与纯化用10xNE buffer4 5.0μl，100xBSA 0.5μl，pShuttle-CMV-GP5-2A-M 25.0μl，PmeI 2.0μl，用灭菌双蒸水补加至总体积50.0μl；37℃ 2.0h，用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，方法同上；

3.2 pShuttle-CMV-GP5-2A-M电转化含有pAdEasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞取出-80℃保存的BJ5183-AD-1感受态细胞1支，置冰上缓慢溶化，然后向其中加入0.1μg的线性化pShuttle-CMV-GP5-2A-M穿梭载体，混匀置冰上；取出一个冰冷的电转杯，将线性化pShuttle-CMV-GP5-2A-M穿梭载体与BJ5183-AD-1感受态细胞混合物迅速加入电转杯金属板中央，进行电转，电转参数为200Ω，2.5KV，25μE；迅速取出电转杯，立即加入1ml的无菌LB培养基，重悬细胞；随后将含有细胞的LB转移至离心管中，放入摇床上，37℃1h，转数225-250rpm；转化的细胞分为50μl，100μl和850μl涂LB卡那霉素抗性琼脂平板，37℃过夜培养；

3.3 重组细菌的挑选和质粒提取经过夜培养，挑取平板上的10个最小菌落接种于3.0ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃225-250rpm过夜培养；使用小剂量碱裂解法提取10个菌液的质粒，用30μl的双蒸灭菌水重悬质粒；

3.4 重组DNA的鉴定

3.4.1 重组质粒的PCR AdGP 5 1.0μl，AdM 1.0μl，2.5mM dNTPs 4.0μl，含Mg⁺⁺10x ExTaq缓冲液5.0μl，ExTaq聚合酶0.25μl，用无菌双蒸水补至总体积50.0μl，循环参数同上，PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳；

3.4.2 重组质粒的酶切10xNE Buffer1 2.0μl，100xBSA 0.2μl，PacI0.2μl，重组DNA 10.0μl，用双蒸灭菌水补至总体积20.0μl，37℃3h，然后进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，鉴定；

3.5 重组质粒的扩增和纯化将鉴定好的重组质粒pAdEasy-1-GP5-2A-M转化XL10—Gold感受态细胞，取100μl的XL10—Gold感受态细胞置于冰上；加入4μl的β-ME混匀，冰浴10min；加入0.1-50ng的重组质粒混匀，冰浴30min；42℃热击30s，冰浴2min；加入预热的NZY⁺培养基0.9ml，置摇床上，37℃1h，转数225-250rpm；转化的细胞分为5μl，25μl和100μl涂LB卡那霉素抗性琼脂平板，37℃过夜培养；挑取一菌落接种于10.0ml的卡那霉素LB培养基中，37℃振荡过夜培养；取1.0ml过夜细菌培养液接种于100ml卡那霉素LB培养基中，37℃振荡过夜培养，使用

 PureFection Maxi Plasimid DNA PurificationSystem提取重组质粒，方法参照试剂盒说明书；

(4)重组腺病毒rAd-GP5-2A-M的获得与鉴定：

4.1 重组pAdEasy-1-GP5-2A-M质粒的线性化10xNE Bufferl 10.0μl，100xBSA 1.0μl，PacI 2.0μl，重组DNA 5.0μg，用双蒸灭菌水补至总体积100μl，37℃ 3h；取0.2μg的重组DNA进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，酶切后使用宝生物工程(大连)有限公司的核酸共沉剂将DNA沉淀，然后在无菌条件下用50μl的双蒸灭菌水重悬DNA，置于-20℃待转染用；

4.2 HEK293-A细胞的复苏、培养与冻存从液氮灌中取一支冻存的HEK293-A细胞，置于37℃的水浴锅中轻轻振荡至40-60s；将细胞转入一个无菌的含有10mlDMEM培养基的离心管中，室温1500rpm，离心5min，弃去上清；加入5ml含10％FBS的新鲜DMEM培养基，重悬细胞；然后将细胞移入50ml的培养瓶中，置37℃ 5％二氧化碳培养箱中培养，至细胞形成单层；用胰酶-EDTA在室温下消化细胞1-3min，轻敲细胞瓶壁使细胞脱落；用培养液按需要进行分瓶传代；为了保存细胞亚型的特殊表型，建立细胞贮存库的细胞融合率需小于50％，把生长良好处于对数期的细胞完全消化下来，离心，沉淀细胞，弃上清；用少量含10％FBS的DMEM重悬细胞，并进行细胞计数；用50％DMEM+10％DMSO+40％FBS冻存培养基使细胞密度达到1 x 10⁶个/ml；用2.0ml的冻存管分装1.0ml的细胞，把冻存管放入冻存盒中置于超低温冰箱中过夜，然后把冻存管移入液氮罐中保存；

4.3 重组pAdEasy-1-GP5-2A-M线性化质粒转染HEK293-A细胞转染在3mm的培养皿中进行，在转染前一天向培养皿中接种3-4 x 10⁵个HEK293-A细胞；取2支无菌的1.5ml的离心管，每管中加入250μl的不含双抗和血清的DMEM；将5μg的线性重组DNA加入一离心管中，混匀；取10μlLipofectamine^TM2000(Invitrogen)加入另一离心管中，混匀，室温孵育5min；然后将两管DMEM合为一管，混匀，室温孵育20min；在此期间吸取细胞培养皿中的培养基，用PBS洗细胞2次；将含有转染混合物的DMEM 500μl移入细胞培养皿中，置二氧化碳培养箱中培养6h，弃培养液上清，加入2ml含双抗和10％血清的DMEM，置二氧化碳培养箱中培养7-10d，每天观察细胞病变；

4.4 重组病毒的噬斑纯化在6孔细胞板的每一个孔接种5 x 10⁵个细胞，37℃过夜培养；将重组病毒原液10倍稀释，稀释所取范围10^-5-10^-9，体积1ml，把各病毒稀释液加入6孔培养板各孔中，并设一空白对照(不加病毒)，37℃ 2h；弃各孔培养液，每孔加入3ml 1.25％低融点胶/DMEM混合液，37℃培养12-21d，观察噬斑；用灭菌枪头挑取白色噬斑的琼脂糖块，放入无菌离心管中，加入200μl的灭菌PBS，将琼脂糖块捣碎后反复冻融3次；12000rpm离心10min；收获的病毒接种一新的6孔板中；

4.5 IFA检测重组腺病毒rAd-GP5-2A-M的表达重组腺病毒接种HEK-293A细胞后24h，弃去培养液，用PBS洗涤细胞；加入冷丙酮，4℃固定30min；弃去丙酮，PBS洗涤3次；将鼠抗PRRSV GP5、M蛋白单克隆抗体(哈尔滨兽医研究所赠送)分别作1∶50稀释，每孔加入50μl，在湿盒内37℃温育30min；移去稀释血清，用PBS洗涤3次；每孔加入50μl的1∶100稀释的FITC标记羊抗鼠IgG，在湿盒内37℃温育30min，用PBS洗涤3次；吹干后滴加加碱性甘油，于荧光显微镜下观察；

4.6 Western blot检测聚合蛋白GP5-2A-M的表达与裂解将感染重组腺病毒的细胞裂解液通过12％SDS-PAGE电泳分离蛋白，采用半干转移(Bio-Rad)转印硝酸纤维膜，并设细胞裂解液做为空白对照；用含5％脱脂乳的PBST封闭过夜，以混合的GP5和M蛋白的单克隆抗体为一抗，1:1000稀释，室温孵育1h；辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG为二抗，1:100000稀释，室温孵育1h；用增强型化学发光底物( West Pico Kit，PIERCE)作用后转印X光片；

(5)重组腺病毒的扩繁：

5.1 将步骤(4)鉴定、纯化后的重组腺病毒rAd-GP5-2A-M在HEK-293A细胞内连续传代30次，其中，每5代检查一次重组腺病毒对GP5-2A-M融合蛋白基因的转录、表达与裂解质量；

5.2 重组腺病毒rAd-GP5-2A-M的病毒滴度测定按常规方法，将病毒裂解液作10倍比稀释，接种96孔HEK293-A细胞板中，每个稀释度接种8个孔，37℃培养5d，计数每个稀释度的CPE数，按Reed-Muench法计算病毒滴度，效价值为10^10.43TCID₅₀/1.0ml；

5.3 小鼠免疫试验取6周龄雌性小鼠54只，分为6组，每组9只，每组分别皮下免疫rAd-GP5-2A-GP6、rAd-GP5-M、rAd-GP5、rAd-M、wtAd和PBS，剂量为0.5mL/只，共免疫3次，每次间隔2周，第三组为PBS对照组；加强免疫后分别于2周、4周和6周采血测定中和抗体；

5.4 中和抗体检测将待检血清56℃灭活30min，2倍倍比稀释后(1:2～1:256)加入96孔细胞培养板中，每孔50μl；然后加入等体积的病毒液PRRSVNB/04(200TCID₅₀/100μl)混合，与37℃孵育1h；然后接种已长满单层Marc-145细胞的96孔培养板中，每个稀释度4孔，同时设细胞对照和病毒对照孔，37℃5％CO₂培养4～5d，逐日观察CPE情况，当病毒对照孔均出现CPE，以抑制50％CPE的最高血清稀释度作为中和抗体滴度；

5.5 T细胞增殖反应检测无菌取首免后第4周免疫小鼠脾脏，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，用含10％FCS的RPMI-1640完全培养基悬浮细胞，使细胞浓度为5×106个细胞/ml，分离出的鼠脾淋巴细胞接种至96孔细胞培养板中，100μl/孔；以纯化灭活的PRRSV NB/04作为刺激抗原100μl/孔，各3复孔；以加未感染PRRSV NB/04的Marc-145细胞裂解液对照阴性孔，而以加PHA作为阳性对照孔，置37℃ 5％CO2培养箱中培养，72h后，于每孔加入MTT(Sigma)，充分混匀，继续培养4h后终止培养，于1h内测定OD值(570nm)，计算刺激指数(SI)，SI＝A/B(A：刺激孔值；B：非刺激孔值)；

上述结果表明，GP5-2A-M融合蛋白在重组腺病毒rAd-GP5-2A-M连续传代过程中表达及自我裂解稳定，接毒后细胞病变规律，毒价稳定在10^10.43TCID₅₀/1.0mi；中和抗体滴度为1:128；

(6)二价重组腺病毒疫苗的制备：

6.1 用猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒制备疫苗将纯化的重组腺病毒rAd-GP5-2A-M，按10¹⁰TCID₅₀量接种于HEK-293A细胞上，连续传代30次，检测并取用表达稳定，毒价稳定在10^10.43TCID₅₀/1.0ml者；当细胞CPE达80-90％时收毒，经反复冻溶3次，离心取上清即获得PRRSV二价重组腺病毒疫苗；

6.2 经质检、分装、包装后即成PRRSV二价重组腺病毒疫苗。

Claims (2)

1、猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗，其特征在于：该疫苗可通过在PRRSV GP5和M蛋白之间插入一具有自我裂解的FMDV2A基因相连接，构建成GP5-2A-M融合蛋白基因，并与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组，将重组病毒DNA经酶切，转染HEK-293A细胞后，得重组腺病毒rAd-GP5-2A-M，经腺病毒纯化、扩增等工艺、步骤，制备成二价重组腺病毒疫苗而获得。

2、制备权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

(1)GP5-2A-M融合基因的构建：根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332和FMDV China/99 O型毒株的基因序列，各设计一对针对PRRSV国内分离株NB/04毒株GP5、M和2A基因的特异性融合引物，引物序列如下：

AdGP5：5’-CGC GGTACC CCA CCA TGG TGG GGA AAT GCT TG-3’

AdGP5-2A:5’-AAC GTC TCC TGC TAA CTT CAA AAG ATC AAA GTT CGT GAGACG ACC CCA-3’

AdM-2A:5’-TTA GCA GGA GAC GTT GAG TCC AAC CCC GGA CCC ATG GGG TCGTCT CTA-3’

AdM:5’-TATGCGGCC GCT TAT TTG GCA TAT TTA AC-3’

以Marc-145细胞增殖NB/04毒株，提取其RNA，以AdM引物作RT；然后以cDNA产物为模板，应用PCR技术扩增出NB/04毒株含FMDV2A基因的GP5和M全基因，再通过融合PCR技术，以AdGP5和AdM引物将GP5、2A和M蛋白基因融合为GP5-2A-M融合基因；

(2)穿梭载体pShuttle-CMV-GP5-2A-M的构建：在步骤(1)融合基因GP5-2A-M的GP5的上游和M的下游引物的5′端引入相应的限制性内切酶KpnI和NotI酶切位点，通过这两个酶切位点，把GP5-2A-M融合基因克隆入穿梭载体pShuttle-CMV中，通过酶切和PCR鉴定，获得含有GP5-2A-M融合基因的穿梭载体pShuttle-CMV-GP5-2A-M；

(3)穿梭载体pShuttle-CMV-GP5-2A-M与腺病毒骨架载体pAdEasy-1的同源重组与纯化：将步骤(2)鉴定含有GP5-2A-M融合基因的穿梭载体pShuttle-CMV-GP5-2A-M用酶切、去磷酸化后，电转化至已转入腺病毒骨架载体pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌细胞，进行菌内同源重组；用卡那霉素筛选获得重组病毒DNA，PacI酶切鉴定，将其中正确的重组病毒DNA再转化XL10—Gold超级感受态细胞，以纯化重组腺病毒DNA；

(4)重组腺病毒rAd-GP5-2A-M的获得与鉴定：鉴定好的重组腺病毒DNA经过DpaI酶切线性化后，转染HEK-293A细胞内，重组腺病毒DNA在胞内包装成完整的重组腺病毒rAd-GP5-2A-M；通过噬斑纯化后，采用RT-PCR、IFA和Western blot方法检测GP5-2A-M聚合蛋白的基因转录、表达及蛋白裂解；

(5)重组腺病毒的扩繁与检测：将步骤(4)鉴定、纯化后的重组腺病毒rAd-GP5-2A-M在HEK-293A细胞内连续传代30次，其中，每5代检查一次重组腺病毒对GP5-2A-M融合蛋白基因的转录、表达与裂解质量，同时测定其TCID₅₀，从中筛选出表达稳定，接毒后细胞病变(CPE)稳定，种毒毒价稳定在10^10.43TCID₅₀/1.0ml的重组腺病毒，-80℃保存；

(6)二价重组腺病毒疫苗的制备：取步骤(5)重组腺病毒，按10¹⁰ TCID₅₀接种于HEK-293A细胞上，进行扩大病毒培养；当细胞病变达70-90％时，取用长成的单层HEK293-A细胞收毒，经冻融3次即可获得PRRSV重组腺病毒rAd-GP5-2A-M疫苗，经质检、分装、包装后即成。

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