CN101915846A - 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的elisa试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒及检测方法，该试剂盒包括包被PRRSV单克隆抗体的酶标板、PRRSV多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG、洗涤液、显色液、终止液、样品裂解液、阳性对照和阴性对照。本发明的试剂盒不仅利用单抗的高度特异性，而且利用多抗针对更多病毒抗原结合位点的特性，因此捕获抗原的能力强，检测敏感性为0.2μg/ml病毒蛋白或0.1ng/ml大肠杆菌表达的PRRSV N蛋白，与猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒无交叉反应，适合于对临床样品的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于动物病毒性疾病监测和诊断试剂研制领域，具体涉及一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒及使用方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)能引起猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，主要表现为妊娠母猪的早产、流产、死胎及仔猪的呼吸系统症状。1987年美国首先报道了该疾病的发生，随后加拿大、德国、荷兰等国家及地区也相继爆发了该病。PRRSV由荷兰学者Wensvoort于1991年首次分离并鉴定，命名为Lelystad病毒(LV)。1992年美国首次分离到一株PRRSV，并命名为VR2332。我国于1996年首次报道有该病的发生。该病自发现以来，在世界范围内流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。
关于PRRS的实验室诊断主要包括病毒抗体和抗原的检测，方法包括：病毒分离(VI)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫过氧化物酶单层实验(IPMA)、间接荧光抗体技术(IFA)、血清中和试验(SN)、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和核酸探针原位杂交技术(ISH)等。在所有检测技术中，ELISA是最适合临床快速诊断的方法，美国IDEXX公司已向市场推出检测PRRSV抗体的ELISA试剂盒。目前，国内外研制的多种ELISA方法主要检测PRRSV抗体，而检测PRRSV抗原的ELISA方法仅见杨汉春等的“猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心ELISA试剂盒”(专利申请号：200910093631.1)。杨汉春等采用针对N蛋白不同抗原决定簇的两种单抗为捕获抗体和检测抗体，本发明则提供了一种以多抗和单抗捕获抗原的ELISA方法。本发明与杨汉春等的方法不同之处在于：不仅利用了单抗的高度特异性，而且利用了多抗针对更多抗原位点的特性，所建立的ELISA方法捕获抗原的能力更强，与RT-PCR检测PRRSV的符合率更高，可应用于PRRS的监测和诊断。
发明内容
本发明的目的是提供一种以多抗和单抗捕获抗原的ELISA检测试剂盒，该试剂盒用于检测PRRSV抗原，敏感性高、特异性强，适合于对临床样品的快速检测。
ELISA检测试剂盒包括：包被PRRSVN蛋白单克隆抗体的酶标板、PRRSV多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG、洗涤液、显色液、终止液、样品裂解液、阳性对照、阴性对照。
上述所说的包被在酶标板上的PRRSVN蛋白单克隆抗体是由杂交瘤细胞株P2D3分泌获得。
本发明研制了针对PRRSV N蛋白的单抗P2D3(“猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的原核表达及其单克隆抗体的研制”，2008-12-16，中国知识资源总库-中国优秀硕士学位论文全文数据库，www.cnki.net，作者：姜丽英，指导教师：吴艳涛。P2D3由申请人保存)。Western blotting试验，单抗可以和PRRSV约15kDa的蛋白带呈阳性反应；间接免疫荧光试验，单抗与感染PRRSV的Marc-145细胞均发生反应而显示特异性荧光，而与未感染PRRSV的Marc-145细胞无反应；单抗亚类为IgG1。
本发明中所说的多抗可按以下方法制备：利用Marc-145细胞培养PRRSV SHY-1株，以超速离心纯化的PRRSV为抗原，与弗氏完全佐剂充分乳化后，免疫60日龄家兔；20天后、40天后以以同样的抗原与弗氏不完全佐剂乳化，各加强免疫一次；60天采血，分离血清；采用Protein G亲和层析纯化。
本发明中包被单抗P2D3的酶标板可按以下方法制备：将单抗P2D3按每孔200ng/100μl包被96孔酶标板，包被液为0.1M pH 9.6碳酸盐缓冲液，37℃包被2小时；酶标板在37℃下以每孔200μl的含10％小牛血清pH 7.5PBS封闭2小时；以pH 7.5PBST洗涤3次，立即使用或贮藏于-20℃备用。
本发明中使用的HRP标记的羊抗兔IgG为商品化试剂；样品裂解液(1％NP-40、1M NaCl、1M Tris-Cl，pH7.5)可以使PRRSV病毒粒子的囊膜被破坏，释放出N蛋白；酶标板洗涤液为PBST(含0.05％Tween-20的PBS)；显色液为TMB；终止液为2M H2SO4；阳性对照为表达的PRRSVN蛋白(10ng/ml)(“猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的原核表达及其单克隆抗体的研制”，2008-12-16，中国知识资源总库-中国优秀硕士学位论文全文数据库，www.cnki.net，作者：姜丽英，指导教师：吴艳涛。申请人保存)、阴性对照为PBS。
本发明提供了检测样品的准备方法：将猪的淋巴结和肺组织等病料研磨至糊状，与等体积样品裂解液混合；经反复冻融3次后，4000rpm离心30min，取上清液备用。
本发明提供了ELISA的流程和工作条件。将待测样品加入酶标板，每孔100μl，37℃孵育30分钟；以PBST洗涤3次；每孔加入475ng/100μl多抗，37℃孵育30分钟；以PBST洗涤3次；每孔加入1∶5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG 100μl，37℃孵育30分钟；以PBST洗涤3次；每孔加入100μl TMB，显色10分钟；加50μl 2MH2SO4中止反应，读取450nm光密度值，判定结果。
本发明试剂盒有以下优点：
(1)以多抗和单抗捕获PRRSV抗原，与猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV)无交叉反应。
(2)检测PRRSV人工攻毒感染猪的组织样品，结果显示肺门淋巴结、腹股沟淋巴结以及肺是最适合临床检测的组织，检出率高达100％。
(3)对300份从临床上收集的猪肺或者淋巴结样品分别采用本发明提供的ELISA方法和RT-PCR方法进行检测，两种方法的符合率为95.7％。
(4)对接种PRRSV弱毒疫苗的猪用本发明提供的ELISA方法检测，在免疫3天和6天后均仍能够从血液中检测到病毒，而在免疫9、12、15、18、21天后均检测不到病毒。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明中，已被文献公开并由申请人保存的生物材料，均自申请日起向公众提供20年。
实施实例1：猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体研制
1实验方法
1.1抗原的制备
复苏Marc-145细胞，待细胞长至单层时，弃去生长液，用PBS洗两次，接种适量PRRSVSHY-1株(由申请者分离、鉴定和保存，见2010年2月出版《中国兽医学报》，第30卷，第2期，145～149页，“猪繁殖与呼吸综合征病毒江苏分离株ORF5及Nsp2基因部分序列分析”，作者：迟兰、吴艳涛等)，37℃吸附1h，加入维持液5ml，37℃6％CO2培养箱培养。培养约3-5天后，细胞病变达80％以上时，收获病毒液，-70℃保存备用。
取适量收获的病毒液用维持液作10倍比稀释。按照Reed-Muench法计算TCID50。
采用PEG浓缩法对所收获的病毒液进行浓缩。取病毒液500ml冻融3次后装入处理后的透析袋内，用PEG-12000包埋透析袋，4℃作用数小时，待透析袋内液体量浓缩至原来的1/5～1/10时，吸出，-20℃保存备用。
将浓缩后的病毒液4℃6000rpm离心30min，弃去沉淀，上清液经28000rpm 4℃离心2h，弃去上清，加入PBS吹散沉淀并混匀。将此病毒上清悬液轻轻加于10％、20％、30％、40％、50％、60％的蔗糖密度梯度上，以35000rpm离心2h，收集30％～40％梯度带上的蛋白质提取物，以35000rpm离心2h，弃上清液，少量PBS悬浮沉淀，紫外分光光度计检测病毒蛋白含量，-70℃保存备用。
1.2动物免疫
取含适量纯化病毒抗原(200μg左右)的病毒液400μl与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下分点注射8周龄BALB/c小鼠200μl/只；2周后、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再各免疫一次；6周后取相同剂量抗原腹腔注射，不加佐剂；3天后融合。
1.3融合
1.3.1骨髓瘤细胞的准备
选择生长状态良好的SP2/0细胞，密度长至75％时弃上清，以无抗不完全DMEM培养基洗涤一次后，用10ml无抗不完全DMEM培养基将细胞轻轻吹下。
1.3.2脾淋巴细胞的准备
取加强免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血作为阳性血清；颈脱臼将小鼠致死，用75％酒精消毒体表10min，随即放入超净台内的解剖板上，腹部朝上，四肢固定；无菌打开腹腔取出脾脏，用无抗不完全DMEM培养基洗涤，并仔细去掉周围附着的结缔组织；随后将脾脏转移到另一个盛有无抗不完全DMEM培养基的平皿中。用研磨棒挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。
1.3.3饲养细胞的制备
饲养细胞可以在融合前一天晚上或者融合过程中制备，方法如下：取一只成熟健康的ICR小鼠，摘眼球采血作为阴性血清，颈脱臼处死；体表消毒和固定后，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜；注入10ml HAT培养基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入已准备好的容器中。如果是在融合前一天晚上制备饲养细胞，可以将饲养细胞预先稀释后加入96孔细胞培养板中。
1.3.4细胞融合
将上述制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50ml的带盖的融合管中，1000rpm离心10min，弃上清。将融合管置于手掌中，轻轻摩擦底部，使两种细胞充分混匀；在37℃水浴中45s内缓慢加入1ml预热的PEG到融合管中，边加边轻轻摇匀；随即在90s内先慢后快滴加30mL 37℃预热的无抗不完全DMEM培养基，使PEG稀释而失去作用，37℃静止10min，1000rpm离心10min；弃上清，用60ml HAT培养基轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量的腹腔巨噬细胞；分装于96孔细胞培养板，然后将培养板置37℃6％CO2培养箱内培养；5d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基；10d后用预热的HT培养基换出HAT培养基；观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清进行抗体检测。
1.4杂交瘤细胞的筛选
以大肠杆菌表达的PRRSVN蛋白(“猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的原核表达及其单克隆抗体的研制”，2008-12-16，中国知识资源总库-中国优秀硕士学位论文全文数据库，www.cnki.net，作者：姜丽英，指导教师：吴艳涛。申请人保存)为检测抗原，采用间接ELISA方法来筛选阳性克隆。
以方阵试验确定检测抗原包被浓度。将检测抗原用碳酸盐包被缓冲液做系列稀释，每一行为一个稀释度，100μl/孔包被酶标板，4℃包被过夜；用PBST洗涤3遍，每次5min，在吸水上拍干；加封闭液200μl/孔，4℃反应过夜，同上洗涤3遍；加入梯度稀释的阳性血清100μl/孔，37℃孵育1.5h，同上洗涤3遍；加入工作浓度(1∶5000稀释)的羊抗鼠HRP-IgG 100μl/孔，37℃孵育1h，同上洗涤3遍；加入TMB显色液100μl/孔，37℃反应10-15min；加入2MH2SO4 100μl/孔终止反应。测定孔内的OD450。
按方阵确定好的抗原浓度包被酶标板，-20℃保存备用。检测杂交瘤上清的ELISA方法同上。免疫小鼠血清作为筛选时的阳性对照，非免疫的ICR小鼠血清作为阴性对照，同时设立空白调零孔。
1.5杂交瘤细胞的克隆化
采用有限稀释法对ELISA检测为阳性的杂交瘤细胞进行克隆化。
首先制备小鼠腹腔饲养细胞，分装到96孔细胞培养板；将阳性孔中的杂交瘤细胞吹下，经计数后用HT培养基稀释，按1个细胞/孔、3个细胞/孔、10个细胞/孔加入到装有饲养细胞的96孔板中；37℃6％CO2培养箱培养7-10天，对出现单个细胞克隆孔的上清再用间接ELISA方法进行检测；连续进行3-4次亚克隆，至每个细胞孔上清均为阳性时可以定株。
1.6腹水的制备及纯化
取10周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，0.5mI/只；1周后腹腔注射用PBS稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞，1×106个/只；待小鼠腹部明显隆起时，用16号针头从腹腔采集腹水，2500rpm离心10min，去除脂肪组织，将上清取出，-70℃保存备用。
采用Protein A亲和层析方法进行纯化腹水。具体方法如下。轻柔颠倒装有Protein A亲和树脂的容器数次以混合树脂使其完全悬浮。将适量Protein A树脂装入层析柱中，加入5ml的结合缓冲液平衡柱子。使用相同或者更多体积的结合缓冲液稀释多抗血清样品，上样。上样后用10ml结合缓冲液洗柱子。结合缓冲液流尽后，用30ml的洗脱缓冲液洗脱抗体，收集洗脱产物。洗脱过程中实时检测洗脱液的PH值，及时用1M Tris-Cl(pH8.5)中和洗脱液，使含洗脱产物的洗脱液的pH为7.4。洗脱液装入透析袋，使用0.01M的Tris-Cl缓冲液(pH7.4)4℃透析过夜，中途换液2-3次。
1.7单抗特性的鉴定
1.7.1单抗腹水效价测定
采用间接ELISA的方法，将腹水先按1∶50稀释，再按2倍倍比稀释，依次加入包被抗原的酶标孔内，其他步骤同1.4。
1.7.2单抗特异性鉴定
取纯化的PPV、PRV、PCV-2、CSFV以及PRRSV包被96孔酶标板，分别对单抗进行间接ELISA试验。
1.7.3间接免疫荧光试验
在24孔板培养Marc-145并接种适量PRRSV，同时设未接毒的正常细胞作为阴性对照；培养3天至80％病变时弃去培养基，用PBS洗涤3次，每次5分钟，用-20℃预冷的丙酮∶乙醇(3∶2)室温固定10min；用PBS洗涤3次，每次5分钟，在吸水纸上拍干，分别滴加1∶600稀释的腹水单抗，37℃作用45min；用PBS洗涤3次，每次5min，在吸水纸上拍干，加入1∶200稀释的羊抗鼠FITC-IgG作用45min；用PBS洗涤3次，每次5min，在吸水纸上拍干，在荧光显微镜下观察，出现特异性的亮绿色荧光者为阳性，反之判为阴性。
1.7.4Western-blot
制备SDS-PAGE电泳凝胶，每孔加入10μl提纯的PRRSV或蛋白质Marker，电泳，转印硝酸纤维素(NC)膜。用去离子水漂洗NC膜，4℃封闭过夜；用PBST洗3次，每次5min，以单抗为一抗(1∶100稀释)，37℃作用1h；用PBST洗3次，每次5min；NC膜放入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶5000稀释)溶液中，37℃作用1h；用PBST洗3次，每次5分钟，将NC膜转移至新鲜配制的底物显色液中避光显色，至条带清晰时用蒸馏水终止反应。
1.7.5亚类鉴定
按单克隆抗体亚类试剂盒说明书介绍的方法进行。具体方法如下：酶标板内分别加入1∶5000单抗腹水100uL/孔，37℃孵育1小时，PBST洗涤3次，每次5min；分别加入工作浓度羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA亚类血清100μL/孔，每株单抗加每种亚类两孔，37℃孵育30min，PBST洗涤3次，每次5min；加入工作浓度兔抗羊辣根过氧化物酶结合物100μl/孔，37℃孵育15min，PBST洗涤3次，每次5min；加TMB显色液100μl/孔，37℃避光显色5-10min；用2M H2SO4100ul/孔终止反应；在450nm波长下测定OD值。以OD值明显高于其他孔者所加亚类血清为单抗亚类。
1.7.6杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性鉴定
将杂交瘤细胞进行连续传代，每隔一周测定其间接ELISA效价，一直传至30代以评价其分泌抗体的稳定性。
2实验结果
2.1PRRSV的扩增和纯化
按照Reed-Muench法计算出细胞培养的PRRSV为104.88TCID50/100μl。经纯化的PRRSV浓度为1.8mg/ml。
2.2杂交瘤细胞株的建立
以间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞，经3次亚克隆共得到10株阳性的杂交瘤细胞系，分别命名为P1A1、P1A2、P1C5、P2D3、P2G7、P5E5、P6G7、P7F2、P7E8和N1H4。
2.3单抗腹水效价测定
将腹水倍比稀释，采用间接ELISA的方法确定阳性反应的最高稀释倍数即为其效价。结果如表1。
表1单抗腹水ELISA效价
2.4单抗特异性鉴定
采用间接ELISA方法，显示10株单克隆抗体均仅与PRRSV反应，而不与PPV、PRV、PCV2、CSFV反应。
2.5间接免疫荧光试验
用感染PRRSV的Marc-145细胞与1∶600稀释的腹水单抗做间接免疫荧光试验，感染病毒的细胞显示特异性荧光，而未感染病毒的对照组细胞无特异性荧光出现。
2.7Western-blotting
单抗P2D3均可以和PRRSV约15kDa的蛋白带呈阳性反应。说明该单抗针对PRRSV N蛋白，且具有良好的反应性和特异性。
2.8单抗亚类鉴定
按单克隆抗体亚类试剂盒说明书介绍的方法对单抗进行亚类鉴定，结果显示单抗P2D3为IgG。
2.9杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性鉴定
单抗P2D3杂交瘤细胞传30代仍能稳定分泌抗体。
实施例2：检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的多抗/单抗捕获抗原ELISA方法建立
1实验方法
1.1兔抗PRRSV多抗血清的制备
1.1.2免疫程序
纯化的病毒抗原经弗氏佐剂乳化后，采用皮下注射的方式对兔子进行免疫，免疫程序为：取含适量纯化的抗原(3mg左右)与弗氏完全佐剂充分乳化，皮下分点注射首免；20天后、40天后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再各免疫一次；60天后颈动脉插管收集全身血液，4℃静置过夜后3000g离心15min收集血清。
1.1.3多抗血清的纯化
多抗血清采用Protein G亲和层析方法进行纯化。具体方法如下。轻柔颠倒装有Protein G亲和树脂的容器数次以混合树脂使其完全悬浮。将适量Protein G树脂装入层析柱中，加入5ml的结合缓冲液平衡柱子。使用相同或者更多体积的结合缓冲液稀释多抗血清样品，上样。上样后用10ml结合缓冲液洗柱子。结合缓冲液流尽后，用10ml的洗脱缓冲液洗脱抗体，收集洗脱产物。洗脱过程中实时检测洗脱液的PH值，及时用1M Tris-Cl(pH8.5)中和洗脱液，使含洗脱产物的洗脱液的pH为7.4。洗脱液装入透析袋，使用0.01M的Tris-Cl缓冲液(pH7.4)4℃透析过夜，中途换液2-3次。
1.2ELISA方法的建立
1.2.1ELISA的一般流程
单抗包被-洗板-封闭-洗板-加抗原-洗板-加多抗-洗板-加酶标二抗-洗板-显色-终止-判定结果。
1.2.2单抗与多抗最佳工作浓度的确定
用方阵试验确定单抗与多抗最佳工作浓度。
①包被用包被液将单抗作1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800稀释，100μl/孔，每个稀释度一行，37℃包被2h后4℃过夜；轻柔而果断地甩出孔内液体，用洗涤液洗涤3次，5min/次，在吸水纸上拍干。
②封闭用10％小牛血清作封闭剂，200μl/孔，37℃封闭2h，同上洗涤三次，拍干。
③加抗原用稀释液将纯化的PRRSV病毒和阴性细胞抗原以相同浓度(4.5μg/ml)相间加入一块酶标板中，100μL/孔，同时设PBS空白对照，37℃作用30min，同上洗涤三次，拍干。
④加多抗用稀释液将多抗作1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200稀释，加入酶标板中，100μl孔，每个稀释度作两列，同时设PBS空白对照，37℃作用30min，同上洗涤三次，拍干。
⑤加酶标二抗加入1∶5000稀释的HRP--羊抗兔IgG，100μl/孔，37℃作用30min，同上洗涤三次，拍干。
⑥显色与终止加入TMB显色液100μl孔，室温避光作用10～15min，加入终止液(2MH2SO4)，50μl/孔，在酶标仪上读取OD450。以阳性孔OD值接近1，P/N值最大时，单抗和多抗的浓度组合为其最佳工作浓度。
1.2.3封闭液的选择
根据确定的单抗和多抗的最佳工作浓度组合，分别以4％明胶-PBST、1％BSA-PBST、5％脱脂乳-PBST、5％小牛血清-PBST和10％小牛血清-PBST作为封闭剂作ELISA检测，以阳性孔OD值接近1，P/N值最大所对应的封闭剂为最佳封闭剂。
1.2.4封闭时间的选择
根据确定的单抗和多抗的最佳工作浓度组合以及封闭液，将封闭时间设为60min、90min，120min分别进行ELISA检测，以阳性孔OD值接近1，P/N值最大所对应的封闭时间为最佳封闭时间。
1.2.5检测抗原、多抗、酶标抗体作用时间的选择
在确定好ELISA单抗、多抗组合、封闭液和封闭时间后，对检测抗原、多抗和酶标抗体的采用不同的作用时间(30min、60min，90min)分别进行ELISA检测，以阳性孔OD值接近1，P/N值最大所对应的封闭时间为最佳作用时间。为了便于比较结果，检测抗原、多抗和酶标抗体三者的作用时间保持一致。
1.2.6阴阳性判断标准的建立
取89份经RT-PCR检测不含PRRSV的病料为阴性样品，用所建立ELISA方法进行实验，测得OD450值，计算平均OD值。则阳性样品OD值下限＝阴性样品平均OD值+3标准差(SD)。
1.3特异性试验
分别以相同浓度(4.5μg/mL)的PRRSV、PPV、PRV、PCV1、PCV2和CSFV作为检测抗原，同时设空白对照，用所建立的ELISA方法进行试验。其中PRRSV采用本室保存的JSDT-1，YZCD-2，ZJ-1，YXAC-2，HH-1等5个PRRSV毒株(“猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的原核表达及其单克隆抗体的研制”，2008-12-16，中国知识资源总库-中国优秀硕士学位论文全文数据库，www.cnki.net，作者：姜丽英，指导教师：吴艳涛。申请人保存)。
1.4敏感性试验
①将纯化的PRRSV连续倍比稀释成不同的浓度，用建立的ELISA方法来检出最低检出量，操作过程中设阴性对照。
②以大肠杆菌表达的PRRSVN蛋白为检测抗原(浓度为100ng～0.1ng)，用建立的ELISA方法来检出最低检出量，操作过程中设阴性对照。
1.5DAS-ELISA检测PRRSV的初步应用
1.5.1RT-PCR检测PRRSV方法的建立
根据GenBank中ATCC VR-2332的基因组序列，应用Premier5.0软件设计了1对扩增ORF-7基因的引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下：
上游(P1)5′-TCCATGCCAAATAACAACGGCAA-3′
下游(P2)5′-GTCGACTCATGCTGAGGGTGA-3′
取250μl病毒的细胞培养物或病料上清，加入Trizol 450μl，颠倒混匀，室温静置10min；再加入氯仿200μl，颠倒混匀，12000rpm离心10min；取上清，加入2倍体积的异丙醇，反复颠倒混匀，-20℃静置5min，12000rpm离心10min；弃去上清，1ml 70％乙醇，12000rpm离心5min；弃去上清，置超净台挥发干；用50μl经DEPC处理的超纯水充分悬浮沉淀，立即使用或置-70℃保存。
取以上提取的病毒基因组RNA 17μl，加入随机引物1μl(50ng)，轻轻混匀后置于70℃恒温金属浴中变性5min，立即冰浴5min，然后依次加入以下试剂：
5×AMV reverse transcriptase reaction buffer 5μl
dNTPs(10mM) 1μl
RNasin(40U/μl) 0.5μl
AMV reverse transcriptase(10U/μl) 0.5μl
用手指轻拨混匀，瞬时低速离心，置40℃水浴中反应1.5h，后取出95℃作用5min以灭活残余的反转录酶。待产物冷却后直接进行以下PCR反应，或者暂存于-20℃。
PCR 50μl反应体系如下：
10×PCR buffer 5μl
dNTPs(10mM) 1μl
cDNA 4μl
P1(25pmol/μl) 1μl
P2(25pmol/μl) 1μl
Taq DNA polymerase(5U/μl) 1μl
SW 37μl
轻轻混匀后，按下列反应参数进行PCR扩增：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45，72℃1min延伸，共35个循环；72℃延伸7min。4℃短期保存。
取RT-PCR产物45μl，加10×loading buffer 5μl混匀，1％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/ml)电泳，恒压65伏电泳2h。通过电泳结果判定是否有PRRSV。
1.5.2人工感染PRRSV实验猪病料的检测
5头经检测未感染PRRSV的2月龄猪随机分成两组。一组的4头猪肌肉注射5ml 100个TCID50剂量的PRRSV细胞毒。另一组的猪注射相同量的PBS作为阴性对照。14天后扑杀剖检，采集其其心、肝、脾、肾、脑、肺、扁桃体、淋巴结等组织作为被检材料。将猪的淋巴结和肺组织等病料研磨至糊状，与等体积样品裂解液(1％NP-40、1M NaCl、1M Tris-Cl，pH7.5)混合；经反复冻融3次后，4000rpm离心30min。取100μl上清液进行ELISA检测，同时再取100μl上清液进行RT-PCR检测。
1.5.3对临床病料的检测
300份于2008和2009年在中国各地收集的疑似PRRSV感染的猪的病料样品(主要是淋巴结和肺)用所建立的方法进行检测。这些样品来源于有疑似PRRSV感染的猪场。所有样品同时采用RT-PCR的方法进行检测，同ELISA方法进行比较。
1.5.4仔猪免疫弱毒疫苗后排毒的检测
20头25日龄的SPF猪随机分成两组，第一组的猪每头肌肉注射1ml弱毒疫苗JXA1-R(扬州威克公司提供)，另一组的猪注射相同剂量的PBS作为阴性对照。在免疫3，6，9，12，15，18，21天后，分别采集猪的全血样品，与等体积样品裂解液(1％NP-40、1M NaCl、1MTris-Cl，pH7.5)混合；经反复冻融3次后，4000rpm离心30min。分别取100μl上清液用所建立的ELISA方法和RT-PCR方法进行检测。
2实验结果
2.1多抗的制备及纯化
对采用Protein G亲和层析法纯化的兔抗PRRSV多抗浓度为3.8mg/ml。
2.2ELISA方法的建立
2.2.1单抗和多抗最佳工作浓度测定结果
经方阵试验测定，采用P2D3单抗和多抗组合，单抗包被量为200ng(1∶400稀释)，多抗用量为475ng(1∶800稀释)时，P/N值最大为12.37(表2)。
表2单抗和多抗最佳工作浓度组合的确定＊
*表中反映了不同工作浓度组合时P/N的值。
2.2.2最佳封闭液的确定
根据确定的单抗和多抗的最佳工作浓度组合，分别以4％明胶-PBST、1％BSA-PBST、5％脱脂乳-PBST、5％小牛血清-PBST和10％小牛血清-PBST作为封闭剂作ELISA检测。不同封闭液作用后，P/N的值不同(见表3)，小牛血清作为封闭液的结果明显优于其他几种封闭液，且10％小牛血清的封闭效果要优于5％小牛血清。
表3最佳封闭液的确定
2.2.3最佳封闭时间的确定
根据确定的单抗和多抗的最佳工作浓度组合以及封闭液，采用不同的封闭时间进行ELISA检测。封闭时间不同，P/N的值也不同(结果见表4)。封闭时间采用120min时，效果最佳。
表4最佳封闭时间的确定
2.2.4检测抗原、多抗、酶标抗体作用时间的确定
在确定好ELISA单抗、多抗组合、封闭液和封闭时间后，对检测抗原、多抗和酶标抗体的采用不同的作用时间进行ELISA检测。不同作用时间的P/N值差别不是很大(表5)。考虑到在临床上应用时需快速敏感得出结果，因此采用30min的作用时间较为适宜。
表5检测抗原、多抗、酶标抗体作用时间确定
2.2.5阴阳性判定标准的确立
89份阴性样品的平均OD值为0.190，标准差SD为0.030，因此阳性判断标准为0.280(0.190+0.090)。检测样品的OD值在0.280以上时可以判断为阳性。
2.3ELISA试验特异性
用PRRSV、PPV、PRV、PCV1、PCV2和HCV作为检测抗原进行ELISA检测。PPV、PRV、PCV1、PCV2和HCV结果均为阴性反应。5个不同的PRRSV毒株检测结果均为为阳性，其OD值在1.116至1.523之间(表6)。
表6特异性试验验结果
2.4ELISA试验敏感性
建立的ELISA试验最低检出纯化PRRSV的浓度为0.2μg/ml(表7)，最低检出大肠杆菌表达的PRRSV N蛋白为1ng/ml(表8)。试验也说明建立的ELISA试验可用于检测大肠杆菌表达的PRRSV N蛋白。
表7敏感性试验结果(1)
a纯化PRRSV的浓度：μg/ml
表8敏感性试验结果(2)
b大肠杆菌表达的PRRSVN蛋白浓度
2.5人工感染PRRSV实验猪病料的检测
ELISA被用来检测实验猪组织样品。阴性对照组的样品经ELISA和RT-PCR检测均为阴性。ELISA检测实验攻毒的猪的组织样品的结果显示，不同的猪不同组织内PRRSV阳性检出率不同(表12)。肺门淋巴结、肺、血液及腹股沟淋巴结的检出率高达100％，而脑和胃的检出率为0％。RT-PCR检测结果同ELISA检测结果相一致。
表8不同组织PRRSV检出率
2.6临床样品的检测结果
300份从临床上收集的猪肺或者淋巴结样品分别采用DAS-ELISA和RT-PCR方法进行检测。DAS-ELISA检测显示有159份样品呈PRRSV阳性，而RT-PCR检测结果表明有165份样品呈阳性。两者检测均呈阳性的共有155份样品，因此两种方法的符合率为95.7％(表9)。
表9ELISA和RT-PCR检测PRRSV的比较
2.7实验猪免疫弱毒疫苗后排毒情况的检测
免疫组的猪在免疫3天和6天后用建立的ELISA方法均仍能够从血液样品中检测到PRRSV弱毒疫苗毒，而在免疫9，12，15，18，21天后均检测不到。阴性对照组的猪的血液样品均未检测到PRRSV。RT-PCR检测结果同ELISA检测结果一致。
Claims (5)
1.一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒，其特征在于：
包被PRRSV N蛋白单克隆抗体的酶标板、PRRSV多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG、洗涤液、显色液、终止液、样品裂解液、阳性对照、阴性对照。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
包被在酶标板上的PRRSVN蛋白单克隆抗体是由杂交瘤细胞株P2D3分泌获得。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
PRRSV多克隆抗体由以下方法制备：利用Marc-145细胞培养PRRSV SHY-1株，以超速离心纯化的PRRSV为抗原，与弗氏完全佐剂充分乳化后，免疫60日龄家兔；20天后、40天后以以同样的抗原与弗氏不完全佐剂乳化，各加强免疫一次；60天采血，分离血清；采用Protein G亲和层析纯化。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：
酶标板的准备按以下进行：将单抗P2D3按每孔200ng/100μl包被96孔酶标板，包被液为0.1M pH 9.6碳酸盐缓冲液，37℃包被2小时；酶标板在37℃下以每孔200μl的含10％小牛血清pH 7.5PBS封闭2小时；以pH 7.5PBST洗涤3次，立即使用或贮藏于-20℃备用。
5.权利要求1的试剂盒的使用方法是：
将待测样品加入酶标板，每孔100μl，37℃孵育30分钟；以PBST洗涤3次；每孔加入475ng/100μl多抗，37℃孵育30分钟；以PBST洗涤3次；每孔加入1∶5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG 100μl，37℃孵育30分钟；以PBST洗涤3次；每孔加入100μlTMB，显色10分钟；加50μl 2M H2SO4中止反应，读取450nm光密度值；OD值在0.280以上时判断为阳性。
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