CN112946285A - 检测高致病性prrsv感染的elisa试剂盒 - Google Patents

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Abstract

一种检测高致病性PRRSV感染的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括：包被抗PRRSV的多克隆抗体的酶标板、抗PRRSV单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG、洗涤液、显色液、终止液、样品裂解液、阳性对照和阴性对照，其特征在于：所述抗PRRSV单克隆抗体是由杂交瘤细胞株3E8分泌获得。所述试剂盒既可以检测目前主要流行的美洲型的PRRSV病毒，适合用于国内PRRS疫情的防控，也能检测在欧洲地区流行的欧洲型PRRSV病毒，适合作为进出口检疫部门的主要检测手段，最低检出纯化PRRSV‑NVDC‑JXA1的浓度为0.05μg/mL，PRRSV‑DV株的浓度为0.1μg/mL，与RT‑PCR检测的一致性为100%。

Description

检测高致病性PRRSV感染的ELISA试剂盒
技术领域：
本发明属于生物领域，具体涉及一种检测高致病性PRRSV感染的ELISA试剂盒及其应用。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪繁殖障碍以及仔猪呼吸道疾病为主要特征的高度接触性传染疾病，主要临床症状是妊娠母猪繁殖障碍，表现为流产、产死胎、木乃伊胎、弱胎，各龄猪尤其是小猪出现呼吸道疾病，哺乳仔猪高死亡率、免疫抑制和持续性感染等，是目前严重影响世界养猪业健康发展的重要传染病之一，特别是2006年以来，我国及周边国家出现以高热、高发病率和高死亡率为主要特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)，给我国的养猪业造成了重大的经济损失。PRRS难以防控主要是因为：第一，PRRSV可通过各种各样的方式无声无息的进行感染和传播，具有高度传染性；第二，PRRSV作为RNA病毒，具有高度变异性，不同毒株的抗原表位差异较大以及不同疫苗的交叉保护性差，使得防控变得极度棘手；第三，PRRSV可以在猪体内潜伏很长一段时间，一旦机体免疫力低下，PRRSV就会趁虚而入，大量增殖，使猪表现出临床症状，进而患病。
该病毒可以侵害免疫系统造成持续感染，当前普遍通过免疫疫苗的方式进行防控，但是疫苗的大量使用使该疫病的流行情况日益复杂多变，因此建立PRRSV的快速诊断方法，对我国猪群PRRS流行病学调查及疫病的控制具有重要指导意义。PRRS的诊断一般分为病原学和血清学两种。用于检测PRRSV的诊断工具非常重要，由于感染迹象的变化，基于现场临床症状诊断PRRSV非常困难。用于诊断PRRSV的最常见诊断工具有免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)，酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量RT-PCR，间接免疫荧光IFA和血清中和试验等，但是实时荧光定量RT-PCR技术含量及检测成本高，同时容易出现假阳性结果；抗体检测方法以美国IDEXX和法国LSI最为经典，其中IDEXX公司的Herdchek ELISA检测试剂盒以全病毒作为包被抗原，一般为PRRSV抗体检测的标准方法。研究表明，在感染的早期机体就会产生较高水平的抗体，最先能够检测到的是针对N和M蛋白的抗体，抗体检测方法在疫病防控中起重要作用，目前，在众多PRRSV的检测方法中，酶联免疫吸附试验(ELISA)操作简便、快速敏感、易于标准化，非常适合用于大规模流行病学调查和监测，近几年来的用重组表达核衣壳蛋白(如N蛋白)为包被抗原建立的间接ELISA和阻断ELISA商品化标准试剂盒，由于其标准化和程序化的试验操作和生产流程，结果的较为可靠，一致性比较高，临床上大型养殖场的大范围初筛和群体检查常使用这一方法。我国目前PRRSV抗体检测主要依靠国外进口的检测试剂盒，价格昂贵，因此建立特异性好、敏感性高的国产PRRSV抗体检测方法对我国PRRSV防控意义重大，而制备PRRSV高特异性和灵敏度的单克隆抗体对PRRSV的检测方法和检测试剂盒的制备具有重要意义。
发明内容：
为解决以上技术问题，本发明旨在提供一种检测高致病性PRRSV感染的ELISA试剂盒及其应用，该试剂盒以本公司制备得到的抗PRRSV单克隆抗体以及多克隆抗体为基础，通过检测条件的优化，得到了一种具有特异性和高灵敏度的检测试剂盒，
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术手段：
一种检测高致病性PRRSV感染的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括：包被抗PRRSV的多克隆抗体的酶标板、抗PRRSV单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG、洗涤液、显色液、终止液、样品裂解液、阳性对照和阴性对照，其特征在于：所述抗PRRSV单克隆抗体是由杂交瘤细胞株3E8分泌获得，所述将杂交瘤细胞株3E8保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，其保藏号为：GDMCC No：61302，保藏日期为2020年11月20日；保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
所述抗PRRSV的多克隆抗体是兔抗PRRSV的多克隆抗体。
所述兔抗PRRSV的多克隆抗体采用如下方法制备得到：利用Marc-145细胞培养PRRSV-NVDC-JXA1株，以超速离心纯化的PRRSV为抗原，与弗氏完全佐剂充分乳化后，皮下分点注射免疫60日龄家兔，5mg抗原/只，15天、30天分别用同样抗原与弗氏不完全佐剂充分乳化后各加强免疫一次，45天后颈动脉插管收集全身血液，4℃静置过夜后3000g离心15min，分离收集血清；用Protein G亲和层析纯化得到所述抗PRRSV的多克隆抗体。
所述阳性对照是灭活的PRRSV-NVDC-JXA1病毒，浓度为5μg/mL。
所述阴性对照是灭菌的PBS或SPF猪血清或灭菌ddH2O。
所述包被抗PRRSV的多克隆抗体的酶标板采用如下方法制备得到：将抗PRRSV的多克隆抗体按照每孔500ng/100μL包被96孔酶标板，包被液为0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液，37℃包被2h后，4℃过夜，轻柔而果断地甩出孔内液体，用PBST洗涤液洗涤3次，5min每次，在吸水纸上拍干；用10％小牛血清作封闭剂，200μl/孔，37℃封闭90min，用PBST洗涤液洗涤3次，立即使用或贮藏于-20℃备用。
所述试剂盒的使用方法为：将处理好的待测样品加入酶标板，每孔100μL，37℃作用30min，用PBST洗涤液洗涤3次，拍干；每孔加入100ng/100μl的抗PRRSV单克隆抗体，37℃作用30min，用PBST洗涤液洗涤3次，拍干；加入1:5000的HRP--羊抗鼠IgG，100μl/孔，37℃作用30min，用PBST洗涤液洗涤3次，拍干；加入TMB显色液100μl孔，室温避光作用10～15min，加入2M H2SO4的终止液，50μl/孔，在酶标仪上读取OD450，OD值在0.245以上时判断为阳性。
本发明还请求保护所述检测高致病性PRRSV感染的ELISA试剂盒在检测PRRSV中的应用。
更进一步的，所述应用是指在实验室研究中检测PRRSV。
所述PRRSV是指美洲型PRRSV或欧洲型PRRSV中的一种或两种。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
首先，本发明以本公司所保藏的PRRSV-NVDC-JXA1作为抗原，制备得到了一株具有高特异性、高灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株3E8，所述杂交瘤细胞株的细胞培养上清中的抗体效价达到1:512，杂交瘤腹水效价能够达到1:20480，远远高于制备得到的其他杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株3E8分泌的单克隆抗体与PRRSV-NVDC-JXA1株及经过传代得到的PRRSV-JXA1-R疫苗弱毒株均具有良好的反应活性，对于美洲型PRRSV和欧洲型PRRSV均具有广谱反应活性，可以用于美洲型PRRSV和欧洲型PRRSV的检测，同时，本发明的单克隆抗体其能抑制和减少PRRSV-NVDC-JXA1株接种后导致的CPE，对于PRRSV病毒具有一定的中和活性。
其次，本发明采用所制备得到的单克隆抗体3E8以及多克隆抗体，构建了检测高致病性PRRSV感染的ELISA试剂盒及检测方法，所述ELISA试剂盒既可以检测目前主要流行的美洲型的PRRSV病毒，适合用于国内PRRS疫情的防控，也能检测在欧洲地区流行的欧洲型PRRSV病毒，适合作为进出口检疫部门的主要检测手段。并且试验表明，所述试剂盒最低检出纯化PRRSV-NVDC-JXA1的浓度为0.05μg/mL，PRRSV-DV株的浓度为0.1μg/mL，与RT-PCR检测的一致性为100％，相比现有技术报道的试剂盒更加灵敏和准确。
综上所述，本发明基于制备得到的具有高度灵敏性和特异性的单克隆抗体，建立了检测高致病性PRRSV感染的ELISA试剂盒，所述试剂盒既可以检测目前主要流行的美洲型的PRRSV病毒，适合用于国内PRRS疫情的防控，也能检测在欧洲地区流行的欧洲型PRRSV病毒，适合作为进出口检疫部门的主要检测手段，最低检出纯化PRRSV-NVDC-JXA1的浓度为0.05μg/mL，PRRSV-DV株的浓度为0.1μg/mL，与RT-PCR检测的一致性为100％。
附图说明：
图1：单克隆抗体鉴定结果，其中A，PRRSV-NVDC-JXA1株(强毒株)；B，PRRSV-JXA1-R疫苗弱毒株；C，阴性对照。
图2：单克隆抗体的毒株检测活性鉴定结果，其中A，阴性对照；B，PRRSV-NVDC-JXA1株(强毒株)；C，PRRSV-GD株(强毒株)；D，PRRSV-JXA1-R疫苗弱毒株；E，PRRSV-VR2332；F，PRRSV-DV株。
图3：单克隆抗体的中和活性测定结果。
图4：ELISA的特异性试验结果，其中1，PRRSV-NVDC-JXA1；2，PEDV；3，CSFV；4，PCV1；5，PCV2；6，PPV；7，PRRSV-DV株；8，SPF猪血清。
具体实施方式：
实施例1.单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立、鉴定和保藏
1.1抗原的制备和Balb/c小鼠的免疫
本发明采用PRRSV病毒NVDC-JXA1株(由广东永顺生物制药股份有限公司保藏和提供)作为免疫原，将PRRSV病毒NVDC-JXA1株接种到Marc-145细胞(由广东永顺生物制药股份有限公司保藏和提供)中，待细胞病变达到80-90％时，置于-80℃反复冻融3次，使得病毒从细胞中释放出来，3000rpm离心5分钟，除去细胞碎片，收集病毒液，测定TCID50毒价，分装后于-70℃下冻存备用。
采用-70℃下冻存的PRRSV病毒NVDC-JXA1株作为免疫抗原，采用灭菌的生理盐水将其进行稀释至106TCID50/mL，而后取病毒稀释液与等体积的弗氏完全佐剂(Sigma公司)按照1:1的比例混合乳化，免疫6周龄雌性SPF级Balb/c小鼠(购自广东省实验动物中心)，腹部皮下多点注射，200μL每只；14天后加强免疫一次，将病毒稀释液与等体积的弗氏不完全佐剂(Sigma公司)按照1:1的比例混合乳化后进行腹部皮下多点注射，200μL每只；间隔14天后，同样的方法进行第三次免疫。第三次免疫后7天尾静脉采血，用间接ELISA方法检测免疫血清中的抗体效价，选取抗体效价最高的两只小鼠，在融合前3天以尾静脉注射加强免疫，200μL每只。
1.2杂交瘤的制备和筛选
(1)杂交瘤的制备
无菌摘取加强免疫3天后的小鼠脾脏，制成脾细胞悬液，与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按照10:1的比例混合，1000rpm离心7min，弃尽上清液，轻弹管底，使得细胞散开混匀，在PEG作用下进行融合。具体融合是：吸取37℃提前预热的融合剂PEG 1mL,轻轻摇晃离心管同时1min内匀速加完，离心管立即静置于40℃水浴2min。随后30S内加入1mL37℃提前预热的DMEM培养液，1min内加入2mL预热的DMEM培养液，2min内加入10mL预热的DMEM培养液，边滴液边轻微摇动离心管，1000r/min，离心7min，弃掉上清，用40mL含有20％胎牛血清的HAT选择培养液轻悬沉淀细胞，混合均匀后，以每孔100μL加入到前一天制备的饲养层细胞96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2饱和湿度培养，24h后轻轻取出观察是否污染，如果出现污染孔，加入1％NaOH，无污染要放回培养箱避免在外长时间观察，容易影响融合细胞的生长。5～7d后，用20％FBS HAT培养液补液或者换液一次(以细胞生长情况为准)，观察融合细胞生长情况。
(2)间接免疫荧光(IFA)方法的建立
4～6周龄健康的Balb/c小鼠，与免疫小鼠在相同条件下饲养，作为阴性对照鼠。融合前将免疫小鼠和对照小鼠采血，分离阴阳性血清，-20℃保存备用。
间接免疫荧光具体方法是：
a.培养Marc-145细胞，保留一瓶不接种病毒的正常细胞作为阴性对照，其他用PRRSV病毒NVDC-JXA1株接种Marc-145细胞，每小瓶细胞接种150μL 106TCID50病毒液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，观察若有50％～70％细胞病变则准备消化细胞，吸除瓶内旧培养液，加入1mL胰酶消化液，显微镜观察待发现细胞间隙增大、折光性增强后弃掉胰酶；直接加1mL含血清的培养液，终止残留胰酶消化并反复吹吸，使细胞从壁上脱落，将细胞悬液转入2mL EP管中，2000rpm，离心3min；弃去上清，加入800μL PBS，移液枪轻柔吹打重悬；按上述方法同时消化重悬正常的Marc-145细胞；
b.准备干净载玻片，将细胞缓冲液均匀涂在载玻片孔内，每孔5μL，充分晾干1h，将加样后的载玻片用-20℃冷藏的丙酮固定10min，自然风干，-20℃保存备用；
c.以SP2/0细胞培养上清、免疫小鼠的阳性血清、对照小鼠的阴性血清、待检杂交瘤细胞上清为一抗，上清使用原液、阴阳性血清用PBS缓冲液稀释，各20μL/孔滴入载玻片上小孔内，注意避免孔内液体相互蔓延，置于湿盒内孵育，37℃作用30min；
d.弃去载玻片上液体，用PBS缓冲液洗涤3次，每次3min，自然风干后将FITC标记山羊抗小鼠IgG二抗用PBS缓冲液稀释至工作浓度(1:100倍稀释)，每孔20μL，置于湿盒内避光孵育，37℃作用30min；
e.用PBS缓冲液洗涤3次，每次5min，自然风干，加入50％甘油、用盖玻片封片，荧光显微镜观察结果；
f.检测为阳性的杂交瘤细胞用制备好的未接毒的正常Marc-145细胞片进行复检，避免出现假阳性。
(3)杂交瘤细胞的筛选及亚克隆
采用间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择强阳性克隆杂交瘤细胞采用有限稀释法进行亚克隆，连续克隆3次，同时采用IFA检测所以克隆细胞阳性率达到100％，即可确定获得稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，从96孔板移入24孔板，继续传代至12孔、6孔细胞培养板，最后在细胞瓶中扩大培养，液氮保存，共获得3株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，分别是1G4、3E8和5D2。
1.3杂交瘤细胞株的性能测定
(1)杂交瘤细胞的稳定性鉴定
将所筛选的3株杂交瘤细胞株冻存、复苏、连续传代培养20代，收集细胞培养上清液，用IFA法检测抗体水平，结果如下表1所示：
表1杂交瘤细胞的稳定性鉴定结果
Figure BDA0002932011760000051
由以上表1的结果可知，本发明获得的3株杂交瘤细胞株中，1G4和3E8分泌单克隆抗体的能力稳定，但5D2杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体的能力随着冻存和传代，其抗体分泌能力下降，抗体效价下降；而3E8的抗体分泌能力随着传代纯化而增强，当其传代20代后，抗体效价达到1:512，高于其他杂交瘤细胞株，而冻存复苏后，对于抗体效价也没有明显的影响，因而，本发明的杂交瘤细胞株3E8分泌抗体稳定性的最好，其次是1G4。
(2)杂交瘤细胞株的单克隆抗体效价的检测
将杂交瘤细胞株3E8、杂交瘤细胞株1G4、杂交瘤细胞株5D2分别传代20代后，选取5只8～10周龄健康Balb/c小鼠为一组，每只小鼠腹腔注射500μL弗式不完全佐剂，7天后，选取传代培养状态良好的杂交瘤细胞株3E8、杂交瘤细胞株1G4、杂交瘤细胞株5D2分别进行计数，每只小鼠腹腔注射约106个杂交瘤细胞；7～14天后，注意观察当小鼠腹部隆起时，用一次性注射器缓慢吸出小鼠体内的腹水，可根据小鼠体内诱生情况多次吸取，采集后离心去除脂肪等杂质，-20℃冻存备用。
参照(3)中间接免疫荧光(IFA)方法对杂交瘤细胞传代培养上清和腹水进行效价检测，将杂交瘤细胞培养上清按1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:512，1:1024稀释，诱生的单克隆抗体腹水按照1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280，1:2560，1:5120，1:10240，1:20480稀释，SP2/0细胞培养上清做阴性对照，加入事先制备好的PRRSV病毒NVDC-JXA1株感染的Marc-145细胞涂片，每孔做2个平行重复孔，按(3)中间接免疫荧光(IFA)方法进行测定。鉴定为阳性的最高稀释度，最终确定为IFA效价。结果如下表2：
表2杂交瘤细胞培养上清及腹水中单克隆抗体效价
杂交瘤细胞株 传代20代后的上清效价 杂交瘤腹水效价
1G4 1:128 1:5120
3E8 1:512 1:20480
5D2 1:32 1:2560
基于以上表2的结果可知，本发明获得的3株杂交瘤细胞株中，1G4和3E8分泌单克隆抗体的能力较强，其中以杂交瘤细胞株3E8分泌单克隆抗体的能力最强，其细胞培养上清中的抗体效价达到1:512，杂交瘤腹水效价能够达到1:20480，远远高于杂交瘤细胞株1G4以及杂交瘤细胞株5D2。
(3)单克隆抗体的亚型鉴定
采用sigma公司的亚型测定试剂盒对于杂交瘤细胞株3E8纯化的腹水中的单克隆抗体进行亚型测定，测得其属于IgG1亚类，轻链为κ链。
(4)单克隆抗体鉴定
以本公司广东永顺生物制药股份有限公司保存的PRRSV毒株PRRSV-NVDC-JXA1株(强毒株)、及经过传代得到的PRRSV-JXA1-R疫苗弱毒株(本公司弱毒疫苗生产毒株)感染Marc-145细胞，以未接毒Marc-145细胞、小鼠阴性血清、SP2/0细胞上清为阴性对照，以杂交瘤细胞株3E8培养上清液做阳性对照，分析杂交瘤细胞株3E8分泌的单克隆抗体与PRRSV毒株反应情况，具体结果如图1所示。
基于图1展示的结果可知，本发明杂交瘤细胞株3E8分泌的单克隆抗体与PRRSV-NVDC-JXA1株及经过传代得到的PRRSV-JXA1-R疫苗弱毒株均具有良好的反应活性。
(5)杂交瘤细胞株的保藏
通过以上试验，本发明获得了一株对PRRSV病毒抗体效价高、特异性好的杂交瘤细胞株3E8，将其在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)进用于专利程序的生物材料的保存，其保存号为：GDMCC No：61302，命名为Mus musculus hybridoma GDWS F5，分类命名为Musmusculus hybridoma；保藏日期为2020年11月20日；保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
实施例2：杂交瘤细胞株3E8单克隆抗体腹水的制备及纯化
2.1体内诱生腹水法制备单抗
选择经产的雌性Balb/c小鼠，腹腔内注射灭菌石蜡500μL/只，一周后，再次腹腔内注射获得的单克隆杂交瘤细胞3E8，注射量为106个细胞，再过一周后，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清，用饱和硫酸铵法对腹水进行纯化。
2.2单克隆抗体腹水的纯化(饱和硫酸铵法)及效价测定
(1)取单抗粗腹水，加等体积pH＝7.4的PBS，两者轻轻混匀。
(2)置于摇床上，室温轻轻旋转，缓慢、逐滴加入等体积的饱和硫酸铵溶液，使其饱和度为50％，此时会出现大量白色沉淀，室温静置30min。
(3)4℃12000rpm离心10min，弃上清，用PBS重悬沉淀，置于摇床上，缓慢加入饱和硫酸铵，使之达到35％的饱和度，室温放置30min。
(4)重复步骤(3)。
(5)4℃12000rpm离心20min，弃上清，用PBS重悬沉淀。
(6)将上述抗体溶液放入适当长度的透析袋中，以0.22μm的滤膜过滤的生理盐水为透析液，并放入转子转动液体，4℃透析24h，期间频繁更换透析液。
(7)收集抗体，用间接ELISA法测定并记录抗体效价，4℃分装，-80℃保存。
实施例3：单克隆抗体的活性鉴定
(1)单克隆抗体的毒株检测活性鉴定
以本公司广东永顺生物制药股份有限公司保存的PRRSV毒株PRRSV-NVDC-JXA1株(强毒株)、PRRSV-GD株(强毒株)、PRRSV-JXA1-R疫苗弱毒株(本公司弱毒疫苗生产毒株)、PRRSV病毒经典毒株PRRSV-VR2332以及欧洲型PRRSV经典毒株PRRSV-DV株感染Marc-145细胞，以未接毒Marc-145细胞、小鼠阴性血清、SP2/0细胞上清为阴性对照，以免疫小鼠阳性血清做阳性对照，分析纯化得到的杂交瘤细胞株3E8分泌的单克隆抗体与PRRSV各毒株反应情况，具体结果如图2所示。
基于图2展示的结果可知，本发明杂交瘤细胞株3E8分泌的单克隆抗体与所有的PRRSV毒株均反应，可见，本发明的单克隆抗体对于美洲型PRRSV和欧洲型PRRSV均具有广谱反应活性。
(2)单克隆抗体的中和活性测定
将纯化的单克隆抗体稀释至效价为1:12800，而后杂交瘤细胞株3E8分泌的单克隆抗体进行病毒中和试验，以检测其中和活性，用Marc-145细胞平铺至24孔板，接种病毒液，其中阳性对照组采用106TCID50病毒液(PRRSV-NVDC-JXA1株)与PBS缓冲液按1:1混合、试验组采用106TCID50病毒液(PRRSV-NVDC-JXA1株)与单克隆抗体稀释液按1:1混合，采用PBS缓冲液作为阴性对照组，通过观察细胞病变情况确定其中和活性，具体结果如图3所示。基于图3的结果可知，本发明的单克隆抗体其能抑制和减少PRRSV-NVDC-JXA1株接种后导致的CPE，对于PRRSV病毒具有一定的中和活性。
实施例4：ELISA检测方法的建立
4.1抗PRRSV多克隆抗体的制备：
利用Marc-145细胞培养PRRSV-NVDC-JXA1株，以超速离心纯化的PRRSV为抗原，与弗氏完全佐剂充分乳化后，皮下分点注射免疫60日龄家兔(5mg抗原/只)，15天、30天分别用同样抗原与弗氏不完全佐剂充分乳化后各加强免疫一次，45天后颈动脉插管收集全身血液，4℃静置过夜后3000g离心15min，分离收集血清；用Protein G亲和层析纯化得到抗PRRSV的多克隆抗体，浓缩至5mg/mL。
4.2 ELISA检测方法的建立
参考专利申请CN201010252436.1(扬州大学，公开号为CN101915846A)中的方法建立PRRSV-ELISA检测方法，本发明采用多克隆抗体进行包被，以使得建立的方法可以更广泛地识别PRRSV毒株，本发明也进行了如下试验：
4.2.1单抗与多抗最佳工作浓度的确定
(1)包被：用碳酸盐包被液将抗PRRSV多克隆抗体进行梯度稀释，100μL/孔，37℃包被2h后4℃过夜；轻柔而果断地甩出孔内液体，用PBST洗涤液洗涤3次，5min每次在吸水纸上拍干；
(2)封闭：用10％小牛血清作封闭剂，200μl/孔，37℃封闭2h，用PBST洗涤液洗涤3次，拍干；
(3)加抗原：用稀释液将纯化的PRRSV病毒、阴性细胞抗原以相同浓度(5μg/ml)相间加入一块酶标板中，100μL/孔，同时设PBS空白对照，37℃作用30min，用PBST洗涤液洗涤3次，拍干；
(4)加单抗：用稀释液将单抗3E8梯度稀释，加入酶标板中，100μl孔，同时设PBS空白对照，37℃作用30min，用PBST洗涤液洗涤3次，拍干；
(5)加酶标二抗：加入稀释的HRP--羊抗鼠IgG，100μl/孔，37℃作用30min，用PBST洗涤液洗涤3次，拍干；
(6)显色与终止：加入TMB显色液100μl孔，室温避光作用10～15min，加入2M H2SO4的终止液，50μl/孔，在酶标仪上读取OD450。以阳性孔OD值接近1，P/N值最大时，单抗和多抗的浓度组合为其最佳工作浓度。
经方阵试验测定，采用单抗3E8和抗PRRSV多克隆抗体组合，单抗量用为100ng，多抗包被量为500ng时，P/N值最大为13.28。
表3单抗与多抗最佳工作浓度的确定
Figure BDA0002932011760000081
4.2.2最佳封闭液的确定
根据确定的单抗和多抗的最佳工作浓度组合，分别以4％明胶-PBST、1％BSA-PBST、5％脱脂乳-PBST、5％小牛血清-PBST和10％小牛血清-PBST作为封闭剂作ELISA检测。不同封闭液作用后，P/N的值不同，其中小牛血清作为封闭液的结果明显优于其他几种封闭液，且10％小牛血清的封闭效果(P/N值为13.15)要优于5％小牛血清(P/N值为8.31)。
4.2.3最佳封闭时间的确定
根据确定的单抗和多抗的最佳工作浓度组合以及封闭液，采用不同的封闭时间(60min、90min、120min)进行ELISA检测，当封闭时间采用90min时，效果最佳(P/N值为13.49)。
4.2.4检测抗原、单抗、酶标抗体作用时间的确定
在确定好ELISA单抗和多抗的最佳工作浓度组合、封闭液和封闭时间后，对检测抗原、单抗和酶标抗体的采用不同的作用时间进行ELISA检测。不同作用时间的P/N值差别不显著，参考CN201010252436.1的时间，兼顾在临床上应用时需快速敏感得出结果，因此采用30min的作用时间较为适宜。
4.2.5阴阳性判定标准的确立
采用以上建立的ELISA方法对50份阴性样品进行检测，阴性样品的平均OD值为0.17，标准差SD为0.025，因此，根据平均OD值+3倍SD的方式计算，阳性判断标准为0.245，即检测样品的OD值在0.245以上时可判断为阳性。
4.3 ELISA的特异性试验
利用本公司生产使用的PRRSV-NVDC-JXA1、PEDV、CSFV、PCV1、PCV2、PPV、PRRSV-DV株作为检测抗原进行ELISA检测，其中PEDV、CSFV、PCV1、PCV2、PPV的检测均为阴性，而PRRSV-NVDC-JXA1以及PRRSV-DV检测结果均为阳性，具体结果见下表4和图4：
表4 ELISA的特异性试验
病毒 PRRSV-NVDC-JXA1 PEDV CSFV PCV1
OD 1.682 0.052 0.055 0.042
病毒 PCV2 PPV PRRSV-DV株 SPF猪血清
OD 0.046 0.041 0.976 0.032
以上结果表明，本发明所建立的ELISA方法对于PRRSV具有良好的特异性，其能有效的检测美洲型PRRSV和欧洲型PRRSV，而对于猪经典猪瘟病毒和腹泻病毒等常见病毒无反应。
4.5 ELISA敏感性试验
将纯化的PRRSV-NVDC-JXA1和PRRSV-DV株分别连续倍比稀释成不同的浓度，用建立的ELISA方法来检出最低的检出量，操作过程中设置阴性对照，结果表明，建立的ELISA试验最低检出纯化PRRSV-NVDC-JXA1的浓度为0.05μg/mL，PRRSV-DV株的浓度为0.1μg/mL。
4.6临床样品检测
取100份从临床上收集的猪肺或者淋巴结样品分别采用本发明的ELISA方法和RT-PCR方法进行检测。ELISA方法检测显示有59份阳性样品，RT-PCR检测结果也是59份样呈阳性，两者的符合率为100％。以上仅是本发明的优选实施方式，在不脱离本发明技术原理的前提下，本技术领域的普通技术人员还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测高致病性PRRSV感染的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括：包被抗PRRSV的多克隆抗体的酶标板、抗PRRSV单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG、洗涤液、显色液、终止液、样品裂解液、阳性对照和阴性对照，其特征在于：所述抗PRRSV单克隆抗体是由杂交瘤细胞株3E8分泌获得，所述将杂交瘤细胞株3E8保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），其保藏号为：GDMCC No：61302，保藏日期为2020年11月20日；保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼 广东省微生物研究所。
2.根据权利要求1所述的检测高致病性PRRSV感染的ELISA试剂盒，其特征在于，所述抗PRRSV的多克隆抗体是兔抗PRRSV的多克隆抗体。
3.根据权利要求1或2所述的检测高致病性PRRSV感染的ELISA试剂盒，其特征在于，所述兔抗PRRSV的多克隆抗体采用如下方法制备得到：利用Marc-145细胞培养PRRSV-NVDC-JXA1株，以超速离心纯化的PRRSV为抗原，与弗氏完全佐剂充分乳化后，皮下分点注射免疫60日龄家兔，5mg抗原/只，15天、30天分别用同样抗原与弗氏不完全佐剂充分乳化后各加强免疫一次，45天后颈动脉插管收集全身血液，4℃静置过夜后3000g离心15min，分离收集血清；用Protein G亲和层析纯化得到所述抗PRRSV的多克隆抗体。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的检测高致病性PRRSV感染的ELISA试剂盒，其特征在于，所述阳性对照是灭活的PRRSV-NVDC-JXA1病毒，浓度为5μg/mL。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的检测高致病性PRRSV感染的ELISA试剂盒，其特征在于，所述阴性对照是灭菌的PBS或SPF猪血清或灭菌ddH2O。
6.根据权利要求1-2中任一项所述的检测高致病性PRRSV感染的ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被抗PRRSV的多克隆抗体的酶标板采用如下方法制备得到：将抗PRRSV的多克隆抗体按照每孔500ng/100μL包被96孔酶标板，包被液为0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液，37℃包被2h后，4℃过夜，轻柔而果断地甩出孔内液体，用PBST洗涤液洗涤3次，5min每次，在吸水纸上拍干；用10％小牛血清作封闭剂，200μl/孔，37℃封闭90min，用PBST洗涤液洗涤3次，立即使用或贮藏于-20℃备用。
7.根据权利要求1-2中任一项所述的检测高致病性PRRSV感染的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法为：将处理好的待测样品加入酶标板，每孔100μL，37℃作用30min，用PBST洗涤液洗涤3次，拍干；每孔加入100ng/100μl的抗PRRSV单克隆抗体，37℃作用30min，用PBST洗涤液洗涤3次，拍干；加入1:5000的HRP--羊抗鼠IgG，100μl/孔，37℃作用30min，用PBST洗涤液洗涤3次，拍干；加入TMB显色液100μl孔，室温避光作用10～15min，加入2M H2SO4的终止液，50μl/孔，在酶标仪上读取OD450，OD值在0.245以上时判断为阳性。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的检测高致病性PRRSV感染的ELISA试剂盒在检测PRRSV中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用是指在实验室研究中检测PRRSV。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述PRRSV是指美洲型PRRSV或欧洲型PRRSV中的一种或两种。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101661042A (zh) * 2009-09-25 2010-03-03 中国农业大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心elisa试剂盒
CN101915846A (zh) * 2010-08-13 2010-12-15 扬州大学 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的elisa试剂盒及使用方法
CN101955531A (zh) * 2009-07-17 2011-01-26 南方医科大学 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗体
CN103808927A (zh) * 2014-01-27 2014-05-21 武汉中博生物股份有限公司 一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101955531A (zh) * 2009-07-17 2011-01-26 南方医科大学 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗体
CN101661042A (zh) * 2009-09-25 2010-03-03 中国农业大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心elisa试剂盒
CN101915846A (zh) * 2010-08-13 2010-12-15 扬州大学 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的elisa试剂盒及使用方法
CN103808927A (zh) * 2014-01-27 2014-05-21 武汉中博生物股份有限公司 一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
任向阳: "分别分泌抗PRV和抗PRRSV单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步应用", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士） 农业科技辑》 *
时晓丽: "猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的研制与抗原捕获ELISA抗体检测方法的建立", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士） 农业科技辑》 *
邵蕾: "猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备及初步应用", 《中国博硕士学位论文全文数据库（硕士） 农业科技辑》 *
马玲: "猪PRRSV HH08株单克隆抗体制备及抗原捕捉ELISA方法建立", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士） 农业科技辑》 *

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