CN104165998B - Prrsv基因标记疫苗株elisa鉴别诊断试剂盒及方法和应用 - Google Patents

Prrsv基因标记疫苗株elisa鉴别诊断试剂盒及方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒，所述试剂盒包含25aa多肽抗原，该25aa多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒，以PRRSV基因标记疫苗株(rHN4‑Δ25+NP49株)特异性标记区域缺失的25aa多肽作为包被抗原，具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，可快速、准确地区分传统PRRS疫苗免疫与标记疫苗免疫猪的血清抗体，同时可快速、准确地鉴别诊断出PRRSV基因标记疫苗株与自然感染毒株，对于PRRS基因标记疫苗株的临床广泛应用具有重要意义。

Description

PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒及方法和应用
技术领域
本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测技术领域，具体涉及一种PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒及方法和应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的全球范围内严重危害养猪业的传染病。1987年首先在美国发现该病，以各年龄段母猪繁殖障碍和呼吸疾病为特征症状的传染性疾病在美国和加拿大地区发现，并迅速向世界各地蔓延；1996年我国首次分离出PRRSV，2006年高致病性猪繁殖与呼吸综合(HP-PRRS)大范围爆发，给我国养殖业带来巨大损失，PRRS的监测和防控成为重要课题。目前，猪繁殖与呼吸综合征流行毒株包括PRRS经典毒株、PRRS经典疫苗株、PRRS高致病性毒株、PRRS高致病性疫苗株等，众多毒株并存使我们对该病监测的难度加大。该病的流行特点及其病原特性决定其高度传染性，疫苗是目前预防该病的主要手段。国内使用的疫苗主要包括弱毒疫苗和灭活疫苗，其中弱毒疫苗由于其具有抗体产生快、持续时间长和保护力强等特点，在临床上被广泛使用于控制PRRS的流行，但传统的弱毒疫苗在抗体监测过程中无法区分野毒和疫苗毒感染。基于此，本实验室在PRRSV弱毒疫苗HuN4-F112株反向遗传平台的基础上，将NSP2的复制非必须区域(Δ508-532)进行缺失，同时在该区域插入新城疫病毒NP蛋白末端49个氨基酸(NP49)作为标记，成功构建了双标记基因工程弱毒疫苗株(rHN4-Δ25+NP49株)，该疫苗株由于具备缺失和插入正、负双标记，这就为特异性区分野毒感染和实现PRRS有效防控奠定了坚实基础。
发明内容
本发明要解决目前由于众多种类PRRS疫苗的广泛使用，加大了对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染鉴别诊断难度的技术问题，提供一种PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒，该试剂盒以基因工程标记疫苗株(rHN4-Δ25+NP49株)的特征缺失的25个氨基酸(25aa)作为包被抗原，不仅能有效区分传统PRRS疫苗免疫与标记疫苗免疫猪的血清抗体，而且能有效区分出PRRSV基因标记疫苗株与自然感染毒株，其灵敏度高、特异性强、重复性好。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
在本发明的一个方面，提供了一种PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒，所述试剂盒包含25aa多肽抗原，该25aa多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明采用特异性标记区域缺失的25个氨基酸(25aa)多肽作为包被抗原，保证抗原的特异性和纯度，避免了其他杂蛋白混杂存在干扰。而且25aa相对分子量小、结构简单，降低了与其他病毒细菌抗体交叉反应的可能性，该25aa合成肽抗原呈水溶性，可较好的包被于酶标板，操作省时方便。该25aa特异性多肽抗原不同于PRRSV全病毒抗原或高表达量的融合蛋白抗原，由于PRRSV感染猪产生的抗体大部分是针对N蛋白，血清样品中针对25aa多肽抗原的抗体相对较少，因此选择纯度高的25aa多肽作为包被抗原可以明显提高针对25aa抗体检测的敏感度和特异性。
所述试剂盒还包含ELISA酶标板、封闭液、血清稀释液、酶标二抗、显示液、终止液、标准阳性血清、标准阴性血清。
优选的，25aa多肽抗原的包被浓度为500ng/孔。
优选的，所述封闭液为5％重量浓度的脱脂乳。
优选的，所述血清稀释液为2％重量浓度的牛血清白蛋白；所述血清稀释液对血清的稀释度为1∶40。
优选的，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪抗体，其稀释度为1∶8000。
在本发明的另一方面，还提供了一种非诊断目的的PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别方法，包括以下步骤：
用25aa多肽抗原包被ELISA酶标板，该25aa多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
将待测血清与包被抗原作用后，依次加入酶标二抗、显色液和终止液；
利用酶标仪读取吸光度值OD450nm，并按公式：S/P＝(待测血清样品OD-阴性对照OD)/(阳性对照OD-阴性对照OD)，计算待测血清样品的S/P值；
待测血清样品S/P值≥临界值的判为阳性，S/P值＜临界值的判为阴性，所述临界值是通过ROC统计学分析方法获得的当灵敏度和特异度数值之和最大时对应的S/P值。
所述待测血清的稀释度为1∶40。
在本发明的另一方面，还提供了上述试剂盒在制备鉴别诊断PRRS基因工程标记疫苗免疫猪的产品中的应用。
本发明PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒，以基因工程标记疫苗株(rHN4-Δ25+NP49株)的特征缺失的25个氨基酸(25aa)作为包被抗原，具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，可快速、准确地区分传统PRRS疫苗免疫与标记疫苗免疫猪的血清抗体，同时可快速、准确地鉴别诊断出PRRSV基因标记疫苗株与自然感染毒株，对于PRRS基因标记疫苗株的临床广泛应用具有重要意义。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例2的25aa-ELISA反应条件优化结果图；
图2是本发明实施例3的25aa-ELISAROC曲线图；
图3是本发明实施例6的25aa-ELISA检测HuN4-F112血清样品结果图。
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克J，拉塞尔DW，著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.分子克隆实验指南，第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)rHN4-Δ25+NP49株是一种用于预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征的新型基因标记弱毒疫苗候选株，为了配合该基因标记疫苗株的免疫效果评价，本发明以基因工程标记疫苗株(rHN4-Δ25+NP49株)的特征缺失的25个氨基酸(25aa，SEQID NO：1)作为包被抗原，建立一种简便、特异的25aa-ELISA方法。本发明通过对25aa-ELISA反应条件的优化，确定抗原最适包被浓度为500ng/孔，5％脱脂乳4℃过夜封闭，血清最佳稀释度为1∶40，酶标二抗最佳稀释度为1∶8000，抗体最佳作用时间及底物选择和显色条件和时间等，同时确定其阴阳性临界值S/P判定标准为0.15，批内和批间重复实验结果显示其变异系数均低于10％，表明该方法具有良好的重复性。对临床血清检测结果显示本发明方法及试剂盒与IDEXX试剂盒检测结果的符合率为94.84％，采用25aa负标记ELISA试剂盒检测HuN4-F112疫苗免疫猪血清，结果显示从免疫后第21天可检测25aa特异性抗体，该抗体至少可持续存在126天。本发明建立的25aa负标记ELISA检测方法和试剂盒为今后PRRSV基因工程标记弱毒疫苗株的临床应用提供了有利保障。
实施例1抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定
1.血清和试剂
PRRS阴性血清、PRRSV HuN4-F112阳性血清、PRRSV rHN4-Δ25+NP49株阳性血清、猪伪狂犬(PRV)阳性血清、猪瘟(CSFV)阳性血清和猪流行性腹泻(PEDV)阳性血清，均为本实验室保存。猪细小病毒(PPV)阳性血清、猪圆环2型病毒(PCV-2)阳性血清为哈尔滨兽医研究所猪病研究室提供；
辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗猪IgG购自Sigma公司；脱脂乳购于BD公司；TMB显色液、脱脂乳、牛血清蛋白(BSA)购自AMRESCO公司。PRRSV抗体检测试剂盒HerdCheckPRRS X3购自IDEXX公司。
2.抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定
将特异性缺失区域25aa多肽抗原(SEQ ID NO：1)用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释成10倍梯度进行包被(10μg/mL至0.125μg/mL)，每孔包被100μL；4℃包被过夜；5％脱脂乳于37℃封闭2h。PRRSV HuN4-F112株阳性血清、阴性血清分别1∶20、1∶40、1∶80、1∶160稀释，每孔100μL，37℃孵育1h进行ELISA方阵试验。HRP标记的山羊抗猪IgG抗体1∶10000倍稀释，每孔100μL，37℃孵育1h。加入100μL TMD显色底物，室温避光显色10min。50μL2mol/L H2SO4终止反应。测定各孔OD450nm值，确定最佳抗原包被浓度与血清稀释浓度。
3.结果
抗原的初始浓度为1mg/ml，通过棋盘法确定最佳抗原包被浓度与血清稀释浓度。由表1可知，抗原和抗体稀释倍数的增加，阳性血清的OD值存在下降趋势，阴性血清的OD值变化不显著。选择阴性血清的OD450nm值≤0.100，阳性血清的OD450nm值≥0.200，阳性血清和阴性血清OD450nm比值P/N≥2的最大稀释度，即血清的稀释度为1∶40，抗原的稀释浓度为1∶200，每孔包被量为500ng抗原为最佳包被量。
表1棋盘法测定阳性血清和阴性血清的OD450nm值
实施例2最佳反应条件的确定
1.方法
从包被时间、封闭液的选择、封闭时间、血清稀释液、酶标二抗稀释度、底物反应时间等方面进行反应条件的优化，其他条件不变，用PRRS HuN4-F112阳性血清和阴性血清进行间接25aa-ELISA测定，用酶联检测仪读出OD450nm值，比较各组阴、阳性血清的OD450nm值和P/N值，确定最佳反应条件。
2.结果
2.1封闭液的确定
选择5％脱脂乳、1％BSA、2％BSA、10％胎牛血清作为封闭液。比较各组阴、阳性血清的OD450nm值和P/N值(表2)，以5％脱脂乳为封闭液时，阴性血清OD450nm值最小，P/N值最大，选择该条件为合适的封闭液。
表2封闭液的确定
2.2封闭时间的确定
封闭时间确定中，在37℃条件下封闭，随着时间的增长，阳性血清和阴性血清的OD450nm值增大，但是P/N值减小。而4℃过夜条件下，P/N值明显高于其他条件(表3)，选择4℃过夜为最佳封闭时间。
表3封闭时间的确定
2.3血清稀释液的选择
在PBST中分别加入1％BSA、2％BSA、10％胎牛血清和IDEXX稀释液作为血清稀释液进行ELISA测定，结果表明，不同血清稀释液下，阴性血清的OD450nm值均小于0.100；2％BSA为稀释液时，阳性血清的OD450nm值最大，且P/N值最大为7.287(表4)，选择2％BSA为血清稀释液。
表4血清稀释液的确定
2.4血清最佳反应时间的确定
用优化的血清稀释液将已知的阴、阳性血清做1∶40稀释后，于室温下分别作用30、60、120min，进行ELISA检测。阳性血清和阴性血清的P/N值随着血清反应时间增加而增大，选择最短反应时间30min为最佳时间(表5)。
表5血清反应时间的确定
2.5酶标二抗的稀释度确定
其他反应条件保持不变，不同梯度稀释酶标二抗，OD450nm值存在显著差异，阳性血清OD450nm值范围为0.459到0.107，阴性血清OD450nm值范围为0.146到0.034，选择阴性血清OD450nm值小于0.100，且P/N值最大者，即1∶8000为二抗最佳稀释度(表6)。
表6酶标抗体稀释度的确定
2.6酶标二抗的作用时间
其他条件不变，仅改变酶标二抗的作用时间，测定OD450nm值。随着反应时间的增长，阳性血清的OD450nm值逐步增大，在作用时间45min、60min、120min时，阴性血清OD值变异系数CV％大于10％，在满足P/N值大于2前提下，选择30min为作用时间(表7)。
表7酶标抗体作用时间的确定
2.7底物反应时间的确定
其他条件不变，随着底物反应时间延长，阴性血清和阳性血清OD450nm值都是逐渐变大，比较各点的P/N值，选择20min作为反应时间(表8)。
表8底物反应时间的确定
通过反应条件的摸索与优化(如图1)，确定反应条件为4℃过夜为抗原最佳包被条件，封闭液为5％脱脂乳，4℃过夜封闭，2％BSA为血清稀释液，作用时间为30min，二抗稀释度为1∶8000，作用时间为30min，TMB底物作用时间为20min。
实施例3临界值的确定
收集临床动物实验的血清，依照已经优化条件25aa-ELISA方法，测定OD450nm值，根据下述公式计算血清样品的S/P值：
S/P＝(待测血清样品OD-阴性对照OD)/(阳性对照OD-阴性对照OD)。
待测样品S/P值≥临界值的判为阳性，S/P值＜临界值的判为阴性，所述临界值是通过ROC统计学分析方法获得的当灵敏度和特异度数值之和最大时对应的S/P值。
ROC曲线是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标，通过SPSS软件绘制ROC曲线，得出25AA-ELISA检测方法的灵敏度和特异度。数据处理分析，得出S/P值的阴阳性血清临界值。
结果：检测临床血清样品300份，以IDEXX检测结果为“金标准”，阴性血清为148份，阳性血清为152份。检测结果输入Excel，再导入SPSS软件分析，绘制ROC曲线。ROC曲线(如图2)是以灵敏度为纵坐标，以1-特异性为横坐标所画的曲线。ROC曲线下面积为0.984(95％CI：0.974～0.994)。
ROC分析同时列出了从-0.124到5.915连续193个切点对应的灵敏度和1-特异度，将该列表从SPSS导出到Excel，对各切点灵敏度和特异度求和，得到的数值最大值为1.880，对应的S/P值为0.154，此值为阴阳性临界值，此时，灵敏度为93.4％和特异度94.6％。
实施例4特异性实验
以建立的间接ELISA方法，检测CSFV、PRV、PPV、PPEDV、PRRS rHuN4-F112-Δ508-532+NP49阳性血清，同时设立PRRSV HuN4-F112株阳性血清和阴性血清为对照，确定25aa多肽抗原是否与其他常见猪病阳性血清发生交叉反应。
结果：通过检测CSFV、PRV、PPV、PEDV、PRRS rHN4-Δ25+NP49阳性血清，测定OD450nm值为0.087、0.075、0.099、0.073、0.078，判定25aa多肽抗原与其他常见猪病阳性血清没有交叉反应。
实施例5重复性实验
批内重复试验选取6份PRRS HuN4-F112抗体水平不同的猪血清，在相同试验条件下进行检测，每份血清平行做3个重复，对检测结果进行统计学分析；批间重复试验选取上述血清，在相同实验条件下，使用3个不同时间包被的ELISA检测板进行检测，每份血清平行做2个重复，对检测结果进行统计学分析。
重复性试验选取6份PRRS HuN4-F112抗体水平不同的猪血清，在相同试验条件下进行检测，实验结果(表9)表明，批内和批间重复性试验的变异系数(CV％)小于10％。
表925aa-ELISA批内重复试验和批问重复试验结果
实施例625aa-ELISA鉴别诊断试剂盒的组成及应用
1.25aa-ELISA鉴别诊断试剂盒的组成
将特异性缺失区域25aa多肽抗原(包被抗原)、待包被ELISA酶标板、包被缓冲液、封闭液、血清稀释液、酶标二抗(本发明实施例中优选HRP标记的山羊抗猪IgG抗体为酶标二抗)、显示液、终止液、洗涤液、标准阳性血清、标准阴性血清，装配成试剂盒，组装后置于合适条件保存。
其中，在选择洗涤液时，25aa-ELISA实验选用PBST。通过增大25aa-ELISA的洗涤液盐离子浓度，可以有效去除非特异性影响。洗涤时，使用PBST需要40min才能有效去除非特异性，当增大盐离子浓度后，洗涤时间可缩短至15min。
2.用上述试剂盒进行25aa-ELISA方法检测
收集临床血清样品310份，分别采用间接25aa-ELISA方法和IDEXX公司的猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒(IDEXX HerdPRRS X3)同时进行检测，比较两种检测方法的结果，计算两者之间的符合率。
5头实验猪，分别注射同剂量的PRRS HuN4-F112，采集血清时间为0天到126天(18周)。使用间接25aa-ELISA方法对已知背景的HuN4F112血清的进行检测，通过上述实施例3确定临界值的方法确定临界值，分析检测临床血清中特异性抗体可检测为阳性的持续时间。
结果：应用建立的间接25aa-ELISA方法与IDEXX检测结果比较，对310份血清样品进行判定，结果见表10，两者的阳性符合率为95.00％，阴性符合率为94.67％，总符合率达到94.84％。
表10血清样品的IDEXX与25AA-ELISA检测结果比较
使用间接25aa-ELISA方法对临床已知背景的HuN4F112血清进行检测，通过检测OD值进行S/P值判定，从第21天开始出现阳性，持续到126天可判定为阳性抗体(见图3)。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>中国农业科学院上海兽医研究所
<120>PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒及方法和应用
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Ser Arg Arg Ala Pro Lys Leu Met Thr Pro Leu Ser Gly Ser Ala Pro
1 5 10 15
Val Pro Ala Pro Arg Arg Thr Val Thr
20 25

Claims (9)

1.一种PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含25个氨基酸的多肽抗原，该25个氨基酸多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含ELISA酶标板、封闭液、血清稀释液、酶标二抗、显示液、终止液、标准阳性血清、标准阴性血清。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述25个氨基酸多肽抗原的包被浓度为500ng/孔。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为5％重量浓度的脱脂乳。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述血清稀释液为2％重量浓度的牛血清白蛋白。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述血清稀释液对血清的稀释度为1：40。
7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪抗体，其稀释度为1：8000。
8.一种非诊断目的的PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
用25个氨基酸多肽抗原包被ELISA酶标板，该25个氨基酸多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示；
将待测血清与包被抗原作用后，依次加入酶标二抗、显色液和终止液；
利用酶标仪读取吸光度值OD450nm，并按公式：S/P＝(待测血清样品OD-阴性对照OD)/(阳性对照OD-阴性对照OD)，计算待测血清样品的S/P值；
待测血清样品S/P值≥临界值的判为阳性，S/P值<临界值的判为阴性，所述临界值是通过ROC统计学分析方法获得的当灵敏度和特异度数值之和最大时对应的S/P值。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测血清的稀释度为1：40。
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Title
《表达外源基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染性克隆的构建及病毒拯救》;徐彦召等;《农业生物技术学报》;20120531;第20卷(第5期);全文 *

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