CN103293311A

CN103293311A - 一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争elisa免疫试剂盒

Info

Publication number: CN103293311A
Application number: CN2013101921517A
Authority: CN
Inventors: 刘永生; 张�杰; 丁耀忠; 陈豪泰; 周建华; 马丽娜
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2013-05-22
Filing date: 2013-05-22
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明公开了一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫试剂盒，所述试剂盒包括抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的酶标记物。本发明的有益效果为：本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫检测试剂盒可以准确定量的测定猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒的抗体效价，其操作简单，所需时间短，可以用于大量样品检测和流行病学调查，和WHO、OIE推荐的试验方法具有良好的一致性。

Description

一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫试剂盒

技术领域

本发明涉及生物疫苗制备技术领域，具体涉及一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）在全球范围内对养猪业造成了巨大的经济损失。该病于20世纪八十年代首次几乎同时出现在德国和美国，此后，PRRS在全球范围内爆发和流行。2006年春，在中国中部暴发的“无名高热”即猪高致病性猪繁殖与呼吸综合征（highly pathogenic PRRS ，PHFD）以高达20%～100%的死亡率引起了社会广泛的关注。

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是导致该病主要病原。其属于动脉炎病毒科，动脉炎病毒属。各种年龄的猪均易感，妊娠母猪感染后可引起流产、死胎、木乃伊胎及弱胎，仔猪可发生呼吸障碍和高病死率，其他猪常呈隐性感染或仅出现轻度的呼吸道症状。PRRS病毒包括欧洲型和美洲型两种主要抗原型，分别以LV和VR-2332为代表株，型间具有明显的抗原交叉反应性。具有63%左右的同源性。由于其对养猪业的严重威胁性，国际兽疫局（1996）已将本病例为B类传染病。

目前检测PRRSV的方法主要有病毒分离鉴定、间接免疫荧光试验和血清中和试验等诊断方法。以上技术要么工作量太大，要么要操作活病毒，要么特异性和敏感性不足，要么诊断时间过长，影响了疫病控制，要么不能够方便的进行临床检测。因此，开发一种具有特异性、敏感性良好，适用于临床检测，劳动强度不高，检测时间较短，检测费用较低的抗体检测试剂盒具有良好的应用价值和市场价值。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体间接竞争ELISA检测试剂盒，通过标记的PRRSV单克隆抗体、标准血清和包被抗原，能够简单快速准确定量的检测猪血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体效价。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫试剂盒，所述试剂盒包括抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的酶标记物。

进一步的，上述的一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫试剂盒，所述试剂盒还包括已包被抗原的酶联板、标准血清、TMB显色液、终止液和PBST洗涤液。

进一步的，上述的一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫试剂盒，所述已包被抗原的酶联板中，包被抗原为：

利用猪繁殖与呼吸综合征病毒的部分或全部核蛋白基因的原核表达系统表达的纯化产物，或

利用猪繁殖与呼吸综合征病毒的部分或全部核蛋白基因的CHO-K1细胞表达的纯化产物。

进一步的，上述的一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫试剂盒，所述抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株NA N002，相关单抗见论文文献《猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白重组抗原及单克隆抗体的制备及鉴定》（中国农业科学院研究院，王猛，2011年6月，硕士论文，分类号S855.3）腹腔接种BALB/C小鼠后纯化的腹水。

上述抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株NA N002，申请人已提供了提供了保证从申请日其二十年内向公众发放该细胞株的证明。

本发明的第二个目的是提供了一种检测血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价的方法，包括以下步骤：

取待检猪血清50μl，在EP管中混合等量的酶标单克隆抗体，加入96孔板中，37℃反应1 h，取出弃掉反应液，加PBST洗涤3遍，每次3分钟，加入TMB显色液，37℃显色15min，取出加入100μl的反应终止液，在酶标仪上读取OD450数值。

其中，包被抗原可以是猪繁殖与呼吸综合征病毒的部分或全部核蛋白的原核表达系统重组蛋白或真核表达系统表达的部分或全部重组核蛋白。

其酶标抗体指的是抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的NA N002 单克隆抗体。

使用的已知效价的标准血清，指的是猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫猪后收获血清后，与WHO和OIE标准血清比对标定，用于标准曲线绘制的标准血清。

使用的标准血清，来自猪的猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗血清。

具体制备过程为：

1、包被抗原的制备和包被,包被抗原大小和特异性见图1：

包被抗原包括以下2类：

（1）利用猪繁殖与呼吸综合征病毒的部分或全部核蛋白基因的原核表达系统表达的纯化产物，包被时稀释成25μg/ml，取100μl/孔的量加到酶联板上，4℃包被过夜。

（2）利用猪繁殖与呼吸综合征病毒的部分或全部核蛋白基因的CHO-K1细胞表达的纯化产物，包被时稀释成25μg/ml，取100μl/孔的量加到酶联板上，4℃包被过夜。

2、酶联板的封闭与保存：

上述酶联板以PBST洗涤3遍，每孔加入100 μl封闭液（5%脱脂奶粉和0.01%的硫柳汞），37℃放置1 h。弃掉洗涤液，PBST洗涤3遍，采用铝箔袋真空封口，4℃保存。

3、标准血清的制备：

以猪繁殖与呼吸综合征病毒按照免疫程序接种40 kg的猪，采集免疫前和免疫后2周的血清，分离血清，测定血清抗体效价，制成0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0国际单位（IU）/ml的标准血清，再次进行抗体效价测定，无菌分装备用。

4、酶标抗体的制备和标记：

将抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株NA N002 腹腔接种BALB/c小鼠腹腔内，小鼠接种细胞大约1周后，可见其腹部明显膨大，通过灭菌的针头，收集腹水，收集的腹水经3000 rpm离心15 min，收集上层清液，获得单克隆抗体。

经饱和硫酸铵初步纯化的抗体，先用0.45μm滤器过滤，除去透析后存在的小颗粒杂质；对其用protein A sephoraseq亲和层析对初步纯化的抗体进行纯化。收集的纯化抗体溶液，先用超滤管超滤浓缩后，测定其中蛋白浓度，用改良的过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶（HRP）标记，用凝胶层系纯化酶标抗体后，分装，置于-20℃保存。

5、试剂盒的其他成分、组装及保存：

TMB显色液购自Sigma公司、终止液为1.25M的硫酸溶液，10×PBST为实验室配制（NaCl为80g，KCl为2g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.12g，KH₂PO₄为2g，pH7.4，定容止1000ml)。真空包装铝箔盒为定做。坐标纸一张，说明书一份。试剂盒保存在4℃冰箱中。

6、血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价的测定程序：

取待检猪血清50μl，在EP管中混合等量的的酶标单克隆抗体，加入96孔板中，37℃反应1h，取出弃掉反应液，加PBST洗涤3遍，每次3分钟，加入TMB显色液37℃显色15 min，取出加入100μl的反应终止液，在酶标仪上读取OD450数值。

以标准血清的OD450为横轴，以已知抗体效价为纵轴，在坐标纸上绘制标准曲线，然后根据待检血清样本测定的OD450值，在标准曲线上得出对应的抗体效价（IU）/ml。

本发明的有益效果为：本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫检测试剂盒可以准确定量的测定猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒的抗体效价，其操作简单，所需时间短，可以用于大量样品检测和流行病学调查，和WHO、OIE推荐的试验方法具有良好的一致性。

附图说明

图1为原核表达系统或CHO-K1细胞表达的纯化产物的western blot检测结果，其中M为蛋白marker；1为表达的猪繁殖与呼吸综合征病毒的核蛋白基因；2阴性对照。

图2为猪血清OD450值与相应的中和抗体效价的标准曲线示意图。

具体实施方式

实施例1：

试剂盒的制备方法：

1、猪繁殖与呼吸综合征病毒原核表达系统表达的核蛋白的制备和包被：

猪繁殖与呼吸综合征病毒的部分或全部核蛋白基因的重组核蛋白接种大肠杆菌表达系统在37℃培养16 h，收集培养物进行重组蛋白纯化，包被时用包被液稀释成100μg/ml，取100μl/孔的量加到酶联板上，4℃包被过夜；以PBST洗涤3遍，每孔加入100μl封闭液（5%脱脂奶粉和0.01%的硫柳汞），37℃放置1h。弃掉洗涤液，PBST洗涤3遍，采用铝箔袋真空封口，4℃保存。

2、标准血清的制备：

以实验室纯化的PRRSV病毒对猪进行2次免疫，免疫前及末次免疫后14天，分别采取血清，分离血清，以中和试验检测血清中中和抗体的效价。检测结果表明，免疫前中和抗体效价为0，免疫后中和抗体效价为43.3 IU/ml，以免疫血清将该免疫血清稀释成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0国际单位（IU）/ml的标准血清，再次进行抗体效价测定。无菌分装作为标准血清，贮存备用。

3、酶标抗体的制备和标记：

将抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株NA N002腹腔接种BALB/c小鼠腹腔内，小鼠接种细胞大约1周后，可见其腹部明显膨大，通过灭菌的针头，收集腹水，收集的腹水经3000rpm离心15min，收集上层清液，获得单克隆抗体。

4、抗原抗体最适宜浓度的选择：

棋盘滴定确定酶标抗体的工作浓度为1:3000，相应抗原的最适包被浓度为25μg/ml，如表1所示为棋盘滴定酶标抗体和抗原的工作浓度的OD450。

。

5、试剂盒的组成和使用方法：

5.1试剂盒组成：

按照表2所列的猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体竞争ELISA检测试剂盒内容，装配试剂盒，组成后装于4℃保存。

。

5.2试剂盒说明书：

（1）以灭菌水将PBST（10×）洗液稀释至250 ml，以灭菌水将酶标抗体（10×）稀释至5 ml；

（2）打开包装袋，取出预包被抗原的酶标板，以1×的PBST洗板3次，每次3分钟；

（3）在EP管中混合50μl的的的酶标单克隆抗体与50μl的不同效价的标准血清，依次加入A1～G1孔内。在EP管中混合50μl的的的酶标单克隆抗体与50μl的不同效价的标准血清，依次加入酶标板其他孔内，37反应1h；

（4）弃掉孔内液体，加PBST洗涤3遍，每次3分钟；

（5）加入TMB 37℃15min，取出加入100μl的反应终止液，在酶标仪上读取OD450数值；

（6）准血清的OD450为横轴，以已知抗体效价为纵轴，在坐标纸上绘制标准曲线，然后根据待检血清样本测定的OD450值，在标准曲线上得出对应的抗体效价（IU/ml）。

实施例2：

试剂盒的制备方法：

1、猪繁殖与呼吸综合征病毒真核表达系统表达的核蛋白的制备和包被：

猪繁殖与呼吸综合征病毒的部分或全部核蛋白基因的重组核蛋白接种转染CHO-K1细胞，37℃培养2～3天，收集细胞培养物，反复冻融2次，收获培养液，包被时用包被液稀释成100 μg/ml，取100 μl/孔的量加到酶联班上，4℃包被过夜；以PBST洗涤3遍，每孔加入100 μl封闭液（5%脱脂奶粉和0.01%的硫柳汞），37℃放置1 h。弃掉洗涤液，PBST洗涤3遍，采用铝箔袋真空封口，4℃保存。

2、标准血清的制备：

3、酶标抗体的制备和标记：

经饱和硫酸铵初步纯化的抗体，除去透析后存在的小颗粒杂质；对其用protein A sephoraseq亲和层析对初步纯化的抗体进行纯化。收集的纯化抗体溶液，先用超滤管超滤浓缩后，测定其中蛋白浓度，用改良的过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶（HRP）标记，用凝胶层系纯化酶标抗体后，分装，置于-20℃保存。

4、抗原抗体最适宜浓度的选择：

棋盘滴定确定酶标抗体的工作浓度为1:3000，相应抗原的最适包被浓度为25μg/ml，如表3所示为棋盘滴定酶标抗体和抗原的工作浓度的OD450。

Figure 2013101921517100002DEST_PATH_IMAGE002

。

5、试剂盒的组成和使用方法：

5.1试剂盒组成：

按照表4所列的猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体竞争ELISA检测试剂盒内容，装配试剂盒，组成后装于4℃保存。

。

5.2 试剂盒说明书

（3）在EP管中混合50 μl的的的酶标单克隆抗体与50 μl的不同效价的标准血清，依次加入A1～G1孔内。在EP管中混合50 μl的的的酶标单克隆抗体与50 μl的不同效价的标准血清，依次加入酶标板其他孔内，37反应1 h；

（4）弃掉孔内液体，加PBST洗涤3遍，每次3分钟；

（5）加入TMB 37℃ 15 min，取出加入100 μl的反应终止液，在酶标仪上读取OD450数值；

实施例3：

1、特异性试验：

用所建立的竞争 ELISA（NA N002 -ELSA）法检测猪口蹄疫阳性血清、猪细小病毒阳性血清、猪圆环病毒-2型和猪水疱病病毒血清各30份，同时猪繁殖与呼吸综合征病毒标准阳性血清30份以及阴性质控血清30份作为阳性和阴性对照，分析该法的特异性。检测猪口蹄疫阳性血清、猪细小病毒阳性血清、猪圆环病毒-2型、猪水疱病病毒血清和阴性血清的反应均为阴性结果，只有猪繁殖与呼吸综合征病毒标准阳性血清呈现阳性结果，结果如下表5，表5为建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒竞争ELISA的特异性试验表明其有很好的特异性，从根本上保证了检测结果的准确和可靠性。

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2、敏感性试验

利用IF、目前应用的IDEXX间接ELISA试剂盒以及本发明的竞争ELISA（NA N002 -ELISA）检测临床样品60份。结果表明，本发明的竞争ELISA（NA N002 -ELISA）的检测结果高于IF，其中IF的阳性检出百分率为43.3%，与IDEXX间接ELISA的检测结果一致，检出阳性结果百分率都为46.75，如表6所示为IF、IDEXX间接ELISA以及本发明的竞争ELISA检测临床样品结果，比S. Dea在2010年报道的同类方法其敏感性明显要高。其中，如图2所示，本发明的竞争ELISA（NA N002 -ELISA）最佳线性范围为 19.82～2IU／ml，最低检出限为0.5IU／ml。

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最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的酶标记物。

2.根据权利要求1所述的一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括已包被抗原的酶联板、标准血清、TMB显色液、终止液和PBST洗涤液。

3.根据权利要求2所述的一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫试剂盒，其特征在于，所述已包被抗原的酶联板中，包被抗原为：

4.根据权利要求3所述的一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫试剂盒，其特征在于，所述抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株NA N002腹腔接种BALB/C小鼠后纯化的腹水。