CN105296434A - 杂交瘤细胞株及其分泌的抗口蹄疫o型病毒的单克隆抗体与应用 - Google Patents
杂交瘤细胞株及其分泌的抗口蹄疫o型病毒的单克隆抗体与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105296434A CN105296434A CN201510737022.0A CN201510737022A CN105296434A CN 105296434 A CN105296434 A CN 105296434A CN 201510737022 A CN201510737022 A CN 201510737022A CN 105296434 A CN105296434 A CN 105296434A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- 1f2anti
- foot
- monoclonal antibody
- mouth disease
- mya98
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明杂交瘤细胞株及其分泌的抗口蹄疫O型病毒的单克隆抗体与应用，使用可以诱发机体产生免疫反应的口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒作为免疫原得到能持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F2，并由该细胞株分泌得到单克隆抗体1F2anti。该单克隆抗体能够特异性地识别口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒，可用于检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒，并具有高特异性、高灵敏度的优点，可应用在口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的检测、疫苗生产、流行病学研究中。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域中的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体与应用，特别是涉及口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞株以及该抗体在检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒中的应用。
背景技术
口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病，最易感染的动物是牛、猪、骆驼、羊、鹿等，野猪、野牛等野生动物也易感染此病。口蹄疫在亚洲、非洲和中东以及南美均有流行，在非流行区也有散发病例。
口蹄疫发病后一般不致死，但会使病兽的口、蹄部出现大量水疱，高烧不退，使实际畜产量锐减。另外，有个别口蹄疫病毒的变种可传染给人。因此，每次爆发后只能屠宰和集体焚毁染病牲畜以绝后患。由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少，被称为畜牧业的“头号杀手”。我国对口蹄疫的预防主要通过疫苗注射接种，发生口蹄疫的则捕杀。
FMDV的免疫是依赖T细胞的口蹄疫病毒(FMDV)目前有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非口蹄疫病毒1、2、3型)和Asia1(亚洲1型)7个血清型。各型之间几乎没有免疫保护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病，因此常常用多价疫苗来降低患口蹄疫的风险。FMDV属于小RNA病毒科(Picornaviridae)口疮病属(Aphthovirus)，是偶蹄类动物高度传染性疾病(口蹄疫)的病原。在病毒的中心为一条单链的正链RNA，由大约8000个碱基组成，是感染和遗传的基础；周围包裹着的蛋白质决定了病毒的抗原性、免疫性和血清学反应能力；病毒外壳为对称的20面体。口蹄疫O型毒株是国内流行较广的一类亚型，其中，口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒是口蹄疫O型的一个毒株。O/Mya98/XJ/2010株由中国兽医药品监察所提供，属于东南亚拓扑型(SEA)Mya-98谱系，该毒株在BHK21细胞上遗传稳定，免疫原性好，疫苗的交叉保护性高，每毫升抗原表达量可达2微克以上，每毫升TCID50可达107.5以上。
疫苗接种是特异性预防FMDV的可靠和有效手段，安全有效的疫苗是成功预防、控制乃至最终消灭FMDV的先决条件。FMDV弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗都具有良好的免疫原性，在预防和控制FMDV的过程中发挥着重要作用。随着分子生物学技术的飞速发展，FMDV基因工程疫苗如亚单位疫苗、可饲疫苗、合成肽疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗等不断涌现。目前，常见的是口蹄疫多种毒株制备的多价疫苗，如口蹄疫O型(O/GX/09-7)和口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)混合制备成的双组份疫苗。疫苗生产企业目前常采用蔗糖密度梯度离心法测量口蹄疫病毒的含量，但是无法对多组份疫苗的某种毒株进行单独定量。
基于抗原抗体的免疫学检测，因操作简单、灵敏度高、特异性强、仪器设备便宜等优点已经被广泛使用在临床检测上。目前，市场上偶见能够检测口蹄疫抗原的酶联免疫检测试剂盒，但是大都采用了多克隆抗体制成，如中国农业科学院兰州兽医研究所开发、生产的O型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒，该试剂盒已经申报专利(申请公布号CN103076451A)，该试剂盒采用了O型口蹄疫的兔抗血清和豚鼠抗血清两种多克隆抗体制成，但是无法区分O型的不同毒株，如缅甸98株(O/Mya98/BY/2010株)和广西株(O/GX/09-7株)，因而就无法对多组份O型疫苗中的每种O型口蹄疫146S抗原进行单独定量，其主要的原因就在于多克隆抗体针对多种抗原表位，而不同的血清型尤其是同一血清型的不同毒株之间存在相同的抗原表位。因此，采用多克隆抗体去特异性检测口蹄疫不同的毒株是不可能成功的，尤其是同一血清型不同的毒株。
单克隆抗体因其针对的抗原位点单一，特异性较好，并且生产的重复性优于多克隆抗体，目前在很多临床检测中被采用。国内偶见有制备口蹄疫单克隆抗体的研究，但尚未见到用于特异性检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供用于检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体。
本发明以口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒为免疫原免疫小鼠，获得持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为1F2，该细胞株已于2015年06月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10896。
由杂交瘤细胞株1F2分泌的单克隆抗体命名为1F2anti，来源于小鼠属小鼠(Musmusculus)，也属于本发明的保护范围。
1F2anti的重链可变区具有序列表中的SEQIDNo：1的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒特异结合的多肽，轻链可变区具有序列表中的SEQIDNo：2的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒特异结合的多肽。
序列表中的SEQIDNo：1由113个氨基酸残基组成，序列表中的SEQIDNo：2由98个氨基酸残基组成。
编码单克隆抗体1F2anti的基因(1F2anti)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：3的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：1的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：4的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：2的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQIDNo：3由339个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo：1的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQIDNo：4由294个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo：2的氨基酸残基序列的蛋白质。
含有本发明基因1F2anti的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增本发明基因1F2anti中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
获得本发明的杂交瘤细胞株1F2的方法，可包括以下步骤：
1)用口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒作为免疫原免疫动物；
2)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤；
3)筛选杂交瘤细胞，得到杂交瘤细胞株1F2。
获得本发明单克隆抗体1F2anti的方法，在上述步骤的基础上增加以下步骤：
4)从杂交瘤细胞株1F2的培养液或接种杂交瘤细胞株1F2的动物的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体1F2anti。
在上述方法中，步骤1)中的口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒可为活病毒或灭活病毒，优选为灭活病毒，浓度为10-1000μg/mL；用于制备单克隆抗体的免疫动物可为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、驴、马等哺乳动物，优选为小鼠。
步骤2)中当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，可分离动物的脾细胞并制备成单细胞悬液。必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞，并在适当的融合剂(如聚乙二醇)的诱导下与骨髓瘤细胞(优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合以形成杂交瘤。
步骤3)中可以在选择性培养基(如HAT培养基)中培养以筛选融合的杂交瘤细胞，并进一步可使用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的阳性抗性细胞株。
步骤4)中可于体外(如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(小鼠腹水)培养分泌口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒单克隆抗体1F2anti的杂交瘤细胞株1F2，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出单克隆抗体1F2anti。
本发明的第二个目的是提供一种单克隆抗体1F2anti的应用，提出口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的ELISA检测方法，该检测是用口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体1F2anti作为包被抗体及酶标抗体的双抗夹心ELISA检测方法。
具体来讲，所述双抗夹心ELISA检测，可包括以下步骤：
1)用单克隆抗体1F2anti包被酶联板，封闭经包被的酶联板；
2)加待测样品，洗板；
3)加辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酯酶(ALP)标记的单克隆抗体1F2anti，洗板；
4)加底物显色；
5)终止反应；
6)测定OD450值。
上述检测方法中的反应条件及试剂均可按照常规方法进行选择。
步骤3)中单克隆抗体1F2anti的标记酶优选为辣根过氧化物酶，可通过戊二醛法或过碘酸法将酶交联在单克隆抗体1F2anti上。
本发明的第三个目的是提供一种检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的ELISA试剂盒。
本发明所提供的检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的ELISA试剂盒，包括用1F2anti作为包被抗体包被的微孔板和用1F2anti作为酶标抗体的酶标记抗体工作液。
所述用1F2anti作为包被抗体包被的微孔板指的是用10mMpH7.0-7.4PBS将1F2anti稀释成0.5-10μg/mL，加入微孔板中，110μl/孔，置于2-8℃过夜；拍干后，加入含1％BSA的10mMpH7.0-7.4PBS，300μl/孔，置于2-8℃过夜；拍干、干燥后真空装入铝箔袋中备用。
所述酶标抗体可用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酯酶(ALP)等标记酶标记抗体，然后用酶标记抗体稀释液(配方为：Na2HPO4·12H2O2.9g，NaH2PO4·2H2O0.296g，NaCl8.5g，Proclin3000.6mL，BSA10g，胎牛血清150mL，酶稳定剂5g，Tween-200.25mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至7.6-7.8)稀释成工作液，工作液的浓度为0.1-1.0μg/mL。
所述试剂盒还可包括显色液A液、显色液B液和终止液，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲溶液，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺溶液，所述终止液为H2SO4溶液。
此外，为方便检测，所述试剂盒还可包括：稀释液，如pH7.0-7.410mMPBS缓冲溶液；洗涤液，如PBST等常规的洗涤试剂。
为便于观测结果，所述试剂盒还可包括标准口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒阳性血清(阳性对照)和标准口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒阴性血清(阴性对照)，可用稀释液作为阴性对照使用。
本发明的第四个目的是提供一种检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的金标纸层析试纸条或测试卡。
用于检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的金标纸层析试纸由玻璃纤维膜样品垫、结合物释放垫、吸水垫、硝酸纤维素膜(NC膜)组成，硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)。
金标纸层析试纸的制备方法包括以下步骤：
1)包被硝酸纤维素膜(NC膜)
用浓度为1-5mg/mL的单克隆抗体1F2anti包被检测线(T线)；用浓度为1-5mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白(购自北京博尔西科技有限公司)包被质控线(C线)；用BIODOT公司XYZ3000喷膜机将单克隆抗体1F2anti和羊抗鼠免疫球蛋白分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜上，形成相互分离的检测线和质控线，检测线和质控线间距为0.3-1.0cm，通常选择0.5cm。37℃干燥1小时后备用。
2)结合物释放垫的制备
2.1用胶体金标记单克隆抗体1F2anti，方法为：在磁力搅拌下，向三角瓶中加入155mL纯化水，煮沸。加入1％四氯化金溶液5mL，煮沸。再加入1％柠檬酸三钠溶液7mL，煮沸5分钟。冷却后保存于2-8℃。取1毫升胶体金溶液于离心管中。加入15μl0.2M碳酸钾溶液，室温静止5min。加入10μl抗体，混匀后静置30min。加入10μl20％BSA溶液，平衡5min。加入10μl20％PEG20000溶液，平衡30min；用离心机10000rpm，离心10min，去上清液。加入100μl金标复溶液(含有2％蔗糖、1％酪蛋白、0.5％BSA、0.1TritonX100、0.1％SDS的硼酸缓冲液)，复溶后备用。
2.2制备结合物释放垫：结合物释放垫的材质为玻璃纤维膜，其上包被有胶体金标记的特异性单克隆抗体1F2anti，将复溶后的金子1:4稀释后按照8μl/cm的速度喷膜，37℃下放置2小时干燥，备用。
3)制备金标纸层析试纸
在PVC背板上先黏贴硝酸纤维素膜，在靠近硝酸纤维素膜质控线的一端黏贴吸水垫，在靠近测试线一端黏贴结合物释放垫和样品垫，得到用于检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒金标纸层析试纸，然后可按所需大小进行切割，得到用于检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒金标纸层析测试条，加干燥剂后密封保存。
如将上述步骤制备的测试条装入塑料卡中，制成测试卡，并组装成试剂盒，该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
本发明使用可以诱发机体产生免疫反应的口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒作为免疫原，采用常规杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F2，并由该细胞株分泌得到单克隆抗体1F2anti。本发明的单克隆抗体能够特异性地识别口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒，可用于检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒，并具有高特异性、高灵敏度的优点。实验证明，本发明的单克隆抗体可以准确检测样品中口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的水平，而不与口蹄疫O型(O/GX/09-7)、亚洲1型(JSL/06)、A型(Re-A/WH/09)病毒发生交叉反应。本发明将在口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的检测、疫苗生产、流行病学研究中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体1F2anti纯度8％的SDS-PAGE电泳检测结果；
图2为抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体1F2anti构象型表位的WesternBlot检测结果；
图3为抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体1F2anti的亚型鉴定结果；
图4为用单克隆抗体1F2anti及ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的灵敏度的拟合曲线；
图5为胶体金纸层析试纸条正面结构图；
图6为胶体金试纸条组装示意图；
图7为用单克隆抗体1F2anti制备的金标纸层析试纸盒检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的灵敏度检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、获得持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞
杂交瘤细胞株1F2的获得方法，包括以下步骤：
1、动物免疫
1)基础免疫：以口蹄疫(O/Mya98/BY/2010)病毒(由金宇保灵生物药品有限公司提供)作为免疫原，采用蔗糖密度梯度离心法测定，纯度≥85％，浓度为10-1000μg/mL。必要时，可用超滤管浓缩病毒抗原以提高病毒含量，浓缩后抗原与福氏完全佐剂(购于Sigma公司)等体积混合并充分乳化，多点皮下注射乳化液，每只Balb/c小鼠(8-12周龄，雌性，SPF级动物培养，购自军事医学科学院实验动物中心)每次注射量为150μg。
2)加强免疫：将浓缩后抗原与福氏不完全佐剂(购于Sigma公司)等体积混合并充分乳化，多点皮下注射乳化液，每只Balb/c小鼠每次注射量为200μg。在进行细胞融合前3天，腹腔注射含200μg抗原的生理盐水溶液，以进一步增强免疫效果。
2、杂交瘤细胞的制备和筛选
用常规方法收集小鼠的脾细胞，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞按10:1的比例在500g/LPEG4000(融合剂，购于Sigma公司)的诱导下进行融合。用HAT(购自生兴生物技术(南京)有限公司)选择性培养液培养，培养条件为5％二氧化碳、37℃。融合后10-15天，取上清采用间接ELISA法筛选分泌抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的杂交瘤细胞株，间接ELISA法的操作步骤为：用110μL浓度为4μg/mL的口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒包板，拍干后，用1％BSA封闭液(100mLpH7.410mMPBS中加入1gBSA，BSA购于Sigma公司)封闭，以免疫小鼠血清1:2000，无克隆生长的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG(购自美国ABCAM公司)100μL，最后测定450nmOD值，以OD450值大于阴性对照2倍为阳性判断依据。
对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆，具体方法是：
1)取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。
2)用HT培养液将细胞稀释成200个/mL、40个/mL、20个/mL和的悬液。
3)用吸管将细胞悬液分别种入微量培养板，每孔0.05mL，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。
4)5％CO2饱和湿度，37℃培养。
5)每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。
6)克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3-1/2时，通过间接ELISA法测培养液上清抗体，选择阳性克隆，并传4-6代就可以建成克隆株。
3、杂交瘤细胞的获得
重复步骤2，进行2次细胞融合，经过4次亚克隆和间接ELISA筛选，得到5株针对口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，并根据克隆产生位置分别编号为1F2、2B4、5C3、4H9、7F5。
4、杂交瘤细胞所得单抗的性能检测
1)细胞培养液上清效价测定：用间接ELISA法(方法见步骤2)检测上述杂交瘤细胞培养上清的效价，结果如表1所示，效价为：1:10-1:120，表明培养上清中均含有目标抗体，其中2B4抗体效价略低。
表1杂交瘤细胞培养上清的效价
2)小鼠腹水效价测定：用间接ELISA法(方法见步骤2)检测上述杂交瘤细胞制备的腹水效价，结果如表2所示，效价为：1:1000-1:1000000，表明小鼠腹水中均产生了目标抗体，抗体效价除2B4外其余4种均满足需要。
表2杂交瘤细胞腹水的效价
| 细胞株1F2 | 细胞株2B4 | 细胞株5C3 | 细胞株4H9 | 细胞株7F5 | |
| 小鼠腹水效价 | 1:32768 | 1:1024 | 1:8192 | 1:65536 | 1:65536 |
3)小鼠腹水抗体特异性验证：用间接ELISA法(方法见步骤2)检测上述杂交瘤细胞制备的腹水的特异性，即分别采用口蹄疫不同的毒株包被微孔板，将腹水用pH7.410mMPBS稀释100倍后检测。结果如表3所示，其中特异性抗体为1F2和2B4克隆，另外三种为非特异性抗体。由于2B4克隆抗体效价较低，故选择1F2抗体用于ELISA试剂盒和胶体金检测试剂的开发和制备
表3杂交瘤细胞培养上清的效价
5、杂交瘤细胞的传代培养
将1F2杂交瘤细胞在含有10％胎牛血清的RPMI-1640(含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中继续进行培养、传代，培养到第10代后，杂交瘤细胞株1F2仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:50以上，表明获得了能够稳定传代，并可以持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
6、保存杂交瘤细胞
获得持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须保存一部分杂交瘤细胞，这是因为在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性；另外，在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。
保存方法包括以下步骤：
1)去掉细胞培养瓶中旧的培养液，加入含有10％胎牛血清的RPM1640培养基，使细胞悬浮。
2)1000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用细胞冻存液(二甲基亚砜：胎牛血清：RPM1640＝1：2：7)复溶制成悬液，浓度5.0×105细胞/mL。
3)取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。具体地：
称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100mL，用滤纸过滤，4度保存。使用时，用pH7.410mMPBS稀释至0.4％。制备单细胞悬液，并作适当稀释。将细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1混合混匀(终浓度0.04％)。在三分钟内，镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。计算活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％。
4)将细胞无菌分装至1.8mL细胞冻存管(购自浙江拱东医疗科技有限公司)，每瓶0.5mL-1.0mL，拧紧瓶盖。
5)细胞冻存：4℃放置2小时，然后-20℃再放置2小时，之后液氮罐气态部分(-70℃)放置2小时，最后转入液氮长期保存。
按以上方法，以口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒为免疫原免疫小鼠，获得了持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为1F2。该细胞株已于2015年06月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10896。
实施例2、大量制备抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体
一、单克隆抗体的大量制备及纯化
1、采用动物体内诱生单克隆抗体法大量制备单抗：选择成年BALB/c小鼠，腹腔接种降植烷，每只小鼠0.5mL。7-10天后腹腔接种第16代杂交瘤细胞1F2，每只小鼠2×106-3×106个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用9号针头采集腹水。
2、抗体纯化：将腹水离心(10000r/min30分钟)，除去细胞成分和其它的沉淀物，收集上清。将上清用15-30倍体积的pH7.0-7.610mMPBS(配方：NaH2PO4·2H2O0.296g，Na2HPO4·12H2O2.9g，双蒸水定溶至1000mL，测定pH值为7.2-7.4)稀释，用ProteinA亲和层析柱(GE公司，货号为29-0491-04)进行亲和纯化，上柱液为pH7.0-7.610mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液为pH3.5100mM的柠檬酸缓冲液(配方：一水柠檬酸21g加入1000mL去离子水中，用5MNaOH或4MHCl调整pH值至3.5)，洗脱下来的抗体尽快用1MpH9.6Tris-HCl调整pH值至中性，得到抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体，命名为1F2anti。
二、抗体鉴定
1、抗体纯度鉴定
对抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体1F2anti进行纯度8％SDS-PAGE电泳鉴定。
结果如图1(泳道1F2为单克隆抗体1F2anti，泳道M为蛋白分子量标准(kDa))所示，无明显杂带，单克隆抗体1F2anti的纯度在85％以上，表明该纯度良好，可以满足需求。
2、抗体构象型表位验证
常规WesternBlot检测方法检测抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体1F2anti所针对的表位是构象型(表示该抗体针对的抗原位点为空间结构)还是线性(表示该抗体针对的抗原位点为线性结构)，方法为：使用150μg灭活口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒进行还原性8％SDS-PAGE电泳，湿转法转至PVDF膜上，使用纯化的单克隆抗体1F2anti进行WesternBlot杂交检测。
结果如图2所示，其中M为蛋白分子量标准(kDa)，泳道3和4为单克隆抗体1F2anti，泳道1、2和5为阳性对照(具体为在单克隆抗体制备过程中产生免疫小鼠的阳性尾血，属于多克隆抗体，见实施例1)，从该图看出，单克隆抗体1F2anti为构象型表位。
3、抗体类及亚类鉴定
采用间接ELISA法，使用抗小鼠各种Ig亚型的抗体鉴定杂交瘤细胞1F2分泌的抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体1F2anti的Ig亚型。
结果如图3所示，单克隆抗体1F2anti为IgG1。
三、单克隆抗体1F2anti的可变区序列测定
提取杂交瘤细胞1F2的mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进行高保真PCR扩增，将PCR扩增片段插入到T载体内进行DNA序列测定。DNA序列测定结果：编码单克隆抗体1F2anti的基因(1F2anti)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：3的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：1的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：4的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：2的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。将获得的DNA序列翻译成蛋白质的氨基酸序列。1F2anti的重链可变区具有序列表中的SEQIDNo：1的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒特异结合的多肽，轻链可变区具有序列表中的SEQIDNo：2的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒特异结合的多肽。上述序列在NCBI数据库进行比对后未显示有相同序列。
实施例3、用单克隆抗体1F2anti及ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒
一、用单克隆抗体1F2anti及ELISA双抗体夹心法检测不同浓度的口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒
有文献(NumberandmolecularweightsofFood-and-MouthDiseaseVirusCapsidProteinsandtheEffectsofMaleylation,JournalofVirology,1971,Vol7,No.2,P250-259)记载，口蹄疫病毒的膜蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)具有多个拷贝，因此本发明以单克隆抗体1F2anti既为包被抗体又为标记抗体来特异性的检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒。
用单克隆抗体1F2anti及ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒，检测方法包括以下步骤：
1)包被微孔板：将单克隆抗体1F2anti用pH7.0-7.410mMPBS缓冲溶液稀释成4μg/mL，在酶标板的每孔加110μL，4℃下包被过夜；倾去包被液，拍干，然后在每孔中加入300μL1％BSA(在pH7.0-7.410mMPBS缓冲溶液中)，放入4℃封闭过夜后，拍干，干燥，真空包装后备用。
2)酶标记抗体：采用过碘酸钠法用辣根过氧化物酶(HRP)标记单克隆抗体1F2anti，具体方法为：称取3mgHRP溶解于1mL蒸馏水中。于上液中加入0.12mL新配的0.1MNaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，对1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。加30μl0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液，使透析后的HRP的pH升高到9.0-9.5，然后立即加入溶解在1mL0.01M碳酸盐缓冲液中的4mgIgG，室温避光轻轻搅拌2小时。加0.12mL新配的5mg/mLNaBH4溶液，混匀，再置4℃2小时。将上述溶液装入透析袋中，对0.01MpH7.2PBS透析，4℃过夜。取出后加入等体积优质甘油，分装，-20℃保存，即为1F2-HRP。用酶标记抗体稀释液按照一定比例稀释即为酶标记抗体工作液。酶标记抗体稀释液的配方为：Na2HPO4·12H2O，2.9g；NaH2PO4·2H2O，0.296g；NaCl，8.5g；Proclin300，0.6mL；BSA，10g；胎牛血清，150mL；酶稳定剂，5g；Tween-200.25mL；双蒸水，定溶至1000mL；调整pH至7.6-7.8。
3)与待检样品反应：向酶标板中分别加入口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒梯度稀释液100μL/孔，病毒浓度见表3，37℃温育1小时。
4)洗板并加入酶标记抗体：用PBST洗液(配方：Na2HPO4·12H2O58g，NaH2PO4·2H2O5.92g，NaCl170g，Tween-205.0mL，Proclin3000.6mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至7.2-7.4；使用前用双蒸水稀释20倍)洗板5次后，再加入1F2-HRP(1:1000-1:8000稀释)100μL/孔，37℃温育0.5小时。
5)洗板与显色：用PBST洗板5次后加入显色液A(配方为：无水乙酸钠4.5g，冰醋酸1.2mL，过氧化脲0.8g，用双蒸水定溶至1000mL。)、显色液B(配方为：柠檬酸1.62g，EDTA-2Na0.372g，甘油100mL，四甲基联苯胺盐酸盐0.50g，用双蒸水定溶至1000mL。)各50μL/孔进行显色，37℃温育15min。
6)终止反应与测量：加入终止液(配方为：1000mL双蒸水中含有98％硫酸27.8mL。)，50μL/孔，读数OD450。
检测结果如表4所示，可以看出该试剂盒能够检测15.6-500ng/mL范围的抗原，在该区间内线性满足需要，表明该试剂盒具有良好的线性。
表4用单克隆抗体1F2anti及ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的结果
二、用单克隆抗体1F2anti及ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的灵敏度检测
用单克隆抗体1F2anti及ELISA双抗体夹心法检测不同浓度的口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒，以确定检测方法的灵敏度，检测方法与步骤一相同。
不同浓度口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的检测结果如表4所示，灵敏度的拟合曲线如图4(横坐标表示以10为底的浓度的对数，纵坐标表示以10为底的OD值的对数)所示，可以看出能够将15.6ng/mL的抗原与阴性对照区分开(OD值是阴性对照的2倍以上)，而7.8ng/mL的OD值与阴性对照区分不大，因此判断该试剂盒的检测灵敏度可达15.6ng/mL，表明该试剂盒具有较高的灵敏度。
三、用单克隆抗体1F2anti及ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的特异性检测
用单克隆抗体1F2anti及ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒、口蹄疫O型(O/GX/09-7)、亚洲1型(JSL/06)和A型(Re-A/WH/09)病毒(病毒均用样品稀释液稀释成4000ng/mL(样品稀释液配方：Na2HPO4·12H2O，2.9g；NaH2PO4·2H2O，0.296g；NaCl，8.5g；Proclin300，0.6mL；BSA，10g；胎牛血清，150mL；硫酸庆大霉素，2支(8万单位/支)；双蒸水，定溶至1000mL；调整pH至7.6-7.8。过滤除菌，2-8℃保存)，以确定检测方法的特异性，检测方法与步骤一相同。
口蹄疫O型(O/GX/09-7)、亚洲1型(JSL/06)和A型(Re-A/WH/09)病毒检测结果呈阴性，无交叉反应，口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒检测结果呈阳性，说明以单克隆抗体1F2anti同时为包被抗体和标记抗体，采用ELISA双抗体夹心法能够特异性地识别口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒，与口蹄疫O型(O/GX/09-7)、亚洲1型(JSL/06)和A型(Re-A/WH/09)病毒等其它病毒无任何反应。
四、制备用ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的试剂盒
以单克隆抗体1F2anti作为包被抗体和标记抗体，用ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的试剂盒包括以下试剂：
1)预包被微孔板：预先用单克隆抗体1F2anti按照4μg/mL的浓度预先包被、封闭，并密封保存在真空铝箔袋中，每个试剂盒一块96孔的微孔板；
2)酶标记抗体工作液：预先用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酯酶(ALP)标记的1F2anti抗体，并用酶标记抗体稀释液稀释成合适浓度作为工作液，通常为0.1-1.0μg/mL，每个试剂盒10.0mL。
酶标记抗体稀释液配方为：Na2HPO4·12H2O，2.9g；NaH2PO4·2H2O，0.296g；NaCl，8.5g；Proclin300，0.6mL；BSA，10g；胎牛血清，150mL；酶稳定剂(购自上海西宝生物科技有限公司)，5g；Tween-200.25mL；双蒸水，定溶至1000mL；调整pH至7.6-7.8。
3)稀释液：用于标准品和待测样品的稀释，其配方为Na2HPO4·12H2O，2.9g；NaH2PO4·2H2O，0.296g；NaCl，8.5g；Proclin300，0.6mL；BSA，10g；胎牛血清，150mL；硫酸庆大霉素，2支(8万单位/支)；双蒸水，定溶至1000mL；调整pH至7.6-7.8。过滤除菌，2-8℃保存。每个试剂盒1瓶，25mL/瓶。
4)洗涤液：为20倍的浓缩洗液，用前稀释。其配方为：Na2HPO4·12H2O58g，NaH2PO4·2H2O5.92g，NaCl170g，Tween-205.0mL，Proclin3000.6mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至7.2-7.4。每个试剂盒1瓶，25mL/瓶。
5)显色液A：每个试剂盒1瓶，7mL/瓶。配方为：无水乙酸钠4.5g，冰醋酸1.2mL，过氧化脲0.8g，用双蒸水定溶至1000mL。
6)显色液B：每个试剂盒1瓶，7mL/瓶。显色液B配方为：柠檬酸1.62g，EDTA-2Na0.372g，甘油100mL，四甲基联苯胺盐酸盐0.50g，用双蒸水定溶至1000mL。
8)终止液：每个试剂盒1瓶，7mL/瓶。配方为：1000mL双蒸水中含有98％硫酸27.8mL。
9)标准口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒阳性血清：每个试剂盒1瓶，1mL/瓶。
10)标准口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒阴性血清：样品稀释液可作为阴性血清使用。
实施例4、用单克隆抗体1F2anti制备的金标纸层析测试卡检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒
1、制备金标纸层析试纸
如图5、6所示(图中5为金标纸正面结构图，图中6为金标纸层析试纸的纵截面结构图)，用于检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的金标纸层析试纸由吸水垫1、硝酸纤维素膜(NC膜)2、玻璃纤维膜样品垫3、玻璃纤维素膜结合物释放垫4组成，硝酸纤维素膜2上设有检测线(T线)6和质控线(C线)5。
金标纸层析试纸的制备方法包括以下步骤：
1)包被硝酸纤维素膜(NC膜)2
用浓度为1-5mg/mL的单克隆抗体1F2anti包被检测线(T线)。用浓度为1-5mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白(购自北京博尔西科技有限公司)包被质控线(C线)。用BIODOT公司XYZ3000喷膜机将单克隆抗体1F2anti和羊抗鼠免疫球蛋白分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜(购自Millipore公司)2上，形成相互分离的检测线6和质控线5，质控线和测试线间距一般为0.3-1.0cm，优选0.5cm,37℃干燥1小时备用。
2)结合物释放垫4的制备
2.1用胶体金标记单克隆抗体1F2anti，方法为：在磁力加热搅拌下，向三角瓶中加入155mL纯化水，煮沸。加入1％四氯化金溶液5mL，煮沸。再加入1％柠檬酸三钠溶液7mL，煮沸5分钟，即为胶体金溶液，冷却后保存于2-8℃。取1毫升胶体金溶液于离心管中。加入15μl0.2M碳酸钾溶液，室温静止5min。加入10μl抗体，混匀后静置30min。加入10μl20％BSA溶液，平衡5min。加入10μl20％PEG20000溶液，平衡30min；用离心机10000rpm，离心10min，去上清液。加入100μl金标复溶液(含有2％蔗糖、1％酪蛋白、0.5％BSA、0.1TritonX100、0.1％SDS的硼酸缓冲液)，复溶后备用。
2.2制备结合物释放垫：结合物释放垫的材质为玻璃纤维膜，其上包被有胶体金标记的特异性单克隆抗体1F2anti，将复溶后的金子用金标复溶液1:4稀释后按照8μl/cm的速度喷膜，37℃下放置2小时干燥，备用。
3)制备金标纸层析测试条和测试卡
在PVC背板7上先黏贴硝酸纤维素膜2，在靠近硝酸纤维素膜质控线的一端黏贴吸水垫1，在靠近测试线一端黏贴结合物释放垫4和样品垫3，得到用于检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒金标纸层析试纸，然后可按所需大小进行切割，得到用于检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒金标纸层析测试条，加干燥剂后密封保存。
如将上述步骤制备的测试条装入塑料卡中，制成测试卡，并组装成试剂盒，该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗(图7)。
2、金标纸层析测试条和测试卡的使用
金标纸层析试纸条的使用方法：将样品垫端浸入样品中，样品垫3即吸取液体向上端移动，流经结合物释放垫4时使干片上的胶体金标记单克隆抗体1F2anti复溶，并带动其向硝酸纤维膜2渗移。若样本中有待测特异抗原(阳性样本)，其可与胶体金标记单克隆抗体1F2anti结合，此抗原抗体复合物流至检测线6即被固相抗体所获，在膜上显出红色检测线条(T线)。过剩的胶体金标记单克隆抗体1F2anti继续前行，至质控线5与羊抗鼠免疫球蛋白(固相二抗)结合，而显出红色质控线条(C线)。反之，若样本中无待测特异抗原(阴性样本)，则无检测线条(T线)，而仅显示质控线条(C线)。如果检测线(T线)与质控线(C线)均不显色或仅检测线(T线)显色，则表示金标纸层析试纸(卡)失效(图5)。
金标纸层析测试卡和试剂盒的使用方法：检测时，取待检样品1-2滴，滴在试纸盒的点样口，根据观测窗内的检测线(T线)和质控线(C线)是否出现色带来确定样品中是否存在口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒。
3、用单克隆抗体1F2anti及金标纸层析试纸盒检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒
用单克隆抗体1F2anti及金标纸层析试纸盒检测不同浓度(浓度分别为500、250、125、62.5、31.3ng/mL)的口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒，以检测试纸盒的灵敏度。
检测结果如图7所示，检测灵敏度可达62.5ng/mL，表明该产品具有较好的灵敏度。
Claims (10)
1.以口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F2，保藏编号为CGMCCNo.10896。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株1F2CGMCCNo.10896分泌的单克隆抗体1F2anti。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体1F2anti，其特征在于：所述单克隆抗体1F2anti的重链可变区具有序列表中的SEQIDNo：1的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒特异结合的多肽，轻链可变区具有序列表中的SEQIDNo：2的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒特异结合的多肽。
4.编码权利要求2或3所述单克隆抗体1F2anti的基因(1F2anti)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：3的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：1的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：4的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：2的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5.获得权利要求1所述杂交瘤细胞株的方法，包括以下步骤：
1)用口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒作为免疫原免疫动物；
2)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤；
3)筛选杂交瘤细胞，得到杂交瘤细胞株1F2。
6.获得权利要求2或3所述单克隆抗体1F2anti的方法，在权利要求5的基础上继续包括以下步骤：
4)从杂交瘤细胞株1F2的培养液或接种杂交瘤细胞株1F2的动物的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体1F2anti。
7.一种检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的ELISA试剂盒，包括权利要求2或3或4所述单克隆抗体1F2anti。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，包括用1F2anti作为包被抗体包被的微孔板和用1F2anti作为酶标抗体的酶标记抗体工作液；
所述用1F2anti作为包被抗体包被的微孔板指的是用10mMpH7.0-7.4PBS将1F2anti稀释成0.5-10μg/mL，加入微孔板中，110μl/孔，置于2-8℃过夜；拍干后，加入含1％BSA的10mMpH7.0-7.4PBS，300μl/孔，置于2-8℃过夜；拍干、干燥后真空装入铝箔袋中备用；
所述酶标抗体可用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酯酶(ALP)等标记酶标记抗体，然后用酶标记抗体稀释液(配方为：Na2HPO4·12H2O2.9g，NaH2PO4·2H2O0.296g，NaCl8.5g，Proclin3000.6mL，BSA10g，胎牛血清150mL，酶稳定剂5g，Tween-200.25mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至7.6-7.8)稀释成工作液，工作液的浓度为0.1-1.0μg/mL。
9.权利要求7或8所述试剂盒的使用方法，用于对口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的ELISA检测，是用权利要求2或3所述单克隆抗体1F2anti作为包被抗体及酶标抗体的双抗夹心ELISA检测，包括以下步骤：
1)用单克隆抗体1F2anti包被96孔微孔板并封闭；
2)加待测样品，洗板；
3)加用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酯酶(ALP)标记的单克隆抗体1F2anti，洗板；
4)加底物显色；
5)终止反应；
6)测定OD450值。
10.一种检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的金标纸层析试纸，由玻璃纤维膜样品垫、结合物释放垫、吸水垫、硝酸纤维素膜(NC膜)组成，硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)，其特征在于：
用浓度为1-5mg/mL的权利要求2或3所述单克隆抗体1F2anti包被检测线(T线)；用浓度为1-5mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白包被质控线(C线)；结合物释放垫上包被有胶体金标记的特异性单克隆抗体1F2anti；所述单克隆抗体1F2anti如权利要求2或3所述。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510737022.0A CN105296434B (zh) | 2015-11-03 | 2015-11-03 | 杂交瘤细胞株及其分泌的抗口蹄疫o型病毒的单克隆抗体与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510737022.0A CN105296434B (zh) | 2015-11-03 | 2015-11-03 | 杂交瘤细胞株及其分泌的抗口蹄疫o型病毒的单克隆抗体与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105296434A true CN105296434A (zh) | 2016-02-03 |
| CN105296434B CN105296434B (zh) | 2018-10-16 |
Family
ID=55194269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510737022.0A Active CN105296434B (zh) | 2015-11-03 | 2015-11-03 | 杂交瘤细胞株及其分泌的抗口蹄疫o型病毒的单克隆抗体与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105296434B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105950563A (zh) * | 2016-07-22 | 2016-09-21 | 北京三联博悦生物技术有限公司 | 杂交瘤细胞株7e3及其分泌的抗口蹄疫a型病毒的单克隆抗体与应用 |
| CN106279408A (zh) * | 2016-07-22 | 2017-01-04 | 北京三联博悦生物技术有限公司 | 抗口蹄疫o型病毒的单克隆抗体及抗体组合以及其在该病毒抗原、抗体检测中的应用 |
| CN110031615A (zh) * | 2019-04-17 | 2019-07-19 | 江苏食品药品职业技术学院 | 一种超敏化学发光hrp底物液及其制备方法 |
| CN114316037A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-04-12 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种O型口蹄疫病毒结构蛋白的抗体m19、制备方法及应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1900115A (zh) * | 2006-07-11 | 2007-01-24 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 抗o型口蹄疫病毒的单克隆抗体制备方法及抗体和用途 |
-
2015
- 2015-11-03 CN CN201510737022.0A patent/CN105296434B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1900115A (zh) * | 2006-07-11 | 2007-01-24 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 抗o型口蹄疫病毒的单克隆抗体制备方法及抗体和用途 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 李志等主编: "《新编动物疫病免疫技术手册》", 28 February 2014, 中国农业出版社 * |
| 汪东风主编: "《食品质量与安全实验技术》", 31 July 2004, 中国轻工业出版社 * |
| 王新华等主编: "《禽病检验与防治》", 31 August 2013, 中国农业出版社 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105950563A (zh) * | 2016-07-22 | 2016-09-21 | 北京三联博悦生物技术有限公司 | 杂交瘤细胞株7e3及其分泌的抗口蹄疫a型病毒的单克隆抗体与应用 |
| CN106279408A (zh) * | 2016-07-22 | 2017-01-04 | 北京三联博悦生物技术有限公司 | 抗口蹄疫o型病毒的单克隆抗体及抗体组合以及其在该病毒抗原、抗体检测中的应用 |
| CN106279408B (zh) * | 2016-07-22 | 2020-06-30 | 北京标驰泽惠生物科技有限公司 | 抗口蹄疫o型病毒的单克隆抗体及抗体组合以及其在该病毒抗原、抗体检测中的应用 |
| CN110031615A (zh) * | 2019-04-17 | 2019-07-19 | 江苏食品药品职业技术学院 | 一种超敏化学发光hrp底物液及其制备方法 |
| CN114316037A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-04-12 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种O型口蹄疫病毒结构蛋白的抗体m19、制备方法及应用 |
| CN114316037B (zh) * | 2022-01-05 | 2023-04-18 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种O型口蹄疫病毒结构蛋白的抗体m19、制备方法及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105296434B (zh) | 2018-10-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103751774B (zh) | 稳定表达猪瘟病毒e2蛋白的重组细胞系及其在制备猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂中的应用 | |
| CN101812129B (zh) | 手足口ev71病毒单克隆抗体及其应用 | |
| CN105950563B (zh) | 杂交瘤细胞株7e3及其分泌的抗口蹄疫a型病毒的单克隆抗体与应用 | |
| CN105296434A (zh) | 杂交瘤细胞株及其分泌的抗口蹄疫o型病毒的单克隆抗体与应用 | |
| CN109182380A (zh) | 杆状病毒表达的猪瘟e2亚单位疫苗的制备方法及应用 | |
| CN101294147B (zh) | 抗猪瘟病毒野毒株e2蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN105348386A (zh) | 抗口蹄疫o型（o/gx/09-7）病毒的单克隆抗体组合及检测该病毒的elisa试剂盒、金标纸层析试纸 | |
| CN110068686A (zh) | 一种伪狂犬病抗体阻断检测试纸 | |
| CN109187967A (zh) | 一种检测并区分o型、a型口蹄疫病毒的双联快速检测卡及其制备方法 | |
| CN104761640A (zh) | 具有中和活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备及应用 | |
| CN105296435A (zh) | 杂交瘤细胞株及其分泌的抗口蹄疫o型（o/gx/09-7）病毒的特异性单克隆抗体与应用 | |
| CN114149497A (zh) | 猪细小病毒中和性单克隆抗体及制备方法和应用 | |
| CN104548087B (zh) | 一种抗a/b亚群禽白血病病毒感染的表位疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN101481675B (zh) | 一种抗猪瘟多表位dna疫苗及构建方法和应用 | |
| CN105541977A (zh) | 鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白及制备方法与应用 | |
| CN101781656A (zh) | 齿兰环斑病毒外壳蛋白基因的表达及其抗体制备方法 | |
| CN102229915B (zh) | Ev71病毒单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用 | |
| CN103954777A (zh) | 一种狂犬病病毒单克隆抗体及其应用 | |
| CN102735807A (zh) | 一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的效力检验方法 | |
| CN103554233B (zh) | 鸭瘟病毒ul13截段重组蛋白、其多克隆抗体及制备方法和应用 | |
| CN106279408A (zh) | 抗口蹄疫o型病毒的单克隆抗体及抗体组合以及其在该病毒抗原、抗体检测中的应用 | |
| CN102559614A (zh) | 一种猪瘟疫苗及其制备方法 | |
| CN103421817A (zh) | 人工合成的猪繁殖与呼吸综合征病毒多表位基因及应用 | |
| CN106749557A (zh) | 蓝舌病病毒vp7蛋白群特异性抗原表位多肽及其应用 | |
| CN102507946B (zh) | J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20180223 Address after: 102629 Beijing City, Daxing District Zhongguancun Science Park Daxing biomedical industry base Qingfeng West Road, No. 29 E District No. 2301 Applicant after: Beijing standard Zai Hui Bio Technology Co., Ltd. Applicant after: Jinyu Baoling Bio-pharmaceutical Co., Ltd. Address before: 102200 Beijing City, Changping District science and Technology Park Fukang Road No. 18, Room 202 Applicant before: BEIJING SANLIAN BOYUE BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Applicant before: Jinyu Baoling Bio-pharmaceutical Co., Ltd. |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |