CN103421112A

CN103421112A - 一种抗肠道病毒的结合分子及其用途

Info

Publication number: CN103421112A
Application number: CN2012101658512A
Authority: CN
Inventors: 黄忠; 库志强; 石金平; 刘庆伟
Original assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Current assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Priority date: 2012-05-24
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2032-05-24
Also published as: CN103421112B

Abstract

本发明涉及一种抗肠道病毒的结合分子及其用途。本发明揭示了对于肠道病毒71型具有优异的中和作用的结合分子，可应用于肠道病毒71型的检测和防治。

Description

一种抗肠道病毒的结合分子及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种抗肠道病毒的结合分子及其用途。

背景技术

肠道病毒71型(EV71)是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科，肠道病毒属(Wong,S.S.et al.,2010.Human enterovirus 71and hand,foot and mouthdisease.Epidemiol Infect 138,1071-1089)。EV71是导致手足口病的主要病原之一，该病目前主要在亚太地区流行。通常，EV71感染引起轻微的自限性症状，比如皮肤红疹，咽喉疼痛和发烧。但是，部分EV71感染患者能产生严重的神经症状，包括脑膜炎、类脊髓灰质炎瘫痪、脑炎和肺水肿，并最终导致死亡。

EV71感染对于生活在远东地区的儿童造成了严重的威胁。目前还没有特异性的疫苗和治疗性药物。目前已有很多工作致力于开发有效的EV71疫苗，但是，EV71疫苗的上市还需要若干年的时间。人源化鼠源单克隆抗体是一个开发预防和治疗病毒感染药物的有效方法，一种抗呼吸道合胞体病毒的人源化单抗Palivizumab就是一个成功上市的抗病毒药物。尽管目前已有数个研究小组分别用灭活病毒、活病毒或SP70多肽作为免疫原制备了鼠源抗EV71中和性单抗。但是，本领域目前还没有一种病毒抑制效果特别理想的抗EV71的单抗被开发。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗肠道病毒的结合分子及其用途。

在本发明的第一方面，提供一种结合分子，其特异性结合肠道病毒71型；并且，其抑制95%细胞病变(95%抑制率)的浓度低于1.5μg/ml(较佳地低于1.3μg/ml；更佳地低于1μg/ml；更佳地低于0.5μg/ml；更佳地低于0.4μg/ml)。

在一个优选例中，所述的结合分子特异性结合肠道病毒71型的VP1蛋白；更佳地，其结合于VP1蛋白的线性表位。

在另一优选例中，所述的结合分子通过肠道病毒71型的病毒样颗粒免疫动物(如小鼠)、获取动物脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，由杂交瘤细胞分泌获得。

在另一优选例中，所述的病毒样颗粒通过共表达P1和3CD制备获得。

在另一优选例中，所述结合分子包含SEQ ID NO:3所示重链CDR1区、SEQ ID NO:4所示重链CDR2和SEQ ID NO:5所示重链CDR3区。

在另一优选例中，所述结合分子包含SEQ ID NO:6所示轻链CDR1区、SEQ ID NO:7所示轻链CDR2和SEQ ID NO:8所示轻链CDR3区。

在另一优选例中，所述的结合分子包含重链可变区，所述的重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的结合分子包含轻链可变区，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的结合分子包含重链可变区和轻链可变区，其重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的结合分子包含重链恒定区和轻链恒定区，其重链恒定区和轻链恒定区分别具有SEQ ID NO:16中第138-461和SEQ ID NO:18中第133-238所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的结合分子是人单克隆抗体，由选自以下的杂交瘤细胞株制备获得：

在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC No.C201232的杂交瘤细胞株(D5)；

在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC No.C201233的杂交瘤细胞株(H7)；或

在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC No.C201234的杂交瘤细胞株(C4)。

在本发明的另一方面，提供编码所述的结合分子的核酸分子。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述表达载体中含有所述的结合分子的核酸。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有所述的表达载体；或其基因组中整合有所述的结合分子的核酸。

在本发明的另一方面，提供所述的结合分子在制备用于诊断、治疗和/或预防肠道病毒71型感染的试剂、试剂盒或药物中的用途。

在一个优选例中，所述的试剂或药物还用于诊断、治疗和/或预防手足口病。

在本发明的另一方面，提供一种抑制肠道病毒71型的组合物，它含有有效量的所述的结合分子，以及药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种检测肠道病毒71型的试剂盒，其包括所述的结合分子。

在本发明的另一方面，提供一种抑制肠道病毒71型的方法(较佳地，为非治疗性的方法)，所述的方法包括给予对象(如携带肠道病毒71型的场所(如公共区域，车辆，家具等)，或受试者)有效量的所述的结合分子。

在本发明的另一方面，提供一种检测肠道病毒71型的方法(较佳地，为非诊断性的方法)，利用所述的结合分子与待测样品(如分离自疑似携带肠道病毒71型的场所(如公共区域，车辆，家具等)的样品，或分离自受试者的离体样品)进行接触，通过检测所述的结合分子与待测样品的结合情况，获得肠道病毒71型的存在情况以及存在量。

在本发明的另一方面，提供产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株，选自：在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC No.C201232的杂交瘤细胞株(D5)；在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC No.C201233的杂交瘤细胞株(H7)；或在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC No.C201234的杂交瘤细胞株(C4)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化的抗EV71单抗。3μg每种纯化的抗体分别经含还原剂的缓冲液处理后上样到10%的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，并以考马斯亮蓝染色显示蛋白条带。M，蛋白分子量标准；1，D5单抗；2，H7单抗；3，C4单抗。

图2、酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定单抗与不同抗原的结合能力。在ELISA板上每孔分别包被10ngEV71灭活全病毒，50ng重组的VP0或VP1蛋白。每孔分别加100ng纯化的单抗在37℃孵育2小时，接着用HRP标记的羊抗鼠IgG二抗进行孵育。抗乙肝表面抗原(HBsAg)单抗被用来做无关对照。表中的柱状图显示了三个重复样品测定的OD450nm平均值和标准差。

图3、Western Blot分析。重组表达的VP1和VP0蛋白(60ng)经处理后分别上样到10%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，接着转移到PVDF膜上，用纯化的单抗进行杂交，最后用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗进行孵育，显色。

图4、免疫荧光染色。正常的(A-C)或者是经EV71感染的(D-L)Vero细胞与D5单抗(A-F)，C4单抗(G-I)或者是HBsAg对照单抗(J-L)进行孵育，接着与FITC-标记的羊抗鼠IgG二抗孵育。所有细胞均用DAPI染色。最后用荧光显微镜观察，拍摄不同滤镜下的细胞-FITC滤镜(A，D，G，J)、DAPI滤镜(B，E，H，K)和合并的图片。

图5、RD细胞病变及保护的形态鉴定。(A)未感染的ED细胞。(B-F)预先经培养基(B)，1.25μg/ml HBsAg对照单抗(C)，0.3125μg/ml D5单抗(D)，0.3125μg/ml H7单抗(E)和1.25μg/ml C4单抗(F)处理的含100TCID50EV71病毒感染的RD细胞。所有图片均为细胞感染3天后拍照。

图6、CHO细胞重组表达D5单抗的ELISA分析。将瞬时表达D5单抗基因的CHO细胞上清及对照空转细胞上清收集，不同倍数稀释后，通过ELISA分析其结合灭活EV71的能力。所显示为450nm的ELISA数值。

具体实施方式

本发明人经过大量分析研究，揭示了对于肠道病毒71型(EV71病毒)具有优异的中和作用的结合分子。在此基础上完成了本发明。

结合分子

本发明提供了能特异性结合EV71病毒的结合分子，其呈现对于EV71病毒的极其优异的中和活性。所述的结合分子也可被称为结合蛋白。

本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子例如多克隆或单克隆抗体或者所述结合分子可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab’)、F(ab’)₂、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体以及至少含有足以赋予与EV71病毒毒株的特异性抗原结合的免疫球蛋白的片段的(多)肤或其片段。在优选实施方案中，本发明的结合分子是单克隆抗体。

本发明的另一方面包括本文所述结合分子的功能变体。如果变体能与亲代结合分子竞争特异性结合EV71病毒或其蛋白片段，则认为该变体分子是本发明结合分子的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合EV71病毒或其片段。优选地，所述功能变体能竞争性特异性结合由亲代结合分子特异性结合的至少两(或更多个)不同的EV71病毒毒株或其片段。此外，如果某分子对于亲代结合分子对其具有中和活性的EV71病毒、优选对于至少两(或多个)EV71病毒毒株具有中和活性，则认为该分子是本发明结合分子的功能变体。功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代结合分子中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。

所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。

保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半肤氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。

此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代结合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合EV71病毒或其片段。例如，本发明的功能变体与亲代结合分子相比对于EV71病毒可具有增加或降低的结合亲和性。优选地，可变区包括但不限于构架区、高变区、特别是CDR3区的氨基酸序列被修饰。通常，轻链和重链可变区包含三个高变区，包括三个CDR，以及更保守的区域，即所谓的构架区((FR)。高变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代结合分子具有至少大约50%至大约99%、优选至少大约60%至大约99%、更优选至少大约70%至大约99%、甚至更优选至少大约80%至大约99%、最优选至少大约90%至大约99%、特别是至少大约95%至大约99%，以及特别是至少大约97%至大约99%的氨基酸序列同源性。本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代结合分子或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。在一个实施方案中，本发明的功能变体对于EV71病毒具有中和活性。所述中和活性与亲代结合分子相比可以相同或者更高或更低。此后，当使用术语结合分子时，其也涵盖所述结合分子的功能变体。

作为本发明的优选方式，所述的结合分子是单克隆抗体，所述的抗EV71病毒单克隆抗体的重链可变区、轻链可变区以及位于重链可变区和轻链可变区的互补决定区(CDR)均具有独特的不同于现有技术的结构。

本发明包括：具有所述可变区链的单克隆抗体。本发明还包括具有含所述的互补决定区(CDR)的轻链和重链的任何抗体，以及CDR区与本发明的单克隆抗体的CDR具有90%以上(较佳地95%以上)的同源性的任何抗体。

抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，所述的CDR区将可变区间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。对于本发明的单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测定。

经验证，本发明的抗EV71病毒单克隆抗体(D5)的CDR区是全新的，其针对的是EV71病毒VP 1蛋白上的表位，技术构思不同于现有的抗EV71病毒抗体。本发明的抗EV71病毒单克隆抗体所识别的表位为线性表位。

作为本发明的优选方式，所述的结合分子是单克隆抗体，由选自以下的杂交瘤细胞株制备获得：在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC No.C201232的杂交瘤细胞株(D5)；在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC No.C201233的杂交瘤细胞株(H7)；或在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC No.C201234的杂交瘤细胞株(C4)。微量中和滴定实验证明D5、H7、C4的IC95分别为0.3125μg/ml、0.3125μg/ml和1.25μg/ml，中和活性异常优异。

另一方面，本发明包括免疫缀合物，即包含本文所述至少一个结合分子以及进一步包含至少一个标记如可检测的部分/物质的分子。本发明的免疫缀合物可包含一个以上的标记。这些标记可以彼此相同或不同，并且可以与结合分子非共价地结合/缀合。所述标记也可以通过共价键与结合分子直接结合/缀合。或者，所述标记可以通过一或多种连接化合物与所述结合分子结合/缀合。标记与结合分子的缀合技术为本领域技术人员所熟知。

本发明的免疫缀合物的标记可以是治疗剂，但是它们也可以是可检测的部分/物质。适于治疗和/或预防的标记可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增强吞噬作用或者免疫刺激作用的其它结合分子。包含可检测物质的免疫缀合物可诊断性地用于例如评定对象是否己经感染EV71病毒或者作为临床实验程序的一部分监测EV71病毒感染的发生或进展以例如确定指定治疗方案的功效。然而，它们也可以用于其它检测和/或分析和/或诊断目的。可检测的部分/物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记结合分子的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、生物测定(例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。

此外，本发明的结合分子或者免疫缀合物也可以附着于固体支持物上，其特别用于EV71病毒的体外免疫测定或者纯化。这种固体支持物可以是多孔或者无孔的、平面或非平面的。本发明的结合分子可以与标记序列融合以便于纯化。所述标记序列的例子包括但不限于六组氨酸标记、myc标记或者flag标记。或者，一种抗体可以与另一种抗体缀合形成抗体异源缀合物(heteroconjugate)。

另一方面，本发明的结合分子可以与一或多个抗原缀合/附着。优选地，这些抗原是由给予了结合分子-抗原缀合物的对象的免疫系统识别的抗原。所述抗原可以彼此相同，但也可以是不同的。使附着抗原和结合分子的缀合方法为本领域所熟知，包括但不限于使用交联剂。

除了通过直接或间接(例如通过接头)缀合而化学产生免疫缀合物之外，所述免疫缀合物可以作为融合蛋白而产生，所述融合蛋白包含本发明的结合分子及合适的标记。融合蛋白可以通过本领域已知方法产生，例如通过构建核酸分子以及随后表达所述核酸分子而重组产生，所述核酸分子包含符合读框的编码结合分子的核苷酸序列以及编码合适标记的核苷酸序列。

本发明另一方面提供了编码本发明的至少一种结合分子、其功能变体或者免疫缀合物的核酸分子。这种核酸分子可以用作中间物以进行克隆。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子是分离或纯化的。DNA分子的序列可以用常规技术，或利用杂交瘤技术获得。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的结合分子(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的结合分子的序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。优选的，所述载体例如含病毒启动子的质粒表达载体，且在所述表达载体中分别插入了抗EV71病毒单克隆抗体重链可变区(VH)与恒定区的IgH(如来自人源IgH的恒定区)融合序列和轻链可变区VL与人体Igkappa(来自人源Igkappa的恒定区)融合序列。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：细菌细胞如大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS7、NSO或Bowes黑素瘤细胞等。特别适用于本发明的宿主细胞是真核宿主细胞，尤其是哺乳动物细胞，如293细胞。

本发明的结合分子优选的是采用哺乳动物细胞来生产，哺乳动物细胞通常需要在含血清的培养基中进行培养。需要对细胞进行无血清的适应过程后，方可让细胞在无血清培养基中正常的生长。

本发明的结合分子也可以在转基因非人哺乳动物如兔、山羊或者牛中产生，并且分泌进例如其乳中。

本发明还提供了所述的结合分子在制备诊断、预防和/或治疗EV71病毒感染的药物中的应用。这种感染可以在小群体中发生，但是也可以以季节流行病方式在世界范围传播，或者更严重地在全球蔓延，数百万个体处于危险之中。本发明提供了可以中和导致这种季节流行病以及潜在的全球性流行病的EV71病毒毒株的感染的结合分子。

药物组合物

本发明的结合分子可用于制备抑制EV71病毒的组合物(如药物)。

基于本发明的新发现，还提供了一种可抑制EV71病毒或EV71病毒感染相关疾病的组合物，其包含：有效量的本发明所述的结合分子；以及药学上可接受的载体。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的结合分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。

可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如

润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。

本发明的结合分子可以以未分离的或者分离的形式使用。此外，本发明的结合分子可以单独应用或者于包含至少一种本发明的结合分子(或其变体或片段)的混合物中应用。换句话说，所述结合分子可以组合应用，例如作为包含两或更多种本发明的结合分子、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的结合分子可以组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用，但是或者也可以将具有相同活性的结合分子组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用。任选地，所述组合物进一步包含至少一种其它治疗剂。

所述组合物可包含两或多个对于EV71病毒具有中和活性的结合分子。在一个实施方案中，当组合应用时，所述结合分子呈现协同中和活性。换句话说，所述组合物包含至少两种具有中和活性的结合分子，特征在于所述结合分子在中和EV71病毒中起协同作用。如本文所用，术语“协同”是指当组合应用时，结合分子的组合作用高于单独应用时的加合作用。所述协同作用的结合分子可以结合EV71病毒的相同或不同片段上的不同结构。所述组合物也可包含具有中和活性的一种结合分子以及一种非中和性EV71病毒特异性结合分子。

可以调整给药方案以提供最佳的所需应答(例如治疗应答)。合适的剂量范围可例如是0.1-100mg/kg体重，优选0.5-15mg/kg体重。此外，例如可以给予一次推注、随时间给予多次分开剂量或者根据治疗情况的紧急性而可以按比例降低或增加剂量。本发明的分子和组合物优选是无菌的。使得这些分子和组合物无菌的方法为本领域所熟知。用于诊断、预防和/或治疗的其它分子可以以与本发明的结合分子相似的给药方案给予。如果单独给予其它分子，则可以在给予本发明的一或多种结合分子或药物组合物之前、同时或者之后给予患者。对于患者的精确给药方案通常在临床实验期间挑选出。

检测试剂和试剂盒

本发明的结合分子可用于制备检测EV71病毒的试剂或试剂盒。

如本文所用，术语“待测样品”涵盖了多种样品类型，包括生物学来源的血液及其它体液样品，实体组织样品如活检组织样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞或者其后代；也涵盖了分离自疑似携带肠道病毒71型的场所(如公共区域，车辆，家具等)的样品。该术语还包括在获得后已经通过任何方式处理的样品，例如用试剂处理、溶解、或者富集某些成分如蛋白质或者多核苷酸。该术语涵盖了得自任何物种的各种临床样品，也包括培养的细胞、细胞上清和细胞溶解产物。

因此，本发明提供了一种用于检测样品中是否存在EV71病毒的检测试剂盒，该试剂盒中含有本发明的抗EV71病毒的结合分子。

在获得了本发明提供的结合分子后，可以方便地制备出用于特异性检测EV71病毒的检测试剂盒。

作为本发明的一种检测方式，采用间接ELISA法，将待测的抗原包被于固相载体上，利用本发明的结合分子进行检测。

为了在检测时更方便，所述试剂盒中除了含有本发明的结合分子以外，还可以包含其它检测试剂或辅助试剂，所述的辅助试剂例如是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的，如显色剂、标记物、二抗、抗抗体、增敏剂等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要在其中利用了本发明的结合分子作为识别EV71病毒的试剂。

此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。

在获得了本发明提供的结合分子和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中EV71病毒或其含量，从而得知待测样品的供体是否感染EV71病毒，这些方法均被包含在本发明中。较佳地，所述的方法是以非疾病诊断为目的的。

作为一种优选方式，本发明提供一种体外(较佳地，为非诊断或治疗性地)检测EV71病毒的方法，包括以下步骤：

(a1)将待测样品包被于固相载体；

(a2)将本发明的结合分子加样于(a1)的固相载体，从而使待测样品中的EV71病毒与结合分子结合，形成带有“EV71病毒-本发明的结合分子”二元复合物的固相载体；

(a3)将特异性结合本发明的结合分子的检测物加样于(a2)的固相载体，形成带有“EV71病毒-本发明的结合分子-检测物”三元复合物的固相载体；所述的检测物上携带一标记物；

(a4)检测三元复合物中的标记物，确定待检测样品中EV71病毒的存在与否以或存在的量。

按照上述方法，只要设置已知浓度的抗原对照，制作浓度标准曲线，通过比照浓度标准曲线就可以得出待测样品中的EV71病毒含量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

I.材料与方法

细胞和病毒

RD细胞(购自中国科学院细胞库)和Vero细胞(购自中国科学院细胞库)均用含有10%(v/v)血清和100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基培养。

SP2/0细胞(购自中国科学院细胞库)用含有10%/v/v)血清和100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基培养。

EV71病毒株G082(广西疾控中心提供)在RD和Vero细胞上扩增。

病毒滴度测定：采用微量滴定法(Reed，L.J.M.，H.，1938.A simple methodof estimating 50percent endpoints.Am J Hyg 27，493-499)在RD细胞上进行，并且表示为半数组织感染量TCID₅₀。

抗原和抗体

利用杆状病毒-昆虫表达系统，通过常规方法共表达P1(序列见SEQ ID NO:19)和3CD(序列见SEQ ID NO:20)制备EV71病毒样颗粒。

His-标记的重组VP0(为P1的一部分，序列见SEQ ID NO:19中1-323位)和VP1蛋白(为P1的一部分，序列见SEQ ID NO:19中566-862位)通过大肠杆菌表达纯化获得，方法同Feng，Y.F.，Liu，Q.W.et.al.，2011，[Expression ofVP0protein of enterovirus 71in Escherichia coli and generation of thecorresponding polyclonal antibodies in guinea pigs].Xi Bao Yu Fen Zi Mian YiXue Za Zhi 27，535-538。

为了制备灭活的EV71全病毒(EV71灭活全病毒)作为包被抗原，EV71病毒感染的RD细胞通过反复冻融裂解，并且在56℃热灭活。裂解液通过20%(w/v)蔗糖垫溶液156,000g离心3小时。沉淀用PBS缓冲液重悬。重悬液中EV71的含量通过Western Blot定量(Feng,Y.F.et al.,2011.[Expression of VP0proteinof enterovirus 71in Escherichia coli and generation of the correspondingpolyclonal antibodies in guinea pigs].Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi 27,535-538)。

杂交瘤细胞的制备和筛选

雌性Balb/c小鼠，腹腔免疫5μgEV71病毒样颗粒，配以等体积铝佐剂和25μgCpG佐剂，在0周、2周、4周各免疫一次。在第6周时，采取小鼠血清检测中和滴度。第7周时中和滴度最高的一只小鼠通过尾静脉加强免疫15μgEV71VLP。3天后，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0通过PEG1500融合，制备杂交瘤细胞。9天之后，通过ELISA实验筛选特异性分泌针对EV71的抗体。简言之，EV71灭活全病毒包被96孔板，每孔用含10ng EV71的PBS溶液4℃包被过夜，用含有5%(w/v)脱脂牛奶的PBST封闭，每孔加70μl杂交瘤细胞培养液在37℃孵育2小时，接着用HRP标记的二抗孵育1小时，最后进行显色反应，读取OD450的吸光值。同时，杂交瘤细胞培养上清也被用来筛选特异性分泌中和抗体的细胞株。

腹水制备和抗体纯化

雌性Balb/c小鼠腹腔注射500μl液体石蜡油，两周后，每只小鼠腹腔注射10⁶个杂交瘤细胞。5天后，收集腹水，12,000rpm离心10min，去除上层油脂和下层沉淀，取澄清的腹水进行抗体纯化。参考说明书，利用HiTrap^TM ProteinG HP亲和柱(购自GE health care)纯化抗体。

酶联免疫吸附实验鉴定单克隆抗体

每孔分别用含10ng EV71、50ng重组VP0或50ng重组VP1蛋白的PBS溶液4℃过夜包被96孔ELISA板，鉴定单抗的结合能力。ELISA板经含5%(W/V)脱脂牛奶的PBST在37℃封闭2小时后，按每孔100ng加入单抗37℃孵育2小时，接着用HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(购自Pierce)进行孵育，最后读取吸光值OD450。

聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot分析

蛋白样品与SDS-PAGE上样缓冲液混合后，煮沸处理10min，经10%聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品。通过考马斯亮蓝染色显示蛋白条带或者将蛋白转移到PVDF膜上进行Western Blot分析。单克隆抗体按最终浓度1μg/ml稀释到含1%脱脂牛奶的PBST中。抗VP0、VP1多克隆抗体1:1000稀释使用(Feng,Y.F.et al.,2011.[Expression of VP0protein of enterovirus 71in Escherichia coli andgeneration of the corresponding polyclonal antibodies in guinea pigs].Xi Bao YuFen Zi Mian Yi Xue Za Zhi 27,535-538)，接着用HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(购自Pierce)进行孵育，最后读取吸光值OD450。

免疫荧光分析

经EV71感染的Vero细胞用4%(w/v)多聚甲醛固定20min，接着用1%(v/v)NP40在室温处理10min。固定的细胞用含有10%(v/v)FBS和10%(w/v)BSA的PBS封闭1小时。将单抗用含5%BSA的PBS稀释到最终浓度10ng/μl后与细胞进行孵育。然后，将Alexa 488标记的羊抗鼠IgG二抗(购自Invitrogen)和DAPI与细胞进行孵育。所有的孵育条件均在37℃进行，每一步中间都用PBS清洗3遍。染色后的样品用荧光显微镜进行分析。

体外中和实验

纯化的单克隆抗体用含2%(v/v)FBS的DMEM进行二倍比稀释。EV71病毒液稀释到工作浓度为2TCID₅₀/μl。中和实验在96孔板中进行，每孔加入50μl稀释的抗体(100ng/ul起始浓度，两倍比稀释10个浓度)和50μl病毒液(2TCID₅₀/μl)，37℃孵育1小时。接着，100μl细胞悬液(含有15,000RD细胞)加入到每孔中，37℃孵育。3天后，观察细胞病变，并记录抑制95%细胞病变的最低单抗浓度(IC95)。

单克隆抗体的基因序列扩增及重组表达鉴定

从生长良好的杂交瘤细胞株用Trizol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，然后PCR扩增出轻、重链全长基因，并在5’端和3’端分别引入HindIII和EcoRI酶切位点。

PCR扩增出轻、重链的方法如下：分别以鼠源kappa链和gamma1恒定区序列设计引物，用5’Race方法扩增轻重链序列。

PCR扩增出轻、重链全长基因分别克隆到pGEM-T载体(Progema)中，筛选阳性克隆测序，将序列正确的克隆用HindIII和EcoRI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，与同酶切的质粒pcDNA3.1(Progema)用T4DNA连接酶进行连接，构建成真核表达载体pcDNA3.1-(mD5H)和pcDNA3.1-(mD5L)。将pcDNA3.1-(mD5H)和pcDNA3.1-(mD5L)脂质体法共转染CHO细胞，72小时后取培养上清进行分析，采用ELISA确定培养上清中抗体的表达：灭活EV71包被ELISA板，用含5%(w/v)牛奶的PBST于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清37℃孵育2小时，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(H+L)(购自Pierce)进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用5分钟，最后用H₃PO₄终止反应，测OD₄₅₀值。

II.实施例

实施例1、分泌EV71特异抗体的杂交瘤细胞的筛选

经过EV71VLP免疫的小鼠的脾脏细胞用来制备杂交瘤细胞。通过ELISA和中和实验筛选杂交瘤细胞上清，从而获得能分泌具有结合和中和病毒能力的杂交瘤细胞株。最终，四株单抗被筛选出来，他们不仅能够结合灭活的EV71全病毒，还能在体外有效地中和EV71。亚型鉴定显示，其中三株D5、H7、C4属于IgG1，B6属于IgM，如表1。之后的研究主要涉及D5、H7、C4这三株，它们在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的保藏号分别如下：D5：CCTCC No.C201232；H7：CCTCC No.C201233；C4：CCTCC No.C201234。

表1、分泌单抗的杂交瘤细胞株鉴定

除IC95的测定外，其它分析均使用70μl杂交瘤细胞培养上清。

*，ELISA实验中的OD450nm吸光值；**，采用纯化的单抗鉴定；ND，没有鉴定。

“与EV71结合能力”中，EV71指灭活EV71全病毒。

对照单抗：抗HBsAg单抗2G9(购自中科英沐生物有限公司)。

实施例2、抗EV71单抗的特性分析

首先，通过SDS-PAGE鉴定从腹水中纯化的EV71单抗的纯度和完整性。图1显示了D5、H7、C4三种单抗的重链和轻链分别约为50KD (重链)和25KD(轻链)。

接着，通过ELISA方法检测了单抗与不同抗原的反应活性，包括灭活的EV71全病毒，重组表达的VP0或VP1蛋白。结果如图2，显示这些单抗与EV71病毒以及VP1蛋白反应而不与VP0反应，对照的无关抗体抗HBsAg单抗则不与EV71任何组分发生反应。

上述结果说明，D5、H7、C4单抗均特异性结合EV71的VP1区。

实施例3、免疫荧光染色检测EV71感染的细胞

本发明人还通过免疫荧光染色考察了D5、H7、C4是否可以检测EV71感染的细胞。

结果如图4，通过免疫荧光染色方法可以看到，D5单抗可以特异性地检测到EV71感染的细胞，而且绿色荧光信号定位在细胞质。

同样地，C4和H7也可以检测到感染的细胞，无关的抗HBsAg单抗则检测不到相应的信号。

实施例4、单克隆抗体的中和活性

通过体外微量滴定中和实验对单抗的中和活性进行检测，100TCID₅₀(半数细胞感染量的100倍)感染的细胞显示了明显的细胞病变(CPE)，如细胞变圆，漂浮，如图5B。无关抗体HBsAg与病毒孵育不能阻止细胞产生CPE，如图5C。作为参照，未感染的ED细胞的形态如图5A。而筛选的EV71单抗与病毒孵育后，能明显阻止细胞产生CPE，如图5D-F。结果说明，这些抗EV71单抗能中和EV71感染。

D5、H7、C4的95%抑制率(IC95)最低浓度分别为0.3125μg/ml、0.3125μg/ml和1.25μg/ml，如表1。可见，D5、H7具有极其优异的抑制病毒效果。

实施例5、单克隆抗体的基因序列分析

通过RT-PCR，克隆出了D5单抗的轻重链序列，具体如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，

为恒定区序列)：

D5单抗重链核苷酸序列(SEQ ID NO:15)：

ATGAAATGGAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCAGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCGGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATTCACTGGGTGAAACAGAGGCCTGAGCAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAAGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGACAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAACTCAAACTATTGGTTCGACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA

D5单抗重链氨基酸序列(SEQ ID NO:16)：

MKWSWVIFFLMAVVTGVNSEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGKIDPANGNTKYDPKFQDKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCANSNYWFDFDYWGQGTTLTSS

D5单抗轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:17)：

ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGATGATGTGGGAGTTTATTACTGCTATCAAGGCTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGA

D5单抗轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:18)：

MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVLMTQTPLSLPSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDVGVYYCYQGSHVPYTFGGGTKLEIKR

进一步地，分析D5单抗的重链可变区和轻链可变区序列。D5单抗的重链可变区氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1，下划线标注的为重链CDR区)：

上述重链可变区属于Igh-VSM7VH14家族。

D5单抗的轻链可变区氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2，下划线标注的为轻链CDR区)：

上述轻链可变区属于IGKV1亚群。

各CDR区氨基酸序列和核苷酸序列总结于表2。

表2

实施例6、单克隆抗体基因的重组表达及鉴定

为了验证所克隆的D5单抗的基因是否正确，本发明人将重链的编码序列和轻链的编码序列分别插入到pcDNA3.1中，构建表达载体pcDNA3.1-(mD5H)和pcDNA3.1-(mD5L)，然后共同转染CHO细胞，并通过ELISA检测细胞上清中是否有特异性结合EV71的抗体存在。

结果如图6，结果显示，表达D5抗体序列的细胞上清有很高的结合信号，而且与上清稀释倍数相关；而对照(没有转染相关质粒的细胞)上清不管稀释与否都没有结合信号。该结果证实了所扩增和表达的序列确实是D5抗体基因。

讨论

在本发明中，本发明人阐述了这三株单抗用来检测和鉴定EV71的可行性。ELISA和Western Blot实验表明这些抗体能够有效地识别EV71病毒，VP1重组蛋白，而不识别VP0重组蛋白。而且免疫荧光染色实验证实这些抗体可以非常有效地检测到EV71感染的细胞。这些特性为以后研究病毒的生物学特性如病毒进入，在细胞内运动以及定位提供了便利。

本发明第一次揭示了通过EV71病毒样颗粒免疫的方式制备中和性单克隆抗体的方法。筛选的中和抗体具有强大的中和活性，三株单抗D5、H7、C4的IC95分别为0.3125μg/ml，0.3125μg/ml和1.25μg/ml。本发明人的结果表明，利用重组表达的病毒样颗粒作为免疫原制备中和单抗的可行性，这种方法对于一些无法进行细胞培养的病毒单抗制备非常有用。

而且，本发明的单抗能用于Western Blot检测VP1，提示其针对的是线性表位。

综上所述，本发明人的抗体不仅可用来开发人源化抗EV71治疗性单抗，而且还是用来开发诊断方法以及研究病毒生物学特性的有效材料。

菌株保藏

本发明的产生单克隆抗体的细胞株D5、H7、C4分别于2012年3月15日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号分别为CCTCC No.C201232(D5)，CCTCC No.C201233(H7)，CCTCC No.C211234(C4)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种结合分子，其特异性结合肠道病毒71型；并且，其抑制95%细胞病变的浓度低于1.5μg/ml。

2.如权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子包含SEQ IDNO:3所示重链CDR1区、SEQ ID NO:4所示重链CDR2和SEQ ID NO:5所示重链CDR3区。

3.如权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子包含SEQ IDNO:6所示轻链CDR1区、SEQ ID NO:7所示轻链CDR2和SEQ ID NO:8所示轻链CDR3区。

4.如权利要求1-3任一所述的结合分子，其特征在于，包含重链可变区，所述的重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1-3任一所述的结合分子，其特征在于，包含轻链可变区，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

6.如权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述的结合分子是人单克隆抗体，由选自以下的杂交瘤细胞株制备获得：

在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC No.C201232的杂交瘤细胞株；

在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC No.C201233的杂交瘤细胞株；或

在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC No.C201234的杂交瘤细胞株。

7.编码权利要求2-5任一所述的结合分子的核酸分子。

8.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中含有编码权利要求2-5任一所述的结合分子的核酸。

9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有权利要求8所述的表达载体；或其基因组中整合有编码权利要求2-5任一所述的结合分子的核酸。

10.权利要求1-6任一所述的结合分子在制备用于诊断、治疗和/或预防肠道病毒71型感染的试剂、试剂盒或药物中的用途。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的试剂或药物还用于诊断、治疗和/或预防手足口病。

12.一种抑制肠道病毒71型的组合物，其特征在于，它含有有效量的权利要求1-6任一所述的结合分子，以及药学上可接受的载体。

13.一种检测肠道病毒71型的试剂盒，其包括权利要求1-6任一所述的结合分子。

14.一种抑制肠道病毒71型的方法，其特征在于，所述的方法包括给予对象有效量的权利要求1-6所述的结合分子。

15.一种检测肠道病毒71型的方法，其特征在于，利用权利要求1-6任一所述的结合分子与待测样品进行接触，通过检测所述的结合分子与待测样品的结合情况，获得肠道病毒71型的存在情况以及存在量。

16.产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株，选自：