CN105664166A - 一种治疗肠道病毒感染的组合物和联合用药方法 - Google Patents

一种治疗肠道病毒感染的组合物和联合用药方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105664166A
CN105664166A CN201610067175.3A CN201610067175A CN105664166A CN 105664166 A CN105664166 A CN 105664166A CN 201610067175 A CN201610067175 A CN 201610067175A CN 105664166 A CN105664166 A CN 105664166A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enterovirus
albumen
favipiravir
active component
compositions
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610067175.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105664166B (zh
Inventor
邹罡
艾德铭
王一卓
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Institute Of Immunology And Infection Chinese Academy Of Sciences
Original Assignee
Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur of Shanghai of CAS filed Critical Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Priority to CN201610067175.3A priority Critical patent/CN105664166B/zh
Publication of CN105664166A publication Critical patent/CN105664166A/zh
Priority to US16/073,487 priority patent/US10864210B2/en
Priority to SG11201806433VA priority patent/SG11201806433VA/en
Priority to PCT/CN2017/070858 priority patent/WO2017128950A1/zh
Priority to JP2018558467A priority patent/JP6644917B2/ja
Priority to AU2017210921A priority patent/AU2017210921B2/en
Priority to MYPI2018702616A priority patent/MY201019A/en
Application granted granted Critical
Publication of CN105664166B publication Critical patent/CN105664166B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本发明提供了一种治疗肠道病毒感染的组合物和联合用药方法，具体地本发明提供了一种抑制肠道病毒组合物，所述组合物包括第一活性成分和第二活性成分，其中，所述第一活性成分为肠道病毒(如，EV71)的3D蛋白抑制剂；所述第二活性成分为肠道病毒(如，EV71)的衣壳蛋白抑制剂。实验结果表明，此药物组合具有显著的协同作用，而且在被测浓度组合下均未发现增强的细胞毒性。

Description

一种治疗肠道病毒感染的组合物和联合用药方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种治疗肠道病毒感染的组合物和联合用药方法。
背景技术
肠道病毒是带有单股正链RNA的微小核糖核酸病毒科病毒，目前共发现多于100种血清型。多数肠道病毒感染并不引起严重的症状或仅仅引起较轻微的疾病，但在儿童和免疫缺陷人群中通常造成严重后果[1]。肠道病毒属中的肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16(CVA16)是引起亚太地区婴幼儿手足口病的主要病原体[2]。手足口病的症状通常较轻微如发热、咽痛、腹泻、局部出疹等，但也有些病人会发展成中枢神经系统(CNS)疾病，如无菌性脑膜炎、致死性脑炎甚至死亡[3-5]。而EV71是引起重症手足口病的主要病原体[6]。迄今为止尚无有效针对肠道病毒感染的药物治疗手段，现有的治疗手段仅限于支持性护理、静脉注射免疫球蛋白或利巴韦林[5， 7]，因此寻找抗病毒药物迫在眉睫。肠道病毒使用病毒自身的RNA依赖性RNA聚合酶合成基因组，所以在RNA复制过程中，子代RNA很容易发生突变。
因此，为了有效地预防或治疗肠道病毒感染，本领域迫切需要开发新型的预防和/或治疗肠道病毒感染的技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗肠道病毒感染的组分和联合用药方法。
本发明的第一方面，提供了一种抑制肠道病毒组合物，所述组合物包括第一活性成分和第二活性成分，
其中，所述第一活性成分为肠道病毒(如，EV71)的3D蛋白抑制剂；
所述第二活性成分为肠道病毒(如，EV71)的衣壳蛋白抑制剂。
在另一优选例中，所述第一活性成分特异性结合肠道病毒的3D蛋白的第121位氨基酸残基(优选为丝氨酸残基)，其中氨基酸残基编号基于SEQIDNO.1。
在另一优选例中，所述第一活性成分包括法匹拉韦、其类似物、或其药学上可接受的盐；
所述第二活性成分包括苏拉明、其类似物、或其药学上可接受盐。
在另一优选例中，所述法匹拉韦的类似物包括对肠道病毒的作用靶点与法匹拉韦相同的物质。
在另一优选例中，所述苏拉明的类似物包括对肠道病毒的作用靶点与苏拉明相同的物质。
在另一优选例中，所述肠道病毒选自下组：肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16(CVA16)、CVB3型、PV1型或EV68型，以及鼻病毒。
在另一优选例中，所述第一活性成分和第二活性成分的摩尔比约为10～100：1～20，优选地为10～100：1～10，更更优选地为10～100：1～5。
在另一优选例中，所述第一活性成分具有肠道病毒(如，EV71)的3D蛋白抑制活性。
在另一优选例中，所述第二活性成分具有肠道病毒(如，EV71)的衣壳蛋白抑制活性。
在另一优选例中，所述组合物中还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊、丸剂、注射剂、或口服液。
在另一优选例中，所述的组合物为单元剂型，每个单元剂型中所述第一活性成分和所述第二活性成分的含量约为日剂量的0.1至1(或0.25-1，或0.5-1)，其中所述日剂量为20-100mg。
在另一优选例中，所述的日剂量为25-70mg，如25mg、40mg、50mg。
本发明的第二方面，提供了如本发明第一方面所述的抑制肠道病毒组合物的用途，用于制备预防和/或治疗肠道病毒感染的药物。
本发明的第三方面，提供了一种预防和/或治疗肠道病毒感染的方法，所述方法包括步骤：
给需要的对象施用本发明第一方面所述的抑制肠道病毒组合物，从而抑制所述对象体内的肠道病毒。
在另一优选例中，所述的对象包括人和非人哺乳动物(如啮齿动物)。
在另一优选例中，所述的施用的用量为10-100mg/kg体重，较佳地15-70mg/kg体重，更佳地10-50mg/kg体重，以所述第一活性成分的重量计。
本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性地抑制肠道病毒生长或者杀灭肠道病毒的方法，包括步骤：在需要处理的场所使用本发明的第一方面所述的抑制肠道病毒组合物。
本发明的第五方面，提供了法匹拉韦、其类似物、或其药学上可接受盐在制备试剂中的用途，所述试剂用于：
(I)抑制肠道病毒3D蛋白的合成,和/或
(II)特异性结合肠道病毒3D蛋白的第121位氨基酸残基，其中氨基酸残基编号基于SEQIDNO.1。
在另一优选例中，所述肠道病毒3D蛋白的第121位氨基酸残基为丝氨酸。
在另一优选例中，所述试剂还用于：(III)抑制肠道病毒的复制。
在另一优选例中，所述肠道病毒为肠道病毒71型。
本发明的第六方面，提供了一种复合物，所述复合物如式I所示
A-B(I)
其中，A为法匹拉韦或其类似物；B为肠道病毒的3D蛋白。
在另一优选例中，所述复合物中，A和B的结合位点包括肠道病毒3D蛋白的第121位氨基酸残基，其中氨基酸残基编号基于SEQIDNO.1。
本发明的第七方面，提供了一种肠道病毒耐药毒株，所述毒株的3D蛋白发生了突变，并且所述突变导致所述肠道病毒产生了耐药性。
在另一优选例中，所述突变发生在3D蛋白的第121位氨基酸残基。
在另一优选例中，所述3D蛋白的第121位氨基酸残基由丝氨酸残基突变为天冬氨酸残基。
在另一优选例中，所述毒株为肠道病毒71型毒株。
本发明的第八方面，提供了本发明第七方面所述的耐药毒株的用途，用于筛选抑制或杀灭肠道病毒的药剂或试剂。
本发明的第九方面，提供了一种本发明所述的肠道病毒耐药毒株的抑制剂，所述抑制剂能抑制或杀灭本发明第七方面所述的的耐药毒株。
本发明的第十方面，提供了一种筛选药物的方法，所述方法包括：将待筛选药物与肠道病毒或者肠道病毒的3D蛋白接触，并检测是否形成式II所述的复合物，
A'-B(II)
其中，A'为待筛选药物；B为肠道病毒的3D蛋白.
在另一优选例中，所述复合物中，A’和B的结合位点包括肠道病毒3D蛋白的第121位氨基酸残基，其中氨基酸残基编号基于SEQIDNO.1
在另一优选例中，所述待筛选药物包括法匹拉韦、其类似物、或其药学上可接受盐。
本发明的第十一方面，提供了一种肠道病毒的抑制剂，所述抑制剂以肠道病毒3D蛋白为靶点，抑制所述肠道病毒的生长或繁殖。
在另一优选例中，所述抑制剂以肠道病毒3D蛋白的第121位氨基酸残基为靶点，其中氨基酸残基编号基于SEQIDNO.1。
在另一优选例中，所述抑制剂选自法匹拉韦、其类似物、或其药学上可接受盐。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1.伊曲康唑、芦平曲韦、法匹拉韦、苏拉明和GW5074抑制EV71的感染。其中，图1A显示了各化合物对EV71的抑制效果及对细胞的毒性作用；图1B显示了显示了不同浓度的各化合物对病毒滴度的影响.
图2.法匹拉韦通过作用于肠道病毒71型3D蛋白抑制病毒复制。
图3.不同药物组合在治疗EV71感染中的相互作用效果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，首次意外地发现了一种抑制肠道病毒组合物，所述组合物中以法匹拉韦为第一活性成分，以苏拉明为第二活性成分，实验结果表明，此药物组合具有显著的协同作用，而且在被测浓度组合下均未发现增强的细胞毒性。
本发明公开了能够有效抑制肠道病毒感染的联合用药方法。针对肠道病毒的抑制活性，本发明人经过大量的测试意外的发现法匹拉韦和苏拉明表现出显著地协同作用。而且上述药物组合，在被测浓度组合下均未发现增强的细胞毒性。法匹拉韦和苏拉明组合能够阻止耐药病毒的产生。此外本发明人还发现法匹拉韦通过作用于EV71的3D蛋白来抑制病毒复制，该位点可以作为潜在的靶点用以开发抗病毒药物。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
法匹拉韦及其类似物
法匹拉韦(favipiravir)是一种具有广谱抗病毒活性的RdRP抑制剂[20]。经过深入的研究本发明人意外地发现法匹拉韦能够在体外抑制EV71复制，机制研究发现其作用位点位于EV71的3D蛋白。
在本发明的一个优选地实施方式中，根据本发明的法匹拉韦的类似物包括对肠道病毒的作用靶点与法匹拉韦相同的物质。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种肠道病毒的抑制剂，所述抑制剂以肠道病毒3D蛋白为靶点，抑制所述肠道病毒的生长或繁殖。
在一个优选地实施方式中，所述抑制剂以肠道病毒3D蛋白的第121位氨基酸残基为靶点，其中氨基酸残基编号基于SEQIDNO.1。
在一个优选地实施方式中，所述抑制剂选自法匹拉韦、其类似物、或其药学上可接受盐。
3D蛋白是一种肠道病毒(EV71病毒)RNA依赖的RNA聚合酶，是病毒基因组编码的重要的酶，它催化了病毒基因组的复制和转录。在本发明的一个优选地实施方式中，所述3D蛋白的氨基酸序列如下：
GEIQWVKPNKETGRLNINGPTRTKLEPSVFHDIFEGNKEPAVLHSKDPRLEVDFEQALFSKYVGNTLYEPDEYIKEAALHYANQLKQLEINTSQMSMEEACYGTENLEAIDLHTSAGYPYSALGIKKRDILDPTTRDVSKMKFYMDKYGLDLPYSTYVKDELRSIDKIKKGKSRLIEASSLNDSVYLRMTFGHLYEAFHANPGTITGSAVGCNPDTFWSKLPILLPGSLFAFDYSGYDASLSPVWFRALELVLREIGYSERAVSLIEGINHTHHVYRNKTYCVLGGMPSGCSGTSIFNSMINNIIIRALLIKTFKGIDLDELNMVAYGDDVLASYPFPIDCLELAKTGKEYGLTMTPADKSPCFNEVNWGNATFLKRGFLPDEQFPFLIHPTMPMREIHESIRWTKDARNTQDHVRSLCLLAWHNGKQEYEKFVSTIRSVPVGRALAIPNYENLRRNWLELF
(SEQIDNO.1)
苏拉明及其类似物
苏拉明(suramin)在临床上用于治疗锥体虫病，它能够与EV71的衣壳蛋白作用从而抑制病毒吸附进入细胞[16-17]。
在本发明的一个优选地实施方式中，根据本发明的苏拉明的类似物具有下式IV所示的结构：
在本发明的一个优选地实施方式中，根据本发明的苏拉明的类似物包括对肠道病毒的作用靶点与苏拉明相同的物质(如：NF449、NF110、NM16)
NF449：
NF110：
NM16：
芦平曲韦及其类似物
芦平曲韦(rupintrivir)最初用于治疗鼻病毒感染，研究表明它主要通过抑制EV71的3C蛋白从而抑制病毒复制[8-9]。
在本发明的一个优选地实施方式中，根据本发明的芦平曲韦的类似物AG7404具有如下结构：
在本发明的一个优选地实施方式中，根据本发明的芦平曲韦的类似物包括对肠道病毒的作用靶点与芦平曲韦相同的物质(如：AG7404)。
伊曲康唑及其类似物
伊曲康唑(itraconazole)是一种口服的三唑类广谱抗真菌剂，能够抑制曲霉菌和白色念珠菌[10-11]，也能有效治疗儿童的霉菌感染[12-13]，它也是一种最近被报道的肠道病毒广谱抑制剂，通过作用于病毒的3A蛋白和宿主的氧化固醇结合蛋白抑制病毒生命周期[14-15]。
在本发明的一个优选地实施方式中，根据本发明的伊曲康唑的类似物包括对肠道病毒的作用靶点与伊曲康唑相同的物质。
GW5074及其类似物
GW5074是Raf信号通路激酶抑制剂，对肠道病毒复制具有抑制作用，但并不作用于该细胞通路，它通过作用于脊髓灰质炎病毒的3A蛋白发挥抗病毒活性[18-19]。
本申请所涉及的化合物的结构式如下：1为伊曲康唑，2为芦平曲韦，3法匹拉韦，4为GW5074，5为苏拉明。
在联合用药疗法中，苏拉明和法匹拉韦表现出显著的强协同作用，且在被测浓度下没有检测到明显增强的细胞毒性；芦平曲韦和法匹拉韦表现出弱协同作用；芦平曲韦和苏拉明表现出叠加作用；而伊曲康唑和苏拉明，伊曲康唑和法匹拉韦，GW5074和伊曲康唑表现出强拮抗作用。
组合物
如本文所用，术语“组合物”包括药物组合物。
发明第一方面所述的组合物包含抑制肠道病毒的活性成分，和药学上可接受的载体。抑制肠道病毒的活性成分包括第一活性成分和第二活性成分，其中，所述第一活性成分包括法匹拉韦、其类似物、或其药学上可接受的盐；而第二活性成分选自下组：苏拉明、其类似物、或其药学上可接受盐；和芦平曲韦、其类似物、或其药学上可接受盐。
本发明的药物组合物还可以包含各种与所含化合物或组合物相适应的药物辅料，并通过常规方法制备成有利于给药的剂型，如：但不仅限于水溶液注射剂、粉针剂、丸剂、散剂、片剂、贴剂、栓剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、颗粒剂、胶囊剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释剂和控释剂等。所述药用辅料既可以是各种制剂中常规使用的，如：但不仅限于等渗剂、缓冲液、矫味剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂等；也可以是为了与所述物质相适应而选择使用的，如：但不仅限于乳化剂、增溶剂、抑菌剂、止痛剂和抗氧剂等，这类辅料能有效提高组合物所含化合物的稳定性和溶解性或改变化合物的释放速率和吸收速率等，从而改善各种化合物在生物体内的代谢，进而增强组合物的给药效果。此外，还可以为实现特定的给药目的或方式，如：缓释给药、控释给药和脉冲给药等，而使用的辅料，如：但不仅限于明胶、白蛋白、壳聚糖、聚醚和聚酯类高分子材料(如：但不仅限于，聚乙二醇、聚氨酯、聚碳酸酯及其共聚物等)。所述有利于给药的主要表现有：但不仅限于提高治疗效果、提高生物利用度、降低毒副作用和提高患者顺应性等。
在水溶液注射剂中，辅料一般包括等渗剂和缓冲液，以及必要的乳化剂(如：Tweeen-80、Pluronic和Poloxamer等)、增溶剂和抑菌剂等。此外，还包括含有药学上可接受的其它药用辅料，如：抗氧剂、pH调节剂和止痛剂等。
用于制取口服液体制剂的辅料一般包括溶剂，以及必要的矫味剂、抑菌剂、乳化剂和着色剂等。
用于制取片剂的辅料一般包括填充剂(如：淀粉、糖粉、糊精、乳糖、可压性淀粉、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙和甘露醇等)、粘合剂(如：乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶溶液、蔗糖溶液和聚乙烯吡咯烷酮的水溶液或醇溶液等)、崩解剂(如：干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮和交联羧甲基纤维素钠)和润滑剂(如：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇4,000、聚乙二醇6,000和月桂醇硫酸镁等)等。
用于制取乳剂的辅料一般为水、油(如：脂肪酸)、乳化剂，以及必要的防腐剂和矫味剂等。
用于制取颗粒剂的辅料与片剂类似，但造粒过程不同。根据需要，将制得的颗粒剂与助流剂混合后装入胶囊即得胶囊剂。
如本文所用，术语“对象”、“生物体”、“动物”或“患者”包括人、野生动物和家畜(Livestock)。野生动物为自然状态下未经人工驯化的动物。家畜是为了提供食物来源而人工饲养的动物，如：但不仅限于狗、猫、鼠、大鼠、仓鼠、猪、兔、奶牛、水牛、公牛、绵羊、山羊、鹅和鸡等。给予治疗的“患者”或“生物体”优先选择哺乳动物，尤其是人。
如本文所用，术语“预防”是指在未被临床标准认定的疾病前，各种用于防止疾病发生或发展的手段或措施，包括医学、物理或化学的方法，以阻止和降低疾病各种症状的发生或发展。
如本文所用，术语“治疗”是指为了阻止和降低疾病的发生或发展，使疾病病程的发展或加重得以抑制、遏制、减轻、改善、减缓、停止、延迟或反转，所描述的保持和/或用药时的疾病的、紊乱的或病理学状态的各种指标包括减轻或减少症状或并发症，或治愈或消除疾病、紊乱或状况。
如本文所用，术语“药物”是指可以用于预防或治疗某种疾病的单一化合物、多种化合物形成的组合物，或指以单一化合物为主要活性成分的组合物或制剂(formulation)，还指由多种化合物为活性成分的组合物或制剂。“药物”应理解为不仅指根据一国之法律规定，通过其设立的行政机构审批并准予生产的产品，还指在为了获得通过审批和准予生产的过程中，所形成的含单一化合物为活性成分的各类物质形态。“形成”应理解为通过化学合成、生物转化或购买等途径获得。
本发明提供的作为药物组合物的给药途径，包括但不仅限于，口服(Oral)、鼻腔(Nasal)、(面)颊(Buccal)、透皮(Transdermal)、肺部(Pulmonal)、阴道(Vaginal)、皮下(Subcutaneous)或静脉(Intravenous)给予生物体。
本发明的主要优点在于：
(1)首次揭示了法匹拉韦、和苏拉明针对肠道病毒的协同抑制作用；
(2)本发明组合物起效量低；
(3)本发明的组合物可大幅降低临床用药量，既可降低生产成本，也能减轻患者负担；
(4)本发明的组合物可以阻止耐药株的产生；
(5)本发明首次公开了一种新颖的肠道病毒作用靶点。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
材料和方法：
细胞、病毒和化合物
RD(人横纹肌瘤)、Vero(非洲绿猴肾)细胞在含有1％青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin,P/S)和10％胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)的DMEM培养基中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养。EV71FY573株(GenBank登录号HM064456)用于评估化合物抗病毒活性、病毒效价减少实验和联合用药实验。EV71G082用于病毒效价减少实验、突变病毒筛选以及评估实验。化合物伊曲康唑、芦平曲韦、法匹拉韦和GW5074分别购自Sigma-Aldrich、SantaCruz和Chembest公司，并溶解于DMSO中进行实验。苏拉明购自拜尔公司并溶解于培养基中。
化合物的评估实验
从Sigma-Aldrich购得伊曲康唑，溶于DMSO中，终浓度为10mM，从拜尔购得苏拉明，溶于含有2％FBS的培养基中，终浓度为50mM，从Chembest购得法匹拉韦，溶于DMSO中，终浓度为400mM，从SantaCruz公司购得芦平曲韦，溶于DMSO中，终浓度为2mM，从Sigma公司购得GW5074，溶于DMSO中，终浓度为10mM。为了评估五种化合物抑制EV71诱导的CPE活性，本发明人进行了剂量依赖实验。向96孔白板(CorningCostar)的每孔中加入50μl含有10000个RD细胞的DMEM，在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，每孔分别加入梯度稀释的被测化合物(对于溶解于DMSO中的化合物，DMSO终浓度为0.25％)，对照组中加入5μl0.25％的DMSO或培养基。然后加入45μl含150PFU的病毒稀释液，每孔的终体积为100μl，培养96小时后，取出，于室温下平衡30分钟。而后每孔加入50μlCellTiter-Glo(Promega)试剂，在室温下放置10到30分钟，使用VeritasMicroplateLuminometer(TurnerBioSystem)酶标仪进行检测。为了测定化合物对细胞的作用，本发明人进行了细胞毒性实验，实验方法与剂量依赖实验相同，但是不再加入病毒液，取而代之的是等体积的含2％FBS和1％P/S的DMEM。
联合用药实验
为评估联合用药疗法对EV71感染的抑制效果，本发明人采用了棋盘法进行实验[21-22]。向96孔白板(CorningCostar)的每孔中加入50μl含有10000个RD细胞的DMEM，在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，向96孔板的中央60个孔中分别加入5μl两种2倍稀释的被测化合物，对照组中加入5μl0.25％的DMSO或培养基。然后加入40μl含150PFU的病毒稀释液，每孔的终体积为100μl，培养96小时后，取出，于室温下平衡30分钟。而后每孔加入50μlCellTiter-Glo(Promega)试剂，在室温下放置10到30分钟，使用VeritasMicroplateLuminometer(TurnerBioSystem)酶标仪进行检测。为了测定同时加入两种化合物对细胞的影响，本发明人进行了细胞毒性实验，实验方法与联合用药实验相同，但是不再加入病毒液，取而代之的是等体积的含2％FBS和1％P/S的DMEM。实验结果用MacSynergyII软件分析并得出3D示意图。
病毒效价的测定
测EV71G082株和重组病毒的效价，向12孔板(CorningCostar)的每孔中加入1ml含3×105个Vero细胞的DMEM，培养24h。病毒进行10倍倍比稀释，即将27μl病毒液与243μl的含2％FBS和1％P/S的DMEM混匀。吸出12孔板中的培养基，每孔加入200μl病毒液。放置在37℃，5％CO2的培养箱中感染1h，每隔15分钟轻轻摇动。然后吸出病毒液，加入1ml含0.8％甲基纤维素(AquacideⅡ，Calbiochem)和2％FBS的DMEM，在37℃，5％CO2的培养箱中培养6天，置于3.7％的福尔马林中固定1h后，用1％的结晶紫染色。
EV71FY573株的滴度是通过半数组织培养感染剂量(TCID50)测定的。向96孔透明板每孔中加入20000个RD细胞，培养24小时后加入100μl10倍倍比稀释的病毒(从10-1到10-8)，每个稀释度的病毒加入到10个孔中。感染1小时后，吸出病毒，加入含2％FBS的DMEM。在37℃，5％CO2的培养箱中培养7天后置于3.7％的福尔马林中固定1h后，用1％的结晶紫染色。用Reed-Muench方法测病毒滴度并表示为TCID50/ml。
病毒效价减少实验
在12孔板中接种RD细胞，3×105个/孔，37℃培养过夜，24小时后加入MOI＝0.1的EV71病毒液和2倍倍比稀释的伊曲康唑、芦平曲韦、法匹拉韦、苏拉明和GW5074，在37℃培养48h后，收集上清液，放到-80℃冰箱中冻存，然后测定病毒滴度。为测定传代病毒对法匹拉韦的耐药性，本发明人在12孔板中接种Vero细胞，3×105个/孔，37℃培养过夜，24小时后加入MOI＝0.1的EV71病毒液和浓度分别为300μM和600μM的法匹拉韦，在37℃培养48h后，收集上清液，放到-80℃冰箱中冻存，然后测定病毒滴度。
病毒筛选实验
为筛抗法匹拉韦耐药株，本发明人进行了传代实验。3×105个Vero细胞被接种在12孔板中，37℃培养过夜，24小时后加入MOI＝0.1的EV71G082株病毒液和法匹拉韦，当观察到明显的细胞病变效应时收集上清，利用收集到的病毒感染预先培养好的Vero细胞，并继续加入法匹拉韦，传代过程中逐渐提高法匹拉韦的浓度，每个浓度筛选一到三轮，每一轮有一个对照组。连续传代16代后，测定上清中病毒的滴度、对化合物的耐药性并测序。
突变病毒耐药性实验
为测定筛选出的突变病毒和重组病毒对化合物的抗性，本发明人进行了基于细胞病变效应的实验和病毒效价减少实验。基于细胞病变效应的实验中，向96孔白板的每孔中加入5000个Vero细胞，在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，每孔分别加入梯度稀释的被测化合物(对于溶解于DMSO中的化合物，DMSO终浓度为0.25％)，对照组中加入5μl0.25％的DMSO或培养基。然后加入45μl含250PFU的突变病毒或重组病毒稀释液，每孔的终体积为100μl，培养96小时后，取出，于室温下平衡30分钟。而后每孔加入50μlCellTiter-Glo试剂，在室温下放置10到30分钟，使用VeritasMicroplateLuminometer酶标仪进行检测。EV71G082株作为对照。
病毒效价减少实验中，在12孔板中接种Vero细胞，3×105个/孔，37℃培养过夜，24小时后加入MOI＝0.1的EV71病毒液和300μM的法匹拉韦，培养48小时后收集上清，并检测病毒滴度。
构建突变病毒
依照制造商的说明书使用FastSite-directedMutagenesiskit(TransGenBiotech)构建出含有突变DNA片段的质粒并测序验证。线性化测序正确的cDNA，依照体外转录试剂盒MEGAscriptT7Kit(Ambion)转录出RNA并使用电转法将RNA转入Vero细胞，待观察到明显的CPE后收集上清，利用空斑形成实验测定病毒滴度。
RT-PCR
参照QIAampviralRNAminikit(Qiagen)试剂盒使用说明书提取病毒RNA并于-80度保存，使用SuperScriptIIIOne-StepRT-PCRSystemwithPlatinumTapDNAPolymerase(Invotroge)试剂盒完成PCR反应。
免疫染色实验
为定性检测耐药株筛选实验中的病毒，本发明人进行了免疫染色。在24孔板中预先接种3×105个Vero细胞，在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，向每孔加入病毒原液和10倍稀释的病毒，放置在37℃，5％CO2的培养箱中感染1h，每隔15分钟轻轻摇动。然后吸出病毒液，加入1ml含0.8％甲基纤维素(AquacideⅡ，Calbiochem)和2％FBS的DMEM，在37℃，5％CO2的培养箱中培养6天。用4％甲醛溶液固定细胞，固定好的细胞用含有0.05％的吐温-20的PBS(PBS-T)洗涤两次，然后与抗肠道病毒71型的一抗(MAB979,MerckMilipore)在室温下孵育1h，之后用PBS-T洗涤三次，与连接有辣根过氧化酶的二抗(羊抗鼠，Bethyl,Montgomery,TX)于室温孵育1h。再经过3次PBS洗涤，加入TrueBlue过氧化物酶底物(50-78-02)显色，至对照组形成明显蓝色斑点，利用蒸馏水停止反应，烘干并记录结果。产生蓝色的细胞为阳性，未产生蓝色的细胞则不含有病毒。
数据分析
把原始数据输入到Excel表格中计算信背比(S/B)，信噪比(S/N)，Z因子以及待测化合物对病毒的抑制率。计算公式如下：S/B＝μc/μv，μc表示细胞对照组信号的平均值，μv表示病毒对照组信号的平均值，S/N＝(μc-μv)/(σc-σv),σc表示细胞对照组信号的标准差，σv表示病毒对照组信号的标准差，Z＝1-((3σc+3σv)/|μc-μv|),Z因子在0.5与1之间表示实验方法能够有效的区分对照组之间的差异[23]。化合物的抗病毒活性CPE抑制率＝(μcpd-μv)/(μc-μv)×100％，μcpd表示待测化合物的平均信号强度，化合物对细胞的作用细胞存活率＝μcpd/μc×100％。半数最大效应浓度(EC50)是指能引起50％最大效应的浓度。半数细胞毒性浓度(CC50)是指引起50％细胞毒性反应的药物浓度，在此实验中表示为实验组比对照组荧光强度降低50％。在利用MacsnergyII分析两种化合物的相互作用效果时，在95％置信度，大于零的体积代表两个化合物的相互作用为协同效果，负值代表拮抗作用。位于-25和+25之间的数值代表两种化合物见的作用不显著，位于25和50之间的数值代表显著但较弱的协同作用，位于50和100间的数值意味着中等协同作用，大于100的数值表示强协同作用。
实施例1单组分活性测定
伊曲康唑、芦平曲韦、法匹拉韦、苏拉明和GW5074能够有效抑制EV71对细胞的感染，呈剂量依赖关系。
图1.伊曲康唑、芦平曲韦、法匹拉韦、苏拉明和GW5074抑制EV71的感染。(A)RD细胞中分别加入2倍倍比稀释的伊曲康唑、芦平曲韦、法匹拉韦、苏拉明和GW5074，加入病毒或培养基培养96h后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞活力，检测四种化合物对EV71的抑制效果及对细胞的毒性作用。(B)RD细胞中分别加入病毒和2倍倍比稀释的伊曲康唑、芦平曲韦、法匹拉韦、苏拉明和GW5074，培养48小时后收集上清，并用TCID50法测定病毒滴度。结果使用GraphpadPrism5进行处理。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表两组平行实验的标准差。
实施例2法匹拉韦作用于肠道病毒71型3D蛋白
通过筛选对法匹拉韦具有耐药性的病毒，本发明人得到两株具有耐药性的病毒。病毒效价减少实验表明这两株病毒均能对法匹拉韦产生耐药性，且通过序列分析本发明人发现在3D蛋白上出现相同的突变。耐药病毒表型实验证明带有3D蛋白第121位突变的EV71对法匹拉韦具有抗性。利用反向遗传学系统，本发明人构建出带有该突变的病毒，并验证其对法匹拉韦的耐药性。结果表明，肠道病毒71型的3D蛋白第121位由丝氨酸突变为天冬氨酸会赋予EV71耐药性，因此本发明人推断法匹拉韦作用于EV71的3D蛋白。此外，本发明人测试了伊曲康唑、芦平曲韦、苏拉明和GW5074对该突变病毒的抑制效果，通过与野生型病毒(G082)比较，没有发现交叉耐药性。结果如图2所示。
图2.法匹拉韦通过作用于肠道病毒71型3D蛋白抑制病毒复制。(A)将肠道病毒71型和法匹拉韦共同培养，并不断增加法匹拉韦浓度。收集第16代培养基上清，测序。利用反向遗传学系统构建含有3D蛋白突变的EV71，利用空斑形成实验测定病毒滴度，利用病毒效价减少实验检测病毒对法匹拉韦的耐药性，实验方法与化合物验证实验相同。(B)利用基于细胞病变效应的实验测定伊曲康唑、芦平曲韦、苏拉明和GW5074对含有3D蛋白突变的病毒的作用效果。结果使用GraphpadPrism5进行处理。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表两组平行实验的标准差。
实施例3组合活性测试
伊曲康唑、芦平曲韦、法匹拉韦、苏拉明和GW5074相互组合在治疗EV71感染中产生协同、叠加或者拮抗三种不同效果。结果如图3所示。
图3.不同药物组合在治疗EV71感染中的相互作用效果。3D图使用MacSynergyII软件做出，图中的数据来自至少三次独立的平行实验。(A)伊曲康唑和GW5074组合，(B)伊曲康唑和苏拉明组合，(C)苏拉明和芦平曲韦组合，(D)法匹拉韦和芦平曲韦组合，(E)法匹拉韦和苏拉明组合，(F)法匹拉韦和伊曲康唑组合。水平面代表两种药物的相互作用为叠加效果，水平面以上的点代表两种药物的作用为协同效果，水平面以下则为拮抗效果。
表1
表1为根据MacSynergyII软件所计算得到的协同、叠加或拮抗结果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
参考文谢：
1.PallanschM,RoosR.2007.Enteroviruses:polioviruses,coxsackieviruses,echoviruses,andnewerenteroviruses,p840–893.InKnipeD,Howley
2.McMinn,P.,Stratov,I.,Nagarajan,L.,Davis,S.,2001.Neurologicalmanifestationsofenterovirus71infectioninchildrenduringanoutbreakofhand,foot,andmouthdiseaseinWesternAustralia.Clinicalinfectiousdiseases:anofficialpublicationoftheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica32,236-242.
3.WangSM,LiuCC.Enterovirus71:epidemiology,pathogenesisandmanagement.ExpertRevAntiInfectTher2009；7:735-742.
4.ChangLY,LinTY,HsuKH,etal.Clinicalfeaturesandriskfactorsofpulmonaryoedemaafterenterovirus-71-relatedhand,foot,andmouthdisease.Lancet1999；354:1682-1686.
5.OoiMH,WongSC,LewthwaiteP,CardosaMJ,SolomonT.Clinicalfeatures,diagnosis,andmanagementofenterovirus71.LancetNeurol2010；9:1097-1105.
6.McMinn,P.C..Anoverviewoftheevolutionofenterovirus71anditsclinicalandpublichealthsignificance.FEMSmicrobiologyreviews2002；26:91-107.
7.SolomonT,LewthwaiteP,PereraD,CardosaMJ,McMinnP,OoiMH.Virology,epidemiology,pathogenesis,andcontrolofenterovirus71.LancetInfectDis2010；10:778-790.
8.ZhangG,ZhouF,GuB,etal.Invitroandinvivoevaluationofribavirinandpleconarilantiviralactivityagainstenterovirus71infection.ArchVirol2012；157:669-679.
9.ZhangX,SongZ,QinB,etal.Rupintrivirisapromisingcandidatefortreatingseverecasesofenterovirus-71infection:evaluationofantiviralefficacyinamurineinfectionmodel.AntiviralRes2013；97:264-269.
10.ZhangXN,SongZG,JiangT,ShiBS,HuYW,YuanZH.RupintrivirisapromisingcandidatefortreatingseverecasesofEnterovirus-71infection.WorldJGastroenterol2010；16:201-209.
11.Haria,M.,Bryson,H.M.,Goa,K.L.,1996.Itraconazole.Areappraisalofitspharmacologicalpropertiesandtherapeuticuseinthemanagementofsuperficialfungalinfections.Drugs51,585-620.
12.Potter,M.,2005.Strategiesformanagingsystemicfungalinfectionandtheplaceofitraconazole.TheJournalofantimicrobialchemotherapy56Suppl1,i49-i54.
13.Gupta,A.K.,Chang,P.,DelRosso,J.Q.,Adam,P.,Hofstader,S.L.,1998.Onychomycosisinchildren:prevalenceandmanagement.Pediatricdermatology15,464-471.
14.Gupta,A.K.,Hofstader,S.L.,Adam,P.,Summerbell,R.C.,1999.Tineacapitis:anoverviewwithemphasisonmanagement.Pediatricdermatology16,171-189.
15.GaoQ,YuanS,ZhangC,etal.Discoveryofitraconazolewithbroad-spectruminvitroantienterovirusactivitythattargetsnonstructuralprotein3A.AntimicrobAgentsChemother2015；59:2654-2665.
16.StratingJR,vanderLindenL,AlbulescuL,etal.Itraconazoleinhibitsenterovirusreplicationbytargetingtheoxysterol-bindingprotein.CellRep2015；10:600-615.
17.RenP,ZouG,BaillyB,etal.TheapprovedpediatricdrugsuraminidentifiedasaclinicalcandidateforthetreatmentofEV71infection-suramininhibitsEV71infectioninvitroandinvivo.EmergMicrobesInfect2014；3:e62.
18.WangY,QingJ,SunY,RaoZ.SuramininhibitsEV71infection.AntiviralRes2014；103:1-6.
19.AritaM,WakitaT,ShimizuH.Cellularkinaseinhibitorsthatsuppressenterovirusreplicationhaveaconservedtargetinviralprotein3Asimilartothatofenviroxime.J.Gen.Virol.2009；90(8):1869-1879
20.AritaM,WakitaT,ShimizuH.Characterizationofpharmacologicallyactivecompoundsthatinhibitpoliovirusandenterovirus71infectivity.J.Gen.Virol.89(10):2518-2530
21.FurutaY,GowenBB,TakahashiK,ShirakiK,SmeeDF,BarnardDL.Favipiravir(T-705),anovelviralRNApolymeraseinhibitor.AntiviralRes2013；100:446-454.
22.PrichardMN,PrichardLE,BaguleyWA,NassiriMR,ShipmanC,Jr.Three-dimensionalanalysisofthesynergisticcytotoxicityofganciclovirandzidovudine.AntimicrobAgentsChemother1991；35:1060-1065.
23.VliegenI,PaeshuyseJ,DeBurghgraeveT,etal.SubstitutedimidazopyridinesaspotentinhibitorsofHCVreplication.JHepatol2009；50:999-1009.
24.Zhang,J.H.,Chung,T.D.,Oldenburg,K.R.,1999.ASimpleStatisticalParameterforUseinEvaluationandValidationofHighThroughputScreeningAssays.Journalofbiomolecularscreening4,67-73.
25.Chou,T.-C.andMartin,N.CompuSynsoftwarefordrugcombinationsandforgeneraldoseeffectanalysis,anduser’sguide.ComboSyn,Inc.Paramus,NJ2007.[www.combosyn.com]

Claims (10)

1.一种抑制肠道病毒组合物，其特征在于，所述组合物包括第一活性成分和第二活性成分，
其中，所述第一活性成分为肠道病毒(如，EV71)的3D蛋白抑制剂；
所述第二活性成分为肠道病毒(如，EV71)的衣壳蛋白抑制剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一活性成分特异性结合肠道病毒的3D蛋白的第121位氨基酸残基(优选为丝氨酸残基)，其中氨基酸残基编号基于SEQIDNO.1。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一活性成分包括法匹拉韦、其类似物、或其药学上可接受的盐；和/或
所述第二活性成分包括苏拉明、其类似物、或其药学上可接受盐。
4.如权利要求1所述的抑制肠道病毒组合物的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗肠道病毒感染的药物。
5.一种体外非治疗性地抑制肠道病毒生长或者杀灭肠道病毒的方法，包括步骤：在需要处理的场所使用权利要求1所述的抑制肠道病毒组合物。
6.法匹拉韦、其类似物、或其药学上可接受盐在制备试剂中的用途，所述试剂用于：
(I)抑制肠道病毒3D蛋白的合成,和/或
(II)特异性结合肠道病毒3D蛋白的第121位氨基酸残基，其中氨基酸残基编号基于SEQIDNO.1。
7.一种复合物，其特征在于，所述复合物如式I所示
A-B(I)
其中，A为法匹拉韦或其类似物；B为肠道病毒的3D蛋白；优选地，所述复合物中，A和B的结合位点包括肠道病毒3D蛋白的第121位氨基酸残基，其中氨基酸残基编号基于SEQIDNO.1。
8.一种肠道病毒耐药毒株，其特征在于，所述毒株的3D蛋白发生了突变，并且所述突变导致所述肠道病毒产生了耐药性；优选地，所述突变发生在3D蛋白的第121位氨基酸残基。
9.一种筛选药物的方法，其特征在于，所述方法包括：将待筛选药物与肠道病毒或者肠道病毒的3D蛋白接触，并检测是否形成式II所述的复合物，
A'-B(II)
其中，A'为待筛选药物；B为肠道病毒的3D蛋白；优选地，所述复合物中，A’和B的结合位点包括肠道病毒3D蛋白的第121位氨基酸残基，其中氨基酸残基编号基于SEQIDNO.1。
10.一种肠道病毒的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂以肠道病毒3D蛋白为靶点，抑制所述肠道病毒的生长或繁殖；优选地，所述抑制剂以肠道病毒3D蛋白的第121位氨基酸残基为靶点，其中氨基酸残基编号基于SEQIDNO.1。
CN201610067175.3A 2016-01-29 2016-01-29 一种治疗肠道病毒感染的组合物和联合用药方法 Active CN105664166B (zh)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610067175.3A CN105664166B (zh) 2016-01-29 2016-01-29 一种治疗肠道病毒感染的组合物和联合用药方法
US16/073,487 US10864210B2 (en) 2016-01-29 2017-01-11 Composition and combined medication method for treating enterovirus infection
SG11201806433VA SG11201806433VA (en) 2016-01-29 2017-01-11 Composition and combined medication method for treating enterovirus infection
PCT/CN2017/070858 WO2017128950A1 (zh) 2016-01-29 2017-01-11 一种治疗肠道病毒感染的组合物和联合用药方法
JP2018558467A JP6644917B2 (ja) 2016-01-29 2017-01-11 エンテロウイルス感染を治療する組成物および薬物併用方法
AU2017210921A AU2017210921B2 (en) 2016-01-29 2017-01-11 Composition and combined medication method for treating enterovirus infection
MYPI2018702616A MY201019A (en) 2016-01-29 2017-01-11 Composition and Combined Medication Method for Treating Enterovirus Infection

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610067175.3A CN105664166B (zh) 2016-01-29 2016-01-29 一种治疗肠道病毒感染的组合物和联合用药方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105664166A true CN105664166A (zh) 2016-06-15
CN105664166B CN105664166B (zh) 2019-05-10

Family

ID=56304022

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610067175.3A Active CN105664166B (zh) 2016-01-29 2016-01-29 一种治疗肠道病毒感染的组合物和联合用药方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105664166B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017128950A1 (zh) * 2016-01-29 2017-08-03 中国科学院上海巴斯德研究所 一种治疗肠道病毒感染的组合物和联合用药方法
CN108553472A (zh) * 2018-05-24 2018-09-21 南方医科大学 Nf546在制备多效杀微生物剂及hiv性传播阻断剂中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103421112A (zh) * 2012-05-24 2013-12-04 中国科学院上海巴斯德研究所 一种抗肠道病毒的结合分子及其用途
WO2015167710A1 (en) * 2014-04-29 2015-11-05 National Health Research Institutes Adenoviral vector-based vaccine against enterovirus infection
CN105085672A (zh) * 2015-01-19 2015-11-25 鄢慧民 3d蛋白特异性单克隆免疫球蛋白a抗体及其组合物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103421112A (zh) * 2012-05-24 2013-12-04 中国科学院上海巴斯德研究所 一种抗肠道病毒的结合分子及其用途
WO2015167710A1 (en) * 2014-04-29 2015-11-05 National Health Research Institutes Adenoviral vector-based vaccine against enterovirus infection
CN105085672A (zh) * 2015-01-19 2015-11-25 鄢慧民 3d蛋白特异性单克隆免疫球蛋白a抗体及其组合物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PEIJUN REN，ET AL: "The approved pediatric drug suramin identified as a clinical candidate for the treatment of EV71 infection—suramin inhibits EV71 infection in vitro and in vivo", 《EMERGING MICROBES AND INFECTIONS》 *
毛莉萍，等: "抗肠道病毒71型治疗策略的研究进展", 《中华实验和临床感染病杂志(电子版)》 *
赵旭，等: "抗病毒药物——法匹拉韦", 《临床药物治疗杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017128950A1 (zh) * 2016-01-29 2017-08-03 中国科学院上海巴斯德研究所 一种治疗肠道病毒感染的组合物和联合用药方法
US10864210B2 (en) 2016-01-29 2020-12-15 Institut Pasteur Of Shanghai, Chinese Academy Of Sciences Composition and combined medication method for treating enterovirus infection
CN108553472A (zh) * 2018-05-24 2018-09-21 南方医科大学 Nf546在制备多效杀微生物剂及hiv性传播阻断剂中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105664166B (zh) 2019-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lee et al. Andrographolide exerts anti‐hepatitis C virus activity by up‐regulating haeme oxygenase‐1 via the p38 MAPK/N rf2 pathway in human hepatoma cells
US20190307722A1 (en) Antiviral compositions for the treatment of infections linked to coronaviruses
WO2015157223A1 (en) Methods of treating coronavirus infection
CN101137748B (zh) 粘液瘤病毒与雷帕霉素的组合在治疗性处理中的应用
EA028605B1 (ru) Комбинация озельтамивира и ингибитора mek для лечения вирусных заболеваний
Ho et al. COVID-19 and the promise of small molecule therapeutics: Are there lessons to be learnt?
CN107106525A (zh) 用于抑制单链rna病毒复制的治疗
Hao et al. Acyclovir inhibits channel catfish virus replication and protects channel catfish ovary cells from apoptosis
CN105664166A (zh) 一种治疗肠道病毒感染的组合物和联合用药方法
Dinda et al. An overview of anti-SARS-CoV-2 and anti-inflammatory potential of baicalein and its metabolite baicalin: insights into molecular mechanisms
Praditya et al. Identification of structurally re-engineered rocaglates as inhibitors against hepatitis E virus replication
CN106880630B (zh) Retro-2cycl及相关衍生物的用途
CN105688216A (zh) 治疗肠道病毒感染的组分和联合用药方法
CN111803472A (zh) 一种抗新型冠状病毒药物及其应用
CN104582794A (zh) 用于治疗病毒性疾病的杂环基氨甲酰
CN106138030A (zh) 新的肠道病毒71毒株以及芒柄花素或其盐在肠道病毒71中的应用
US20240009213A1 (en) Treatment for viral infection
WO2023287620A1 (en) Methods for treating coronavirus infection
US10864210B2 (en) Composition and combined medication method for treating enterovirus infection
Su et al. Downregulation of NF-кB signaling is involved in berberine-mediated protection of crucian carp (Carassius auratus gibelio) from cyprinid herpesvirus 2 infection
CN111920801A (zh) 表没食子儿茶素没食子酸酯在制备治疗和/或预防埃克病毒感染所致疾病的药物中的用途
US20210244716A1 (en) Vemurafenib and salts thereof for use in the treatment of enteroviral infections
CN115721654B (zh) 藜芦碱在制备抗冠状病毒的药物中的应用
Zhu et al. Aminoguanidine alleviates gout in goslings experimentally infected with goose astrovirus-2 by reducing kidney lesions
Arshad et al. Lack of antiviral activity of ivermectin against foot-and-mouth disease virus serotype O in BALB/c mice

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP03 Change of name, title or address
CP03 Change of name, title or address

Address after: Building 2, No. 225, Chongqing South Road, Huangpu District, Shanghai, 200025

Patentee after: Shanghai Institute of Immunology and Infection, Chinese Academy of Sciences

Address before: No. 411, Hefei Road, Huangpu District, Shanghai 200025

Patentee before: INSTITUT PASTEUR OF SHANGHAI, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES