CN108553472A - Nf546在制备多效杀微生物剂及hiv性传播阻断剂中的应用 - Google Patents

Nf546在制备多效杀微生物剂及hiv性传播阻断剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了NF546在制备多效杀微生物剂及HIV性传播阻断剂中的应用。发明人通过经过相关实验证明，NF546能直接而显著的抑制SEVI纤维的形成、抑制SEVI结合HIV‑1病毒，拮抗SEVI介导的促进病毒感染的能力，同时具有抗HIV‑1活性的特点，使其可以成一个预防HIV性传播的候选杀微生物剂，既具有抗HIV活性又能靶向淀粉样纤维的多效杀微生物剂。

Description

NF546在制备多效杀微生物剂及HIV性传播阻断剂中的应用
技术领域
本发明涉及一种药物化合物的新用途，特别涉及NF546既具有抗病毒活性，又能多效靶向精液淀粉样纤维，作为一种多效杀微生物剂的新用途。
背景技术
艾滋病(Acquired immunodeficiencysyndrome,AIDS)由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的人类最严重的单一病因疾病之一，严重威胁着世界的安全和人类生存。根据2013年联合国艾滋病规划署报告，全球范围内，2012年仍有约250万人新感染HIV，170万艾滋病的死亡，新感染病例中，80％是通过性传播感染的，在非洲一些国家更高达90％,性传播已成为HIV最主要的传播途径。由于现在尚无可预防艾滋病的疫苗，因此急需研发可用于预防HIV性传播的杀微生物剂。
杀微生物剂是一类含有抗HIV成分的凝胶、乳脂、栓剂、药膜或海绵，在性交前置入阴道或肛门内，通过直接灭活HIV、阻止HIV粘附或侵入阴道或直肠粘膜内的靶细胞、抑制HIV在靶细胞的复制等作用机理，预防HIV和其它性传播病原体的传播。因此，杀微生物剂能使性伙伴即使在不使用安全套的情况下避免感染HIV。更重要的是，杀微生物剂的使用可被女性所控制，从而为女性自主预防HIV性传播提供了有效措施。这在女性地位比较低的发展国家(如非洲)和性工作者中预防艾滋病非常关键。最近研究表明，在性传播中，男男同性恋传播HIV的比例在近几年逐年上升，因此开发能预防男男同性恋传播的直肠杀微生物剂也非常迫切。虽然最近美国食品药品监督管理局已经通过一种口服复方抗病毒药物(TDF/FTC，Gilead Science)用于预防高危人群的HIV性传播，但口服抗病毒药物用于预防HIV性传播带来的影响不可忽略，例如：增加耐药病毒株的产生、药物的全身毒副作用、阴道粘膜/直肠粘膜有效药物浓度低等；而局部使用的杀微生物剂，由于具有阴道粘膜/直肠粘膜局部药物浓度高、不需要全身给药等特点，在预防HIV性传播方面具有良好的前景
迄今为止超过二十个杀微生物剂产品已进入临床试验的各个阶段，但其中7个已结束IIb/III期大规模临床试验(N-9，Savvy,Ushercell,Carraguard,BufferGel,PRO-2000和Carbopol974P),均先后宣布失败或被中止。含1％Tenofovir的阴道凝胶制剂作为候选的杀生物剂在南非完成了IIb期临床试验(CAPRISA 004试验)，结果显示其能有效降低39％人群感染HIV，尤其对于用药高依附性人群，降低感染率高达54％。但Tenofovir的另一个大规模的临床试验却证明无效(VOICE试验)。杀微生物剂尚无有效的产品面世。综合其中的原因有:(1)受试药物抗病毒活性不够，比如对性传播主要的CCR5辅助受体依赖的病毒株抑制效果差；应选择抗病毒效果更好的单方或复方联用药物用于试验；(2)受试药物诱导的宿主机体炎症反应限制其临床应用，应选择安全性更佳的药物用于试验；(3)受试药物的使用依从性差。
德国Ulmx大学的munch等发现精液中存在一些降解的多肽片段，这些水解的多肽片段能形成淀粉样沉淀，从而促进HIV感染靶细胞。他们把这种增强病毒感染的淀粉样纤维命名为精液来源的病毒感染增强因子(Semen-derived Enhancer of Virus Infection,SEVI)。SEVI促进HIV病毒感染的作用机理主要与其极强的阳离子特性有关，SEVI能通过捕获HIV，协助病毒与宿主细胞相互作用，从而增强HIV感染。SEVI能促进病毒感染同时会降低抗病毒药物的药效，因此，SEVI近年来成为杀微生物剂的靶点之一！
精液来源的淀粉样纤维能大大促进病毒感染，从而导致HIV性传播的几率大大提高，另一方面，精液来源的淀粉样纤维的存在，能使现有绝大部分的抗病毒药效下降，包括聚阴离子化合物、中和抗体、逆转录酶抑制剂等。因此，精液来源的淀粉样纤维是杀微生物剂开发的一个新的，重要的靶点。
由于在精液中分别发现天然存在的淀粉样纤维原性多肽和淀粉样纤维，淀粉样纤维是由淀粉样原性多肽聚合而成的，淀粉样纤维才具有增强病毒感染的能力。因此，活性化合物分别抑制原性多肽，使其不能聚集形成淀粉样纤维，或靶向淀粉样纤维、解散淀粉样纤维，使其不能增强病毒感染，均可开发为潜在的多效杀微生物剂。
目前为止，不同的研究小组已开发拮抗精液淀粉样纤维的活性小分子，这些活性化合物主要包括：1)EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)能使SEVI纤维分解从而拮抗其增强HIV感染的过程；2)Roan NR等人发现，氨基喹啉类小分子化合物Surfen能干扰SEVI与HIV病毒颗粒及靶细胞结合，拮抗其促进病毒感染的能力；3)金属离子和非天然的氨基酸抑制剂能抑制SEVI的形成；4)Olsen JS等人研究发现，结构和硫磺素T类似化合物BTA-EG6能特异性和淀粉样纤维结合，从而抑制HIV病毒颗粒和靶细胞的结合；5)Garlic acid能特异性与淀粉样纤维结合，从而抑制HIV病毒颗粒与靶细胞的结合。尽管这些化合物能拮抗SEVI增强病毒感染的活性，但它们的作用机制比较单一，只是作用在SEVI三方面的其中之一，有一定的局限性。
NF546是一种多磺酸萘醌盐类，含有多个磺酸基团，CAS号1006028-37-0，化学名为：4,4'-(Carbonylbis(imino-3,1-phenylene-carbonylimino-3,1-(4-methyl-phenylene)carbonylimino))-bi s(1,3-xylene-alpha,alpha'-diphosphonic acidtetrasodium salt，其结构式如下：
已有研究表明NF546是选择性非核苷酸P2Y11激动剂，并可刺激人单核细胞源树突细胞分泌白介素8。未有研究表明其具有灭杀微生物或阻断HIV经性传播的功效。
发明内容
本发明的目的在于提供NF546在制备多效杀微生物剂及HIV性传播阻断剂中的应用。
发明人通过刚果红染色实验检测NF546对SEVI形成的抑制作用；通过病毒感染实验检测NF546对SEVI的增强感染作用的影响以及NF546的抗病毒作用；过viruspulldown实验探究NF546阻断SEVI结合HIV-1的作用；通过XTT法检测NF546局部用药对不同部位的不同细胞的毒性进行体外安全性评价，发现NF546可以抑制SEVI形成、结合SEVI，从而拮抗SEVI的促进HIV感染能力，阻断HIV经性传播。同时，NF546具有广谱的微生物灭杀能力，具有很好的安全性，可以作为很好的杀微生物活性成分使用。
本发明所采取的技术方案是：
NF546在制备多效杀微生物剂中的应用。
NF546在制备SEVI形成抑制剂中的应用。
NF546在制备HIV性传播阻断剂中的应用。
一种外用HIV性传播阻断剂，包括辅料和活性成分NF546。
作为上述外用HIV性传播阻断剂的进一步改进，其剂型选自灌肠剂、栓剂、凝胶剂或乳脂。
作为上述外用HIV性传播阻断剂的进一步改进，还添加有可接受的抗病毒化合物。
作为上述外用HIV性传播阻断剂的进一步改进，抗病毒化合物为抗HIV病毒化合物。
一种外用多效杀微生物剂，包括辅料和活性成分NF546。
作为上述外用多效杀微生物剂的进一步改进，其剂型选自灌肠剂、栓剂、凝胶剂或乳脂。
本发明的有益效果是：
发明人通过实验发现，NF546可以抑制SEVI形成、结合SEVI，从而拮抗SEVI的促进HIV感染能力，阻断HIV经性传播。同时，NF546具有显著的抗HIV活性，同时可以作为很好的杀微生物活性成分使用。
附图说明
图1和图2为本发明NF546体外抑制PAP248-286形成SEVI纤维的数据；
图3和图4为本发明NF546体外抑制SEVI结合HIV-1病毒的数据；
图5和图6为本发明NF546体外抗HIV-1克隆病毒的数据。
具体实施方式
下面通过体外实验对NF546抑制SEVI形成、结合SEVI从而拮抗SEVI的促进病毒感染能力以及NF546抗病毒活性的验证。
实验例1：NF546对SEVI形成的影响
刚果红染色法：多肽PAP248-286(439μM)与各浓度NF546(250μM、1000μM、4000μM)或PBS混匀，置于37℃振荡器中在1400rpm转速下反应，不同时间点(2h,4h,8h,12h,24h,48h)取出10μl样品与90μl刚果红溶液(Sigma)混合，暗处反应15min，12000rpm离心，去掉上清，沉淀用50μl DMSO溶解，测定490nm的吸光度值,参照波长为650nm。
病毒感染增强实验：多肽与NF546或PBS混匀反应(如上所述)，不同时间点(2h,4h,8h,12h,24h,48h)取样，5000rpm室温下离心10min,沉淀重悬在培养基中与病毒共孵加到TZM-b1细胞中，3h后换新鲜培养基，48h后，用荧光素酶检测试剂盒检测化学发光值，判断样品对病毒感染的促进作用。
由图1和2可见，NF546能抑制PAP248-286形成SEVI纤维,同时拮抗SEVI介导的增强病毒感染的效果。
实验例2：NF546对SEVI结合病毒的影响
Virus pull down实验：把已震摇成纤维的SEVI(22μM)与各浓度NF546(6μM，0.6μM，0.06μM,0.006μM)或PBS混匀，37℃反应15min,样品5000rpm室温离心10min,,PBS重悬沉淀，加入适量HIV-1SF162(100ng/ml P24),37℃孵育15min,样品5000rpm室温离心10min,上清和沉淀分别测定P24的含量。
病毒感染增强实验：SEVI与NF546或PBS混合，37℃共孵15min，5000rpm室温下离心10min,沉淀重悬在培养基中与病毒共孵加到TZM-b1细胞中，3h后换新鲜培养基，48h后，用荧光素酶检测试剂盒检测化学发光值，判断样品对病毒感染的促进作用。
实验结果如图3和4所示。由图3和4可见，NF546能有效阻断SEVI结合HIV-1病毒，阻断其增加病毒感染的能力。
实验例3：NF546的安全性评价
选用生长状态良好的生殖道细胞(Vk2/E6E7、Ect/E6E7、Hela、Siha等)、淋巴细胞(CEMx1745.25M7、Jurkat、MT-2)按3×105/ml密度接种于96孔板,100μl/well。将不同浓度的NF546(1200μM、600μM、300μM、150μM、75μM、32.5μM、16.25μM)分别加到细胞培养板中，每组3个复孔，37℃，5％CO2培养箱孵育48h，XTT法检测NF546对细胞的活力影响，计算CC50。
采用XTT法检测了NF546对生殖道相关细胞及淋巴细胞的毒性，实验结果如表1所示。
表1、NF546对生殖道、淋巴细胞活力的影响
由表1可见，NF546对两类细胞基本没有毒性，CC50均大于1000μM。
实验例4：NF546的抗HIV-1效果
选取生长状态良好的TZM-b1按1×105/ml密度接种于96孔板,100μl/well，37℃，5％CO2培养箱孵育过夜。NF546倍比稀释，与100倍TCID50不同嗜性病毒(HIV-1SF162、HIV-1NL4-3或HIV-181A and NL4-3)37℃共孵30min，每孔100μl加入细胞中，48h后，用荧光素酶检测试剂盒检测化学发光值，计算IC50。
实验结果如图5和6所示。由图5和6可见，NF546对HIV-1三种嗜性的病毒均有抑制作用，其IC50分别为6.73μM、0.074μM、0.471μM。

Claims (9)

1.NF546在制备多效杀微生物剂中的应用。
2.NF546在制备SEVI形成抑制剂中的应用。
3.NF546在制备HIV性传播阻断剂中的应用。
4.一种外用HIV性传播阻断剂，包括辅料和活性成分NF546。
5.根据权利要求4所述的一种外用HIV性传播阻断剂，其特征在于：其剂型选自灌肠剂、栓剂、凝胶剂或乳脂。
6.根据权利要求4或5所述的一种外用HIV性传播阻断剂，其特征在于：还添加有可接受的抗病毒化合物。
7.根据权利要求6所述的一种外用HIV性传播阻断剂，其特征在于：抗病毒化合物为抗HIV病毒化合物。
8.一种外用多效杀微生物剂，包括辅料和活性成分NF546。
9.根据权利要求8所述的一种外用多效杀微生物剂，其特征在于：其剂型选自灌肠剂、栓剂、凝胶剂或乳脂。
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