CN109310758A - 针对肠病毒71的人源化抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供针对肠病毒71(EV71)的人源化抗体，其是手足口病(HFMD)的致病因子，以及包含这些抗体的药物组合物及其在HFMD的治疗、预防和诊断中的用途。这些抗体适用于患有HFMD的人对象或具有HFMD风险的人，例如由于暴露于受感染的个体所致。

Description

针对肠病毒71的人源化抗体
发明领域
本发明涉及针对肠病毒71(EV71)的人源化抗体，其是手足口病(HFMD)的病原体。
发明背景
HFMD
手足口病(HFMD)是一种常见于幼儿的传染性疾病。最近，HFMD感染在亚太地区普遍存在，导致严重的疾病和死亡。例如，在2012年，中国共报告了2,198,442例HFMD病例；其中，神经系统并发症的严重病例2万多，死亡569例。
目前，没有特定的疫苗或抗病毒药物可用于HFMD。因此，对于治疗这种高度传染性疾病的医疗需求显然未得到满足。
EV71
肠病毒71(EV71)是HFMD的两种主要致病因子之一(另一种是柯萨奇病毒A16(CA16))。在1969年，在美国9月龄脑炎患儿的粪便中分离出来后，EV71首次被确定为致病性病原体之一。在接下来的5年中，在澳大利亚、日本、瑞典和美国报道了包括脑炎和无菌性脑膜炎在内的神经系统感染的小规模爆发，并归因于EV71感染(Solomon T等，Lancet InfectDis，2010年11月；10(11):778-90)。在1970年代，欧洲报告了EV71感染所致的两次大规模的HFMD暴发。自1997年以来，EV71已成为亚太地区爆发的主因，2008年中国报告了亚太地区最大的流行病。与心肺功能障碍相关的脑干脑炎已成为亚洲EV71相关流行病的显著特征和死亡主因。
最近的一项临床调查表明，在2009年中国HFMD爆发期间，266个实验室确认的HFMD病例中有50.4％和38.3％分别由EV71和CA16感染引起。感染EV71的个体通常会出现轻微的症状，包括发烧、口腔溃疡以及手、脚和臀部表面的皮疹；然而，一部分患者产生严重的神经系统并发症，如脊髓灰质炎样麻痹、脑干脑炎和肺水肿，最终可能导致死亡。例如，最近的报告显示，在92例有神经系统并发症的严重HFMD病例中，有65例感染EV71。
EV71是小核糖核酸病毒科肠病毒属的一员。它具有～7.4kb的单链正义RNA基因组，包装在无包膜的二十面体衣壳中。针对EV71衣壳的抗体可以防止病毒进入易感细胞，从而中和病毒感染。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)也可能在体内保护中起作用。
抗体治疗
针对HFMD的疫苗接种是预防或减轻EV71或该疾病的其它致病因子感染的可能手段。然而，即使存在针对该传染物的疫苗，这可能不是降低该传染物引起的死亡的最佳途径。例如，给人群接种疫苗可能在经济上不可行，或者可能是摄入量低于预防爆发所需的。对于EV71等病毒，另一种选择是提供一种抗体，从而可以治疗产生并发症的那些个体，和/或为接触这些个体的人提供预防性治疗。
针对EV71的抗体
US 2006/0292693描述了源自特异性中和EV71感染的小鼠杂交瘤细胞系的单克隆抗体。US 2006/0292693的发明人提出抗体可以多种形式给予，包括作为人源化抗体。CN103421112 A描述了不同的鼠单克隆抗EV71抗体，D5。
人源化抗体
通常希望开发用于人类对象的鼠抗体是人源化的。原则上，这涉及将每个鼠重链和轻链可变区的三个互补决定区(CDR)转移到框架区与鼠框架区具有一定程度同源性的人抗体的可变区中。然而，人源化抗体存在许多困难。与原始鼠抗体相比，简单地将CDR转移到人框架中通常导致结合亲和力的显著丧失。此外，人源化抗体可能更难以生产，和/或可能具有一种或多种不良的物理或化学性质，包括聚集倾向或缺乏热稳定性。因此，即使鼠抗体被认为是候选治疗剂，也可能无法提供兼具结合亲和力与其它所需物理和化学性质的人源化形式，使其适合在临床中使用。
发明内容
本发明人研究了D5抗体。已经确定该抗体在新生小鼠中提供抵御EV71致死攻击的保护作用。此外，在EV71感染后1天用D5治疗性治疗还显示出显著改善EV71感染动物的存活。
还发现D5可以抑制EV71与容许性细胞(permissive cells)的结合，并且D5可以在后续附着步骤中中和EV71。这些特性表明D5是抵御EV71感染的有效药剂，因此可用于治疗感染EV71菌株的个体的HFMD。
本发明的一个目的是提供适用于人类对象的人源化D5抗体。这些对象可以是患有HFMD的对象或具有HFMD风险的对象，例如暴露于受感染的个体。本发明人鉴定了具有一级序列的重链和轻链人框架区，所述一级序列可能是D5抗体的CDR的合适载体。然而，简单地将D5CDR转移到表观上相容的人框架中导致人源化抗体与其靶抗原的结合显著降低。在对抗体进行详细的结构和功能分析之后，本发明人能够产生修饰抗体，所述抗体的中和活性，以及临床试剂中所需或必需的其它物理和化学性质改善。
在一个方面，本发明提供了包含重链可变域和轻链可变域的人源化D5抗体，其中
a)重链可变结构域(VH结构域)包含SEQ ID NO:1，具有以下8个取代中的至少6个：Y27X6；T28X2；F29X1；T30X4；R67X4；V68X1；R72X1和S98X2；任选地，具有最多四个额外的框架取代，其中每个X1残基独立地选自：A、I、L、M和V；每个X2残基独立地选自：N、C、Q、S和T；每个X4残基独立地选自：R、H和K；X6残基选自F或W；和
b)轻链可变域(VK结构域)包含SEQ ID NO:2；任选地具有最多四个框架取代。
上文和下文中的术语“取代”是指氨基酸残基“Xn”(其中“n”是1-6中的任何一个)不同于SEQ ID NO:1相应位置上存在的氨基酸。
本发明的抗体的具体实例在下文中描述。在本说明书中提及包含本发明抗体的产品、组合物，或涉及本发明抗体的工艺、方法或用途的地方，提及这些应理解为在上文定义中的任何本发明抗体，包括但不限于下文提到的此类抗体的任何具体实例。
本发明还提供了编码本发明抗体的核酸。本发明还提供了载体，其包含与启动子可操作性连接的核酸。本发明还提供了包含此类核酸或载体的宿主细胞。
本发明还提供了制备本发明抗体的方法，通过在宿主细胞培养物中表达本发明的核酸或载体以产生抗体，并从细胞培养物中回收抗体。
本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的抗体和药学上可接受的载体。
本发明还提供了通过给予需要治疗的个体有效量的本发明抗体或药物组合物来治疗或预防HFMD的方法。个人可能患有HFMD，或者具有患HFMD的风险。
本发明还提供了本发明的抗体或其药物组合物，以便用于人体或动物体的治疗方法中。治疗方法可以是个体中HFMD的治疗或预防性治疗。
本发明还提供了包含本发明抗体的诊断试剂盒。
附图说明
图1描绘了人源化重链的可变域的序列。比对天然鼠D5VH和人重链供体候选物EF178053的序列。显示了人源化重链变体D5HA至D5HQ，突出显示的残基表明从EF178053中的人残基向相应鼠D5残基的回复突变。
图2a和2b显示嵌合D5抗体(cD5)与EV71 VLP(病毒样颗粒)和SP70肽表位结合，EC50值与用鼠D5(mD5)抗体观察到的EC50值相当。通过ELISA在浓度系列上测量结合情况。
图3显示鼠D5(mD5)和嵌合D5(cD5/chD5)抗体与EV71-VLP结合具有相当的表观KD值，因此证明它们对病毒具有相似的亲和力。浓度系列采用生物层干涉(Bio-LayerInterferometry)进行。
图4描绘了轻链可变域的序列。在天然鼠D5VK轻链和人轻链供体候选物AJ388646之间可以观察到差异。描绘了人源化轻链变体D5KA至D5KE，突出显示的残基指示人残基回复突变为等同的鼠D5残基的位置。
图5显示当与嵌合D5抗体(cD5 CHCK)比较并通过结合ELISA测量时，人源化D5抗体变体hEV71 HAKA、hEV71 HAKB、hEV71 HBKA和hEV71 HBKB与EV71-VLP和SP70肽表位的结合能力降低。
图6显示当与嵌合D5抗体(cD5 CHCK)比较并通过结合ELISA测量时，进一步人源化D5抗体变体hEV71 HCKA与hEV71 HJKA对SP70肽表位的结合能力降低。
图7显示人源化D5抗体变体hEV71 HAKA到hEV71 HJKA和hEV71 HAKB到hEV71 HJKB的EV71病毒中和能力。能够中和病毒的唯一抗体变体是包含HB重链变体的那些变体。cD5是嵌合D5抗体，mD5 IgG1是天然鼠D5抗体。
图8显示了含有HB、HM、HN、HP和HQ重链变体与KA轻链组合的人源化D5抗体变体与SP70肽表位的结合能力。通过结合ELISA测量结合。hEV71 HBKA和hEV71 HNKA显示出相似的结合能力。hEV71 HMKA和hEV71 HQKA对SP70表位显示出更高的结合能力，类似于嵌合D5抗体(cD5 CHCK)的结合能力。hEV71 HPKA显示与SP70表位的结合差。
图9描绘了hEV71 HBKA、HMKA、HNKA、HPKA和HQKA抗体变体与SP70肽表位的15种变体的结合能力。通过在每种抗体的EC80结合ELISA来测量结合情况。通过丙氨酸扫描产生SP70表位变异。包含HM、HN、HP和HQ重链的hEV71变体结合SP70表位文库表现出与嵌合D5抗体(cEV71 CHCK)和hEV71 HBKA变体相同的模式。
图10显示hEV71 HMKA到hEV71 HQKA抗体变体的EV71病毒中和能力。与hEV71 HBKA相比，hEV71 HNKA的病毒中和方面略有改善，hEV71 HPKA不能中和病毒。hEV71 HMKA和hEV71 HQKA相对于HBKA变体显示出显著改善，相对于鼠D5抗体(mD5 IgG1)的改善较小。
图11显示嵌合D5抗体(cD5)和hEV71 HMKA与SP70肽表位的结合情况，通过等温滴定量热法进行。计算两种抗体的观察到的结合常数(KA)、观察到的解离常数(KD)、焓(ΔH)和熵(ΔS)。嵌合D5抗体和hEV71 HMKA具有相似的KA和KD值，表明它们以相似的亲和力结合SP70表位。
图12显示了hEV71 HMKA抗体的热稳定性。图12a显示了通过结合ELISA测量的，在25℃和80℃之间的温度处理后，抗体与EV71 SP70表位的结合活性。hEV71 HMKA保持表位结合活性直至70℃。图12b显示在热变换测定中熔融温度(Tm)约为70℃。
图13显示hEV71 HMKA不具有聚集倾向。将抗体以0.4ml/min注射到HPLC系统的尺寸排阻柱中，并通过多角度光散射进行分析以确定绝对摩尔质量并检查聚集情况。该图谱未显示聚集的迹象，并且预期IgG单体的平均分子量为约136.6kDa。多分散性值为1.00表明抗体是单分散的，并且高质量回收率表明抗体不粘附于柱或含有不溶性聚集体。
图14显示hEV71 HMKA具有低的非特异性相互作用倾向和良好的溶解度。进行交叉相互作用色谱法以评估非特异性相互作用和溶解度。hEV71 HMKA的低保留指数(k’)表明该抗体不太可能涉及非特异性相互作用并且具有良好的溶解性。
图15显示hEV71 HMKA抗体可以浓缩最高至～100mg/ml而没有明显的沉淀。动态光散射(DLS)用于测试可溶性聚集体。通过累积量分析获得平均粒径(Z-Ave直径)和多分散指数(PDI)，浓缩前和浓缩后抗体样品显示相似的值。
图16显示hEV71 HMKA经历冻/融处理不会引起聚集。纯化的hEV71 HMKA样品进行10个循环的以下处理：-80℃15分钟，然后在室温下解冻15分钟，并通过SEC-MALS(尺寸排阻色谱-多角度光散射)分析。经处理的hEV71 HMKA样品含有分子量在单体IgG范围内的物质，并且抗体是单分散的(即，存在一个分子量)。
图17描绘了暴露于4℃、25℃、37℃或50℃持续33天的hEV71 HMKA抗体的SEC-MALS分析。没有明显的抗体聚集，分子量与单体IgG的分子量相似，并且抗体是单分散的。
图18显示hEV71抗体在小鼠、人和食蟹猴血清中稳定一个月。将抗体在各血清或PBS对照中孵育30天，并通过结合ELISA测量孵育期后抗体与SP70肽表位的结合情况。血清孵育的抗体与SP70肽的结合情况非常类似于PBS孵育的和未孵育的抗体的结合情况。
图19显示用EVE病毒攻击小鼠14天后，用hEV71 HMKA处理导致100％存活。
图20显示了通过测量10、25和50mM乙酸钠(pH 5.2,130mM NaCl)缓冲液中的大小分布来测定hEV71 HMKA抗体缓冲液探测(scout)的结果。
图21显示了通过测量10、25和50mM磷酸钠(pH 7.0,135mM NaCl)缓冲液中的大小分布来测定hEV71 HMKA抗体缓冲液探测的结果。
图22显示了通过测量10、25和50mM琥珀酸钠(pH 6.0,125mM NaCl)缓冲液中的大小分布来测定hEV71 HMKA抗体缓冲液探测的结果。
图23显示了通过测量10、25和50mM柠檬酸钠(pH 6.0,125mM NaCl)缓冲液中的大小分布来测定hEV71 HMKA抗体缓冲液探测的结果。
图24显示用抗体hEV71 HMKA治疗导致恒河猴模型中EV71感染后体温升高减少(治疗组与模型对照组比较：*p<0.05，**p<0.01；治疗组与对照抗体组比较：#p<0.05，##p<0.01)。
图25显示用抗体hEV71 HMKA治疗导致恒河猴模型中感染3-4天后，感染后病毒载量降低(治疗组与模型对照组相比，*p<0.05，**p<0.01；治疗组与对照抗体组比较，#p<0.05，##p<0.01)。
发明详述
本发明的抗体
本发明的抗体分别包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的重链可变域和轻链可变域，如上所述进行修饰。在本说明书中，其中残基编号是相对于序列标识符(即，格式如SEQ IDNO:n所示的)定义，残基从第一个残基连续编号。在所附的实施例和附图中，氨基酸的编号也根据Kabat，“免疫学感兴趣蛋白的序列”(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，1987和1991)的定义进行讨论。使用Kabat编号的地方会标明或将从上下文中得知。
发明人已鉴定了SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的许多框架残基，其可被改变以修饰包含SEQ ID NO:1所示重链可变域和SEQ ID NO:2所示轻链可变域的抗体的性质。在所附实施例中，改变框架残基以恢复相应鼠框架序列的那些残基。然而，替代VH和VK结构域人框架残基的任何氨基酸残基，例如上述K23T取代中的Thr残基，自身可以被具有相似性质的另一种氨基酸取代，即保守变化至同一功能组中的氨基酸。例如，K23T取代可以是K23S取代，因为Thr和Ser都具有极性不带电荷的侧链。
对于保守残基取代，氨基酸可以如下分组：组X1(非极性侧链)：Ala(A)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Val(V)；组X2(极性不带电侧链)：Asn(N)、Cys(C)、Gln(Q)、Ser(S)、Thr(T)；组X3(酸性侧链)：Asp(D)、Glu(E)；组X4(碱性侧链)：Arg(R)、His(H)、Lys(K)；组X5(影响含非极性侧链的链取向的残基)：Gly(G)、Pro(P)；组X6(芳香族非极性侧链)：Phe(F)、Trp(W)、Tyr(Y)。
因此，本发明的重链可变结构域(VH结构域)包含SEQ ID NO:1，具有以下8个取代中的至少6个或至少7个：Y27X6；T28X2；F29X1；T30X4；R67X4；V68X1；R72X1和S98X2；任选地，最多有四个额外的框架取代。含有该组中所有8个取代基的重链可变域在下表1A中指定为HB’链。
优选地，所述至少6个取代包括S98X2。当存在S98X2时，优选S98N。
在一方面，所述至少6个、或至少7个或所有8个取代选自Y27F；T28N；F29I；T30K；R67K；V68A；R72A和S98N。优选地，所述至少6个取代包括S98N。该组的8个取代统称为HB结构域基团取代。含有如上所述的所有8种特定取代的重链可变域称为HB链(SEQ ID NO:11)。
当可存在最多四个额外的框架取代时，可以是1、2、3或4个额外的取代。取代优选在SEQ ID NO:1中不同于鼠重链可变域的相应残基的残基处。取代的残基示于图1的比对结果中。四个取代中的三个可以选自：K23X2、R38X4和S77X2，其中每个X2残基独立地选自N、C、Q、S或T，X4残基选自R、H或K。通常可以对鼠抗体序列的相应残基进行回复取代。四个取代中的三个可选自K23T、R38K或S77N。
SEQ ID NO:1的框架残基是残基1-30、36-49、67-98和108-118。
在所附实施例中，SEQ ID NO:1称为HA结构域。本发明的VH结构域的实例包括HB’结构域基团取代中6、7或全部8个取代的HA链序列，包括表1A中列出的那些组合：
表1A
结构域 Y27X<sub>6</sub> T28X<sub>2</sub> F29X<sub>1</sub> T30X<sub>4</sub> R67X<sub>4</sub> V68X<sub>1</sub> R72X<sub>1</sub> S98X<sub>2</sub>
Hb’1 · · · · · ·
Hb’2 · · · · · ·
Hb’3 · · · · · ·
Hb’4 · · · · · ·
Hb’5 · · · · · ·
Hb’6 · · · · · ·
Hb’7 · · · · · ·
Hb’8 · · · · · ·
Hb’9 · · · · · · ·
Hb’10 · · · · · · ·
HB’ · · · · · · · ·
其中“·”表示SEQ ID NO:1的HA结构域已被取代，如表中标题行所示。
当存在6、7或所有8个HB’基团取代时，这些可以与以下组合：(a)K23X2、R38X4和S77X2；(b)K23X2和R38X4；(c)R38X4和S77X2；(d)K23X2和S77X2；(e)K23X2；(f)R38X4或(g)S77X2；其中每个X2残基独立地选自N、C、Q、S或T，并且X4残基选自R、H或K。包含这些取代的任何组合的重链可以与本文所述的任何轻链序列组合存在于抗体中。
例如，Hb’1可以与上述(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb’2可以与上述(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb’3可以与上述(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb’4可以与上述(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb’5可以与上述(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb’6可以与上述(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb’7可以与上述(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb’8可以与上述(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb’9可以与上述(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb’10可以与上述(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；HB’可以与上述(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合。
在优选的实施方式中，本发明的VH结构域包含HB结构域基团取代中6、7或全部8个取代的HA链序列，包括表1B中列出的那些组合：
表1B
结构域 Y27F T28N F29I T30K R67K V68A R72A S98N
Hb1 · · · · · ·
Hb2 · · · · · ·
Hb3 · · · · · ·
Hb4 · · · · · ·
Hb5 · · · · · ·
Hb6 · · · · · ·
Hb7 · · · · · ·
Hb8 · · · · · ·
Hb9 · · · · · · ·
Hb10 · · · · · · ·
HB · · · · · · · ·
其中“·”表示SEQ ID NO:1的HA结构域已被取代，如表中标题行所示。
当存在6、7或所有8个HB基团取代时，这些可以与以下组合：(i)K23T、R38K和S77N；(ii)K23T和R38K；(iii)R38K和S77N；(iv)K23T和S77N；(v)K23T；(vi)R38K；或(vii)S77N。包含这些取代的任何组合的重链可以与本文所述的任何轻链序列组合存在于抗体中。
例如，Hb1可以与(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb2可以与(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb3可以与(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb4可以与(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb5可以与(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb6可以与(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb7可以与(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb8可以与(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb9可以与(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；Hb10可以与(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合；HB可以与(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中列出的进一步取代的任何组合相组合。
本发明的VH结构域的实例包括在所附实施例中列出的HM(SEQ ID NO:3)、HN(SEQID NO:4)和HQ(SEQ ID NO:6)重链。
本发明的轻链可变域(VK结构域)包含SEQ ID NO:2；任选地具有最多4个框架取代，例如3、2或1个取代。SEQ ID NO:2在本文中称为KA结构域。取代优选在SEQ ID NO:2中不同于鼠重链可变域的相应残基的残基处。取代的残基示于图4的比对结果中。取代可包括I2X1、V3X1和Q50X4中的1、2或3个，其中每个X1残基独立地选自A、I、L、M或V；X4残基选自R、H或K。术语“取代”是指氨基酸残基“X1”不同于SEQ ID NO:2中相应位置存在的氨基酸。包含这些取代的任何组合的轻链可以与上文所述的任何重链序列组合存在于抗体中。
轻链结构域取代通常是对鼠抗体序列的那些相应残基的反向取代。KA的取代可包括I2V、V3L和Q50K中的1、2或3个。取代的KA结构域的实例包括命名为KB(SEQ ID NO:7)、KC(SEQ ID NO:8)、KD(SEQ ID NO:9)和KE(SEQ ID NO:10)的可变域。
SEQ ID NO:2的框架残基是1-23、40-54、62-93和103-112。
本发明的抗体可以包含任何上述重VH结构域与每个和任何上述VK结构域的组合。在一个实施方式中，KA结构域是优选的，并且这可以与上述每个和任何VH结构域联用。
在一个实施方式中，本发明的抗体包含SEQ ID NO:3所示VH结构域和SEQ ID NO:2所示VK结构域。该抗体在实施例中称为hEV71 HMKA。
为避免疑义，组合术语“具有以下8个取代中的至少6个”和“任选地具有最多4个额外的框架取代”表示本发明的重链可变域具有SEQ ID NO:1所示序列，除了至少6个、最多总共12个框架残基的取代，序列的其余部分如SEQ ID NO:1所示。当提及1、2或3个额外的框架取代的特定组合时，重链可变域将总共具有以下8个中的至少6个：Y27X6；T28X2；F29X1；T30X4；R67X4；V68X1；R72X1和S98X2连同额外的特定数量的额外框架取代；例如，分别是总共7-9、8-10或9-11个框架取代。类似地，本发明的轻链可变域可具有SEQ ID NO:2的总共4个框架取代，例如总共0、1、2、3或4个，序列的其余部分如SEQ ID NO:2所示。
抗体结构
术语“免疫球蛋白”或“抗体”可互换使用，指具有特异性结合一种或多种抗原的能力的蛋白。天然抗体通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，在不同抗体同种型的重链之间具有不同数量的二硫键。各重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。
抗体包含称为“结构域”的重链或轻链多肽的球状区域。结构域包含肽环，通常为3至4个环，其通过例如β-折叠片层和/或链内二硫键得以稳定。根据在“恒定”域的情况下，各种类成员的结构域内相对缺乏序列变异，或者在“可变”域的情况下，各种类别的结构域内的显著变异，在本文中进一步将结构域称为“恒定”或“可变”。抗体或多肽“结构域”在本领域通常可互换地称为抗体或多肽“区域”。
抗体轻链的“恒定”域可称为“轻链恒定区”、“轻链恒定结构域”、“CL”区或“CL”结构域。抗体重链的“恒定”域可称为“重链恒定区”、“重链恒定结构域”、“CH”区或“CH”结构域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐。
包含抗体尾区的重链恒定域在本文中称为Fc(可结晶片段)结构域或Fc区。Fc区可以与细胞表面Fc受体和补体系统的一些蛋白相互作用，通过该方法抗体可以激活免疫系统。Fc区在各多肽链中含有三个重链恒定域。
抗体轻链的“可变”域可称为“轻链可变区”、“轻链可变结构域”、“VL”区或“VL”结构域(这里的“L”是指“轻”而不是轻链同种型“λ”)。抗体重链的“可变”域可称为“重链可变区”、“重链可变结构域”、“VH”区或“VH”结构域。
完整的轻链具有，例如两个结构域(VL和CL)，完整的重链具有例如4个或5个结构域(VH、CH1、CH2和CH3)。
轻链和重链可变域包括“高变区”(HVR或HV)，也称为“互补决定区”或“CDR”，其在序列上是高变的并且可以形成结构上限定的环。通常，抗体包含六个高变区；重链中的3个(H1、H2、H3)和轻链中的3个(L1、L2、L3)，散布在相对保守的框架区(FR)之间。在本发明的抗体中，可变域和CDR的氨基酸序列如本文所定义，参考图1、图4和序列表。
各轻/重链配对的可变区形成抗原结合位点。术语“抗原结合位点”是指特异性结合(与之免疫反应)抗原的位点。本发明的抗体包含至少一个抗原结合位点，优选包含两个抗原结合位点。抗原结合位点由重链和轻链CDR形成，通过框架区对齐，从而能够结合特定表位。“抗原结合区”或“抗原结合域”是包括抗体结合位点的抗体区域或结构域。本发明的抗体具有至少一个能够识别EV71的SP70表位的抗原结合位点。
天然存在的抗体链或重组产生的抗体链可以用前导序列表达，所述前导序列在细胞加工过程中被除去以产生成熟链。成熟链也可以重组产生，含有非天然存在的前导序列，例如以增强分泌或改变感兴趣的特定链的加工。
抗体同种型
构成抗体的重链和轻链的恒定区显示出表型变异。基于轻链恒定区的氨基酸序列，抗体轻链被分类为κ(κ)或λ(λ)，长度为约230个残基。本发明的抗体包含κ轻链(κ轻链的可变结构域在本文中称为VK)。
来自人类和高等哺乳动物的重链被分类为γ(γ)、μ(μ)、α(α)、δ(δ)或ε(ε)，长度约450-600个残基，抗体的同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。IgM有两种亚类(H和L)、IgA有三种亚类(IgA1、IgA2和分泌型IgA)，以及IgG有四种亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。本发明的抗体优选为免疫球蛋白G(IgG)抗体。本发明的抗体更优选为IgG1抗体。
本发明的抗体可包含属于本文所述的任何免疫球蛋白同种型的重链。本发明的抗体可包含来自一种以上类别或同种型的序列。
本发明的抗体可以表现出细胞毒活性。在这样的抗体中，恒定域通常是补体固定恒定域，该类通常是IgG1。人同种型IgG1和IgG4是示例性的。
抗体形式
本发明的抗体可包含抗体片段。术语“片段”是指抗体或抗体链的部分或一部分，其包含比完整或完全抗体或抗体链更少的氨基酸残基，其中该部分优选通常保留当存在于完整抗体中时与该部分相关的至少一种，优选大多数或全部功能。片段可以通过化学或酶处理完整或完全抗体或抗体链获得。片段也可以通过重组方法获得。
本发明的抗体可以存在片段，包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、化学连接的F(ab')2、单特异性Fab2、双特异性Fab2、三特异性Fab2、单价IgG、scFv(单链可变片段)、di-scFv(二价scFv)、双特异性双抗体、三特异性三抗体、scFv-Fc、微抗体和sdAb(单结构域抗体)片段。
本发明抗体的片段可以结合抗原或与完整抗体(即，与获得它们的完整抗体)竞争结合抗原结合(即特异性结合)。本发明的抗体与EV71VP1衣壳蛋白上的SP70肽结合表位结合。结合片段通过重组DNA技术产生，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割产生。本发明的抗体可以存在结合片段，包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、化学连接的F(ab')2、单特异性Fab2、双特异性Fab2、三特异性Fab2、单价IgG、scFv(单链可变片段)、di-scFv(二价scFv)、双特异性双抗体、三特异性三抗体、scFv-Fc、微抗体或sdAb(单结构域抗体)，并保留结合EV71的SP70表位的能力。
本发明的抗体可以是双特异性或三特异性抗体的一部分。双特异性是具有两个不同重/轻链配对和两个不同抗原结合位点的人工杂合抗体；三特异性抗体是具有三种不同重/轻链配对和三个不同抗原结合位点的人工杂合抗体。双特异性和三特异性抗体可以通过多种方法产生，包括杂交瘤融合或Fab'片段的连接。参见，例如Songsivilai和Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny等.,J.Immunol.148,1547-1553(1992)。
本发明的示例性抗体可以是包含至少两个不同抗原结合位点的双特异性抗体。在一具体实施方式中，一个抗原结合位点可以结合EV71的SP70肽表位，一个抗原结合位点可以结合另一感染因子，例如可以结合柯萨奇病毒A16(CA16)病毒的抗原结合位点。
抗体特征
本发明的抗体具有如本文所述的结构特征，并且特异性结合EV71 VP1蛋白的SP70结合表位(SEQ ID NO:12)(参见实施例4)。
本发明的抗体可以中和EV71病毒(参见实施例5)。
如下文所述，并参考实施例，本发明的抗体还可具有所需的结构、物理、生物物理和化学性质。
抗体结合亲和力
本文所述的抗体的亲和力是抗体与表位或抗原结合的程度或强度。解离常数，Kd和亲和常数，Ka是亲和力的定量度量。Kd是抗体解离速率(koff，其与抗原解离的速度)与抗体结合速率(kon，其与抗原的结合速度)之比。抗体与其抗原的结合是可逆过程，并且结合反应的速率与反应物的浓度成比例。在平衡时，[抗体][抗原]复合物形成的速率等于解离成其组分[抗体]+[抗原]的速率。反应速率常数的度量可用于定义平衡或亲和常数，Ka(Ka＝1/Kd)。Kd值越小，抗体对其靶标的亲和力越大。大多数抗体具有低微摩尔(10-6)至纳摩尔(10-7至10-9)范围内的Kd值。通常认为高亲和力抗体处于低纳摩尔范围(10-9)，非常高亲和力的抗体处于皮摩尔(10-12)范围内。
本发明抗体的结合速率常数(kon)可以是：至少2x105M-1s-1、至少5x105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5x106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5x107M-1s-1或至少108M-1s-1。
本发明抗体的抗体解离(koff)速率可以是：小于5x10-1s-1、小于10-1s-1、小于5x10- 2s-1、小于10-2s-1、小于5x10-3s-1、小于10-3s-1、小于5x10-4s-1或小于10-4s-1。在另一实施方式中，本发明抗体的koff可以是：小于5x10-5s-1、小于10-5s-1、小于5x10-6s-1、小于10-6s-1、小于5x10-7s-1、小于10-7s-1、小于5x10-8s-1、小于10-8s-1、小于5x10-9s-1、小于10-9s-1或小于10-10s-1。
在一实施方式中，本发明抗体结合(例如特异性结合)EV71的SP70肽结合表位(SEQID NO:12)，亲和常数或Ka为至少102M-1、至少5x102M-1、至少103M-1、至少5x103M-1、至少104M-1、至少5x104M-1、至少105M-1、至少5x105M-1、至少106M-1、至少5x106M-1、至少107M-1、至少5x107M-1、至少108M-1、至少5x108M-1、至少109M-1、至少5x109M-1、至少1010M-1、至少5x1010M-1或至少1011M-1。
本发明抗体与EV71的SP70表位的解离常数或Kd为：小于5x10-2M、小于10-2M、小于5x10-3M、小于10-3M、小于5x10-4M、小于10-4M、小于5x10-5M、小于10-5M、小于5x10-6M、小于10- 6M、小于5x10-7M、小于10-7M、小于5x10-8M、小于10-8M、小于5x10-9M、小于10-9M、小于5x10-10M、小于10-10M、小于5x10-11M、小于10-11M、小于5x10-12M或小于10-12M。
在一优选的实施方式中，本发明抗体结合EV71的SP70表位的Ka为：106M-1-108M-1。在另一实例中，本发明抗体与EV71的SP70表位结合的Ka为：107M-1-5x107M-1。在另一实例中，本发明抗体与EV71的SP70表位结合的Ka为：1.5x107M-1-3.5x107M-1(参见实施例6)。
在一优选的实施方式中，本发明抗体的Kd为10-6M-10-9M。在另一实例中，本发明抗体的Kd为5x10-7M-5x10-9M。在另一实例中，本发明抗体的Kd为10-7M-10-8M(参见实施例6)。
抗体的特异性结合意味着抗体对特定抗原或表位表现出明显的亲和力，并且通常不表现出显著的交叉反应性。“不表现出显著的交叉反应性”的抗体是不会明显结合不希望的实体(例如，不希望的蛋白实体)的抗体。例如，特定表位的特异性抗体不会与同一蛋白或肽上的远程表位显著交叉反应。本发明抗体的特异性结合，即koff、kon、Ka和Kd可以根据任何本领域公认的用于测定这种结合的方法来测定。
生物物理学特性
本发明的抗体可以是热稳定的，即本发明的抗体可以在30℃至85℃的温度，特别是在最高75℃(参见实施例7)下与EV71病毒的SP70结合表位(SEQ ID NO:12)结合。本发明的抗体可具有50℃至100℃之间，特别是60至80℃之间，更具体地接近70℃的解链温度(参见实施例7)。
本发明的抗体可具有低聚集倾向。在一实例中，使用多角度光散射分析聚集倾向，在另一实例中，使用动态光散射分析聚集倾向。本发明的抗体的特异性蛋白-蛋白相互作用的倾向低，还具有良好的溶解性(参见实施例8)。
当浓缩时，本发明的抗体可具有低聚集倾向(参见实施例8)。本发明的制剂可包含浓缩至50-200mg/ml，例如75-150mg/ml，优选80-120mg/ml，更优选90-110mg/ml，优选浓度为约100mg/ml的抗体，在维持生理pH的水溶液，例如Dulbecco PBS中不形成可溶性聚集体。
当经历反复的冻融，或者长时间处于高于正常体温的温度时，本发明抗体可以的聚集倾向低。在一实例中，长时间温度是在Dulbecco PBS中，50℃，持续33天。
本发明抗体的等电点(pI)可以在pH 6.6-pH 7.6。在一实例中，本发明抗体的pI在pH 7-pH 7.5。在更进一步的实例中，本发明抗体的pI在pH 7.3-pH 7.4，优选pI为pH 7.4(参见实施例8)。
37℃，在小鼠、人和/或食蟹猴灵长类动物的血清中孵育后，本发明抗体可保留对EV71的SP70肽表位(SEQ ID NO:12)的结合能力(参见实施例9)。在一实例中，本发明抗体在小鼠、人和/或食蟹猴血清中孵育10至50天，优选20-40天，更优选30天后，可保留对SP70肽表位的结合能力。在一实例中，保留结合能力是指抗体在37℃下表现出与未在血清中孵育，或在对照溶液中孵育的抗体中观察到的相同或基本相同的结合能力。
在一实施方式中，本发明抗体具有本文所述的结构特征，并且还具有以下活性或功能特征中的至少一种：(i)结合EV71；(ii)结合EV71的SP70表位；(iii)中和EV71病毒感染；(iv)具有本文所述的Ka值；(v)具有本文所述的Kd值；(vi)保持SP70表位结合活性直至75℃；(vii)解链温度为70℃；(viii)浓缩至100mg/ml时不会聚集；(ix)通过交叉相互作用色谱分析时，保留指数(k’)低于0.037；(x)经过反复的冻融循环，或在最高50℃的温度下处理最长33天时不会聚集；(xi)具有如本文所述的等电点(pI)；(xii)当在小鼠、人或食蟹猴血清中孵育最长30天时，保留结合EV71的SP70表位的能力。
非糖基化抗体
本文公开的抗体可以是“非糖基化”抗体。IgG抗体的Fc区具有高度保守的N-糖基化位点，并且Fc片段的糖基化对于Fc受体介导的活性是必需的。附着于该位点的N-聚糖碳水化合物部分主要是复杂类型的核心-岩藻糖基化的二天线(diantennary)结构。此外，少量的这些N-聚糖还具有二等分的GlcNAc和α-2,6连接的唾液酸残基。
“非糖基化”是指抗体通过但不限于化学或酶促过程、一个或多个糖基化位点的突变或在细菌中表达而缺乏一个或多个碳水化合物部分。本发明的非糖基化抗体可以是去糖基化抗体，即，已经通过例如化学或酶促去除Fc碳水化合物的抗体。或者，本发明的非糖基化抗体可以是非糖基化或未糖基化的抗体，即，表达没有Fc碳水化合物部分的抗体，例如通过突变编码糖基化模式的一个或多个残基或通过在不会将碳水化合物附着在蛋白上的生物体，例如细菌中来表达。
本文描述的抗体可以是“非岩藻糖基化的”，即，工程改造使得抗体Fc区中的碳水化合物部分不具有任何岩藻糖单元。或者，本文所述的抗体可具有数量减少的岩藻糖单元。非岩藻糖基化抗体在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性方面更有效(见下文)。本文所述的非岩藻糖基化抗体可以在工程改造以产生非岩藻糖基化蛋白的细胞系中产生，例如CHOK1SV细胞系(BioWa/Lonza)、-工程改造细胞(ProBioGen)或鸭胚胎干细胞系EB66(Valneva)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
可以修饰本文所述的抗体以增强其抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。ADCC是细胞介导的反应，其中非特异性细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，并随后引起靶细胞裂解。这种细胞可以是人细胞。通常认为抗体的ADCC活性需要抗体的Fc区与效应细胞，例如杀伤细胞、天然杀伤细胞和活化的巨噬细胞表面上存在的抗体受体结合。相对于未修饰的人源化抗体，通过改变人源化抗体的碳水化合物结构(即，在Fc区)的岩藻糖基化(例如，减少或消除)，可以在体外增强抗体的ADCC活性，例如10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍、或500倍、或600倍、或700倍、或1000倍。由于ADCC活性增加，这种修饰的抗体相比于未修饰的抗体，可以更低的剂量使用，并且通常在患者中具有更少或降低的副作用。
补体依赖性细胞毒性
本文所述的抗体可用于补体依赖性细胞毒性(CDC)。CDC涉及中枢先天补体系统，其作为适应性免疫的效应物。经典CDC途径由与靶细胞上的抗原结合的抗体分子触发，并且通过C1q蛋白与所结合抗体的Fc结构域的结合而启动。所得的补体级联反应激活膜攻击途径，导致形成膜攻击复合物，其诱导靶细胞的裂解。可以通过本领域已知的任何方法修饰本文所述的抗体以增强其触发CDC的能力，例如但不限于工程改造蛋白骨架以便在抗体重链的恒定域中包含氨基酸残基取代。对于用于增强CDC活性的IgG1氨基酸取代的组合的实例，参见Moore等，mAbs，2(2)，181-189(2010)。相对于未修饰的人源化抗体，本文所述的经修饰抗体的CDC活性可以增强，例如10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍、或500倍、或600倍、或700倍或1000倍。
抗原
“抗原”是免疫球蛋白或抗体(或其抗原结合片段)特异性结合的实体(例如，蛋白实体或肽)。
本发明的抗体可以与EV71的抗原性15-氨基酸SP70肽表位(SEQ ID NO:12)结合(实施例4)。SP70表位位于EV71的VP1衣壳蛋白上，残基208-222。SP70的氨基酸序列在来自病毒的各亚基因型的EV71菌株的VP1序列中高度保守。因此，包含SP70表位(SEQ ID NO:12)的EV71，一无包膜单链正义RNA病毒可以通过与SP70表位结合的本发明抗体中和。
肠病毒71
EV71和柯萨奇病毒A16(CA16)是无包膜的单链正义RNA病毒，属于小核糖核酸病毒家族的肠病毒属(其还包括诸如脊髓灰质炎病毒等病毒)。人肠病毒含有4种血清型(A-D)，其中EV71和CA16属于血清型A。
EV71有几个基因型组；A、B、C、D、E和F。基因型B和C可以进一步分解为亚基因型B1-B5和C1-C5，各亚组显示出与其它亚组相差约15％。对于HFMD的大规模爆发，记录了属于这些亚基因型的EV71的不同菌株。A组仅由一名成员组成，该成员于1970年首次在美国加利福尼亚州被发现并被认为不再流行。B基因型在马来西亚和新加坡一直很突出，而C基因型在中国和越南显得很突出。Bessaud等(PLOS ONE；2014年3月,第9卷,第3期,e90624)报告了另外三个基因型组，包括一个印度基因型组(基因型组D)和2个非洲基因型组(E和F)。
EV71和CA16都具有较高的基因组进化速率，并且新的亚基因型不断出现。17-22％的差异是指定新基因型的截止值，EV71在过去40年内分为两种基因型。在中国，只有EV71的C4亚基因型是地方性的，虽然分子基础不清楚，C4a进化分支看来表现出更高的发病率和死亡率以及更大的神经毒力(Zhang等.,PLoS One,2011；Zhang等.,J.Clin Microbiol,2010)。
所有人肠道病毒的结构相似，因此EV71和CA16都具有相似的结构，由小的二十面体颗粒组成，其含有约7.4kb的单链正义多腺苷酸化病毒RNA。病毒衣壳中的每个原体(protomer)含有四种结构病毒蛋白(VP1-VP4)的拷贝，其中VP1、VP2和VP3是外部的，而VP4完全内化，因此不暴露于宿主抗体反应。所有这些结构蛋白都由基因组的P1区编码。VP1是EV71的主要衣壳蛋白，并且与中和表位成簇，包括SP70表位，在此处本发明的抗体结合并中和病毒。因此，本发明的抗体对EV71是有效的，其中EV71是具有约7.4kb的单链、正义、多腺苷酸化基因组的小RNA病毒，具有包含SP70表位的主要衣壳蛋白(VP1)，即，SEQ ID NO:12。
在进入过程中，病毒首先通过与细胞受体结合而附着于易感细胞。公认EV71可以在人类和动物模型中感染神经细胞，并导致中枢神经系统中的神经炎症，从而导致神经脑炎(neuroencephalitis)、无菌性脑膜炎、脑干脑炎(综述见Weng KF等.,Microbes Infect,2010)。结合后，在病毒衣壳中发生一系列结构变化，并且在细胞膜中形成孔，从而允许病毒通过胞吞作用穿过质膜，然后经历衣壳构象变化以释放病毒RNA。
神经系统并发症的发生率在亚洲爆发之间有所不同，尚不清楚哪些因素决定EV71或CA16感染是否会引起神经系统并发症。然而，有人提出，病毒的特定菌株可能是严重神经系统疾病发病的原因。1999年，据报告B3和C2亚组在澳大利亚流行。1998年，台湾患有严重神经系统疾病的儿童的分离株被证实来自C2亚组。相比之下，1997年流行中来自沙捞越的简单HFMD儿童的分离株显示来自B3亚组。这表明来自C2亚组的EV71病毒可能更可能引起CNS并发症，尽管这仍有待充分证实。然而，最近在中国，据报道C4a亚组更具神经毒性。
与世界其它地区相比，亚洲HFMD发病率很高，导致了调查寄主对HFMD易感性的可能性。Chang及其同事进行的遗传研究报道，HLA-A33与EV71感染易感性增加有关，亚洲人群中HLA-A33的发生率高于白人群体(Chang LY等，Pediatrics，2008)。该研究还表明，HLA-A2可能与EV71感染患者的心肺功能衰竭风险有关，尽管其机制尚不清楚。对于HFMD已经显示HFMD相关的神经系统并发症的另一个理论是双重感染。1997年沙捞越的爆发报告了EV71B3亚组和21型腺病毒的双重感染(Ooi MH等，Clin Infect Dis 2007)。还报道了EV71与登革热和日本脑炎的双重感染(Ooi等，2007)。然而，目前没有确凿的证据表明双重感染是CNS参与HFMD的原因。
已显示针对EV71衣壳蛋白的抗体与病毒表面结合，因此占据受体结合位点并阻断病毒/受体相互作用。这抑制病毒进入细胞(称为中和)。小鼠单克隆抗体D5对EV71表现出有效的中和作用，并支持上述作用机制。D5的IC95为0.3μg/ml(Ku Z等，J Virol Methods，2012)并且可以抑制EV71与易感细胞的结合。此外，D5可以在附着后步骤中和EV71。
到目前为止，没有疫苗或特异性(化学或生物化学)抗病毒药物被批准用于HFMD治疗，因此缓解发热和疮的症状方法以及足够的液体摄入的支持治疗代表了目前唯一可用的治疗方法。在西方国家，医生允许这种疾病继续发展。然而，如上所述，严重并发症在亚洲爆发中更常见。
从其病毒中和能力来看，本发明人认为小鼠D5抗体是人源化的候选物，以产生适合于人类治疗用途的抗体。
除预防益处外，本发明的抗体还提供治疗益处，因此比迄今为止所采用的疫苗接种方法更可用于治疗HFMD。如果有足够的公众选择接种可选的疫苗，那么预防HFMD的疫苗也只能有效预防HFMD的爆发。本发明的抗体可提供预防性治疗，但一旦患者感染疾病，也可提供有益的治疗。
组合物
药物组合物
本发明的抗体可以作为包含活性治疗性抗体剂和多种其它药学上可接受的组分的药物组合物配制和/或给予，参见《雷明顿：药学科学和实践》(Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy)(第22版，药物出版社，伦敦，宾夕法尼亚州，(2013))。优选的形式取决于预期的给药方式和治疗应用。取决于所需的制剂，组合物还可包括药学上可接受的无毒载体或稀释剂，其定义为通常用于配制用于动物或人类给药的药物组合物的载体。选择稀释剂以便不影响组合的生物活性。这种稀释剂的实例是蒸馏水、生理磷酸缓冲盐水、林格溶液、右旋糖溶液和汉克液。此外，药物组合物或制剂还可包括其它载体、佐剂或无毒、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。
含有本发明抗体的药物组合物还可以包括大的、代谢缓慢的大分子，例如蛋白，多糖例如壳聚糖，聚乳酸，聚乙醇酸和共聚物(例如胶乳官能化的SepharoseTM、琼脂糖，纤维素等)，聚合氨基酸，氨基酸共聚物和脂质聚集体(如油滴或脂质体)。另外，这些载体可以起免疫刺激剂(即佐剂)的作用。
对于肠胃外给药，本发明的抗体或组合物可以作为生理学上可接受的稀释剂中的物质与药物载体的可注射剂量的溶液或悬浮液给药，所述药物载体可以是无菌液体，例如水、油、盐水、甘油或乙醇。另外，组合物中可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等。药物组合物的其它组分是石油、动物、植物或合成来源的组分，例如花生油、大豆油和矿物油。通常，二醇，如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体，特别是对于可注射溶液。抗体可以以长效注射剂或植入制剂的形式给药，其可以配制成允许活性成分持续释放的方式。
本文所用的术语肠胃外包括皮下、静脉内、皮内、肌肉内、腹膜内和鞘内给予本发明的抗体或组合物。本发明的抗体或组合物还可以通过鼻或经胃方法给予。
通常，将组合物制成注射剂，可以是液体溶液或悬浮液；也可以制备成适于在注射前溶解或悬浮在液体载体中的固体形式。如上所述，该制剂还可以乳化或包封在脂质体或微粒，如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物中以增强佐剂效果(参见Langer，Science 249：1527(1990)和Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28:97(1997))。本发明的药剂可以采用长效注射剂或植入制剂的形式给药，其可以配制成允许活性成分持续或脉冲释放的方式。
适用于其它给药方式的其它制剂包括口服、鼻内和肺部制剂、栓剂和透皮应用。对于栓剂，粘合剂和载体包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；此类栓剂可以由含有0.5％-10％，优选1％-2％的活性成分的混合物形成。口服制剂包括赋形剂，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。这些组合物采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末的形式，并含有10％-95％，优选25％-70％的活性成分。
局部应用可导致透皮或皮内递送。通过将药剂与霍乱毒素或其解毒衍生物或其亚单位或其它类似的细菌毒素共同给药可以促进局部给药(参见Glenn等，Nature 391,851(1998))。共同给药可以通过使用作为混合物的组分或通过化学交联或表达为融合蛋白而获得的连接分子来实现。
或者，可以使用皮肤贴剂或使用转移体实现透皮递送(Paul等.,Eur.J.Immunol.25:3521(1995)；Cevc等.,Biochem.Biophys.Acta 1368:201-15(1998))。
本发明的组合物可包含本文所述的本发明抗体，药学上可接受的载体和其它治疗剂，特别是用于预防、控制或治疗HFMD、HFMD相关疾病和/或感染EV71病毒的预防或治疗剂。此类治疗剂可包括镇痛药、抗炎药、抗病毒药、缓解发热或体温升高的药物、以及设计用于麻痹疼痛的治疗性化合物，例如可麻痹口腔疼痛的漱口水或喷雾剂。本发明的组合物还可包含用于，通过例如通过静脉内治疗来再水化对象的组合物。本发明的组合物还可以包含本发明的抗体和不属于本发明的至少一种其它抗体，例如结合另一感染因子的抗体，例如可以结合柯萨奇病毒A16(CA16)病毒结合的抗体。
本发明的组合物可包含编码本文公开的抗体的核酸，即DNA或RNA，以及递送此类核酸的任何方法(含或不含任何上述其它组合物化合物)。组合物还可以包含载体，例如但不限于本文所述的表达载体，其本身包含本发明的核酸。
本发明的组合物可包含病毒载体，以便用作进入细胞的核酸递送系统。合适的病毒载体核酸递送系统包括逆转录病毒系统、腺病毒载体、来自痘科(包括痘苗病毒和禽痘病毒)的病毒载体以及来自α病毒属的病毒载体。编码本发明抗体的核酸或含有其的载体可以包装到脂质体中以递送至个体或细胞，其可以掺入所述的组合物中。编码抗体的载体和核酸也可以吸附到颗粒载体上或与颗粒载体相连。
本发明的组合物可包含基因治疗载体，其含有编码本发明抗体的核苷酸序列，或本发明的裸抗体多肽链。组合物可包含与本发明抗体组合的此类载体或多肽以及上述任何其它组合物组分。
试剂盒
本发明的抗体可以用于试剂盒中。术语“试剂盒”用于指试剂和有利于样品分析的其它材料的组合。在一些实施方式中，本发明的免疫测定试剂盒包括合适的抗原、包含可检测部分的结合剂和检测试剂。用于扩增可检测部分产生的信号的系统可以包括或不包括在试剂盒中。此外，在其它实施方式中，所述试剂盒包括但不限于以下组件或组分：例如用于样品收集的装置、样品管、夹具、托盘、支架、盘、板、试剂盒使用者的说明书、溶液或其它化学试剂以及用于标准化、归一化和/或对照样品的样品。
试剂盒可含有至少一种本发明的抗体。在一个实施方式中，试剂盒在一个或多个容器中包含本发明的组合物。在另一实施方式中，试剂盒在一个或多个容器中包含本发明的组合物和用于预防、控制或治疗HFMD、HFMD相关疾病和/或EV71病毒感染的一种或多种其它预防或治疗剂。如果含有用于给药的组分的组合物不配制成通过消化道递送，例如口服递送，则可以包括能够通过一些其它途径递送试剂盒组分的装置，例如注射器。试剂盒可以进一步包括用于预防、治疗、控制或改善HFMD、HFMD相关疾病和/或EV71病毒感染的使用说明书，以及副作用和给药方法的剂量信息。
本发明还提供诊断试剂盒。本发明的抗体可用于监测、诊断或为HFMD、HFMD相关疾病和/或EV71病毒感染的产生或进展提供预后，并且可用于适合于此类目的的试剂盒中。本发明的抗体可以用于诊断试剂盒中，以检测取自个体的体液样品中EV71抗原或EV71抗原的SP70肽表位的存在，其中个体可以是人或哺乳动物，例如非人灵长类动物或实验动物，包括小鼠、大鼠和家兔。从个体获取体液样品，例如但不限于血液、血清或脑脊液，使用本发明的抗体测试抗原的存在。使用本发明的抗体测量个体血液中的EV71水平可以提供关于合适的给药方案和用于治疗此类个体的本发明抗体或组合物的剂量信息。上述方法通常在体外进行。
可用于上述诊断的试剂盒可包含与可检测物质偶联的本发明抗体，包括但不限于：用于包括EIA和ELISA在内的测定中的各种酶，例如但不限于，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，例如但不限于链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；颗粒，如乳胶珠或细菌，以便用于凝集试验；荧光材料，例如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如但不限于鲁米诺；生物发光材料，例如但不限于荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；放射性物质，例如但不限于碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In、111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Sn；用于各种正电子发射断层扫描的发射正电子的金属、非放射性顺磁金属离子和放射性标记或与特定放射性同位素偶联的分子。不难测量的任何可检测标记可以与本发明的抗体偶联，并用于诊断本文所述的疾病。可以采用本领域已知的技术，将可检测物质直接或通过中间体(例如，本领域已知的接头)间接偶联或缀合至抗体。参见，例如，美国专利第4,741,900号的金属离子，其可与抗体偶联以用作诊断剂。
使用本文所述试剂盒中的本发明抗体，通过采用上述任何方法或可检测物质检测抗原可以对EV71病毒或SP70肽的存在给出阳性结果，并且可以将个体诊断为患有HFMD、HFMD相关疾病和/或EV71病毒感染。此类个体随后需要和/或经历本文所述的HFMD治疗。
治疗
本发明尤其涉及肠病毒71(EV71)及相关疾病和病症的治疗，包括手足口病(HFMD)。本发明还涉及给予需要治疗的个体有效量的本文所述的本发明抗体或组合物来治疗或预防HFMD的方法。本发明的抗体或组合物，优选药物组合物(例如，包含本发明抗体和一种额外的治疗剂，例如可以与柯萨奇病毒A16(CA16)病毒结合的抗体的组合物)可以用于治疗人体或动物体的方法。本发明的抗体或组合物，优选药物组合物可用于治疗人体或动物体的方法，其中所述治疗是治疗性或预防性治疗个体中的HFMD。
上述治疗方法可以包括在个体中产生有益治疗反应的条件下，给予本发明的抗体或组合物(例如，包含本发明抗体和一种额外的治疗剂，例如可以与柯萨奇病毒A16(CA16)病毒结合的抗体的组合物)，例如，用于预防或治疗HFMD。
此类个体可能被EV71感染或可能患有HFMD或HFMD相关疾病。本文所述的治疗方法可用于无症状患者和目前显示疾病症状的患者，特别是HFMD。本发明的抗体可以预防性地给予未感染EV71且不具有HFMD的个体。本发明的抗体可以给予感染EV71并且没有或没有表现出HFMD症状的个体。本发明的抗体可以给予患有或似乎患有HFMD或HFMD相关疾病的个体。此类个体可以是不知道EV71是否存在的个体。适合治疗的个体包括具有接触EV71-或HFMD-相关疾病的风险但未显示出症状的个体和怀疑患有EV71-或HFMD-相关疾病的个体，以及目前表现出症状的个体。本发明的抗体可以预防性地给予一般人群，而不需要对对象个体的风险作任何评估。
术语“治疗”、“治疗的”或“治疗方法”(或语法上等同的术语)意味着个体病情的严重程度降低或至少部分改善或好转和/或实现至少一种临床症状的缓解、减轻或降低和/或抑制或延迟病情的进展和/或预防或延迟疾病或病症的发作。
可用于治疗EV71感染和/或HFMD或HFMD相关疾病的方法的本发明抗体可以是本文所述的任何序列和形式的抗体，其特异性结合EV71的SP70肽表位。用于本文所述治疗方法的抗体可以是本发明抗体的片段，例如抗原结合片段。本发明的抗体可以给予感染任何基因型组A、B、C、D、E或F的EV71的个体，包括分类为任何亚基因型组的EV71，例如B1-B5或C1-C5。
本发明的抗体可以与药物载体或药物组合物或在本文所述的任何组合物中给予需要治疗的个体。
或者，可以通过给予编码至少一个抗体链的多核苷酸将抗体给予个体。表达多核苷酸以在患者中产生抗体链。任选地，多核苷酸编码抗体的重链和轻链。表达多核苷酸以在个体中产生重链和轻链。
本发明的抗体可用于预防或治疗HFMD或相关疾病或病症的方法，包括给予患者有效剂量的本文所述抗体。本文所用的本发明治疗性抗体的“有效量”或“有效剂量”或“充足量”(或语法上等同的术语)是指有效产生所需效果的本发明抗体或组合物的用量，其任选地是治疗效果(即，通过给予治疗有效量)。例如，“有效量”或“有效剂量”或“充足量”可以是某一用量，以便减少或至少部分改善或缓解改善个体病症(例如HFMD)的严重程度和/或实现至少一种临床症状的一些缓解、减轻或降低和/或抑制或延迟病情的进展和/或预防或延迟疾病或病症(例如HFMD)的发作。
术语“患者”、“个体”或“对象”包括接受本发明的预防性或治疗性治疗与一种或多种药剂(例如免疫治疗剂或抗体)的人和其它哺乳动物对象。哺乳动物对象包括灵长类动物，例如非人灵长类动物。哺乳动物对象还包括常用于研究的实验动物，例如但不限于家兔和啮齿动物，如大鼠和小鼠。哺乳动物对象也可以是家畜，包括牛、绵羊、马和猪等家畜，以及诸如猫和狗等宠物。
剂量
足以完成治疗或预防性治疗的本发明抗体或组合物的用量定义为有效剂量，例如治疗或预防有效剂量。在预防和治疗方案中，可以以几种剂量给予试剂，直到达到足够的免疫应答。术语“免疫应答”或“免疫学应答”包括产生针对受体对象中抗原的体液(抗体介导的)和/或细胞(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导)反应。通常，监测免疫应答并且如果免疫应答开始减弱则给予重复剂量。
用于治疗上述病症的本发明组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括给药方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、给予的其它药物、以及治疗是预防性的还是治疗性的。患者通常是人，但也可以治疗非人哺乳动物，例如非人灵长类动物、家兔、大鼠和小鼠，包括转基因哺乳动物。需要滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
对于用本发明抗体进行被动免疫，剂量范围为约0.0001至100mg/kg宿主体重，更通常为0.01至5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内，优选至少1mg/kg。在另一实例中，剂量可以是0.5mg/kg体重或15mg/kg体重或在0.5-15mg/kg范围内，优选至少1mg/kg。在另一实例中，剂量可以是0.5mg/kg体重或20mg/kg体重或在0.5-20mg/kg范围内，优选至少1mg/kg。在另一实例中，剂量可以是0.5mg/kg体重或30mg/kg体重或在0.5-30mg/kg范围内，优选至少1mg/kg。在优选的实例中，剂量可以是约30kg/mg。
本发明的方法可包括以单剂量、两剂量或多剂量给予对象抗体。抗体的剂量可以是约100μg/kg至100mg/kg患者体重，约300μg/kg至30mg/kg患者体重，或约1mg/kg至10mg/kg患者体重。对象可以每日、每隔日、每周或根据经验分析确定的任何其它时间表给予这样的剂量。治疗可包括在长时间，例如至少六个月给予多剂量。其它治疗方案可能包括每两周一次或每月一次或每3至6个月一次的给药。示例性剂量方案包括连续几天1-10mg/kg或15mg/kg，隔天30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，可以同时给予具有不同结合特异性的本发明的两种或更多种单克隆抗体，至少一种抗体，在这种情况下，给予的每种抗体的剂量落在所示的范围内。
可以多次给予本发明的抗体。单剂量间隔可以是每周，每月或每年。如通过测量患者中针对EV71的抗体的血液水平所指示的，间隔也可以是不规则的。在一些方法中，调节剂量达到1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中达到25-300μg/ml。或者，本发明的抗体可以作为持续释放制剂给予，在这种情况下需要较低频率的给药。剂量和频率根据患者中抗体的半衰期而不同。通常，人源化抗体显示出比嵌合和非人抗体更长的半衰期。
给药剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性而有所不同。在预防性应用中，将含有本发明抗体或其混合物的组合物给予尚未处于疾病状态的患者以增强患者的抵抗力。此类用量定义为“预防有效剂量”。在该用途中，精确用量还取决于患者的健康状况和一般免疫力，但通常为每剂0.1至25mg，特别是每剂0.5至2.5mg。在较长时间内以相对不频繁的间隔给予相对低的剂量。
在治疗应用中，有时需要以较短的间隔时间和较高的剂量(例如，每剂量约1至200mg抗体，更常用的剂量为5至25mg)，直至疾病进展减少或终止，优选直到患者表现出疾病症状部分或完全改善。
编码本发明抗体的核酸的剂量范围为每位患者约10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg或30-300μg DNA。感染性病毒载体的剂量为每剂量10-100或更多种病毒粒子。
如本文所述，本发明的抗体和组合物可以通过肠胃外、局部、静脉内、口服、经胃、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌肉内方法给予以供治疗性和/或预防性治疗。肌内注射或静脉内输注优选用于抗体给药。
核酸的给药
通过给予编码本发明抗体的核酸可以诱导针对EV71的免疫应答。此类核酸可以是如其中所述的DNA或RNA，参考序列表。编码本发明抗体的核酸区段可以与调控元件，例如启动子和增强子连接，其允许核酸区段在患者的所需靶细胞中表达。为了在血细胞中表达，如诱导免疫应答所需，示例性启动子和增强子元件包括来自轻链或重链免疫球蛋白基因和/或CMV主要中间早期启动子和增强子的那些(Stinski，美国专利号5,168,062和5,385,839)。通常将连接的调控元件和编码序列克隆到载体中。对于双链抗体的给药，可以将两条链克隆到同一或不同的载体中。
许多病毒载体核酸递送系统是可用的，包括逆转录病毒系统(参见，例如Lawrie和Tumin,Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109(1993))；腺病毒载体(参见，例如Bett等，J.Virol.67:5911(1993))；腺相关病毒载体(参见，例如Zhou等，J.Exp.Med.179:1867(1994))；来自痘科的病毒载体，包括痘苗病毒和禽痘病毒，来自α病毒属，例如源自辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒(参见，例如Dubensky等，J.Virol.70:508(1996))，委内瑞拉马脑炎病毒(参见Johnston等，美国专利号5,643,576)和弹状病毒，如水疱性口炎病毒(参见Rose，美国专利号6,168,943)和乳头瘤病毒(Ohe等，Human Gene Therapy 6:325(1995)：Woo等，WO 94/12629和Xiao和Brandsma，Nucleic Acids.Res.24,2630-2622(1996))的病毒载体。
编码本发明抗体的核酸或含有其的载体可以包装到脂质体中以递送至个体或细胞。合适的脂质和相关的类似物由Eppstein等的美国专利号5,208,036、Felgner等的美国专利号5,264,618、Rose的美国专利号5,279,833和Epand等的美国专利号5,283,185中描述。编码此类抗体的载体和核酸也可以吸附到颗粒载体上或与颗粒载体结合，其实例包括聚甲基丙烯酸甲酯聚合物和聚交酯和聚(丙交酯乙交酯共聚物)，参见例如McGee等，J.Micro Encap.(1996)。
含有本发明核酸或裸多肽的基因治疗载体可以通过给予个体患者作体内递送，通常通过全身给药(例如，静脉内、腹膜内、鼻内、胃内、皮内、肌肉内、皮下或颅内输注))或局部应用(参见例如Anderson等，美国专利号5,399,346)。术语“裸多核苷酸”是指未与转染促进剂结合递送的多核苷酸。有时将裸多核苷酸克隆在质粒载体中。此类载体可进一步包括促进剂，如布比卡因(Weiner等，美国专利号5,593,972)。DNA也可以使用基因枪给药。参见上文的Xiao和Brandsma。编码抗体的DNA沉淀在微观金属珠的表面上。微粒用冲击波或膨胀的氦气加速，并穿透组织到几个细胞层的深度。例如，由Agricetus，Inc.(米德尔顿，威斯康星州)制造的Accel.TM基因递送装置是合适的。或者，简单地通过将化学或机械刺激将DNA点到皮肤上，裸DNA可以穿过皮肤进入血流(参见Howell等，WO 95/05853)。
在进一步的变化中，编码本发明抗体的载体可以离体递送至细胞，例如从个体患者(例如，淋巴细胞、骨髓抽吸物、组织活检)移出的细胞或通用供体造血干细胞，然后将细胞再植入患者，通常在选择掺入了载体的细胞后。
核酸、宿主细胞和抗体的产生
本发明还涉及编码所公开抗体多肽链的核酸。本发明的核酸可具有SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示核苷酸序列。核酸也可以是RNA序列，其中胸腺嘧啶核碱基被尿嘧啶取代。
可以通过重组表达产生本发明的抗体。可以将编码任选与恒定区连接的轻链和重链可变区的上述核酸插入表达载体中。包含编码本发明抗体的核酸的载体本身是本发明的一部分。轻链和重链可以克隆在同一或不同的表达载体中。编码本发明抗体链的核酸与表达载体中的一个或多个控制序列操作性连接，所述控制序列确保抗体多肽的表达。表达控制序列包括但不限于启动子(例如，天然相关或异源启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。优选地，表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞(例如COS，CHO或Expi293细胞)的载体中的真核启动子系统。可以将此类载体包括在合适的宿主中，从而将宿主维持在适合于核苷酸序列的高水平表达以及抗体的收集和纯化的条件下。
在一个实施方式中，核酸编码本文所述的本发明抗体。在另一实施方式中，载体，优选表达载体包含编码本发明抗体的一种或多种核酸。在进一步的实施方式中，载体包含一种或多种编码本发明抗体的核酸，其操作性连接于启动子。示例性表达载体是pHuK和pHuG1，其与本文公开的核酸组合包含编码本发明抗体的核苷酸序列。也可以使用提供编码抗体轻链和重链恒定区的核苷酸序列的其它载体。
用于本发明的表达载体通常可作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分在宿主生物中复制。通常，表达载体含有选择标记(例如，氨苄青霉素抗性，潮霉素抗性，四环素抗性，卡那霉素抗性或新霉素抗性)以便检测转化有所需DNA序列的那些细胞(参见，例如，Itakura等的美国专利号4,704,362)。
用表达载体转化宿主细胞，并在适当的常规营养培养基中培养以诱导启动子，选择转化子或扩增编码所需序列的基因。包含本发明的核酸或载体的宿主细胞本身是所述发明的一部分。
本发明还涉及制备本发明抗体的方法，该方法包括在宿主细胞培养物中还表达本发明的载体以产生所述抗体，并从细胞培养物中回收抗体。该方法涉及将包含编码上述抗体或抗体链的一种或多种核酸的载体转移到宿主细胞中，如本文所述，在允许一种或多种核酸表达的条件下培养宿主细胞培养物，通过本领域已知的任何合适方法回收表达的抗体。在一个实例中，载体是pHuK和pHuG1，核酸包含SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中列出的核苷酸序列，宿主细胞是人Expi293悬浮细胞(参见实施例1)。
适用于克隆本发明核酸的微生物宿主生物包括原核宿主；大肠杆菌(Escherichiacoli)、杆菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和其它肠杆菌科，如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)和各种假单胞菌(Pseudomonas)。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。此外，存在任何数量的各种熟知的启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常将控制表达，任选地具有操纵基因序列，并具有核糖体结合位点序列等，以便启动和完成转录和翻译。用于原核细胞的载体也需要复制起点组分。
其它微生物，例如酵母也可用于表达本发明的抗体、核酸或载体。酵母(Saccharomyces)是优选的酵母宿主，有合适的载体，其具有表达控制序列(例如，启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其它糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
除微生物外，哺乳动物组织细胞培养物也可用于从本发明的核酸和载体表达和产生本发明的抗体多肽(例如，编码抗体或其片段的多核苷酸)。参见Winnacker，“从基因到克隆”(From Genes to Clones)，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.(1987)。包含本发明的核酸或载体的真核或哺乳动物细胞宿主本身是本发明的一部分。真核细胞实际上是优选的，因为本领域已经开发了许多能够分泌异源蛋白的合适宿主细胞系(例如，完整抗体)，并且包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系或转化的B细胞或杂交瘤。细胞可以是人或非人的，例如非人类哺乳动物细胞。优选地，细胞是Expi293人细胞。本发明的抗体可以在工程改造以产生非岩藻糖基化蛋白的细胞系中产生，例如CHOK1SV细胞系(BioWa/Lonza)，-工程改造细胞(ProBioGen)或鸭胚胎干细胞系EB66(Valneva))。用于哺乳动物细胞的表达载体通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和必需的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列是衍生自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。参见Co等，J.Immunol.148:1149(1992)。
用于真核宿主细胞的本发明载体还可含有信号序列或在感兴趣的成熟蛋白或多肽的N-末端具有特异性切割位点的其它多肽。选择的异源信号序列优选是宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，有哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列可用，例如单纯疱疹病毒gD信号。
或者，可以将本发明的抗体编码序列纳入转基因中以便导入转基因动物的基因组中并随后在转基因动物的乳汁中表达(参见，例如Deboer等.,美国专利号5,741,957；Rosen,美国专利号5,304,489；和Meade等.,美国专利号5,849,992)。合适的转基因包括与来自乳腺特异性基因(例如酪蛋白或β乳球蛋白)的启动子和增强子操作性连接的轻链和/或重链的编码序列。
含有感兴趣多核苷酸序列(例如重链和轻链编码序列和表达控制序列)的本发明载体可以通过熟知的方法转移到宿主细胞中，这些方法根据细胞宿主的类型而不同。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、生物射弹或基于病毒的转染可用于其它细胞宿主。(参见Green和Sambrook，《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，第4版，2012)。用于转化哺乳动物细胞的其它方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(通常参见，Sambrook等，同上)。为了产生转基因动物，可以将转基因显微注射到受精卵母细胞中，或者可以将其掺入胚胎干细胞的基因组中，并将这些细胞的细胞核转移到去核卵母细胞中。
当将重链和轻链克隆到不同的表达载体上时，共转染载体以获得本发明的完整抗体的表达和装配。表达后，可以根据本领域的标准程序纯化本发明的全抗体、其二聚体、单个轻链和重链或其它免疫球蛋白形式，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、HPLC纯化、凝胶电泳等(参见Scopes，《蛋白质纯化》(Protein Purification)，Springer-Verlag，纽约，(1982))。对于本文所述的药学应用，优选至少约90-95％同质性的基本上纯的抗体，最优选98-99％或更高的同质性。可以采用本领域已知的标准蛋白纯化方法。以下步骤是合适的蛋白纯化方法的示例：在免疫亲和或离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶或阳离子交换树脂，如DEAE色谱法，色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和凝胶过滤。
本发明的抗体的产生可以通过任何合适的技术进行，包括本文所述的技术以及本领域技术人员已知的技术。本发明的抗体可以使用本领域熟知的用于大规模制备抗体的方法以商业规模生产。例如，这可以使用重组表达系统完成，例如本文所述的那些。
本文提及的所有专利、专利申请和出版物均通过引用整体并入本文。
尽管出于清楚理解的目的通过说明和示例提供了本公开内容的某些细节，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本公开内容的精神或范围的情况下可以实践各种改变和修改。因此，说明和实施例不应被解释为限制性的。
通过以下实施例说明本发明。
实施例
本文的实施例描述了来自小鼠的抗EV71D5抗体的人源化形式的产生和性质。
实施例1.D5人源化抗体变体的设计
初步研究表明嵌合D5抗体的结合能力与天然鼠D5抗体的结合能力相似。由于发现嵌合D5抗体保留功能并与EV71病毒结合，进行了抗体的进一步人源化。
扩增编码鼠D5抗体κ轻链(VH)和重链(VK)的可变区的cDNA，并将其导入kappa/IgG表达载体(分别为pHuK和pHuG1)。将构建体共转染到Expi293悬浮细胞中以产生嵌合D5(cD5)抗体，其包含人恒定区和鼠D5可变区。
通过ELISA测量嵌合D5抗体与EV71-VLP(病毒样颗粒)和SP70肽结合表位的结合，发现嵌合抗体具有与鼠D5抗体相当(如果略低)的EC50值(图2a和2b)。通过生物层干涉进一步表征小鼠和嵌合D5抗体与EV71-VLP的结合。图3中的小鼠和嵌合D5抗体与EV71-VLP结合的稳态图显示两种抗体结合EV71-VLP具有相当的表观KD值。
人源化需要鉴定合适的人可变区作为非人互补决定区(CDR)的框架区。用D5抗体VH和VK蛋白质序列查询人可变重链(VH)和轻链(VK)链序列数据库。鉴定了小鼠D5抗体结构中CDR残基的内的框架残基，命名为“邻近残基”。在邻近残基中与D5VH具有最高相同性的人VH序列比对被认为是合适的框架序列。
由于与鼠D5VH的高度序列相同，选择序列EF178053作为人重链供体候选对象。将鼠D5抗体重链的CDR1、2和3引入EF178053的框架中以产生命名为D5HA的序列(SEQ ID NO:1)。将8个鉴定的邻近残基回复突变为等同的小鼠残基，以产生称为D5HB(SEQ ID NO:11)的人源化抗体变体，其含有8个突变：Y27F；T28N；F29I；T30K；R67K；V68A；R72A和S98N。产生了另外8个重链变体，命名为HC(SEQ ID NO:13)、HD(SEQ ID NO:14)、HE(SEQ ID NO:15)、HF(SEQ ID NO:16)、HG(SEQ ID NO:17)、HH(SEQ ID NO:18)、HI(SEQ ID NO:19)和HJ(SEQID NO:20)，各自包含上述顺序中的八个突变之一(即变体HC仅含有Y27F突变，HD仅包含T28N突变，依此类推)，见图1。
选择序列AJ388646作为人κ轻链供体候选对象。将鼠D5VK的CDR 1、2和3导入AJ388646的框架中。得到的构建体命名为D5KA(SEQ ID NO:2)。产生另一种变体，D5KB(SEQID NO:7)，其中D5KA中的两个不匹配的邻近残基被回复突变(I2V和V3L)至等同的小鼠残基。用取代的KA结构域产生三个另外的变体，命名为KC(SEQ ID NO:8；I2V)、KD(SEQ IDNO:9；V3L)和KE(SEQ ID NO:10；I2V、V3L和Q50K)。序列和突变如图4所示。
以下实施例中讨论的人源化抗体描述为“hEV71[重链变体][轻链变体]”。例如，“hEV71HBKA”是人源化形式的D5抗体(结合EV71病毒)，含有HB重链和KA轻链。
实施例2.D5人源化抗体的产生
将实施例1中产生的EF178053(HA至HJ)和AJ388646(KA至KE)的经修饰可变域核苷酸序列导入表达载体pHuK和pHuG1中，并在大肠杆菌细胞中表达。提取质粒DNA，并使用编码人源化VH和VK链的表达质粒制备物转染Expi293细胞。将细胞在无血清培养基中培养5-7天，收获所得的分泌抗体。
实施例3.原始D5人源化抗体变体的功效
该实施例显示，与嵌合D5抗体相比，实施例1中产生的人源化D5抗体变体显示出与EV71-VLP的结合较低，并且与相关的EV71SP70肽D5表位的结合显著较低。
通过结合ELISA(如Ku等.,(2012)J.Virol Methods 71 186:193-197中所述)将HA/HB重链与人源化D5抗体的KA/KB轻链形式的组合与EV71-VLP或SP70肽抗原进行结合。将抗体变体的系列稀释液(从～100μg/ml开始)加入固定的EV71-VLP或SP70肽表位中，室温下振荡1小时并用PBS-T洗涤。加入抗人κ链HRP并重复孵育和洗涤步骤。将TMB/K-Blue底物在室温下与反应温育5-10分钟，然后用H2SO4 RED STOP终止反应。在450/650nm处读取光密度。
图5显示Kappa轻链的KA或KB形式的存在并未致使抗体与抗原的结合能力有可观察的差异。引入KB的两个反向突变似乎不是抗体结合所必需的。
与嵌合D5抗体相比，含有HA和HB重链的人源化抗体变体显示出对EV71 SP70肽表位的结合能力降低(图5)。图6显示，与嵌合D5抗体相比，进一步人源化D5抗体形式hEV71HCKA与hEV71 HJKA对SP70肽表位的结合能力严重受损。
测试人源化抗体重链变体HA-HJ与KA或KBκ轻链的组合的中和能力。图7显示含有HB重链的抗体变体是能够中和EV71病毒的唯一变体。
通常，在人源化抗体中，人框架中非人CDR序列的约内的残基(即，4A邻近残基)需要被相应的非人残基取代以维持抗体功能。然而，图5、6和7显示将邻近残基回复突变为含有重链HB-HJ的人源化D5抗体变体中的鼠残基不能实现预期的抗体功能维持，以及与嵌合D5抗体相比，实施例3中描述的人源化D5抗体的结合能力极大降低。
实施例4.hEV71 HM-HQ人源化重链的功效
为应对实施例3中人源化抗体变体中结合活性的意外丧失，产生新的人源化D5重链形式，其含有回复突变为鼠残基的新的和/或不同组合，以试图获得结合能力提高的人源化D5抗体。三种有希望的重链序列变异被命名为HM(SEQ ID NO:3)、HN(SEQ ID NO:4)和HQ(SEQ ID NO:6)。
将HM-HQ重链与KA轻链的KA形式组合。通过结合ELISA测量hEV71 HMKA、hEV71HNKA和hEV71 HQKA抗体与SP70肽表位的结合活性，如图8所示。hEV71 HNKA形式显示出与HBKA候选对象相似的结合能力。然而，hEV71 HMKA和hEV71 HQKA形式在与SP70肽表位结合方面显示出出乎意料的改善，显示出与嵌合D5抗体相似的结合能力。除了已经存在于HB重链变体中的突变之外，HM重链中存在的两个补充突变(SEQ ID NO:3中的K23T和S77N)改善了hEV71 HMKA人源化D5抗体的结合。HQ重链变体包含HB重链中存在的所有突变，HM重链中的两个额外突变和另外的突变：R38K。hEV71 HQKA似乎不具有优于hEV71 HMKA的结合能力，因此R38K突变似乎对抗体功能不是至关重要的。
产生另一种人源化D5重链，命名为HP(SEQ ID NO:5)。然而，hEV71 HPKA显示与SP70肽表位的结合不良(图8)。
通过在每种抗体的EC80处进行结合ELISA来测试hEV71 HMKA与hEV71 HQKA变体与SP70肽表位的15种变体的结合。通过将SP70肽序列(SEQ ID NO:12)中的每个氨基酸一次一个突变为丙氨酸残基来产生表位变异。如前所述进行结合ELISA测定。图9显示HM至HQ抗体变体与嵌合D5抗体和HBKA变体显示出与SP70肽丙氨酸扫描文库结合的相同模式。如在图8中的结合ELISA中观察到的，hEV71 HMKA和hEV71 HQKA变体显示对SP70肽表位变异的结合能力最高。
实施例5.hEV71 HMKA病毒中和
进行中和测定以评估hEV71 HMKA到hEV71 HQKA人源化D5抗体变体的EV71病毒中和能力(图10)。与hEV71 HBKA相比，hEV71 HNKA变体在病毒中和方面显示出小的改善。hEV71 HPKA未能中和病毒。然而，hEV71 HMKA和hEV71 HQKA变体显著优于hEV71 HBKA，hEV71 HNKA改进程度略小，甚至与小鼠D5抗体相比，显示出意想不到的改善。
实施例6.hEV71 HMKA抗体对SP70肽具有与嵌合D5抗体相似的结合亲和力
该实施例显示了hEV71 HMKA抗体的观察到的结合常数(KA)和观察到的解离常数(KD)。Ka描述了在达到与组分解离成[抗体]+[抗原]的速率平衡的反应点时存在多少[抗体][抗原]复合物。高亲和力抗体将在比低亲和力抗体更短的时间内结合更大量的抗原，并且具有大于107M-1的Ka值。Kd越低，抗体对其抗原或表位的亲和力越大。对于大多数抗体，Kd值通常在低微摩尔(10-6)至纳摩尔(10-7至10-9)范围内，或者对于亲和力高或非常高的抗体在低纳摩尔(10-9)或甚至皮摩尔范围(10-12)中。
嵌合D5和hEV71 HMKA抗体与SP70肽表位的结合通过等温滴定量热法(ITC；图11)进行，这是一种产生“观察到的”KA和KD值的热力学技术。可以利用吉布斯自由能、焓和熵计算KD：ΔG＝ΔH-TΔS和ΔG＝RT ln KD。KA采用KA＝1/KD计算。
hEV71 HMKA抗体与SP70肽结合的观察到的KA为2.62×107M-1。嵌合D5抗体与SP70肽结合的观察到的KA为5.66×107M-1。两种抗体对SP70表位都具有高亲和力。
图11还显示hEV71 HMKA抗体与SP70肽结合的观察到的KD值为38.2nM(3.82x10- 8M)，这与嵌合D5抗体的观察到的KD值，17.1nM(1.71x10-8M)相当，并且接近高亲和力抗体的一般KD范围。
因此，hEV71 HMKA抗体对EV71病毒的VP1衣壳蛋白上的SP70肽表位的观察到的结合常数高和观察到的解离常数低，类似于嵌合D5抗体计算的值。引入hEV71 HMKA框架区的鼠突变产生了具有重链的抗体，其具有表位结合所需的必需鼠D5特征。因此，本发明的抗体可用于临床，例如治疗或预防性使用或其它用途，如本文所述。特别是，本发明抗体可用于治疗EV71感染和/或HFMD和相关疾病，或者本发明抗体需要结合EV71的SP70肽表位的情况下。
以下实施例提供了hEV71 HMKA抗体的详细生物物理学分析，讨论了临床试剂中所需或必需的抗体特性。
实施例7.hEV71 HMKA的热稳定性
单克隆抗体相对脆弱，高温可导致抗体变性，从而产生对不可逆聚集敏感的蛋白。此外，更稳定的抗体在患者血清中具有更长的半衰期，并且可以对治疗给药策略产生有益效果。
测试了hEV71 HMKA抗体的热稳定性。将hEV71 HMKA抗体用100μl 1％的牛奶/PBS/0.05％吐温20稀释至EC80浓度。将抗体在25℃至80℃之间以5℃间隔进行10分钟温度处理，冷却至4℃，并通过结合ELISA测试。图12a显示hEV71 HMKA看起来稳定，保持其与EV71 SP70肽表位的结合能力直至70℃，其中与SP70的结合降低。
在热变换测定中测试hEV71 HMKA的解链温度(Tm)。将终浓度为1或2μM的抗体与荧光染料(Sypro Orange)一起孵育71个循环，在qPCR热循环仪中每循环增加1℃，温度为25℃至95℃。计算出hEV71 HMKA的Tm为69-70℃(图12b)。
解链温度为69-70℃并且在高至和超过其解链温度的温度下结合SP70表位的能力表明本发明的抗体适合于治疗和预防应用，不可能在患者体内变性并且可能具有较长的半衰期，因此治疗HFMD、相关疾病和/或EV71感染可能需要较低剂量的抗体。
实施例8.hEV71 HMKA的凝聚和溶解度
该实施例表明，本发明的抗体可以经浓缩并保持单体形式。
将hEV71 HMKA抗体样品以0.4ml/min注射到HPLC系统中的尺寸排阻柱中，并通过多角度光散射分析以确定绝对摩尔质量并检查凝聚情况。图13中的图谱显示没有凝聚迹象，因为检测到的物质具有约136.6kDa的平均分子量，这是该分析中IgG单体的预期范围。抗体是单分散的(Mw/Mn&lt;1.05)。质量回收率在99.6-99.9％之间(计算质量超过注射质量)，这表明蛋白回收率良好，并且样品看来不粘附在柱子上或不含有由保护柱保留的不溶性凝聚物。总体数据表明hEV71 HMKA抗体没有凝聚问题。
进行交叉相互作用色谱(CIC)分析以评估抗体参与非特异性蛋白-蛋白相互作用的倾向，并为可能对下游制造引起问题的任何溶解度问题提供指示。CIC可用于区分可溶性和不溶性抗体。保留指数(k’)提高表示自相互作用倾向和溶解度低。通过两次单独的20μl注射分析样品，一次注射到含有30mg人多克隆IgG的1ml NHS活化树脂上，另一次注射到1mlNHS活化对照柱上。通过UV吸光度检测洗脱的样品。样品峰保留时间用于计算保留因子k’。图14说明hEV71 HMKA抗体显示保留指数低于0.037，表明非特异性相互作用的倾向性低且溶解性良好。
动态光散射(DLS)用作互补技术(即，静态光散射，例如SEC-MALS)以便检测可溶性凝聚物。使用溶剂吸收浓缩器(MWCO 7500kDa)浓缩在Dulbecco PBS(Sigma；2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4,138.0mM NaCl，8.1mM Na2HPO4；生理pH)中的一式三份30ml hEV71 HMKA抗体样品，并在定时的间隔测量浓度(图15)。将抗体浓缩至98.5mg/ml，没有明显的沉淀。凝聚评估DLS显示，浓缩后，发现抗体具有与单体一致的流体动力学半径和多分散性。数据表明抗体在高达98mg/ml的浓度下不易沉淀。通过累积量分析获得平均粒径(Z-Ave直径)和多分散指数(PDI)，并且浓缩前和浓缩后抗体样品显示相似值。
进一步测试hEV71 HMKA抗体在冻/融应激期间的凝聚倾向。将纯化的候选抗体样品进行以下10个循环：-80℃、15分钟，然后在室温下解冻15分钟。然后通过SEC-MALS(尺寸排阻色谱-多角度光散射)分析“非应激”和“应激”样品以检查凝聚体的存在和/或诱导，这可能引起下游制造问题。图16中的数据表明冻/融不会引起hEV71 HMKA抗体凝聚。应激后hEV71 HMKA的分子量约为141.5kDa，接近IgG的单体重量。抗体是单分散的(Mw/Mn&lt;1.05)，意味着仅存在一种分子量，单体质量分数为99.8％。
对hEV71 HMKA抗体进行热诱导应激分析以研究凝聚。将纯化的候选抗体的样品在a)4℃、b)25℃、c)37℃和d)50℃下暴露33天。然后通过上述SEC-MALS分析样品以检查凝聚。图17显示hEV71 HMKA的分子量在所有四个温度下保持在136kDa的单体重量附近。抗体是单分散的(Mw/Mn&lt;1.05)，意味着仅存在一个分子量，并且质量分数值不受热处理的影响。
通过毛细管等电聚焦(cIEF)测定hEV71 HMKA抗体的等电点(pI)，该方法在毛细管场上施加电压，从而能够通过pH梯度基于它们的pI分离蛋白，其中相对的末端浸没在酸性(阳极)和碱性(阴极)溶液中。蛋白一旦达到等电点就会停止迁移并具有中性电荷。该技术使用含有≤50mM NaCl的5-10mg/ml蛋白溶液，在以下缓冲液中进行：阳极电解液(200mM磷酸)、阴极电解液(300mM氢氧化钠)、化学动员剂(350mM乙酸)、阴极稳定剂(500mM精氨酸)、阳极稳定剂(200mM亚氨基二乙酸)、4.3M尿素溶液和3M尿素-cIEF凝胶溶液。确定hEV71HMKA抗体的主峰的pI为pH 7.4。总体数据表明hEV71 HMKA抗体具有优异的生物物理特性，并且没有凝聚或溶解度问题。hEV71 HMKA抗体保持单体状态，显示出非特异性相互作用的倾向低，未表现出具有任何溶解性问题，浓缩时不凝聚或沉淀，在经历反复的冻融循环时不会发生凝聚，并且在经受长时间的热处理时没有表现出凝聚倾向。hEV71 HMKA抗体通过生物物理特性的所有QC标准。组合来看，这些数据表明，如本文所述，可以制造、储存和使用本发明的抗体，而不会被这种处理损坏或不能使用。
实施例9.hEV71 HMKA的血清稳定性评估
该实施例证明了hEV71抗体在哺乳动物血清中的稳定性。
将PBS中的hEV71 HMKA抗体纯化样品在小鼠、人和食蟹猴血清中于37℃温育5、10、20和30天。孵育后抗体与SP70肽表位的结合亲和力通过结合ELISA来测量。将已经在3种不同血清中孵育的hEV71 HMKA的结合与未经历任何孵育的抗体结合和已经在PBS中孵育的抗体结合进行比较。图18中的ELISA测定显示，血清孵育的抗体与SP70肽表位的结合与31天后PBS孵育和未孵育的抗体的结合非常相似。因此，hEV71 HMKA抗体在小鼠、人和食蟹猴血清中孵育一个月对抗体对SP70肽表位的结合功能没有影响。
如果抗体用于对象或此类对象的细胞中，则抗体的血清稳定性是重要的。当在基于血清的环境中时，本发明的抗体保留SP70表位的结合能力，因此可用于治疗性和预防性治疗。
实施例10.抗体功能的关键残基
通过X射线晶体学解析与SP70肽形成复合物的嵌合D5抗体的fab区域的结构。对该结构的分析表明，小鼠D5重链上76号天冬酰胺残基6的侧链(根据Kabat编号；相当于SEQ IDNO:3中的反向突变残基N77)与苯丙氨酸27和天冬酰胺28的主链形成氢键。这两个残基是位于可变重链的CDR环1开始之前的2个氨基酸，并且它们似乎是稳定该环以供抗原识别所必需的。因此，保留该天冬酰胺残基(N76(Kabat))是保持这种功能的关键。
除D5F27和N28残基外，hEV71 HMKA和hEV71 HQKA人源化抗体变体(分别为SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:6)还含有回复突变的鼠D5N77残基。这为与在77位含有人丝氨酸残基而非天冬酰胺的含重链变体HB突变(SEQ ID NO:11)的抗体相比，HMKA和HQKA变体的较高结合亲和力和病毒中和能力提供了解释。
实施例11.hEV71 HMKA的体内效力
用hEV71 HMKA治疗导致感染EV71的小鼠的存活率为100％。
对于治疗研究，将7日龄的ICR小鼠组腹膜内接种5×105TCID50的EV71/MAV-W。然后在注射后的1天，通过腹膜内注射给予小鼠单剂量(10ug/g体重)的mAb(小鼠D5(n＝15)，hEV71 HMKA(EVM00；n＝15)或人IgG1同种型对照(n＝16))。每天监测所有小鼠的存活和临床体征，持续14天。临床评分分级如下：0，健康；1，流动性降低；2，四肢无力；3，瘫痪；4，死亡。如图19所示，接受对照抗体的小鼠最终发生严重疾病并死亡(死亡率为～67％)；相比之下，所有接受小鼠D5或人源化D5(hEV71 HMKA；EVM00)的小鼠存活且没有严重临床症状。这些结果表明，本发明的抗体完全保留了治疗能力并起到体内中和EV71病毒的作用，因此可用于本文所述的治疗和预防用途。
实施例12.hEV71 HMKA抗体抗体缓冲液探测
利用Malvern Zetasizer APS仪器，采用动态光散射法测量尺寸分布来对hEV71HMKA抗体进行缓冲液探测(buffer scouting)。所有测量均使用0.5mg/ml的抗体浓度。
通过在室温下进行三次单次测量，在下表2中所示的缓冲液中测量hEV71 HMKA抗体的流体动力学半径。在室温下，hEV71 HMKA抗体维持可溶于乙酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠和琥珀酸钠缓冲液中，其程度与PBS对照相当(表3)。未检测到凝结物。
在相同的缓冲液中进行升温以确定抗体开始凝聚的温度。每个温度进行一次测量，以2℃的增量从50℃至80℃。显示hEV71 HMKA抗体在PBS缓冲液中在约70℃凝聚，并且与10、25和50mM醋酸钠130mM NaCl pH 5.2缓冲液(图20)，在10、25和50mM磷酸钠135mM NaClpH 7.0缓冲液(图21)和10、25和50mM琥珀酸钠125mM NaCl pH 6.0缓冲液(图22)中具有70℃的相似凝聚温度。在10、25和50mM柠檬酸钠125mM NaCl pH 6.0缓冲液中，凝聚温度升高至约72℃(图23)。
这些结果表明乙酸钠、磷酸钠、琥珀酸钠和/或柠檬酸钠制剂可用于hEV71 HMKA抗体，并且柠檬酸钠缓冲液制剂增加hEV71 HMKA抗体的稳定性。
表2–缓冲溶液
缓冲液r
10mM乙酸钠,130mM NaCl pH 5.2
25mM乙酸钠,130mM NaCl pH 5.2
50mM乙酸钠,130mM NaCl pH 5.2
10mM柠檬酸钠,125mM NaCl pH 6.0
25mM柠檬酸钠,125mM NaCl pH 6.0
50mM柠檬酸钠,125mM NaCl pH 6.0
10mM琥珀酸钠,125mM NaCl pH 6.0
25mM琥珀酸钠,125mM NaCl pH 6.0
50mM琥珀酸钠,125mM NaCl pH 6.0
10mM磷酸钠,135mM NaCl pH 7.0
25mM磷酸钠,135mM NaCl pH 7.0
50mM磷酸钠,135mM NaCl pH 7.0
表3–抗体溶解度测定
(Z-平均值＝直径的强度加权平均流体动力学尺寸；IgG的预期直径约为10nm)
实施例13.hEV71 HMKA对EV71感染的幼猴的保护作用
通过气管滴注用1×106CCID50EV71感染1.5±0.5月龄的恒河猴组。在感染的同一天给予猴子单次静脉内剂量的hEV71 HMKA(“抗体治疗”，5mg/kg体重，n＝4)，对照人IgG1k抗体(“hIgG1K对照”，5mg/kg体重，n＝3)，或空溶剂对照(“模型对照”，0.9％w/v NaCl，n＝2)。感染后监测所有猴子14天。记录体温和血液病毒载量的变化。
在EV71病毒感染后，溶剂对照组显示体温显著增加和血液中病毒载量增加，与HFMD的临床表现一致。
溶剂处理组和对照抗体处理组的动物在感染后显示体温显著增加(图24，表4)。hEV71 HMKA处理组中的动物在感染后显示体温略微增加，但是增加的量小于其它两组。EV71感染后3至7天，huEV71 HMKA处理组的体温显著低于其它两组。
每组中，感染后血液病毒载量增加。在EV71感染后第4天至第5天，抗体治疗组的血液样品中的病毒载量显著低于其它两组的病毒载量(图25，表5)。
与对照组相比，观察到的抗体处理动物的体温和病毒载量降低表明huEV71HMKA在该体内模型中具有治疗EV71病毒感染的作用。
表4：感染后的体温.
与模型对照组相比，*p&lt;0.05，**p&lt;0.01，与对照抗体组相比，#p&lt;0.05，##p&lt;0.01。
表5：感染后动物血液中的血液病毒载量
与模型对照组相比，*p&lt;0.05，**p&lt;0.01；与对照抗体组比较，#p&lt;0.05，##p&lt;0.01。
序列表

Claims (23)

1.一种包含重链可变域和轻链可变域的抗体，其中
a)所述重链可变结构域(VH结构域)包含SEQ ID NO:1，具有以下8个取代中的至少6个：Y27X6；T28X2；F29X1；T30X4；R67X4；V68X1；R72X1和S98X2；任选地，具有最多四个额外的框架取代，其中每个X1残基独立地选自：A、I、L、M和V；每个X2残基独立地选自：N、C、Q、S和T；每个X4残基独立地选自：K、R和H；X6残基选自F或W；和
b)所述轻链可变域(VK结构域)包含SEQ ID NO:2；任选地具有最多四个框架取代。
2.如权利要求1所述的抗体，包含重链可变域和轻链可变域的抗体，其特征在于，
a)所述重链可变结构域(VH结构域)包含SEQ ID NO:1，具有以下8个取代中的至少6个：Y27F；T28N；F29I；T30K；R67K；S98N；V68A和R72A；任选地，具有最多四个额外的框架取代；和
b)所述轻链可变域(VK结构域)包含SEQ ID NO:2；任选地具有最多四个框架取代。
3.如权利要求1或2所述的抗体，包含一个、两个或三个选自下组的额外的重链结构域框架取代：S77X2、K23X2和R38X4，其中每个X2残基独立地选自N、C、Q、S或T，X4残基选自R、H或K。
4.如权利要求3所述的抗体，包含一个、两个或三个选自下组的额外的重链结构域框架取代：S77N、K23T和R38K。
5.以上权利要求中任一项所述的抗体，包含重链结构域框架取代S98N。
6.以上权利要求中任一项所述的抗体，其特征在于，所述轻链结构域包含选自下组的1/2或3个取代：I2X1、V3X1和Q50X4，其中每个X1残基独立地选自V、L、A、I或M；X4残基选自K、R或H。
7.如权利要求6所述的抗体，其特征在于，所述1、2或3个取代选自：I2V、V3L和Q50K。
8.以上权利要求中任一项所述的抗体，其特征在于，所述VH结构域包含包含SEQ IDNO:1，具有取代Y27F；T28N；F29I；T30K；R67K；V68A；R72A和S98N，连同一个、两个或三个选自下组的额外的框架取代：S77N、K23T和R38K。
9.如权利要求8所述的抗体，其特征在于，所述额外的框架取代是K23T和S77N。
10.以上权利要求中任一项所述的抗体，其特征在于，所述VH结构域包含HM(SEQ IDNO:3)、HN(SEQ ID NO:4)或HQ(SEQ ID NO:5)VH结构域。
11.以上权利要求中任一项所述的抗体，其特征在于，所述VK结构域包含SEQ ID NO:2。
12.一种抗体，包含SEQ ID NO:3所示VH结构域和SEQ ID NO:2所示VK结构域。
13.一种包含第一抗原结合位点和第二抗原结合位点的双特异性抗体，所述第一抗原结合位点包含权利要求1-12中任一项所述的重链和轻链可变域，所述第二抗原结合位点能够结合另一感染因子，所述其它感染因子任选是柯萨奇病毒A16(CA16)病毒。
14.一种药物组合物，包含以上权利要求中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载体。
15.如权利要求14所述的药物组合物，还包含结合另一感染因子的第二抗体，其中所述第二抗体任选是能够结合柯萨奇病毒A16(CA16)病毒的抗体。
16.一种核酸，编码权利要求1到13中任一项所述抗体。
17.一种载体，包含操作性连接于启动子的权利要求16所述的核酸。
18.一种宿主细胞，包含权利要求16所述的核酸或权利要求17所述的载体。
19.一种制备权利要求1到13中任一项所述抗体的方法，所述方法包括在宿主细胞培养物中表达权利要求17所述的载体以便产生所述抗体；和从所述细胞培养物中回收所述抗体。
20.一种治疗或预防HFMD的方法，所述方法通过给予需要治疗的个体有效量的权利要求1到13中任一项所述的抗体或权利要求14或15所述的药物组合物。
21.权利要求1到13中任一项所述的抗体或权利要求14或15所述的药物组合物，用于人或动物体的治疗方法。
22.如权利要求21所述使用的抗体或组合物，其特征在于，所述治疗是个体中HFMD的治疗性治疗或预防性治疗。
23.一种诊断试剂盒，用于检测体液样品中EV71抗原或EV71抗原的SP70肽表位的存在，其中所述试剂盒包含权利要求1到13中任一项所述的抗体。
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