BR112020021269A2

BR112020021269A2 - Construções de anticorpo anti-ror

Info

Publication number: BR112020021269A2
Application number: BR112020021269-5A
Authority: BR
Inventors: Lucas Bailey; Qufei Li; Malgorzata Agnieszka Nocula-Lugowska; Bryan Glaser
Original assignee: Exelixis, Inc.
Priority date: 2018-04-18
Filing date: 2019-04-18
Publication date: 2021-03-16
Also published as: EA202092202A1; MX2020010881A; EP3797122A1; PH12020551716A1; JP2023168551A; SG11202010235QA; CN112384533A; WO2019204564A1; CA3097704A1; WO2019204564A9; KR20200143470A; AU2019256431A1; JP2021522162A; IL278061A; EP3797122A4; US20210155692A1

Abstract

construções de anticorpo anti-ror. a presente invenção se refere a construções de anticorpo anti-ror, composições farmacêuticas que compreendem as construções e métodos de uso dos mesmos.

Description

CONSTRUÇÕES DE ANTICORPO ANTI-ROR

1. REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório Norte-Americano N o. 62/659,635 depositado em 18 de abril de 2018, cuja revelação está incorporada por referência na presente invenção em sua totalidade.

2. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] Este pedido incorpora, por referência, uma listagem de sequências submetida com este pedido como um arquivo de texto ASCII, intitulado 14529-001- 228_SEQ_LISTING.txt, criado em 15 de abril de 2019, com

336.627 bytes de tamanho.

3. HISTÓRICO

[0003] O design e o uso terapêutico de anticorpos multiespecíficos – proteínas derivadas de anticorpos projetadas para reconhecer múltiplos alvos – é uma área de pesquisa intensiva. Os anticorpos multiespecíficos oferecem a promessa de maior controle terapêutico do que é rotineiramente fornecido pelos anticorpos monoclonais monoespecíficos. Por exemplo, anticorpos multiespecíficos podem ser projetados para proporcionar maior especificidade ao alvo do que os anticorpos monoespecíficos, reduzindo os efeitos não direcionados associados a muitas terapias com anticorpos, particularmente com imunoterapias à base de anticorpos. Os anticorpos multiespecíficos também oferecem a promessa de estratégias terapêuticas que não são possíveis com os anticorpos monoespecíficos, como o direcionamento sinérgico dos receptores de múltiplas células, especialmente na imunoterapia. Uma dessas imunoterapias é o uso de anticorpos biespecíficos para recrutar e redirecionar as células T para alvejar e matar populações específicas de células tumorais através da ligação biespecífica de um marcador de células T e um marcador de células tumorais. Por exemplo, o alvejamento de um linfoma de célula B usando os anticorpos biespecíficos CD3xCD19, como o Cd3xCD19 BiTE blinatumomabe (Blincyto), é descrito na Publicação Norte- Americana No. 2006/0193852.

[0004] Há, portanto, a necessidade de anticorpos multiespecíficos aprimorados que se ligam especificamente a populações de células distintas, incluindo populações de células tumorais, com melhorias incluindo maior afinidade ou avidez, redução da ligação não direcionada e/ou reduzida ativação imunológica não intencional.

[0005] Vários tumores podem demonstrar a expressão na superfície celular dos antígenos do receptor transmembranar da proteína tirosina quinase (ROR), como descrito em mais detalhes em Gentile, et al. (Cancer Res; 71(8) 15 de abril de 2011), Rebagay, et al. (Front. Oncol., 18 de abril de 2012), Zhang, et al. (American Journal of Pathology, Vol. 181, No. 6, dezembro de 2012), Henry, et al. (Oncotarget, Vol. 6, No. 37 2015), Zhang, et al. (PLoS ONE 7(3): e31127.),e Bainbridge, et al. (PLoS ONE 9(7): e102695.), cada um aqui incorporado por referência em sua totalidade. Além disso, a expressão do ROR não pode ser efetuada, ou apenas demonstrar expressão limitada, no tecido normal, ou seja, não canceroso, como descrito em Balakrishnan et al. (Clin Cancer Res. 15 de junho de 2017; 23(12): 3061–

3071), aqui incorporado em sua totalidade. Assim, os antígenos do ROR podem ser usados como um marcador específico de tumor em certos tumores. Exemplos de tumores e cânceres com expressão de ROR demonstrada incluem, mas não se limitam a, câncer de pâncreas, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer gástrico, melanoma, sarcoma de Ewing, leucemia linfocítica crônica, linfoma de células do manto e B-ALL, como descrito em Gohil et al. (Oncoimmunology. 2017; 6(7): e1326437.), aqui incorporados em suas totalidades. Outros cânceres incluem, mas não se limitam, ao câncer hematológico, câncer de próstata, câncer de cólon, câncer renal e câncer de útero. O uso de anticorpos multiespecíficos para o ROR, formatados em várias plataformas de anticorpos, para atingir tumores, é descrito em Gohil, et al., no pedido internacional WO 2017/053469, no pedido internacional WO 2014/167022, na Publicação US No. 2017/0198045, no pedido internacional WO 2016/094873, no pedido internacional WO 2017/127499 e no pedido internacional WO 2016/142768, sendo cada um deles aqui incorporado por referência, em suas totalidades.

[0006] Desse modo, as moléculas de ligação ao antígeno do ROR têm potencial terapêutico no tratamento do câncer. Moléculas de ligação ao ROR multiespecíficas que se ligam aos antígenos na superfície de células T, além de um antígeno do ROR, têm potencial para causar a morte redirecionada de células T das células cancerosas que expressam ROR.

[0007] Há, portanto, uma necessidade de moléculas de ligação ao antígeno do ROR, incluindo moléculas de ligação ao antígeno do ROR multiespecíficas. Há também a necessidade de moléculas de ligação de antígeno do ROR que têm melhorias, incluindo maior afinidade ou avidez, ligação não direcionada reduzida e/ou ativação imunológica não intencional. Há uma necessidade particular por uma molécula de ligação ao antígeno do ROR multiespecífica que tenha capacidade de fabricação aprimorada e seja facilmente purificada.

4. SUMÁRIO

[0008] Em um primeiro aspecto, são fornecidas moléculas de ligação ao antígeno. Em todas as modalidades, a molécula de ligação ao antígeno inclui pelo menos um sítio de ligação ao antígeno específico para um antígeno do ROR; desse modo, as moléculas de ligação ao antígeno são chamadas de moléculas de ligação ao antígeno do ROR.

[0009] São descritas na presente invenção moléculas de ligação ao antígeno do receptor transmembranar da proteína tirosina quinase (ROR) que compreendem: A) sequências de aminoácidos de uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de uma região variável da cadeia leve (VL) de um sítio de ligação ao antígeno do ROR, em que as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VL são selecionadas da tabela 6; e B) compreende sequências de aminoácidos de uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de uma região variável da cadeia pesada (VH) do sítio de ligação ao antígeno do ROR, em que as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da VH são selecionadas da tabela 6, em que o sítio de ligação ao antígeno do ROR é um primeiro sítio de ligação ao antígeno e é específico para (i) ROR1 e ROR2, (ii) ROR1 ou (iii) ROR2. Em certos aspectos, a molécula de ligação ao antígeno do ROR compreende adicionalmente um segundo sítio de ligação ao antígeno. Em certos aspectos, o segundo sítio de ligação ao antígeno é o mesmo que o primeiro sítio de ligação ao antígeno. Em certos aspectos, o segundo sítio de ligação ao antígeno é específico para um segundo antígeno diferente do antígeno do ROR do primeiro sítio de ligação ao antígeno. Em certos aspectos, o segundo antígeno é um antígeno CD3.

[0010] São descritas na presente invenção moléculas de ligação ao antígeno do receptor transmembranar da proteína tirosina quinase (ROR) que compreendem: uma primeira e uma segunda cadeia polipeptídica, em que: (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende um domínio A, um domínio B, um domínio D e um domínio E, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação A-B-D-E, e em que o domínio A tem uma sequência de aminoácidos da VL, o domínio B tem uma sequência de aminoácidos de CH3, o domínio D tem uma sequência de aminoácidos de CH2, o domínio E tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; (b) a segunda cadeia polipeptídica compreende um domínio F e um domínio G, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação F-G, e em que o domínio F tem uma sequência de aminoácidos da VH e o domínio G tem uma sequência de aminoácidos de CH3; e (c) o primeiro e o segundo polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios A e F e uma interação entre os domínios B e G para formar a molécula de ligação ao antígeno do ROR, em que a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um antígeno do ROR.

[0011] Em certos aspectos, o antígeno do ROR é ROR1. Em certos aspectos, o antígeno do ROR é ROR2. Em certos aspectos, o antígeno do ROR é ROR1 e ROR2. Em certos aspectos, o antígeno do ROR é um domínio selecionado do grupo que consiste em: um domínio ROR1 Frizzle, um domínio ROR2 Frizzle, um domínio tipo Ig ROR1, um domínio tipo Ig ROR2, um domínio ROR1 Kringle e um domínio ROR2 Kringle. Em certos aspectos, o antígeno do ROR compreende um antígeno do ROR humano.

[0012] Em certos aspectos, o domínio A compreende sequências de aminoácidos de uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de uma região variável da cadeia leve (VL) específica de um sítio de ligação ao antígeno do ROR, em que as sequências da CDR1, CDR2 e CDR3 da VL são selecionadas da tabela 6, e o domínio F compreende sequências de aminoácidos de uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de uma região variável da cadeia pesada (VH) específica do sítio de ligação ao antígeno do ROR, em que as sequências da CDR1, CDR2 e CDR3 da VH são selecionadas da tabela 6. Em certos aspectos, o sítio de ligação ao antígeno do ROR específico é I2A-10, I2A-10 D54E Y55Q ou I2A-27 da tabela 6.

[0013] Em certos aspectos, o domínio A compreende uma VL com uma ou duas mutações de aminoácidos em comparação com uma sequência da VL do anticorpo na tabela 6, em que as uma ou duas mutações de aminoácidos estão em uma ou mais regiões da CDR na VL. Em certos aspectos, o domínio F compreende uma VH com uma ou duas mutações de aminoácidos em comparação com uma sequência da VH do anticorpo na tabela 6, em que as uma ou duas mutações de aminoácidos estão em uma ou mais regiões da CDR na VH. Em certos aspectos, o domínio A compreende uma VL com a sequência da VL de I2A-10 com uma ou mais mutações em uma ou mais regiões da CDR. Em certos aspectos, o domínio A compreende uma VL com a sequência da VL de I2A-27 com uma ou mais mutações em uma ou mais regiões da CDR. Em certos aspectos, o domínio F compreende uma VL com a sequência da VL de I2A-10 com uma ou mais mutações em uma ou mais regiões da CDR. Em certos aspectos, o domínio F compreende uma VL com a sequência da VL de I2A-27 com uma ou mais mutações em uma ou mais regiões da CDR.

[0014] Em certos aspectos, as sequências de aminoácidos do domínio B e do domínio G são idênticas, em que a sequência é uma sequência CH3 endógena.

[0015] Em certos aspectos, as sequências de aminoácidos do domínio B e do domínio G são diferentes e compreendem separadamente, e respectivamente, modificações ortogonais em uma sequência CH3 endógena, em que o domínio B interage com o domínio G, e em que nem o domínio B e nem o domínio G interagem significativamente com um domínio CH3 que não tem a modificação ortogonal.

[0016] Em certos aspectos, as modificações ortogonais do domínio B e do domínio G compreendem mutações que geram pontes de dissulfeto modificadas entre o domínio B e o domínio G. Em certos aspectos, as mutações do domínio B e do domínio G que geram pontes dissulfeto modificadas são uma mutação S354C em um dentre o domínio B e o domínio G, e um 349C no outro domínio.

[0017] Em certos aspectos, as modificações ortogonais do domínio B e do domínio G compreendem mutações knob-in-hole. Em certos aspectos, as mutações knob-in-hole são uma mutação T366W em um do domínio B e do domínio G, e uma mutação T366S, L368A e aY407V no outro domínio.

[0018] Em certos aspectos, as modificações ortogonais do domínio B e do domínio G compreendem mutações de par de carga. Em certos aspectos, as mutações de par de carga são uma mutação T366K em um do domínio B ou do domínio G, e uma mutação L351D no outro domínio.

[0019] Em certos aspectos, o domínio E tem uma sequência de aminoácidos CH3.

[0020] Em certos aspectos, as sequências de aminoácidos do domínio E e do domínio K são idênticas, em que a sequência é uma sequência CH3 endógena.

[0021] Em certos aspectos, as sequências de aminoácidos do domínio E e do domínio K são diferentes. Em certos aspectos, as sequências diferentes compreendem separadamente, e respectivamente, modificações ortogonais em uma sequência CH3 endógena, em que o domínio E interage com o domínio K, e em que nem o domínio E e nem o domínio K interage significativamente com um domínio CH3 que não tem a modificação ortogonal.

[0022] Em certos aspectos, as modificações ortogonais compreendem mutações que geram pontes dissulfeto modificadas entre o domínio E e o domínio K. Em certos aspectos, as mutações que geram as pontes dissulfeto modificadas são uma mutação S354C em um dentre o domínio E e o domínio K, e uma 349C no outro domínio.

[0023] Em certos aspectos, as modificações ortogonais no domínio E e no domínio K compreendem mutações knob-in-hole. Em certos aspectos, as mutações knob-in-hole são uma mutação T366W em um do domínio E ou do domínio K e uma mutação T366S, L368A e aY407V no outro domínio.

[0024] Em certos aspectos, as modificações ortogonais no domínio E e no domínio K compreendem mutações de par de carga. Em certos aspectos, as mutações de par de carga são uma mutação T366K em um do domínio E ou do domínio K, e uma mutação L351D correspondente no outro domínio.

[0025] Em certos aspectos, as sequências de aminoácidos do domínio E e do domínio K são sequências endógenas de dois domínios de anticorpo diferentes, os quais são selecionados para ter uma interação específica que promove a associação específica entre o primeiro e o terceiro polipeptídeos. Em certos aspectos, as duas sequências de aminoácidos diferentes são uma sequência CH1 e uma sequência CL.

[0026] Em certos aspectos, a sequência que forma a junção entre o domínio A e o domínio B é IKRTPREP ou IKRTVREP.

[0027] Em certos aspectos, a sequência que forma a junção entre o domínio F e o domínio G é SSASPREP.

[0028] Em certos aspectos, a pelo menos uma sequência de aminoácidos CH3 tem uma inserção de tripeptídeo no terminal C conectando a sequência de aminoácidos CH3 a uma sequência de aminoácidos da dobradiça, em que a inserção de tripeptídeo é selecionada do grupo consistindo em PGK, KSC e GEC.

[0029] Em certos aspectos, as sequências são sequências humanas.

[0030] Em certos aspectos, pelo menos uma sequência de aminoácidos CH3 é uma sequência de IgG. Em certos aspectos, as sequências de IgG são sequências da IgG1.

[0031] Em certos aspectos, pelo menos uma sequência de aminoácidos CH3 tem uma ou mais mutações de isoalotipo. Em certos aspectos, as mutações de isoalotipo são D356E e L358M.

[0032] Em certos aspectos, a sequência de aminoácidos CL é uma sequência C-kappa.

[0033] Em certos aspectos, as sequências CH2 têm uma ou mais mutações modificadas que reduzem a função Fc efetora. Em certos aspectos, uma ou mais mutações manipuladas estão na posição L234, L235 e P329. Em certos aspectos, uma ou mais mutações manipuladas são L234A, L235A e P329G. Em certos aspectos, a uma ou mais mutações manipuladas são L234A, L235A e P329K.

[0034] Também são descritas na presente invenção moléculas de ligação ao antígeno do receptor transmembranar da proteína tirosina quinase (ROR) que compreendem: uma primeira, segunda, terceira e quarta cadeia polipeptídica, em que (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende um domínio A, um domínio B, um domínio D e um domínio E, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação A-B-D-E, e o domínio A tem uma sequência de aminoácidos da VL, o domínio B tem uma sequência de aminoácidos CH3, o domínio D tem uma sequência de aminoácidos CH2, e o domínio E tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; (b) a segunda cadeia polipeptídica compreende um domínio F e um domínio G, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação F-G, e em que o domínio F tem uma sequência de aminoácidos da VH e o domínio G tem uma sequência de aminoácidos CH3; (c) a terceira cadeia polipeptídica compreende um domínio H, um domínio I, um domínio J e um domínio K, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação H-I-J-K, e em que o domínio H tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável, o domínio I tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante, o domínio J tem uma sequência de aminoácidos CH2, e K tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; (d) a quarta cadeia polipeptídica compreende um domínio L e um domínio M, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação L-M, e em que o domínio L tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável e o domínio M tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; (e) o primeiro e o segundo polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios A e F, e uma interação entre os domínios B e G; (f) o terceiro e o quarto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios H e L e uma interação entre os domínios I e M; e (g) o primeiro e o terceiro polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios D e J e uma interação entre os domínios E e K para formar a molécula de ligação ao antígeno do ROR, em que a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno, e em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno, o segundo sítio de ligação ao antígeno ou o primeiro e o segundo sítios de ligação ao antígeno são específicos para um antígeno do ROR.

[0035] Em certos aspectos, o primeiro sítio de ligação ao antígeno é específico para o antígeno do ROR. Em certos aspectos, o segundo sítio de ligação ao antígeno é específico para o antígeno do ROR. Em certos aspectos, o primeiro e o segundo sítios de ligação ao antígeno são específicos para o antígeno do ROR.

[0036] Em certos aspectos, o antígeno do ROR é ROR1. Em certos aspectos, o antígeno do ROR é ROR2. Em certos aspectos, o antígeno do ROR é ROR1 e ROR2. Em certos aspectos, o antígeno do ROR é um domínio selecionado do grupo que consiste em: um domínio ROR1 Frizzle, um domínio ROR2 Frizzle, um domínio tipo Ig ROR1, um domínio tipo Ig ROR2, um domínio ROR1 Kringle e um domínio ROR2 Kringle. Em certos aspectos, o antígeno do ROR compreende um antígeno do ROR humano.

[0037] Em certos aspectos, o domínio A compreende sequências de aminoácidos de uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de uma região variável da cadeia leve (VL) específica de um sítio de ligação ao antígeno do ROR, em que as sequências da CDR1, CDR2 e CDR3 da VL são selecionadas da tabela 6, e o domínio F compreende sequências de aminoácidos de uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de uma região variável da cadeia pesada (VH) específica do sítio de ligação ao antígeno do ROR, em que as sequências da CDR1, CDR2 e CDR3 da VH são selecionadas da tabela 6. Em certos aspectos, o sítio de ligação ao antígeno do ROR específico é I2A-10, I2A-10 D54E Y55Q ou I2A-27 da tabela 6.

[0038] Em certos aspectos, o domínio A compreende uma VL com uma ou duas mutações de aminoácidos em comparação com uma sequência da VL do anticorpo na tabela 6, em que as uma ou duas mutações de aminoácidos estão em uma ou mais regiões da CDR na VL. Em certos aspectos, o domínio F compreende uma VH com uma ou duas mutações de aminoácidos em comparação com uma sequência da VH do anticorpo na tabela 6, em que as uma ou duas mutações de aminoácidos estão em uma ou mais regiões da CDR na VH. Em certos aspectos, o domínio A compreende uma VL com a sequência da VL de I2A-10 com uma ou mais mutações em uma ou mais regiões da CDR. Em certos aspectos, o domínio A compreende uma VL com a sequência da VL de I2A-27 com uma ou mais mutações em uma ou mais regiões da CDR. Em certos aspectos, o domínio F compreende uma VL com a sequência da VL de I2A-10 com uma ou mais mutações em uma ou mais regiões da CDR. Em certos aspectos, o domínio F compreende uma VL com a sequência da VL de I2A-27 com uma ou mais mutações em uma ou mais regiões da CDR.

[0039] Em certos aspectos, o segundo sítio de ligação ao antígeno compreende: A) na terceira cadeia polipeptídica, uma sequência de aminoácidos específica da região variável da cadeia leve (VL) selecionada do grupo que consiste na: SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 73; e B) na quarta cadeia polipeptídica, uma sequência de aminoácidos específica da região variável da cadeia pesada (VH) selecionada a partir do grupo consistindo na: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72.

[0040] Em certos aspectos, o segundo sítio de ligação ao antígeno compreende: A) na quarta cadeia polipeptídica, uma sequência de aminoácidos específica da região variável da cadeia leve (VL) selecionada do grupo que consiste na: SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 73; e B) na terceira cadeia polipeptídica, uma sequência de aminoácidos específica da região variável da cadeia pesada (VH) selecionada a partir do grupo consistindo na: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72.

[0041] Em certos aspectos, as sequências de aminoácidos do domínio B e do domínio G são idênticas, em que a sequência é uma sequência CH3 endógena.

[0042] Em certos aspectos, as sequências de aminoácidos do domínio B e do domínio G são diferentes e compreendem separadamente, e respectivamente, modificações ortogonais em uma sequência CH3 endógena, em que o domínio B interage com o domínio G, e em que nem o domínio B e nem o domínio G interagem significativamente com um domínio CH3 que não tem a modificação ortogonal.

[0043] Em certos aspectos, as modificações ortogonais do domínio B e do domínio G compreendem mutações que geram pontes de dissulfeto modificadas entre o domínio B e o domínio G. Em certos aspectos, as mutações do domínio B e do domínio G que geram pontes dissulfeto modificadas são uma mutação S354C em um dentre o domínio B e o domínio G, e um 349C no outro domínio.

[0044] Em certos aspectos, as modificações ortogonais do domínio B e do domínio G compreendem mutações knob-in-hole. Em certos aspectos, as mutações knob-in-hole são uma mutação T366W em um do domínio B e do domínio G, e uma mutação T366S, L368A e aY407V no outro domínio.

[0045] Em certos aspectos, as modificações ortogonais do domínio B e do domínio G compreendem mutações de par de carga. Em certos aspectos, as mutações de par de carga são uma mutação T366K em um do domínio B ou do domínio G, e uma mutação L351D no outro domínio.

[0046] Em certos aspectos, o domínio E tem uma sequência de aminoácidos CH3.

[0047] Em certos aspectos, as sequências de aminoácidos do domínio E e do domínio K são idênticas, em que a sequência é uma sequência CH3 endógena.

[0048] Em certos aspectos, as sequências de aminoácidos do domínio E e do domínio K são diferentes. Em certos aspectos, as sequências diferentes compreendem separadamente, e respectivamente, modificações ortogonais em uma sequência CH3 endógena, em que o domínio E interage com o domínio K, e em que nem o domínio E e nem o domínio K interage significativamente com um domínio CH3 que não tem a modificação ortogonal.

[0049] Em certos aspectos, as modificações ortogonais compreendem mutações que geram pontes dissulfeto modificadas entre o domínio E e o domínio K. Em certos aspectos, as mutações que geram as pontes dissulfeto modificadas são uma mutação S354C em um dentre o domínio E e o domínio K, e uma 349C no outro domínio.

[0050] Em certos aspectos, as modificações ortogonais no domínio E e no domínio K compreendem mutações knob-in-hole. Em certos aspectos, as mutações knob-in-hole são uma mutação T366W em um do domínio E ou do domínio K e uma mutação T366S, L368A e aY407V no outro domínio.

[0051] Em certos aspectos, as modificações ortogonais no domínio E e no domínio K compreendem mutações de par de carga. Em certos aspectos, as mutações de par de carga são uma mutação T366K em um do domínio E ou do domínio K, e uma mutação L351D correspondente no outro domínio.

[0052] Em certos aspectos, as sequências de aminoácidos do domínio E e do domínio K são sequências endógenas de dois domínios de anticorpo diferentes, os quais são selecionados para ter uma interação específica que promove a associação específica entre o primeiro e o terceiro polipeptídeos. Em certos aspectos, as duas sequências de aminoácidos diferentes são uma sequência CH1 e uma sequência CL.

[0053] Em certos aspectos, o domínio I tem uma sequência CL e o domínio M tem uma sequência CH1.

[0054] Em certos aspectos, o domínio H tem uma sequência VL e o domínio L tem uma sequência VH.

[0055] Em certos aspectos, o domínio H tem uma sequência de aminoácidos VL; o domínio I tem uma sequência de aminoácidos CL; domínio K tem uma sequência de aminoácidos CH3; o domínio L tem uma sequência de aminoácidos VH; e o domínio M tem uma sequência de aminoácidos CH1.

[0056] Em certos aspectos, a molécula de ligação ao antígeno do ROR compreende, ainda: uma quinta cadeia polipeptídica, em que: (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende ainda um domínio N e um domínio O, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação N-O-A-B-D-E, e em que o domínio N tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável, o domínio O tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; (b) a molécula de ligação ao antígeno do ROR compreende, adicionalmente, uma quinta cadeia polipeptídica, compreendendo: um domínio P e um domínio Q, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação P-Q, e em que o domínio P tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável e o domínio Q tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; e (c) o primeiro e o quinto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios N e P e uma interação entre os domínios O e Q para formar a molécula de ligação ao antígeno do ROR.

[0057] Em certos aspectos, (a) as sequências de aminoácidos do domínio N e do domínio A são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio H é diferente da sequência do domínio N e do domínio A, as sequências de aminoácidos do domínio O e do domínio B são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio I é diferente das sequências do domínio O e do domínio B, as sequências de aminoácidos do domínio P e do domínio F são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio L é diferente das sequências do domínio P e do domínio F, as sequências de aminoácidos do domínio Q e do domínio G são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio M é diferente das sequências do domínio Q e do domínio G; e (b) em que a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio N e o domínio P forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno. Em certos aspectos, o primeiro antígeno é o antígeno do ROR. Em certos aspectos, o segundo antígeno é um antígeno CD3.

[0058] Em certos aspectos, (a) as sequências de aminoácidos do domínio N, do domínio A e do domínio H são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio O, do domínio B e do domínio I são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio P, do domínio F e do domínio L são diferentes, e as sequências de aminoácidos do domínio Q, do domínio G e do domínio M são diferentes; (b) a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e o domínio N e o domínio P formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para um terceiro antígeno, e (c) o primeiro, o segundo ou o terceiro antígeno é o antígeno do ROR.

[0059] Em certos aspectos, a molécula de ligação ao antígeno do ROR compreende, adicionalmente: uma sexta cadeia polipeptídica, em que: (a) a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda um domínio R e um domínio S, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação R-S-H-I-J-K, e em que o domínio R tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável e o domínio S tem uma sequência de aminoácidos de domínio constante; (b) a molécula de ligação ao antígeno do ROR compreende, adicionalmente, uma sexta cadeia polipeptídica, que compreende: um domínio T e um domínio U, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação T-U, e em que o domínio T tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável e o domínio U tem uma sequência de aminoácidos de domínio constante. E (c) o terceiro e o sexto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios R e T e uma interação entre os domínios S e U para formar a molécula de ligação ao antígeno do ROR.

[0060] Em certos aspectos, (a) as sequências de aminoácidos do domínio R e do domínio A são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio H é diferente da sequência do domínio R e do domínio A, as sequências de aminoácidos do domínio S e do domínio B são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio I é diferente das sequências do domínio S e do domínio B, as sequências de aminoácidos do domínio T e do domínio F são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio L é diferente das sequências do domínio T e do domínio F, as sequências de aminoácidos do domínio U e do domínio G são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio M é diferente das sequências do domínio U e do domínio G; e (b) a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno. Em certos aspectos, o primeiro antígeno é o antígeno do ROR. Em certos aspectos, o segundo antígeno é um antígeno CD3.

[0061] Em certos aspectos, (a) as sequências de aminoácidos do domínio R e do domínio H são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio A é diferente da sequência do domínio R e do domínio H, as sequências de aminoácidos do domínio S e do domínio I são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio B é diferente das sequências do domínio S e do domínio I, as sequências de aminoácidos do domínio T e do domínio L são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio F é diferente das sequências do domínio T e do domínio L, as sequências de aminoácidos do domínio U e do domínio M são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio G é diferente das sequências do domínio U e do domínio M; e (b) a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o segundo antígeno. Em certos aspectos, o segundo sítio de ligação ao antígeno é específico para o antígeno do ROR. Em certos aspectos, o primeiro antígeno é um antígeno CD3.

[0062] Em certos aspectos, (a) as sequências de aminoácidos do domínio R, do domínio A e do domínio H são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio S, do domínio B e do domínio I são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio T, do domínio F e do domínio L são diferentes, e as sequências de aminoácidos do domínio U, do domínio G e do domínio M são diferentes; (b) a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para um terceiro antígeno, e (c) o primeiro, o segundo ou o terceiro antígeno é o antígeno do ROR.

[0063] Em certos aspectos, a molécula de ligação ao antígeno do ROR compreende, adicionalmente: uma quinta e uma sexta cadeia polipeptídica, em que: (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende, adicionalmente, um domínio N e um domínio O, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação N-O-A-B-D-E; (b) a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda um domínio R e um domínio S, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação R-S-H-I-J-K; (c) a molécula de ligação ao antígeno do ROR compreende, ainda, uma quinta e uma sexta cadeia polipeptídica, em que: a quinta cadeia polipeptídica compreende um domínio P e um domínio Q, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação P-Q, e a sexta cadeia polipeptídica compreende um domínio T e um domínio U, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação T-U; e (d) o primeiro e o quinto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios N e P e uma interação entre os domínios O e Q, e o terceiro e o sexto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios R e T e uma interação entre os domínios S e U para formar a molécula de ligação ao antígeno do ROR.

[0064] Em certos aspectos, (a) as sequências de aminoácidos do domínio N e do domínio A são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio H e do domínio R são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio O e do domínio B são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio I e do domínio S são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio P e do domínio F são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio L e do domínio T são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio Q e do domínio G são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio M e domínio U são idênticas; e (b) em que a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro site de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, o domínio N e o domínio P formam um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um quarto sítio de ligação ao antígeno específico para o segundo antígeno.

[0065] Em certos aspectos, (a) as sequências de aminoácidos do domínio H e do domínio A são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio N e do domínio R são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio I e do domínio B são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio O e do domínio S são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio L e do domínio F são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio P e do domínio T são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio M e do domínio G são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio Q e do domínio U são idênticas; e (b) em que a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, o domínio N e o domínio P formam um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um quarto sítio de ligação ao antígeno específico para o segundo antígeno.

[0066] Em certos aspectos, a sequência que forma a junção entre o domínio A e o domínio B é IKRTPREP ou IKRTVREP.

[0067] Em certos aspectos, a sequência que forma a junção entre o domínio F e o domínio G é SSASPREP.

[0068] Em certos aspectos, pelo menos uma sequência de aminoácidos CH3 tem uma inserção de tripeptídeo no terminal C conectando a sequência de aminoácidos CH3 a uma sequência de aminoácidos da dobradiça, em que a inserção de tripeptídeo é selecionada do grupo consistindo em PGK, KSC e GEC.

[0069] Em certos aspectos, as sequências são sequências humanas.

[0070] Em certos aspectos, pelo menos uma sequência de aminoácidos CH3 é uma sequência de IgG. Em certos aspectos, as sequências de IgG são sequências da IgG1.

[0071] Em certos aspectos, pelo menos uma sequência de aminoácidos CH3 tem uma ou mais mutações de isoalotipo. Em certos aspectos, as mutações de isoalotipo são D356E e L358M.

[0072] Em certos aspectos, a sequência de aminoácidos CL é uma sequência C-kappa.

[0073] Em certos aspectos, as sequências CH2 têm uma ou mais mutações modificadas que reduzem a função Fc efetora. Em certos aspectos, uma ou mais mutações manipuladas estão na posição L234, L235 e P329. Em certos aspectos, uma ou mais mutações manipuladas são L234A, L235A e P329G. Em certos aspectos, a uma ou mais mutações manipuladas são L234A, L235A e P329K.

[0074] Também são descritas na presente invenção moléculas de ligação ao antígeno do receptor transmembranar da proteína tirosina quinase (ROR) que compreendem: um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um antígeno do ROR, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende: A) sequências de aminoácidos de uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de uma região variável da cadeia leve (VL) de um sítio de ligação ao antígeno do ROR específico, em que as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VL são selecionadas da tabela 6; e B) compreende sequências de aminoácidos de uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de uma região variável da cadeia pesada (VH) do sítio de ligação ao antígeno do ROR, em que as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da VH são selecionadas da tabela 6.

[0075] Em certos aspectos, o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende uma VL com uma ou duas mutações de aminoácidos em comparação com uma sequência VL do anticorpo na tabela 6, em que as uma ou duas mutações de aminoácidos estão em uma ou mais regiões da CDR na VL. Em certos aspectos, o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende uma VH com uma ou duas mutações de aminoácidos em comparação com uma sequência VH do anticorpo na tabela 6, em que as uma ou duas mutações de aminoácidos estão em uma ou mais regiões da CDR na VH.

[0076] Em certos aspectos, o primeiro sítio de ligação ao antígeno é específico para o ROR1. Em certos aspectos, o primeiro sítio de ligação ao antígeno é específico para o ROR2. Em certos aspectos, o primeiro sítio de ligação ao antígeno é específico para o ROR1 e o ROR2. Em certos aspectos, o antígeno do ROR é um domínio selecionado do grupo que consiste em: um domínio ROR1 Frizzle, um domínio ROR2 Frizzle, um domínio tipo Ig ROR1, um domínio tipo Ig ROR2, um domínio ROR1 Kringle e um domínio ROR2 Kringle. Em certos aspectos, o antígeno do ROR compreende um antígeno do ROR humano.

[0077] Em certos aspectos, a molécula de ligação ao antígeno do ROR compreende adicionalmente um segundo sítio de ligação ao antígeno. Em certos aspectos, o segundo sítio de ligação ao antígeno é específico para o antígeno do ROR. Em certos aspectos, o segundo sítio de ligação ao antígeno é específico para um segundo antígeno diferente do antígeno do ROR. Em certos aspectos, o segundo antígeno é um antígeno CD3. Em certos aspectos, o sítio de ligação ao antígeno é específico para um epítopo do antígeno CD3. Em certos aspectos, o segundo sítio de ligação ao antígeno compreende: A) uma sequência de aminoácidos específica da região variável da cadeia leve (VL) selecionada do grupo que consiste na: SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 73; e B) uma sequência de aminoácidos específica da região variável da cadeia pesada (VH) selecionada a partir do grupo consistindo na: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72. Em certos aspectos, o segundo sítio de ligação ao antígeno compreende: A) uma sequência de aminoácidos específica da região variável da cadeia leve (VL) selecionada do grupo que consiste na: SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 73; e B) uma sequência de aminoácidos específica da região variável da cadeia pesada (VH) selecionada a partir do grupo consistindo na: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72.

[0078] Em certos aspectos, a molécula de ligação ao antígeno do ROR compreende um formato de anticorpo selecionado do grupo consistindo em: anticorpos completos, fragmentos Fab, Fvs, scFvs, scFvs em tandem, diacorpos, sc- diacorpos, DARTs, tandAbs e minicorpos. Em certos aspectos, a molécula de ligação ao antígeno do ROR compreende: uma primeira e uma segunda cadeia polipeptídica, em que (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende um domínio A, um domínio B, um domínio D e um domínio E, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação A-B-D-E, em que o domínio A tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável, e em que o domínio B, domínio D e domínio E têm uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; (b) a segunda cadeia polipeptídica compreende um domínio F e um domínio G, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação F-G, e em que o domínio F tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável e o domínio G tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante, c) o primeiro e o segundo polipeptídeos estão associados através de uma interação entre o domínio A e o domínio F e uma interação entre o domínio B e o domínio G para formar a molécula de ligação ao antígeno do ROR, e em que a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno.

[0079] Em certos aspectos, a molécula de ligação ao antígeno do ROR compreende, adicionalmente: uma terceira e uma quarta cadeia polipeptídica, em que (a) a terceira cadeia polipeptídica compreende um domínio H, um domínio I, um domínio J e um domínio K, em que os domínios estão dispostos, do terminal N para o terminal C, em uma orientação H-I-J-K, e em que o domínio H tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável e os domínios I, J e K têm uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; (b) a quarta cadeia polipeptídica compreende um domínio L e um domínio M, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação L-M, e em que o domínio L tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável e o domínio M tem uma sequência de aminoácidos da região constante; (c) o terceiro e o quarto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios H e L e uma interação entre os domínios I e M; e (d) o primeiro e o terceiro polipeptídeos estão associados através de uma interação entre o domínio D e o domínio J e uma interação entre o domínio E e o domínio K para formar a molécula de ligação ao antígeno do ROR, e em que a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno. Em certos aspectos, o primeiro sítio de ligação ao antígeno é específico para o antígeno do ROR. Em certos aspectos, o segundo sítio de ligação ao antígeno é específico para CD3.

[0080] Em certos aspectos, o domínio B e o domínio G têm uma sequência de aminoácidos CH3.

[0081] Em certos aspectos, as sequências de aminoácidos do domínio B e do domínio G são idênticas, em que a sequência é uma sequência CH3 endógena.

[0082] Em certos aspectos, as sequências de aminoácidos do domínio B e do domínio G são diferentes e compreendem separadamente, e respectivamente, modificações ortogonais em uma sequência CH3 endógena, em que o domínio B interage com o domínio G, e em que nem o domínio B e nem o domínio G interagem significativamente com um domínio CH3 que não tem a modificação ortogonal.

[0083] Em certos aspectos, as modificações ortogonais do domínio B e do domínio G compreendem mutações que geram pontes dissulfeto modificadas entre o domínio B e o domínio G. Em certos aspectos, as mutações do domínio B e do domínio G que geram pontes dissulfeto modificadas são uma mutação S354C em um dentre o domínio B e o domínio G, e um 349C no outro domínio.

[0084] Em certos aspectos, as modificações ortogonais do domínio B e do domínio G compreendem mutações knob-in-hole. Em certos aspectos, as mutações knob-in-hole do domínio B e do domínio G são uma mutação T366W em um do domínio B e do domínio G, e uma mutação T366S, L368A e aY407V no outro domínio.

[0085] Em certos aspectos, as modificações ortogonais do domínio B e do domínio G compreendem mutações de par de carga. Em certos aspectos, as mutações de par de carga do domínio B e do domínio G são uma mutação T366K em um dos domínios B ou G, e uma mutação L351D no outro domínio.

[0086] Em certos aspectos, o domínio B e o domínio G têm uma sequência de aminoácidos CH2 da IgM ou uma sequência de aminoácidos CH2 da IgE. Em certos aspectos, a sequência de aminoácidos CH2 da IgM ou a sequência de aminoácidos CH2 da IgE compreendem modificações ortogonais.

[0087] Em certos aspectos, o domínio I tem uma sequência CL e o domínio M tem uma sequência CH1. Em certos aspectos, o domínio I tem uma sequência CH1 e o domínio M tem uma sequência CL. Em certos aspectos, cada uma da sequência CH1 e da sequência CL compreendem uma ou mais modificações ortogonais, em que um domínio que tem a sequência CH1 não interage significativamente com um domínio que tem uma sequência CL sem a modificação ortogonal.

[0088] Em certos aspectos, as modificações ortogonais compreendem mutações que geram pontes dissulfeto modificadas entre o pelo menos um domínio CH1 e um domínio CL, sendo as mutações selecionadas do grupo que consiste em: uma cisteína modificada na posição 138 da sequência CH1 e na posição 116 da sequência CL; uma cisteína modificada na posição 128 da sequência CH1 e na posição 119 da sequência CL, e uma cisteína modificada na posição 129 da sequência CH1 e na posição 210 da sequência CL.

[0089] Em certos aspectos, as modificações ortogonais compreendem mutações que geram pontes dissulfeto modificadas entre pelo menos um domínio CH1 e um domínio CL, em que as mutações compreendem cisteínas modificadas na posição 128 da sequência CH1 e na posição 118 de uma sequência CL kappa.

[0090] Em certos aspectos, as modificações ortogonais compreendem mutações que geram pontes dissulfeto modificadas entre o pelo menos um domínio CH1 e um domínio CL, as mutações selecionadas do grupo que consiste em: uma mutação F118C na sequência CL com um A141C correspondente na sequência CH1; uma mutação F118C na sequência CL com um L128C correspondente na sequência CH1; e mutações S162C na sequência CL com uma mutação P171C correspondente na sequência CH1.

[0091] Em certos aspectos, as modificações ortogonais compreendem mutações de par de carga entre o pelo menos um domínio CH1 e um domínio CL, sendo as mutações de par de carga selecionadas do grupo que consiste em: uma mutação F118S na sequência CL com um A141L correspondente na sequência CH1; uma mutação F118A na sequência CL com um A141L correspondente na sequência CH1; uma mutação F118V na sequência CL com um A141L correspondente na sequência CH1; e uma mutação T129R na sequência CL com um K147D correspondente na sequência CH1.

[0092] Em certos aspectos, as modificações ortogonais compreendem mutações de par de carga entre o pelo menos um domínio CH1 e um domínio CL, sendo as mutações de par de carga selecionadas do grupo consistindo em: uma mutação N138K na sequência CL com um G166D correspondente na sequência CH1, e uma mutação N138D na sequência CL com um G166K correspondente na sequência CH1.

[0093] Em certos aspectos, o domínio A tem uma sequência de aminoácidos VL e o domínio F tem uma sequência de aminoácidos VH. Em certos aspectos, o domínio A tem uma sequência de aminoácidos VH e o domínio F tem uma sequência de aminoácidos VL.

[0094] Em certos aspectos, o domínio H tem uma sequência de aminoácidos VL e o domínio L tem uma sequência de aminoácidos VH. Em certos aspectos, o domínio H tem uma sequência de aminoácidos VH e o domínio L tem uma sequência de aminoácidos VL.

[0095] Em certos aspectos, o domínio D e o domínio J têm uma sequência de aminoácidos CH2.

[0096] Em certos aspectos, o domínio E tem uma sequência de aminoácidos CH3.

[0097] Em certos aspectos, as sequências de aminoácidos do domínio E e do domínio K são idênticas, em que a sequência é uma sequência CH3 endógena.

[0098] Em certos aspectos, as sequências de aminoácidos do domínio E e do domínio K são diferentes. Em certos aspectos, as sequências diferentes compreendem separadamente, e respectivamente, modificações ortogonais em uma sequência CH3 endógena, em que o domínio E interage com o domínio K, e em que nem o domínio E e nem o domínio K interage significativamente com um domínio CH3 que não tem a modificação ortogonal.

[0099] Em certos aspectos, as modificações ortogonais compreendem mutações que geram pontes dissulfeto modificadas entre o domínio E e o domínio K. Em certos aspectos, as mutações que geram as pontes dissulfeto modificadas são uma mutação S354C em um dentre o domínio E e o domínio K, e uma 349C no outro domínio. Em certos aspectos, as modificações ortogonais no domínio E e no domínio K compreendem mutações knob-in-hole. Em certos aspectos, as mutações knob-in-hole são uma mutação T366W em um do domínio E ou do domínio K e uma mutação T366S, L368A e aY407V no outro domínio. Em certos aspectos, as modificações ortogonais no domínio E e no domínio K compreendem mutações de par de carga. Em certos aspectos, as mutações de par de carga são uma mutação T366K em um do domínio E ou do domínio K, e uma mutação L351D correspondente no outro domínio.

[0100] Em certos aspectos, as sequências de aminoácidos do domínio E e do domínio K são sequências endógenas de dois domínios de anticorpo diferentes, os quais são selecionados para ter uma interação específica que promove a associação específica entre o primeiro e o terceiro polipeptídeos. Em certos aspectos, as duas sequências de aminoácidos diferentes são uma sequência CH1 e uma sequência CL.

[0101] Em certos aspectos, a molécula de ligação ao antígeno do ROR compreende, adicionalmente, um terceiro sítio de ligação ao antígeno. Em certos aspectos, o terceiro sítio de ligação ao antígeno é específico para um antígeno do ROR. Em certos aspectos, o primeiro sítio de ligação ao antígeno e o terceiro sítio de ligação ao antígeno são específicos para o mesmo antígeno do ROR. Em certos aspectos, o primeiro sítio de ligação ao antígeno e o terceiro sítio de ligação ao antígeno são específicos para diferentes antígenos ROR.

[0102] Em certos aspectos, a molécula de ligação ao antígeno do ROR compreende uma quinta cadeia polipeptídica, em que: (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende ainda um domínio N e um domínio O, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação N- O-A-B-D-E, e em que o domínio N tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável, o domínio O tem uma sequência de aminoácidos da região constante; (b) a quinta cadeia polipeptídica compreende um domínio P e um domínio Q, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação P-Q, e em que o domínio P tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável e o domínio Q tem uma sequência de aminoácidos da região constante; e (c) o primeiro e o quinto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios N e P e uma interação entre os domínios O e Q para formar a molécula de ligação ao antígeno do ROR.

[0103] Em certos aspectos, (a) as sequências de aminoácidos do domínio N e do domínio A são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio H é diferente da sequência do domínio N e do domínio A, as sequências de aminoácidos do domínio O e do domínio B são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio I é diferente das sequências do domínio O e do domínio B, as sequências de aminoácidos do domínio P e do domínio F são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio L é diferente das sequências do domínio P e do domínio F, as sequências de aminoácidos do domínio Q e do domínio G são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio M é diferente das sequências do domínio Q e do domínio G; e (b) em que a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio N e o domínio P forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno. Em certos aspectos, o primeiro antígeno é um antígeno do ROR. Em certos aspectos, o segundo antígeno é um antígeno CD3.

[0104] Em certos aspectos, (a) as sequências de aminoácidos do domínio N, do domínio A e do domínio H são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio O, do domínio B e do domínio I são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio P, do domínio F e do domínio L são diferentes, e as sequências de aminoácidos do domínio Q, do domínio G e do domínio M são diferentes; e (b) a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro site de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio N e o domínio P forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para um terceiro antígeno.

[0105] Em certos aspectos, a molécula de ligação ao antígeno do ROR compreende uma sexta cadeia polipeptídica, em que: (a) a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda um domínio R e um domínio S, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação R- S-H-I-J-K, e em que o domínio R tem uma sequência de aminoácidos da região variável e o domínio S tem uma sequência de aminoácidos de domínio constante; (b) a sexta cadeia polipeptídica compreende: um domínio T e um domínio U, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação T-U, e em que o domínio T tem uma sequência de aminoácidos da região variável e o domínio U tem uma sequência de aminoácidos de domínio constante; e (c) o terceiro e o sexto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios R e T e uma interação entre os domínios S e U para formar a molécula de ligação ao antígeno do ROR.

[0106] Em certos aspectos, (a) as sequências de aminoácidos do domínio R e do domínio A são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio H é diferente da sequência do domínio R e do domínio A, as sequências de aminoácidos do domínio S e do domínio B são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio I é diferente das sequências do domínio S e do domínio B, as sequências de aminoácidos do domínio T e do domínio F são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio L é diferente das sequências do domínio T e do domínio F, as sequências de aminoácidos do domínio U e do domínio G são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio M é diferente das sequências do domínio U e do domínio G; e (b) a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno. Em certos aspectos, o primeiro antígeno é um antígeno do ROR. Em certos aspectos, o segundo antígeno é um antígeno CD3.

[0107] Em certos aspectos, (a) as sequências de aminoácidos do domínio R e do domínio H são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio A é diferente da sequência do domínio R e do domínio H, as sequências de aminoácidos do domínio S e do domínio I são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio B é diferente das sequências do domínio S e do domínio I, as sequências de aminoácidos do domínio T e do domínio L são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio F é diferente das sequências do domínio T e do domínio L, as sequências de aminoácidos do domínio U e do domínio M são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio G é diferente das sequências do domínio U e do domínio M; e (b) a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o segundo antígeno. Em certos aspectos, o segundo antígeno é um antígeno do ROR. Em certos aspectos, o primeiro antígeno é um antígeno CD3.

[0108] Em certos aspectos, (a) as sequências de aminoácidos do domínio R, do domínio A e do domínio H são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio S, do domínio B e do domínio I são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio T, do domínio F e do domínio L são diferentes, e as sequências de aminoácidos do domínio U, do domínio G e do domínio M são diferentes; e (b) a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro site de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para um terceiro antígeno.

[0109] Também são descritos na presente invenção moléculas de ligação ao antígeno do ROR purificadas, onde as moléculas de ligação ao antígeno do ROR purificadas compreendem qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno do ROR descritas na presente invenção. Em certos aspectos,

as moléculas de ligação ao antígeno do ROR purificadas são purificadas por um método de purificação que compreende uma etapa de purificação por afinidade de CH1. Em certos aspectos, o método de purificação é um método de purificação de uma única etapa.

[0110] Também são descritas na presente invenção composições farmacêuticas que compreendem qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno do ROR aqui descritas, e um diluente farmaceuticamente aceitável.

[0111] Também são descritos na presente invenção métodos para o tratamento de um indivíduo com câncer, onde os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições farmacêuticas descritas na presente invenção. Em certos aspectos, o câncer é selecionado do grupo consistindo em : câncer de pâncreas, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer gástrico, melanoma, sarcoma de Ewing, leucemia linfocítica crônica, linfoma de células do manto, B-ALL, câncer hematológico, câncer de próstata, câncer de cólon, câncer renal e câncer de útero.

5. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0112] A figura 1 mostra um alinhamento do par dímero da IgG1 CH3-CH3 CH1-CL. As estruturas quaternárias se alinham com um RMSD de ~1,6 Å2.

[0113] A figura 2 apresenta arquiteturas esquemáticas, com as respectivas convenções de nomenclatura, para várias moléculas de ligação (também chamadas de construções de anticorpo) descritas na presente invenção.

[0114] A figura 3 apresenta um esquema de maior resolução das cadeias polipeptídicas e dos seus domínios, com as respectivas convenções de nomenclatura, para as construções de anticorpos bivalentes 1x1 descritas na presente invenção.

[0115] A figura 4 mostra a arquitetura de uma construção exemplar bivalente e monoespecífica.

[0116] A figura 5 mostra dados de um experimento de interferometria biocamada (BLI), descrito no exemplo 1, em que uma molécula de ligação monoespecífica bivalente tendo a arquitetura ilustrada na figura 4 [polipeptídeo 1: VL- CH3(Knob)-CH2-CH3 / polipeptídeo 2: VH-CH3(Hole)] foi avaliada. O sítio de ligação ao antígeno foi específico para TNFα. A resposta da BLI da imobilização da molécula de ligação e da ligação do TNFα À construção imobilizada demonstra uma ligação robusta, específica e bivalente ao antígeno. Os dados são consistentes com uma molécula com uma alta porcentagem de emparelhamento pretendido de polipeptídeo 1 e polipeptídeo 2.

[0117] A figura 6 ilustra as características de uma molécula de ligação biespecífica 1x1 bivalente exemplar, “BC1”.

[0118] A figura 7A mostra a análise de cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) do “BC1”, demonstrando que uma etapa de purificação por afinidade de CH1 de uma etapa (resina de afinidade CH1 CaptureSelect™) produz um pico único e monodisperso via filtração em gel, em que >98% é composto por proteína bivalente não agregada. A figura 7B mostra dados de literatura comparativa da análise por SEC de uma construção de anticorpo bivalente CrossMab [dados de Schaefer et al. (Proc Natl Acad Sci USA. 5 de julho de 2011; 108 (27): 11187-92)].

[0119] A figura 8A é um perfil de eluição de cromatografia de troca catiônica de “BC1” após uma purificação em uma etapa usando a resina de afinidade CH1 CaptureSelect™, mostrando um único pico compacto. A figura 8B é um perfil de eluição de cromatografia de troca catiônica de “BC1” após a purificação usando a purificação padrão da proteína A.

[0120] A figura 9 mostra géis SDS-PAGE não redutores de “BC1” em vários estágios de purificação.

[0121] As figuras 10A e 10B comparam os géis SDS- PAGE de “BC1” após a purificação por afinidade de CH1 em uma etapa em condições não redutoras e redutoras (figura 10A) com géis SDS-PAGE de um anticorpo bivalente biespecífico CrossMab em condições não redutoras e redutoras, conforme é publicado na literatura referenciada (figura 10B).

[0122] As figuras 11A e 11B mostram a análise de espectrometria de massa de “BC1”, demonstrando duas cadeias pesadas distintas (figura 11A) e duas cadeias leves distintas (figura 11B), sob condições redutoras.

[0123] A figura 12 apresenta uma análise de espectrometria de massa do “BC1” purificado em condições não redutoras, confirmando a ausência de pareamento incompleto após a purificação.

[0124] A figura 13 apresenta os dados do teste de estabilidade acelerada, demonstrando a estabilidade do “BC1”

durante 8 semanas a 40 °C, em comparação com dois anticorpos de controle IgG.

[0125] A figura 14ilustra características de uma molécula de ligação biespecífica 1x1 bivalente exemplar, “BC6”, descrita adicionalmente no exemplo 3.

[0126] A figura 15A apresenta a análise por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) de “BC6” após a purificação em uma etapa usando a resina de afinidade CH1 CaptureSelect™, demonstrando que a purificação por afinidade de CH1 em uma única etapa produz um único pico monodisperso e a ausência de agregados não covalentes. A figura 15B mostra um gel SDS-PAGE de “BC6” em condições não redutoras.

[0127] A figura 16 ilustra características de uma molécula de ligação biespecífica bivalente exemplar, “BC28”, descrita adicionalmente no exemplo 4.

[0128] A figura 17 mostra a análise de SDS-PAGE por condições não redutoras após a purificação por afinidade de CH1 em uma etapa de “BC28”, “BC29”, “BC30”, “BC31” e “BC32”.

[0129] A figura 18 mostra a análise por SEC de “BC28” e “BC30”, cada uma após a purificação em uma etapa usando a resina de afinidade CH1 CaptureSelect™.

[0130] A figura 19 ilustra características de uma molécula de ligação biespecífica bivalente exemplar, “BC44”, descrita adicionalmente no exemplo 5.

[0131] As figuras 20A e 20B mostram dados de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) de duas moléculas de ligação bivalente, “BC15” e “BC16”, respectivamente, sob condições de teste de estabilidade acelerada. “BC15” e “BC16” têm diferentes junções variáveis da região-CH3.

[0132] A figura 21 apresenta um esquema de cinco cadeias polipeptídicas e seus domínios, com as respectivas convenções de nomenclatura, para as construções de anticorpos trivalentes 2x1 descritas aqui, em que, de acordo com a convenção de nomenclatura, a cadeia 5 é chamada de “5ª cadeia polipeptídica” na representação esquemática.

[0133] A figura 22 ilustra as características de uma molécula de ligação biespecífica trivalente 2x1 exemplar, “BC1-2x1”, descrita adicionalmente no exemplo 7.

[0134] A figura 23 mostra a SDS-PAGE não redutora de “BC1” e a proteína “BC1-2x1” expressa usando o sistema de transfecção transitório ThermoFisher Expi293, em vários estágios de purificação.

[0135] A figura 24 compara a avidez da construção bivalente 1x1 “BC1” com a avidez da construção trivalente 2x1 “BC1-2x1” usando uma análise de interferometria biocamada Octet (Pall ForteBio).

[0136] A figura 25 ilustra características importantes de uma construção trivalente 2x1, “TB111”.

[0137] A figura 26 apresenta um esquema de cinco cadeias polipeptídicas e seus domínios, com as respectivas convenções de nomenclatura, para as construções de anticorpos trivalentes 1x2 descritas aqui, em que, de acordo com a convenção de nomenclatura, a cadeia 5 é chamada de “6ª cadeia polipeptídica” na representação esquemática.

[0138] A figura 27 ilustra características de uma construção trivalente exemplar 1x2 “CTLA4-4 x Nivo x CTLA4- 4”, adicionalmente descrita no exemplo 10.

[0139] A figura 28 é um gel SDS-PAGE no qual as raias que mostram a construção trivalente 1x2 “CTLA4-4 x Nivo x CTLA4-4” sob condições não redutoras (“-DTT”) e redutoras (“+DTT”) estão compreendidas no retângulo.

[0140] A figura 29 mostra uma comparação da ligação ao antígeno entre dois anticorpos: a construção bivalente 1x1 “CTLA4-4 x OX40-8” e a construção trivalente 1x2 “CTLA4-4 x Nivo x CTLA4-4”. “CTLA4-4 x OX40-8” se liga ao CTLA4 monovalentemente, enquanto “CTLA4-4 x Nivo x CTLA4-4” se liga ao CTLA4 bivalentemente.

[0141] A figura 30 ilustra características de uma construção trivalente 1x2 triespecífica exemplar, “BC28- 1x1x1a”, adicionalmente descrita no exemplo 11.

[0142] A figura 31 mostra a cromatografia de exclusão por tamanho de “BC28-1x1x1a” após a expressão transitória e a purificação da resina de afinidade de CH1 em uma única etapa, mostrando um único pico bem definido.

[0143] A figura 32 mostra os resultados de SDS-PAGE com construções bivalentes e trivalentes, cada uma após a expressão transitória e a purificação em uma etapa usando a resina de afinidade CH1 CAPTURESelect™, em condições não redutoras e redutoras, conforme descrito no exemplo 12.

[0144] As figuras 33A a 33C mostram as análises de ligação Octet para 3 antígenos: PD1, antígeno “A” e CTLA4. Como é adicionalmente descrito no exemplo 13, a figura 33A mostra a ligação do “BC1” ao PD1 e ao antígeno “A”; a figura 33B mostra a ligação de uma construção biespecífica bivalente “CTLA4-4 x OX40-8” para CTLA4, o antígeno “A” e PD1; a figura

33C mostra a ligação do “BC28-1x1x1a” trivalente triespecífico ao PD1, ao antígeno “A” e CTLA4.

[0145] A figura 34 apresenta uma representação esquemática de seis cadeias polipeptídicas e seus domínios, com as respectivas convenções de nomenclatura, para certas construções tetravalentes 2x2 descritas na presente invenção.

[0146] A figura 35 ilustra certas características relevantes da construção 2x2 tetravalente exemplar, “BC22- 2x2”, descrita adicionalmente no exemplo 14.

[0147] A figura 36 é um gel SDS-PAGE não redutor comparando a construção tetravalente 2x2 “BC22-2x2” com uma construção trivalente 1x2 “BC12-1x2” e uma construção trivalente 2x1 “BC21-2x1” em diferentes estágios de purificação.

[0148] A figura 37 fornece a arquitetura para uma construção tetravalente 2x2 exemplar.

[0149] A figura 38 apresenta uma representação esquemática de seis cadeias polipeptídicas e seus domínios, com as respectivas convenções de nomenclatura, para certas construções tetravalentes descritas na presente invenção, em que, de acordo com a convenção de nomenclatura, a cadeia 5 é chamada de “7ª cadeia polipeptídica” e a cadeia 6 é chamada de “8ª cadeia polipeptídica” na representação esquemática.

[0150] A figura 39 fornece uma arquitetura exemplar de uma construção tetravalente biespecífica.

[0151] A figura 40 fornece uma arquitetura exemplar para uma construção tetravalente triespecífica utilizando uma estratégia de cadeia leve comum.

[0152] A figura 41 mostra a ligação biespecífica do antígeno pela construção tetravalente esquematizada na figura 39, demonstrando que essa construção era capaz de se ligar em simultâneo. As respostas de interferometria biocamada (BLI) da imobilização do B-body e da ligação do TNFα à construção imobilizada são consistentes com uma molécula com uma alta porcentagem de emparelhamento de cadeias pretendida.

[0153] A figura 42 fornece uma análise de citometria de fluxo da ligação do B-body ao antígeno de superfície celular. O sinal com hachuras cruzadas indica células sem antígeno; o sinal pontilhado indica células transitoriamente transfectadas com o antígeno de superfície.

[0154] A figura 43 fornece uma arquitetura exemplar de uma construção trivalente.

[0155] A figura 44 fornece uma arquitetura exemplar de uma construção trivalente.

[0156] A figura 45 mostra os resultados de SDS-PAGE com construções bivalentes e trivalentes, cada uma após a expressão transitória e a purificação em uma etapa usando a resina de afinidade CH1 CaptureSelect™, em condições não redutoras e redutoras, conforme descrito no exemplo 17.

[0157] A figura 46 mostra as diferenças nas transições térmicas para “BC24jv”, “BC26jv” e “BC28jv” medidas para avaliar a estabilidade de pareamento das variantes juncionais.

[0158] A figura 47 demonstra a análise de interferometria biocamada Octet (Pall ForteBio) de uma diluição em série de duas vezes (200 a 12,5 nM) usada para determinar a afinidade de ligação ao CD3 para um B-body monovalente SP34-89 que não sofreu mutação.

[0159] As figuras 48A a 48B demonstram a análise de interferometria biocamada de Octet (Pall ForteBio) de uma diluição em série de duas vezes (200 a 12,5 nM) usada para determinar a afinidade de ligação ao ROR1 para dois candidatos a sítio de ligação ao antígeno do ROR (Figura 48A, clone I2-A10; figura 48B, clone I2-A27).

[0160] A figura 49 mostra que os B-bodies 1x1 e 1x2 biespecíficos para RORxCD3 resultaram na ativação das células T repórteres, quando misturados com as linhagens tumorais expressando o ROR1 (HOP-92), mas nenhuma ativação quando misturados com as linhagens tumorais que não expressaram ROR1 (B16).

[0161] A figura 50 mostra que o B-body 1x2 I2A-10 biespecífico de rorxCD3 1x2 resultou na morte mediada por células T citotóxicas, quando misturado com as linhagens tumorais expressando ROR1 (MDA-MD-231), mas não resultou em citotoxicidade quando um B-body biespecífico de CD3 com um tumor irrelevante ABS (por exemplo, um antígeno tumoral não expresso em MDA-MD-231) foi adicionado à mistura.

[0162] As figuras 51A a 51E mostram que os B-bodies 1x1 e 1x2 biespecíficos para RORxCD3 resultaram na ativação das células T repórteres, quando misturados com as linhagens tumorais expressando ROR1 HOP-92 (figura 51A), A549 (figura 51B), MDA-MD-231 (figura 51C), JeKo-1 (figura 51D), e RPMI- 8226 (figura 51E), mas não em ativação quando misturados com as linhagens tumorais que não expressam ROR1 (B16).

[0163] A figura 52 mostra que os B-bodies 1x2 biespecíficos de RORxCD3 I2A-1, I2A-3, I2A-10, I2A-14, I2A- 22 e I2A-27 resultaram na morte mediada por células T citotóxicas, quando misturados com as linhagens tumorais expressando ROR1 (MDA-MD-231), mas os B-bodies 1x2 I2A-16 e I2A-22 não resultaram em uma potente citotoxicidade.

[0164] A figura 53A ilustra os dados de expressão de ROR1 publicados para as linhagens tumorais MDA-MD-231 e RPMI-

8226. As figuras 53B e a figura 53C demonstram que a eficácia da citotoxicidade se correlaciona com o ROR1 nas linhagens celulares tumorais MDA-MD-231 e RPMI-8226.

[0165] As figuras 54A a 54F mostram que os B-bodies I2A-10 e I2A-27 ativaram as células T CD8+ em uma população de PBMC, conforme determinado pela quantificação de CD25 (figura 54A), CD69 (figura 54C), e tanto CD25 quanto CD69 (figura 54E), bem como ativaram as células T CD4+ em uma população PBMC, conforme determinado pela quantificação de CD25 (figura 54A), CD69 (figura 54D), e tanto CD25 quanto CD69 (figura 54F).

[0166] A figura 55 mostra que 26% e 36% dos candidatos I2A-10 (painel superior) e I2A-27 (painel inferior) foram internalizados após um período de incubação de 2 horas com células MDA-MB-231, respectivamente.

[0167] A figura 56 mostra a análise por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), demonstrando que uma etapa única de purificação por afinidade de CH1 produz picos únicos e monodispersos por filtração em gel, em que > 98% é proteína não agregada para os candidatos a B- body 1x2 I2A-10 (painel superior) e I2A-27 (painel inferior).

[0168] A figura 57A mostra géis de SDS-PAGE não redutores dos candidatos a B-body 1x2 I2A-10 (painel esquerdo) e I2A-27 (painel direito), demonstrando uma grande banda de construções totalmente montadas (banda de 250 kDa de alta migração).

[0169] A figura 57B mostra a análise com o bioanalisador (Agilent) de amostras não reduzidas para os ts a B-body 1x2 I2A-10 e I2A-27, indicando uma grande banda de construções totalmente montadas.

[0170] A figura 58 mostra a análise por SDS-PAGE dos anticorpos biespecíficos que compreendem mutações ortogonais knob-hole padrão introduzidas nos domínios CH3 encontrados em suas posições nativas dentro da porção Fc do anticorpo bivalente biespecífico que foram purificados usando uma etapa de purificação por afinidade CH1 de uma etapa (resina de afinidade de CH1 CaptureSelect™).

[0171] As figuras 59A e 59B mostram a análise de interferometria biocamada na Octet (Pall ForteBio) demonstrando a ligação do FcγRIa ao trastuzumabe (figura 59A, “WT IgG1”), mas não do sFc10 (figura 59B).

[0172] A figura 60 mostra a morte pelo trastuzumabe (herceptina, “IgG1 tipo selvagem”), mas não por sFc7 ou sFc10 em um ensaio de ADCC.

[0173] A figura 61 mostra a ligação de C1q pelo trastuzumabe (herceptina, “IgG1 tipo selvagem”) mas não por sFc1, sFc7 ou sFc10 em um ELISA de C1q.

[0174] As figuras 62A a 62C mostram o volume do tumor monitorado para camundongos enxertados com células tumorais, humanizados com PBMCs (seta sólida esquerda), e em seguida tratados IV (seta tracejada direita) com PBS (figura 62A), candidato a B-body 1x2 I2-A10 (figura 62B), ou o candidato a B-body 1x2 I2-A27 (figura 62C).

[0175] A figura 63 mostra volume do tumor na conclusão do estudo para cada um dos camundongos, com desvio médio e padrão para cada grupo mostrado. O quadrado aberto para o grupo I2-A27 foi removido da análise devido à provável não humanização por PMBCs.

[0176] A figura 64A mostra a ligação do SP34-89 às células T cinomólogas e Jurkat. A figura 64B mostra a ligação de um anticorpo biespecífico B-body™ 1x2 I2-A27 ao heterodímero delta e épsilon de CD3 cinomólogo.

[0177] A figura 65A mostra a ligação de um anticorpo IgG I2-A27 IgG ao ROR1 em um ensaio de ligação monovalente. A figura 65B mostra a ligação mínima de um anticorpo IgG I2- A27 ao ROR2. A figura 65C mostra a ligação de um B-body™ 1x2 I2-A27 ao ROR1 em um ensaio de ligação monovalente. A figura 65D mostra a ligação mínima de um B-body™ 1x2 I2-A27 ao ROR2. A figura 65E mostra a ligação de um B-body™ 1x2 I2-A27 ao ROR1 em um ensaio de ligação bivalente.

[0178] A figura 66A mostra a análise por SEC de um B-body™ 1x2 I2-A27. A figura 66B mostra a análise por SMAC de um B-body™ 1x2 I2-A27. A figura 66C mostra a análise por CIH de um B-body™ 1x2 I2-A27.

[0179] A figura 67A mostra a atividade de um B-body™ 1x2 I2-A27 em um ensaio de Jurkat com células MDA-MB-231 (expressando ROR1). A figura 67B mostra a atividade de um B- body™ 1x2 I2-A27 em um ensaio de Jurkat com células RPMI- 8226 (expressando ROR1 e ROR2). A figura 67C mostra a inatividade de um B-body™ 1x2 I2-A27 em um ensaio de Jurkat com células K562 (expressando ROR2). A figura 67D mostra a inatividade de um B-body™ 1x2 I2-A27 em um ensaio de Jurkat na ausência de uma linhagem celular-alvo.

[0180] A figura 68A mostra a expressão de CD69 com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A27 e células MDA- MB-231 expressando ROR1. A figura 68B mostra a expressão de CD69 com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A27 e células RPMI-8226 expressando ROR1. A figura 68C mostra a expressão de CD25 com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A27 e células MDA-MB-231 expressando ROR1. A figura 68D mostra a expressão de CD25 com várias concentrações de um B- body™ 1x2 I2-A27 e células RPMI-8226 expressando ROR1.

[0181] A figura 69A mostra a liberação de LDH com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A27 e células MDA- MB-231 expressando ROR1. A figura 69B mostra a liberação de LDH com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A27 e células RPMI-8226 expressando ROR1.

[0182] A figura 70A mostra a granzima B com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A27 e células MDA-MB-231 expressando ROR1. A figura 70B mostra a granzima B com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A27 e células RPMI-8226 expressando ROR1. A figura 70C mostra a secreção de TNFα com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A27 e células MDA- MB-231 expressando ROR1. A figura 70D mostra a secreção de TNFα com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A27 e células RPMI-8226 expressando ROR1. A figura 70E mostra a liberação de IFNγ com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A27 e células MDA-MB-231 expressando ROR1. A figura 70F mostra a liberação de IFNγ com várias concentrações de um B- body™ 1x2 I2-A27 e células RPMI-8226 expressando ROR1.

[0183] A figura 71A mostra a atividade para amostras de B-body™ 1x2 I2-A27 armazenadas em soro humano a 4°C ou 37 °C durante 1 semana. A figura 71B mostra a inatividade das amostras em um ensaio de Jurkat na ausência de células expressando ROR1.

[0184] A figura 72 mostra ensaios de estabilidade em amostras de B-body™ 1x2 I2-A27 sob condições aceleradas.

[0185] A figura 73 mostra ensaios de estabilidade em amostras de B-body™ 1x2 I2-A27 sob condições em tempo real.

[0186] A figura 74 mostra ensaios de estabilidade em meio ácido de um B-body™ 1x2 I2-A27.

[0187] A figura 75 mostra a ligação de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q ao heterodímero delta e épsilon CD3 cinomólogo.

[0188] A figura 76A mostra a ligação de um anticorpo IgG I2-A10 D54E Y55Q ao ROR1 em um ensaio de ligação monovalente. A figura 76B mostra a ligação de uma IgG I2-A10 D54E Y55Q ao ROR2 em um ensaio de ligação monovalente. A figura 76C mostra a ligação de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q ao ROR1 em um ensaio de ligação monovalente. A figura 76D mostra a ligação de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q ao ROR2 em um ensaio de ligação monovalente. A figura 76E mostra a ligação de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q ao ROR1 em um ensaio de ligação bivalente. A figura 76F mostra a ligação de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q ao ROR2 em um ensaio de ligação bivalente.

[0189] A figura 77 mostra a ligação de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q ao domínio semelhante à Ig do ROR1.

[0190] A figura 78A mostra a análise por SEC de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q. A figura 78B mostra a análise por SMAC de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q. A figura 78C mostra a análise por CIH de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q.

[0191] A figura 79A mostra a atividade de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q em um ensaio de Jurkat com células MDA- MB-231 (expressando ROR1). A figura 79B mostra a atividade de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q em um ensaio de Jurkat com células RPMI-8226 (expressando ROR1 e ROR2). A figura 79C mostra atividade de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q com células K562 (expressando ROR2). A figura 79D mostra a inatividade de um B-body™ 1x2 I2-A10 em um ensaio de Jurkat na ausência de uma linhagem celular-alvo.

[0192] A figura 80A mostra a expressão de CD69 com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q e células MDA-MB-231 expressando ROR1. A figura 80B mostra a expressão de CD69 com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q e células RPMI-8226 expressando ROR1 e ROR2. A figura 80C mostra a expressão de CD25 com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q e células MDA-MB-231 expressando ROR1. A figura 80D mostra a expressão de CD25 com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q e células RPMI-8226 expressando ROR1 e ROR2.

[0193] A figura 81A mostra a liberação de LDH com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q e células MDA-MB-231 expressando ROR1. A figura 81B mostra a liberação de LDH com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q e células RPMI-8226 expressando ROR1 e ROR2.

[0194] A figura 82A mostra a granzima B com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q e células MDA-MB-231 expressando ROR1. A figura 82B mostra a granzima B com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q e células RPMI-8226 expressando ROR1 e ROR2. A figura 82C mostra a secreção de TNFα com várias concentrações de um B-body 1x2 I2-A10 D54E Y55Q e células MDA-MB-231 expressando ROR1. A figura 82D mostra a secreção de TNFα com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q e células RPMI-8226 expressando ROR1 e ROR2. A figura 82E mostra a secreção de IFNɤ com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q e células MDA-MB-231 expressando ROR1. A figura 82F mostra a secreção de IFNɤ com várias concentrações de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q e células RPMI-8226 expressando ROR1 e ROR2.

[0195] A figura 83A mostra a atividade de amostras de B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q armazenadas em soro humano a 4°C ou 37 °C durante 1 semana. A figura 83B mostra a inatividade das amostras em um ensaio de Jurkat na ausência de células expressando ROR1.

[0196] A figura 84 mostra ensaios de estabilidade de amostras de B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q sob condições aceleradas.

[0197] A figura 85 mostra ensaios de estabilidade de amostras de B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q sob condições em tempo real.

[0198] A figura 86 mostra ensaios de estabilidade ácida de um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q.

[0199] A figura 87 mostra a eficácia in vivo de um B-body™ 1x2 I2-27 e um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q para reduzir o volume do tumor (mm3) em um modelo de camundongo para estudo de câncer.

[0200] A figura 88 mostra a eficácia in vivo de doses múltiplas de um B-body™ 1x2 I2-27 e um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q para reduzir o tamanho do tumor (mm3) em um modelo de camundongo para estudo de câncer.

[0201] As figuras representam várias modalidades da presente invenção apenas para fins de ilustração. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá prontamente, a partir da discussão a seguir, que modalidades alternativas das estruturas e métodos aqui ilustrados podem ser empregadas sem se afastar dos princípios da invenção aqui descritos.

6. Descrição detalhada

6.1. Definições

[0202] A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o significado comumente compreendido por uma pessoa versada na técnica, a quem esta invenção pertence. Conforme utilizado nesse documento, os termos a seguir têm os significados atribuídos a eles, abaixo.

[0203] “Sítio de ligação ao antígeno” significa uma região de uma molécula de ligação ao ROR que reconhece ou se liga especificamente a um dado antígeno ou epítopo.

[0204] “B-Body”, conforme utilizado na presente invenção e com referência à figura 3, se refere às moléculas de ligação que compreendem os atributos de uma primeira e uma segunda cadeia polipeptídica, em que: (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende um domínio A, um domínio B, um domínio D e um domínio E, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação A- B-D-E, e em que o domínio A tem uma sequência de aminoácidos da VL, o domínio B tem uma sequência de aminoácidos de CH3, o domínio D tem uma sequência de aminoácidos de CH2 e o domínio E tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; (b) a segunda cadeia polipeptídica compreende um domínio F e um domínio G, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação F-G, e em que o domínio F tem uma sequência de aminoácidos da VH e o domínio G tem uma sequência de aminoácidos de CH3; e (c) o primeiro e o segundo polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios A e F e uma interação entre os domínios B e G para formar a molécula de ligação. Os B-bodies são descritos com mais detalhes no pedido de patente internacional No. PCT/US2017/057268, aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[0205] Conforme utilizado na presente invenção, os termos “tratar” ou “tratamento” se referem tanto ao tratamento terapêutico como às medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou abrandar (diminuir) uma alteração ou desordem fisiológica indesejada, tal como a progressão da esclerose múltipla, de artrite ou câncer. Resultados benéficos ou clínicos desejados incluem, mas não se limitam, ao alívio de sintomas, à diminuição da extensão da doença, ao estado da doença estabilizado (ou seja, não piorado), ao retardo ou desaceleração da progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença e à remissão (parcial ou total), seja ela detectável ou não detectável. “Tratamento” pode significar também prolongar a sobrevivência em comparação com a sobrevivência esperada se não receber tratamento. As pessoas que necessitam de tratamento incluem aquelas já com a condição ou distúrbio, bem como aquelas pessoas propensos a ter a condição ou distúrbio ou aquelas nas quais a condição ou distúrbio deve ser evitada.

[0206] Por “sujeito”, “indivíduo”, “animal”, “paciente” ou “mamífero”, se entende qualquer indivíduo, particularmente um mamífero, para quem o diagnóstico, prognóstico ou terapia é desejado. Os indivíduos mamíferos incluem seres humanos, animais domésticos, animais de fazenda e animais de zoológico, de esporte ou de estimação, como cães, gatos, porquinhos-da-índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, vacas e assim por diante.

[0207] O termo “quantidade suficiente” significa uma quantidade suficiente para produzir um efeito desejado, por exemplo, uma quantidade suficiente para modular a agregação de proteínas em uma célula.

[0208] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” é uma quantidade que é eficaz para melhorar um sintoma de uma doença. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser uma “quantidade profilaticamente eficaz”, uma vez que a profilaxia pode ser considerada terapia.

6.2. Outras convenções de interpretação

[0209] A menos que seja especificado de outra forma, todas as referências às sequências na presente invenção são para as sequências de aminoácidos.

[0210] A menos que seja especificado de outra forma, a numeração de resíduos da região constante do anticorpo está de acordo com o índice Eu, conforme descrito em www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html #refs (acessado em 22 de agosto de 2017) e em Edelman et al., Proc. Natl. Acad. EUA, 63:78-85 (1969), que são incorporados por referência em suas totalidades, e identifica o resíduo de acordo com sua localização em uma sequência da região constante endógena, independentemente da localização física do resíduo dentro de uma cadeia de moléculas de ligação ao ROR descritas na presente invenção. Por “sequência endógena” ou “sequência nativa” se entende qualquer sequência, incluindo sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos, que se originam de um organismo, tecido ou célula e não foi artificialmente modificada ou mutada.

[0211] Os números da cadeia polipeptídica (por exemplo, uma “primeira” cadeia polipeptídica, uma “segunda” cadeia polipeptídica etc. ou a “cadeia 1”, “cadeia 2” polipeptídica etc.) são usados na presente invenção como um identificador único para cadeias polipeptídicas específicas que formam uma molécula de ligação e não se destinam a conotar a ordem ou a quantidade das diferentes cadeias de polipeptídeos na molécula de ligação.

[0212] Nesta revelação, “compreende”, “compreendendo”, “contendo”, “tendo”, “inclui”, “incluindo” e variantes linguísticas dos mesmos têm o significado atribuído a eles na lei de patentes dos EUA, permitindo a presença de componentes adicionais além daqueles explicitamente citados.

[0213] Entende-se que as faixas aqui fornecidas são abreviaturas para todos os valores dentro da faixa, incluindo para os pontos extremos da faixa citados. Por exemplo, entende-se que uma faixa de 1 a 50 inclui qualquer número, combinação de números ou subfaixas do grupo consistindo em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50.

[0214] A menos que seja especificamente declarado ou esteja evidente no contexto, o termo “ou”, como usado aqui, é interpretado como inclusivo. A menos que seja especificamente declarado ou evidente a partir do contexto, conforme utilizado na presente invenção, os termos “um”, “uma” e “o/a” são interpretados como sendo singulares ou plurais.

[0215] A menos que seja especificamente declarado ou esteja evidente a partir do contexto, conforme utilizado na presente invenção, o termo “cerca de” é entendido como estando dentro de uma faixa de tolerância normal na técnica, como por exemplo, dentro de 2 desvios padrão da média. Cerca de pode ser entendido como estando dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% ou 0,01% do valor declarado. A menos que seja claro a partir do contexto, todos os valores numéricos aqui fornecidos são modificados pelo termo cerca de.

6.3. Moléculas de ligação ao antígeno do ROR

[0216] Em um primeiro aspecto, são fornecidas moléculas de ligação ao antígeno. Em todas as modalidades, a molécula de ligação ao antígeno inclui pelo menos um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um antígeno do ROR; desse modo, as moléculas de ligação são chamadas de moléculas de ligação ao antígeno do ROR.

[0217] As moléculas de ligação ao ROR descritas na presente invenção se ligam especificamente aos antígenos do ROR.

[0218] Conforme utilizado na presente invenção, “antígenos do ROR” se refere aos membros da família do receptor transmembranar da proteína tirosina quinase (ROR), incluindo os membros ROR1 e ROR2. Em certas modalidades, a molécula de ligação ao ROR possui sítios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente apenas ao ROR1. Em outras modalidades, a molécula de ligação ao ROR possui sítios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente apenas ao ROR2. Ainda em outras modalidades, a molécula de ligação ao ROR possui sítios de ligação ao antígeno que são reativos de forma cruzada e se ligam especificamente tanto ao ROR1 como ao ROR2.

[0219] As proteínas ROR1 e ROR2 normalmente consistem em pelo menos quatro domínios proteicos: três domínios extracelulares - domínios semelhantes a Ig, FZ e domínios kringle - bem como ao domínio da proteína quinase intracelular. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao ROR possui sítios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente à porção extracelular do antígeno do ROR. Em certas modalidades, a molécula de ligação ao ROR possui sítios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente apenas ao domínio tipo Ig. Em outras modalidades, a molécula de ligação ao ROR possui sítios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente ao domínio FZ. Ainda em outras modalidades, a molécula de ligação ao ROR possui sítios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente ao domínio Kringle. Em modalidades particulares, a molécula de ligação ao ROR possui sítios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a pelo menos uma porção de um único domínio ROR. Em modalidades particulares, a molécula de ligação ao ROR possui sítios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a pelo menos uma porção de mais de um domínio ROR, como a junção entre um primeiro e um segundo domínio ROR. Os domínios ROR podem se referir aos domínios ROR1 ou aos domínios ROR2.

[0220] Em modalidades específicas, o antígeno do ROR é humano. O número de acesso Uniprot Q01973 descreve uma proteína do ROR1 humano canônica, incluindo suas sequências e especificidades de domínio, e é incorporada por referência em sua totalidade. A SEQ ID NO: 94 fornece a sequência proteica completa do ROR1. Com referência à sequência completa do terminal N para o terminal C, o domínio tipo Ig é definido como os aminoácidos 42 a 147, o domínio FZ como os aminoácidos 165 a 299, e o domínio kringle como os aminoácidos 312 a 391. O número de acesso Uniprot Q01974 descreve uma proteína do ROR2 humano canônica, incluindo suas sequências e especificidades de domínio, e é incorporada por referência em sua totalidade. A SEQ ID NO: 95 fornece a sequência proteica completa do ROR2. Com referência à sequência completa do terminal N para o terminal C, o domínio tipo Ig é definido como os aminoácidos 55 a 145, o domínio FZ como os aminoácidos 169 a 303, e o domínio kringle como os aminoácidos 316 a 394.

[0221] Vários tumores podem demonstrar a expressão na superfície celular dos antígenos do ROR, como descrito em mais detalhes em Gentile, et al. (Cancer Res; 71(8) 15 de abril de 2011), Rebagay, et al. (Front. Oncol., 18 de abril de 2012), Zhang, et al. (American Journal of Pathology, Vol. 181, No. 6, dezembro de 2012), Henry, et al. (Oncotarget, Vol. 6, No. 37 2015), Zhang, et al. (PLoS ONE 7(3): e31127.),e Bainbridge, et al. (PLoS ONE 9(7): e102695.),cada um aqui incorporado por referência em suas totalidades. Além disso, a expressão do ROR não pode ser efetuada, ou apenas demonstrar expressão limitada, no tecido normal, ou seja, não canceroso, como descrito em Balakrishnan et al. (Clin Cancer Res. 15 de junho de 2017; 23(12): 3061–3071), aqui incorporado em sua totalidade. Assim, os antígenos do ROR podem ser usados como um marcador específico de tumor em certos tumores. Exemplos de tumores e cânceres com expressão de ROR demonstrada incluem, mas não se limitam a, câncer de pâncreas, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer gástrico, melanoma, sarcoma de Ewing, leucemia linfocítica crônica, linfoma de células do manto e B-ALL, como descrito em Gohil et al. (Oncoimmunology. 2017; 6(7): e1326437.),aqui incorporados em suas totalidades. Outros cânceres incluem, mas não se limitam, ao câncer hematológico,

câncer de próstata, câncer de cólon, câncer renal e câncer de útero.

[0222] Em várias modalidades, a molécula de ligação ao ROR se liga especificamente a pelo menos um antígeno adicional a um antígeno do ROR.

[0223] Em uma modalidade específica, a molécula de ligação ao ROR é uma molécula bivalente biespecífica. Em outra modalidade, a molécula de ligação ao ROR é uma molécula trivalente biespecífica. Em modalidades particulares, a molécula de ligação ao ROR possui sítios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente ao antígeno do ROR e a uma molécula expressa na superfície das células T. Em uma modalidade específica, a molécula de ligação ao ROR possui sítios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente ao antígeno do ROR e a uma proteína CD3 expressa na superfície das células T. Sem desejar se ater à teoria, a molécula de ligação ao ROR que se liga especificamente ao antígeno do ROR e à molécula expressa na superfície das células T (ou seja, CD3) pode direcionar a morte mediada por células T (citotoxicidade) das células expressando o antígeno do ROR através do redirecionamento das células T para as células expressando ROR (ou seja, as células-alvo). A morte mediada por células T usando moléculas anti-CD3 biespecíficas é descrita em detalhes na Publicação Norte- Americana No. 2006/0193852, aqui incorporada por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, a molécula expressa na superfície das células T é selecionada dentre qualquer molécula capaz de redirecionar as células T para uma célula-alvo.

[0224] Com referência à figura 3, em uma série de modalidades, as moléculas de ligação ao ROR compreendem uma primeira e uma segunda cadeia polipeptídica, em que: (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende um domínio A, um domínio B, um domínio D e um domínio E, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação A-B-D-E, em que o domínio A tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável, e em que o domínio B, o domínio D e o domínio E têm uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; (b) a segunda cadeia polipeptídica compreende um domínio F e um domínio G, em que os domínios estão dispostos, do terminal N para o terminal C, em uma orientação F-G, e em que o domínio F tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável e o domínio G tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; (c) a terceira cadeia polipeptídica compreende um domínio H, um domínio I, um domínio J e um domínio K, em que os domínios estão dispostos, do terminal N para o terminal C, em uma orientação H-I-J-K, e em que o domínio H tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável, o domínio I tem uma sequência de aminoácidos CL, e os domínios J e K têm uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; (d) a quarta cadeia polipeptídica compreende um domínio L e um domínio M, em que os domínios estão dispostos, do terminal N para o terminal C, em uma orientação L-M, e em que o domínio L tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável, e em que a quarta cadeia polipeptídica compreende os domínios CH1 e o domínio M é o domínio CH1, ou uma porção do mesmo; (e)

o primeiro e o segundo polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios A e F e uma interação entre os domínios B e G; (f) o terceiro e o quarto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios H e L e uma interação entre os domínios I e M; (g) o primeiro e o terceiro polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios D e J e uma interação entre os domínios E e K para formar a molécula de ligação ao ROR.

[0225] Em uma série de modalidades, (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende um domínio A, um domínio B, um domínio D e um domínio E, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação A-B-D-E, em que o domínio A tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável, e em que o domínio B, o domínio D e o domínio E têm uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; (b) a segunda cadeia polipeptídica compreende um domínio F e um domínio G, em que os domínios estão dispostos, do terminal N para o terminal C, em uma orientação F-G, e em que o domínio F tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável e o domínio G tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; (c) a terceira cadeia polipeptídica compreende um domínio H, um domínio I, um domínio J e um domínio K, em que os domínios estão dispostos, do terminal N para o terminal C, em uma orientação H-I-J-K, e em que o a terceira cadeia polipeptídica compreende o domínio CH1 e o domínio I está no domínio CH1, ou em uma porção do mesmo, o domínio H tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável, e os domínios J e K têm uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; (d) a quarta cadeia polipeptídica compreende um domínio L e um domínio M, em que os domínios estão dispostos, do terminal N para o terminal C, em uma orientação L-M, e em que o domínio L tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável, e em que o domínio M tem uma sequência de aminoácidos CL; (e) o primeiro e o segundo polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios A e F e uma interação entre os domínios B e G; (f) o terceiro e o quarto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios H e L e uma interação entre os domínios I e M; (g) o primeiro e o terceiro polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios D e J e uma interação entre os domínios E e K para formar a molécula de ligação ao ROR.

6.3.1. Domínio A (região variável)

[0226] Nas moléculas de ligação ao ROR, o domínio A tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável. As sequências de aminoácidos do domínio da região variável, conforme descrito na presente invenção, são sequências de aminoácidos do domínio da região variável de um anticorpo, incluindo as sequências de domínio de anticorpo VL e VH. As sequências VL e VH são descritas em maior detalhe abaixo, nas seções 0 e 0, respectivamente. Em uma modalidade preferencial, o domínio A tem uma sequência de domínio de anticorpo VL e o domínio F tem uma sequência de domínio de anticorpo VH.

6.3.1.1. Regiões VL

[0227] As sequências de aminoácidos da VL úteis nas moléculas de ligação ao ROR descritas na presente invenção são sequências de domínio variável da cadeia leve do anticorpo. Em uma disposição típica, em anticorpos naturais e nas construções de anticorpos descritas na presente invenção, uma sequência de aminoácidos da VL específica se associa com uma sequência de aminoácidos da VH para formar um sítio de ligação ao antígeno. Em várias modalidades, as sequências de aminoácidos da VL são sequências de mamíferos, incluindo sequências humanas, sequências sintetizadas, ou combinações de sequências humanas, de mamíferos não humanos, de mamíferos e/ou sintetizadas, conforme descrito em mais detalhes abaixo nas seções 0 e 0.

[0228] Em várias modalidades, as sequências de aminoácidos da VL são sequências mutantes de sequências que ocorrem na natureza. Em certas modalidades, as sequências de aminoácidos da VL são as sequências do domínio variável da cadeia leve lambda (λ). Em certas modalidades, as sequências de aminoácidos da VL são sequências do domínio variável da cadeia leve kappa (κ). Em uma modalidade preferencial, as sequências de aminoácidos da VL são sequências do domínio variável da cadeia leve kappa (κ).

[0229] Nas moléculas de ligação ao ROR descritas na presente invenção, o terminal C do domínio A está ligado ao terminal N do domínio B. Em certas modalidades, o domínio A tem uma sequência de aminoácidos VL que é modificada por mutação em seu C-terminal na junção entre o domínio A e o domínio B, conforme descrito em mais detalhes abaixo na Seção 0 e no exemplo 6.

6.3.1.2. Regiões determinantes da complementaridade

[0230] As sequências de aminoácidos da VL compreendem sequências altamente variáveis denominadas “regiões determinantes da complementaridade” (CDRs), tipicamente três CDRs (CDR1, CD2 e CDR3). Em várias modalidades, as CDRs são sequências de mamíferos, incluindo, mas sem se limitar, a sequências de camundongo, rato, hamster, coelho, camelo, burro, cabra e humanas. Em uma modalidade preferencial, as CDRs são sequências humanas. Em várias modalidades, as CDRs são sequências que ocorrem naturalmente. Em várias modalidades, as CDRs são sequências que ocorrem na natureza que foram modificadas por mutação para alterar a afinidade de ligação do sítio de ligação ao antígeno para um antígeno ou epítopo particular. Em certas modalidades, as CDRs que ocorrem na natureza foram modificadas por mutação em um hospedeiro in vivo através da maturação de afinidade e da hipermutação somática. Em certas modalidades, as CDRs foram modificadas por mutação in vitro através de métodos incluindo, mas sem se limitar, à mutagênese por PCR e mutagênese química. Em várias modalidades, as CDRs são sequências sintetizadas, incluindo, mas sem se limitar, às CDRs obtidas a partir de bibliotecas de CDR de sequência aleatória e bibliotecas de CDR projetadas racionalmente.

6.3.1.3. Regiões de estrutura e enxertamento com CDR

[0231] As sequências de aminoácidos da VL compreendem sequências da “região de estrutura” (FR). As FRs são geralmente regiões de sequência conservadas que atuam como uma estrutura para CDRs intercalados (consulte a seção

0.),tipicamente em uma disposição FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FR4 (do terminal N para o terminal C). Em várias modalidades, as FRs são sequências de mamíferos, incluindo, mas sem se limitar, a sequências de camundongo, rato, hamster, coelho, camelo, burro, cabra e humanas. Em uma modalidade preferencial, as FRs são sequências humanas. Em várias modalidades, as FRs são sequências que ocorrem na natureza. Em várias modalidades, as FRs são sequências sintetizadas, incluindo, mas sem se limitar, a sequências racionalmente projetadas.

[0232] Em várias modalidades, as FRs e as CDRs são ambas da mesma sequência de domínio variável que ocorre na natureza. Em várias modalidades, as FRs e as CDRs são de diferentes sequências de domínio variável, em que as CDRs são enxertadas sobre a estrutura FR com os CDRs proporcionando especificidade para um antígeno específico. Em certas modalidades, os CDRs enxertados são todos derivados da mesma sequência de domínio variável que ocorre na natureza. Em certas modalidades, os CDRs enxertados são derivados de diferentes sequências de domínio variável. Em certas modalidades, as CDRs enxertadas são sequências sintetizadas, incluindo, mas sem se limitar, às CDRs obtidas a partir de bibliotecas de CDR de sequência aleatória e bibliotecas de CDR projetadas racionalmente. Em certas modalidades, as Frs e as CDRs enxertados são da mesma espécie. Em certas modalidades, as Frs e as CDRs enxertadas são de espécies diferentes. Em uma modalidade de CDR enxertada preferencial, um anticorpo é “humanizado”, onde as CDRs enxertadas são sequências de mamíferos não humanos, incluindo, mas sem se limitar, a sequências de camundongo, rato, hamster, coelho, camelo, burro e cabra, e as FRs são sequências humanas. Anticorpos humanizados são discutidos com mais detalhes na Patente Norte-Americana No. 6,407,213, cuja totalidade é incorporada neste documento por referência, em relação a tudo o que ensina. Em várias modalidades, porções ou sequências específicas de FRs de uma espécie são usadas para substituir porções ou sequências específicas das FRs de outra espécie.

6.3.1.4. Regiões da VH

[0233] As sequências de aminoácidos da VH nas moléculas de ligação ao ROR descritas na presente invenção são sequências de domínio variável da cadeia pesada do anticorpo. Em uma disposição típica de anticorpo tanto natural como de moléculas de ligação ao ROR descritas na presente invenção, uma sequência de aminoácidos da VH específica se associa com uma sequência de aminoácidos da VL específica para formar um sítio de ligação ao antígeno. Em várias modalidades, as sequências de aminoácidos da VH são sequências de mamíferos, incluindo sequências humanas, sequências sintetizadas, ou combinações de sequências de mamíferos não humanos, de mamíferos e/ou sintetizadas, conforme descrito em mais detalhes acima nas seções 0 e 0. Em várias modalidades, as sequências de aminoácidos da VH são sequências mutantes de sequências que ocorrem na natureza.

6.3.2. Domínio B (região constante)

[0234] Nas moléculas de ligação ao ROR, o domínio B tem uma sequência de domínio da região constante. As sequências de aminoácidos de domínio da região constante, conforme descrito na presente invenção, são sequências de um domínio da região constante de um anticorpo.

[0235] Em várias modalidades, as sequências da região constante são sequências de mamíferos, incluindo, mas sem se limitar, a sequências de camundongo, rato, hamster, coelho, camelo, burro, cabra e humanas. Em uma modalidade preferencial, as sequências da região constante são sequências humanas. Em certas modalidades, as sequências da região constante são de uma cadeia leve do anticorpo. Em modalidades particulares, as sequências da região constante são de uma cadeia leve lambda ou kappa. Em certas modalidades, as sequências da região constante são de uma cadeia pesada do anticorpo. Em modalidades particulares, as sequências da região constante são uma sequência de cadeia pesada do anticorpo que é um isotipo de IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ou IgM. Em uma modalidade específica, as sequências da região constante são de um isotipo de IgG. Em uma modalidade preferencial, as sequências da região constante são de um isotipo de IgG1. Em modalidades específicas preferenciais, a sequência da região constante é uma sequência CH3. As sequências CH3 são descritas em mais detalhes abaixo na seção 0. Em outras modalidades preferenciais, a sequência da região constante0 é uma sequência CH2 ortóloga. As sequências CH2 ortólogas são descritas em mais detalhes abaixo na seção 0.

[0236] Em modalidades particulares, a sequência da região constante foi modificada para incluir uma ou mais mutações ortogonais. Em uma modalidade preferencial, o domínio B tem uma sequência da região constante que é uma sequência CH3 que compreende mutações ortogonais knob-hole (sinonimamente, “knob-in-hole”, “KIH”), conforme descrito em mais detalhes abaixo na seção 0, e uma mutação S354C ou Y349C que forma uma ponte dissulfeto modificada com um domínio CH3 contendo uma mutação ortogonal, conforme descrito em mais detalhes abaixo na Seção 0. Em algumas modalidades preferenciais, a mutação ortogonal knob-hole é uma mutação T366W.

6.3.2.1. Regiões CH3

[0237] As sequências de aminoácidos CH3, conforme descrito na presente invenção, são sequências do domínio terminal C de uma cadeia pesada do anticorpo.

[0238] Em várias modalidades, as sequências CH3 são sequências de mamíferos, incluindo, mas sem se limitar, a sequências de camundongo, rato, hamster, coelho, camelo, burro, cabra e humanas. Em uma modalidade preferencial, as sequências CH3 são sequências humanas. Em certas modalidades, as sequências CH3 são de um isotipo de IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ou sequências CH4 de um isotipo de IgE ou IgM. Em uma modalidade específica, as sequências CH3 são de um isotipo de IgG. Em uma modalidade preferencial, as sequências CH3 são de um isotipo de IgG1.

[0239] Em certas modalidades, as sequências CH3 são sequências endógenas. Em modalidades particulares, a sequência CH3 são os aminoácidos 244-330 do número de acesso Uniprot P01857. Em várias modalidades, uma sequência CH3 é um segmento de uma sequência CH3 endógena. Em modalidades particulares, uma sequência CH3 tem uma sequência CH3 endógena que não possui os aminoácidos do terminal N G224 e Q225. Em modalidades particulares, uma sequência CH3 tem uma sequência CH3 endógena que não possui os aminoácidos do terminal C P328, G329 e K330. Em modalidades particulares, uma sequência CH3 tem uma sequência CH3 endógena que não tem tanto os aminoácidos do terminal N G224 e Q225 como os aminoácidos do terminal C P328, G329 e K330. Em modalidades preferenciais, uma molécula de ligação ao ROR tem múltiplos domínios que têm sequências CH3, em que uma sequência CH3 pode se referir tanto a uma sequência CH3 endógena completa como a uma sequência CH3 que não tem aminoácidos N-terminais, aminoácidos C-terminais, ou ambos.

[0240] Em certas modalidades, as sequências CH3 são sequências endógenas que têm uma ou mais mutações. Em modalidades particulares, as mutações são uma ou mais mutações ortogonais que são introduzidas em uma sequência CH3 endógena para orientar o emparelhamento específico de sequências CH3 específicas, conforme é descrito em mais detalhes abaixo nas Seções 0-0.

[0241] Em certas modalidades, as sequências CH3 são projetadas para reduzir a imunogenicidade do anticorpo, substituindo aminoácidos específicos de um alotipo por aqueles de outro alotipo, e referidos na presente invenção como mutações de isoalotipo, como descrito em mais detalhes em Stickler et al. (Genes Immun. abril de 2011; 12(3): 213-

221), que está aqui incorporado por referência por tudo o que ensina. Em modalidades particulares, aminoácidos específicos do alotipo G1m1 são substituídos. Em uma modalidade preferencial, as mutações de isoalotipo D356E e L358M são feitas na sequência CH3.

[0242] Em uma modalidade preferencial, o domínio B tem uma sequência de aminoácidos CH3 de IgG1 humana com as seguintes alterações mutacionais: P343V; Y349C; e uma inserção de tripeptídeo, 445P, 446G, 447K. Em outras modalidades preferenciais, o domínio B tem uma sequência CH3 de IgG1 humana com as seguintes alterações mutacionais: T366K; e uma inserção de tripeptídeo, 445K, 446S, 447C. Em ainda outras modalidades preferenciais, o domínio B tem uma sequência CH3 de IgG1 humana com as seguintes alterações mutacionais: Y349C e uma inserção de tripeptídeo, 445P, 446G, 447K.

[0243] Em certas modalidades, o domínio B tem uma sequência CH3 de IgG1 humana com uma mutação 447C incorporada em uma sequência CH3 endógena.

[0244] Nas moléculas de ligação ao ROR descritas na presente invenção, o terminal N do domínio B está ligado ao terminal C do domínio A. Em certas modalidades, o domínio B tem uma sequência de aminoácidos CH3 que é mutada em seu terminal N na junção entre o domínio A e o domínio B, conforme descrito em mais detalhes abaixo na seção 0 e no exemplo 6.

[0245] Nas moléculas de ligação ao ROR, o terminal C do domínio B está ligado ao terminal N do domínio D. Em certas modalidades, o domínio B tem uma sequência de aminoácidos CH3 que é estendida no terminal C na junção entre o domínio B e o domínio D, conforme descrito em mais detalhes abaixo na seção 0.

6.3.2.2. Regiões CH2 ortólogas

[0246] As sequências de aminoácidos CH2, conforme descritas na presente invenção, são sequências do terceiro domínio de uma cadeia pesada do anticorpo, com referência do terminal N ao terminal C. As sequências de aminoácidos CH2, em geral, são discutidas com mais detalhes abaixo na seção

0. Em uma série de modalidades, uma molécula de ligação ao ROR tem mais de um conjunto emparelhado de domínios CH2 que têm sequências CH2, onde um primeiro conjunto tem sequências de aminoácidos CH2 de um primeiro isotipo e um ou mais conjuntos ortólogos de sequências de aminoácidos CH2 de outro isotipo. As sequências de aminoácidos CH2 ortólogas, como descrito aqui, são capazes de interagir com as sequências de aminoácidos CH2 a partir de um isotipo compartilhado, mas não de interagir significativamente com as sequências de aminoácidos CH2 de outro isotipo presente na molécula de ligação ao ROR. Em modalidades particulares, todos os conjuntos de sequências de aminoácidos CH2 são da mesma espécie. Em modalidades preferenciais, todos os conjuntos de sequências de aminoácidos CH2 são sequências humanas de aminoácidos CH2. Em outras modalidades, os conjuntos de sequências de aminoácidos CH2 são de espécies diferentes. Em modalidades particulares, o primeiro conjunto de sequências de aminoácidos CH2 é do mesmo isotipo que os outros domínios não CH2 na molécula de ligação ao ROR. Em uma modalidade específica, o primeiro conjunto tem sequências de aminoácidos CH2 de um isotipo IgG e o um ou mais conjuntos de ortólogos tem sequências de aminoácidos CH2 de um isotipo IgM ou IgE. Em certas modalidades, um ou mais dos conjuntos de sequências de aminoácidos CH2 são sequências CH2 endógenas. Em outras modalidades, um ou mais dos conjuntos de sequências de aminoácidos CH2 são sequências CH2 endógenas que têm uma ou mais mutações. Em modalidades particulares, uma ou mais mutações são mutações ortogonais knob-in-hole, mutações ortogonais de par de carga ou mutações ortogonais hidrofóbicas. As sequências de aminoácidos CH2 ortólogas úteis para as moléculas de ligação ao ROR são descritas com mais detalhes nos pedidos PCT internacionais WO2017/011342 e WO2017/106462, aqui incorporados por referência em suas totalidades.

6.3.3. Domínio D (região constante)

[0247] Nas moléculas de ligação ao ROR descritas na presente invenção, o domínio D tem uma sequência de aminoácidos da região constante. As sequências de aminoácidos da região constante são descritas com mais detalhes na seção 0.

[0248] Em uma série preferencial de modalidades, o domínio D tem uma sequência de aminoácidos CH2. As sequências de aminoácidos CH2, conforme descritas na presente invenção, são sequências de aminoácidos CH2 do terceiro domínio de uma cadeia pesada do anticorpo nativa, com referência do terminal N ao terminal C. Em várias modalidades, as sequências CH2 são sequências de mamíferos, incluindo, mas sem se limitar, a sequências de camundongo, rato, hamster, coelho, camelo, burro, cabra e humanas. Em uma modalidade preferencial, as sequências CH2 são sequências humanas. Em certas modalidades, as sequências CH2 são de um isotipo IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ou IgM. Em uma modalidade preferencial, as sequências CH2 são de um isotipo de IgG1.

[0249] Em certas modalidades, as sequências CH2 são sequências endógenas. Em modalidades particulares, a sequência é formada pelos aminoácidos 111-223 do número de registro Uniprot P01857. Em uma modalidade preferencial, as sequências CH2 possuem um peptídeo da região da dobradiça do terminal N que conecta o segmento do domínio variável do terminal N-domínio constante ao domínio CH2, conforme discutido em mais detalhes abaixo na seção 0.

[0250] Nas moléculas de ligação ao ROR, o terminal N do domínio D está ligado ao terminal C do domínio B. Em certas modalidades, o domínio B tem uma sequência de aminoácidos CH3 que é estendida no terminal C na junção entre o domínio D e o domínio B, conforme descrito em mais detalhes abaixo na seção 0.

6.3.4. Domínio E (região constante)

[0251] Nas moléculas de ligação ao ROR, o domínio E tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante. As sequências de aminoácidos da região constante são descritas com mais detalhes na seção 0.

[0252] Em certas modalidades, a sequência da região constante é uma sequência CH3. As sequências CH3 são descritas em mais detalhes acima na seção 0. Em modalidades particulares, a sequência da região constante foi modificada para incluir uma ou mais mutações ortogonais. Em uma modalidade preferencial, o domínio E tem uma sequência da região constante que é uma sequência CH3 que compreende mutações ortogonais knob-hole (sinonimamente, “knob-in- hole”, “KIH”), conforme descrito em mais detalhes abaixo na seção 0, e uma mutação S354C ou Y349C que forma uma ponte dissulfeto modificada com um domínio CH3 contendo uma mutação ortogonal, conforme descrito em mais detalhes abaixo na seção

0. Em algumas modalidades preferenciais, a mutação ortogonal knob-hole é uma mutação T366W.

[0253] Em certas modalidades, a sequência do domínio da região constante é uma sequência CH1. Em modalidades particulares, a sequência de aminoácidos CH1 do domínio E é a única sequência de aminoácidos CH1 na molécula de ligação ao ROR. Em certas modalidades, o terminal N do domínio CH1 está conectado ao terminal C de um domínio CH2, conforme é descrito em mais detalhes abaixo em 0. Em certas modalidades, a sequência da região constante é uma sequência CL. Em certas modalidades, o terminal N do domínio CL está conectado ao terminal C de um domínio CH2, conforme é descrito em mais detalhes abaixo em 0. As sequências CH1 e CL são descritas em mais detalhes na seção 0.

6.3.5. Domínio F (região variável)

[0254] Nas moléculas de ligação ao ROR, o domínio F tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável. As sequências de aminoácidos do domínio da região variável, como discutido em mais detalhes na seção [0225], são sequências de aminoácidos do domínio da região variável de um anticorpo, incluindo sequências de domínio de anticorpo VL e VH. As sequências VL e VH são descritas em mais detalhes abaixo, nas seções 0 e 0, respectivamente. Em uma modalidade preferencial, o domínio F tem uma sequência de domínio de anticorpo VH.

6.3.6. Domínio G (região constante)

[0255] Nas moléculas de ligação ao ROR, o domínio G tem uma sequência de aminoácidos da região constante. As sequências de aminoácidos da região constante são descritas com mais detalhes na seção 0.

[0256] Em modalidades específicas preferenciais, a sequência da região constante é uma sequência CH3. As sequências CH3 são descritas em mais detalhes abaixo na seção

0. Em outras modalidades preferenciais, a sequência da região constante0 é uma sequência CH2 ortóloga. As sequências CH2 ortólogas são descritas em mais detalhes abaixo na seção 0.

[0257] Em certas modalidades preferenciais, o domínio G tem uma sequência CH3 da IgG1 humana com as seguintes alterações mutacionais: S354C; e uma inserção de tripeptídeo, 445P, 446G, 447K. Em algumas modalidades preferenciais, o domínio G tem uma sequência CH3 da IgG1 humana com as seguintes alterações mutacionais: S354C; e uma inserção de tripeptídeo, 445P, 446G, 447K. Em algumas modalidades preferenciais, o domínio G tem uma sequência CH3 da IgG1 humana com as seguintes alterações: L351D; e uma inserção de tripeptídeo de 445G, 446E, 447C.

6.3.7. Domínio H (região variável)

[0258] Nas moléculas de ligação ao ROR, o domínio L tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável. As sequências de aminoácidos do domínio da região variável, como discutido em mais detalhes na seção [0225], são sequências de aminoácidos do domínio da região variável de um anticorpo, incluindo sequências de domínio de anticorpo VL e VH. As sequências VL e VH são descritas em mais detalhes abaixo, nas seções 0 e 0, respectivamente. Em uma modalidade preferencial, o domínio H tem uma sequência de domínio de anticorpo VL.

6.3.8. Domínio I (região constante)

[0259] Nas moléculas de ligação ao ROR, o domínio I tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante. As sequências de aminoácidos do domínio da região constante são descritas em mais detalhes acima na seção 0. Em uma série de modalidades preferenciais das moléculas de ligação ao ROR, o domínio I tem uma sequência de aminoácidos CL. Em outra série de modalidades, o domínio I tem uma sequência de aminoácidos CH1. As sequências de aminoácidos CH1 e CL são descritas em mais detalhes na seção 0.

6.3.8.1. Regiões CH1 e CL

[0260] As sequências de aminoácidos CH1, conforme descritas na presente invenção, são sequências do segundo domínio de uma cadeia pesada do anticorpo, com referência do terminal N ao terminal C. Em certas modalidades, as sequências CH1 são sequências endógenas. Em várias modalidades, as sequências CH1 são sequências de mamíferos, incluindo, mas sem se limitar, a sequências de camundongo, rato, hamster, coelho, camelo, burro, cabra e humanas. Em uma modalidade preferencial, as sequências CH1 são sequências humanas. Em certas modalidades, as sequências CH1 são de um isotipo IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ou IgM. Em uma modalidade preferencial, as sequências CH1 são de um isotipo de IgG1. Em modalidades preferenciais,

a sequência CH1 é formada pelos aminoácidos 1-98 do número de registro Uniprot P01857.

[0261] As sequências de aminoácidos CL úteis nas moléculas de ligação ao ROR descritas na presente invenção são sequências de domínio constante de cadeia leve do anticorpo. Em certas modalidades, as sequências CL são sequências endógenas. Em várias modalidades, as sequências CL são sequências de mamíferos, incluindo, mas sem se limitar, a sequências de camundongo, rato, hamster, coelho, camelo, burro, cabra e humanas. Em uma modalidade preferencial, as sequências CL são sequências humanas.

[0262] Em certas modalidades, as sequências de aminoácidos CL são sequências de domínio constante de cadeia leve lambda (λ). Em modalidades particulares, as sequências de aminoácidos CL são sequências de domínio constantes da cadeia leve lambda humana. Em modalidades preferenciais, a sequência de cadeia leve lambda (λ) é o número de registro Uniprot P0CG04.

[0263] Em certas modalidades, as sequências de aminoácidos CL são sequências do domínio constante de cadeia leve kappa (κ). Em uma modalidade preferencial, as sequências de aminoácidos CL são sequências do domínio constante de cadeia leve kappa (κ) humana. Em uma modalidade preferencial, a sequência de cadeia leve kappa é o número de registro Uniprot P01834.

[0264] Em certas modalidades, a sequência CH1 e as sequências CL são ambas sequências endógenas. Em certas modalidades, a sequência CH1 e as sequências CL compreendem, separadamente, e respectivamente, modificações ortogonais nas sequências CH1 e CL endógenas, conforme discutido abaixo em mais detalhes na seção 0. Deve ser compreendido que as mutações ortogonais na sequência CH1 não eliminam a interação de ligação específica entre o reagente de ligação CH1 e o domínio CH1. No entanto, em algumas modalidades, as mutações ortogonais podem reduzir, embora não eliminar, a interação da ligação específica. As sequências CH1 e CL também podem ser porções das mesmas, seja de uma sequência endógena ou modificada, de tal forma que um domínio com a sequência CH1, ou porção da mesma, possa se associar a um domínio com a sequência CH1, ou porção da mesma. Além disso, a molécula de ligação ao ROR com uma porção das sequências CH1 descritas acima pode ser ligada pelo reagente de ligação CH1.

[0265] Sem desejar se ater à teoria, o domínio CH1 também é único na medida em que a sua dobragem é tipicamente a etapa limitante da taxa na secreção da IgG (Feige et al. Mol Cell. 12 de junho de 2009; 34(5): 569-79; aqui incorporado por referência em sua totalidade). Assim, a purificação das moléculas de ligação ao ROR com base no componente limitante de taxa de CH1 que compreende cadeias polipeptídicas pode fornecer um meio para purificar complexos completos de cadeias incompletas, como por exemplo, purificar complexos com um domínio CH1 limitante de complexos que só têm uma ou mais cadeias compreendendo não CH1.

[0266] Embora a expressão limitante de CH1 possa ser um benefício em alguns aspectos, como discutido, há o potencial para o CH1 limitar a expressão geral das moléculas de ligação ao ROR completas. Assim, em certas modalidades,

a expressão da cadeia polipeptídica compreendendo a(s) sequência(s) CH1 é ajustada para melhorar a eficiência das moléculas de ligação ao ROR formando complexos completos.

Em um exemplo ilustrativo, a razão de um vetor de plasmídeo construído para expressar a cadeia polipeptídica que compreende a(s) sequência(s) CH1 pode ser aumentada em relação aos vetores de plasmídeo construídos para expressar as outras cadeias polipeptídicas.

Em outro exemplo ilustrativo, a cadeia polipeptídica compreendendo a(s) sequência(s) CH1, em comparação com a cadeia polipeptídica compreendendo a(s) sequência(s) CL(s), pode ser a menor das duas cadeias polipeptídicas.

Em outra modalidade específica, a expressão da cadeia polipeptídica compreendendo a(s) sequência(s) CH1 pode ser ajustada controlando qual cadeia polipeptídica tem a(s) sequência(S) CH1. Por exemplo, pode- se manipular a molécula de ligação ao ROR de modo que o domínio CH1 esteja presente em uma cadeia polipeptídica de dois domínios (por exemplo, a 4ª cadeia polipeptídica descrita na presente invenção), em vez da posição nativa da sequência CH1 em uma cadeia polipeptídica de quatro domínios (por exemplo, a 3ª cadeia polipeptídica descrita na presente invenção) para controlar a expressão da cadeia polipeptídica que compreende a(s) sequência(s) CH1. No entanto, em outros aspectos, um nível de expressão relativa de cadeias contendo CH1 que seja muito alto em comparação com as outras cadeias pode resultar em complexos incompletos que possuem a cadeia CH1, mas não em cada uma das outras cadeias.

Assim, em certas modalidades, a expressão da cadeia polipeptídica que compreende a(s) sequência(s) CH1 é ajustada tanto para reduzir a formação de complexos incompletos sem a cadeia contendo CH1, quanto para reduzir a formação de complexos incompletos com a cadeia contendo CH1, mas sem as outras cadeias presentes em um complexo completo.

6.3.8.2. Modificações ortogonais em CH1 e CL

[0267] Em certas modalidades, a sequência CH1 e as sequências CL compreendem, separadamente, e respectivamente, modificações ortogonais nas sequências CH1 e CL endógenas. As mutações ortogonais, em geral, são descritas com mais detalhes abaixo nas seções 0 a 0.

[0268] Em modalidades particulares, as modificações ortogonais em sequências CH1 e CL endógenas são uma ponte dissulfeto modificada selecionada a partir de cisteínas modificadas na posição 138 da sequência CH1 e na posição 116 da sequência CL, na posição 128 da sequência CH1 e na posição 119 da sequência CL, ou na posição 129 da sequência CH1 e na posição 210 da sequência CL, tal como é numerado e discutido com mais detalhes na Patente Norte-Americana No. 8,053,562 e na Patente Norte-Americana No. 9,527,927, sendo cada uma delas incorporada neste documento por referência em suas totalidades. Em uma modalidade preferencial, as cisteínas modificadas estão na posição 128 da sequência CH1 e na posição 118 da sequência CL kappa, conforme numerado pelo índice Eu.

[0269] Em uma série de modalidades preferenciais, as mutações que fornecem aminoácidos de cisteína não endógenos são uma mutação F118C na sequência CL com um A141C correspondente na sequência CH1, ou uma mutação F118C na sequência CL com um L128C correspondente na sequência CH1,

ou mutações S162C na sequência CL com uma mutação P171C correspondente na sequência CH1, conforme numerado pelo índice Eu.

[0270] Em várias modalidades, as mutações ortogonais na sequência CL e na sequência CH1 são mutações de par de carga. Em modalidades específicas, as mutações de par de carga são mutações F118S, F118A ou F118V na sequência CL com um A141L correspondente na sequência CH1 ou uma mutação T129R na sequência CL com um K147D correspondente na sequência CH1, conforme numerado pelo índice Eu e descrito em mais detalhes em Bonisch et al. (Protein Engineering, Design & Selection, 2017, páginas 1-12), aqui incorporado por referência por tudo o que ensina. Em uma série de modalidades preferenciais, as mutações de par de carga são uma mutação N138K na sequência CL com um G166D correspondente na sequência CH1, ou uma mutação N138D na sequência CL com um G166K correspondente na sequência CH1, numerada pelo índice Eu.

6.3.9. Domínio J (CH2)

[0271] Nas moléculas de ligação ao ROR, o domínio J tem uma sequência de aminoácidos CH2. As sequências de aminoácidos CH2 são descritas em mais detalhes acima na seção

0. Em uma modalidade preferencial, a sequência de aminoácidos CH2 tem uma região da dobradiça no terminal N que conecta o domínio J ao domínio I, conforme descrito em mais detalhes abaixo na seção 0.

[0272] Nas moléculas de ligação ao ROR, o terminal C do domínio J está ligado ao terminal N do domínio K. Em modalidades particulares, o domínio J está conectado ao terminal N do domínio K que tem uma sequência de aminoácidos CH1 ou sequência de aminoácidos CL, conforme descrito em mais detalhes abaixo na seção 0.

6.3.10. Domínio K (região constante)

[0273] Nas moléculas de ligação ao ROR, o domínio K tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante. As sequências de aminoácidos do domínio da região constante são descritas em mais detalhes acima na seção 0. Em uma modalidade preferencial, o domínio K tem uma sequência da região constante que é uma sequência CH3 que compreende mutações ortogonais knob-hole, conforme descrito em mais detalhes abaixo na seção 0; mutações de isoalotipo, conforme descrito em mais detalhes acima em 0; e uma mutação S354C ou Y349C que forma uma ponte dissulfeto modificada com um domínio CH3 contendo uma mutação ortogonal, conforme descrito em mais detalhes abaixo na seção 0. Em algumas modalidades preferenciais, as mutações ortogonais knob-hole combinadas com as mutações de isoalotipo são as seguintes alterações mutacionais: D356E, L358M, T366S, L368A e Y407V.

[0274] Em certas modalidades, a sequência do domínio da região constante é uma sequência CH1. Em modalidades particulares, a sequência de aminoácidos CH1 do domínio K é a única sequência de aminoácidos CH1 na molécula de ligação ao ROR. Em certas modalidades, o terminal N do domínio CH1 está conectado ao terminal C de um domínio CH2, conforme é descrito em mais detalhes abaixo em 0. Em certas modalidades, a sequência da região constante é uma sequência CL. Em certas modalidades, o terminal N do domínio CL está conectado ao terminal C de um domínio CH2, conforme é descrito em mais detalhes abaixo em 0. As sequências CH1 e CL são descritas em mais detalhes na seção 0.

6.3.11. Domínio L (região variável)

[0275] Nas moléculas de ligação ao ROR, o domínio L tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável. As sequências de aminoácidos do domínio da região variável, como discutido em mais detalhes na seção [0225], são sequências de aminoácidos do domínio da região variável de um anticorpo, incluindo sequências de domínio de anticorpo VL e VH. As sequências VL e VH são descritas em mais detalhes acima, nas seções 0 e 0, respectivamente. Em uma modalidade preferencial, o domínio L tem uma sequência de domínio de anticorpo da VH.

6.3.12. Domínio M (região constante)

[0276] Nas moléculas de ligação ao ROR, o domínio M tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante. As sequências de aminoácidos do domínio da região constante são descritas em mais detalhes acima na seção 0. Em uma série de modalidades preferenciais das moléculas de ligação ao ROR, o domínio I tem uma sequência de aminoácidos CH1. Em outra série de modalidades preferenciais, o domínio I tem uma sequência de aminoácidos CL. As sequências de aminoácidos CH1 e CL são descritas em mais detalhes na seção

0.

6.3.13. Emparelhamento dos domínios A e F

[0277] Nas moléculas de ligação ao ROR, uma sequência de aminoácidos da VL ou VH do domínio A e uma sequência de aminoácidos da VL ou VH do domínio F estão associadas e formam um sítio de ligação ao antígeno (ABS, da sigla para o termo em inglês Antigen binding site”). O sítio de ligação ao antígeno (ABS) A:F é capaz de se ligar especificamente a um epítopo de um antígeno. A ligação ao antígeno por um ABS é descrita em mais detalhes abaixo na seção 0.

[0278] Em uma variedade de modalidades multivalentes, o ABS formado pelos domínios A e F (A:F) tem a sequência idêntica a um ou mais ABS na molécula de ligação ao ROR e, portanto, tem a mesma especificidade de reconhecimento que um ou mais outros ABS com sequência idêntica dentro da molécula de ligação ao ROR.

[0279] Em várias modalidades multivalentes, o ABS A:F não tem a sequência idêntica a um ou mais outros ABS dentro da molécula de ligação ao ROR. Em certas modalidades, o ABS A:F tem uma especificidade de reconhecimento diferente da do um ou mais outros ABS de sequência não idêntica na molécula de ligação ao ROR. Em modalidades particulares, o ABS A:F reconhece um antígeno diferente daquele reconhecido por pelo menos um outro ABS de sequência não idêntica na molécula de ligação ao ROR. Em modalidades particulares, o ABS A:F reconhece um epítopo diferente de um antígeno que também é reconhecido por pelo menos um outro ABS de sequência não idêntica na molécula de ligação ao ROR. Nessas modalidades, o ABS formado pelos domínios A e F reconhece um epítopo do antígeno, em que um ou mais outros ABS na molécula de ligação ao ROR reconhece o mesmo antígeno, mas não o mesmo epítopo.

6.3.13.1. Ligação do antígeno pelo ABS

[0280] Dizemos que um ABS, e a molécula de ligação ao ROR compreendendo tal ABS, “reconhece” o epítopo (ou de modo mais geral, o antígeno) ao qual o ABS se liga especificamente, e dizemos que o epítopo (ou de modo mais geral, o antígeno) é a “especificação de reconhecimento” ou a “especificidade de ligação” do ABS.

[0281] Diz-se que o ABS se liga ao seu antígeno ou epítopo específico com uma afinidade particular. Conforme descrito na presente invenção, “afinidade” se refere à intensidade da interação de forças intermoleculares não covalentes entre uma molécula e outra. A afinidade, ou seja, a força da interação, pode ser expressa como uma constante de equilíbrio de dissociação (KD), em que um valor kD mais baixo se refere a uma interação mais forte entre as moléculas. Os valores de KD das construções de anticorpo são medidos por métodos bem conhecidos na técnica, incluindo, mas sem se limitar, à interferometria de biocamada (por exemplo, na plataforma Octet/FORTEBIO®), tecnologia de ressonância de plasmônio de superfície (RPS) (por exemplo, Biacore®), e ensaios de ligação celular. Para efeitos na presente invenção, as afinidades são as constantes de equilíbrio de dissociação medidas por interferometria de biocamada usando a plataforma Octet/FORTEBIO®.

[0282] “Ligação específica”, conforme utilizado na presente invenção, se refere a uma afinidade entre um ABS e seu antígeno cognato ou epítopo em que o valor KD está abaixo de 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M ou 10-10M.

[0283] O número de ABS em uma molécula de ligação ao ROR, conforme descrito na presente invenção, define a

“valência” da molécula de ligação ao ROR, como esquematizado na figura 2. Uma molécula de ligação ao ROR com um único ABS é “monovalente”. Uma molécula de ligação ao ROR com vários ABS é considerada “multivalente”. Uma molécula de ligação ao ROR multivalente com dois ABS é “bivalente”. Uma molécula de ligação ao ROR multivalente com três ABS é “trivalente”. Uma molécula de ligação ao ROR multivalente com quatro ABS é “tetravalente”.

[0284] Em várias modalidades multivalentes, toda a pluralidade dos ABS tem a mesma especificidade de reconhecimento. Conforme ilustrado na figura 2, tal molécula de ligação ao ROR é uma construção de ligação “monoespecífica” “multivalente”. Em outras modalidades multivalentes, pelo menos duas dentre a pluralidades de ABS possuem especificidades de reconhecimento diferentes. Tais moléculas de ligação ao ROR são multivalentes e “multiespecíficas”. Em modalidades multivalentes em que os ABS têm, coletivamente, duas especificidades de reconhecimento, a molécula de ligação ao ROR é “biespecífica”. Em modalidades multivalentes em que os ABS têm, coletivamente, três especificidades de reconhecimento, a molécula de ligação ao ROR é “triespecífica”.

[0285] Em modalidades multivalentes em que os ABS têm, coletivamente, uma pluralidade de especificidades de reconhecimento para diferentes epítopos presentes no mesmo antígeno, a molécula de ligação ao ROR é “multiparatópica.” Modalidades multivalentes em que os ABS reconhecem coletivamente dois epítopos no mesmo antígeno são “biparatópicas”.

[0286] Em várias modalidades multivalentes, a multivalência da molécula de ligação ao ROR melhora a avidez da molécula de ligação ao ROR por um alvo específico. Conforme descrito na presente invenção, “avidez” se refere à força geral da interação entre duas ou mais moléculas, por exemplo, uma molécula de ligação ao ROR multivalente para um alvo específico, onde a avidez é a força cumulativa da interação proporcionada pelas afinidades de múltiplos ABS. A avidez pode ser medida pelos mesmos métodos utilizados para determinar a afinidade, como descrito acima. Em certas modalidades, a avidez de uma molécula de ligação ao ROR por um alvo específico é tal que a interação é uma interação de ligação específica, em que a avidez entre duas moléculas tem um valor de KD abaixo de 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M ou 10-10M. Em certas modalidades, a avidez de uma molécula de ligação ao ROR por um alvo específico tem um valor de KD tal que a interação é uma interação de ligação específica, em que uma ou mais afinidades de ABS individuais não tem um valor de KD que se qualifique como uma ligação específica dos seus respectivos antígenos ou epítopos por si só. Em certas modalidades, a avidez é a força da interação cumulativa proporcionada pelas afinidades de múltiplos ABS por antígenos separados em um alvo ou complexo específico compartilhado, como antígenos separados encontrados em uma célula individual. Em certas modalidades, a avidez é a força de interação cumulativa proporcionada pelas afinidades de múltiplos ABS por epítopos separados em um antígeno individual compartilhado.

6.3.14. Emparelhamento de domínios B & G

[0287] Nas moléculas de ligação ao ROR descritas na presente invenção, uma sequência de aminoácidos da região constante do domínio B e uma sequência de aminoácidos da região constante do domínio G estão associadas. As sequências de aminoácidos do domínio da região constante são descritas em mais detalhes acima na seção 0.

[0288] Em uma série de modalidades preferenciais, o domínio B e o domínio G têm sequências de aminoácidos CH3. As sequências CH3 são descritas em mais detalhes acima na seção 0. Em várias modalidades, as sequências de aminoácidos dos domínios B e G são idênticas. Em algumas dessas modalidades, a sequência é uma sequência CH3 endógena.

[0289] Em uma variedade de modalidades, as sequências de aminoácidos dos domínios B e G são diferentes, e compreendem separadamente, e respectivamente, modificações ortogonais em uma sequência CH3 endógena, em que o domínio B interage com o domínio G, e em que nem o domínio B e nem o domínio G interagem significativamente com um domínio CH3 que não tem a modificação ortogonal.

[0290] “Modificações ortogonais” ou sinonimamente, “mutações ortogonais”, conforme descrito na presente invenção, são uma ou mais mutações por manipulação em uma sequência de aminoácidos de um domínio de anticorpo que aumentam a afinidade de ligação de um primeiro domínio tendo modificação ortogonal por um segundo domínio tendo uma modificação ortogonal complementar. Em certas modalidades, as modificações ortogonais diminuem a afinidade de um domínio que tem as modificações ortogonais por um domínio que não tem as modificações ortogonais complementares. Em certas modalidades, as modificações ortogonais são mutações em uma sequência de domínio de anticorpo endógena. Em uma variedade de modalidades, as modificações ortogonais são modificações do terminal N ou do terminal C de uma sequência de domínio de anticorpo endógena, incluindo, mas sem se limitar, a adições ou deleções de aminoácidos. Em modalidades particulares, as modificações ortogonais incluem, mas não se limitam, a pontes dissulfeto modificadas, mutações knob-in- hole e mutações de par de carga, como descrito em mais detalhe abaixo nas seções 0-0. Em modalidades particulares, as modificações ortogonais incluem uma combinação de modificações ortogonais selecionadas, mas não limitadas, a pontes dissulfeto modificadas, mutações knob-in-hole e mutações de par de carga. Em modalidades particulares, as modificações ortogonais podem ser combinadas com substituições de aminoácidos que reduzem a imunogenicidade, como mutações de isoalotipo, conforme descrito em mais detalhes acima na seção 0.

6.3.14.1. Pontes dissulfeto modificadas ortogonais

[0291] Em uma variedade de modalidades, as modificações ortogonais compreendem mutações que geram pontes dissulfeto modificadas entre um primeiro e um segundo domínio. Conforme descrito na presente invenção, “pontes dissulfeto modificadas” são mutações que fornecem aminoácidos de cisteína não endógenos em dois ou mais domínios, de tal forma que uma ligação de dissulfeto não nativa se forma quando os dois ou mais domínios se associam. As pontes dissulfeto modificadas são descritas em mais detalhes em Merchant et al. (Nature Biotech(1998) 16:677-

681), cuja totalidade é incorporada por referência em relação a tudo o que ensina. Em certas modalidades, as pontes dissulfeto modificadas melhoram a associação ortogonal entre domínios específicos. Em uma modalidade particular, as mutações que geram pontes dissulfeto modificadas são uma mutação K392C em um de um primeiro ou segundo domínios CH3, e um D399C no outro domínio CH3. Em uma modalidade preferencial, as mutações que geram pontes dissulfeto modificadas são uma mutação S354C em um de um primeiro ou segundo domínios CH3, e um Y349C no outro domínio CH3. Em outra modalidade preferida, as mutações que geram pontes dissulfeto modificadas são uma mutação 447C no primeiro e no segundo domínios CH3 que são fornecidos pela extensão do terminal C de um domínio CH3 que incorpora uma sequência tripeptídica KSC.

6.3.14.2. Mutações ortogonais knob-in-hole

[0292] Em várias modalidades, as modificações ortogonais compreendem mutações knob-in-hole (sinonimamente, knob-in-hole). Conforme descrito na presente invenção, as mutações knob-hole são mutações que alteram as características estéricas da superfície de um primeiro domínio de modo que o primeiro domínio se associará preferencialmente com um segundo domínio com mutações estéricas complementares relativas à associação com os domínios sem as mutações estéricas complementares. As mutações knob-hole são descritas com mais detalhes na Patente Norte-Americana No. 5,821,333 e na Patente Norte-Americana No. 8,216,805, sendo cada uma delas aqui incorporada em sua totalidade. Em várias modalidades, as mutações knob-hole são combinadas com pontes dissulfeto modificadas, como descrito em mais detalhes em Merchant et al. (Nature Biotech(1998) 16:677-681), incorporado na presente invenção por referência em sua totalidade. Em várias modalidades, as mutações knob- hole, mutações de isoalotipo e mutações dissulfeto por manipulação são combinadas.

[0293] Em certas modalidades, as mutações knob-in- hole são uma mutação T366Y em um primeiro domínio, e uma mutação Y407T em um segundo domínio. Em certas modalidades, as mutações knob-in-hole são um F405A em um primeiro domínio e um T394W em um segundo domínio. Em certas modalidades, as mutações knob-in-hole são uma mutação T366Y e uma F405A em um primeiro domínio, e uma T394W e uma Y407T em um segundo domínio. Em certas modalidades, as mutações knob-in-hole são a mutação T366W em um primeiro domínio e uma Y407A em um segundo domínio. Em certas modalidades, as mutações knob-in- hole combinadas e as mutações dissulfeto por manipulação são mutações S354C e T366W em um primeiro domínio, e uma mutação Y349C, T366S, L368A e AY407V em um segundo domínio. Em uma modalidade preferencial, as mutações knob-in-hole, mutações de isoalotipo e mutações dissulfeto por manipulação combinadas são mutações S354C e T366W em um primeiro domínio, e uma mutação Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A e AY407V em um segundo domínio.

6.3.14.3. Mutações ortogonais de par de carga

[0294] Em várias modalidades, as modificações ortogonais são mutações de par de carga. Conforme utilizado na presente invenção, as mutações de par de carga são mutações que afetam a carga de um aminoácido na superfície de um domínio, de modo que o domínio se associará preferencialmente com um segundo domínio com mutações de par de carga complementares relativas à associação com os domínios sem as mutações de par de carga complementares. Em certas modalidades, as mutações de par de carga melhoram a associação ortogonal entre domínios específicos. As mutações de par de carga estão descritas com mais detalhes na Patente Norte-Americana No. 8,592,562, na Patente Norte-Americana No. 9,248,182, e na Patente Norte-Americana No. 9,358,286, sendo cada uma delas incorporada por referência na presente invenção por tudo o que ensinam. Em certas modalidades, as mutações de par de carga melhoram a estabilidade entre domínios específicos. Em uma modalidade preferencial, as mutações de par de carga são uma mutação T366K em um primeiro domínio, e uma mutação L351D no outro domínio.

6.3.15. Emparelhamento dos domínios E e K

[0295] Em várias modalidades, o domínio E tem uma sequência de aminoácidos CH3.

[0296] Em várias modalidades, o domínio K tem uma sequência de aminoácidos CH3.

[0297] Em várias modalidades, as sequências de aminoácidos dos domínios E e K são idênticas, em que a sequência é uma sequência CH3 endógena.

[0298] Em várias modalidades, as sequências dos domínios E e K são diferentes. Em várias modalidades, as sequências diferentes compreendem separadamente, e respectivamente, modificações ortogonais em uma sequência CH3 endógena, em que o domínio E interage com o domínio K,

e em que nem o domínio E e nem o domínio K interage significativamente com um domínio CH3 que não tem a modificação ortogonal. Em certas modalidades, as modalidades ortogonais incluem, mas não se limitam, a pontes dissulfeto modificadas, mutações knob-in-hole e mutações de par de carga, como descrito em mais detalhes abaixo nas seções 0-

0. Em modalidades particulares, as modificações ortogonais incluem uma combinação de modificações ortogonais selecionadas, mas não limitadas, a pontes dissulfeto modificadas, mutações knob-in-hole e mutações de par de carga. Em modalidades particulares, as modificações ortogonais podem ser combinadas com substituições de aminoácidos que reduzem a imunogenicidade, como mutações de isotipo.

6.3.16. Emparelhamento dos Domínios I e M e dos domínios H e L

[0299] Em várias modalidades, o domínio I tem uma sequência CL e o domínio M tem uma sequência CH1. Em várias modalidades, o domínio H tem uma sequência VL e o domínio L tem uma sequência VH. Em uma modalidade preferencial, o domínio H tem uma sequência de aminoácidos VL, o domínio I tem uma sequência de aminoácidos CL, o domínio L tem uma sequência de aminoácidos VH e o domínio M tem uma sequência de aminoácidos CH1. Em outra modalidade preferencial, o domínio H tem uma sequência de aminoácidos VL, o domínio I tem uma sequência de aminoácidos CL, o domínio L tem uma sequência de aminoácidos VH, o domínio M tem uma sequência de aminoácidos CH1 e o domínio K tem uma sequência de aminoácidos CH3.

[0300] Em uma variedade de modalidades, as sequências de aminoácidos dos domínios I e M compreendem separadamente, e respectivamente, modificações ortogonais em uma sequência endógena, em que o domínio I interage com o domínio M, e em que nem o domínio I e nem o domínio M interagem significativamente com um domínio que não tem a modificação ortogonal. Em uma série de modalidades, as mutações ortogonais no domínio I estão em uma sequência CL e as mutações ortogonais no domínio M estão na sequência CH1. As mutações ortogonais nas sequências CH1 e CL são descritas com mais detalhes acima na seção 0.

[0301] Em uma variedade de modalidades, as sequências de aminoácidos dos domínios H e L compreendem separadamente, e respectivamente, modificações ortogonais em uma sequência endógena, em que o domínio H interage com o domínio L, e em que nem o domínio H e nem o domínio L interagem significativamente com um domínio que não tem a modificação ortogonal. Em uma série de modalidades, as mutações ortogonais no domínio H estão em uma sequência VL e as mutações ortogonais no domínio L estão na sequência VH. Em modalidades específicas, as mutações ortogonais são mutações de par de carga na interface VH/VL. Em modalidades preferenciais, as mutações de par de carga na interface VH/VL são um Q39E na VH com um Q38K correspondente na VL, ou um Q39K na VH com um Q38E correspondente na VL, como descrito em mais detalhes em Igawa et al. (Protein Eng. Des. Sel., 2010, vol. 23, 667-677), aqui incorporado por referência por tudo o que ensina.

[0302] Em certas modalidades, a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, e a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno. Em certas modalidades, a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, e a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno.

6.3.17. Moléculas de ligação ao ROR trivalentes

[0303] Em outra série de modalidades, as moléculas de ligação ao ROR têm três sítios de ligação ao antígeno e são, portanto, denominadas “trivalentes.“

[0304] Com referência à figura 21, em várias modalidades trivalentes, as moléculas de ligação ao ROR compreendem, ainda, uma quinta cadeia polipeptídica, em que (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende ainda um domínio N e um domínio O, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação N-O-A-B-D-E, e em que o domínio N tem uma sequência de aminoácidos VL, o domínio O tem uma sequência de aminoácidos da região constante; (b) a molécula de ligação ao ROR compreende, adicionalmente, uma quinta cadeia polipeptídica, compreendendo: um domínio P e um domínio Q, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação P-Q, e em que o domínio P tem uma sequência de aminoácidos VH e o domínio Q tem uma sequência de aminoácidos constante; e (c) o primeiro e o quinto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios N e P e uma interação entre os domínios O e Q para formar a molécula de ligação ao ROR. Conforme ilustrado na figura 2, essas modalidades trivalentes são denominadas construções trivalentes “2x1”.

[0305] Com referência à figura 26, em uma série adicional de modalidades trivalentes, as moléculas de ligação ao ROR compreendem, adicionalmente, uma sexta cadeia polipeptídica, em que (a) a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda um domínio R e um domínio S, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação R-S-H-I-J-K, e em que o domínio R tem uma sequência de aminoácidos VL e o domínio S tem uma sequência de aminoácidos de domínio constante; (b) a molécula de ligação ao ROR compreende, adicionalmente, uma sexta cadeia polipeptídica, que compreende: um domínio T e um domínio U, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação T-U, e em que o domínio T tem uma sequência de aminoácidos VH e o domínio U tem uma sequência de aminoácidos de domínio constante; e (c) o terceiro e o sexto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios R e T e uma interação entre os domínios S e U para formar a molécula de ligação ao ROR. Conforme ilustrado na figura 2, essas modalidades trivalentes são denominadas construções trivalentes “1x2”.

[0306] Em uma variedade das modalidades, o domínio O é conectado ao domínio A através de um ligante peptídico. Em uma variedade de modalidades, o domínio S é conectado ao domínio H através de um ligante peptídico. Em uma modalidade preferencial, o ligante peptídico que conecta o domínio O ao domínio A, ou conecta o domínio S ao domínio H, é uma sequência de peptídeo GSGSGS com 6 aminoácidos, conforme descrito em mais detalhes na seção 0.

6.3.17.1. Construções biespecíficas trivalentes 2x1 [2(A-A)x1(B)]

[0307] Com referência à figura 21, em uma variedade de modalidades, as sequências de aminoácidos do domínio N e do domínio A são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio H é diferente dos domínios N e A, as sequências de aminoácidos do domínio O e do domínio B são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio I é diferente dos domínios O e B, as sequências de aminoácidos do domínio P e do domínio F são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio L é diferente dos domínios P e F, as sequências de aminoácidos do domínio Q e do domínio G são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio M é diferente dos domínios Q e G; e a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e o domínio N e o domínio P formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno.

6.3.17.2. Construções biespecíficas trivalentes 2x1 [2(A-B)x1(A)]

[0308] Com referência à figura 21, em uma variedade de modalidades, as sequências de aminoácidos do domínio N e do domínio H são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio A é diferente dos domínios N e H, as sequências de aminoácidos do domínio O e do domínio I são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio B é diferente dos domínios O e I, as sequências de aminoácidos do domínio P e do domínio L são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio F é diferente dos domínios P e L, as sequências de aminoácidos do domínio Q e do domínio M são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio G é diferente dos domínios Q e M; e a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e o domínio N e o domínio P formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o segundo antígeno.

6.3.17.2. Construções triespecíficas trivalentes 2x1 [2(A-B)x1(C)]

[0309] Com referência à figura 21, em uma variedade de modalidades, as sequências de aminoácidos do domínio N, do domínio A e do domínio H são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio O, do domínio B e do domínio I são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio P, do domínio F e do domínio L são diferentes, e as sequências de aminoácidos do domínio Q, do domínio G e do domínio M são diferentes; e a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e o domínio N e o domínio P formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para um terceiro antígeno.

[0310] Em certas modalidades, o domínio O tem uma sequência da região constante que é um CL de uma cadeia leve kappa e o domínio Q tem uma sequência da região constante que é um CH1 de um isotipo IgG1, como discutido em mais detalhes na seção 0. Em uma modalidade preferencial, o domínio O e o domínio Q possuem sequências CH3, de modo que se associam especificamente entre si, como discutido em mais detalhes acima na seção 0.

6.3.17.4. Construções biespecíficas trivalentes 1x2 [1(A)x2(B-A)]

[0311] Com referência à figura 26, em uma variedade de modalidades, as sequências de aminoácidos do domínio R e do domínio A são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio H é diferente dos domínios R e A, as sequências de aminoácidos do domínio S e do domínio B são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio I é diferente dos domínios S e B, as sequências de aminoácidos do domínio T e do domínio F são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio L é diferente dos domínios T e F, as sequências de aminoácidos do domínio U e do domínio G são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio M é diferente dos domínios U e G, e a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e o domínio R e o domínio T formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno.

6.3.17.5. Construções biespecíficas trivalentes 1x2 [1(A)x2(B-B)]

[0312] Em uma variedade de modalidades, a molécula de ligação ao ROR compreende, ainda, um segundo domínio CH1, ou parte do mesmo. Com referência à figura 26, em modalidades específicas, as sequências de aminoácidos do domínio R e do domínio H são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio A é diferente dos domínios R e H, as sequências de aminoácidos do domínio S e do domínio I são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio B é diferente dos domínios S e I, as sequências de aminoácidos do domínio T e do domínio L são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio F é diferente dos domínios T e L, as sequências de aminoácidos do domínio U e do domínio M são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio G é diferente dos domínios U e M, e a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e o domínio R e o domínio T formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o segundo antígeno.

[0313] Em modalidades particulares, as sequências de aminoácidos do domínio S e domínio I são sequências CH1. Em modalidades particulares, as sequências de aminoácidos do domínio U e do domínio M são sequências CH1.

6.3.17.6. Construções triespecíficas trivalentes 1x2 [1(A)x2(B-C)]

[0314] Com referência à figura 26, em uma variedade de modalidades, as sequências de aminoácidos do domínio R, do domínio A e do domínio H são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio S, do domínio B e do domínio I são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio T, do domínio F e do domínio L são diferentes, e as sequências de aminoácidos do domínio U, do domínio G e do domínio M são diferentes; e a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e o domínio R e o domínio T formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para um terceiro antígeno.

[0315] Em modalidades particulares, o domínio S tem uma sequência da região constante que é um CL de uma cadeia leve kappa e o domínio U tem uma sequência da região constante que é um CH1 de um isotipo IgG1, como discutido em mais detalhes na seção 0. Em uma modalidade preferencial, o domínio S e o domínio U possuem sequências CH3, de modo que se associam especificamente entre si, como discutido em mais detalhes acima na seção 0.

[0316] Em certas modalidades, a molécula de ligação ao ROR compreende, ainda, um segundo domínio CH1, ou parte do mesmo. Em modalidades particulares, as sequências de aminoácidos do domínio S e domínio I são sequências CH1. Em modalidades particulares, as sequências de aminoácidos do domínio U e do domínio M são sequências CH1.

6.3.18. Moléculas de ligação ao tetravalentes 2x2

[0317] Em uma variedade de modalidades, as moléculas de ligação ao ROR têm 4 sítios de ligação ao antígeno e são, portanto, denominadas “tetravalentes”.

[0318] Com referência à figura 34, em uma série adicional de modalidades, as moléculas de ligação ao ROR compreendem, adicionalmente, uma quinta e uma sexta cadeia polipeptídica, em que: (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende, adicionalmente, um domínio N e um domínio O, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação N-O-A-B-D-E; (b) a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda um domínio R e um domínio S, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação R-S-H-I-J-K; (c) a molécula de ligação ao antígeno do ROR compreende, ainda, uma quinta e uma sexta cadeia polipeptídica, em que a quinta cadeia polipeptídica compreende um domínio P e um domínio Q, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação P-Q, e a sexta cadeia polipeptídica compreende um domínio T e um domínio U, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação T-U; e (d) o primeiro e o quinto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios N e P e uma interação entre os domínios O e Q, e o terceiro e o sexto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios R e T e uma interação entre os domínios S e U para formar a molécula de ligação ao ROR.

[0319] Em várias modalidades, o domínio O é conectado ao domínio A através de um ligante peptídico e o domínio S é conectado ao domínio H através de um ligante peptídico. Em uma modalidade preferencial, o ligante peptídico que conecta o domínio O ao domínio A, e conecta o domínio S ao domínio H é uma sequência de peptídeo GSGSGS com 6 aminoácidos, conforme descrito em mais detalhes na seção 0.

6.3.18.1. Construções biespecíficas tetravalentes 2x2

[0320] Com referência à figura 34, em uma série de moléculas de ligação ao ROR biespecíficas tetravalentes 2x2, as sequências de aminoácidos do domínio N e do domínio A são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio H e do domínio R são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio O e do domínio B são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio I e do domínio S são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio P e do domínio F são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio L e do domínio T são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio Q e do domínio G são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio M e domínio U são idênticas; e em que a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, o domínio N e o domínio P formam um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um quarto sítio de ligação ao antígeno específico para o segundo antígeno.

[0321] Com referência à figura 34 em outra série de moléculas de ligação ao ROR biespecíficas tetravalentes 2x2, as sequências de aminoácidos do domínio H e do domínio A são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio N e do domínio R são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio I e do domínio B são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio O e do domínio S são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio L e do domínio F são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio P e do domínio T são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio M e do domínio G são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio Q e do domínio U são idênticas, e em que a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, o domínio N e o domínio P formam um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno, e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um quarto sítio de ligação ao antígeno específico para o segundo antígeno.

6.3.19. Junções de domínio

6.3.19.1. Junções conectando os domínios VL e CH3

[0322] Em uma variedade de modalidades, a sequência de aminoácidos que forma uma junção entre o terminal C de um domínio VL e o terminal N de um domínio CH3 é uma sequência modificada. Em certas modalidades, um ou mais aminoácidos são excluídos ou adicionados no terminal C do domínio VL. Em certas modalidades, a junção que conecta o terminal C de um domínio VL e o terminal N de um domínio CH3 é uma das sequências descritas na tabela 2 abaixo, na seção 0. Em modalidades particulares, o A111 é excluído no terminal C do domínio VL. Em certas modalidades, um ou mais aminoácidos são excluídos ou adicionados no terminal N do domínio CH3. Em modalidades particulares, p343 é excluído no terminal N do domínio CH3. Em modalidades particulares, P343 e R344 são excluídos no terminal N do domínio CH3. Em certas modalidades, um ou mais aminoácidos são excluídos ou adicionados tanto ao terminal C do domínio VL como ao terminal N do domínio CH3. Em modalidades particulares, o A111 é excluído no terminal C do domínio VL e o P343 é excluído no terminal N no domínio CH3. Em uma modalidade preferencial, A111 e V110 são excluídos no terminal C do domínio VL. Em outra modalidade preferencial, A111 e V110 são excluídos no terminal C do domínio VL e o terminal N do domínio CH3 tem uma mutação P343V.

6.3.19.2. Junções conectando os domínios VH e CH3

[0323] Em uma variedade de modalidades, a sequência de aminoácidos que forma uma junção entre o terminal C de um domínio VH e o terminal N de um domínio CH3 é uma sequência modificada. Em certas modalidades, um ou mais aminoácidos são excluídos ou adicionados no terminal C do domínio VH. Em certas modalidades, a junção que conecta o terminal C de um domínio VH e o terminal N de um domínio CH3 é uma das sequências descritas na tabela 3 abaixo, na seção 0. Em modalidades particulares, K117 e G118 são excluídos no terminal C do domínio VH. Em certas modalidades, um ou mais aminoácidos são excluídos ou adicionados no terminal N do domínio CH3. Em modalidades particulares, P343 é excluído no terminal N do domínio CH3. Em modalidades particulares, P343 e R344 são excluídos no terminal N do domínio CH3. Em modalidades particulares, P343, R344 e E345 são excluídos no terminal N do domínio CH3. Em certas modalidades, um ou mais aminoácidos são excluídos ou adicionados tanto ao terminal C do domínio VH como ao terminal N do domínio CH3. Em uma modalidade preferencial, T116, K117 e G118 são excluídos no terminal C do domínio VH.

6.3.19.3. Junções conectando o terminal C CH3 ao terminal N CH2 (dobradiça)

[0324] Nas moléculas de ligação ao ROR descritas na presente invenção, o terminal N do domínio CH2 tem uma sequência de aminoácidos da região da “dobradiça”. Conforme utilizado na presente invenção, as regiões da dobradiça são sequências de uma cadeia pesada do anticorpo que ligam o segmento do domínio variável-domínio constante do terminal N de um anticorpo e um domínio CH2 de um anticorpo. Além disso, a região da dobradiça normalmente fornece tanto flexibilidade entre o segmento do domínio variável-domínio constante do terminal N e o domínio CH2, bem como porções da sequência de aminoácidos que formam pontes dissulfeto entre cadeias pesadas (por exemplo, a primeira e a terceira cadeias polipeptídicas). Conforme utilizado na presente invenção, a sequência de aminoácidos da região da dobradiça é a SEQ ID NO: 56.

[0325] Em uma variedade de modalidades, uma sequência de aminoácidos CH3 é estendida no terminal C na junção entre o terminal C do domínio CH3 e o terminal N de um domínio CH2. Em certas modalidades, uma sequência de aminoácidos CH3 é estendida no terminal C na junção entre o terminal C do domínio CH3 e uma região da dobradiça, que por sua vez está conectada ao terminal N de um domínio CH2. Em uma modalidade preferencial, a sequência de aminoácidos CH3 é estendida inserindo uma sequência tripeptídica PGK, seguido pela porção DKTHT de uma região da dobradiça daIgG1.

[0326] Em uma modalidade particular, a extensão no terminal C do domínio CH3 incorpora sequências de aminoácidos que podem formar uma ligação dissulfeto com extensão ortogonal no terminal C de outro domínio CH3. Em uma modalidade preferencial, a extensão no terminal C do domínio CH3 incorpora uma sequência tripeptídica KSC que é seguida pela porção DKTHT de uma região da dobradiça da IgG1 que forma uma ligação dissulfeto com a extensão ortogonal no terminal C de outro domínio CH3 que incorpora uma porção GEC de uma cadeia leve kappa.

6.3.19.4. Junções conectando o terminal C CL e o terminal N CH2 (dobradiça)

[0327] Em uma variedade de modalidades, uma sequência de aminoácidos CL é conectada através de seu terminal C a uma região da dobradiça que, por sua vez, está conectada ao terminal N de um domínio CH2. As sequências da região da dobradiça são descritas com mais detalhes acima na seção 0. Em uma modalidade preferencial, a sequência de aminoácidos da região da dobradiça é a SEQ ID NO: 56.

6.3.19.5. Junções conectando o terminal C CH2 ao domínio da região constante

[0328] Em várias modalidades, uma sequência de aminoácidos CH2 está conectada através de seu terminal C ao terminal N de um domínio da região constante. As regiões constantes são descritas com mais detalhes acima na seção 0. Em uma modalidade preferencial, a sequência CH2 é conectada a uma sequência CH3 através de sua sequência endógena. Em outras modalidades, a sequência CH2 está conectada a uma sequência CH1 ou CL. Exemplos que discutem a conexão de uma sequência CH2 a uma sequência CH1 ou CL são descritos com mais detalhes na Patente Norte-Americana No. 8,242,247, que está incorporada por meio deste documento em sua totalidade.

6.3.19.6. Junções conectando o domínio O ao domínio A ou o domínio S ao domínio H em moléculas trivalentes e tetravalentes

[0329] Em várias modalidades, as cadeias pesadas dos anticorpos (por exemplo, a primeira e terceira cadeias polipeptídicas) são estendidas em seus terminais N para incluir domínios adicionais que fornecem ABS adicionais. Com referência à figura 21, à figura 26 e à figura 34, em certas modalidades, o terminal C da sequência de aminoácidos de domínio da região constante de um domínio O e/ou de um domínio S está conectado ao terminal N da sequência de aminoácidos de domínio da região variável de um domínio A e/ou de um domínio H, respectivamente. Em algumas modalidades preferenciais, o domínio da região constante é uma sequência de aminoácidos CH3 e o domínio da região variável é uma sequência de aminoácidos da VL. Em algumas modalidades preferenciais, o domínio da região constante é uma sequência de aminoácidos CL e o domínio da região variável é uma sequência de aminoácidos VL. Em certas modalidades, o domínio da região constante está conectado ao domínio da região variável através de um ligante peptídico. Em uma modalidade preferencial, o ligante peptídico é uma sequência de peptídeo GSGSGS com 6 aminoácidos.

[0330] Em uma variedade de modalidades, as cadeias leves dos anticorpos (por exemplo, a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas) são estendidas em seus terminais N para incluir segmentos de domínio variável-domínio constante adicionais de um anticorpo. Em certas modalidades, o domínio da região constante é uma sequência de aminoácidos CH1 e o domínio da região variável é uma sequência de aminoácidos VH.

6.4. Moléculas de ligação ao ROR bivalentes específicas

[0331] Em um aspecto adicional, são fornecidas moléculas de ligação ao ROR bivalentes.

[0332] Com referência à figura 3, em uma série de modalidades, as moléculas de ligação ao ROR compreendem uma primeira, segunda, terceira e quarta cadeias polipeptídicas, em que (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende um domínio A, um domínio B, um domínio D e um domínio E, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação A-B-D-E, e o domínio A tem uma sequência de aminoácidos da VL, o domínio B tem uma sequência de aminoácidos CH3, o domínio D tem uma sequência de aminoácidos

CH2, e o domínio E tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; (b) a segunda cadeia polipeptídica compreende um domínio F e um domínio G, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação F-G, e em que o domínio F tem uma sequência de aminoácidos da VH e o domínio G tem uma sequência de aminoácidos CH3; (c) a terceira cadeia polipeptídica compreende um domínio H, um domínio I, um domínio J e um domínio K, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação H-I-J-K, e em que o domínio H tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável, o domínio I tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante, o domínio J tem uma sequência de aminoácidos CH2, e K tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; (d) a quarta cadeia polipeptídica compreende um domínio L e um domínio M, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação L-M, e em que o domínio L tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região variável e o domínio M tem uma sequência de aminoácidos de domínio da região constante; (e) o primeiro e o segundo polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios A e F, e uma interação entre os domínios B e G; (f) o terceiro e o quarto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios H e L e uma interação entre os domínios I e M; e (g) o primeiro e o terceiro polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios D e J e uma interação entre os domínios E e K para formar a molécula de ligação ao ROR.

[0333] Em uma modalidade preferencial, o domínio E tem uma sequência de aminoácidos CH3, o domínio H tem uma sequência de aminoácidos VL, o domínio I tem uma sequência de aminoácidos CL, o domínio K tem uma sequência de aminoácidos CH3, o domínio L tem uma sequência de aminoácidos VH e o domínio M tem uma sequência de aminoácidos CH1.

[0334] Em certas modalidades, a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, e a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a molécula de ligação ao ROR é uma molécula de ligação ao ROR bivalente biespecífica. Em certas modalidades, a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, e a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno, e a molécula de ligação ao ROR é uma molécula de ligação ao ROR bivalente monoespecífica.

6.4.1. B-body biespecífico bivalente “BC1”

[0335] Com referência à figura 3 e à figura 6, em uma série de modalidades, a molécula de ligação ao ROR tem uma primeira, segunda, terceira e quarta cadeias polipeptídicas, em que (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende um domínio A, um domínio B, um domínio D e um domínio E, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação A-B-D-E, e o domínio A tem uma primeira sequência de aminoácidos VL, o domínio B tem uma sequência de aminoácidos CH3 da IgG1 humana com uma mutação T366K e uma extensão de terminal C incorporando uma sequência tripeptídica KSC que é seguida pela porção DKTHT de uma região da dobradiça da IgG1, o domínio D tem uma sequência de aminoácidos CH2 da IgG1, e o domínio E tem aminoácidos CH3 da IgG1 humana com uma mutação S354C e T366W; (b) a segunda cadeia polipeptídica tem um domínio F e um domínio G, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação F-G, e em que o domínio F tem uma primeira sequência de aminoácidos VH e o domínio G tem uma sequência de aminoácidos CH3 da IgG1, com uma mutação L351D e uma extensão do terminal C incorporando uma porção dissulfeto de aminoácido GEC; (c) a terceira cadeia polipeptídica tem um domínio H, um domínio I, um domínio J e um domínio K, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação H-I-J-K, e em que o domínio H tem uma segunda sequência de aminoácidos VL, o domínio I tem uma sequência de aminoácido Cl kappa humana, o domínio J tem uma sequência de aminoácidos CH2 da IgG1 humana e o K tem uma sequência de aminoácidos CH3 da IgG1 humana com um Y349C, uma mutação D356E, uma L358M, uma T366S, uma L368A e uma Y407V; (d) a quarta cadeia polipeptídica tem um domínio L e um domínio M, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação L- M, e em que o domínio L tem uma segunda sequência de aminoácidos VH e o domínio M tem uma sequência de aminoácidos CH1 da IgG1; (e) o primeiro e o segundo polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios A e F e uma interação entre os domínios B e G; (f) o terceiro e o quarto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios H e L e uma interação entre os domínios I e M; (g) o primeiro e o terceiro polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios D e J e uma interação entre os domínios E e K para formar a molécula de ligação ao ROR; (h) o domínio A e o domínio F formam um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno; e (i) o domínio H e o domínio L formam um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno.

[0336] Em modalidades preferenciais, a primeira cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 8, a segunda cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 9, a terceira cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 10 e a quarta cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 11.

6.4.2. B-body biespecífico bivalente “BC6”

[0337] Com referência à figura 3 e à figura 14, em uma série de modalidades, a molécula de ligação ao ROR tem uma primeira, segunda, terceira e quarta cadeias polipeptídicas, em que (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende um domínio A, um domínio B, um domínio D e um domínio E, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação A-B-D-E, e o domínio A tem uma primeira sequência de aminoácidos VL, o domínio B tem uma sequência de aminoácidos CH3 da IgG1 humana com uma extensão C-terminal incorporando uma sequência tripeptídica KSC que é seguida pela porção DKTHT de uma região da dobradiça da IgG1, o domínio D tem uma sequência de aminoácidos CH2 da IgG1, e o domínio E tem aminoácidos CH3 da IgG1 humana com uma mutação S354C e T366W; (b) a segunda cadeia polipeptídica tem um domínio F e um domínio G, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação F-G, e em que o domínio F tem uma primeira sequência de aminoácidos VH e o domínio G tem uma sequência de aminoácidos CH3 da IgG1, com uma extensão C-terminal incorporando uma porção dissulfeto de aminoácido GEC; (c) a terceira cadeia polipeptídica tem um domínio H, um domínio I, um domínio J e um domínio K, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação H- I-J-K, e em que o domínio H tem uma segunda sequência de aminoácidos VL, o domínio I tem uma sequência de aminoácidos CL kappa humana, o domínio J tem uma sequência de aminoácidos CH2 da IgG1 humana e o K tem uma sequência de aminoácidos CH3 da IgG1 humana com uma mutação Y349C, uma D356E, uma L358M, uma T366S, uma L368A e uma Y407V; (d) a quarta cadeia polipeptídica tem um domínio L e um domínio M, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação L-M, e em que o domínio L tem uma segunda sequência de aminoácidos VH e o domínio M tem uma sequência de aminoácidos da IgG1 humana; (e) o primeiro e o segundo polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios A e F e uma interação entre os domínios B e G; (f) o terceiro e o quarto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios H e L e uma interação entre os domínios I e M; (g) o primeiro e o terceiro polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios D e J e uma interação entre os domínios E e K para formar a molécula de ligação ao ROR; (h) o domínio

A e o domínio F formam um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno; e (i) o domínio H e o domínio L formam um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno.

6.4.3. B-body biespecífico bivalente “BC28”

[0338] Com referência à figura 3 e à figura 16, em uma série de modalidades, a molécula de ligação ao ROR tem uma primeira, segunda, terceira e quarta cadeias polipeptídicas, em que (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende um domínio A, um domínio B, um domínio D e um domínio E, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação A-B-D-E, e o domínio A tem uma primeira sequência de aminoácidos VL, o domínio B tem uma sequência de aminoácidos CH3 da IgG1 humana com uma mutação Y349C e uma extensão de terminal C incorporando uma sequência tripeptídica PGK que é seguida pela porção DKTHT de uma região da dobradiça da IgG1, o domínio D tem uma sequência de aminoácidos CH2 da IgG1, e o domínio E tem aminoácidos CH3 da IgG1 humana com uma mutação S354C e T366W; (b) a segunda cadeia polipeptídica tem um domínio F e um domínio G, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação F-G, e em que o domínio F tem uma primeira sequência de aminoácidos VH e o domínio G tem uma sequência de aminoácidos CH3 da IgG1, com uma mutação S354C e uma extensão do terminal C incorporando uma sequência tripeptídica PGK; (c) a terceira cadeia polipeptídica tem um domínio H, um domínio I, um domínio J e um domínio K, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação H-I-J-K, e em que o domínio H tem uma segunda sequência de aminoácidos VL, o domínio I tem uma sequência de aminoácidos CL kappa humana, o domínio J tem uma sequência de aminoácidos CH2 da IgG1 humana e o K tem uma sequência de aminoácidos CH3 da IgG1 humana com uma mutação Y349C, uma D356E, uma L358M, uma T366S, uma L368A e uma Y407V; (d) a quarta cadeia polipeptídica tem um domínio L e um domínio M, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação L-M, e em que o domínio L tem uma segunda sequência de aminoácidos VH e o domínio M tem uma sequência de aminoácidos CH1 da IgG1; (e) o primeiro e o segundo polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios A e F e uma interação entre os domínios B e G; (f) o terceiro e o quarto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios H e L e uma interação entre os domínios I e M; (g) o primeiro e o terceiro polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios D e J e uma interação entre os domínios E e K para formar a molécula de ligação ao ROR; (h) o domínio A e o domínio F formam um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno; e (i) o domínio H e o domínio L formam um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno.

[0339] Em modalidades preferenciais, a primeira cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 24, a segunda cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 25, a terceira cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 10 e a quarta cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO:

11.

6.4.4. B-body biespecífico bivalente “BC44”

[0340] Com referência à figura 3 e à figura 19, em uma série de modalidades, a molécula de ligação ao ROR tem uma primeira, segunda, terceira e quarta cadeias polipeptídicas, em que (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende um domínio A, um domínio B, um domínio D e um domínio E, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação A-B-D-E, e o domínio A tem uma primeira sequência de aminoácidos VL, o domínio B tem uma sequência de aminoácidos CH3 da IgG1 humana com uma mutação Y349C, uma mutação P343V, e uma extensão de terminal C incorporando uma sequência tripeptídica PGK que é seguida pela porção DKTHT de uma região da dobradiça da IgG1, o domínio D tem uma sequência de aminoácidos CH2 da IgG1 humana, e o domínio E tem aminoácidos CH3 da IgG1 humana com uma mutação S354C e uma mutação T366W; (b) a segunda cadeia polipeptídica tem um domínio F e um domínio G, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação F-G, e em que o domínio F tem uma primeira sequência de aminoácidos VH e o domínio G tem uma sequência de aminoácidos CH3 da IgG1 humana, com uma mutação S354C e uma extensão do terminal C incorporando uma sequência tripeptídica PGK; (c) a terceira cadeia polipeptídica tem um domínio H, um domínio I, um domínio J e um domínio K, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação H-I-J-K, e em que o domínio H tem uma segunda sequência de aminoácidos VL, o domínio I tem uma sequência de aminoácidos CL kappa humana, o domínio J tem uma sequência de aminoácidos CH2 da IgG1 humana e o K tem uma sequência de aminoácidos CH3 da IgG1 humana com uma Y349C, T366S, L368A e aY407V; (d) a quarta cadeia polipeptídica tem um domínio L e um domínio M, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação L-M, e em que o domínio L tem uma segunda sequência de aminoácidos VH e o domínio M tem uma sequência de aminoácidos da IgG1 humana; (e) o primeiro e o segundo polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios A e F e uma interação entre os domínios B e G; (f) o terceiro e o quarto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios H e L e uma interação entre os domínios I e M; e (g) o primeiro e o terceiro polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios D e J e uma interação entre os domínios E e K para formar a molécula de ligação ao ROR; (h) o domínio A e o domínio F formam um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno; e (i) o domínio H e o domínio L formam um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno.

[0341] Em modalidades preferenciais, a primeira cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 32, a segunda cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 25, a terceira cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 10 e a quarta cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO:

11.

6.5. Moléculas de ligação ao ROR trivalentes específicas

6.5.1. B-body biespecífico trivalente 1x2 “BC28-1x2”

[0342] Com referência à seção 0 e à figura 26, em uma série de modalidades, as moléculas de ligação ao ROR compreendem, adicionalmente, uma sexta cadeia polipeptídica, em que (a) a terceira cadeia polipeptídica compreende, adicionalmente, um domínio R e um domínio S, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação R-S-H-I-J-K, e em que o domínio R tem a primeira sequência de aminoácidos VL e p domínio S tem uma sequência de aminoácidos CH3 da IgG1 com uma mutação Y349C e uma extensão no terminal C incorporando uma sequência tripeptídica PGK que é seguida pelo peptídeo ligante GSGSGS conectando o domínio S ao domínio H; (b) a molécula de ligação ao ROR compreende, adicionalmente, uma sexta cadeia polipeptídica, que compreende: um domínio T e um domínio U, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação T-U, e em que o domínio T tem a primeira sequência de aminoácidos VH e domínio U tem uma sequência de aminoácidos CH3 da IgG1 humana com uma mutação S354C e uma extensão no terminal C incorporando uma sequência tripeptídica PGK; (c) o terceiro e o sexto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios R e T e uma interação entre os domínios S e U para formar a molécula de ligação ao ROR, e (d) o domínio R e o domínio T formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno.

[0343] Em modalidades preferenciais, a primeira cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 24, a segunda cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 25, a terceira cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 37, a quarta cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 11 e a sexta cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO:

25.

6.5.2. B-body triespecífico trivalente 1x2 “BC28- 1x1x1a”

[0344] Com referência à seção 0 e à figura 26 e à figura 30, em uma série de modalidades, as moléculas de ligação ao ROR compreendem, adicionalmente, uma sexta cadeia polipeptídica, em que (a) a terceira cadeia polipeptídica compreende, adicionalmente, um domínio R e um domínio S, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação R-S-H-I-J-K, e em que o domínio R tem uma terceira sequência de aminoácidos VL e o domínio S tem uma sequência de aminoácidos CH3 da IgG1 humana com uma mutação T366K e uma extensão no terminal C incorporando uma sequência tripeptídica KSC que é seguida pelo peptídeo ligante GSGSGS conectando o domínio S ao domínio H; (b) a molécula de ligação ao ROR compreende, adicionalmente, uma sexta cadeia polipeptídica, que compreende: um domínio T e um domínio U, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação T-U, e em que o domínio T tem uma terceira sequência de aminoácidos VH e o domínio U tem uma sequência de aminoácidos CH3 da IgG1 humana com uma mutação L351D e uma extensão no terminal C incorporando uma porção dissulfeto de aminoácido GEC; e (c) o terceiro e o sexto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios R e T e uma interação entre os domínios S e U para formar a molécula de ligação ao ROR, e (d) o domínio R e o domínio T formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para um terceiro antígeno.

[0345] Em modalidades preferenciais, a primeira cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 24, a segunda cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 25, a terceira cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 45, a quarta cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO: 11 e a sexta cadeia polipeptídica tem a sequência SEQ ID NO:

53.

6.6. Outras plataformas de molécula de ligação ao ROR

[0346] As várias plataformas de anticorpos descritas acima não são limitantes. Os´ sítios de ligação ao antígeno descritos na presente invenção, incluindo os subconjuntos de CDR específicos, podem ser formatados em qualquer plataforma de moléculas de ligação, incluindo, mas sem se limitar, a anticorpos completos, fragmentos fab, Fvs, scFvs, scFvs em tandem, diacorpos, scdiacorpos, DARTs, tandAbs, minicorpos, VHH de camelídeo e outros fragmentos ou formatos de anticorpo conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Anticorpos e formatos de fragmentos de anticorpos exemplares são descritos em detalhes em Brinkmann et al. (MABS, 2017, Vol. 9, No. 2, 182-212), aqui incorporado por referência por tudo o que ensina.

6.7. Especificidades do antígeno

[0347] Outros antígenos aos quais uma molécula de ligação ao ROR, conforme descrito na presente invenção, podem se ligar especificamente, além de um antígeno do ROR, podem ser escolhidos a partir de uma grande variedade de alvos moleculares. Por exemplo, um sítio ou sítios de ligação ao antígeno podem se ligar, especificamente, ao local ou locais de ligação ao antígeno podem se ligar especificamente ao E-

Cad, CLDN7, FGFR2b, N-Cad, Cad-11, FGFR2c, ERBB2, ERBB3, FGFR1, FOLR1, IGF-Ira, GLP1R, PDGFRa, PDGFRb, EPHB6, ABCG2, CXCR4, CXCR7, integrina-avb3, SPARC, VCAM, ICAM, anexina, ROR1, ROR2, TNFα, CD137, angiopoietina 2, angiopoietina 3, BAFF, beta-amiloide, C5, CA-125, CD147, CD125, CD147, CD152, CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD25, CD274, CD28, CD3, CD30, CD33, CD37, CD4, CD40, CD44, CD44v4, CD44v6, CD44v7, CD50, CD51, CD52, CEA, CSF1R, CTLA-2, DLL4, EGFR, EPCAM, HER3, gangliosídeo GD2, GDF-8, Her2/neu, CD2221, IL-17A, IL-12, IL-23, IL-13, IL-6, IL-23, uma integrina, CD11a, MUC1, Notch, TAG-72, TGFβ, TRAIL-R2, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, VEGFc, hematopoietinas (feixes de quatro hélices) (como EPO (eritropoietina), IL-2 (fator de crescimento de células T), IL-3 (multicolônias CSF), IL-4 (BCGF-1, BSF-1), IL-5 (BCGF- 2), IL-6 IL-4 (IFN-β2, BSF-2, BCDF), IL-7, IL-8, IL-9, IL- 11, IL-13 (P600), G-CSF, IL-15 (fator de crescimento de células T), GM-CSF (fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos), OSM (OM, oncostatina M) e LIF (fator inibitório da leucemia)); interferons (como IFN-γ, IFN-α e IFN-β); superfamília de imunoglobulinas (como B7.1 (CD80) e B7.2 (B70, CD86)); família de TNF (como TNF-α (caquectina), TNF-β (linfotoxina, LT, LT-α), LT-β, Fas, CD27, CD30 e 4-1BBL); e aqueles não atribuídos a uma família em particular (como TGF-β, IL 1α, IL-1β, IL-1 RA, IL-10 (inibidor da síntese de citocina F), IL-12 (fator estimulador de células NK), MIF, IL-16, IL-17 (mCTLA-8) e/ou IL-18 (IGIF, fator indutor de interferon γ)); em modalidades relacionadas a anticorpos biespecíficos, o anticorpo pode se ligar, por exemplo, a dois desses alvos.

Além disso, a porção Fc da cadeia pesada de um anticorpo pode ser usada para alvejar células que expressam o receptor de Fc, como o uso da porção Fc de um anticorpo IgE para alvejar mastócitos e basófilos.

[0348] Outros antígenos aos quais uma molécula de ligação ao ROR, conforme descrito na presente invenção, pode se ligar especificamente, além de um antígeno do ROR, podem ser escolhidos, que se ligam especificamente à família TNF de receptores incluindo, mas sem se limitar, ao TNFR1 (também conhecido como CD120a e TNFRSF1A), TNFR2 (também conhecido como CD120b e TNFRSF1B), TNFRSF3 (também conhecido como LTβR), TNFRSF4 (também conhecido como OX40 e CD134), TNFRSF5 (também conhecido como CD40), TNFRSF6 (também conhecido como FAS e CD95), TNFRSF6B (também conhecido como DCR3), TNFRSF7 (também conhecido como CD27), TNFRSF8 (também conhecido como CD30), TNFRSF9 (também conhecido como 4-1BB), TNFRSF10A (também conhecido como TRAILR1, DR4 e CD26), TNFRSF10B (também conhecido como TRAILR2, DR5 e CD262), TNFRSF10C (também conhecido como TRAILR3, DCR1, CD263), TNFRSF10D (também conhecido como TRAILR4, DCR2 e CD264), TNFRSF11A (também conhecido como RANK e CD265), TNFRSF11B (também conhecido como OPG), TNFRSF12A (também conhecido como FN14, TWEAKR e CD266), TNFRSF13B (também conhecido como TACI e CD267), TNFRSF13C (também conhecido como BAFFR, BR3 e CD268), TNFRSF14 (também conhecido como HVEM e CD270), TNFRSF16 (também conhecido como NGFR, p75NTR e CD271) ou TNFRSF17 (também conhecido como BCMA e CD269), TNFRSF18 (também conhecido como GITR e CD357), TNFRSF19 (também conhecido como TROY, TAJ e TRADE), TNFRSF21 (também conhecido como

CD358), TNFRSF25 (também conhecido como Apo-3, TRAMP, LARD ou WS-1) e EDA2R (também conhecido como XEDAR).

[0349] Outros antígenos aos quais uma molécula de ligação ao ROR, conforme descrito na presente invenção, podem se litar especificamente, além de um antígeno do ROR, podem ser escolhidos a partir de alvos imuno-oncológicos incluindo, mas sem se limitar, aos alvos inibidores do ponto de verificação, como PD1, PDL1, CTLA-4, PDL2, B7-H3, B7-H4, BTLA, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, BY55 e CGEN-15049.

6.8. Outras modificações

[0350] Em uma série adicional de modalidades, a molécula de ligação ao ROR tem modificações adicionais.

6.8.1. Conjugados de anticorpo-fármaco

[0351] Em várias modalidades, a molécula de ligação ao ROR é conjugada com um agente terapêutico (por exemplo, fármaco) para formar um conjugado de molécula de ligação ao ROR-fármaco. Os agentes terapêuticos incluem, mas não se limitam a, agentes quimioterapêuticos, agentes de imageamento (por exemplo, radioisótopos), imunomoduladores (por exemplo, citocinas, quimiocinas ou inibidores de ponto de verificação) e toxinas (por exemplo, agentes citotóxicos). Em certas modalidades, os agentes terapêuticos são ligados à molécula de ligação ao ROR através de um peptídeo ligante, como discutido em mais detalhes abaixo na seção 0.

[0352] Métodos de preparação de conjugados de anticorpo-fármaco (CAFs) que podem ser adaptados para conjugar os fármacos com as moléculas de ligação ao ROR reveladas na presente invenção são descritos, por exemplo,

na Patente Norte-Americana N o. 8,624,003 (método em recipiente), a Patente Norte-Americana No. 8,163,888 (em uma etapa), a Patente Norte-Americana No. 5,208,020 (método em duas etapas), a Patente Norte-Americana No. 8,337,856, a Patente Norte-Americana No. 5,773,001, a patente Norte- Americana N o. 7,829,531, a patente Norte-Americana No. 5,208,020, a patente Norte-Americana No. 7,745,394, WO 2017/136623, WO 2017/015502, WO 2017/015496, WO 2017/015495, WO 2004/010957, WO 2005/077090, WO 2005/082023, WO 2006/065533, WO 2007/030642, WO 2007/103288, WO 2013/173337, WO 2015/057699, WO 2015/095755, WO 2015/123679, WO 2015/157286, WO 2017/165851, WO 2009/073445, WO 2010/068759, WO 2010/138719, WO 2012/171020, WO 2014/008375, WO 2014/093394, WO 2014/093640, WO 2014/160360, WO 2015/054659, WO 2015/195925, WO 2017/160754, Storz (MAbs. 2015, Nov-Dez; 7(6): 989–1009), Lambert et al. (Adv Ther, 2017 34: 1015), Diamantis et al. (British Journal of Cancer, 2016, 114, 362– 367), Carrico et al. (Nat Chem Biol, 2007. 3: 321-2), We et al. (Proc Natl Acad Sci USA, 2009. 106: 3000-5), Rabuka et al. (Curr Opin Chem Biol., 2011 14: 790-6), Hudak et al. (Angew Chem Int Ed Engl., 2012: 4161-5), Rabuka et al. (Nat Protoc., 2012 7:1052-67), Agarwal et al. (Proc Natl Acad Sci USA., 2013, 110: 46-51), Agarwal et al. (Bioconjugate Chem., 2013, 24: 846–851), Barfield et al. (Drug Dev. e D., 2014, 14:34-41), Drake et al. (Bioconjugate Chem., 2014, 25:1331- 41), Liang et al. (J Am Chem Soc., 2014, 136:10850-3), Drake et al. (Curr Opin Chem Biol., 2015, 28:174-80) e York et al. (BMC Biotechnology, 2016, 16(1):23), cada um deles incorporado por referência em sua totalidade, por tudo o que ensinam.

6.8.2. Porções de ligação adicionais

[0353] Em várias modalidades, a molécula de ligação ao ROR tem modificações que compreendem uma ou mais porções de ligação adicionais. Em certas modalidades, as porções de ligação são fragmentos de anticorpo ou formatos de anticorpo incluindo, mas sem se limitar, a anticorpos completos, fragmentos fab, Fvs, scFvs, scFvs em tandem, diacorpos, scdiacorpos, DARTs, tandAbs, minicorpos, VHH de camelídeo e outros fragmentos ou formatos de anticorpos conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Anticorpos e formatos de fragmentos de anticorpos exemplares são descritos em detalhes em Brinkmann et al. (MABS, 2017, Vol. 9, No. 2, 182-212), aqui incorporado por referência por tudo o que ensina.

[0354] Em modalidades particulares, a uma ou mais porções de ligação adicionais são fixadas ao terminal C da primeira ou da terceira cadeia polipeptídica. Em modalidades particulares, a uma ou mais porções de ligação adicionais são fixadas ao terminal C da primeira e terceira cadeia polipeptídica. Em modalidades particulares, a uma ou mais porções de ligação adicionais são fixadas ao terminal C tanto da primeira como da terceira cadeias polipeptídicas. Em certas modalidades, as porções individuais de uma ou mais porções de ligação adicionais são separadamente fixadas ao terminal C da primeira e terceira cadeias polipeptídicas, de modo que as porções formam uma porção de ligação funcional.

[0355] Em modalidades particulares, a uma ou mais porções de ligação adicionais são fixadas ao terminal N de qualquer uma das cadeias polipeptídicas (por exemplo, a primeira, segunda, terceira, quarta, quinta ou sexta cadeias polipeptídicas). Em certas modalidades, porções individuais das porções de ligação adicionais são separadamente fixadas ao terminal N de diferentes cadeias polipeptídicas, de modo que as porções formam a porção de ligação funcional.

[0356] Em certas modalidades, a uma ou mais porções de ligação adicionais são específicas para um antígeno ou epítopo diferente dos ABS dentro da molécula de ligação ao ROR. Em certas modalidades, a uma ou mais porções de ligação adicionais são específicas para o mesmo antígeno ou epítopo do ABS dentro da molécula de ligação ao ROR. Em certas modalidades, em que a modificação é duas ou mais porções de ligação adicionais, as porções de ligação adicionais são específicas para o mesmo antígeno ou epítopo. Em certas modalidades, em que a modificação é duas ou mais porções de ligação adicionais, as porções de ligação adicionais são específicas para diferentes antígenos ou epítopos.

[0357] Em certas modalidades, a uma ou mais porções de ligação adicionais são ligadas à molécula de ligação ao ROR usando métodos in vitro incluindo, mas sem se limitar, a química reativa e sistemas de marcação de afinidade, como discutido em mais detalhes abaixo na seção 0. Em certas modalidades, a uma ou mais porções de ligação adicionais são fixadas À molécula de ligação ao ROR por meio da ligação mediada por Fc (por exemplo, proteína A/G). Em certas modalidades, a uma ou mais porções de ligação adicionais são fixadas à molécula de ligação ao ROR usando técnicas de DNA recombinante, como a codificação da sequência nucleotídica do produto de fusão entre a molécula de ligação ao ROR e as porções de ligação adicionais no mesmo vetor de expressão (por exemplo, plasmídeo).

6.8.3. Grupos funcionais/reativos

[0358] Em várias modalidades, a molécula de ligação ao ROR possui modificações que compreendem grupos funcionais ou grupos quimicamente reativos, que podem ser usados em processos a jusante, como a ligação a porções adicionais (por exemplo, conjugados de fármacos e porções de ligação adicionais, como discutido em mais detalhes acima nas seções 0 e 0) e nos processos de purificação a jusante.

[0359] Em certas modalidades, as modificações são grupos quimicamente reativos, incluindo, mas sem se limitar, aos tióis reativos (por exemplo, grupos reativos à base de maleimida), aminas reativas (por exemplo, grupos reativos à base de N-hidroxissuccinimida, “química de clique” (por exemplo, grupos alquino reativos), e formilglicina contendo aldeídos (FGly). Em certas modalidades, as modificações são grupos funcionais incluindo, mas sem se limitar, às sequências de peptídeos de afinidade (por exemplo, HA, HIS, FLAG, GST, MBP e sistemas Strep etc.). Em certas modalidades, os grupos funcionais ou grupos quimicamente reativos têm uma sequência de peptídeo clivável. Em modalidades particulares, o peptídeo clivável é clivado por meios incluindo, mas sem se limitar, a fotoclivagem, clivagem química, clivagem por protease, condições de redução e condições de pH. Em modalidades particulares, a clivagem da protease é realizada por proteases intracelulares. Em modalidades particulares, a clivagem da protease é realizada por proteases extracelulares ou associadas com a membrana. As terapias ADC que adotam a clivagem da protease são descritas, com mais detalhes, em Choi et al. (Theranostics, 2012; 2(2): 156–

178.), cuja totalidade é incorporada neste documento por referência, em relação a tudo o que ensina.

6.8.4. Função efetora reduzida

[0360] Em certas modalidades, a molécula de ligação ao ROR possui uma ou mais mutações por manipulação na sequência de aminoácidos de um domínio de anticorpo que reduz as funções efetoras naturalmente associadas à ligação do anticorpo. As funções efetoras incluem, mas não se limitam, a funções celulares que resultam de uma ligação ao receptor de Fc a uma porção Fc de um anticorpo, como citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC, também referida como citotoxicidade mediada por célula dependentes de anticorpos), fixação do complemento (por exemplo, ligação ao C1q), fagocitose mediada por células dependentes de anticorpos (ADCP) e opsonização. As mutações por manipulação que reduzem as funções efetoras estão descritas, com mais detalhes, na Publicação Norte-Americana No. 2017/0137530, em Armour, et al. (Eur. J. Immunol. 29(8) (1999) 2613-2624), Shields, et al. (J. Biol. Chem. 276(9) (2001) 6591-6604), e em Oganesyan, et al. (Acta Cristallographica D64 (2008) 700- 704), cada um aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[0361] Em modalidades específicas, a molécula de ligação ao ROR possui uma ou mais mutações por manipulação em uma sequência de aminoácidos de um domínio de anticorpo que reduzem a ligação de uma porção Fc da molécula de ligação ao ROR pelos receptores FcR. Em algumas modalidades, os receptores FcR são receptores FcRγ. Em modalidades particulares, os receptores FcR são os receptores FcγRIIa e/ou FcγRIIIA.

[0362] Em modalidades específicas, a uma ou mais mutações por manipulação que reduzem a função efetora são mutações em um domínio CH2 de um anticorpo. Em várias modalidades, a uma ou mais mutações por manipulação estão na posição L234 e L235 do domínio CH2. Em modalidades particulares, a uma ou mais mutações por manipulação são L234A e L235A do domínio CH2. Em outras modalidades, a uma ou mais mutações por manipulação estão nas posições L234, L235 e P329 do domínio CH2. Em modalidades particulares, a uma ou mais mutações por manipulação são L234A, L235A e P329G do domínio CH2. Em modalidades particulares, a uma ou mais mutações por manipulação são L234A, L235A e P329K do domínio CH2.

6.9. Métodos de purificação

[0363] A presente invenção fornece um método de purificação de uma molécula de ligação ao ROR compreendendo uma plataforma B-Body.

[0364] Em uma série de modalidades, o método compreende as etapas de: i) colocar em contato uma amostra que compreende a molécula de ligação ao ROR com um reagente de ligação CH1, em que a molécula de ligação ao ROR compreende pelo menos uma primeira, segunda, terceira e quarta cadeias polipeptídicas associadas em um complexo, em que o complexo compreende pelo menos um domínio CH1, ou porção do mesmo, e em que o número de domínios CH1 no complexo é pelo menos um a menos do que a valência do complexo, e em que o contato é realizado em condições suficientes para que o reagente de ligação CH1 se ligue ao domínio CH1, ou porção do mesmo; e ii) purificar o complexo de um ou mais complexos incompletos, em que os complexos incompletos não compreendem a primeira, segunda, terceira e quarta cadeias polipeptídicas.

[0365] Em um típico anticorpo que ocorre na natureza, duas cadeias pesadas estão associadas, tendo cada uma delas um domínio CH1 como segundo domínio, numerando do terminal N para o terminal C. Assim, um anticorpo típico tem dois domínios CH1. Os domínios CH1 são descritos com mais detalhes na seção 0. Em várias das moléculas de ligação ao ROR descritas na presente invenção, o domínio CH1 tipicamente encontrado na proteína foi substituído por outro domínio, de tal forma que o número de domínios CH1 na proteína é efetivamente reduzido. Em um exemplo ilustrativo não limitante, o domínio CH1 de um anticorpo típico pode ser substituído por um domínio CH3, gerando uma proteína de ligação ao antígeno com apenas um único domínio CH1.

[0366] As moléculas de ligação ao ROR também podem se referir a moléculas baseadas em arquiteturas de anticorpos que foram modificadas de tal forma que não possuem mais uma arquitetura típica de anticorpo. Por exemplo, um anticorpo pode ser estendido em seu terminal N ou C para aumentar a valência (descrito com mais detalhes na seção 0) da proteína de ligação ao antígeno, e em certos casos, o número de domínios CH1 também é aumentado além dos dois domínios CH1 típicos. Tais moléculas também podem ter um ou mais de seus domínios CH1 substituídos, de tal forma que o número de domínios CH1 na proteína é pelo menos um a menos do que a valência da proteína de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o número de domínios CH1 que são substituídos por outros domínios gera uma molécula de ligação ao ROR com apenas um único domínio CH1. Em outras modalidades, o número de domínios CH1 substituídos por outro domínio gera uma molécula de ligação ao ROR com dois ou mais domínios CH1, mas pelo menos um a menos do que a valência da proteína de ligação ao antígeno. Em modalidades particulares, onde uma molécula de ligação ao ROR tem dois ou mais domínios CH1, os múltiplos domínios CH1 podem estar todos na mesma cadeia polipeptídica. Em outras modalidades particulares, onde uma molécula de ligação ao ROR tem dois ou mais domínios CH1, os múltiplos domínios CH1 podem ser um único domínio CH1 em múltiplas cópias da mesma cadeia polipeptídica presente no complexo completo.

6.9.1. Reagentes de ligação CH1

[0367] Nos métodos de purificação exemplares não limitantes das moléculas de ligação ao ROR, uma amostra que compreende as moléculas de ligação ao ROR entra em contato com os reagentes de ligação ao CH1. Os reagentes de ligação ao CH1, conforme descrito na presente invenção, podem ser qualquer molécula que se ligue especificamente a um epítopo CH1. As várias sequências CH1 que fornecem o epítopo CH1 são descritas com mais detalhes na seção 0, e a ligação específica é descrita em mais detalhes na seção 0.

[0368] Em algumas modalidades, os reagentes de ligação ao CH1 são derivados de proteínas imunoglobulinas e têm um sítio de ligação ao antígeno (ABS) que se liga especificamente ao epítopo CH1. Em modalidades particulares, o reagente de ligação ao CH1 é um anticorpo, também referido como um “anticorpo anti-CH1”. O anticorpo anti-CH1 pode ser derivado de várias espécies.

Em modalidades particulares, o anticorpo anti-CH1 é um anticorpo de mamífero, incluindo, mas sem se limitar, a anticorpos de camundongo, rato, hamster, coelho, camelo, burro, cabra e seres humanos.

Em modalidades específicas, o anticorpo anti-CH1 é um anticorpo de domínio único.

Os anticorpos de domínio único, como descritos na presente invenção, têm um único domínio variável que forma o ABS e se liga especificamente ao epítopo CH1. Anticorpos de domínio único exemplares incluem, mas não se limitam, aos anticorpos de cadeia pesada derivados de camelos e tubarões, como descrito em mais detalhes no pedido internacional WO 2009/011572, aqui incorporado por referência, por tudo o que ensina.

Em uma modalidade preferencial, o anticorpo anti-CH1 é um anticorpo derivado de camelo (também referido como um “anticorpo camelídeo”). Anticorpos camelídeos exemplares incluem, mas não se limitam, à IgG-CH1 humana CaptureSelect™ (ThermoFisher, nº 194320010) e IgA-CH1 humana (ThermoFisher, nº 194311010). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CH1 é um anticorpo monoclonal.

Anticorpos monoclonais são tipicamente produzidos a partir de linhagens celulares produtoras de anticorpos cultivados.

Em outras modalidades, o anticorpo anti-CH1 é um anticorpo policlonal, ou seja, uma coleção de diferentes anticorpos anti-CH1, onde cada um reconhece o epítopo CH1. Os anticorpos policlonais são tipicamente produzidos coletando o soro contendo anticorpo de um animal imunizado com o antígeno de interesse, ou fragmento do mesmo, neste caso o CH1.

[0369] Em algumas modalidades, os reagentes de ligação ao CH1 são moléculas não derivadas de proteínas de imunoglobulina. Exemplos dessas moléculas incluem, mas não se limitam, a aptâmeros, peptoides e aficorpos, como descrito em mais detalhes em Perret e Boschetti (Biochimie, fevereiro de 2018, vol 145: 98-112).

6.9.2. Suportes sólidos

[0370] Em métodos exemplares não limitantes de purificação de moléculas de ligação ao ROR, o reagente de ligação ao CH1 pode ser ligado a um suporte sólido em várias modalidades da invenção. Os suportes sólidos, conforme descritos na presente invenção, se referem a um material ao qual outras entidades podem ser ligadas ou imobilizadas, como por exemplo, o reagente de ligação CH1. Suportes sólidos, também chamados de “transportadores”, são descritos com mais detalhes no pedido internacional WO 2009/011572.

[0371] Em modalidades específicas, o suporte sólido compreende uma esfera ou nanopartícula. Exemplos de esferas e nanopartículas incluem, mas não se limitam, às esferas de agarose, esferas de poliestireno, nanopartículas magnéticas (por exemplo, Dynabeads™, da ThermoFisher), polímeros (por exemplo, dextrana), polímeros sintéticos (por exemplo, Sepharose™) ou qualquer outro material adequado para ligar o reagente de ligação ao CH1. Em modalidades particulares,

o suporte sólido é modificado para permitir a fixação do reagente de ligação ao CH1. Exemplos de modificações de suporte sólido incluem, mas não se limitam, a modificações químicas que formam ligações covalentes com proteínas (por exemplo, grupos aldeído ativados) e modificações que se emparelham especificamente com uma modificação cognata de um reagente de ligação ao CH1 (por exemplo, pares de biotina- estreptavidina, ligações bissulfeto, poli-histidina-níquel, ou modificações de “química de clique”, como pares azido- alquinila).

[0372] Em certas modalidades, o reagente de ligação ao CH1 é ligado ao suporte sólido antes do reagente de ligação ao CH1 entrar em contato com as moléculas de ligação ao ROR, aqui também referidas como uma “resina anti-CH1”. Em algumas modalidades, as resinas anti-CH1 são dispersas em uma solução. Em outras modalidades, as resinas anti-CH1 são “empacotadas” em uma coluna. A resina anti-CH1 é, em seguida, colocada em contato com as moléculas de ligação ao ROR e os reagentes de ligação ao CH1 se ligam especificamente com as moléculas de ligação ao ROR.

[0373] Em outras modalidades, o reagente de ligação ao CH1 é fixado ao suporte sólido após o reagente de ligação ao CH1 entrar em contato com as moléculas de ligação ao ROR. Como uma ilustração não limitante, um reagente de ligação ao CH1 com uma modificação de biotina pode entrar em contato com as moléculas de ligação ao ROR, e posteriormente, a mistura de reagente de ligação ao CH1/molécula de ligação ao ROR pode ser colocada em contato com o suporte sólido modificado com estreptavidina para fixar o reagente de ligação ao CH1 ao suporte sólido, incluindo reagentes de ligação ao CH1 especificamente ligados às moléculas de ligação ao ROR.

[0374] Nos métodos em que os reagentes de ligação ao CH1 são ligados a suportes sólidos, em uma variedade de modalidades, as moléculas de ligação ao ROR ligadas são liberadas, ou “eluídas”, a partir do suporte sólido formando um eluato com as moléculas de ligação ao ROR. Em algumas modalidades, as moléculas de ligação ao ROR ligadas são liberadas através da inversão das modificações emparelhadas (por exemplo, redução da ligação dissulfeto), adição de um reagente para competir com as moléculas de ligação ao ROR (por exemplo, adição de imidazol que compete com uma poli- histidina para se ligar ao níquel), clivagem das moléculas de ligação ao ROR (por exemplo, uma porção clivável pode ser incluída na modificação) ou, de outra forma, interferência com a ligação específica do reagente de ligação ao CH1 para a molécula de ligação ao ROR. Os métodos que interferem com a ligação específica incluem, mas não se limitam, a colocar em contato as moléculas de ligação ao ROR ligadas aos reagentes de ligação ao CH1 com uma solução de pH baixo. Na modalidade preferencial, a solução de pH baixo compreende ácido acético 0,1 M em pH 4,0. Em outras modalidades, as moléculas de ligação ao ROR ligadas podem ser colocadas em contato com uma faixa de soluções de baixo pH, ou seja, com um “gradiente”.

6.9.3. Purificação adicional

[0375] Em algumas modalidades dos métodos não limitantes exemplares, uma única iteração do método utilizando as etapas de contato com as moléculas de ligação ao ROR com os reagentes de ligação ao CH1, seguido pela eluição das moléculas de ligação ao ROR, é usada para purificar as moléculas de ligação ao ROR dos um ou mais complexos incompletos. Em modalidades particulares, nenhuma outra etapa de purificação é realizada. Em outras modalidades, uma ou mais etapas de purificação adicionais são realizadas para purificar ainda mais as moléculas de ligação ao ROR dos um ou mais complexos incompletos. A uma ou mais etapas de purificação adicionais incluem, mas não se limitam, à purificação das moléculas de ligação ao ROR com base em outras características proteicas, como tamanho (por exemplo, cromatografia de exclusão por tamanho), carga (por exemplo, cromatografia de troca iônica) ou hidrofobicidade (por exemplo, cromatografia de interação hidrofóbica). Em uma modalidade preferencial, é realizada uma análise de cromatografia de troca catiônica adicional. Além disso, as moléculas de ligação ao ROR podem ser adicionalmente purificadas repetindo o contato das moléculas de ligação ao ROR com os reagentes de ligação ao CH1, como descrito acima, bem como modificando o método de purificação do CH1 entre as iterações, por exemplo, usando uma eluição em etapas para a primeira iteração e uma eluição de gradiente para uma eluição subsequente.

6.9.4. Montagem e pureza dos complexos

[0376] Nas modalidades da presente invenção, pelo menos quatro cadeias polipeptídicas distintas se associam para formar um complexo completo, por exemplo, a molécula de ligação ao ROR. No entanto, complexos incompletos também podem se formar que não contenham pelo menos quatro cadeias polipeptídicas distintas. Por exemplo, complexos incompletos podem se formar que tenham apenas uma, duas ou três cadeias polipeptídicas. Em outros exemplos, um complexo incompleto pode conter mais de três cadeias polipeptídicas, mas não conter as pelo menos quatro cadeias polipeptídicas distintas, por exemplo, o complexo incompleto se associa inapropriadamente a mais de uma cópia de uma cadeia polipeptídica distinta. O método da invenção purifica o complexo, por exemplo, a molécula de ligação ao ROR completamente montada, a partir de complexos incompletos.

[0377] Os métodos para avaliar a eficácia e a eficiência das etapas de purificação são bem conhecidos pelos técnicos versados no assuntoe incluem, mas não se limitam, a análise por SDS-PAGE, cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão por tamanho e espectrometria de massa. A pureza também pode ser avaliada de acordo com uma variedade de critérios. Exemplos de critérios incluem, mas não se limitam, a: 1) avaliar a porcentagem da proteína total em um eluato que seja fornecida pela molécula de ligação ao ROR completamente montada, 2) avaliar o enriquecimento em vezes ou o aumento porcentual do método de purificação dos produtos desejados, por exemplo, comparando a proteína total fornecida pela molécula de ligação ao ROR completamente montada no eluato com a de uma amostra inicial, 3) avaliar o porcentual de proteína total ou a diminuição porcentual de produtos indesejados, por exemplo, os complexos incompletos descritos acima, incluindo determinar a porcentagem ou a diminuição porcentual de produtos indesejados específicos (por exemplo, cadeias polipeptídicas únicas não associadas, dímeros de qualquer combinação das cadeias polipeptídicas ou trímeros de qualquer combinação das cadeias polipeptídicas). A pureza pode ser avaliada após qualquer combinação dos métodos descritos na presente invenção. Por exemplo, a pureza pode ser avaliada após uma única iteração do uso do reagente anti-ligação ao CH1, conforme descrito na presente invenção, ou após etapas adicionais de purificação, conforme descrito em mais detalhes na seção 0. A eficácia e eficiência das etapas de purificação também podem ser usadas para comparar os métodos descritos usando o reagente anti-ligação ao CH1 com outros métodos de purificação conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, como a purificação da proteína A.

6.10. Métodos de fabricação

[0378] As moléculas de ligação ao ROR descritas na presente invenção podem ser prontamente fabricadas por expressão usando as abordagens de tradução de livre de células padrão, transfecção transitória e transfecção estável atualmente usadas para a fabricação de anticorpos. Em modalidades específicas, as células Expi293 (ThermoFisher) podem ser usadas para a produção de moléculas de ligação ao ROR usando protocolos e reagentes da ThermoFisher, como ExpiFectamine, ou outros reagentes conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, como a polietilenimina, conforme descrito em detalhes em Fang et al. (Biological Procedures Online, 2017, 19:11), aqui incorporado por referência por tudo o que ensina.

[0379] Como é adicionalmente descrito nos exemplos abaixo, as proteínas expressas podem ser prontamente separadas das proteínas indesejadas e complexos proteicos usando uma resina de afinidade de CH1, como a resina de CH1 CaptureSelect e o protocolo fornecido da ThermoFisher. Outras estratégias de purificação incluem, mas não se limitam, ao uso dos reagentes de proteína A, proteína G ou proteína A/G. A purificação adicional pode ser realizada usando cromatografia de troca iônica, como é rotineiramente utilizado na técnica.

6.11. Composições farmacêuticas

[0380] Em outro aspecto, são fornecidas composições farmacêuticas que compreendem a molécula de ligação ao ROR, conforme descrito na presente invenção, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em modalidades típicas, a composição farmacêutica é estéril.

[0381] Em várias modalidades, a composição farmacêutica compreende a molécula de ligação ao ROR a uma concentração de 0,1 mg/mL a 100 mg/mL. Em modalidades específicas, a composição farmacêutica compreende a molécula de ligação ao ROR a uma concentração de 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 1,5 mg/mL, 2 mg/mL, 2,5 mg/mL, 5 mg/mL, 7,5 mg/mL, ou 10 mg/mL. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende a molécula de ligação ao ROR a uma concentração de mais de 10 mg/mL. Em certas modalidades, a molécula de ligação ao ROR está presente em uma concentração de 20 mg/mL, 25 mg/mL, 30 mg/mL, 35 mg/mL, 40 mg/mL, 45 mg/mL ou até mesmo

50 mg/mL ou mais. Em modalidades particulares, a molécula de ligação ao ROR está presente em uma concentração de mais de 50 mg/mL.

[0382] Em várias modalidades, as composições farmacêuticas são descritas com mais detalhes na Patente Norte-Americana No. 8,961,964, na Patente Norte-Americana No. 8,945,865, na Patente Norte-Americana No. 8,420,081, na Patente Norte-Americana No. 6,685,940, na Patente Norte- Americana N o. 6,171,586, na Patente Norte-Americana No. 8,821,865, na Patente Norte-Americana No. 9,216,219, no pedido Norte-Americano No. 10/813,483, WO 2014/066468, WO 2011/104381 e WO 2016/180941, cada uma dos quais estando aqui incorporada em sua totalidade.

6.12. Métodos de tratamento

[0383] Em outro aspecto, são fornecidos métodos de tratamento, que compreendem a administração de uma molécula de ligação ao ROR (por exemplo, anticorpo), conforme descrito na presente invenção, a um indivíduo, em uma quantidade eficaz para tratar o indivíduo. Tais moléculas de ligação ao antígeno do ROR são úteis no tratamento de cânceres expressando ROR, incluindo cânceres que expressam um antígeno ao ROR1, cânceres que expressam um antígeno ao ROR2 e/ou cânceres que expressam um antígeno ao ROR1 e um antígeno ao ROR2.

[0384] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente revelação pode ser usado para tratar uma variedade de cânceres. O câncer pode ser um câncer de bexiga, sangue (leucemia mieloide [aguda e crônica], leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, doenças mieloproliferativas, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica), de osso, medula óssea, cérebro (astrocitoma, meduloblastoma, glioma, ependimoma, germinoma [pinealoma], glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, schwannoma, retinoblastoma, tumores congênitos), de mama, cólon, esôfago (carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, leiomiossarcoma, linfoma), gastrointestinal, de gengiva, cabeça, rim (adenocarcinoma, tumor de Wilm [nefroblastoma], linfoma, leucemia, carcinoma de células renais), de fígado, pulmão, nasofaringe, pescoço, ovário, próstata (adenocarcinoma, sarcoma, câncer de próstata resistente à castração), pele, estômago (carcinoma, linfoma, leiomiossarcoma), de testículo (seminoma, teratoma, carcinoma embrionário, teratocarcinoma, coriocarcinoma, sarcoma, carcinoma celular intersticial, fibroma, fibroadenoma, tumores adenomatoides, lipoma), de língua ou útero.

Em algumas modalidades, o câncer pode ser uma neoplasia, maligna; carcinoma; carcinoma indiferenciado; carcinoma de células gigantes e fusiformes; carcinoma de células pequenas; carcinoma papilar; carcinoma de células escamosas; carcinoma linfoepitelial; carcinoma basocelular; carcinoma de pilomatriz; carcinoma de células transicionais; carcinoma de células transicionais papilares; adenocarcinoma; gastrinoma, maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular combinado e colangiocarcinoma; adenocarcinoma trabecular; carcinoma adenoide cístico; adenocarcinoma em pólipo adenomatoso; adenocarcinoma, polipose familiar do cólon; carcinoma sólido; tumor carcinoide, maligno; adenocarcinoma bronquioalveolar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromófobo; carcinoma acidófilo; adenocarcinoma oxifílico; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de células claras; carcinoma de células granulares; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma papilar e folicular; carcinoma esclerosante não encapsulante; carcinoma adrenocortical; carcinoma endometroide; carcinoma de apêndice cutâneo; adenocarcinoma apócrino; adenocarcinoma sebáceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide; cistadenocarcinoma; cistadenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma seroso papilífero; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de células de anel de sinete; carcinoma infiltrante de dutos; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatório; doença de Paget, mamária; carcinoma de células acinares; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma com metaplasia escamosa; timoma, maligno; tumor do estroma ovariano, maligno; tecoma, maligno; tumor de células da granulosa, maligno; androblastoma, maligno; carcinoma das células de Sertoli; tumor de células de Leydig, maligno; tumor de células lipídicas, maligno; paraganglioma, maligno; paraganglioma extramamário, maligno; feocromocitoma; glomangiossarcoma; melanoma maligno; melanoma amelanótico; melanoma expansivo superficial, melanoma maligno no nevo pigmentado gigante, melanocitoma epitelioide, nevo azul, maligno; sarcoma (angiossarcoma, fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, lipossarcoma); fibrossarcoma; histiocitoma fibroso, maligno; mixossarcoma; lipossarcoma; leiomiossarcoma; rabdomiossarcoma; rabdomiossarcoma embrionário; rabdomiossarcoma alveolar; sarcoma estromal;

tumor misto, maligno; tumor mulleriano misto; nefroblastoma; hepatoblastoma; carcinossarcoma; mesenquimoma, maligno; tumor de Brenner, maligno; tumor filoide, maligno; sarcoma sinovial; mesotelioma, maligno; disgerminoma, carcinoma embrionário; teratoma, maligno; estroma ovariano, maligno; coriocarcinoma; mesonefroma, maligno; hemangiossarcoma; hemangioendotelioma, maligno; sarcoma de Kaposi; hemangiopericitoma, maligno; linfangiossarcoma; osteossarcoma; osteossarcoma justacortical; condrossarcoma; condroblastoma, maligno; condrossarcoma mesenquimal; tumor de células gigantes do osso; sarcoma de Ewing; tumor odontogênico, maligno; odontossarcoma ameloblástico; ameloblastoma, maligno; fibrossarcoma ameloblástico; pinealoma, maligno; cordoma; glioma, maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma protoplásmico; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; neuroectodérmico primitivo; sarcoma cerebelar; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; tumor neurogênico olfativo; meningioma, maligno; neurofibrossarcoma; neurilemoma, maligno; tumor de células granulares, maligno; linfoma maligno (sarcoma de célula do retículo); doença de Hodgkin; paragranuloma de Hodgkin; linfoma maligno, linfocítico pequeno; linfoma maligno de células grandes, difuso; linfoma maligno, folicular; micose fungoide; outros linfomas não-hodgkin especificados; histiocitose maligna; mieloma múltiplo; sarcoma de mastócitos; doença imunoproliferativa do intestino delgado; leucemia; leucemia linfoide; leucemia de células plasmáticas; eritroleucemia; leucemia de células do linfossarcoma; leucemia mieloide; leucemia basofílica; leucemia eosinofílica; leucemia monocítica; leucemia mastocítica; leucemia megacarioblástica; sarcoma mieloide; leucemia de células pilosas; mixoma; rabdomioma; fibroma; carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço; câncer laríngeo e hipofaríngeo; câncer de cavidade nasal ou seios paranasais; câncer nasofaríngeo; câncer da glândula salivar; câncer oral; orofaríngeo; carcinoma broncogênico (de células escamosas, de células pequenas indiferenciadas, células grandes indiferenciadas, adenocarcinoma, câncer de pulmão de células não pequenas); carcinoma alveolar (bronquiolar); adenoma brônquico; hamartoma condromatoso; câncer colorretal; tumores estromais gastrintestinais; carcinoides; síndrome de Turcot; câncer gástrico; adenocarcinoma da junção gastroesofágica; de pâncreas (adenocarcinoma ductal, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, tumores carcinoides, virgoma); do intestino delgado (adenocarcinoma, linfoma, tumores carcinoides, sarcoma de Karposi, leiomioma, hemangioma, lipoma, neurofibroma, fibroma); do intestino grosso (adenocarcinoma, adenoma tubular, adenoma viloso, hamartoma, leiomioma); câncer de mama metastático; carcinoma ductal in situ; carcinoma ductal invasivo; carcinoma tubular; carcinoma mucinoso; carcinoma lobular in situ; câncer de mama triplo negativo; de bexiga e uretra (carcinoma de células escamosas, carcinoma de células transicionais, adenocarcinoma, carcinoma urotelial); carcinoma de células claras; hepatoma (carcinoma hepatocelular); angiossarcoma; adenoma hepatocelular; hemangioma; sarcoma osteogênico (osteossarcoma); histiocitoma fibroso maligno; cordoma de tumor maligno de células gigantes; osteocondroma (exostoses osteocartilaginosas); condroma benigno; condromixofibroma; osteomia osteoide; tumores de células gigantes; câncer medular de tireoide; câncer diferenciado de tireoide; câncer de tireoide papilífero; câncer de tireoide folicular; câncer das células de Hurthle; câncer anaplásico de tireoide; de crânio (osteoma, hemangioma, granuloma, xantoma, de osteíte deformante); meninges (meningioma, meningiossarcoma, gliomatose); da medula espinhal (neurofibroma, meningioma, glioma, sarcoma); de útero (claro); de colo do útero (carcinoma cervical, pré-displasia cervical tumoral); de ovário (carcinoma ovariano [cistadenocarcinoma seroso, cistadenocarcinoma mucinoso carcinoma não classificado], tumores de células granulosas-tecais, tumores de células de Sertoli-Leydig, disgerminoma, teratoma maligno); da vulva (carcinoma de células escamosas, carcinoma intraepitelial, adenocarcinoma, fibrossarcoma, melanoma); da vagina (câncer de células claras, carcinoma de células escamosas); sarcoma botrioide (rabdomiossarcoma embrionário); das trompas de falópio (carcinoma); linfoma não-Hodgkin [linfoma maligno]; sarcoma de Karposi; nevos displásicos moles; angioma; dermatofibroma; queloides; psoríase; neuroblastoma; carcinoma adrenocortical; feocromocitomas; paragangliomas; carcinoma de células de Merkel; tumores neuroendócrinos; tumores carcinoides; cânceres de pâncreas; gastroesofágicos; carcinoma de célula renal de células claras; e câncer peritoneal primário.

[0385] Um anticorpo da presente revelação pode ser administrado a um indivíduo por si ou sob a forma de uma composição farmacêutica para o tratamento, por exemplo, de câncer, autoimunidade, rejeição de transplante, respostas imunológicas pós-traumáticas, doença do enxerto-versus- hospedeiro, isquemia, acidente vascular cerebral e doenças infecciosas (por exemplo, por tomar antígenos virais como alvo, como gp120 do HIV).

[0386] Em outro aspecto, uma molécula de ligação ao ROR (por exemplo, anticorpo), conforme descrito na presente invenção, pode ser usada em um método de tratamento de um indivíduo com câncer em combinação com uma ou mais terapias adicionais. As terapias adicionais que podem ser usadas em combinação com uma molécula de ligação ao antígeno do ROR (por exemplo, anticorpo) descrita na presente invenção incluem, mas não se limitam, a: (i) cirurgia; (ii) radioterapia; (iii) terapia endócrina; (iv) imunoterapia (incluindo terapia adjuvante e terapia celular, como terapia de células T CAR); e (v) quimioterapia, incluindo agentes citotóxicos e agentes quimioterapêuticos.

[0387] Qualquer terapia que tenha uma atividade contra um câncer pode ser usada juntamente com uma molécula de ligação ao antígeno do ROR (por exemplo, anticorpo), fornecida na presente invenção. Exemplos desses agentes para o tratamento de câncer podem ser encontrados, por exemplo, em https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/drugs (última visita em 22 de janeiro de 2019) e em fontes disponíveis publicamente, como em Cancer Principles and Practice of Oncology, por V. T. Devita e S. Hellman (editores), 11ª edição (2018), Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Um técnico versado no assunto seria capaz de discernir quais combinações de agentes seriam úteis com base nas características particulares dos medicamentos e no tipo de câncer envolvido.

[0388] Em certas modalidades, a terapia adicional é uma radioterapia incluindo, por exemplo, radiação gama, radioterapia de feixe de nêutrons, radioterapia de feixe de elétrons, terapia de prótons, braquiterapia e isótopos radioativos sistêmicos. A radioterapia pode compreender radiação ou administração associada de radiofármacos. A fonte de radiação pode ser externa ou interna ao paciente sendo tratado (o tratamento com radiação pode, por exemplo, estar na forma de terapia de radiação de feixe externo (EBRT) ou braquiterapia (BT)). Elementos radioativos exemplares incluem, por exemplo, rádio, césio-137, irídio-192, amerício-241, ouro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnécio-99, iodeto-123, iodeto-131 e índio-111.

[0389] Em certas modalidades, a terapia adicional é uma imunoterapia. A imunoterapia (também chamada de terapia modificadora da resposta biológica, terapia biológica, bioterapia, imunoterapia ou terapia biológica) é o tratamento que usa partes do sistema imunológico para combater doenças. A imunoterapia pode ajudar o sistema imunológico a reconhecer células cancerosas, ou melhorar uma resposta contra as células cancerosas. As imunoterapias incluem imunoterapias ativas e passivas. As imunoterapias ativas, incluindo os agentes imunoterapêuticos, estimulam o próprio sistema imunológico do corpo (por exemplo, vacinas), enquanto as imunoterapias passivas, incluindo os agentes imunoterapêuticos, geralmente usam componentes do sistema imunológico criados fora do corpo (por exemplo, anticorpos), anticorpos conjugados com fármacos, toxinas ou radionuclídeos, e terapias direcionadas.

[0390] Agentes imunoterapêuticos exemplares incluem inibidores de ponto de verificação (checkpoint) imunológico. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificaçãoimunológico usado nos métodos de tratamento podem reduzir, inibir, interferir ou modular, totalmente ou parcialmente, uma ou mais proteínas de ponto de verificação que regulam a ativação ou função de células T. Várias proteínas de ponto de verificação são conhecidas, como CTLA-4 e seus ligantes CD80 e CD86; e PD-1 com seus ligantes PD-Ll e PD-L2 (Pardoll, Nature Reviews Cancer, 2012, 12, 252-264). Os inibidores de ponto de verificação imunológico incluem anticorpos ou são derivados de anticorpos.

[0391] Em certas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um agonista OX40 (CD134). Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um anticorpo anti-OX40. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-OX40 é anti-OX-40. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-OX40 é MEDI6469.

[0392] Em certas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um agonista OX40. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um anticorpo anti-OX40. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 é CF-870.893.

[0393] Em certas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um inibidor CTLA-4 Em algumas modalidades, o inibidor CTLA-4 é um anticorpo anti-CTLA-4. Exemplos de anticorpos anti-CTLA-4 incluem, mas não se limitam, àqueles descritos nas Patentes Norte-Americanas Nos. 5,811,097; 5,811,097; 5,855,887; 6,051,227; 6,207,157; 6,682,736; 6,984,720; e 7,605,238. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 é tremelimumabe (também conhecido como ticilimumabe ou CP-675.206). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 é ipilimumabe (também conhecido como MDX-010 ou MDX-101). O ipilimumabe é um anticorpo IgG monoclonal totalmente humano que se liga ao CTLA-4. O ipilimumabe é comercializado sob o nome comercial Yervoy™.

[0394] Em certas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um inibidor de PD-1/PD-L1. Exemplos de inibidores de PD-l/PD-L1 incluem, mas não se limitam, àqueles descritos nas Patentes Norte-Americanas Nos. 7,488,802; 7,943,743; 8,008,449; 8,168,757; 8,217,149, e nas publicações de pedidos de patente PCT Nos. WO2003042402, WO2008156712, WO2010089411, WO2010036959, WO2011066342, WO2011159877, WO2011082400 e WO2011161699.

[0395] Em certas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um inibidor da PD-1/PD-L1. Em algumas modalidades, o inibidor da PD-1 é um anticorpo anti-PD-1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é BGB-A317, nivolumabe (também conhecido como ONO-4538, BMS-936558 ou MDX1106) ou pembrolizumabe (também conhecido como MK-3475, SCH 900475 ou lambrolizumabe). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é nivolumabe. O nivolumabe é um anticorpo monoclonal anti-PD-1 de IgG4 humana, e é comercializado com o nome comercial Opdivo™. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é pembrolizumabe. O pembrolizumabe é um anticorpo monoclonal de IgG4 humanizado, e é comercializado com o nome comercial Keytruda™. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é CT-011, um anticorpo humanizado. O CT-011, administrado isoladamente, não mostrou resposta no tratamento da leucemia mieloide aguda (LMA) em recidiva. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é AMP-224, uma proteína de fusão. Em algumas modalidades, o anticorpo PD-1 é BGB-A317. O BGB-A317 é um anticorpo monoclonal no qual a capacidade de se ligar ao receptor de Fc gama I é especificamente modificada por manipulação, e que tem uma assinatura de ligação única com o PD-1, com alta afinidade e especificidade para o alvo superior.

[0396] Em certas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um inibidor de PD-L1. Em algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é um anticorpo anti-PD-L1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é MEDI4736 (durvalumabe). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- L1 é BMS-936559 (também conhecido como MDX-1105-01). Em algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é atezolizumabe (também conhecido como MPDL3280A, e Tecentriq®).

[0397] Em certas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um inibidor de PD-L2. Em algumas personificações, o inibidor de PD-L2 é um anticorpo anti-PD- L2. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L2 é rHIgM12B7A.

[0398] Em certas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um inibidor do gene-3 de ativação de linfócitos (LAG-3). Em algumas modalidades, o inibidor do LAG-3 é IMP321, uma proteína de fusão de Ig solúvel (Brignone et al., J. Immunol., 2007, 179, 4202-4211). Em algumas modalidades, o inibidor do LAG-3 é BMS-986016.

[0399] Em certas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um inibidor de B7. Em algumas modalidades, o inibidor de B7 é um inibidor de B7-H3 ou um inibidor de B7- H4. Em algumas modalidades, o inibidor de B7-H3 é MGA271, um anticorpo anti-B7-H3 (Loo et al., Clin. Cancer Res., 2012, 3834).

[0400] Em certas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um inibidor TIM3 (domínio de imunoglobulina de célula T e domínio de mucina 3) (Fourcade et al., J. Exp. Med., 2010, 207, 2175-86; Sakuishi et al., J. Exp. Med., 2010, 207, 2187-94).

[0401] Em certas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um agonista de GITR. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um anticorpo anti-GITR. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GITR é TRX518.

[0402] Em certas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um agonista CD137. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um anticorpo anti-CD137. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD137 é urelumabe. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD137 é PF-

05082566.

[0403] Em certas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é a interleucina-15 humana recombinante (rhIL- 15).

[0404] Em certas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é um inibidor de IDO. Em algumas modalidades, o inibidor de IDO é INCB024360. Em algumas modalidades, o inibidor de IDO é indoximode.

[0405] Outras imunoterapias exemplares incluem terapias adjuvantes, incluindo agentes imunoterapêuticos como citocinas, quimiocinas, interferons, interleucinas ou linfocinas. Exemplos incluem citocinas, como fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos (GM- CSF), fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), proteína inflamatória de macrófagos (MIP)-1-alfa, interleucinas (incluindo IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL- 12, IL-15, IL-18, IL-21 e IL-27), fatores de necrose tumoral (incluindo TNF-alfa) e interferons (incluindo IFN-alfa, IFN- beta e IFN-gama); hidróxido de alumínio (alume); bacilo Calmette-Guerin (BCG); hemocianina da lapa californiana (KLH); adjuvante de Freund incompleto (IFA); QS-21; DETOX; levamisol; e dinitrofenil (DNP), e combinações dos mesmos como, por exemplo, combinações de interleucinas, por exemplo, IL-2, com outras citocinas, como IFN-alfa.

[0406] Outras imunoterapias exemplares incluem terapias celulares, por exemplo, uma população de células imunológicas, como leucócitos (glóbulos brancos nucleados), compreendendo (por exemplo, expressando) um receptor que se liga a um antígeno de interesse. Um leucócito da presente divulgação pode ser, por exemplo, um neutrófilo, eosinófilo, basófilo, linfócito ou um monócito. Em algumas modalidades, um leucócito é um linfócito. Exemplos de linfócitos incluem células T, células B, células natural killer (NK) ou células NKT. Em algumas modalidades, uma célula T é uma célula Th CD4+ (T helper), uma célula T citotóxica CD8+, uma célula T γδT ou uma célula T reguladora (supressora). Em algumas modalidades, uma célula imunológica é uma célula dendrítica. Em algumas modalidades, as terapias celulares são terapias com células T CAR. Em algumas modalidades, um CAR biespecífico é composto por dois domínios distintos de reconhecimento de antígeno presentes em tandem em um único receptor transgênico (referido como um TanCAR; consulte, por exemplo, Grada Z et al. Molecular Therapy Nucleic Acids 2013; 2:e105, aqui incorporado por referência em sua totalidade). Assim, os métodos, em algumas modalidades, compreendem fornecer a um tumor uma combinação que compreende uma molécula de ligação ao antígeno do ROR (por exemplo, anticorpo) e um agente imunoterapêutico, em que o agente imunoterapêutico é um ácido nucleico modificado que codifica um antígeno, ou que libera para um tumor um ácido nucleico modificado que induz a expressão de um autoantígeno, e entrega ao tumor uma célula imune expressando um CAR biespecífico que se liga a dois antígenos, sendo um deles codificado pelo ácido nucleico modificado.

[0407] Outras imunoterapias exemplares incluem agentes imunoterapêuticos, como vacinas contra o câncer, que podem ser usadas para eliciar uma resposta imunológica em um indivíduo contra um antígeno do câncer. Um método exemplar envolve administrar ao indivíduo uma vacina de RNA que compreende pelo menos um polinucleotídeo de RNA com um quadro de leitura aberto codificando pelo menos um polipeptídeo antigênico ou um fragmento imunogênico do mesmo, induzir no indivíduo uma resposta imunológica específica para o polipeptídeo antigênico ou um fragmento do mesmo, em combinação com a administração de uma molécula de ligação ao antígeno do ROR (por exemplo, anticorpo) na mesma composição ou em uma composição separada, administrada ao mesmo tempo, ou dosada sequencialmente, em que o título de anticorpo de polipeptídeo antiantigênico no indivíduo é aumentado após a vacinação em relação ao título de anticorpo de polipeptídeo antiantigênico em um indivíduo vacinado com uma dose profilaticamente eficaz de uma vacina tradicional contra o câncer.

[0408] Em certas modalidades, as terapias adicionais incluem quimioterapia, como um ou mais agentes citotóxicos ou um ou mais agentes quimioterapêuticos. Um agente citotóxico pode inibir ou prevenir uma função celular e/ou causar a morte ou destruição celular. Os agentes citotóxicos incluem, mas não se limitam, a isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu); agentes quimioterapêuticos; agentes inibidores do crescimento; enzimas e fragmentos delas, como enzimas nucleotídicas; e toxinas como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes das mesmas.

[0409] Em certas modalidades, a terapia adicional inclui um ou mais agentes quimioterapêuticos. Os agentes quimioterapêuticos incluem compostos químicos úteis no tratamento do câncer. Os agentes quimioterapêuticos incluem (i) agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação hormonal em tumores como antiestrogênios e moduladores seletivos do receptor de estrogênio; (ii) inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogênio nas glândulas adrenais; (iii) antiandrógenos; (iv) inibidores da proteína-quinase; (v) inibidores da quinase lipídica; (vi) oligonucleotídeos antissentido, incluindo aqueles que inibem a expressão de genes nas vias de sinalização envolvidas na proliferação de células aberrantes; (viii) vacinas como vacinas de terapia gênica. Os agentes quimioterapêuticos também podem incluir anticorpos.

[0410] Inibidores da quinase exemplares incluem erlotinibe (Tarceva®), gefitinibe (Iressa®), dasatinibe (Sprycel®), nilotinibe (Tasigna®), crizotinibe (Xalkori®), ruxolitinibe (Jakafi®), vemurafenibe (Zelboraf®), vandetanibe (Caprelsa®), pazopanibe (Votrient®), afatinibe, alisertibe, amuvatinibe, axitinibe, baricitinibe, bosutinibe, brivanibe, canertinibe, cabozantinibe (Cabometyx®), cediranibe, ceritinibe, crenolanibe, dabrafenibe, dacomitinibe, danusertibe, dovitinibe, foretinibe, ganetespibe, ibrutinibe, idelalisibe, imatinibe, iniparibe, lapatinibe, lenvatinibe, linifanibe, linsitinibe, masitinibe, momelotinibe, motesanibe, neratinibe, nintedanibe, niraparibe, oprozomibe, olaparibe, palbociclibe, pictilisibe, pirfenidone, ponatinibe, quizartinibe, regorafenibe, rigosertibe, rucaparibe, saracatinibe, saridegibe, sorafenibe, sunitinibe, tandutinibe, tasocitinibe, telatinibe, tivantinibe, tivozanibe, tofacitinibe, trametinibe, veliparibe, vismodegibe, volasertibe, cobimetinibe (Cotellic®), XL-147,

XL-765, XL-499, XL-880 e outros. Em algumas modalidades, uma molécula de ligação ao antígeno do ROR (por exemplo, anticorpo) pode ser usada em combinação com um inibidor de HSP90 (por exemplo, XL888), modulares do receptor X do fígado (LXR), moduladores do receptor gama-órfão relacionado ao retinoide (RORy), um inibidor de CK1, um inibidor de CK1-α, um inibidor da via de WNT (por exemplo, SST-215), ou um inibidor do receptor mineralocorticoide (por exemplo, esaxerenona ou XL-550) para o tratamento do câncer.

[0411] Os inibidores da quinase podem ser inibidores da tirosina-quinase, como os inibidores do EGFR; inibidor da tirosina quinase do HER2 de moléculas pequenas, como mubritonibe (TAK165, Takeda); CP-724.714, (Axon Medchem BV, um inibidor seletivo oral da tirosina quinase do receptor de ErbB2); inibidores de HER duplos, como o EKB-569 (disponível junto à Wyeth), que se liga preferencialmente ao EGFR, mas inibe tanto as células que super expressam HER2 como EGFR; lapatinibe (GSK572016; disponível junto à Glaxo-SmithKline), um inibidor oral da tirosina quinase do HER2 e EGFR; PKI-166 (disponível junto à Novartis); inibidores pan-HER, como canertinibe (CI-1033; Pharmacia); inibidores de Raf-1, como o agente antissentido ISIS-5132 disponível junto à ISIS Pharmaceuticals, que inibem a sinalização de Raf-1; inibidores das TK não direcionados ao HER, como mesilato de imatinibe (GLEEVEC®, disponível junto à Glaxo SmithKline); inibidores da tirosina-quinase multidirecionados, como sunitinibe (SUTENT®, disponível junto à Pfizer); inibidores do receptor da tirosina quinase do VEGF, como vatalanibe (PTK787/ZK222584, disponível junto à Novartis/Schering AG);

inibidor da quinase 1 regulada por MAPK extracelular CI-1040 (disponível junto à Pharmacia); quinazolinas, como PD 153035,4-(3-cloroanilino)quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas; pirrolopirimidinas, como CGP 59326, CGP 60261 e CGP 62706; pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H- pirrolo[2,3-d]pirimidinas; curcumina (diferuloil-metano, 4,5 bis-(4-fluoroanilino)ftalimida); porções nitrotiofeno contendo trifostinas; moléculas antissentido (por exemplo, aquelas que se ligam ao ácido nucleico que codifica o HER); quinoxalinas (Patente Norte-Americana N o. 5,804,396); trifostinas (Patente Norte-Americana N o. 5,804,396); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); PKI166 (Novartis); Semaxinibe (Pfizer); INC-1C11 (Imclone), rapamicina (sirolimo, RAPAMUNE®); ou como descrito em qualquer uma das seguintes publicações de patentes: Patente Norte-Americana No. 5,804,396; WO 1999/09016 (American Cyanamid); WO 1998/43960 (American Cyanamid); WO 1997/38983 (Warner Lambert); WO 1999/06378 (Warner Lambert); WO 1999/06396 (Warner Lambert); WO 1996/30347 (Pfizer, Inc); WO 1996/33978 (Zeneca); WO 1996/3397 (Zeneca) e WO 1996/33980 (Zeneca).

[0412] O tratamento combinado com a molécula de ligação ao antígeno do ROR (por exemplo, anticorpo) fornecido na presente invenção e a terapia adicional, como um agente terapêutico, podem ser simultâneos, separados ou sequenciais, em qualquer ordem. Para combinações de agentes terapêuticos, como uma molécula que proporciona ligação ao antígeno do ROR e outro agente terapêutico, como um agente imunoterapêutico ou um agente quimioterapêutico, a administração simultânea dos agentes terapêuticos pode ocorrer como uma composição ou como composições separadas, conforme apropriado.

6.13. Exemplos

[0413] Os exemplos a seguir são fornecidos como forma de ilustração, e não como limitação.

6.13.1. Métodos

[0414] Métodos ilustrativos não limitantes para a purificação das várias proteínas de ligação ao antígeno e seu uso em vários ensaios estão descritos com mais detalhes abaixo.

6.13.1.1. Expressão de Expi293

[0415] As várias proteínas de ligação ao antígeno testadas foram expressas utilizando o sistema de transfecção transitória Expi293 de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, quatro plasmídeos codificados para quatro cadeias individuais foram misturados em uma razão em massa de 1:1:1:1, a menos que seja indicado de outra forma, e transfectados com o kit de transfecção ExpiFectamine 293 para células Expi 293. As células foram cultivadas a 37 °C com CO2 a 8%, 100% de umidade e por agitação a 125 rpm. As células transfectadas foram alimentadas uma vez após 16 a 18 horas de transfecções. As células foram coletadas no dia 5 por centrifugação a 2.000 g por 10 minutos. O sobrenadante foi coletado para purificação por cromatografia de afinidade.

6.13.1.2. Purificação de Proteína A e anti-CH1

[0416] Os sobrenadantes limpos contendo as várias proteínas de ligação ao antígeno foram separados usando uma resina de proteína A (ProtA) ou uma resina anti-CH1 em um

FPLC purificador de AKTA. Nos exemplos em que foi realizada uma comparação de igual para igual, os sobrenadantes contendo as várias proteínas de ligação ao antígeno foram divididos em duas amostras iguais. Para a purificação de protA, uma coluna de proteína A de 1 mL (GE Healthcare) foi equilibrada com PBS (fosfato de potássio sódico 5 mM, em pH 7,4, cloreto de sódio 150 mM). A amostra foi carregada na coluna a 5 mL/min. A amostra foi eluída usando ácido acético 0,1 M em pH 4,0. A eluição foi monitorada por absorvância a 280 nm e os picos de eluição foram agrupados para análise. Para a purificação anti-CH1, uma coluna CaptureSelect™ XL de 1 mL (ThermoFisher) foi equilibrada com PBS. A amostra foi carregada na coluna a 5 mL/min. A amostra foi eluída usando ácido acético 0,1 M em pH 4,0. A eluição foi monitorada por absorvância a 280 nm e os picos de eluição foram agrupados para análise.

6.13.1.3. Análise de SDS-PAGE

[0417] As amostras contendo as várias proteínas de ligação ao antígeno separadas foram analisadas por SDS-PAGE redutore não redutor quanto à presença de produto completo, produto incompleto e pureza geral. 2 μg de cada amostra foram adicionados a 15 µL de tampão de carga de SDS. As amostras redutoras foram incubadas na presença agente redutor 10 mM a 75 °C por 10 minutos. As amostras não redutoras foram incubadas a 95 °C por 5 minutos sem reduzir o agente. As amostras redutoras e não redutoras foram carregadas em um gel TGX com gradiente de 4 a 15% (BioRad) com tampão de análise, e foram analisadas durante 30 minutos a 250 volts. Após concluir análise, o gel foi lavado com água DI e corado usando corante de proteína GelCode Blue Safe (ThermoFisher). Os géis foram descorados com água DI antes da análise. A análise de densitometria das imagens digitalizadas dos géis descorados foi realizada utilizando-se software padrão de análise de imagem para calcular a abundância relativa das bandas em cada amostra.

6.13.1.4. Cromatografia IEX

[0418] As amostras contendo as várias proteínas de ligação ao antígeno separadas foram analisadas por cromatografia de troca catiônica quanto à razão de produto completo para produto incompleto, e impurezas. Os sobrenadantes limpos foram analisados com uma MonoS de 5 mL (GE Lifesciences) em um FPLC purificador de AKTA. A coluna MonoS foi equilibrada com tampão A de MES 10 mM, em pH 6,0. As amostras foram carregadas na coluna a 2 mL/min. A amostra foi eluída utilizando um gradiente de 0 a 30% com tampão B (MES 10 mM MES, em pH 6,0, e cloreto de sódio 1 M) em 6 CV. A eluição foi monitorada por absorvância a 280 nm e a pureza das amostras foi calculada por integração do pico para identificar a abundância dos picos de monômeros e dos picos de contaminantes. O pico de monômero e os picos de contaminantes foram separados para análise por SDS-PAGE, conforme descrito acima.

6.13.1.5. Cromatografia SEC analítica

[0419] As amostras contendo as várias proteínas de ligação ao antígeno separadas foram analisadas por cromatografia de exclusão por tamanho analítica quanto à razão de monômero para produtos de alto peso molecular e impurezas. Os sobrenadantes limpos foram analisados com uma coluna TSK G3000SWxl padrão da indústria (Tosoh Bioscience) em um HPLC 1100 da Agilent. A coluna TSK foi equilibrada com PBS. 25 μL de cada amostra a 1 mg/mL foram carregados na coluna a 1 ml/min. A amostra foi eluída por meio de um fluxo isocrático de PBS para 1,5 CV. A eluição foi monitorada por absorvância a 280 nm e os picos de eluição foram analisados por integração de pico.

6.13.1.6. Espectrometria de massa

[0420] Amostras contendo as várias proteínas de ligação ao antígeno separadas foram analisadas por espectrometria de massa para confirmar as espécies corretas por peso molecular. Todas as análises foram realizadas por uma organização de pesquisa terceirizada. Resumidamente, as amostras foram tratadas com um coquetel de enzimas para remover a glicosilação. Ambas as amostras foram testadas no formato reduzido, para identificar especificamente cada cadeia por peso molecular. Todas as amostras foram testadas em condições não redutoras para identificar os pesos moleculares de todos os complexos nas amostras. A análise por espectrometria de massa foi utilizada para identificar o número de produtos únicos com base no peso molecular.

6.13.1.7. Descoberta de anticorpos por exibição de fago

[0421] A exibição de fago das bibliotecas de Fab humanas foi realizada usando protocolos padrão. Os domínios extracelulares biotinilados das proteínas ROR1 e ROR2 humanas foram adquiridos junto à Acro Biosystems e foram biotinilados com biotina EZ-Link NHS ( No. do catálogo Thermo Scientific 20217). Os clones de fago foram examinados quanto à capacidade de ligar os domínios extracelulares do ROR1 (No.

de catálogo Acro RO1-H522y) e ROR2 (No. de catálogo ACroRO2- H52E5) por fago-ELISA utilizando protocolos padrão. Resumidamente, as bibliotecas de fagos em formato Fab foram construídas utilizando vetores de expressão capazes de se replicar e expressar no fago (também referido como um fagemídeo). Tanto a cadeia leve como a cadeia pesada foram codificadas no mesmo vetor de expressão, onde a cadeia pesada foi fundida a uma variante truncada da proteína de revestimento de fago pIII. A cadeia leve e a fusão cadeia pesada-pIII são expressas como polipeptídeos separados e montadas no periplasma bacteriano, onde o potencial redox permite a formação de ligações dissulfeto, para formar o anticorpo de exibição de fago contendo o candidato a ABS.

[0422] A biblioteca foi criada usando sequências derivadas de um domínio variável da cadeia pesada humana específico (VH3-23) e um domínio variável da cadeia leve humana específico (Vk-1). Os domínios variáveis da cadeia leve dentro da biblioteca testada gerados com diversidade foram introduzido na CDR3 da VL (L3) e onde a CDR1 (L1) e CDR2 (L2) da cadeia leve permaneceram sendo a sequência germinativa humana. Para a biblioteca testada, todas as três CDRs do domínio VH foram diversificadas para corresponder à frequência de aminoácidos posicional pelo comprimento de CDR encontrado no repertório de anticorpos humanos. As estruturas da cadeia pesada (SEQ ID NO: 74) e da cadeia leve (SEQ ID NO: 75) de exibição de fagos usadas na biblioteca estão listadas abaixo, onde um “x” minúsculo representa aminoácidos da CDR que variaram para criar a biblioteca, e os que estão escritos em itálico e negrito representam as sequências da CDR que eram constantes.

[0423] Diversidade foi criada através da mutagênese Kunkel usando primers para introduzir diversidade na CDR3 da VL e na CDR1 (H1), CDR2 (H2) e CDR3 (H3) da VH para imitar a diversidade encontrada no repertório de anticorpos naturais, conforme descrito em mais detalhes em Kunkel, TA (PNAS, 1º de janeiro de 1985. 82 (2) 488-492), aqui incorporado por referência em sua totalidade. Em suma, os DNAs de fita simples foram preparados a partir de fago isolado usando procedimentos padrão, e a mutagênese de Kunkel foi realizada. O DNA quimicamente sintetizado foi, em seguida, eletroporado em células TG1, seguido por recuperação. As células recuperadas foram subcultivadas e infectadas com o fago auxiliar M13K07 para produzir a biblioteca de fagos.

[0424] A imobilização dos fagos foi realizada por meio de procedimentos padrão. Resumidamente, a primeira rodada de imobilização de fagos foi realizada com o alvo imobilizado em esferas magnéticas de estreptavidina, que foram submetidas a ~5x1012 fagos da biblioteca preparada em um volume de 1 mL em PBST-BSA a 2%. Após uma hora de incubação, os fagos ligados à esfera foram separados do sobrenadante usando um suporte magnético. As esferas foram lavadas três vezes para remover os fagos não especificamente ligados, e foram, em seguida, adicionadas às células ER2738 (5 mL) a DO600 ~ 0,6. Após 20 minutos, as células infectadas foram subcultivadas em 25 mL 2xYT + ampicilina e com fago auxiliar M13K07, e foram deixadas se multiplicar de um dia para o outro a 37 C com agitação vigorosa. No dia seguinte, os fagos foram preparados utilizando procedimentos padrão por precipitação com PEG. A pré-depuração dos fagos específicos para esferas revestidas com SAV foi realizada antes da imobilização. A segunda de imobilização foi realizada usando o manipulador de esferas magnéticas KingFisher com antígeno imobilizado em esferas a 100 nM, usando procedimentos padrão. No total, foram realizadas 3 a 4 rodadas de imobilização de fago para enriquecer nos Fabs exibindo fagos específicos para o antígeno-alvo. O enriquecimento específico do alvo foi confirmado utilizando fago-ELISA policlonal e monoclonal. O sequenciamento de DNA foi usado para determinar clones de Fab isolados contendo um candidato a ABS.

[0425] Para medir a afinidade de ligação nas campanhas de descoberta de ligantes do ROR, os domínios VL e VH identificados na análise dos fagos descrita acima foram formatados em uma arquitetura de IgG1 completa bivalente humana, nativa e monoespecífica e imobilizados em um biossensor em um interferômetro de biocamada Octet (Pall ForteBio). Os antígenos do ROR solúveis, incluindo os domínios extracelulares do ROR1 (No. do catálogo Acro RO1- H522y) e ROR2 (No. do catálogo Acro RO2-H52E5), bem como os domínios individuais ROR1 Frizzled (No. do catálogo Acro RO1- H5222), tipo Ig (No. do catálogo Acro RO2-H52E5), tipo Ig (No. do catálogo Acro RO1-H5221) e Kringle (No. do catálogo Acro RO1-H5223) foram, em seguida, adicionados ao sistema, e a ligação foi medida.

[0426] Para os experimentos realizados utilizando o formato B-Body, as regiões variáveis da VL dos clones individuais foram formatadas no domínio A e/ou H, e da região VH no domínio F e/ou L de uma estrutura B-Body 1x1 bivalente “BC1” mostrada abaixo e com referência à figura 3.

[0427] Estrutura “BC1”: 1ª cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 78) Domínio A = estrutura A/H do domínio B-Body do antígeno 1 (SEQ ID NO: 76) Domínio B = CH3 (T366K; inserção de tripeptídeo 445K, 446S, 447C) Domínio D = CH2 Domínio E = CH3 (T366W, S354C) 2ª cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 79): Domínio F = estrutura F/L do domínio B-Body do antígeno 1 (SEQ ID NO: 77) Domínio G = CH3 (L351D; inserção de tripeptídeo 445G, 446E, 447C) 3ª cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 80): Domínio H = estrutura A/H do domínio B-Body do antígeno 2 (SEQ ID NO: 76) Domínio I = CL (kappa) Domínio J (CH2) Domínio K = CH3 (Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A, Y407V) 4ª cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 81): Domínio L = estrutura F/L do domínio B-Body do antígeno 2 (SEQ ID NO: 77) Domínio M = CH1.

[0428] Para os candidatos a ABS do ROR formatados em um formato bivalente biespecífico 1x1 com SP34-89 anti-CD3, o domínio H tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69 e o domínio L tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 68, enquanto o domínio A tem a sequência candidata da VL do ROR e o domínio F teve a sequência candidata da VH do ROR.

[0429] Para os formatos BC1 1x2, os domínios variáveis foram formatados no formato 1(A)x2(B-A) descrito na seção 0, que se refere à figura 26. A figura 26 apresenta um esquema de cinco cadeias polipeptídicas e seus domínios, com as respectivas convenções de nomenclatura, para as construções de anticorpos trivalentes 1x2 descritas aqui, em que, de acordo com a convenção de nomenclatura, a cadeia 5 é chamada de “6ª cadeia polipeptídica” na representação esquemática. A menos que seja especificado de outra forma, o sítio de ligação ao antígeno (ABS) ROR é o ligante bivalente (a especificidade “A” ) e o CD3 é o ligante monovalente (a especificidade “B”). A estrutura da cadeia 3 SP34-89 1x2 tem a sequência da SEQ ID NO: 82, onde a junção entre o domínio S e o domínio H é um ligante de 10 aminoácidos com a sequência TASSGGSSSG (SEQ ID NO: 83), a menos que seja indicado de outra forma. As cadeias polipeptídicas 2 e 5 são idênticas no formato 1(A)x2(B-A) (consulte, por exemplo, a figura 26, em que, de acordo com a convenção de nomenclatura, a cadeia 5, é denominada “6ª cadeia polipeptídica” no esquema).

6.13.1.8. Ensaio de estimulação de células T NFκB GFP Jurkat

[0430] A linhagem celular repórter transcricional NFκB/Jurkat/GFP foi comprada junto à System Biosciences (No. de catálogo TR850-1). O anticorpo anti-CD28 usado para coestimulação foi adquirido junto à BD Pharmingen (No. de catálogo 555725). A solução C de corante de supressão de sinal de fundo foi adquirida junto à Life Technologies (K1037). Resumidamente, as células Jurkat (células efetoras, E) foram misturadas com as células tumorais (T) em uma razão E:T de 2:1 a 4:1 na presença de uma série de diluições de anticorpos B-body™ e um anticorpo anti-CD28 a 1 ug/mL em uma placa de fundo claro e paredes pretas de 96 poços. A placa foi incubada a 37°C/5% de CO2 por 6 horas, após o que uma solução 6X da solução C supressora de sinal de fundo foi adicionada à placa, e a fluorescência da GFP foi lida em um leitor de placa. Os valores da EC50, referindo-se à concentração de anticorpo que produz metade da resposta máxima, foram determinados a partir da diluição em série.

6.13.1.9. Ensaio primário de citotoxicidade de células

T

[0431] As células expressando o antígeno tumoral alvo (T) e as células efetoras (E) foram misturadas em uma razão E:T, variando de 3:1 a 10:1. As células efetoras utilizadas incluíam PBMCs ou células T CD8+ citotóxicas isoladas. O anticorpo candidato de redirecionamento de células T foi adicionado em uma série de diluição às células. Os controles incluíam controles apenas com meio, controles apenas com células tumorais e controles com células E:T não tratados. As células misturadas e em condições de controle foram incubadas a 37°C/5% deCO2 durante 40 a 50 horas. O kit de detecção de citotoxicidade Plus (LDH) foi adquirido junto à Sigma (No. de catálogo 4744934001) e as instruções do fabricante foram seguidas. Resumidamente, a solução de lise adicionada às células tumorais serviu como o controle de 100% de citotoxicidade, e as células E:T não tratadas serviram como o controle de 0% de citotoxicidade. O nível de lactato desidrogenase (LDH) em cada amostra foi determinado por absorvância a 490 nm e normalizado para os controles de 100% e 0%. Os valores da EC50, referindo-se à concentração de anticorpo que produz metade da resposta máxima, foram determinados a partir da diluição em série.

6.13.2. Exemplo 1: Construção monoespecífica bivalente e construção bispecífica bivalente

[0432] Um B-Body bivalente monoespecífico que reconhece TNFα foi construído com a seguinte arquitetura (VL(certolizumabe)-CH3(Knob)-CH2-CH3/VH(certolizumabe)- CH3(Hole)) utilizando procedimentos padrão de biologia molecular. Nesta construção, temos: 1ª cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 1) Domínio A = VL (certolizumabe) Domínio B = CH3 (IgG1) (knob: S354C+T366W) Domínio D = CH2 (IgG1) Domínio E = CH3 (IgG1) 2ª cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 2) Domínio F = VH (certolizumabe) Domínio G = CH3 (IgG1) (hole: Y349C, T366S, L368A, Y407V) 3ª cadeia polipeptídica: idêntica à 1ª cadeia polipeptídica

4ª cadeia polipeptídica idêntica à 2ª cadeia polipeptídica.

[0433] As referências do domínio e da cadeia polipeptídica estão de acordo com a figura 3. A arquitetura de construção geral é ilustrada na figura 4. A sequência da primeira cadeia polipeptídica, com o domínio A identificado abreviadamente como “(VL)”, é fornecida na SEQ ID NO: 1. A sequência da segunda cadeia polipeptídica, com o domínio F identificado abreviadamente como “(VH)”, é fornecida na SEQ ID NO: 2.

[0434] A construção completa foi expressa em um sistema de expressão de síntese proteica isento de células E. Coli por cerca de 18 horas a 26 °C com agitação branda. Após a expressão, o extrato isento de células foi centrifugado para peletizar o material insolúvel, e o sobrenadante foi diluído 2x com tampão cinético 10x (Forte Bio) e usado como analito em interferometria biocamada.

[0435] O TNFα biotinilado foi imobilizado em um sensor de estreptavidina para produzir uma mudança de resposta de onda de cerca de 1,5 nm. Após estabelecer uma linha de base com tampão cinético 10x, o sensor foi imerso na solução de analito de construção de anticorpo. A construção produziu uma resposta de cerca de 3 nm, comparável ao formato da IgG tradicional do certolizumabe, demonstrando a capacidade da construção monoespecífica bivalente de ser montada em um anticorpo completo funcional. Os resultados são mostrados na figura 5.

[0436] Também construímos um anticorpo bivalente biespecífico com a seguinte arquitetura de domínio:

1ª cadeia polipeptídica: VL-CH3-CH2-CH2 (knob) 2ª cadeia polipeptídica: VH-CH3 3ª cadeia polipeptídica: VL-CL-CH2-CH3 (hole) 4ª cadeia polipeptídica: VH-CH1.

[0437] As sequências (exceto as sequências da região variável) são fornecidas respectivamente na SEQ ID NO: 3 (1ª cadeia polipeptídica), SEQ ID NO: 4 (2ª cadeia polipeptídica), SEQ ID NO: 5 (3ª cadeia polipeptídica) e SEQ ID NO: 6 (4ª cadeia polipeptídica).

6.13.3. Exemplo 2: B-body biespecífico bivalente “BC1”

[0438] Construímos uma construção biespecífica bivalente, chamada “BC1”, específica para PD1 e um segundo antígeno, o “antígeno A”). As características relevantes da arquitetura do “BC1” estão ilustradas na figura 6.

[0439] Em mais detalhes, com as referências do domínio e da cadeia polipeptídica de acordo com a figura 3, e as modificações da sequência nativa indicadas entre parênteses, a arquitetura foi a seguinte: 1ª cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 8) Domínio A = VL (“antígeno A”) Domínio B = CH3 (T366K; inserção de tripeptídeo 445K, 446S, 447C) Domínio D = CH2 Domínio E = CH3 (T366W, S354C) 2ª cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 9): Domínio F = VH (“antígeno A”) Domínio G = CH3 (L351D; inserção de tripeptídeo 445G, 446E, 447C) 3ª cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 10):

Domínio H = VL (“Nivo”) Domínio I = CL (kappa) Domínio J (CH2) Domínio K = CH3 (Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A, Y407V) 4ª cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 11): Domínio L = VH (“Nivo”) Domínio M = CH1.

[0440] O domínio A (SEQ ID NO: 12) e o domínio F (SEQ ID NO: 16) formam um sítio de ligação ao antígeno (A:F) específico para o “antígeno A”. O domínio H tem a sequência da VH do nivolumabe e o domínio L tem a sequência da VL do nivolumabe; H e L se associam para formar um sítio de ligação ao antígeno (H:L) específico para o PD1 humano.

[0441] O domínio B (SEQ ID NO: 13) tem a sequência de CH3 da IgG1 humana com várias mutações: inserção T366K, 445K, 446S e 447C. A mutação T366K é um par de cargas cognato do resíduo L351D no domínio G. O resíduo “447C” no domínio B é derivado da inserção do tripeptídeo KSC no terminal C.

[0442] O domínio D (SEQ ID NO: 14) tem a sequência de CH2 da IgG1 humana

[0443] O domínio E (SEQ ID NO: 15) tem a sequência CH3 da IgG1 humana com as mutações T366W e S354C. O 366W é a mutação “knob”. A 354C introduz uma cisteína que é capaz de formar uma ligação dissulfeto com a mutação 349C cognata no domínio K.

[0444] O domínio G (SEQ ID NO: 17) tem a sequência de CH3 da IgG1 humana com as seguintes mutações: L351D, e a inserção de tripeptídeo 445G, 446E, 447C. A mutação L351D introduz um par de carga cognato à mutação T366K do domínio B. O resíduo “447C” no domínio G é derivado da inserção do tripeptídeo GEC no terminal C.

[0445] O domínio I (SEQ ID NO: 19) tem a sequência de cadeia leve kappa C humana (Cκ).

[0446] O domínio J [SEQ ID NO: 20] tem a sequência do domínio CH2 da IgG1 humana, e é idêntico à sequência do domínio D.

[0447] O domínio K [SEQ ID NO: 21] tem a sequência de CH3 da IgG1 humana com as seguintes alterações: Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A, Y407V. A mutação 349C introduz uma cisteína que é capaz de formar uma ligação dissulfeto com a mutação 354C cognata no domínio E. A 356E e L358M introduzem aminoácidos os aminoácidos do isoalotipo que reduzem a imunogenicidade. As mutações 366S, 368A e 407V são mutações do tipo “hole”.

[0448] O domínio M [SEQ ID NO: 23] tem a sequência da região CH1 da IgG1 humana.

[0449] O “BC1” poderia ser facilmente expresso em altos níveis usando expressão de mamíferos em concentrações superiores a 100 μg/mL.

[0450] Descobrimos que a proteína biespecífica bivalente “BC1” poderia ser facilmente purificada em uma única etapa usando uma resina de afinidade CaptureSelect™ específica para CH1, da ThermoFisher.

[0451] Conforme ilustrado na figura 7A, a análise por SEC demonstra que uma etapa de purificação por afinidade de CH1 em uma única etapa produz um único pico monodisperso através da filtração em gel, em que mais de 98% corresponde a monômero. A figura 7B mostra dados de literatura comparativa da análise por SEC de uma construção de anticorpo bivalente CrossMab.

[0452] A figura 8A é um perfil de eluição de cromatografia de troca catiônica de “BC1” após uma purificação em uma etapa usando a resina de afinidade CH1 CAPTURESelect™, mostrando um único pico compacto. A figura 8B é um perfil de eluição de cromatografia de troca catiônica de “BC1” após a purificação usando a purificação padrão da proteína A, mostrando picos de eluição adicionais consistentes com a copurificação dos produtos incompletos da montagem.

[0453] A figura 9 mostra géis SDS-PAGE em condições não redutoras. Como visto na raia 3, a purificação em uma única etapa de “BC1” com resina de afinidade de CH1 fornece uma banda única quase homogênea, com a raia 4 mostrando purificação adicional mínima com uma etapa subsequente de purificação por troca catiônica. A raia 7, em comparação, mostra uma purificação menos substancial utilizando a purificação padrão da proteína A, com as raias 8 a 10 demonstrando uma purificação maior do material de proteína A purificado usando cromatografia de troca catiônica.

[0454] A figura 10 compara os géis de SDS-PAGE de “BC1” após a purificação por afinidade com CH1 de etapa única, sob condições não redutoras e redutoras (painel A) com géis de SDS-PAGE de um anticorpo bivalente biespecífico CrossMab em condições não redutoras e redutoras, conforme publicado na literatura de referência (painel B).

[0455] A figura 11 mostra a análise de espectrometria de massa do “BC1”, demonstrando duas cadeias pesadas distintas (figura 11A) e duas cadeias leves distintas (figura 11B), sob condições redutoras. Os dados de espectrometria de massa na figura 12 confirma a ausência de pareamento incompleto após a purificação.

[0456] O teste de estabilidade acelerada foi realizado para avaliar a estabilidade a longo prazo do desenho B-Body “BC1”. O B-Body purificado foi concentrado em 8,6 mg/ml em tampão PBS e incubado a 40 °C. A integridade estrutural foi medida semanalmente usando cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) analítica com uma coluna Shodex KW-803. A integridade estrutural foi determinada medindo a porcentagem de monômero intacto (% de monômero) em relação à formação de agregados. Os dados são mostrados na figura

13. O controle 1 de IgG é um controle positivo com boas propriedades de estabilidade. O controle 2 de IgG é um controle negativo que é conhecido por se agregar sob condições de incubação. O B-Body “BC1” foi incubado por 8 semanas sem qualquer perda de integridade estrutural, conforme determinado por SEC analítica.

[0457] Também determinamos que o “BC1” apresenta alta termoestabilidade, com uma TM da construção bivalente de cerca de 72 ºC.

[0458] A tabela 1 compara o “BC1” com o CrossMab em relação às principais características de capacidade de desenvolvimento:

Tabela 1 Parâmetro Unidade Roche “BC1” CrossMab* Rendimento de purificação mg/L 58,5 300 após proteína A/SEC Homogeneidade após a % da área 50-85 98 purificação na SEC Temperatura de graus C 69,2 72 desnaturação (Tm) *Dados de Schaefer et al. (Proc Natl Acad Sci USA. 5 de julho de 2011; 108 (27): 11187-92)].

6.13.4. Exemplo 3: B-body biespecífico bivalente “BC6”

[0459] Construímos um B-Body biespecífico bivalente, chamado “BC6”, que é idêntico ao “BC1”, exceto por reter resíduos tipo selvagem no domínio B no resíduo 366 e no domínio G no resíduo 351. Assim, o “BC6” não tem os cognatos de carga-par T366K e L351D que foram concebidos para facilitar o emparelhamento correto do domínio B e do domínio G no “BC1”. As características relevantes da arquitetura do “BC6” estão ilustradas na figura 14.

[0460] Não obstante a ausência dos resíduos de carga-par presentes no “BC1”, descobrimos que uma única etapa de purificação do “BC6” utilizando a resina de afinidade de CH1 resultou em uma amostra altamente homogênea. A figura 15A mostra a análise por SEC do “BC6” após a purificação em uma etapa usando a resina de afinidade de CH1 CaptureSelect™. Os dados demonstram que a purificação por afinidade do CH1 em uma única etapa produz um único pico monodisperso, semelhante ao observado com “BC1”, demonstrando que as pontes bissulfeto entre as cadeias polipeptídicas 1 e 2 e entre as cadeias polipeptídicas 3 e 4 estão intactas. O cromatograma também mostra a ausência de agregados não covalentes.

[0461] A figura 15B mostra um gel de SDS-PAGE em condições não redutoras, com a raia 1 carregada com um primeiro lote de “BC6” após uma purificação por afinidade do CH1 em uma etapa única, e a raia 2 carregada com um segundo lote de “BC6” após uma purificação por afinidade do CH1 em uma etapa única. As raias 3 e 4 demonstram que mais purificação pode ser alcançada por cromatografia de troca iônica após a purificação por afinidade do CH1.

6.13.5. Exemplo 4: B-bodies biespecíficos bivalentes “BC28”, “BC29”, “BC30” e “BC31”

[0462] Construímos B-bodies biespecíficos bivalentes 1x1 “BC28”, “BC29”, “BC30” e “BC31” tendo um dissulfeto modificado dentro da interface CH3 nos domínios B e G como uma ligação S-S alternativa ao dissulfeto do terminal C presente no “BC1” e no “BC6”. A literatura indica que a ligação dissulfeto na interface do CH3 é insuficiente para reforçar a ortogonalidade no contexto dos domínios CH3 do Fc. A arquitetura geral dessas construções de B-Body é esquematizada na Figura 16, com as características relevantes do “BC28” resumidas abaixo: Cadeia polipeptídica 1: cadeia 1 do “BC28” (SEQ ID NO: 24) Domínio A = VL (antígeno “A”) Domínio B = CH3 (Y349C; inserção de 445P, 446G, 447K) Domínio D = CH2 Domínio E = CH3 (S354C, T366W)

Cadeia polipeptídica 2: cadeia 2 do “BC28” (SEQ ID NO: 25) Domínio F = VH (antígeno “A”) Domínio G = CH3 (S354C; inserção 445P, 446G, 447K) Cadeia polipeptídica 3: cadeia 3 do “BC1” (SEQ ID NO: 10) Domínio H = VL (“Nivo”) Domínio I = CL (kappa) Domínio J = (CH2) Domínio K = CH3 (Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A, Y407V) Cadeia polipeptídica 4: cadeia 4 do “BC1” (SEQ ID NO: 11) Domínio L = VH (“Nivo”) Domínio M = CH1.

[0463] O sítio de ligação ao antígeno A:F do “BC28” é específico para o “antígeno A”. O sítio de ligação de antígeno H:L do “BC28” é específico para o PD1 (sequências do nivolumabe). O domínio B do “BC28” tem as seguintes alterações em comparação com o CH3 tipo selvagem: Y349C; inserção 445P, 446G, 447K. O domínio E do “BC28” tem as seguintes alterações em comparação com o CH3 tipo selvagem: S354C, T366W. O domínio G do “BC28” tem as seguintes alterações em comparação com o tipo selvagem: S354C; inserção 445P, 446G, 447K.

[0464] Assim, o “BC28” tem uma cisteína modificada no resíduo 349C do domínio B e uma cisteína modificada no resíduo 354C do domínio G (“349C-354C”).

[0465] O “BC29” possui cisteínas modificadas no resíduo 351C do domínio B e 351C do domínio G (“351C-351C”). “BC30” tem uma cisteína modificada no resíduo 354C do domínio B e 349C do domínio G (“354C-349C”). BC31 tem uma cisteína modificada no resíduo 394C e uma cisteína modificada no 394C do domínio G (“394C-394C”). BC32 tem cisteínas modificadas no resíduo 407C do domínio B e 407C do domínio G (“407C- 407C”).

[0466] A figura 17 mostra a análise de SDS-PAGE em condições não redutoras após a purificação em uma etapa usando a resina de afinidade de CH1 CaptureSelect™. As raias 1 e 3 apresentam altos níveis de expressão e homogeneidade substancial de “BC28” (raia 1) e “BC30” (raia 3) intactos. A raia 2 mostra a oligomerização do BC29. As raias 4 e 5 apresentam má expressão de BC31 e BC32, respectivamente, e ligação insuficiente no BC32. Outra construção, BC9, que teve cisteínas introduzidas no resíduo 392 no domínio B e 399 no domínio G (“392C-399C”), um emparelhamento de dissulfeto relatado pela Genentech, demonstrou oligomerização no SDS-PAGE (dados não mostrados).

[0467] A figura 18 mostra a análise por SEC de “BC28” e “BC30”, após a purificação em uma etapa usando a resina de afinidade de CH1 CaptureSelect™. Também demonstramos que o “BC28” pode ser facilmente purificado usando uma única etapa de purificação usando a resina da proteína A (resultados não mostrados).

6.13.6. Exemplo 5: B-body biespecífico bivalente “BC44”

[0468] A figura 19 mostra a arquitetura geral do B- Body biespecífico bivalente 1x1 “BC44”, nossa construção biespecífica bivalente 1x1 atualmente preferida. primeira cadeia polipeptídica (cadeia 1 do “BC44”) (SEQ ID NO: 32) Domínio A = VL (antígeno “A”) Domínio B = CH3 (P343V; Y349C; inserção 445P, 446G, 447K) Domínio E = CH2 Domínio E = CH3 (S354C, T366W) segunda cadeia polipeptídica: (= cadeia polipeptídica 2 do “BC28”) (SEQ NO: 25) Domínio F = VH (antígeno “A”) Domínio G = CH3 (S354C; inserção 445P, 446G, 447K) terceira cadeia polipeptídica (= cadeia polipeptídica 3 do “BC1”) (SEQ ID NO: 10) Domínio H = VL (“Nivo”) Domínio I = CL (kappa) Domínio J = CH2 Domínio K = CH3 (Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A, Y407V) quarta cadeia polipeptídica (= cadeia polipeptídica 4 do “BC1”) (SEQ ID NO: 11) Domínio L = VH (“Nivo”) Domínio M = CH1.

6.13.7. Exemplo 6: Modificação da junção variável-CH3

[0469] Produzimos uma série de variantes nas quais modificamos por mutação a junção VL-CH3 entre os domínios A e B e a junção VH-CH3 entre os domínios F e G para avaliar o nível de expressão, montagem e estabilidade das construções bivalentes 1x1 do B-Body. Embora existam provavelmente muitas soluções, para reduzir a introdução dos epítopos de célula T, optamos por usar apenas resíduos encontrados naturalmente nos domínios VL, VH e CH3. A avaliação estrutural da arquitetura do domínio limita ainda mais as combinações de sequência desejáveis. A tabela 2 e a tabela 3 abaixo mostram junções para diversas variantes juncionais baseadas em “BC1” e em outras construções bivalentes.

Tabela 2 – variantes das junções do domínio variável/domínio constante para a 1ª cadeia polipeptídica VL CH3 Sequência Variante106 107 108 109 110 111 343 344 345 346

IKRTPREP BC1 I K R T P R E P (SEQ ID NO: 57)

IKRTPREP BC13 I K R T P R E P (SEQ ID NO: 57)

IKRTPREP BC14 I K R T P R E P (SEQ ID NO: 57)

IKRTVREP BC15 I K R T V R E P (SEQ ID NO: 58)

IKRTREP BC16 I K R T R E P (SEQ ID NO: 59)

IKRTVPREP BC17 I K R T V P R E P (SEQ ID NO: 60)

IKRTPREP BC24 I K R T P R E P (SEQ ID NO: 57)

IKRTPREP BC25 I K R T P R E P (SEQ ID NO: 57)

IKRTVAEP BC26 I K R T V A E P (SEQ ID NO: 61)

IKRTVAPREP BC27 I K R T V A P R E P (SEQ ID NO: 62)

IKRTVREP BC44 I K R T V R E P (SEQ ID NO:58)

Tabela 2 – variantes das junções do domínio variável/domínio constante para a 1ª cadeia polipeptídica VL CH3 Sequência

IKRTPREP BC45 I K R T P R E P (SEQ ID NO: 57)

IKRTPREP BC5 I K R T P R E P (SEQ ID NO: 57)

IKRTPREP BC6 I K R T P R E P (SEQ ID NO: 57)

IKRTPREP BC28 I K R T P R E P (SEQ ID NO: 57)

IKRTPREP BC30 I K R T P R E P (SEQ ID NO: 57) Tabela 3 – variantes das junções do domínio variável/domínio constante para a 2ª cadeia polipeptídica VH CH3 Sequência Variante112113114115116117118343344345346

SSASPREP BC1 S S A S P R E P (SEQ ID NO: 63)

SSASTREP BC13 S S A S T R E P (SEQ ID NO: 64)

SSASTPREP BC14 S S A S T P R E P (SEQ ID NO: 65)

SSASPREP BC15 S S A S P R E P (SEQ ID NO: 63)

SSASPREP BC16 S S A S P R E P (SEQ ID NO: 63)

SSASPREP BC17 S S A S P R E P (SEQ ID NO: 63)

SSASTKGEP BC24 S S A S T K G E P (SEQ ID NO: 66)

SSASTKGREP BC25 S S A S T K G R E P (SEQ ID NO: 67)

SSASPREP BC26 S S A S P R E P (SEQ ID NO: 63)

SSASPREP BC27 S S A S P R E P (SEQ ID NO: 63)

SSASPREP BC44 S S A S P R E P (SEQ ID NO: 63)

Tabela 3 – variantes das junções do domínio variável/domínio constante para a 2ª cadeia polipeptídica VH CH3 Sequência

SSASPREP BC45 S S A S P R E P (SEQ ID NO: 63)

SSASPREP BC5 S S A S P R E P (SEQ ID NO: 63)

SSASPREP BC6 S S A S P R E P (SEQ ID NO: 63)

SSASPREP BC28 S S A S P R E P (SEQ ID NO: 63)

SSASPREP BC30 S S A S P R E P (SEQ ID NO: 63)

[0470] A figura 20 mostra a cromatografia de exclusão por tamanho das amostras “BC15” e “BC16” na semana indicada de um protocolo de teste de estabilidade acelerado a 40° C. O “BC15” manteve-se estável; o “BC16” mostrou-se instável ao longo do tempo.

6.13.8. Exemplo 7: Construção biespecífica trivalente 2x1 do B-Body (“BC1-2x1”)

[0471] Construímos um B-Body biespecífico trivalente 2x1 “BC1-2x1” com base no “BC1”. As características relevantes da arquitetura estão ilustradas na figura 22.

[0472] Em mais detalhes, usando as referências do domínio e da cadeia polipeptídica resumidas na figura 21, 1ª cadeia polipeptídica Domínio N = VL (“antígeno A”) Domínio O = CH3 (T366K, 447C) Domínio A = VL (“Antígeno A”) Domínio B = CH3 (T366K, 447C) Domínio D = CH2 Domínio E = CH3 (knob, 354C)

5ª cadeia polipeptídica (= cadeia 2 do “BC1”) Domínio P = VH (“Antígeno A”) Domínio Q = CH3 (L351D, 447C) 2ª cadeia polipeptídica (= cadeia 2 do “BC1”) Domínio F = VH (“antígeno A”) Domínio G = CH3 (L351D, 447C) 3ª cadeia polipeptídica (= cadeia 3 do “BC1”) Domínio H = VL (“Nivo”) Domínio I = CL (kappa) Domínio J = CH2 Domínio K = CH3 (hole, 349C) 4ª cadeia polipeptídica (= cadeia 4 do “BC1”) Domínio L = VH (“Nivo”) Domínio M = CH1.

[0473] A figura 23 mostra o SDS-PAGE não redutor da proteína expressa usando o sistema de transfecção transiente Expi293 da ThermoFisher.

[0474] A raia 1 mostra o eluato da proteína trivalente 2x1 “BC1-2X1” após a purificação em uma etapa usando a resina de afinidade de CH1 CaptureSelect™. A raia 2 mostra a proteína “BC1” bivalente de menor peso molecular e migração mais rápida, após a purificação em uma etapa, usando a resina de afinidade de CH1 CaptureSelect™. As raias 3 a 5 demonstram a purificação de “BC1-2x1” usando proteína A. As raias 6 e 7 mostram a purificação de “BC1-2x1” usando a resina de afinidade de CH1.

[0475] A figura 24 compara a avidez da construção bivalente “BC1” com a avidez da construção trivalente 2x1 “BC1-2x1” usando uma análise de Octet (Pall ForteBio). O antígeno “A” biotinilado é imobilizado na superfície, e os construtos de anticorpos são passados sobre a superfície para análise de ligação.

6.13.9. Exemplo 8: Construção triespecífica trivalente 2x1 do B-Body (“TB111”)

[0476] Projetamos uma molécula triespecífica trivalente 2x1 “TB111”, tendo a arquitetura esquematizada na figura 25. Com referência às convenções de nomenclatura de domínio definidas na figura 21, TB111 tem a seguinte arquitetura (“Ada” indica uma região V do adalimumabe): cadeia polipeptídica 1 Domínio N: VH (“Ada”) Domínio O:CH3 (T366K, 394C) Domínio A:VL (“Antígeno A”) Domínio B:CH3 (T366K, 349C) Domínio D: CH2 Domínio E:CH3 (knob, 354C) cadeia polipeptídica 5 Domínio P:VL (“Ada”) Domínio Q:CH3 (L351D, 394C) cadeia polipeptídica 2 Domínio F:VH (“Antígeno A”) Domínio G:CH3 (L351D, 351C) cadeia polipeptídica 3 Domínio H:VL (“Nivo”) Domínio I:CL (kappa) Domínio J:CH2 Domínio K:CH3 (hole, 349C) cadeia polipeptídica 4 (= cadeia 4 do “BC1”)

Domínio L:VH (“Nivo”) Domínio M:CH1 Esta construção não se expressou.

6.13.10. Exemplo 9: Construção biespecífica trivalente 1x2 (“BC28-1x2”)

[0477] Construímos um B-body biespecífico trivalente 1x2 com o seguinte domínio e estrutura de cadeia com referência ao domínio e à nomenclatura de cadeia definidos na figura 26: 1ª cadeia polipeptídica (= cadeia 1 “BC28”) (SEQ ID NO: 24) Domínio A = VL (“Antígeno A”) Domínio B = CH3 (Y349C; inserção de 445P, 446G, 447K) Domínio D = CH2 Domínio E = CH3 (S354C, T366W) 2ª cadeia polipeptídica (= cadeia 2 do “BC28”) (SEQ ID NO: 25) Domínio F = VH (antígeno “A”) Domínio G = CH3 (S354C; inserção 445P, 446G, 447K) 3ª cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 37) Domínio R = VL (antígeno “A”) Domínio S = CH3 (Y349C; inserção de 445P, 446G, 447K) Ligante = GSGSGS Domínio H = VL (“Nivo”) Domínio I = CL Domínio J = CH2

Domínio K = CH3 (Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A, Y407V) 4ª cadeia polipeptídica: (= cadeia 4 do “BC1”) (SEQ ID NO: 11): Domínio L = VH (“Nivo”) Domínio M = CH1. 6ª cadeia polipeptídica (= cadeia 2 do “BC28”) (SEQ ID NO: 25) Domínio T = VH (antígeno “A”) Domínio U = CH3 (S354C; inserção 445P, 446G, 447K)

[0478] O sítio de ligação ao antígeno A:F é específico para o “Antígeno A”, assim como o sítio de ligação ao antígeno de ligação ao H:L. O sítio de ligação ao antígeno R:T é específico para o PD. Portanto, a especificidade desta construção é o antígeno “A” x (PD1-antígeno “A”).

6.13.11. Exemplo 10: construção bispecífica trivalente 1x2 (“CTLA4-4 x Nivo x CTLA4-4”)

[0479] Construímos uma molécula biespecífica trivalente 1x2 com a estrutura geral esquematizada na figura 27 (“CTLA4-4 x Nivo x CTLA4-4”). A nomenclatura do domínio é definida na figura 26.

[0480] A figura 28 é um gel de SDS-PAGE no qual as raias que mostram a construção “CTLA4-4 x Nivo x CTLA4-4” sob condições não redutoras e redutoras estão compreendidas no retângulo.

[0481] A figura 29 compara a ligação ao antígeno de dois anticorpos: “CTLA4-4 x OX40-8” e “CTLA4-4 x Nivo x CTLA4-4”. “CTLA4-4 x OX40-8” se liga ao CTLA4 monovalentemente, enquanto “CTLA4-4 x Nivo x CTLA4-4” se liga ao CTLA4 bivalentemente.

6.13.12. Exemplo 11: Construção triespecífica trivalente 1x2 “BC28-1x1x1a”

[0482] Construímos uma molécula triespecífica trivalente 1x2 com a estrutura geral esquematizada na figura

30. Com relação ao domínio e à nomenclatura de cadeia estabelecida na figura 26, 1ª cadeia polipeptídica (= cadeia 1 do “BC28”) [SEQ ID NO: 24] Domínio A = VL (“Antígeno A”) Domínio B = CH3 (Y349C; inserção de 445P, 446G, 447K) Domínio D = CH2 Domínio E = CH3 (S354C, T366W) 2ª cadeia polipeptídica (= cadeia 2 do “BC28”) (SEQ ID NO: 25) Domínio F = VH (antígeno “A”) Domínio G = CH3 (S354C; inserção 445P, 446G, 447K) 3ª cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 45) Domínio R = VL (CTLA4-4) Domínio S = CH3 (T366K; inserção de 445K, 446S, 447C) Ligante = GSGSGS Domínio H = VL (“Nivo”) Domínio I = CL Domínio J = CH2 Domínio K = CH3 (Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A, Y407V)

4ª cadeia polipeptídica: (= cadeia 4 do “BC1”) (SEQ ID NO: 11) Domínio L = VH (“Nivo”) Domínio M = CH1 6ª cadeia polipeptídica (=cadeia 2 do hCTLA4-4) (SEQ ID NO: 53) Domínio T = VH (CTLA4) Domínio U = CH3 (L351D; inserção de 445G, 446E, 447C).

[0483] Os sítios de ligação ao antígeno desta construção triespecífica foram: O sítio de ligação ao antígeno A:F foi específico para o “antígeno A” O sítio de ligação ao antígeno H:L foi específico para o PD1 (sequência de nivolumabe) O sítio de ligação ao antígeno R:T foi específico para o CTLA4.

[0484] A figura 31 mostra a cromatografia de exclusão por tamanho com “BC28-1x1x1a” após a expressão transitória e a purificação em uma etapa usando a resina de afinidade de CH1 CaptureSelect™, demonstrando um único pico bem definido.

6.13.13. Exemplo 12: análise de SDS-PAGE de construções bivalentes e trivalentes

[0485] A figura 32 mostra um gel de SDS-PAGE com várias construções, cada uma após a expressão transitória e purificação em uma etapa usando a resina de afinidade de CH1 CaptureSelect™, em condições não redutoras e redutoras.

[0486] As raias 1 (condições não redutoras) e 2 (condições redutoras + DTT) são a construção biespecífica bivalente 1x1 “BC1”. As raias 3 (não redutoras) e 4 (redutoras) são a construção biespecífica trivalente 2x1 “BC1-2x1” (consulte o exemplo 7). As raias 5 (não redutoras) e 6 (redutoras) são a construção biespecífica trivalente 1x2 “CTLA4-4 x Nivo x CTLA4-4” (consulte o exemplo 10). As raias 7 (não redutoras) e 8 (redutoras) são a construção triespecífica trivalente 1x2 “BC28-1x1x1a” descrita no exemplo 11.

[0487] O gel de SDS-PAGE demonstra a montagem completa de cada construção, com a banda predominante no gel não redutor aparecendo no peso molecular esperado para cada construção.

6.13.14. Exemplo 13: análise de ligação

[0488] A figura 33 mostra as análises de ligação Octet para 3 antígenos: PD1, antígeno “A” e CTLA-4. Em cada caso, o antígeno é imobilizado e o B-Body é o analito. Por referência, os “BC1” e “CTLA4-4 x OX40-8” 1x1 biespecíficos também foram comparados para demonstrar que os B-Bodies 1x1 se ligam especificamente somente aos antígenos para os quais os sítios de ligação ao antígeno foram selecionados.

[0489] A figura 33A mostra a ligação do “BC1” ao PD1 e ao antígeno “A”, mas não ao CTLA4. A figura 33B mostra a ligação de uma construção biespecífica bivalente 1x1 “CTLA4- 4 x OX40-8” ao CTLA4, mas não ao antígeno “A” ou PD1. A figura 33C mostra a ligação da construção triespecífica trivalente 1x2, “BC28-1x1x1a”, ao PD1, antígeno “A” e CTLA4.

6.13.15. Exemplo 14: Construções tetravalentes

[0490] A figura 35 mostra a arquitetura geral de uma construção biespecífica tetravalente 2x2 “BC22 - 2x2”. A bispecífica tetravalente 2x2 foi construída a estrutura “BC1” duplicando cada segmento do domínio variável-domínio constante. A nomenclatura do domínio é definida na figura

34.

[0491] A figura 36 é um gel de SDS-PAGE. As raias 7 a 9 mostram a construção tetravalente “BC22-2x2”, respectivamente, após a purificação em uma etapa usando a resina de afinidade de CH1 CapturSelect™ (“eluato de CH1”), e após uma purificação por cromatografia de troca iônica adicional (raia 8, “pk 1 após IEX”; raia 9, “pk 2 após IEX”). As raias 1 a 3 são a construção trivalente 2x1 “BC21-2x1” após a purificação por afinidade de CH1 (raia 1) e, nas raias 2 e 3, a subsequente cromatografia de troca iônica. As raias 4 a 6 são a construção trivalente 1x2 “BC12-1x2”.

[0492] A figura 37 mostra a arquitetura geral de uma construção tetravalente 2x2.

[0493] As figuras 39 e 40 esquematizam construções tetravalentes com arquiteturas alternativas. A nomenclatura do domínio é apresentada na figura 38.

6.13.16. Exemplo 15: Ligação do antígeno biespecífico pelo B-Body.

[0494] Um B-Body biespecífico tetravalente 2x2 “B- Body-IgG 2x2” foi construído. Em mais detalhes, usando as referências de nomenclatura do domínio e da cadeia polipeptídica resumidas na figura 38,

1ª cadeia polipeptídica Domínio A = VL (certolizumabe) Domínio B = CH3 (IgG1, knob) Domínio D = CH2 (IgG1) Domínio E = CH3 (IgG1) Domínio W = VH (antígeno “A”) Domínio X = CH1 (IgG1) 3ª cadeia polipeptídica (idêntica à primeira cadeia polipeptídica) Domínio H = VL (certolizumabe) Domínio I = CH3 (IgG1, knob) Domínio J = CH2 (IgG1) Domínio K = CH3 (IgG1) Domínio WW = VH (antígeno “A”) Domínio XX = CH1 (IgG1) 2ª cadeia polipeptídica Domínio F = VH (certolizumabe) Domínio G = CH3 (IgG1, hole) 4ª cadeia polipeptídica (idêntica à terceira cadeia polipeptídica) Domínio F = VH (certolizumabe) Domínio G = CH3 (IgG1, hole) 7ª cadeia polipeptídica Domínio Y = VH (“Antígeno A”) Domínio Z = CL kappa 8ª cadeia polipeptídica (idêntica à sétima cadeia polipeptídica) Domínio YY = VH (“Antígeno A”) Domínio ZZ = CL kappa.

[0495] Isso foi clonado e expresso como descrito no exemplo 1. Aqui, o experimento com BLI consistiu na imobilização do antígeno biotinitado “A” em um sensor de estreptavidina, seguido pelo estabelecimento da linha de base com tampão cinético de 10x. O sensor foi, em seguida, imerso no “B-Body-IgG 2x2” expresso sem células, seguido pelo estabelecimento de uma nova linha de base. Por fim, o sensor foi imerso em TNFα 100 nM onde um segundo evento de ligação foi observado, confirmando a ligação bispecífica de ambos os antígenos por uma única construção “B-Body-IgG 2x2”. Os resultados são mostrados na figura 41.

6.13.17. Exemplo 16: Ligação celular antígeno específica do “BB-IgG 2x2”.

[0496] As células expi-293 foram simuladamente transfectadas ou transitoriamente transfectadas com antígeno “B”, usando o kit de transfecção Expi-293 (Life Technologies). Quarenta e oito horas após a transfecção, as células Expi-293 foram coletadas e fixas em paraformaldeído 4% por 15 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas duas vezes com PBS. 200.000 células Expi-293 transfectadas com antígeno B ou falsamente transfectadas foram colocadas em uma placa de 96 poços com fundo em V em 100 μL de PBS. As células foram incubadas com “B-Body-IgG 2x2” a uma concentração de 3 ug/mL durante 1,5 hora em temperatura ambiente. As células foram centrifugadas a 300 x g por 7 minutos, lavadas em PBS e incubadas com 100 μL de anticorpo secundário de cabra anti-humano marcado com FITC a uma concentração de 8 μg/mL durante 1 hora à temperatura ambiente. As células foram centrifugadas a 300xG por 7 minutos e lavadas em PBS, e a ligação celular foi confirmada por citometria de fluxo usando uma Guava easyCyte. Os resultados são mostrados na figura 42.

6.13.18. Exemplo 17: Análise de SDS-PAGE de construções bivalentes e trivalentes

[0497] A figura 45 mostra um gel de SDS-PAGE com várias construções, cada uma após a expressão transitória e purificação em uma etapa usando a resina de afinidade de CH1 CaptureSelect™, em condições não redutoras e redutoras.

[0498] As raias 1 (condições não redutoras) e 2 (condições redutoras + DTT) são a construção biespecífica bivalente 1x1 “BC1”. As raias 3 (não redutoras) e 4 (redutoras) são a construção biespecífica bivalente 1x1 “BC28” (consulte o exemplo 4). As raias 5 (não redutoras) e 6 (redutoras) são a construção biespecífica bivalente 1x1 “BC44” (consulte o exemplo 5). As raias 7 (não redutoras) e 8 (redutoras) são a construção biespecífica trivalente 1x2 “BC28-1x2” (consulte o exemplo 9). As raias 9 (não redutoras) e 10 (redutoras) são a construção triespecífica trivalente 1x2 “BC28-1x1x1a” descrita no exemplo 11.

[0499] O gel de SDS-PAGE demonstra a montagem completa de cada construção, com a banda predominante no gel não redutor aparecendo no peso molecular esperado para cada construção.

6.13.19. Exemplo 18: Análise de estabilidade da modificação da junção variável-CH3

[0500] Foi avaliada a estabilidade de pareamento entre várias combinações de variantes juncionais. A fluorimetria diferencial de varredura foi realizada para determinar a temperatura de fusão de vários pareamentos de variantes juncionais entre os polipeptídeos VL-CH3 da cadeia 1 (domínios A e B) e dos polipeptídeos VH-CH3 da cadeia 2 (domínios F e G). As variantes juncionais “BC6jv”, “BC28jv”, “BC30jv”, “BC44jv” e “BC45jv”, cada uma com as sequências juncionais correspondentes de “BC6”, “BC28”, “BC30”, “BC44” e “BC45” encontradas na tabela 2 e na tabela 3 acima, demonstram maior estabilidade de pareamento com as Tms na faixa de 76 a 77 graus (consulte a tabela 4). A figura 46 mostra diferenças nas transições térmicas para “BC24jv”, “BC26jv” e “BC28jv”, com “BC28jv” demonstrando a maior estabilidade das três. O eixo x da figura é a temperatura e o eixo y é a alteração na fluorescência dividido pela alteração na temperatura (-dFluor/dTemp). Os experimentos foram realizados como descrito em Niesen et al. (Nature Protocols, (2007) 2, 2212 – 2221), que é incorporado na presente invenção por referência, por tudo o que ensina. TABELA 4 – TEMPERATURAS DE FUSÃO DOS PARES DE VARIANTES

JUNCIONAIS

PAR DE VARIANTE TEMPERATURA DE TEMPERATURA DE JUNCIONAL FUSÃO Nº 1 (°C) FUSÃO Nº 2 (°C) BC1jv 69,7 55,6 BC5jv 71,6 BC6jv 77 BC15jv 68,2 54 BC16jv 65,9 BC17jv 68 BC24jv 69,7 BC26jv 70,3 BC28jv 76,7 BC30jv 76,8 BC44jv 76,2 BC45jv 76

6.13.20. Exemplo 19: moléculas de ligação candidatas do RORxCD3

[0501] Vários anticorpos RORxCD3 foram construídos e testados conforme descrito abaixo.

6.13.20.1. Braço de ligação ao CD3

[0502] Uma série de variantes do braço de ligação do CD3 com base em uma versão humanizada do anticorpo anti-CD3 SP34 (SP34-89, SEQ ID Nos: 68 e 69) foram projetadas com mutações pontuais emambas as sequências de aminoácidos VH ou VL (SEQ ID Nos: 70 a 73). As várias sequências VH e VL foram emparelhadas como descrito na tabela 5. Tabela 5: variantes do braço de ligação SP34 anti-CD3 VL-WT SP34-89 (SEQ VL-W57G SP34-89 (SEQ ID Variantes VL/VH ID NO: 69) NO: 73) VH-WT SP34-89 VL-WT SP34-89/ VH-WT VL-W57G SP34-89/ VH-WT SEQ ID NO: 68 SP34-89 SP34-89 VH-N30S SP34-89 VL-WT SP34-89/ VH-WT VL-W57G SP34-89/ VH-N30S SEQ ID NO: 70 SP34-89 SP34-89 VH-G65D SP34-89 VL-WT SP34-89/ VH- VL-W57G SP34-89/ VH-G65D SEQ ID NO: 71 G65D SP34-89 SP34-89 VH-S68T SP34-89 VL-WT SP34-89/ VH- VL-W57G SP34-89/ VH-S68T SEQ ID NO: 72 S68T SP34-89 SP34-89

[0503] As variantes VL e VH foram clonadas em um braço de um B-Body BC1 1x1, enquanto o outro braço continha um sítio de ligação ao antígeno irrelevante. A figura 47 demonstra a afinidade de ligação do B-Body monovalente SP34- 89 que não sofreu mutação, conforme determinado pela interferometria biocamada da Octet (Pall ForteBio). Uma diluição em série de duas vezes (200 a 12,5 nM) da construção foi usada para determinar uma afinidade de ligação de 23 nM para SP34-89 (kon = 3x105 M-1s-1, koff = 7,1x10-3 s-1), combinando a afinidade com outras variantes de SP34 na literatura. A afinidade cinética também correspondeu à afinidade de ligação de equilíbrio.

6.13.20.2. Braço de ligação ao ROR

[0504] Uma biblioteca de fagos Fab quimicamente sintética com diversidade introduzida nas CDRs do Fab foi testada contra antígenos do ROR usando um formato de fago- ELISA monoclonal, onde as variantes de ROR imobilizadas em placa foram avaliadas quanto à ligação ao fago, como descrito acima. Os clones de fagos expressando os Fabs que reconheceram antígenos foram sequenciados. Uma primeira campanha de triagem para ligação ao ROR1 identificou os clones do sítio de ligação ao antígeno (ABS) designados “I2A” na tabela 6, e uma segunda campanha de triagem para ligação ao ROR2 identificou os clones ABS designados “I2C” na tabela

6.

Tabela 6: Candidatos de sítio de ligação ao antígeno do ROR ABS VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3

FSSYFI AIYPEGGYTY DYKYVGAL RASQSVSSAVA SASSLYS YYYFPG I2A-1 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:153) NO:154) NO:155) NO:156) NO:157) NO:158)

FSYYGI FIYSRGGYTI YIGAGL RASQSVSSAVA SASSLYS YYWDPI I2A-2 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:159) NO:160) NO:161) NO:162) NO:163) NO:164)

FTSYEI HIDPYGGYTQ RGVAVF RASQSVSSAVA SASSLYS WAYAPV I2A-3 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:165) NO:166) NO:167) NO:168) NO:169) NO:170)

FYSYDI YISPYWGITT YIGSSYWDAL RASQSVSSAVA SASSLYS SDSSLV I2A-4 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:171) NO:172) NO:173) NO:174) NO:175) NO:176)

FSSYGI WISPTGSITI SYMIYGGL RASQSVSSAVA SASSLYS RVSSPW I2A-5 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:177) NO:178) NO:179) NO:180) NO:181) NO:182)

FSLYAI EIDSWLGYTY RPVTEVYYSAL RASQSVSSAVA SASSLYS YDRSLH I2A-6 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:183) NO:184) NO:185) NO:186) NO:187) NO:188)

FSRYYI DIDSYGGFTY AHRFLQGGYVL RASQSVSSAVA SASSLYS YSWGLW I2A-7 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:189) NO:190) NO:191) NO:192) NO:193) NO:194) I2A-8 FYGYYI GIRPGGTYTY YRYPAF RASQSVSSAVA SASSLYS RRQHLW

Tabela 6: Candidatos de sítio de ligação ao antígeno do ROR ABS VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:195) NO:196) NO:197) NO:198) NO:199) NO:200)

FSSYTI AIDSGWSYTD AYGGVM RASQSVSSAVA SASSLYS YWWPG I2A-9 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:201) NO:202) NO:203) NO:204) NO:205) NO:206)

FSSYFI GIYPSDGYTS YYVSGM RASQSVSSAVA SASSLYS YYYYPG I2A-10 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:207) NO:208) NO:209) NO:210) NO:211) NO:212) I2A-10 FSSYFI GIYPSEGYTS YYVSGM RASQSVSSAVA SASSLQS YYYYPG D54E (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID Y55Q NO:213) NO:214) NO:215) NO:216) NO:217) NO:218)

FSSYVI AIYPYTSSTQ SYGTGGF RASQSVSSAVA SASSLYS WYSYPL I2A-11 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:219) NO:220) NO:221) NO:222) NO:223) NO:224)

FTTYYI YISPEDGYTS AYYSAVM RASQSVSSAVA SASSLYS SWSPAT I2A-12 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:225) NO:226) NO:227) NO:228) NO:229) NO:230)

FSYYFI VIYPDGGYTL IYYPSGAM RASQSVSSAVA SASSLYS TYWYPG I2A-13 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:231) NO:232) NO:233) NO:234) NO:235) NO:236)

FDSYVI YIFSFGGYTY SPYGTFAL RASQSVSSAVA SASSLYS YYYTPG I2A-14 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:237) NO:238) NO:239) NO:240) NO:241) NO:242)

FWGYVI AIDSWDGDTD SFYYIYVM RASQSVSSAVA SASSLYS LYSTLV I2A-15 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:243) NO:244) NO:245) NO:246) NO:247) NO:248)

FSGYFI AIFPYRGGTS GGVSPGGF RASQSVSSAVA SASSLYS YYLYPG I2A-16 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:249) NO:250) NO:251) NO:252) NO:253) NO:254)

FESYDI AIFSYGGYTT GSYGDGRGM RASQSVSSAVA SASSLYS YYYWPG I2A-17 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:255) NO:256) NO:257) NO:258) NO:259) NO:260)

FSSYFI AIHPAFSFTY PRLSSAVVL RASQSVSSAVA SASSLYS I2A-18 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID * NO:261) NO:262) NO:263) NO:264) NO:265)

FSSYFI WIYPSGSYTY EMDRVGYSGM RASQSVSSAVA SASSLYS YRTPLG I2A-19 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:266) NO:267) NO:268) NO:269) NO:270) NO:271)

FSDYGI EIDSWLGYTY SPYHYLYYGL RASQSVSSAVA SASSLYS LSSSLG I2A-20 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:272) NO:273) NO:274) NO:275) NO:276) NO:277)

FSGYFI GISPWAGYTS GGGRAF RASQSVSSAVA SASSLYS YYWYPG I2A-21 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:278) NO:279) NO:280) NO:281) NO:282) NO:283)

FSSYFI AIYPSGWYTS VQAGVF RASQSVSSAVA SASSLYS YYYYPG I2A-22 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:284) NO:285) NO:286) NO:287) NO:288) NO:289)

FDDYFI AISSEGGYTD AYRGVF RASQSVSSAVA SASSLYS YYYFPG I2A-23 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:290) NO:291) NO:292) NO:293) NO:294) NO:295) I2A-24 FSTYGI AIYPGTSYTG EYFMGM RASQSVSSAVA SASSLYS YYYWPG

Tabela 6: Candidatos de sítio de ligação ao antígeno do ROR ABS VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:296) NO:297) NO:298) NO:299) NO:300) NO:301)

FYGYTI AIYPYTDSTR DYRRAL RASQSVSSAVA SASSLYS YTDFPW I2A-25 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:302) NO:303) NO:304) NO:305) NO:306) NO:307)

FQSYDI AIDPTGRSTA DYGVF RASQSVSSAVA SASSLYS FYRSPA I2A-26 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:308) NO:309) NO:310) NO:311) NO:312) NO:313)

FKGYYI AIYPYGGSTD VYIYGVF RASQSVSSAVA SASSLYS YYSSPR I2A-27 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:314) NO:315) NO:316) NO:317) NO:318) NO:319)

FSSYWI WIYPGTRYTE DYVWPYGF RASQSVSSAVA SASSLYS ASWSPV I2A-28 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:320) NO:321) NO:322) NO:323) NO:324) NO:325)

FSSYWI WIYSSGGYTF EYFLYTGF RASQSVSSAVA SASSLYS YSSGPV I2A-29 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:326) NO:327) NO:328) NO:329) NO:330) NO:331)

FDSYFI YIYSWGSYTH GHRRYFAL RASQSVSSAVA SASSLYS VYFTPG I2A-30 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:332) NO:333) NO:334) NO:335) NO:336) NO:337)

FSSYWI FIGPSGGYTY ETDSYTGF RASQSVSSAVA SASSLYS YYSWLG I2A-31 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:338) NO:339) NO:340) NO:341) NO:342) NO:343)

FQSYVI AIYPYSSSTI SWSVYLGM RASQSVSSAVA SASSLYS SYDSPR I2A-32 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:344) NO:345) NO:346) NO:347) NO:348) NO:349)

FDDYYI WIDSYGGYTS SSYYYPGGF RASQSVSSAVA SASSLYS WDSTLY I2A-33 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:350) NO:351) NO:352) NO:353) NO:354) NO:355)

FSWYVI YIAPYTGSTY AFFGIRLGL RASQSVSSAVA SASSLYS AISSPY I2A-34 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:356) NO:357) NO:358) NO:359) NO:360) NO:361)

FSAYDI WIDPYGGDTD SPSYMQYGGL RASQSVSSAVA SASSLYS YYSSLL I2A-35 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:362) NO:363) NO:364) NO:365) NO:366) NO:367)

FSQYWI AIYSSTKYTI ESMYFYSYGL RASQSVSSAVA SASSLYS LPSTPL I2A-36 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:368) NO:369) NO:370) NO:371) NO:372) NO:373)

FSWYGI YIDSYTSSTY SHFGHYDYVM RASQSVSSAVA SASSLYS AYDQLY I2A-37 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:374) NO:375) NO:376) NO:377) NO:378) NO:379)

FDWYRI WIDSYGSWTG SYFGPYGYVL RASQSVSSAVA SASSLYS I2A-38 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID * NO:380) NO:381) NO:382) NO:383) NO:384)

FTSYGI AIYPHSGFTS TSYRGF RASQSVSSAVA SASSLYS YYWYPG I2C-1 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:385) NO:386) NO:387) NO:388) NO:389) NO:390)

FSDYFI GIYPYSGYTK DHSPVL RASQSVSSAVA SASSLYS WYYWPG I2C-2 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:391) NO:392) NO:393) NO:394) NO:395) NO:396) I2C-3 FSHYWI LIAPGGDYTS SGLPGF RASQSVSSAVA SASSLYS YKSSPL

Tabela 6: Candidatos de sítio de ligação ao antígeno do ROR ABS VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:397) NO:398) NO:399) NO:400) NO:401) NO:402)

FWSYFI YIHPSSSYTD TSRDGAM RASQSVSSAVA SASSLYS WYSPPE I2C-4 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:403) NO:404) NO:405) NO:406) NO:407) NO:408)

FSSYDI WIYPYWGYTI GTYAPAL RASQSVSSAVA SASSLYS FYSYLS I2C-5 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:409) NO:410) NO:411) NO:412) NO:413) NO:414)

FSWYFI RIYSTGGYTE SAFFGAL RASQSVSSAVA SASSLYS YPSGPE I2C-6 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:415) NO:416) NO:417) NO:418) NO:419) NO:420)

FDSYYI WIDPYGLDTK EPGDYGM RASQSVSSAVA SASSLYS AYGSLL I2C-7 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:421) NO:422) NO:423) NO:424) NO:425) NO:426)

FSGYFI AIFPYRGGTS GGVSPGGF RASQSVSSAVA SASSLYS YYLYPG I2C-8 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:427) NO:428) NO:429) NO:430) NO:431) NO:432)

FTDYDI RIWPHGSYTF SLTHSYGF RASQSVSSAVA SASSLYS YYTWLI I2C-9 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:433) NO:434) NO:435) NO:436) NO:437) NO:438)

FSSYFI TIHSYFDGTS TRPTGGAF RASQSVSSAVA SASSLYS AYWSPA I2C-10 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:439) NO:440) NO:441) NO:442) NO:443) NO:444)

FGSYFI AIFPAGGYTY YGSMGGAF RASQSVSSAVA SASSLYS YYWFPG I2C-11 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:445) NO:446) NO:447) NO:448) NO:449) NO:450)

FSSYFI AIHPAFSFTY PRLSSAVVL RASQSVSSAVA SASSLYS GYYFPG I2C-12 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:451) NO:452) NO:453) NO:454) NO:455) NO:456)

FSSYGI YIHSGIGYTI TSSTSTSVM RASQSVSSAVA SASSLYS TYWSPG I2C-13 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:457) NO:458) NO:459) NO:460) NO:461) NO:462)

FESYDI AIFSYGGYTT GSYGDGRGM RASQSVSSAVA SASSLYS YYYWPG I2C-14 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:463) NO:464) NO:465) NO:466) NO:467) NO:468)

FSSYFI LIYPDTDDTY YGYLGVGAF RASQSVSSAVA SASSLYS LYWTPG I2C-15 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:469) NO:470) NO:471) NO:472) NO:473) NO:474)

FSSYWI AIHPSGSYTY VGLLVTSVM RASQSVSSAVA SASSLYS YYYFPG I2C-16 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:475) NO:476) NO:477) NO:478) NO:479) NO:480)

FSDYFI YIYPASGGTC GYIPHMAAL RASQSVSSAVA SASSLYS YYWWPG I2C-17 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:481) NO:482) NO:483) NO:484) NO:485) NO:486)

FAGYPI AIDPDGGYTY HTGFHRYRGM RASQSVSSAVA SASSLYS YYWFPP I2C-18 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:487) NO:488) NO:489) NO:490) NO:491) NO:492)

FTSYDI WIDPGLSYTS ASIGGGVPVM RASQSVSSAVA SASSLYS YVTGPY I2C-19 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:493) NO:494) NO:495) NO:496) NO:497) NO:498) I2C-20 FSSYYI IIIPYSGYTY RGYFSLGTAM RASQSVSSAVA SASSLYS VYWWPG

Tabela 6: Candidatos de sítio de ligação ao antígeno do ROR ABS VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:499) NO:500) NO:501) NO:502) NO:503) NO:504)

FSSYYI WIDPYISYTY DSELVSGYAM RASQSVSSAVA SASSLYS GDSSLV I2C-21 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:505) NO:506) NO:507) NO:508) NO:509) NO:510)

FSSYSI AIYPYWGTTE PSGVTYGYAL RASQSVSSAVA SASSLYS YYYSPW I2C-22 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:511) NO:512) NO:513) NO:514) NO:515) NO:516)

FSSYEI SIYPFSGDTY PGRAIYYAVM RASQSVSSAVA SASSLYS AGSHLF I2C-23 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:517) NO:518) NO:519) NO:520) NO:521) NO:522)

FSRYYI DIDSYGGFTY AHRFLQGGYVL RASQSVSSAVA SASSLYS YSWGLW I2C-24 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:523) NO:524) NO:525) NO:526) NO:527) NO:528)

FSDYYI YIAPYGGFTY DSYRRGYVSGF RASQSVSSAVA SASSLYS RYSSPS I2C-25 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:529) NO:530) NO:531) NO:532) NO:533) NO:534)

FSDYYI DIDSYGGFTY DPHFLDDVYVL RASQSVSSAVA SASSLYS YSWGLW I2C-26 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:535) NO:536) NO:537) NO:538) NO:539) NO:540) “I2A” testado contra ROR1; “I2C” testado contra ROR2; * nenhuma sequência determinada; negrito: potenciais sítios de isomerização (consulte abaixo)

[0505] As sequências VH e VL acima foram formatadas em uma arquitetura de IgG1 humana completa nativa monoespecífica bivalente. As figuras 48A a 48B demonstram a análise de interferometria biocamada de Octet (Pall ForteBio) de uma diluição em série de duas vezes (200 a 12,5 nM) para dois candidatos de ligação ao ROR (Figura 48A, clone I2-A10; figura 48B, clone I2-A27). As afinidades e cinéticas de ligação foram determinadas a partir das diluições em série, e são mostradas na tabela 7. Tabela 7: cinética de ligação dos candidatos a ABS do ROR Candidato KD (nM) Kon (1/Ms) Kdis (1/s) RMax 5 -4 I2-A10 0,82 5,38x10 3,8x10 0,4159 5 -3 I2-A27 4,1 5,11x10 1,85x10 0,5668

[0506] Os candidatos de ligação ao ROR, formatados na arquitetura de IgG1 humana nativa monoespecífica bivalente, foram adicionalmente caracterizados pela ligação ao ROR1 e/ou ao ROR2. A tabela 8 apresenta candidatos que se ligam especificamente apenas ao ROR1, que se ligam especificamente apenas ao ROR2, e que reagiram de forma cruzada tanto para o ROR1 como para o ROR2. Os candidatos de ligação ao ROR também foram caracterizados por sua ligação aos domínios de ROR1 específicos.

A tabela 9 apresenta candidatos que se ligam especificamente aos domínios frizzled, tipo Ig e kringle.

Tabela 8: especificidade do candidato de ligação ao ROR Específico do Específico Reatividade cruzada com o ROR1 do ROR2 ROR1/ROR2 I2A-3 I2C-3 I2A-1 I2A-4 I2C-5 I2A-10 I2A-10 I2A-6 I2C-7 D54E Y55Q I2-A8 I2C-19 I2A-11 I2-A12 I2C-21 I2-A13 I2A-20 I2C-25 I2A-14 I2-A25 I2C-26 I2A-16 I2A-26 I2-A18 I2A-27 I2A-19 I2-A30 I2A-22 I2-A32 I2A-24 I2-A33 I2-A26 I2-A37 I2-A34 I2-A36 I2C-1 I2C-2 I2C-4 I2C-6 I2C-8 I2C-9 I2C-10

Tabela 8: especificidade do candidato de ligação ao ROR Específico do Específico Reatividade cruzada com o ROR1 do ROR2 ROR1/ROR2 I2C-11 I2C-12 I2C-13 I2C-14 I2C-15 I2C-16 I2C-17 I2C-18 I2C-20 I2C-22 I2C-23 I2C-24

Tabela 9: Mapeamento de domínios Clone Domínio de ROR1 I2A-11 Frizzled I2A-19 Frizzled I2C-23 Frizzled I2C-6 Frizzled I2A-32 Frizzled I2A-34 Frizzled I2A-26 Frizzled I2A-25 Frizzled I2A-26 Frizzled I2-A12 Frizzled I2A-1 Tipo Ig I2A-10 Ig-like I2A-10 tipo Ig D54E Y55Q I2A-14 tipo Ig I2A-16 tipo Ig I2A-20 tipo Ig I2A-22 tipo Ig I2A-3 tipo Ig I2A-35 tipo Ig I2A-4 tipo Ig I2-A6 tipo Ig I2-A13 tipo Ig I2-A18 tipo Ig

Tabela 9: Mapeamento de domínios Clone Domínio de ROR1 I2-A30 tipo Ig I2-A33 tipo Ig I2-A37 tipo Ig I2C-1 tipo Ig I2C-10 tipo Ig I2C-11 tipo Ig I2C-12 tipo Ig I2C-13 tipo Ig I2C-14 tipo Ig I2C-15 tipo Ig I2C-16 tipo Ig I2C-17 tipo Ig I2C-2 tipo Ig I2C-20 tipo Ig I2C-24 tipo Ig I2C-4 tipo Ig I2C-8 tipo Ig I2C-9 tipo Ig I2A-27 Kringle

[0507] A seleção dos candidatos de ligação do ROR foram adicionalmente analisados quanto às porções da sequência que poderiam afetar negativamente as propriedades dos anticorpos que são relevantes para o desenvolvimento clínico, como a estabilidade, mutabilidade e imunogenicidade. A análise computacional foi realizada de acordo com Kumar e Singh (Developability of biotherapeutics: computational approaches. Boca Raton: CRC Press, Taylor & Francis Group, 2016). Os resultados da análise estão apresentados na tabela 10 e demonstram um número limitado de porções de sequências adversas presentes nos clones listados que ilustram o potencial de desenvolvimento clínico adicional.

Tabela 10: Número de possíveis porções de sequências adversas Outros Sítios de Sítios de nº dos Sítios de Cys sítios desamidação glicosilação epítopos ABS isomerização na (LLQG, HPQ, (NG, NS, ligados a N de células (DG, DP, DS) CDR FHENSP, NA, NH, ND) (NXS/T) T* LPRWG, HHH) I2A-27 0 1 0 0 0 2 I2A-3 0 1 0 0 0 0 I2A-10 0 2 0 0 0 0 I2A-11 0 1 0 0 0 0 I2A-19 0 1 0 0 0 0 *Epítopo de célula T previsto encontrado na herceptina está presente nessas moléculas.

6.13.21. Exemplo 20: Eficácia do B-Body biespecífica de RORxCD3 in vitro

[0508] O ROR candidato e os sítios de ligação ao antígeno foram formatados nos formatos 1x1 e 1x2 do BC1 do B-Body e testados em uma série de modelos de eficácia tumoral.

6.13.21.1. Comparação de formato de B-Body biespecífico

[0509] O candidato a sítio de ligação ao antígeno (ABS) ROR I2A-3 e o candidato a ABS CD3 SP34-89 foram formatados nos formatos de B-Body bisespecíficos “BC1” 1x1 e 1x2. Com referência à figura 3 e à figura 26, o candidato a ABS do ROR forma os sítios de ligação A:F e R:T, enquanto o candidato a ABS CD3 forma o sítio de ligação H:L. Dois formatos 1x2 foram construídos com uma junção de 10 aminoácidos ou uma junção de 16 aminoácidos entre o domínio S e o domínio H, com referência à figura 26. As diferentes construções foram testadas no ensaio de estimulação da célula T NFκB GFP Jurkat descrito na presente invenção. Em resumo, as células T repórteres (células efetoras) foram misturadas com a linhagem de células tumorais alvo de câncer de pulmão de células não pequenas HOP-92, que expressa o antígeno do ROR1, ou a linhagem de células tumorais alvo de melanoma B16, que não expressa ROR1. Diluições em série das diferentes construções de B-Body foram, então, incubadas com a mistura efetor:alvo.

[0510] Conforme ilustrado na figura 49 e apresentado na tabela 11, os B-bodies biespecíficos de RORxCD3 1x1 e 1x2 resultaram na ativação das células T repórteres, quando misturadas com as linhagens tumorais expressando ROR1 (HOP- 92), mas nenhuma ativação foi observada quando os B-Bodies biespecíficos de RORXCD3 1x1 e 1x2 foram misturados com as linhagens tumorais que não expressam o ROR1 (B16). Além disso, o formato de B-Body 1x2 que possui a especificidade bivalente para o ROR1 foi mais potente do que o formato de B-Body 1x1, e a variação do comprimento da junção resultou em diferenças mínimas de potência. Tabela 11: Comparação do formato biespecífico de B-body Linhagem celular/anticorpo EC50 (pM) HOP-92 1x1 634 ligante de 16 aa HOP-92 1x2 47 ligante de 10 aa HOP-92 1x2 37

6.13.21.2. A ligação de CD3 por si só não ativa as células T

[0511] O candidato a ABS ao ROR I2A-10 e o candidato a ABS ao CD3 SP34-89 foi formatado em um formato de B-Body biespecífico 1x2 “BC1” (“I2-A10 1X2”). Em uma construção separada, um braço de controle para um antígeno tumoral diferente do ROR1 também foi formatado com o candidato a ABS ao CD3 SP34-89 em um formato de B-Body biespecífico “BC1” 1x2 (“controle negativo”). Com referência à figura 3 e à figura 26, o candidato a ABS ao ROR e o ABS do braço de “controle negativo”) forma os sítios de ligação A:F e R:T, enquanto o candidato a ABS ao CD3 forma o sítio de ligação H:L. As diferentes construções foram testadas em um ensaio de citotoxicidade de células T. Em suma, as células T CD8+ isoladas (células efetoras) foram misturadas com a linhagem de células tumorais de câncer de mama triplo negativo MDA- MD-231, que expressa o antígeno do ROR1 (células-alvo). Diluições em série das diferentes construções de B-Body foram, então, incubadas com a mistura efetor:alvo.

[0512] Conforme ilustrado na figura 50, o B-Body biespecífico trivalente RORXCD3 1x2 resultou na morte mediada por células T citotóxicas, quando misturado com as linhagens tumorais expressando ROR1 (MDA-MD-231), mas não resultou em citotoxicidade quando um B-Body biespecífico de CD3 com um ABS tumoral irrelevante (por exemplo, um antígeno tumoral não expresso em MDA-MD-231) foi adicionado à mistura.

6.13.21.3. Eficácia do B-body biespecífico RORxCD3 em múltiplos modelos tumorais

[0513] O candidato a ABS ao ROR I2A-3 e o candidato a ABS ao CD3 SP34-89 foram formatados em B-Body biespecíficos “BC1” 1x1 e 1x2, conforme descrito acima, com o formato 1x2 tendo uma junção de 10 aminoácidos entre os domínios S e H. As diferentes construções foram testadas no ensaio de estimulação da célula T NFκB GFP Jurkat descrito na presente invenção. Em suma, as células T repórteres (células efetoras) foram misturadas com as linhagens celulares tumorais expressando ROR1 HOP-92 (câncer de pulmão de células não pequenas 1), A549 (câncer de pulmão de células não pequenas

2), MDA-MD-231 (câncer de mama triplo negativo), JeKo-1 (linfoma de células do manto) e RPMI-8226 (mieloma múltiplo). As construções também foram misturadas com a linhagem de células tumorais de melanoma B16 que não expressa ROR1 (células-alvo). Diluições em série das diferentes construções de B-Body foram, então, incubadas com a mistura efetor:alvo.

[0514] Conforme mostrado nas figuras 51A a 51E e apresentado na tabela 12, os B-Bodies biespecíficos para RORxCD3 1x1 e 1x2 resultaram na ativação das células T repórteres, quando misturados com as linhagens tumorais expressando ROR1 HOP-92 (figura 51A), A549 (figura 51B), MDA-MD-231 (figura 51C), JeKo-1 (figura 51D) e RPMI-8226 (figura 51E), mas não houve ativação quando essas construções foram misturadas com as linhagens tumorais que não expressam ROR1 (B16). O formato de B-body 1x2 possuindo especificidade bivalente para ROR1 foi mais potente do que o formato B-body 1x1 em todas as linhagens tumorais testadas. Assim, os B- bodies biespecíficos para RORxCD3 1x1 e 1x2 demonstraram eficácia em uma gama de modelos tumorais. Tabela 12: Eficácia do B-body biespecífico em múltiplos modelos tumorais Linhagem celular/anticorpo EC50 (pM) HOP-92 1x1 634 HOP-92 1x2 37 MDA-MB-231 1x1 510 MDA-MB-231 1x2 31 A549 1x1 678 A549 1x2 70 JeKo-1 1x1 342 JeKo-1 1x2 41 RPMI-8226 29

6.13.21.4. Triagem de candidatos a ABS ao ROR para a ativação de células T

[0515] Os candidatos a ABS ao ROR I2A-1, I2A-3, I2A- 10, I2A-14, I2A-16, I2A-20, I2A-22 e I2A-27 foram formatados com o candidato a ABS ao CD3 SP34-89 em um formato de B-Body biespecífico “BC1” 1x2, como descrito acima, com o formato 1x2 tendo uma junção de 10 aminoácidos entre os domínios S e H. As diferentes construções foram testadas no ensaio de citotoxicidade de células T descrito acima. Em suma, as células T CD8+ isoladas (células efetoras) foram misturadas com a linhagem de células tumorais de câncer de mama triplo negativo MDA-MD-231, que expressa o antígeno do ROR1 (células-alvo) em uma razão E:T de 6:1. Diluições em série das diferentes construções de B-Body foram, então, incubadas com a mistura efetor:alvo.

[0516] Conforme ilustrado na figura 52 e apresentado na tabela 13, os B-bodies biespecíficos ao RORXCD3 1x2 I2A- 1, I2A-3, I2A-10, I2A-14, I2A-22 e I2A-27 resultaram em mortes mediadas por células T citotóxicas, quando misturados com as linhagens tumorais expressando ROR1 (MDA-MD-231), mas os B-bodies 1x2 I2A-16 e I2A-20 não resultaram em uma potente citotoxicidade. Além disso, o I2A-22 resultou em uma curva de dose-resposta irregular. Assim, os candidatos a ABS ao ROR I2A-1, I2A-3, I2A-10, I2A-14 e I2A-17 resultaram em mortes efetivas mediadas por células T. Tabela 13: Candidatos a ABS ao ROR Morte mediada por células T ABS EC50 (pM) I2-A1 5,3 I3-A3 23 I2-A10 13 I2-A14 21

I2-A16 ND I2-A20 ND I2-A22 ND I2-A27 8,2

6.13.21.5. A morte por citotoxicidade se correlaciona com a expressão de ROR1

[0517] O candidato a ABS ao ROR I2A-10 e o candidato a ABS ao CD3 SP34-89 foram formatados em um formato de B- Body biespecífico “BC1” 1x2, conforme descrito acima, com o formato 1x2 tendo uma junção de 10 aminoácidos entre os domínios S e H. O candidato I2A-10 foi testado no ensaio de citotoxicidade de células T descrito. Em suma, as células T CD8+ isoladas (células efetoras) foram misturadas com as linhagens celulares tumorais expressando ROR1 MDA-MD-231 (câncer de mama triplo negativo) e RPMI-8226 (mieloma múltiplo) em uma razão E:T de 4:1. Uma diluição em série do candidato foi incubada com a mistura efetor:alvo.

[0518] A figura 53A ilustra os dados de expressão de ROR1 publicados para as linhagens tumorais MDA-MD-231 e RPMI-

8226. A figura 53B e a figura 53C demonstram que a eficácia da citotoxicidade observada em nossos experimentos se correlaciona com o ROR1 nas linhagens celulares tumorais MDA-MD-231 e RPMI-8226.

6.13.21.6. Ativação primária de células T com candidatos a ABS ao ROR I2A-10 e I2A-27

[0519] Os candidatos a ABS ao ROR I2A-10 e I2A-27 foram formatados com o candidato a ABS ao CD3 SP34-89 em um formato de B-Body biespecífico “BC1” 1x2, como descrito acima, com o formato 1x2 tendo uma junção de 10 aminoácidos entre os domínios S e H. As sequências de aminoácidos para as quatro cadeias polipeptídicas que formam o B-body BC1 1x2 I2A-10 estão listadas nas SEQ ID Nos: 84, 85, 87 e 88. As sequências de aminoácidos para as quatro cadeias polipeptídicas que formam o BC1 1x2 I2A-27 estão listadas nas SEQ ID Nos: 89, 90, 92 e 93.

[0520] As diferentes construções foram testadas no ensaio de ativação de células T, conforme quantificado por citometria de fluxo. Em suma, as células mononucleares de sangue periférico isoladas (PBMCs, células efetoras) foram misturadas com a linhagem de células tumorais de câncer de mama triplo negativo MDA-MD-231 e a linhagem de células tumorais de carcinoma pancreático PANC1 (células-alvo), cada uma expressando o antígeno do ROR1, em uma razão E:T de 7:1. Diluições em série das diferentes construções de B-Body foram, a seguir, incubadas com a mistura efetor:alvo e incubadas juntas durante 44 horas. As células foram, em seguida, marcadas com marcadores de células T CD3, CD4 e CD8, bem como com os marcadores de ativação CD25 e CD69, e foram analisadas por citometria de fluxo.

[0521] Conforme mostrado nas figuras 54A a 54F os B- bodies I2A-10 e I2A-27 ativaram as células T CD8+ na população de PBMC, conforme determinado pela expressão de CD25 (figura 54A), CD69 (figura 54C), e tanto o CD25 como o CD69 (figura 54E), e as células T CD4+ ativadas na população de PBMC, conforme determinado por CD25 (figura 54A), CD69 (figura 54D), e tanto CD25 quanto CD69 (figura 54F). Assim, os candidatos a ABS ao ROR são capazes de ativar as células T primárias.

6.13.21.7. Internalização dos candidatos a ABS ao ROR I2A-10 e I2A-27

[0522] Os candidatos a ABS ao ROR I2A-10 e I2A-27 foram formatados com o candidato a ABS ao CD3 SP34-89 em um formato de B-Body biespecífico “BC1” 1x2, como descrito acima, com o formato 1x2 tendo uma junção de 10 aminoácidos entre os domínios S e H. As diferentes construções foram testados quanto à internalização por linhagens celulares tumorais, conforme foi quantificado por citometria de fluxo. Em suma, as células MDA-MB-231 foram incubadas por 2 horas a 37 oC ou 4 oC com I2-A10, I2-A27, ou com um isotipo controle. Após 2 horas, um anticorpo secundário marcado foi adicionado a 4 oC por 30 min e, em seguida, foi analisado por citometria de fluxo. A internalização porcentual foi calculada pela normalização entre o isotipo controle (0%) e o controle a 4 oC (100%) com base na intensidade de fluorescência média (IFM).

[0523] Conforme ilustrado na figura 55, 26% e 36% dos candidatos I2A-10 (painel superior) e I2A-27 (painel inferior) foram internalizados após um período de incubação de 2 horas com células MDA-MB-231, respectivamente. A internalização pelas células tumorais torna possível várias estratégias de conjugado anticorpo-fármaco para matar as células tumorais que expressam um antígeno do ROR.

6.13.22. Exemplo 21: Purificação em uma única etapa do B-body biespecífico RORxCD3

[0524] Os candidatos a ABS ao ROR I2A-10 e I2A-27 foram formatados com o candidato a ABS ao CD3 SP34-89 em um formato de B-Body biespecífico trivalente “BC1” 1x2, como descrito acima, com o formato 1x2 tendo uma junção de 10 aminoácidos entre os domínios S e H. As construções foram purificadas usando uma purificação em uma etapa usando a resina de afinidade de CH1 CaptureSelect™.

[0525] A figura 56 mostra a análise por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), demonstrando que uma etapa única de purificação por afinidade de CH1 produz picos únicos e monodispersos por filtração em gel, em que > 98% é proteína não agregada para os candidatos a B- body 1x2 I2A-10 (painel superior) e I2A-27 (painel inferior).

[0526] A figura 57A mostra géis de SDS-PAGE não redutores dos candidatos a B-body 1x2 I2A-10 (painel esquerdo) e I2A-27 (painel direito), demonstrando uma grande banda de construções totalmente montadas (banda de 250 kDa de alta migração). A figura 57B mostra a análise com o bioanalisador (Agilent) de amostras não reduzidas para os candidatos a B-body 1x2 I2A-10 e I2A-27, indicando uma grande banda de construções totalmente montadas.

[0527] A eficiência de purificação dos anticorpos bisespecíficos anti-CH1 também foi testada para moléculas de ligação ao ROR apenas com mutações ortogonais knob-hole padrão introduzidas nos domínios CH3 encontrados em suas posições nativas dentro da porção Fc do anticorpo biespecífico, sem outras modificações de domínio. Portanto, cada um dos dois anticorpos testados, KL27-6 e KL27-7, continha dois domínios CH1, um em cada braço do anticorpo. Como descrito em mais detalhes na seção 0, cada anticorpo biespecífico foi expresso, purificado a partir de produtos de proteína indesejados em uma coluna anti-CH1, e analisado em um gel de SDS-PAGE. Conforme ilustrado na figura 58, uma banda significativa em 75 kDa representando um anticorpo biespecífico incompleto estava presente, interpretada como um complexo contendo apenas (i) uma primeira e segunda ou (ii) terceira e quarta cadeias polipeptídicas, com referência à figura 3. Assim, os métodos que utilizam anti- CH1 para purificar moléculas biespecíficas completas que têm um domínio CH1 em cada braço resultaram em contaminação de fundo devido a complexos de anticorpos incompletos.

6.13.23. Exemplo 22: Função efetora de redução de mutações de Fc

[0528] Uma série de variantes de Fc modificadas foi gerada no anticorpo IgG1 monoclonal trastuzumabe (herceptina, “IgG1 tipo selvagem”) com mutações nas posições L234, L235 e P329 do domínio CH2. As mutações específicas para as variantes testadas estão descritas na tabela 14 abaixo e incluem sFc1 (PALALA), sFc7 (PGLALA) e sFc10 (PKLALA). Todas as variantes apresentaram estabilidade semelhante, conforme determinado pelas temperaturas de fusão (tabela 14, TM1 e TM2).

[0529] IgG1 tipo selvagem e as variantes de Fc foram imobilizadas no biossensor da Octet e o FcγRIa solúvel foi adicionado ao sistema para determinar a ligação. As figuras 59A e 59B mostram a análise de interferometria biocamada na Octet (Pall ForteBio) demonstrando a ligação do FcγRIa ao trastuzumabe (figura 59A, “WT IgG1”), mas não do sFc10 (figura 59B). Após a adição de FcγRIa, um aumento no sinal foi observado para o trastuzumabe, mas nenhum aumento de sinal observável foi detectado para sFc10, demonstrando que o FcγRIa não se liga mais ao anticorpo com as mutações por manipulação. Os resumos de ligações para as variantes testadas estão apresentados na tabela 14. Além disso, todas as variantes mantiveram forte ligação ao HER2 (não mostrado). Tabela 14: comparação da variante de Fc TM1 TM2 Ligação ao Variante L234 L235 P329 (°C) (°C) FcγRIa sFc1 A A P 68,1 81,8 Sim (fraca) sFc7 A A G 65,7 81,8 Não sFc10 A A K 65,3 81,1 Não IgG1 tipo L L P 66,2 81,1 Sim (forte) selvagem

[0530] As variantes IgG1 tipo selvagem e Fc foram testadas em um ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) como outra medida de ligação ao FcγR, especificamente FcγRIIIa. Conforme ilustrado na figura 60, o trastuzumabe (herceptina, “IgG1 tipo selvagem”) apresentou morte, enquanto nem o sFc7 nem o sFc10 resultaram em níveis detectáveis de morte. As variantes de IgG1 tipo selvagem e Fc também foram testadas quanto à ligação ao componente do complemento C1q por ELISA. Conforme ilustrado na figura 61, o trastuzumabe (herceptina, “IgG1 tipo selvagem”) demonstrou ligação ao C1q, enquanto nem o sFc1, nem sFc7 e nem o sFc10 resultaram em ligação detectável ao C1q. Assim, os resultados demonstram que as variantes de Fc testadas têm níveis reduzidos de função Fc efetora.

6.13.24. Exemplo 23: Eficácia do B-Body biespecífico de RORxCD3 in vivo

[0531] A eficácia in vivo foi medida utilizando estudos de xenoenxerto em camundongos humanizados. Em suma, 5x106 células tumorais MDA-MB-231 foram enxertadas subcutaneamente no flanco traseiro de camundongos NOD Scid Gamma (NSG) e foram cultivadas até aproximadamente 120 a 150 mm3. Os camundongos foram, em seguida, humanizados através de injeção intravenosa (IV) de 1x107 PBMCs humanos de um único doador. Os camundongos NSG humanizados foram randomizados em três grupos de oito e dosados IV com PBS, 0,5 mg/Kg de candidato a ABS ao ROR I2-A10 formatado com o candidato a ABS ao CD3 SP34-89 em uma arquitetura de B-body 1x2 (“I2-A10”), ou 0,5 mg/Kg de candidato a ABS ao ROR I2- A27 formatado com o candidato a ABS ao CD3 SP34-89 em uma arquitetura de B-body 1x2 (“I2-A27”) três dias após o enxertamento de PBMC. A dosagem continuou duas vezes por semana durante três semanas. Os animais foram monitorados quanto ao crescimento tumoral, peso corporal e estado geral de saúde. Após a conclusão do estudo, os animais foram sacrificados para análise. A análise de citometria de fluxo foi realizada utilizando técnicas padrão para determinar o estado de humanização dos camundongos NSG.

[0532] Os tumores são coletados e analisados utilizando técnicas de imuno-histoquímica padrão para monitorar a infiltração de células T humanas nos tumores em resposta ao tratamento. A IHC é realizada utilizando técnicas padrão. Em suma, amostras de FFPE são desparafinadas e re- hidratadas por cozimento a 60 oC, colocando em solução de xileno 100% e, em seguida, re-hidratadas através de uma série de lavagens com etanol (etanol 100%, etanol 95%, etanol 70%,

etanol 50%, PBS). A recuperação do antígeno é realizada incubando as lâminas durante 10 minutos em tampão de citrato de sódio 10 mM + Tween 20 0,05%, em pH 6,0, a 95 oC. O kit de IHM mouse on mouse da AbCam (nº de catálogo Ab127055) é usado de acordo com as instruções do fabricante para coloração. Em suma, a atividade da peroxidase endógena é bloqueada com uma solução de peróxido de hidrogênio e as interações endógenas não específicas são bloqueadas com uma solução Rodent Block. As lâminas são incubadas com os anticorpos primários de acordo com as recomendações do fabricante (geralmente 2 horas à temperatura ambiente ou de um dia para o outro a 4 oC) e, em seguida, foram coradas com o polímero HRP mouse on mouse do kit da AbCam. A coloração com o cromógeno DAB com contracoloração com hematoxilina é usada para visualização.

6.13.24.1. Resultados de B-Body biespecíficos trivalentes RORXCD3 na redução do crescimento tumoral

[0533] Conforme mostrado nas figuras 62A a 62C, o volume do tumor foi monitorado para camundongos enxertados com células tumorais, humanizados com PBMCs (seta sólida esquerda), e em seguida tratados IV (seta tracejada direita) com PBS (figura 62A), o candidato a B-body 1x2 I2-A10 (figura 62B), ou o candidato a B-body 1x2 I2-A27 (figura 62C). A figura 63 mostra volume do tumor na conclusão do estudo para cada um dos camundongos, com desvio médio e padrão para cada grupo mostrado. O quadrado aberto para o grupo I2-A27 foi removido da análise devido à provável não humanização por PMBCs. Os resultados demonstram que o tratamento com I2-A27 resultou em uma redução significativa no crescimento tumoral de aproximadamente 40%.

[0534] O estado de humanização dos camundongos NSG no estudo foi confirmado por meio da análise de citometria de fluxo. Como mostrado na tabela 15, todos os camundongos analisados foram humanizados com sucesso com linfócitos humanos, conforme determinado pela coloração para CD45 humano (%hu CD45+). A amostra 03_B10 (b) não foi analisada. As populações de linfócitos humanizados em todos os camundongos analisados também possuíam células T humanas, incluindo células T positivas CD4 e CD8, conforme determinado por marcação para CD3 humano (% de CD3 acoplado nas células T CD3+ humanas).

[0535] A imuno-histoquímica foi realizada nas amostras do tumor e confirmou a infiltração de células T humanas nos tumores em resposta ao tratamento. Tabela 15: Humanização de camundongos NSG Acoplamento não Acoplamento Acoplamento dublete huCD45+ CD3+ humano ID da Condição %ms %hu %CD3+ %CD4+ %CD8+ amostra CD45+ CD45+ 01_A01 PBS 48,1 50,8 99,6 44,5 46,1 01_A02 PBS 60,1 39,0 98,5 76,6 13,7 01_A07 PBS 56,0 43,8 99,1 23,5 64,1 01_B06 PBS 42,6 56,4 99,8 80,6 9,8 01_C04 PBS 51,0 47,7 99,2 64,6 23,8 01_C05 PBS 22,1 77,0 98,5 77,9 14,1 01_C09 PBS 67,8 31,8 99,4 27,7 64,6 01_D05 PBS 37,0 62,0 98,7 77,2 18,0 02_B01 I2-A10 1x2 44,8 53,5 99,0 83,3 10,4 02_B07 I2-A10 1x2 50,4 47,8 98,3 78,6 16,5 02_C02 I2-A10 1x2 6,9 92,8 98,5 81,5 11,9 02_C03 I2-A10 1x2 32,6 65,2 99,5 81,6 9,2 02_C06 (a) I2-A10 1x2 2,9 94,4 95,0 60,2 30,9 02_C08 (a) I2-A10 1x2 31,3 65,2 98,7 53,0 39,6 02_D04 (a) I2-A10 1x2 29,9 66,5 99,3 33,9 61,1

03_A03 I2-A27 1x2 32,4 66,4 93,0 84,7 3,8 03_A04 I2-A27 1x2 30,5 66,9 98,9 84,9 6,2 03_A10 I2-A27 1x2 58,6 40,2 98,9 92,5 4,2 03_B02 I2-A27 1x2 20,5 78,2 99,2 86,6 7,6 03_B10 (b) I2-A27 1x2 ---- ---- ---- ---- ---- 03_C10 I2-A27 1x2 34,2 64,2 98,8 91,7 4,8 03_D03 I2-A27 1x2 60,9 38,5 99,4 49,8 43,2

6.13.25. Exemplo 24: Eficácia do B-body™ biespecífico ROR1xCD3

[0536] Mais moléculas de ligação ao antígeno do ROR compreendendo as seis CDRs do I2A-27, como mostrado na tabela 6, foram preparadas, e os experimentos foram realizados para testar sua eficácia como construções biespecíficas trivalentes em um formato de B-body™ biespecífico ROR1xCD3.

6.13.25.1. Geração de mais anticorpo biespecífico B- body™ ROR1xCD3 1x2 adicional com base em I2-A27

[0537] O candidato a ABS ao ROR I2A-27 foi formatado com o candidato a ABS ao CD3 SP34-89 em um formato de B-Body biespecífico “BC1” 1x2, como descrito acima, com o formato 1x2 tendo uma junção de 10 aminoácidos entre os domínios S e H (consulte, por exemplo, a figura 26 para o esquema de domínios). As sequências de aminoácidos para as cinco cadeias polipeptídicas que formam uma molécula de ligação ao antígeno do ROR biespecífico trivalente BC1 1x2 I2A-27 exemplar estão listadas como SEQ ID NO: 96 (cadeia 1), SEQ ID NO: 97 (cadeia 2), SEQ ID NO: 98 (cadeia 3), SEQ ID NO: 99 (cadeia 4) e SEQ ID NO: 97 (cadeia 5).

[0538] Na descrição a seguir neste exemplo, o termo “B-body™ 1x2 I2-A27” ou “I2-A27” ou “A27” se refere a este B-body™ 1x2 ROR1xCD3 com uma cadeia 1 da SEQ ID NO: 96, uma cadeia 2 da SEQ ID NO: 97, uma cadeia 3 da SEQ ID NO: 98,

uma cadeia 4 da SEQ ID NO: 99 e uma cadeia 5 da SEQ ID NO:

97.

6.13.25.2. Ligação do anticorpo biespecífico B-body™ 1x2 ROR1xCD3 ao CD3 e ROR1

[0539] Como descrito no exemplo 19 acima, SP34-89 mostrou uma Kd monovalente de 23 nM para o CD3 delta humano e um heterodímero épsilon (consulte a figura 47).

[0540] Neste exemplo, a ligação ao CD3 humano e cinomólogo foi adicionalmente caracterizada pela avaliação da ligação celular às células T Jurkat, uma linhagem celular nocaute de CD3 Jurkat, ou uma linhagem de células T cinomólogas. Especificamente, a ligação do anticorpo humanizado SP34-89 às células T Jukart humanas e cinomólogas foi determinada por citometria de fluxo. O SP34-89 foi incubado com as linhagens celulares indicadas nas concentrações indicadas, seguido pela marcação com um anticorpo secundário fluorescentemente marcado. A intensidade de fluorescência média foi representada graficamente em comparação com a concentração de SP34-89. Conforme ilustrado na figura 64A, SP34-89 exibiu forte ligação tanto com as células T Jurkat como com as cinomólogas, mas não apresentou ligação significativa com a linhagem celular nocaute de CD3, indicando que a reatividade cruzada humana e cinomóloga e a ligação celular foram mantidas.

[0541] Além disso, a afinidade de ligação do anticorpo biespecífico B-body™ I2-A27 1x2 resultante, como descrito na seção 6.13.25.1, pelo heterodímero CD3 delta e épsilon cinomólogo, foi determinada pela avaliação de ligação de interferometria de biocamada (BLI).

[0542] Mais especificamente, a análise de afinidade de ligação monovalente foi realizada utilizando o OctetQK 384 (ForteBio) utilizando biossensores de Fc. O B-body™ não marcado é primeiramente ligado ao biossensor de Fc em uma concentração para produzir uma resposta de aproximadamente 1 nm (tipicamente 10 a 50 nM de proteína). Os biossensores são, em seguida, equilibrados em tampão cinético 10X (ForteBio) para estabelecer uma linha de base. O monômero não marcado de cada concentração de antígeno variou de 50 nm a 0,75 nM. As respostas de associação e dissociação foram monitoradas e registradas. As Kon e Koff foram ajustadas usando o software de análise Octet. Conforme ilustrado na figura 64B, o anticorpo biespecífico exibiu uma Kd monovalente de 3 nM para o heterodímero de CD3 delta e épsilon cinomólogo.

[0543] Em seguida, a ligação ao ROR1 foi avaliada. Consistentemente com os dados descritos em 6.13.20.2 acima (consulte, por exemplo, a figura 48B), quando as sequências VH e VL foram formatadas em uma arquitetura de IgG monoespecífica bivalente, o anticorpo IgG I2-A27 apresentou ligação monovalente de 2,8 nM ao ROR1 e ligação mínima ao ROR2 (figura 65A e figura 65B).

[0544] Em seguida, a ligação monovalente e bivalente do anticorpo biespecífico B-body™ 1x2 I2-A27 ao ROR1 e ao ROR2 foi analisada utilizando BLI.

[0545] A análise de ligação monovalente foi realizada conforme descrito acima, e o anticorpo foi capturado com um sensor de Fc e colocado em contato com o antígeno indicado para a fase de associação, seguido por uma fase de dissociação apenas no tampão.

[0546] A análise de ligação bivalente foi realizada usando a OctetQK 384 (ForteBio) utilizando biossensores de estreptavidina. O antígeno biotinilado foi primeiramente ligado ao biossensor de estreptavidina em uma concentração para produzir uma resposta de aproximadamente 1 nm (tipicamente 10 a 50 nM de proteína biotinilada). Os biossensores foram, em seguida, equilibrados em tampão cinético 10X (ForteBio) para estabelecer uma linha de base. O B-body™ 1x2 foi colocado em contato com os sensores revestidos com antígeno em concentrações que variam de 50 nm a 0,75 nM. As respostas de associação e dissociação foram monitoradas e registradas. As Kon e Koff foram ajustadas usando o software de análise Octet.

[0547] Conforme mostrado nas figuras 65C, 65D e 65E, o formato de B-body™ 1x2 I2-A27 mostrou ligação monovalente de 3,8 nM e ligação bivalente de 0,71 nM ao ROR1 e ligação mínima ao ROR2.

6.13.25.3. Caracterização adicional do anticorpo biespecífico B-body™ ROR1xCD3 1x2

[0548] Um anticorpo biespecífico B-body™ 1x2 I2-A27, conforme descrito na seção 6.13.25.1, foi produzido através da transfecção transitória das cadeias polipeptídicas 1-4 que codificam DNA (a cadeia polipeptídica 5 é a mesma que a cadeia polipeptídica 2) em células Expi-CHO. O anticorpo de cinco cadeias foi purificado com uma resina de afinidade de CH1 e o tampão foi trocado em PBS, pH 7,4.

[0549] A montagem e a pureza do B-body™ resultante foi avaliada através de SDS-PAGE não redutor e redutor.

[0550] O SDS-PAGE não redutor foi realizado utilizando 2 μg de anticorpo, variando de cerca de 0,2 a 1 mg/mL. A amostra, até 10 μL, foi misturada com 4 μL de tampão de amostra Laemmli 2X (Bio-Rad) em tubos PCR de 200 μL. Em um tubo separado foram adicionados 4 μL de ladder de peso molecular (Precision Plus Protein Dual Color Standards, Bio- Rad). Os tubos de PCR foram incubados a 55 °C por 10 min e resfriados até 4 °C usando um termociclador. Os tubos foram centrifugados e todo o volume de cada tubo foi carregado em poços individuais de um gel Bis-Tris de 4 a 15% (Mini-PROTEAN TGX, Bio-Rad). As amostras foram submetidas à eletroforese durante 30 min usando um sistema Mini-PROTEAN Tetra da Bio- Rad com tampão de análise tris/glicina/SDS (diluído de 10X a 1X) operado em tensão constante (220 V) usando uma fonte de alimentação externa. Os géis foram lavados com água deionizada e marcados com corante coomassie (corante de proteínas GelCode Blue Safe, da ThermoFisher Scientific) por um mínimo de 15 minutos. Os géis foram posteriormente desmarcados com água deionizada por um mínimo de 30 minutos, e fotografados.

[0551] A SDS-PAGE redutora foi realizada utilizando 3 μg de anticorpo, variando de ~0,3 a 1,5 mg/mL. A amostra, até 10 μL, foi misturada com 4 μL de tampão de amostra Laemmli 2X (Bio-Rad) em tubos PCR de 200 μL, e 5 µL de ditiotreitol 5 M. Em um tubo separado foram adicionados 4 μL de ladder de peso molecular (Precision Plus Protein Dual Color Standards, Bio-Rad). Os tubos de PCR foram incubados à temperatura ambiente por 30 minutos. As amostras foram, em seguida, incubadas a 55 °C por 10 min e resfriadas até 4 °C usando um termociclador. Os tubos foram centrifugados e até 14 µL de amostra foram colocados em poços individuais de um gel Bis-Tris de 4 a 15% (Mini-PROTEAN TGX, Bio-Rad). As amostras foram submetidas à eletroforese durante 30 min usando um sistema Mini-PROTEAN Tetra da Bio-Rad com tampão de análise tris/glicina/SDS (diluído de 10X a 1X) operado em tensão constante (220 V) usando uma fonte de alimentação externa. Os géis foram lavados com água deionizada e marcados com corante coomassie (corante de proteínas GelCode Blue Safe, da ThermoFisher Scientific) por um mínimo de 15 minutos. Os géis foram posteriormente desmarcados com água deionizada por um mínimo de 30 minutos, e fotografados.

[0552] O B-body™ 1x2 apresentou um comportamento perto do peso molecular esperado de 200 kD em um formato não reduzido (dados não mostrados aqui). Em um formato reduzido, as 3 bandas esperadas foram separadas (uma cadeia em 75 kD, uma cadeia em 50 kD e 2 cadeias em 25kD) (dados não mostrados aqui).

[0553] A proteína foi posteriormente analisada por eletroforese capilar em formato reduzido e não reduzido.

[0554] A eletroforese capilar foi executada em um bioanalisador 2100 da Agilent, de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as amostras foram incubadas com corante de marcação no tampão de marcação em gelo, no escuro, por 30 minutos. A etanolamina foi, em seguida, adicionada, e as amostras foram incubadas por 10 minutos no gelo no escuro, para dissipar o corante não incorporado.

Para as amostras reduzidas, DTT 1 M foi adicionado ao tampão de amostra. As amostras foram incubadas a 98 °C por 5 minutos para desnaturar as amostras antes do carregamento no chip NanoFluidic. A pureza porcentual foi calculada a partir das três principais bandas da amostra reduzida, como sendo 95,54% (dados não mostrados aqui).

[0555] A proteína do anticorpo foi, em seguida, analisada por meio de um conjunto de colunas para avaliar a homogeneidade com cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), a propensão à agregação foi analisada por com cromatografia de adsorção em monocamada (standup monolayer adsorption chromatography - SMAC) e a hidrofobicidade com cromatografia de interação hidrofóbica (CIH).

[0556] A análise por SEC foi realizada utilizando se uma coluna TSKgel G3000SWXL de 7,8 mm DI x 30 cm (Tosoh Bioscience LLC, PN 08541) em um HPLC 1100 da Agilent. Os anticorpos foram normalizados a 1 mg/mL de concentração em dPBS (pH 7,4) e purificados por meio de centrifugação, para peletizar os particulados. O tampão de fase móvel foi dPBS (pH 7,4, sem cálcio e magnésio). Para cada amostra, 10 μL foram carregados e eluídos isocraticamente a 1,0 mL/min durante 20 min. A absorvância foi monitorada a 280 nm. Os picos cromatográficos foram integrados para determinar a % de homogeneidade e o tempo de retenção.

[0557] A análise por SMAC foi realizada utilizando uma coluna Zenix SEC 300 mm de 4,6 mm de DI x 300 mm (Sepax Technologies, PN 213300P-4630) em um HPL 1100 da Agilent. Os anticorpos foram normalizados a 1 mg/mL de concentração em dPBS (pH 7,4) e purificados por meio de centrifugação, para peletizar os particulados. O tampão de fase móvel foi dPBS (pH 7,4, sem cálcio e magnésio). Para cada amostra, 10 μL foram carregados e eluídos isocraticamente a 0,25 mL/min durante 32 min. A absorvância foi monitorada a 280 nm. O tempo de retenção da amostra foi calculado e comparado com um conjunto de controles padrão para identificar anticorpos com maior tempo de retenção (maior propensão a formar agregados).

[0558] A análise por CIH foi realizada utilizando uma coluna TSKgel Butyl-NPR de 4,6 mm de DI x 3,5 cm (Tosoh Bioscience LLC, PN 14947) em um HPLC 1100 da Agilent. Os anticorpos foram normalizados a 2 mg/mL de concentração em dPBS (pH 7,4) e, em seguida, diluídos com um volume igual de tampão de fase móvel B até uma concentração final de proteína de 1 mg/mL. A coluna foi equilibrada com 100% de tampão B de fase móvel (sulfato de amônio 2 M/fosfato de sódio 20 mM, pH 7,0) a uma vazão de 1 mL/min. Para cada amostra, 10 μL foram carregados e eluídos usando um gradiente de 100% de tampão B de fase móvel até 100% de tampão A de fase móvel (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,0) a 1,0 mL/min durante 15 min, mantido em 100% de A por 3 min para lavar a coluna, e retornou para 100% de B durante 2 min, para equilíbrio. A absorvância foi monitorada a 280 nm. O tempo de retenção da amostra foi calculado e comparado com um conjunto de controles padrão para identificar anticorpos com maior tempo de retenção (maior hidrofobicidade).

[0559] Os resultados destas análises são mostrados nas figuras 66A, 66B e 66C. Como mostrado, a proteína apareceu > 99% homogênea pela SEC e resultou em um único pico com SMAC e CIH, que estavam dentro da faixa observada para outros anticorpos em desenvolvimento, sugerindo um perfil aceitável de agregação e hidrofobicidade.

[0560] A proteína foi, em seguida, analisada com o instrumento analítico UNcle, capaz de medir a Tm, IPD e o diâmetro hidrodinâmico utilizando espalhamento de luz dinâmico (ELD), espalhamento de luz estático (ELE) e fluorescência. Os anticorpos foram normalizados a 1 mg/mL de concentração em dPBS (pH 7,4) e purificados por meio de centrifugação, para peletizar os particulados. As amostras foram aliquotadas em um dispositivo de cubeta capilar de quartzo de 9 µL Uncle, (Uni) e vedadas. O IPD e o diâmetro hidrodinâmico foram medidos por ELD a 15 °C. A temperatura foi aumentada gradualmente de 15 °C para 95 °C a 0,5 °C/min, durante o que a Tm foi medida por fluorescência intrínseca. Os dados foram analisados utilizando o software de análise UNcle v. 3.1.

[0561] A proteína apresentou temperaturas de fusão de 67,4 °C e 73,7 °C. O IPD mediano de três medidas foi 0,19, o que indica uma amostra monodispersa (IPD < 0,25 é considerado monodisperso) com diâmetro hidrodinâmico de 14,4 nm (consulte a tabela 16 abaixo). Tabela 16. Resultados para temperatura de fusão, índice de polidispersividade e diâmetro hidrodinâmico do instrumento analítico UNcle Tm1 (°C) Tm2 (°C) IPD Diâmetro (nm) B-body I2- 67,4 73,7 0,19 14,4 A27 1x2™

6.13.25.4. Avaliação funcional in vitro do anticorpo biespecífico B-body™ ROR1xCD3 1x2

[0562] A capacidade funcional de um B-body™ I2-A27 em ensaios de co-cultura celular de células T e células cancerosas expressando ROR1 foi analisada. Foram avaliadas as linhagens de células cancerosas que expressavam ROR1 e/ou ROR2.

[0563] MDA-MB-231, RPMI-8226 e K562 foram avaliados pelo número de cópias de ROR1expressos na superfície e pela proteína ROR2 intimamente relacionada através de citometria de fluxo, usando um anticorpo específico do ROR1 (I2-A27) e um anticorpo específico do ROR2 (I2-C21). A especificidade dos anticorpos utilizados para a avaliação do número de cópias foi determinada por BLI e foi confirmado que o I2-A27 se liga seletivamente ao ROR1 e o I2-C21 se liga seletivamente ao ROR2. Foi determinado que a linhagem celular MDA-MB-231 expressa principalmente ROR1, que a linhagem celular RPMI-8226 expressa tanto ROR1 quanto ROR2, e que a linhagem celular K562 expressa principalmente ROR2, como mostrado na tabela 17. Tabela 17. Número de cópias de proteína de superfície de ROR1 e ROR2 nas células MDA-MB-231, RPMI-8226 e K562 Número de cópias Número de cópias de ROR1 de ROR2 MDA-MB-231 114.000 < 7.000 RPMI-8226 110.000 72.000 K562 < 7.000 68.000

[0564] Para avaliar se o B-body™ I2-A27 poderia ativar células T na presença das células cancerosas expressando ROR1 ou ROR2, um ensaio de gene repórter de co- cultura de NFkB Jurkat foi utilizado. A ativação das células

T Jurkat leva à ativação do elemento de resposta NFkB e à produção de eGFP. Especificamente, as células RPMI-8226 ou K562 foram plaqueadas no dia do ensaio (35.000 células/poço) ou as células MDA-MB-231 foram plaqueadas um dia antes do ensaio (25.000 células/poço) em uma placa de 96 poços de fundo claro, paredes pretas de meia-área. No dia do ensaio, foram adicionadas diluições do anticorpo nas concentrações indicadas na presença de anticorpo anti-CD28 a 1 μg/mL. As células repórteres NFkB-GFP Jurkat foram adicionadas ao poço a 75.000 células/poço. A placa foi incubada por 6 horas a 37 °C/5% de CO2. Um corante de supressão de sinal de fundo foi adicionado, e um leitor de placa Safire foi usado para determinar a fluorescência a 520 nm.

[0565] Conforme mostrado nas figuras 67A, 67B, 67C e 67D, o anticorpo biespecífico B-body™ 1x2 I2-A27 demonstrou ser capaz de ativar a linhagem de células repórter Jurkat na faixa de pM na presença de células MDA-MB-231 (expressando ROR1) ou RPMI-8226 (expressando ROR1 e ROR2), mas não na presença de células K562 (expressando ROR2) ou na ausência de uma linhagem celular alvo.

[0566] Em seguida, a função do anticorpo biespecífico B-body™ 1x2 I2-A27 para ativar células T CD8+ primárias foi estudada na presença de linhagens celulares expressando ROR1, conforme avaliado pelo aumento dos níveis de expressão do marcador de ativação de células T precoce, CD69, e o marcador de ativação de células T tardio, CD25. Especificamente, o anticorpo biespecífico B-body™ 1x2 I2- A27, células T CD8+, com ou sem células MDA-MB-231 ou células RPMI-8226 em uma razão de 6:1 de E:T, foram incubados por 48 horas. Em seguida, as células foram marcadas com anticorpo CD69 PE-Cy7 (BD Biosciences 561928) e um anticorpo CD25 BB515 (BD Biosciences 564467) por 1 hora a 4 °C. Após a marcação, as amostras foram centrifugadas a 300 x g e ressuspensas em uma solução de imageamento de células vivas (Thermo Fisher) antes da análise por citometria de fluxo no analisador IntelliCyt IQue.

[0567] Conforme mostrado nas figuras 68A a 68D, o anticorpo biespecífico B-body™ 1x2 I2-A27 levou a um aumento dependente da dose na expressão de CD69 e CD25 quando na presença de células expressando ROR1 (MDA-MB-231 ou RPMI- 8226), mas não na ausência dessas células.

[0568] Foi avaliado se as células T ativadas poderiam posteriormente matar as linhagens celulares expressando ROR1 pela liberação de LDH das células-alvo e secreção de granzima B, TNFα e IFNγ pelas células efetoras CD8+.

[0569] A liberação de LDH das células-alvo foi analisada da seguinte forma: as células RPMI-8226 foram plaqueadas no dia do ensaio ou as células MDA-MB-231 foram plaqueadas no dia anterior ao ensaio em placas de 96 poços de fundo claro e paredes pretas de meia-área. As células CD8+ foram adicionadas a uma razão de efetor para célula- alvo de 6:1. O meio de ensaio foi RPMI + 2% de FBS inativado pelo calor. As células foram incubadas por dois dias a 37 °C/5% de CO2. Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase (Roche) foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante usando o meio de ensaio de cada poço. Os dados foram normalizados para um controle de CD8+ negativo (0% de citotoxicidade) e um controle morto por detergente (100% de citotoxicidade).

[0570] Conforme mostrado nas figuras 69A e 69B, o anticorpo biespecífico B-body™ 1x2 I2-A27 levou à citotoxicidade dependente da dose das células expressando ROR1 na presença de células T CD8+, mas não na ausência de células T CD8+.

[0571] A secreção da granzima B, TNFα e IFNγ pelas células efetoras CD8+ foi analisada da seguinte forma: o kit de ensaio de proteína secretada MultiCyt QBeads PlexScreen (IntelliCyt) foi usado para determinar o nível de TNFα, IFNγ e granzima B secretados, de acordo com o protocolo do fabricante. Em suma, as esferas de captura para cada analito são fornecidas como um concentrado de 50x. As esferas são combinadas e diluídas até um concentrado de 2x antes do uso. 10 μL de sobrenadante são transferidos para uma placa com fundo V, 10 μL de esferas preparadas são adicionadas às amostras, a placa é misturada em um agitador de placas e a placa é incubada à temperatura ambiente durante 1 hora. Após a incubação, 10 μL de reagente de detecção são adicionados a cada poço, a placa é misturada em um agitador de placa, e a placa é incubada à temperatura ambiente durante 2 horas. Após a incubação, 50 μL de tampão de lavagem são adicionados a cada poço, a placa é centrifugada por 5 min a 1100 x g, os sobrenadantes são aspirados e as amostras são ressuspensas adicionando 10 μL de tampão de lavagem a cada poço. Os dados são adquiridos no citômetro de fluxo IQue Screener, da IntelliCyt.

[0572] Observou-se um aumento dependente da dose na granzima B, TNFα e IFNγ liberados pelas células T CD8+ na presença de células expressando ROR1 e I2-A27; não foi observado um aumento como esse na ausência de células expressando ROR1, como mostrado na figuras 70A a 70F.

6.13.25.5. Avaliação da estabilidade sérica do anticorpo biespecífico B-body™ 1x2ROR1xCD3

[0573] Foi analisada a estabilidade sérica de um anticorpo biespecífico B-body™ 1x2 I2-A27. O anticorpo biespecífico B-body™ 1x2 I2-A27 foi diluído de 2,5 mg/mL em PBS para 170 µg/mL em soro humano (cerca de 93% da concentração de soro final) ou PBS. As amostras foram, em seguida, incubadas a 37 °C ou a 4 °C durante 1 semana. Após a incubação de uma semana, o ensaio de atividade Jurkat foi realizado nas amostras armazenadas no soro humano ou no controle de PBS. Verificou-se que não houve perda de atividade para amostras armazenadas em soro humano a 4 °C ou a 37 °C durante 1 semana (consulte a figura 71A). Se o material tivesse agregado durante a incubação de uma semana no soro, espera-se que o B-body™ leve a um aumento no sinal na ausência de células expressando ROR1 devido à ativação direta do receptor de CD3. Não foi detectado nenhum aumento da atividade quando o ensaio foi executado na ausência de células expressando ROR1 (consulte a figura 71B).

[0574] A estabilidade do anticorpo biespecífico B- body™ 1x2 I2-A27 foi, em seguida, avaliada armazenando o anticorpo a 4 °C ou a 40 °C a 2,5 mg/mL em PBS e avaliando a homogeneidade das amostras por SEC e IPD, semanalmente. Para ensaios de estabilidade acelerada, o anticorpo foi armazenado a 2,5 mg/mL em PBS a 40 °C por até quatro semanas. O anticorpo parecia estável sob as condições de estabilidade acelerada (consulte a figura 72). Para ensaios em tempo real, o anticorpo foi armazenado a 2, 5 mg/mL em PBS a 4 °C por até doze semanas. O anticorpo também pareceu ser estável nas condições em tempo real (consulte a figura 73).

[0575] O IPD e o diâmetro Z-ave para cada amostra de estabilidade acelerada e em tempo real foram determinados utilizando o instrumento analítico UNcle, e os resultados estão mostrados na tabela 18 abaixo. Tabela 18. IPD e diâmetro Z-ave para cada amostra de estabilidade acelerada e em tempo real, conforme determinado usando o instrumento analítico UNcle I2-A27 Diâmetro Z-Ave

IPD Lote 18-007-44 (nm) 1W, 4C 0,10 12,16 2W, 4C 0,10 11,82 3W, 4C N/D N/D 4W, 4C 0,16 11,72 5W, 4C 0,17 11,57 6W, 4C 8W, 4C 10W, 4C 12W, 4C 1W, 40C 0,22 12,41 2W, 40C 0,14 12,41 3W, 40C 0,10 12,28

[0576] Em seguida, a estabilidade do anticorpo em ácido foi avaliada. O B-body™ foi submetido ao procedimento de purificação conforme descrito acima, pela ligação a uma resina de afinidade de CH1 com eluição utilizando acetato de sódio 100 mM, em pH 3,5. O B-body™ foi deixado em ácido por 0, 30, 60 ou 120 min antes da neutralização com tampão Tris-

HCl. O tampão da proteína foi, em seguida, trocado por PBS, antes dela ser analisada por SEC. Conforme ilustrado na figura 74, o anticorpo biespecífico B-body™ 1x2 I2-A27 ficou estável em ácido por até 2 horas.

6.13.25.6. Estudo de eficácia in vivo do anticorpo biespecífico B-body™ 1x2 ROR1xCD3

[0577] A eficácia in vivo de um B-body™ biespecífico ROR1xCD3 exemplar, o B-body™ 1x2 I2-A27, foi estudada em um modelo de camundongo NSG™ humanizado com PBMC de câncer de mama.

[0578] Mais especificamente, camundongos fêmeas NSMTM (Jackson Laboratory, nº de estoque 005557, também conhecido como NOD-scidIL2Rgamanull, NOD-scidIL2Rgnull, NSG ou NOD Scid Gamma) de seis a oito semanas de idade foram inoculadas ortotopicamente na gordura infrapatelar mamária com 5 x 106 MDA-MB-231 ressuspenso em uma mistura 1:1 de Matrigel com PBS ou meio isento de soro. Os pesos corporais e as observações clínicas foram registrados de uma a duas vezes por semana. As medições usando um paquímetro digital foram iniciadas para determinar o volume do tumor de uma a duas vezes por semana, quando os tumores se tornaram palpáveis. Os camundongos foram randomizados com base nos volumes do tumor, quando estes atingiram ~60-80 mm3 (dia de estudo -1 ou dia de estudo 0). Os camundongos foram injetados com PBMCs no dia de estudo 0. Após a injeção de PBMCs, a dosagem começou com base nos resultados da validação da fase

1. Os camundongos foram dosados a 0,5 mg/kg, 2,5 mg/kg e 10 mg/kg. Os pesos corporais, observações clínicas e medições com paquímetro digital foram registrados duas vezes por semana após a aplicação da dose. Os animais que atingiram um escore de condição corporal ≤ 2, uma perda de peso corporal ≥ 20% ou um volume do tumor > 2000 mm3 foram eutanasiados antes do término do estudo. Os animais com tumores ulcerados foram submetido a eutanásia antes do término do estudo. Os tecidos não foram coletados de animais encontrados mortos. No dia de estudo 30, todos os animais foram submetidos a eutanásia por asfixia com CO2 e os tecidos foram coletados. Os tumores foram, em seguida, coletados e separados em fragmentos. Um fragmento foi colocado no meio para análise por citometria de fluxo. Os seguintes marcadores foram examinados: CD45, CD3, CD8, CD4 e 7AAD. Um fragmento foi fixado em formalina tamponada neutra (NBF) a 10% para incorporação de parafina (FFPE). Um fragmento foi congelado rapidamente. O sangue total foi coletado no fim do estudo. Cerca de 50 µL de sangue total foram obtidos para análise de citometria de fluxo. Os seguintes marcadores foram examinados: CD45, CD3, CD8, CD4 e 7AAD.

[0579] Os resultados são mostrados na figura 87 (painel superior) e na figura 88. Como mostrado, o B-body™ 1x2 I2-A27 mostrado demonstrou eficácia in vivo na redução do crescimento tumoral nas doses de 0,5 mg/kg e 2,5 mg/kg.

6.13.26. Exemplo 25: Eficácia do B-body™ biespecífico ROR1/ROR2xCD3

[0580] Mais moléculas de ligação ao antígeno do ROR compreendendo as seis CDRs do I2A-10, como mostrado na tabela 6, e várias CDRs mutantes, foram preparadas, e os experimentos foram realizados para testar sua eficácia como construções biespecíficas trivalentes em um formato de B- body™ biespecífico ROR1xCD3.

6.13.26.1. Geração de anticorpos biespecíficos B-body™ 1x2 ROR1/ROR2xCD3 adicionais baseados em I2-A10

[0581] Mutações seletivas nas regiões CDR de um anticorpo I2-A10 e construções de anticorpo nos formatos de IgG, B-body™ 1x1 e B-body™ 1x2 foram feitas e testadas.

[0582] Por exemplo, o candidato a ABS ao ROR designado I2A-10 foi formatado com o candidato a ABS ao CD3 SP34-89 em um formato de B-Body biespecífico “BC1” 1x2, como descrito acima, com o formato 1x2 tendo uma junção de 10 aminoácidos entre os domínios S e H (consulte, por exemplo, a figura 26 para o esquema de domínios). As sequências de aminoácidos para as cinco cadeias polipeptídicas que formam uma molécula de ligação ao antígeno do ROR biespecífica trivalente 1x2 BC1 I2A-27 exemplar estão listadas como SEQ ID NO: 114 (cadeia 1), SEQ ID NO: 115 (cadeia 2), SEQ ID NO: 116 (cadeia 3), SEQ ID NO: 117 (cadeia 4) e SEQ ID NO: 115 (cadeia 5).

[0583] Na descrição a seguir neste exemplo, o termo “B-body™ 1x2 I2-A10” ou “I2-A27” ou “A27” se refere a este B-body™ 1x2 ROR1/ROR2xCD3 com uma cadeia 1 da SEQ ID NO: 114, uma cadeia 2 da SEQ ID NO: 115, uma cadeia 3 da SEQ ID NO: 116, uma cadeia 4 da SEQ ID NO: 117 e uma cadeia 5 da SEQ ID NO: 115.

[0584] As construções de anticorpo I2-A10 com mutações incluíam I2-A10 R66G, I2-A10 R66K, I2-A10 D54G, I2- A10 D54E, I2-A10 Y55E, I2-A10 Y55Q, I2-A10 Y56S, I2-A10 Y93SY94S, e I2-A10 A32Y.

[0585] O título da expressão e o rendimento dessas construções de anticorpo foram analisados conforme mostrado na tabela 19. Tabela 19. Título da expressão e rendimento IgG B-Body 1x1 B-Body 1x2 Pré- Pós- Pré- Pós- Pré- Pós- rendimento rendimento rendimentorendimentorendimentorendimento (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) I2-A10 140 114 450 144 125 22 (47) I2-A27 140 98 525 174 135 20 (62) I2-A10 R66G N/D N/D 215 48 224 12 (63) I2-A10 R66K N/D N/D 245 68 225 45 (84) I2-A10 D54G N/D N/D 235 72 226 11 (67) I2-A10 D54E N/D N/D 61 24 213 47 I2-A10 Y55E N/D N/D 122 52 252 84 I2-A10 Y55Q N/D N/D 119 58 233 64 I2-A10 Y56S N/D N/D 148 38 230 64 I2-A10 N/D N/D 98 66 217 62 Y93SY94S I2-A10 A32Y N/D N/D 116 54 245 68

[0586] A ligação ao ROR1 dessas construções de anticorpo foi, em seguida, testada, e cada um mostrou ligação positiva, exceto quanto às construções A32Y e Y93/94S, que apresentaram ligação fraca.

[0587] Essas construções de anticorpos foram, em seguida, testadas no ensaio funcional Jurkat descrito na presente invenção (consulte, por exemplo, a seção 6.13.1.8). Os resultados são mostrados na tabela 20. Tabela 20. Ensaio funcional Jurkat para construções I2- A10 com mutações K562 K562 RPMI RPMI MDAEC50 MDAEC50 EC50 EC50 EC50 EC50 Ab (pM) (pM) (pM) (pM) (pM) (pM) 1x1 1x2 1x1 1x2 1x1 1x2 A27 378 58 N/A N/A 351 19 A10 102 33 33 3,2 36 12

K562 K562 RPMI RPMI MDAEC50 MDAEC50 EC50 EC50 EC50 EC50 Ab (pM) (pM) (pM) (pM) (pM) (pM) 1x1 1x2 1x1 1x2 1x1 1x2 R66G 314 30 91 3,5 N/D 218 R66K 121 20 24 1,2 49 7,7 D54G 51 19 20 0,2 23 5,9 D54E 43 9 26 0,3 16 6,7 Y55E 552 36 322 4,7 512 16 Y55Q 256 49 68 0,8 192 8,8 Y56S 480 49 85 13 235 12

[0588] Essas variantes também foram testadas no ensaio de morte celular. Os resultados são mostrados na tabela 21. Tabela 21. Ensaio de morte celular para variantes I2- A10 Ab LDH pM % atividade máxima I2-A10 5,4 36 I2-A27 0,3 46 I2-A10 R66G 47,3 35 I2-A10 R66K 5,8 31 I2-A10 D54G 3,6 58 I2-A10 Y55E 10,2 29 I2-A10 Y55Q 6,1 39 I2-A10 Y56S 15,1 35 I2-A10 D54E 2,5 48

[0589] Em seguida, foram analisadas as construções de anticorpo para avaliar a homogeneidade com a SEC, a propensão à agregação com a SMAC e a hidrofobicidade com a CIH. Os ensaios de SEC, SMAC e CIH foram realizados, conforme descrito no exemplo 24. O D54G não era aceitável de acordo com o ensaio da SEC. Y55Q (e Y55E) apresentaram valores de CIH melhorados em relação ao I2-A10 original. A fluorimetria diferencial de varredura (FDV) também foi utilizada para testar as construções de anticorpo.

[0590] Com base nos ensaios e análises acima descritos, as mutações D54E e Y55Q foram selecionadas para a preparação de um novo anticorpo relacionado ao A10 designado I2-A10 D54E Y55Q. A mutação D54E, que corrige um potencial sítio de isomerização, resultou inesperadamente em um anticorpo com melhor atividade (ensaios funcionais in vitro) do que a atividade do anticorpo original I2-A10. A mutação Y55Q, que reverte um resíduo raro para a linhagem germinativa, resultou inesperadamente em um anticorpo com valores de CIH melhorados em comparação com o anticorpo original I2-A10.

[0591] Um B-body™ 1x2 ROR1/ROR2xCD3 adicional foi, em seguida, gerado, incorporando as mutações D54E e Y55Q. Y55Q é uma mutação na região CDR2 da VL do sítio de ligação ao antígeno para ROR1 e ROR2, como mostrado na tabela 6, e foi introduzida na cadeia 1 e na cadeia 3, como mostrado abaixo. D54E é uma mutação na região CDR2 da VH do sítio de ligação ao antígeno para ROR1 e ROR2, como mostrado na tabela 6, e foi introduzida na cadeia 2 e na cadeia 5, como mostrado abaixo. Além disso, as mutações para gerar uma configuração knob-in-hole foram incluídas nos segundos domínios CH3 na cadeia 1 (hole) e na cadeia 3 (knob).

[0592] O candidato a ABS ao ROR designado I2A-10 D54E Y55Q foi formatado com o candidato a ABS ao CD3 SP34- 89 em um formato de B-Body biespecífico “BC1” 1x2, como descrito acima, com o formato 1x2 tendo uma junção de 10 aminoácidos entre os domínios S e H (consulte, por exemplo,

a figura 26 para o esquema de domínios). As sequências de aminoácidos para as cinco cadeias polipeptídicas que formam uma molécula de ligação ao antígeno do ROR biespecífica trivalente 1x2 BC1 I2A-10 D54E Y55Q exemplar estão listadas como SEQ ID NO: 132 (cadeia 1), SEQ ID NO: 133 (cadeia 2), SEQ ID NO: 134 (cadeia 3), SEQ ID NO: 135 (cadeia 4) e SEQ ID NO: 133 (cadeia 5).

[0593] Na descrição a seguir neste exemplo, o termo “B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q” ou “I2-A10 D54E Y55Q” se refere a este B-body™ 1x2 ROR1/ROR2xCD3 com uma cadeia 1 da SEQ ID NO: 132, uma cadeia 2 da SEQ ID NO: 133, uma cadeia 3 da SEQ ID NO: 134, uma cadeia 4 da SEQ ID NO: 135 e uma cadeia 5 da SEQ ID NO: 133.

6.13.26.2. Ligação do anticorpo biespecífico B-body™ 1x2 ROR1xCD3 ao CD3 e ROR1

[0594] A afinidade de ligação de um B-body™ 1x2 I2- A10 D54E Y55Q ao heterodímero delta e épsilon CD3 cinomólogo foi determinada pela avaliação da ligação por BLI monovalente descrita no exemplo 24 acima. Conforme ilustrado na figura 75, o anticorpo biespecífico exibiu uma Kd monovalente de 3,5 nM para o heterodímero delta e épsilon CD3 cinomólogo.

[0595] Em seguida, a ligação do anticorpo ao ROR1 e ROR2 foi avaliada utilizando as avaliações de ligação por BLI monovalente e bivalente, conforme descrito no exemplo

24. Conforme mostrado nas figuras 76A e 76B, o anticorpo IgG I2-A10 D54E Y55Q mostrou ligação monovalente de 0,7 nM para o ROR1 e menos de 1 pM para o ROR2. O B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q mostrou uma ligação monovalente de 0,46 nM para o ROR1 e menos de 1 pM para o ROR2, e ligação bivalente de 21 pM para o ROR1 e 3 pM para o ROR2 (consulte as figuras 76C a 76F).

[0596] A ligação da IgG I2-A10 D54E Y55Q aos domínios tipo Ig, frizzled e kringle foi, em seguida, determinada por BLI. Conforme ilustrado na figura 77, a IgG I2-A10 D54E Y55Q se liga ao domínio tipo Ig do ROR1.

6.13.26.3. Caracterização adicional do B-body™ 1x2 ROR1/ROR2xCD3

[0597] Um B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q foi produzido através da transfecção transitória das cadeias polipeptídicas que codificam DNA (a cadeia polipeptídica 5 é a mesma que a cadeia polipeptídica 2) nas células Expi- CHO. O anticorpo de cinco cadeias foi purificado com uma resina de afinidade de CH1 e o tampão foi trocado em PBS, pH 7,4.

[0598] A montagem e a pureza do B-body™ resultante foram avaliadas através de SDS-PAGE não redutor e redutor, conforme descrito no exemplo 24. O B-body™ 1x2 apresentou um comportamento perto do peso molecular esperado de 200 kD em um formato não reduzido. Em formato reduzido, as 3 bandas foram separadas (uma cadeia a 75 kD, uma cadeia a 50 kD e 2 cadeias a 25 kD) (dados não mostrados aqui). A proteína foi posteriormente analisada por eletroforese capilar em formato reduzido e não reduzido, conforme descrito no exemplo 24, e a pureza porcentual foi calculada como sendo 96,25%, a partir das três principais bandas da amostra reduzida.

[0599] A proteína de anticorpo foi, em seguida, analisada através de um conjunto de colunas para avaliar a homogeneidade com a SEC, a propensão à agregação com SMAC e a hidrofobicidade com CIH. Os ensaios de SEC, SMAC e CIH foram realizados conforme descrito no exemplo 24.

[0600] Os resultados dessas análises estão mostrados nas figuras 78A a 78C. Como mostrado, a proteína apareceu > 99% homogênea pela SEC e resultou em um único pico com SMAC e CIH, que estavam dentro da faixa observada para outros anticorpos em desenvolvimento, sugerindo um perfil aceitável de agregação e hidrofobicidade.

[0601] A proteína foi, em seguida, analisada com o instrumento analítico UNcle, conforme descrito no exemplo

24. O anticorpo apresentou temperaturas de fusão de 68,5 °C e 77,4 °C. O IPD mediano de três medidas foi 0,21, o que indica uma amostra monodispersa (IPD < 0,25 é considerado monodisperso) com um diâmetro hidrodinâmico de 12,6 nm (consulte a tabela 22 abaixo). Tabela 22. Resultados para temperatura de fusão, índice de polidispersividade e diâmetro hidrodinâmico do instrumento analítico UNcle Diâmetro Tm1 (°C) Tm2 (°C) IPD (nm) I2-A10 D54E Y55Q 68,5 77,4 0,21 12,6 B-Body™ 1x2

6.13.26.4. Avaliação funcional in vitro de B-body™ 1x2 ROR1/ROR2xCD3

[0602] A capacidade funcional de um B-body™ 1x2 I2- A10 D54E Y55Q em ensaios de co-cultura celular de células T e células cancerosas expressando ROR1 foi analisada. Foram avaliadas as linhagens de células cancerosas que expressavam ROR1 e/ou ROR2.

[0603] As células MDA-MB-231, RPMI-8226 e K562 foram utilizadas neste estudo, e como mostrado no exemplo 24, a linhagem celular MDA-MB-231 foi determinada como expressando principalmente ROR1, a linhagem celular RPMI-8226 foi determinada como expressando tanto ROR1 como ROR2, e a linhagem celular K562 foi determinada como expressando principalmente ROR22.

[0604] Para avaliar se o B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q poderia ativar células T na presença das células cancerosas expressando ROR1 ou ROR2, um ensaio de gene repórter de co-cultura de NFkB Jurkat foi utilizado, como descrito no exemplo 24. A ativação das células T Jurkat leva à ativação do elemento de resposta NFkB e à produção de eGFP. Conforme mostrado nas figuras 79A a 79D, o B-body™ 1x2 I2- A10 D54E Y55Q foi capaz de ativar a linhagem celular repórter Jurkat na faixa de pM na presença de células MDA-MB-231 (expressando ROR1), RPMI-8226 (expressando ROR1 e ROR2) e K562 (expressando ROR2), mas não na ausência de uma linhagem celular expressando ROR1 ou ROR2.

[0605] Em seguida, a função do B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q para ativar células T CD8+ primárias foi estudada. Este ensaio funcional é como descrito no exemplo 24 acima, na presença de linhagens celulares expressas ROR1, conforme avaliado pelo aumento dos níveis de expressão do marcador de ativação de células T precoce, CD69, e do marcador de ativação de células T tardio, CD25.

[0606] Como mostrado na figuras 80A a 80D, o B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q levou a um aumento dependente da dose na expressão de CD69 e CD25 quando na presença de células expressando ROR1 (MDA-MB-231 ou RPMI-8226), mas não na ausência dessas células.

[0607] Foi avaliado se as células T ativadas poderiam posteriormente matar as linhagens celulares expressando ROR1 pela liberação de LDH das células-alvo e secreção de granzima B, TNFα e IFNγ pelas células efetoras CD8+.

[0608] A liberação de LDH das células-alvo foi analisada conforme descrito no Exemplo 24. Conforme mostrado nas figuras 81A e 81B, o B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q levou à citotoxicidade dependente da dose das células expressando ROR1 na presença de células T CD8+, mas não na ausência de células T CD8+.

[0609] A secreção da granzima B, TNFα e IFNγ pelas células efetoras CD8+ foi analisada conforme descrito no exemplo 24. Observou-se um aumento dependente da dose na granzima B, TNFα e IFNγ liberados pelas células T CD8+ na presença de células expressando ROR1 e B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q ; não foi observado um aumento como esse na ausência de células expressando ROR1, como mostrado na figuras 82A a 82F.

6.13.26.5. Avaliação da estabilidade sérica do anticorpo biespecífico B-body™ 1x2ROR1xCD3

[0610] A estabilidade sérica do B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q foi analisada. O anticorpo biespecífico foi diluído de 2,5 mg/mL em PBS até 170 µg/mL em soro humano (cerca de 93% da concentração de soro final) ou PBS. As amostras foram, em seguida, incubadas a 37 °C ou a 4 °C durante 1 semana. Após a incubação de uma semana, o ensaio de atividade Jurkat foi realizado nas amostras armazenadas no soro humano ou no controle de PBS. Verificou-se que não houve perda de atividade para amostras armazenadas em soro humano a 4 °C ou a 37 °C durante 1 semana (consulte a figura 83A). Se o material tivesse agregado durante a incubação de uma semana no soro, espera-se que o B-body™ leve a um aumento no sinal na ausência de células expressando ROR1 devido à ativação direta do receptor de CD3. Não foi detectado nenhum aumento da atividade quando o ensaio foi executado na ausência de células expressando ROR1 (consulte a figura 83B).

[0611] A estabilidade do anticorpo biespecífico B- body™ 1x2 I2-A27 foi, em seguida, avaliada armazenando o anticorpo a 4 °C ou a 40 °C a 2,5 mg/mL em PBS e avaliando a homogeneidade das amostras por SEC e IPD, semanalmente. Para ensaios de estabilidade acelerada, o anticorpo foi armazenado a 2,5 mg/mL em PBS a 40 °C por até quatro semanas. O anticorpo parecia estável sob as condições de estabilidade acelerada (consulte a figura 84). Para ensaios em tempo real, o anticorpo foi armazenado a 2, 5 mg/mL em PBS a 4 °C por até doze semanas. O anticorpo também pareceu ser estável nas condições em tempo real (consulte a figura 85).

[0612] O IPD e o diâmetro Z-ave para cada amostra de estabilidade acelerada e em tempo real foram determinados utilizando o instrumento analítico UNcle, e os resultados estão mostrados na tabela 23.

Tabela 23. IPD e diâmetro Z-ave para cada amostra de estabilidade acelerada e em tempo real, conforme determinado usando o instrumento analítico UNcle I2-A10 D54E Y55Q Diâmetro Z-Ave

IPD Lote 18-007-45 (nm) 1W, 4C 0,13 12,24 2W, 4C 0,14 11,68 3W, 4C 0,21 12,17 4W, 4C 0,12 11,68 5W, 4C 0,25 11,33 6W, 4C 8W, 4C 10W, 4C 12W, 4C 1W, 40C 0,184 12,15 2W, 40C 0,139 12,01 3W, 40C 0,058 14,72

[0613] Em seguida, a estabilidade do anticorpo em ácido foi avaliada. O B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q foi submetido ao procedimento de purificação conforme descrito acima, pela ligação a uma resina de afinidade de CH1 com eluição utilizando acetato de sódio 100 mM, em pH 3,5. O anticorpo biespecífico foi deixado em ácido por 0, 30, 60 ou 120 min antes da neutralização com tampão Tris-HCl. O tampão da proteína foi, em seguida, trocado por PBS, antes dela ser analisada por SEC. Conforme ilustrado na figura 86, o B- body™ I2-A10 D54E Y55Q 1x2 ficou estável em ácido por até 2 horas.

6.13.26.6. Estudo de eficácia in vivo de anticorpo biespecífico B-body™ 1x2 ROR1/ROR2xCD3

[0614] A eficácia in vivo de um B-body™ biespecífico ROR1/ROR2xCD3, B-body™ 1x2 I2-A10 D54E Y55Q, foi estudada em um modelo de camundongo NSG™ humanizado com PBMC de câncer de mama. O estudo foi realizado conforme descrito no exemplo 24 acima.

[0615] Os resultados são mostrados na figura 87 (painel inferior) e na figura 88. Como mostrado, o B-body™ 1x2 I2-A10 demonstrou eficácia in vivo na redução do crescimento tumoral nas doses de 0,5 mg/kg, 2,5 mg/kg e 10 mg/Kg.

6.14. Sequências > Exemplo 1, CADEIA 1 da construção monoespecífica bivalente [SEQ ID NO: 1] (VL)~VEIKRTPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN

YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > Exemplo 1, CADEIA 2 da construção monoespecífica bivalente [SEQ ID NO: 2] (VH)~VTVSSASPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN

NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > Exemplo 1, CADEIA 1 da construção biespecífica bivalente [SEQ ID NO: 3] (VL)~VEIKRTPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN

SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK VL- CH3- Dobradiça- CH2- CH3 (knob)

> Exemplo 1, CADEIA 2 da construção biespecífica bivalente [SEQ ID NO: 4] (VH)~VTVSSASPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN

NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK VH- CH3 > Exemplo 1, CADEIA 3 da construção biespecífica bivalente [SEQ ID NO: 5] (VL)~VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG

NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK VL- CL- Dobradiça- CH2- CH3(hole) > Exemplo 1, CADEIA 4 da construção biespecífica bivalente [SEQ ID NO: 6] (VH)~VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG

VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSC VH- CH1 > Fragmento Fc da IgG1 humana [SEQ ID NO: 7]

GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP > Cadeia 1 do BC1 [SEQ ID NO: 8]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTK NQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Arranjo de domínio: A- B- Dobradiça- D- E VL- CH3- Dobradiça- CH2- CH3 (knob) Mutações no primeiro CH3 (domínio B): T366K; inserção de 445K, 446S, 447C Mutações no segundo CH3 (domínio E): S354C, T366W > Cadeia 2 do BC1 [SEQ ID NO: 9]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDIHWVRQAPGKGLEWVGDITPYDGTTN YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARLVGEIATGFDYWGQGTLVTV SSASPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV

LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC Arranjo de domínio: F- G VH- CH3 Mutações no CH3 (domínio G): L351D; inserção de 445G, 446E, 447C > Cadeia 3 do BC3 [SEQ ID NO: 10]

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTK NQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Arranjo de domínio: H- I- Dobradiça- J- K VL- CL- Dobradiça- CH2- CH3 (hole) Mutações em CH3 (domínio K): Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A, Y407V >cadeia 4 de BC1 [SEQ ID NO: 11]

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRY YADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS

LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSC Arranjo de domínio: L- M VH- CH1 > domínio A do BC1 [SEQ ID NO: 12]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVP

SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT > domínio B do BC1 [SEQ ID NO: 13]

PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSC > domínio D do BC1 [SEQ ID NO: 14]

APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT

KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK > domínio E do BC1 [SEQ ID NO: 15]

GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > domínio F do BC1 [SEQ ID NO: 16]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDIHWVRQAPGKGLEWVGDITPYDGTTN YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARLVGEIATGFDYWGQGTLVTV SSAS

> domínio G do BC1 [SEQ ID NO: 17]

PREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC > domínio H do BC1 [SEQ ID NO: 18]

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIP

ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK > domínio I do BC1 [SEQ ID NO: 19]

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ

DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC > domínio J do BC1 [SEQ ID NO: 20]

APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT

KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK > domínio K do BC1 [SEQ ID NO: 21]

GQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > domínio L do BC1 [SEQ ID NO: 22]

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRY

YADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS > domínio M do BC1 [SEQ ID NO: 23]

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS

SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSC > Cadeia 1 do BC28 [SEQ ID NO: 24]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTPREPQVCTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTK NQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Arranjo de domínio: A- B- Dobradiça- D- E VL- CH3- Dobradiça- CH2- CH3 (knob) Mutações no domínio B: Y349C; inserção 445P, 446G, 447K Mutações no domínio E: S354C, T366W > Cadeia 2 do BC28 [SEQ ID NO: 25]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDIHWVRQAPGKGLEWVGDITPYDGTTN YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARLVGEIATGFDYWGQGTLVTV SSASPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV

LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Arranjo de domínio: F- G VH- CH3 Mutações no domínio G: S354C; inserção 445P, 446G, 447K > domínio A do BC28 [SEQ ID NO: 26]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVP

SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT > domínio B do BC28 [SEQ ID NO: 27]

PREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > domínio D do BC28 [SEQ ID NO: 28]

APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

> domínio E do BC28 [SEQ ID NO: 29]

GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > domínio F do BC28 [SEQ ID NO: 30]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDIHWVRQAPGKGLEWVGDITPYDGTTN YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARLVGEIATGFDYWGQGTLVTV

SSAS > domínio G do BC28 [SEQ ID NO: 31]

PREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > cadeia 1 de BC44 [SEQ ID NO: 32]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVREPQVCTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTK NQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Arranjo de domínio: A- B- Dobradiça- D- E VL- CH3- Dobradiça- CH2- CH3 (knob) Mutações no domínio B: P343V; Y349C; inserção 445P, 446G, 447K Mutações no domínio E: S354C, T366W > domínio A do BC44 [SEQ ID NO: 33]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT

> domínio B do BC44 [SEQ ID NO: 34]

VREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > Domínio D do BC44 [SEQ ID NO: 35]

APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT

KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK > domínio E do BC44 [SEQ ID NO: 36]

GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > cadeia bivalente 3 do BC28 equivalente à SEQ ID NO: 10 > cadeia bivalente 4 do BC28 equivalente à SEQ ID NO: 11 > cadeia 3 1x2 do BC28 [SEQ ID NO: 37]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTPREPQVCTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSGSGSEIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTI SSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH

YTQKSLSLSPGK Arranjo de domínio: R- S- ligante- H- I- Dobradiça- J- K- VL- CH3- ligante- VL- CL- Dobradiça- CH2- CH3(hole) Mutações no domínio S: Y349C; inserção 445P, 446G, 447K

Inserção de ligante de seis aminoácidos: GSGSGS Mutações no domínio K: Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A, Y407V > domínio R 1x2 de BC28 [SEQ ID NO: 38]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVP

SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT > domínio S 1x2 de BC28 [SEQ ID NO: 39]

PREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK >Ligante 1x2 do BC28 [SEQ ID NO: 40]

GSGSGS > domínio H 1x2 de BC28 [SEQ ID NO: 41]

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIP

ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK > domínio I 1x2 de BC28 [SEQ ID NO: 42]

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ

DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC > domínio J 1x2 de BC28 [SEQ ID NO: 43]

APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT

KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK > domínio K 1x2 de BC28 [SEQ ID NO: 44]

GQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > Cadeia 3 do BC28-1x1x1a [SEQ ID NO: 45]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRDSYLWTFGQGTKVEIKRTPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSCGSGSGSEIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTI SSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH

YTQKSLSLSPGK Arranjo de domínio: R- S- ligante- H- I- Dobradiça- J- K- VL- CH3- ligante- VL- CL- Dobradiça- CH2- CH3(hole) Mutações no domínio S: T366K; inserção de 445K, 446S, 447C Inserção de ligante de seis aminoácidos: GSGSGS Mutações no domínio K: Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A, Y407V > domínio R de BC28-1x1x1a [SEQ ID NO: 46]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVP

SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRDSYLWTFGQGTKVEIKRT > domínio S de BC28-1x1x1a [SEQ ID NO: 47]

PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSC > Ligante de BC28-1x1x1a [SEQ ID NO: 48]

GSGSGS > domínio H do BC28-1x1x1a [SEQ ID NO: 49]

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIP

ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK > domínio I do BC28-1x1x1a [SEQ ID NO: 50]

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

> domínio J do BC28-1x1x1a [SEQ ID NO: 51]

APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT

KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK > domínio K do BC28-1x1x1a [SEQ ID NO: 52]

GQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK >hCTLA4-4.cadeia 2 [SEQ ID NO: 53]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYYIHWVRQAPGKGLEWVAVIYPYTGFTY YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEYTVLDYWGQGTLVTVSSA SPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS

DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC Arranjo de domínio: F- G VH- CH3 Mutações no domínio G L351D; inserção de 445G, 446E, 447C > domínio F do hCTLA4-4 [SEQ ID NO: 54]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYYIHWVRQAPGKGLEWVAVIYPYTGFTY YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEYTVLDYWGQGTLVTVSSA

S > domínio G do hCTLA4-4 [SEQ ID NO: 55]

PREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC Outras sequências: >Dobradiça: DKTHTCPPCP [SEQ ID NO: 56] >Junção de domínio BC1-polipeptídeo 1: IKRTPREP [SEQ ID NO: 57] >Junção de domínio BC15-polipeptídeo 1: IKRTVREP [SEQ ID NO: 58]

>Junção de domínio BC16-polipeptídeo 1: IKRTREP [SEQ ID NO: 59] >Junção de domínio BC17-polipeptídeo 1: IKRTVPREP [SEQ ID NO: 60] >Junção de domínio BC26-polipeptídeo 1: IKRTVAEP [SEQ ID NO: 61] >Junção de domínio BC27-polipeptídeo 1: IKRTVAPREP [SEQ ID NO: 62] >Junção de domínio BC1-polipeptídeo 2: SSASPREP [SEQ ID NO: 63] >Junção de domínio BC13-polipeptídeo 2: SSASTREP [SEQ ID NO: 64] >Junção de domínio BC14-polipeptídeo 2: SSASTPREP [SEQ ID NO: 65] >Junção de domínio BC24-polipeptídeo 2: SSASTKGEP [SEQ ID NO: 66] >Junção de domínio BC25-polipeptídeo 2: SSASTKGREP [SEQ ID NO: 67] >VH de SP34-89 [SEQ ID NO: 68]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKGRFSISRDDSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQG

TLVTV >VL de SP34-89 [SEQ ID NO: 69]

QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPW TPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL

>VH de SP34-89-VH de N30S [SEQ ID NO: 70] letra minúscula indica mutação EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFsTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA

TYYADSVKGRFSISRDDSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQG

TLVTV >VH de SP34-89-VH de G65D [SEQ ID NO: 71] letra minúscula indica mutação

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKdRFSISRDDSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQG

TLVTV >VH de SP34-89-VH de S68T [SEQ ID NO: 72] letra minúscula indica mutação

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKGRFtISRDDSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQG

TLVTV >VL de SP34-89-VL de W57G [SEQ ID NO: 73] letra minúscula indica mutação QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPg

TPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL > Cadeia pesada de exibição de fago [SEQ ID NO: 74]: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFxxxxIHWVRQAPGKGLEWVAxxxxxxxxxx xYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARxxxxxxxxxxxxxDYWGQG

TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

> Cadeia leve de exibição de fago [SEQ ID NO: 75]:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQxxxxxxTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIF

PPSDSQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS

TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >Estrutura A/H do domínio de B-Body [SEQ ID NO: 76]:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQxxxxxxTFGQGTKVEIKRT >Estrutura F/L do domínio de B-Body [SEQ ID NO: 77]: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFxxxxIHWVRQAPGKGLEWVAxxxxxxxxxx xYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARxxxxxxxxxxxxxDYWGQG

TLVTVSSAS > Estrutura da cadeia 1 de BC1 [SEQ ID NO: 78]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQxxxxxxTFGQGTKVEIKRTPREPQVYTL

PPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTK NQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK “x” representa aminoácidos da CDR que variaram para criar a biblioteca, e o itálico negrito representa as sequências de CDR que eram constantes Arranjo de domínio: A- B- Dobradiça- D- E VL- CH3- Dobradiça- CH2- CH3 (knob) Mutações no primeiro CH3 (domínio B): T366K; inserção de 445K, 446S, 447C

Mutações no segundo CH3 (domínio E): S354C, T366W > Estrutura da cadeia 2 de BC1 [SEQ ID NO: 79] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFxxxxIHWVRQAPGKGLEWVAxxxxxxxxxx xYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARxxxxxxxxxxxxxDYWGQG

TLVTVSSASPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK

TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC “x” representa aminoácidos da CDR que variaram para criar a biblioteca, e o itálico negrito representa as sequências de CDR que eram constantes Arranjo de domínio: F- G VH- CH3 Mutações no CH3 (domínio G): L351D; inserção de 445G, 446E, 447C > Estrutura da cadeia 3 de BC1 [SEQ ID NO: 80]

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTK NQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK “x” representa aminoácidos da CDR que variaram para criar a biblioteca, e o itálico negrito representa as sequências de CDR que eram constantes Arranjo de domínio: H- I- Dobradiça- J- K

VL- CL- Dobradiça- CH2- CH3 (hole) Mutações em CH3 (domínio K): Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A, Y407V > Estrutura da cadeia 4 de BC1 [SEQ ID NO: 81] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFxxxxIHWVRQAPGKGLEWVAxxxxxxxxxx xYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARxxxxxxxxxxxxxDYWGQG

TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSC “x” representa aminoácidos da CDR que variaram para criar a biblioteca, e o itálico negrito representa as sequências de CDR que eram constantes Arranjo de domínio: L- M VH- CH1 > Estrutura da cadeia 3 de BC1 1(A)x2(B-A) SP34-89 [SEQ ID NO: 82]

PPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSCTASSGGSSSGQAVVTQEPSLTV SPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGG KAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK

“x” representa aminoácidos da CDR que variaram para criar a biblioteca, e o itálico negrito representa as sequências de CDR que eram constantes Arranjo de domínio: R- S- ligante- H- I- Dobradiça- J- K VL- CH3- ligante- SP34- CL- Dobradiça- CH2- CH3 (hole) Mutações no domínio S: T366K; inserção de 445K, 446S, 447C Inserção de ligante de dez aminoácidos: TASSGGSSSG Mutações no domínio J: L234A, L235A e P329K Mutações no domínio K: Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A, Y407V > Junção S-H da cadeia 3 de BC1 1(A)x2(B-A) SP34-89 [SEQ ID NO: 83]

TASSGGSSSG > Cadeia 1 de I2A-10 BC1 1x1 [SEQ ID NO: 84]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIKRTPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTK NQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > Cadeia 2 de I2A-10 BC1 1x1 [SEQ ID NO: 85]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYFIHWVRQAPGKGLEWVAGIYPSDGYTS YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYSGMDYWGQGTLVTVSSAS PREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC > Cadeia 3 de I2A-10 BC1 1x1 [SEQ ID NO: 86]

QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPW TPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREE MTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > Cadeia 4 de I2A-10 BC1 1x1 [SEQ ID NO: 87]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKGRFSISRDDSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSC > Cadeia 3 de I2A-10 BC1 1x2 [SEQ ID NO: 88]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIKRTPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSCTASSGGSSSGQAVVTQEPSLTV SPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGG KAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK

> Cadeia 1 de I2A-27 BC1 1x1 [SEQ ID NO: 89]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSSPRTFGQGTKVEIKRTPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTK NQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > Cadeia 2 de I2A-27 BC1 1x1 [SEQ ID NO: 90]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKGYYIHWVRQAPGKGLEWVAAIYPYGGSTD YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARVYIYGVFDYWGQGTLVTVSS ASPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC > Cadeia 3 de I2A-27 BC1 1x1 [SEQ ID NO: 91]

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > Cadeia 4 de I2A-27 BC1 1x1 [SEQ ID NO: 92]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKGRFSISRDDSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSC

> Cadeia 3 de I2A-27 BC1 1x2 [SEQ ID NO: 93]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSSPRTFGQGTKVEIKRTPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSCTASSGGSSSGQAVVTQEPSLTV SPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGG KAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM

HEALHNHYTQKSLSLSPGK >ROR1 humano (número de adesão UniProt Q01973) [SEQ ID NO: 94]

MHRPRRRGTRPPLLALLAALLLAARGAAAQETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLT LDEPMNNITTSLGQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSRLRI RNLDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYEEDGFCQPYRGIA CARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCD ETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAAN CIRIGIPMADPINKNHKCYNSTGVDYRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPE LNGGHSYCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPACDSKDSKEKNKMEILYILVPSVA IPLAIALLFFFICVCRNNQKSSSAPVQRQPKHVRGQNVEMSMLNAYKPKSKAKELPLSA VRFMEELGECAFGKIYKGHLYLPGMDHAQLVAIKTLKDYNNPQQWTEFQQEASLMAELH HPNIVCLLGAVTQEQPVCMLFEYINQGDLHEFLIMRSPHSDVGCSSDEDGTVKSSLDHG DFLHIAIQIAAGMEYLSSHFFVHKDLAARNILIGEQLHVKISDLGLSREIYSADYYRVQ SKSLLPIRWMPPEAIMYGKFSSDSDIWSFGVVLWEIFSFGLQPYYGFSNQEVIEMVRKR QLLPCSEDCPPRMYSLMTECWNEIPSRRPRFKDIHVRLRSWEGLSSHTSSTTPSGGNAT TQTTSLSASPVSNLSNPRYPNYMFPSQGITPQGQIAGFIGPPIPQNQRFIPINGYPIPP GYAAFPAAHYQPTGPPRVIQHCPPPKSRSPSSASGSTSTGHVTSLPSSGSNQEANIPLL

PHMSIPNHPGGMGITVFGNKSQKPYKIDSKQASLLGDANIHGHTESMISAEL >ROR2 humano (número de adesão UniProt Q01974) [SEQ ID NO: 95]

MARGSALPRRPLLCIPAVWAAAALLLSVSRTSGEVEVLDPNDPLGPLDGQDGPIPTLKG YFLNFLEPVNNITIVQGQTAILHCKVAGNPPPNVRWLKNDAPVVQEPRRIIIRKTEYGS RLRIQDLDTTDTGYYQCVATNGMKTITATGVLFVRLGPTHSPNHNFQDDYHEDGFCQPY RGIACARFIGNRTIYVDSLQMQGEIENRITAAFTMIGTSTHLSDQCSQFAIPSFCHFVF PLCDARSRTPKPRELCRDECEVLESDLCRQEYTIARSNPLILMRLQLPKCEALPMPESP DAANCMRIGIPAERLGRYHQCYNGSGMDYRGTASTTKSGHQCQPWALQHPHSHHLSSTD FPELGGGHAYCRNPGGQMEGPWCFTQNKNVRMELCDVPSCSPRDSSKMGILYILVPSIA IPLVIACLFFLVCMCRNKQKASASTPQRRQLMASPSQDMEMPLINQHKQAKLKEISLSA VRFMEELGEDRFGKVYKGHLFGPAPGEQTQAVAIKTLKDKAEGPLREEFRHEAMLRARL QHPNVVCLLGVVTKDQPLSMIFSYCSHGDLHEFLVMRSPHSDVGSTDDDRTVKSALEPP DFVHLVAQIAAGMEYLSSHHVVHKDLATRNVLVYDKLNVKISDLGLFREVYAADYYKLL GNSLLPIRWMAPEAIMYGKFSIDSDIWSYGVVLWEVFSYGLQPYCGYSNQDVVEMIRNR QVLPCPDDCPAWVYALMIECWNEFPSRRPRFKDIHSRLRAWGNLSNYNSSAQTSGASNT TQTSSLSTSPVSNVSNARYVGPKQKAPPFPQPQFIPMKGQIRPMVPPPQLYVPVNGYQP VPAYGAYLPNFYPVQIPMQMAPQQVPPQMVPKPSSHHSGSGSTSTGYVTTAPSNTSMAD

RAALLSEGADDTQNAPEDGAQSTVQEAEEEEEGSVPETELLGDCDTLQVDEAQVQLEA Cadeia 1 de I2A-27 [SEQ ID NO: 96]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSSPRTFGQGTKVEIKRTPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTK NQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Arranjo de domínio: A- B- Dobradiça- D- E VL- CH3- Dobradiça- CH2- CH3 (hole) Mutações no primeiro CH3 (domínio B): T366K; inserção de 445K, 446S, 447C Sequência da dobradiça: DKTHTCPPCP [SEQ ID NO: 56] Mutações no segundo CH3 (domínio E): Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A, Y407V Sequência sinal exemplar para a cadeia 1: MGWSLILLFLVAVATRVLS (SEQ ID NO: 150) >Cadeia 2 de I-27A2 [SEQ ID NO: 97]

SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC Arranjo de domínio: F- G VH- CH3 Mutações no CH3 (domínio G): L351D; inserção de 445G, 446E, 447C Sequência sinal exemplar para a cadeia 2: MDFQVQIISFLLISASVIMSRG (SEQ ID NO: 151) >Cadeia 3 de I2A-27 [SEQ ID NO: 98]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSSPRTFGQGTKVEIKRTPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSCTASSGGSSSGQAVVTQEPSLTV SPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGG KAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM

HEALHNHYTQKSLSLSPGK Arranjo de domínio: R- S- ligante- H- I- Dobradiça- J- K VL- CH3- ligante- VL- CL- Dobradiça- CH2- CH3 (knob) Mutações no primeiro CH3 (domínio S): T366K; inserção de 445K, 446S, 447C Inserção de ligante de dez aminoácidos: TASSGGSSSG (SEQ ID NO: 83) Sequência da dobradiça: DKTHTCPPCP [SEQ ID NO: 56] Mutações no segundo CH3 (domínio K): S354C, K366W Sequência sinal exemplar para a cadeia 3: MDFQVQIISFLLISASVIMSRGS (SEQ ID NO: 152) > Cadeia 4 de I2A-27 [SEQ ID NO: 99]

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSC Arranjo de domínio: L- M VH- CH1 Sequência sinal exemplar para a cadeia 4: MDFQVQIISFLLISASVIMSRG (SEQ ID NO: 151)

>Cadeia 5 de I2A-27 [SEQ ID NO: 97]

SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC Arranjo de domínio: T- U VH- CH3 Mutações no CH3 (domínio U): L351D; inserção de 445G, 446E, 447C Sequência sinal exemplar para a cadeia 5: MDFQVQIISFLLISASVIMSRG (SEQ ID NO: 151) > Domínio A do I2A-27 [SEQ ID NO: 100]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVP

SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSSPRTFGQGTKVEIKRT > Domínio B do I2A-27 [SEQ ID NO: 101]

PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSC > Domínio D do I2A-27 [SEQ ID NO: 102]

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT

KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAK > Domínio E do I2A-27 [SEQ ID NO: 103]

GQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > Domínio F do I2A-27 [SEQ ID NO: 104]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKGYYIHWVRQAPGKGLEWVAAIYPYGGSTD YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARVYIYGVFDYWGQGTLVTVSS AS

> Domínio G do I2A-27 [SEQ ID NO: 105]

PREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC > Domínio R do I2A-27 [SEQ ID NO: 106]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVP

SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSSPRTFGQGTKVEIKRT > Domínio S do I2A-27 [SEQ ID NO: 107]

PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSC > Domínio H do I2A-27 [SEQ ID NO: 108]

QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPW

TPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTV > Domínio I do I2A-27 [SEQ ID NO: 109]

AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC > Domínio J do I2A-27 [SEQ ID NO: 110]

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT

KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAK > Domínio K do I2A-27 [SEQ ID NO: 111]

GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > Domínio L do I2A-27 [SEQ ID NO: 112]

TLVTVSSAS > Domínio M do I2A-27 [SEQ ID NO: 113]

TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSC

> Domínio T do I2A-27 [SEQ ID NO: 104]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKGYYIHWVRQAPGKGLEWVAAIYPYGGSTD YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARVYIYGVFDYWGQGTLVTVSS

AS > Domínio U do I2A-27 [SEQ ID NO: 105]

PREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC > Cadeia 1 do I2A-10 [SEQ ID NO: 114]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIKRTPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTK NQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Arranjo de domínio: A- B- Dobradiça- D- E VL- CH3- Dobradiça- CH2- CH3 (hole) Mutações no primeiro CH3 (domínio B): T366K; inserção de 445K, 446S, 447C Sequência da dobradiça: DKTHTCPPCP [SEQ ID NO: 56] Mutações no segundo CH3 (domínio E): Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A, Y407V Sequência sinal exemplar para a cadeia 1: MGWSLILLFLVAVATRVLS (SEQ ID NO: 150) >Cadeia 2 do I2A-10 [SEQ ID NO: 115]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYFIHWVRQAPGKGLEWVAGIYPSDGYTS YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYVSGMDYWGQGTLVTVSSA SPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS

DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC Arranjo de domínio: F- G VH- CH3 Mutações no CH3 (domínio G): L351D; inserção de 445G, 446E, 447C Sequência sinal exemplar para a cadeia 2: MDFQVQIISFLLISASVIMSRG (SEQ ID NO: 151) > Cadeia 3 do I2A-10 [SEQ ID NO: 116]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIKRTPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSCTASSGGSSSGQAVVTQEPSLTV SPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGG KAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM

HEALHNHYTQKSLSLSPGK Arranjo de domínio: R- S- ligante- H- I- Dobradiça- J- K VL- CH3- ligante- VL- CL- Dobradiça- CH2- CH3 (knob) Mutações no primeiro CH3 (domínio S): T366K; inserção de 445K, 446S, 447C Inserção de ligante de dez aminoácidos: TASSGGSSSG (SEQ ID NO: 83)

Sequência da dobradiça: DKTHTCPPCP [SEQ ID NO: 56] Mutações no segundo CH3 (domínio K): S354C, K366W Sequência sinal exemplar para a cadeia 3: MDFQVQIISFLLISASVIMSRGS (SEQ ID NO: 152) > Cadeia 4 do I2A-10 [SEQ ID NO: 117]

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSC Arranjo de domínio: L- M VH- CH1 Sequência sinal exemplar para a cadeia 4: MDFQVQIISFLLISASVIMSRG (SEQ ID NO: 151) > Cadeia 5 do I2A-10 [SEQ ID NO: 115]

DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC Arranjo de domínio: T- U VH- CH3 Mutações no CH3 (domínio U): L351D; inserção de 445G, 446E, 447C Sequência sinal exemplar para a cadeia 5: MDFQVQIISFLLISASVIMSRG (SEQ ID NO: 151)

> Domínio A do I2A-10 [SEQ ID NO: 118]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVP

SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIKRT > Domínio B do I2A-10 [SEQ ID NO: 119]

PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSC > Domínio D do I2A-10 [SEQ ID NO: 120]

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT

KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAK > Domínio E do I2A-10 [SEQ ID NO: 121]

GQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > Domínio F do I2A-10 [SEQ ID NO: 122]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYFIHWVRQAPGKGLEWVAGIYPSDGYTS YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYVSGMDYWGQGTLVTVSSA

S > Domínio G do I2A-10 [SEQ ID NO: 123]

PREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC > Domínio R do I2A-10 [SEQ ID NO: 124]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVP

SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIKRT > Domínio S do I2A-10 [SEQ ID NO: 125]

PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSC > Domínio H do I2A-10 [SEQ ID NO: 126]

QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPW TPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTV

> Domínio I do I2A-10 [SEQ ID NO: 127]

AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC > Domínio J do I2A-10 [SEQ ID NO: 128]

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT

KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAK > Domínio K do I2A-10 [SEQ ID NO: 129]

GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > Domínio L do I2A-10 [SEQ ID NO: 130]

TLVTVSSAS > Domínio M do I2A-10 [SEQ ID NO: 131]

TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG

LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSC > Domínio T do I2A-10 [SEQ ID NO: 122]

S > Domínio U do I2A-10 [SEQ ID NO: 123]

PREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC >Cadeia 1 do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 132]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIKRTPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTK NQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Arranjo de domínio: A- B- Dobradiça- D- E VL- CH3- Dobradiça- CH2- CH3 (hole) Mutações no primeiro CH3 (domínio B): T366K; inserção de 445K, 446S, 447C Sequência da dobradiça: DKTHTCPPCP [SEQ ID NO: 56] Mutações no segundo CH3 (domínio E): Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A, Y407V Sequência sinal exemplar para a cadeia 1: MGWSLILLFLVAVATRVLS (SEQ ID NO: 150) >Cadeia 2 do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 133]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYFIHWVRQAPGKGLEWVAGIYPSEGYTS YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYVSGMDYWGQGTLVTVSSA SPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS

DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC Arranjo de domínio: F- G VH- CH3 Mutações no CH3 (domínio G): L351D; inserção de 445G, 446E, 447C Sequência sinal exemplar para a cadeia 2: MDFQVQIISFLLISASVIMSRG (SEQ ID NO: 151) > Cadeia 3 do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 134]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVP SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIKRTPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSCTASSGGSSSGQAVVTQEPSLTV SPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGG KAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM

HEALHNHYTQKSLSLSPGK Arranjo de domínio: R- S- ligante- H- I- Dobradiça- J- K VL- CH3- ligante- VL- CL- Dobradiça- CH2- CH3 (knob) Mutações no primeiro CH3 (domínio S): T366K; inserção de 445K, 446S, 447C Inserção de ligante de dez aminoácidos: TASSGGSSSG (SEQ ID NO: 83) Sequência da dobradiça: DKTHTCPPCP [SEQ ID NO: 56] Mutações no segundo CH3 (domínio K): S354C, K366W Sequência sinal exemplar para a cadeia 3: MDFQVQIISFLLISASVIMSRGS (SEQ ID NO: 152) > Cadeia 4 do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 135]

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSC Arranjo de domínio: L- M VH- CH1

Sequência sinal exemplar para a cadeia 4: MDFQVQIISFLLISASVIMSRG (SEQ ID NO: 151) >Cadeia 5 do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 133]

DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC Arranjo de domínio: T- U VH- CH3 Mutações no CH3 (domínio U): L351D; inserção de 445G, 446E, 447C Sequência sinal exemplar para a cadeia 5: MDFQVQIISFLLISASVIMSRG (SEQ ID NO: 151) > Domínio A do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 136]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVP

SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIKRT > Domínio B do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 137]

PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSC > Domínio D do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 138]

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT

KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAK > Domínio E do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO:139]

GQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

> Domínio F do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 140]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYFIHWVRQAPGKGLEWVAGIYPSEGYTS YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYVSGMDYWGQGTLVTVSSA

S > Domínio G do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 141]

PREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC > Domínio R do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO:142]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVP

SRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIKRT > Domínio S do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 143]

PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSC > Domínio H do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 144]

QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPW

TPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTV > Domínio I do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 145]

AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC > Domínio J do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 146]

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT

KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALKAPIEKTISKAK > Domínio K do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 147]

GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > Domínio L do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 148]

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKGRFSISRDDSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQG TLVTVSSAS

> Domínio M do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 149]

TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG

LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSC > Domínio T do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 140]

S > Domínio U do I2A-10 D54E Y55Q [SEQ ID NO: 141]

PREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC

7. INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[0616] Todas as publicações, patentes, pedidos de patentes e outros documentos citados neste pedido são por meio disso incorporados por referência em suas totalidades para todos os efeitos, na mesma medida como se cada publicação, patente, pedido de patente ou outro documento fosse, individualmente, indicado para ser incorporado por referência, para todos os efeitos.

8. EQUIVALENTES

[0617] Embora várias modalidades específicas tenham sido ilustradas e descritas, o relatório descritivo acima não é restritivo. Será notado que várias alterações podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da(s) invenção(ões). Muitas variações se tornarão evidentes para as pessoas versadas na técnica após a revisão deste relatório descritivo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ligação ao receptor transmembranar da proteína tirosina quinase (ROR) caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno ROR compreende: um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um antígeno ROR, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende: A) sequências de aminoácidos de uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de uma região variável da cadeia leve (VL) específica de um sítio de ligação ao antígeno ROR específico, em que as sequências da CDR1, CDR2 e CDR3 da VL são selecionadas a partir da tabela 6; e B) sequências de aminoácidos de uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de uma região variável da cadeia pesada (VH) específica do sítio de ligação ao antígeno ROR específico, em que as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VH são selecionadas a partir da tabela 6, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno é específico para ROR1 e ROR2.

2. Molécula de ligação ao receptor transmembranar da proteína tirosina quinase (ROR) caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno ROR compreende: um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um antígeno ROR, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende: A) sequências de aminoácidos de uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de uma região variável da cadeia leve (VL) específica de um sítio de ligação ao antígeno ROR específico,

em que as sequências da CDR1, CDR2 e CDR3 da VL são selecionadas a partir da tabela 6; e B) sequências de aminoácidos de uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de uma região variável da cadeia pesada (VH) específica do sítio de ligação ao antígeno ROR específico, em que as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VH são selecionadas a partir da tabela 6, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno é específico para a ROR1.

3. Molécula de ligação ao receptor transmembranar da proteína tirosina quinase (ROR) caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno ROR compreende: um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um antígeno ROR, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende: A) sequências de aminoácidos de uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de uma região variável da cadeia leve (VL) específica de um sítio de ligação ao antígeno ROR específico, em que as sequências da CDR1, CDR2 e CDR3 da VL são selecionadas a partir da tabela 6; e B) sequências de aminoácidos de uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de uma região variável da cadeia pesada (VH) específica do sítio de ligação ao antígeno ROR específico, em que as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VH são selecionadas a partir da tabela 6, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno é específico para a ROR2.

4. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o antígeno ROR é um domínio selecionado do grupo que consiste em: um domínio ROR1 Frizzle, um domínio ROR2 Frizzle, um domínio semelhante a Ig ROR1, um domínio semelhante a Ig ROR2, um domínio ROR1 Kringle e um domínio ROR2 Kringle.

5. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o antígeno ROR compreende um antígeno ROR humano.

6. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4 e 5, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VH e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VL de I2A-1, I2A-10, I2A-10 D54E Y55Q, I2A-11, I2A-13, I2A-14, I2A-16, I2A-18, I2A-19, I2A-22, I2A-24, I2A-26, I2A-34, I2A-36, I2C-1, I2C-2, I2C- 4, I2C-6, I2C-8, I2C-9, I2C-10, I2C-11, I2C-12, I2C-13, I2C- 14, I2C-15, I2C-16, I2C-17, I2C-18, I2C-1-20, I2C-22, I2C- 23 ou I2C-24 da tabela 6.

7. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 4 e 5, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VH e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VL de I2A-3, I2A-4, I2A-6, I2A-8, I2A-12, I2A-20, I2A-25, I2A-26, I2A-27, I2A-30, I2A- 32, I2A-33 ou I2A37 da tabela 6.

8. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3, 4 e 5, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VH e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VL de I2C-3, I2C-5, I2C-7, I2C-19, I2C-21, I2C-25 ou I2C-26 da tabela 6.

9. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno ROR compreende adicionalmente um segundo sítio de ligação ao antígeno.

10. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno é o mesmo que o primeiro sítio de ligação ao antígeno.

11. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VH e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VL de I2A-1, I2A-10, I2A-10 D54E Y55Q, I2A-11, I2A-13, I2A-14, I2A-16, I2A-18, I2A-19, I2A-22, I2A-24, I2A-26, I2A-34, I2A- 36, I2C-1, I2C-2, I2C-4, I2C-6, I2C-8, I2C-9, I2C-10, I2C- 11, I2C-12, I2C-13, I2C-14, I2C-15, I2C-16, I2C-17, I2C-18, I2C-1-20, I2C-22, I2C-23 ou I2C-24 da tabela 6.

12. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VH e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VL de I2A-3, I2A-4, I2A-6, I2A-8, I2A-12, I2A-20, I2A-25, I2A-26, I2A-27, I2A-30, I2A-32, I2A-33 ou I2A37 da tabela 6.

13. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VH e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VL de

I2C-3, I2C-5, I2C-7, I2C-19, I2C-21, I2C-25 ou I2C-26 da tabela 6.

14. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno é específico para um segundo antígeno diferente do antígeno ROR.

15. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o segundo antígeno é um antígeno CD3.

16. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno é específico para um epítopo do antígeno CD3.

17. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno compreende: A) uma sequência de aminoácidos específica da região variável da cadeia leve (VL) selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 73; e B) uma sequência de aminoácidos específica da região variável da cadeia pesada (VH) selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72.

18. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno compreende: A) uma sequência de aminoácidos específica da região variável da cadeia leve (VL) selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 73; e

B) uma sequência de aminoácidos específica da região variável da cadeia pesada (VH) selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72.

19. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno ROR compreende um formato de anticorpo selecionado do grupo consistindo em: anticorpos completos, fragmentos Fab, Fvs, scFvs, scFvs em tandem, diacorpos, sc-diacorpos, DARTs, tandAbs e minicorpos.

20. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que a molécula compreende uma sequência de uma ou mais regiões constantes.

21. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a região constante é uma região constante CH1, CH2, CH3 e/ou CL.

22. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 21, caracterizada pelo fato de que a sequência da região constante compreende uma ou mais de (i) uma sequência da região constante CH1 que é a SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131 ou SEQ ID NO: 149; (ii) uma sequência da região constante CH2 que é a SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 138 ou SEQ ID NO: 146; (iii) uma sequência da região constante CH3 que é a SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:

21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143 ou SEQ ID NO: 147; e/ou (iv) uma sequência da região constante CL que é a SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 127 ou SEQ ID NO: 145.

23. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno ROR compreende: uma primeira e uma segunda cadeia polipeptídica, em que: (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende um domínio A, um domínio B, um domínio D e um domínio E, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação A-B-D-E, em que o domínio A tem uma sequência de aminoácidos do domínio de região variável, e em que o domínio B, o domínio D e o domínio E têm uma sequência de aminoácidos do domínio da região constante; (b) a segunda cadeia polipeptídica compreende um domínio F e um domínio G, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação F-G, e em que o domínio F tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região variável e o domínio G tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região constante,

(c) o primeiro e o segundo polipeptídeos estão associados através de uma interação entre o domínio A e o domínio F e uma interação entre o domínio B e o domínio G para formar a molécula de ligação ao antígeno ROR, e em que a interação entre o domínio A e o domínio F forma o primeiro sítio de ligação ao antígeno.

24. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno ROR compreende adicionalmente: uma terceira e uma quarta cadeia polipeptídica, em que: (a) a terceira cadeia polipeptídica compreende um domínio H, um domínio I, um domínio J e um domínio K, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação H-I-J-K, e em que o domínio H tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região variável, e os domínios I, J e K têm uma sequência de aminoácidos do domínio da região constante; (b) a quarta cadeia polipeptídica compreende um domínio L e um domínio M, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação L-M, e em que o domínio L tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região variável e o domínio M tem uma sequência de aminoácidos da região constante; (c) o terceiro e o quarto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios H e L e uma interação entre os domínios I e M; e (d) o primeiro e o terceiro polipeptídeos estão associados através de uma interação entre o domínio D e o domínio J e uma interação entre o domínio E e o domínio K para formar a molécula de ligação ao antígeno ROR, e em que a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno.

25. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com as reivindicações 23 ou 24, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno é específico para ROR1 e ROR2, ROR1 ou ROR2.

26. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VH e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VL de I2A-1, I2A-10, I2A-10 D54E Y55Q, I2A-11, I2A-13, I2A-14, I2A-16, I2A-18, I2A-19, I2A-22, I2A-24, I2A-26, I2A-34, I2A- 36, I2C-1, I2C-2, I2C-4, I2C-6, I2C-8, I2C-9, I2C-10, I2C- 11, I2C-12, I2C-13, I2C-14, I2C-15, I2C-16, I2C-17, I2C-18, I2C-1-20, I2C-22, I2C-23 ou I2C-24 da tabela 6.

27. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VH e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VL de I2A-3, I2A-4, I2A-6, I2A-8, I2A-12, I2A-20, I2A-25, I2A-26, I2A-27, I2A-30, I2A-32, I2A-33 ou I2A37 da tabela 6.

28. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VH e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VL de I2C-3, I2C-5, I2C-7, I2C-19, I2C-21, I2C-25 ou I2C-26 da tabela 6.

29. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno é específico para CD3.

30. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 28, caracterizada pelo fato de que o domínio B e o domínio G têm uma sequência de aminoácidos CH3.

31. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que as sequências de aminoácidos do domínio B e do domínio G são idênticas, em que a sequência é uma sequência CH3 endógena.

32. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que as sequências de aminoácidos do domínio B e do domínio G são diferentes e compreendem separadamente, e respectivamente, modificações ortogonais em uma sequência CH3 endógena, em que o domínio B interage com o domínio G, e em que nem o domínio B e nem o domínio G interagem significativamente com um domínio CH3 que não tem a modificação ortogonal.

33. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que as modificações ortogonais do domínio B e do domínio G compreendem mutações que geram pontes dissulfeto modificadas entre o domínio B e o domínio G.

34. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que as mutações do domínio B e do domínio G que geram pontes dissulfeto modificadas são uma mutação S354C em um do domínio B e domínio G, e um 349C no outro domínio.

35. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 34, caracterizada pelo fato de que as modificações ortogonais do domínio B e do domínio G compreendem mutações knob-in-hole.

36. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que as mutações knob-in-hole do domínio B e do domínio G são uma mutação T366W em um do domínio B e do domínio G, e uma mutação T366S, L368A e aY407V no outro domínio.

37. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 36, caracterizada pelo fato de que as modificações ortogonais do domínio B e do domínio G compreendem mutações de par de carga.

38. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que as mutações de par de carga do domínio B e do domínio G são uma mutação T366K em um do domínio B e do domínio G, e uma mutação L351D no outro domínio.

39. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 38, caracterizada pelo fato de que o domínio B e o domínio G têm uma sequência de aminoácidos CH2 da IgM ou uma sequência de aminoácidos CH2 da IgE.

40. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos CH2 da IgM ou a sequência de aminoácidos CH2 da IgE compreende modificações ortogonais.

41. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 40, caracterizado pelo fato de que o domínio I tem uma sequência CL e o domínio M tem uma sequência CH1.

42. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 40, caracterizado pelo fato de que o domínio I tem uma sequência CH1 e o domínio M tem uma sequência CL.

43. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 41 ou 42, caracterizada pelo fato de que cada uma da sequência CH1 e da sequência CL compreende uma ou mais modificações ortogonais, em que um domínio que tem a sequência CH1 não interage significativamente com um domínio que tem uma sequência CL sem a modificação ortogonal.

44. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que as modificações ortogonais compreendem mutações que geram pontes dissulfeto modificadas entre o pelo menos um domínio CH1 e um domínio CL, sendo as mutações selecionadas do grupo que consistem em: uma cisteína modificada na posição 138 da sequência CH1 e na posição 116 da sequência CL; uma cisteína modificada na posição 128 da sequência CH1 e na posição 119 da sequência CL, e uma cisteína modificada na posição 129 da sequência CH1 e na posição 210 da sequência CL.

45. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que as modificações ortogonais compreendem mutações que geram pontes dissulfeto modificadas entre o pelo menos um domínio CH1 e um domínio CL, em que as mutações compreendem cisteínas modificadas na posição 128 da sequência CH1 e na posição 118 de uma sequência CL kappa.

46. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que as modificações ortogonais compreendem mutações que geram pontes dissulfeto modificadas entre o pelo menos um domínio CH1 e um domínio CL, as mutações selecionadas do grupo que consistem em: uma mutação F118C na sequência CL com um A141C correspondente na sequência CH1; uma mutação F118C na sequência CL com um L128C correspondente na sequência CH1; e mutações S162C na sequência CL com uma mutação P171C correspondente na sequência CH1.

47. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 46, caracterizada pelo fato de que compreende mutações de par de carga entre o pelo menos um domínio CH1 e um domínio CL, sendo as mutações de par de carga selecionadas do grupo que consiste em: uma mutação F118S na sequência CL com um A141L correspondente na sequência CH1; uma mutação F118A na sequência CL com um A141L correspondente na sequência CH1; uma mutação F118V na sequência CL com um A141L correspondente na sequência CH1; e uma mutação T129R na sequência CL com um K147D correspondente na sequência CH1.

48. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 46, caracterizada pelo fato de que as modificações ortogonais compreendem mutações de par de carga entre o pelo menos um domínio CH1 e um domínio CL, sendo as mutações de par de carga selecionadas do grupo consistindo em: uma mutação N138K na sequência CL com um G166D correspondente na sequência CH1, e uma mutação N138D na sequência CL com um G166K correspondente na sequência CH1.

49. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 48, caracterizada pelo fato de que o domínio A tem uma sequência de aminoácidos VL e o domínio F tem uma sequência de aminoácidos VH.

50. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 48, caracterizada pelo fato de que o domínio A tem uma sequência de aminoácidos VH e o domínio F tem uma sequência de aminoácidos VL.

51. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 45, caracterizada pelo fato de que o domínio H tem uma sequência de aminoácidos VL e o domínio L tem uma sequência de aminoácidos VH.

52. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 45, caracterizada pelo fato de que o domínio H tem uma sequência de aminoácidos VH e o domínio L tem uma sequência de aminoácidos VL.

53. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o domínio D e o domínio J têm uma sequência de aminoácidos CH2.

54. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 53, caracterizada pelo fato de que o domínio E tem uma sequência de aminoácidos CH3.

55. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 54, caracterizada pelo fato de que as sequências de aminoácidos do domínio E e do domínio K são idênticas, onde a sequência é uma sequência CH3 endógena.

56. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 54, caracterizada pelo fato de que as sequências de aminoácidos do domínio E e do domínio K são diferentes.

57. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 56, caracterizada pelo fato de que as sequências diferentes compreendem separadamente, e respectivamente, modificações ortogonais em uma sequência CH3 endógena, em que o domínio E interage com o domínio K, e em que nem o domínio E e nem o domínio K interagem significativamente com um domínio CH3 que não tem a modificação ortogonal.

58. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que as modificações ortogonais compreendem mutações que geram pontes dissulfeto modificadas entre o domínio E e o domínio K.

59. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que as mutações que geram as pontes dissulfeto modificadas são uma mutação S354C em um dentre o domínio E e o domínio K, e uma 349C no outro domínio.

60. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 59, caracterizada pelo fato de que as modificações ortogonais no domínio E e no domínio K compreendem mutações knob-in-hole.

61. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que as mutações knob-in-hole são uma mutação T366W em um do domínio E ou do domínio K, e uma mutação T366S, L368A e aY407V no outro domínio.

62. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 61, caracterizada pelo fato de que as modificações ortogonais no domínio E e no domínio K compreendem mutações de par de carga.

63. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que as mutações de par de carga são uma mutação T366K em um do domínio E ou do domínio K, e uma mutação L351D correspondente no outro domínio.

64. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 56, caracterizada pelo fato de que as sequências de aminoácidos do domínio E e do domínio K são sequências endógenas de dois domínios de anticorpo diferentes, os quais são selecionados para ter uma interação específica que promove a associação específica entre o primeiro e o terceiro polipeptídeos.

65. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que as duas sequências de aminoácidos diferentes são uma sequência CH1 e uma sequência CL.

66. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 65, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno ROR compreende adicionalmente um terceiro sítio de ligação ao antígeno.

67. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 54, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação ao antígeno é específico para ROR1 e ROR2, ROR1 ou ROR2.

68. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação ao antígeno é o mesmo que o primeiro sítio de ligação ao antígeno.

69. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 67 ou 68, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação ao antígeno compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VH e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VL de I2A-1, I2A-10, I2A-10 D54E Y55Q, I2A- 11, I2A-13, I2A-14, I2A-16, I2A-18, I2A-19, I2A-22, I2A-24, I2A-26, I2A-34, I2A-36, I2C-1, I2C-2, I2C-4, I2C-6, I2C-8, I2C-9, I2C-10, I2C-11, I2C-12, I2C-13, I2C-14, I2C-15, I2C- 16, I2C-17, I2C-18, I2C-1-20, I2C-22, I2C-23, ou I2C-24 da tabela 6.

70. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 67 ou 68, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação ao antígeno compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VH e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VL de I2A-3, I2A-4, I2A-6, I2A-8, I2A-12, I2A-20, I2A-25, I2A-26, I2A-27, I2A-30, I2A-32, I2A-33 ou I2A37 da tabela 6.

71. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 67 ou 68, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação ao antígeno compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VH e as sequências CDR1,

CDR2 e CDR3 da VL de I2C-3, I2C-5, I2C-7, I2C-19, I2C-21, I2C-25 ou I2C-26 da tabela 6.

72. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 71, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno ROR compreende uma quinta cadeia polipeptídica, em que (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende adicionalmente um domínio N e um domínio O, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação N-O-A-B-D-E, e em que o domínio N tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região variável, e o domínio O tem uma sequência de aminoácidos da região constante; (b) a quinta cadeia polipeptídica compreende um domínio P e um domínio Q, em que os domínios são dispostos, do terminal N para o terminal C, em uma orientação P-Q, e em que o domínio P tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região variável e o domínio Q tem uma sequência de aminoácidos da região constante; e (c) o primeiro e o quinto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios N e P e uma interação entre os domínios O e Q para formar a molécula de ligação ao antígeno ROR.

73. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que (a) as sequências de aminoácidos do domínio N e do domínio A são idênticas,

a sequência de aminoácidos do domínio H é diferente da sequência do domínio N e do domínio A, as sequências de aminoácidos do domínio O e do domínio B são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio I é diferente da sequência do domínio O e do domínio B, as sequências de aminoácidos do domínio P e do domínio F são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio L é diferente da sequência do domínio P e do domínio F, as sequências de aminoácidos do domínio Q e do domínio G são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio M é diferente da sequência do domínio Q e do domínio G; e (b) em que a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio N e o domínio P forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno.

74. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que o primeiro antígeno é um antígeno ROR.

75. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 73 ou 74, caracterizada pelo fato de que o segundo antígeno é um antígeno CD3.

76. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que:

(a) as sequências de aminoácidos do domínio N, do domínio A e domínio H são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio O, do domínio B e do domínio I são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio P, do domínio F e do domínio L são diferentes, e as sequências de aminoácidos do domínio Q, do domínio G e do domínio M são diferentes; e (b) a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio N e o domínio P forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno para um terceiro antígeno.

77. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 69, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno ROR compreende uma quinta cadeia polipeptídica, em que: (a) a terceira cadeia polipeptídica compreende adicionalmente um domínio R e um domínio S, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação R-S-H-I-J-K, e em que o domínio R tem uma sequência de aminoácidos da região variável e o domínio S tem uma sequência de aminoácidos do domínio constante; (b) a quinta cadeia polipeptídica compreende:

um domínio T e um domínio U, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação T-U, e em que o domínio T tem uma sequência de aminoácidos da região variável e o domínio U tem uma sequência constante de aminoácidos do domínio constante; e (c) o terceiro e o quinto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios R e T e uma interação entre os domínios S e U para formar a molécula de ligação ao antígeno ROR.

78. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que: (a) as sequências de aminoácidos do domínio R e do domínio A são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio H é diferente da sequência do domínio R e do domínio A, as sequências de aminoácidos do domínio S e do domínio B são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio I é diferente da sequência do domínio S e do domínio B, as sequências de aminoácidos do domínio T e do domínio F são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio L é diferente da sequência do domínio T e do domínio F, as sequências de aminoácidos do domínio U e do domínio G são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio M é diferente da sequência do domínio U e do domínio G; e

(b) a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno.

79. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 78, caracterizada pelo fato de que o primeiro antígeno é um antígeno ROR.

80. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 78 ou 79, caracterizada pelo fato de que o segundo antígeno é um antígeno CD3.

81. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 80, caracterizada pelo fato de que a molécula compreende cinco cadeias polipeptídicas, e em que a cadeia 1 compreende a SEQ ID NO: 96, a cadeia 2 compreende a SEQ ID NO: 97, a cadeia 3 compreende a SEQ ID NO: 98, a cadeia 4 compreende a SEQ ID NO: 99 e a cadeia 5 compreende a SEQ ID NO: 97.

82. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 80, caracterizada pelo fato de que a molécula compreende cinco cadeias polipeptídicas, e em que a cadeia 1 compreende a SEQ ID NO: 114, a cadeia 2 compreende a SEQ ID NO: 115, a cadeia 3 compreende a SEQ ID NO: 116, a cadeia 4 compreende a SEQ ID NO: 117 e a cadeia 5 compreende a SEQ ID NO: 115.

83. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 80, caracterizada pelo fato de que a molécula compreende cinco cadeias polipeptídicas, e em que a cadeia 1 compreende a SEQ ID NO: 132, a cadeia 2 compreende a SEQ ID NO: 133, a cadeia 3 compreende a SEQ ID NO: 134, a cadeia 4 compreende a SEQ ID NO: 135 e a cadeia 5 compreende a SEQ ID NO: 133.

84. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que: (a) as sequências de aminoácidos do domínio R e do domínio H são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio A é diferente da sequência do domínio R e do domínio H, as sequências de aminoácidos do domínio S e do domínio I são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio B é diferente da sequência do domínio S e do domínio I, as sequências de aminoácidos do domínio T e do domínio L são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio F é diferente da sequência do domínio T e do domínio L, as sequências de aminoácidos do domínio U e do domínio M são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio G é diferente da sequência do domínio U e do domínio M, e (b) a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno,

a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o segundo antígeno.

85. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 84, caracterizada pelo fato de que o segundo antígeno é um antígeno ROR.

86. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 85, caracterizada pelo fato de que o primeiro antígeno é um antígeno CD3.

87. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que: (a) as sequências de aminoácidos do domínio R, do domínio A e do domínio H são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio S, do domínio B e do domínio I são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio T, do domínio F e do domínio L são diferentes, e as sequências de aminoácidos do domínio U, do domínio G e do domínio M são diferentes; e (b) a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para um terceiro antígeno.

88. Molécula de ligação ao antígeno receptor transmembranar da proteína tirosina quinase (ROR), caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno ROR compreende: uma primeira e uma segunda cadeia polipeptídica, em que: (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende um domínio A, um domínio B, um domínio D e um domínio E, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação A-B-D-E, e em que o domínio A tem uma sequência de aminoácidos VL, o domínio B tem uma sequência de aminoácidos CH3, o domínio D tem uma sequência de aminoácidos CH2 e o domínio E tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região constante; (b) a segunda cadeia polipeptídica compreende um domínio F e um domínio G, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação F-G, e em que o domínio F tem uma sequência de aminoácidos VH e o domínio G tem uma sequência de aminoácidos CH3; e (c) o primeiro e o segundo polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios A e F e uma interação entre os domínios B e G para formar a molécula de ligação ao antígeno ROR, em que a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um antígeno ROR.

89. Molécula de ligação ao antígeno receptor transmembranar da proteína tirosina quinase (ROR), caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno ROR compreende: uma primeira, segunda, terceira e quarta cadeia polipeptídica, em que: (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende um domínio A, um domínio B, um domínio D e um domínio E, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação A-B-D-E, e o domínio A tem uma sequência de aminoácidos VL, o domínio B tem uma sequência de aminoácidos CH3, o domínio D tem uma sequência de aminoácidos CH2 e o domínio E tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região constante; (b) a segunda cadeia polipeptídica compreende um domínio F e um domínio G, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação F-G, e em que o domínio F tem uma sequência de aminoácidos VH e o domínio G tem uma sequência de aminoácidos CH3; (c) a terceira cadeia polipeptídica compreende um domínio H, um domínio I, um domínio J e um domínio K, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação H-I-J-K, e em que o domínio H tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região variável, o domínio I tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região constante, o domínio J tem uma sequência de aminoácidos CH2 e K tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região constante;

(d) a quarta cadeia polipeptídica compreende um domínio L e um domínio M, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação L-M, e em que o domínio L tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região variável e o domínio M tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região constante; (e) o primeiro e o segundo polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios A e F e uma interação entre os domínios B e G; (f) o terceiro e o quarto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios H e L e uma interação entre os domínios I e M; e (g) o primeiro e o terceiro polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios D e J e uma interação entre os domínios E e K para formar a molécula de ligação ao antígeno ROR, em que a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno e em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno, o segundo sítio de ligação ao antígeno ou o primeiro e o segundo sítio de ligação ao antígeno são específicos para um antígeno ROR.

90. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 89, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno é específico para o antígeno ROR.

91. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 89 ou 90, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno é específico para o antígeno ROR.

92. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 89, caracterizada pelo fato de que o primeiro e o segundo sítio de ligação ao antígeno é específico para o antígeno ROR.

93. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 92, caracterizada pelo fato de que o antígeno ROR é ROR1.

94. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 92, caracterizada pelo fato de que o antígeno ROR é ROR2.

95. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 92, caracterizada pelo fato de que o antígeno ROR é ROR1 e ROR2.

96. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 92, caracterizada pelo fato de que o antígeno ROR é um domínio selecionado do grupo que consiste em: um domínio ROR1 Frizzle, um domínio ROR2 Frizzle, um domínio semelhante a Ig ROR1, um domínio semelhante a Ig ROR2, um domínio ROR1 Kringle e um domínio ROR2 Kringle.

97. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 93 a 96, caracterizada pelo fato de que o antígeno ROR compreende um antígeno ROR humano.

98. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 97,caracterizada pelo fato de que o domínio A compreende sequências de aminoácidos de uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de uma região variável da cadeia leve (VL) específica de um sítio de ligação ao antígeno ROR específico, em que as sequências da CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são selecionadas a partir da tabela 6, e em que o domínio F compreende sequências de aminoácidos de uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de uma região variável da cadeia pesada (VH) do sítio de ligação ao antígeno ROR específico, em que as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da VH são selecionadas a partir da tabela 6.

99. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 98, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação ao antígeno ROR específico é I2A-10 ou I2A-27.

100. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 89 a 99, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno compreende: A) na terceira cadeia polipeptídica, uma sequência de aminoácidos específica da região variável da cadeia leve (VL) selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 73; e B) na quarta cadeia polipeptídica, uma sequência de aminoácidos específica da região variável da cadeia pesada (VH) selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72.

101. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 89 a 99, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno compreende: A) na quarta cadeia polipeptídica, uma sequência de aminoácidos específica da região variável da cadeia leve (VL) selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 73; e B) na terceira cadeia polipeptídica, uma sequência de aminoácidos específica da região variável da cadeia pesada (VH) selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72.

102. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 100, caracterizada pelo fato de que as sequências de aminoácidos do domínio B e do domínio G são idênticas, em que a sequência é uma sequência CH3 endógena.

103. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 100, caracterizada pelo fato de que as sequências de aminoácidos do domínio B e do domínio G são diferentes e compreendem separadamente, e respectivamente, modificações ortogonais em uma sequência CH3 endógena, em que o domínio B interage com o domínio G, e em que nem o domínio B e nem o domínio G interagem significativamente com um domínio CH3 que não tem a modificação ortogonal.

104. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 103, caracterizada pelo fato de que as modificações ortogonais do domínio B e do domínio G compreendem mutações que geram pontes dissulfeto modificadas entre o domínio B e o domínio G.

105. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 104, caracterizada pelo fato de que as mutações do domínio B e do domínio G que geram pontes dissulfeto modificadas são uma mutação S354C em um dentre o domínio B e o domínio G, e um 349C no outro domínio.

106. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 103 a 105, caracterizada pelo fato de que as modificações ortogonais do domínio B e do domínio G compreendem mutações knob-in-hole.

107. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 106, caracterizada pelo fato de que as mutações knob-in-hole são uma mutação T366W em um do domínio B e do domínio G, e uma mutação T366S, L368A e aY407V no outro domínio.

108. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 103 a 107, caracterizada pelo fato de que as modificações ortogonais do domínio B e do domínio G compreendem mutações de par de carga.

109. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 108, caracterizada pelo fato de que as mutações de par de carga são uma mutação T366K em um do domínio B ou do domínio G, e uma mutação L351D no outro domínio.

110. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 109, caracterizada pelo fato de que o domínio E tem uma sequência de aminoácidos CH3.

111. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 110, caracterizada pelo fato de que as sequências de aminoácidos do domínio E e do domínio K são idênticas, em que a sequência é uma sequência CH3 endógena.

112. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 110, caracterizada pelo fato de que as sequências de aminoácidos do domínio E e do domínio K são diferentes.

113. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 112, caracterizada pelo fato de que as sequências diferentes compreendem separadamente, e respectivamente, modificações ortogonais em uma sequência CH3 endógena, em que o domínio E interage com o domínio K, e em que nem o domínio E e nem o domínio K interagem significativamente com um domínio CH3 que não tem a modificação ortogonal.

114. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 113, caracterizada pelo fato de que as modificações ortogonais compreendem mutações que geram pontes dissulfeto modificadas entre o domínio E e o domínio K.

115. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 114, caracterizada pelo fato de que as mutações que geram as pontes dissulfeto modificadas são uma mutação S354C em um dentre o domínio E e o domínio K, e uma 349C no outro domínio.

116. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 113 a 115, caracterizada pelo fato de que as modificações ortogonais no domínio E e no domínio K compreendem mutações knob-in-hole.

117. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 116, caracterizada pelo fato de que as mutações knob-in-hole são uma mutação T366W em um do domínio E ou do domínio K, e uma mutação T366S, L368A e aY407V no outro domínio.

118. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 113 a 117, caracterizada pelo fato de que as modificações ortogonais no domínio E e no domínio K compreendem mutações de par de carga.

119. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 118, caracterizada pelo fato de que as mutações de par de carga são uma mutação T366K em um do domínio E ou do domínio K, e uma mutação L351D correspondente no outro domínio.

120. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 112, caracterizada pelo fato de que as sequências de aminoácidos do domínio E e do domínio K são sequências endógenas de dois domínios de anticorpo diferentes, os quais são selecionados para ter uma interação específica que promove a associação específica entre o primeiro e o terceiro polipeptídeos.

121. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 120, caracterizada pelo fato de que as duas sequências de aminoácidos diferentes são uma sequência CH1 e uma sequência CL.

122. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 89 a 121, caracterizada pelo fato de que o domínio I tem uma sequência CL e o domínio M tem uma sequência CH1.

123. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 89 a 122, caracterizada pelo fato de que o domínio H tem uma sequência VL e domínio L tem uma sequência VH.

124. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 89 a 123, caracterizada pelo fato de que: o domínio H tem uma sequência de aminoácidos VL; o domínio I tem uma sequência de aminoácidos CL; o domínio K tem uma sequência de aminoácidos CH3; o domínio L tem uma sequência de aminoácidos VH; e o domínio M tem uma sequência de aminoácidos CH1.

125. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 89 a 124, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente: uma quinta cadeia polipeptídica, em que: (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende adicionalmente um domínio N e um domínio O, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação N-O-A-B-D-E, e em que o domínio N tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região variável e o domínio O tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região constante; (b) a molécula de ligação ao antígeno ROR compreende adicionalmente uma quinta cadeia polipeptídica, compreendendo: um domínio P e um domínio Q, em que os domínios são dispostos, do terminal N para o terminal C, em uma orientação P-Q, e em que o domínio P tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região variável e o domínio Q tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região constante; e (c) o primeiro e o quinto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios N e P e uma interação entre os domínios O e Q para formar a molécula de ligação ao antígeno ROR.

126. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 125, caracterizada pelo fato de que: (a) as sequências de aminoácidos do domínio N e do domínio A são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio H é diferente da sequência do domínio N e do domínio A, as sequências de aminoácidos do domínio O e do domínio B são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio I é diferente da sequência do domínio O e do domínio B, as sequências de aminoácidos do domínio P e do domínio F são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio L é diferente da sequência do domínio P e do domínio F, as sequências de aminoácidos do domínio Q e do domínio G são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio M é diferente da sequência do domínio Q e do domínio G; e (b) em que a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio N e o domínio P forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno.

127. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 126, caracterizada pelo fato de que o primeiro antígeno é o antígeno ROR.

128. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 126 ou 127, caracterizada pelo fato de que o segundo antígeno é um antígeno CD3.

129. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 125, caracterizada pelo fato de que: (a) as sequências de aminoácidos do domínio N, do domínio A e domínio H são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio O, do domínio B e do domínio I são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio P, do domínio F e do domínio L são diferentes, e as sequências de aminoácidos do domínio Q, do domínio G e do domínio M são diferentes; (b) a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e o domínio N e o domínio P formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para um terceiro antígeno, e (c) o primeiro, o segundo ou o terceiro antígeno é o antígeno ROR.

130. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 89 a 124, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente: uma quinta cadeia polipeptídica, em que: (a) a terceira cadeia polipeptídica compreende adicionalmente um domínio R e um domínio S, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação R-S-H-I-J-K, e em que o domínio R tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região variável e o domínio S tem uma sequência de aminoácidos do domínio constante; (b) a molécula de ligação ao antígeno ROR compreende adicionalmente uma quinta cadeia polipeptídica, compreendendo: um domínio T e um domínio U, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação T-U, e em que o domínio T tem uma sequência de aminoácidos do domínio da região variável e o domínio U tem uma sequência de aminoácidos do domínio constante; e (c) o terceiro e o quinto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios R e T e uma interação entre os domínios S e U para formar a molécula de ligação ao antígeno ROR.

131. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 130, caracterizada pelo fato de que: (a) as sequências de aminoácidos do domínio R e do domínio A são idênticas,

a sequência de aminoácidos do domínio H é diferente da sequência do domínio R e do domínio A, as sequências de aminoácidos do domínio S e do domínio B são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio I é diferente da sequência do domínio S e do domínio B, as sequências de aminoácidos do domínio T e do domínio F são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio L é diferente da sequência do domínio T e do domínio F, as sequências de aminoácidos do domínio U e do domínio G são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio M é diferente da sequência do domínio U e do domínio G, e (b) a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno; e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno.

132. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 131, caracterizada pelo fato de que o primeiro antígeno é o antígeno ROR.

133. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 131 ou 132, caracterizada pelo fato de que o segundo antígeno é um antígeno CD3.

134. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 130, caracterizada pelo fato de que: (a) as sequências de aminoácidos do domínio R e do domínio H são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio A é diferente da sequência do domínio R e do domínio H, as sequências de aminoácidos do domínio S e do domínio I são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio B é diferente da sequência do domínio S e do domínio I, as sequências de aminoácidos do domínio T e do domínio L são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio F é diferente da sequência do domínio T e do domínio L, as sequências de aminoácidos do domínio U e do domínio M são idênticas, a sequência de aminoácidos do domínio G é diferente da sequência do domínio U e do domínio M, e (b) a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o segundo antígeno.

135. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 134, caracterizada pelo fato de que o segundo antígeno é o antígeno ROR.

136. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 134 ou 135, caracterizada pelo fato de que o primeiro antígeno é um antígeno CD3.

137. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 130, caracterizada pelo fato de que: (a) as sequências de aminoácidos do domínio R, do domínio A e do domínio H são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio S, do domínio B e do domínio I são diferentes, as sequências de aminoácidos do domínio T, do domínio F e do domínio L são diferentes, e as sequências de aminoácidos do domínio U, do domínio G e do domínio M são diferentes; (b) a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para um terceiro antígeno; e (c) o primeiro, o segundo ou o terceiro antígeno é o antígeno ROR.

138. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 89 a 124, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente: uma quinta e uma sexta cadeia polipeptídica, em que: (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende adicionalmente um domínio N e um domínio O, em que os domínios são dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação N-O-A-B-D-E; (b) a terceira cadeia polipeptídica compreende adicionalmente um domínio R e um domínio S, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação R-S-H-I-J-K; (c) molécula de ligação ao antígeno ROR, que compreende adicionalmente uma quinta e uma sexta cadeia polipeptídica, em que: a quinta cadeia polipeptídica compreende um domínio P e um domínio Q, em que os domínios são dispostos, do terminal N para o terminal C, em uma orientação P-Q, e a sexta cadeia polipeptídica compreende um domínio T e um domínio U, em que os domínios estão dispostos, do terminal N ao terminal C, em uma orientação T-U; e (d) o primeiro e o quinto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios N e P e uma interação entre os domínios O e Q, e o terceiro e o sexto polipeptídeos estão associados através de uma interação entre os domínios R e T e uma interação entre os domínios S e U para formar a molécula de ligação ao antígeno ROR.

139. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 138, caracterizada pelo fato de que: (a) as sequências de aminoácidos do domínio N e do domínio A são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio H e do domínio R são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio O e do domínio B são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio I e do domínio S são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio P e do domínio F são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio L e do domínio T são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio Q e do domínio G são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio M e do domínio U são idênticas; e (b) em que a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, o domínio N e o domínio P formam um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um quarto sítio de ligação ao antígeno específico para o segundo antígeno.

140. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 138, caracterizada pelo fato de que:

(a) as sequências de aminoácidos do domínio H e do domínio A são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio N e do domínio R são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio I e do domínio B são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio O e do domínio S são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio L e do domínio F são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio P e do domínio T são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio M e do domínio G são idênticas, as sequências de aminoácidos do domínio Q e do domínio U são idênticas; e (b) em que a interação entre o domínio A e o domínio F forma um primeiro sítio de ligação ao antígeno específico para um primeiro antígeno, o domínio N e o domínio P formam um segundo sítio de ligação ao antígeno específico para um segundo antígeno, a interação entre o domínio H e o domínio L forma um terceiro sítio de ligação ao antígeno específico para o primeiro antígeno e a interação entre o domínio R e o domínio T forma um quarto sítio de ligação ao antígeno específico para o segundo antígeno.

141. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 140, caracterizada pelo fato de que a sequência que forma a junção entre o domínio A e o domínio B é IKRTPREP ou IKRTVREP.

142. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 141, caracterizada pelo fato de que a sequência que forma a junção entre o domínio F e o domínio G é SSASPREP.

143. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 142, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma sequência de aminoácidos CH3 tem uma inserção de tripeptídeo no terminal C conectando a sequência de aminoácidos CH3 a uma sequência de aminoácidos da dobradiça, em que a inserção de tripeptídeo é selecionada do grupo consistindo em PGK, KSC e GEC.

144. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 143, caracterizada pelo fato de que as sequências são sequências humanas.

145. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 144, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma sequência de aminoácidos CH3 é uma sequência de IgG.

146. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 145, caracterizada pelo fato de que as sequências de IgG são sequências da IgG1.

147. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 146, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma sequência de aminoácidos CH3 tem uma ou mais mutações de isoalotipo.

148. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 147, caracterizada pelo fato de que as mutações de isoalotipo são D356E e L358M.

149. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 148, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos CL é uma sequência Ckappa.

150. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 149, caracterizada pelo fato de que as sequências CH2 têm uma ou mais mutações modificadas que reduzem a função Fc efetora.

151. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 150, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais mutações modificadas estão na posição L234, L235 e P329.

152. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 151, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais mutações modificadas são L234A, L235A e P329G.

153. Molécula de ligação ao antígeno ROR, de acordo com a reivindicação 151, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais mutações modificadas são L234A, L235A e P329K.

154. Molécula de ligação ao antígeno ROR purificada caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno ROR purificada compreende a molécula de ligação ao antígeno ROR conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 153.

155. Molécula de ligação ao antígeno ROR purificada, de acordo com a reivindicação 154, caracterizada pelo fato de que a ligação ao antígeno ROR purificada é purificada por um método de purificação que compreende uma etapa de purificação por afinidade a CH1.

156. Molécula de ligação ao antígeno ROR purificada, de acordo com qualquer uma das reivindicação 154 a 155,

caracterizada pelo fato de que o método de purificação é um método de purificação de uma única etapa.

157. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender a molécula de ligação ao antígeno ROR conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 156, e um diluente farmaceuticamente aceitável.

158. Método para tratar um indivíduo com câncer caracterizado pelo fato de o método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 157 ao indivíduo.

159. Método, de acordo com a reivindicação 158, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer que expressa o antígeno ROR.

160. Método, de acordo com a reivindicação 159, caracterizado pelo fato de que o câncer expressa um antígeno ROR1.

161. Método, de acordo com a reivindicação 159, caracterizado pelo fato de que o câncer expressa um antígeno ROR2.

162. Método, de acordo com a reivindicação 159, caracterizado pelo fato de que o câncer expressa um antígeno ROR1 e um antígeno ROR2.

163. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 158 a 162, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo consistindo em: câncer de pâncreas, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer gástrico, melanoma, sarcoma de Ewing, leucemia linfocítica crônica, linfoma de células do manto, B-ALL,

câncer hematológico, câncer de próstata, câncer de cólon, câncer renal, câncer de tireoide, câncer de fígado, carcinoma urotelial, melanoma, câncer endometrial, carcinoma de célula renal de células claras, carcinoma de células claras e câncer de útero.

164. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 158 a 163, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada em combinação com uma terapia adicional.

165. Método, de acordo com a reivindicação 164, caracterizado pelo fato de que a terapia adicional é cirurgia, radioterapia, terapia endócrina, imunoterapia ou quimioterapia.

166. Método, de acordo com a reivindicação 165, caracterizado pelo fato de que a imunoterapia é um agente imunoterapêutico.

167. Método, de acordo com a reivindicação 166, caracterizado pelo fato de que o agente imunoterapêutico é um inibidor de ponto de verificação imunológico.

168. Método, de acordo com a reivindicação 166, caracterizado pelo fato de que o agente imunoterapêutico é uma vacina.

169. Método, de acordo com a reivindicação 165, caracterizado pelo fato de que a quimioterapia é um agente citotóxico ou um agente quimioterapêutico.