JP2021522162A - 抗ror抗体構築物 - Google Patents

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Abstract

抗ROR抗体構築物、前記構築物を含む医薬組成物、およびそれらの使用方法が提示される。ある特定の態様では、ROR抗原は、ROR1である。ある特定の態様では、ROR抗原は、ROR2である。ある特定の態様では、ROR抗原は、ROR1およびROR2である。ある特定の態様では、ROR抗原は、ROR1 Frizzleドメイン、ROR2 Frizzleドメイン、ROR1 Ig様ドメイン、ROR2 Ig様ドメイン、ROR1 KringleドメインおよびROR2 Kringleドメインからなる群から選択されるドメインである。ある特定の態様では、ROR抗原は、ヒトROR抗原を含む。

Description

1.関連出願の相互参照
本出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、2018年4月18日に出願された米国特許仮出願第62/659,635号の利益を主張する。
2.配列表
本出願は、本出願と共にASCIIテキストファイルとして提出された配列表を参照により本明細書に組み込み、前記ASCIIテキストファイルは、14529−001−228_SEQ_LISTING.txtという表題であり、2019年4月15日に作成され、336,627バイトの大きさである。
3.背景
複数の標的を認識するように操作された抗体由来のタンパク質である多重特異性抗体の設計および治療的使用は、集中的な研究分野である。多重特異性抗体は、単一特異性モノクローナル抗体によってルーチンに提供される治療的制御よりも優れた治療的制御の将来的見込みを提供する。例えば、多重特異性抗体は、単一特異性抗体よりも優れた標的特異性を提供し、多くの抗体療法、特に抗体に基づく免疫療法に付随するオフターゲット効果を低減させるように操作することができる。多重特異性抗体は、特に免疫療法において、複数の細胞受容体の相乗的ターゲティングなどの単一特異性抗体では不可能な治療戦略の将来的見込みも提供する。このような免疫療法の1つは、T細胞マーカーおよび腫瘍細胞マーカーの二特異性係合を介して、T細胞をリクルートし再び方向付け、特定の腫瘍細胞集団を標的化し死滅させるための、二特異性抗体の使用である。例えば、CD3xCD19 BiTEブリナツモマブ(ビーリンサイト(Blincyto))などによる、CD3xCD19二特異性抗体を使用したB細胞リンパ腫のターゲティングは、米国特許出願公開第2006/0193852号に記載されている。
したがって、増加された親和性もしくはアビディティ、低減されたオフターゲット結合、および/または低減された意図されない免疫活性化を含む改善を有する、腫瘍細胞集団を含む別個の細胞集団に特異的に結合する改善された多重特異性抗体が必要とされている。
それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Gentile, et al. (Cancer Res; 71(8) April 15, 2011)、Rebagay, et al. (Front. Oncol., 18 April 2012)、Zhang, et al. (American Journal of Pathology, Vol. 181, No. 6, December 2012)、Henry, et al. (Oncotarget, Vol. 6, No. 37 2015)、Zhang, et al. (PLoS ONE 7(3): e31127.)およびBainbridge, et al. (PLoS ONE 9(7): e102695.)にさらに詳細に記載される通り、様々な腫瘍が、チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体(ROR)抗原の細胞表面発現を実証することができる。加えて、その全体が本明細書に組み込まれるBalakrishnan et al. (Clin Cancer Res. 2017 Jun 15; 23(12): 3061−3071)に記載されている通り、ROR発現は、正常、すなわち、非がん性組織において発現されないまたは限定的な発現のみを実証することができる。よって、ROR抗原は、ある特定の腫瘍において腫瘍特異的マーカーとして使用することができる。実証されたROR発現を有する腫瘍およびがんの例としては、その全体が本明細書に組み込まれるGohil et al. (Oncoimmunology. 2017; 6(7): e1326437.)に記載されている通り、膵がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、胃がん、黒色腫、ユーイング肉腫、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫およびB−ALLが挙げられるがこれらに限定されない。他のがんとしては、血液学的がん、前立腺がん、結腸がん、腎がんおよび子宮がんが挙げられるがこれらに限定されない。腫瘍を標的化するための様々な抗体プラットフォームにおいてフォーマットされたROR多重特異性抗体の使用は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Gohil, et al.、国際出願WO2017/053469、国際出願WO2014/167022、米国特許出願公開第2017/0198045号、国際出願WO2016/094873、国際出願WO2017/127499および国際出願WO2016/142768に記載されている。
よって、ROR抗原結合分子は、がんの処置における治療潜在力を有する。ROR抗原に加えてT細胞表面抗原に結合する多重特異性ROR結合分子は、RORを発現するがん細胞の、T細胞に再び方向付けられた死滅を提供する潜在力を有する。
したがって、多重特異性ROR抗原結合分子を含むROR抗原結合分子が必要とされている。増加された親和性もしくはアビディティ、低減されたオフターゲット結合、および/または低減された意図されない免疫活性化を含む改善を有するROR抗原結合分子も必要とされている。改善された製造可能性を有し、容易に精製される、多重特異性ROR抗原結合分子が特に必要とされている。
Gentile, et al. (Cancer Res; 71(8) April 15, 2011) Rebagay, et al. (Front. Oncol., 18 April 2012) Zhang, et al. (American Journal of Pathology, Vol. 181, No. 6, December 2012)
国際出願第2017/053469号 国際出願第2014/167022号 米国特許出願公開第2017/0198045号明細書
4.概要
第1の態様では、抗原結合分子が提供される。全ての実施形態では、抗原結合分子は、ROR抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位を含み、したがって、結合分子は、ROR抗原結合分子と命名される。
A)チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体(ROR)抗原結合部位由来の軽鎖可変領域(VL)のCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列であって、CDR1、CDR2およびCDR3 VL配列が表6から選択される、CDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列;ならびにB)ROR抗原結合部位由来の重鎖可変領域(VH)のCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列であって、CDR1、CDR2およびCDR3 VH配列が表6から選択される、CDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列を含む、ROR抗原結合分子であって、第1の抗原結合部位であり、(i)ROR1およびROR2、(ii)ROR1、または(iii)ROR2に特異的である、ROR抗原結合部位が本明細書に記載されている。ある特定の態様では、ROR抗原結合分子は、第2の抗原結合部位をさらに含む。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、第1の抗原結合部位と同じである。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、第1の抗原結合部位のROR抗原と異なる第2の抗原に特異的である。ある特定の態様では、第2の抗原は、CD3抗原である。
第1および第2のポリペプチド鎖を含むチロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体(ROR)抗原結合分子であって、(a)第1のポリペプチド鎖はドメインA、ドメインB、ドメインDおよびドメインEを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、A−B−D−Eの配向で配置され、ドメインAはVLアミノ酸配列を有し、ドメインBはCH3アミノ酸配列を有し、ドメインDはCH2アミノ酸配列を有し、ドメインEは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(b)第2のポリペプチド鎖はドメインFおよびドメインGを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、F−Gの配向で配置され、ドメインFはVHアミノ酸配列を有し、ドメインGはCH3アミノ酸配列を有し;(c)第1および第2のポリペプチドは、AドメインとFドメインとの間の相互作用およびBドメインとGドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR抗原結合分子を形成し、AドメインとFドメインとの間の相互作用は、ROR抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成する、ROR抗原結合分子が本明細書に記載されている。
ある特定の態様では、ROR抗原は、ROR1である。ある特定の態様では、ROR抗原は、ROR2である。ある特定の態様では、ROR抗原は、ROR1およびROR2である。ある特定の態様では、ROR抗原は、ROR1 Frizzleドメイン、ROR2 Frizzleドメイン、ROR1 Ig様ドメイン、ROR2 Ig様ドメイン、ROR1 KringleドメインおよびROR2 Kringleドメインからなる群から選択されるドメインである。ある特定の態様では、ROR抗原は、ヒトROR抗原を含む。
ある特定の態様では、ドメインAは、特定のROR抗原結合部位由来の特定の軽鎖可変領域(VL)のCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列を含み、CDR1、CDR2およびCDR3 VL配列は表6から選択され、ドメインFは、特定のROR抗原結合部位由来の特定の重鎖可変領域(VH)のCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列を含み、CDR1、CDR2およびCDR3 VH配列は表6から選択される。ある特定の態様では、特定のROR抗原結合部位は、表6のI2A−10、I2A−10 D54E Y55QまたはI2A−27である。
ある特定の態様では、ドメインAは、表6における抗体のVL配列と比較して1つまたは2つのアミノ酸変異を有するVLを含み、1つまたは2つのアミノ酸変異は、VLにおける1つまたは複数のCDR領域に存在する。ある特定の態様では、ドメインFは、表6における抗体のVH配列と比較して1つまたは2つのアミノ酸変異を有するVHを含み、1つまたは2つのアミノ酸変異は、VHにおける1つまたは複数のCDR領域に存在する。ある特定の態様では、ドメインAは、1つまたは複数のCDR領域における1つまたは複数の変異を有するI2A−10のVL配列を有するVLを含む。ある特定の態様では、ドメインAは、1つまたは複数のCDR領域における1つまたは複数の変異を有するI2A−27のVL配列を有するVLを含む。ある特定の態様では、ドメインFは、1つまたは複数のCDR領域における1つまたは複数の変異を有するI2A−10のVL配列を有するVLを含む。ある特定の態様では、ドメインFは、1つまたは複数のCDR領域における1つまたは複数の変異を有するI2A−27のVL配列を有するVLを含む。
ある特定の態様では、BドメインおよびGドメインのアミノ酸配列は同一であり、ここで配列は内在性CH3配列である。
ある特定の態様では、BドメインおよびGドメインのアミノ酸配列は異なり、それぞれ別個に直交型修飾を内在性CH3配列に含み、ここでBドメインはGドメインと相互作用し、BドメインとGドメインのどちらも、直交型修飾を欠くCH3ドメインと有意に相互作用しない。
ある特定の態様では、BドメインおよびGドメインの直交型修飾は、BドメインとGドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。ある特定の態様では、操作されたジスルフィド架橋を生成するBドメインおよびGドメインの変異は、BドメインとGドメインの一方におけるS354C変異、ならびに他方のドメインにおける349Cである。
ある特定の態様では、BドメインおよびGドメインの直交型修飾はノブ・イン・ホール(knob−in−hole)変異を含む。ある特定の態様では、ノブ・イン・ホール変異は、BドメインとGドメインの一方におけるT366W変異、ならびに他方のドメインにおけるT366S、L368AおよびY407V変異である。
ある特定の態様では、BドメインおよびGドメインの直交型修飾は、電荷対変異を含む。ある特定の態様では、電荷対変異は、BドメインとGドメインの一方におけるT366K変異、ならびに他方のドメインにおけるL351D変異である。
ある特定の態様では、EドメインはCH3アミノ酸配列を有する。
ある特定の態様では、EドメインおよびKドメインのアミノ酸配列は同一であり、ここで配列は内在性CH3配列である。
ある特定の態様では、EドメインおよびKドメインのアミノ酸配列は異なる。ある特定の態様では、異なる配列が、それぞれ別個に直交型修飾を内在性CH3配列に含み、ここでEドメインはKドメインと相互作用し、EドメインとKドメインのどちらも、直交型修飾を欠くCH3ドメインと有意に相互作用しない。
ある特定の態様では、直交型修飾は、EドメインとKドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。ある特定の態様では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、EドメインとKドメインの一方におけるS354C変異、ならびに他方のドメインにおける349Cである。
ある特定の態様では、EドメインとKドメインにおける直交型修飾はノブ・イン・ホール変異を含む。ある特定の態様では、ノブ・イン・ホール変異は、EドメインとKドメインの一方におけるT366W変異、ならびに他方のドメインにおけるT366S、L368AおよびY407V変異である。
ある特定の態様では、EドメインとKドメインにおける直交型修飾は、電荷対変異を含む。ある特定の態様では、電荷対変異は、EドメインまたはKドメインの一方におけるT366K変異、ならびに他方のドメインにおける対応するL351D変異である。
ある特定の態様では、EドメインおよびKドメインのアミノ酸配列が、第1のポリペプチドと第3のポリペプチドとの間の特異的会合を促進する特異的相互作用を有するように選択された2つの異なる抗体ドメインの内在性配列である。ある特定の態様では、2つの異なるアミノ酸配列は、CH1配列およびCL配列である。
ある特定の態様では、AドメインとBドメインとの間のジャンクションを形成する配列は、IKRTPREPまたはIKRTVREPである。
ある特定の態様では、FドメインとGドメインとの間のジャンクションを形成する配列は、SSASPREPである。
ある特定の態様では、少なくとも1つのCH3アミノ酸配列は、CH3アミノ酸配列をヒンジアミノ酸配列に接続するC末端トリペプチド挿入を有し、トリペプチド挿入は、PGK、KSCおよびGECからなる群から選択される。
ある特定の態様では、配列は、ヒト配列である。
ある特定の態様では、少なくとも1つのCH3アミノ酸配列は、IgG配列である。ある特定の態様では、IgG配列は、IgG1配列である。
ある特定の態様では、少なくとも1つのCH3アミノ酸配列は、1つまたは複数のイソアロタイプ変異を有する。ある特定の態様では、イソアロタイプ変異は、D356EおよびL358Mである。
ある特定の態様では、CLアミノ酸配列は、Cカッパ配列である。
ある特定の態様では、CH2配列は、Fcエフェクター機能を低減させる1つまたは複数の操作された変異を有する。ある特定の態様では、1つまたは複数の操作された変異は、L234、L235およびP329位に存在する。ある特定の態様では、1つまたは複数の操作された変異は、L234A、L235AおよびP329Gである。ある特定の態様では、1つまたは複数の操作された変異は、L234A、L235AおよびP329Kである。
第1、第2、第3および第4のポリペプチド鎖を含むチロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体(ROR)抗原結合分子であって、(a)第1のポリペプチド鎖はドメインA、ドメインB、ドメインDおよびドメインEを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、A−B−D−Eの配向で配置され、ドメインAはVLアミノ酸配列を有し、ドメインBはCH3アミノ酸配列を有し、ドメインDはCH2アミノ酸配列を有し、ドメインEは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(b)第2のポリペプチド鎖はドメインFおよびドメインGを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、F−Gの配向で配置され、ドメインFはVHアミノ酸配列を有し、ドメインGはCH3アミノ酸配列を有し;(c)第3のポリペプチド鎖はドメインH、ドメインI、ドメインJおよびドメインKを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、H−I−J−Kの配向で配置され、ドメインHは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインIは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインJはCH2アミノ酸配列を有し、Kは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(d)第4のポリペプチド鎖はドメインLおよびドメインMを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、L−Mの配向で配置され、ドメインLは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインMは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(e)第1および第2のポリペプチドは、AドメインとFドメインとの間の相互作用およびBドメインとGドメインとの間の相互作用を介して会合し;(f)第3および第4のポリペプチドは、HドメインとLドメインとの間の相互作用およびIドメインとMドメインとの間の相互作用を介して会合し;(g)第1および第3のポリペプチドは、DドメインとJドメインとの間の相互作用およびEドメインとKドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR抗原結合分子を形成し、AドメインとFドメインとの間の相互作用は、第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用は、第2の抗原結合部位を形成し、第1の抗原結合部位、第2の抗原結合部位、または第1および第2の抗原結合部位は、ROR抗原に特異的である、ROR抗原結合分子も本明細書に記載されている。
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、ROR抗原に特異的である。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、ROR抗原に特異的である。ある特定の態様では、第1および第2の抗原結合部位は、ROR抗原に特異的である。
ある特定の態様では、ROR抗原は、ROR1である。ある特定の態様では、ROR抗原は、ROR2である。ある特定の態様では、ROR抗原は、ROR1およびROR2である。ある特定の態様では、ROR抗原は、ROR1 Frizzleドメイン、ROR2 Frizzleドメイン、ROR1 Ig様ドメイン、ROR2 Ig様ドメイン、ROR1 KringleドメインおよびROR2 Kringleドメインからなる群から選択されるドメインである。ある特定の態様では、ROR抗原は、ヒトROR抗原を含む。
ある特定の態様では、ドメインAは、特定のROR抗原結合部位由来の特定の軽鎖可変領域(VL)のCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列を含み、CDR1、CDR2およびCDR3 VL配列は表6から選択され、ドメインFは、特定のROR抗原結合部位由来の特定の重鎖可変領域(VH)のCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列を含み、CDR1、CDR2およびCDR3 VH配列は表6から選択される。ある特定の態様では、特定のROR抗原結合部位は、表6のI2A−10、I2A−10 D54E Y55QまたはI2A−27である。
ある特定の態様では、ドメインAは、表6における抗体のVL配列と比較して1つまたは2つのアミノ酸変異を有するVLを含み、1つまたは2つのアミノ酸変異は、VLにおける1つまたは複数のCDR領域に存在する。ある特定の態様では、ドメインFは、表6における抗体のVH配列と比較して1つまたは2つのアミノ酸変異を有するVHを含み、1つまたは2つのアミノ酸変異は、VHにおける1つまたは複数のCDR領域に存在する。ある特定の態様では、ドメインAは、1つまたは複数のCDR領域における1つまたは複数の変異を有するI2A−10のVL配列を有するVLを含む。ある特定の態様では、ドメインAは、1つまたは複数のCDR領域における1つまたは複数の変異を有するI2A−27のVL配列を有するVLを含む。ある特定の態様では、ドメインFは、1つまたは複数のCDR領域における1つまたは複数の変異を有するI2A−10のVL配列を有するVLを含む。ある特定の態様では、ドメインFは、1つまたは複数のCDR領域における1つまたは複数の変異を有するI2A−27のVL配列を有するVLを含む。
ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、A)第3のポリペプチド鎖内の、配列番号69および配列番号73からなる群から選択される特定の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列;ならびにB)第4のポリペプチド鎖内の、配列番号68、配列番号70、配列番号71および配列番号72からなる群から選択される特定の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列を含む。
ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、A)第4のポリペプチド鎖内の、配列番号69および配列番号73からなる群から選択される特定の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列;ならびにB)第3のポリペプチド鎖内の、配列番号68、配列番号70、配列番号71および配列番号72からなる群から選択される特定の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列を含む。
ある特定の態様では、BドメインおよびGドメインのアミノ酸配列が同一であり、配列は内在性CH3配列である。
ある特定の態様では、BドメインおよびGドメインのアミノ酸配列は、異なり、それぞれ別個に直交型修飾を内在性CH3配列に含み、BドメインはGドメインと相互作用し、BドメインとGドメインのどちらも、直交型修飾を欠くCH3ドメインと有意に相互作用しない。
ある特定の態様では、BドメインおよびGドメインの直交型修飾は、BドメインとGドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。ある特定の態様では、操作されたジスルフィド架橋を生成するBドメインおよびGドメインの変異は、BドメインとGドメインの一方におけるS354C変異、および他方のドメインにおける349Cである。
ある特定の態様では、BドメインおよびGドメインの直交型修飾は、ノブ・イン・ホール変異を含む。ある特定の態様では、ノブ・イン・ホール変異は、BドメインとGドメインの一方におけるT366W変異、ならびに他方のドメインにおけるT366S、L368AおよびY407V変異である。
ある特定の態様では、BドメインおよびGドメインの直交型修飾は、電荷対変異を含む。ある特定の態様では、電荷対変異は、BドメインとGドメインの一方におけるT366K変異、および他方のドメインにおけるL351D変異である。
ある特定の態様では、Eドメインは、CH3アミノ酸配列を有する。
ある特定の態様では、EドメインおよびKドメインのアミノ酸配列は同一であり、配列は内在性CH3配列である。
ある特定の態様では、EドメインおよびKドメインのアミノ酸配列は、異なる。ある特定の態様では、異なる配列は、それぞれ別個に直交型修飾を内在性CH3配列に含み、EドメインはKドメインと相互作用し、EドメインとKドメインのどちらも、直交型修飾を欠くCH3ドメインと有意に相互作用しない。
ある特定の態様では、直交型修飾は、EドメインとKドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。ある特定の態様では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、EドメインとKドメインの一方におけるS354C変異、および他方のドメインにおける349Cである。
ある特定の態様では、EドメインおよびKドメインにおける直交型修飾は、ノブ・イン・ホール変異を含む。ある特定の態様では、ノブ・イン・ホール変異は、EドメインまたはKドメインの一方におけるT366W変異、ならびに他方のドメインにおけるT366S、L368AおよびY407V変異である。
ある特定の態様では、EドメインおよびKドメインにおける直交型修飾は、電荷対変異を含む。ある特定の態様では、電荷対変異は、EドメインまたはKドメインの一方におけるT366K変異、および他方のドメインにおける対応するL351D変異である。
ある特定の態様では、EドメインおよびKドメインのアミノ酸配列は、第1のポリペプチドと第3のポリペプチドとの間の特異的会合を促進する特異的相互作用を有するように選択された2つの異なる抗体ドメインの内在性配列である。ある特定の態様では、2つの異なるアミノ酸配列は、CH1配列およびCL配列である。
ある特定の態様では、ドメインIはCL配列を有し、ドメインMはCH1配列を有する。
ある特定の態様では、ドメインHはVL配列を有し、ドメインLはVH配列を有する。
ある特定の態様では、ドメインHはVLアミノ酸配列を有し;ドメインIはCLアミノ酸配列を有し;ドメインKはCH3アミノ酸配列を有し;ドメインLはVHアミノ酸配列を有し;ドメインMはCH1アミノ酸配列を有する。
ある特定の態様では、ROR抗原結合分子は、第5のポリペプチド鎖をさらに含み、(a)第1のポリペプチド鎖はドメインNおよびドメインOをさらに含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、N−O−A−B−D−Eの配向で配置され、ドメインNは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインOは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(b)ROR抗原結合分子は、ドメインPおよびドメインQを含む第5のポリペプチド鎖をさらに含み、ドメインは、N末端からC末端へ、P−Qの配向で配置され、ドメインPは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインQは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(c)第1および第5のポリペプチドは、NドメインとPドメインとの間の相互作用およびOドメインとQドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR抗原結合分子を形成する。
ある特定の態様では、(a)ドメインNおよびドメインAのアミノ酸配列は同一であり、ドメインHのアミノ酸配列は、ドメインNおよびドメインAの配列と異なり、ドメインOおよびドメインBのアミノ酸配列は同一であり、ドメインIのアミノ酸配列は、ドメインOおよびドメインBの配列と異なり、ドメインPおよびドメインFのアミノ酸配列は同一であり、ドメインLのアミノ酸配列は、ドメインPおよびドメインFの配列と異なり、ドメインQおよびドメインGのアミノ酸配列は同一であり、ドメインMのアミノ酸配列は、ドメインQおよびドメインGの配列と異なり;(b)AドメインとFドメインとの間の相互作用は、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用は、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、NドメインとPドメインとの間の相互作用は、第1の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する。ある特定の態様では、第1の抗原は、ROR抗原である。ある特定の態様では、第2の抗原は、CD3抗原である。
ある特定の態様では、(a)ドメインN、ドメインAおよびドメインHのアミノ酸配列は異なり、ドメインO、ドメインBおよびドメインIのアミノ酸配列は異なり、ドメインP、ドメインFおよびドメインLのアミノ酸配列は異なり、ドメインQ、ドメインGおよびドメインMのアミノ酸配列は異なり;(b)AドメインとFドメインとの間の相互作用は、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用は、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、ドメインNおよびドメインPは、第3の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成し、(c)第1、第2または第3の抗原は、ROR抗原である。
ある特定の態様では、ROR抗原結合分子は、第6のポリペプチド鎖をさらに含み、(a)第3のポリペプチド鎖はドメインRおよびドメインSをさらに含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、R−S−H−I−J−Kの配向で配置され、ドメインRは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインSは定常ドメインアミノ酸配列を有し;(b)ROR抗原結合分子は、ドメインTおよびドメインUを含む第6のポリペプチド鎖をさらに含み、ドメインは、N末端からC末端へ、T−Uの配向で配置され、ドメインTは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインUは定常ドメインアミノ酸配列を有し;(c)第3および第6のポリペプチドは、RドメインとTドメインとの間の相互作用およびSドメインとUドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR抗原結合分子を形成する。
ある特定の態様では、(a)ドメインRおよびドメインAのアミノ酸配列は同一であり、ドメインHのアミノ酸配列は、ドメインRおよびドメインAの配列と異なり、ドメインSおよびドメインBのアミノ酸配列は同一であり、ドメインIのアミノ酸配列は、ドメインSおよびドメインBの配列と異なり、ドメインTおよびドメインFのアミノ酸配列は同一であり、ドメインLのアミノ酸配列は、ドメインTおよびドメインFの配列と異なり、ドメインUおよびドメインGのアミノ酸配列は同一であり、ドメインMのアミノ酸配列は、ドメインUおよびドメインGの配列と異なり、(b)AドメインとFドメインとの間の相互作用は、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用は、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し;RドメインとTドメインとの間の相互作用は、第1の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する。ある特定の態様では、第1の抗原は、ROR抗原である。ある特定の態様では、第2の抗原は、CD3抗原である。
ある特定の態様では、(a)ドメインRおよびドメインHのアミノ酸配列は同一であり、ドメインAのアミノ酸配列は、ドメインRおよびドメインHの配列と異なり、ドメインSおよびドメインIのアミノ酸配列は同一であり、ドメインBのアミノ酸配列は、ドメインSおよびドメインIの配列と異なり、ドメインTおよびドメインLのアミノ酸配列は同一であり、ドメインFのアミノ酸配列は、ドメインTおよびドメインLの配列と異なり、ドメインUおよびドメインMのアミノ酸配列は同一であり、ドメインGのアミノ酸配列は、ドメインUおよびドメインMの配列と異なり、(b)AドメインとFドメインとの間の相互作用は、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用は、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、RドメインとTドメインとの間の相互作用は、第2の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する。ある特定の態様では、第2の抗原は、ROR抗原である。ある特定の態様では、第1の抗原は、CD3抗原である。
ある特定の態様では、(a)ドメインR、ドメインAおよびドメインHのアミノ酸配列は異なり、ドメインS、ドメインBおよびドメインIのアミノ酸配列は異なり、ドメインT、ドメインFおよびドメインLのアミノ酸配列は異なり、ドメインU、ドメインGおよびドメインMのアミノ酸配列は異なり;(b)AドメインとFドメインとの間の相互作用は、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用は、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、RドメインとTドメインとの間の相互作用は、第3の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成し;(c)第1、第2または第3の抗原は、ROR抗原である。
ある特定の態様では、ROR抗原結合分子は、さらに第5および第6のポリペプチド鎖を含み、(a)第1のポリペプチド鎖はさらにドメインNおよびドメインOを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、N−O−A−B−D−Eの配向で配置され;(b)第3のポリペプチド鎖はドメインRおよびドメインSをさらに含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、R−S−H−I−J−Kの配向で配置され;(c)ROR抗原結合分子はさらに第5および第6ポリペプチド鎖を含み、第5ポリペプチド鎖はドメインPおよびドメインQを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、P−Qの配向で配置され、第6ポリペプチド鎖はドメインTおよびドメインUを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、T−Uの配向で配置され;(d)第1および第5のポリペプチドは、NドメインとPドメインとの間の相互作用およびOドメインとQドメインとの間の相互作用を介して会合し、第3および第6のポリペプチドは、RドメインとTドメインとの間の相互作用およびSドメインとUドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR抗原結合分子を形成する。
ある特定の態様では、(a)ドメインNおよびドメインAのアミノ酸配列は同一であり、ドメインHおよびドメインRのアミノ酸配列は同一であり、ドメインOおよびドメインBのアミノ酸配列は同一であり、ドメインIおよびドメインSのアミノ酸配列は同一であり、ドメインPおよびドメインFのアミノ酸配列は同一であり、ドメインLおよびドメインTのアミノ酸配列は同一であり、ドメインQおよびドメインGのアミノ酸配列は同一であり、ドメインMおよびドメインUのアミノ酸配列は同一であり;(b)AドメインとFドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、ドメインNおよびドメインPが、第1の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成し、RドメインとTドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第4の抗原結合部位を形成する。
ある特定の態様では、(a)ドメインHおよびドメインAのアミノ酸配列は同一であり、ドメインNおよびドメインRのアミノ酸配列は同一であり、ドメインIおよびドメインBのアミノ酸配列は同一であり、ドメインOおよびドメインSのアミノ酸配列は同一であり、ドメインLおよびドメインFのアミノ酸配列は同一であり、ドメインPおよびドメインTのアミノ酸配列は同一であり、ドメインMおよびドメインGのアミノ酸配列は同一であり、ドメインQおよびドメインUのアミノ酸配列は同一であり;(b)AドメインとFドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、ドメインNおよびドメインPが、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成し、RドメインとTドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第4の抗原結合部位を形成する。
ある特定の態様では、AドメインとBドメインとの間のジャンクションを形成する配列は、IKRTPREPまたはIKRTVREPである。
ある特定の態様では、FドメインとGドメインとの間のジャンクションを形成する配列は、SSASPREPである。
ある特定の態様では、少なくとも1つのCH3アミノ酸配列は、CH3アミノ酸配列をヒンジアミノ酸配列に連結するC末端トリペプチド挿入を有し、ここでトリペプチド挿入は、PGK、KSCおよびGECからなる群から選択される。
ある特定の態様では、配列はヒト配列である。
ある特定の態様では、少なくとも1つのCH3アミノ酸配列は、IgG配列である。ある特定の態様では、IgG配列は、IgG1配列である。
ある特定の態様では、少なくとも1つのCH3アミノ酸配列は、1つまたは複数のイソアロタイプ変異を有する。ある特定の態様では、イソアロタイプ変異は、D356EおよびL358Mである。
ある特定の態様では、CLアミノ酸配列は、Cカッパ配列である。
ある特定の態様では、CH2配列は、Fcエフェクター機能を低減させる1つまたは複数の操作された変異を有する。ある特定の態様では、1つまたは複数の操作された変異は、L234、L235およびP329位に存在する。ある特定の態様では、1つまたは複数の操作された変異は、L234A、L235AおよびP329Gである。ある特定の態様では、1つまたは複数の操作された変異は、L234A、L235AおよびP329Kである。
ROR抗原に特異的な第1の抗原結合部位を含むチロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体(ROR)抗原結合分子であって、第1の抗原結合部位が、A)特定のROR抗原結合部位由来の特定の軽鎖可変領域(VL)のCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列であって、CDR1、CDR2およびCDR3 VL配列が表6から選択される、CDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列;ならびにB)特定のROR抗原結合部位由来の特定の重鎖可変領域(VH)のCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列であって、CDR1、CDR2およびCDR3 VH配列が表6から選択される、CDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列を含む、ROR抗原結合分子も本明細書に記載されている。
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、表6における抗体のVL配列と比較して1つまたは2つのアミノ酸変異を有するVLを含み、1つまたは2つのアミノ酸変異は、VLにおける1つまたは複数のCDR領域に存在する。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、表6における抗体のVH配列と比較して1つまたは2つのアミノ酸変異を有するVHを含み、1つまたは2つのアミノ酸変異は、VHにおける1つまたは複数のCDR領域に存在する。
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、ROR1に特異的である。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、ROR2に特異的である。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、ROR1およびROR2に特異的である。ある特定の態様では、ROR抗原は、ROR1 Frizzleドメイン、ROR2 Frizzleドメイン、ROR1 Ig様ドメイン、ROR2 Ig様ドメイン、ROR1 KringleドメインおよびROR2 Kringleドメインからなる群から選択されるドメインである。ある特定の態様では、ROR抗原は、ヒトROR抗原を含む。
ある特定の態様では、ROR抗原結合分子は、第2の抗原結合部位をさらに含む。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、ROR抗原に特異的である。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、ROR抗原と異なる第2の抗原に特異的である。ある特定の態様では、第2の抗原は、CD3抗原である。ある特定の態様では、抗原結合部位は、CD3抗原のあるエピトープに特異的である。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、A)配列番号69および配列番号73からなる群から選択される特定の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列;ならびにB)配列番号68、配列番号70、配列番号71および配列番号72からなる群から選択される特定の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、A)配列番号69および配列番号73からなる群から選択される特定の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列;ならびにB)配列番号68、配列番号70、配列番号71および配列番号72からなる群から選択される特定の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列を含む。
ある特定の態様では、ROR抗原結合分子は、全長抗体、Fab断片、Fv、scFv、タンデムscFv、ダイアボディ(Diabody)、scダイアボディ、DART、tandAbおよびミニボディ(minibody)からなる群から選択される抗体フォーマットを含む。ある特定の態様では、ROR抗原結合分子は、第1および第2のポリペプチド鎖を含み、(a)第1のポリペプチド鎖はドメインA、ドメインB、ドメインDおよびドメインEを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、A−B−D−Eの配向で配置され、ドメインAは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインB、ドメインDおよびドメインEは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(b)第2のポリペプチド鎖はドメインFおよびドメインGを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、F−Gの配向で配置され、ドメインFは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインGは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、c)第1および第2のポリペプチドは、AドメインとFドメインとの間の相互作用およびBドメインとGドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR抗原結合分子を形成し、AドメインとFドメインとの間の相互作用は、第1の抗原結合部位を形成する。
ある特定の態様では、ROR抗原結合分子は、第3および第4のポリペプチド鎖をさらに含み、(a)第3のポリペプチド鎖はドメインH、ドメインI、ドメインJおよびドメインKを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、H−I−J−Kの配向で配置され、ドメインHは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインI、JおよびKは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(b)第4のポリペプチド鎖はドメインLおよびドメインMを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、L−Mの配向で配置され、ドメインLは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインMは定常領域アミノ酸配列を有し;(c)第3および第4のポリペプチドは、HドメインとLドメインとの間の相互作用およびIドメインとMドメインとの間の相互作用を介して会合し;(d)第1および第3のポリペプチドは、DドメインとJドメインとの間の相互作用およびEドメインとKドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR抗原結合分子を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用は、第2の抗原結合部位を形成する。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、ROR抗原に特異的である。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、CD3に特異的である。
ある特定の態様では、ドメインBおよびドメインGは、CH3アミノ酸配列を有する。
ある特定の態様では、BドメインおよびGドメインのアミノ酸配列は同一であり、配列は内在性CH3配列である。
ある特定の態様では、BドメインおよびGドメインのアミノ酸配列は、異なり、それぞれ別個に直交型修飾を内在性CH3配列に含み、BドメインはGドメインと相互作用し、BドメインとGドメインのどちらも、直交型修飾を欠くCH3ドメインと有意に相互作用しない。
ある特定の態様では、BドメインおよびGドメインの直交型修飾は、BドメインとGドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。ある特定の態様では、操作されたジスルフィド架橋を生成するBドメインおよびGドメインの変異は、BドメインとGドメインの一方におけるS354C変異、および他方のドメインにおける349Cである。
ある特定の態様では、BドメインおよびGドメインの直交型修飾は、ノブ・イン・ホール変異を含む。ある特定の態様では、BドメインおよびGドメインのノブ・イン・ホール変異は、BドメインとGドメインの一方におけるT366W変異、ならびに他方のドメインにおけるT366S、L368AおよびY407V変異である。
ある特定の態様では、BドメインおよびGドメインの直交型修飾は、電荷対変異を含む。ある特定の態様では、BドメインおよびGドメインの電荷対変異は、BドメインとGドメインの一方におけるT366K変異、および他方のドメインにおけるL351D変異である。
ある特定の態様では、ドメインBおよびドメインGは、IgM CH2アミノ酸配列またはIgE CH2アミノ酸配列を有する。ある特定の態様では、IgM CH2アミノ酸配列またはIgE CH2アミノ酸配列は、直交型修飾を含む。
ある特定の態様では、ドメインIはCL配列を有し、ドメインMはCH1配列を有する。ある特定の態様では、ドメインIはCH1配列を有し、ドメインMはCL配列を有する。ある特定の態様では、CH1配列およびCL配列はそれぞれ、1つまたは複数の直交型修飾を含み、CH1配列を有するドメインは、直交型修飾を欠くCL配列を有するドメインと有意に相互作用しない。
ある特定の態様では、直交型修飾は、少なくとも1つのCH1ドメインとCLドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含み、変異は、CH1配列の138位およびCL配列の116位における操作されたシステイン;CH1配列の128位およびCL配列の119位における操作されたシステイン、ならびにCH1配列の129位およびCL配列の210位における操作されたシステインからなる群から選択される。
ある特定の態様では、直交型修飾は、少なくとも1つのCH1ドメインとCLドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含み、変異は、CH1配列の128位およびCLカッパ配列の118位における操作されたシステインを含む。
ある特定の態様では、直交型修飾は、少なくとも1つのCH1ドメインとCLドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含み、変異は、CL配列におけるF118C変異と対応するCH1配列におけるA141C;CL配列におけるF118C変異と対応するCH1配列におけるL128C;およびCL配列におけるS162C変異と対応するCH1配列におけるP171C変異からなる群から選択される。
ある特定の態様では、直交型修飾は、少なくとも1つのCH1ドメインとCLドメインとの間の電荷対変異を含み、電荷対変異は、CL配列におけるF118S変異と対応するCH1配列におけるA141L;CL配列におけるF118A変異と対応するCH1配列におけるA141L;CL配列におけるF118V変異と対応するCH1配列におけるA141L;およびCL配列におけるT129R変異と対応するCH1配列におけるK147Dからなる群から選択される。
ある特定の態様では、直交型修飾は、少なくとも1つのCH1ドメインとCLドメインとの間の電荷対変異を含み、電荷対変異は、CL配列におけるN138K変異と対応するCH1配列におけるG166D、およびCL配列におけるN138D変異と対応するCH1配列におけるG166Kからなる群から選択される。
ある特定の態様では、ドメインAはVLアミノ酸配列を有し、ドメインFはVHアミノ酸配列を有する。ある特定の態様では、ドメインAはVHアミノ酸配列を有し、ドメインFはVLアミノ酸配列を有する。
ある特定の態様では、ドメインHはVLアミノ酸配列を有し、ドメインLはVHアミノ酸配列を有する。ある特定の態様では、ドメインHはVHアミノ酸配列を有し、ドメインLはVLアミノ酸配列を有する。
ある特定の態様では、ドメインDおよびドメインJは、CH2アミノ酸配列を有する。
ある特定の態様では、Eドメインは、CH3アミノ酸配列を有する。
ある特定の態様では、EドメインおよびKドメインのアミノ酸配列は同一であり、配列は内在性CH3配列である。
ある特定の態様では、EドメインおよびKドメインのアミノ酸配列は異なる。ある特定の態様では、異なる配列は、それぞれ別個に直交型修飾を内在性CH3配列に含み、EドメインはKドメインと相互作用し、EドメインとKドメインのどちらも、直交型修飾を欠くCH3ドメインと有意に相互作用しない。
ある特定の態様では、直交型修飾は、EドメインとKドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。ある特定の態様では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、EドメインとKドメインの一方におけるS354C変異、および他方のドメインにおける349Cである。ある特定の態様では、EドメインおよびKドメインにおける直交型修飾は、ノブ・イン・ホール変異を含む。ある特定の態様では、ノブ・イン・ホール変異は、EドメインまたはKドメインの一方におけるT366W変異、ならびに他方のドメインにおけるT366S、L368AおよびY407V変異である。ある特定の態様では、EドメインおよびKドメインにおける直交型修飾は、電荷対変異を含む。ある特定の態様では、電荷対変異は、EドメインまたはKドメインの一方におけるT366K変異、および他方のドメインにおける対応するL351D変異である。
ある特定の態様では、EドメインおよびKドメインのアミノ酸配列は、第1のポリペプチドと第3のポリペプチドとの間の特異的会合を促進する特異的相互作用を有するように選択された2つの異なる抗体ドメインの内在性配列である。ある特定の態様では、2つの異なるアミノ酸配列は、CH1配列およびCL配列である。
ある特定の態様では、ROR抗原結合分子は、第3の抗原結合部位をさらに含む。ある特定の態様では、第3の抗原結合部位は、ROR抗原に特異的である。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位および第3の抗原結合部位は、同じROR抗原に特異的である。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位および第3の抗原結合部位は、異なるROR抗原に特異的である。
ある特定の態様では、ROR抗原結合分子は、第5のポリペプチド鎖を含み、(a)第1のポリペプチド鎖はドメインNおよびドメインOをさらに含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、N−O−A−B−D−Eの配向で配置され、ドメインNは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインOは定常領域アミノ酸配列を有し;(b)第5のポリペプチド鎖はドメインPおよびドメインQを含み、ドメインは、N末端からC末端へ、P−Qの配向で配置され、ドメインPは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインQは定常領域アミノ酸配列を有し;(c)第1および第5のポリペプチドは、NドメインとPドメインとの間の相互作用およびOドメインとQドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR抗原結合分子を形成する。
ある特定の態様では、(a)ドメインNおよびドメインAのアミノ酸配列は同一であり、ドメインHのアミノ酸配列は、ドメインNおよびドメインAの配列と異なり、ドメインOおよびドメインBのアミノ酸配列は同一であり、ドメインIのアミノ酸配列は、ドメインOおよびドメインBの配列と異なり、ドメインPおよびドメインFのアミノ酸配列は同一であり、ドメインLのアミノ酸配列は、ドメインPおよびドメインFの配列と異なり、ドメインQおよびドメインGのアミノ酸配列は同一であり、ドメインMのアミノ酸配列は、ドメインQおよびドメインGの配列と異なり;(b)AドメインとFドメインとの間の相互作用は、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用は、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、NドメインとPドメインとの間の相互作用は、第1の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する。ある特定の態様では、第1の抗原は、ROR抗原である。ある特定の態様では、第2の抗原は、CD3抗原である。
ある特定の態様では、(a)ドメインN、ドメインAおよびドメインHのアミノ酸配列は異なり、ドメインO、ドメインBおよびドメインIのアミノ酸配列は異なり、ドメインP、ドメインFおよびドメインLのアミノ酸配列は異なり、ドメインQ、ドメインGおよびドメインMのアミノ酸配列は異なり;(b)AドメインとFドメインとの間の相互作用は、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用は、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、NドメインとPドメインとの間の相互作用は、第3の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する。
ある特定の態様では、ROR抗原結合分子は、第6のポリペプチド鎖を含み、(a)第3のポリペプチド鎖はドメインRおよびドメインSをさらに含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、R−S−H−I−J−Kの配向で配置され、ドメインRは可変領域アミノ酸配列を有し、ドメインSは定常ドメインアミノ酸配列を有し;(b)第6のポリペプチド鎖はドメインTおよびドメインUを含み、ドメインは、N末端からC末端へ、T−Uの配向で配置され、ドメインTは可変領域アミノ酸配列を有し、ドメインUは定常ドメインアミノ酸配列を有し;(c)第3および第6のポリペプチドは、RドメインとTドメインとの間の相互作用およびSドメインとUドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR抗原結合分子を形成する。
ある特定の態様では、(a)ドメインRおよびドメインAのアミノ酸配列は同一であり、ドメインHのアミノ酸配列は、ドメインRおよびドメインAの配列と異なり、ドメインSおよびドメインBのアミノ酸配列は同一であり、ドメインIのアミノ酸配列は、ドメインSおよびドメインBの配列と異なり、ドメインTおよびドメインFのアミノ酸配列は同一であり、ドメインLのアミノ酸配列は、ドメインTおよびドメインFの配列と異なり、ドメインUおよびドメインGのアミノ酸配列は同一であり、ドメインMのアミノ酸配列は、ドメインUおよびドメインGの配列と異なり、(b)AドメインとFドメインとの間の相互作用は、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用は、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し;RドメインとTドメインとの間の相互作用は、第1の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する。ある特定の態様では、第1の抗原は、ROR抗原である。ある特定の態様では、第2の抗原は、CD3抗原である。
ある特定の態様では、(a)ドメインRおよびドメインHのアミノ酸配列は同一であり、ドメインAのアミノ酸配列は、ドメインRおよびドメインHの配列と異なり、ドメインSおよびドメインIのアミノ酸配列は同一であり、ドメインBのアミノ酸配列は、ドメインSおよびドメインIの配列と異なり、ドメインTおよびドメインLのアミノ酸配列は同一であり、ドメインFのアミノ酸配列は、ドメインTおよびドメインLの配列と異なり、ドメインUおよびドメインMのアミノ酸配列は同一であり、ドメインGのアミノ酸配列は、ドメインUおよびドメインMの配列と異なり、(b)AドメインとFドメインとの間の相互作用は、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用は、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、RドメインとTドメインとの間の相互作用は、第2の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する。ある特定の態様では、第2の抗原は、ROR抗原である。ある特定の態様では、第1の抗原は、CD3抗原である。
ある特定の態様では、(a)ドメインR、ドメインAおよびドメインHのアミノ酸配列は異なり、ドメインS、ドメインBおよびドメインIのアミノ酸配列は異なり、ドメインT、ドメインFおよびドメインLのアミノ酸配列は異なり、ドメインU、ドメインGおよびドメインMのアミノ酸配列は異なり;(b)AドメインとFドメインとの間の相互作用は、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用は、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、RドメインとTドメインとの間の相互作用は、第3の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する。
本明細書に記載されているROR抗原結合分子のいずれかを含む、精製されたROR抗原結合分子も本明細書に記載されている。ある特定の態様では、精製されたROR抗原結合分子は、CH1親和性精製ステップを含む精製方法によって精製される。ある特定の態様では、精製方法は、単一ステップの精製方法である。
本明細書に記載されているROR抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容される希釈剤とを含む医薬組成物も本明細書に記載されている。
がんを有する対象を処置するための方法であって、本明細書に記載されている医薬組成物のいずれかの治療有効量を投与するステップを含む方法も本明細書に記載されている。ある特定の態様では、がんは、膵がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、胃がん、黒色腫、ユーイング肉腫、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、B−ALL、血液学的がん、前立腺がん、結腸がん、腎がんおよび子宮がんからなる群から選択される。
5.図面の簡単な説明
図1は、CH1−Cと対になったCH3−CH3 IgG1二量体対のアラインメントを示す。四次構造は、約1.6ÅのRMSDで整列している。
図2は、本明細書に記載の様々な結合分子(抗体構築物とも称される)について、それぞれの命名規則と共に、構成の概略図を示す。
図3は、本明細書に記載の二価1×1抗体構築物について、それぞれの命名規則と共に、ポリペプチド鎖とそれらのドメインのより高解像度の概略図を示す。
図4は、例示的な二価の単一特異性構築物の構成を示す。
図5は、実施例1に記載のバイオレイヤー干渉(biolayer interferometry、BLI)実験からのデータを示し、ここでは、図4に示した構成を有する二価の単一特異性結合分子[ポリペプチド1:VL−CH3(ノブ)−CH2−CH3/ポリペプチド2:VH−CH3(ホール)]がアッセイされた。抗原結合部位は、TNFαに対して特異的であった。結合分子固定化および固定化された構築物へのTNFα結合からのBLI応答は、抗原への頑強で特異的な二価結合を示す。データは、分子が、ポリペプチド1とポリペプチド2との意図された対形成を高いパーセンテージで有していることと一致する。
図6は、例示的な二価の1×1二重特異性結合分子「BC1」の特徴を示す。
図7Aは、単一ステップのCH1親和性精製ステップ(CaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂)により、ゲル濾過を介して、>98%が非凝集二価タンパク質である単一の単分散ピークが得られることを実証する、「BC1」のサイズ排除クロマトグラフィ(SEC)解析を示す。図7Bは、CrossMab二価抗体構築物のSEC解析の比較文献データ[Schaefer et al. (Proc Natl Acad Sci USA., 2011 Jul 5;108(27):11187−92)からのデータ]を示す。
図8Aは、CaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の「BC1」の陽イオン交換クロマトグラフィ溶出プロファイルであって、単一のタイトなピークが示されている。図8Bは、標準プロテインA精製を使用して精製した後の「BC1」の陽イオン交換クロマトグラフィの溶出プロファイルである。
図9は、様々な精製段階での「BC1」の非還元SDS−PAGEゲルを示す。
図10Aおよび10Bは、非還元および還元条件下の両方での単一ステップのCH1−親和性精製後の「BC1」のSDS−PAGEゲル(図10A)を、参照文献で公開されている非還元および還元条件下のCrossMab二重特異性抗体のSDS−PAGEゲル(図10B)と比較した図である。
図11Aおよび11Bは、還元条件下の2つの別個の重鎖(図11A)、および2つの別個の軽鎖(図11B)を実証する「BC1」の質量分析の解析を示す。 同上。
図12は、精製後の不完全な対形成の非存在を確認する、非還元条件下で精製された「BC1」の質量分析の解析を示す。
図13は、2つのIgG対照抗体と比較した、「BC1」の40℃で8週間にわたる安定性を実証する、加速安定性試験データを示す。
図14は、実施例3でさらに説明されている、例示的な二価1×1二重特異性結合分子「BC6」の特徴を示す。
図15Aは、単一ステップのCH1親和性精製によって単一の単分散ピークが得られることと非共有結合凝集体が存在しないことを実証する、CaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂を使用したワンステップ精製後の「BC6」のサイズ排除クロマトグラフィ(SEC)解析を示す。図15Bは、非還元条件下での「BC6」のSDS−PAGEゲルを示す。
図16は、実施例4でさらに説明されている、例示的な二価の二重特異性結合分子「BC28」の特徴を示す。
図17は、「BC28」、「BC29」、「BC30」、「BC31」および「BC32」の単一ステップのCH1親和性精製後の非還元条件下のSDS−PAGE解析を示す。
図18は、それぞれ、CaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂を使用したワンステップ精製後の「BC28」および「BC30」のSEC解析を示す。
図19は、実施例5でさらに説明されている、例示的な二価の二重特異性結合分子「BC44」の特徴を示す。
図20Aおよび20Bは、それぞれ加速安定性試験条件下での、2つの二価結合分子「BC15」および「BC16」のサイズ排除クロマトグラフィ(SEC)データを示す。「BC15」および「BC16」は、異なる可変領域−CH3ジャンクションを有する。
図21は、本明細書に記載の三価2×1抗体構築物について、それぞれの命名規則と共に、5つのポリペプチド鎖とそれらのドメインの概略図を示し、ここで、命名規則に従って、鎖5は概略図で「第5のポリペプチド鎖」と命名されている。
図22は、実施例7でさらに説明されている、例示的な三価2×1二重特異性結合分子「BC1−2×1」の特徴を示す。
図23は、様々な精製段階で、ThermoFisher Expi293一過性トランスフェクション系を使用して発現された「BC1」および「BC1−2×1」タンパク質の非還元SDS−PAGEを示す。
図24は、Octet(Pall ForteBio)バイオレイヤー干渉解析を使用して、二価1×1構築物「BC1」のアビディティを、三価2×1構築物「BC1−2×1」のアビディティと比較したものである。
図25は、三価2×1構築物「TB111」の顕著な特徴を示す。
図26は、本明細書に記載の三価1×2抗体構築物について、それぞれの命名規則と共に、5つのポリペプチド鎖とそれらのドメインの概略図を示し、ここで、命名規則に従って、鎖5は概略図で「第6のポリペプチド鎖」と命名されている。
図27は、実施例10にさらに説明されている、例示的な三価1×2構築物「CTLA4−4×Nivo×CTLA4−4」の特徴を示す。
図28は、SDS−PAGEゲルであり、ここで非還元(「−DTT」)および還元(「+DTT」)条件下の三価1×2構築物「CTLA4−4×Nivo×CTLA4−4」構築物を示すレーンを枠で囲っている。
図29は、2つの抗体:二価1×1構築物「CTLA4−4×OX40−8」および三価1×2構築物「CTLA4−4×Nivo×CTLA4−4」の間の抗原結合の比較を示す。「CTLA4−4×OX40−8」は、CTLA4に一価的に結合する一方、「CTLA4−4×Nivo×CTLA4−4」は、CTLA4に二価的に結合する。
図30は、実施例11にさらに説明されている、例示的な三価1×2三重特異性構築物「BC28−1×1×1a」の特徴を示す。
図31は、単一の明確に確定されるピークを示す、一過性発現および単一ステップのCH1親和性樹脂精製後の「BC28−1×1×1a」のサイズ排除クロマトグラフィを示す。
図32は、実施例12でさらに説明されるように、それぞれ一過性発現およびCaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の二価および三価構築物の、非還元および還元条件下でのSDS−PAGEの結果を示す。
図33A〜33Cは、3つの抗原:PD1、抗原「A」およびCTLA4へのOctet結合分析を示す。実施例13でさらに説明されるように、図33Aは、「BC1」の、PD1および抗原「A」への結合を示し;図33Bは、二価二重特異性構築物「CTLA4−4×OX40−8」の、CTLA4、抗原「A」およびPD1への結合を示し;図33Cは、三価三重特異性「BC28−1×1×1a」の、PD1、抗原「A」およびCTLA4への結合を示す。
図34は、本明細書に記載の特定の四価2×2構築物について、それぞれの命名規則と共に、6つのポリペプチド鎖とそれらのドメインの概略図を示す。
図35は、実施例14にさらに説明されている、例示的な四価2×2構築物「BC22−2×2」の特定の顕著な特徴を示す。
図36は、様々な精製段階で、2×2四価「BC22−2×2」構築物を、1×2三価構築物「BC12−1×2」および2×1三価構築物「BC21−2×1」と比較する、非還元SDS−PAGEゲルである。
図37は、例示的な四価2×2構築物の構成を示す。
図38は、本明細書に記載の特定の四価構築物について、それぞれの命名規則と共に、6つのポリペプチド鎖とそれらのドメインの概略図を示し、ここで、命名規則に従って、鎖5は概略図で「第7のポリペプチド鎖」と命名されており、鎖6は「第8のポリペプチド鎖」と命名されている。
図39は、二重特異性四価構築物の例示的な構成を示す。
図40は、共通軽鎖ストラテジーを利用した三重特異性四価構築物についての例示的な構成を示す。
図41は、図39に概略化された四価構築物による二重特異性抗原係合を示し、この構築物が同時係合できたことを実証する。B−Body固定化および固定化された構築物へのTNFα結合からのバイオレイヤー干渉(BLI)応答は、分子が、意図された鎖の対形成を高いパーセンテージで有していることと一致する。
図42は、B−Bodyの細胞表面抗原への結合のフローサイトメトリー解析を示す。網掛けで示すシグナルは、抗原なしの細胞を示し;ドットで示すシグナルは、表面抗原で一過性にトランスフェクトされた細胞を示す。
図43は、三価構築物の例示的な構成を示す。
図44は、三価構築物の例示的な構成を示す。
図45は、実施例17でさらに説明されているように、それぞれ一過性発現およびCaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の二価および三価構築物の、非還元および還元条件下でのSDS−PAGEの結果を示す。
図46は、ジャンクションバリアントの対形成安定性を評価するために測定された「BC24jv」、「BC26jv」および「BC28jv」の熱転移の差異を示す。
図47は、変異誘発されていないSP34−89一価B−bodyについてのCD3への結合親和性を決定するために使用される2倍段階希釈(200〜12.5nM)のOctet(Pall ForteBio)バイオレイヤー干渉解析を示す。
図48A〜48Bは、2つのROR抗原結合部位候補(図48AのクローンI2−A10;図48BのクローンI2−A27)についてのROR1への結合親和性を決定するために使用される2倍段階希釈(200〜12.5nM)のOctet(Pall ForteBio)バイオレイヤー干渉解析を示す。 同上。
図49は、ROR×CD3二重特異性1×1および1×2 B−bodyが、ROR1発現腫瘍株(HOP−92)と混合した場合にレポーターT細胞の活性化をもたらしたが、ROR1を発現しない腫瘍株(B16)と混合した場合には活性化をもたらさなかったことを示す。
図50は、ROR×CD3二重特異性I2A−10 1×2 B−bodyが、ROR1発現腫瘍株(MDA−MD−231)と混合した場合に細胞傷害性T細胞媒介性殺傷をもたらしたが、無関係の腫瘍ABS(例えば、MDA−MD−231で発現されない腫瘍抗原)を有するCD3二重特異性B−bodyが混合物に添加された場合には細胞傷害性をもたらさなかったことを示す。
図51A〜51Eは、ROR×CD3二重特異性I2A−3 1×1および1×2 B−bodyが、ROR1発現腫瘍株のHOP−92(図51A)、A549(図51B)、MDA−MD−231(図51C)、JeKo−1(図51D)およびRPMI−8226(図51E)と混合した場合にレポーターT細胞の活性化をもたらしたが、ROR1を発現しない腫瘍株(B16)と混合した場合には活性化をもたらさなかったことを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。
図52は、ROR×CD3二重特異性1×2 B−bodyのI2A−1、I2A−3、I2A−10、I2A−14、I2A−22およびI2A−27が、ROR1発現腫瘍株(MDA−MD−231)と混合した場合には細胞傷害性T細胞媒介性殺傷をもたらしたが、1×2 B−bodyのI2A−16およびI2A−22は強い細胞傷害性をもたらさなかったことを示す。
図53Aは、MDA−MD−231およびRPMI−8226腫瘍株について公表されたROR1発現データを示す。図53Bおよび図53Cは、細胞傷害性効果がMDA−MD−231およびRPMI−8226腫瘍細胞系のROR1と相関することを示す。 同上。
図54A〜54Fは、CD25(図54A)、CD69(図54C)、およびCD25とCD69の両方(図54E)を定量化することによって判定した場合にI2A−10およびI2A−27のB−bodyがPBMC集団におけるCD8+T細胞を活性化したこと、ならびにCD25(図54B)、CD69(図54D)、およびCD25とCD69の両方(図54F)を定量化することによって判定した場合にPBMC集団におけるCD4+T細胞を活性化したことを示す。 同上。 同上。
図55は、候補のI2A−10(上パネル)およびI2A−27(下パネル)のそれぞれ26%および36%が、MDA−MB−231細胞との2時間インキュベーション後に内部移行したことを示す。
図56は、単一ステップのCH1親和性精製ステップにより、ゲル濾過を介して、単一の単分散ピークが得られることを実証する、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)解析を示し、ここでは、1×2 B−body候補のI2A−10(上パネル)およびI2A−27(下パネル)の非凝集タンパク質が98%を超えている。
図57Aは、完全にアセンブルされた構築物の主要なバンド(高移動性250kDaバンド)を実証する、1×2 B−body候補のI2A−10(左パネル)およびI2A−27(右パネル)の非還元SDS−PAGEゲルを示す。
図57Bは、完全にアセンブルされた構築物の主要なバンドを実証する、1×2 B−body候補のI2A−10およびI2A−27の非還元試料のBioanalyzer(Agilent)解析を示す。
図58は、単一ステップのCH1親和性精製ステップ(CaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂)を使用して精製された二重特異性抗体のFc部分内の天然位置で確認された、CH3ドメインに導入された標準ノブ・ホール直交型変異を含む二重特異性抗体のSDS−PAGE解析を示す。
図59A〜59Bは、トラスツズマブへのFcγRIa結合(図59A「WT IgG1」)を実証し、sFc10への結合はない(図59B)ことを実証するOctet(Pall ForteBio)バイオレイヤー干渉解析を示す。
図60は、ADCCアッセイにおけるトラスツズマブ(Herceptin、「WT−IgG1」)による殺傷を示すが、sFc7またはsFc10による殺傷は示さない。
図61は、C1q ELISAにおけるトラスツズマブ(Herceptin、「WT−IgG1」)によるC1q結合を示すが、sFc1、sFc7またはsFc10による結合は示さない。
図62A〜62Cは、腫瘍細胞を移植し、PBMCでヒト化し(左実線矢印)、その後続いてPBS(図62A)、1×2 B−body候補I2−A10(図62B)、または1×2 B−body候補I2−A27(図62C)でIVを処置(右破線矢印)したマウスについてモニターした腫瘍体積を示す。
図63は、各マウスの研究の終了時の腫瘍体積を示し、各群の平均および標準偏差を示している。I2−A27群の白色四角形は、PMBCによる非ヒト化の可能性があるため、解析から除いた。
図64Aは、SP34−89のJurkat細胞およびカニクイザル(cynomolgus)T細胞への結合を示す。図64Bは、I2−A27 1×2 B−body(商標)二重特異性抗体のカニクイザルCD3デルタおよびイプシロンヘテロ二量体への結合を示す。
図65Aは、一価結合アッセイにおけるI2−A27 IgG抗体のROR1への結合を示す。図65Bは、I2−A27 IgG抗体のROR2への最小結合を示す。図65Cは、一価結合アッセイにおけるI2−A27 1×2 B−body(商標)のROR1への結合を示す。図65Dは、I2−A27 1×2 B−body(商標)のROR2への最小結合を示す。図65Eは、二価結合アッセイにおけるI2−A27 1×2 B−body(商標)のROR1への結合を示す。 同上。 同上。
図66Aは、I2−A27 1×2 B−body(商標)のSEC解析を示す。図66Bは、I2−A27 1×2 B−body(商標)のSMAC解析を示す。図66Cは、I2−A27 1×2 B−body(商標)のHIC解析を示す。 同上。
図67Aは、MDA−MB−231(ROR1発現)細胞を用いたJurkatアッセイにおけるI2−A27 1×2 B−body(商標)の活性を示す。図67Bは、RPMI−8226(ROR1およびROR2発現)細胞を用いたJurkatアッセイにおけるI2−A27 1×2 B−body(商標)の活性を示す。図67Cは、K562(ROR2発現)細胞を用いたJurkatアッセイにおけるI2−A27 1×2 B−body(商標)の不活性を示す。図67Dは、標的細胞系の非存在下でのJurkatアッセイにおけるI2−A27 1×2 B−body(商標)の不活性を示す。 同上。
図68Aは、様々な濃度のI2−A27 1×2 B−body(商標)およびROR1発現MDA−MB−231細胞によるCD69発現を示す。図68Bは、様々な濃度のI2−A27 1×2 B−body(商標)およびROR1発現RPMI−8226細胞によるCD69発現を示す。図68Cは、様々な濃度のI2−A27 1×2 B−body(商標)およびROR1発現MDA−MB−231細胞によるCD25発現を示す。図68Dは、様々な濃度のI2−A27 1×2 B−body(商標)およびROR1発現RPMI−8226細胞によるCD25発現を示す。 同上。
図69Aは、様々な濃度のI2−A27 1×2 B−body(商標)およびROR1発現MDA−MB−231細胞によるLDH放出を示す。図69Bは、様々な濃度のI2−A27 1×2 B−body(商標)およびROR1発現RPMI−8226細胞によるLDH放出を示す。
図70Aは、様々な濃度のI2−A27 1×2 B−body(商標)およびROR1発現MDA−MB−231細胞によるグランザイムBを示す。図70Bは、様々な濃度のI2−A27 1×2 B−body(商標)およびROR1発現RPMI−8226細胞によるグランザイムBを示す。図70Cは、様々な濃度のI2−A27 1×2 B−body(商標)およびROR1発現MDA−MB−231細胞によるTNFα分泌を示す。図70Dは、様々な濃度のI2−A27 1×2 B−body(商標)およびROR1発現RPMI−8226細胞によるTNFα分泌を示す。図70Eは、様々な濃度のI2−A27 1×2 B−body(商標)およびROR1発現MDA−MB−231細胞によるIFNγ放出を示す。図70Fは、様々な濃度のI2−A27 1×2 B−body(商標)およびROR1発現RPMI−8226細胞によるIFNγ放出を示す。 同上。 同上。
図71Aは、4℃または37℃で1週間、ヒト血清に保存されたI2−A27 1×2 B−body(商標)試料の活性を示す。図71Bは、ROR1発現細胞の非存在下でのJurkatアッセイにおける試料の不活性を示す。
図72は、加速条件下でのI2−A27 1×2 B−body(商標)試料の安定性アッセイを示す。
図73は、リアルタイム条件下でのI2−A27 1×2 B−body(商標)試料の安定性アッセイを示す。
図74は、I2−A27 1×2 B−body(商標)の酸安定性アッセイを示す。
図75は、I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)のカニクイザルCD3デルタおよびイプシロンヘテロ二量体への結合を示す。
図76Aは、一価結合アッセイにおけるI2−A10 D54E Y55Q IgG抗体のROR1への結合を示す。図76Bは、一価結合アッセイにおけるI2−A10 D54E Y55Q IgGのROR2への結合を示す。図76Cは、一価結合アッセイにおけるI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)のROR1への結合を示す。図76Dは、一価結合アッセイにおけるI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)のROR2への結合を示す。図76Eは、二価結合アッセイにおけるI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)のROR1への結合を示す。図76Fは、二価結合アッセイにおけるI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)のROR2への結合を示す。 同上。 同上。
図77は、I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)の、ROR1のIg様ドメインへの結合を示す。
図78Aは、I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)のSEC解析を示す。図78Bは、I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)のSMAC解析を示す。図78Cは、I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)のHIC解析を示す。 同上。
図79Aは、MDA−MB−231(ROR1発現)細胞を用いたJurkatアッセイにおけるI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)の活性を示す。図79Bは、RPMI−8226(ROR1およびROR2発現)細胞を用いたJurkatアッセイにおけるI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)の活性を示す。図79Cは、K562(ROR2発現)細胞を用いたI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)の活性を示す。図79Dは、標的細胞系の非存在下でのJurkatアッセイにおけるI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)の不活性を示す。 同上。
図80Aは、様々な濃度のI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)およびROR1発現MDA−MB−231細胞によるCD69発現を示す。図80Bは、様々な濃度のI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)ならびにROR1およびROR2発現RPMI−8226細胞によるCD69発現を示す。図80Cは、様々な濃度のI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)およびROR1発現MDA−MB−231細胞によるCD25発現を示す。図80Dは、様々な濃度のI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)ならびにROR1およびROR2発現RPMI−8226細胞によるCD25発現を示す。 同上。
図81Aは、様々な濃度のI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)およびROR1発現MDA−MB−231細胞によるLDH放出を示す。図81Bは、様々な濃度のI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)ならびにROR1およびROR2発現RPMI−8226細胞によるLDH放出を示す。
図82Aは、様々な濃度のI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)およびROR1発現MDA−MB−231細胞によるグランザイムBを示す。図82Bは、様々な濃度のI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)ならびにROR1およびROR2発現RPMI−8226細胞によるグランザイムBを示す。図82Cは、様々な濃度のI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−bodyおよびROR1発現MDA−MB−231細胞によるTNFα分泌を示す。図82Dは、様々な濃度のI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)ならびにROR1およびROR2発現RPMI−8226細胞によるTNFα分泌を示す。図82Eは、様々な濃度のI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)およびROR1発現MDA−MB−231細胞によるIFNγ分泌を示す。図82Fは、様々な濃度のI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)ならびにROR1およびROR2発現RPMI−8226細胞によるIFNγ分泌を示す。 同上。 同上。
図83Aは、4℃または37℃で1週間、ヒト血清に保存されたI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)試料の活性を示す。図83Bは、ROR1発現細胞の非存在下でのJurkatアッセイにおける試料の不活性を示す。
図84は、加速条件下でのI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)試料の安定性アッセイを示す。
図85は、リアルタイム条件下でのI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)試料の安定性アッセイを示す。
図86は、I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)の酸安定性アッセイを示す。
図87は、I2−27 1×2 B−body(商標)およびI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)が、がんのマウスモデルの腫瘍体積(mm)を減少させるin vivoでの有効性を示す。
図88は、I2−27 1×2 B−body(商標)およびI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)の複数回投与が、がんのマウスモデルの腫瘍体積(mm)を減少させるin vivoでの有効性を示す。
図面は、例示の目的のためのみに、本発明の様々な実施形態を示している。当業者は、本明細書に例示された構造および方法の代替的実施形態が、本明細書に記載の本発明の原理から逸脱することなく利用しうることを以下の説明から容易に認識する。
6.詳細な説明
6.1.定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解されている意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、下記で与えられる意味を有する。
「抗原結合部位」は、所与の抗原またはエピトープを特異的に認識するまたはそれに特異的に結合するROR結合分子の領域を意味する。
「B−body」は、本明細書で使用される場合、また、図3を参照すると、第1および第2のポリペプチド鎖の特色を含む結合分子であって、(a)第1のポリペプチド鎖はドメインA、ドメインB、ドメインDおよびドメインEを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、A−B−D−Eの配向で配置され、ドメインAはVLアミノ酸配列を有し、ドメインBはCH3アミノ酸配列を有し、ドメインDはCH2アミノ酸配列を有し、ドメインEは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(b)第2のポリペプチド鎖はドメインFおよびドメインGを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、F−Gの配向で配置され、ドメインFはVHアミノ酸配列を有し、ドメインGはCH3アミノ酸配列を有し;(c)第1および第2のポリペプチドは、AドメインとFドメインとの間の相互作用およびBドメインとGドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する、結合分子を指す。B−bodyは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願番号PCT/US2017/057268により詳細に記載されている。
本明細書で使用される場合、「処置する」または「処置」という用語は、治療的処置および予防的または防止的手段の両方を指し、ここで目的は、多発性硬化症、関節炎またはがんの進行などの望ましくない生理学的変化または障害を予防または減速(軽減)することである。有益または望ましい臨床結果としては、検出可能であろうとまたは検出不能であろうと、症状の緩和、疾患の範囲の縮減、疾患の安定した(つまり、悪化していない)状態、疾患の進行の遅延または減速、疾患の状態の回復または緩和、および寛解(部分的寛解または完全寛解)が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けない場合の予測生存期間と比較した生存期間の延長も意味しうる。処置を必要とする対象には、すでに状態もしくは障害に罹患している対象、ならびに状態もしくは障害を有する傾向にある対象、または状態もしくは障害を予防すべき状態にある対象が含まれる。
「対象」、「個体」、「動物」、「患者」または「哺乳動物」は、診断、予防または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、家庭用動物、農業用動物、ならびに動物園、スポーツまたはペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛などが含まれる。
「十分な量」という用語は、所望の効果を生じさせるために十分な量、例えば、細胞内のタンパク質凝集を調節するために十分な量を意味する。
「治療有効量」は、疾患の症状を改善するために有効な量である。予防が治療と考えることができるように、治療有効量は「予防有効量」であることができる。
6.2.その他の解釈上の規則
別途指定しない限り、本明細書における配列に対する全ての参照は、アミノ酸配列に対するものである。
別途指定しない限り、抗体定常領域残基ナンバリングは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるwww.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs(2017年8月22日にアクセス)およびEdelman et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63:78−85 (1969)に記載のEuインデックスに従い、本明細書に記載されるROR結合分子の鎖内の残基の物理的な位置にかかわらず、内在性定常領域配列におけるその位置にしたがって残基を識別する。「内在性配列」または「天然配列」は、生物、組織、または細胞に由来し、人工的に修飾または変異されていない、核酸およびアミノ酸配列の両方を含む任意の配列を意味する。
ポリペプチド鎖番号(例えば、「第1の」ポリペプチド鎖、「第2の」ポリペプチド鎖等、またはポリペプチド「鎖1」、「鎖2」等)は、結合分子を形成する特定のポリペプチド鎖に特有の識別子として本明細書で使用され、結合分子内の異なるポリペプチド鎖の順序または含量の暗示を意図するものではない。
この開示において、「含む(comprises)」、「含むこと(comprising)」、「含有すること(containing)」、「有すること(having)」、「含む(includes)」、「含むこと(including)」およびその言語的変化形は、米国特許法でそれらが帰する意味を有し、明示的に列挙されている成分以外のさらなる成分の存在を許容する。
本明細書で提供される範囲は、列挙される端点を含む範囲内の全ての値についての省略表現と理解される。例えば、1〜50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49および50からなる群からの任意の数、数の組合せ、または部分範囲を含むと理解される。
特に明記されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される「または」という用語は、包括的であると理解される。特に明記されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、「a」、「an」および「the」という用語は、単数または複数であると理解される。
特に明記されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される「約」という用語は、当技術分野で通常許容される範囲内、例えば、平均の2標準偏差以内と理解される。約は、示された値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%または0.01%以内と理解することができる。文脈から明らかでない限り、本明細書で提供される全ての数値は、約という用語によって修飾されている。
6.3.ROR抗原結合分子
第1の態様では、抗原結合分子が提供される。全ての実施形態では、抗原結合分子は、ROR抗原に特異的な少なくとも第1の抗原結合部位を含む;したがって、結合分子は、ROR抗原結合分子と命名される。
本明細書に記載されているROR結合分子は、ROR抗原に特異的に結合する。
本明細書で使用される場合、「ROR抗原」は、メンバーROR1およびROR2を含む、チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体(ROR)ファミリーのメンバーを指す。ある特定の実施形態では、ROR結合分子は、ROR1のみに特異的に結合する抗原結合部位を有する。他の実施形態では、ROR結合分子は、ROR2のみに特異的に結合する抗原結合部位を有する。さらに他の実施形態では、ROR結合分子は、交差反応性があり、ROR1およびROR2の両方に特異的に結合する、抗原結合部位を有する。
ROR1およびROR2タンパク質は典型的に、少なくとも4つのタンパク質ドメインからなる:3つの細胞外ドメイン(Ig様、FZおよびKringleドメイン)と共に細胞内タンパク質キナーゼドメイン。一部の実施形態では、ROR結合分子は、ROR抗原の細胞外部分に特異的に結合する抗原結合部位を有する。ある特定の実施形態では、ROR結合分子は、Ig様ドメインに特異的に結合する抗原結合部位を有する。他の実施形態では、ROR結合分子は、FZドメインに特異的に結合する抗原結合部位を有する。さらに他の実施形態では、ROR結合分子は、Kringleドメインに特異的に結合する抗原結合部位を有する。特定の実施形態では、ROR結合分子は、単一のRORドメインの少なくとも一部分に特異的に結合する抗原結合部位を有する。特定の実施形態では、ROR結合分子は、第1および第2のRORドメインの間のジャンクションなど、2つ以上のRORドメインの少なくとも一部分に特異的に結合する抗原結合部位を有する。RORドメインは、ROR1ドメインまたはROR2ドメインを指すことができる。
特定の実施形態では、ROR抗原は、ヒトである。UniProt受託#Q01973は、その配列およびドメイン特色を含む正準ヒトROR1タンパク質を表し、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列番号94は、全長ROR1タンパク質配列を提供する。全長配列をN末端からC末端へと参照すると、Ig様ドメインはとアミノ酸42〜147として、FZドメインはアミノ酸165〜299として、Kringleドメインはアミノ酸312〜391として定義される。UniProt受託#Q01974は、その配列およびドメイン特色を含む正準ヒトROR2タンパク質を表し、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列番号95は、全長ROR2タンパク質配列を提供する。全長配列をN末端からC末端へと参照すると、Ig様ドメインはアミノ酸55〜145として、FZドメインはアミノ酸169〜303として、Kringleドメインはアミノ酸316〜394として定義される。
それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Gentile, et al. (Cancer Res; 71(8) April 15, 2011)、Rebagay, et al. (Front. Oncol., 18 April 2012)、Zhang, et al. (American Journal of Pathology, Vol. 181, No. 6, December 2012)、Henry, et al. (Oncotarget, Vol. 6, No. 37 2015)、Zhang, et al. (PLoS ONE 7(3): e31127.)およびBainbridge, et al. (PLoS ONE 9(7): e102695.)にさらに詳細に記載される通り、様々な腫瘍が、ROR抗原の細胞表面発現を実証することができる。加えて、その全体が本明細書に組み込まれるBalakrishnan et al. (Clin Cancer Res. 2017 Jun 15; 23(12): 3061−3071)に記載されている通り、ROR発現は、正常、すなわち、非がん性組織において発現されないまたは限定的な発現のみを実証することができる。よって、ROR抗原は、ある特定の腫瘍において腫瘍特異的マーカーとして使用することができる。実証されたROR発現を有する腫瘍およびがんの例としては、その全体が本明細書に組み込まれるGohil et al. (Oncoimmunology. 2017; 6(7): e1326437.)に記載されている通り、膵がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、胃がん、黒色腫、ユーイング肉腫、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫およびB−ALLが挙げられるがこれらに限定されない。他のがんとしては、血液学的がん、前立腺がん、結腸がん、腎がんおよび子宮がんが挙げられるがこれらに限定されない。
様々な実施形態では、ROR結合分子はその上、ROR抗原に追加して少なくとも1つの抗原に特異的に結合する。
特定の実施形態では、ROR結合分子は、二特異性二価分子である。別の実施形態では、ROR結合分子は、二特異性三価分子である。特定の実施形態では、ROR結合分子は、ROR抗原およびT細胞表面に発現される分子に特異的に結合する抗原結合部位を有する。特定の実施形態では、ROR結合分子は、ROR抗原およびT細胞表面に発現されるタンパク質CD3に特異的に結合する抗原結合部位を有する。理論に制約されることは望まないが、ROR抗原およびT細胞表面に発現される分子(すなわち、CD3)に特異的に結合するROR結合分子は、T細胞をROR発現細胞(すなわち、標的細胞)に再び方向付けることにより、ROR抗原を発現する細胞のT細胞媒介性死滅(細胞傷害性)を方向付けることができる。二特異性抗CD3分子を使用したT細胞媒介性死滅は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2006/0193852号に詳細に記載されている。一部の実施形態では、T細胞表面に発現される分子は、T細胞を標的細胞に再び方向付けることができるいずれかの分子から選択される。
図3を参照すると、一連の実施形態では、ROR結合分子は、第1および第2のポリペプチド鎖を含み:(a)第1のポリペプチド鎖はドメインA、ドメインB、ドメインDおよびドメインEを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、A−B−D−Eの配向で配置され、ドメインAは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインB、ドメインDおよびドメインEは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(b)第2のポリペプチド鎖はドメインFおよびドメインGを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、F−Gの配向で配置され、ドメインFは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインGは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(c)第3のポリペプチド鎖はドメインH、ドメインI、ドメインJおよびドメインKを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、H−I−J−Kの配向で配置され、ドメインHは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインIはCLアミノ酸配列を有し、ドメインJおよびKは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(d)第4のポリペプチド鎖はドメインLおよびドメインMを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、L−Mの配向で配置され、ドメインLは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチド鎖はCH1ドメインを含み、ドメインMはCH1ドメインまたはその部分であり;(e)第1および第2のポリペプチドは、AドメインとFドメインとの間の相互作用およびBドメインとGドメインとの間の相互作用を介して会合し;(f)第3および第4のポリペプチドは、HドメインとLドメインとの間の相互作用およびIドメインとMドメインとの間の相互作用を介して会合し;(g)第1および第3のポリペプチドは、DドメインとJドメインとの間の相互作用およびEドメインとKドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR結合分子を形成する。
一連の実施形態では、(a)第1のポリペプチド鎖はドメインA、ドメインB、ドメインDおよびドメインEを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、A−B−D−Eの配向で配置され、ドメインAは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインB、ドメインDおよびドメインEは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(b)第2のポリペプチド鎖はドメインFおよびドメインGを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、F−Gの配向で配置され、ドメインFは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインGは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(c)第3のポリペプチド鎖はドメインH、ドメインI、ドメインJおよびドメインKを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、H−I−J−Kの配向で配置され、第3のポリペプチド鎖はCH1ドメインを含み、ドメインIはCH1ドメインまたはその部分であり、ドメインHは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインJおよびKは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(d)第4のポリペプチド鎖はドメインLおよびドメインMを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、L−Mの配向で配置され、ドメインLは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインMはCLアミノ酸配列を有し;(e)第1および第2のポリペプチドは、AドメインとFドメインとの間の相互作用およびBドメインとGドメインとの間の相互作用を介して会合し;(f)第3および第4のポリペプチドは、HドメインとLドメインとの間の相互作用およびIドメインとMドメインとの間の相互作用を介して会合し;(g)第1および第3のポリペプチドは、DドメインとJドメインとの間の相互作用およびEドメインとKドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR結合分子を形成する。
6.3.1.ドメインA(可変領域)
ROR結合分子において、ドメインAは可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。本明細書に記載されている可変領域ドメインアミノ酸配列は、VLおよびVH抗体ドメイン配列を含む抗体の可変領域ドメインアミノ酸配列である。VLおよびVH配列は、それぞれセクション6.3.1.1および6.3.1.4でさらになお詳細に後述される。好まれる実施形態では、ドメインAはVL抗体ドメイン配列を有し、ドメインFはVH抗体ドメイン配列を有する。
6.3.1.1.VL領域
本明細書に記載のROR結合分子において有用なVLアミノ酸配列は、抗体軽鎖可変ドメイン配列である。本明細書に記載の天然抗体および抗体構築物の両方における典型的な配列では、特定のVLアミノ酸配列が、特定のVHアミノ酸配列と会合して、抗原結合部位を形成する。様々な実施形態では、VLアミノ酸配列は、下記セクション6.3.1.2および6.3.1.3においてさらに詳細に記載されているように、ヒト配列、合成配列、または、ヒト配列、非ヒト哺乳動物配列、哺乳動物配列および/もしくは合成配列の組合せを含む、哺乳動物配列である。
様々な実施形態では、VLアミノ酸配列は、天然に存在する配列の変異配列である。ある特定の実施形態では、VLアミノ酸配列は、ラムダ(λ)軽鎖可変ドメイン配列である。ある特定の実施形態では、VLアミノ酸配列は、カッパ(κ)軽鎖可変ドメイン配列である。好ましい実施形態では、VLアミノ酸配列は、カッパ(κ)軽鎖可変ドメイン配列である。
本明細書に記載のROR結合分子では、ドメインAのC末端は、ドメインBのN末端に連結されている。ある特定の実施形態では、ドメインAは、下記セクション6.3.19.1および実施例6においてさらに詳細に記載されているように、ドメインAとドメインBとの間のジャンクションにおいてそのC末端で変異しているVLアミノ酸配列を有する。
6.3.1.2.相補性決定領域
VLアミノ酸配列は、「相補性決定領域」(CDR)と称される高度に可変性の配列、典型的に3つのCDR(CDR1、CD2、およびCDR3)を含む。様々な実施形態では、CDRは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、CDRは、ヒト配列である。様々な実施形態では、CDRは、天然に存在する配列である。様々な実施形態では、CDRは、特定の抗原またはエピトープに対して抗原結合部位の結合親和性を変化させるように変異された天然に存在する配列である。ある特定の実施形態では、天然に存在するCDRは、親和性成熟および体細胞超変異を介してin vivo宿主で変異されている。ある特定の実施形態では、CDRは、PCR突然変異誘発および化学的突然変異誘発を含むがこれらに限定されない方法を介してin vitroで変異されている。様々な実施形態では、CDRは、ランダム配列CDRライブラリおよび合理的に設計されたCDRライブラリから得られたCDRを含むがこれらに限定されない、合成配列である。
6.3.1.3.フレームワーク領域およびCDRグラフト化
VLアミノ酸配列は、「フレームワーク領域」(FR)配列を含む。FRは、一般的に、散在されたCDRの足場として作用する保存配列領域(セクション6.3.1.2.参照)であり、典型的には、FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4配置(N末端からC末端へ)である。様々な実施形態では、FRは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、FRは、ヒト配列である。様々な実施形態では、FRは、天然に存在する配列である。様々な実施形態では、FRは、合理的に設計された配列を含むがそれに限定されない、合成配列である。
様々な実施形態では、FRおよびCDRは両方が、同じ天然に存在する可変ドメイン配列に由来する。様々な実施形態では、FRおよびCDRは、異なる可変ドメイン配列に由来し、ここでCDRはFR足場にグラフト化され、CDRが特定の抗原に対する特異性を提供している。ある特定の実施形態では、グラフト化されたCDRは全て、同じ天然に存在する可変ドメイン配列に由来する。ある特定の実施形態では、グラフト化されたCDRは、異なる可変ドメイン配列に由来する。ある特定の実施形態では、グラフト化されたCDRは、ランダム配列CDRライブラリおよび合理的に設計されたCDRライブラリから得られたCDRを含むがこれらに限定されない、合成配列である。ある特定の実施形態では、グラフト化されたCDRおよびFRは、同じ種に由来する。ある特定の実施形態では、グラフト化されたCDRおよびFRは、異なる種に由来する。好ましいグラフト化されたCDR実施形態では、抗体は「ヒト化」されており、ここで、グラフト化されたCDRは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバおよびヤギ配列を含むがこれらに限定されない非ヒト哺乳動物配列であり、FRはヒト配列である。ヒト化抗体は、教示する全てについてその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,407,213号においてより詳細に議論されている。様々な実施形態では、ある種に由来するFRの部分または特定の配列は、別の種のFRの部分または特定の配列を置き換えるために使用される。
6.3.1.4.VH領域
本明細書に記載されているROR結合分子におけるVHアミノ酸配列は、抗体重鎖可変ドメイン配列である。天然のおよび本明細書に記載されているROR結合分子の両方の典型的な抗体配置において、特定のVHアミノ酸配列は、特定のVLアミノ酸配列と会合して、抗原結合部位を形成する。様々な実施形態では、セクション6.3.1.2および6.3.1.3にさらに詳細に上述されている通り、VHアミノ酸配列は、ヒト配列を含む哺乳動物配列、合成配列、または非ヒト哺乳動物、哺乳動物および/または合成配列の組合せである。様々な実施形態では、VHアミノ酸配列は、天然に存在する配列の変異した配列である。
6.3.2.ドメインB(定常領域)
ROR結合分子において、ドメインBは定常領域ドメイン配列を有する。本明細書に記載されている定常領域ドメインアミノ酸配列は、抗体の定常領域ドメインの配列である。
様々な実施形態では、定常領域配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、定常領域配列は、ヒト配列である。ある特定の実施形態では、定常領域配列は、抗体軽鎖由来である。特定の実施形態では、定常領域配列は、ラムダまたはカッパ軽鎖由来である。ある特定の実施形態では、定常領域配列は、抗体重鎖由来である。特定の実施形態では、定常領域配列は、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはIgMアイソタイプである抗体重鎖配列である。特定の実施形態では、定常領域配列は、IgGアイソタイプに由来する。好まれる実施形態では、定常領域配列は、IgG1アイソタイプに由来する。好まれる特定の実施形態では、定常領域配列は、CH3配列である。CH3配列は、セクション6.3.2.1でさらになお詳細に後述される。他の好まれる実施形態では、定常領域配列は、オルソロガスCH2配列である。オルソロガスCH2配列は、セクション6.3.2.2でさらになお詳細に後述される。
特定の実施形態では、定常領域配列は、1つまたは複数の直交型変異を含むように変異された。好まれる実施形態では、ドメインBは、セクション6.3.14.2でさらになお詳細に後述される通り、ノブ・ホール(knob−hole)(同義的に「ノブ・イン・ホール」、「KIH」)直交型変異、およびセクション6.3.14.1にさらになお詳細に後述されている通り、直交型変異を含有するCH3ドメインと操作されたジスルフィド架橋を形成するS354CまたはY349C変異のいずれかを含むCH3配列である定常領域配列を有する。一部の好まれる実施形態では、ノブ・ホール直交型変異は、T366W変異である。
6.3.2.1.CH3領域
CH3アミノ酸配列は、本明細書に記載されるように、抗体重鎖のC末端ドメインの配列である。
様々な実施形態では、CH3配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、CH3配列は、ヒト配列である。ある特定の実施形態では、CH3配列は、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4アイソタイプに由来し、またはIgEもしくはIgMアイソタイプ由来のCH4配列である。特定の実施形態では、CH3配列は、IgGアイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、CH3配列は、IgG1アイソタイプに由来する。
ある特定の実施形態では、CH3配列は、内在性配列である。特定の実施形態では、CH3配列は、UniProt受託番号P01857アミノ酸224−330である。様々な実施形態では、CH3配列は、内在性CH3配列のセグメントである。特定の実施形態では、CH3配列は、N末端アミノ酸G224およびQ225を欠く内在性CH3配列を有する。特定の実施形態では、CH3配列は、C末端アミノ酸P328、G329およびK330を欠く内在性CH3配列を有する。特定の実施形態では、CH3配列は、N末端アミノ酸G224およびQ225ならびにC末端アミノ酸P328、G329およびK330を欠く内在性CH3配列を有する。好ましい実施形態では、ROR結合分子は、CH3配列を有する複数のドメインを有し、ここで、CH3配列は、全長内在性CH3配列、ならびにN末端アミノ酸、C末端アミノ酸、またはその両方を欠くCH3配列の両方を指すことができる。
ある特定の実施形態では、CH3配列は、1つまたは複数の変異を有する内在性配列である。特定の実施形態では、変異は、下記セクション6.3.14.1−6.3.14.3においてさらに詳細に記載されているように、内在性CH3配列に導入されて特定のCH3配列の特定の対形成をガイドする、1つまたは複数の直交型変異である。
ある特定の実施形態では、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるStickler et al. (Genes Immun. 2011 Apr; 12(3): 213−221)においてより詳細に記載されているように、CH3配列は、本明細書でイソアロタイプ変異と称される、あるアロタイプの特定のアミノ酸を別のアロタイプのアミノ酸に置き換えることによって、抗体の免疫原性を低減するように操作されている。特定の実施形態では、G1m1アロタイプの特定のアミノ酸が置き換えられている。好ましい実施形態では、CH3配列において、イソアロタイプ変異D356EおよびL358Mがなされている。
好ましい実施形態では、ドメインBは、以下の変異変化P343V;Y349C;およびトリペプチド挿入445P、446G、447Kを有するヒトIgG1 CH3アミノ酸配列を有する。他の好ましい実施形態では、ドメインBは、以下の変異変化:T366K;およびトリペプチド挿入445K、446S、447Cを有するヒトIgG1 CH3配列を有する。さらなる他の好ましい実施形態では、ドメインBは、以下の変異変化:Y349Cおよびトリペプチド挿入445P、446G、447Kを有するヒトIgG1 CH3配列を有する。
ある特定の実施形態では、ドメインBは、それらと異なって、内在性CH3配列に組み込まれた447C変異を有するヒトIgG1 CH3配列を有する。
本明細書に記載されるROR結合分子では、ドメインBのN末端が、ドメインAのC末端に連結されている。ある特定の実施形態では、ドメインBは、下記セクション6.3.19.1および実施例6においてさらに詳細に記載されているように、ドメインAとドメインBとの間のジャンクションにおいてそのN末端で変異しているCH3アミノ酸配列を有する。
ROR結合分子では、ドメインBのC末端は、ドメインDのN末端に連結されている。ある特定の実施形態では、ドメインBは、下記セクション6.3.19.3においてさらに詳細に記載されているように、ドメインBとドメインDとの間のジャンクションにC末端で伸長されているCH3アミノ酸配列を有する。
6.3.2.2.オルソロガスCH2領域
本明細書に記載されているCH2アミノ酸配列は、N末端からC末端へと参照した場合の、抗体重鎖の第3のドメインの配列である。CH2アミノ酸配列は、全般に、セクション6.3.3により詳細に後述される。一連の実施形態では、ROR結合分子は、CH2配列を有するCH2ドメインの2つ以上の対セットを有し、第1のセットは、第1のアイソタイプ由来のCH2アミノ酸配列、および別のアイソタイプ由来のCH2アミノ酸配列の1つまたは複数のオルソロガスセットを有する。本明細書に記載されているオルソロガスCH2アミノ酸配列は、共有されるアイソタイプ由来のCH2アミノ酸配列と相互作用することができるが、ROR結合分子に存在する別のアイソタイプ由来のCH2アミノ酸配列とは有意に相互作用しない。特定の実施形態では、CH2アミノ酸配列の全セットが、同じ種に由来する。好まれる実施形態では、CH2アミノ酸配列の全セットが、ヒトCH2アミノ酸配列である。他の実施形態では、CH2アミノ酸配列のセットは、異なる種に由来する。特定の実施形態では、CH2アミノ酸配列の第1のセットは、ROR結合分子における他の非CH2ドメインと同じアイソタイプに由来する。特定の実施形態では、第1のセットは、IgGアイソタイプ由来のCH2アミノ酸配列を有し、1つまたは複数のオルソロガスセットは、IgMまたはIgEアイソタイプ由来のCH2アミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、CH2アミノ酸配列のセットのうち1つまたは複数は、内在性CH2配列である。他の実施形態では、CH2アミノ酸配列のセットのうち1つまたは複数は、1つまたは複数の変異を有する内在性CH2配列である。特定の実施形態では、1つまたは複数の変異は、直交型ノブ・ホール変異、直交型電荷対変異または直交型疎水性変異である。ROR結合分子に有用なオルソロガスCH2アミノ酸配列は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際PCT出願WO2017/011342およびWO2017/106462により詳細に記載されている。
6.3.3.ドメインD(定常領域)
本明細書に記載されているROR結合分子において、ドメインDは、定常領域アミノ酸配列を有する。定常領域アミノ酸配列は、セクション6.3.2により詳細に記載されている。
好まれる一連の実施形態では、ドメインDは、CH2アミノ酸配列を有する。CH2アミノ酸配列は、本明細書に記載されるように、N末端からC末端へ参照して天然抗体重鎖の第3のドメインのCH2アミノ酸配列である。様々な実施形態では、CH2配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、CH2配列は、ヒト配列である。ある特定の実施形態では、CH2配列は、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはIgMアイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、CH2配列は、IgG1アイソタイプに由来する。
ある特定の実施形態では、CH2配列は、内在性配列である。特定の実施形態では、配列は、UniProt受託番号P01857アミノ酸111−223である。好ましい実施形態では、CH2配列は、下記セクション6.3.19.3においてより詳細が議論されているように、N末端可変ドメイン−定常ドメインセグメントを、CH2ドメインへ連結するN末端ヒンジ領域ペプチドを有する。
ROR結合分子では、ドメインDのN末端が、ドメインBのC末端に連結されている。ある特定の実施形態では、ドメインBは、下記セクション6.3.19.3においてさらに詳細に記載されているように、ドメインDとドメインBとの間のジャンクションにおいてC末端で伸長されているCH3アミノ酸配列を有する。
6.3.4.ドメインE(定常領域)
ROR結合分子において、ドメインEは、定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。定常領域アミノ酸配列は、セクション6.3.2により詳細に記載されている。
ある特定の実施形態では、定常領域配列は、CH3配列である。CH3配列は、上記セクション6.3.2.1においてさらに詳細に記載されている。特定の実施形態では、定常領域配列は、1つまたは複数の直交型変異を含むように変異されている。好ましい実施形態では、ドメインEは、下記セクション6.3.14.2においてより詳細に記載されているように、ノブ−ホール(同義的に「ノブ・イン・ホール」、「KIH」)直交型変異、ならびに下記セクション6.3.14.1においてより詳細に記載されているように、直交型変異を含有するCH3ドメインと操作されたジスルフィド架橋を形成するS354CまたはY349C変異のいずれかを含むCH3配列である定常領域配列を有する。一部の好ましい実施形態では、ノブ−ホール直交型変異は、T366W変異である。
ある特定の実施形態では、定常領域ドメイン配列は、CH1配列である。特定の実施形態では、ドメインEのCH1アミノ酸配列は、ROR結合分子における唯一のCH1アミノ酸配列である。ある特定の実施形態では、CH1ドメインのN末端は、下記で6.3.19.5においてさらに詳細に記載されているように、CH2ドメインのC末端に連結されている。ある特定の実施形態では、定常領域配列は、CL配列である。ある特定の実施形態では、下記で6.3.19.5においてさらに詳細に記載されているように、CLドメインのN末端は、CH2ドメインのC末端に連結されている。CH1およびCL配列は、セクション6.3.8.1にさらに詳細に記載されている。
6.3.5.ドメインF(可変領域)
ROR結合分子において、ドメインFは、可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。セクション6.3.1にさらになお詳細に記述されている可変領域ドメインアミノ酸配列は、VLおよびVH抗体ドメイン配列を含む抗体の可変領域ドメインアミノ酸配列である。VLおよびVH配列は、それぞれセクション6.3.1.1および6.3.1.4にさらになお詳細に上述されている。好まれる実施形態では、ドメインFは、VH抗体ドメイン配列を有する。
6.3.6.ドメインG(定常領域)
ROR結合分子において、ドメインGは、定常領域アミノ酸配列を有する。定常領域アミノ酸配列は、セクション6.3.2により詳細に記載されている。
好まれる特定の実施形態では、定常領域配列は、CH3配列である。CH3配列は、セクション6.3.2.1でさらになお詳細に後述される。他の好まれる実施形態では、定常領域配列は、オルソロガスCH2配列である。オルソロガスCH2配列は、セクション6.3.2.2でさらになお詳細に後述される。
ある特定の好ましい実施形態では、ドメインGは、以下の変異変化:S354C;およびトリペプチド挿入445P、446G、447Kを有するヒトIgG1 CH3配列を有する。一部の好ましい実施形態では、ドメインGは、以下の変異変化:S354C;および445P、446G、447Kトリペプチド挿入を有するヒトIgG1 CH3配列を有する。一部の好ましい実施形態では、ドメインGは、以下の変化:L351D;および445G、446E、447Cトリペプチド挿入を有するヒトIgG1 CH3配列を有する。
6.3.7.ドメインH(可変領域)
ROR結合分子において、ドメインLは可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。セクション6.3.1にさらになお詳細に記述されている可変領域ドメインアミノ酸配列は、VLおよびVH抗体ドメイン配列を含む抗体の可変領域ドメインアミノ酸配列である。VLおよびVH配列は、それぞれセクション6.3.1.1および6.3.1.4にさらになお詳細に上述されている。好まれる実施形態では、ドメインHはVL抗体ドメイン配列を有する。
6.3.8.ドメインI(定常領域)
ROR結合分子において、ドメインIは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。定常領域ドメインアミノ酸配列は、セクション6.3.2にさらになお詳細に上述されている。ROR結合分子の一連の好まれる実施形態では、ドメインIはCLアミノ酸配列を有する。別の一連の実施形態では、ドメインIはCH1アミノ酸配列を有する。CH1およびCLアミノ酸配列は、セクション6.3.8.1にさらに詳細に記載されている。
6.3.8.1.CH1およびCL領域
CH1アミノ酸配列は、本明細書に記載される場合、N末端からC末端へ参照して抗体重鎖の第2のドメインの配列である。ある特定の実施形態では、CH1配列は、内在性配列である。様々な実施形態では、CH1配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、CH1配列は、ヒト配列である。ある特定の実施形態では、CH1配列は、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはIgMアイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、CH1配列は、IgG1アイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、CH1配列は、UniProt受託番号P01857アミノ酸1−98である。
本明細書に記載されるROR結合分子において有用なCLアミノ酸配列は、抗体軽鎖定常ドメイン配列である。ある特定の実施形態では、CL配列は、内在性配列である。様々な実施形態では、CL配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、CL配列は、ヒト配列である。
ある特定の実施形態では、CLアミノ酸配列は、ラムダ(λ)軽鎖定常ドメイン配列である。特定の実施形態では、CLアミノ酸配列は、ヒトラムダ軽鎖定常ドメイン配列である。好ましい実施形態では、ラムダ(λ)軽鎖配列は、UniProt受託番号P0CG04である。
ある特定の実施形態では、CLアミノ酸配列は、カッパ(κ)軽鎖定常ドメイン配列である。好ましい実施形態では、CLアミノ酸配列は、ヒトカッパ(κ)軽鎖定常ドメイン配列である。好ましい実施形態では、カッパ軽鎖配列は、UniProt受託番号P01834である。
ある特定の実施形態では、CH1配列およびCL配列は両者共に内在性配列である。ある特定の実施形態では、下のセクション6.3.8.2にさらになお詳細に記述される通り、CH1配列およびCL配列は別個に、それぞれ直交型修飾を内在性CH1およびCL配列に含む。CH1配列における直交型変異が、CH1結合試薬とCH1ドメインとの間の特異的結合相互作用を排除しないことを理解されたい。しかし、一部の実施形態では、直交型変異は、特異的結合相互作用を排除しないとしても、低減させる場合がある。CH1配列またはその部分を有するドメインが、CH1配列またはその部分を有するドメインと会合することができるように、CH1およびCL配列は、内在性または修飾配列のいずれかの、その部分となることもできる。さらに、上述のCH1配列の一部分を有するROR結合分子は、CH1結合試薬に結合され得る。
理論に制約されることは望まないが、CH1ドメインは、また、そのフォールディングが典型的にIgGの分泌における律速ステップであるという点において、特有である(Feige et al. Mol Cell. 2009 Jun 12;34(5):569−79;その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。よって、CH1を含むポリペプチド鎖の律速成分に基づくROR結合分子の精製は、不完全鎖から完全複合体を精製する手段、例えば、1つまたは複数の非CH1を含む鎖のみを有する複合体からの律速CH1ドメインを有する複合体の精製を提供することができる。
記述された通り、CH1律速発現は、一部の態様では利益となる場合があるが、CH1は、完全ROR結合分子の全体的な発現を限定する可能性がある。よって、ある特定の実施形態では、CH1配列(複数可)を含むポリペプチド鎖の発現は、完全複合体を形成するROR結合分子の効率を改善するように調整される。説明目的の例では、CH1配列(複数可)を含むポリペプチド鎖を発現するように構築されたプラスミドベクターの比は、他のポリペプチド鎖を発現するように構築されたプラスミドベクターと比べて増加させることができる。別の説明目的の例では、CL配列(複数可)を含むポリペプチド鎖と比較した場合、CH1配列(複数可)を含むポリペプチド鎖は、2つのポリペプチド鎖のうち小さい方となることができる。別の特定の実施形態では、CH1配列(複数可)を含むポリペプチド鎖の発現は、いずれのポリペプチド鎖がCH1配列(複数可)を有するか制御することにより調整することができる。例えば、CH1ドメインが、4ドメインポリペプチド鎖(例えば、本明細書に記載されている第3のポリペプチド鎖)におけるCH1配列のネイティブ位置の代わりに、2ドメインポリペプチド鎖(例えば、本明細書に記載されている第4のポリペプチド鎖)に存在するように、ROR結合分子を操作することは、CH1配列(複数可)を含むポリペプチド鎖の発現の制御に使用することができる。しかし、他の態様では、他の鎖と比較して高すぎるCH1含有鎖の相対的発現レベルは、CH1鎖を有するが他の鎖のそれぞれがない不完全複合体をもたらし得る。よって、ある特定の実施形態では、CH1配列(複数可)を含むポリペプチド鎖の発現は、CH1含有鎖がない不完全複合体の形成を低減させ、かつ、CH1含有鎖があるが完全複合体に存在する他の鎖がない不完全複合体の形成を低減させるように調整される。
6.3.8.2.CH1およびCL直交型修飾
ある特定の実施形態では、CH1配列およびCL配列は別個に、それぞれ直交型修飾を内在性CH1およびCL配列に含む。直交型変異は全般に、下のセクション6.3.14.1〜6.3.14.3により詳細に記載されている。
特定の実施形態では、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第8,053,562号および米国特許第9,527,927号においてナンバリングされ、より詳細が議論されているように、内在性CH1およびCL配列における直交型修飾は、CH1配列における138位およびCL配列における116位、CH1配列における128位およびCL配列における119位、またはCH1配列における129位およびCL配列における210位の操作されたシステインから選択される、操作されたジスルフィド架橋である。好ましい実施形態では、操作されたシステインは、EuインデックスによってナンバリングされるCH1配列における128位およびCLカッパ配列における118位である。
一連の好まれる実施形態では、非内在性システインアミノ酸をもたらす変異は、Eu指標によりナンバリングされた、CL配列におけるF118C変異と対応するCH1配列におけるA141C、またはCL配列におけるF118C変異と対応するCH1配列におけるL128C、またはCL配列におけるS162C変異と対応するCH1配列におけるP171C変異である。
様々な実施形態では、CL配列およびCH1配列における直交型変異は、電荷対変異である。特定の実施形態では、電荷対変異は、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるBonisch et al. (Protein Engineering, Design & Selection, 2017, pp.1−12)においてさらに詳細に記載されているように、EuインデックスによってナンバリングされるCL配列におけるF118S、F118AまたはF118V変異と対応するCH1配列におけるA141L、またはCL配列におけるT129R変異と対応するCH1配列におけるK147Dである。一連の好ましい実施形態では、電荷対変異は、EuインデックスによってナンバリングされるCL配列におけるN138K変異と対応するCH1配列におけるG166D、またはCL配列におけるN138D変異と対応するCH1配列におけるG166Kである。
6.3.9.ドメインJ(CH2)
ROR結合分子では、ドメインJは、CH2アミノ酸配列を有する。CH2アミノ酸配列は、上記セクション6.3.3でさらに詳細に記載されている。好ましい実施形態では、CH2アミノ酸配列は、下記セクション6.3.19.4においてより詳細に記載されているように、ドメインJをドメインIへ連結するN末端ヒンジ領域を有する。
ROR結合分子では、ドメインJのC末端は、ドメインKのN末端に連結されている。特定の実施形態では、ドメインJは、下記セクション6.3.19.5においてさらに詳細に記載されているように、CH1アミノ酸配列またはCLアミノ酸配列を有するドメインKのN末端に連結されている。
6.3.10.ドメインK(定常領域)
ROR結合分子では、ドメインKは、定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。定常領域ドメインアミノ酸配列は、上記セクション6.3.2においてさらに詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ドメインKは、下記セクション6.3.14.2でさらに詳細に記載されているノブ−ホール直交型変異;上記6.3.2.1においてより詳細に記載されているイソアロタイプ変異;ならびに下記セクション6.3.14.1においてより詳細に記載されている直交型変異を含有するCH3ドメインと操作されたジスルフィド架橋を形成するS354CまたはY349C変異のいずれかを含むCH3配列である定常領域配列を有する。一部の好ましい実施形態では、イソアロタイプ変異と組み合わされたノブ−ホール直交型変異は、以下の変異変化:D356E、L358M、T366S、L368AおよびY407Vである。
ある特定の実施形態では、定常領域ドメイン配列は、CH1配列である。特定の実施形態では、ドメインKのCH1アミノ酸配列は、ROR結合分子における唯一のCH1アミノ酸配列である。ある特定の実施形態では、6.3.19.5でさらになお詳細に後述される通り、CH1ドメインのN末端は、CH2ドメインのC末端に接続される。ある特定の実施形態では、定常領域配列は、CL配列である。ある特定の実施形態では、6.3.19.5でさらになお詳細に後述される通り、CLドメインのN末端は、CH2ドメインのC末端に接続される。CH1およびCL配列は、セクション6.3.8.1にさらに詳細に記載されている。
6.3.11.ドメインL(可変領域)
ROR結合分子では、ドメインLは、可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。セクション6.3.1にさらになお詳細に記述されている可変領域ドメインアミノ酸配列は、VLおよびVH抗体ドメイン配列を含む抗体の可変領域ドメインアミノ酸配列である。VLおよびVH配列は、それぞれ上記セクション6.3.1.1および6.3.1.4においてさらに詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ドメインLは、VH抗体ドメイン配列を有する。
6.3.12.ドメインM(定常領域)
ROR結合分子では、ドメインMは、定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。定常領域ドメインアミノ酸配列は、上記セクション6.3.2においてさらに詳細に記載されている。ROR結合分子の一連の好まれる実施形態では、ドメインIはCH1アミノ酸配列を有する。別の一連の好まれる実施形態では、ドメインIはCLアミノ酸配列を有する。CH1およびCLアミノ酸配列は、セクション6.3.8.1にさらに詳細に記載されている。
6.3.13.ドメインAおよびFの対形成
ROR結合分子では、ドメインA VLまたはVHアミノ酸配列およびコグネートドメインF VLまたはVHアミノ酸配列は会合して、抗原結合部位(ABS)を形成する。A:F抗原結合部位(ABS)は、抗原のエピトープに特異的に結合することができる。ABSによる抗原結合は、下記セクション6.3.13.1においてさらに詳細に記載されている。
様々な多価の実施形態では、ドメインAおよびF(A:F)によって形成されるABSは、ROR結合分子内の1つまたは複数の他のABSと配列が同一であり、したがって、ROR結合分子内の1つまたは複数の他の配列同一ABSと同じ認識特異性を有する。
様々な多価の実施形態では、A:F ABSは、ROR結合分子内の1つまたは複数の他のABSと配列が非同一である。ある特定の実施形態では、A:F ABSは、ROR結合分子における1つまたは複数の他の配列非同一ABSと異なる認識特異性を有する。特定の実施形態では、A:F ABSは、ROR結合分子における少なくとも1つの他の配列非同一ABSによって認識される抗原と異なる抗原を認識する。特定の実施形態では、A:F ABSは、ROR結合分子における少なくとも1つの他の配列非同一ABSによっても認識される抗原の、異なるエピトープを認識する。この実施形態では、ドメインAおよびFによって形成されるABSは、抗原のエピトープを認識し、ここで、ROR結合分子内の1つまたは複数の他のABSは、同じ抗原を認識するが、同じエピトープは認識しない。
6.3.13.1.ABSによる抗原の結合
ABSおよびそのようなABSを含むROR結合分子は、ABSが特異的に結合するエピトープ(またはより全体的には抗原)を「認識する」と言われ、エピトープ(またはより全体的には抗原)は、ABSの「認識特異性」または「結合特異性」と言われる。
ABSは、特定の親和性で、その特定の抗原またはエピトープに結合すると言われる。本明細書で記載される場合、「親和性」は、1個の分子と別の分子との間の非共有結合性分子間力相互作用の強度を指す。親和性、つまり相互作用の強度は、解離平衡定数(K)として表すことができ、ここでK値は低いほど、分子間の相互作用が強力であることを示す。抗体構築物のK値は、当技術分野で周知の方法によって測定することができ、例えば、バイオレイヤー干渉法(例えば、Octet/FORTEBIO(登録商標))、表面プラズモン共鳴(SPR)技術(例えば、Biacore(登録商標))、および細胞結合アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の目的のために、親和性は、Octet/FORTEBIO(登録商標)を使用してバイオレイヤー干渉法によって測定された解離平衡定数である。
「特異的結合」は、本明細書で使用される場合、ABSとそのコグネート抗原またはエピトープとの間の親和性を指し、ここでK値は、10−6M、10−7M、10−8M、10−9Mまたは10−10M未満である。
図2に概略化されるように、本明細書に記載されるROR結合分子におけるABSの数は、ROR結合分子の「価」を定義する。単一のABSを有するROR結合分子は「一価」である。複数のABSを有するROR結合分子は、「多価」であると言われる。2つのABSを有する多価ROR結合分子は「二価」である。3つのABSを有する多価ROR結合分子は「三価」である。4つのABSを有する多価ROR結合分子は「四価」である。
様々な多価の実施形態では、複数のABSは全て同じ認識特異性を有する。図2に概略化されているように、そのようなROR結合分子は、「単一特異性」「多価」結合構築物である。他の多価の実施形態では、複数のABSの少なくとも2つが、異なる認識特異性を有する。そのようなROR結合分子は、多価および「多重特異性」である。ABSが集約的に2つの認識特異性を有する多価の実施形態では、ROR結合分子は「二重特異性」である。ABSが集約的に3つの認識特異性を有する多価の実施形態では、ROR結合分子は「三重特異性」である。
ABSが、集約的に、同じ抗原に存在する異なるエピトープに対して複数の認識特異性を有する多価の実施形態では、ROR結合分子は、「多重パラトピック(multiparatopic)」である。ABSが、集約的に、同じ抗原の2つのエピトープを認識する多価の実施形態では、ROR結合分子は、「二重パラトピック(biparatopic)」である。
様々な多価の実施形態では、ROR結合分子の多価性は、特定の標的に対するROR結合分子のアビディティを向上させる。本明細書で記載される場合、「アビディティ」は、2つまたはそれより多くの分子、例えば特定の標的に対する多価ROR結合分子間の全体的な相互作用の強度を指し、ここで、アビディティは、複数のABSの親和性によって与えられる相互作用の累積強度である。アビディティは、上記で説明されているような、親和性を決定するために使用される方法と同じ方法によって測定することができる。ある特定の実施形態では、特定の標的に対するROR結合分子のアビディティは、相互作用が特異的結合相互作用であり、ここで2つの分子間のアビディティは、10−6M、10−7M、10−8M、10−9Mまたは10−10M未満のK値を有する。ある特定の実施形態では、特定の標的に対するROR結合分子のアビディティが、相互作用が特異的結合相互作用であるK値であり、ここで個々のABSの1つまたは複数の親和性は、それらの各抗原またはエピトープ自体への特異的結合として十分なK値を有していない。ある特定の実施形態では、アビディティは、共通の特定の標的または複合体の別個の抗原、例えば個々の細胞で見出される別個の抗原に対する複数のABSの親和性によって与えられる相互作用の累積強度である。ある特定の実施形態では、アビディティは、共通の個々の抗原の別個のエピトープに対する複数のABSの親和性によって与えられる相互作用の累積強度である。
6.3.14.ドメインBおよびGの対形成
本明細書に記載されているROR結合分子において、ドメインB定常領域アミノ酸配列およびドメインG定常領域アミノ酸配列が会合する。定常領域ドメインアミノ酸配列は、セクション6.3.2にさらになお詳細に上述されている。
一連の好まれる実施形態では、ドメインBおよびドメインGは、CH3アミノ酸配列を有する。CH3配列は、セクション6.3.2.1にさらになお詳細に上述されている。様々な実施形態では、BおよびGドメインのアミノ酸配列は、同一である。これらの実施形態のいくつかでは、配列は、内在性CH3配列である。
様々な実施形態では、BおよびGドメインのアミノ酸配列は異なっており、それぞれ別個に直交型修飾を内在性CH3配列に含み、ここでBドメインはGドメインと相互作用し、BドメインとGドメインのどちらも、直交型修飾を欠くCH3ドメインと有意に相互作用しない。
本明細書に記載される「直交型修飾」または同義的に「直交型変異」は、直交型修飾を有する第1のドメインの、相補的な直交型修飾を有する第2のドメインに対する結合の親和性を増加させる抗体ドメインのアミノ酸配列における1つまたは複数の操作された変異である。ある特定の実施形態では、直交型修飾は、直交型修飾を有するドメインの、相補的な直交型修飾を欠くドメインに対する親和性を減少させる。ある特定の実施形態では、直交型修飾は、内在性抗体ドメイン配列における変異である。様々な実施形態では、直交型修飾は、アミノ酸の付加または欠失を含むがこれらに限定されない、内在性抗体ドメイン配列のN末端またはC末端の修飾である。特定の実施形態では、直交型修飾には、下記セクション6.3.14.1−6.3.14.3においてさらに詳細に記載されている操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異および電荷対変異が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、直交型修飾には、限定されないが、操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異および電荷対変異から選択される直交型修飾の組合せが含まれる。特定の実施形態では、直交型修飾は、上記セクション6.3.2.1においてさらに詳細に記載されているイソアロタイプ変異などの免疫原性を減少させるアミノ酸置換と組み合わせることができる。
6.3.14.1.直交型操作されたジスルフィド架橋
様々な実施形態では、直交型修飾は、第1のドメインと第2のドメインとの間の操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。本明細書に記載される場合、「操作されたジスルフィド架橋」は、2つまたはそれより多いドメインが会合するとき非天然ジスルフィド結合を形成するように、2つまたはそれより多いドメインに非内在性システインアミノ酸を提供する変異である。操作されたジスルフィド架橋は、教示する全てについて参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMerchant et al. (Nature Biotech (1998) 16:677−681)においてより詳細に記載されている。ある特定の実施形態では、操作されたジスルフィド架橋は、特定のドメイン間の直交型会合を改善させる。特定の実施形態では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、第1または第2のCH3ドメインの一方におけるK392C変異、ならびに他方のCH3ドメインにおけるD399Cである。好ましい実施形態では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、第1または第2のCH3ドメインの一方におけるS354C変異、ならびに他方のCH3ドメインにおけるY349Cである。別の好ましい実施形態では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、KSCトリペプチド配列を組み込んだCH3ドメインのC末端の伸長によって提供される第1および第2のCH3ドメインの両方における447C変異である。
6.3.14.2.直交型ノブ−ホール変異
様々な実施形態では、直交型修飾は、ノブ−ホール(同義的にノブ・イン・ホール)変異を含む。本明細書で記載される場合、ノブ−ホール変異は、第1のドメインが、相補的立体変異のないドメインとの会合と比較して、相補的立体変異を有する第2のドメインと優先的に会合するように、第1のドメインの表面の立体的特徴を変化させる変異である。ノブ−ホール変異は、それぞれその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第5,821,333号および米国特許第8,216,805号において、より詳細に記載されている。様々な実施形態では、ノブ−ホール変異は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMerchant et al. (Nature Biotech (1998) 16:677−681))においてさらに詳細に記載されているように、操作されたジスルフィド架橋と組み合わされる。様々な実施形態では、ノブ−ホール変異、イソアロタイプ変異、および操作されたジスルフィド変異が組み合わされる。
ある特定の実施形態では、ノブ・イン・ホール変異は、第1のドメインにおけるT366Y変異、ならびに第2のドメインにおけるY407T変異である。ある特定の実施形態では、ノブ・イン・ホール変異は、第1のドメインにおけるF405A、ならびに第2のドメインにおけるT394Wである。ある特定の実施形態では、ノブ・イン・ホール変異は、第1のドメインにおけるT366Y変異およびF405Aであり、第2のドメインにおけるT394WおよびY407Tである。ある特定の実施形態では、ノブ・イン・ホール変異は、第1のドメインにおけるT366W変異、ならびに第2のドメインにおけるY407Aである。ある特定の実施形態では、組み合わされたノブ・イン・ホール変異および操作されたジスルフィド変異は、第1のドメインにおけるS354CおよびT366W変異、ならびに第2のドメインにおけるY349C、T366S、L368AおよびY407V変異である。好ましい実施形態では、組み合わされたノブ・イン・ホール変異、イソアロタイプ変異、および操作されたジスルフィド変異は、第1のドメインにおけるS354CおよびT366W変異、ならびに第2のドメインにおけるY349C、D356E、L358M、T366S、L368AおよびY407V変異である。
6.3.14.3.直交型電荷対変異
様々な実施形態では、直交型修飾は、電荷対変異である。本明細書で使用される場合、電荷対変異は、ドメインが、相補的電荷対変異のないドメインとの会合と比較して、相補的電荷対変異を有する第2のドメインと優先的に会合するように、ドメインの表面のアミノ酸の電荷に影響を与える変異である。ある特定の実施形態では、電荷対変異は、特定のドメイン間の直交型会合を改善させる。電荷対変異は、それぞれ教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれる米国特許第8,592,562号、米国特許第9,248,182号、および米国特許第9,358,286号においてより詳細に記載されている。ある特定の実施形態では、電荷対変異は、特定のドメイン間の安定性を改善させる。好ましい実施形態では、電荷対変異は、第1のドメインにおけるT366K変異、および他のドメインにおけるL351D変異である。
6.3.15.ドメインEおよびKの対形成
様々な実施形態では、Eドメインは、CH3アミノ酸配列を有する。
様々な実施形態では、Kドメインは、CH3アミノ酸配列を有する。
様々な実施形態では、EおよびKドメインのアミノ酸配列は同一であり、配列は、内在性CH3配列である。
様々な実施形態では、EドメインとKドメインの配列は異なる。様々な実施形態では、異なる配列が、それぞれ別個に直交型修飾を内在性CH3配列に含み、ここでEドメインはKドメインと相互作用し、EドメインとKドメインのどちらも、直交型修飾を欠くCH3ドメインと有意に相互作用しない。ある特定の実施形態では、直交型修飾には、上記セクション6.3.14.1−6.3.14.3においてさらに詳細に記載されているように、操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異および電荷対変異が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、直交型修飾には、限定されないが、操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異、および電荷対変異から選択される直交型修飾の組合せが含まれる。特定の実施形態では、直交型修飾は、イソアロタイプ変異などの免疫原性を減少させるアミノ酸置換と組み合わせることができる。
6.3.16.ドメインIおよびMならびにドメインHおよびLの対形成
様々な実施形態では、ドメインIは、CL配列を有し、ドメインMは、CH1配列を有する。様々な実施形態では、ドメインHは、VL配列を有し、ドメインLは、VH配列を有する。好ましい実施形態では、ドメインHは、VLアミノ酸配列を有し、ドメインIは、CLアミノ酸配列を有し、ドメインLは、VHアミノ酸配列を有し、およびドメインMは、CH1アミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、ドメインHは、VLアミノ酸配列を有し、ドメインIは、CLアミノ酸配列を有し、ドメインLは、VHアミノ酸配列を有し、ドメインMは、CH1アミノ酸配列を有し、ドメインKは、CH3アミノ酸配列を有する。
様々な実施形態では、IドメインおよびMドメインのアミノ酸配列は、それぞれ別個に直交型修飾を内在性配列に含み、ここでIドメインはMドメインと相互作用し、IドメインとMドメインのどちらも、直交型修飾を欠くドメインと有意に相互作用しない。一連の実施形態では、Iドメインにおける直交型変異はCL配列にあり、Mドメインにおける直交型変異はCH1配列にある。CH1およびCL配列に存在する直交型変異は、上のセクション6.3.8.2により詳細に記載されている。
様々な実施形態では、HドメインおよびLドメインのアミノ酸配列は、それぞれ別個に直交型修飾を内在性配列に含み、ここでHドメインはLドメインと相互作用し、HドメインとLドメインのどちらも、直交型修飾を欠くドメインと有意に相互作用しない。一連の実施形態では、Hドメインにおける直交型変異はVL配列にあり、Lドメインにおける直交型変異はVH配列にある。特定の実施形態では、直交型変異は、VH/VL境界での電荷対変異である。好ましい実施形態では、VH/VL境界での電荷対変異は、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるIgawa et al. (Protein Eng. Des. Sel., 2010, vol. 23, 667−677)においてより詳細に記載されているように、VHにおけるQ39Eと対応するVLにおけるQ38K、またはVHにおけるQ39Kと対応するVLにおけるQ38Eである。
ある特定の実施形態では、AドメインとFドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成する。ある特定の実施形態では、AドメインとFドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成する。
6.3.17.三価ROR結合分子
別の一連の実施形態において、ROR結合分子は、3つの抗原結合部位を有し、したがって「三価」と称される。
図21を参照して、様々な三価の実施形態では、ROR結合分子は、第5のポリペプチド鎖をさらに含み、(a)第1のポリペプチド鎖はドメインNおよびドメインOをさらに含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、N−O−A−B−D−Eの配向で配置され、ドメインNはVLアミノ酸配列を有し、ドメインOは定常領域アミノ酸配列を有し;(b)ROR結合分子は、第5のポリペプチド鎖をさらに含み、第5のポリペプチド鎖が、ドメインPおよびドメインQを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、P−Qの配向で配置され、ドメインPはVHアミノ酸配列を有し、ドメインQは定常アミノ酸配列を有し;(c)第1および第5のポリペプチドは、NドメインとPドメインとの間の相互作用およびOドメインとQドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR結合分子を形成する。図2に概略化されているように、これらの三価の実施形態は、「2×1」三価構築物と称される。
図26を参照して、さらなる一連の三価の実施形態では、ROR結合分子は、第6のポリペプチド鎖をさらに含み、(a)第3のポリペプチド鎖はドメインRおよびドメインSをさらに含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、R−S−H−I−J−Kの配向で配置され、ドメインRはVLアミノ酸配列を有し、ドメインSは定常ドメインアミノ酸配列を有し;(b)ROR結合分子は、第6のポリペプチド鎖をさらに含み、第6のポリペプチド鎖が、ドメインTおよびドメインUを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、T−Uの配向で配置され、ドメインTはVHアミノ酸配列を有し、ドメインUは定常ドメインアミノ酸配列を有し;(c)第3および第6のポリペプチドは、RドメインとTドメインとの間の相互作用およびSドメインとUドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR結合分子を形成する。図2に概略化されているように、これらの三価の実施形態は、「1×2」三価構築物と称される。
様々な実施形態では、ドメインOは、ペプチドリンカーを介してドメインAに連結される。様々な実施形態では、ドメインSは、ペプチドリンカーを介してドメインHに連結される。好ましい実施形態では、ドメインOをドメインAに連結するかまたはドメインSをドメインHに連結するペプチドリンカーは、セクション6.3.19.6においてより詳細に記載されている6アミノ酸GSGSGSペプチド配列である。
6.3.17.1.三価2×1二重特異性構築物[2(A−A)×1(B)]
図21を参照して、様々な実施形態では、ドメインNおよびドメインAのアミノ酸配列は同一であり、ドメインHのアミノ酸配列はドメインNおよびAのアミノ酸配列と異なり、ドメインOおよびドメインBのアミノ酸配列は同一であり、ドメインIのアミノ酸配列はドメインOおよびBのアミノ酸配列と異なり、ドメインPおよびドメインFのアミノ酸配列は同一であり、ドメインLのアミノ酸配列はドメインPおよびFのアミノ酸配列と異なり、ドメインQおよびドメインGのアミノ酸配列は同一であり、ドメインMのアミノ酸配列はドメインQおよびGのアミノ酸配列と異なり;AドメインとFドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、ドメインNおよびドメインPが、第1の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する。
6.3.17.2.三価2×1二重特異性構築物[2(A−B)×1(A)]
図21を参照して、様々な実施形態では、ドメインNおよびドメインHのアミノ酸配列は同一であり、ドメインAのアミノ酸配列はドメインNおよびHのアミノ酸配列と異なり、ドメインOおよびドメインIのアミノ酸配列は同一であり、ドメインBのアミノ酸配列はドメインOおよびIのアミノ酸配列と異なり、ドメインPおよびドメインLのアミノ酸配列は同一であり、ドメインFのアミノ酸配列はドメインPおよびLのアミノ酸配列と異なり、ドメインQおよびドメインMのアミノ酸配列は同一であり、ドメインGのアミノ酸配列はドメインQおよびMのアミノ酸配列と異なり;AドメインとFドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、ドメインNおよびドメインPが、第2の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する。
6.3.17.3.三価2×1三重特異性構築物[2(A−B)×1(C)]
図21を参照して、様々な実施形態では、ドメインN、ドメインA、およびドメインHのアミノ酸配列は異なり、ドメインO、ドメインB、およびドメインIのアミノ酸配列は異なり、ドメインP、ドメインF、およびドメインLのアミノ酸配列は異なり、ドメインQ、ドメインG、およびドメインMのアミノ酸配列は異なり;AドメインとFドメインとの間の相互作用が第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用が第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、ドメインNおよびドメインPが、第3の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する。
ある特定の実施形態では、セクション6.3.8.1においてより詳細に記載されているように、ドメインOは、カッパ軽鎖由来のCLである定常領域配列を有し、ドメインQは、IgG1アイソタイプ由来のCH1である定常領域配列を有する。好ましい実施形態では、上記セクション6.3.14においてより詳細が議論されているように、ドメインOおよびドメインQは、互いに特異的に会合するようにCH3配列を有する。
6.3.17.4.三価1×2二重特異性構築物[1(A)×2(B−A)]
図26を参照して、様々な実施形態では、ドメインRおよびドメインAのアミノ酸配列は同一であり、ドメインHのアミノ酸配列はドメインRおよびAのアミノ酸配列と異なり、ドメインSおよびドメインBのアミノ酸配列は同一であり、ドメインIのアミノ酸配列はドメインSおよびBのアミノ酸配列と異なり、ドメインTおよびドメインFのアミノ酸配列は同一であり、ドメインLのアミノ酸配列はドメインTおよびFのアミノ酸配列と異なり、ドメインUおよびドメインGのアミノ酸配列は同一であり、ドメインMのアミノ酸配列はドメインUおよびGのアミノ酸配列と異なり;AドメインとFドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、ドメインRおよびドメインTが、第1の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する。
6.3.17.5.三価1×2二重特異性構築物[1(A)×2(B−B)]
種々の実施形態では、ROR結合分子は、第2のCH1ドメインまたはその部分をさらに含む。図26を参照して、特定の実施形態では、ドメインRおよびドメインHのアミノ酸配列は同一であり、ドメインAのアミノ酸配列はドメインRおよびHのアミノ酸配列と異なり、ドメインSおよびドメインIのアミノ酸配列は同一であり、ドメインBのアミノ酸配列はドメインSおよびIのアミノ酸配列と異なり、ドメインTおよびドメインLのアミノ酸配列は同一であり、ドメインFのアミノ酸配列はドメインTおよびLのアミノ酸配列と異なり、ドメインUおよびドメインMのアミノ酸配列は同一であり、ドメインGのアミノ酸配列はドメインUおよびMのアミノ酸配列と異なり;AドメインとFドメインとの間の相互作用が第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、ドメインRおよびドメインTが、第2の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する。
特定の実施形態では、ドメインSおよびドメインIのアミノ酸配列は、CH1配列である。特定の実施形態では、ドメインUおよびドメインMのアミノ酸配列は、CH1配列である。
6.3.17.6.三価1×2三重特異性構築物[1(A)×2(B−C)]
図26を参照して、様々な実施形態では、ドメインR、ドメインA、およびドメインHのアミノ酸配列は異なり、ドメインS、ドメインB、およびドメインIのアミノ酸配列は異なり、ドメインT、ドメインF、およびドメインLのアミノ酸配列は異なり、ドメインU、ドメインG、およびドメインMのアミノ酸配列は異なり;AドメインとFドメインとの間の相互作用が第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用が第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、ドメインRおよびドメインTが、第3の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する。
特定の実施形態では、セクション6.3.8.1により詳細に記述される通り、ドメインSは、カッパ軽鎖由来のCLである定常領域配列を有し、ドメインUは、IgG1アイソタイプ由来のCH1である定常領域配列を有する。好まれる実施形態では、セクション6.3.14により詳細に上述されている通り、ドメインSおよびドメインUは、互いと特異的に会合するようなCH3配列を有する。
ある特定の実施形態では、ROR結合分子は、第2のCH1ドメインまたはその部分をさらに含む。特定の実施形態では、ドメインSおよびドメインIのアミノ酸配列は、CH1配列である。特定の実施形態では、ドメインUおよびドメインMのアミノ酸配列は、CH1配列である。
6.3.18.四価2×2 ROR結合分子
様々な実施形態では、ROR結合分子は、4つの抗原結合部位を有し、したがって「四価」と称される。
図34を参照して、さらなる一連の実施形態では、ROR結合分子は、さらに第5および第6のポリペプチド鎖を含み、(a)第1のポリペプチド鎖はさらにドメインNおよびドメインOを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、N−O−A−B−D−Eの配向で配置され;(b)第3のポリペプチド鎖はドメインRおよびドメインSをさらに含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、R−S−H−I−J−Kの配向で配置され;(c)ROR結合分子はさらに第5および第6ポリペプチド鎖を含み、第5ポリペプチド鎖はドメインPおよびドメインQを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、P−Qの配向で配置され、第6ポリペプチド鎖はドメインTおよびドメインUを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、T−Uの配向で配置され;(d)第1および第5のポリペプチドは、NドメインとPドメインとの間の相互作用およびOドメインとQドメインとの間の相互作用を介して会合し、第3および第6のポリペプチドは、RドメインとTドメインとの間の相互作用およびSドメインとUドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR結合分子を形成する。
様々な実施形態では、ドメインOは、ペプチドリンカーを介してドメインAに連結され、ドメインSは、ペプチドリンカーを介してドメインHに連結される。好ましい実施形態では、ドメインOをドメインAに連結し、ドメインSをドメインHに連結するペプチドリンカーは、セクション6.3.19.6においてより詳細に記載されているように、6アミノ酸GSGSGSペプチド配列である。
6.3.18.1.四価2×2二重特異性構築物
図34を参照して、一連の四価2×2二重特異性ROR結合分子では、ドメインNおよびドメインAのアミノ酸配列は同一であり、ドメインHおよびドメインRのアミノ酸配列は同一であり、ドメインOおよびドメインBのアミノ酸配列は同一であり、ドメインIおよびドメインSのアミノ酸配列は同一であり、ドメインPおよびドメインFのアミノ酸配列は同一であり、ドメインLおよびドメインTのアミノ酸配列は同一であり、ドメインQおよびドメインGのアミノ酸配列は同一であり、ドメインMおよびドメインUのアミノ酸配列は同一であり;AドメインとFドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、ドメインNおよびドメインPが、第1の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成し、RドメインとTドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第4の抗原結合部位を形成する。
図34を参照して、別の一連の四価2×2二重特異性ROR結合分子では、ドメインHおよびドメインAのアミノ酸配列は同一であり、ドメインNおよびドメインRのアミノ酸配列は同一であり、ドメインIおよびドメインBのアミノ酸配列は同一であり、ドメインOおよびドメインSのアミノ酸配列は同一であり、ドメインLおよびドメインFのアミノ酸配列は同一であり、ドメインPおよびドメインTのアミノ酸配列は同一であり、ドメインMおよびドメインGのアミノ酸配列は同一であり、ドメインQおよびドメインUのアミノ酸配列は同一であり;AドメインとFドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、ドメインNおよびドメインPが、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成し、RドメインとTドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第4の抗原結合部位を形成する。
6.3.19.ドメインジャンクション
6.3.19.1.VLとCH3ドメインとを連結するジャンクション
様々な実施形態では、VLドメインのC末端とCH3ドメインのN末端との間のジャンクションを形成するアミノ酸配列は、操作された配列である。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸は、VLドメインのC末端で欠失または付加されている。ある特定の実施形態では、VLドメインのC末端とCH3ドメインのN末端とを連結しているジャンクションは、下記のセクション6.13.7の表2に記載されている配列の1つである。特定の実施形態では、A111が、VLドメインのC末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸が、CH3ドメインのN末端で、欠失または付加されている。特定の実施形態では、P343は、CH3ドメインのN末端で欠失されている。特定の実施形態では、P343およびR344は、CH3ドメインのN末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸が、VLドメインのC末端およびCH3ドメインのN末端の両方で欠失または付加されている。特定の実施形態では、A111が、VLドメインのC末端で欠失されており、P343が、CH3ドメインのN末端で欠失されている。好ましい実施形態では、A111およびV110が、VLドメインのC末端で欠失されている。別の好ましい実施形態では、A111およびV110が、VLドメインのC末端で欠失され、CH3ドメインのN末端が、P343V変異を有する。
6.3.19.2.VHとCH3ドメインとを連結するジャンクション
様々な実施形態では、VHドメインのC末端とCH3ドメインのN末端との間のジャンクションを形成するアミノ酸配列は、操作された配列である。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸が、VHドメインのC末端で欠失または付加されている。ある特定の実施形態では、VHドメインのC末端とCH3ドメインのN末端を連結するジャンクションは、下記のセクション6.13.7の表3に記載されている配列の1つである。特定の実施形態では、K117およびG118が、VHドメインのC末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸が、CH3ドメインのN末端で欠失または付加されている。ある特定の実施形態では、P343は、CH3ドメインのN末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、P343およびR344は、CH3ドメインのN末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、P343、R344およびE345が、CH3ドメインのN末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸が、VHドメインのC末端およびCH3ドメインのN末端の両方で欠失または付加されている。好ましい実施形態では、T116、K117およびG118が、VHドメインのC末端で欠失されている。
6.3.19.3.CH3のC末端をCH2のN末端に連結しているジャンクション(ヒンジ)
本明細書に記載のROR結合分子では、CH2ドメインのN末端は、「ヒンジ」領域アミノ酸配列を有する。本明細書で使用される場合、ヒンジ領域は、抗体のN末端可変ドメイン−定常ドメインセグメントと抗体のCH2ドメインとを連結している抗体重鎖の配列である。加えて、ヒンジ領域は、典型的に、N末端可変ドメイン−定常ドメインセグメントとCH2ドメインとの間のフレキシビリティ、ならびに重鎖間のジスルフィド架橋を形成するアミノ酸配列モチーフ(例えば、第1および第3のポリペプチド鎖)の両方を提供する。本明細書で使用される場合、ヒンジ領域アミノ酸配列は、配列番号56である。
様々な実施形態では、CH3アミノ酸配列は、CH3ドメインのC末端とCH2ドメインのN末端との間のジャンクションにおいてC末端で伸長されている。ある特定の実施形態では、CH3アミノ酸配列は、CH3ドメインのC末端とヒンジ領域との間のジャンクションにおいてC末端で伸長され、次いでCH2ドメインのN末端に連結されている。好ましい実施形態では、CH3アミノ酸配列は、PGKトリペプチド配列の挿入、続いてIgG1ヒンジ領域のDKTHTモチーフの挿入によって伸長されている。
特定の実施形態では、CH3ドメインのC末端における伸長は、別のCH3ドメインの直交型C末端伸長とジスルフィド結合を形成することができるアミノ酸配列を組み込んでいる。好ましい実施形態では、CH3ドメインのC末端における伸長は、KSCトリペプチド配列とそれに続くIgG1ヒンジ領域のDKTHTモチーフを組み込んでおり、IgG1ヒンジ領域のDKTHTモチーフは、カッパ軽鎖のGECモチーフを組み込んでいる別のCH3ドメインの直交型C末端伸長とジスルフィド結合を形成する。
6.3.19.4.CLのC末端とCH2のN末端とを連結するジャンクション(ヒンジ)
様々な実施形態では、CLアミノ酸配列は、そのC末端を介してヒンジ領域に連結され、次いで、CH2ドメインのN末端に連結される。ヒンジ領域配列は、上記セクション6.3.19.3においてより詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ヒンジ領域アミノ酸配列は、配列番号56である。
6.3.19.5.CH2のC末端を定常領域ドメインに連結するジャンクション
様々な実施形態では、CH2アミノ酸配列は、そのC末端を介して、定常領域ドメインのN末端に連結されている。定常領域は、上記セクション6.3.4においてより詳細に記載されている。好ましい実施形態では、CH2配列は、その内在性配列を介してCH3配列に連結されている。他の実施形態では、CH2配列は、CH1またはCL配列に連結されている。CH2配列のCH1またはCL配列への連結を議論する例が、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許第8,242,247号においてより詳細に記載されている。
6.3.19.6.三価および四価分子においてドメインOをドメインAにまたはドメインSをドメインHに連結するジャンクション
様々な実施形態では、抗体の重鎖(例えば、第1および第3のポリペプチド鎖)が、追加のABSを提供する追加のドメインを含むようにそのN末端で伸長される。図21、図26および図34を参照して、ある特定の実施形態では、ドメインOおよび/またはドメインSの定常領域ドメインアミノ酸配列のC末端は、それぞれ、ドメインAおよび/またはドメインHの可変領域ドメインアミノ酸配列のN末端に連結されている。一部の好ましい実施形態では、定常領域ドメインは、CH3アミノ酸配列であり、可変領域ドメインは、VLアミノ酸配列である。一部の好ましい実施形態では、定常領域ドメインは、CLアミノ酸配列であり、可変領域ドメインは、VLアミノ酸配列である。ある特定の実施形態では、定常領域ドメインは、ペプチドリンカーを介して可変領域ドメインに連結されている。好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは、6アミノ酸GSGSGSペプチド配列である。
様々な実施形態では、抗体の軽鎖(例えば、第2および第4のポリペプチド鎖)が、抗体の追加の可変ドメイン−定常ドメインセグメントを含むようにそのN末端で伸長される。ある特定の実施形態では、定常領域ドメインは、CH1アミノ酸配列であり、可変領域ドメインは、VHアミノ酸配列である。
6.4.特定の二価ROR結合分子
さらなる態様では、二価ROR結合分子が提供される。
図3を参照して、一連の実施形態では、ROR結合分子は、第1、第2、第3、および第4のポリペプチド鎖を含み、ここで(a)第1のポリペプチド鎖はドメインA、ドメインB、ドメインD、およびドメインEを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、A−B−D−Eの配向で配置され、ドメインAはVLアミノ酸配列を有し、ドメインBはCH3アミノ酸配列を有し、ドメインDはCH2アミノ酸配列を有し、ドメインEは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(b)第2のポリペプチド鎖はドメインFおよびドメインGを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、F−Gの配向で配置され、ドメインFはVHアミノ酸配列を有し、ドメインGはCH3アミノ酸配列を有し;(c)第3のポリペプチド鎖はドメインH、ドメインI、ドメインJ、およびドメインKを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、H−I−J−Kの配向で配置され、ドメインHは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインIは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインJはCH2アミノ酸配列を有し、およびKは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(d)第4のポリペプチド鎖はドメインLおよびドメインMを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、L−Mの配向で配置され、ドメインLは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインMは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;(e)第1および第2のポリペプチドは、AドメインとFドメインとの間の相互作用およびBドメインとGドメインとの間の相互作用を介して会合し;(f)第3および第4のポリペプチドは、HドメインとLドメインとの間の相互作用およびIドメインとMドメインとの間の相互作用を介して会合し;(g)第1および第3のポリペプチドは、DドメインとJドメインとの間の相互作用およびEドメインとKドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR結合分子を形成する。
好ましい実施形態では、ドメインEは、CH3アミノ酸配列を有し;ドメインHは、VLアミノ酸配列を有し;ドメインIは、CLアミノ酸配列を有し、ドメインKは、CH3アミノ酸配列を有し;ドメインLは、VHアミノ酸配列を有し;ドメインMは、CH1アミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、AドメインとFドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、ROR結合分子は、二重特異性二価ROR結合分子である。ある特定の実施形態では、AドメインとFドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、HドメインとLドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、ROR結合分子は、単一特異性二価ROR結合分子である。
6.4.1.二価の二重特異性B−Body「BC1」
図3および図6を参照して、一連の実施形態では、ROR結合分子は、第1、第2、第3、および第4のポリペプチド鎖を有し、ここで(a)第1のポリペプチド鎖はドメインA、ドメインB、ドメインD、およびドメインEを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、A−B−D−Eの配向で配置され、ドメインAは第1のVLアミノ酸配列を有し、ドメインBは、T366K変異およびKSCトリペプチド配列とそれに続くIgG1ヒンジ領域のDKTHTモチーフを組み込んだC末端伸長を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸配列を有し、ドメインDはヒトIgG1 CH2アミノ酸配列を有し、ドメインEはS354CおよびT366W変異を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸を有し;(b)第2のポリペプチド鎖はドメインFおよびドメインGを有し、ここでドメインは、N末端からC末端へ、F−Gの配向で配置され、ドメインFは第1のVHアミノ酸配列を有し、ドメインGはL351D変異およびGECアミノ酸ジスルフィドモチーフを組み込んだC末端伸長を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸配列を有し;(c)第3のポリペプチド鎖はドメインH、ドメインI、ドメインJ、およびドメインKを有し、ここでドメインは、N末端からC末端へ、H−I−J−Kの配向で配置され、ドメインHは第2のVLアミノ酸配列を有し、ドメインIはヒトCLカッパアミノ酸配列を有し、ドメインJはヒトIgG1 CH2アミノ酸配列を有し、およびKはY349C、D356E、L358M、T366S、L368AおよびY407V変異を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸配列を有し;(d)第4のポリペプチド鎖はドメインLおよびドメインMを有し、ここでドメインは、N末端からC末端へ、L−Mの配向で配置され、ドメインLは第2のVHアミノ酸配列を有し、ドメインMはヒトIgG1 CH1アミノ酸配列を有し;(e)第1および第2のポリペプチドは、AドメインとFドメインとの間の相互作用およびBドメインとGドメインとの間の相互作用を介して会合し;(f)第3および第4のポリペプチドは、HドメインとLドメインとの間の相互作用およびIドメインとMドメインとの間の相互作用を介して会合し;(g)第1および第3のポリペプチドは、DドメインとJドメインとの間の相互作用およびEドメインとKドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR結合分子を形成し;(h)ドメインAおよびドメインFは、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し;(i)ドメインHおよびドメインLは、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成する。
好ましい実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号8の配列を有し、第2のポリペプチド鎖は、配列番号9の配列を有し、第3のポリペプチド鎖は、配列番号10の配列を有し、および第4のポリペプチド鎖は、配列番号11の配列を有する。
6.4.2.二価の二重特異性B−Body「BC6」
図3および図14を参照して、一連の実施形態では、ROR結合分子は、第1、第2、第3、および第4のポリペプチド鎖を有し、ここで(a)第1のポリペプチド鎖はドメインA、ドメインB、ドメインD、およびドメインEを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、A−B−D−Eの配向で配置され、ドメインAは第1のVLアミノ酸配列を有し、ドメインBは、KSCトリペプチド配列とそれに続くIgG1ヒンジ領域のDKTHTモチーフを組み込んだC末端伸長を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸配列を有し、ドメインDはヒトIgG1 CH2アミノ酸配列を有し、ドメインEはS354CおよびT366W変異を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸を有し;(b)第2のポリペプチド鎖はドメインFおよびドメインGを有し、ここでドメインは、N末端からC末端へ、F−Gの配向で配置され、ドメインFは第1のVHアミノ酸配列を有し、ドメインGはGECアミノ酸ジスルフィドモチーフを組み込んだC末端伸長を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸配列を有し;(c)第3のポリペプチド鎖はドメインH、ドメインI、ドメインJ、およびドメインKを有し、ここでドメインは、N末端からC末端へ、H−I−J−Kの配向で配置され、ドメインHは第2のVLアミノ酸配列を有し、ドメインIはヒトCLカッパアミノ酸配列を有し、ドメインJはヒトIgG1 CH2アミノ酸配列を有し、およびKはY349C、D356E、L358M、T366S、L368AおよびY407V変異を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸配列を有し;(d)第4のポリペプチド鎖はドメインLおよびドメインMを有し、ここでドメインは、N末端からC末端へ、L−Mの配向で配置され、ドメインLは第2のVHアミノ酸配列を有し、ドメインMはヒトIgG1アミノ酸配列を有し;(e)第1および第2のポリペプチドは、AドメインとFドメインとの間の相互作用およびBドメインとGドメインとの間の相互作用を介して会合し;(f)第3および第4のポリペプチドは、HドメインとLドメインとの間の相互作用およびIドメインとMドメインとの間の相互作用を介して会合し;(g)第1および第3のポリペプチドは、DドメインとJドメインとの間の相互作用およびEドメインとKドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR結合分子を形成し;(h)ドメインAおよびドメインFは、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し;(i)ドメインHおよびドメインLは、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成する。
6.4.3.二価の二重特異性B−Body「BC28」
図3および図16を参照して、一連の実施形態では、ROR結合分子は、第1、第2、第3、および第4のポリペプチド鎖を有し、ここで(a)第1のポリペプチド鎖はドメインA、ドメインB、ドメインD、およびドメインEを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、A−B−D−Eの配向で配置され、ドメインAは第1のVLアミノ酸配列を有し、ドメインBは、Y349C変異およびPGKトリペプチド配列とそれに続くIgG1ヒンジ領域のDKTHTモチーフを組み込んだC末端伸長を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸配列を有し、ドメインDはヒトIgG1 CH2アミノ酸配列を有し、ドメインEはS354CおよびT366W変異を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸を有し;(b)第2のポリペプチド鎖はドメインFおよびドメインGを有し、ここでドメインは、N末端からC末端へ、F−Gの配向で配置され、ドメインFは第1のVHアミノ酸配列を有し、ドメインGはS354C変異およびPGKトリペプチド配列を組み込んだC末端伸長を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸配列を有し;(c)第3のポリペプチド鎖はドメインH、ドメインI、ドメインJ、およびドメインKを有し、ここでドメインは、N末端からC末端へ、H−I−J−Kの配向で配置され、ドメインHは第2のVLアミノ酸配列を有し、ドメインIはヒトCLカッパアミノ酸配列を有し、ドメインJはヒトIgG1 CH2アミノ酸配列を有し、およびKはY349C、D356E、L358M、T366S、L368AおよびY407Vを有するヒトIgG1 CH3アミノ酸配列を有し;(d)第4のポリペプチド鎖はドメインLおよびドメインMを有し、ここでドメインは、N末端からC末端へ、L−Mの配向で配置され、ドメインLは第2のVHアミノ酸配列を有し、ドメインMはヒトIgG1 CH1アミノ酸配列を有し;(e)第1および第2のポリペプチドは、AドメインとFドメインとの間の相互作用およびBドメインとGドメインとの間の相互作用を介して会合し;(f)第3および第4のポリペプチドは、HドメインとLドメインとの間の相互作用およびIドメインとMドメインとの間の相互作用を介して会合し;(g)第1および第3のポリペプチドは、DドメインとJドメインとの間の相互作用およびEドメインとKドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR結合分子を形成し;(h)ドメインAおよびドメインFは、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し;(i)ドメインHおよびドメインLは、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成する。
好ましい実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号24の配列を有し、第2のポリペプチド鎖は、配列番号25の配列を有し、第3のポリペプチド鎖は、配列番号10の配列を有し、および第4のポリペプチド鎖は、配列番号11の配列を有する。
6.4.4.二価の二重特異性B−Body「BC44」
図3および図19を参照して、一連の実施形態では、ROR結合分子は、第1、第2、第3、および第4のポリペプチド鎖を有し、ここで(a)第1のポリペプチド鎖はドメインA、ドメインB、ドメインD、およびドメインEを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、A−B−D−Eの配向で配置され、ドメインAは第1のVLアミノ酸配列を有し、ドメインBは、Y349C変異、P343V変異、およびPGKトリペプチド配列とそれに続くIgG1ヒンジ領域のDKTHTモチーフを組み込んだC末端伸長を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸配列を有し、ドメインDはヒトIgG1 CH2アミノ酸配列を有し、ドメインEはS354C変異およびT366W変異を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸を有し;(b)第2のポリペプチド鎖はドメインFおよびドメインGを有し、ここでドメインは、N末端からC末端へ、F−Gの配向で配置され、ドメインFは第1のVHアミノ酸配列を有し、ドメインGはS354C変異およびPGKトリペプチド配列を組み込んだC末端伸長を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸配列を有し;(c)第3のポリペプチド鎖はドメインH、ドメインI、ドメインJ、およびドメインKを有し、ここでドメインは、N末端からC末端へ、H−I−J−Kの配向で配置され、ドメインHは第2のVLアミノ酸配列を有し、ドメインIはヒトCLカッパアミノ酸配列を有し、ドメインJはヒトIgG1 CH2アミノ酸配列を有し、およびKはY349C、T366S、L368AおよびY407Vを有するヒトIgG1 CH3アミノ酸配列を有し;(d)第4のポリペプチド鎖はドメインLおよびドメインMを有し、ここでドメインは、N末端からC末端へ、L−Mの配向で配置され、ドメインLは第2のVHアミノ酸配列を有し、ドメインMはヒトIgG1アミノ酸配列を有し;(e)第1および第2のポリペプチドは、AドメインとFドメインとの間の相互作用およびBドメインとGドメインとの間の相互作用を介して会合し;(f)第3および第4のポリペプチドは、HドメインとLドメインとの間の相互作用およびIドメインとMドメインとの間の相互作用を介して会合し;(g)第1および第3のポリペプチドは、DドメインとJドメインとの間の相互作用およびEドメインとKドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR結合分子を形成し;(h)ドメインAおよびドメインFは、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し;(i)ドメインHおよびドメインLは、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成する。
好ましい実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号32の配列を有し、第2のポリペプチド鎖は、配列番号25の配列を有し、第3のポリペプチド鎖は、配列番号10の配列を有し、および第4のポリペプチド鎖は、配列番号11の配列を有する。
6.5.特定の三価ROR結合分子
6.5.1.三価1×2二重特異性B−Body「BC28−1×2」
セクション6.4.3および図26を参照して、一連の実施形態では、ROR結合分子は、第6のポリペプチド鎖をさらに含み、ここで(a)第3のポリペプチド鎖はドメインRおよびドメインSをさらに含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、R−S−H−I−J−Kの配向で配置され、ドメインRは第1のVLアミノ酸配列を有し、ドメインSは、Y349C変異、およびPGKトリペプチド配列とそれに続くドメインSをドメインHに連結するGSGSGSリンカーペプチドを組み込んだC末端伸長を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸配列を有し;(b)ROR結合分子が、第6のポリペプチド鎖をさらに含み、第6のポリペプチド鎖が、ドメインTおよびドメインUを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、T−Uの配向で配置され、ドメインTは第1のVHアミノ酸配列を有し、ドメインUはS354C変異およびPGKトリペプチド配列を組み込んだC末端伸長を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸配列を有し;(c)第3および第6のポリペプチドは、RドメインとTドメインとの間の相互作用およびSドメインとUドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR結合分子を形成し;(d)ドメインRおよびドメインTが第1の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する。
好ましい実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号24の配列を有し、第2のポリペプチド鎖は、配列番号25の配列を有し、第3のポリペプチド鎖は、配列番号37の配列を有し、第4のポリペプチド鎖は、配列番号11の配列を有し、および第6のポリペプチド鎖は、配列番号25の配列を有する。
6.5.2.三価1×2三重特異性B−Body「BC28−1×1×1a」
セクション6.4.3ならびに図26および図30を参照して、一連の実施形態では、ROR結合分子は、第6のポリペプチド鎖をさらに含み、ここで(a)第3のポリペプチド鎖はドメインRおよびドメインSをさらに含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、R−S−H−I−J−Kの配向で配置され、ドメインRは第3のVLアミノ酸配列を有し、ドメインSは、T366K変異およびKSCトリペプチド配列とそれに続くドメインSをドメインHに連結するGSGSGSリンカーペプチドを組み込んだC末端伸長を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸配列を有し;(b)ROR結合分子が、第6のポリペプチド鎖をさらに含み、第6のポリペプチド鎖が、ドメインTおよびドメインUを含み、ここでドメインは、N末端からC末端へ、T−Uの配向で配置され、ドメインTは第3のVHアミノ酸配列を有し、ドメインUはL351D変異およびGECアミノ酸ジスルフィドモチーフを組み込んだC末端伸長を有するヒトIgG1 CH3アミノ酸配列を有し;(c)第3および第6のポリペプチドは、RドメインとTドメインとの間の相互作用およびSドメインとUドメインとの間の相互作用を介して会合して、ROR結合分子を形成し;(d)ドメインRおよびドメインTが第3の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する。
好ましい実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号24の配列を有し、第2のポリペプチド鎖は、配列番号25の配列を有し、第3のポリペプチド鎖は、配列番号45の配列を有し、第4のポリペプチド鎖は、配列番号11の配列を有し、および第6のポリペプチド鎖は、配列番号53の配列を有する。
6.6.他のROR結合分子プラットフォーム
上述の様々な抗体プラットフォームは、限定的なものではない。特定のCDRサブセットを含む本明細書に記載されている抗原結合部位は、全長抗体、Fab断片、Fv、scFv、タンデムscFv、ダイアボディ、scダイアボディ、DART、tandAb、ミニボディ、ラクダ類VHH、および当業者に公知の他の抗体断片またはフォーマットを含むがこれらに限定されない、いずれかの結合分子プラットフォームへとフォーマットすることができる。例示的な抗体および抗体断片フォーマットは、それが教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれる、Brinkmann et al. (MABS, 2017, Vol. 9, No. 2, 182−212)に詳細に記載されている。
6.7.抗原特異性
ROR抗原に加えて本明細書に記載されているROR結合分子が特異的に結合することができる他の抗原は、多種多様な分子標的から選択することができる。例えば、抗原結合部位(単数または複数)は、E−Cad、CLDN7、FGFR2b、N−Cad、Cad−11、FGFR2c、ERBB2、ERBB3、FGFR1、FOLR1、IGF−Ira、GLP1R、PDGFRa、PDGFRb、EPHB6、ABCG2、CXCR4、CXCR7、インテグリン−avb3、SPARC、VCAM、ICAM、アネキシン、ROR1、ROR2、TNFα、CD137、アンジオポエチン2、アンジオポエチン3、BAFF、ベータアミロイド、C5、CA−125、CD147、CD125、CD147、CD152、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD25、CD274、CD28、CD3、CD30、CD33、CD37、CD4、CD40、CD44、CD44v4、CD44v6、CD44v7、CD50、CD51、CD52、CEA、CSF1R、CTLA−2、DLL4、EGFR、EPCAM、HER3、GD2ガングリオシド、GDF−8、Her2/neu、CD2221、IL−17A、IL−12、IL−23、IL−13、IL−6、IL−23、インテグリン、CD11a、MUC1、Notch、TAG−72、TGFβ、TRAIL−R2、VEGF−A、VEGFR−1、VEGFR2、VEGFc、ヘマトポエチン(4ヘリックスバンドル)(EPO(エリスロポエチン)、IL−2(T細胞増殖因子)、IL−3(マルチコロニーCSF)、IL−4(BCGF−1、BSF−1)、IL−5(BCGF−2)、IL−6 IL−4(IFN−β2、BSF−2、BCDF)、IL−7、IL−8、IL−9、IL−11、IL−13(P600)、G−CSF、IL−15(T細胞増殖因子)、GM−CSF(顆粒球マクロファージコロニー刺激因子)、OSM(OM、オンコスタチンM)、およびLIF(白血病阻止因子)など);インターフェロン(IFN−γ、IFN−αおよびIFN−βなど);免疫グロブリンスーパーファミリー(B7.1(CD80)およびB7.2(B70、CD86)など);TNFファミリー(TNF−α(カケクチン)、TNF−β(リンホトキシン、LT、LT−α)、LT−β、Fas、CD27、CD30、および4−1BBLなど);ならびに特定のファミリーに分類されないもの(TGF−β、IL 1α、IL−1β、IL−1 RA、IL−10(サイトカイン合成阻害因子F)、IL−12(NK細胞刺激因子)、MIF、IL−16、IL−17(mCTLA−8)、および/またはIL−18(IGIF、インターフェロン−γ誘導因子)など)に特異的に結合しうる;二重特異性抗体に関する実施形態では、抗体は、例えば、これらの標的のうちの2つに結合しうる。さらに、標的マスト細胞および好塩基球を標的とするためのIgE抗体のFc部分の使用など、Fc受容体発現細胞を標的とするために、抗体の重鎖のFc部分を使用してもよい。
ROR抗原に加えて本明細書に記載されているROR結合分子が特異的に結合することができる他の抗原を選ぶことができ、これは、TNFR1(CD120aおよびTNFRSF1Aとしても公知)、TNFR2(CD120bおよびTNFRSF1Bとしても公知)、TNFRSF3(LTβRとしても公知)、TNFRSF4(OX40およびCD134としても公知)、TNFRSF5(CD40としても公知)、TNFRSF6(FASおよびCD95としても公知)、TNFRSF6B(DCR3としても公知)、TNFRSF7(CD27としても公知)、TNFRSF8(CD30としても公知)、TNFRSF9(4−1BBとしても公知)、TNFRSF10A(TRAILR1、DR4およびCD26としても公知)、TNFRSF10B(TRAILR2、DR5およびCD262としても公知)、TNFRSF10C(TRAILR3、DCR1、CD263としても公知)、TNFRSF10D(TRAILR4、DCR2およびCD264としても公知)、TNFRSF11A(RANKおよびCD265としても公知)、TNFRSF11B(OPGとしても公知)、TNFRSF12A(FN14、TWEAKRおよびCD266としても公知)、TNFRSF13B(TACIおよびCD267としても公知)、TNFRSF13C(BAFFR、BR3およびCD268としても公知)、TNFRSF14(HVEMおよびCD270としても公知)、TNFRSF16(NGFR、p75NTRおよびCD271としても公知)またはTNFRSF17(BCMAおよびCD269としても公知)、TNFRSF18(GITRおよびCD357としても公知)、TNFRSF19(TROY、TAJおよびTRADEとしても公知)、TNFRSF21(CD358としても公知)、TNFRSF25(Apo−3、TRAMP、LARDまたはWS−1としても公知)、EDA2R(XEDARとしても公知)を含むがこれらに限定されない、受容体のTNFファミリーに特異的に結合する。
ROR抗原に加えて本明細書に記載されているROR結合分子が特異的に結合することができる他の抗原は、PD1、PDL1、CTLA−4、PDL2、B7−H3、B7−H4、BTLA、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、BY55およびCGEN−15049などのチェックポイント阻害剤標的を含むがこれらに限定されない、免疫腫瘍学(immuno−oncology)標的から選択することができる。
6.8.さらに別の修飾
さらなる一連の実施形態では、ROR結合分子は追加的修飾を有する。
6.8.1.抗体−薬物コンジュゲート
様々な実施形態では、ROR結合分子は、治療剤(例えば、薬物)にコンジュゲートされて、ROR結合分子−薬物コンジュゲートを形成する。治療剤には、化学治療剤、画像化剤(例えば、放射性同位体)、免疫調節剤(例えば、サイトカイン、ケモカイン、またはチェックポイント阻害剤)、および毒素(例えば、細胞毒性剤)が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、治療剤は、下記セクション6.8.3においてより詳細に議論されているように、リンカーペプチドを介してROR結合分子に連結されている。
薬物を本明細書に開示されるROR結合分子にコンジュゲートするために適合しうる抗体−薬物コンジュゲート(ADC)の調製方法は、例えば、それぞれ教示する全てについて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第8,624,003号(ポット法)、米国特許第8,163,888号(ワンステップ法)、米国特許第5,208,020号(ツーステップ法)、米国特許第8,337,856号、米国特許第5,773,001号、米国特許第7,829,531号、米国特許第5,208,020号、米国特許第7,745,394号、WO2017/136623、WO2017/015502、WO2017/015496、WO2017/015495、WO2004/010957、WO2005/077090、WO2005/082023、WO2006/065533、WO2007/030642、WO2007/103288、WO2013/173337、WO2015/057699、WO2015/095755、WO2015/123679、WO2015/157286、WO2017/165851、WO2009/073445、WO2010/068759、WO2010/138719、WO2012/171020、WO2014/008375、WO2014/093394、WO2014/093640、WO2014/160360、WO2015/054659、WO2015/195925、WO2017/160754、Storz (MAbs. 2015 Nov−Dec; 7(6): 989−1009)、Lambert et al. (Adv Ther, 2017 34: 1015)、Diamantis et al. (British Journal of Cancer, 2016, 114, 362−367)、Carrico et al. (Nat Chem Biol, 2007. 3: 321−2)、We et al. (Proc Natl Acad Sci USA, 2009. 106: 3000−5)、Rabuka et al. (Curr Opin Chem Biol., 2011 14: 790−6)、Hudak et al. (Angew Chem Int Ed Engl., 2012: 4161−5)、Rabuka et al. (Nat Protoc., 2012 7:1052−67)、Agarwal et al. (Proc Natl Acad Sci USA., 2013, 110: 46−51)、Agarwal et al. (Bioconjugate Chem., 2013, 24: 846−851)、Barfield et al. (Drug Dev. and D., 2014, 14:34−41)、Drake et al. (Bioconjugate Chem., 2014, 25:1331−41)、Liang et al. (J Am Chem Soc., 2014, 136:10850−3)、Drake et al. (Curr Opin Chem Biol., 2015, 28:174−80)およびYork et al. (BMC Biotechnology, 2016, 16(1):23)に記載されている。
6.8.2.さらなる結合部分構造
様々な実施形態では、ROR結合分子は、1つまたは複数の追加の結合部分構造を含む修飾を有する。ある特定の実施形態では、結合部分構造は、例えば、全長抗体、Fab断片、Fv、scFv、タンデムscFv、ダイアボディ、scダイアボディ、DART、tandAb、ミニボディ、カメリドVHH、および当業者に公知の他の抗体断片もしくはフォーマットを含むがこれらに限定されない抗体断片または抗体フォーマットである。例示的な抗体および抗体断片フォーマットは、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるBrinkmann et al. (MABS, 2017, Vol. 9, No. 2, 182−212)において詳細に記載されている。
特定の実施形態では、1つまたは複数の追加の結合部分構造は、第1または第3のポリペプチド鎖のC末端に連結されている。特定の実施形態では、1つまたは複数の追加の結合部分構造は、第1および第3のポリペプチド鎖の両方のC末端に連結されている。特定の実施形態では、1つまたは複数の追加の結合部分構造は、第1および第3のポリペプチド鎖の両方のC末端に連結されている。ある特定の実施形態では、1つまたは複数の追加の結合部分構造の個々の部分が、官能性結合部分構造を形成するように、第1および第3のポリペプチド鎖のC末端に別個に連結されている。
特定の実施形態では、1つまたは複数の追加の結合部分構造は、ポリペプチド鎖のいずれか(例えば、第1、第2、第3、第4、第5、または第6のポリペプチド鎖)のN末端に連結されている。ある特定の実施形態では、追加の結合部分構造の個々の部分が、官能性結合部分構造を形成するように、異なるポリペプチド鎖のN末端に別個に連結されている。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数の追加の結合部分構造は、ROR結合分子内のABSの異なる抗原またはエピトープに特異的である。ある特定の実施形態では、1つまたは複数の追加の結合部分構造は、ROR結合分子内のABSの同じ抗原またはエピトープに特異的である。修飾が2つまたはそれより多い追加の結合部分構造である特定の実施形態では、追加の結合部分構造は、同じ抗原またはエピトープに特異的である。修飾が2つまたはそれより多い追加の結合部分構造である特定の実施形態では、追加の結合部分構造は、異なる抗原またはエピトープに特異的である。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数の追加の結合部分構造は、下記セクション6.8.3においてより詳細が議論されているように、例えば、反応性化学および親和性タグシステムを含むがこれらに限定されないin vitro方法を使用してROR結合分子に連結される。ある特定の実施形態では、1つまたは複数の追加の結合部分構造は、Fc媒介結合(例えば、プロテインA/G)を介してROR結合分子に連結される。ある特定の実施形態では、1つまたは複数の追加の結合部分構造は、例えば、ROR結合分子と追加の結合部分構造との融合産物のヌクレオチド配列を同じ発現ベクター(例えば、プラスミド)にコード化するなどの組換えDNA技術を使用して、ROR結合分子に連結される。
6.8.3.官能基/反応基
様々な実施形態では、ROR結合分子は、例えば追加の部分構造(例えば、上記セクション6.8.1および6.8.2においてより詳細が議論されている薬物コンジュゲートおよび追加の結合部分構造)の連結などの下流プロセスおよび下流精製プロセスにおいて使用することができる、官能基または化学的反応性基を含む修飾を有する。
ある特定の実施形態では、修飾は、例えば、反応性チオール(例えば、マレイミド系反応性基)、反応性アミン(例えば、N−ヒドロキシスクシンイミド系反応性基)、「クリック化学」基(例えば、反応性アルキン基)、およびホルミルグリシン(FGly)を保持するアルデヒド類を含むがこれらに限定されない化学的反応性基である。ある特定の実施形態では、修飾は、親和性ペプチド配列(例えば、HA、HIS、FLAG、GST、MBPおよびStrepシステムなど)を含むがこれらに限定されない官能基である。ある特定の実施形態では、官能基または化学的反応性基は、開裂可能なペプチド配列を有する。特定の実施形態では、開裂可能なペプチドは、光開裂、化学開裂、プロテアーゼ開裂、還元条件、およびpH条件を含むがこれらに限定されない手段によって開裂される。特定の実施形態では、プロテアーゼ開裂は、細胞内プロテアーゼによって実施される。特定の実施形態では、プロテアーゼ開裂は、細胞外または膜会合プロテアーゼによって実施される。プロテアーゼ開裂を採用するADC治療は、教示する全てについて参照によりその全体が本明細書に組み込まれるChoi et al. (Theranostics, 2012; 2(2): 156−178.)においてより詳細に記載されている。
6.8.4.低減されたエフェクター機能
ある特定の実施形態では、ROR結合分子は、抗体結合に天然では関連するエフェクター機能を低減させる抗体ドメインのアミノ酸配列における1つまたは複数の操作された変異を有する。エフェクター機能としては、抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC、これは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害とも称される)、補体固定(例えば、C1q結合)、抗体依存性細胞媒介性ファゴサイトーシス(ADCP)およびオプソニン化など、抗体のFc部分へのFc受容体結合に起因する細胞機能が挙げられるがこれらに限定されない。エフェクター機能を低減させる操作された変異は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2017/0137530号、Armour, et al. (Eur. J. Immunol. 29(8) (1999) 2613−2624)、Shields, et al. (J. Biol. Chem. 276(9) (2001) 6591−6604)およびOganesyan, et al. (Acta Cristallographica D64 (2008) 700−704) により詳細に記載されている。
特定の実施形態では、ROR結合分子は、FcR受容体によるROR結合分子のFc部分の結合を低減させる抗体ドメインのアミノ酸配列における1つまたは複数の操作された変異を有する。一部の実施形態では、FcR受容体は、FcRγ受容体である。特定の実施形態では、FcR受容体は、FcγRIIaおよび/またはFcγRIIIA受容体である。
特定の実施形態では、エフェクター機能を低減させる1つまたは複数の操作された変異は、抗体のCH2ドメインにおける変異である。様々な実施形態では、1つまたは複数の操作された変異は、CH2ドメインのL234およびL235位に存在する。特定の実施形態では、1つまたは複数の操作された変異は、CH2ドメインのL234AおよびL235Aである。他の実施形態では、1つまたは複数の操作された変異は、CH2ドメインのL234、L235およびP329位に存在する。特定の実施形態では、1つまたは複数の操作された変異は、CH2ドメインのL234A、L235AおよびP329Gである。好まれる実施形態では、1つまたは複数の操作された変異は、CH2ドメインのL234A、L235AおよびP329Kである。
6.9.精製方法
B−bodyプラットフォームを含むROR結合分子を精製する方法が本明細書に提供される。
一連の実施形態では、方法は、i)ROR結合分子を含む試料をCH1結合試薬と接触させるステップであって、ROR結合分子が、複合体において会合した少なくとも第1、第2、第3および第4のポリペプチド鎖を含み、複合体が、少なくとも1つのCH1ドメインまたはその部分を含み、複合体におけるCH1ドメインの数が、複合体の価数(valency)よりも少なくとも1つ少なく、接触が、CH1結合試薬がCH1ドメインまたはその部分に結合するのに十分な条件下で行われる、ステップと;ii)1つまたは複数の不完全複合体から複合体を精製するステップであって、不完全複合体が、第1、第2、第3および第4のポリペプチド鎖を含まない、ステップとを含む。
典型的な天然に存在する抗体において、N末端からC末端へナンバリングされた第2のドメインとしてCH1ドメインをそれぞれ有する、2つの重鎖が会合する。よって、典型的な抗体は、2つのCH1ドメインを有する。CH1ドメインは、セクション6.3.8.1により詳細に記載されている。本明細書に記載されている種々のROR結合分子において、タンパク質におけるCH1ドメインの数が有効に低減されるように、タンパク質に典型的に見出されるCH1ドメインは、別のドメインに置換されている。非限定的な説明目的の例では、典型的な抗体のCH1ドメインをCH3ドメインに置換し、単一のCH1ドメインのみを有する抗原結合タンパク質を生成することができる。
ROR結合分子は、典型的な抗体アーキテクチャをもはや保有しないように操作された抗体アーキテクチャに基づく分子を指すこともできる。例えば、抗体は、そのNまたはC末端において拡張して、抗原結合タンパク質の価数(セクション6.3.13.1により詳細に記載されている)を増加させることができ、ある特定の実例では、CH1ドメインの数も、典型的な2つのCH1ドメインを越えて増加される。このような分子は、タンパク質におけるCH1ドメインの数が、抗原結合タンパク質の価数よりも少なくとも1つ少なくなるように、そのCH1ドメインのうち1つまたは複数を置換させることもできる。一部の実施形態では、他のドメインによって置換されるCH1ドメインの数は、単一のCH1ドメインのみを有するROR結合分子を生成する。他の実施形態では、別のドメインによって置換されるCH1ドメインの数は、2つまたはそれよりも多いが、抗原結合タンパク質の価数よりも少なくとも1つ少ないCH1ドメインを有するROR結合分子を生成する。特定の実施形態では、ROR結合分子が2つまたはそれよりも多いCH1ドメインを有する場合、複数のCH1ドメインは全て、同じポリペプチド鎖に存在することができる。他の特定の実施形態では、ROR結合分子が2つまたはそれよりも多いCH1ドメインを有する場合、複数のCH1ドメインは、完全複合体に存在する同じポリペプチド鎖の複数コピーにおける単一のCH1ドメインとなることができる。
6.9.1.CH1結合試薬
ROR結合分子を精製する例示的で非限定的な方法において、ROR結合分子を含む試料は、CH1結合試薬と接触される。本明細書に記載されているCH1結合試薬は、CH1エピトープに特異的に結合するいずれかの分子となることができる。CH1エピトープをもたらす様々なCH1配列は、セクション6.3.8.1により詳細に記載されており、特異的結合は、セクション6.3.13.1により詳細に記載されている。
一部の実施形態では、CH1結合試薬は、免疫グロブリンタンパク質に由来し、CH1エピトープに特異的に結合する抗原結合部位(ABS)を有する。特定の実施形態では、CH1結合試薬は、「抗CH1抗体」とも称される抗体である。抗CH1抗体は、種々の種に由来することができる。特定の実施形態では、抗CH1抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト抗体を含むがこれらに限定されない、哺乳動物抗体である。特定の実施形態では、抗CH1抗体は、単一ドメイン抗体である。本明細書に記載されている単一ドメイン抗体は、ABSを形成し、CH1エピトープに特異的に結合する単一の可変ドメインを有する。例示的な単一ドメイン抗体としては、それが教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれる、国際出願WO2009/011572により詳細に記載されているラクダおよびサメに由来する重鎖抗体が挙げられるがこれらに限定されない。好まれる実施形態では、抗CH1抗体は、ラクダ由来の抗体(「ラクダ類抗体」とも称される)である。例示的なラクダ類抗体としては、ヒトIgG−CH1 CaptureSelect(商標)(ThermoFisher、#194320010)およびヒトIgA−CH1(ThermoFisher、#194311010)が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、抗CH1抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は典型的に、培養されている抗体産生細胞系から産生される。他の実施形態では、抗CH1抗体は、ポリクローナル抗体、すなわち、それぞれがCH1エピトープを認識する異なる抗CH1抗体の集合体である。ポリクローナル抗体は典型的に、目的の抗原またはその断片、この場合はCH1で免疫化した動物の抗体含有血清を収集することにより産生される。
一部の実施形態では、CH1結合試薬は、免疫グロブリンタンパク質に由来しない分子である。このような分子の例としては、Perret and Boschetti (Biochimie, Feb. 2018, Vol 145:98−112)により詳細に記載されている通り、アプタマー、ペプトイドおよびアフィボディ(affibody)が挙げられるがこれらに限定されない。
6.9.2.固体支持体
ROR結合分子を精製する例示的で非限定的な方法において、CH1結合試薬は、本発明の様々な実施形態では、固体支持体に取り付けることができる。本明細書に記載されている固体支持体は、他の実体、例えば、CH1結合試薬を取り付けるまたは固定化することができる材料を指す。「担体」とも称される固体支持体は、国際出願WO2009/011572により詳細に記載されている。
特定の実施形態では、固体支持体は、ビーズまたはナノ粒子を含む。ビーズおよびナノ粒子の例としては、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、磁気ナノ粒子(例えば、Dynabeads(商標)、ThermoFisher)、ポリマー(例えば、デキストラン)、合成ポリマー(例えば、Sepharose(商標))、またはCH1結合試薬の取付けに適した他のいずれかの材料が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、固体支持体は、CH1結合試薬の取付けを可能にするように修飾される。固体支持体修飾の例としては、タンパク質と共有結合を形成する化学修飾(例えば、活性化されたアルデヒド基)、およびCH1結合試薬のコグネート修飾と特異的に対形成する修飾(例えば、ビオチン−ストレプトアビジン対、ジスルフィド連結、ポリヒスチジン−ニッケル、またはアジド−アルキニル対などの「クリックケミストリー」修飾)が挙げられるがこれらに限定されない。
ある特定の実施形態では、ROR結合分子へのCH1結合試薬接触に先立ち、CH1結合試薬は、固体支持体に取り付けられ、「抗CH1樹脂」とも本明細書で称される。一部の実施形態では、抗CH1樹脂は、溶液中に分散される。他の実施形態では、抗CH1樹脂は、カラム内に「充填される」。次に、抗CH1樹脂は、ROR結合分子と接触され、CH1結合試薬は、ROR結合分子に特異的に結合する。
他の実施形態では、CH1結合試薬がROR結合分子に接触した後に、CH1結合試薬は、固体支持体に取り付けられる。非限定的な例証として、ビオチン修飾を有するCH1結合試薬は、ROR結合分子と接触させることができ、その後、CH1結合試薬/ROR結合分子混合物は、ストレプトアビジン修飾固体支持体と接触させて、ROR結合分子に特異的に結合されたCH1結合試薬を含むCH1結合試薬を固体支持体に取り付けることができる。
CH1結合試薬が固体支持体に取り付けられる方法において、種々の実施形態では、結合されたROR結合分子は、固体支持体から放出または「溶出」され、ROR結合分子を有する溶出液を形成する。一部の実施形態では、対形成した修飾を反転させる(例えば、ジスルフィド連結の還元)、ROR結合分子と競合して外すための試薬を添加する(例えば、ニッケルへの結合に関してポリヒスチジンと競合するイミダゾールの添加)、ROR結合分子を切断して外す(例えば、修飾に切断可能部分が含まれていてよい)、またはROR結合分子に対するCH1結合試薬の特異的結合に他の仕方で干渉することにより、結合されたROR結合分子が放出される。特異的結合に干渉する方法としては、CH1結合試薬に結合されたROR結合分子と低pH溶液との接触が挙げられるがこれに限定されない。好まれる実施形態では、低pH溶液は、0.1M酢酸、pH4.0を含む。他の実施形態では、結合されたROR結合分子は、ある範囲の低pH溶液、すなわち、「勾配」と接触させることができる。
6.9.3.さらなる精製
例示的で非限定的な方法の一部の実施形態では、ROR結合分子をCH1結合試薬と接触させ、続いてROR結合分子を溶出するステップを使用した方法の単一の反復が使用されて、1つまたは複数の不完全複合体からROR結合分子を精製する。特定の実施形態では、他の精製ステップは行われない。他の実施形態では、1つまたは複数の追加的な精製ステップが行われて、1つまたは複数の不完全複合体からROR結合分子をさらに精製する。1つまたは複数の追加的な精製ステップとしては、サイズ(例えば、サイズ排除クロマトグラフィ)、電荷(例えば、イオン交換クロマトグラフィ)または疎水性(例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィ)などの他のタンパク質特徴に基づくROR結合分子の精製が挙げられるがこれらに限定されない。好まれる実施形態では、追加的な陽イオン交換クロマトグラフィが行われる。その上、上述のCH1結合試薬とROR結合分子との接触を繰り返すと共に、反復間のCH1精製方法を修飾して、例えば、第1の反復のための溶出ステップおよびその後の溶出のための勾配溶出を使用して、ROR結合分子は、さらに精製することができる。
6.9.4.複合体のアセンブリおよび純度
本発明の実施形態では、少なくとも4つの別個のポリペプチド鎖が、一体に会合して、完全複合体、例えば、ROR結合分子を形成する。しかし、少なくとも4つの別個のポリペプチド鎖を含有しない不完全複合体を形成する場合もある。例えば、ポリペプチド鎖のうち1、2または3つのみを有する不完全複合体を形成し得る。他の例では、不完全複合体は、4つ以上のポリペプチド鎖を含有することができるが、少なくとも4つの別個のポリペプチド鎖を含有しない、例えば、不完全複合体は、別個のポリペプチド鎖の2つ以上のコピーと不適切に会合する。本発明の方法は、不完全複合体から複合体、例えば、完全にアセンブルしたROR結合分子を精製する。
精製ステップの有効性および効率を評価するための方法は、当業者にとって周知であり、そのようなものとしては、SDS−PAGE解析、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィおよび質量分析が挙げられるがこれらに限定されない。純度は、種々の判断基準に従って評価することもできる。判断基準の例としては、1)完全にアセンブルされたROR結合分子によって提供される溶出液における総タンパク質のパーセンテージの評価、2)所望の産物を精製するための方法の倍数濃縮またはパーセント増加の評価、例えば、溶出液における完全にアセンブルされたROR結合分子によって提供される総タンパク質の、出発試料におけるものとの比較、3)特定の望まれない産物(例えば、会合していない単一のポリペプチド鎖、ポリペプチド鎖のいずれかの組合せの二量体、またはポリペプチド鎖のいずれかの組合せの三量体)のパーセントまたはパーセント減少の決定を含む、望まれない産物、例えば、上述の不完全複合体の総タンパク質のパーセンテージ、またはパーセント減少の評価が挙げられるがこれらに限定されない。純度は、本明細書に記載されている方法のいずれかの組合せの後に評価することができる。例えば、純度は、本明細書に記載されている通り、抗CH1結合試薬を使用した単一の反復の後に、またはセクション6.9.3により詳細に記載されている通り、追加的な精製ステップの後に評価することができる。精製ステップの有効性および効率を使用して、抗CH1結合試薬を使用して記載されている方法を、プロテインA精製などの当業者にとって公知の他の精製方法と比較することもできる。
6.10.製造方法
本明細書に記載されているROR結合分子は、抗体製造のために現在使用されている、標準無細胞翻訳、一過性トランスフェクションおよび安定したトランスフェクションアプローチを使用した発現により容易に製造することができる。特定の実施形態では、ExpiFectamineなどのThermoFisherのプロトコールおよび試薬、またはそれが教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるFang et al. (Biological Procedures Online, 2017, 19:11)に詳細に記載されているポリエチレンイミンなどの当業者にとって公知の他の試薬を使用して、Expi293細胞(ThermoFisher)をROR結合分子の産生のために使用することができる。
後述する実施例にさらに記載されている通り、CaptureSelect CH1樹脂などのCH1親和性樹脂およびThermoFisherから提供されたプロトコールを使用して、発現されたタンパク質は、望まれないタンパク質およびタンパク質複合体から容易に分離することができる。他の精製戦略としては、プロテインA、プロテインGまたはプロテインA/G試薬の使用が挙げられるがこれらに限定されない。当技術分野でルーチンに使用される通り、イオン交換クロマトグラフィを使用して、さらなる精製をもたらす(affect)ことができる。
6.11.医薬組成物
別の態様では、本明細書に記載されるROR結合分子と、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物が提供される。典型的な実施形態では、医薬組成物は滅菌される。
様々な実施形態では、医薬組成物は、ROR結合分子を0.1mg/ml〜100mg/mlの濃度で含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、ROR結合分子を、0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、7.5mg/mlまたは10mg/mlの濃度で含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、ROR結合分子を、10mg/mlを超える濃度で含む。ある特定の実施形態では、ROR結合分子は、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、またはさらには50mg/mlもしくはそれより高い濃度で存在する。特定の実施形態では、ROR結合分子は、50mg/mlを超える濃度で存在する。
様々な実施形態では、医薬組成物は、それぞれその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第8,961,964号、米国特許第8,945,865号、米国特許第8,420,081号、米国特許第6,685,940号、米国特許第6,171,586号、米国特許第8,821,865号、米国特許第9,216,219号、米国特許出願第10/813,483号、WO2014/066468、WO2011/104381およびWO2016/180941においてより詳細に記載されている。
6.12.処置方法
別の態様では、処置方法であって、対象の処置に有効な量で、本明細書に記載されているROR結合分子(例えば、抗体)を対象に投与するステップを含む方法が提供される。このようなROR抗原結合分子は、ROR1抗原を発現するがん、ROR2抗原を発現するがん、および/またはROR1抗原とROR2抗原の両方を発現するがんを含む、ROR発現がんの処置において有用である。
一部の実施形態では、本開示の抗体は、様々ながんを処置するために使用されうる。がんは、膀胱、血液(骨髄球性白血病[急性および慢性]、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群)、骨、骨髄、脳(星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫[松果体腫]、多形性神経膠芽細胞腫、乏突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍)、乳房、結腸、食道(扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫)、胃腸管、歯肉、頭部、腎臓(腺癌、ウィルムス腫瘍[腎芽腫]、リンパ腫、白血病、腎細胞癌)、肝臓、肺、上咽頭、頸部、卵巣、前立腺(腺癌、肉腫、去勢抵抗性前立腺がん)、皮膚、胃(癌、リンパ腫、平滑筋肉腫)、精巣(セミノーマ、テラトーマ、胎児性癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫)、舌または子宮由来のがんとなることができる。一部の実施形態では、がんは、新生物、悪性疾患;癌腫;未分化癌腫;巨細胞紡錘形細胞癌;小細胞癌;乳頭癌;扁平上皮癌;リンパ腫;基底細胞癌;毛母癌;移行上皮癌;乳頭状移行上皮癌;腺癌;悪性ガストリノーマ;胆管癌;肝細胞癌;混合型肝細胞癌・胆管細胞癌;小柱腺癌;腺様嚢胞癌;腺腫性ポリープの腺癌;腺腫性家族性大腸ポリポーシス;固形癌;カルチノイド悪性腫瘍;細気管支肺胞腺癌(branchiolo−alveolar adenocarcinoma);乳頭状腺癌;嫌色素性癌;好酸性癌(acidophil carcinoma);好酸性腺癌;好塩基球腫;明細胞腺癌;顆粒細胞癌;濾胞腺癌;乳頭状・濾胞腺癌;非被包性硬化性癌(nonencapsulating sclerosing carcinoma);副腎皮質癌;子宮内膜癌;皮膚付属器癌;アポクリン腺癌;皮脂腺癌;耳垢腺癌;粘表皮癌;嚢胞腺癌;乳頭状嚢胞腺癌;乳頭状漿液性嚢胞腺癌;粘液性嚢胞腺癌;粘液腺癌;印環細胞癌;ダクト癌浸潤;髄様癌;小葉癌;炎症性腫;乳腺パジェット病;腺房細胞癌;腺扁平上皮癌;扁平上皮化生随伴腺癌;悪性胸腺腫;悪性卵巣間質腫瘍;悪性莢膜細胞腫;悪性顆粒細胞腫瘍;悪性男性細胞腫;セルトリ細胞癌;悪性ライディッヒ細胞腫瘍;悪性脂質細胞腫瘍;悪性傍神経節腫;悪性エキストラ乳腺傍神経節腫;褐色細胞腫;糸球体肉腫;悪性黒色腫;メラニン欠乏メラノーマ;表在拡大型黒色腫;巨大色素性母斑の悪性黒色腫(malig melanoma);類上皮細胞メラノーマ;悪性青色母斑;肉腫(血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫);線維肉腫;悪性線維性組織球腫;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;胎児性横紋筋肉腫;肺胞横紋筋肉腫;間質肉腫;悪性混合腫瘍;ミュラー管混合腫瘍;腎芽;肝芽腫;癌肉腫;悪性間葉腫;悪性ブレンナー腫瘍;悪性葉状腫瘍;滑膜肉腫;悪性中皮腫;未分化胚細胞腫;胎児性癌;悪性奇形腫;悪性卵巣甲状腺腫;絨毛癌;悪性中腎腫;血管肉腫;悪性血管内皮腫;カポジ肉腫;悪性血管周囲細胞腫;リンパ管肉腫;骨肉腫;傍骨性骨肉腫;軟骨肉腫;悪性軟骨芽細胞腫;間葉系軟骨肉腫;骨の巨細胞腫;ユーイング肉腫;悪性歯原性腫瘍;エナメル上皮歯牙肉腫;悪性エナメル上皮腫;エナメル上皮線維肉腫;悪性松果体腫;脊索腫;悪性神経膠腫;上衣腫;星細胞腫;原形質性星細胞腫;線維性星細胞腫;星芽腫;神経膠芽腫;乏突起;乏突起膠芽腫;原始神経外胚葉;小脳肉腫;神経節;神経芽細胞腫;網膜芽細胞腫;嗅覚神経原性腫瘍;悪性髄膜腫;神経線維肉腫;悪性神経鞘腫;悪性顆粒細胞腫瘍;悪性リンパ腫(細網細胞肉腫);ホジキン病;ホジキン;側肉芽腫;悪性小リンパ球性リンパ腫;悪性びまん性大細胞型リンパ腫;悪性濾胞性リンパ腫;菌状息肉症;他の特定の非ホジキンリンパ腫;悪性組織球症;多発性骨髄腫;マスト細胞肉腫;免疫増殖性小腸疾患;白血病;リンパ性白血病;形質細胞白血病;赤白血病;リンパ肉腫細胞白血病;骨髄性白血病;好塩基球性白血病;好酸球性白血病;単球性白血病;マスト細胞白血病;巨核芽球性白血病;顆粒球肉腫;ヘアリー細胞白血病;粘液腫;横紋筋腫;線維腫;頭頸部の扁平上皮癌;喉頭および下咽頭がん;鼻腔および副鼻腔がん;鼻咽頭がん;唾液腺がん;口腔;中咽頭(orppharyngeal)がん;気管支原性癌(扁平上皮、未分化型小細胞、未分化型大細胞、腺癌、非小細胞肺がん);肺胞(細気管支)癌;気管支腺腫;軟骨性過誤腫;結腸直腸がん;消化管間質腫瘍;カルチノイド;ターコット症候群;胃がん;食道胃接合部腺癌;膵(腺管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ);小腸(腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ(Karposi)肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫);大腸(腺癌、管状アデノーマ、絨毛アデノーマ、過誤腫、平滑筋腫);転移性乳がん;腺管癌in situ;浸潤性腺管癌;管状癌;粘液性癌;小葉癌in situ;三種陰性乳がん;膀胱および尿道(扁平上皮癌、移行細胞癌、腺癌、尿路上皮癌);明細胞癌;ヘパトーマ(肝細胞癌);血管肉腫;肝細胞アデノーマ;血管腫;骨原性肉腫(骨肉腫);悪性線維性組織球腫;悪性巨細胞腫瘍脊索腫;骨軟骨腫(osteochrondroma)(骨軟外骨腫(osteocartilaginous exostoses));良性軟骨腫;軟骨粘液線維腫(chondromyxofibroma);類骨腫;巨細胞腫瘍;髄様甲状腺がん;分化型甲状腺がん;乳頭状甲状腺がん;濾胞性甲状腺がん;ハースル細胞がん;退形成甲状腺がん;頭蓋(骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎);髄膜(髄膜腫、髄膜肉腫(meningiosarcoma)、神経膠腫症);脊髄(神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫);子宮(明細胞(clear));子宮頸部(子宮頸部癌、前(pre)腫瘍子宮頸部異形成);卵巣(卵巣癌[漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、未分類癌]、顆粒膜包膜細胞腫瘍、セルトリ・ライディッヒ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、悪性テラトーマ);外陰部(扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫);腟(明細胞癌、扁平上皮癌);ブドウ状肉腫(胎児性横紋筋肉腫);ファロピウス管(癌);非ホジキンリンパ腫[悪性リンパ腫];カポジ(Karposi)肉腫;異形成母斑黒子(moles dysplastic nevi);血管腫;皮膚線維腫;ケロイド;乾癬;神経芽細胞腫;副腎皮質癌;褐色細胞腫;傍神経節腫;メルケル細胞癌;膵神経内分泌およびカルチノイド腫瘍;神経内分泌腫瘍;カルチノイド腫瘍;膵がん;胃食道;腎明細胞癌;ならびに原発性腹膜がんでありうる。
本開示の抗体は、例えば、がん、自己免疫、移植拒絶反応、外傷後の免疫応答、移植片対宿主病、虚血、脳卒中、および感染症の処置のために(例えば、HIVのgp120などのウイルス抗原を標的とすることにより)、それ自体または医薬組成物の形態で、対象に投与することができる。
別の態様では、本明細書に記載されているROR結合分子(例えば、抗体)は、1つまたは複数の追加的な治療と組み合わせて、がんを有する対象を処置する方法において使用することができる。本明細書に記載されているROR抗原結合分子(例えば、抗体)と組み合わせて使用することができる追加的な治療としては、(i)外科手術;(ii)放射線療法;(iii)内分泌療法;(iv)免疫療法(CAR T細胞療法など、アジュバント療法および細胞療法を含む);ならびに(v)細胞傷害剤および化学療法剤を含む化学療法が挙げられるがこれらに限定されない。
がんに対する活性を有するいずれかの治療法は、本明細書に提供されるROR抗原結合分子(例えば、抗体)と組み合わせて使用することができる。がん処置のためのこのような薬剤の例は、例えば、https://www.cancer.gov/about−cancer/treatment/drugs(最終アクセス2019年1月22日)、およびCancer Principles and Practice of Oncology by V. T. Devita and S. Hellman (editors), 11th edition (2018), Lippincott Williams & Wilkins Publishersなどの公開ソースに見出すことができる。当業者であれば、薬物の特定の特徴および関与するがんの型に基づき、薬剤のいずれの組合せが有用となるか識別することができよう。
ある特定の実施形態では、追加的な治療は、例えば、ガンマ線照射、中性子ビーム放射線療法、電子ビーム放射線療法、陽子線療法、ブラキセラピーおよび全身性放射性同位元素を含む放射線療法である。放射線療法は、照射、または放射性医薬品の関連する投与を含むことができる。線源は、処置されている対象の外部または内部のいずれかとなることができる(照射処置は、例えば、外照射療法(EBRT)またはブラキセラピー(BT)の形態となることができる)。例示的な放射性元素は、例えば、ラジウム、セシウム−137、イリジウム−192、アメリシウム−241、金−198、コバルト−57、銅−67、テクネチウム−99、ヨウ素−123、ヨウ素−131およびインジウム−111を含む。
ある特定の実施形態では、追加的な治療は、免疫療法である。免疫療法(生体応答修飾物質療法、生物学的療法、生物療法、免疫治療または生物学治療とも呼ばれる)は、疾患と戦うために免疫系の一部を使用する処置である。免疫療法は、免疫系ががん細胞を認識するのを助けることができる、またはがん細胞に対する応答を増強することができる。免疫療法は、能動および受動免疫療法を含む。免疫療法剤を含む能動免疫療法は、身体自身の免疫系を刺激する(例えば、ワクチン)一方、免疫療法剤を含む受動免疫療法は一般に、身体の外側で作成された免疫系成分(例えば、抗体)、薬物、毒素または放射性核種とコンジュゲートされた抗体、および標的化治療薬を使用する。
例示的な免疫療法剤は、免疫チェックポイント阻害剤を含む。一部の実施形態では、処置方法において使用される免疫チェックポイント阻害剤は、T細胞活性化または機能を調節する1つまたは複数のチェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に低減させる、これを阻害する、これに干渉するまたはこれを調節することができる。CTLA−4とそのリガンドCD80およびCD86;ならびにPD−1とそのリガンドPD−LlおよびPD−L2など、多数のチェックポイントタンパク質が公知である(Pardoll, Nature Reviews Cancer, 2012, 12, 252−264)。免疫チェックポイント阻害剤は、抗体を含む、または抗体に由来する。
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、OX40(CD134)アゴニストである。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗OX40抗体である。一部の実施形態では、抗OX40抗体は、抗OX−40である。一部の実施形態では、抗OX40抗体は、MEDI6469である。
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、CD40アゴニストである。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗CD40抗体である。一部の実施形態では、抗CD40抗体は、CF−870,893である。
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、CTLA−4阻害剤である。一部の実施形態では、CTLA−4阻害剤は、抗CTLA−4抗体である。抗CTLA4抗体の例としては、米国特許第5,811,097号;同第5,811,097号;同第5,855,887号;同第6,051,227号;同第6,207,157号;同第6,682,736号;同第6,984,720号;および同第7,605,238号に記載されているものが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、抗CTLA−4抗体は、トレメリムマブ(チシリムマブ(ticilimumab)またはCP−675,206としても公知)である。一部の実施形態では、抗CTLA−4抗体は、イピリムマブ(MDX−010またはMDX−101としても公知)である。イピリムマブは、CTLA−4に結合する完全にヒトモノクローナルIgG抗体である。イピリムマブは、Yervoy(商標)の商品名で市販されている。
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、PD−1/PD−L1阻害剤である。PD−l/PD−L1阻害剤の例としては、米国特許第7,488,802号;同第7,943,743号;同第8,008,449号;同第8,168,757号;同第8,217,149号、ならびにPCT特許出願公開番号WO2003042402、WO2008156712、WO2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400およびWO2011161699に記載されているものが挙げられるがこれらに限定されない。
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、PD−1阻害剤である。一部の実施形態では、PD−1阻害剤は、抗PD−1抗体である。一部の実施形態では、抗PD−1抗体は、BGB−A317、ニボルマブ(ONO−4538、BMS−936558またはMDX1106としても公知)またはペンブロリズマブ(MK−3475、SCH900475またはランブロリズマブとしても公知)である。一部の実施形態では、抗PD−1抗体は、ニボルマブである。ニボルマブは、ヒトIgG4 抗PD−1モノクローナル抗体であり、Opdivo(商標)の商品名で市販されている。一部の実施形態では、抗PD−1抗体は、ペンブロリズマブである。ペンブロリズマブは、ヒト化モノクローナルIgG4抗体であり、Keytruda(商標)の商品名で市販されている。一部の実施形態では、抗PD−1抗体は、ヒト化抗体であるCT−011である。単独で投与されたCT−011は、再発時に急性骨髄球性白血病(AML)の処置において応答を示すことができなかった。一部の実施形態では、抗PD−1抗体は、融合タンパク質であるAMP−224である。一部の実施形態では、PD−1抗体は、BGB−A317である。BGB−A317は、Fcガンマ受容体Iに結合する能力が排除されるように特異的に操作されたモノクローナル抗体であり、高い親和性および優れた標的特異性でのPD−1に対する特有の結合シグネチャーを有する。
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、PD−L1阻害剤である。一実施形態では、PD−L1阻害剤は、抗PD−L1抗体である。一部の実施形態では、抗PD−L1抗体は、MEDI4736(デュルバルマブ)である。一部の実施形態では、抗PD−L1抗体は、BMS−936559(MDX−1105−01としても公知)である。一部の実施形態では、PD−L1阻害剤は、アテゾリズマブ(MPDL3280AおよびTecentriq(登録商標)としても公知)である。
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、PD−L2阻害剤である。一部の実施形態では、PD−L2阻害剤は、抗PD−L2抗体である。一部の実施形態では、抗PD−L2抗体は、rHIgM12B7Aである。
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、リンパ球活性化遺伝子−3(LAG−3)阻害剤である。一部の実施形態では、LAG−3阻害剤は、可溶性Ig融合タンパク質であるIMP321である(Brignone et al., J. Immunol., 2007, 179, 4202−4211)。一部の実施形態では、LAG−3阻害剤は、BMS−986016である。
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、B7阻害剤である。一部の実施形態では、B7阻害剤は、B7−H3阻害剤またはB7−H4阻害剤である。一部の実施形態では、B7−H3阻害剤は、抗B7−H3抗体であるMGA271である(Loo et al., Clin. Cancer Res., 2012, 3834)。
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、TIM3(T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン3)阻害剤である(Fourcade et al., J. Exp. Med., 2010, 207, 2175−86;Sakuishi et al., J. Exp. Med., 2010, 207, 2187−94)。
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、GITRアゴニストである。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗GITR抗体である。一部の実施形態では、抗GITR抗体は、TRX518である。
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、CD137アゴニストである。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗CD137抗体である。一部の実施形態では、抗CD137抗体は、ウレルマブである。一部の実施形態では、抗CD137抗体は、PF−05082566である。
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、組換えヒトインターロイキン−15(rhIL−15)である。
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、IDO阻害剤である。一部の実施形態では、IDO阻害剤は、INCB024360である。一部の実施形態では、IDO阻害剤は、インドキシモド(indoximod)である。
他の例示的な免疫療法は、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキンまたはリンホカインなどの免疫療法剤を含むアジュバント療法を含む。例としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、マクロファージ炎症性タンパク質(MIP)−1−アルファ、インターロイキン(IL−1、IL−2、IL−4、IL−6、IL−7、IL−12、IL−15、IL−18、IL−21およびIL−27を含む)、腫瘍壊死因子(TNF−アルファを含む)およびインターフェロン(IFN−アルファ、IFN−ベータおよびIFN−ガンマを含む)などのサイトカイン;水酸化アルミニウム(アラム(alum));カルメット・ゲラン桿菌(BCG);キーホールリンペットヘモシアニン(KLH);不完全フロイントアジュバント(IFA);QS−21;DETOX;レバミソール;ならびにジニトロフェニル(DNP)、ならびに例えば、インターロイキン、例えば、IL−2と、IFN−アルファなどの他のサイトカインの組合せなどのこれらの組合せが挙げられる。
他の例示的な免疫療法は、細胞療法、例えば、目的の抗原に結合する受容体を含む(例えば、これを発現する)白血球(有核白血球細胞)などの免疫細胞の集団を含む。本開示の白血球は、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球または単球となることができる。一部の実施形態では、白血球は、リンパ球である。リンパ球の例としては、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞またはNKT細胞が挙げられる。一部の実施形態では、T細胞は、CD4+Th(Tヘルパー)細胞、CD8+細胞傷害性T細胞、γδT細胞または調節性(サプレッサー)T細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、樹状細胞である。一部の実施形態では、細胞療法は、CAR−T細胞療法である。一部の実施形態では、二特異性CARは、単一のトランスジェニック受容体においてタンデムで存在する2つの別個の抗原認識ドメインで構成される(TanCARと称される;例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるGrada Z et al. Molecular Therapy Nucleic Acids 2013; 2:e105を参照)。よって、方法は、一部の実施形態では、ROR抗原結合分子(例えば、抗体)および免疫療法剤を含む組合せを腫瘍に送達するステップであって、免疫療法剤が、抗原をコードする操作された核酸であるステップを含む、または自己抗原の発現を誘導する操作された核酸を腫瘍に送達するステップと、2つの抗原に結合する二特異性CARを発現する免疫細胞を腫瘍に送達するステップであって、2つの抗原のうち1つが、操作された核酸によってコードされる、ステップとを含む。
他の例示的な免疫療法は、がん抗原に対する対象における免疫応答の誘発(illicit)に使用することができる、がんワクチンなどの免疫療法剤を含む。例示的な方法は、ROR抗原結合分子(例えば、抗体)の投与と組み合わせて、同じ組成物において、または同時に投与されるもしくは逐次に投薬される別々の組成物のいずれかにおいて、少なくとも1つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドを含むRNAワクチンを対象に投与し、これにより、対象において、抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を誘導するステップが関与し、がんに対する伝統的ワクチンの予防的有効用量をワクチン接種した対象における抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比べて、対象における抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後に増加される。
ある特定の実施形態では、追加的な治療は、1つもしくは複数の細胞傷害剤または1つもしくは複数の化学療法剤などの化学療法を含む。細胞傷害剤は、細胞機能を阻害もしくは防止することができる、および/または細胞の死もしくは破壊を引き起こす。細胞傷害剤としては、放射性同位元素(例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、およびLuの放射性同位元素);化学療法剤;成長阻害性薬剤;核酸分解酵素などの酵素およびその断片;ならびにその断片および/またはバリアントを含む、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素活性がある毒素などの毒素が挙げられるがこれらに限定されない。
ある特定の実施形態では、追加的な治療は、1つまたは複数の化学療法剤を含む。化学療法剤は、がんの処置において有用な化合物を含む。化学療法剤は、(i)抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーターなど、腫瘍におけるホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤;(ii)副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤;(iii)抗アンドロゲン薬;(iv)タンパク質キナーゼ阻害剤;(v)脂質キナーゼ阻害剤;(vi)異常細胞増殖に関係付けられるシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するものを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド;(viii)遺伝子療法ワクチンなどのワクチンを含む。化学療法剤は、抗体を含むこともできる。
例示的なキナーゼ阻害剤は、エルロチニブ(Tarceva(登録商標))、ゲフィチニブ(Iressa(登録商標))、ダサチニブ(Sprycel(登録商標))、ニロチニブ(Tasigna(登録商標))、クリゾチニブ(Xalkori(登録商標))、ルキソリチニブ(Jakafi(登録商標))、ベムラフェニブ(Zelboraf(登録商標))、バンデタニブ(Caprelsa(登録商標))、パゾパニブ(Votrient(登録商標))、アファチニブ、アリセルチブ、アムバチニブ(amuvatinib)、アキシチニブ、バリシチニブ、ボスチニブ、ブリバニブ、カネルチニブ、カボザンチニブ(Cabometyx(登録商標))、セジラニブ、セリチニブ、クレノラニブ、ダブラフェニブ、ダコミチニブ、ダヌセルチブ(danusertib)、ドビチニブ、フォレチニブ(foretinib)、ガネテスピブ(ganetespib)、イブルチニブ、イデラリシブ、イマチニブ、イニパリブ、ラパチニブ、レンバチニブ、リニファニブ、リンシチニブ(linsitinib)、マシチニブ(masitinib)、モメロチニブ、モテサニブ、ネラチニブ、ニンテダニブ、ニラパリブ、オプロゾミブ(oprozomib)、オラパリブ、パルボシクリブ、ピクチリシブ、ピルフェニドン、ポナチニブ、キザルチニブ、レゴラフェニブ、リゴサチブ、ルカパリブ、サラカチニブ(saracatinib)、サリデジブ(saridegib)、ソラフェニブ、スニチニブ、タンズチニブ(tandutinib)、タソシチニブ(tasocitinib)、テラチニブ(telatinib)、チバンチニブ、チボザニブ、トファシチニブ、トラメチニブ、ベリパリブ、ビスモデギブ、ボラセルチブ、コビメチニブ(Cotellic(登録商標))、XL−147、XL−765、XL−499、XL−880、およびその他を含む。一部の実施形態では、ROR抗原結合分子(例えば、抗体)は、がんの処置のために、HSP90阻害剤(例えば、XL888)、肝臓X受容体(LXR)モジュレーター、レチノイド関連オーファン受容体ガンマ(RORy)モジュレーター、CK1阻害剤(inhbitor)、CK1−α阻害剤、Wnt経路阻害剤(例えば、SST−215)またはミネラロコルチコイド受容体阻害剤(例えば、エサキセレノンまたはXL−550)と組み合わせて使用することができる。
キナーゼ阻害剤は、EGFR阻害剤などのチロシンキナーゼ阻害剤;ムブリトニブ(Mubritonib)(TAK165、Takeda)などの小分子HER2チロシンキナーゼ阻害剤;CP−724.714(Axon Medchem BV、ErbB2受容体チロシンキナーゼの経口選択的阻害剤);EGFRに優先的に結合するが、HER2およびEGFR過剰発現細胞の両方を阻害するEKB−569(Wyethから入手可)などのデュアルHER阻害剤;ラパチニブ(GSK572016;Glaxo−SmithKlineから入手可)、経口HER2およびEGFRチロシンキナーゼ阻害剤;PKI−166(Novartisから入手可);カネルチニブ(CI−1033;Pharmacia)などの汎(pan)HER阻害剤;Raf−1シグナル伝達を阻害する、ISIS Pharmaceuticalsから入手可なアンチセンス剤ISIS−5132などのRaf−1阻害剤;イマチニブメシル酸塩(GLEEVEC(登録商標)、Glaxo SmithKlineから入手可)などの非HER標的化TK阻害剤;スニチニブ(SUTENT(登録商標)、Pfizerから入手可)などの多重標的化チロシンキナーゼ阻害剤;バタラニブ(PTK787/ZK222584、Novartis/Schering AGから入手可)などのVEGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤;MAPK細胞外調節キナーゼ1阻害剤CI−1040(Pharmaciaから入手可);PD 153035,4−(3−クロロアニリノ)キナゾリンなどのキナゾリン;ピリドピリミジン;ピリミドピリミジン;CGP 59326、CGP 60261およびCGP 62706などのピロロピリミジン;ピラゾロピリミジン、4−(フェニルアミノ)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン;クルクミン(ジフェルロイルメタン,4,5−ビス(4−フルオロアニリノ)フタルイミド);ニトロチオフェン部分を含有するチロホスチン;アンチセンス分子(例えば、HERコード核酸に結合するアンチセンス分子);キノキサリン(米国特許第5,804,396号);チロホスチン(tryphostin)(米国特許第5,804,396号);Affinitac(ISIS 3521;Isis/Lilly);PKI166(Novartis);セマキシニブ(Pfizer);INC−1C11(Imclone)、ラパマイシン(シロリムス、RAPAMUNE(登録商標));または次の特許公開のいずれかに記載されているもの:米国特許第5,804,396号;WO1999/09016(American Cyanamid);WO1998/43960(American Cyanamid);WO1997/38983(Warner Lambert);WO1999/06378(Warner Lambert);WO1999/06396(Warner Lambert);WO1996/30347(Pfizer, Inc);WO1996/33978(Zeneca);WO1996/3397(Zeneca)およびWO1996/33980(Zeneca)となることができる。
本明細書に提供されるROR抗原結合分子(例えば、抗体)および治療剤などの追加的な治療による併用処置は、いずれかの順序での、同時、別々または逐次のものとなることができる。ROR抗原結合提供分子などの治療剤、および免疫療法剤または化学療法剤などの別の治療剤の組合せ、同時投与のため、治療剤は、適宜、1つの組成物または別々の組成物として投与することができる。
6.13.
以下の実施例は、例示として提供されるものであり、限定するものではない。
6.13.1.方法
様々な抗原結合タンパク質の精製のための非限定的な説明目的の方法、および様々なアッセイにおけるそれらの使用は、下により詳細に記載されている。
6.13.1.1.Expi293発現
製造業者の使用説明書に従ってExpi293一過性トランスフェクション系を使用して、検査されている様々な抗原結合タンパク質を発現させた。簡潔に説明すると、4つの個々の鎖をコードする4つのプラスミドを、他に記述がなければ1:1:1:1質量比で混合し、ExpiFectamine 293トランスフェクションキットを用いてExpi 293細胞へとトランスフェクトした。細胞を37℃で、8%CO2、100%湿度にて、125rpmで振盪しつつ培養した。トランスフェクトした細胞に、トランスフェクションの16〜18時間後に1回栄養供給した。2000gで10分間の遠心分離により、5日目に細胞を回収した。親和性クロマトグラフィ精製のために上清を収集した。
6.13.1.2.プロテインAおよび抗CH1精製
様々な抗原結合タンパク質を含有する清澄化された上清を、AKTA Purifier FPLCにおいてプロテインA(ProtA)樹脂または抗CH1樹脂のいずれかを使用して分離した。直接(head−to−head)比較が行われた例において、様々な抗原結合タンパク質を含有する上清を、2つの等しい試料へと分割した。ProtA精製のため、1mLプロテインAカラム(GE Healthcare)をPBS(5mMリン酸ナトリウム・リン酸カリウム(sodium potassium phosphate)pH7.4、150mM塩化ナトリウム)で平衡化した。5ml/分にて試料をカラムにロードした。0.1M酢酸pH4.0を使用して試料を溶出した。280nmの吸光度により溶出をモニターし、解析のために溶出ピークをプールした。抗CH1精製のため、1mL CaptureSelect(商標)XLカラム(ThermoFisher)をPBSで平衡化した。5ml/分にて試料をカラムにロードした。0.1M酢酸pH4.0を使用して試料を溶出した。280nmの吸光度により溶出をモニターし、解析のために溶出ピークをプールした。
6.13.1.3.SDS−Page解析
様々な分離された抗原結合タンパク質を含有する試料は、完全産物、不完全産物の存在および全体的な純度に関して、還元および非還元SDS−PAGEにより解析した。2μgの各試料を、15μL SDSローディング緩衝剤に添加した。還元試料は、10mM還元剤の存在下で75℃にて10分間インキュベートした。非還元試料は、還元剤なしで95℃にて5分間インキュベートした。還元および非還元試料を、ランニング緩衝剤により4〜15%勾配TGXゲル(BioRad)にロードし、30分間250ボルトでランを行った。ランの完了後に、ゲルをDI水で洗浄し、GelCode Blue Safe Protein Stain(ThermoFisher)を使用して染色した。解析に先立ちゲルをDI水で脱染した。脱染したゲルのスキャンした画像のデンシトメトリー解析を、標準画像解析ソフトウェアを使用して行って、各試料におけるバンドの相対的存在量を計算した。
6.13.1.4.IEXクロマトグラフィ
様々な分離された抗原結合タンパク質を含有する試料は、完全産物の不完全産物および不純物に対する比に関して陽イオン交換クロマトグラフィにより解析した。清澄化された上清は、AKTA Purifier FPLCにおける5ml MonoS(GE Lifesciences)により解析した。MonoSカラムを緩衝剤A、10mM MES、pH6.0で平衡化した。2ml/分にて試料をカラムにロードした。6CVにわたる緩衝剤B(10mM MES、pH6.0、1M塩化ナトリウム)による0〜30%勾配を使用して試料を溶出した。280nmの吸光度により溶出をモニターし、ピーク積分により試料の純度を計算して、単量体ピークおよび夾雑物ピークの存在量を同定した。単量体ピークおよび夾雑物ピークは、上述のSDS−PAGEによる解析のために別々にプールした。
6.13.1.5.分析的SECクロマトグラフィ
様々な分離された抗原結合タンパク質を含有する試料は、単量体の高分子量産物および不純物に対する比に関して分析的サイズ排除クロマトグラフィにより解析した。清澄化された上清は、Agilent 1100 HPLCにおける業界標準TSK G3000SWxlカラム(Tosoh Bioscience)により解析した。TSKカラムをPBSで平衡化した。1mg/mLの各試料25μLを、1ml/分にてカラムにロードした。1.5CVのPBSの均一濃度の流れを使用して試料を溶出した。280nmの吸光度により溶出をモニターし、ピーク積分により溶出ピークを解析した。
6.13.1.6.質量分析
様々な分離された抗原結合タンパク質を含有する試料を、質量分析により解析して、分子量により正確な種を確認した。全解析は、第三者研究機関により行われた。簡潔に説明すると、試料は、酵素のカクテルで処置して、グリコシル化を除去した。試料は両者共に還元フォーマットで検査して、分子量により各鎖を特異的に同定した。試料は全て、非還元条件下で検査して、試料における全ての複合体の分子量を同定した。質量スペクトル解析を使用して、分子量に基づき特有の産物の数を同定した。
6.13.1.7.ファージディスプレイによる抗体発見
ヒトFabライブラリのファージディスプレイは、標準プロトコールを使用して実行した。ヒトROR1およびROR2タンパク質のビオチン化細胞外ドメインは、Acro Biosystemsから購入し、EZ−Link NHSビオチン(Thermo Scientificカタログ番号20217)でビオチン化した。標準プロトコールを使用したファージELISAにより、ROR1(Acroカタログ番号RO1−H522y)およびROR2(Acroカタログ番号RO2−H52E5)の細胞外ドメインに結合する能力に関してファージクローンをスクリーニングした。簡潔に説明すると、ファージにおける複製および発現が可能な発現ベクター(ファージミドとも称される)を使用して、Fabフォーマットされたファージライブラリを構築した。重鎖および軽鎖の両方が、同じ発現ベクターにおいてコードされており、重鎖は、ファージコートタンパク質pIIIのトランケートバリアントに融合された。軽鎖および重鎖−pIII融合体は、別々のポリペプチドとして発現され、細菌周辺質においてアセンブルし、そこで、レドックス潜在力が、ジスルフィド結合形成を可能にして、候補ABSを含有するファージディスプレイ抗体を形成する。
特定のヒト重鎖可変ドメイン(VH3−23)および特定のヒト軽鎖可変ドメイン(Vk−1)に由来する配列を使用して、ライブラリを作成した。スクリーニングされたライブラリ内の軽鎖可変ドメインは、VL CDR3(L3)に多様性を導入しつつ生成し、軽鎖VL CDR1(L1)およびCDR2(L2)は、ヒト生殖系列配列のままであった。スクリーニングされたライブラリに関して、VHドメインの全3種のCDRは、ヒト抗体レパートリーに見出されるCDRの長さによる位置的アミノ酸頻度にマッチするように多様化された。ライブラリにおいて使用されるファージディスプレイ重鎖(配列番号74)および軽鎖(配列番号75)足場は、下に収載されており、それによると、小文字「x」は、ライブラリを作成するために変動されたCDRアミノ酸を表し、太字イタリック体は、一定であったCDR配列を表す。
その全体が参照により本明細書に組み込まれるKunkel, TA (PNAS January 1, 1985. 82 (2) 488−492)により詳細に記載されている通り、天然抗体レパートリーに見出される多様性を模倣するようにVL CDR3ならびにVH CDR1(H1)、CDR2(H2)およびCDR3(H3)に多様性を導入するためにプライマーを使用したKunkel変異誘発により、多様性を作成した。簡潔に説明すると、標準手順を使用して、単離されたファージから一本鎖DNAを調製し、Kunkel変異誘発を実行した。次に、化学合成されたDNAを電気穿孔してTG1細胞に入れ、続いて回収した。回収された細胞を継代培養し、M13K07ヘルパーファージに感染させて、ファージライブラリを産生した。
標準手順を使用してファージパニングを行った。簡潔に説明すると、ファージパニングの第1のラウンドは、PBST−2%BSAにおける1mLの体積で、調製されたライブラリ由来の約5×1012個のファージに晒した、ストレプトアビジン磁気ビーズに固定化された標的により行った。1時間インキュベーション後に、ビーズに結合したファージを、磁気スタンドを使用して上清から分離した。ビーズを3回洗浄して、非特異的に結合したファージを除去し、次いでこれを、OD600約0.6のER2738細胞(5mL)に添加した。20分後に、感染した細胞を、25mL 2×YT+アンピシリンおよびM13K07ヘルパーファージにおいて継代培養し、激しく振盪しつつ一晩37℃で育成した。翌日、PEG沈殿による標準手順を使用してファージを調製した。SAVコーティングされたビーズに特異的なファージのプレクリアランス(Pre−clearance)をパニングに先立ち行った。標準手順を使用した100nMビーズ固定化抗原によるKingFisher磁気ビーズハンドラーを使用して、パニングの第2のラウンドを行った。総計して、3〜4ラウンドのファージパニングを行って、標的抗原に特異的なFabをディスプレイするファージを濃縮した。標的特異的濃縮は、ポリクローナルおよびモノクローナルファージELISAを使用して確認した。DNA配列決定を使用して、候補ABSを含有する単離されたFabクローンを決定した。
ROR結合剤発見キャンペーンにおいて結合親和性を測定するために、上述のファージスクリーニングにおいて同定されたVLおよびVHドメインを、二価単一特異性ネイティブヒト全長IgG1アーキテクチャへとフォーマットし、Octet(Pall ForteBio)バイオレイヤー(biolayer)干渉計におけるバイオセンサーに固定化した。次に、ROR1(Acroカタログ番号RO1−H522y)およびROR2(Acroカタログ番号RO2−H52E5)の細胞外ドメイン、ならびに個々のROR1 Frizzled(Acroカタログ番号RO1−H5222)、Ig様(Acroカタログ番号RO1−H5221)およびKringle(Acroカタログ番号RO1−H5223)ドメインを含む可溶性ROR抗原を系に添加し、結合を測定した。
B−bodyフォーマットを使用して行われる実験のため、下に示す通り、また、図3を参照する通り、個々のクローンのVL可変領域を二価1×1 B−body「BC1」足場のドメインAおよび/またはHへとフォーマットし、VH領域をそのドメインFおよび/またはLへとフォーマットした。
「BC1」足場:
第1のポリペプチド鎖(配列番号78)
ドメインA=抗原1 B−bodyドメインA/H足場(配列番号76)
ドメインB=CH3(T366K;445K、446S、447Cトリペプチド挿入)
ドメインD=CH2
ドメインE=CH3(T366W、S354C)
第2のポリペプチド鎖(配列番号79):
ドメインF=抗原1 B−bodyドメインF/L足場(配列番号77)
ドメインG=CH3(L351D;445G、446E、447Cトリペプチド挿入)
第3のポリペプチド鎖(配列番号80):
ドメインH=抗原2 B−bodyドメインA/H足場(配列番号76)
ドメインI=CL(カッパ)
ドメインJ=CH2
ドメインK=CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
第4のポリペプチド鎖(配列番号81):
ドメインL=抗原2 B−bodyドメインF/L足場(配列番号77)
ドメインM=CH1。
抗CD3 SP34−89を有する二価二特異性1×1フォーマットへとフォーマットされたROR ABS候補のため、ドメインHは、配列番号69のアミノ酸配列を有し、ドメインLは、配列番号68のアミノ酸配列を有する一方、ドメインAは、候補ROR VL配列を有し、ドメインFは、候補ROR VH配列を有する。
BC1 1×2フォーマットのため、図26を参照するセクション6.3.17.4に記載されている1(A)×2(B−A)フォーマットへと可変ドメインをフォーマットした。図26は、本明細書に記載されている三価1×2抗体構築物のためのそれぞれの命名規則により、5つのポリペプチド鎖およびそれらのドメインの概略図を提示し、命名規則に従って、鎖5は、概略図において「第6のポリペプチド鎖」と命名されている。他に指定がなければ、ROR抗原結合部位(ABS)は、二価結合剤(「A」特異性)であり、CD3は、一価結合剤(「B」特異性)である。SP34−89 1×2鎖3足場は、配列番号82の配列を有し、ドメインSとドメインHとの間のジャンクションは、他に記述がなければ、配列TASSGGSSSG(配列番号83)を有する10アミノ酸リンカーである。ポリペプチド鎖2および鎖5は、1(A)×2(B−A)フォーマットにおいて同一である(例えば、図26を参照、命名規則に従って、鎖5は、この概略図において「第6のポリペプチド鎖」と命名される)。
6.13.1.8.NFκB GFP Jurkat T細胞刺激アッセイ
NFκB/Jurkat/GFP転写レポーター細胞系は、System Biosciences(Cat#TR850−1)から購入した。同時刺激に使用された抗CD28抗体は、BD Pharmingen(Cat 555725)から購入した。溶液Cバックグラウンド抑制色素は、Life Technologies(K1037)から購入した。簡潔に説明すると、96ウェルの黒色の壁と透明な底のプレートにおいて、B−body(商標)抗体の希釈系列および1ug/mLの抗CD28抗体の存在下、Jurkat細胞(エフェクター細胞、E)を腫瘍細胞(T)と2:1〜4:1のE:T比で混合した。プレートを37℃/5%COで6時間インキュベートし、その後、溶液Cバックグラウンドサプレッサーの6×溶液をプレートに添加し、プレートリーダーにおいてGFP蛍光を読み出した。最大半量応答を生じる抗体の濃度を指すEC50値を、希釈系列から決定した。
6.13.1.9.初代T細胞細胞傷害性アッセイ
標的腫瘍抗原を発現する細胞(T)およびエフェクター細胞(E)を3:1〜10:1に及ぶE:T比で混合した。使用されたエフェクター細胞は、PBMCまたは単離された細胞傷害性CD8+T細胞を含む。候補の再び方向付けるT細胞抗体は、希釈系列で細胞に添加した。対照は、培地のみ対照、腫瘍細胞のみ対照、および無処置E:T細胞対照を含んだ。混合した細胞および対照条件を37℃/5%COで40〜50時間インキュベートした。Cytotoxicity Detection Kit Plus(LDH)は、Sigma(Cat 4744934001)から購入し、製造業者の指示に従った。簡潔に説明すると、腫瘍細胞に添加した溶解溶液は、100%細胞傷害性対照とし、無処置E:T細胞は、0%細胞傷害性対照とした。各試料における乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)のレベルは、490nmの吸光度により決定し、100%および0%対照に対して正規化した。最大半量応答を生じる抗体の濃度を指すEC50値を、希釈系列から決定した。
6.13.2.
(実施例1)
二価単一特異性構築物および二価の二重特異性構築物
TNFαを認識する二価単一特異性B−Bodyを、標準的な分子生物学的手法を使用して、以下の構成(VL(セルトリズマブ)−CH3(ノブ)−CH2−CH3/VH(セルトリズマブ)−CH3(ホール))で構築した。この構築物において、
第1のポリペプチド鎖(配列番号1)
ドメインA=VL(セルトリズマブ)
ドメインB=CH3(IgG1)(ノブ:S354C+T366W)
ドメインD=CH2(IgG1)
ドメインE=CH3(IgG1)
第2のポリペプチド鎖(配列番号2)
ドメインF=VH(セルトリズマブ)
ドメインG=CH3(IgG1)(ホール:Y349C、T366S、L368A、Y407V)
第3のポリペプチド鎖:
第1のポリペプチド鎖と同一
第4のポリペプチド鎖:
第2のポリペプチド鎖と同一。
ドメインおよびポリペプチド鎖の参照は、図3に従う。構築物の全体の構成を図4に示す。「(VL)」と略記して特定されているドメインAを有する第1のポリペプチド鎖の配列は、配列番号1で提供される。「(VH)」と略記して特定されているドメインFを有する第2のポリペプチド鎖の配列は、配列番号2で提供される。
全長構築物を、E.coli無細胞タンパク質合成発現系で、約18時間、26℃で穏やかに撹拌しながら発現させた。発現後、無細胞抽出物を遠心分離して、不溶性物質をペレット化し、上清を、10×カイネティックバッファー(Forte Bio)で2倍希釈して、バイオレイヤー干渉のための検体として使用した。
ビオチン化TNFαを、ストレプトアビジンセンサーに固定化し、約1.5nmのウェーブシフト応答に付した。10×カイネティックバッファーでベースラインを確立した後、センサーを、抗体構築物検体溶液中に浸漬した。構築物は、セルトリズマブの従来のIgGフォーマットに匹敵する約3nmの応答を与え、機能性の全長抗体へと組み立てられる二価単一特異性構築物の能力を実証した。結果を図5に示す。
本発明者らはまた、以下のドメイン構成を有する二価の二重特異性抗体を構築した:
第1のポリペプチド鎖:VL−CH3−CH2−CH3(ノブ)
第2のポリペプチド鎖:VH−CH3
第3のポリペプチド鎖:VL−CL−CH2−CH3(ホール)
第4のポリペプチド鎖 VH−CH1。
配列(可変領域配列を除く)を、配列番号3(第1のポリペプチド鎖)、配列番号4(第2のポリペプチド鎖)、配列番号5(第3のポリペプチド鎖)、配列番号6(第4のポリペプチド鎖)でそれぞれ示す。
6.13.3.
(実施例2)
二価の二重特異性B−Body「BC1」
本発明者らは、PD1および第2の抗原「抗原A」に特異的な「BC1」と称する二価の二重特異性構築物を構築した。「BC1」構成の顕著な特徴を、図6に示す。
さらに詳細に、図3に従ってドメインおよびポリペプチド鎖の参照を示し、天然の配列からの修飾を括弧内に示すと、構成は、以下の通りであった:
第1のポリペプチド鎖(配列番号8)
ドメインA=VL(「抗原A」)
ドメインB=CH3(T366K;445K、446S、447Cトリペプチド挿入)
ドメインD=CH2
ドメインE=CH3(T366W、S354C)
第2のポリペプチド鎖(配列番号9):
ドメインF=VH(「抗原A」)
ドメインG=CH3(L351D;445G、446E、447Cトリペプチド挿入)
第3のポリペプチド鎖(配列番号10):
ドメインH=VL(「Nivo」)
ドメインI=CL(カッパ)
ドメインJ=CH2
ドメインK=CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
第4のポリペプチド鎖(配列番号11):
ドメインL=VH(「Nivo」)
ドメインM=CH1。
Aドメイン(配列番号12)およびFドメイン(配列番号16)は、「抗原A」に特異的な抗原結合部位(A:F)を形成する。Hドメインは、ニボルマブ由来のVH配列を有し、Lドメインは、ニボルマブ由来のVL配列を有し;HおよびLは会合して、ヒトPD1に特異的な抗原結合部位(H:L)を形成する。
Bドメイン(配列番号13)は、いくつかの変異、つまりT366K、445K、446Sおよび447C挿入を有するヒトIgG1 CH3の配列を有する。T366K変異は、ドメインGにおけるL351D残基の電荷対コグネートである。ドメインBにおける「447C」残基は、C末端KSCトリペプチド挿入に由来するものである。
ドメインD(配列番号14)は、ヒトIgG1 CH2の配列を有する。
ドメインE(配列番号15)は、変異T366WおよびS354Cを有するヒトIgG1 CH3の配列を有する。366Wは、「ノブ」変異である。354Cは、ドメインKにおけるコグネート349C変異とジスルフィド結合を形成することができるシステインを導入する。
ドメインG(配列番号17)は、以下の変異:L351D、および445G、446E、447Cトリペプチド挿入を有する、ヒトIgG1 CH3の配列を有する。L351D変異は、ドメインB T366K変異に対する電荷対コグネートを導入する。ドメインGの「447C」残基は、C末端GECトリペプチド挿入に由来する。
ドメインI(配列番号19)は、ヒトCカッパ軽鎖(Cκ)の配列を有する。
ドメインJ[配列番号20]は、ヒトIgG1 CH2ドメインの配列を有し、ドメインDの配列と同一である。
ドメインK[配列番号21]は、以下の変化:Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 CH3の配列を有する。349C変異は、ドメインEのコグネート354C変異とジスルフィド結合を形成することができるシステインを導入する。356EおよびL358Mは、免疫原性を減少させるイソアロタイプアミノ酸を導入する。366S、368Aおよび407Vは、「ホール」変異である。
ドメインM[配列番号23]は、ヒトIgG1 CH1領域の配列を有する。
「BC1」は、哺乳動物発現を使用して100μg/mlを超える濃度で、高レベルで容易に発現することができる。
本発明者らは、二価の二重特異性「BC1」タンパク質が、ThermoFisherからのCH1特異的CaptureSelect(商標)親和性樹脂を使用して単一ステップで容易に精製することができることを見出した。
図7Aに示すように、SEC解析は、単一ステップのCH1親和性精製ステップにより、ゲル濾過を介して、>98%がモノマーである単一の単分散ピークが得られることを実証する。図7Bは、CrossMab二価抗体構築物のSEC解析の比較文献データを示す。
図8Aは、CaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の「BC1」の陽イオン交換クロマトグラフィ溶出プロファイルであって、単一のタイトなピークが示されている。図8Bは、標準的なプロテインA精製を使用して精製した後の「BC1」の陽イオン交換クロマトグラフィ溶出プロファイルであり、不完全な組み立て産物の同時精製と一致する追加的な溶出ピークを示す。
図9は、非還元条件下のSDS−PAGEゲルを示す。レーン3でみられるように、CH1親和性樹脂を用いた「BC1」の単一ステップの精製により、ほぼ均一な単一バンドが得られる。レーン4は、続いて陽イオン交換仕上げ工程で最小の追加的な精製を行ったものを示す。レーン7は、比較による、標準的なプロテインA精製を使用した軽度の精製を示し、レーン8〜10は、陽イオン交換クロマトグラフィを使用した、プロテインA精製物質のさらなる精製を示す。
図10は、非還元および還元条件下の両方での単一ステップのCH1−親和性精製後の「BC1」のSDS−PAGEゲル(パネルA)を、参照文献で公開されている非還元および還元条件下のCrossMab二重特異性抗体のSDS−PAGEゲル(パネルB)と比較した図である。
図11は、還元条件下の2つの別個の重鎖(図11A)、および2つの別個の軽鎖(図11B)を実証する「BC1」の質量分析の解析を示す。図12における質量分析データは、精製後の不完全対形成の非存在を確認する。
加速安定性試験を実行して、「BC1」B−Body設計の長期安定性を評価した。精製されたB−BodyをPBSバッファー中8.6mg/mlに濃縮して40℃でインキュベートした。構造的完全性をShodex KW−803カラムを備えた分析的サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)を使用して毎週測定した。構造的完全性を、凝集物の形成と関連させて、無傷のモノマーのパーセンテージ(%モノマー)を測定することによって決定した。データを図13に示す。IgG対照1は、良好な安定性特性を有する陽性対照である。IgG対照2は、インキュベーション条件下で凝集することが公知の陰性対照である。「BC1」B−Bodyは、分析的SECで決定されるように、構造的完全性を何ら失うことなく、8週間、インキュベートされた。
また、二価構築物のTMは約72℃であり、本発明者らは、「BC1」が高い耐熱性を有すると決定した。
表1は、重要な開発性特徴について、「BC1」とCrossMabとを比較する。
Figure 2021522162
*Schaefer et al. (Proc Natl Acad Sci USA. 2011 Jul 5;108(27):11187−92)からのデータ
6.13.4.
(実施例3)
二価の二重特異性B−Body「BC6」
本発明者らは、「BC6」と称する二価の二重特異性B−Bodyを構築した。「BC6」は、「BC1」と同様であるが、ドメインBの残基366およびドメインGの残基351で野生型残基を保持していることを除いてBC1と同一であった。したがって「BC6」は、「BC1」のドメインBとドメインGにおける正しい対形成を容易にするように設計された電荷対コグネートT366KおよびL351Dを欠く。「BC6」構成の顕著な特徴を図14に示す。
「BC1」に存在する電荷対残基の非存在にもかかわらず、CH1親和性樹脂を使用した「BC6」の単一ステップの精製は、高度に均質な試料をもたらすことが分かった。図15Aは、CaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂を使用したワンステップ精製後の「BC6」のSEC解析を示す。データは、単一のステップCH1親和性精製によって、「BC1」での観察と同様に、単一の単分散ピークが得られることを実証し、ポリペプチド鎖1とポリペプチド鎖2との間およびポリペプチド鎖3とポリペプチド鎖4との間のジスルフィド結合が無傷のままであることを実証する。またクロマトグラムは、非共有結合性の凝集物が存在しないことも示す。
図15Bは、非還元条件下のSDS−PAGEゲルを示し、レーン1は単一ステップのCH1親和性精製後の「BC6」の第1のロットをローディングしたものであり、レーン2は、単一ステップのCH1親和性精製後の「BC6」の第2のロットをローディングしたものである。レーン3および4は、CH1親和性精製に続けてイオン交換クロマトグラフィを用いて達成しうるさらなる精製を実証する。
6.13.5.
(実施例4)
二価の二重特異性B−Body「BC28」、「BC29」、「BC30」、「BC31」
本発明者らは、ドメインBおよびGのCH3境界内の操作されたジスルフィドを「BC1」および「BC6」に存在するC末端ジスルフィドに対する代替的S−S連結として有する二価1×1二重特異性B−Body「BC28」、「BC29」、「BC30」および「BC31」を構築した。文献は、CH3境界のジスルフィド結合が、Fc CH3ドメインの状況で直交性を行使するには不十分であることを示している。これらのB−Body構築物の全体の構成を図16に概略化し、「BC28」の顕著な特徴を下記に示す:
ポリペプチド鎖1:「BC28」鎖1(配列番号24)
ドメインA=VL(抗原「A」)
ドメインB=CH3(Y349C;445P、446G、447K挿入)
ドメインD=CH2
ドメインE=CH3(S354C、T366W)
ポリペプチド鎖2:「BC28」鎖2(配列番号25)
ドメインF=VH(抗原「A」)
ドメインG=CH3(S354C;445P、446G、447K挿入)
ポリペプチド鎖3:「BC1」鎖3(配列番号10)
ドメインH=VL(「Nivo」)
ドメインI=CL(カッパ)
ドメインJ=CH2
ドメインK=CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
ポリペプチド鎖4:「BC1」鎖4(配列番号11)
ドメインL=VH(「Nivo」)
ドメインM=CH1。
「BC28」A:F抗原結合部位は、「抗原A」に特異的である。「BC28」H:L抗原結合部位は、PD1(ニボルマブ配列)に特異的である。「BC28」ドメインBは、野生型CH3と比較して以下の変化:Y349C;445P、446G、447K挿入を有する。「BC28」ドメインEは、野生型CH3と比較して以下の変化:S354C、T366Wを有する。「BC28」ドメインGは、野生型と比較して以下の変化:S354C;445P、446G、447K挿入を有する。
したがって、「BC28」は、ドメインBの残基349Cに操作されたシステイン、およびドメインGの残基354Cに操作されたシステインを有する(「349C−354C」)。
「BC29」は、ドメインBの残基351CおよびドメインGの351Cに、操作されたシステインを有する(「351C−351C」)。「BC30」は、ドメインBの残基354CおよびドメインGの349Cに操作されたシステインを有する(「354C−349C」)。BC31は、残基394Cに操作されたシステイン、およびドメインGの394Cに操作されたシステイン(「394C−394C」)を有する。BC32は、ドメインBの残基407CおよびドメインGの407Cに操作されたシステインを有する(「407C−407C」)。
図17は、CaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の非還元条件下でのSDS−PAGE解析を示す。レーン1および3は、無傷の「BC28」(レーン1)および「BC30」(レーン3)の高レベルの発現および実質的な均一性を示す。レーン2は、BC29のオリゴマー化を示す。レーン4および5は、BC31およびBC32の乏しい発現をそれぞれ示し、BC32の連結が不十分であることを示す。別の構築物BC9(Genentechによって報告された、ドメインBの残基392およびドメインGの399に導入されたシステインを有し(「392C−399C」)、ジスルフィド対を形成する構築物)は、SDS PAGEでオリゴマー化を示した(データは示さず)。
図18は、CaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂を使用したワンステップ精製後の「BC28」および「BC30」のSEC解析を示す。さらに本発明者らは、「BC28」が、プロテインA樹脂を使用した単一ステップの精製を使用して容易に精製することができることを実証した(結果は示さず)。
6.13.6.
(実施例5)
二価の二重特異性B−Body「BC44」
図19は、本発明者らの現行の好ましい二価の二重特異性1×1構築物である二価の二重特異性1×1B−Body「BC44」の一般的構成を示す。
第1のポリペプチド鎖(「BC44」鎖1)(配列番号32)
ドメインA=VL(抗原「A」)
ドメインB=CH3(P343V;Y349C;445P、446G、447K挿入)
ドメインE=CH2
ドメインE=CH3(S354C、T366W)
第2のポリペプチド鎖(=「BC28」ポリペプチド鎖2)(配列番号25)
ドメインF=VH(抗原「A」)
ドメインG=CH3(S354C;445P、446G、447K挿入)
第3のポリペプチド鎖(=「BC1」ポリペプチド鎖3)(配列番号10)
ドメインH=VL(「Nivo」)
ドメインI=CL(カッパ)
ドメインJ=CH2
ドメインK=CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
第4のポリペプチド鎖(=「BC1」ポリペプチド鎖4)(配列番号11)
ドメインL=VH(「Nivo」)
ドメインM=CH1
6.13.7.
(実施例6)
可変−CH3ジャンクション操作
本発明者らは、ドメインAとBとの間のVL−CH3ジャンクション、ならびにドメインFとGとの間のVH−CH3ジャンクションを変異させた一連のバリアントを作製し、二価1×1 B−Body構築物の発現レベル、組み立て、および安定性を評価した。多くの解決策がありうるが、本発明者らは、T細胞エピトープの導入を減少させるために、VL、VHおよびCH3ドメイン内で天然に見出される残基のみを使用することを選択した。ドメイン構成の構造的評価は、好ましい配列組合せをさらに限定する。下記表2および表3は、「BC1」および他の二価構築物に基づくいくつかのジャンクションバリアントについてのジャンクションを示す。
Figure 2021522162
Figure 2021522162
図20は、40℃での加速安定性試験プロトコールにおける示された週数での「BC15」および「BC16」試料のサイズ排除クロマトグラフィを示す。「BC15」は安定なままであった;「BC16」は、経時的に不安定となることが分かった。
6.13.8.
(実施例7)
三価2×1二重特異性B−Body構築物(「BC1−2×1」)
本発明者らは、「BC1」に基づいて三価2×1二重特異性B−Body「BC1−2×1」を構築した。構成の顕著な特徴を図22に示す。
より詳細には、図21に要約されているドメインおよびポリペプチド鎖の参照を使用して、
第1のポリペプチド鎖
ドメインN=VL(「抗原A」)
ドメインO=CH3(T366K、447C)
ドメインA=VL(「抗原A」)
ドメインB=CH3(T366K、447C)
ドメインD=CH2
ドメインE=CH3(ノブ、354C)
第5のポリペプチド鎖(=「BC1」鎖2)
ドメインP=VH(「抗原A」)
ドメインQ=CH3(L351D、447C)
第2のポリペプチド鎖(=「BC1」鎖2)
ドメインF=VH(「抗原A」)
ドメインG=CH3(L351D、447C)
第3のポリペプチド鎖(=「BC1」鎖3)
ドメインH=VL(「Nivo」)
ドメインI=CL(カッパ)
ドメインJ=CH2
ドメインK=CH3(ホール、349C)
第4のポリペプチド鎖(=「BC1」鎖4)
ドメインL=VH(「Nivo」)
ドメインM=CH1
図23は、ThermoFisher Expi293一過性トランスフェクション系を使用して発現されたタンパク質の非還元SDS−PAGEを示す。
レーン1は、CaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の三価2×1「BC1−2×1」タンパク質の溶離液を示す。レーン2は、CaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の、より分子量が低く、移動が速い、二価「BC1」タンパク質を示す。レーン3〜5は、プロテインAを使用した「BC1−2×1」の精製を示す。レーン6および7は、CH1親和性樹脂を使用した「BC1−2×1」の精製を示す。
図24は、Octet(Pall ForteBio)解析を使用して、二価「BC1」構築物のアビディティを、三価2×1「BC1−2×1」構築物のアビディティと比較したものである。ビオチン化抗原「A」を表面に固定化し、その表面上を、結合解析のために、抗体構築物に通過させる。
6.13.9.
(実施例8)
三価2×1三重特異性B−Body構築物(「TB111」)
本発明者らは、図25に概略化された構成を有する三価2×1三重特異性分子「TB111」を設計した。図21に示すドメイン命名規則を参照して、TB111は、以下の構成を有する(「Ada」は、アダリムマブ由来のV領域を示す):
ポリペプチド鎖1
ドメインN:VH(「Ada」)
ドメインO:CH3(T366K、394C)
ドメインA:VL(「抗原A」)
ドメインB:CH3(T366K、349C)
ドメインD:CH2
ドメインE:CH3(ノブ、354C)
ポリペプチド鎖5
ドメインP:VL(「Ada」)
ドメインQ:CH3(L351D、394C)
ポリペプチド鎖2
ドメインF:VH(「抗原A」)
ドメインG:CH3(L351D、351C)
ポリペプチド鎖3
ドメインH:VL(「Nivo」)
ドメインI:CL(カッパ)
ドメインJ:CH2
ドメインK:CH3(ホール、349C)
ポリペプチド鎖4(=「BC1」鎖4)
ドメインL:VH(「Nivo」)
ドメインM:CH1
この構築物は、発現しなかった。
6.13.10.
(実施例9)
三価1×2二重特異性構築物(「BC28−1×2」)
本出願人らは、図26に表記されているドメインおよび鎖命名法を参照した、次のドメインおよび鎖構造を有する三価1×2二特異性B−bodyを構築した:
第1のポリペプチド鎖(=「BC28」鎖1)(配列番号24)
ドメインA=VL(抗原「A」)
ドメインB=CH3(Y349C;445P、446G、447K挿入)
ドメインD=CH2
ドメインE=CH3(S354C、T366W)
第2のポリペプチド鎖(=「BC28」鎖2)(配列番号25)
ドメインF=VH(抗原「A」)
ドメインG=CH3(S354C;445P、446G、447K挿入)
第3のポリペプチド鎖(配列番号37)
ドメインR=VL(抗原「A」)
ドメインS=CH3(Y349C;445P、446G、447K挿入)
リンカー=GSGSGS
ドメインH=VL(「Nivo」)
ドメインI=CL
ドメインJ=CH2
ドメインK=CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
第4のポリペプチド鎖(=「BC1」鎖4)(配列番号11):
ドメインL=VH(「Nivo」)
ドメインM=CH1
第6のポリペプチド鎖(=「BC28」鎖2)(配列番号25)
ドメインT=VH(抗原「A」)
ドメインU=CH3(S354C;445P、446G、447K挿入)。
H:L結合抗原結合部位と同様に、A:F抗原結合部位は「抗原A」に特異的である。R:T抗原結合部位は、PDに対して特異的である。この構築物の特異性は、したがって抗原「A」×(PD1−抗原「A」)である。
6.13.11.
(実施例10)
三価1×2二重特異性構築物(「CTLA4−4×Nivo×CTLA4−4」)
本発明者らは、図27に概略化した一般構造を有する、三価1×2二重特異性分子(「CTLA4−4×Nivo×CTLA4−4」)を構築した。ドメインの命名法を図26に示す。
図28は、SDS−PAGEゲルであり、ここで非還元および還元条件下の「CTLA4−4×Nivo×CTLA4−4」構築物を示すレーンを枠で囲っている。
図29は、2つの抗体「CTLA4−4×OX40−8」および「CTLA4−4×Nivo×CTLA4−4」の抗原結合を比較している。「CTLA4−4×OX40−8」は、CTLA4に一価的に結合する一方、「CTLA4−4×Nivo×CTLA4−4」は、CTLA4に二価的に結合する。
6.13.12.
(実施例11)
三価1×2三重特異性構築物「BC28−1×1×1a」
本発明者らは、図30に概略化した一般構造を有する三価1×2三重特異性分子を構築した。図26に示すドメインおよび鎖の命名法を参照して、
第1のポリペプチド鎖(=「BC28」鎖1)[配列番号24]
ドメインA=VL(抗原「A」)
ドメインB=CH3(Y349C;445P、446G、447K挿入)
ドメインD=CH2
ドメインE=CH3(S354C、T366W)
第2のポリペプチド鎖(=「BC28」鎖2)(配列番号25)
ドメインF=VH(抗原「A」)
ドメインG=CH3(S354C;445P、446G、447K挿入)
第3のポリペプチド鎖(配列番号45)
ドメインR=VL(CTLA4−4)
ドメインS=CH3(T366K;445K、446S、447C挿入)
リンカー=GSGSGS
ドメインH=VL(「Nivo」)
ドメインI=CL
ドメインJ=CH2
ドメインK=CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
第4のポリペプチド鎖(=「BC1」鎖4)(配列番号11)
ドメインL=VH(「Nivo」)
ドメインM=CH1。
第6のポリペプチド鎖(=hCTLA4−4鎖2)(配列番号53)
ドメインT=VH(CTLA4)
ドメインU=CH3(L351D、445G、446E、447C挿入)
この三重特異性構築物の抗原結合部位は、以下の通りであった:
抗原結合部位A:Fは、「抗原A」に特異的であった;
抗原結合部位H:Lは、PD1(ニボルマブ配列)に特異的であった;
抗原結合部位R:Tは、CTLA4に特異的であった。
図31は、単一の明確に確定されるピークを示す、一過性発現およびCaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の「BC28−1×1×1a」のサイズ排除クロマトグラフィを示す。
6.13.13.
(実施例12)
二価および三価構築物のSDS−PAGE解析
図32は、それぞれ一過性発現およびCaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の様々な構築物の、非還元および還元条件下でのSDS−PAGEゲルを示す。
レーン1(非還元条件)およびレーン2(還元条件、+DTT)は、二価1×1二重特異性構築物「BC1」である。レーン3(非還元)およびレーン4(還元)は、三価の二重特異性2×1構築物「BC1−2×1」である(実施例7参照)。レーン5(非還元)およびレーン6(還元)は、三価1×2二重特異性構築物「CTLA4−4×Nivo×CTLA4−4」である(実施例10参照)。レーン7(非還元)およびレーン8(還元)は、実施例11に記載の三価1×2三重特異性「BC28−1×1×1a」構築物である。
SDS−PAGEゲルは、各構築物の完全なアセンブリを実証しており、各構築物について、非還元ゲルの主要なバンドが、予測される分子量で示されている。
6.13.14.
(実施例13)
結合解析
図33は、3つの抗原:PD1、抗原「A」およびCTLA−4へのOctet結合解析を示す。それぞれの場合において、抗原が固定化され、B−Bodyが検体である。参照のために、1×1二重特異性の「BC1」と「CTLA4−4×OX40−8」も比較すると、1×1 B−Bodyが、抗原結合部位が選択される抗原のみに特異的に結合することが実証された。
図33Aは、「BC1」がPD1および抗原「A」に結合するが、CTLA4に結合しないことを示す。図33Bは、二価の二重特異性1×1構築物「CTLA4−4×OX40−8」がCTLA4に結合するが、抗原「A」またはPD1に結合しないことを示す。図33Cは、三価三重特異性1×2構築物「BC28−1×1×1a」がPD1、抗原「A」およびCTLA4に結合することを示す。
6.13.15.
(実施例14)
四価構築物
図35は、2×2四価二重特異性構築物「BC22−2×2」の全体の構成を示す。2×2四価二重特異性は、それぞれの可変ドメイン−定常ドメインセグメントを複製することによって「BC1」足場で構築した。ドメインの命名法を図34に概略化する。
図36は、SDS−PAGEゲルである。レーン7〜9は、CaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後(「CH1溶離液」)、およびさらにイオン交換クロマトグラフィ精製した後(レーン8、「IEX後のpk1」;レーン9、「IEX後のpk2」)の「BC22−2×2」四価構築物をそれぞれ示す。レーン1〜3は、CH1親和性精製した後(レーン1)、レーン2および3はさらにイオン交換クロマトグラフィした後の三価2×1構築物「BC21−2×1」である。レーン4〜6は、1×2三価構築物「BC12−1×2」である。
図37は、2×2四価構築物全体の構成を示す。
図39および40は、代替的な構成を有する四価構築物の概略図である。ドメインの命名法を図38に示す。
6.13.16.
(実施例15)
B−Bodyによる二重特異性抗原係合
四価二重特異性2×2 B−Body「B−Body−IgG 2×2」を構築した。より詳細には、図38にまとめたドメインおよびポリペプチド鎖の命名法の参照を使用して、
第1のポリペプチド鎖
ドメインA=VL(セルトリズマブ)
ドメインB=CH3(IgG1、ノブ)
ドメインD=CH2(IgG1)
ドメインE=CH3(IgG1)
ドメインW=VH(抗原「A」)
ドメインX=CH1(IgG1)
第3のポリペプチド鎖(第1のポリペプチド鎖と同一)
ドメインH=VL(セルトリズマブ)
ドメインI=CH3(IgG1、ノブ)
ドメインJ=CH2(IgG1)
ドメインK=CH3(IgG1)
ドメインWW=VH(抗原「A」)
ドメインXX=CH1(IgG1)
第2のポリペプチド鎖
ドメインF=VH(セルトリズマブ)
ドメインG=CH3(IgG1、ホール)
第4のポリペプチド鎖(第3のポリペプチド鎖と同一)
ドメインF=VH(セルトリズマブ)
ドメインG=CH3(IgG1、ホール)
第7のポリペプチド鎖
ドメインY=VH(「抗原A」)
ドメインZ=CLカッパ
第8のポリペプチド鎖(第7のポリペプチド鎖と同一)
ドメインYY=VH(「抗原A」)
ドメインZZ=CLカッパ。
これを、実施例1に記載されるようにクローニングし、発現させた。ここで、BLI実験は、ビオチン化抗原「A」のストレプトアビジンセンサー上への固定化、その後の10×カイネティックバッファーを用いたベースラインの確立で構成した。次いで、センサーを、無細胞発現された「B−Body−IgG 2×2」中に浸漬し、次いで、新たなベースラインを確立した。最終的に、センサーを、第2の結合事象が観察された100nM TNFαに浸漬し、単一の「B−Body−IgG 2×2」構築物による両方の抗原の二重特異性結合を確認した。結果を図41に示す。
6.13.17.
(実施例16)
「BB−IgG 2×2」の抗原特異的細胞結合
Expi−293細胞を、Expi−293トランスフェクションキット(Life Technologies)を使用して、mockトランスフェクトするかまたは抗原「B」で一過性トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、Expi−293細胞を回収し、4%パラホルムアルデヒド中で15分間、室温で固定化した。細胞を、PBS中で2回洗浄した。200,000抗原BまたはMockトランスフェクトされたExpi−293細胞を、V底96ウェルプレート内の100μLのPBS中に入れた。細胞を、3ug/mLの濃度の「B−Body−IgG 2×2」と1.5時間、室温でインキュベートした。細胞を、300×Gで7分間遠心分離し、PBSで洗浄し、8μg/mLの濃度の100μLのFITC標識ヤギ抗ヒト第2抗体と室温で1時間インキュベートした。細胞を300×Gで7分間遠心分離し、PBSで洗浄し、細胞結合をGuava easyCyteを使用してフローサイトメトリーによって確認した。結果を図42に示す。
6.13.18.
(実施例17)
二価および三価構築物のSDS−PAGE解析
図45は、それぞれ一過性発現およびCaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の様々な構築物の、非還元および還元条件下でのSDS−PAGEゲルを示す。
レーン1(非還元条件)およびレーン2(還元条件、+DTT)は、二価1×1二重特異性構築物「BC1」である。レーン3(非還元)およびレーン4(還元)は、二価1×1二重特異性構築物「BC28」である(実施例4参照)。レーン5(非還元)およびレーン6(還元)は、二価1×1二重特異性構築物「BC44」である(実施例5参照)。レーン7(非還元)およびレーン8(還元)は、三価1×2二重特異性「BC28−1×2」構築物である(実施例9参照)。レーン9(非還元)およびレーン10(還元)は、実施例11に記載の三価1×2三重特異性「BC28−1×1×1a」構築物である。
SDS−PAGEゲルは、各構築物の完全なアセンブリを実証しており、各構築物について、非還元ゲルの主要なバンドが、予測される分子量で示されている。
6.13.19.
(実施例18)
可変−CH3ジャンクション操作の安定性解析
様々なジャンクションバリアントの組合せ間の対形成安定性を評価した。示差走査蛍光定量を行って、鎖1のVL−CH3ポリペプチド(ドメインAおよびB)と鎖2のVH−CH3ポリペプチド(ドメインFおよびG)との間の様々なジャンクションバリアント対形成の融点を決定した。ジャンクションバリアント「BC6jv」、「BC28jv」、「BC30jv」、「BC44jv」および「BC45jv」(それぞれ、上記表2および表3でみられる「BC6」、「BC28」、「BC30」、「BC44」および「BC45」の対応するジャンクション配列を有する)は、76〜77度の範囲のTmを有し、対形成安定性の増加を実証する(表4参照)。図46は、「BC24jv」、「BC26jv」および「BC28jv」の熱転移の差異を示し、「BC28jv」が3つの中で安定性が最も大きいことを実証している。図のx軸は温度であり、y軸は温度変化で割った蛍光変化(−dFluor/dTemp)である。実験は、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるNiesen et al. (Nature Protocols, (2007) 2, 2212 − 2221)に記載されているように行った。
Figure 2021522162
6.13.20.
(実施例19)
ROR×CD3候補結合分子
後述する通り、様々なROR×CD3抗体を構築し検査した。
6.13.20.1.CD3結合アーム
SP34抗CD3抗体(SP34−89、配列番号68および69)のヒト化バージョンに基づく一連のCD3結合アームバリアントを、VHまたはVLアミノ酸配列(配列番号70〜73)のいずれかにおける点変異により操作した。表5に記載されている通り、様々なVHおよびVL配列を一体に対形成させた。
Figure 2021522162
VLおよびVHバリアントは、1×1 BC1 B−bodyの一方のアームへとクローニングし、一方、他方のアームは、無関係抗原結合部位を含有した。図47は、Octet(Pall ForteBio)バイオレイヤーインターフェロメトリー解析によって決定された、非変異誘発SP34−89一価B−bodyの結合親和性を実証する。構築物の2倍系列希釈(200〜12.5nM)を使用して、SP34−89に対する23nMの結合親和性を決定し(kon=3×10−1−1、koff=7.1×10−3−1)、これは、文献における他のSP34バリアントに対する親和性にマッチする。動態親和性も、平衡結合親和性にマッチした。
6.13.20.2.ROR結合アーム
Fab CDRに多様性が導入された化学合成Fabファージライブラリを、モノクローナルファージELISAフォーマットを使用してROR抗原に対してスクリーニングし、それによると、プレート固定化されたRORバリアントが、上述の通りファージへの結合に関して評価された。抗原を認識したFabを発現するファージクローンを配列決定した。ROR1への結合に関する第1のスクリーニングキャンペーンは、表6における「I2A」と名付けられた抗原結合部位(ABS)クローンを同定し、ROR2への結合に関する第2のスクリーニングキャンペーンは、表6における「I2C」と名付けられたABSクローンを同定した。
Figure 2021522162
Figure 2021522162
Figure 2021522162
「I2A」、ROR1に対するスクリーニング;「I2C」、ROR2に対するスクリーニング;*は、配列未決定を表す;太字は、潜在的な異性化部位(後述を参照)を表す
上述のVHおよびVL配列を、二価単一特異性ネイティブヒト全長IgG1アーキテクチャへとフォーマットした。図48A〜図48Bは、2種のROR結合候補に対する2倍系列希釈(200〜12.5nM)のOctet(Pall ForteBio)バイオレイヤーインターフェロメトリー解析を実証する(図48A、クローンI2−A10;図48B、クローンI2−A27)。結合親和性および動態を系列希釈から決定し、表7に示す。
Figure 2021522162
二価単一特異性ネイティブヒト全長IgG1アーキテクチャへとフォーマットされたROR結合候補を、ROR1および/またはROR2への結合に関してさらに特徴付けた。表8は、ROR1のみに特異的に結合した候補、ROR2のみに特異的に結合した候補、ならびにROR1およびROR2の両方に対し交差反応性であった候補を提示する。ROR結合候補はまた、特定のROR1ドメインへのその結合に関して特徴付けた。表9は、Frizzled、Ig様およびKringleドメインに特異的に結合した候補を提示する。
Figure 2021522162
Figure 2021522162
選択されたROR結合候補を、安定性、変異性および免疫原性など、臨床開発に関連する抗体特性に有害に影響し得る配列モチーフに関してさらに解析した。Kumar and Singh (Developability of biotherapeutics: computational approaches. Boca Raton: CRC Press, Taylor & Francis Group, 2016)に従って計算的解析を行った。解析結果は、表10に提示され、限られた数の有害配列モチーフが、収載されているクローンに存在することを実証し、さらなる臨床開発のための潜在力を説明する。
Figure 2021522162
*ハーセプチンに見出される予測T細胞エピトープは、これらの分子に存在する
6.13.21.
(実施例20)
in vitroでのROR×CD3二特異性B−body有効性
候補RORおよびCD3抗原結合部位は、B−body BC1 1×1および1×2フォーマットへとフォーマットし、一連の腫瘍有効性モデルにおいて検査した。
6.13.21.1.二特異性B−bodyフォーマット比較
ROR抗原結合部位(ABS)候補I2A−3およびCD3 ABS候補SP34−89は、二特異性B−body「BC1」1×1および1×2フォーマットへとフォーマットした。図3および図26を参照すると、ROR ABS候補は、A:FおよびR:T結合部位を形成する一方、CD3 ABS候補は、H:L結合部位を形成する。図26を参照すると、SドメインとHドメインとの間に10アミノ酸ジャンクションまたは16アミノ酸ジャンクションのいずれかを有する、2つの1×2フォーマットを構築した。異なる構築物を、本明細書に記載されているNFκB GFP Jurkat T細胞刺激アッセイにおいて検査した。簡潔に説明すると、レポーターT細胞(エフェクター細胞)を、ROR1抗原を発現する非小細胞肺がん標的腫瘍細胞系HOP−92、またはROR1を発現しないB16黒色腫標的腫瘍細胞系のいずれかと混合した。次に、異なるB−body構築物の希釈系列を、エフェクター:標的混合物と共にインキュベートした。
図49に示し、表11に提示する通り、ROR×CD3二特異性1×1および1×2 B−bodyは、ROR1発現腫瘍系統(HOP−92)と混合した場合に、レポーターT細胞の活性化をもたらしたが、ROR×CD3二特異性1×1および1×2 B−bodyを、ROR1を発現しない腫瘍系統(B16)と混合した場合に、活性化は観察されなかった。加えて、ROR1に対する二価特異性を保有する1×2 B−bodyフォーマットは、1×1 B−bodyフォーマットよりも強力であり、ジャンクションの長さの変動は、最小限の効力差をもたらした。
Figure 2021522162
6.13.21.2.CD3結合単独は、T細胞を活性化しない
ROR ABS候補I2A−10およびCD3 ABS候補SP34−89は、二特異性B−body「BC1」1×2フォーマットへとフォーマットした(「I2−A10 1×2」)。別々の構築物において、ROR1以外の腫瘍抗原に対する対照アームも、CD3 ABS候補SP34−89と共に、二特異性B−body「BC1」1×2フォーマットへとフォーマットした(「Neg Ctrl」)。図3および図26を参照すると、ROR候補ABSおよび「Neg Ctrl」アームABSは、A:FおよびR:T結合部位を形成する一方、CD3 ABS候補は、H:L結合部位を形成する。異なる構築物を、T細胞細胞傷害性アッセイにおいて検査した。簡潔に説明すると、単離されたCD8+T細胞(エフェクター細胞)を、ROR1抗原を発現する三種陰性乳がん腫瘍細胞系MDA−MD−231(標的細胞)と混合した。次に、異なるB−body構築物の希釈系列を、エフェクター:標的混合物と共にインキュベートした。
図50に示す通り、ROR×CD3三価二特異性1×2 B−bodyは、ROR1発現腫瘍系統(MDA−MD−231)と混合した場合に、細胞傷害性T細胞媒介性死滅をもたらしたが、無関係腫瘍ABS(例えば、MDA−MD−231において発現されない腫瘍抗原)を有するCD3二特異性B−bodyが混合物に添加された場合には、細胞傷害性をもたらさなかった。
6.13.21.3.複数の腫瘍モデルにおけるROR×CD3二特異性B−body有効性
ROR ABS候補I2A−3およびCD3 ABS候補SP34−89は、上述の二特異性B−body「BC1」1×1および1×2フォーマットへとフォーマットし、1×2フォーマットは、SドメインとHドメインとの間に10アミノ酸ジャンクションを有した。異なる構築物を、本明細書に記載されているNFκB GFP Jurkat T細胞刺激アッセイにおいて検査した。簡潔に説明すると、レポーターT細胞(エフェクター細胞)を、ROR1発現腫瘍細胞系、HOP−92(非小細胞肺がん1)、A549(非小細胞肺がん2)、MDA−MD−231(三種陰性乳がん)、JeKo−1(マントル細胞リンパ腫)およびRPMI−8226(多発性骨髄腫)と混合した。構築物は、また、ROR1を発現しないB16黒色腫腫瘍細胞系(標的細胞)と混合した。次に、異なるB−body構築物の希釈系列を、エフェクター:標的混合物と共にインキュベートした。
図51A〜図51Eに示し、表12に提示する通り、ROR×CD3二特異性1×1および1×2 B−bodyは、ROR1発現腫瘍系統、HOP−92(図51A)、A549(図51B)、MDA−MD−231(図51C)、JeKo−1(図51D)およびRPMI−8226(図51E)と混合した場合に、レポーターT細胞の活性化をもたらしたが、このような構築物を、ROR1を発現しない腫瘍系統(B16)と混合した場合に、活性化は生じなかった。ROR1に対する二価特異性を保有する1×2 B−bodyフォーマットは、検査した全腫瘍系統において1×1 B−bodyフォーマットよりも強力であった。よって、ROR×CD3二特異性1×1および1×2 B−bodyは、ある範囲の腫瘍モデルに及ぶ有効性を実証した。
Figure 2021522162
6.13.21.4.T細胞活性化に関するROR ABS候補スクリーニング
ROR ABS候補I2A−1、I2A−3、I2A−10、I2A−14、I2A−16、I2A−20、I2A−22およびI2A−27は、CD3 ABS候補SP34−89と共に、上述の二特異性B−body「BC1」1×2フォーマットへとフォーマットし、1×2フォーマットは、SドメインとHドメインとの間に10アミノ酸ジャンクションを有した。異なる構築物を、上述のT細胞細胞傷害性アッセイにおいて検査した。簡潔に説明すると、単離されたCD8+T細胞(エフェクター細胞)を、ROR1抗原を発現する三種陰性乳がん腫瘍細胞系MDA−MD−231(標的細胞)と6:1のE:T比で混合した。次に、異なるB−body構築物の希釈系列を、エフェクター:標的混合物と共にインキュベートした。
図52に示し、表13に提示する通り、ROR×CD3二特異性1×2 B−body I2A−1、I2A−3、I2A−10、I2A−14、I2A−22およびI2A−27は、ROR1発現腫瘍系統(MDA−MD−231)と混合した場合に、細胞傷害性T細胞媒介性死滅をもたらしたが、1×2 B−body I2A−16およびI2A−20は、強力な細胞傷害性をもたらさなかった。加えて、I2A−22は、変則的な用量応答曲線をもたらした。よって、ROR ABS候補I2A−1、I2A−3、I2A−10、I2A−14およびI2A−17は、有効なT細胞媒介性死滅をもたらした。
Figure 2021522162
6.13.21.5.細胞傷害性死滅は、ROR1発現と相関する
ROR ABS候補I2A−10およびCD3 ABS候補SP34−89は、上述の二特異性B−body「BC1」1×2フォーマットへとフォーマットし、1×2フォーマットは、SドメインとHドメインとの間に10アミノ酸ジャンクションを有した。I2A−10候補を、記載されているT細胞細胞傷害性アッセイにおいて検査した。簡潔に説明すると、単離されたCD8+T細胞(エフェクター細胞)を、ROR1発現腫瘍細胞系、MDA−MD−231(三種陰性乳がん)およびRPMI−8226(多発性骨髄腫)と4:1のE:T比で混合した。候補の希釈系列を、エフェクター:標的混合物と共にインキュベートした。
図53Aは、MDA−MD−231およびRPMI−8226腫瘍系統に関する発表されたROR1発現データを説明する。図53Bおよび図53Cは、本出願人らの実験において観察された細胞傷害性有効性が、MDA−MD−231およびRPMI−8226腫瘍細胞系においてROR1と相関することを実証する。
6.13.21.6.ROR ABS候補I2A−10およびI2A−27による初代T細胞活性化
ROR ABS候補I2A−10およびI2A−27は、CD3 ABS候補SP34−89と共に、上述の二特異性B−body「BC1」1×2フォーマットへとフォーマットし、1×2フォーマットは、SドメインとHドメインとの間に10アミノ酸ジャンクションを有した。I2A−10 BC1 1×2 B−bodyを形成する4つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号84、85、87および88に収載されている。I2A−27 BC1 1×2を形成する4つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号89、90、92および93に収載されている。
異なる構築物を、フローサイトメトリーによって定量化されるT細胞活性化アッセイにおいて検査した。簡潔に説明すると、単離された末梢血単核細胞(PBMC、エフェクター細胞)を、ROR1抗原をそれぞれ発現する三種陰性乳がん腫瘍細胞系MDA−MD−231および膵癌腫瘍細胞系PANC1(標的細胞)と7:1のE:T比で混合した。次に、異なるB−body構築物の希釈系列を、エフェクター:標的混合物と共にインキュベートし、44時間一緒にインキュベートした。次に、T細胞マーカーCD3、CD4およびCD8ならびに活性化マーカーCD25およびCD69に関して細胞を染色し、フローサイトメトリーによって解析した。
図54A〜図54Fに示す通り、I2A−10およびI2A−27 B−bodyは、CD25(図54A)、CD69(図54C)、CD25およびCD69の両方(図54E)の発現によって決定される通り、PBMC集団におけるCD8+T細胞を活性化し、CD25(図54B)、CD69(図54D)、CD25およびCD69の両方(図54F)によって決定される通り、PBMC集団におけるCD4+T細胞を活性化した。よって、ROR ABS候補は、初代T細胞を活性化することができる。
6.13.21.7.ROR ABS候補I2A−10およびI2A−27の内部移行
ROR ABS候補I2A−10およびI2A−27は、CD3 ABS候補SP34−89と共に、上述の二特異性B−body「BC1」1×2フォーマットへとフォーマットし、1×2フォーマットは、SドメインとHドメインとの間に10アミノ酸ジャンクションを有した。異なる構築物を、フローサイトメトリーによって定量化される通り、腫瘍細胞系により内部移行に関して検査した。簡潔に説明すると、MDA−MB−231細胞を、I2−A10、I2−A27またはアイソタイプ対照と共に2時間37℃または4℃でインキュベートした。2時間後に、標識された二次抗体を、4℃で30分間添加し、次いでフローサイトメトリーによって解析した。パーセント内部移行は、平均蛍光強度(MFI)に基づき、アイソタイプ対照(0%)および4℃対照(100%)の間で正規化することにより計算した。
図55に示す通り、候補I2A−10(上パネル)およびI2A−27(下パネル)の26%および36%が、それぞれ、MDA−MB−231細胞との2時間インキュベーション後に内部移行した。腫瘍細胞による内部移行は、ROR抗原を発現する腫瘍細胞を死滅させるための様々な抗体−薬物コンジュゲート戦略を可能にする。
6.13.22.
(実施例21)
ROR×CD3二特異性B−body単一ステップの精製
ROR ABS候補I2A−10およびI2A−27は、CD3 ABS候補SP34−89と共に、上述の二特異性B−body「BC1」三価1×2フォーマットへとフォーマットし、1×2フォーマットは、SドメインとHドメインとの間に10アミノ酸ジャンクションを有した。CaptureSelect(商標)CH1親和性樹脂を使用した1ステップ精製を使用して、構築物を精製した。
図56は、単一ステップCH1親和性精製ステップが、ゲル濾過により単一の単分散ピークを生じたことを実証する、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)解析を示し、それによると、>98%が、1×2 B−body候補I2A−10(上パネル)およびI2A−27(下パネル)の、凝集していないタンパク質である。
図57Aは、完全にアセンブルした構築物の主要バンド(高い位置の移動度の250kDaバンド)を実証する、1×2 B−body候補I2A−10(左パネル)およびI2A−27(右パネル)の非還元SDS−PAGEゲルを示す。図57Bは、完全にアセンブルした構築物の主要バンドを実証する、1×2 B−body候補I2A−10およびI2A−27に関する非還元試料のBioanalyzer(Agilent)解析を示す。
二特異性抗体の抗CH1精製効率も、二特異性抗体のFc部分内のそのネイティブ位置に見出されるCH3ドメインに導入された標準ノブ・ホール直交型変異のみを有し、他のドメイン修飾がないROR結合分子に関して検査した。したがって、検査した2種の抗体KL27−6およびKL27−7はそれぞれ、抗体の各アームに1つが存在する、2つのCH1ドメインを含有した。セクション6.13.1により詳細に記載されている通り、各二特異性抗体を発現させ、抗CH1カラムにおいて望まれないタンパク質産物から精製し、SDS−PAGEゲルにおいてランを行った。図58に示す通り、不完全二特異性抗体を表す75kDaの有意なバンドが存在し、これは、図3を参照すると、(i)第1および第2の、または(ii)第3および第4のポリペプチド鎖のみを含有する複合体として解釈される。よって、抗CH1を使用して、各アームにCH1ドメインを有する完全二特異性分子を精製する方法は、不完全抗体複合体によるバックグラウンドコンタミネーションをもたらした。
6.13.23.
(実施例22)
エフェクター機能を低減させるFc変異
一連の操作されたFcバリアントを、モノクローナルIgG1抗体トラスツズマブ(ハーセプチン、「WT−IgG1」)において生成し、これは、CH2ドメインのL234、L235およびP329位に変異を有する。検査したバリアントの特定の変異は、下の表14に記載されており、sFc1(PALALA)、sFc7(PGLALA)およびsFc10(PKLALA)を含む。全バリアントは、融解温度(表14、TM1およびTM2)によって決定される通り、同様の安定性を示した。
WT−IgG1およびFcバリアントをOctetバイオセンサーに固定化し、可溶性FcγRIaを系に添加して、結合を決定した。図59A〜図59Bは、トラスツズマブへのFcγRIa結合を実証する(図59A「WT IgG1」)が、sFc10への結合を実証しない(図59B)、Octet(Pall ForteBio)バイオレイヤーインターフェロメトリー解析を示す。FcγRIaの添加後に、トラスツズマブについてシグナルの増加が見られたが、sFc10について観察可能なシグナル増加は検出されず、FcγRIaが、操作された変異を有する抗体にもはや結合しなくなったことを実証する。検査したバリアントの結合概要を表14に提示する。加えて、全バリアントが、HER2への強い結合を保持した(図示せず)。
Figure 2021522162
WT−IgG1およびFcバリアントを、FcγR結合、特にFcγRIIIaの別の尺度として、抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)アッセイにおいて検査した。図60に示す通り、トラスツズマブ(ハーセプチン、「WT−IgG1」)は、死滅を実証したが、sFc7とsFc10のいずれも、検出可能レベルの死滅をもたらさなかった。WT−IgG1およびFcバリアントは、ELISAにより補体成分C1q結合に関しても検査した。図61に示す通り、トラスツズマブ(ハーセプチン、「WT−IgG1」)は、C1q結合を実証したが、sFc1とsFc7とsFc10のいずれも、検出可能なC1q結合をもたらさなかった。よって、結果は、検査したFcバリアントが、低減したレベルのFcエフェクター機能を有することを実証する。
6.13.24.
(実施例23)
in vivoでのROR×CD3二特異性B−body有効性
ヒト化マウスにおける異種移植試験を使用して、in vivo有効性を測定した。簡潔に説明すると、5×10個のMDA−MB−231腫瘍細胞を、NOD Scidガンマ(NSG)マウス(Jackson Labs)の後部側腹部の皮下に生着させ、およそ120〜150mm3まで成長させた。次に、単一のドナー由来の1×10個のヒトPBMCの静脈内(IV)注射によりマウスをヒト化させた。ヒト化NSGマウスを、8匹の3群へとランダム化し、PBMC生着3日後に、PBS、0.5mg/Kgの、CD3 ABS候補SP34−89と共に1×2 B−bodyアーキテクチャへとフォーマットしたROR ABS候補I2−A10(「I2−A10」)または0.5mg/Kgの、CD3 ABS候補SP34−89と共に1×2 B−bodyアーキテクチャへとフォーマットしたROR ABS候補I2−A27(「I2−A27」)をIV投薬した。週に2回の投薬を3週間続けた。腫瘍成長、体重および全体的な健康に関して動物をモニターした。試験完了後に、解析のために動物を屠殺した。標準技法を使用してフローサイトメトリー解析を行って、NSGマウスのヒト化状態を決定した。
腫瘍を収集し、標準免疫組織化学技法を使用して解析して、処置に応答した腫瘍へのヒトT細胞の浸潤をモニターする。IHCは、標準技法を使用して実行される。簡潔に説明すると、FFPE試料は、脱パラフィンし、60℃でベーキングして100%キシレン溶液に置くことにより脱水(rehydrate)し、次いで、エタノール系列洗浄(100%エタノール、95%エタノール、70%エタノール、50%エタノール、PBS)により再度水分補給する。10mMクエン酸Na+0.05%Tween(登録商標)20、pH6.0緩衝剤においてスライドを95℃で10分間インキュベートすることにより、抗原修復を実行する。AbCam Mouse on Mouse IHCキット(Cat.Ab127055)は、染色のための製造業者の指示に従って使用する。簡潔に説明すると、内在性ペルオキシダーゼ活性は、過酸化水素溶液により遮断され、内在性非特異的相互作用は、Rodent Block溶液により遮断される。スライドを、製造業者の推奨(一般に、2時間室温または一晩4℃)に従って一次抗体と共にインキュベートし、次いで、AbCamキットのmouse on mouse HRPポリマーで染色する。DAB色素原(chromagen)染色とヘマトキシリン(hemotoxylin)対比染色を可視化のために使用する。
6.13.24.1.ROR×CD3三価二特異性B−bodyは、腫瘍成長低減をもたらす
図62A〜図62Cに示す通り、腫瘍細胞を生着した、PBMCでヒト化し(左の実線矢印)、次いで、PBS(図62A)、1×2 B−body候補I2−A10(図62B)または1×2 B−body候補I2−A27(図62C)でその後IV処置した(右の破線矢印)マウスの、腫瘍体積をモニターした。図63は、マウスのそれぞれの、試験結論時の腫瘍体積を示し、群毎の平均および標準偏差を示す。I2−A27群の白い四角は、PMBCによる非ヒト化がほぼ確実なため、解析から除去した。結果は、I2−A27処置は、およそ40%の腫瘍成長の有意低減をもたらしたことを実証する。
試験におけるNSGマウスのヒト化状態は、フローサイトメトリー解析により確認した。表15に示す通り、解析した全マウスは、ヒトCD45(%hu CD45+)の染色によって決定される通り、ヒトリンパ球によるヒト化に成功した。試料03_B10(b)は解析しなかった。解析した全マウスにおけるヒト化リンパ球集団はまた、ヒトCD3(huCD45+リンパ球においてゲーティングした%CD3、およびヒトCD3+T細胞においてゲーティングした%CD4+/CD8+)の染色によって決定される通り、CD4およびCD8陽性T細胞を含むヒトT細胞を有した。
腫瘍試料において免疫組織化学検査を行い、処置に応答した腫瘍へのヒトT細胞の浸潤を確認する。
表15: NSGマウスのヒト化
Figure 2021522162
6.13.25.
(実施例24)
ROR1×CD3二特異性B−body(商標)有効性
表6に示すI2A−27の6個のCDRを含む追加的なROR抗原結合分子を調製し、実験を行って、ROR1×CD3二特異性B−body(商標)フォーマットにおける三価二特異性構築物としてのその有効性を検査した。
6.13.25.1.I2−A27に基づく追加的なROR1×CD3 1×2 B−body(商標)二特異性抗体の生成
ROR ABS候補I2A−27は、CD3 ABS候補SP34−89と共に、上述の二特異性B−body「BC1」1×2フォーマットへとフォーマットし、1×2フォーマットは、SドメインとHドメインとの間に10アミノ酸ジャンクションを有した(例えば、ドメインの概略図については図26を参照)。例示的なI2A−27 BC1 1×2三価二特異性ROR抗原結合分子を形成する5つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号96(鎖1)、配列番号97(鎖2)、配列番号98(鎖3)、配列番号99(鎖4)および配列番号97(鎖5)として収載する。
本実施例における次の記載では、用語「I2−A27 1×2 B−body(商標)」または「I2−A27」または「A27」は、配列番号96の鎖1、配列番号97の鎖2、配列番号98の鎖3、配列番号99の鎖4および配列番号97の鎖5を有するこのROR1×CD3 1×2 B−body(商標)を指す。
6.13.25.2.CD3およびROR1へのROR1×CD3 1×2 B−body(商標)二特異性抗体の結合
上の実施例19に記載されている通り、SP34−89は、ヒトCD3デルタおよびイプシロンヘテロ二量体に対する23nMの一価Kdを示した(図47を参照)。
本実施例において、ヒトおよびカニクイザルCD3への結合は、Jurkat T細胞、Jurkat CD3ノックアウト細胞系またはカニクイザルT細胞系への細胞結合を評価することによりさらに特徴付けた。具体的には、ヒトJurkatおよびカニクイザルT細胞へのSP34−89ヒト化抗体の結合をフローサイトメトリーにより決定した。SP34−89は、表示の濃度で表示の細胞系と共にインキュベートし、続いて、蛍光標識された二次抗体による標識を行った。平均蛍光強度を、SP34−89の濃度に対してプロットした。図64Aに示す通り、SP34−89は、JurkatおよびカニクイザルT細胞の両方への強い結合を示したが、Jurkat CD3ノックアウト細胞系への有意な結合を示さず、ヒトおよびカニクイザル交差反応性および細胞結合が維持されたことを検証する。
加えて、カニクイザルCD3デルタおよびイプシロンヘテロ二量体に対する、セクション6.13.25.1に記載されているその結果得られるI2−A27 1×2 B−body(商標)二特異性抗体の結合親和性を、バイオレイヤーインターフェロメトリー(BLI)結合評価により決定した。
より具体的には、Fcバイオセンサーを使用したOctetQK384(ForteBio)を使用して、一価結合親和性解析を行った。およそ1nm応答を生じる濃度(典型的には10〜50nMタンパク質)で、未標識B−body(商標)を先ずFcバイオセンサーに結合させる。次に、バイオセンサーを10×動態緩衝剤(ForteBio)において平衡化して、ベースラインを確立する。各抗原のタグが付いていない単量体を、50nm〜0.75nMに及ぶ濃度で、抗体コーティングされたセンサーと接触させる。会合応答および解離をモニターし記録した。その結果得られるKonおよびKoffは、Octet解析ソフトウェアを使用してフィットさせた。図64Bに示す通り、二特異性抗体は、カニクイザルCD3デルタおよびイプシロンヘテロ二量体に対する3nMの一価Kdを示した。
次に、ROR1への結合を評価した。上の6.13.20.2に記載されているデータ(例えば、図48Bを参照)と一貫して、VHおよびVL配列が、二価単一特異性IgGアーキテクチャへとフォーマットされる場合、I2−A27 IgG抗体は、ROR1に対し2.8nMの一価結合を示し、ROR2に対し最小の結合を示した(図65Aおよび図65B)。
次に、ROR1およびROR2へのI2−A27 1×2 B−body(商標)二特異性抗体の一価および二価結合を、BLIを使用して解析した。
上述の通りに一価結合解析を行い、抗体をFcセンサーにより捕捉し、緩衝剤のみにおいて会合相に続く解離相のために表示の抗原と接触させた。
ストレプトアビジンバイオセンサーを使用したOctetQK384(ForteBio)を使用して、二価結合解析を行った。およそ1nm応答を生じる濃度(典型的には10〜50nMビオチン化タンパク質)で、ビオチン化抗原を先ずストレプトアビジンバイオセンサーに結合させた。次に、バイオセンサーを10×動態緩衝剤(ForteBio)において平衡化して、ベースラインを確立した。50nm〜0.75nMに及ぶ濃度で、1×2 B−body(商標)を抗原コーティングされたセンサーと接触させた。会合応答および解離をモニターし記録した。その結果得られるKonおよびKoffは、Octet解析ソフトウェアを使用してフィットさせた。
図65C、図65Dおよび図65Eに示す通り、I2−A27 1×2 B−body(商標)フォーマットは、ROR1に対し3.8nMの一価結合および0.71nMの二価結合を示し、ROR2に対し最小の結合を示した。
6.13.25.3.ROR1×CD3 1×2 B−body(商標)二特異性抗体のさらなる特徴付け
Expi−CHO細胞におけるポリペプチド鎖1〜4(ポリペプチド鎖5は、ポリペプチド鎖2と同じである)をコードするDNAの一過性トランスフェクションにより、セクション6.13.25.1に記載されているI2−A27 1×2 B−body(商標)二特異性抗体を産生した。5鎖抗体をCH1親和性樹脂により精製し、PBS、pH7.4へと緩衝液交換した。
その結果得られるB−body(商標)のアセンブリおよび純度を非還元および還元SDS−PAGEにより評価した。
約0.2〜1mg/mLに及ぶ2μgの抗体を使用して、非還元SDS−PAGEを行った。最大10μLの試料を、200μL PCR管において4μLの2×レムリ(Laemmli)試料緩衝剤(Bio−Rad)と混合した。別々の管に、4μLの分子量ラダー(Precision Plus Protein Dual Color Standards、Bio−Rad)を添加した。サーモサイクラー(thermocycler)を使用して、PCR管を55℃で10分間インキュベートし、4℃に冷却した。管を遠心分離し、各管の全体積を、4〜15%Bis−Trisゲル(Mini−PROTEAN TGX、Bio−Rad)の個々のウェルにロードした。外部電源を使用して定電圧(220V)で操作した、Tris/Glycine/SDSランニング緩衝剤(10×から1×に希釈)によるBio−Rad Mini−PROTEAN Tetra Systemを使用して、30分間かけて試料を電気泳動した。ゲルを脱イオン水で洗浄し、クーマシー色素(GelCode Blue Safe Protein Stain、ThermoFisher Scientific)で最小15分間染色した。ゲルをその後、脱イオン水で最小30分間脱染し、撮像した。
約0.3〜1.5mg/mLに及ぶ3μgの抗体を使用して還元SDS−PAGEを行った。最大10μLの試料を、200μL PCR管において4μLの2×レムリ試料緩衝剤(Bio−Rad)および5μLの5Mジチオスレイトールと混合した。別々の管に、4μL分子量ラダー(Precision Plus Protein Dual Color Standards、Bio−Rad)を添加した。PCR管を室温で30分間インキュベートした。次に、サーモサイクラーを使用して、試料を55℃で10分間インキュベートし、4℃に冷却した。管を遠心分離し、最大14μLの試料を、4〜15%Bis−Trisゲル(Mini−PROTEAN TGX、Bio−Rad)の個々のウェルにロードした。外部電源を使用して定電圧(220V)で操作した、Tris/Glycine/SDSランニング緩衝剤(10×から1×に希釈)によるBio−Rad Mini−PROTEAN Tetra Systemを使用して、30分間かけて試料を電気泳動した。ゲルを脱イオン水で洗浄し、クーマシー色素(GelCode Blue Safe Protein Stain、ThermoFisher Scientific)で最小15分間染色した。ゲルをその後、脱イオン水で最小30分間脱染し、撮像した。
1×2 B−body(商標)は、非還元フォーマットにおいて200kDの予想される分子量付近に泳動された(本明細書にデータ図示せず)。還元フォーマットにおいて、予想される3本のバンドが分離された(1つの鎖は75kDに、1つの鎖は50kDに、2つの鎖は25kDに)(本明細書にデータ図示せず)。
タンパク質はその後、還元および非還元フォーマットにおいてキャピラリー電気泳動によって解析した。
製造業者の使用説明書に従って、Agilent 2100 Bioanalyzerにおいてキャピラリー電気泳動のランを行った。簡潔に説明すると、試料を、標識緩衝剤において標識色素と共に氷上で暗所にて30分間インキュベートした。次に、エタノールアミンを添加し、試料を氷上で暗所にて10分間インキュベートして、取り込まれなかった色素をクエンチした。還元試料のため、1M DTTを試料緩衝剤に添加した。試料を98℃で5分間インキュベートして、NanoFluidicチップにおけるローディングに先立ち試料を変性した。還元試料における3本の主要バンドから、95.54%であるとパーセント純度を計算した(本明細書にデータ図示せず)。
次に、カラムのセットにより抗体タンパク質を解析して、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)により均一性を、スタンドアップ単層吸着クロマトグラフィ(SMAC)により凝集傾向を、疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC)により疎水性を評価した。
Agilent 1100 HPLCにおける7.8mm ID×30cm TSKゲルG3000SWXLカラム(Tosoh Bioscience LLC、PN 08541)を使用して、SEC解析を行った。抗体をdPBS(pH7.4)における1mg/mL濃度に対して正規化し、遠心分離により清澄化して、微粒子をペレットにした。移動相緩衝剤は、dPBS(pH7.4、カルシウムおよびマグネシウム不含)であった。試料毎に、10μLをロードし、20分間にわたる1.0ml/分にて均一濃度で溶出した。280nmにおける吸光度をモニターした。クロマトグラフィピークを積分して、%均一性および保持時間を決定した。
Agilent 1100 HPLCにおける4.6mm ID×300mm Zenix SEC 300カラム(Sepax Technologies、PN 213300P−4630)を使用して、SMAC解析を行った。抗体をdPBS(pH7.4)における1mg/mL濃度に対して正規化し、遠心分離により清澄化して、微粒子をペレットにした。移動相緩衝剤は、dPBS(pH7.4、カルシウムおよびマグネシウム不含)であった。試料毎に、10μLをロードし、32分間にわたる0.25mL/分にて均一濃度で溶出した。280nmにおける吸光度をモニターした。試料保持時間を計算し、標準対照のセットと比較して、増加した保持時間(増加した凝集形成傾向)を有する抗体を同定した。
Agilent 1100 HPLCにおける4.6mm ID×3.5cm TSKゲルButyl−NPRカラム(Tosoh Bioscience LLC、PN 14947)を使用して、HIC解析を行った。抗体をdPBS(pH7.4)における2mg/mL濃度に対して正規化し、次いで、1mg/mLの最終タンパク質濃度となるように等しい体積の移動相緩衝剤Bで希釈した。1mL/分の流速における100%移動相緩衝剤B(2M硫酸アンモニウム/20mMリン酸ナトリウム、pH7.0)でカラムを平衡化した。試料毎に、10μLをロードし、15分間にわたる1.0mL/分における100%移動相緩衝剤Bから100%移動相緩衝剤A(20mMリン酸ナトリウム、pH7.0)への勾配を使用して溶出し、100%Aで3分間維持してカラムを洗浄し、平衡化のために100%Bに2分間戻した。280nmにおける吸光度をモニターした。試料保持時間を計算し、標準対照のセットと比較して、増加した保持時間(増加した疎水性)を有する抗体を同定した。
これらの解析の結果を図66A、図66Bおよび図66Cに示す。図示する通り、タンパク質は、SECにより>99%均質であると思われ、他の開発可能な抗体に観察された範囲内に収まるSMACおよびHICの両方による単一のピークをもたらし、許容される凝集および疎水性プロファイルを示唆する。
次に、動的光散乱(DLS)、静的光散乱(SLS)および蛍光を使用してTm、PDIおよび流体力学直径を測定することができるUNcle分析機器により、タンパク質を解析した。抗体をdPBS(pH7.4)における1mg/mL濃度に対して正規化し、遠心分離により清澄化して、微粒子をペレットにした。試料をUNcleの9μL石英キャピラリーキュベットデバイス(Uni)へと等分し、封着した。15℃でDLSによりPDIおよび流体力学直径を測定した。0.5℃/分で15℃から95℃へと温度を一定速度で増加させ、その間に、自家蛍光によりTmを測定した。UNcle解析ソフトウェアv3.1を使用してデータを解析した。
タンパク質は、67.4℃および73.7℃の融解温度を示した。3回の測定から得られるPDI中央値は、0.19であり、これは単分散試料を示し(PDI<0.25は、単分散と考慮される)、流体力学直径は14.4nmであった(下の表16を参照)。
表16. UNcle分析機器による融点、多分散指標および流体力学直径の結果
Figure 2021522162
6.13.25.4.ROR1×CD3 1×2 B−body(商標)二特異性抗体のin vitro機能評価
T細胞およびROR1発現がん細胞の細胞共培養アッセイにおけるI2−A27 B−body(商標)の機能性能を解析した。ROR1および/またはROR2を発現するがん細胞系を評価した。
ROR1特異的抗体(I2−A27)およびROR2特異的抗体(I2−C21)を使用したフローサイトメトリーにより、MDA−MB−231、RPMI−8226およびK562を、表面発現されたROR1および近縁のROR2タンパク質のコピーの数に関して評価した。コピー数評価に使用する抗体の特異性をBLIにより決定したところ、I2−A27がROR1に選択的に結合し、I2−C21がROR2に選択的に結合することが確認された。表17に示す通り、MDA−MB−231細胞系は、ROR1を主に発現することが決定され、RPMI−8226細胞系は、ROR1およびROR2の両方を発現することが決定され、K562細胞系は、主にROR2を発現することが決定された。
表17. MDA−MB−231、RPMI−8226およびK562細胞におけるROR1およびROR2の表面タンパク質コピー数
Figure 2021522162
I2−A27 B−body(商標)が、ROR1またはROR2発現がん細胞の存在下でT細胞を活性化することができるか評価するために、NFkB Jurkat共培養レポーター遺伝子アッセイを利用した。Jurkat T細胞の活性化は、NFkB応答エレメントの活性化およびeGFPの産生をもたらす。具体的には、ハーフエリア(half area)の黒色の壁と透明な底の96ウェルプレートにおいて、アッセイ当日にRPMI−8226もしくはK562細胞を蒔いた(35,000細胞/ウェル)、またはアッセイ前日にMDA−MB−231細胞を蒔いた(25,000細胞/ウェル)。アッセイ当日に、1μg/mL抗CD28抗体の存在下で、表示される濃度の抗体の希釈物を添加した。NFkB−GFP Jurkatレポーター細胞をウェルに75,000細胞/ウェルで添加した。プレートを6時間37℃/5%COでインキュベートした。バックグラウンド抑制色素を添加し、Safireプレートリーダーを使用して、520nmにおける蛍光を決定した。
図67A、図67B、図67Cおよび図67Dに示す通り、I2−A27 1×2 B−body(商標)二特異性抗体は、MDA−MB−231(ROR1発現)またはRPMI−8226(ROR1およびROR2発現)細胞の存在下、pM範囲でJurkatレポーター細胞系を活性化することができるが、K562(ROR2発現)細胞の存在下でまたは標的細胞系の非存在下では活性化できなかったことが示された。
次に、初期T細胞活性化マーカーCD69および後期T細胞活性化マーカーCD25の発現レベル増加によって評価される通り、初代CD8+T細胞を活性化するI2−A27 1×2 B−body(商標)二特異性抗体の機能を、ROR1発現細胞系の存在下で試験した。具体的には、I2−A27 1×2 B−body(商標)二特異性抗体、CD8+T細胞を、MDA−MB−231細胞またはRPMI−8226細胞ありまたはなしで、6:1のE:T比で、48時間インキュベートした。次に、細胞をPE−Cy7 CD69抗体(BD Biosciences 561928)およびBB515 CD25抗体(BD Biosciences 564467)で1時間4℃にて標識した。標識後に、IntelliCyt IQue screenerにおけるフローサイトメトリーによる解析に先立ち、試料を300×gで遠心分離し、生細胞イメージング溶液(Thermo Fisher)に再懸濁した。
図68A〜図68Dに示す通り、I2−A27 1×2 B−body(商標)二特異性抗体は、ROR1発現細胞(MDA−MB−231またはRPMI−8226)の存在下の場合、CD69およびCD25の発現の用量依存性増加をもたらしたが、これらの細胞の非存在下では用量依存性増加をもたらさなかった。
活性化されたT細胞がその後、ROR1発現細胞系を死滅させることができるかについて、標的細胞からのLDH放出、ならびにCD8+エフェクター細胞によるグランザイムB、TNFαおよびIFNγの分泌によって評価した。
標的細胞からのLDH放出を次の通りに解析した:ハーフエリアの黒色の壁と透明な底の96ウェルプレートにおいて、アッセイ当日にRPMI−8226細胞を蒔いた、またはアッセイ前日にMDA−MB−231細胞を蒔いた。CD8+細胞を6:1のエフェクター対標的細胞比で添加した。アッセイ培地は、RPMI+2%熱失活FBSであった。細胞を37℃/5%COで2日間インキュベートした。各ウェル由来のアッセイ培地を使用して、製造業者のプロトコールに従って乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出アッセイ(Roche)を行った。CD8+なし対照(0%細胞傷害性)および洗剤死滅対照(100%細胞傷害性)に対してデータを正規化した。
図69Aおよび図69Bに示す通り、I2−A27 1×2 B−body(商標)二特異性抗体は、CD8+T細胞の存在下でROR1発現細胞の用量依存性細胞傷害性をもたらしたが、CD8+T細胞の非存在下では用量依存性細胞傷害性をもたらさなかった。
CD8+エフェクター細胞によるグランザイムB、TNFαおよびIFNγの分泌を次の通りに解析した:MultiCyt QBeads PlexScreen分泌タンパク質アッセイキット(IntelliCyt)を使用して、製造業者のプロトコールに従って分泌されたTNFα、IFNγおよびグランザイムBのレベルを決定した。簡潔に説明すると、分析物毎の捕捉ビーズを50×濃縮物として用意する。使用に先立ち、ビーズを一緒に組み合わせ、2×濃縮物に希釈する。10μLの上清をV字底プレートに移し、10μLの調製されたビーズを試料に添加し、プレート振盪機においてプレートを混合し、プレートを室温で1時間インキュベートする。インキュベーション後に、10μLの検出試薬を各ウェルに添加し、プレート振盪機においてプレートを混合し、プレートを室温で2時間インキュベートする。インキュベーション後に、50μLの洗浄緩衝剤を各ウェルに添加し、プレートを5分間1100×gで遠心分離し、上清を吸引し、10μLの洗浄緩衝剤を各ウェルに添加することにより試料を再懸濁する。IntelliCyt IQue Screenerフローサイトメーターにおいてデータを取得する。
CD8+T細胞によって放出されるグランザイムB、TNFαおよびIFNγの用量依存性増加は、I2−A27およびROR1発現細胞の存在下で観察された;このような増加は、図70A〜図70Fに示す通り、ROR1発現細胞の非存在下では観察されなかった。
6.13.25.5.ROR1×CD3 1×2 B−body(商標)二特異性抗体の血清安定性評価
I2−A27 1×2 B−body(商標)二特異性抗体の血清安定性を解析した。I2−A27 1×2 B−body(商標)二特異性抗体を、PBSにおける2.5mg/mLから、ヒト血清(約93%最終血清濃度)またはPBSにおける170μg/mLへと希釈した。次に、試料を37℃または4℃で1週間インキュベートした。1週間に及ぶインキュベーション後に、ヒト血清またはPBS対照において貯蔵した試料においてJurkat活性アッセイを実行した。1週間4℃または37℃でヒト血清において貯蔵した試料に、活性の損失がないことが判明した(図71Aを参照)。血清における1週間に及ぶインキュベーション中に材料が凝集した場合、B−body(商標)は、CD3受容体の直接的活性化により、ROR1発現細胞の非存在下でシグナルの増加をもたらすと予想することができる。ROR1発現細胞の非存在下でアッセイのランを行った場合、活性増加は検出されなかった(図71Bを参照)。
次に、PBSにおける2.5mg/mLにて4℃または40℃で抗体を貯蔵し、毎週SECおよびPDIにより試料の均一性を評価することにより、I2−A27 1×2 B−body(商標)二特異性抗体の安定性を評価した。加速された安定性アッセイのため、PBSにおける2.5mg/mLの抗体を40℃で最大4週間貯蔵した。抗体は、加速された安定性条件下で安定していると思われた(図72を参照)。リアルタイムアッセイのため、PBSにおける2.5mg/mLの抗体を4℃で最大12週間貯蔵した。抗体はまた、リアルタイム条件下で安定していると思われた(図73を参照)。
加速されたリアルタイム安定性試料毎のPDIおよびZ平均(ave)直径を、UNcle分析機器を使用して決定し、結果を下の表18に示す。
表18. UNcle分析機器を使用して決定された、加速されたリアルタイム安定性試料毎のPDIおよびZ平均直径
Figure 2021522162
次に、酸における抗体の安定性を評価した。100mM酢酸ナトリウム、pH3.5を使用した溶出によりCH1親和性樹脂に結合することにより、B−body(商標)を、上に概要を述べる精製手順に付した。B−body(商標)を酸に0、30、60または120分間放置し、その後、Tris−HCl緩衝剤で中和した。次に、SECにより解析する前に、タンパク質の緩衝液をPBSに交換した。図74に示す通り、I2−A27 1×2 B−body(商標)二特異性抗体は、酸において最大2時間安定していた。
6.13.25.6.ROR1×CD3 1×2 B−body(商標)二特異性抗体のin vivo有効性試験
乳がんのPBMCヒト化NSG(商標)マウスモデルにおいて、例示的なROR1×CD3二特異性B−body(商標)、I2−A27 1×2 B−body(商標)のin vivo有効性を試験した。
より具体的には、6〜8週齢のNSM(商標)(Jackson Laboratory、系統番号005557、これは、NOD−scid IL2Rガンマnull、NOD−scid IL2Rgnull、NSG、NOD scidガンマとしても公知である)雌マウスに、MatrigelとPBSまたは無血清培地の1:1混合物に再懸濁した5×10個のMDA−MB−231を、乳房脂肪体において同所性に接種した。体重および臨床観察を1週間に1回〜2回記録した。腫瘍が触知可能になったら、デジタルノギス測定を開始して、腫瘍体積を1週間に1回〜2回決定した。腫瘍体積が約60〜80mmに達したら、腫瘍体積に基づきマウスをランダム化した(試験−1日目または試験0日目)。試験0日目に、マウスにPBMCを注射した。PBMCの注射の後に、第1相検証の結果に基づき投薬を始めた。マウスに、0.5mg/kg、2.5mg/kgおよび10mg/kgで投薬した。体重、臨床観察およびデジタルノギス測定を、用量開始後に1週間に2回記録した。≦2のボディ・コンディション・スコア、≧20%の体重減少または腫瘍体積>2000mmに達した動物は、試験終点前に安楽死させた。潰瘍化した腫瘍を有する動物は、試験終点前に安楽死させた。死亡しているのが見つかった動物からは組織を収集しなかった。試験30日目に、CO窒息により全動物を安楽死させ、組織を収集した。次に、腫瘍を収集し、断片へと分離した。1つの断片は、フローサイトメトリー解析のために培地に置いた。次のマーカーを検査した:CD45、CD3、CD8、CD4および7AAD。1つの断片は、パラフィン包埋(FFPE)のために10%中性緩衝ホルマリン(NBF)において固定した。1つの断片は瞬間(flash)凍結した。試験の終わりに全血を収集した。フローサイトメトリー解析のために約50μLの全血を得た。次のマーカーを検査した:CD45、CD3、CD8、CD4および7AAD。
結果を図87(上部パネル)および図88に示す。図示する通り、I2−A27 1×2 B−body(商標)は、用量0.5mg/kgおよび2.5mg/kgにおいて、腫瘍成長の低減におけるin vivo有効性を実証した。
6.13.26.
(実施例25)
ROR1/ROR2×CD3二重特異性B−body(商標)の有効性
表6に示すI2A−10の6つのCDRおよび様々なCDR変異体を含むさらなるROR抗原結合分子を調製し、実験を実施してROR1×CD3二重特異性B−body(商標)フォーマットの三価二重特異性構築物としてのそれらの有効性を試験した。
6.13.26.1.
I2−A10に基づくさらなるROR1/ROR2×CD3 1×2 B−body(商標)二重特異性抗体の生成
I2−A10抗体ならびにIgG、1×1 B−body(商標)および1×2 B−body(商標)フォーマットの抗体構築物のCDR領域の選択的変異を作製し、試験した。
例えば、I2A−10と命名されたROR ABS候補は、上記で説明されているように、CD3 ABS候補SP34−89と二重特異性B−body「BC1」1×2フォーマットへとフォーマットされ、その1×2フォーマットはSドメインとHドメインとの間に10アミノ酸ジャンクションを有する(例えば、ドメインの概略図については図26を参照)。例示的なI2A−10 BC1 1×2三価二重特異性ROR抗原結合分子を形成する5つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号114(鎖1)、配列番号115(鎖2)、配列番号116(鎖3)、配列番号117(鎖4)、および配列番号115(鎖5)として挙げられている。
この実施例における以下の説明において、「I2−A10 1×2 B−body(商標)」または「I2−A10」または「A10」という用語は、配列番号114の鎖1、配列番号115の鎖2、配列番号116の鎖3、配列番号117の鎖4、および配列番号115の鎖5を有するこのROR1/ROR2×CD3 1×2 B−body(商標)を指す。
変異を有するI2−A10抗体構築物には、I2−A10 R66G、I2−A10 R66K、I2−A10 D54G、I2−A10 D54E、I2−A10 Y55E、I2−A10 Y55Q、I2−A10 Y56S、I2−A10 Y93SY94SおよびI2−A10 A32Yが含まれる。
これらの抗体構築物の発現力価および収量を表19に示すように解析した。
表19.発現力価および収量
Figure 2021522162
次いで、これらの抗体構築物のROR1への結合を試験したところ、不十分な結合を示したA32YおよびY93/94S構築物を除き、それぞれが陽性の結合を示した。
次いで、これらの抗体構築物を本明細書に記載のJurkat機能アッセイにおいて試験した(例えば6.13.1.8を参照)。結果を表20に示す。
表20.変異を有するI2−A10構築物のJurkat機能アッセイ
Figure 2021522162
これらのバリアントは細胞殺傷アッセイにおいても試験した。結果を表21に示す。
表21. I2−A10バリアントの細胞殺傷アッセイ
Figure 2021522162
次いで、抗体構築物を解析し、SECでの均一性、SMACでの凝集傾向、およびHICでの疎水性を評価した。SEC、SMACおよびHICアッセイは、実施例24で説明されているように実施した。D54Gは、SECアッセイによると許容されなかった。Y55Q(およびY55E)は、I2−A10親よりも改善されたHIC値を示した。示差走査蛍光測定(DSF)も抗体構築物の試験に使用した。
上記のアッセイおよび解析に基づき、D54EおよびY55Q変異を、I2−A10 D54E Y55Qと命名した新規A10関連抗体の調製に選択した。潜在的異性化部位を修正するD54E変異は、予期せず、I2−A10親抗体の活性よりも良好な活性(in vitro機能アッセイ)を有する抗体をもたらした。レア残基を生殖細胞系列に逆戻りさせるY55Q変異は、予期せず、I2−A10親抗体と比較して、改善されたHIC値を有する抗体をもたらした。
次いで、さらなるROR1/ROR2×CD3 1×2 B−body(商標)がD54EおよびY55Q変異を組み込んで生成された。Y55Qは、表6に示すようにROR1およびROR2についての抗原結合部位のVLのCDR2領域における変異であり、以下に示すように鎖1および鎖3に導入された。D54Eは、表6に示すようにROR1およびROR2についての抗原結合部位のVHのCDR2領域における変異であり、以下に示すように鎖2および鎖5に導入された。さらに、ノブ・アンド・ホール(knob−and−hole)配置を生成する変異は、鎖1(ホール)および鎖3(ノブ)の第2のCH3ドメインに含まれていた。
I2A−10 D54E Y55Qと命名されたROR ABS候補は、上記で説明されているように、CD3 ABS候補SP34−89と二重特異性B−body「BC1」1×2フォーマットへとフォーマットされ、その1×2フォーマットはSドメインとHドメインとの間に10アミノ酸ジャンクションを有している(例えば、ドメインの概略図については図26を参照)。例示的なI2A−10 D54E Y55Q BC1 1×2三価二重特異性ROR抗原結合分子を形成する5つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号132(鎖1)、配列番号133(鎖2)、配列番号134(鎖3)、配列番号135(鎖4)、および配列番号133(鎖5)として挙げられている。
この実施例における以下の説明において、「I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)」または「I2−A10 D54E Y55Q」という用語は、配列番号132の鎖1、配列番号133の鎖2、配列番号134の鎖3、配列番号135の鎖4および配列番号133の鎖5を有するこのROR1/ROR2×CD3 1×2 B−body(商標)を指す。
6.13.26.2.
ROR1/ROR2×CD3 1×2 B−body(商標)二重特異性抗体のCD3およびROR1への結合
I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)のカニクイザルCD3デルタおよびイプシロンヘテロ二量体への結合親和性は、上記の実施例24で説明した一価BLI結合評価によって決定した。図75に示すように、二重特異性抗体は、カニクイザルCD3デルタおよびイプシロンヘテロ二量体に対して3.5nMの一価Kdを示した。
次に、抗体のROR1およびROR2への結合を、実施例24で説明されているように一価および二価のBLI結合評価を使用して評価した。図76A〜76Bに示すように、I2−A10 D54E Y55Q IgG抗体は、ROR1に対して0.7nM、ROR2に対して1pM未満の一価結合を示した。I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)は、ROR1に対して0.46nMおよびROR2に対して1pM未満の一価結合、ならびにROR1に対して21pMおよびROR2に対して3pMの二価結合を示した(図76C〜76Fを参照)。
次いで、I2−A10 D54E Y55Q IgGのIg様ドメイン、 FrizzledドメインおよびKringleドメインへの結合をBLIによって決定した。図77に示すように、I2−A10 D54E Y55Q IgGは、ROR1のIg様ドメインに結合する。
6.13.26.3.
ROR1/ROR2×CD3 1×2 B−body(商標)のさらなる特徴付け
I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)は、Expi−CHO細胞におけるポリペプチド鎖1〜4(ポリペプチド鎖5はポリペプチド鎖2と同じである)をコードするDNAの一過性トランスフェクションによって生成された。5つの鎖抗体をCH1親和性樹脂で精製し、バッファーをPBS、pH7.4に交換した。
得られたB−body(商標)のアセンブリおよび純度は、実施例24で説明されているように非還元および還元SDS−PAGEによって評価した。2×1 B−body(商標)は、非還元フォーマットにおいて予想される分子量の200kD近くで泳動した。還元フォーマットでは、予想される3つのバンド(75kDに1つの鎖、50kDに1つの鎖、および25kDに2つの鎖)が分離された(ここではデータは示さず)。続いて、タンパク質を、実施例24で説明されているように還元および非還元フォーマットでキャピラリー電気泳動によって解析し、そのパーセント純度を還元試料の3つの主要なバンドから計算したところ96.25%であった。
次いで、抗体タンパク質を1セットのカラムによって解析し、SECでの均一性、SMACでの凝集傾向、およびHICでの疎水性を評価した。SEC、SMACおよびHICアッセイは、実施例24で説明されているように実施した。
これらの解析の結果を図78A〜78Cに示す。示したように、タンパク質はSECによって>99%均一に見え、SMACとHICの両方で単一ピークがもたらされ、他の開発可能な抗体に対して観察された範囲内にあり、このことは許容可能な凝集および疎水性プロファイルを示唆している。
次にタンパク質を、実施例24で説明されているようにUNcle分析機器を用いて解析した。抗体は、68.5℃および77.4℃の融解温度を示した。3回の測定からのPDI中央値は0.21であり、流体力学的直径が12.6nmの単分散試料(PDI<0.25が単分散と考えられる)を示している(下記の表22を参照)。
表22. UNcle分析機器からの融解温度、多分散指数および流体力学的直径の結果
Figure 2021522162
6.13.26.4.
ROR1/ROR2×CD3 1×2 B−body(商標)のin vitro機能評価
T細胞およびROR1発現がん細胞の細胞共培養アッセイにおけるI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)の機能的能力を解析した。ROR1および/またはROR2を発現したがん細胞系を評価した。
MDA−MB−231、RPMI−8226、およびK562の細胞を、この研究において、実施例24に示したように使用し、MDA−MB−231細胞系は主としてROR1を発現すると決定され、RPMI−8226細胞系はROR1とROR2の両方を発現すると決定され、K562細胞系は主としてROR2を発現すると決定された。
I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)がROR1またはROR2発現がん細胞の存在下でT細胞を活性化することができるかどうかを評価するため、実施例24で説明されているようにNFkB Jurkat共培養レポーター遺伝子アッセイを利用した。Jurkat T細胞の活性化は、NFkB応答エレメントの活性化とeGFPの生成をもたらす。図79A〜79Dに示すように、I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)は、MDA−MB−231(ROR1発現)、RPMI−8226(ROR1およびROR2発現)ならびにK562(ROR2発現)細胞の存在下で、pM範囲のJurkatレポーター細胞系を活性化することができたが、ROR1またはROR2発現細胞系の非存在下では活性化することはできなかった。
次に、初代CD8+T細胞を活性化するI2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)の機能を研究した。この機能アッセイは、初期T細胞活性化マーカーのCD69、および後期T細胞活性化マーカーのCD25の発現レベルの増加により評価する場合、ROR1発現細胞系の存在下で、上記の実施例24に説明されている通りである。
図80A〜80Dに示すように、I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)は、ROR1発現細胞(MDA−MB−231またはRPMI−8226)の存在下である場合、CD69およびCD25の発現における用量依存的増加をもたらしたが、これらの細胞が非存在の場合には増加はなかった。
活性化T細胞が続いてROR1発現細胞系を殺傷させることができるかどうかは、標的細胞からのLDH放出、ならびにCD8+エフェクター細胞によるグランザイムB、TNFα、およびIFNγの分泌によって評価した。
標的細胞からのLDH放出は、実施例24で説明されているように解析した。図81Aおよび81Bに示すように、I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)は、CD8+T細胞の存在下でROR1発現細胞の用量依存的細胞傷害性をもたらしたが、CD8+T細胞の非存在下ではもたらされなかった。
CD8+エフェクター細胞によるグランザイムB、TNFαおよびIFNγの分泌は、実施例24で説明されているように解析した。CD8+T細胞によって放出されたグランザイムB、TNFαおよびIFNγの用量依存的増加は、図82A〜82Fに示すように、I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)およびROR1発現細胞の存在下で観察された;しかしそのような増加は、ROR1発現細胞の非存在下では観察されなかった。
6.13.26.5.
ROR1×CD3 1×2 B−body(商標)二重特異性抗体の血清安定性評価
I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)の血清安定性を解析した。二重特異性抗体は、PBS中2.5mg/mLからヒト血清(約93%最終血清濃度)またはPBS中170μg/mLに希釈した。次いで、試料を1週間37℃または4℃でインキュベートした。1週間のインキュベーション後、Jurkat活性アッセイをヒト血清に保存された試料またはPBS対照に対して実施した。ヒト血清中に、4℃または37℃で1週間保存した試料については、活性に損失がないことがわかった(図83Aを参照)。物質が血清中で1週間のインキュベーション中に凝集した場合には、B−body(商標)は、CD3受容体の直接的活性化により、ROR1発現細胞の非存在下でシグナルの増加をもたらすことが予想され得る。このアッセイがROR1発現細胞の非存在下で実施された場合、活性の増加は検出されなかった(図83Bを参照)。
次いで、I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)の安定性について、抗体を4℃または40℃でPBS中2.5mg/mLで保存し、SECおよびPDIによって試料の均一性を毎週評価することによって評価した。加速安定性アッセイについては、抗体をPBS中2.5mg/mLで40℃にて最大4週間保存した。抗体は、加速安定性条件下で安定しているように思われた(図84を参照)。リアルタイムアッセイにおいては、抗体をPBS中2.5mg/mLで4℃にて最大12週間保存した。抗体はまた、リアルタイム条件下でも安定しているように思われた(図85を参照)。
各加速安定性試料およびリアルタイム安定性試料のPDIおよびZ−ave直径は、UNcle分析機器を使用して決定し、結果を表23に示す。
表23. UNcle分析機器を使用して決定された各加速安定性試料およびリアルタイム安定性試料のPDIおよびZ−ave直径
Figure 2021522162
次に、酸での抗体の安定性を評価した。I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)は、CH1親和性樹脂に結合させ、100mMの酢酸ナトリウム、pH3.5を使用して溶出させることにより上記の精製手順に供した。Tris−HClバッファーで中和する前に、二重特異性抗体を0、30、60、または120分間、酸中に放置した。次いで、SECで解析する前に、タンパク質をPBSにバッファー交換した。図86に示すように、I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)は、酸中で最大2時間安定していた。
6.13.26.6.
ROR1/ROR2×CD3 1×2 B−body(商標)二重特異性抗体のin vivo有効性の研究
例示的なROR1/ROR2×CD3二重特異性B−body(商標)、I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)のin vivoでの有効性は、乳がんのPBMCヒト化NSG(商標)マウスモデルで研究した。この研究は、上記の実施例24で説明されているように実施した。
結果を図87(下パネル)および図88に示す。示すように、I2−A10 D54E Y55Q 1×2 B−body(商標)は、用量0.5mg/kg、2.5mg/kg、および10mg/kgで腫瘍成長を減少させるin vivoでの有効性を実証した。
6.14.配列
Figure 2021522162
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他の配列:
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7.参照による組み込み
本出願で引用された全ての公開文献、特許、特許出願および他の文献は、あたかも個別の公開文献、特許、特許出願または他の文献が、あらゆる目的のために参照により個別に示されて組み込まれているのと同程度に、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
8.均等物
様々な特定の実施形態を例証および記載してきたが、上記明細書は限定的なものではない。様々な変更が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行われうることが理解される。多くの変形が、本明細書を検討すると、当業者には明らかになる。

Claims (169)

  1. チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体(ROR)結合分子であって、前記ROR抗原結合分子が、
    ROR抗原に特異的な第1の抗原結合部位
    を含み、前記第1の抗原結合部位が、
    A)特定のROR抗原結合部位由来の特定の軽鎖可変領域(VL)のCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列であって、CDR1、CDR2およびCDR3 VL配列が表6から選択される、CDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列;ならびに
    B)前記特定のROR抗原結合部位由来の特定の重鎖可変領域(VH)のCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列であって、CDR1、CDR2およびCDR3 VH配列が表6から選択される、CDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列
    を含み、
    前記第1の抗原結合部位が、ROR1およびROR2に特異的である、ROR結合分子。
  2. チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体(ROR)結合分子であって、前記ROR抗原結合分子が、
    ROR抗原に特異的な第1の抗原結合部位
    を含み、前記第1の抗原結合部位が、
    A)特定のROR抗原結合部位由来の特定の軽鎖可変領域(VL)のCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列であって、CDR1、CDR2およびCDR3 VL配列が表6から選択される、CDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列;ならびに
    B)前記特定のROR抗原結合部位由来の特定の重鎖可変領域(VH)のCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列であって、CDR1、CDR2およびCDR3 VH配列が表6から選択される、CDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列
    を含み、
    前記第1の抗原結合部位が、ROR1に特異的である、ROR結合分子。
  3. チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体(ROR)結合分子であって、前記ROR抗原結合分子が、
    ROR抗原に特異的な第1の抗原結合部位
    を含み、前記第1の抗原結合部位が、
    A)特定のROR抗原結合部位由来の特定の軽鎖可変領域(VL)のCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列であって、CDR1、CDR2およびCDR3 VL配列が表6から選択される、CDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列;ならびに
    B)前記特定のROR抗原結合部位由来の特定の重鎖可変領域(VH)のCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列であって、CDR1、CDR2およびCDR3 VH配列が表6から選択される、CDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列
    を含み、
    前記第1の抗原結合部位が、ROR2に特異的である、ROR結合分子。
  4. 前記ROR抗原が、ROR1 Frizzleドメイン、ROR2 Frizzleドメイン、ROR1 Ig様ドメイン、ROR2 Ig様ドメイン、ROR1 KringleドメインおよびROR2 Kringleドメインからなる群から選択されるドメインである、請求項1から3のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  5. 前記ROR抗原が、ヒトROR抗原を含む、請求項1から4のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  6. 前記第1の抗原結合部位が、表6のI2A−1、I2A−10、I2A−10 D54E Y55Q、I2A−11、I2A−13、I2A−14、I2A−16、I2A−18、I2A−19、I2A−22、I2A−24、I2A−26、I2A−34、I2A−36、I2C−1、I2C−2、I2C−4、I2C−6、I2C−8、I2C−9、I2C−10、I2C−11、I2C−12、I2C−13、I2C−14、I2C−15、I2C−16、I2C−17、I2C−18、I2C−1−20、I2C−22、I2C−23またはI2C−24のCDR1、CDR2およびCDR3 VH配列ならびにCDR1、CDR2およびCDR3 VL配列を含む、請求項1、4および5のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  7. 前記第1の抗原結合部位が、表6のI2A−3、I2A−4、I2A−6、I2A−8、I2A−12、I2A−20、I2A−25、I2A−26、I2A−27、I2A−30、I2A−32、I2A−33またはI2A37のCDR1、CDR2およびCDR3 VH配列ならびにCDR1、CDR2およびCDR3 VL配列を含む、請求項2、4および5のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  8. 前記第1の抗原結合部位が、表6のI2C−3、I2C−5、I2C−7、I2C−19、I2C−21、I2C−25またはI2C−26のCDR1、CDR2およびCDR3 VH配列ならびにCDR1、CDR2およびCDR3 VL配列を含む、請求項3、4および5のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  9. 第2の抗原結合部位をさらに含む、請求項1から8のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  10. 前記第2の抗原結合部位が、前記第1の抗原結合部位と同じである、請求項9に記載のROR抗原結合分子。
  11. 前記第2の抗原結合部位が、表6のI2A−1、I2A−10、I2A−10 D54E Y55Q、I2A−11、I2A−13、I2A−14、I2A−16、I2A−18、I2A−19、I2A−22、I2A−24、I2A−26、I2A−34、I2A−36、I2C−1、I2C−2、I2C−4、I2C−6、I2C−8、I2C−9、I2C−10、I2C−11、I2C−12、I2C−13、I2C−14、I2C−15、I2C−16、I2C−17、I2C−18、I2C−1−20、I2C−22、I2C−23またはI2C−24のCDR1、CDR2およびCDR3 VH配列ならびにCDR1、CDR2およびCDR3 VL配列を含む、請求項9に記載のROR抗原結合分子。
  12. 前記第2の抗原結合部位が、表6のI2A−3、I2A−4、I2A−6、I2A−8、I2A−12、I2A−20、I2A−25、I2A−26、I2A−27、I2A−30、I2A−32、I2A−33またはI2A37のCDR1、CDR2およびCDR3 VH配列ならびにCDR1、CDR2およびCDR3 VL配列を含む、請求項9に記載のROR抗原結合分子。
  13. 前記第2の抗原結合部位が、表6のI2C−3、I2C−5、I2C−7、I2C−19、I2C−21、I2C−25またはI2C−26のCDR1、CDR2およびCDR3 VH配列ならびにCDR1、CDR2およびCDR3 VL配列を含む、請求項9に記載のROR抗原結合分子。
  14. 前記第2の抗原結合部位が、前記ROR抗原と異なる第2の抗原に特異的である、請求項9に記載のROR抗原結合分子。
  15. 前記第2の抗原が、CD3抗原である、請求項14に記載のROR抗原結合分子。
  16. 前記抗原結合部位が、前記CD3抗原のあるエピトープに特異的である、請求項15に記載のROR抗原結合分子。
  17. 前記第2の抗原結合部位が、
    A)配列番号69および配列番号73からなる群から選択される特定の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列;ならびに
    B)配列番号68、配列番号70、配列番号71および配列番号72からなる群から選択される特定の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列
    を含む、請求項15に記載のROR抗原結合分子。
  18. 前記第2の抗原結合部位が、
    A)配列番号69および配列番号73からなる群から選択される特定の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列;ならびに
    B)配列番号68、配列番号70、配列番号71および配列番号72からなる群から選択される特定の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列
    を含む、請求項15に記載のROR抗原結合分子。
  19. 全長抗体、Fab断片、Fv、scFv、タンデムscFv、ダイアボディ、scダイアボディ、DART、tandAbおよびミニボディからなる群から選択される抗体フォーマットを含む、請求項1から18のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  20. 1つまたは複数の定常領域の配列を含む、請求項1から19のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  21. 前記定常領域が、CH1、CH2、CH3および/またはCL定常領域である、請求項20に記載のROR抗原結合分子。
  22. 前記定常領域の配列が、(i)配列番号23、配列番号113、配列番号131もしくは配列番号149であるCH1定常領域配列;(ii)配列番号14、配列番号20、配列番号28、配列番号35、配列番号43、配列番号51、配列番号102、配列番号110、配列番号120、配列番号128、配列番号138もしくは配列番号146であるCH2定常領域配列;(iii)配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号21、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号34、配列番号36、配列番号39、配列番号44、配列番号47、配列番号52、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号111、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号129、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、もしくは配列番号147であるCH3定常領域配列;および/または(iv)配列番号19、配列番号42、配列番号50、配列番号109、配列番号127もしくは配列番号145であるCL定常領域配列のうち1つまたは複数を含む、請求項20から21のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  23. 第1および第2のポリペプチド鎖を含み、
    (a)前記第1のポリペプチド鎖はドメインA、ドメインB、ドメインDおよびドメインEを含み、
    ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、A−B−D−Eの配向で配置され、
    ドメインAは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、
    ドメインB、ドメインDおよびドメインEは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;
    (b)前記第2のポリペプチド鎖はドメインFおよびドメインGを含み、
    ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、F−Gの配向で配置され、
    ドメインFは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインGは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、
    (c)前記第1および前記第2のポリペプチドは、前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用および前記Bドメインと前記Gドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ROR抗原結合分子を形成し、前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用は、前記第1の抗原結合部位を形成する、請求項1から22のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  24. 第3および第4のポリペプチド鎖をさらに含み、
    (a)前記第3のポリペプチド鎖はドメインH、ドメインI、ドメインJおよびドメインKを含み、
    ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、H−I−J−Kの配向で配置され、
    ドメインHは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインI、JおよびKは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;
    (b)前記第4のポリペプチド鎖はドメインLおよびドメインMを含み、
    ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、L−Mの配向で配置され、
    ドメインLは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインMは定常領域アミノ酸配列を有し;
    (c)前記第3および前記第4のポリペプチドは、前記Hドメインと前記Lドメインとの間の相互作用および前記Iドメインと前記Mドメインとの間の相互作用を介して会合し;
    (d)前記第1および前記第3のポリペプチドは、前記Dドメインと前記Jドメインとの間の相互作用および前記Eドメインと前記Kドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ROR抗原結合分子を形成し、前記Hドメインと前記Lドメインとの間の相互作用は、第2の抗原結合部位を形成する、請求項23に記載のROR抗原結合分子。
  25. 前記第1の抗原結合部位が、ROR1およびROR2に、ROR1に、またはROR2に特異的である、請求項23または24に記載のROR抗原結合分子。
  26. 前記第1の抗原結合部位が、表6のI2A−1、I2A−10、I2A−10 D54E Y55Q、I2A−11、I2A−13、I2A−14、I2A−16、I2A−18、I2A−19、I2A−22、I2A−24、I2A−26、I2A−34、I2A−36、I2C−1、I2C−2、I2C−4、I2C−6、I2C−8、I2C−9、I2C−10、I2C−11、I2C−12、I2C−13、I2C−14、I2C−15、I2C−16、I2C−17、I2C−18、I2C−1−20、I2C−22、I2C−23またはI2C−24のCDR1、CDR2およびCDR3 VH配列ならびにCDR1、CDR2およびCDR3 VL配列を含む、請求項25に記載のROR抗原結合分子。
  27. 前記第1の抗原結合部位が、表6のI2A−3、I2A−4、I2A−6、I2A−8、I2A−12、I2A−20、I2A−25、I2A−26、I2A−27、I2A−30、I2A−32、I2A−33またはI2A37のCDR1、CDR2およびCDR3 VH配列ならびにCDR1、CDR2およびCDR3 VL配列を含む、請求項25に記載のROR抗原結合分子。
  28. 前記第1の抗原結合部位が、表6のI2C−3、I2C−5、I2C−7、I2C−19、I2C−21、I2C−25またはI2C−26のCDR1、CDR2およびCDR3 VH配列ならびにCDR1、CDR2およびCDR3 VL配列を含む、請求項25に記載のROR抗原結合分子。
  29. 前記第2の抗原結合部位が、CD3に特異的である、請求項24から28のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  30. ドメインBおよびドメインGが、CH3アミノ酸配列を有する、請求項23から28のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  31. 前記Bドメインおよび前記Gドメインのアミノ酸配列が同一であり、前記配列は内在性CH3配列である、請求項30に記載のROR抗原結合分子。
  32. 前記Bドメインおよび前記Gドメインのアミノ酸配列が異なり、それぞれ別個に直交型修飾を内在性CH3配列に含み、前記Bドメインは前記Gドメインと相互作用し、前記Bドメインと前記Gドメインのどちらも、前記直交型修飾を欠くCH3ドメインと有意に相互作用しない、請求項30に記載のROR抗原結合分子。
  33. 前記Bドメインおよび前記Gドメインの前記直交型修飾が、前記Bドメインと前記Gドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む、請求項32に記載のROR抗原結合分子。
  34. 操作されたジスルフィド架橋を生成する前記Bドメインおよび前記Gドメインの前記変異が、前記BドメインとGドメインの一方におけるS354C変異、および他方のドメインにおける349Cである、請求項33に記載のROR抗原結合分子。
  35. 前記Bドメインおよび前記Gドメインの前記直交型修飾が、ノブ・イン・ホール変異を含む、請求項32から34のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  36. 前記Bドメインおよび前記Gドメインの前記ノブ・イン・ホール変異が、前記BドメインとGドメインの一方におけるT366W変異、ならびに他方のドメインにおけるT366S、L368AおよびY407V変異である、請求項35に記載のROR抗原結合分子。
  37. 前記Bドメインおよび前記Gドメインの前記直交型修飾が、電荷対変異を含む、請求項32から36のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  38. 前記Bドメインおよび前記Gドメインの前記電荷対変異が、前記BドメインとGドメインの一方におけるT366K変異、および他方のドメインにおけるL351D変異である、請求項37に記載のROR抗原結合分子。
  39. ドメインBおよびドメインGが、IgM CH2アミノ酸配列またはIgE CH2アミノ酸配列を有する、請求項23から38のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  40. 前記IgM CH2アミノ酸配列または前記IgE CH2アミノ酸配列が、直交型修飾を含む、請求項39に記載のROR抗原結合分子。
  41. ドメインIがCL配列を有し、ドメインMがCH1配列を有する、請求項24から40のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  42. ドメインIがCH1配列を有し、ドメインMがCL配列を有する、請求項24から40のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  43. 前記CH1配列および前記CL配列がそれぞれ、1つまたは複数の直交型修飾を含み、前記CH1配列を有するドメインが、前記直交型修飾を欠くCL配列を有するドメインと有意に相互作用しない、請求項41または42に記載のROR抗原結合分子。
  44. 前記直交型修飾が、少なくとも1つのCH1ドメインとCLドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含み、前記変異が、前記CH1配列の138位および前記CL配列の116位における操作されたシステイン;前記CH1配列の128位および前記CL配列の119位における操作されたシステイン、ならびに前記CH1配列の129位および前記CL配列の210位における操作されたシステインからなる群から選択される、請求項43に記載のROR抗原結合分子。
  45. 前記直交型修飾が、少なくとも1つのCH1ドメインとCLドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含み、前記変異が、前記CH1配列の128位およびCLカッパ配列の118位における操作されたシステインを含む、請求項43に記載のROR抗原結合分子。
  46. 前記直交型修飾が、少なくとも1つのCH1ドメインとCLドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含み、前記変異が、前記CL配列におけるF118C変異と対応する前記CH1配列におけるA141C;前記CL配列におけるF118C変異と対応する前記CH1配列におけるL128C;および前記CL配列におけるS162C変異と対応する前記CH1配列におけるP171C変異からなる群から選択される、請求項43に記載のROR抗原結合分子。
  47. 前記直交型修飾が、少なくとも1つのCH1ドメインとCLドメインとの間の電荷対変異を含み、前記電荷対変異が、前記CL配列におけるF118S変異と対応する前記CH1配列におけるA141L;前記CL配列におけるF118A変異と対応する前記CH1配列におけるA141L;前記CL配列におけるF118V変異と対応する前記CH1配列におけるA141L;および前記CL配列におけるT129R変異と対応する前記CH1配列におけるK147Dからなる群から選択される、請求項43から46のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  48. 前記直交型修飾が、少なくとも1つのCH1ドメインとCLドメインとの間の電荷対変異を含み、前記電荷対変異が、前記CL配列におけるN138K変異と対応する前記CH1配列におけるG166D、および前記CL配列におけるN138D変異と対応する前記CH1配列におけるG166Kからなる群から選択される、請求項43から46のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  49. ドメインAがVLアミノ酸配列を有し、ドメインFがVHアミノ酸配列を有する、請求項23から48のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  50. ドメインAがVHアミノ酸配列を有し、ドメインFがVLアミノ酸配列を有する、請求項23から48のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  51. ドメインHがVLアミノ酸配列を有し、ドメインLがVHアミノ酸配列を有する、請求項24から45のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  52. ドメインHがVHアミノ酸配列を有し、ドメインLがVLアミノ酸配列を有する、請求項24から45のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  53. ドメインDおよびドメインJが、CH2アミノ酸配列を有する、請求項24のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  54. 前記Eドメインが、CH3アミノ酸配列を有する、請求項23から53のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  55. 前記Eドメインおよび前記Kドメインのアミノ酸配列が同一であり、前記配列は内在性CH3配列である、請求項24から54のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  56. 前記Eドメインおよび前記Kドメインのアミノ酸配列が異なる、請求項24から54のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  57. 前記異なる配列が、それぞれ別個に直交型修飾を内在性CH3配列に含み、前記Eドメインは前記Kドメインと相互作用し、前記Eドメインと前記Kドメインのどちらも、前記直交型修飾を欠くCH3ドメインと有意に相互作用しない、請求項56に記載のROR抗原結合分子。
  58. 前記直交型修飾が、前記Eドメインと前記Kドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む、請求項57に記載のROR抗原結合分子。
  59. 操作されたジスルフィド架橋を生成する前記変異が、前記Eドメインと前記Kドメインの一方におけるS354C変異、および他方のドメインにおける349Cである、請求項58に記載のROR抗原結合分子。
  60. 前記Eドメインおよび前記Kドメインにおける前記直交型修飾が、ノブ・イン・ホール変異を含む、請求項57から59のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  61. 前記ノブ・イン・ホール変異が、前記Eドメインまたは前記Kドメインの一方におけるT366W変異、ならびに他方のドメインにおけるT366S、L368AおよびY407V変異である、請求項60に記載のROR抗原結合分子。
  62. 前記Eドメインおよび前記Kドメインにおける前記直交型修飾が、電荷対変異を含む、請求項57から61のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  63. 前記電荷対変異が、前記Eドメインまたは前記Kドメインの一方におけるT366K変異、および他方のドメインにおける対応するL351D変異である、請求項62に記載のROR抗原結合分子。
  64. 前記Eドメインおよび前記Kドメインのアミノ酸配列が、前記第1のポリペプチドと前記第3のポリペプチドとの間の特異的会合を促進する特異的相互作用を有するように選択された2つの異なる抗体ドメインの内在性配列である、請求項56に記載のROR抗原結合分子。
  65. 前記2つの異なるアミノ酸配列が、CH1配列およびCL配列である、請求項64に記載のROR抗原結合分子。
  66. 第3の抗原結合部位をさらに含む、請求項1から65のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  67. 前記第3の抗原結合部位が、ROR1およびROR2に、ROR1に、またはROR2に特異的である、請求項54に記載のROR抗原結合分子。
  68. 前記第3の抗原結合部位が、前記第1の抗原結合部位と同じである、請求項67に記載のROR抗原結合分子。
  69. 前記第3の抗原結合部位が、表6のI2A−1、I2A−10、I2A−10 D54E Y55Q、I2A−11、I2A−13、I2A−14、I2A−16、I2A−18、I2A−19、I2A−22、I2A−24、I2A−26、I2A−34、I2A−36、I2C−1、I2C−2、I2C−4、I2C−6、I2C−8、I2C−9、I2C−10、I2C−11、I2C−12、I2C−13、I2C−14、I2C−15、I2C−16、I2C−17、I2C−18、I2C−1−20、I2C−22、I2C−23またはI2C−24のCDR1、CDR2およびCDR3 VH配列ならびにCDR1、CDR2およびCDR3 VL配列を含む、請求項67または68に記載のROR抗原結合分子。
  70. 前記第3の抗原結合部位が、表6のI2A−3、I2A−4、I2A−6、I2A−8、I2A−12、I2A−20、I2A−25、I2A−26、I2A−27、I2A−30、I2A−32、I2A−33またはI2A37のCDR1、CDR2およびCDR3 VH配列ならびにCDR1、CDR2およびCDR3 VL配列を含む、請求項67または68に記載のROR抗原結合分子。
  71. 前記第3の抗原結合部位が、表6のI2C−3、I2C−5、I2C−7、I2C−19、I2C−21、I2C−25またはI2C−26のCDR1、CDR2およびCDR3 VH配列ならびにCDR1、CDR2およびCDR3 VL配列を含む、請求項67または68に記載のROR抗原結合分子。
  72. 第5のポリペプチド鎖を含み、
    (a)前記第1のポリペプチド鎖はドメインNおよびドメインOをさらに含み、ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、N−O−A−B−D−Eの配向で配置され、
    ドメインNは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインOは定常領域アミノ酸配列を有し;
    (b)前記第5のポリペプチド鎖はドメインPおよびドメインQを含み、ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、P−Qの配向で配置され、
    ドメインPは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインQは定常領域アミノ酸配列を有し;
    (c)前記第1および前記第5のポリペプチドは、前記Nドメインと前記Pドメインとの間の相互作用および前記Oドメインと前記Qドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ROR抗原結合分子を形成する、請求項66から71のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  73. (a)ドメインNおよびドメインAのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインHのアミノ酸配列がドメインNおよびドメインAの配列と異なり、
    ドメインOおよびドメインBのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインIのアミノ酸配列がドメインOおよびドメインBの配列と異なり、
    ドメインPおよびドメインFのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインLのアミノ酸配列がドメインPおよびドメインFの配列と異なり、
    ドメインQおよびドメインGのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインMのアミノ酸配列がドメインQおよびドメインGの配列と異なり;
    (b)前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、前記Hドメインと前記Lドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、前記Nドメインと前記Pドメインとの間の相互作用が、前記第1の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する、請求項72に記載のROR抗原結合分子。
  74. 前記第1の抗原が、ROR抗原である、請求項73に記載のROR抗原結合分子。
  75. 前記第2の抗原が、CD3抗原である、請求項73または74に記載のROR抗原結合分子。
  76. (a)ドメインN、ドメインAおよびドメインHのアミノ酸配列が異なり、
    ドメインO、ドメインBおよびドメインIのアミノ酸配列が異なり、
    ドメインP、ドメインFおよびドメインLのアミノ酸配列が異なり、
    ドメインQ、ドメインGおよびドメインMのアミノ酸配列が異なり;
    (b)前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、
    前記Hドメインと前記Lドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、
    前記Nドメインと前記Pドメインとの間の相互作用が、第3の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する、請求項58に記載のROR抗原結合分子。
  77. 第5のポリペプチド鎖を含み、
    (a)前記第3のポリペプチド鎖はドメインRおよびドメインSをさらに含み、
    ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、R−S−H−I−J−Kの配向で配置され、
    ドメインRは可変領域アミノ酸配列を有し、ドメインSは定常ドメインアミノ酸配列を有し;
    (b)前記第5のポリペプチド鎖はドメインTおよびドメインUを含み:
    ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、T−Uの配向で配置され、
    ドメインTは可変領域アミノ酸配列を有し、ドメインUは定常ドメインアミノ酸配列を有し;
    (c)前記第3および前記第5のポリペプチドは、前記Rドメインと前記Tドメインとの間の相互作用および前記Sドメインと前記Uドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ROR抗原結合分子を形成する、請求項66から69のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  78. (a)ドメインRおよびドメインAのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインHのアミノ酸配列がドメインRおよびドメインAの配列と異なり、
    ドメインSおよびドメインBのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインIのアミノ酸配列がドメインSおよびドメインBの配列と異なり、
    ドメインTおよびドメインFのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインLのアミノ酸配列がドメインTおよびドメインFの配列と異なり、
    ドメインUおよびドメインGのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインMのアミノ酸配列がドメインUおよびドメインGの配列と異なり;
    (b)前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、
    前記Hドメインと前記Lドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、
    前記Rドメインと前記Tドメインとの間の相互作用が、前記第1の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する、請求項77に記載のROR抗原結合分子。
  79. 前記第1の抗原が、ROR抗原である、請求項78に記載のROR抗原結合分子。
  80. 前記第2の抗原が、CD3抗原である、請求項78または79に記載のROR抗原結合分子。
  81. 前記分子が、5つのポリペプチド鎖を含み、鎖1が配列番号96を含み、鎖2が配列番号97を含み、鎖3が配列番号98を含み、鎖4が配列番号99を含み、鎖5が配列番号97を含む、請求項77から80のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  82. 前記分子が、5つのポリペプチド鎖を含み、鎖1が配列番号114を含み、鎖2が配列番号115を含み、鎖3が配列番号116を含み、鎖4が配列番号117を含み、鎖5が配列番号115を含む、請求項77から80のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  83. 前記分子が、5つのポリペプチド鎖を含み、鎖1が配列番号132を含み、鎖2が配列番号133を含み、鎖3が配列番号134を含み、鎖4が配列番号135を含み、鎖5が配列番号133を含む、請求項77から80のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  84. (a)ドメインRおよびドメインHのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインAのアミノ酸配列が、ドメインRおよびドメインHの配列と異なり、
    ドメインSおよびドメインIのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインBのアミノ酸配列が、ドメインSおよびドメインIの配列と異なり、
    ドメインTおよびドメインLのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインFのアミノ酸配列が、ドメインTおよびドメインLの配列と異なり、
    ドメインUおよびドメインMのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインGのアミノ酸配列が、ドメインUおよびドメインMの配列と異なり、
    (b)前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、
    前記Hドメインと前記Lドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、
    前記Rドメインと前記Tドメインとの間の相互作用が、前記第2の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する、請求項77に記載のROR抗原結合分子。
  85. 前記第2の抗原が、ROR抗原である、請求項84に記載のROR抗原結合分子。
  86. 前記第1の抗原が、CD3抗原である、請求項85に記載のROR抗原結合分子。
  87. (a)ドメインR、ドメインAおよびドメインHのアミノ酸配列が異なり、
    ドメインS、ドメインBおよびドメインIのアミノ酸配列が異なり、
    ドメインT、ドメインFおよびドメインLのアミノ酸配列が異なり、
    ドメインU、ドメインGおよびドメインMのアミノ酸配列が異なり;
    (b)前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、
    前記Hドメインと前記Lドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、
    前記Rドメインと前記Tドメインとの間の相互作用が、第3の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する、請求項77に記載のROR抗原結合分子。
  88. 第1および第2のポリペプチド鎖を含むチロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体(ROR)抗原結合分子であって、
    (a)前記第1のポリペプチド鎖はドメインA、ドメインB、ドメインDおよびドメインEを含み、
    ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、A−B−D−Eの配向で配置され、
    ドメインAはVLアミノ酸配列を有し、ドメインBはCH3アミノ酸配列を有し、ドメインDはCH2アミノ酸配列を有し、ドメインEは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;
    (b)前記第2のポリペプチド鎖はドメインFおよびドメインGを含み、
    ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、F−Gの配向で配置され、
    ドメインFはVHアミノ酸配列を有し、ドメインGはCH3アミノ酸配列を有し;
    (c)前記第1および前記第2のポリペプチドは、前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用および前記Bドメインと前記Gドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ROR抗原結合分子を形成し、前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用は、ROR抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成する、ROR抗原結合分子。
  89. 第1、第2、第3および第4のポリペプチド鎖を含むチロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体(ROR)抗原結合分子であって、
    (a)前記第1のポリペプチド鎖はドメインA、ドメインB、ドメインDおよびドメインEを含み、
    ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、A−B−D−Eの配向で配置され、
    ドメインAはVLアミノ酸配列を有し、ドメインBはCH3アミノ酸配列を有し、ドメインDはCH2アミノ酸配列を有し、ドメインEは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;
    (b)前記第2のポリペプチド鎖はドメインFおよびドメインGを含み、
    ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、F−Gの配向で配置され、
    ドメインFはVHアミノ酸配列を有し、ドメインGはCH3アミノ酸配列を有し;
    (c)前記第3のポリペプチド鎖はドメインH、ドメインI、ドメインJおよびドメインKを含み、
    ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、H−I−J−Kの配向で配置され、
    ドメインHは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインIは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインJはCH2アミノ酸配列を有し、Kは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;
    (d)前記第4のポリペプチド鎖はドメインLおよびドメインMを含み、
    ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、L−Mの配向で配置され、
    ドメインLは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインMは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;
    (e)前記第1および前記第2のポリペプチドは、前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用および前記Bドメインと前記Gドメインとの間の相互作用を介して会合し;
    (f)前記第3および前記第4のポリペプチドは、前記Hドメインと前記Lドメインとの間の相互作用および前記Iドメインと前記Mドメインとの間の相互作用を介して会合し;
    (g)前記第1および前記第3のポリペプチドは、前記Dドメインと前記Jドメインとの間の相互作用および前記Eドメインと前記Kドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ROR抗原結合分子を形成し、
    前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用は、第1の抗原結合部位を形成し、前記Hドメインと前記Lドメインとの間の相互作用は、第2の抗原結合部位を形成し、
    前記第1の抗原結合部位、前記第2の抗原結合部位、または前記第1および前記第2の抗原結合部位は、ROR抗原に特異的である、ROR抗原結合分子。
  90. 前記第1の抗原結合部位が、ROR抗原に特異的である、請求項89に記載のROR抗原結合分子。
  91. 前記第2の抗原結合部位が、ROR抗原に特異的である、請求項89または90に記載のROR抗原結合分子。
  92. 前記第1および前記第2の抗原結合部位が、ROR抗原に特異的である、請求項89に記載のROR抗原結合分子。
  93. 前記ROR抗原が、ROR1である、請求項88から92のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  94. 前記ROR抗原が、ROR2である、請求項88から92のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  95. 前記ROR抗原が、ROR1およびROR2である、請求項88から92のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  96. 前記ROR抗原が、ROR1 Frizzleドメイン、ROR2 Frizzleドメイン、ROR1 Ig様ドメイン、ROR2 Ig様ドメイン、ROR1 KringleドメインおよびROR2 Kringleドメインからなる群から選択されるドメインである、請求項88から92のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  97. 前記ROR抗原が、ヒトROR抗原を含む、請求項93から96のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  98. ドメインAが、特定のROR抗原結合部位由来の特定の軽鎖可変領域(VL)のCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列を含み、CDR1、CDR2およびCDR3 VL配列が表6から選択され、
    ドメインFが、前記特定のROR抗原結合部位由来の特定の重鎖可変領域(VH)のCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列を含み、CDR1、CDR2およびCDR3 VH配列が表6から選択される、請求項88から97のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  99. 前記特定のROR抗原結合部位が、I2A−10またはI2A−27である、請求項98に記載のROR抗原結合分子。
  100. 前記第2の抗原結合部位が、
    A)前記第3のポリペプチド鎖内の、配列番号69および配列番号73からなる群から選択される特定の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列;ならびに
    B)前記第4のポリペプチド鎖内の、配列番号68、配列番号70、配列番号71および配列番号72からなる群から選択される特定の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列
    を含む、請求項89から99のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  101. 前記第2の抗原結合部位が、
    A)前記第4のポリペプチド鎖内の、配列番号69および配列番号73からなる群から選択される特定の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列;ならびに
    B)前記第3のポリペプチド鎖内の、配列番号68、配列番号70、配列番号71および配列番号72からなる群から選択される特定の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列
    を含む、請求項89から99のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  102. 前記Bドメインおよび前記Gドメインのアミノ酸配列が同一であり、前記配列は内在性CH3配列である、請求項88から100のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  103. 前記Bドメインおよび前記Gドメインのアミノ酸配列が異なり、それぞれ別個に直交型修飾を内在性CH3配列に含み、前記Bドメインは前記Gドメインと相互作用し、前記Bドメインと前記Gドメインのどちらも、前記直交型修飾を欠くCH3ドメインと有意に相互作用しない、請求項88から100のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  104. 前記Bドメインおよび前記Gドメインの前記直交型修飾が、前記Bドメインと前記Gドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む、請求項103に記載のROR抗原結合分子。
  105. 操作されたジスルフィド架橋を生成する前記Bドメインおよび前記Gドメインの前記変異が、前記BドメインとGドメインの一方におけるS354C変異、および他方のドメインにおける349Cである、請求項104に記載のROR抗原結合分子。
  106. 前記Bドメインおよび前記Gドメインの前記直交型修飾が、ノブ・イン・ホール変異を含む、請求項103から105のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  107. 前記ノブ・イン・ホール変異が、前記BドメインとGドメインの一方におけるT366W変異、ならびに他方のドメインにおけるT366S、L368AおよびY407V変異である、請求項106に記載のROR抗原結合分子。
  108. 前記Bドメインおよび前記Gドメインの前記直交型修飾が、電荷対変異を含む、請求項103から107のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  109. 前記電荷対変異が、前記BドメインとGドメインの一方におけるT366K変異、および他方のドメインにおけるL351D変異である、請求項108に記載のROR抗原結合分子。
  110. 前記Eドメインが、CH3アミノ酸配列を有する、請求項88から109のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  111. 前記Eドメインおよび前記Kドメインのアミノ酸配列が同一であり、前記配列は内在性CH3配列である、請求項88から110のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  112. 前記Eドメインおよび前記Kドメインのアミノ酸配列が異なる、請求項88から110のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  113. 前記異なる配列が、それぞれ別個に直交型修飾を内在性CH3配列に含み、前記Eドメインは前記Kドメインと相互作用し、前記Eドメインと前記Kドメインのどちらも、前記直交型修飾を欠くCH3ドメインと有意に相互作用しない、請求項112に記載のROR抗原結合分子。
  114. 前記直交型修飾が、前記Eドメインと前記Kドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む、請求項113に記載のROR抗原結合分子。
  115. 操作されたジスルフィド架橋を生成する前記変異が、前記Eドメインと前記Kドメインの一方におけるS354C変異、および他方のドメインにおける349Cである、請求項114に記載のROR抗原結合分子。
  116. 前記Eドメインおよび前記Kドメインにおける前記直交型修飾が、ノブ・イン・ホール変異を含む、請求項113から115のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  117. 前記ノブ・イン・ホール変異が、前記Eドメインまたは前記Kドメインの一方におけるT366W変異、ならびに他方のドメインにおけるT366S、L368AおよびY407V変異である、請求項116に記載のROR抗原結合分子。
  118. 前記Eドメインおよび前記Kドメインにおける前記直交型修飾が、電荷対変異を含む、請求項113から117のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  119. 前記電荷対変異が、前記Eドメインまたは前記Kドメインの一方におけるT366K変異、および他方のドメインにおける対応するL351D変異である、請求項118に記載のROR抗原結合分子。
  120. 前記Eドメインおよび前記Kドメインのアミノ酸配列が、前記第1のポリペプチドと前記第3のポリペプチドとの間の特異的会合を促進する特異的相互作用を有するように選択された2つの異なる抗体ドメインの内在性配列である、請求項112に記載のROR抗原結合分子。
  121. 前記2つの異なるアミノ酸配列が、CH1配列およびCL配列である、請求項120に記載のROR抗原結合分子。
  122. ドメインIがCL配列を有し、ドメインMがCH1配列を有する、請求項89から121のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  123. ドメインHがVL配列を有し、ドメインLがVH配列を有する、請求項89から122のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  124. ドメインHがVLアミノ酸配列を有し;
    ドメインIがCLアミノ酸配列を有し;
    ドメインKがCH3アミノ酸配列を有し;
    ドメインLがVHアミノ酸配列を有し;
    ドメインMがCH1アミノ酸配列を有する、
    請求項89から123のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  125. 第5のポリペプチド鎖をさらに含むROR抗原結合分子であって、
    (a)前記第1のポリペプチド鎖はドメインNおよびドメインOをさらに含み、ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、N−O−A−B−D−Eの配向で配置され、
    ドメインNは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインOは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;
    (b)前記ROR抗原結合分子は、ドメインPおよびドメインQを含む第5のポリペプチド鎖をさらに含み:
    ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、P−Qの配向で配置され、
    ドメインPは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインQは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し;
    (c)前記第1および前記第5のポリペプチドは、前記Nドメインと前記Pドメインとの間の相互作用および前記Oドメインと前記Qドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ROR抗原結合分子を形成する、請求項89〜124のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  126. (a)ドメインNおよびドメインAのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインHのアミノ酸配列が、ドメインNおよびドメインAの配列と異なり、
    ドメインOおよびドメインBのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインIのアミノ酸配列が、ドメインOおよびドメインBの配列と異なり、
    ドメインPおよびドメインFのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインLのアミノ酸配列が、ドメインPおよびドメインFの配列と異なり、
    ドメインQおよびドメインGのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインMのアミノ酸配列が、ドメインQおよびドメインGの配列と異なり;
    (b)前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、前記Hドメインと前記Lドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、前記Nドメインと前記Pドメインとの間の相互作用が、前記第1の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する、請求項125に記載のROR抗原結合分子。
  127. 前記第1の抗原が、ROR抗原である、請求項126に記載のROR抗原結合分子。
  128. 前記第2の抗原が、CD3抗原である、請求項126または127に記載のROR抗原結合分子。
  129. (a)ドメインN、ドメインAおよびドメインHのアミノ酸配列が異なり、
    ドメインO、ドメインBおよびドメインIのアミノ酸配列が異なり、
    ドメインP、ドメインFおよびドメインLのアミノ酸配列が異なり、
    ドメインQ、ドメインGおよびドメインMのアミノ酸配列が異なり;
    (b)前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、
    前記Hドメインと前記Lドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、
    前記ドメインNおよびドメインPが、第3の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成し、
    (c)前記第1、前記第2または前記第3の抗原が、ROR抗原である、請求項125に記載のROR抗原結合分子。
  130. 第5のポリペプチド鎖をさらに含むROR抗原結合分子であって、
    (a)前記第3のポリペプチド鎖はドメインRおよびドメインSをさらに含み、
    ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、R−S−H−I−J−Kの配向で配置され、
    ドメインRは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインSは定常ドメインアミノ酸配列を有し;
    (b)前記ROR抗原結合分子は、ドメインTおよびドメインUを含む第5のポリペプチド鎖をさらに含み、
    ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、T−Uの配向で配置され、
    ドメインTは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインUは定常ドメインアミノ酸配列を有し;
    (c)前記第3および前記第5のポリペプチドは、前記Rドメインと前記Tドメインとの間の相互作用および前記Sドメインと前記Uドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ROR抗原結合分子を形成する、請求項89から124のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  131. (a)ドメインRおよびドメインAのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインHのアミノ酸配列が、ドメインRおよびドメインAの配列と異なり、
    ドメインSおよびドメインBのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインIのアミノ酸配列が、ドメインSおよびドメインBの配列と異なり、
    ドメインTおよびドメインFのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインLのアミノ酸配列が、ドメインTおよびドメインFの配列と異なり、
    ドメインUおよびドメインGのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインMのアミノ酸配列が、ドメインUおよびドメインGの配列と異なり、
    (b)前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、
    前記Hドメインと前記Lドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し;
    前記Rドメインと前記Tドメインとの間の相互作用が、前記第1の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する、請求項130に記載のROR抗原結合分子。
  132. 前記第1の抗原が、ROR抗原である、請求項131に記載のROR抗原結合分子。
  133. 前記第2の抗原が、CD3抗原である、請求項131または132に記載のROR抗原結合分子。
  134. (a)ドメインRおよびドメインHのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインAのアミノ酸配列が、ドメインRおよびドメインHの配列と異なり、
    ドメインSおよびドメインIのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインBのアミノ酸配列が、ドメインSおよびドメインIの配列と異なり、
    ドメインTおよびドメインLのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインFのアミノ酸配列が、ドメインTおよびドメインLの配列と異なり、
    ドメインUおよびドメインMのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインGのアミノ酸配列が、ドメインUおよびドメインMの配列と異なり、
    (b)前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、
    前記Hドメインと前記Lドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、
    前記Rドメインと前記Tドメインとの間の相互作用が、前記第2の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成する、請求項130に記載のROR抗原結合分子。
  135. 前記第2の抗原が、ROR抗原である、請求項134に記載のROR抗原結合分子。
  136. 前記第1の抗原が、CD3抗原である、請求項134または135に記載のROR抗原結合分子。
  137. (a)ドメインR、ドメインAおよびドメインHのアミノ酸配列が異なり、
    ドメインS、ドメインBおよびドメインIのアミノ酸配列が異なり、
    ドメインT、ドメインFおよびドメインLのアミノ酸配列が異なり、
    ドメインU、ドメインGおよびドメインMのアミノ酸配列が異なり;
    (b)前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、
    前記Hドメインと前記Lドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、
    前記Rドメインと前記Tドメインとの間の相互作用が、第3の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成し;
    (c)前記第1、前記第2または前記第3の抗原が、ROR抗原である、請求項130に記載のROR抗原結合分子。
  138. 第5および第6のポリペプチド鎖をさらに含むROR抗原結合分子であって、
    (a)前記第1のポリペプチド鎖はドメインNおよびドメインOをさらに含み、ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、N−O−A−B−D−Eの配向で配置され;
    (b)前記第3のポリペプチド鎖はドメインRおよびドメインSをさらに含み、
    ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、R−S−H−I−J−Kの配向で配置され;
    (c)前記ROR抗原結合分子は、第5および第6のポリペプチド鎖をさらに含み:
    前記第5のポリペプチド鎖は、ドメインPおよびドメインQを含み、ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、P−Qの配向で配置され、
    前記第6のポリペプチド鎖は、ドメインTおよびドメインUを含み、ここで前記ドメインは、N末端からC末端へ、T−Uの配向で配置され;
    (d)前記第1および前記第5のポリペプチドは、前記Nドメインと前記Pドメインとの間の相互作用および前記Oドメインと前記Qドメインとの間の相互作用を介して会合し、
    前記第3および前記第6のポリペプチドは、前記Rドメインと前記Tドメインとの間の相互作用および前記Sドメインと前記Uドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記ROR抗原結合分子を形成する、請求項89から124のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子。
  139. (a)ドメインNおよびドメインAのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインHおよびドメインRのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインOおよびドメインBのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインIおよびドメインSのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインPおよびドメインFのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインLおよびドメインTのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインQおよびドメインGのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインMおよびドメインUのアミノ酸配列が同一であり;
    (b)前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、前記ドメインNおよびドメインPが、前記第1の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、前記Hドメインと前記Lドメインとの間の相互作用が、第2の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成し、前記Rドメインと前記Tドメインとの間の相互作用が、前記第2の抗原に特異的な第4の抗原結合部位を形成する、請求項138に記載のROR抗原結合分子。
  140. (a)ドメインHおよびドメインAのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインNおよびドメインRのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインIおよびドメインBのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインOおよびドメインSのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインLおよびドメインFのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインPおよびドメインTのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインMおよびドメインGのアミノ酸配列が同一であり、
    ドメインQおよびドメインUのアミノ酸配列が同一であり;
    (b)前記Aドメインと前記Fドメインとの間の相互作用が、第1の抗原に特異的な第1の抗原結合部位を形成し、前記ドメインNおよびドメインPが、第2の抗原に特異的な第2の抗原結合部位を形成し、前記Hドメインと前記Lドメインとの間の相互作用が、前記第1の抗原に特異的な第3の抗原結合部位を形成し、前記Rドメインと前記Tドメインとの間の相互作用が、前記第2の抗原に特異的な第4の抗原結合部位を形成する、請求項138に記載のROR抗原結合分子。
  141. 前記Aドメインと前記Bドメインとの間のジャンクションを形成する配列が、IKRTPREPまたはIKRTVREPである、上記請求項のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  142. 前記Fドメインと前記Gドメインとの間のジャンクションを形成する配列が、SSASPREPである、上記請求項のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  143. 少なくとも1つのCH3アミノ酸配列が、前記CH3アミノ酸配列とヒンジアミノ酸配列とを連結するC末端トリペプチド挿入を有し、ここで前記トリペプチド挿入は、PGK、KSCおよびGECからなる群から選択される、上記請求項のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  144. 前記配列が、ヒトの配列である、上記請求項のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  145. 少なくとも1つのCH3アミノ酸配列が、IgG配列である、上記請求項のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  146. 前記IgG配列がIgG1配列である、請求項145に記載のROR抗原結合分子。
  147. 少なくとも1つのCH3アミノ酸配列が、1つまたは複数のイソアロタイプ変異を有する、上記請求項のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  148. 前記イソアロタイプ変異がD356EおよびL358Mである、請求項147に記載のROR抗原結合分子。
  149. 前記CLアミノ酸配列がCカッパ配列である、上記請求項のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  150. 前記CH2配列が、Fcエフェクター機能を低減させる1つまたは複数の操作された変異を有する、上述の請求項のいずれかに記載のROR抗原結合分子。
  151. 前記1つまたは複数の操作された変異が、L234、L235およびP329位に存在する、請求項150に記載のROR抗原結合分子。
  152. 前記1つまたは複数の操作された変異が、L234A、L235AおよびP329Gである、請求項151に記載のROR抗原結合分子。
  153. 前記1つまたは複数の操作された変異が、L234A、L235AおよびP329Kである、請求項151に記載のROR抗原結合分子。
  154. 請求項1から153のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子を含む、精製されたROR抗原結合分子。
  155. CH1親和性精製ステップを含む精製方法によって精製された、請求項154に記載の精製されたROR抗原結合分子。
  156. 前記精製方法が、単一ステップの精製方法である、請求項154または155に記載の精製されたROR抗原結合分子。
  157. 請求項1から156のいずれか一項に記載のROR抗原結合分子と、薬学的に許容される希釈剤とを含む、医薬組成物。
  158. がんを有する対象を処置するための方法であって、治療有効量の請求項157に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
  159. 前記がんが、ROR抗原発現がんである、請求項158に記載の方法。
  160. 前記がんが、ROR1抗原を発現する、請求項159に記載の方法。
  161. 前記がんが、ROR2抗原を発現する、請求項159に記載の方法。
  162. 前記がんが、ROR1抗原およびROR2抗原を発現する、請求項159に記載の方法。
  163. 前記がんが、膵がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、胃がん、黒色腫、ユーイング肉腫、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、B−ALL、血液学的がん、前立腺がん、結腸がん、腎がん、甲状腺がん、肝臓がん、尿路上皮癌、黒色腫、子宮内膜がん、腎明細胞癌、明細胞癌および子宮がんからなる群から選択される、請求項158から162のいずれかに記載の方法。
  164. 前記医薬組成物が、追加的な治療と組み合わせて投与される、請求項158から163のいずれか一項に記載の方法。
  165. 前記追加的な治療が、外科手術、放射線療法、内分泌療法、免疫療法または化学療法である、請求項164に記載の方法。
  166. 前記免疫療法が、免疫療法剤である、請求項165に記載の方法。
  167. 前記免疫療法剤が、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項166に記載の方法。
  168. 前記免疫療法剤が、ワクチンである、請求項166に記載の方法。
  169. 前記化学療法が、細胞傷害剤または化学療法剤である、請求項165に記載の方法。
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