JP2015532644A - Ｒｏｒ１癌の治療および転移の阻害に使用するための抗体およびワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、抗ＲＯＲ１抗体または抗原結合断片、ＲＯＲ１結合ペプチド、およびＲＯＲ１ワクチンを使用して転移を阻害する、医薬組成物および方法に関する。【選択図】図１０

Description

関連出願
本出願は、米国特許法119条(e)のもと、２０１２年８月２４日に出願された米国特許出願第６１／６９３，２３０号、２０１２年１０月２日に出願された米国特許出願第６１／７０９，０５５号、および２０１２年１０月４日に出願された米国特許出願第６１／７０９，８０３号に対する優先権の利益を主張するものであり、これらの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
添付の配列表の資料は、参考によりその全体が本明細書に組み込まれる。「ＳＴ−ＵＣＳＤ３８２０−１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前の添付ファイルは、２０１３年３月１４日に作成され、３３Ｋｂである。ファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＯＳを使用したコンピュータ上でＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄを使用してアクセスできる。

グラント情報
本発明は、国立衛生研究所よって授与されたＰ０１−ＣＡ０８１５３４およびＲ３７−ＣＡ０４９８７０、およびカリフォルニア再生医療学会のＤＲ１−０１４３０の下で政府の支援により行われた。アメリカ政府は、本発明において一定の権利を有する。

発明の分野
本発明は、概ね、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１抗体およびワクチン、ならびに転移を阻害するための方法に関する。

背景情報
癌は、冠動脈疾患に続く人間の２番目に主要な死亡原因である。世界中で、何百万人もの人々が毎年癌で死亡している。米国だけでも、優に毎年５０万人以上が癌で死亡しており、およそ毎年１４０万件の新しい症例が診断されている。心臓病による死亡が大幅に減少している一方で、一般的に癌に起因する死亡が増加している。受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、細胞の分化、増殖、遊走、脈管形成、および生存において重要な役割を果たす。受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）は、ＲＯＲサブファミリーに属し、免疫グロブリン（Ｉｇ）様、フリッツルド、およびクリングルドメインを含有する細胞外ドメインを有する、進化的に保存されたＩ型膜タンパク質である。ＲＯＲ１欠損マウスは、骨格および泌尿生殖器系内の種々の表現型の欠陥、ならびに生後の成長の遅れを示す。ＲＯＲ１は、胚形成、および種々の異なる癌によって発現されるが、正常な分娩後組織によっては発現されず、腫瘍胚性表面抗原と見なすことができる。機能データは、ＲＯＲ１が、悪性細胞の生存を促進するために、非カノニカルＷＮＴシグナル伝達において機能し得ることを示唆している。さらに最近の研究は、非カノニカルＷＮＴシグナル伝達が、乳癌転移の基底様および他のサブタイプにおいて主要な役割を果たすことを示している。ＲＯＲ１ヒト乳癌の発現はまた、ＡＫＴ−ＣＲＥＢ経路の活性化および増大した腫瘍細胞の成長に関連している。

受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）は、保存された胚性タンパク質であり、その発現は、哺乳類における胚発生中に徐々に低減するようになる。その無傷のタンパク質は、その細胞外ドメインを含み、正常な成体哺乳類組織において有意に発現しているように見えない。具体的には、研究では、正常な非癌性のＢ細胞を含む、正常な成人のヒト組織の細胞表面上のＲＯＲ１の著しい発現を特定していない（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１４：３９６（２００８）（非特許文献１）；ＤａｎｅｓｈＭａｎｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２３：１１９０（２００８）（非特許文献２）およびＦｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５：３０４７（２００８）（非特許文献３））。しかしながら、ＲＯＲ１は、悪性Ｂ細胞（Ｂ−ＣＬＬ）およびマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）の細胞表面上に発現される。また、ＲＯＲ１はバーキットリンパ腫、腎細胞癌、結腸癌、および乳癌を含む一定の他の癌細胞株において発現されることが報告されている（米国特許出願第２００７／０２０７５１１０号（特許文献１））。したがって、ＲＯＲ１は、これらの癌のための選択的マーカーと見なすことができる。

米国特許出願第２００７／０２０７５１１０号

Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１４：３９６（２００８） ＤａｎｅｓｈＭａｎｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２３：１１９０（２００８） Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５：３０４７（２００８）

本発明は、癌細胞の成長および転移を阻害することができるＲＯＲ１に対する抗体を提供する。本発明は、ＲＯＲ１に対する抗体、ＲＯＲ１結合ペプチド、およびＲＯＲ１ペプチドワクチンを提供する。抗ＲＯＲ１抗体またはこれらの抗原結合断片、ＲＯＲ１抗体免疫複合体、ＲＯＲ１ペプチドワクチン、またはＲＯＲ１は結合ペプチドを用いて転移を阻害するための、組成物および方法をさらに提供する。一実施形態において、本発明は、抗体９９９６１と同じ結合特異性を有する単離された抗ヒトＲＯＲ１抗体を提供する。一態様において、抗体は、ヒトＲＯＲ−１（ｈＲＯＲ１）のＣＲＤドメインと隣接するＩｇ様ドメインに結合する。追加の態様において、抗体は、ｈＲＯＲ−１のアミノ酸４２〜１６０にマッピングするエピトープに結合する。さらなる態様において、抗体は、ｈＲＯＲ−１のアミノ酸１３０〜１６０にマッピングするエピトープに結合する。別の態様において、抗体は、結合するためにｈＲＯＲ−１の１３８位のグルタミン酸の存在を必要とする。

追加の実施形態において、本発明は、重鎖可変領域を含む単離された抗ヒトＲＯＲ１抗体を提供し、該重鎖可変領域は、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、および配列番号１７からなる群から選択され、かつ軽鎖可変領域が、配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、および配列番号１９からなる群から選択される。一態様において、重鎖可変領域に従う抗体は配列番号５であり、軽鎖可変領域は配列番号７である。

一実施形態において、本発明は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３４、および配列番号３５からなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３から構成される重鎖可変領域と、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８からなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３から構成される軽鎖可変領域を含む単離された抗ヒトＲＯＲ１抗体を提供する。一態様において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３から構成される重鎖可変領域は、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９から構成され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３から構成される軽鎖可変領域は、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２からなる群から選択される。

さらなる実施形態において、本発明は、４１ｎＭを超える結合親和性を有する抗ヒトＲＯＲ−１抗体を提供する。一態様において、抗体結合親和性は、約５００ｐＭ〜約６ｎＭの間である。一態様において、抗体結合親和性は、約８００ｐＭである。

一態様において、抗体は、９９９６１、または抗体９９９６１．１、９９９６１．２、９９９６１．３、もしくは９９９６１．４を含むそのヒト化形態である。別の態様において、抗体が転移を阻害する。追加の態様において、抗体は、内在化し、細胞遊走を阻害する。さらなる態様において、抗体は、内在化し、ビメンチン、スネイル１／２、またはＺＥＢを下方調節する。好ましい態様において、抗体は、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である。

別の実施形態において、本発明は、ＲＯＲ１に対する抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を提供する。

さらなる実施形態は、ＲＯＲ１に対する抗体をコードする単離された核酸を提供する。別の実施形態において、本発明は、ｈＲＯＲ１に対する抗体をコードする核酸を含む、発現ベクターを提供する。追加の実施形態において、本発明は、ｈＲＯＲ１に対する抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、抗体を産生する条件下で宿主細胞を培養すること、次いで、任意選択により、抗体を回収することを含む、抗ヒトＲＯＲ１抗体を産生する方法を提供する。

一実施形態において、本発明は、ＲＯＲ−１発現細胞に対するワクチンであって、抗体Ｄ１０のＲＯＲ−１結合領域に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する単離されたまたは合成的に産生されたペプチドの薬学的に許容される組成物を含むワクチンを提供する。一態様において、抗体Ｄ１０のＲＯＲ−１結合領域のアミノ酸配列は、ＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣである。さらなる態様において、抗体Ｄ１０のＲＯＲ−１結合領域のアミノ酸配列は、ＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣである。別の態様において、ＲＯＲ−１発現細胞は、癌細胞である。追加の態様において、癌細胞は、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、ＣＬＬ、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、卵巣癌、結腸癌、肺癌、皮膚癌、膵臓癌、精巣癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌、または副腎癌である。

別の実施形態において、本発明は、ＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ１結合ペプチドと、薬学的に許容される担体とを有するワクチンを提供する。一態様において、ペプチドは、哺乳類のものである。追加の態様において、ＲＯＲ１結合ペプチドは、キメラおよび／またはヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、霊長類、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ニワトリまたはクマの起源である。別の態様において、ワクチンは、免疫原性アジュバントをさらに含む。さらなる態様において、アジュバントは、結合ペプチドと複合体化された免疫原性担体部分である。一態様において、結合ペプチドのアミノ酸配列は、ＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣである。別の態様において、免疫原性担体部分は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、水酸化アルミニウム、または他の薬学的に許容される免疫アジュバントなどの担体ペプチドである。薬学的に許容される免疫アジュバントの例は、以下に見出すことができる：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．４２：Ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｔ．Ｏ'Ｈａｇａｎ；Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ ａｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｌｏｎｄｏｎ ２００４。

別の実施形態において、本発明は、ＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ１結合ペプチドと、薬学的に許容される担体とを有するワクチンを提供する。追加の態様において、ＲＯＲ１結合ペプチドは、キメラおよび／またはヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、霊長類、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ニワトリまたはクマの起源である。さらなる態様において、アジュバントは、結合ペプチドと複合体化された免疫原性担体部分である。一態様において、結合ペプチドのアミノ酸配列は、ＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣである。別の態様において、免疫原性担体部分は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、水酸化アルミニウム、または他の薬学的に許容される免疫アジュバントなどの担体ペプチドである。薬学的に許容される免疫アジュバントの例は、以下に見ることができる：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．４２：Ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｔ．Ｏ'Ｈａｇａｎ；Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ ａｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｌｏｎｄｏｎ ２００４。

追加の実施形態において、本発明は、ＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ１結合ペプチドと、薬学的に許容される担体とを有するワクチンを有する医薬製剤を提供する。

追加の実施形態において、本発明は、ＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ１結合ペプチドと、薬学的に許容される担体とを有するワクチンを有する医薬製剤を提供する。

一実施形態において、本発明は、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＲＯＲ１結合ペプチドを提供する。一態様において、ペプチドは、ＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。別の態様において、ペプチドは、ＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸ペプチド配列を有する。別の態様において、結合ペプチドは哺乳類のものである。追加の態様において、結合ペプチドは、キメラおよび／またはヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、霊長類、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ニワトリまたはクマの起源である。

一実施形態において、本発明は、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＲＯＲ１結合ペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を提供する。

別の実施形態において、本発明は、配列番号２５および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＲＯＲ１結合ペプチドをコードする単離された核酸を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号２５および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＲＯＲ１結合ペプチドをコードする核を含む発現ベクターを提供する。さらなる実施形態において、本発明は、配列番号２５および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＲＯＲ１結合ペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。追加の実施形態において、本発明は、結合ペプチドを産生する条件下で、配列番号２５および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＲＯＲ１結合ペプチドをコードする宿主細胞を培養することを含む、ペプチドを産生する方法を提供する。一態様において、ペプチドを産生するための方法は、結合ペプチドを回収することをさらに含む。

一実施形態において、本発明は、ＲＯＲ−１発現癌の転移を抑制する方法を提供し、該方法は、モノクローナル抗体９９９６１の結合特異性を有する抗体、抗体Ｄ１０のＲＯＲ−１結合領域に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドから構成されるワクチン、またはＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ−１結合ペプチドを投与することによって腫瘍細胞の上皮間葉転換を妨害することを含む。一態様において、ＲＯＲ−１発現癌は、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、ＣＬＬ、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、卵巣癌、結腸癌、肺癌、皮膚癌、膵臓癌、精巣癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌、または副腎癌である。

一実施形態において、本発明は、ＲＯＲ−１発現癌の転移を抑制する方法を提供し、該方法は、モノクローナル抗体９９９６１の結合特異性を有する抗体、抗体Ｄ１０のＲＯＲ−１結合領域に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドから構成されるワクチン、またはＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ−１結合ペプチドを投与することによって腫瘍細胞の上皮間葉転換を妨害することを含む。一態様において、ＲＯＲ−１発現癌は、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、ＣＬＬ、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、卵巣癌、結腸癌、肺癌、皮膚癌、膵臓癌、精巣癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌、または副腎癌である。

追加の実施形態において、本発明は、対象において癌を治療または予防するための方法を提供し、該方法は、モノクローナル抗体９９９６１の結合特異性を有する抗体、抗体Ｄ１０のＲＯＲ−１結合領域に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドから構成されるワクチン、またはＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ−１結合ペプチドを対象に投与することを含む。一態様において、癌は、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、ＣＬＬ、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、卵巣癌、結腸癌、肺癌、皮膚癌、膵臓癌、精巣癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌、または副腎癌である。

追加の実施形態において、本発明は、対象において癌を治療または予防するための方法を提供し、該方法は、モノクローナル抗体９９９６１の結合特異性を有する抗体、抗体Ｄ１０のＲＯＲ−１結合領域に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドから構成されるワクチン、またはＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ−１結合ペプチドを対象に投与することを含む。一態様において、癌は、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、ＣＬＬ、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、卵巣癌、結腸癌、肺癌、皮膚癌、膵臓癌、精巣癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌、または副腎癌である。

乳癌におけるＲＯＲ１の高レベルの発現が、より短い無転移生存およびＥＭＴ遺伝子シグネチャに関連していることを示している。（Ａ）グラフは、ＰｕｂＭｅｄのＧＥＯデータベース（ＧＳＥ２６０３、ＧＳＥ５３２７、ＧＳＥ２０３４、およびＧＳＥ１２２７６）を介して利用可能な公開されているデータから得られた。カプランマイヤー曲線は、全体的無転移生存におけるＲＯＲ１の発現の予後の影響を示している。各分析のために、５８２件の症例を、最も高いレベルのＲＯＲ１ ｍＲＮＡを伴う腫瘍を有していた患者の３分の１を表すＲＯＲ１Ｈと指定されたグループと、最も低いレベルのＲＯＲ１ ｍＲＮＡを伴う癌を有していた患者の３分の１を表すＲＯＲ１Ｌと指定されたグループとにより、三分位に分離した。ＲＯＲ１ ｍＲＮＡの中間の発現を伴う腫瘍を有していた患者の三分の一が、ＲＯＲ１Ｍと指定された。無転移生存は、カプランマイヤー分析により判定され、統計的な差は、ログランク検定により判定された。各カテゴリにおける患者の数、総転移性事象、および対応するＰ値（カイ二乗検定）が、組み込まれた表に示されている。（Ｂ）ＲＯＲ１（上）、患者から単離された原発性乳癌細胞内のＥＭＴ関連遺伝子（ＳＮＡＩ１およびＳＮＡＩ２コードスネイル１およびスネイル２、ＺＥＢ１コードＺＥＢ−１、ＶＩＭコードビメンチン、ＣＤＨ２コードＮ−カドヘリン、ＣＤＨ１コードＥ−カドヘリン、ＴＪＰ１コードＺＯ−１、ＴＪＰ３コードＺＯ−３、ＫＲＴ１９コードＣＫ−１９、またはＣＬＤＮ３コードクラウディン３）の発現を示すヒートマップ。（Ｃ）ＲＯＲ１−ｓｉＲＮＡまたはＣＴＲＬ−ｓｉＲＮＡで治療されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１（左）、ＨＳ−５７８Ｔ（中央）、ＢＴ５４９（右）細胞から単離されたＥＭＴ関連遺伝子の発現を示すヒートマップ。（Ｄ）上に示されるように、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡまたはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた（下に示される）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＳ−５７８Ｔ、またはＢＴ５４９のタンパク質溶解物の免疫ブロット。免疫ブロットは左側に示されたタンパク質に特異的な抗体でプローブされた。（Ｅ）上に示されるように、対照ベクターまたはＲＯＲ１発現ベクターがトランスフェクトされた、ＭＣＦ７のタンパク質溶解物の免疫ブロット。免疫ブロットは左側に示されたタンパク質に特異的な抗体でプローブされた。 乳癌細胞株によるＲＯＲ１の発現が、ＥＭＴの特徴およびより高い転移可能性と関連していることを示している。（Ａ）上で示されるＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡまたはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＳ−５７８Ｔ、またはＢＴ５４９（左に示される）の形態的変化（４０倍）。（Ｂ）ＣＫ−１９、Ｅカドヘリン、またはビメンチンの発現が、６３倍率下でＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡまたはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞内で免疫蛍光法染色によって検出された。（Ｃ）（上で示される）対照ベクターまたはＲＯＲ１発現ベクターがトランスフェクトされたＭＣＦ７細胞の形態的変化（４０倍）。（Ｄ）ＣＫ−１９、Ｅカドヘリン、またはビメンチンの発現が、対照ベクターまたはＲＯＲ１−発現ベクター（６３倍率）のいずれかがトランスフェクトされたＭＣＦ７細胞の免疫蛍光法染色によって検出された。（Ｅ）ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡ（黒）またはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡ（白）のいずれかがトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＳ−５７８Ｔ、またはＢＴ５４９上の細胞遊走（左ヒストグラム）または浸潤（右ヒストグラム）のアッセイ。全てのデータは、親細胞株について述べたものと異ならなかったＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞の結果に対して正規化された。結果は、各試験群の平均値である（±標準誤差）（ｎ＝試験群あたり３）。（Ｆ）細胞遊走（上）または浸潤（下）のアッセイにおける、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１（左パネル）またはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１（右パネル）の代表的な顕微鏡写真。データは平均±標準誤差として示され、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡ群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 ＲＯＲ１サイレンシングが、乳房体異種移植後に乳癌の転移を低減することを示している。（Ａ）研究のステージＩまたはＩＩを示す図。（Ｂ）ステージＩの間の経時（日）的な腫瘍体積。（Ｃ）各群から切除された腫瘍の重さ。（Ｄ）各群の原発性腫瘍のエクスビボ光子束。（Ｅ〜Ｆ）段階ＩＩ中での各マウスのインビボ（ｅ）肺光子束または（ｆ）肝臓光子束は、各マウスについて原発性腫瘍光子束で正規化された。ヒストグラムは、各群の正規化された肺および肝臓光子束を示している。（Ｇ）各群のステージＩＩ中のインビボ肺光子束（Ｈ）水平線は、各群について２１日目のマウスの平均エクスビボ肺光子束を示している（左）。右は、各群から摘出された肺の代表的な生物発光画像である。（Ｉ）ヒストグラムは、各群の肺重量指数を表す。（Ｊ）代表的なＨ＆Ｅ染色された肺切片。（Ｋ）水平線は、各群についての２１日目のマウスの平均エクスビボ肝臓光子束を示している（左）。右は、各群の２１日目の摘出された肝臓の代表的な生物発光画像である。（ｌ）各群について注射されたマウスの２１日目のＨ＆Ｅ染色された代表的な肝臓切片。データは、平均±標準誤差として示されている。データは、平均±標準誤差として示され、Ｐ＞０．０５は、有意でない（Ｎ．Ｓ．）と見なされ、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡ群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 ＲＯＲ１サイレンシングは、インビボでＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の実験的肺転移および骨転移を低減することを示す。Ａ）５ｘ１０^５個のＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた、またはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞を静脈内注射されたマウスのカプランマイヤー生存曲線（Ｐ＜０．００１、ログランク検定による）。（Ｂ）注射に続く、経時的な各群のインビボ肺光子束（左）。各群のマウスの代表的な生物発光画像が右に示されている。（Ｃ〜Ｅ）（ｃ）３日目、（ｄ）２１日目、および（ｅ）２８日目の代表的なＨ＆Ｅ染色された肺切片。（Ｆ）下のヒストグラムは、各群について２８日目のエクスビボ肺ＧＦＰ光子束を提供する。２８日目の摘出された肺の代表的な生物発光画像。（Ｇ）２８日目の各群からの肺重量指数（下）。各群の肺（上）の代表的な写真。（Ｈ）１ｘ１０^５個のＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた、またはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞を食間に注射されたマウスのカプランマイヤー生存曲線（Ｐ＝０．００１７、ログランク検定による）。（Ｉ）食間の腫瘍注射後のマウスの代表的な生物発光画像。白いボックスは、（Ｊ）で提示された生物発光データを取得した領域を定義する。（Ｊ）ヒストグラムは、各群の正規化されたインビボ骨光子束を提供する。（Ｋ）２１日目の各群の抽出された骨盤骨のエクスビボ骨光子束。抽出された骨盤骨の代表的な生物発光画像が、右に示されている。（Ｌ）各々からのマウスの代表的なＨ＆Ｅ染色された組織学的骨切片。マウスの漫画は、参照文献（３０）から修正されている。データは平均±標準誤差として示され、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡ群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 抗ＲＯＲ１抗体がインビボでＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の肺転移を低減することを示している。（Ａ）Ｄ１０ ｍＡｂは、ＲＯＲ１の内在化を引き起こす。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が、氷上で３０分間、対照ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ６４７（ｒｅｄ）またはＤ１０−Ａｌｅｘａ６４７で染色され、次いで、氷上で保存されたか（青）、またはフローサイトメトリーの前に３７℃に１時間移された（橙）。（Ｂ）３７℃で１時間のインキュベーションの前後にＤ１０染色された（緑）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の共焦点顕微鏡。（Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、生存能力を喪失せずに蛍光色素ラベル、非交差遮断抗ＲＯＲ１での染色の前に、２４時間、（−）対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）もしくはＤ１０を伴いまたは伴わずに処理された。処理された細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）が示されている（＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡによる）。（Ｄ）代表的な免疫ブロットは、Ｄ１０または対照ＩｇＧでの治療の前（０時間）または１、４、または２４時間後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１から調製された溶解物のビメンチン（上）またはβ−アクチン（下）をプローブした。ビメンチンのβアクチンバンドに対する強度比率が、以下に提供される。対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）または抗ＲＯＲ１（ＲＯＲ１）を使用したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞溶解物の（Ｅ）免疫沈降物が、分析ビメンチン（上）またはＲＯＲ１（下）に特異的な抗体でプローブされた免疫ブロットに使用された。（Ｆ）ヒストグラムは、Ｄ１０または対照ＩｇＧで１時間予備処理された遊走したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の数を提供する。（Ｇ）左、インビボでの肺光子束を示すヒストグラム。右、代表的なＨ＆Ｅ染色された肺切片。（Ｈ）グラフは、正規化されたインビボ肺光子束を示している。（Ｉ）ＩｇＧ（上）またはＤ１０（下）で処理された、腫瘍注射されたマウスの代表的な生物発光画像。（Ｊ）ヒストグラムは、肺重量指数を示している。（Ｋ）代表的なＨ＆Ｅ染色された肺切片。データは平均±標準誤差として示され、ＩｇＧ群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 ＲＯＲ１抗体Ｄ１０のエピトープをマッピングするために使用されるキメラ構築を示している。構築物の明部はマウスであり、暗部はヒトである。 マウスＲＯＲ１タンパク質と反応しないＤ１０抗体をマッピングするエピトープを示している。マウスまたはヒトのＲＯＲ１タンパク質は、アミノ酸１３８、１４２、または１６０位において異なるアミノ酸残基を有し、ヒトＲＯＲ１タンパク質は、これらの位置でアミノ酸残基Ｅ、Ｓ、またはＹを有するが、一方で、マウスＲＯＲ１タンパク質はそれぞれ、アミノ酸１３８、１４２、または１６０位においてアミノ酸残基Ｋ、Ｔ、またはＳを有する。これらの位置でのみマウスまたはヒトのアミノ酸残基のいずれかを有する組換えヒトＲＯＲ１タンパク質を生成した。これらの組換えタンパク質は、非変性ポリアクリルアミドゲル中で分離され、次いで、Ｄ１０ ｍＡｂでプローブされたナイロン上に移された。この図に見られるように、Ｄ１０は、組換えタンパク質１、３、４、および７と反応するが、２、５、または６とは反応せず、下の凡例に説明されている。ヒトＲＯＲ１タンパク質の１３８位のヒトアミノ酸残基Ｅと、１３８位のマウスアミノ酸残基Ｔとの置換が、Ｄ１０結合を終わらせることに留意されたい。 抗ヒトＲＯＲ１抗体４Ａ５をマッピングするエピトープを示している。マウスまたはヒトのＲＯＲ１タンパク質は、アミノ酸８８、１０５、１０９、または１１１位において異なるアミノ酸残基を有し、ヒトＲＯＲ１タンパク質は、これらの位置でアミノ酸残基Ｔ、Ｌ、Ｓ、またはＩを有するが、一方で、マウスＲＯＲ１タンパク質はそれぞれ、アミノ酸８８、１０５、１０９、または１１１位においてアミノ酸残基Ｓ、Ｉ、Ａ、またはＮを有する。これらの位置でのみマウスまたはヒトのアミノ酸残基のいずれかを有する組換えヒトＲＯＲ１タンパク質を生成した。これらの組換えタンパク質は、非変性ポリアクリルアミドゲル中で分離され、次いで、４Ａ５ ｍＡｂでプローブされたナイロン上に移された。この図に見られるように、４Ａ５は、組換えタンパク質１、２、３、または５に結合することができたが、４には結合できなかった。組換えタンパク質４は、ヒトＲＯＲ１タンパク質であるが、ヒトＲＯＲ１タンパク質中に見て取れるアミノ酸残基Ｉではなく１１１位のマウスアミノ酸残基Ｎを伴う。 抗ヒトＲＯＲ１抗体Ｄ１０が乳癌細胞の転移を阻害することを示す。Ａ〜Ｂ．Ｄ１０モノクローナル抗体は、ＲＯＲ１受容体の内在化を容易にする。Ｃ．２４時間の抗ＲＯＲ１抗体によるＤ１０の処理は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中でＲＯＲ１表面発現を減少させる。Ｄ．ＲＯＲ１は乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中でビメンチンと複合体を形成する。Ｅ．インビトロでのＤ１０抗体処理は、ビメンチン発現を減少させることができた。Ｆ．抗ヒトＲＯＲ１抗体は、インビトロで乳癌遊走を減少させる。Ｇ．Ｄ１０モノクローナル抗体は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌早期（２日目）の肺転移を阻害する。Ｈ．Ｄ１０モノクローナル抗体は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌の肺転移を阻害する。Ｉ．５Ｅ５ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注射された代表的なマウスが背位で示されている。Ｊ．抗ヒトＲＯＲ１抗体処置は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１担持マウスの肺重量を低減させた。Ｋ．抗ＲＯＲ１抗体治療の後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１担持マウスからの代表的な肺Ｈ＆Ｅ組織学。エラーバーは、標準誤差を示し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１であり、対応のない両側スチューデントｔ検定に基づく。 ｍＡｂｓ Ｄ１０、９９４５１、９９９６１、または９９２２１によって認識されるＲＯＲ１エピトープに対して生成された高い親和性の抗体を示している。マウスまたはヒトのＲＯＲ１タンパク質は、アミノ酸１３８、１４２、または１６０位において異なるアミノ酸残基を有し、ヒトＲＯＲ１タンパク質は、これらの位置でアミノ酸残基Ｅ、Ｓ、またはＹを有するが、一方で、マウスＲＯＲ１タンパク質はそれぞれ、アミノ酸１３８、１４２、または１６０位においてアミノ酸残基Ｋ、Ｔ、またはＳを有する。これらの位置でのみマウスまたはヒトのアミノ酸残基のいずれかを有する組換えヒトＲＯＲ１タンパク質を生成した。これらの組換えタンパク質は、非変性ポリアクリルアミドゲル中で分離され、次いで、ナイロン上に移されて、左の余白に示されているように、３個のｍＡｂの各々、９９４５１、９９９６１、または９９２２１でプローブされた。この図に見られるように、これらの抗体の各々は、組換えタンパク質２、４、５、および８と反応するが、２、３、６、または７とは反応しない（下の凡例に説明されている）。ヒトＲＯＲ１タンパク質の１３８位のヒトアミノ酸残基Ｅと、１３８位のマウスアミノ酸残基Ｔとの置換が、９９４５１、９９９６１、または９９２２１のいずれかの結合を終わらせることに留意されたい。 野生型もしくは組換えＲＯＲ１タンパク質に対する抗体Ｄ１０または９９９６１の結合活性を示している。ヒトまたはキメラＲＯＲ１タンパク質をコードするベクターが、２９３個の細胞にトランスフェクトされた。これは、組換えヒト−マウスキメラＲＯＲ１タンパク質の産生を可能にし、この組換えヒト−マウスキメラＲＯＲ１タンパク質は、次いで、異なる抗ＲＯＲ１ ｍＡｂでの免疫ブロット分析のために非変性ＰＡＧＥゲル（右）またはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（左）においてサイズ分離することが可能であった。この結果は、Ｄ１０および９９９６１抗体の両方が、Ｉｇ様ドメインのＣ末端上の同じ領域に結合すること、ならびにＤ１０および９９９６１が、変性条件および天然条件の両方においてＲＯＲ１と結合し得ることを示している。Ｄ１０および９９９６１は、１３を除く全ての組換えタンパク質に結合することに留意されたい。１３番のキメラタンパク質は、図６に説明される通りである。完全なヒト細胞外ドメインは、いずれかのゲルの一番左のレーンで提供される。 抗ヒトＲＯＲ１抗体９９９６１の特徴付けを示している。Ａ、Ｂ．９９９６１抗体は、トランスジェニックマウスにおいてＣＬＬ生着を阻止することができた。Ｃ．９９９６１抗体は、Ｄ１０抗体の約５０倍より大きい結合親和性を有する。 ヒト臍帯血再構成免疫不全マウスにおけるＣＬＬ細胞に対する９９９６１の特異的活性を示す。Ａ．９９９６１抗体は、９０％を超えるＣＬＬ細胞を排除する。Ｂ、Ｃ．９９９６１抗体は、正常なＢまたはＴ細胞発生には影響しない。 ＲＯＲ＋原発性ＡＭＬにおける９９９６１の特異的活性を示している。 ９９９６１によって認識されるエピトープが、正常な造血幹または前駆細胞によって発現されないことを示している。 ９９９６１が正常な成体組織と交差反応しないことを示している。 免疫欠損マウスにおける９９９６１についてのＰＫ研究を示している。 ＲＯＲ１ペプチドワクチンの設計を示している。３個の異なる抗体エピトープを使用して、ペプチドＡ１９、Ｒ２２、およびＫ１９を作成した。ヒト（上）またはマウス（下）ＲＯＲ１のいずれかに対応する線の上にＡ１９、Ｒ２２、またはＫ１９のラベルが付けられた線がある。これらの線は、ＲＯＲ１細胞外ドメインにおけるペプチド、Ａ１９、Ｒ２２、またはＫ１９の位置を説明する。 ＫＬＨをペプチドに複合体化するために使用される方法を示している。 ペプチドＲ２２のペプチド設計を示している。ＫＬＨに複合体化するために使用されるようにペプチドのＣ端末に添加される。 Ｄ１０および９９９６１がＲ２２ペプチドに結合する一方で、４Ａ５は結合しないことを示している。 ＢＡＬＢ／ｃマウスのＲ２２免疫化のための免疫化スキームを示している。 Ｒ２２誘導ＲＯＲ１抗体がＲＯＲ１に結合する、エピトープの免疫ブロット分析を示している。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＲ２２−ＫＬＨための免疫化スキームを示している。 ４℃または３７℃で１時間抗Ｒ２２−ＫＬＨ抗血清とインキュベートされ、次いで、ＲＯＲ１発現のＦＡＣＳ分析の前に３０分間氷上で、アイソタイプ対照−Ａｌｅｘａ６４７ラベル抗体または４Ａ５−Ａｌｅｘａ６４７複合体で対比染色された、ＲＯＲ１陽性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞のＦＡＣＳ分析を示している。この結果は、トランスジェニックマウスからの抗ＲＯＲ１血清が、３７℃でＲＯＲ１受容体内在化を誘導したが、４℃では誘導しなかったことを示した。 Ｒ２２−ＫＬＨで免疫化されたトランスジェニックマウスからの抗ＲＯＲ１血清が、インビトロで乳癌遊走を阻害することを示している。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＲ−２２−ＫＬＨのための免疫化スキームを示している。 図１８で説明される３個のペプチドのうちの任意の１個のＫＬＨ複合体で免疫化されたマウスの抗血清の滴定曲線を示している。ＥＬＩＳＡを介して評価された、抗血清のヒトＲＯＲ１タンパク質でコーティングされたポリスチレンプレートへの結合を描写する。 ＥＷ３６、ＪｅＫｏ−１、またはＣＬＬ細胞のＦＡＣＳ分析を示している。この研究のために、Ｒ２２−ＫＬＨで免疫化されたマウスからの抗血清の希釈物を、２０分間４℃で細胞と共にインキュベートした。細胞は、次いで、洗浄され、次いで、フローサイトメトリーによる検出のために蛍光色素と複合体化されたヤギ抗マウスＩｇでラベル付けされた。中空のヒストグラムは、最初にＲ２２−ＫＬＨ抗血清で細胞をインキュベートせずに、ヤギ抗マウスＩｇで染色された細胞である。影付きのヒストグラムは、最初に抗Ｒ２２−ＫＬＨ抗血清とインキュベートされた細胞の蛍光である。細胞の蛍光の増加は、表面に結合されたマウス抗ＲＯＲ１抗体によるものであり、これは、次いで、ヤギ抗マウスＩｇで検出された。予備免疫化されたこれらのマウスの抗血清またはＫＬＨで免疫化されたマウスの抗血清は、これらの細胞に結合しなかった。 凡例に示されている細胞を洗浄し、丸底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）においてＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ中で１ウェルあたり５×１０^５個の細胞２５μｌを播種した。希釈された抗血清（２５μｌ）および赤ん坊のウサギ補体の１：５での希釈２５μｌがウェル毎に添加された。Ｄ１０ ｍＡｂが、陽性対照として使用された。全ての条件は三連で行われた。プレートを４時間３７℃でインキュベートし、細胞は、ＤｉＯＣ６／ＰＩ染色およびフローサイトメトリー分析によって生存率を直ちに定量した。この研究は、Ｄ１０、またはＲ２２−ＫＬＨペプチドに対して生成された抗血清のいずれかが、細胞担持ヒトＲＯＲ１の補体媒介溶解を方向付けることができたことを示している。ＲＯＲ１を担持しない細胞は、死滅しなかった（図示されず）。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスのための第１のＲ２２−ＫＬＨ免疫化スキームを示している。このペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と複合体化され、次いで、上で図示されたスキーマに従ってＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫化するために使用された。ＫＬＨまたはＲ２２−ＫＬＨの第１の注射は、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）においてであった。第２の注射およびその後の注射は、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）においてであった。これらの動物は、紫色の矢印でマークされた日に採血された。第１の注射の日から４４日後に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ヒトＲＯＲ１トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスに由来するヒトＲＯＲ１発現ＣＬＬを投与され、マウスはまた、Ｔ細胞白血病１（ＴＣＬ１遺伝子）についてもトランスジェニックであり、同様にＢ細胞特異的プロモータ／エンハンサ（Ｅ−Ｃμ）の制御下にある。この白血病はヒトＣＬＬに類似し、ヒト表面ＲＯＲ１を発現する。 Ｒ２２−ＫＬＨでの免疫化の結果を示している。Ａ．ＫＬＨで免疫化されたマウスからの代表的な脾臓対Ｒ２２−ＫＬＨで免疫化されたマウス。Ｂ．Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＲＯＲ１ペプチドＲ２２−ＫＬＨでの免疫化によるＲＯＲ１＋ＣＬＬの生着の阻害。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＲ２２−ＫＬＨについての第２の免疫化スキームを示している。 Ｒ２２ペプチドの免疫化の結果を示している。Ａ．ＫＬＨで免疫化されたマウスからの脾臓およびＲ２２−ＫＬＨで免疫化されたマウス。Ｂ．Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＲ２２−ＫＬＨでの免疫化に続くＲＯＲ１＋ＣＬＬの生着の阻害。 Ｂ２２０（ｙ軸）またはＲＯＲ１（ｘ軸）に特異的な蛍光色素複合体化ｍＡｂを使用して、ＫＬＨ（上行）またはＲ２２−ＫＬＨ（下行）のいずれかで免疫化されたＣ５７ＢＬ／６マウスからの脾細胞のＦＡＣＳ分析である。細胞を染色するために使用されるｍＡｂは、Ｒ２２−ＫＬＨによって誘導される抗体よりＲＯＲ１の非交差遮断エピトープと結合する。ボックスは、白血病細胞が検出された領域の輪郭を示している。存在する場合、Ｒ２２−ＫＬＨワクチンで免疫化されたマウスの脾臓内の白血病細胞がはるかに少ないことに留意されたい。 ＲＯＲ１＋ＣＬＬ細胞上のＲＯＲ１のＦＡＣＳ分析であり、これは、ＲＯＲ１がＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＲ２２−ＫＬＨでの免疫化後に下方調節されたことを示している。 ＫＬＨまたはＲ２２−ＫＬＨで免疫化されたマウス内に存在するＣＤ８＋Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析である。Ａ．Ｒ２２での免疫化は、ＫＬＨで免疫化されたマウスに存在しない、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加を引き起こす。下のパネルは、ＫＬＨまたはＲ２２−ＫＬＨのいずれかで７５日前に、最初に免疫化されたマウスの脾臓からのＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示している。 ＲＯＲ１トランスジェニックマウスのＲ２２−ＫＬＨ免疫化のための免疫化スキームを示している。 ＲＯＲ１−ＴｇマウスにおけるＲＯＲ１ペプチドＲ２２での免疫化によるＲＯＲ＋ＣＬＬ生着の阻害のＦＡＣＳ分析である。 ＲＯＲ１トランスジェニックマウスにおけるＲ２２−ＫＬＨでの免疫化の結果を示している。ＲＯＲ１＋ＣＬＬは、ＲＯＲ１トランスジェニックマウスにおいてＲ２２−ＫＬＨでの免疫化に続き阻害された。 ＲＯＲ１＋ＣＬＬ細胞上のＲＯＲ１のＦＡＣＳ分析であり、これは、ＲＯＲ１がＲＯＲ１トランスジェニックマウスにおけるＲ２２−ＫＬＨでの免疫化後に下方調節されたことを示している。 ＫＬＨまたはＲ２２−ＫＬＨで免疫化されたＲＯＲ１−Ｔｇマウスに存在するＣＤ３＋Ｔリンパ球のＦＡＣＳ分析である。パネルＡは、Ｒ２２−ＫＬＨでの免疫化がＴリンパ球の増殖を引き起こしたことを示している。パネルＢは、７５日目にマウスの脾臓から採取されたＣＤ３＋Ｔリンパ球の割合（％）を示している。 ＫＬＨまたはＲ２２−ＫＬＨで免疫化されたマウスに存在するＣＤ４＋Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析である。パネルＡは、Ｒ２２−ＫＬＨでの免疫化が、ＫＬＨで免疫化されたマウスに検出されないＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増加を引き起こすことを示している。パネルＢ．７５日目にマウスの脾臓から採取されたＣＤ４＋Ｔ細胞の割合（％）を示している。 ＫＬＨまたはＲ２２−ＫＬＨで免疫化されたマウスに存在するＣＤ８＋Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析である。パネルＡは、Ｒ２２−ＫＬＨでの免疫化は、ＫＬＨで免疫化されたマウスに検出されないＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加を引き起こすことを示している。パネルＢ．７５日目にマウスの脾臓から採取されたＣＤ８＋Ｔの割合（％）を示している。 乳癌におけるＲＯＲ１の高レベルの発現は、肺、骨、および脳のより短い無転移生存に関連していることを示している。グラフはＰｕｂＭｅｄのＧＥＯデータベース（ＧＳＥ２６０３、ＧＳＥ５３２７、ＧＳＥ２０３４、およびＧＳＥ１２２７６）を介して入手可能な公開済みのデータから得られた。カプランマイヤー曲線は、（Ａ）肺無転移生存、（Ｂ）骨無転移生存、または（Ｃ）脳無転移生存におけるＲＯＲ１発現の予後の影響を示している。各分析のために、５８２件の症例は、最も高いレベルのＲＯＲ１ ｍＲＮＡを伴う腫瘍を有していた患者の３分の１を表すＲＯＲ１Ｈと指定されたグループと、最も低いレベルのＲＯＲ１ ｍＲＮＡを伴う癌を有していた患者の３分の１を表すＲＯＲ１Ｌと指定されたグループとにより、三分位に分離された。ＲＯＲ１ ｍＲＮＡの中間の発現を伴う腫瘍を有していた患者の三分の一が、ＲＯＲ１Ｍと指定された。無転移生存は、カプランマイヤー分析により判定され、統計的な差は、ログランク検定により判定された。各カテゴリにおける患者の数、総転移性事象、および対応するＰ値（カイ二乗検定）が、組み込まれた表に示されている。 乳癌におけるＲＯＲ１の高レベル発現は、より短い無転移生存に関連し、それらのＥＲ、ＰＲ、およびＨＥＲ２状態から独立していることを示している。乳腺癌を有する５８２人の患者のコホートが、生存分析に含まれた。（Ａ）ＥＲＮｅｇ（ｎ＝２４２）およびＥＲ＋（ｎ＝３２５）乳癌患者（左パネル）、ＰＲＮｅｇ（ｎ＝２７４）およびＰＲ＋（ｎ＝２７１）乳癌患者（中央パネル）、ならびにＨＥＲ２Ｎｅｇ（ｎ＝４０４）およびＨＥＲ２＋（ｎ＝１０６）乳癌患者（右パネル）の悪性細胞のＲＯＲ１ ｍＲＮＡ発現のレベルの比較。結果は平均±標準誤差であり、ｐ値は、スチューデントｔ−検定によって判定された。（Ｂ）全体的無転移生存におけるＥＲ状態の予後の影響（Ｐ＝０．１３、ログランク検定による）。（Ｃ）ＥＲ状態およびＲＯＲ１ ｍＲＮＡ発現の全体的無転移生存に対する予後の影響（Ｐ＜０．０００１、ログランク検定による）。（Ｄ）全体的無転移生存におけるＰＲ状態（Ｐ＝０．０００７、ログランク検定による）。（Ｅ）全体的無転移生存に対するＰＲ状態およびＲＯＲ１ ｍＲＮＡ発現の予後の影響（Ｐ＜０．０００１、ログランク検定による）。（Ｆ）全体的無転移生存におけるＨＥＲ２状態（Ｐ＝０．１６、ログランク検定による）。（Ｇ）ＨＥＲ２状態およびＲＯＲ１ ｍＲＮＡ発現の全体的無転移生存に対する予後の影響（Ｐ＜０．０００１、ログランク検定による）。 乳癌細胞株によるＲＯＲ１の発現が、ＥＭＴの機能に関連していることを示している。（Ａ）ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡまたはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡでトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１からの溶解物の免疫ブロットは、左に示されるように、ＲＯＲ１（上）またはβ−アクチン（下）に特異的な抗体でプローブされた。（Ｂ）三連のサンプルにおいてｑＲＴ−ＰＣＲを介して検出される、ＶＩＭおよびＫＲＴ１９の平均量（±標準誤差）。データは平均±標準誤差として示され、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡ群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 ＲＯＲ１をサイレンシングすることはＣＸＣＲ４の発現を低減することを示している。（Ａ）ヒストグラムは、各ヒストグラムの下に示される、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡ２またはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡ２のいずれかでトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１の三連のサンプルにおいてｑＲＴ−ＰＣＲを介して検出されたＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡの量を示している。（Ｂ）それぞれ抗ＣＸＣＲ４−ＡＰＣｍＡｂまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（影付きヒストグラム）で染色された、ＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡ２（緑の線の中空のヒストグラム）またはＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡ２（青い線の中空のヒストグラム）が形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の代表的なフローサイトメトリー蛍光ヒストグラムである。（Ｃ）細胞は、下部チャンバに２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで添加されたＣＸＣＬ１２に対する走化性を検査するためにＢＤマトリゲル（商標）なしでトランスウェルの上部チャンバに播種された。３７℃で６時間後に遊走した細胞が、１０倍の倍率で計数された。ヒストグラムは各々、ヒストグラムの下に示されるように、ＣＮＴＬ−ｓｈＲＮＡまたはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡのいずれかでトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が播種された３個のチャンバの各々において、遊走した細胞の数を提供する。結果は、３回の独立した実験を代表している。データは平均±標準誤差として示され、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡ群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 ＲＯＲ１をサイレンシングすることがＥＭＴ遺伝子発現を調整することを示している。ヒストグラムは、各ヒストグラムの下に示される、ＣＴＲＬ−ｓｉＲＮＡまたはＲＯＲ１−ｓｉＲＮＡのいずれかでトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ａ）、ＨＳ５７８Ｔ（Ｂ）、およびＢＴ５４９（Ｃ）の三連のサンプルにおいてｑＲＴ−ＰＣＲを介して検出された、様々な遺伝子の相対的なｍＲＮＡの量を示している。結果は、２回の独立した実験を代表している。データは平均±標準誤差として示され、ＣＴＲＬ−ｓｉＲＮＡ群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 ＲＯＲ１をサイレンシングすることが注射部位における同所性異種移植片の中程度の後期成長阻害、しかし実験的肺転移の強力な阻害をもたらすことを示している。（Ａ）ＲＡＧ−／−γｃ−／−マウスが、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡでトランスフェクトされたまたはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡでトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１の皮下（ｓ．ｃ．）または静脈内（ｉ．ｖ．）注射をされた。各マウスの注射された乳房脂肪体または肺内の原発性腫瘍の生物発光光子束は、腫瘍の注射に続く第１の測定のために検出された光子束に対して正規化された（１００は、初期測定の日に検出された光子束の１００％を表す）（上のパネル）。上の３つのグラフは、１×１０^６個（左）、５×１０^５個（中央）、または２．５×１０^５個（右）の示された細胞の皮下注射を与えられたマウスの乳房脂肪体の正規化された生物発光光子束を示している。下のグラフは、１×１０^６個（左）、５×１０^５個（中央）、または２．５×１０^５個（右）の示された細胞の静脈内注射を与えられた、マウスの肺の正規化された生物発光光子束を提供する。（注意：左下のグラフは、１×１０^６個の示された細胞の静脈内注射を与えられたマウスの肺の実際の平均生物発光光子束を示している。）（Ｂ）ヒストグラムは、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡでトランスフェクトされた（黒）もしくはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡでトランスフェクトされた（灰）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、または細胞無し（白）を静脈内注射された２１日目（ｎ＝５−８）の各群のマウスについての肺重量指数を示している。Ｐ値は、一元配置ＡＮＯＶＡによって判定された。（Ｃ）２１日目の各群からのマウスを代表するＨ＆Ｅ染色された肺切片。データは平均±標準誤差として示され、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡ群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 実験的な転移巣の免疫組織化学を示している。ＲＡＧ−／−γｃ−／−マウスが、５ｘ１０^５のＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡでトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１（上のパネル）およびＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡでトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１（下のパネル）の静脈内（ｉ．ｖ．）注射をされた。（Ａ）肺の切片が、２１日目に安楽死させた動物から調製された。ＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を注射されたマウスの肺は、免疫組織化学分析のために識別される転移巣をほとんど有さない。切片は、Ｋｉ６７＋、ＣＫ−１９、またはビメンチン、または端末デオキシヌクレオチド転移ｄＵＴＰニック末端ラベリング（トンネル）に特異的なｍＡｂｓで染色された。（４０倍の倍率）。（Ｂ）（ａ）におけるような肺の切片が、ホスホ−ＡＫＴ（左パネル）またはホスホ−ＣＲＥＢ（右パネル）（４０倍の倍率）に特異的なｍＡｂで染色された。 ＲＯＲ１をサイレンシングすることが、インビボでＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来の細胞株ＬＭ２−４１７５およびＢｏＭ−１８３３の肺転移および骨転移を減少させることを示している。（Ａ）ＬＭ２−４１７５細胞が肺に優先的に転移し、ＢｏＭ−１８３３細胞が骨に優先的に転移することを示す概略図。ＬＭ２−４１７５およびＢｏＭ−１８３３におけるＲＯＲ１発現を示すフローサイトメトリー分析。マウスの漫画は、参照文献から修正されている（Ｃａｎｃｅｅｒ Ｃｅｌｌ、２００９、１、６７−７８）。（Ｂ〜Ｃ）ＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡ２を使用した、ＬＭ２−４１７５およびＢｏＭ−１８３３におけるＲＯＲ１サイレンシング効率を示すフローサイトメトリー分析。（Ｄ）マウスは各々、２ｘ１０^５個のＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡでトランスフェクトされたまたはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡでトランスフェクトされたＬＭ２−４１７５細胞の静脈内注射を与えられた。左、各群の代表的な生物発光画像、右、各群の正規化されたインビボ肺光子束。（Ｅ）２ｘ１０^５個の示されるＬＭ２−４１７５細胞を静脈内注射されたマウスのカプランマイヤー生存曲線（Ｐ＜０．０００１、ログランク検定による）。（Ｆ）２１日目の各群の肺重量指数（下）。各群の肺の代表的な写真（上）。（Ｇ）２１日目の各群のエクスビボ肺ＧＦＰ光子束（下）。各群の骨の代表的な写真（上）。（Ｈ）２１日目の代表的なＨ＆Ｅ染色された組織学的肺切片。（Ｉ）マウスは各々、１ｘ１０^５個のＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされたまたはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされたＢｏＭ−１８３３細胞をｉ．ｃ．注射された。上、各群の代表的な生物発光画像、下、各群の正規化されたインビボ骨光子束（Ｊ）２１日目の代表的な骨のエクスビボ光子束、および骨のＨ＆Ｅ染色された組織学的切片。（Ｋ）２１日目の代表的な肝臓のエクスビボ光子束および肝臓のＨ＆Ｅ染色された組織学的切片。データは平均±標準誤差として示され、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡ群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 ＲＯＲ１をサイレンシングすることがインビトロでＨＳ−５７８ＴおよびＢＴ５４９の遊走を阻害することを示している。データは平均±標準誤差として示され、対照ＩｇＧで処理された細胞と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。

発明の詳細な説明
本発明は、抗ＲＯＲ１抗体またはこれらの抗原結合断片、ＲＯＲ１抗体免疫複合体、ＲＯＲ１ペプチドワクチン、またはＲＯＲ１結合ペプチドを使用して、転移を阻害する組成物および方法の発展性のある発見に関する。

本発明の組成物および方法を説明する前に、組成物、方法、および条件は様々であり得るので、本発明は、記載される特定の組成物、方法、および実験条件に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を記述することのみを目的としており、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲においてのみ制限されるため、制限することを意図しないこともまた理解されたい。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に明確に記載のない限り、複数形の参照を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、１個以上の方法、および／または本開示などを閲読するとき、当業者に明らかになるであろう本明細書に記載の種類のステップを含む。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および物質と同様もしくは同等の任意の方法および物質を本発明の実践または試験において使用することもできるが、好ましい方法および物質を、これから記載する。

ＲＯＲ１
本出願人は、多数の癌細胞株およびサンプル中に完全長ＲＯＲ１の発現を以前発見したが、非白血病患者または正常な成人ドナーの血液もしくは脾臓リンパ球を含めた他の組織では発見せず、かつ全長ヒトＲＯＲ１に対するマウス抗血清をも生成した。Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ：ＡＳＨ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ２００４ １０４，Ａｂｓｔｒａｃｔ ７７２（２００４）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ポリペプチドおよびＲＯＲ１のためのコード配列は他にも報告されており、また、この参照により本明細書に組み込まれる（例えば、受託番号ＮＰ＿００５００３．１およびＮＭ＿００５０１２．１を参照されたい）。ＣＬＬ細胞などのＷｎｔ５ａタンパク質を発現する癌細胞は、ＲＯＲ１と結合するのみならず、結果として付与された生存優位性を持っている。本発明は、したがって、癌を治療または予防するために、癌細胞におけるＲＯＲ−１発現の特異性を利用する手段を提供する。

ＲＯＲ１発現は、アポトーシスに対する耐性を高め、癌細胞の成長を促進することが示されている。例に示されるように、ＲＯＲ１の発現は、胚形成および癌転移の間に起こる上皮間葉転換（ＥＭＴ）と関連する。ＲＯＲ１の高レベルの発現は、乳腺癌の患者における増大した再発および転移率と関連する。転移しやすい乳癌細胞株内でＲＯＲ１をサイレンシングすることは、ＥＭＴ関連タンパク質（例えば、ビメンチン、スネイル−１／２、およびＺＥＢ）の発現、上皮サイトケラチンおよびタイトジャンクションタンパク質（例えば、ＣＫ−１９およびＺＯ−１）の増大した発現を減弱し、それらの遊走／浸潤能および転移の可能性を少なくした。Ｄ１０、ＲＯＲ１に特異的なｍＡｂ、でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１の処置は、癌細胞遊走を阻害するように、（ＲＯＲ１と関連する）ビメンチンを下方調節する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を移植した免疫不全マウスへのＤ１０の投与は、腫瘍転移を有意に阻害する。

抗体
ある特定の実施形態は、ヒトＲＯＲ１タンパク質に対して向けられる免疫ペプチドを含む。本明細書で記載される免疫グロブリンペプチドまたは抗体は、ＲＯＲ１タンパク質に結合することが示される。ＲＯＲ１結合活性は、特異的であり、ＲＯＲ１に対する観察された抗体の結合は、非特異的な試薬により実質的に阻止されない。これらのＲＯＲ１特異的な抗体を使用して、ＲＯＲ１細胞と正常な細胞との間で区別することができる。ＲＯＲ１特異的な抗体はまた、ＲＯＲ−１癌の治療後の応答を判定し、転移を阻害するために、ＲＯＲ１癌に対する免疫療法において使用することができる。このような免疫ペプチドは、当該技術分野で既知の種々の手段で産生され得る。

本明細書で使用されるとき、抗体という用語は、全てのタイプの抗体および抗体断片（例えば、ポリクローナル、モノクローナルおよび、ファージ提示法によって産生されるもの）を包含する。特に好ましい本発明の抗体は、ＲＯＲ１に対して比較的高い程度の親和性を有する抗体である。一定の実施形態において、抗体は、約Ｋｄ＜１０^−８ＭのＲＯＲ１に対する親和性を呈する。

実質的に精製されたものは一般に、非精製、例えば、天然状態または環境で抗体が関連している他の細胞成分を本質的に含まない組成物を指す。精製された抗体は、それは乾燥状態または水溶液中のいずれかにあり得るが、一般に均質な状態にある。純度および均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて判定される。

実質的に精製されたＲＯＲ−１特異的抗体は、通常、医薬担体、賦形剤、アジュバント、緩衝剤、吸収増強剤、安定剤、防腐アジュバント、または他の共成分と抗体との混合または製剤化の前に、製剤中に存在する全ての高分子種の８０％超を構成するであろう。より典型的には、抗体は、精製された調製物中に存在する全タンパク質の９０％以上となるように精製される。特定の実施形態において、抗体は、９５％を超える純度まで精製されるか、または本質的に均質であってもよく、他の高分子種は、従来の技術では検出されない。

免疫グロブリンペプチドは、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗体断片を含む。以下は、実施例で使用されたものと機能的に同等である類似の親和性および特異性を有する他の好適な免疫グロブリンペプチドを作るために当業者によって使用され得る方法を介した免疫グロブリンペプチド、具体的にはＲＯＲ１抗体の生成を説明する。

ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、種々の家禽、ウサギ、マウス、またはラットなどの種々の温血動物から当業者によって容易に生成され得る。簡潔に述べると、ＲＯＲ１抗原は、フロイント完全または不完全アジュバントなどのアジュバントで、腹腔内注射、筋肉内注射、眼内注射、または皮下注射を介して動物を免疫化するために利用される。数回の追加免疫の後、血清のサンプルが収集され、ＲＯＲ１に対する反応性について試験される。特に好ましいポリクローナル抗血清は、これらのアッセイの１つに、背景よりも少なくとも３倍大きいシグナルを与えるであろう。動物の力価は、ＲＯＲ１に対するその反応性に関して安定状態に達すると、より大量の抗血清が、動物を毎週採血するかまたは放血させるかのいずれかによって容易に取得され得る。

モノクローナル抗体
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）技術を使用して、ＲＯＲ１に対するｍＡｂｓを取得することができる。簡潔に述べると、ハイブリドーマが、ヒトＲＯＲ１抗原で免疫化されたマウスからの脾臓細胞を使用して産生される。各免疫化されたマウスの脾臓細胞は、例えば、ポリエチレングリコール融合法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：３−４６（１９８１））を用いて、マウス骨髄腫Ｓｐ２／０細胞と融合される。ハイブリドーマの成長、ＨＡＴ培地での選択、抗原に対するクローンのクローニングおよびスクリーニングは、標準的な手法を用いて実行される（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：３−４６（１９８１））。

ＨＡＴ選択されたクローンが、Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：３−４６（１９８１）に記載されるように、腹水中のｍＡｂを大量に産生するためにマウスに注射され、これは、タンパク質Ａカラムクロマトグラフィー（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）を使用して精製され得る。ｍＡｂは、ＲＯＲ−１に対するそれらの（ａ）特異性、（ｂ）高い結合親和性、（ｃ）アイソタイプ、および（ｄ）安定性についてに基づいて選択され得る。

ｍＡｂは、ウエスタンブロッティング（Ｋｏｒｅｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８７６：９１−１００（１９８６））および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Ｋｏｒｅｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８７６：９１−１００（１９８６））を含む種々の標準的な技術のいずれかを使用して、ＲＯＲ１特異性についてスクリーニングまたは試験することができる。

ヒト化抗体
マウス抗体のヒト化形態は、組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３，１９８９、および国際特許第ＷＯ９０／０７８６１号（各々が、参照により組み込まれる）を参照）によって、非ヒト抗体のＣＤＲ領域をヒト定常領域に連結することによって生成することができる。ヒト抗体は、ファージディスプレイ法を使用して取得できる（例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際特許第ＷＯ９１／１７２７１号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．、国際特許第ＷＯ９２／０１０４７号を参照）。これらの方法で、メンバーがそれらの外表面上に異なる抗体を提示する、ファージのライブラリが産生される。抗体は、通常、ＦｖまたはＦａｂ断片として提示される。所望の特異性を有する抗体を提示するファージは、親和性濃縮度によって選択され得る。

抗体断片
特定の用途のためにｍＡｂの機能的断片を産生し使用することが所望であり得る。典型的なＩｇＧ分子の周知の基本構造は、２個の同一の軽ポリペプチド鎖（約２２０個のアミノ酸含有）および２個の同一の重ポリペプチド鎖（約４４０個のアミノ酸含有）からなる、約１５０，０００〜２００，０００ダルトンの対称四量体のＹ字型分子である。重鎖は、少なくとも１個のジスルフィド結合により互いに連結されている。各軽鎖は、ジスルフィド結合によって隣接する重鎖に連結されている。抗原結合部位またはドメインは、Ｙ字型の抗体分子の各腕に位置し、ジスルフィド結合された軽鎖および重鎖の各対のアミノ末端領域の間に形成される。軽鎖および重鎖のこれらのアミノ末端領域は、最初の約１１０個のアミノ末端のアミノ酸からなり、軽鎖および重鎖の可変領域として知られている。

加えて、軽鎖および重鎖の可変領域内に、相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られているアミノ酸配列の広がりを含有する超可変領域が存在する。ＣＤＲは、エピトープと呼ばれる抗原分子上の１個の特定部位に対する抗体の特異性の原因である。したがって、典型的なＩｇＧ分子は、各抗原結合部位が各抗原分子の特異的なエピトープに結合可能であるので、それが２個の抗原分子に結合できるという点で、二価である。軽鎖および重鎖のカルボキシ末端領域は、他の抗体分子のものと類似するかまたは同一であり、定常領域と呼ばれる。特定の抗体の重鎖の定常領域のアミノ酸配列は、それが抗体のどのクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ）であるかを定義する。抗体のいくつかのクラスは、多価の抗原結合配置において互いに関連する２個以上の同一の抗体を含有する。

ＲＯＲ−１に結合するｍＡｂのＦａｂおよびＦ（ａｂ'）_２断片を、全ｍＡｂの代わりに使用することができる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ'）_２断片は、完全な抗体分子より小さいので、より多くの抗原結合ドメインが、全抗体分子が使用されるときより、利用可能である。パパインによる典型的なＩｇＧ分子のタンパク質分解切断は、ジスルフィド連結を介して隣接する重鎖のアミノ末端部分に連結された完全な軽鎖を含有する、Ｆａｂ断片と呼ばれる２個の個別の抗原結合断片を産生することが知られている。パパイン消化した免疫グロブリン分子の残りの部分は、Ｆｃ断片と呼ばれ、完全なまま残され、かつジスルフィド結合を介し一緒に連結された抗体のカルボキシ末端部分からなる。抗体がペプシンで消化される場合、Ｆｃ領域を欠いているが（Ｆａｂ断片として）隣接する軽鎖と重鎖と間のジスルフィド結合によって一緒に保持される両方の抗原結合ドメイン、および隣接する重鎖の残りの部分の間のジスルフィド結合も含有する、Ｆ（ａｂ'）_２断片として知られる断片が産生される（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ １：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８６））。

単鎖Ｆｖ断片（ＳｃＦｖまたはＳｃＦｖ抗体）として知られる一本鎖抗原結合ポリペプチドである、組換え免疫グロブリンペプチドの産生および選択を容認する組換えＤＮＡ法が開発されている。更に、ＳｃＦｖは、二重特異性抗体を産生するために二量体化することができる。ＳｃＦｖは、目的の特異的なエピトープに結合し、例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１０８３２−１０８３８；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５２，６２４−６２８；ａｎｄ Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，６３７８−６３８２に記載されているように、組換え細菌ファージに基づく種々の方法のいずれかを使用して産生することができる。これらの方法は、通常、組換えＭ１３またはｆｄファージなどの遺伝的に改変された繊維状ファージの産生に基づいており、それらは、融合タンパク質のアミノ末端領域として抗原結合性のＳｃＦｖ抗体と、融合タンパク質のカルボキシ末端領域として微量のファージコートタンパク質ｇ３ｐとを含有する組換え融合タンパク質をファージ粒子の表面上に提示する。このような組換えファージは、容易に成長し得、周知のファージ法を用いて単離され得る。さらに、完全なファージ粒子は、通常、ファージ粒子から離れたＳｃＦｖを単離する必要なしに、それらの表面上の抗原結合ＳｃＦｖの存在（提示）を直接スクリーニングされ得る。

ＳｃＦｖを生成するために、標準的な逆転写酵素プロトコルが、ＲＯＲ１抗原を標的化するためのｍＡｂを産生するハイブリドーマから単離されたｍＲＮＡからｃＤＮＡを最初に生成するために使用される。ｍＡｂの重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ分子が、次いで、マウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域のための１組のプライマーを使用した標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法によって増幅され得る（Ｃｌａｃｋｓｏｎ（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４−６２８）。ｍＡｂ 重鎖および軽鎖可変領域をコードする増幅されたｃＤＮＡｓは、次いで、組換えＳｃＦｖ ＤＮＡ分子を生成するためにリンカーオリゴヌクレオチドで共に連結される。ＳｃＦｖＤＮＡは、ｇ３ｐと呼ばれる微量のコートタンパク質をコードするファージ遺伝子の５'領域に増幅されたｃＤＮＡ配列を融合するように設計された繊維状ファージプラスミドに連結される。大腸菌の細菌細胞は、組換えファージプラスミドで形質転換されるより、繊維状ファージが成長し、採取された。所望の組換えファージは、微量のコートタンパク質のアミノ端末領域と融合した抗原結合ドメインを提示する。次いで、このような「提示ファージ」は、結合抗原を可能にするＳｃＦｖ抗体タンパク質を含有するそれらのファージ粒子を吸着するために、例えば、「パニング」として知られる方法を用いて固定された抗原上を通過することができる（Ｐａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８９） Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１，２１５−２１８；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，６３７８−６３８２を参照されたい）。次いで、抗原結合ファージ粒子は、標準的なファージ感染法によって増幅され得、増幅された組換えファージ集団は、再度抗原結合能力について選択される。増幅前の、抗原結合能力についての選択のこのような連続ラウンドは、組換えファージ上に提示されたＳｃＦｖにおいて増大した抗原結合能力のために選択する。増加した抗原結合親和性のための選択は、より緊密な結合活性を必要とするために結合が起こる条件を調整することによって行われ得る。

増大した抗原結合活性を選択する別の方法は、抗原結合活性および増幅についての選択の連続ラウンドにＳｃＦｖ対象組換えファージ集団の結合ドメインをコードするｃＤＮＡ内のヌクレオチド配列を改変することである（Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，１０８３２−１０８３８；ａｎｄ Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，６３７８−６３８２を参照されたい）。

一旦ＳｃＦｖが選択されると、組換えＲＯＲ１抗体は、大腸菌株ＨＢ２１５１と併せて適切なベクターを使用して自由な形態で産生され得る。これらの細菌は実際に、ファージ成分を含まない可溶性形態のＳｃＦｖを分泌する（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，４１３３−４１３７）。ＨＢ２１５１細菌培養培地からの可溶性のＳｃＦｖの精製は、ＡＦＦＩＧＥＬ（商標）などの固体支持体上に固定された抗原分子を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって達成することができる（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）。

組換え抗体技術の他の開発は、二量体および四量体にＳｃＦｖを重合することによって、増加する結合の意欲などのさらなる改善の可能性について実証する（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，６４４４−６４４８を参照されたい）。

ＳｃＦｖがＦａｂまたはＦ（ａｂ'）_２断片よりさらに小さい分子であるため、それらを使用して、可能な全抗体、Ｆ（ａｂ'）_２、またはＦａｂ断片の使用よりも、固体支持体物質上に固定化されたとき、単位面積当たりの抗原結合部位のより高い密度を達成することができる。さらに、組換え抗体技術は、ハイブリドーマと比較して、抗体のより安定した遺伝源を提供する。組換え抗体はまた、標準的な細菌ファージ産生法を使用して、より迅速かつ経済的に産生することができる。

本発明の抗体またはこれらの抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化された、もしくはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'およびＦ（ａｂ'）サブ２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ））、ＶＬもしくはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって産生された断片、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示されているＲＯＲ１抗体に対する抗Ｉｄ抗体）を含むが、これらに限定されない。ＳｃＦｖ分子は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、または免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。ヒトＲＯＲ１に対するｓｃＦｖの例は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４を含む。

単鎖抗体を含む抗体断片は、単独で、または以下の全部または部分と組み合わせて可変領域（複数可）を含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン。また、本発明において、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを有する可変領域（複数可）の任意の組み合わせも含む抗原結合断片が含まれる。本発明の抗体またはその免疫特異的断片は、鳥類および哺乳類を含む任意の動物に由来し得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体である。別の実施形態において、可変領域は、コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）が起源であり得る（例えば、サメ）。本明細書で使用されるとき、「ヒト」抗体は、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら）において下に説明されるように、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、１個以上のヒト免疫グロブリンのためのヒト免疫グロブリンライブラリまたは動物のトランスジェニックから単離された、内因性免疫グロブリンを発現しない抗体を含む。

組換え抗体産生
本明細書に記載される抗体を組換えて産生するために、軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸が、任意選択により、定常領域に連結され、発現ベクターに挿入される。軽鎖および重鎖は、同じまたは異なる発現ベクター内でクローニングすることができる。例えば、配列番号１〜５の重鎖および軽鎖を、本発明に従って使用することができる。米国特許第６，２８７，５６９号（Ｋｉｐｐｓら）の教示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書において提供される方法は、本発明のワクチンを作るために当業者によって容易に適合され得る。抗体鎖をコードするＤＮＡセグメントは、抗体鎖の発現を確実にする発現ベクター（複数可）における制御配列に操作可能に連結される。このような制御配列は、シグナル配列、プロモータ、エンハンサ、および転写終結配列を含み得る。

発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、または宿主染色体の不可欠な部分として、宿主生物内で複製可能である。大腸菌は、本発明の抗体を発現するために特に有用である１個の原核生物宿主である。使用に好適な他の微生物宿主として、枯草菌などのバチルス、およびサルモネラ、セラチア、および様々なシュードモナス種など他の腸内細菌が挙げられる。これらの原核生物宿主中でまた、典型的に宿主細胞（例えば、複製起源）と適合性のある発現制御配列を含有する発現ベクター、およびラクトースプロモータ系などの調節配列、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系、β−ラクタマーゼプロモータ系、またはファージラムダからのプロモータ系を作ることができる。酵母などの他の微生物も発現のために使用され得る。サッカロミセスは、所望に応じて、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素を含むプロモータ、および複製起源、終結配列などの、発現制御配列を有する好適なベクターを有する好ましい宿主である。哺乳類組織細胞培養もまた、本発明の抗体を発現し産生するために使用され得る（例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８７を参照されたい）。完全な抗体を分泌することが可能ないくつかの好適な宿主細胞株が開発されているので、真核細胞が好ましい。本発明の免疫グロブリンをコードする核酸を発現するために好ましい好適な宿主細胞は、以下を含む：ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）によって形質転換されたサルの腎臓ＣＶ１株、ヒト胚性腎臓株、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウスセルトリ細胞、サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、およびＴＲＩ細胞。

目的のポリヌクレオチド配列を含有するベクター（例えば、配列および発現制御配列をコードする重鎖および軽鎖）は、宿主細胞に移すことができる。塩化カルシウムトランスフェクションが、一般に、原核細胞に利用されるが、リン酸カルシウム処理または電気穿孔を、他の細胞宿主に使用することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．，１９８９を参照されたい）。重鎖および軽鎖が、個別の発現ベクター上でクローニングされるとき、ベクターは、完全な免疫グロブリンの発現およびアセンブリを取得するように同時トランスフェクトされる。組換えＤＮＡの導入後、免疫グロブリン産生物を発現する細胞株は、選択された細胞である。安定した発現が可能な細胞株が好ましい（すなわち、細胞株の５０回の継代後、衰えることのない発現レベル）。

一旦発現されると、全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、または本発明の他の免疫グロブリンの形態は、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当該技術分野の標準的な手順に従って精製することができる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８２を参照されたい）。少なくとも約９０〜９５％の均質性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％以上の均質性が最も好ましい。

複数の特異的抗体、抗体免疫複合体、および融合分子
本発明のＲＯＲ１抗体またはこれらの抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、「多重特異性」（例えば、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の多重特異性）であり得、これは、１個以上の異なる抗原（例えば、タンパク質）上に同時に存在する２個以上の異なるエピトープを認識し、それに結合することを意味する。したがって、ＲＯＲ１抗体が「単一特異性」であるか、または「多重特異性」（例えば、「二重特異性」）であるかは、結合ポリペプチドが反応する異なるエピトープの数を指す。多重特異性抗体は、本明細書に記載の標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であり得るか、または標的ポリペプチド、ならびに異種ポリペプチドまたは固体支持物質などの異種エピトープに対して特異的であり得る。

本明細書で使用されるとき、「結合価」という用語は、可能性のある結合ドメイン（例えば、ＲＯＲ１抗体、結合ポリペプチド、または抗体内に存在する抗原結合ドメイン）の数を指す。各結合ドメインは、１個のエピトープに特異的に結合する。ＲＯＲ１抗体、結合ポリペプチド、または抗体は、２個以上の結合ドメインを含むとき、各結合ドメインは、「二価単一特異性」と呼ばれる２個の結合ドメインを有する抗体のために、同じエピトープと特異的に結合し得るか、または「二価二重特異性」と呼ばれる２個の結合ドメインを有する抗体のために、異なるエピトープに対して結合し得る。抗体はまた、各特異性について二重特異性および二価であり得る（「二重特異性四価抗体」と呼ばれる）。別の実施形態において、四価低分子化抗体またはドメイン欠失抗体を作ることができる。

二重特異性二価抗体およびそれらを作る方法は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、同第５，８０７，７０６号、同第５，８２１，３３３号、および米国特許出願公開第２００３／０２０７３４号および同第２００２／０１５５５３７号（これらの全ての開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。二重特異性四価抗体およびそれを作る方法は、例えば、国際特許第ＷＯ０２／０９６９４８号および同第ＷＯ００／４４７８８号（これらの両方の開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。一般に、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１７７１５号、同第ＷＯ９２／０８８０２号、同第ＷＯ９１／００３６０号、同第ＷＯ９２／０５７９３号、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）、米国特許第４，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい。

本発明は、多重特異性ＲＯＲ１抗体を含む。例えば、二重特異性抗体は、２個のｓｃＦｖ抗体断片から構成され、その両方がＲＯＲ１と結合する。ｓｃＦｖ抗体断片は、ＲＯＲ１上で同じまたは異なるエピトープを結合し得る。追加の例として、多重特異性抗体は、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号３９、または配列番号４２からなる群から選択される重鎖可変領域と、配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９、配列番号４１、または配列番号４５からなる群から選択される軽鎖可変領域とを有する抗体のエピトープに結合する二重特異性抗体であり得る。

本発明は、融合タンパク質までさらに拡張する。融合タンパク質は、例えば、少なくとも１個の標的結合部位を有する免疫グロブリン抗原結合ドメインと、少なくとも１個の異種部分（すなわち、それが自然の中で自然に連結されていない部分）とを含むキメラ分子である。アミノ酸配列は、通常、融合ポリペプチド内で一緒になる別個のタンパク質内に存在し得るか、またはそれらは、通常、同じタンパク質内に存在し得るが、融合ポリペプチド内の新しい配置内に置かれる。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係においてコードされるポリヌクレオチドを作り、翻訳することによって、作られ得る。

本発明のＲＯＲ１抗体またはこれらの抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、Ｎ末端もしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的にさらに融合され得るか、またはポリペプチドもしくは他の組成物と化学的に複合体化（共有および非共有複合体化を含む）され得る。例えば、ＲＯＲ１特異的な抗体は、組換え的に融合され得るか、または検出アッセイおよび異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素などのエフェクター分子でラベルとして有用な分子に複合体化され得る。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０８４９５号、同第ＷＯ９１／１４４３８号、同第ＷＯ８９／１２６２４号、米国特許第５，３１４，９９５号、および欧州特許第ＥＰ３９６，３８７号を参照されたい。本発明の放射標識ＲＯＲ１抗体は、特に有用であろう一方、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、まだ開発されていない。

本発明のＲＯＲ１抗体、またはこれらの抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、（すなわち、抗体に対する任意のタイプの分子の共有結合によって）修飾された誘導体を含み、共有結合が、抗体がＲＯＲ１に結合することを妨げないようにする。例えば、限定はしないが、抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスフィル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基、タンパク質分解切断による誘導体化、細胞リガンドまたは他のタンパク質などへの結合によって修飾された抗体を含む。多数の化学修飾のいずれも、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むがこれらに限定されない、既知の技術によって実施することができる。加えて、誘導体は、１個以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。

本発明のＲＯＲ１抗体またはこれらの抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわち、ペプチド等価物）によって互いに接合されるアミノ酸からなり得、２０個の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。ＲＯＲ１特異的抗体は、翻訳後の処理として、または当該技術分野で周知の化学修飾技術などの天然のプロセスによって修飾され得る。このような修飾は、基本的な文書およびより詳細な学術論文、ならびに多数の研究文献に十分に説明されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノもしくはカルボキシル末端を含むＲＯＲ１特異的抗体のどこでも、または炭水化物などの部分に発生し得る。同じタイプの修飾が、所定のＲＯＲ１特異的抗体のいくつかの部位に同じまたは様々な程度で存在し得ることが理解されるであろう。

本発明はまた、ＲＯＲ１抗体またはこれらの抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体と、異種ポリペプチドとを含む、融合タンパク質を提供する。抗体が融合された異種ポリペプチドは、機能のために有用であるか、ＲＯＲ１ポリペプチド発現細胞を標的とするのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体またはこれらの断片もしくは変異体のＶＨ領域のうちの任意の１個以上のアミノ酸配列もしくは本発明の抗体のＶＬ領域のうちの任意の１個以上のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有する、ポリペプチドを含む。

別の実施形態において、本明細書に開示される治療方法で使用するための融合タンパク質は、ＲＯＲ１特異的な抗体、またはその断片、変異体、もしくは誘導体の、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９からなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲのうちの任意の１個、２個、３個のアミノ酸配列、あるいはＲＯＲ１特異的な抗体、またはその断片、変異体、もしくは誘導体の、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群から選択されるＶＬ−ＣＤＲのうちの任意の１個、２個、３個のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有する、ポリペプチドを含む。一実施形態において、融合タンパク質は、本発明のＲＯＲ１特異的な抗体、またはこの断片、誘導体、もしくは変異体のＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有する、ポリペプチドを含み、この融合タンパク質は、ＲＯＲ１の少なくとも１個のエピトープに特異的に結合する。別の実施形態において、融合タンパク質は、本発明のＲＯＲ１特異的な抗体またはこの断片、誘導体、もしくは変異体の少なくとも１個のＶＨ領域のアミノ酸配列および本発明のＲＯＲ１特異的な抗体の少なくとも１個のＶＬ領域のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有する、ポリペプチドを含む。好ましくは、融合タンパク質のＶＨおよびＶＬ領域は、ＲＯＲ１の少なくとも１個のエピトープに特異的に結合する単一源抗体（またはｓｃＦｖもしくはＦａｂ断片）に対応する。さらに別の実施形態において、本明細書に開示される診断および治療方法で使用するための融合タンパク質は、ＲＯＲ１特異的な抗体のＶＨＣ ＤＲのうちの任意の１個、２個、３個、もしくはそれ以上のアミノ酸配列およびＲＯＲ１特異的な抗体のうちの任意の１個、２個、３個、もしくはそれ以上のＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列と、あるいはこれらの断片もしくは変異体と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む。好ましくは、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上のＶＨ−ＣＤＲ（複数可）もしくはＶＬ−ＣＤＲ（複数可）が、本発明の単一源抗体（またはｓｃＦｖもしくはＦａｂ断片）に対応する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子もまた、本発明により包含される。

融合タンパク質は、当該技術分野で周知の方法を用いて調製され得る（例えば、米国特許第５，１１６，９６４号および同第５，２２５，５３８号を参照されたい）。融合がなされる正確な部位は、融合タンパク質の分泌または結合特性を最適化するように経験的に選択され得る。融合タンパク質をコードするＤＮＡは、次いで、発現のために宿主細胞内にトランスフェクトされる。

本発明は、特に好ましい抗ヒトＲＯＲ１抗体（すなわち、抗体９９９６１と同じ結合特異性を有する単離された抗ＲＯＲ１抗体）を提供する。一態様において、抗体は、ＲＯＲ１のＣＲＤドメインと隣接するＩｇ様ドメインに結合する。追加の態様において、抗体は、ｈＲＯＲ１のアミノ酸４２〜１６０に結合する。さらなる態様において、抗体は、ＲＯＲ−１のアミノ酸１３０〜１６０に結合する。別の態様において、抗体は、結合するために、ｈＲＯＲ１の１３８位のグルタミン酸の存在を必要とする。

追加の実施形態において、本発明は、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、および配列番号１７からなる群から選択される重鎖可変領域が、および配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、および配列番号１９からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む単離された抗ＲＯＲ１抗体を提供する。一態様において、重鎖可変領域に従う抗体は配列番号５であり、軽鎖可変領域は配列番号７である。

一実施形態において、本発明は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３４、および配列番号３５からなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３から構成される重鎖可変領域、および配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８からなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３から構成される軽鎖可変領域を含む単離された抗ヒトＲＯＲ１抗体を提供する。一態様において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３から構成される重鎖可変領域は、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９から構成され、かつＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３から構成される軽鎖可変領域が、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群から選択される。

さらなる実施形態において、本発明は、４１ｎＭを超える結合親和性を有する抗ヒトＲＯＲ１抗体を提供する。一態様において、抗体結合親和性が、約５００ｐＭ〜約６ｎＭの間である。一態様において、抗体結合親和性が、約８００ｐＭである。

別の態様において、抗体は、転移を阻害する。追加の態様において、抗体は、内在化し、細胞遊走を阻害する。さらなる態様において、抗体は、内在化し、ビメンチン、スネイル１／２、またはＺＥＢを下方調節する。別の態様において、抗体は、ヒト、ヒト化、またはキメラである。一態様において、抗体は、９９９６１、９９９６１．１、９９９６１．２、９９９６１．３、または９９９６１．４である。好ましい態様において、抗体は、９９９６１．１である。

本発明の一実施形態は、ＲＯＲ１に対する抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を提供する。追加の実施形態において、本発明は、ＲＯＲ１に対する抗体をコードする単離された核酸を提供する。別の実施形態において、本発明は、ＲＯＲ１に対する抗体をコードする核酸に従う核酸を含む発現ベクターを提供する。追加の実施形態において、本発明は、ＲＯＲ１に対する抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、抗体を産生するための条件下で、宿主細胞を培養することを含む、抗ＲＯＲ１抗体を産生する方法を提供する。一態様において、抗体を産生する方法は、抗体を回収することをさらに含む。

実施例に示されるように、抗ＲＯＲ１抗体Ｄ１０は、マウスおよびヒトＣＬＬ生着を阻害し、補体依存性細胞傷害を方向付けることができ、白血病の負荷の大幅な低減を誘発し、かつ乳癌細胞の肺および骨への転移を阻止する。

Ｄ１０は、生物活性を有することが示されている一方で、他の既知の抗ＲＯＲ１抗体（例えば、４Ａ５およびＫ１９）は、４Ａ５がＲＯＲ１のためにさらに有意に高い結合親和性を有するにも関わらず、生物活性を呈さない。抗体４Ａ５は、Ｄ１０よりも異なるエピトープに結合することが示されている。癌がＲＯＲ＋である癌患者のサブセット、ＲＯＲ１に対する抗血清が産生されることが示されている。患者のさらなるサブセットが、Ｗｎｔ５ａ活性を阻害する抗体を作り、したがって、全てのＲＯＲ１抗体が生物活性を有するわけではないという結論に至る。

実施例にさらに説明されているように、エピトープのマッピングが、Ｄ１０および４Ａ５のエピトープを判定するために実施された。これらの研究は、Ｄ１０は、ＲＯＲ１上でＣＲＤに隣接するＩｇ様ドメインのＣ末端でエピトープに結合すると判定した。４Ａ５のためのエピトープはまた、Ｉｇ様ドメインにマッピングされたが、ドメインのアミノ端末により近いものであった。これらの知見は、Ｄ１０と同じエピトープに結合する抗体は、ＲＯＲ１生物活性を阻害するであろうが、一方、他の場所で結合する抗体は阻害しないこともあるという結論に至った。

実施例に示されるように、高い親和性抗体（すなわち、９９９６１）は、高い親和性の組換え抗体を選択するために、Ｄ１０エピトープを用いて得られた。選択された抗体の一つ、９９９６１は、Ｄ１０よりＲＯＲ１のために有意により高い結合親和性を有する。９９９６１抗体は、Ｄ１０より５０倍高い結合親和性（すなわち、８００ｐＭ ｖ．４１ ｎＭ）を有する。加えて、９９９６１は、４個の異なる抗体を生成するようヒト化された。実験により、９９９６１がＤ１０と同じエピトープを有することが確認された。実験により、このエピトープが正常な造血幹および前駆細胞上で発現されないことが確認された。さらに、９９９６１は、正常な成体組織と交差反応しない。この抗体はまた、ＣＬＬ細胞に対する活性、ＲＯＲ＋原発性ＡＭＬ内の活性、およびＲＯＲ１内在化の誘導を実証した。

ワクチン
加えて、本発明は、単離または合成的に産生されたＲＯＲ１結合ペプチドの薬学的に許容される組成物からなる、対象における治療のためのワクチン、癌の予防、または転移の阻害を提供する。本発明はまた、Ｄ１０のＲＯＲ−１結合領域に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＲＯＲ１結合ペプチドを提供する。さらなる態様において、本発明は、Ｄ１０の結合領域に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を有するＲＯＲ１結合ペプチドを提供する。一態様において、Ｄ１０の結合領域は、ＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣである。追加の態様において、Ｄ１０の結合領域は、ＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣである。一態様において、Ｄ１０結合領域は、少なくとも２２個のアミノ酸である。さらなる態様において、Ｄ１０結合領域は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個のアミノ酸である。

本発明はまた、リンパ腫（例えば、ＲＯＲ１の発現を伴うＣＬＬ）などの疾患に対するＲＯＲ１結合ペプチドワクチンの使用を提供する。正常な成体組織がＲＯＲ−１を発現するように見えないため、能動免疫療法で標的化することができる腫瘍特異的な抗原を表す。例えば、ＲＯＲ１のレベルは、動物においてＲＯＲ１に対して保護的または治療的免疫応答およびその発現の効果をもたらす、治療有効量のＲＯＲ１結合ペプチドワクチンを患者に投与することによって下方調節され得る。ワクチンは、ペプチドを含み得る。このようなペプチドを使用する方法は、ワクチンの、ＲＯＲ１に対する抗体を生成するための使用を含む。ＲＯＲ１結合ペプチドはまた、免疫アジュバントを含む。免疫アジュバントは、結合ペプチドと複合体化された免疫原性担体部分であり得る。一態様において、免疫原性担体部分はペプチドである。ワクチンのための好適な担体の例としては、免疫原性アジュバントがさらに挙げられる。さらなる態様において、アジュバントは、結合ペプチドと複合体化された免疫原性担体部分である。免疫原性担体部分は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、水酸化アルミニウム、または他の薬学的に許容される免疫アジュバントなどの担体ペプチドであり得る。薬学的に許容される免疫アジュバントの例は、以下に見ることができる：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．４２：Ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｔ．Ｏ'Ｈａｇａｎ；Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ ａｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｌｏｎｄｏｎ ２００４。典型的には、ワクチン組成物はまた、薬学的に許容される担体または希釈液を含むであろう。

一実施形態において、本発明は、ＲＯＲ−１発現細胞に対するワクチンであって、抗体Ｄ１０のＲＯＲ−１結合領域に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する単離されたまたは合成的に産生されたペプチドの薬学的に許容される組成物を含むワクチンを提供する。一態様において、ワクチン、抗体Ｄ１０のＲＯＲ−１結合領域のアミノ酸配列は、ＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣである。さらなる態様において、ワクチン、抗体Ｄ１０のＲＯＲ−１結合領域のアミノ酸配列は、ＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣである。別の態様において、ＲＯＲ１発現細胞は、癌細胞である。追加の態様において、癌細胞は、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、ＣＬＬ、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、卵巣癌、結腸癌、肺癌、皮膚癌、膵臓癌、精巣癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌、または副腎癌からのものである。

別の実施形態において、本発明は、ＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ１結合ペプチドと、薬学的に許容される担体とを有するワクチンを提供する。一態様において、ペプチドは、哺乳類のものである。追加の態様において、ペプチドは、キメラおよび／またはヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、霊長類、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ニワトリまたはクマの起源である。別の態様において、ワクチンは、免疫原性アジュバントをさらに含む。さらなる態様において、アジュバントは、結合ペプチドと複合体化された免疫原性担体ペプチドである。一態様において、結合ペプチドのアミノ酸配列は、ＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣである。別の態様において、免疫原性担体ペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である。ワクチンは、免疫原性アジュバントをさらに含む。さらなる態様において、アジュバントは、結合ペプチドと複合体化された免疫原性担体部分である。一態様において、結合ペプチドのアミノ酸配列は、ＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣである。免疫原性担体部分は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、水酸化アルミニウム、または他の薬学的に許容される免疫アジュバントなどの担体ペプチドであり得る。薬学的に許容される免疫アジュバントの例は、以下に見ることができる：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．４２：Ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｔ．Ｏ'Ｈａｇａｎ；Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ ａｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｌｏｎｄｏｎ ２００４。

別の実施形態において、本発明は、ＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ１結合ペプチドと、薬学的に許容される担体とを有するワクチンを提供する。一態様において、ペプチドは、哺乳類のものである。追加の態様において、ペプチドは、キメラおよび／またはヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、霊長類、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ニワトリまたはクマの起源である。別の態様において、ワクチンは、免疫原性アジュバントをさらに含む。さらなる態様において、アジュバントは、結合ペプチドと複合体化された免疫原性担体ペプチドである。一態様において、結合ペプチドのアミノ酸配列は、ＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣである。免疫原性担体部分は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、水酸化アルミニウム、または他の薬学的に許容される免疫アジュバントなどの担体ペプチドであり得る。薬学的に許容される免疫アジュバントの例は、以下に見ることができる：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．４２：Ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｔ．Ｏ'Ｈａｇａｎ；Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ ａｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｌｏｎｄｏｎ ２００４。

追加の実施形態において、本発明は、ＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ１結合ペプチドと、薬学的に許容される担体とを有するワクチンを有する医薬製剤を提供する。

追加の実施形態において、本発明は、ＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ１結合ペプチドと、薬学的に許容される担体とを有するワクチンを有する医薬製剤を提供する。

実施例に示されるように、ペプチドワクチンは、図１８に示されるように開発された。３個のペプチドが、ＲＯＲ１抗体Ｄ１０、４Ａ５、およびＫ１９のエピトープに基づいて使用された。動物は、３個のペプチドで免疫化された。３個のペプチド全てが、ＲＯＲ１抗血清の産生を誘導した。結果は、Ｒ２２ペプチドでの免疫化が最大の抗体力価をもたらしたこと実証する。実施例に示されるように、ＲＯＲ１抗血清は、ＲＯＲ１と結合し、白血病の負荷を減少させ、ＲＯＲ１内在化を誘導し、補体依存性細胞傷害を媒介し、乳癌細胞遊走を阻害し、ＲＯＲ＋白血病細胞の生着を阻害する。したがって、本発明は、遊走して転移するＲＯＲ＋癌細胞の能力を阻害するための抗体の誘導を可能にするように、ＲＯＲ１に対して患者を免疫化する方法を提供する。

ＲＯＲ１結合ペプチド
一実施形態において、本発明は、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＲＯＲ１結合ペプチドを提供する。一態様において、ペプチドは、ＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。別の態様において、ペプチドは、ＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸ペプチド配列を有する。別の態様において、結合ペプチドは哺乳類のものである。追加の態様において、結合ペプチドは、キメラおよび／またはヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、霊長類、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ニワトリまたはクマの起源である。

一実施形態において、本発明は、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＲＯＲ１結合ペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を提供する。

別の実施形態において、本発明は、配列番号２５および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＲＯＲ１結合ペプチドをコードする単離された核酸を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号２５および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＲＯＲ１結合ペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。さらなる実施形態において、本発明は、配列番号２５および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＲＯＲ１結合ペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。追加の実施形態において、本発明は、結合ペプチドを産生する条件下で、配列番号２５および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＲＯＲ１結合ペプチドをコードする宿主細胞を培養することを含む、ペプチドを産生する方法を提供する。一態様において、ペプチドを生成するための方法は、結合ペプチドを回収することをさらに含む。

転移の抑制
一実施形態において、本発明は、ＲＯＲ−１発現癌の転移を抑制する方法を提供し、該方法は、モノクローナル抗体９９９６１の結合特異性を有する抗体、抗体Ｄ１０のＲＯＲ−１結合領域に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドから構成されるワクチン、ＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ−１結合ペプチド、またはＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ−１結合ペプチドを投与することによって腫瘍細胞の上皮間葉転換を妨害することを含む。一態様において、ＲＯＲ−１発現癌は、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、ＣＬＬ、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、卵巣癌、結腸癌、肺癌、皮膚癌、膵臓癌、精巣癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌、または副腎癌である。

実施例は、ＲＯＲ１抗体、結合ペプチド、およびワクチンが、ＲＯＲ＋癌細胞が遊走することまたは転移することを阻害する能力を有する証拠を提供する。

治療
本明細書で使用されるとき、「治療する」または「治療」という用語は、治療的処置および予防法または予防措置の両方を指し、その目的は、癌の進行または拡大などの所望でない生理学的変化または障害を予防するまたは遅らせる（軽減する）ことである。有益なまたは所望の臨床結果としては、検出可能または検出不可能に関わらず、症状の緩和、疾患の程度の軽減、安定化した（すなわち、悪化しない）疾患の状態、疾患の進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的または全体的に関わらず）が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存と比較して、延長された生存を意味し得る。治療を必要とする者としては、状態または障害を既に有する者、ならびに状態もしくは障害を有する傾向がある者、または予防されるべき状態または障害を有する者が挙げられる。

本明細書で使用されるとき、「癌」、「癌細胞」、「ＲＯＲ１発現癌」、または「ＲＯＲ１発現癌細胞」という用語は、悪性または良性に関わらず、全ての新生物細胞の成長および増殖を指し、全ての形質転換された細胞および組織と全ての癌性細胞および組織とを含む。癌は新生物に限定されず、良性または悪性に関わらず、以下に位置するものを含む：前立腺、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、および尿生殖路。一定の実施形態において、このような新生物は、ＲＯＲ１を発現する、過剰に発現する、または異常に発現する。

癌としてはまた、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、ＣＬＬ、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、卵巣癌、結腸癌、肺癌、皮膚癌、膵臓癌、精巣癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌、および副腎癌が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体、ＲＯＲ１結合ペプチド、およびＲＯＲ１ワクチンは、対象におけるＲＯＲ１癌の治療または予防のため、またはＲＯＲ１癌細胞の転移を阻害するために使用することができる。

抗体
一定の治療的実施形態において、選択された抗体は典型的には、単独で、または１つ以上の組み合わせ治療剤と組み合わせて、もしくはそれと複合体化されて投与され得る抗ＲＯＲ１抗体であるだろう。本明細書に記載の抗体が、治療剤として単独で投与される場合、それらは、種々の機構によって対象において有益な効果を発揮し得る。一定の実施形態において、ｈＲＯＲ−１を特異的に結合するモノクローナル抗体は、１つ以上のｈＲＯＲ−１の活性を阻止するために、または１つ以上の形態のｈＲＯＲ−１の別の生体分子との相互作用を阻止するもしくは阻害するために、精製され、ｈＲＯＲ−１の１つ以上の形態を中和するように患者に投与される。

本発明の免疫治療的試薬は、ヒト化抗体を含み得、追加の活性または不活性成分（例えば、従来の薬学的に許容される担体または希釈液、例えば、免疫原性アジュバント、および任意に、抗新生物薬などの補助的または組み合わせ的に活性な薬剤）を治療的使用のために組み合わせることができる。

他の実施形態において、本明細書に記載の治療的抗体は、組み合わせ治療剤（例えば、放射性核種、分化誘導物質、薬物、または毒素）と協調的に投与される、それと製剤化される、またはそれと繋がれる（例えば、共有結合される）。^９０Ｙ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、および^２１１Ａｔを含む、様々な既知の放射性核種を用いることができる。このような組み合わせ治療製剤および方法における使用のための有用な薬物としては、メトトレキサート、ならびにピリミジンおよびプリン類似体が挙げられる。好適な分化誘導物質としては、ホルボールエステルおよび酪酸を含む。好適な毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、シュードモナス外毒素、赤痢菌毒素、およびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。これらの組み合わせ治療剤は、直接的または間接的（例えば、リンカー基を介して）のいずれかで抗ＲＯＲ１抗体に繋がることができる。各々が他方と反応できる置換基を有するとき、薬剤と抗体との間の直接反応が可能である。例えば、一方のアミノまたはスルフヒドリル基などの求核性基は、他方で酸無水物または酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基と、または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基と反応することが可能である場合がある。代替的に、結合能力の妨害を回避するために、組み合わせ治療剤から抗体を引き離すためのスペーサとして、リンカー基を介して組み合わせ治療剤および抗体を繋ぐことが所望であり得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学反応性を増加させ、したがって、結合効率を増加させるために作用し得る。ホモおよびヘテロ官能性の両方である種々の二官能性または多官能性試薬（例えば、イリノイ州、ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．のカタログに記載されている）が、リンカー基として用いられ得ることは、当業者にとって明らかであろう。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化炭水化物残基を介して影響され得る。

２つ以上の薬剤を抗ＲＯＲ１抗体と繋ぐこともまた所望であり得る。一実施形態において、薬剤の複数の分子は、１つの抗体分子に繋がれる。別の実施形態において、２つ以上のタイプの薬剤は、１つの抗体に繋がれ得る。特定の実施形態によらず、２つ以上の薬剤を有する免疫複合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、２つ以上の薬剤は、抗体分子と直接繋がれ得、または付着のために複数の部位を提供するリンカーが使用され得る。代替的に、担体が使用され得る。

抗体および免疫複合体のための種々の投与経路が、使用され得る。典型的には、投与は、静脈内、筋肉内、または皮下である。

抗体／免疫複合体の正確な用量は、使用される抗体、抗原密度、および抗体のクリアランス速度などの要因に応じて様々であることは明らかであろう。抗ＲＯＲ１剤の安全かつ有効な量は、例えば、所望でない副作用を最小限に抑えながら、患者に所望の治療効果を引き起こすであろう量である。一般に、治療上有効な量は、１つ以上のサイトカインの産生を促進する、および／または補体媒介性または抗体依存性細胞傷害を引き起こすのに十分な量である。投薬レジメンは、治療される状態の正確な性質、状態の重症度、患者の年齢および一般的身体状態などの要因に基づいて熟練した臨床医によって決定されるであろう。

追加の実施形態において、本発明は、対象において癌を治療または予防するための方法を提供し、該方法は、モノクローナル抗体９９９６１の結合特異性を有する抗体、ヒト抗体Ｄ１０のＲＯＲ−１結合領域に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドから構成されるワクチン、ＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ−１結合ペプチド、またはＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ−１結合ペプチドを対象に投与することを含む。一態様において、癌は、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、ＣＬＬ、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、卵巣癌、結腸癌、肺癌、皮膚癌、膵臓癌、精巣癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌、または副腎癌である。

ＲＯＲ１を標的化することによる転移の阻害
元の部位から身体の遠隔領域への新生物細胞の広がりは癌関連死の９０％の原因である。転移プロセスは、遠隔臓器への原発性腫瘍細胞の物理的な移動およびその後のコロニー化を含む。いくつかの悪い予後遺伝子シグネチャは、いくつかの原発性腫瘍内の細胞が、転移しやすいことを示唆している。しかしながら、転移の分子および細胞決定因子の理解は限られており、腫瘍細胞がこのイベントを体験するプロセスは、不明な点が多い。最近の注目は、現在、腫瘍の進行、運動性の獲得、浸潤性、転移、および自己複製特徴に顕著な要因と見なされる、上皮間葉転換（ＥＭＴ）と呼ばれる細胞生物学的プログラムに集まっている。

ＥＭＴは、新生物上皮細胞に浸潤転移カスケードのステップのほとんどを達成するために必要な生物学的特徴を付与する。正常な発達および癌転移の両方において、ＥＭＴは、上皮細胞がそれらの微小環境から受け取る文脈シグナルにより調節されるようである。胚の形態形成および創傷治癒に関与する複数の経路の使用により、癌細胞は、浸潤および転移を可能にする属性を並存して取得することができる。

治療後の転移または再発を説明することができる癌幹細胞（ＣＳＣ）を定義する研究は、様々な腫瘍内のＣＳＣの１つ以上の亜集団に関連する種々の特徴を特定している。これらの研究のうちのいくつかでは、ＥＭＴにおける細胞の表現型特徴の取得が、ＣＳＣのような状態に入るために非ＣＳＣを誘導することができることを見出した。したがって、恐らくＥＭＴを体験した移転性癌細胞は、ＣＳＣ表現型を呈し、循環中の生存、遠隔臓器への管外溢出、脈管形成、転移部位で制御されない増殖を促進する浸潤性特性を獲得し得る。

実施例においてさらに詳述されるように、癌細胞におけるＲＯＲ１の高レベルの発現は、再発および／または転移性疾患の高い割合に関連している。実施例１に記載の乳腺癌を有する患者におけるＲＯＲ１発現およびサイレンシングの効果は、転移を阻害する本発明の実施を示している。図示されるように、転移を起こしやすい乳癌細胞株におけるＲＯＲ１発現のサイレンシングは、ＥＭＴに関連する表現型の特徴を逆転させ、インビトロでおよびインビボでの遊走、浸潤、および転移を損なう。さらに、ＲＯＲ１に対して特異的な本発明の抗体は、免疫不全マウスに異種移植されたヒト乳癌細胞の転移を阻害する。これらの研究は、乳癌転移についての以前に未知であった経路を識別し、癌治療のための有望な標的としてＲＯＲ１を検証する。低いＲＯＲ１発現レベルはより長い無転移生存と相関し、より重要なことに、抗ＲＯＲ１抗体によるＲＯＲ１の治療的標的化は、乳癌転移発達を阻害し得る。

転移は、原発位置から身体の他の部分への癌細胞の広がりである。癌が転移性になると、それは効果的に手術または放射線療法によって治療することができない。さらに、癌患者の死亡の主な原因は、転移である。受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、分化、増殖、遊走、脈管形成、および生存を含む、多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たすことが知られている。ＲＯＲ２が、メラノーマおよび前立腺癌細胞の転移を促進することが見出されているが、攻撃的乳癌細胞株と非攻撃的乳癌細胞株との間でＲＯＲ２発現に有意な差異はない。しかしながら、ＲＯＲ１の発現は、攻撃的な乳癌細胞株と強い相関がある。

本発明は、その作用機構としての理論によって限定されないが、ＲＯＲ１は、スネイル１、スネイル２、ＴＣＦ８／ＺＥＢ、ＣＫ−１９、ビメンチン、ＣＸＣＲ４などの乳癌転移に関与するタンパク質をコードする遺伝子を活性化することは注目すべきことである。ＡＫＴは最近、細胞死および脈管形成への耐性のある、ＥＭＴを含む転移の機能に関与することが報告された。実施例において実証されるように、ＲＯＲ１は、ＡＫＴ活性およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の抗ＲＯＲ１抗体Ｄ１０低減ｐ−ＡＫＴ活性への曝露を上方調整する。これらのデータは、ＲＯＲ１により調節されるＡＫＴ活性化の阻害が、Ｄ１０がその抗腫瘍効果を発揮する１つの機構であり得ることを示唆している。

具体的には、乳癌転移に関して、遺伝子発現シグネチャを用いて、原発性乳房腫瘍におけるＲＯＲ１の発現は、骨、肺、および脳転移を含む乳癌転移に関連することが見出された。分析された５８２例のうち、再発率は、ＲＯＲ１の低い群における３７％と比較してＲＯＲ１の高い群で５５％であった。重要なことには、この再発率は、ＲＯＲ１の７５〜１００番目の群において６３％まで増加した。ＲＯＲ１発現はまた、ＥＲ、ＰＲ、およびＨｅｒ２を含む、臨床的に攻撃的な乳癌腫瘍マーカーと強く相関している。乳癌のＴステージに基づいた群の間に統計的に有意な差異はないが、ＲＯＲ１の高い患者の割合は、Ｔ１およびＴ４ステージにおいてそれぞれ５１％〜７７％に増加した。臓器特異的な転移（乳癌から肺または骨へ）は、本発明に従うＲＯＲ１ノックダウンノックダウンによって有意に阻害された。これらのデータは、ＲＯＲ１が、ＣＸＣＲ４などのある種の肺および骨に特異的な遺伝子を調節し得ることを示唆している。

ヒトケモカインは、１９個の異なるＧタンパク質結合ケモカイン受容体に結合する４８個のリガンドのスーパーファミリーで構成されている。転移性腫瘍細胞は、ケモカイン受容体媒介性細胞遊走ハイウェイを「ハイジャック」できるという仮説が立てられている。乳癌腫瘍細胞は、ＣＸＣＲ４を含む選択されたケモカイン受容体を発現する。本発明に従うＣＸＣＬ１２−ＣＸＣＲ４軸の阻害は、肺への細胞株ＭＤＡ−ＭＢ ２３１のインビボ転移を阻止できる。ＲＯＲ１についてサイレンシングされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた親のＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１よりもＣＸＣＲ４の低い発現を有した。

遺伝子発現分析を使用して、ＲＯＲ１の発現はまた、肺（図１Ｂ）、骨（図１Ｃ）、および脳（図１Ｄ）転移と関連していることが見出された。ハザード比分析に基づいて、ＲＯＲ１は、ＥＲ、ＰＲおよびＨＥＲ２より全体、骨、および肺転移のはるかに良い予測因子であることが判定された。ＲＯＲ１はまた、ＥＲおよびＲＯＲ１状態による乳癌患者の全体的な再発の全体的な再発率に基づく、転移関連予測因子の遺伝子であり得る。無転移生存の初期段階においてＥＲ＋の症例とＥＲ−の症例との間にいくつかの違いがあったが、ＲＯＲ１低い症例およびＲＯＲ１高い症例のみが、無転移生存の後期段階で著しい違いを有した。したがって、本発明は、転移を阻害し、患者の生存を改善するための経路を提供する。

一般に、投与されるＲＯＲ１抗体、ＲＯＲ１抗体成分、結合ペプチドワクチン組成物、それらの免疫複合体、融合タンパク質の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な病状、および以前の病歴などの要因に応じて様々であるだろう。典型的には、約１ｎｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ（薬剤の量／患者の体重）の範囲で、抗体成分、ワクチン、免疫複合体、または融合タンパク質の用量を受容者に提供することが所望であるが、諸事情により、より低いまたはより高い用量も投与され得る。

患者への抗体、抗体成分、ワクチン、免疫複合体、または融合タンパク質の投与は、局所カテーテルを介した灌流によるか、または直接的病巣内注射による、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内であり得る。注射による治療的タンパク質、ペプチド、または複合体を投与するとき、投与は、連続注入によるか、または単一もしくは複数のボーラスによるものであり得る。

当業者は、静脈内注射は、抗体を急速に配布する際の循環の徹底のために、投与に有用なモードを提供することを認識している。しかしながら、静脈内投与は、脈管構造の内皮細胞および内皮下のマトリックスを含む血管障壁により制限される。依然として、血管障壁は、固形腫瘍による治療抗体の取込みのためのより注目すべき問題である。リンパ腫は、比較的高い血流速度を有し、有効な抗体送達に寄与する。皮下または筋肉内注射、またはリンパ管のカテーテル法などによる投与のリンパ管内経路はまた、リンパ腫の治療の有用な手段を提供する。

好ましくは、ＲＯＲ１抗体、結合ペプチド、これらの免疫複合体、および融合タンパク質は、一度または繰り返し非経口的に与えられた用量当たり２０〜３０００ミリグラムのタンパク質といった低いタンパク質用量で投与される。代替的に、投与は、用量当たり１００〜３００ミリグラムのタンパク質、または用量当たり３００〜１０００ミリグラムのタンパク質、用量当たり１０００〜２０００ミリグラムのタンパク質の用量である。

本発明はまた、ＲＯＲ１抗体成分が、放射標識であるか、または放射標識免疫複合体もしくは融合タンパク質投与で補われる、治療的方法を企図している。一変形形態では、ＲＯＲ１抗体は、低線量放射標識ＲＯＲ１抗体または断片として、またはそれと共に投与される。代替として、ＲＯＲ１抗体は、低線量の放射標識ＲＯＲ１サイトカイン免疫複合体と共に投与され得る。当業者は、薬学的に許容される放射標識分子およびそれらの適切な投与レベルに精通しているであろう。参考までに、好ましい用量は、^１３１Ｉラベル免疫複合体の「低線量」を考慮されたく、ここで１５〜４０ｍＣｉの範囲であるが、最も好ましい範囲は、２０〜３０ｍＣｉである。対照的に、^９０Ｙラベル免疫複合体の好ましい線量は、１０〜３０ｍＣｉの範囲であるが、最も好ましい範囲は、１０〜２０ｍＣｉである。

全ての態様での本発明が、次の実施例でさらに例示される。実施例は、しかしながら、本発明の範囲を限定せず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。

ＲＯＲ１は、乳腺癌における早期転移性再発に関連する。
５８２人の患者の組み合わされたコホートにおける患者から単離された乳癌細胞についてのＧＥＯデータベースにおける、トランスクリプトームデータを調査した。これらの症例のおよそ３分の２（５８２人中４２６人）は、外科手術時点で所属リンパ節において検出可能な癌を有せず、補助療法を施与されなかった。残りの症例は、所属リンパ節において検出可能な疾患を有し、補助ホルモン療法および／または化学療法を受けた。５８２症例の中で、４６％が再発し（ｎ＝２７０）、２２．１ヶ月の無転移生存時間中央値を有した。我々は、患者を、彼らのＲＯＲ１の相対的な癌細胞発現に基づいて３つの群に分離した。上位３分の１レベルのＲＯＲ１ ｍＲＮＡ発現（ＲＯＲ１_Ｈ）を有する腫瘍を有する患者は、ＲＯＲ１の下位３分の１レベル（ＲＯＲ１_Ｌ）または中間レベル（ＲＯＲ１_Ｍ）の発現を有した腫瘍を有する患者よりも、有意により短い無転移生存を有した（ｐ＜０．０００１、図１Ａ）。臓器部位別の無転移生存を検査した。ＲＯＲ１Ｈ腫瘍を有する患者は、ＲＯＲ１_ＬまたはＲＯＲ１_Ｍ乳癌を有する患者よりも、肺（ｐ＝０．００２、図４５Ａ）、骨（ｐ＝０．００４、図４５Ｂ）、または脳（ｐ＝０．０４、図４５Ｃ）へのより高い転移率を有することが見出された。ＲＯＲ１_Ｈ癌は、ＲＯＲ１_ＬまたはＲＯＲ１_Ｍである癌よりも、エストロゲン／プロゲステロン受容体またはＨＥＲ２等の、予後良好の兆候を有する腫瘍の有意により低い割合を有した。

ＲＯＲ１の高レベルの発現はまた、より短い無転移生存を予測することにおいて独立因子として機能した。ＲＯＲ１_Ｈ腫瘍を有する患者は、ＥＲ、ＰＲ、またはＨＥＲ２状態に関わらず、ＲＯＲ１_Ｌ／Ｍ腫瘍を有する患者よりも、より高い転移率、より早期の再発、およびより良好でない生存率を有した（図４６）。さらに、乳癌におけるＥＭＴ遺伝子シグネチャについてのＧＳＥ２０３４、ＧＳＥ２６０３、ＧＳＥ５３２７、およびＧＳＥ１２２７６アレイデータの調査は、ＲＯＲ１_Ｌ腫瘍が、ＲＯＲ１_Ｈ腫瘍よりも、ＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリンをコードする）、ＴＪＰ１（ＺＯ１をコードする）、およびＴＪＰ３（ＺＯ３をコードする）等の、上皮細胞に関連する遺伝子の有意により高い発現レベルを有するが、ＳＮＡＩ１（Ｓｎａｉｌ−１をコードする）、ＳＮＡＩ２（Ｓｎａｉｌ−２をコードする）、ＣＤＨ２（Ｎ−カドヘリンをコードする）、またはＶＩＭ（ビメンチンをコードする）等の、間葉細胞に関連する遺伝子のより低い発現レベルを有することを明らかにした（図１Ｂ）。

ＲＯＲ１＋乳癌細胞株
６個の基底細胞型乳癌細胞株および８個の管腔細胞型乳癌細胞株を含む、１４個の明確に異なる乳癌上皮細胞株のＲＯＲ１の発現を検査した。ＲＯＲ１の発現のレベルは、基底細胞型乳癌細胞株において、概してＲＯＲ１を発現しなかった管腔細胞型乳癌細胞株におけるＲＯＲ１の発現のレベルと比べて、有意により高かった。その上、ＲＯＲ１の相対的発現レベルは、三種陰性ＥＲ^ＮｅｇＰＲ^ＮｅｇＨＥＲ２／Ｎｅｕ^Ｎｅｇ等の、攻撃的腫瘍表現型、ならびにインビトロでの高レベルの遊走能および浸潤能と相関していた。

ＲＯＲ１を、２つの異なるＲＯＲ１配列のいずれかを標的とする短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用して、高浸潤性の基底細胞型乳癌細胞株（例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）においてサイレンシングした。ＲＯＲ１タンパク質の発現は、対照ｓｈＲＮＡ（ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡ）がトランスフェクトされた細胞とは対照的に、ＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡ１またはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡ２のいずれかがトランスフェクトされた細胞において阻害された（図４７Ａ）。ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡまたはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＧＥＯ受託：ＧＳＥ３１６３１）間の遺伝子発現差異についてのアレイデータの調査は、ＲＯＲ１をサイレンシングされた細胞が、親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１よりも、ＫＲＴ１９（ＣＫ１９をコードする）のより高い発現レベル、ＣＸＣＲ４およびＶＩＭのより低い発現レベルを有することを明らかにした。これらの知見は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって確認した（図４７Ｂ、図４８Ａ）。フローサイトメトリー分析もまた、ＣＸＣＲ４の細胞表面発現が、ＲＯＲ１をサイレンシングされた細胞においてより低いことを実証した（図４８Ｂ）。

ＥＭＴの調節におけるＲＯＲ１の可能性のある役割を評価するために、我々は、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡまたはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡで治療された細胞におけるＥＭＴ関連マーカーについて検査した。３つの明確に異なる基底細胞型乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＳ−５７８Ｔ、またはＢＴ５４９）のいずれかにおいて、ＲＯＲ１−ｓｉＲＮＡまたはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡ１／２のいずれかでＲＯＲ１の発現を抑制することにより、ＥＭＴに関連するｍＲＮＡおよび／またはコードされるタンパク質（例えば、ビメンチン、ＳＮＡＩＬ−１／２、およびＺＥＢ１）のそれらの発現は減弱された。逆に、ＲＯＲ１のサイレンシングにより、ｍＲＮＡおよびコードされる上皮サイトケラチン（例えば、ＣＫ−１９）の発現が増加した。検査された３つの細胞株のいずれにおいてもＺＯ−１をコードするＴＪＰ１ ｍＲＮＡの有意な変化は何ら存在しなかったが、ＲＯＲ１をサイレンシングされた細胞は、このタイトジャンクションタンパク質のより高い発現レベルを有したことから、ＺＯ−１が転写後制御下にあり得ることが示唆される（図１Ｃ〜Ｄおよび図４９）。最後に、ＲＯＲ１を発現させるようなＲＯＲ１陰性ＭＣＦ７細胞のトランスフェクションは、上皮タンパク質（例えば、Ｅ−カドヘリンおよびＣＫ１９）の発現を減少させ、ＳＮＡＩＬ１／２等のＥＭＴ転写因子の発現を増加させた（図１Ｅ）。

培養物において、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＳ−５７８Ｔ、またはＢＴ５４９細胞は、典型的に星状の形態を示していたが、これはインビトロでの間葉細胞の形態と同様である。しかしながら、ＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡでのトランスフェクション後に、これらの細胞は、より球状の形態を呈し、これは上皮細胞の形態と同様であった（図２Ａ）。ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡでのこれらの細胞のトランスフェクションは、そのような変化を誘導しなかった。さらに、免疫蛍光染色は、ＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡでのトランスフェクションが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、中程度のレベルのＥ−カドヘリンおよびより高いレベルのＣＫ−１９を発現するように誘導するが、ビメンチンの発現を低減させることを明らかにした（図２Ｂ）。同様の結果がまた、ＨＳ−５７８ＴまたはＢＴ５４９細胞についても観察された。他方で、無処理の細胞または対照ベクターがトランスフェクトされた細胞と比較して、ＲＯＲ１陰性ＭＣＦ７細胞は、ＲＯＲ１を発現するようにトランスフェクトされたとき、間葉細胞に対して形態的な類似性を生じ、上皮マーカー（例えば、ＣＫ１９およびＥ−カドヘリン）の減少した発現、およびビメンチン等の間葉マーカーの増加した発現を有した。さらに、ＲＯＲ１をサイレンシングされた細胞は、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡで処理された細胞の遊走／浸潤能と比較して、より低い遊走／浸潤能を有した（図２ＥおよびＦ）。ＣＸＣＬ１２への走化性が、ＲＯＲ１をサイレンシングされた細胞において有意に低減されたこともまた見出された（図４８）。ＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡ１またはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡ２のいずれかでサイレンシングされた細胞を使用して、事実上同一の結果が得られた。集合的に、これらの結果は、ＲＯＲ１の発現がＥＭＴおよび腫瘍転移に寄与し得ることを示す。

ＲＯＲ１のサイレンシングは、同所性肺転移を阻害する
細胞培養
乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＳ−５７８Ｔ、ＢＴ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−４１５、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＭＤＡ−ＭＢ−１３４、ＭＣＦ７、ＢＴ−４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＳＫＢＲ３、ＭＤＡ−ＭＢ−３３０、およびＢＴ−４８３を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得、以前に記載されたように維持した（Ｎｅｖｅ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，１０：５１５（２００６））。

ＲＯＲ１−ノックダウン
ＲＯＲ１のノックダウンを、以前に記載されたように（Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，１６：６７（２００９））、配列５′−ＴＣＣ ＧＧＡ ＴＴＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＣＡ ＴＧ−３′（ｓｈＲＮＡ１）、および５′−ＣＴＴ ＴＡＣ ＴＡＧ ＧＡＧ ＡＣＧ ＣＣＡ ＡＴＡ−３′（ｓｈＲＮＡ２）を標的とすることによって達成した。非特異的なｓｈＲＮＡ対照を、配列５′−ＡＧＣ ＧＧＡ ＣＴＡ ＡＧＴ ＣＣＡ ＴＴＧ Ｃ−３′を標的とすることによって作り出した。Ｖｉｒａｐｏｗｅｒ（商標）レンチウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者の指示に従ってｓｈＲＮＡを発現させた。ＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡ１およびＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡ１構築物はまた、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）もコードした。ＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡ１およびＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡ１構築物に対するオリゴヌクレオチドを合成し（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＲＦＰ−ｐＬＫＯ．１ベクターに挿入した。ＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡ２およびＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡ２構築物は、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（イリノイ州、ロックフォード）から購入した。乳癌細胞株の感染のためのウイルス粒子を、２９３−ＦＴパッケージング細胞株のトランスフェクションによって得、トランスフェクション後４８および７２時間時点で細胞上清から収集した。上清を濾過し、４３，０００×ｇで遠心分離してウイルス粒子を濃縮し、それを使用して、コンフルエントに達していない培養物を、５μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で一晩感染させた。

トランスフェクションの２４時間後、細胞を２μｇ／ｍｌのピューロマイシンで選択した。ノックダウン細胞を、抗ＲＯＲ１ ｍＡｂ（４Ａ５）を使用してフローサイトメトリーによって選別した。ｓｈＲＮＡ１またはｓｈＲＮＡ２を安定に発現する選別された細胞を、それぞれＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡ１またはＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡ２と指定した。サブクローニングを用いずに細胞選別後の最初の１０世代において得られた、ノックダウン細胞のプールされた集団を、インビボ実験のためにｒａｇ−／−γ−／−マウスに注射した。ＲＯＲ１のノックダウン効率を、逆転写による定量ＰＣＲ（ｑＲＴ-ＰＣＲ）ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、またはウェスタン免疫ブロット分析（抗ＲＯＲ１抗体、Ｓ４１０２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）によって確認した。β２−ミクログロブリンおよびアクチンを、それぞれｑＲＴ-ＰＣＲおよびウェスタンブロットに対する内在性対照として使用した。

トランスウェル遊走および浸潤アッセイ
癌細胞を、成長因子を含まない０．２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地中で一晩馴化した。翌日、細胞をトリプシン処理し、成長因子を含まない０．２％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地中に再懸濁させた。腫瘍細胞を、遊走アッセイについて１ウェル当たり２５，０００細胞の密度でトランスウェルインサート（３μＭ細孔サイズ、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）中に、または１ウェル当たり５０，０００細胞の密度でマトリゲルコーティング、成長因子低減、浸潤チャンバ（８μＭ細孔サイズ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に播種した。遊走アッセイについては６時間後、または浸潤アッセイについては２２時間後に、ウェルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。各インサートの頂端側上の細胞を、削り落とすことによって除去した。膜の基底側に遊走した細胞を染色し、ニコン倒立顕微鏡で可視化した。

ｍＲＮＡおよびタンパク質発現の分析
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、２μｇの各試料を使用して、高性能ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅｒ転写キット（ＡＢＩ）を用いてｃＤＮＡを生成した。各ｃＤＮＡを、ＡＢＩ ７５００ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して３系列で分析した。タンパク質発現レベルを、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有する溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．９）、２５％グリセロール、０．５Ｎ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、０．５ｍＭジチオトレイトール、および０．１％デオキシコール酸塩）中の細胞溶解物（４０〜６０μｇ）で、抗ＲＯＲ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）および抗β−アクチン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用して、免疫ブロット分析によって評価した。

フローサイトメトリー
乳癌細胞をフローサイトメトリーによって染色またはプール選別した。細胞を洗浄し、ＰＢＳ溶液中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁させ、ＲＯＲ１発現に対して、製造業者のプロトコルに従ってＡｌｅｘ４８８複合体化抗体（クローン４Ａ５またはクローンＤ１０）またはＡｌｅｘ４８８複合体化ＩｇＧ２ｂもしくはＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を使用して染色した。フローサイトメトリーデータを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ血球計算器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。

免疫蛍光法および免疫組織化学分析
マウス肺を４％パラホルムアルデヒドで固定し、病理組織検査のためにＯＣＴでパラフィン包埋または凍結させた。組織切片（５μｍ ｔｈｉｃｋ）を調製し、ヘマトキシリン＆エオジン（Ｈ＆Ｅ）、またはｐ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３、Ｄ９Ｅ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐ−Ｃｒｅｂ（Ｓｅｒ１３３、８７Ｇ３、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＣＫ−１９（ＲＣＫ１０８、Ｄａｋｏ）、もしくはビメンチン（Ｄ２１Ｈ３、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）一次抗体で染色した。画像を、Ｄｅｌｔａ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡を使用して収集し、ＳＰＯＴソフトウェアで処理した。

転移の分析
メスＲａｇ−／−γ−／−マウスに、親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ ＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡ１細胞（群１）、および親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する対照ｓｈＲＮＡ細胞（群２）のプールを注射した。細胞を、１００μＬのＰＢＳ中、側面尾静脈を通じて静脈内注射したか（群１〜２について５×１０^５、群３〜４について２×１０^５）、または１００μＬのＰＢＳ中、心内注射によって投与した（群５〜６について１×１０^５）。非侵襲的な生物発光撮像をＩＶＩＳ ２００撮像システムによって毎週行った。事前に死亡しなかったかまたは病気であるように見えなかった全てのマウスを、注射の３〜４週間後に安楽死させ、それらの肺を摘出し、１０％ホルマリン中に固定した。

乳房体異種移植片のインビボ転移に及ぼすＲＯＲ１の影響を研究するために、乳癌腫瘍を８週齢のメスＲａｇ−／−γ−／−マウスにおいて、１００μＬの単細胞懸濁液（１×１０^６生細胞／マウス）を、右腹部乳腺の第２の脂肪体領域の皮下に注射することによって誘導した。腫瘍サイズを３日毎に測定した。腫瘍体積が３００ｍｍ^３に到達したとき、腫瘍を摘出した。乳癌転移における抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体の治療効果を研究するために、乳癌腫瘍を８週齢のメスＲａｇ−／−γ−／−マウスにおいて、１００μＬの単細胞懸濁液（５×１０^５細胞／マウス）の静脈内注射を通じて誘導した。マウスＩｇＧまたは抗ＲＯＲ１ ｍＡｂを毎週静脈内注射した。非侵襲的な生物発光撮像を毎週行った。異種移植片の定着の５週間後、マウスを屠殺して肺を摘出し、１０％ホルマリン中に固定した。

Ｏｎｃｏｍｉｎｅ遺伝子発現データ分析
Ｐｕｂｍｅｄ ＧＥＯデータベース（ＧＥＯ２６０３、ＧＳＥ５３２７、ＧＳＥ２０３４、およびＧＳＥ１２２７６）からの５８２人の患者のマイクロアレイデータセットを編集した。これらのデータセットを、ｌｏｇ２によって変換し、各マイクロアレイを全てのプローブの中央値の中心に合わせた。各患者について、無転移生存を、外科手術と転移の診断との間の時間間隔として定義した。ヒト組織におけるＲＯＲ１ ｍＲＮＡ発現の相対レベルを、公開された遺伝子発現データセットのＯｎｃｏｍｉｎｅ癌マイクロアレイデータベース分析（ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ）によって決定した。データをｌｏｇ２変換し、このうち中央値をゼロに設定し、標準偏差を１に設定した。

統計分析。カプランマイヤー曲線間の比較を、ログランク検定を使用して行った。データを平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として提示する。別途指定のない限り、対応のないスチューデントｔ検定を使用して、２つの群を比較した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると見なした。

無転移生存を予測することにおけるＲＯＲ１の性能を、Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルによる多変量解析によって分析した。各共変数のハザード比およびその９５％信頼区間を報告する。Ｐ値を正規分布に基づいて算出して、帰無仮説の確率（ハザード比＝１、すなわち予後の有意性なし）を評価する。

ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞の転移可能性を、同所性モデルにおいてルシフェラーゼ／ＧＦＰ発現ベクターを使用して安定にトランスフェクトされた、ＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と比較した（図３Ａ）。免疫不全ＲＡＧ−／−γｃ−／−マウスの皮下乳房脂肪体への２．５〜１０×１０^５細胞の注射により、生物発光を介して監視することができる注射部位で原発性腫瘍を生成した。我々は、以前の研究で留意されたように、少なくとも１×１０^６個の細胞の注射の３週間以上後まで、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞対ＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞の注射からもたらされた腫瘍の生物発光の漸進的増加において、有意な差異を観察しなかった。「自発的」癌転移の率における差異について検査するために、１×１０^６個の細胞の注射からもたらされた原発性腫瘍を、それらが３００ｍｍ^３の体積に到達したときに外科的に摘出した（点線、図３Ｂ）。異なる成長率のために、原発性腫瘍の細胞注射から外科的摘出までの日数中央値は、同等の数のＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞を受けたマウスについての日数中央値（３１±０．５日間）よりも、ＲＯＲ１をサイレンシングされた細胞を注射されたマウスについて、有意により大きかった（４０±２．５日間）（図３Ｂ）。摘出された原発性腫瘍は、同様の体積、重量、およびエクスビボ生物発光（図３、Ｃ〜Ｅ）を有した。原発性腫瘍の摘出後、我々は、生物発光を介して転移性疾患について監視した。ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞を注射された動物は、マウスの原発性腫瘍が切除されたときのより後の時点でＲＯＲ１をサイレンシングされた細胞を移植されたマウスが有した生物発光よりも、原発性腫瘍切除の時点で肺または肝臓において有意により高い生物発光を有した（図３、ＥおよびＦ）。ＲＯＲ１をサイレンシングされた細胞を注射された動物は、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞を注射されたマウスの生物発光と比べて、肺の生物発光においてより検出しづらい増加を有した（図３Ｇ）。動物の原発性腫瘍を切除して、エクスビボ生物発光、サイズ、ならびに肺（図３、Ｈ〜Ｊ）および肝臓（図３、ＫおよびＬ）の組織像を検査した２１日後に、動物を屠殺した。ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞を注射されたマウスの摘出された肺および肝臓は、ＲＯＲ１がサイレンシングされた細胞を注射されたマウスの生物発光および重量よりも、有意により高い生物発光および重量を有した。その上、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞を注射されたマウスの肺および肝臓は全般的に、ＲＯＲ１がサイレンシングされた細胞を注射されたマウスの組織においては観察されなかった、広範な転移性疾患を有した（図３、ＪおよびＬ）。

ＲＯＲ１のサイレンシングは、実験上の肺および骨転移を阻害する
ＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡまたはＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、６〜８週齢のＲａｇ^−／−γ^−／−マウスに、静脈内（５×１０^５細胞）または心内（１×１０^５細胞）注射を介して投与して、静脈血中または動脈血中のいずれかに注射された細胞の転移可能性の差異について評価した。ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞を側面尾静脈中に受けた全ての動物は、肺転移に起因して注射の３２日以内に死亡した。同等の数のＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞を尾静脈に注射された動物は、有意により長く生存した（図４Ａ）。ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞を注射された動物は、ＲＯＲ１をサイレンシングされた細胞を注射されたマウスよりも、肺においてそれぞれ２１日目または２８日目に１９倍または６０倍高い生物発光を有した（図４Ｂ）。我々はまた、別の実験において種々の時点で動物を屠殺して、転移性疾患について肺を検査した。発生期の転移巣は、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞の注射の３日後に容易に検出された一方で、ＲＯＲ１がサイレンシングされた細胞を注射された動物の肺において検出することができた転移巣は、より後の時点でさえも、たとえあったとしてもほんのわずかであった（図４Ｃ〜Ｅ）。その上、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞を注射されたマウスから摘出された肺は、ＲＯＲ１がサイレンシングされた細胞を注射されたマウスの肺よりも、有意により高いエクスビボ生物発光および重量中央値（それぞれ２１および２８日目に３倍および６倍）を有した（図４Ｆ〜Ｇ、データは図示されず）。ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞を注射された動物において発達した転移巣はまた、我々がＲＯＲ１がサイレンシングされた細胞を注射されたマウスにおいて検出したほんのわずかな転移巣（それはより高いレベルのＣＫ−１９およびより低いレベルのビメンチンを代わりに発現した）よりも、より高いレベルのホスホ−ＡＫＴおよびホスホ−ＣＲＥＢを発現し、より高い割合の増殖性細胞を有した（図４７）。

我々はまた、左心室中への１×１０^５個の細胞の注射後の転移性疾患についても検査した。ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞を側面尾静脈中に受けた全てのマウスは、この注射の３０日以内に死亡したが、一方で、ＲＯＲ１がサイレンシングされた細胞を注射された動物は、有意により長く生存した（図４Ｈ）。ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞を注射されたマウスは、実質的な大腿／骨盤領域の生物発光を生じたが、この生物発光は、ＲＯＲ１をサイレンシングされた腫瘍細胞を注射されたマウスにおいては検出されなかった（図４、ＩおよびＪ）。我々は、２１日目に動物を屠殺し、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞を注射されたマウスの単離された大腿／骨盤骨が、広範な骨髄転移（図４Ｌ）に起因して、高い生物発光（図４Ｋ）を有することを見出したが、この生物発光は、ＲＯＲ１をサイレンシングされた細胞を注射されたマウスにおいては明らかでなかった。

最近の研究は、異なる組織部位が、血中循環癌細胞による転移の定着のために異なる要件を課すことを見出している。ヒト乳癌細胞株ＢｏＭ１８３３およびＬＭ２−４１７５を、異なる組織向性を有するようにＭＤＡ−ＭＢ−２３１から選択した。ＢｏＭ−１８３３は、骨に優先的に転移し、ＬＭ２−４１７５は、肺に優先的に転移する。我々は、これらの細胞株の各々がＲＯＲ１の発現を保持することを見出した（図５Ａ）。各細胞株のＲＯＲ１−ｓｈＲＮＡ２とのトランスフェクションが、ＲＯＲ１の発現サイレンシングしたことから（図５ＢおよびＣ）、我々は、６〜８週齢のＲＡＧ−／−γｃ−／−マウスへの２×１０^５ＬＭ２−４１７５の静脈内注射または１×１０^５ＢｏＭ−１８３３の心内注射後の、臓器特異的転移のＲＯＲ１依存性を検査することとなった。ＲＯＲ１をサイレンシングされたＬＭ２−４１７５を注射されたマウスは、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされたＬＭ２−４１７５を注射されたマウスが有した増加中央値および生存中央値よりも、肺の生物発光において有意により低い増加中央値、および有意により長い生存中央値を有した（図５ＤおよびＥ）。これらの観察と一致して、ＲＯＲ１がサイレンシングされたＬＭ２−４１７５の注射の２１日後に単離されたマウスの肺は、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされたＬＭ２−４１７５を注射されたマウスよりも、有意により低い重量中央値、エクスビボ生物発光、およびより少数かつより小さい転移巣を有した（図５Ｆ〜Ｈ）。同様に、ＲＯＲ１をサイレンシングされたＢｏＭ−１８３３を注射されたマウスは、同等の数のＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされたＢｏＭ−１８３３を注射されたマウスが有した生物発光の増加よりも、骨格の生物発光において有意により低い増加を有した（図５ＩおよびＪ）。その上、心内注射の２１日後に屠殺された動物の検死は、骨または肝臓における検出可能な転移巣がたとえあったとしてもほんのわずかであることを明らかにした。これは、ＣＴＲＬ−ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされたＢｏＭ−１８３３を注射された動物においてこれらの部位の各々で検出された、広範な転移性疾患と際立った対照を成した（図５ＪおよびＫ）。

抗ＲＯＲ１抗体は、癌転移を阻害する
ＲＯＲ１の細胞外ドメインに特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成し、Ｄ１０と指定されるものは、３７℃で表面ＲＯＲ１の急速な下方調節を誘導することができた（図５Ａ）。Ｄ１０によるＭＤＡ−ＭＢ−２３１の処理は、共焦点顕微鏡を介して評価したとき、ＲＯＲ１内在化を引き起こした（図５Ｂ）。これは、ＲＯＲ１の明確に異なる非交差遮断（ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）エピトープに特異的な異なるｍＡｂを使用して、フローサイトメトリーを介して評価したとき、表面ＲＯＲ１の有意な低減をもたらした（図５Ｃ）。Ｄ１０によるＭＤＡ−ＭＢ−２３１の処理はまた、共免疫沈降研究においてＲＯＲ１に結合した（図５Ｅ）、細胞質ビメンチンの発現も低減した（図５Ｄ）。Ｄ１０による処理はまた、インビトロでＭＤＡ−ＭＢ−２３１の遊走および浸潤能を有意に阻害した（図５ＦおよびＧ）。Ｄ１０はまた、他のＲＯＲ１＋癌細胞株（例えば、ＨＳ−５７８ＴおよびＢＴ５４９（図９））の遊走／浸潤能を阻害することもできた。

Ｄ１０を、ＲＡＧ−／−γｃ−／−マウスの尾静脈に注射されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１の浸潤および転移の阻害について評価した。５×１０^５個の細胞の注射後、マウスに５ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧまたはＤ１０の静脈内注射を与え、次いで３日後に屠殺した。Ｄ１０を与えられた動物からの肺のエクスビボ生物発光は、対照ＩｇＧで処置された動物の肺のエクスビボ生物発光よりも有意により低かった（図５Ｈ）。その上、対照ＩｇＧを受けた動物の肺は、複数の転移巣を有したが、Ｄ１０で処置されたマウスにおいては検出不可能であった。別の実験において、各マウスに、５×１０^５ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の静脈内注射を受けさせ、次いで５ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧまたはＤ１０の３回の毎週の静脈内注射を与えた。Ｄ１０で処置されたマウスは、対照ＩｇＧを与えられたマウスよりも有意により低い肺の生物発光を発生させた（図５、ＩおよびＪ）。３５日目に屠殺されたとき、Ｄ１０で処置されたマウスの肺は、対照ＩｇＧを与えられた動物の肺よりも有意により低い重量（図５Ｋ）およびより少数の転移巣（図５Ｌ）を有した。全体として、これらのデータは、Ｄ１０が免疫不全マウスにおいて転移を阻害し得ることを示す。

結論として、ＲＯＲ１が乳癌転移を媒介し得ること、およびＲＯＲ１の治療的標的化が乳癌転移進行を遅延させ得ることが、これにより実証される。胚性幹細胞は検出可能なＲＯＲ１タンパク質を発現し、ＲＯＲ１の喪失はＲＯＲ２欠損マウスにおいて心臓および骨格異常を増大させ得るが、主要な成体組織は、膵臓および脂肪組織における低レベルでの発現を除いて、ＲＯＲ１タンパク質をまれにしか発現しないことから、ＲＯＲ１癌特異性を有する本発明の抗体およびそれらの使用方法を提供している。

ＲＯＲ１高親和性抗体
エピトープ研究を上述のＲＯＲ１抗体Ｄ１０に対して行った。ヒトおよびマウスＲＯＲ１の広がりを含む一連のキメラタンパク質を生成して、インビトロでＲＯＲ１を下方調節し、ビメンチンの発現の低減をもたらし、癌細胞遊走（転移を形成する癌の能力の良好な代用マーカー）を阻害し得るＤ１０によって認識される、エピトープ（複数可）をマッピングした。関与するＲＯＲ１の唯一の領域は、ＲＯＲ１のアミノ末端上にあるＩｇ様ドメインである。各構築物は、キメラＩｇ様ドメインならびにヒトＣＲＤおよびクリングルドメイン（マウス部分は明色であり、ヒト部分は暗色である）を含有する。Ｉｇ様ドメインのみがここでは示される（図６）。これらの構築物をフリースタイル（ｆｒｅｅ−ｓｔｙｌｅ）２９３細胞内で発現させた。培養培地を免疫ブロットに使用し、精製タンパク質をＥＬＩＳＡに使用した。Ｄ１０ ｍＡｂ抗ＲＯＲ１は、ヒトＲＯＲ１を認識したが、マウスＲＯＲ１を認識しなかったため、これらの構築物うちのどちらが結合可能または不可能であったかを見出すことは、Ｄ１０によって認識されるエピトープをマッピングする一助となり得た。結果は、抗体Ｄ１０が、ＣＲＤドメインと隣接するＩｇ様ドメインのＣ末端でＲＯＲ１に結合することを示す（図７）。図８は、ＲＯＲ１抗体４Ａ５に対するエピトープのマッピングを示す。示されるように、４Ａ５エピトープは、Ｄ１０エピトープとは異なる。

上述のように、抗ＲＯＲ１抗体、すなわちＤ１０は、インビボでＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の肺転移を阻害することができる。Ｄ１０モノクローナル抗体は、ＲＯＲ１受容体の内在化を容易にする（図９Ａ、Ｂ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をイソ−Ａｌｅｘ６４７、またはＤ１０−Ａｌｅｘ６４７で３０分間、氷上で染色した。染色された細胞を次いで、２つの画分へと分離した。１つの画分を氷上で１時間保ち、その他の画分を３７℃に１５分間、３０分間移した。２４時間の抗ＲＯＲ１抗体Ｄ１０治療は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においてＲＯＲ１表面発現を減少させる（図９Ｃ）。ＲＯＲ１は、乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においてビメンチンとの複合体を形成する（図９Ｄ）。インビトロでのＤ１０抗体治療は、ビメンチン発現を減少することができた（図９Ｅ）。抗ＲＯＲ１抗体は、インビトロで乳癌遊走を減少させる。（図９Ｆ）。Ｄ１０モノクローナル抗体は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌の早期（２日目）肺転移を阻害する（図９Ｇ）。Ｄ１０モノクローナル抗体は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌の肺転移を阻害する（図９Ｈ）。異種移植マウスに、２００ｍｇの抗ＲＯＲ１抗体を１日目に、および１００ｍｇの抗ＲＯＲ１抗体を３、７、１４、および２１日目に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１担持マウスの肺からの正規化された光子束が示される。５Ｅ５ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注射された代表的なマウスが背位で示される（図９Ｉ）。抗ＲＯＲ１抗体治療は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１担持マウスの肺重量を低減した（図９Ｊ）。抗ＲＯＲ１抗体治療の後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１担持マウスからの代表的な肺のＨ＆Ｅ組織像（図９Ｋ）。エラーバーは、標準誤差を示し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１であり、対応のない両側スチューデントｔ検定に基づく。

図６に描写される構築物を使用して、高親和性組換え抗体を選択した。ネイティブウェスタンはまた、全ての３つのヒト化Ｄ１０様ｍＡｂが、Ｄ１０と同じエピトープを標的とし、ヒトＲＯＲ１への結合のためにアミノ酸１３８を必要とすることを示した（図１０）。ヒトおよびキメラＲＯＲ１−細胞外（ｅｘ）構築物を２９３細胞中にトランスフェクトした。これは、組換えヒト−マウスキメラＲＯＲ１タンパク質の産生を可能にし、この組換えヒト−マウスキメラＲＯＲ１タンパク質は、異なる抗ＲＯＲ１ ｍＡｂでの免疫ブロット分析のために非変性ＰＡＧＥゲルまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいてサイズ分離することが可能であった。この結果は、Ｄ１０および９９９６１抗体の両方が、Ｉｇ様ドメインのＣ末端上の同じ領域に結合すること、ならびにＤ１０および９９９６１が、変性条件および天然条件の両方においてＲＯＲ１と結合し得ることを示している。完全ヒト細胞外ドメインは、いずれかのゲルの一番左のレーンで提供される（図１１）。抗体９９９６１は、ＲＯＲ１に対して、Ｄ１０よりも５０倍高い結合親和性を有し、白血病負荷をＤ１０よりも大きく低減した（図１２）。９９９６１抗体をヒト化して、９９９６１．１、９９９６１．２、９９９６１．３、および９９９６１．４と指定される４つの抗体を産生した。

ＲＯＲ１抗体９９９６１の特徴付け
ヒト臍帯血再構成免疫不全マウスにおいてＣＬＬ細胞に対する９９９６１の特異的活性を実証するために、アッセイを実施した。ヒト免疫系を発生するようにヒト臍帯血（ＣＢ）細胞で再構成されたＲａｇ−／−γ−／−マウスに、新鮮なまたは凍結したＣＬＬ ＰＢＭＣを腹腔内注射した。翌日、マウスに１ｍｇ／ｋｇの９９９６１またはＤ１０または対照ｍＩｇＧを静脈内で与えた。７日後、腹腔からのＣＬＬ ＰＢＭＣ細胞を採取し、フローサイトメトリーによって分析した（図１３Ａ）。データは、９９９６１が、９０％超のＣＬＬ細胞を排除し、正常なヒトＢ細胞またはＴ細胞発生には何の影響も及ぼさないことを示す（図１３Ｂ、Ｃ）。

ＲＯＲ＋原発性ＡＭＬにおける９９９６１の特異的活性を実証するために、研究をまた行った。結果は、９９９６１が、原発性コロニーの生存および続発性コロニーの自己再生能を減少させることを示す（図１４）。

９９９６１ ｍＡｂのエピトープマッピングは、このエピトープが種々の癌上でのみ発現され、臍帯血細胞または成体ヒト細胞、および胎児肝臓由来の前駆細胞もしくは幹細胞上では発現されないことを実証した（図１５）。９９９６１が白血病細胞に結合するが、正常な成体組織とは交差反応しないこともまた示されている（図１６）。リンパ腫多組織アレイは、切片が４０個のリンパ腫由来であるＬｉｆｅｓｃａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＬＳ−ＳＬＹＣＡ５）からのものであり、Ａｂ９９９１が悪性細胞に結合した５つの症例を有した。切片が複数の異なる正常な組織由来である、Ｂｉｏｍａｘ（ＦＤＡ９９９）からの正常な多組織アレイは、９９９６１との特異的な結合領域を何ら示さなかった。免疫組織化学を、ＤＡＫＯ（カリフォルニア州、カーペンテリア）からの高ｐＨ緩衝液による熱誘導抗原賦活化を使用して行い、続いてビオチニルチラミド増幅（ＤＡＫＯからのＣＳＡキット）を使用して増強した。

９９９６１のＰＫ研究を、マウス１匹当たり１ｍｇの抗体をＲａｇ−／−γ−／−マウスに静脈内注射することにより行った。血液を異なる時点で採取し、血漿中の９９９６１ ｍＡｂのレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、抗体半減期が１１．４日間であり、体積が１．１８ｍＬ（４７ｍＬ／ｋｇ）であり、クリアランスが０．０７２ｍＬ／日（０．１２ｍＬ／時／ｋｇ）であったことを示し、他の高分子および臨床的に利用される抗体と全て一致していた（図１７）。

ＲＯＲ１ペプチドワクチン
上で考察されるように、Ｄ１０が、ＲＯＲ１のＣＲＤドメインに隣接するＩｇ様ドメインのカルボキシ末端で結合することが示された。抗体４Ａ５は、Ｉｇ様ドメイン内で異なるエピトープに結合し、生物活性を欠いている。ｍＡｂのエピトープは、ヒトとマウスのＲＯＲ１との間の異なるアミノ酸のキメラＲＯＲ１−細胞外および部位突然変異によって確認された。Ｄ１０、４Ａ５、および他のＲＯＲ１抗体が結合するＲＯＲ１の細胞外ドメインに対応するペプチド、すなわちＡ１９、Ｒ２２、およびＫ１９を構築した。Ａ１９ペプチドは、４Ａ５ ｍＡｂによって認識されるエピトープに対応し、Ｒ２２ペプチドは、Ｄ１０ ｍＡｂ、９９９６１ ｍＡｂ（すなわち、ＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＣ）、およびヒト化９９９６１ ｍＡｂｓによって認識されるエピトープに対応し、Ｋ１９ペプチドは、ＲＯＲ１特異的な他のｍＡｂによって認識されるクリングルドメイン内の領域に対応する（図１８）。３つのペプチドは各々、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）またはフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）のアジュバントにおいて、免疫化のためのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とＣ末端で複合体化された。システイン（Ｃ）は、Ｃ末端に付加され、ＭＢＳとのＫＬＨの複合体化のために使用された（図２０）。複合体化反応は、図１９に示されている。複合体化されたペプチドが、Ｄ１０および９９９６１に結合することが示される（図２１）。Ｃ５７ＢＬ／６およびトランスジェニックマウスは、複合体化されたペプチドで免疫化された。抗体力価は、免疫化後４週目に収集した。Ｒ２２−ＫＬＨワクチンは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＲＯＲ１−Ｔｇマウスのいずれかにおいて、抗ＲＯＲ１抗血清の最も高い力価を誘導した（図２８）。この実験を、Ｄ１０エピトープの１６個のアミノ酸ペプチド、Ｒ１６により再び行い、このペプチドもまた、ヒトのＲＯＲ１タンパク質と反応する抗体を誘導したが、力価は一般的に、Ｒ２２−ＫＬＨによって誘導されたものよりも低かった（データは示されない）。

Ｒ２２−ＫＬＨワクチンにより誘導された抗ＲＯＲ１抗体は、ＥＷ３６、ＪｅＫｏ−１、またはＣＬＬ細胞上に存在する表面ＲＯＲ１に結合することが示された（図２９）。この研究において、Ｒ２２−ＫＬＨで免疫化されたマウスからの抗血清の希釈は、２０分間４℃で細胞とインキュベートされた。細胞は、次いで、洗浄され、次いで、フローサイトメトリーによる検出のために蛍光色素と複合体化されたヤギ抗マウスＩｇでラベル付けされた。中空のヒストグラムは、最初にＲ２２−ＫＬＨ抗血清で細胞をインキュベートせずに、ヤギ抗マウスＩｇで染色された細胞である。影付きのヒストグラムは、最初に抗Ｒ２２−ＫＬＨ抗血清とインキュベートされた細胞の蛍光である。細胞の蛍光における増加は、表面に結合されたマウス抗ＲＯＲ１抗体によるものであり、これは、次いで、ヤギ抗マウスＩｇで検出された。これらのマウスの免疫化前の抗血清またはＫＬＨで免疫化されたマウスの抗血清は、これらの細胞に結合しなかった（図２９）。

Ｒ２２−ＫＬＨ誘導抗血清が、補体依存性細胞傷害について検査された。ＥＷ３６、Ｊｅｋｏ−１、ＣＬＬ−１、およびＣＬＬ−２細胞を洗浄し、丸底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）においてＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ中で１ウェルあたり５×１０^５個の細胞２５μｌをプレーティングした。希釈された抗血清（２５μｌ）および赤ん坊のウサギ補体の１：５での希釈２５μｌがウェル毎に添加された。Ｄ１０ ｍＡｂが、陽性対照として使用された。全ての条件は三連で行われた。プレートは４時間３７℃でインキュベートされ、細胞は、ＤｉＯＣ６／ＰＩ染色およびフローサイトメトリー分析によって生存率を直ちに定量した。この研究は、Ｄ１０、またはＲ２２ペプチドに対して生成された抗血清のいずれかが、細胞担持ヒトＲＯＲ１の補体媒介溶解を方向付けることができたことを示している（図３０）。ＲＯＲ１を担持しない細胞は、死滅しなかった。

Ｒ２２−ＫＬＨによって誘導された抗体のＩｇのサブクラスを検査した。このために、我々はヒトＲＯＲ１でコーティングされたプレートを用いてＥＬＩＳＡを使用し、これを、次いで、希釈された抗血清とインキュベートし、洗浄し、次いで、ｘ 軸上に示されるようにＩｇＧサブクラスの各々に特異的な酵素複合体化された二次抗体を使用して検出された。この結果は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３がすべて、様々な程度に誘導されたことを示した。ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３は、Ｔｈ１のプロファイルと関連し、ＩｇＧ１は、Ｔｈ２のプロファイルと関連する。これらの結果は、Ｔｈ１およびＴｈ２のＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞が両方、ワクチン接種後に活性化されることを示している。

Ｒ２２−ＫＬＨを使用して、図３１に示されるようにＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫化した。ＫＬＨまたはＲ２２−ＫＬＨペプチドの第１の注射は、ＣＦＡにおいてであった。第２の注射およびその後の注射は、ＩＦＡにおいてであった。これらの動物は、紫色の矢印でマークされた日に採血された。第１の注射の日から４４日後に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ヒトＲＯＲ１トランスジェニックマウスに由来するヒトＲＯＲ１発現ＣＬＬ細胞で喚起された。このマウスは、Ｔ細胞白血病１に対してトランスジェニックであった（ＴＣＬ１遺伝子）。両方の導入遺伝子は、Ｂ細胞特異的プロモータ／エンハンサ（Ｅ−Ｃμ）の制御下にある。この白血病はヒトＣＬＬに類似し、ヒト表面ＲＯＲ１を発現する。

収集された抗血清は、Ｒ２２−ＫＬＨで免疫化されたマウスの白血病細胞負荷において著しい低減をもたらしたが、ＫＬＨで免疫化されたマウスではそれをもたらさなかった。（図３２）

Ｃ５７ＢＬ／６マウス
Ｒ２２−ＫＬＨを使用して、図３３に示されるスキーマに従ってＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫化した。ＫＬＨまたはＲ２２−ＫＬＨペプチドの第１の注射は、ＣＦＡにおいてであった。第２の注射およびその後の注射は、ＩＦＡにおいてであった。これらの動物は、紫色の矢印でマークされた日に採血された。第１の注射の日から４４日後に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ヒトＲＯＲ１トランスジェニックマウスに由来するヒトＲＯＲ１発現ＣＬＬ細胞で喚起され、これはまた、Ｔ細胞白血病１（ＴＣＬ１遺伝子）についてトランスジェニックであった。両方の導入遺伝子は、Ｂ細胞特異的プロモータ／エンハンサ（Ｅ−Ｃμ）の制御下にある。この白血病はヒトＣＬＬに類似し、ヒト表面ＲＯＲ１を発現する。

抗体は、４２日目にＲ２２−ＫＬＨで免疫化されたマウスにおいて観察されたヒトＲＯＲ１に反応するが、ＫＬＨで免疫化されたマウスでは反応しなかった。Ｒ２２−ＫＬＨで免疫化された４匹のマウス全てが、組換えヒトＲＯＲ１タンパク質の細胞外ドメインでコーティングされたプレートを用いて、ＥＬＩＳＡを介して検出されたヒトＲＯＲ１に対して高力価抗体を生成した。これらのデータは、Ｒ２２−ＫＬＨペプチドでの免疫化が、これらのＲＯＲ１−ＴｇマウスのすべてのＢ細胞に発現されるＲＯＲ１に対する自己寛容を破壊することができることを示す。Ｒ２２−ＫＬＨペプチドを与えられたマウスからの脾臓は、対照動物に類似したままであるが、ＫＬＨマウスは、有意により大きい脾臓を有する（図３４）。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾細胞のフローサイトメトリーは、ＣＤ５またはＲＯＲ１に特異的な蛍光色素複合体化ｍＡｂを使用して、ＫＬＨまたはＲ２２−ＫＬＨのいずれかで免疫化した。細胞を染色するために使用されるｍＡｂは、Ｒ２２−ＫＬＨによって誘導される抗体よりＲＯＲ１の非交差遮断エピトープと結合する。存在する場合、Ｒ２２−ＫＬＨワクチンで免疫化されたマウスの脾臓内の白血病細胞がはるかに少ないことに留意されたい（図３９）。

１ｘ１０^５個のヒトＲＯＲ１＋ＣＬＬ細胞より３０日早くＲ２２−ＫＬＨペプチドを注射されたＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓内に見て取れた白血病細胞の総数は、ＫＬＨを注射されたマウスの脾臓より有意に低かった。１個の脾臓あたりの白血病細胞の数は、（フローサイトメトリーを介して評価された）脾細胞集団における白血病細胞のパーセントと脾臓から採取された脾細胞の数を乗算することによって得られた（図３４）。

ＫＬＨまたはＲ２２−ＫＬＨで免疫化されたマウスの脾臓内のＣＤ８＋細胞の数は、フローサイトメトリーによって判定された。Ｒ２２−ＫＬＨでの免疫化に続き、ＣＤ８Ｔ細胞において劇的に増加したが、これは、ＫＬＨで免疫化されたマウスにおいて増加しなかった。下列は、７５日目にマウスの脾臓から採取されたＣＤ８Ｔ細胞の絶対数を示す（図３７）。

Ｃ５７ＢＬ／６ ＲＯＲ１トランスジェニックマウス
トランスジェニックマウスは、図３８に示されるように、Ｒ２２−ＫＬＨまたはＫＬＨのいずれかを注射された。マウスは、Ｂ細胞特異的プロモータ／エンハンサ（Ｅ−Ｃμ）下でヒトＲＯＲ１にトランスジェニックである。ＫＬＨまたはＲ２２−ＫＬＨペプチドの第１の注射は、ＣＦＡにおいてであった。第２の注射およびその後の注射は、ＩＦＡにおいてであった。これらの動物は、紫色の矢印でマークされた日に採血された。第１の注射の日から４４日後に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ヒトＲＯＲ１−Ｔｇマウスに由来するヒトＲＯＲ１発現ＣＬＬ細胞で喚起され、これはまた、Ｔ細胞白血病１（ＴＣＬ１遺伝子）についてトランスジェニックであった。両方の導入遺伝子は、Ｂ細胞特異的なプロモータ／エンハンサ（Ｅ−Ｃμ）の制御下にある。それゆえに、これらのＲＯＲ１−Ｔｇマウスは、ヒトＲＯＲ１を発現するＢ細胞を有する。結果は、Ｒ２２−ＫＬＨペプチドが、ＲＯＲ１を発現するマウスにおける抗ＲＯＲ１保護的免疫を誘導できることを実証し、それゆえに、自己寛容を破壊する

抗体は、４２日目にＲ２２−ＫＬＨで免疫化されたＲＯＲ１−ＴｇマウスにおいてヒトＲＯＲ１に反応するが、ＫＬＨで免疫化されたマウスでは反応しないことが観察された。Ｒ２２−ＫＬＨで免疫化された４匹のマウス全てが、組換えヒトＲＯＲ１タンパク質の細胞外ドメインでコーティングされたプレートを用いて、ＥＬＩＳＡを介して検出されたヒトＲＯＲ１に対して高力価抗体を生成した。フローサイトメトリーによるさらなる分析は、ＫＬＨで免疫化されたマウスよりＲ２２−ＫＬＨワクチンで免疫化されたマウスの脾臓内の白血病細胞が、存在したとしても、はるかに少ないことを実証した（図４０）。ＦＡＣＳ分析はまた、ＲＯＲ１が、Ｒ２２−ＫＬＨで免疫化されたマウスにおいて下方調節されたが、ＫＬＨで免疫化されたマウスでは調節されなかったことを示した。Ｒ２２−ＫＬＨで免疫化されたマウスからの脾臓は、ＫＬＨで免疫化されたマウスと比較して、有意にさらに少ない白血病細胞を有する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いたとき、Ｒ２２ペプチドＫＬＨでの免疫化は、ＣＤ８Ｔ細胞における劇的な増加をもたらしたが、これは、ＫＬＨで免疫化されたマウスでは増加しなかった（図３９）．類似する結果が、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図４３）およびＣＤ３＋Ｔ細胞（図４２）で見られた。

ＢＡＬＢ／ｃマウス
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、図２２に示されているように、ＫＬＨまたはＲ２２−ＫＬＨで免疫化された。このため、ＫＬＨまたはＫＬＨと複合体化されたペプチドは各々、アジュバント（ＣＦＡまたはＩＦＡ）と乳剤を形成した。ＣＦＡは、第１の免疫化のために使用され、ＩＦＡは、その後のブーストのために使用された。採血およびペプチド注射の日が示されている。

Ｒ２２−ＫＬＨ誘導抗ＲＯＲ１抗体レベルは、ＥＬＩＳＡによって判定された。精製されたＲＯＲ１細胞外ドメインを、９６ウェルプレートにコーティングし、個々の採血日から示された希釈時間で抗血清をインキュベートした。ＥＬＩＳＡの結果は、抗ＲＯＲ１抗体の濃度は、免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、経時的に誘導されたことを示した。免疫化前に収集されたこれらの動物からの血清は、低い血清希釈でさえ、ＲＯＲ１タンパク質と反応しなかった。

免疫ブロット分析はまた、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＲ２２−ＫＬＨでの免疫化によって生成された抗ＲＯＲ１抗体は、Ｄ１０と同じエピトープ特異性を有する抗ＲＯＲ１抗体を誘導したことを示した（図２３）。加えて、抗血清はまた、マウスのタンパク質と反応するように見える。

ＦＡＣＳ分析は、細胞の表面上でのＲＯＲ１への、Ｒ２２−ＫＬＨで免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウスからの抗血清の結合を確認した。

トランスジェニックマウスＩＩ
トランスジェニックマウスは、図２４に示されるように、ＫＬＨまたはＲ２２−ＫＬＨのいずれかで免疫化された。ペプチドと複合体化されたＫＬＨは、アジュバントと混合された（ＣＦＡまたはＩＦＡ）。ＣＦＡは、第１の免疫化のために使用され、ＩＦＡは、続くブーストのために使用された。ＥＬＩＳＡの結果は、抗ＲＯＲ１抗体の濃度は、Ｒ２２−ＫＬＨで免疫化されたＲＯＲ１トランスジェニックマウスに経時的に誘導されたことを示した。ＦＡＣＳ分析は、細胞の表面上でのＲＯＲ１への、Ｒ２２−ＫＬＨで免疫化されたＲＯＲ１トランスジェニックマウスからの抗血清の結合を確認した。

Ｒ２２−ＫＬＨで免疫化されたマウスからの抗血清を、ＲＯＲ１受容体内在化能力について検査した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、４℃または３７℃で１時間トランスジェニックマウスからの抗血清とインキュベートし、次いで、ＲＯＲ１発現のＦＡＣＳ分析前に、３０分間氷上においてアイソタイプＡｌｅｘａ６４７または４Ａ５−Ａｌｅｘａ６４７を用いて染色された。この結果は、Ｒ２２−ＫＬＨで免疫化されたトランスジェニックマウスからの抗ＲＯＲ１血清が、ＲＯＲ１受容体内在化を誘導したことを示していた（図２５）。

Ｒ２２−ＫＬＨで免疫化されたマウスからの抗血清を、乳癌遊走におけるそれらの影響を判定するために検査した。遊走した細胞は、１０倍の倍率下で１時間の抗血清処理、次いで、１６時間の３７℃でのインキュベーション後に観察された。結果は、平均±標準誤差である。ｎ＝３である。（＊＊ｐ＜０．０１）。この結果は、トランスジェニックマウスからの抗ＲＯＲ１血清が、インビトロで乳癌遊走を減少させることができたことを示した（図２６）。

Claims (29)

1. 抗体９９９６１と同じ結合特異性を有する単離された抗ＲＯＲ１抗体。
2. ｈＲＯＲ−１のアミノ酸１３０〜１６０に結合する、請求項１に記載の抗体。
3. ＲＯＲ１アミノ酸１３８がｈＲＯＲ−１への結合のためにグルタミン酸であることを必要とする、請求項２に記載の抗体。
4. 配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、および配列番号１７からなる群から選択される重鎖可変領域、および配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、および配列番号１９からなる群から選択される軽鎖可変領域を備える、請求項１に記載の抗体。
5. 結合親和性を有する前記抗体が、約５００ｐＭ〜約６ｎＭの間である、請求項１に記載の抗体。
6. 前記結合親和性が約８００ｐＭである、請求項５に記載の抗体。
7. ９９９６１、９９９６１．１、９９９６１．２、９９９６１．３、および９９９６１．４からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
8. 転移を阻害する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
9. ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
11. ＲＯＲ−１発現細胞に対するワクチンであって、抗体Ｄ１０のＲＯＲ−１結合領域に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、単離されたまたは合成的に産生されたペプチドの薬学的に許容される組成物を含む、ワクチン。
12. 抗体Ｄ１０の前記ＲＯＲ−１結合領域のアミノ酸配列が、
    

    

    である、請求項１１に記載のワクチン。
13. 抗体Ｄ１０の前記ＲＯＲ−１結合領域のアミノ酸配列が、
    

    

    である、請求項１１に記載のワクチン。
14. ＲＯＲ−１発現細胞が癌細胞である、請求項１２に記載のワクチン。
15. 癌細胞が、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、ＣＬＬ、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、卵巣癌、結腸癌、肺癌、皮膚癌、膵臓癌、精巣癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌、および副腎癌からなる群から選択される、請求項１１に記載のワクチン。
16. 免疫原性アジュバントをさらに含む、請求項１２または１３に記載のワクチン。
17. 前記アジュバントは、結合ペプチドに複合体化された免疫原性担体ペプチドである、請求項１６に記載のワクチン。
18. 前記結合ペプチドのアミノ酸配列が、
    

    

    であり、かつ前記免疫原性担体ペプチドが、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン、またはオボアルブミンである、請求項１７に記載のワクチン。
19. 前記結合ペプチドのアミノ酸配列が、
    

    

    であり、かつ前記免疫原性担体ペプチドが、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である、請求項１７に記載のワクチン。
20. 

    に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、ＲＯＲ１結合ペプチド。
21. 哺乳類由来である、請求項２０に記載の結合ペプチド。
22. 請求項２０に記載の結合ペプチドをコードする、単離された核酸。
23. 

    に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、ＲＯＲ１結合ペプチド。
24. 哺乳類のペプチドである、請求項２３に記載の結合ペプチド。
25. 請求項２３に記載の結合ペプチドをコードする単離された核酸。
26. ＲＯＲ−１発現癌の転移を抑制する方法であって、モノクローナル抗体９９９６１の結合特異性を有する抗体、抗体Ｄ１０のＲＯＲ−１結合領域に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドから構成されるワクチン、
    

    

    に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ−１結合ペプチド、または
    

    

    に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ−１結合ペプチドを投与することによって、腫瘍細胞の上皮間葉転換を妨害することを含む、方法。
27. 前記ＲＯＲ−１発現癌が、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、ＣＬＬ、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、卵巣癌、結腸癌、肺癌、皮膚癌、膵臓癌、精巣癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌、および副腎癌からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
28. 対象において癌を治療または予防するための方法であって、モノクローナル抗体９９９６１の結合特異性を有する抗体、抗体Ｄ１０のＲＯＲ−１結合領域に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドから構成されるワクチン、
    

    

    に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ−１結合ペプチド、または
    

    

    に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＯＲ−１結合ペプチドを前記対象に投与することを含む、方法。
29. 癌が、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、ＣＬＬ、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、卵巣癌、結腸癌、肺癌、皮膚癌、膵臓癌、精巣癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌、および副腎癌からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。

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