MX2015002337A

MX2015002337A - Anticuerpos y vacunas para utilizarse en el tratamiento de canceres por ror1 y para inhibir la metastasis.

Info

Publication number: MX2015002337A
Application number: MX2015002337A
Authority: MX
Inventors: Thomas James Kipps; Jian Yu; Bing Cui; Liguang Chen; George Widhopf; Charles Prussak
Original assignee: Univ California
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2015-08-14
Also published as: SG11201500730XA; JP2021058215A; US11312787B2; PH12015500390A1; AU2020267172A1; US20230110249A1; PL3489261T3; JP6479660B2; IL264057B; US9758591B2; JP6823094B2; WO2014031174A1; MY181648A; AU2013306390A1; EP2888283B1; CA2881966A1; KR102134088B1; EP2888283A4; MX362456B; KR20200079561A

Abstract

La presente invención se relaciona con composiciones farmacéuticas y con un método para inhibir la metástasis utilizando anticuerpos anti-ROR1 o fragmentos de unión a antígenos, péptidos de unión al ROR1 y vacunas del ROR1.

Description

ANTICUERPOS Y VACUNAS PARA UTILIZARSE EN EL TRATAMIENTO DE CÁNCERES POR ROR1 Y PARA INHIBIR LA METÁSTASIS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona en general con anticuerpos y vacunas del receptor huérfano 1 similar a la tirosina quinasa receptora, asi como con los métodos para inhibir la metástasis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer es la segunda causa que provoca la muerte en humanos después de la enfermedad coronaria. A nivel mundial, millones de personas mueren por cáncer cada año. Sólo en los Estados Unidos, el cáncer provoca la muerte de más de medio millón de personas anualmente, con aproximadamente 1.4 millones de casos nuevos diagnosticados al año. Mientras que las muertes por enfermedad cardiaca han descendido significativamente, aquellas que resultan del cáncer en general están aumentando. Las tirosina quinasas receptoras (RTK) desempeñan funciones decisivas en la diferenciación, proliferación, migración, angiogenesis, y supervivencia celular. El receptor huérfano 1 similar a la tirosina quinasa receptora (RORl) es una proteína de membrana tipo I evolutivamente conservada que pertenece a la sub- familia del ROR y tiene dominios extra-celulares que contienen dominios similares a inmunoglobulina (Ig), Frizzled, y Kringle. Los ratones con deficiencia de ROR1 exhiben una variedad de defectos fenotípicos dentro de los sistemas esquelético y urogenital, así como retraso en el crecimiento postnatal. El ROR1 se expresa durante la embriogénesis y mediante una variedad de diferentes cánceres, aunque no por tejidos normales pos-parto, y se puede considerar un antígeno superficial onco-embrionario. Los datos funcionales sugieren que el ROR1 puede funcionar en la señalización WNT no canónica para estimular la supervivencia de células malignas. Estudios más recientes han mostrado que la señalización WNT no canónica desempeña una función principal en los subtipos similares a básales y otros de la metástasis del cáncer de mama. La expresión del cáncer de mama humano por ROR1 también está asociada con la activación de la trayectoria AKT-CREB y el crecimiento intensificado de células tumorales.

El receptor huérfano 1 similar a la tirosina quinasa receptora (ROR1) es una proteína embrionaria conservada cuya expresión se reduce progresivamente durante el desarrollo embrionario en mamíferos. La proteína intacta, que incluyen su dominio extracelular, no parece estar expresada significativamente en tejidos normales de mamífero adulto. En particular, los estudios no han identificado una expresión significativa del ROR1 sobre la superficie celular de tejidos normales de humano adulto, incluyendo células B no cancerosas, normales (Baker et al., Clin. Cáncer Res., 14:396 (2008); DaneshManesh et al., Int. J. Cáncer, 123:1190 (2008) and Fukuda et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 105:3047 (2008)). Sin embargo, el ROR1 se expresa sobre la superficie celular de células B malignas (B-CLL) y el linfoma de la célula del manto (MCL). También se ha reportado que el ROR1 se expresa en otras ciertas lineas celulares de cáncer incluyendo el linfoma de Burkett, el carcinoma de células renales, cáncer de colon y cáncer de mama (solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2007/02075110). Por lo tanto, se puede considerar al ROR1 un marcador selectivo para estos cánceres.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona anticuerpos contra el R0R1 que pueden inhibir el crecimiento de celular cancerosas y la metástasis. Esta invención proporciona anticuerpos contra el R0R1 , péptidos de unión a R0R1 y vacunas del péptido de R0R1. Además se proporcionan composiciones y métodos para inhibir la metástasis utilizando anticuerpos anti-RORl o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, inmuno-conjugados del anticuerpo del R0R1, vacunas del péptido del ROR1 o péptidos de unión al ROR1. En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo del ROR1 anti-humano aislado que tiene la misma especificidad de unión como el anticuerpo 99961. En un aspecto, el anticuerpo se une al dominio similar a Ig, que es contiguo con el dominio CRD del ROR-1 humano (hRORl). En un aspecto adicional, el anticuerpo se une a un epítope que mapea para los aminoácidos 42-160 del hROR-1. En un aspecto adicional, el anticuerpo se une a un epitope que mapea para los aminoácidos 130-160 de hROR-1. En otro aspecto, el anticuerpo requiere la presencia de ácido glutámico en la posición 138 del hROR-1 para la unión.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un anticuerpo del ROR1 anti-humano aislado que comprende una región variable de cadena pesada que se selecciona del grupo que consiste de la SEC ID NO:l, la SEO ID NO:5, la SEC ID NO:9, la SEC ID NO:13, y la SEC ID N0:17, y la región variable de cadena ligera se selecciona del grupo que consiste de la SEC ID NO:3, la SEC ID NO:7, la SEC ID NO:11, la SEC ID NO:15 y la SEC ID NO:19. En un aspecto, el anticuerpo de acuerdo con la región variable de cadena pesada es la SEC ID NO:5 y la región variable de cadena ligera es la SEC ID NO:7.

En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo de R0R1 anti-humano aislado que comprende una región variable de cadena pesada comprendida de la CDR1, la CDR2 y la CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO:27, la SEC ID NO:28, la SEC ID NO:29, la SEC ID NO:33, la SEC ID NO:34 y la SEC ID NO:35, y la región variable de cadena ligera comprendida de la CDR1, la CDR2 y la CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO:30, la SEC ID NO:31, la SEC ID NO:32, la SEC ID NO:36, la SEC ID NO:37 y la SEC ID NO:38. En un aspecto, la región variable de cadena pesada comprendida de la CDR1, la CDR2 y la CDR3 está comprendida de la SEC ID NO:27, la SEC ID NO:28 y la SEC ID NO:29, y la región variable de cadena ligera comprendida de la CDR1, la CDR2 y la CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO:30, la SEC ID NO:31 y la SEC ID NO:32.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un anticuerpo del ROR-1 anti-humano con una afinidad de unión mayor que 41 nM. En un aspecto, la afinidad de unión con el anticuerpo es entre aproximadamente 500 pM y aproximadamente 6 nM. En un aspecto, la afinidad de unión al anticuerpo es de aproximadamente 800 pM.

En un aspecto, el anticuerpo es 99961 o las formas humanizadas del mismo, incluyendo los anticuerpos 99961.1 99961.2, 99961.3 ó 99961.4. En otro aspecto, el anticuerpo inhibe la metástasis. En un aspecto adicional, el anticuerpo internaliza e inhibe la migración celular. En un aspecto adicional, el anticuerpo internaliza y sub-modula la Vimentin, Snail 1/2, o ZEB. En un aspecto preferido, el anticuerpo es humano, humanizado, o quimérico.

En otra modalidad, la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo contra el R0R1 y un portador farmacéuticamente portador aceptable.

Una modalidad adicional proporciona un ácido nucleico aislado que codifica para el anticuerpo contra el ROR1. En otra modalidad, la invención proporciona un vector de expresión que comprende una ácido nucleico que codifica para un anticuerpo contra el hRORl. En una modalidad adicional, la invención proporciona una célula hospedera que comprende el ácido nucleico que codifica para un anticuerpo contra ei hRORl. En una modalidad adicional, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo del ROR1 anti-humano que comprende cultivar las células hospederas bajo condiciones para producir 'el anticuerpo, luego recuperar opcionalmente el anticuerpo.

En una modalidad, la invención proporciona una vacuna contra las células que expresan el ROR-1, la vacuna comprende una composición farmacéuticamente aceptable de un péptido aislado o producido sintéticamente que tenga una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con la región de unión con el ROR-1 del anticuerpo DIO. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos de la región de unión del ROR-1 del anticuerpo DIO es VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. En un aspecto adicional, la secuencia de aminoácidos de la región de unión del ROR-1 del anticuerpo DIO es EVVSSTGVLFVKFGPC. En otro aspecto, la célula de expresión del ROR-1 es una célula cancerosa. En un aspecto adicional, la célula cancerosa es un cáncer por leucemia de células B, de linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, ovárico, de colon, pulmonar, de la piel, pancreático, testicular, de la vejiga, uterino, prostético, o adrenal.

En otra modalidad, la invención proporciona una vacuna que comprende un péptido de unión al ROR1 que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC y un portador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, el péptido es de mamífero. En un aspecto adicional, el péptido de unión al ROR1 es de origen quimérico y/o de humano, de ratón, de rata, porcino, bovino, de primate, felino, canino, de conejo, de cabra, de pollo o úrsido. En otro aspecto, la vacuna comprende además un adyuvante inmunogénico. En un aspecto adicional, el adyuvante es una porción portadora inmunogénica conjugada con el péptido de unión. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del péptido de unión es VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. En otro aspecto, la porción portadora inmunogénica es un péptido portador, tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA), ovalbumina, hidróxido de aluminio u otro inmuno-adyuvante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de inmuno-adyuvantes farmacéuticamente aceptables se pueden encontrar en Methods in Molecular Medicine, Vol.42: Vaccine adjuvants: Preparation, Methods and Research Protocols; Editado por D. T. O'Hagan; Humana Press Inc., Totowa NJ and European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, Committee for Proprietary Medicinal Products, Guidelines on Adjuvants in Vaccines, Londres 2004.

En otra modalidad, la invención proporciona una vacuna que comprende un péptido de unión al RORl que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con EVVSSTGVLFVKFGPC y un portador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto adicional, el péptido de unión al RORl es de origen quimérico y/o humano, de ratón, de rata, porcino, bovino, de primate, felino, canino, de conejo, de cabra, de pollo u úrsido. En un aspecto adicional, el adyuvante es una porción portadora inmunogénica conjugada con el péptido de unión. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del péptido de unión es VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. En otro aspecto, la porción portadora inmunogénica es un péptido portador, tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA), ovalbumina, hidróxido de aluminio u otro inmuno-adyuvante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de inmuno-adyuvantes farmacéuticamente aceptables se pueden encontrar Molecular Medicine, Vol.42: Vaccine adjuvants: Preparation, Methods and Research Protocols; Editado por D. T. O'Hagan; Humana Press Inc., Totowa NJ and European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, Committee for Proprietary Medicinal Products, Guidelines on Adjuvants in Vaccines, Londres 2004.

En una modalidad adicional, la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende la vacuna que comprende un péptido de unión al ROR1 que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC y un portador farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad adicional, la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende la vacuna que comprende el péptido de unión al ROR1 que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con EVVSSTGVLFVKFGPC y un portador farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, la invención proporciona un péptido de unión al ROR1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEC ID NO:25 y SEC ID NO:26. En un aspecto, el péptido tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. En otro aspecto, el péptido tiene una secuencia peptídica de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con EVVSSTGVLFVKFGPC. En otro aspecto, el péptido de unión es de mamífero. En un aspecto adicional, el péptido de unión es de origen quimérico y/o de humano, de ratón, de rata, porcino, bovino, de primate, felino, canino, de conejo, de cabra, de pollo o úrsido .

En una modalidad, la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende un péptido de unión al RORl que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEC ID NO:25 y SEC ID NO:26 y un portador farmacéuticamente aceptable.

En otra modalidad, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica para un péptido de unión al RORl que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:25 y la SEC ID NO:26. En otra modalidad, la invención proporciona un vector de expresión que comprende el ácido nucleico que codifica para un péptido de unión al R0R1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:25 y la SEC ID NO:26. En una modalidad adicional, la invención proporciona una célula hospedera que comprende el ácido nucleico que codifica para un péptido de unión al R0R1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:25 y la SEC ID NO:26. En una modalidad adicional, la invención proporciona un método para producir un péptido que comprende cultivar la célula hospedera que codifica para un péptido de unión al ROR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:25 y la SEC ID NO:26 bajo condiciones para producir el péptido de unión. En un aspecto, el método para producir un péptido comprende además recuperar el péptido de unión.

En una modalidad, la invención proporciona un método para suprimir la metástasis del cáncer que expresa el ROR-1, el método comprende interrumpir la transición epitelial mesenquimal de células tumorales al administrar un anticuerpo que tenga la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal 99961, una vacuna comprendida de un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con la región de unión al ROR-1 del anticuerpo DIO o un péptido de unión al ROR-1 que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. En un aspecto, el cáncer que expresa el ROR-1 es cáncer por leucemia de células B, de linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, ovárico, de colon, pulmonar, de la piel, pancreático, testicular, de la vejiga, uterino, prostático, o adrenal.

En una modalidad, la invención proporciona un método para suprimir la metástasis del cáncer que expresa el ROR-1, el método comprende interrumpir la transición epitelial mesenquimal de las células tumorales al administrar un anticuerpo que tenga la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal 99961, una vacuna comprendida de un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con la región de unión al ROR-1 del anticuerpo DIO o un péptido de unión al ROR-1 que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con EVVSSTGVLFVKFGPC. En un aspecto, el cáncer que expresa el ROR-1 es cáncer por leucemia de células B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, ovárico, de colon, pulmonar, de la piel, pancreático, testicular, de la vejiga, uterino, prostático, o adrenal.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un método para tratar o prevenir un cáncer en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto un anticuerpo que tenga la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal 99961, una vacuna comprendida de un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con la región de unión al ROR-1 del anticuerpo DIO o un péptido de unión al ROR-1 que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. En un aspecto, el cáncer es cáncer por leucemia de células B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, ovárico, de colon, pulmonar, de la piel, pancreático, testicular, de la vejiga, uterino, prostético, o adrenal.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un método para tratar o prevenir un cáncer en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto un anticuerpo que tenga la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal 99961, una vacuna comprendida de un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con la región de unión al ROR-1 del anticuerpo DIO o un péptido de unión al ROR-1 que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con EVVSSTGVLFVKFGPC. En un aspecto, el cáncer es cáncer por leucemia de células B, de linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, ovárico, de colon, pulmonar, de la piel, pancreático, el testicular, de la vejiga, uterino, prostático, o adrenal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A, IB, 1C, ID y 1E, muestran una expresión de nivel alto del ROR1 en cáncer de mama asociada con la supervivencia sin metástasis más corta y la firma génica EMT. (Figura 1A) La gráfica se derivó de los datos publicados disponibles a través de la base de datos PubMed GEO (GSE2603, GSE5327, GSE2034 y GSE12276). Las curvas Kaplan-Meier representan el impacto predictivo de la expresión del ROR1 sobre la supervivencia general sin metástasis. Para cada análisis, se segregaron 582 casos en tres grupos iguales con un grupo designado ROR1H que representa un tercio de los pacientes que tuvieron tumores con los mayores niveles de ARNm de R0R1, y el grupo designado R0R1L que representa un tercio de pacientes que tuvieron cánceres con los menores niveles de ARNm del R0R1. Un tercio de los pacientes que tuvieron tumores con una expresión intermedia de ARNm del ROR1 se designó como ROR1M. La supervivencia sin metástasis se determinó mediante análisis de Kaplan-Meier, y se determinaron las diferencias estadísticas mediante una prueba de rango logarítmico. El número de pacientes en cada categoría, los casos metastásicos totales, y los valores P correspondientes (prueba chi- cuadrado) se muestran en las tablas integradas. (Figura IB) Mapa de calor que muestra la expresión del RORl (parte superior), genes EMT-relacionados (SNAI1 y SNAI2 que codifican para Snail-1 y Snail-2, ZEB1 que codifica para ZEB-1, VIM que codifica para Vimentin, CDH2 que codifica para N-Caderina, CDH1 que codifica para E-Caderina, TJP1 que codifica para ZO-1, TJP3 que codifica para ZO-3, KRT19 que codifica para CK-19, o CLDN3 que codifica para Claudina 3, en células cancerosas de mama primero aisladas de los pacientes. (Figura 1C) Mapa de calor que muestra la expresión de genes EMT relacionados aislados de células MDA-MB-231 (izquierda), HS-578T (a la mitad), BT549 (a la derecha) tratadas con ROR1-siRNA o CTRL-siRNA. (Figura ID) Inmuno-transferencias de lisados proteinicos de MDA-MB-231, HS-578T, o BT549 (como se indica en la parte inferior) transfectada con CTRL-shRNA o RORl-shRNA, como se indica en la parte superior. Las inmuno-transferencias se comprobaron con anticuerpos específicos para las proteínas indicadas a la izquierda. (Figura 1E) Inmuno-transferencias de lisados proteinicos de MCF7 transíectadas con un vector control o un vector para expresión del ROR1, como se indica en la parte superior. Las inmuno-transferencias se comprobaron con anticuerpos específicos para las proteínas indicadas a la izquierda.

Las figuras 2A, 2B, 2C, 2D, 2E y 2F, muestran la expresión del ROR1 mediante líneas celulares de cáncer de mama asociada con las características de EMT y mayores potenciales metastásicos. (Figura 2A) Cambios morfológicos (40x) de MDA-MB-231, HS-578T, o BT549 (como se indica a la izquierda) transfectados con CTRL-shRNA o RORl-shRNA, como se indica en la parte superior. (Figura 2B) La expresión de CK-19, E-Caderina, o Vientin se detectó mediante tinción por inmuno-fluorescencia en células MDA-MB-231 transfectadas con CTRL-shRNA o RORl-shRNA bajo un aumento de 63x. (Figura 2C) Cambios morfológicos (40x) de células MCF7 transfectadas con el vector control o el vector de expresión del ROR-1 (como se indica en la parte superior). (Figura 2D) La expresión de CK-19, E-Caderina, o Vimentin se detectó mediante tinción por inmunoflorescencia de células MCF7 transfectadas con ya sea el vector control o el vector para expresión del ROR1 (aumento de 63x). (Figura 2E) Análisis para la migración celular (histogramas a la izquierda) o invasión (histogramas a la derecha) sobre MDA-MB-231, HS-578T, o BT549 transfectados con ya sea CTRL-shRNA (negro) o RORl-shRNA (blanco). Todos los datos se normalizaron con los resultados de las células transfectadas con CTRL-shRNA que no difieren de aquellos observados para las lineas celulares parentales. Los resultados son el valor medio por cada grupo de prueba (± SEM) (n = 3 por grupo de prueba). (Figura 2F) Fotomicrografía representativa de MDA-MB-231 transfectado con CTRL-shRNA- (paneles a la izquierda) o MDA-MB-231 transfectado con R0R1- shRNA (panales a la derecha) en análisis para la migración celular (parte superior) o invasión (parte inferior). Los datos se muestran como la media + SEM; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, en comparación con el grupo CTRL-shRNA.

Las figuras 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 31, 3J, 3K y 3L, muestran que la lentificación del ROR1 reduce la metástasis del cáncer de mama después del xenoinjerto de almohadilla mamaria. (Figura 3A) Diagrama que representa la Etapa I o II del estudio. (Figura 3B) Volúmenes tumorales durante el tiempo (días) durante la etapa I. (Figura 3C) Peso de los tumores extirpados de cada grupo. (Figura 3D) Flujo fotónico ex vivo de tumores primarios de cada grupo. (Figuras 3E y 3F). La (figura 3E) flujo fotónico de pulmón in vivo o (figura 3F) flujo fotónico de hígado de cada ratón durante la etapa II se normalizaron con el flujo fotónico de tumor primario para cada ratón. Los histogramas representan el flujo fotónico normalizado de pulmón e hígado de cada grupo. (Figura 3G) El flujo fotónico de pulmón in vivo durante la etapa II de cada grupo. (Figura 3H) Las barras horizontales indican la media del flujo fotónico de pulmón ex vivo de ratones en d21 para cada grupo (izquierda). Las imágenes representativas de bioluminiscencia de los pulmones extirpados de cada grupo se representan a la derecha. (Figura 31) Los histogramas representan el índice de peso del pulmón para cada grupo. (Figura 3J) Secciones representativas del pulmón teñido con H&E. (Figura 3K) las barras horizontales indican el flujo fotónico de hígado medio ex vivo de ratones en d21 para cada grupo (izquierda). A la derecha están imágenes representativas de bioluminiscencia de hígados extirpados en d21 para cada grupo. (Figura 3L) Secciones representativas teñidas con H&E del hígado en d21 de ratones inyectados para cada grupo. Los datos se muestran como la media ± SEM. Los datos se muestran como la media ± SEM; P>0.05 no se considera significativo (N.S.), *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, en comparación con el grupo CTRL-shRNA.

Las figuras 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 41, 4J, 4K y 4L, muestran que la lentificación del ROR1 reduce la metástasis pulmonar experimental y la metástasis ósea de la célula MDA-MB-231 in vivo. (Figura 4A) Curvas de supervivencia Kaplan-Meier de ratones inyectados i.v. con 5xl05 CTRL-shRNA transfectado o células transíectadas con RORl-shRNA (P<0.001 mediante la prueba de rango logarítmico). (Figura 4B) El flujo fotónico de pulmón in vivo de cada grupo durante el tiempo después de la inyección (izquierda). Las imágenes representativas de bioluminiscencia de ratones de cada grupo se representan a la derecha. (Figuras 4C, 4D y 4E) Secciones representativas teñidas con H&E del pulmón en la (Figura 4C) d3, (Figura 4D) d21, y (Figura 4E) d28. (Figura 4F) Los histogramas en la parte inferior proporcionan el flujo fotónico GFP de pulmón ex vivo en d28 para cada grupo. Las imágenes representativas de bioluminiscencia de los pulmones extirparon en d28. (Figura 4G) El indice de peso del pulmón de cada de grupo en d28 (parte inferior). Fotografías representativas de los pulmones (parte superior) de cada grupo. (Figura 4H) Curvas de supervivencia Kaplan-Meier de ratones inyectados i.c. con células lxlO5 CTRL-shRNA-transfectadas o RORl-shRNA-transfectadas (P =0.0017 mediante la prueba de rango logarítmico). (Figura 41) Imágenes representativas de bioluminiscencia de ratones después de la inyección del tumor i.c. Los cuadros blancos definen el área a partir de la cual se obtuvieron los datos de bioluminiscencia presentados en la (Figura 4J). (Figura 4J) Los histogramas proporcionan el flujo fotónico óseo normalizado ín vivo de cada grupo. (Figura 4K) El flujo fotónico óseo ex vivo de los huesos pélvicos extraídos de cada grupo en d21. Imágenes representativas de bioluminiscencia de los huesos pélvicos extraídos se representan a la derecha. (Figura 4L) Las secciones óseas histológicas representativas teñidas con H&E de ratones provenientes de cada uno. El dibujo de ratón se modifica a partir de la referencia (30). Los datos se muestran como la media ± SEM *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, en comparación con el grupo CTRL-shRNA.

Las figuras 5A, 5B, 5C, 5Df 5E, 5F, 5G, 5H, 51, 5J, 5K y 5L, muestran un anticuerpo anti-RORl gue reduce la metástasis pulmonar de la célula MDA-MB-231 in vivo. (Figura 5A) mAb DIO provoca la internalización de R0R1. Las células MDA-MB-231 se tiñeron con control-IgG-Alexa647 (rojo), o D10-Alexa647 durante 30 min en hielo, y luego ya sea se mantuvieron en hielo (azul) o se transfirieron a 37°C durante lh (naranja) antes de la citometria de flujo. (Figura 5B) Microscopía confocal de células MDA-MB-231 teñidas con DIO (verde) antes y después de la incubación por lh a 37°C. (Figura 5C) las células MDA-MB-231 se trataron con o sin (-) control IgG (IgG) o DIO durante 24h antes de la tinción con un anti-RORl del bloqueo sin cruce, marcado con fluorocromo, sin pérdida de viabilidad. Se muestra la intensidad de fluorescencia media (MFI) de las células tratadas (***P<0.001 mediante ANOVA uni-direccional). (Figura 5D) las inmuno-transferencias representativas se comprobaron para Vimentin (parte superior) o b-actina (parte inferior) de los lisados preparados a partir de MDA-MB-231 antes (Oh) o después de 1, 4, o 24 h de tratamiento con DIO o IgG control. Las proporciones de intensidad de banda de Vimentin a b-actina se proporcionan más adelante. (Figura 5E) Los inmunoprecipitados del listado celular de MDA-MB-231 utilizando IgG control (IgG) o anti-RORl (ROR1) se utilizaron para análisis de inmuno-transferencia comprobados con anticuerpos especifico para Vimentin (parte superior) o R0R1 (parte inferior). (Figura 5F) Los histogramas proporcionan el número de células MDA-MB-231 migradas que se pre-trataron durante 1 h con DIO o IgG control. (Figura 5G) Izquierda, histogramas que representan el flujo fotónico de pulmón in vivo. Derecha, secciones representativas teñidas con H&E de los pulmones. (Figura 5H) La gráfica representa el flujo fotónico normalizado de pulmón in vivo. (Figura 51) Imágenes representativas de bioluminiscencia de ratones inyectados en el tumor tratados con IgG (parte superior) o DIO (parte inferior). (Figura 5J) El histograma representa el indice de peso del pulmón. (Figura 5K) Secciones representativas teñidas con H&E de los pulmones. Los datos se muestran como la media ± SEM; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, en comparación con el grupo IgG.

La figura 6, muestra las estructuras quiméricas utilizadas para mapear el epitope del anticuerpo DIO del ROR1 . La porción ligera de la estructura es la porción de ratón y la más oscura en un ser humano.

La figura 7, representa el mapeo de epitopes para el anticuerpo DIO que no reacciona con la proteina del ROR1 de ratón. La proteina del ROR1 de ratón o humano tienen los residuos diferentes de aminoácidos en las posiciona de los aminoácidos 138, 142 ó 160; la proteína del ROR1 humana tiene los residuos de los aminoácido E, S, o Y, en estas posiciones, mientras que la proteína del ROR1 de ratón tiene los residuos de los aminoácido K, T, o S en las posiciones de los aminoácidos posiciona 138, 142 ó 160, respectivamente. Se generaron proteínas recombinantes del ROR1 que tiene el residuo de aminoácidos ya sea de ratón o humano en estas posiciones únicamente. Estas proteínas recombinantes se separaron en gel de poliacrilamida sin desnaturalizar y luego se transfirieron sobre nilón, que se comprobó con mAb DIO. Como se puede observar en la figura, DIO reacciona con las proteínas recombinantes 1, 3, 4, y 7, pero no con 2, 5, ó 6, que se describen en la lcyenda más adelante. Obsérvese que la sustitución del residuo humano de aminoácidos E en la posición 138 de la proteína del ROR1 humano con el residuo de aminoácidos T de ratón en la posición 138 anula la unión a DIO.

La figura 8, muestra el mapeó de epítopes para el anticuerpo 4A5 del RORl anti-humano. La proteína del ROR1 de ratón o humano tiene los residuos de aminoácidos diferentes en las posiciones de los aminoácidos 88, 105, 109 ó 111; la proteína del RORl humano tiene los residuos de los aminoácidos T, L, S, o I en estas posiciones, mientras que la proteína del ROR1 de ratón tiene los residuos de aminoácidos S, I, A, o N en las posiciones de los aminoácidos 88, 105, 109, ó 111, respectivamente. Se generaron proteínas recombinantes del ROR1 humano que tienen el residuo de aminoácidos de ratón o humano en estas posiciones únicamente. Estas proteínas recombinantes se separaron en gel de pliacrilamida sin desnaturalizar y luego se transfirieron sobre nilón, que se comprobó con el mAb 4A5. Como se puede observar en la figura, 4A5 podrían unirse a las proteínas reco binantes 1, 2, 3, ó 5, pero no a 4. La proteína recombinante 4 es la proteína del R0R1 humano aunque con el residuo de aminoácidos N de ratón en la posición 111 en lugar del residuo de aminoácido I, que se encontró en la proteína del ROR1 humano.

Las figuras 9A, 9B, 9C, 9D, 9E, 9F, 9G, 9H, 91, 9J, 9K, demuestra que el anticuerpo DIO del ROR1 anti-humano inhibe la metástasis de las células cancerosas de mama. Figuras 9A, 9B. El anticuerpo monoclonal DIO facilita la internalización del receptor del ROR1. Figura 9C. A las 24 horas, el anticuerpo DIO del anti-cuerpo anti-RORl disminuye la expresión superficial del ROR1 en células MDA-MB-231. Figura 9D. ROR1 forma un complejo con Vimentin en las células MDA-MB-231 de cáncer de mama. Figura 9E. El tratamiento con anticuerpo DIO in vitro podría disminuir la expresión de Vimentin. Figura 9F. Los anticuerpos del ROR1 anti-humano disminuyen la migración del cáncer de mama in vitro. Figura 9G. El anticuerpo monoclonal DIO inhibe la metástasis pulmonar en etapa temprana del cáncer de mama MDA-MB-231 (día 2). Figura 9H. El anticuerpo monoclonal DIO inhibe la metástasis pulmonar del cáncer de mama MDA-MB-231. Figura 91. los ratones representativos inyectados con las células 5E5 MDA-MB-231 se muestran en la posición dorsal. Figura 9J. El tratamiento con anticuerpo del RORl anti-humano reduce el peso pulmonar del pulmón de ratones que portan MDA-MB-231. Figura 9K. Histología H&E pulmonar representativa de ratones que portan MDA-MB-231 después del tratamiento con el anticuerpo anti-RORl. Las barras de error indican el SEM; *p<0.05, **p<0.01; con base en prueba t de student bilateral no pareada.

La figura 10, representa los anticuerpos de alta afinidad generados contra el epítope del RORl reconocidos por los mAb DIO, 99451, 99961, ó 99221. La proteína del RORl de ratón o humano tienen los residuos de aminoácidos diferentes en las posiciones de los aminoácidos 138, 142, ó 160; la proteína del RORl humano tiene los residuos de los aminoácidos E, S, o Y, en estas posiciones, mientras que la proteína del RORl de ratón tiene los residuos de los aminoácido K, T, o S en las posiciones de los aminoácidos 138, 142 ó 160, respectivamente. Se generaron proteínas del R0R1 humano recombinante que tienen el residuo de aminoácidos ya sea de ratón o de humano en estas posiciones únicamente. Las proteínas recombinantes se separaron en gel de poliacrilamida sin desnaturalizar y luego se transfirieron sobre nilón que se comprobó con cada uno de los tres mAb, 99451, 99961 ó 99221, como se indica en el margen izquierdo. Como se puede observar en esta figura, cada uno de estos anticuerpos reacciona con las proteínas recombinantes 2, 4, 5, y 8, pero no con 2, 3, 6 ó 7, que se describe en la lcyenda más adelante. Obsérvese que la sustitución del residuo de aminoácidos humano E en la posición 138 de la proteína del ROR1 humano con el residuo de aminoácidos T de ratón en la posición 138 anula la unión de ya sea 99451, 99961 ó 99221.

La figura 11, representa la actividad de unión de los anticuerpos DIO ó 99961 para la proteína del ROR1 tipo silvestre o recombinante. Los vectores que codifican para la proteína del ROR1 humano o quimérico se transíectaron en 293 células. Esto permite la producción de la proteína del ROR1 recombinante de humano-ratón quimérico que luego se podría dimensionar por separado en un gel PAGE sin desnaturalizar (a la derecha) o gel SDS-PAGE (a la izquierda) para análisis de inmuno-transferencia con un diferente mAb anti-RORl. Los resultados indican que los anticuerpos tanto DIO como 99961 se unen a la misma región, en el término C del dominio similar a Ig, y que DIO y 99961 se pueden unir al ROR1 bajo condiciones tanto desnaturalizadas como naturales. Obsérvese que DIO y 99961 se unen a todas las proteínas recombinantes excepto para 13. La proteína quimérica #13 es como se describe en la figura 6. El dominio extracelular humano completo se proporciona en el extremo izquierdo de cualquier gel.

Las figuras 12A, 12B, 12C, muestran la caracterización del anticuerpo 99961 del ROR1 anti-humano. Figuras 12A y 12B. El anticuerpo 99961 fue capaz de bloquear el injerto CLL en ratones transgénicos. Figura 12C. El anticuerpo 99961 tiene una afinidad de unión aproximadamente 50x mayor que el anticuerpo DIO.

Las figuras 13A, 13B y 13C, muestran la actividad específica de 99961 contra las células CLL en ratones inmuno-deficiencia de sangre umbilical reconstituida. Figura 13A. El anticuerpo 99961 elimina el >90% de las células CLL. Figuras 13B y 13C. El anticuerpo 99961 no tuvo efecto sobre el desarrollo normal de células B o T.

Las figuras 14A, 14B y 14C, muestran la actividad específica de 99961 en AML primario del R0R+.

La figura 15, muestra que el epítope reconocido por 99961 no se expresa por las células madre o progenitoras hematopoyéticas normales.

La figura 16, muestra que 99961 no realiza una reacción cruzada con el tejido normal de adulto.

Las figuras 17A y 17B, muestran estudios PK sobre 99961 en ratones inmuno-deficientes.

La figura 18, ilustra el diseño de la vacuna peptidica del R0R1. Estos epitopes diferentes de anticuerpos se utilizaron para producir los péptidos A19, R22 y K19. Sobre las barras que corresponden al RORl ya sea de humano (parte superior) o de ratón (parte inferior), las barras se marcan con A19, R22, o K19. Estas barras describen la ubicación de los péptidos, A19, R22, o K19 en el dominio extracelular del RORl.

La figura 19, muestra el método utilizado para conjugar KLH con los péptidos.

La figura 20, muestra el diseño peptidico del péptido R22. Se agregó una cisteina a la C-terminal del péptido que se utilizará para conjugar para KLH.

La figura 21, muestra que DIO y 99961 se unen al péptido R22 mientras que 4A5 no lo hace.

La figura 22, muestra el esquema de inmunización para la inmunización con R22 de ratones BALB/c.

La figura 23, muestra el análisis de inmuno- transferencia del epítope en el cual el R22 indujo la unión de los anticuerpos del R0R1 sobre el R0R1.

La figura 24, muestra el esquema de inmunización para R22-KLH en ratones C57BL/6.

La figura 25, muestra el análisis FACS de las células cancerosas de mama MDA-MB-231 RORl-positivas que se habían incubado con el antisuero anti-R22-KLH a 4°C o 37°C durante 1 h y luego se contra-tiñeron con el anticuerpo con las marcas isotipo-control-Alexa647, o el conjugado 4A5-Alexa647 durante 30 min sobre hielo antes del análisis FACS de la expresión del ROR1. Los resultados mostraron que los sueros anti-RORl provenientes de ratones transgénicos indujeron la internalización del receptor ROR1 a 37°C, pero no a 4°C.

Las figura 26A y 26B, muestran los sueros anti-RORl provenientes de ratones transgénicos inmunizados con R22-KLH que inhiben la migración de cáncer de mama in vi tro.

La figura 27, muestra el esquema de inmunización para R-22-KLH en ratones de C57BL/6.

La figura 28, muestra las curvas de titulación de los antisueros de ratones inmunizados con los conjugados KLH de cualquiera de los tres péptidos descrito en la figura 18. Se representa la unión de antisueros con placas de poliestireno recubiertas con la proteína del ROR1 humano según se evalúa mediante ELISA.

La figura 29, muestra el análisis FACS de células EW36, JeKo-1, o CLL. Para este estudio, se incubó con las células una dilución de antisueros provenientes de ratones inmunizados con R22-KLH durante 20 minutos a 4 grados C. Las células luego se lavaron y se marcaron con un Ig anti-ratón de cabra que se conjugó con un fluorocromo para detección mediante citometría de flujo. Los histogramas abiertos son las células teñidas con el Ig anti-ratón de cabra sin incubar primero las células con los antisueros R22-KLH. Los histogramas sombreados son la fluorescencia de las células que se incubaron primero con los antisueros anti-R22-KLH. El aumento de fluorescencia de las células es debido a los anticuerpos anti-RORl de ratón unidos a la superficie, que luego se detectaron con el Ig anti-ratón de cabra. Los antisueros de pre-inmunización de estos ratones o los antisueros de ratones inmunizados con KLH no se unieron a estas células.

La figura 30, las células indicadas en la lcyenda se lavaron y se colocaron en placas a 25 ml con 5><105 células por pocilio en RPMI/10% de FBS en placas de 96 pocilios de fondo redondo (Corning Costar). Los antisueros diluidos (25 ml) y 25 m? de una dilución 1:5 de complemento de conejo bebé se agregaron por pocilio. El mAb DIO se utilizó como un control positivo. Todas las condiciones se realizaron por triplicado. Las placas se incubaron durante 4 h a 37°C, y las células se cuantificaron inmediatamente para la viabilidad mediante la tinción con DÍ0C6/PI y Análisis por Citometría de Flujo. Este estudio indica que ya sea DIO o los antisueros generados contra el péptido R22-KLH podrían dirigir la lisis mediada complementaria directa de las células que portan el R0R1 humano. Las células que no portan el R0R1 no se exterminaron (no mostradas).

La figura 31, muestra el primer esquema de inmunización con R22-KLH para ratones C57BL/6. Este péptido se conjugó con hemocianina de lapa californiana (KLH) y luego se utilizó para inmunizar a ratones C57BL/6 de acuerdo con el esquema ilustrado anteriormente. La primera inyección de KLH o R22-KLH fue el adyuvante completo de Freund (CFA). La segunda y posteriores inyecciones fueron el adyuvante incompleto de Freund (IFA). Los animales se sangraron en los días marcados con la flecha púrpura.44 días después del día de la primera inyección, los ratones C57BL/6 se inocularon con CLL que expresa el ROR1 humano que se originó en un ratón C57BL/6 transgénico con R0R1 humano que también fue transgénico para la leucemia de células T 1-(gen TCL1), también bajo el control de un promotor/intensificador específico de células B (E-Om). Esta leucemia se asemeja a la CLL humana y expresa el ROR1 superficial humano.

Las figuras 32A y 32B, muestra los resultados de inmunización con R22-KLH. Figura 32A. Un bazo representativo proveniente de ratones inmunizados con KLH contra un ratón inmunizado con R22-KLH. Figura 32B. Inhibición del injerto de ROR1+ CLL mediante la inmunización con el péptido del ROR1 R22-KLH en ratones C57BL/6.

La figura 33, muestra el segundo esquema de inmunización para el R22-KLH en ratones C57BL/6.

Las figuras 34A y 34B, muestran los resultados de la inmunización con el péptido R22. Figura 34A. Bazos provenientes de un ratón inmunizado con KLH y un ratón inmunizados con R22-KLH. Figura 34B. Inhibición del injerto de ROR1+ CLL después de la inmunización con R22-KLH en ratones C57BL/6.

La figura 35, son análisis FACS de esplenocitos provenientes de ratones C57BL/6 inmunizados con ya sea KLH (flecha superior) o R22-KLH (flecha inferior), utilizando un mAb flurocromo-conjugado especifico para B220 (eje y) o ROR1 (eje x). El mAb utilizado para teñir la célula se une a un epitope sin bloqueo cruzado de ROR1 distinto de los anticuerpos inducidos por R22-KLH. El recuadro traza el área en la cual se detectan las células de leucemia. Obsérvese que hay muy pocas, si no es que ninguna, células de leucemia en los bazos de ratones inmunizados con la vacuna R22-KLH.

La figura 36, son análisis FACS de R0R1 sobre las células ROR1 + CLL lo cual indica que el R0R1 se sub-moduló después de la inmunización con R22-KLH en ratones C57BL/6.

Las figuras 37A y 37B, son análisis de FACS de células T CD8+ presentes en ratones que se inmunizaron con KLH o R22-KLH. Figura 37A. La inmunización con R22 provoca un aumento en el número de células T CD8+ que estuvo ausente en los ratones inmunizaron con KLH. El panel inferior muestra el porcentaje de células T CD8+ provenientes de los bazos de ratones inmunizados primero 75 dias antes con ya sea KLH, o R22-KLH.

La figura 38, muestras el esquema de inmunización para la inmunización con R22-KLH de ratones transgénico con el ROR1.

La figura 39, son análisis FACS de la inhibición del injerto de ROR+ CLL mediante la inmunización con el péptido R22 del ROR1 en ratones RORl-Tg.

La figura 40, muestra los resultados de la inmunización con R22-KLH en ratones transgénicos con el ROR1. ROR1+ CLL se inhibió después de la inmunización con R22-KLH en ratones transgénicos con el ROR1.

La figura 41, son análisis FACS de RORl sobre las células ROR1+ CLL lo cual indica que el RORl se sub-moduló después de la inmunización con R22-KLH en ratones transgénicos con el ROR1.

Las figura 42A y 42B, son análisis FACS de linfocitos CD3+ T presentes en ratones con el RORl-Tg que se inmunizaron con KLH o R22-KLH. La figura 42A, muestra que la inmunización con R22-KLH provocó una proliferación de linfocitos T. La figura 42B, muestra el porcentaje de linfocitos CD3+ T recolectados de los bazos de los ratones en día 75.

Las figuras 43A y 43B, son análisis FACS de células CD4+ T presentes en ratones que se inmunizaron con KLH o R22-KLH. La figura 43A muestra que la inmunización con R22-KLH provoca un aumento en el número de células CD4+ T que no se detectaron en ratones inmunizados con KLH. La figura 43B. Muestra el porcentaje de células CD4+ T recolectadas a partir de los bazos de ratones en el día 75.

Las figuras 44A y 44B, son análisis FACS de células T CD8+ presentes en ratones que se inmunizaron con KLH o R22-KLH . La figura 44A muestra que la inmunización con R22-KLH provoca un aumento en el número de células T CD8+ que no se detectaron en los ratones inmunizados con KLH. La figura 44B. Muestra el porcentaje de células T CD8+ recolectadas a partir de los bazos de ratones en el dia 75.

Las figuras 45A, 45B y 45C, muestran que el alto nivel de expresión del ROR1 en cáncer de mama está asociado con la supervivencia sin metástasis de pulmón más corto, hueso y cerebro. La gráfica se derivó de los datos publicados disponible a través de la base de datos PubMed GEO (GSE2603, GSE5327, GSE2034, y GSE12276). Las curvas Kaplan-Meier representan el impacto predictivo de la expresión del ROR1 en la (figura 45A) supervivencia sin metástasis pulmonar, (figura 45B) supervivencia sin metástasis ósea, o (figura 45C) supervivencia sin metástasis del cerebro. Para cada análisis, 582 casos se segregaron en tres grupos iguales con el grupo designado ROR1H que representa un tercio de los pacientes que tuvieron tumores con los mayores niveles de ARNm del RORl, y el grupo designado ROR1L que representa un tercio de pacientes que tuvieron cánceres con los menores niveles del ARNm del RORl. El tercio de pacientes que tuvieron tumores con una expresión intermedia del ARNm del RORl se designó como ROR1M. La supervivencia sin metástasis se determinó mediante análisis Kaplan-Meier, y se determinaron diferencias estadísticas mediante una prueba de rango logarítmico. En las tablas integradas se muestran el número de pacientes en cada categoría, los casos metastásicos totales, y los valores P correspondientes (prueba chi- cuadrado).

Las figuras 46A, 46B, 46C, 46D, 46E, 46F y 46G, muestran que el alto nivel de expresión del R0R1 en cáncer de mama está asociado con supervivencia sin metástasis más corta, y es independiente de su estado ER, PR y HER2. El cohorte de 582 pacientes con adenocarcinoma de pecho se incluyeron en los análisis de supervivencia. (Figura 46A) Comparación de los niveles de la expresión del ARNm del R0R1 de las células malignas de pacientes con cáncer de mama ERNeg (n = 242) y ER+ (n = 325) (panel izquierdo), pacientes con cáncer de mama PRNeg (n = 274) y PR+ (n = 271) (panel central), y pacientes con cáncer de mama HER2Neg (n = 404) y HER2+ (n = 106) (panel derecho). Los resultados son la media ± SEM. El valor p se determinó mediante prueba t de Student. (Figura 46B) Impacto predictivo del estado ER sobre la supervivencia sin metástasis general (P = 0.13 mediante la prueba de rango logarítmico). (Figura 46C) Impacto predictivo del estado ER y la expresión de ARNm del R0R1 sobre la supervivencia sin metástasis general (P 0.0001 mediante la prueba de rango logarítmico). (Figura 46D) Estado PR sobre la supervivencia sin metástasis general (P = 0.0007 mediante la prueba de rango logarítmico). (Figura 46E) Impacto predictivo del estado PR y la expresión de ARNm del ROR1 sobre la supervivencia sin metástasis general (P<0.0001 mediante la prueba de rango logarítmico). (Figura 46F) Estado HER2 sobre la supervivencia sin metástasis general (P = 0.16 mediante la prueba de rango logarítmico). (Figura 46G) Impacto predictivo del estado HER2 y la expresión de ARNm del R0R1 sobre la supervivencia sin metástasis general (P O.OOOl mediante la prueba de rango logarítmico).

Las figuras 47A y 47B, muestra que la expresión del R0R1 mediante líneas celulares de cáncer de mama está asociada con las características de EMT. (Figura 47A) Inmuno-transferencias de U sados provenientes de MDA-MB-231 transíectados con CTRL-shRNA o RORl-shRNA se cmprobron con los anticuerpos específico para ROR1 (parte superior) o b-actina (parte inferior) como se indica a la izquierda. (Figura 47B) Cantidad media de VIM y KRT19 (± SEM), según se detecta mediante qRT-PCR en muestras por triplicado. Los datos se muestran como la media ± SEM; *P<0.05, **P<0.01, en comparación con el grupo CTRL-shRNA.

Las figuras 48A, 48B, 48C, muestran que la lentif icación del ROR1 reduce la expresión de CXCR4. (Figura 48A) Histogramas que indican la cantidad del ARNm de CXCR4 detectado vía qRT-PCR en muestras por triplicado de MDA-MB-231 transfectado con ya sea CTRL-shRNA2 o RORl-shRNA2, según se indica en la parte inferior de cada histograma. (Figura 48B) Histogramas por fluorescencia de citometría de flujo representativos de RORl-shRNA2 (histograma abierto con línea verde) o CTRL-shRNA2 (histograma abierto con línea azul) células MDA-MB-231 transducidas teñidas con el mAb anti- CXCR4-APC o el mAb de control isotipico (histogramas sombreados), respectivamente. (Figura 48C) las células se sembraron en la parte superior de cámaras de trans-pocillos sin BD MatrigelTM para examinar la quimiotaxis para CXCL12 que se agregó a una concentración final de 200 ng/ml a las cámaras inferiores. Las células que migraron después de seis horas a 37°C se numeraron bajo un aumento lOx. Cada uno de los histogramas proporciona los números de células migradas a en cada una de las tres cámaras sembradas con células MDA-MB-231 transíectadas ya sea con CNTL-shRNA o RORl-shRNA, como se indica en la parte inferior del histograma. Los resultados son representativos de 3 experimentos independientes. Los datos se muestran como la media ± SEM; *P<0.05, **P<0.01, ***p<0.001, en comparación con el grupo CTRL-shRNA.

Las figuras 49A, 49B y 49C, muestran que la lentificación del ROR1 regula la expresión de los genes EMT. Los histogramas que indican la cantidad relativa del ARNm de genes de variedad, según se indica en la parte inferior de cada histograma, detectados vía qRT-PCR en muestras por triplicado de MDA-MB-231 (figura 49A), HS578T (figura 49B), y BT549 (figura 49C) transíectados con ya sea CTRL-siRNA o RORl-siRNA. Los resultados son representativos de 2 experimentos independientes. Los datos se muestran como la media ± SEM; *P<0.05, **P<0.01, en comparación con el grupo CTRL-siRNA.

Las figuras 50A, 50B y 50C, muestran que la lentificación del RORl provoca una modesta inhibición de crecimiento tardío de los xenoinjertos ortotópicos en el sitio de inyección pero una fuerte inhibición de las metástasis pulmonares experimentales. (Figura 50A) a los ratones RAG-/-yc-/- se les suministraron inyecciones subcutáneas (s.c.) o intravenosas (i.v.) de MDA-MB-231 transfectado con CTRL-shRNA o transfectado con RORl-shRNA. El flujo fotónico de bioluminiscencia del tumor primario en la almohadilla plana mamaria inyectada o del pulmón de cada ratón se normalizó contra el flujo fotónico detectado para la primera medición después de la inyección del tumor (100 representa el 100% del flujo fotónico detectado en el día de la medición inicial) (paneles superiores). Las tres gráficas superiores representan el flujo fotónico de bioluminiscencia normalizado de las almohadillas planas mamarias de ratones a los que se les administraron inyecciones s.c. de 1*106 (izquierda), 5*105 (central), o 2.5><105 (derecha) células indicadas. Las gráficas inferiores proporcionan el flujo fotónico de bioluminiscencia normalizado del pulmón de ratones a los que se les administró inyecciones i.v. de 1*106 (izquierda), 5c105 (central), o 2.5><105 (derecha) células indicadas. (Observación: la gráfica izquierda inferior representa el flujo fotónico de bioluminiscencia medio real de los pulmones de ratones a los que se les administraron inyecciones i.v. de 1><106 células indicadas. (Figura 50B) Los histogramas representan el indice de peso del pulmón para los ratones de cada grupo en d21 (n=5-8) inyectados i.v. con MDA-MB-231 transfectado con CTRL-shRNA (negro) o transfectado con RORl-shRNA (gris) o sin célula (blanco). Los valores P se determinaron mediante ANOVA unidireccional. (Figura 50C) las secciones teñidas con H&E del pulmón representativas de los ratones provenientes de cada grupo en d21. Los datos se muestran como la media ± SEM *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, en comparación con el grupo CTRL-shRNA.

Las figuras 51A y 51B, muestran la inmunohistoquímica de los focos metastásicos experimentales. A los ratones RAG-/-yc-/- se les administraron inyecciones intravenosas (i.v.) de 5xl03 MDA-MB-231 transfectado con CTRL-shRNA (paneles superiores) o transfectado con RORl-shRNA (paneles inferiores). (Figura 51A) las secciones del pulmón se separaron de los animales sacrificados en el día 21. Los pulmones de los ratones inyectados con células transíectadas con RORl-shRNA tuvieron pocos focos metastásicos, los cuales se identificaron para análisis de inmunohistoquímica. Las secciones se tiñeron con los mAb específicos para el marcado de corte extremo con Ki67+, CK-19, o Vimentin, o desoxinucleotidiltransferasa dUTP terminal (Tunnel). (Aumento 40x). (Figura 51B) Secciones del pulmón como en (s) se tiñeron con el mAb especifico para fosfo-AKT (panel izquierdo) o fosfo-CREB (panel derecho) (aumento 40x).

Las figuras 52A, 52B, 52C, 52D, 52E, 52F, 52G, 52H, 521, 52J y 52K, muestran que la lentificación del R0R1 reduce la metástasis pulmonar y la metástasis ósea de las lineas celulares LM2-4175 y BoM-1833 in vivo derivadas de MDA-MB-231. (Figura 52A) Diagrama esquemático que muestra que las células LM2-4175 de preferencia realizan la metástasis para el pulmón y las células BoM-1833 de preferencia realizan la metástasis para el hueso. Análisis de citometria de flujo que muestran la expresión del ROR1 en LM2-4175 y BoM-1833. Los dibujos de ratón se modifican a partir de la referencia (célula cancerosa, 2009; 1; 67-78) (figuras 52B y52C) Análisis de citometria de flujo que muestran la eficiencia de la lentificación del ROR1 en LM2-4175 y BoM-1833, utilizando RORl-shRNA2 . (Figura 52D) A cada uno de los ratones se le administró una inyección i.v. de 2xl05 células LM2-4175 transíectadas con CTRL-shRNA o transfectadas con RORl-shRNA. Izquierda, imágenes representativas de bioluminiscencia de cada grupo; Derecha, normalizadas en flujo fotónico de pulmón in vivo de cada grupo. (Figura 52E) curvas de supervivencia Kaplan-Meier de ratones inyectados i.v. con 2xl05 células LM2-4175 indicadas (P<0.0001 prueba de rango logarítmico). (Figura 52F) El índice de peso del pulmón de cada grupo en d21 (parte inferior). Fotos representativas de los pulmones de cada grupo (parte superior). (Figura 52G) El flujo fotónico GFP de pulmón ex vivo de cada grupo en d21 (parte inferior). Fotos representativas de los huesos de cada grupo (parte superior). (Figura 52H) Secciones histologías representativas teñidas con H&E del pulmón en d21. (Figura 521) A cada uno de los ratones se les administró una inyección i.c. de lxlO5 células BoM-1833 transíectadas con CTRL-shRNA o transíectadas con RORl-shRNA. Parte superior, imágenes representativas de bioluminiscencia de cada grupo; parte inferior, flujo fotónico normalizado de hueso in vivo de cada grupo. (Figura 52J) flujo fotónico representativo ex vivo del hueso y secciones histológicas teñidas con H&E del hueso en d21. (Figura 52K) flujo fotónico representativo ex vivo de hígado y secciones histológicas teñidas con H&E del hígado en d21. Los datos se muestran como la media ± SEM; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, en comparación con el grupo CTRL-shRNA.

La figura 53, muestra que la lentificación del RORl inhibe la migración de HS-578T y BT549 in vítro. Los datos se muestran como la media ± SEM *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 en comparación con las células tratadas con IgG control.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el descubrimiento fundamental de composiciones y métodos para inhibir la metástasis utilizando anticuerpos anti-RORl o fragmentos de unión a antigenos del mismo, inmuno-conjugados de anticuerpos del RORl, vacunas peptidicas del ROR1 o péptidos de unión con el RORl.

Antes de describir las presentes composiciones y métodos, se debe entender que esta invención no se limita a las composiciones particulares, métodos, y condiciones descritos, ya que estas composiciones, métodos, y condiciones pueden variar. También se debe entender que la terminología utilizada en la presente tiene el fin de describir únicamente modalidades particulares, y no pretender ser limitante,·ya que el alcance de la presente invención se limitará únicamente por las reivindicaciones anexas.

En el sentido en el que se utiliza en esta especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "uno", "una", y "el", incluyen referencias al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta forma, por ejemplo, las referencias a "el método" incluyen uno o más métodos, y/o pasos del tipo descrito en la presente que se harán evidentes para aquellos expertos en la téenica con la lectura de esta descripción, etc.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien con experiencia normal en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar en la práctica o prueba de la invención cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente, ahora se describirán los métodos y materiales preferidos .

RORl Los solicitantes han descubierto con anterioridad la expresión del RORl de longitud total en muchas líneas y muestras de células cancerosas, aunque no otros tejidos, incluyendo la sangre o linfocitos esplénicos de pacientes que no son leucémicos o donadores adultos normales, y también generaron anti-sueros de ratón contra el RORl humano de longitud completa. Fukuda et al., Blood: ASH Annual Meeting Abstracts 2004 104, Extracto 772 (2004) (incorporado en la presente como referencia en su totalidad). El polipéptido y las secuencias codificantes para el RORl se han reportado en otro sitio y también se incorporan en la presente como referencia (véanse, por ejemplo, los Nos. de acceso NP_005003.1 y NM_005012.1). Las células cancerosas que expresan la proteina Wnt5a, tales como las células CLL, no sólo se unen al RORl sino que tienen una ventaja de supervivencia conferida como una consecuencia. La invención por lo tanto proporciona los medios para utilizar la especificidad de la expresión de ROR-1 en células cancerosas para tratar o prevenir el cáncer.

Se ha mostrado que la expresión de RORl intensifica la resistencia a la apoptosis y estimula el crecimiento de células cancerosas. Como se muestra en los ejemplos, la expresión del RORl se asocia con la transición epitelial-mesenquimal (EMT) que se presenta durante la embriogénesis y la metástasis del cáncer. El alto nivel de expresión del RORl se asocia con las tazas aumentadas de recaídas y metástasis en pacientes con adenocarcinoma de mama. La lentificación del RORl en la expresión atenuada de líneas celulares de cáncer de mama propensas a metástasis de las proteínas asociadas con EMT (por ejemplo Vimentin, Snail-1/2, y ZEB), mejora la expresión de las citoqueratinas epiteliales y las proteínas de conexiones estrecha (por ejemplo CK-19 y ZO-1), y afectan su capacidad de migración/invasión y el potencial metastásico. El tratamiento de MDA-MB-231 con DIO, un mAb especifico para ROR1, sub-modula la Vimentin (que se asocia con el ROR1) para inhibir la migración de células cancerosas. La administración de DIO a ratones inmunodeficientes injertados con MDA-MB-231 inhibe significativamente la metástasis tumoral.

Anticuerpos Ciertas modalidades comprenden los inmunopéptidos dirigidos contra la proteina del R0R1 humano. Los péptidos de inmunoglobulina, o los anticuerpos, descritos en la presente se muestran para unirse a la proteina del R0R1. La actividad de unión al ROR1 es especifica; la unión observada del anticuerpo al R0R1 no se bloquea sustancialmente por reactivos no específicos. Estos anticuerpos específicos de R0R1 se pueden utilizar para diferenciar entre las células del RORl y las células normales. Los anticuerpos específicos del RORl también se pueden utilizar en inmunoterapia contra un cáncer de RORl, para determinar la respuesta después de la terapia para un cáncer de ROR-1 y para inhibir la metástasis. Estos inmunopéptidos se pueden conseguir en una variedad de medios conocidos en la téenica.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término anticuerpo abarca todos los tipos de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, policlonales, monoclonales, y aquellos producidos mediante la metodología de exhibición de fagos. Los anticuerpos particularmente preferidos de la invención son anticuerpos que tienen un grado relativamente alto de afinidad para el RORl. En ciertas modalidades, los anticuerpos exhiben una afinidad para el RORl de aproximadamente Kd <108 M.

Sustancialmente purificada en general se refiere a una composición que está esencialmente libre de otros componentes celulares con los cuales están asociados los anticuerpos en un entorno no purificado, por ejemplo, en estado natural. El anticuerpo purificado en general está en un estado homogéneo, aunque puede estar ya sea en un estado seco o en una solución acuosa. La pureza y homogeneidad típicamente se determinan utilizando téenicas de química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alta resolución.

El anticuerpo ROR-1 específico sustancialmente purificado por lo general comprenderá no más del 80% de todas las especies macromoleculares presentes en una preparación antes de la mezcla o formulación del anticuerpo con un portador, excipiente, adyuvante, tampón, farmacéutico, un agente para intensificar la absorción, un estabilizante, un conservador, un adyuvante u otro co-ingrediente. Más típicamente, el anticuerpo se purifica para que represente más del 90% de todas las proteínas presentes en una preparación purificada. En modalidades especificas, el anticuerpo se purifica para tener más del 95% de pureza o puede ser esencialmente homogéneo, en donde no son detectables mediante téenicas convencionales otras especies macromoleculares .

Los péptidos de inmunoglobulina incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, y fragmentos de anticuerpos. Lo siguiente describe la generación de péptidos de inmunoglobulina, especialmente los anticuerpos del ROR1, vía los métodos gue se puedan utilizar por aquellos expertos en la técnica para producir otros péptidos de inmunoglobulina adecuados que tengan afinidad y especificidad similar que sean funcionalmente equivalentes con aquellos utilizados en los ejemplos.

Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales se pueden generar fácilmente, por alguien con experiencia normal en la técnica a partir de una variedad de animales de sangre caliente tales como caballos, vacas, diversas aves de corral, conejos, ratones, o ratas. En resumen, el antigeno de ROR1 se utiliza para inmunizar al animal a través de inyecciones intraperitoneales, intramusculares, intraoculares o subcutáneas, con un adyuvante tal como el adyuvante completo o incompleto de Freund. Después de diversas inmunizaciones de refuerzo, las muestras de suero se recolectan y se prueban para reactividad con el R0R1. Los antisueros policlonales particularmente preferidos proporcionarán una señal sobre uno de estos análisis que es al menos tres veces mayor que el antecedente. Una vez que el título del animal haya alcanzado un tope en los términos de su reactividad para el R0R1, se pueden obtener fácilmente mayores cantidades de antisueros ya sea mediante sangrados semanales o mediante desangrado del animal .

Anticuerpos Monoclonales La teenología de anticuerpos monoclonales (mAb) se puede utilizar para obtener los mAb para el RORl. En resumen, los hibridomas se producen utilizando células de bazo provenientes de ratones inmunizados con antígenos del RORl humano. Las células de bazo de cada ratón inmunizado se fusionan con células Sp 2/0 de mieloma de ratón, por ejemplo utilizando el método de fusión con polietilenglicol Galfre, G. y Milstein, C., Methods Enzymol., 73:3-46 (1981). El crecimiento de hibridomas, la selección en medio HAT, la clonación y selección de clones contra los antígenos se llevaron a cabo utilizando metodología estándar (Galfre, G. and Milstein, C., Methods Enzymol., 73:3-46 (1981)).

Los clones seleccionados mediante HAT se inyectan en ratones para producir grandes cantidades de mAb en ascitis como se describe por Galfre, G. and Milstein, C., Methods Enzymol., 73:3-46 (1981), que se pueden purificar utilizando cromatografía en columna de la proteína A (BioRad, Hercules, Calif.). Los mAb se seleccionan en base a su (a) especificidad para el ROR-1, (b) la alta afinidad de unión, (c) el isotipo, y (d) la estabilidad.

Los mAb se pueden seleccionar o probar para la especificidad del ROR1 utilizando cualquiera de una variedad de téenicas estándar, entre las que se incluyen Transferencia Western (Koren, E. et al., Biochim. Biophys. Acta 876:91-100 (1986)) y el ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima (ELISA) (Koren, E. et al., Biochim. Biophys. Acta 876:91-100 (1986)).

Anticuerpos humanizados Las formas humanizadas de anticuerpos de ratón se pueden generar al enlazar las regiones CDR de anticuerpos no humanos con las regiones constantes humanas mediante de técnicas de ARN recombinante (véase, por ejemplo, Queen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989 y WO 90/07861, cada uno incorporado como referencia). Los anticuerpos humanos se pueden obtener utilizando métodos para exhibición de fagos (véase, por ejemplo, Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al., WO 92/01047). En estos métodos, se producen bibliotecas de fagos en los cuales los miembros exhiben diferentes anticuerpos en sus superficies externas. Los anticuerpos por lo general se exhiben como fragmentos de Fv o Fab. Los anticuerpos para exhibición de fagos con una especificidad deseada se pueden seleccionar mediante enriquecimiento de afinidad.

Fragmentos de anticuerpos Puede ser conveniente producir y utilizar fragmentos funcionales de un mAb para una aplicación particular. La estructura básica bien conocida de una molécula típica de IgG es una molécula Y-configurada tetramérica simétrica de aproximadamente 150,000 hasta 200,000 daltons que consiste de dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas (que contienen aproximadamente 220 aminoácidos) y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas (que contienen aproximadamente 440 aminoácidos). Las cadenas pesadas están enlazadas entre si a través de al menos un enlace disulfuro. Cada cadena ligera está enlazada a una cadena pesada contigua mediante un enlace disulfuro. Un sitio o dominio de unión a antígenos está ubicado en cada ramificación de la molécula del anticuerpo con forma de Y y esta formado entre las regiones amino-terminales de cada par de cadenas ligeras y pesadas enlazadas con disulfuro. Estas regiones amino-terminales de las cadenas ligeras y pesadas consiste de aproximadamente sus primeros 110 aminoácidos amino-terminales y se conocen como las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas.

Además, dentro de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas se encuentran regiones hipervariables que consisten de tramos de secuencias de aminoácidos, conocidos como regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las CDR son responsables de la especificidad del anticuerpo para un sitio particular único o una molécula antigénica denominada un epitope. De esta forma, la molécula IgG típica es divalente ya que se puede unir a dos moléculas antigénicas debido a que cada sitio de unión a antígenos es capaz de unirse al epitope específico de cada molécula antigénica. Las regiones carboxi terminales de las cadenas ligera y pesada son similares o idénticas a aquellas de otras moléculas de anticuerpos y se denominan regiones constantes. La secuencia de aminoácidos de la región constante de las cadenas pesadas de un anticuerpo particular define la clase de anticuerpo que es, por ejemplo, IgG, IgD, IgE, IgA o IgM. Algunas clases de anticuerpos contienen dos o más anticuerpos idénticos asociados entre si en disposiciones multivalentes de unión a antigenos.

Los fragmentos Fab y de F(ab')2 de los mAb que se unen al ROR-1 se pueden utilizar en lugar de los mAb completos. Debido a que los fragmentos Fab y F(ab')2 son más pequeños que las moléculas del anticuerpo intacto, están disponibles más dominios de unión a antigenos que cuando se utilizan moléculas de anticuerpos completos. La segmentación proteolítica de una molécula típica de IgG con papaína se sabe que produce dos fragmentos de unión a antígenos separados denominados fragmentos Fab que contienen una cadena ligera intacta enlazada a una porción amino terminal de la cadena pesada contigua vía un enlace disulfuro. La porción restante de la molécula de inmunoglobina digerida con papaína se conoce como el fragmento Fe y consiste de las porciones carboxi-terminales del anticuerpo que quedó intacto y se enlazó conjuntamente vía enlaces disulfuro. Si un anticuerpo se digiere con pepsina, se produce un fragmento conocido como un fragmento F(ab')2 que carece de la región Fe pero contiene ambos dominios de unión a antígenos mantenidos conjuntamente mediante enlaces disulfuro entre las cadenas ligeras y pesadas contiguas (como fragmentos Fab) y también los enlaces disulfuro entre las porciones restantes de las cadenas pesadas contiguas (Handbook of Experimental Immunology. Vol 1: Immunochemistry, Weir, D. M., Editor, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1986·)).

Se han desarrollado métodos de ADN recombinante que permiten la producción y selección de péptidos de inmunoglobulina recombinante que son polipéptidos de unión a antigeno de cadena individual conocidos como fragmentos Fv de cadena individual (ScFv o anticuerpos ScFv). Además, los ScFv se pueden dimerizar para producir un diacuerpo. Los ScFv se unen a un epitope especifico de interés y se pueden producir utilizando cualquiera de una variedad de métodos basados en bacteriófagos recombinantes, por ejemplo como se describe en Lowman et al. (1991) Biochemistry, 30, 10832-10838; Clackson et al. (1991) Nature 352, 624-628; and Cwirla et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 6378-6382. Estos métodos por lo general se basan en la producción de fagos filamentosos alterados genéticamente, tales como los fagos recombinantes MI3 o fd, que exhiben sobre la superficie de la partícula del fago una proteina de fusión recombinante que contiene el anticuerpo ScFv de unión a antigenos como la región amino-terminal de la proteina de fusión y la proteina g3p con envoltura de fagos menores como la región carboxi-terminal de la proteína de fusión. Estos fagos recombinantes se pueden hacer crecer y aislar fácilmente utilizando métodos bien conocidos de fagos. Además, las partículas del fago intactas por lo general se pueden seleccionar directamente para la presencia (exhibición) de un ScFv de unión a antigenos sobre su superficie sin la necesidad de aislar el ScFv lejos de la partícula del fago.

Para producir un ScFv, se utilizan protocolos de transcriptasa inversa para producir en primer lugar un ADNc a partir de un ARNm aislado de un hibridoma que produce un Ab para dirigirse al antígeno del ROR1. Las moléculas de ADNc que codifican para las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del mAb luego se pueden amplificar mediante una metodología estándar de reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando un conjunto de cebadores para las regiones variables pesadas y ligeras de inmunoglobulina de ratón (Clackson (1991) Nature, 352, 624-628). Los ADNc amplificados que codifican para las regiones variables de cadena pesada y ligera del mAb luego se enlazan con untamente con un oligonucleótido enlazador para generar una molécula de ADN ScFv recombinante. El ADN ScFv se liga en un plásmido de fago filamentoso diseñado para fusionar las secuencias del ADNc amplificado en la región 5' del gen del fago que codifica para la proteína con envoltura menor denominada g3p. Las células bactrianas de Escherichia coli son más que las transformadas con los plásmidos de fagos recombinantes, y se hacen crecer y recolectan fagos filamentosos. Los fagos recombinantes deseados exhiben dominios de unión a antigenos fusionados a la región amino-terminal de la proteina con envoltura menor. Estos "fagos de exhibición" luego se pueden hacer pasar sobre el antigeno inmovilizado, por ejemplo, utilizando el método conocido como "panorámica", véase Parmlcy and Smith (1989) Adv. Exp. Med. Biol.251, 215-218; Cwirla et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 6378-6382, para adsorber aquellas partículas del fago que contienen las proteínas del anticuerpo ScFv que sean capaces de unirse al antígeno. Las partículas de fago de unión a antígenos luego se pueden amplificar mediante métodos de estándar para infección de fagos, y la población amplificada de fagos recombinantes nuevamente se selecciona para la capacidad de unión a antígenos. Estos ciclos sucesivos de selección para la capacidad de unión a antígenos, seguidos por amplificación, seleccionan la capacidad mejorada de unión a antígenos en los fagos exhibidos o recombinantes de los ScFv. La selección para la afinidad aumentada de unión a antígenos se puede realizar al ajustar las condiciones bajo las cuales se lleva a cabo la unión para requerir una actividad de unión más estricta.

Otro método para seleccionar una actividad mejorada de unión a antígeno es alterar las secuencias de nucleótidos dentro del ADNc que codifica para el dominio de unión del ScFv y someter las poblaciones de fagos recombinantes a ciclos sucesivos de selección para la actividad de unión a antígenos y amplificación (véase, Lowman et al. (1991) Biochemistry 30, 10832-10838; and Cwirla et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 6378-6382).

Una vez que se selecciona un ScFv, el anticuerpo del R0R1 recombinante se puede producir en una forma libre utilizando un vector adecuado junto con la cepa HB2151 de E. coli . Estas bacterias realmente secretan el ScFv en una forma soluble, libre de componentes de fagos (Hoogenboom et al. (1991) Nucí. Acids Res. 19, 4133-4137). La purificación del ScFv soluble a partir del medio de cultivo de bacterias HB2151 se puede llevar a cabo mediante cromatografía de afinidad utilizando moléculas antigénicas inmovilizadas en un soporte sólido tal como AFFIGELMR (BioRad, Hercules, Calif.).

Otros desarrollos en la teenología de anticuerpos recombinantes demuestran posibilidades para mejoras adicionales tales como una avidez de unión aumentada mediante la polimerización de los ScFv en dímeros y tetrámeros (véase, Holliger et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 6444- 6448).

Debido a que los ScFv incluso son moléculas más pequeñas que los fragmentos Fab o F(ab')2, los mismos se pueden utilizar para alcanzar densidades incluso mayores de los sitios de unión a antigenos por unidad de área superficial cuando se inmovilizan sobre un material de soporte sólido que utilizando posibles anticuerpos enteros, fragmentos F(ab')2 o Fab. Además, la teenología de anticuerpos recombinantes ofrece una fuente genética más estable de anticuerpos, en comparación con los hibridomas. Los anticuerpos recombinantes también se pueden producir más rápida y económicamente utilizando métodos estándar para producción bacteriófagos.

Los anticuerpos o los fragmentos de unión a antígenos, variantes, o derivados del mismo de la invención, incluyen de manera enunciativa, anticuerpos poiiclonaies, monoclonales, multispecíficios, humanos, humanizados, primatizados, o quiméricos, anticuerpos de cadena individual, fragmentos de unión a epítopes, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab') .sub.2, Fd, Fvs, Fvs de cadena individual (scFv), anticuerpos de cadena individual, Fvs enlazados a dsulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden un dominio ya sea VL o VH, fragmentos producidos mediante una biblioteca de expresión Fab, y anticuerpos anti-idiotipicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id para los anticuerpos del ROR1 descritos en la presente). Las moléculas ScFv se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5,892,019. La inmunoglobulina o las moléculas de anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), clase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) o subclase de la molécula del inmunoglobulina. Los ejemplos de scFv para el ROR1 humano incluyen la SEC ID NO:21, la SEC ID NO:22, la SEC ID NO:23 y la SEC ID NO:24.

Los fragmentos de anticuerpos, incluyendo los anticuerpos de cadena individual, pueden comprender las regiones variables solas o en combinación con la totalidad o una porción de lo siguiente: la región articulada, los dominios CH1, CH2, y CH3. También se incluyen en la invención los fragmentos de unión a antigenos que también comprenden cualquier combinación de las regiones variables con una región articulada, los dominios CH1, CH2, y CH3 . Los anticuerpos de fragmentos inmunoespecífíeos de los mismos de la presente invención pueden provenir de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. De preferencia, los anticuerpos son anticuerpos humanos, murinos, de asno, de conejo, de cabra, de cobayo, de camello, de llama, de caballo, o de pollo. En otra modalidad, la región variable puede ser de origen condrictoide (por ejemplo, a partir de tiburones) . En el sentido en el que se utiliza en la presente, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de las bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe infra y, por ejemplo en la patente de los Estados Unidos No.5,939,598 de Kucherlapati et al.

Producción de anticuerpos recombinantes Para producir recombinantemente los anticuerpos descritos en la presente, los ácidos nucleicos que codifican para las regiones variables de cadena ligera y pesada, enlazadas opcionalmente a regiones constantes, se insertan en los vectores de expresión. Las cadenas ligeras y pesadas se pueden clonar en los mismos o diferentes vectores de expresión. Las cadenas pesadas y ligeras de las SEC ID NOs: 1-5 se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención. Las enseñanzas de la patente de los Estados Unidos No. 6,287,569 de Kipps et al., incorporada en la presente como referencia en su totalidad, y los métodos proporcionados en la presente se pueden adaptar fácilmente por aquellos expertos en la téenica para crear las vacunas de la presente invención. Los segmentos de ADN que codifican para las cadenas de anticuerpos se enlazan funcionalmente a las secuencias control en los vectores de expresión que aseguran la expresión de las cadenas de anticuerpos. Estas secuencias control pueden incluir una secuencia de señal, un promotor, un intensificador y una secuencia para terminación de transcripción.

Los vectores de expresión típicamente se pueden replicar en los organismos hospederos ya sea como episomas o como una parte integral del cromosoma hospedero. E. colí es un hospedero procariota particularmente útil para expresar los anticuerpos de la presente invención. Otros hospederos microbianos adecuados para utilizarse incluyen bacilos, tales Bacillus subtilus, y otras enterobacteriáceas, tales como Salmonella, Serratia, y diversas especies de Pseudomonas. En estos hospederos procariotas, también se pueden producir vectores de expresión, que contienen típicamente las secuencias para control de expresión compatibles con la célula hospedera (por ejemplo, un origen de replicación) las secuencias reguladoras tales como un sistema promotor de lactosa, un sistema del promotor de triptófano (trp), un sistema del promotor de beta-lactamasa, o un sistema promotor a partir del fago lambda. También se pueden utilizar para la expresión otros microbios, tales como levadura. Los Saccharomyces es un hospedero preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias para control de expresión, tales como promotores, que incluyen la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glucolíticas, y un origen de replicación, secuencias de terminación y lo semejante según se desee. También se puede utilizar un cultivo de células de tejido de mamífero para expresar y producir los anticuerpos de la presente invención (véase, por ejemplo, Winnacker, From Genes to Clones VCH Publishers, N.Y., 1987).Se prefieren células eucariotas, debido a que se ha desarrollado una serie de líneas de células hospederas adecuadas capaces de secretar anticuerpos intactos. Las células hospederas adecuadas preferidas para expresar ácidos nucleicos que codifican para las inmunoglobulinas de la invención incluyen: la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionaria humano; las células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); las células ováricas de hámster chino (CHO); las células sertoli de ratón; las células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); las células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL 1587); las células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); las células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); las células de hígado de búfalo y rata (BRL 3A, ATCC CRL 1442); las células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); las células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); el tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); y las células TRI.

Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés (por ejemplo, las secuencias que codifican para la cadena pesada y ligera y las secuencias para control de expresión) se pueden transferir en la célula hospedera. La transfección con cloruro de calcio comúnmente se utiliza para células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio o electroporación se puede utilizar para otros hospederos celulares (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989). Cuando las cadenas pesadas y ligeras se clonan en vectores de expresión por separado, los vectores se co-transfectan para obtener la expresión y ensamble de inmunoglobulinas intactas. Después de la introducción del ADN recombinante, las lineas celulares que expresan los productos de inmunoglobulina son células seleccionadas. Se prefieren las lineas celulares con capacidad para una expresión estable (es decir, niveles no disminuidos de expresión después de cincuenta sub-cultivos de la linea celular).

Una vez expresados, los anticuerpos completos, sus dimeros, las cadenas ligeras y pesadas individuales, u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención se puede purificar de acuerdo con los procedimientos estándar de la téenica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y lo semejante (véase, por ejemplo, Scopes, Protein Purífication, Springer-Verlag, N.Y., 1982). Se prefieren inmunoglobulinas sustancialmente puras de al menos aproximadamente 90 hasta 95% de homogeneidad, y se prefiere en mayor medida del 98 hasta 99% o más homogeneidad.

Múltiples anticuerpos específicos, inmuno-conjugados de anticuerpos y moléculas de fusión Los anticuerpos del ROR1 o los fragmentos de unión a antigenos, las variantes o los derivados del mismo de la invención pueden ser "multiespecificos", por ejemplo, biespecificos , triespecificos o de mayor multlespecificidad, lo que significa que reconoce y se une a dos o más diferentes epitopes presentes en uno o más diferentes antígenos (por ejemplo, proteínas) al mismo tiempo. De esta forma, si un anticuerpo de ROR1 es "monoespecifico" o" multiespecifico, " por ejemplo, "biespecifico, " se refiere al número de diferentes epitopes con los cuales reacciona un polipéptido de unión. Los anticuerpos multiespecificos pueden ser específicos para diferentes epitopes de un polipéptido blanco descrito en la presente o pueden ser específicos para un polipéptido blanco asi como para un epltope heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o un material de soporte sólido.

En el sentido en el que se utiliza, el término "valencia" se refiere al número de dominios de unión potencial, por ejemplo, los dominios de unión a antigenos, presentes en un anticuerpo del ROR1, un polipéptido o anticuerpo de unión. Cada dominio de unión se une específicamente a un epítope. Cuando un anticuerpo del ROR1, un polipéptido de unión o un anticuerpo comprende más de un dominio de unión, cada dominio de unión se puede unir específicamente al mismo epítope, para un anticuerpo con dos dominios de unión, denominados "bivalentes monoespecífíeos" o a diferentes epítopes, para un anticuerpo con dos dominios de unión, denominados "bivalentes específicos". Un anticuerpo también puede ser biespecífico y bivalente para cada especificidad (denominada "anticuerpos biespecífíeos tetravalentes") . En otra modalidad, se pueden producir minicuerpos tetravalentes o anticuerpos con dominio suprimido .

Los anticuerpos bivalentes biespecífíeos, y los métodos para elaborar los mismos, se describen, por ejemplo en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,731,168; 5,807,706; 5,821,333; y las publicaciones de solicitud de los Estados Unidos Nos. 2003/020734 y 2002/0155537, las descripciones de todas se incorporan como referencia en la presente. Los anticuerpos tetravalentes biespecíficos, y los métodos para elaborar los mismos, se describen, por ejemplo, en la WO 02/096948 y la WO 00/44788, las descripciones de las mismas se incorporan como referencia en la presente. Véase, en general las publicaciones del PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al., J.

Inmunol. 147:60-69 (1991); PatentesS de los Estados Unidos Nos. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny et al., J. Inmunol.148:1547-1553 (1992).

La presente invención incluye anticuerpos multiespecificos del ROR1. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico comprendido de dos fragmentos del anticuerpo scFv ambos se unen al ROR1. Los fragmentos del anticuerpo scFv se pueden unir al mismo o diferentes epítopes en el ROR1 . Como un ejemplo adicional, el anticuerpo multiespecif ico puede ser un diacuerpo que se une a los epítopes de los anticuerpos con una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:l. la SEC ID NO:5, la SEC ID NO:9, la SEC ID NO: 13, la SEC ID NO :17, la SEC ID NO:39 o la SEC ID NO:42 y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:3. La SEC ID NO:7, la SEC ID NO:ll, la SEC ID NO: 15, la SEC ID NO:19, la SEC ID NO:41 o la SEC ID NO:45.

La invención se extiende además a las proteínas de fusión. Las proteínas de fusión son moléculas quiméricas que comprenden, por ejemplo, un dominio de unión a antigenos de inmunoglobulina con al menos un sitio de unión blanco, y al menos una porción heteróloga, es decir, una porción con la cual no se enlaza naturalmente por naturaleza. Las secuencias de aminoácidos pueden existir normalmente en proteínas por separado que se portan conjuntamente en el polipéptido de fusión o normalmente existen en la misma proteína pero están colocadas en una nueva disposición en el polipéptido de fusión. Las proteínas de fusión se pueden crear, por ejemplo, mediante síntesis química, o al crear y traducir un polinucleótido en el cual se codifican las regiones peptídicas en la relación deseada.

Los anticuerpos del R0R1, o los fragmentos de unión a antigenos, las variantes, o los derivados de los mismos de la invención se pueden fusionar además recombinantemente a un polipéptido heterólogo en el término N- o C- o se pueden conjugar químicamente (incluyendo con ugaciones covalentes y no covalentes) a los polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos RORl-específicos se pueden fusionar o conjugar recombinantemente a moléculas útiles como marcas en los ensayos de detección y moléculas detectoras tales como los polipéptidos heterólogos, fármacos, radionúclidos, o toxinas. Véanse, por ejemplo, las publicaciones del PCT WO 92/08495; WO 91/14438; O 89/12624; la patente de los Estados Unidos No. 5,314,995; y la EP 396,387. Los anticuerpos del R0R1 radiomarcado de la invención serán particularmente útiles, mientras que los conjugados del fármaco del anticuerpo (ADC) se siguen desarrollando. Los anticuerpos del ROR1, o los fragmentos de unión a antígenos, las variantes, o derivados del mismo de la invención incluyen derivados que se modifican, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo de tal forma que la unión covalente no evite que el anticuerpo se una al ROR1. Por ejemplo, aunque no como limitación, los derivados de anticuerpos incluyen anticuerpos que se hayan modificado, por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación, pegilación, fosfilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, segmentación proteolitica, enlace a un ligando celular u otra proteina, etc. Cualquiera de las muchas modificaciones químicas se puede llevar a cabo mediante téenicas conocidas, incluyendo, de manera enunciativa segmentación química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Los anticuerpos del ROR1, o los fragmentos de unión con antígenos, las variantes, o derivados de los mismos de la invención pueden estar compuestos de aminoácidos unidos entre sí, mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isósteros peptídicos, y pueden contener aminoácidos distintos a los aminoácidos codificados por el gen 20. Los anticuerpos RORl específicos se pueden modificar mediante procesos naturales, tales como procesamiento pos-traduccional, o mediante téenicas de modificación química que son bien conocidas en este campo. Estas modificaciones quedan bien descritas en los textos básicos y en monografías más detalladas, así como en la voluminosa bibliografía de investigación. Las modificaciones se pueden presentar en cualquier lugar en el anticuerpo RORl específico, incluyendo la estructura del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y los términos amino o carboxilo, o en porciones tales como carbohidratos. Se apreciará que puede estar presente al mismo o grados variables el mismo tipo de modificación en diversos sitios en un anticuerpo RORl determinado .

La presente invención también proporciona proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo del RORl, o un fragmento de unión a antígenos, variante, o derivado del mismo, y un polipéptido heterólgo. El polipéptido heterólogo al cual se fusiona el anticuerpo puede útil para una función o es útil para dirigir las células que expresan el polipéptido del R0R1. En una modalidad, una proteina de fusión de la invención comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de una o más regiones VH de un anticuerpo de la invención o la secuencia de aminoácidos de cualquiera de una o más de las regiones VL de un anticuerpo de la invención o los fragmentos o variantes de las mismas, y una secuencia de un polipéptido heterólogo.

En otra modalidad, la proteína de fusión para utilizarse en los métodos de tratamiento descritos en la presente comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de una, dos, tres de las VH-CDR seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO:27, la SEC ID NO: 28 y la SEC ID NO:29 de un anticuerpo ROR1-específico, o los fragmentos, las variantes, o del mismo, o la secuencia de aminoácidos de cualquiera de una, dos, tres de las VL-CDR seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO:30, la SEC ID NO:31 y la SEC ID NO:32 de un anticuerpo RORl-especí fico, o los fragmentos, las variantes, o derivados del mismo, y una secuencia del polipéptido heterólogo. En una modalidad, la proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un VH-CDR3 de un anticuerpo RORl-específico de la presente invención, o un fragmento, derivado, o variante del mismo, y una secuencia del polipéptido heterólogo en el cual la proteína de fusión se une específicamente a al menos un epítope de R0R1. En otra modalidad, una proteina de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de al menos una región VH de un anticuerpo RORl-especifico de la invención y la secuencia de aminoácidos de al menos una región VL de un anticuerpo RORl-especifico de la invención o los fragmentos, derivado o variante del mismo, y una secuencia de polipéptido heterólogo. De preferencia, las regiones VH y VL de la proteina de fusión corresponden a un anticuerpo de fuente individual (o fragmento scFv o Fab) que se une específicamente a al menos un epítope del ROR1. Todavía en otra modalidad, una proteína de fusión para utilizarse en los métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en la presente comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de una, dos, tres o más de las VH CDR de un anticuerpo RORl-especifico y la secuencia de aminoácidos de cualquiera de una, dos, tres o más de las VL CDR de un anticuerpo RORl-especifico, o los fragmentos o variantes del mismo, y una secuencia de polipéptido heterólogo. De preferencia, dos, tres, cuatro, cinco, seis, o más de las VH-CDR o VL-CDR correspondan al anticuerpo de la fuente individual (o el fragmento scFv o Fab) de la invención. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para estas proteínas de fusión también se abarcan por la invención.

Las proteínas de fusión se pueden preparar utilizando métodos que son bien conocidos en la téenica (véanse por ejemplo las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,116,964 y 5,225,538). El sitio preciso en el cual se realiza la fusión se puede seleccionar empíricamente para optimizar las características de secreción o unión de la proteína de fusión. El ADN que codifica para la proteína de fusión luego se transfectada en una célula hospedera para la expresión.

La invención proporciona un anticuerpo del RORl anti-humano particularmente preferido; es decir, un anticuerpo anti-RORl aislado que tiene la misma especificidad de unión que el anticuerpo 99961. En un aspecto, el anticuerpo se une al dominio similar a Ig que es contiguo con el dominio CRD del RORl. En un aspecto adicional, el anticuerpo se une a los aminoácidos 42-160 del hRORl. En un aspecto adicional, el anticuerpo se une a los aminoácidos 130-160 del ROR-1. En otro aspecto, el anticuerpo requiere ácido glutámico en la posición 138 del hRORl que estará presente para la unión.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un anticuerpo del anti-RORl aislado que comprende una región variable de cadena pesada que se selecciona del grupo que consiste de la SEC ID NO:l, la SEC ID NO:5, ]a SEC ID NO:9, la SEC ID NO:13, y la SEC ID NO:17, y la región variable de cadena ligera que se selecciona del grupo que consiste de la SEC ID N0:3, la SEC ID NO:7, la SEC ID NO:ll, la SEC ID NO:15 y la SEC ID NO:19. En un aspecto, el anticuerpo de acuerdo con la región variable de cadena pesada es la SEC ID NO:5 y la región variable de cadena ligera es la SEC ID NO:7.

En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo del ROR1 anti-humano aislado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la CDR1, la CDR2 y la CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO:27, la SEC ID NO:28, la SEC ID NO:29, la SEC ID NO:33, la SEC ID NO:34 y la SEC ID NO:35, y la región variable de cadena ligera comprendida de la CDR1, la CDR2 y la CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO:30, la SEC ID NO:31, la SEC ID NO:32, la SEC ID NO:36, la SEC ID NO:37 y la SEC ID NO:38. En un aspecto, la región variable de cadena pesada comprendida de la CDRl, la CDR2 y la CDR3 esta comprendida de la SEC ID NO:27, la SEC ID NO:28 y la SEC ID NO:29, y la región variable de cadena ligera está comprendida de la CDRl, la CDR2 y la CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO:30, la SEC ID NO:31 y la SEC ID NO: 32.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un anticuerpo del ROR1 anti-humano con una afinidad de unión mayor que 41 nM. En un aspecto, la afinidad de unión al anticuerpo es entre aproximadamente 500 pM y aproximadamente 6 nM. En un aspecto, la afinidad de unión al anticuerpo es de aproximadamente 800 pM.

En otro aspecto, el anticuerpo inhibe la metástasis. En un aspecto adicional, el anticuerpo internaliza e inhibe la migración celular. En un aspecto adicional, el anticuerpo internaliza y sub-modula la Vimentin, Snail 1/2 o ZEB. En otro aspecto, el anticuerpo es humano, humanizado o quimérico. En un aspecto, el anticuerpo es 99961, 99961.1, 99961.2, 99961.3 o 99961.4. En un aspecto preferido, el anticuerpo es 99961.1.

Una modalidad de la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo contra el ROR1 y un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad adicional, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica para el anticuerpo contra el R0R1 . En otra modalidad, la invención proporciona un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de acuerdo con el ácido nucleico que codifica para un anticuerpo contra el ROR1 . En una modalidad adicional, la invención proporciona una célula hospedera que comprende el ácido nucleico que codifica para un anticuerpo contra el ROR1. En una modalidad adicional, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo del anti-RORl que comprende cultivar la célula hospedera bajo condiciones para producir el anticuerpo. En un aspecto, el método para producir un anticuerpo comprende además recuperar el anticuerpo.

Como se muestra en los ejemplos, el anticuerpo de DIO del anti-RORl que inhibe el injerto CLL de ratón y humano, puede dirigir la citotoxicidad de complemento dependiente, induce una reducción significativa en la carga leucémica, y bloquea la metástasis de las células de cáncer de mama hacia al pulmón y hueso.

Se ha mostrado que DIO tiene actividad biológica mientras que otros anticuerpos anti-RORl conocidos (por ejemplo, 4A5 y K19) no exhiben actividad biológica a pesar de 4A5 que tiene una afinidad de unión significativamente mayor para el ROR1. Se ha mostrado que el anticuerpo 4A5, se une a diferentes epitopes distintos a DIO. También se ha mostrado que un subconjunto de pacientes con cáncer en los cuales el cáncer es ROR+, se producen antisueros para el ROR1. Un subconjunto adicional de pacientes producen anticuerpos que inhiben la actividad de Wnt5a, conduciendo asi a la conclusión de que no todos los anticuerpos del ROR1 tienen actividad biológica.

Como se describe adicionalmente en los Ejemplos, se realizó un mapeo de epítopes para determinar el epitope de DIO y 4A5. Estos estudios determinan que DIO se une a un epitope en el término C del dominio celular Ig que es contiguo al CRD en el ROR1. El epitope para 4A5 también se mapeo para el dominio similar a Ig, aunque más cercano a la misma terminal del dominio. Estos hallazgos han conducido a la conclusión de que los anticuerpos que unen al mismo epitope como DIO inhibirán la actividad biológica del ROR1 mientras que los anticuerpos que unen en otra parte no lo harán.

Como se muestra en los ejemplos, los anticuerpos de alta afinidad, es decir 99961, se derivaron utilizando el epitope DIO para seleccionar los anticuerpos recombinantes de alta afinidad. Uno de los anticuerpos seleccionados, 99961 tiene una afinidad de unión significativamente superior para el ROR1 que DIO. El anticuerpo 99961 tiene 50x más afinidad de unión que DIO, es decir 800 pM contra 41 nM. Adicionalmente, 99961 se humanizó generando cuatro anticuerpos diferentes. Los experimentos confirman que 99961 tuvo el mismo epitope como DIO. Los experimentos confirman que este epitope no se expresa en células madre y progenitoras hematopoieticas normales. Además, 99961 no realiza una reacción cruzada con tejidos normales de adulto.

Este anticuerpo también demostró actividad contra las células CLL, actividad en AML primario del ROR+ y la inducción de la internalización del ROR1.

Vacunas Adicionalmente, la invención proporciona una vacuna para el tratamiento o prevención del cáncer o la inhibición de metástasis en un sujeto que consiste de· una composición farmacéuticamente aceptable de un aislado o un péptido de unión al ROR1 producido sintéticamente. La invención también proporciona un péptido de unión al ROR1 con al menos el 95% de identidad de secuencia con la región de unión al ROR-1 de DIO. En un aspecto adicional, la invención proporciona un péptido de unión al R0R1 con al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de identidad de secuencia con la región de unión de DIO. En un aspecto adicional, la región de unión de DIO es VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC . En un aspecto adicional, la región de unión de DIO es EVVSSTGVLFVKFGPC. En un aspecto la región de unión de DIO tiene al menos 22 aminoácidos. En un aspecto adicional, la región de unión DIO tiene al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21 ó 22 aminoácidos.

La presente invención también proporciona el uso de vacunas con el péptido de unión al ROR1 contra enfermedades, tales como un linfoma, por ejemplo, CLL que implica la expresión del ROR1. Debido a que los tejidos normales de adulto no parecen expresar el ROR-1, éste representa un antigeno tumor-específico que puede ser el objetivo de la terapia inmunoactiva. Por ejemplo, los niveles del R0R1 se pueden sub-regular al administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de la vacuna con el péptido de unión al ROR1 que produce en animales una respuesta inmunitaria protectora o terapéutica contra el R0R1 y los efectos de su expresión. Las vacunas pueden incluir péptidos. Los métodos para utilizar estos péptidos incluyen el uso en vacunas y para generar anticuerpos contra el ROR1. El péptido de ROR1 también puede incluir un inmuno-adyuvante. El inmuno-adyuvante puede ser una porción portadora inmunogénica conjugada con el péptido de unión. En un aspecto, la porción portadora inmunogénica es un péptido. Los ejemplos de un portador adecuado para la vacuna comprenden además un adyuvante inmunogénico. En un aspecto adicional, el adyuvante es una porción portadora inmunogénica conjugada con el péptido de unión. La porción portadora inmunogénica puede ser un péptido portador, tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA), ovalbumina, hidróxido de aluminio u otro inmuno-adyuvante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de inmuno-adyuvantes farmacéuticamente aceptables se pueden encontrar en Methods in Molecular Medicine, Yol.42: Vaccine adjuvants: Preparation, Methods and Research Protocols; Editada por D. T. O'Hagan; Humana Press Inc., Totowa NJ and European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, Committee for Proprietary Medicinal Products, Guidelines on Adjuvants in Vaccines, London 2004. Típicamente, la composición de vacuna también incluirá un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad la invención proporciona una vacuna contra las células que expresan el ROR-1, la vacuna comprende una composición farmacéuticamente aceptable de un péptido aislado o producido sintéticamente que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con la región de unión al ROR-1 del anticuerpo DIO. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos de la vacuna de la región de unión al ROR-1 del anticuerpo DIO es VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC . En un aspecto adicional, la secuencia de aminoácidos de la vacuna para la región de unión del ROR-1 del anticuerpo DIO es EVVSSTGVLFVKFGPC. En otro aspecto, la célula que expresa el ROR1 es una célula cancerosa. En un aspecto adicional, la célula cancerosa proviene de una leucemia por células B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, cáncer ovárico, de colon, pulmonar, de la piel, pancreático, testicular, de la vejiga, uterino, prostático, o adrenal.

En otra modalidad, la invención proporciona una vacuna que comprende un péptido de unión al R0R1 que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC y un portador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, el péptido es de mamífero. En un aspecto adicional, el péptido es de origen quimérico y/o de humano, ratón, rata, porcino, bovino, de primate, felino, canino, de conejo, de cabra, de pollo o úrsido. En otro aspecto, la vacuna comprende además un adyuvante inmunogénico. En un aspecto adicional, el adyuvante es un péptido portador inmunogénico conjugado con el péptido de unión. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del péptido de unión es VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. En otro aspecto, el péptido portador de inmunogénico es hemocianina de lapa californiana (KLH). La vacuna comprende además un adyuvante inmunogénico. En un aspecto adicional, el adyuvante es una porción portadora inmunogénica conjugada con el péptido de unión. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del péptido de unión es VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. La porción portadora inmunogénica puede ser un péptido portador, tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA), ovalbumina, hidróxido de aluminio u otro inmuno-adyuvante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de inmuno-adyuvantes farmacéuticamente aceptables, se pueden encontrar en Methods in Molecular Medicine, Vol.42: Vaccine adjuvants: Preparation, Methods and Research Protocols; Editado por D. T. O'Hagan; Humana Press Inc., Totowa NJ and European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, Committee for Proprietary Medicinal Products, Guidelines on Adjuvants in Vaccines, London 2004.

En otra modalidad, la invención proporciona una vacuna que comprende un péptido de unión al R0R1 que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con EVVSSTGVLFVKFGPC y un portador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, el péptido es de mamífero. En un aspecto adicional, el péptido es de origen quimérico y/o de humano, de ratón, de rata, porcino, bovino, de primate, felino, canino, de conejo, de cabra, de pollo o úrsido. En otro aspecto, la vacuna comprende además un adyuvante in unogénico. En un aspecto adicional, el adyuvante es un péptido portador inmunogénico conjugado con el péptido de unión. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del péptido de unión es EVVSSTGVLFVKFGPC. La porción portadora inmunogénica puede ser un péptido portador, tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA) ovalbumina, hidróxido de aluminio u otro inmuno-adyuvante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de inmuno-adyuvantes farmacéuticamente aceptables se pueden encontrar en Molecular Medicine, Vol. 42: Vaccine adjuvants: Preparation, Methods and Research Protocols; Editado por D. T. O'Hagan; Humana Press Inc., Totowa NJ and European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, Committee for Proprietary Medicinal Products, Guidelines on Adjuvants in Vaccines, London 2004.

En una modalidad adicional, la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende la vacuna que comprende un péptido de unión al ROR1 que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con EVVSSTGVLFVKFGPC y un portador farmacéuticamente aceptable.

Como mostrado en los ejemplos, las vacunas peptidicas se desarrollaron como se muestra en la figura 18. Se utilizaron tres péptidos con base en el epitopes de los anticuerpos de DIO, 4A5 y K19 del ROR1. Los animales inmunizados en los tres péptidos. Los tres péptidos indujeron la producción de antisuero del ROR1. Los resultados demuestran que la inmunización con el péptido R22 produjo el mayor titulo de anticuerpos. Como se indica en los ejemplos, los antisueros del ROR1 se unen al ROR1, disminuyen la carga leucémica, inducen la internalización del ROR1, producen la citotoxicidad complemento dependiente, inhiben la migración de las células de cáncer de mama e inhiben el injerto de las células leucémicas ROR+. De esta forma, la invención proporciona un método para inmunizar a pacientes contra el ROR1 para permitir la inducción de anticuerpos para que inhiban la capacidad de las células cancerosas ROR+ para migrar y realizar la metástasis.

Péptidos de unión al ROR1 En una modalidad, la invención proporciona un péptido de unión al ROR1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: la SEC ID NO:25 y la SEC ID NO:26. En un aspecto, el péptido tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. En otro aspecto, el péptido tiene una secuencia peptidica de aminoácido con al menos el 95% de identidad de secuencia con EVVSSTGVLFVKFGPC. En otro aspecto, el péptido de unión es de mamífero. En un aspecto adicional, el péptido de unión es de origen quimérico y/o de humano, de ratón, de rata, porcino, bovino, de primate, felino, canino, de conejo, de cabra, de pollo o úrsido.

En una modalidad, la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende un péptido de unión al R0R1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: la SEC ID NO:25 y la SEC ID NO:26 y un portador farmacéuticamente aceptable.

En otra modalidad, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica para el péptido de unión al R0R1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:25 y la SEC ID NO:26. En otra modalidad, la invención proporciona un vector de expresión que comprende el ácido nucleico que codifica para un péptido de unión al R0R1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:25 y la SEC ID NO:26. En una modalidad adicional, la invención proporciona una célula hospedera que comprende la ácido nucleico que codifica un péptido de unión al ROR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:25 y la SEC ID NO:26. En una modalidad adicional, la invención proporciona un método de producir un péptido que comprende cultivar la célula hospedera que codifica para un péptido de unión al ROR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:25 y la SEC ID NO:26 bajo condiciones para producir el péptido de unión. En un aspecto, el método para producir un péptido comprende además recuperar el péptido de unión.

Supresión de la metástasis En una modalidad, la invención proporciona un método para suprimir la metástasis del cáncer que expresa el ROR-1, el método comprende interrumpir la transición mesenquimal a epitelial de las células tumorales al administrar un anticuerpo que tenga la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal 99961, una vacuna comprendida de un péptido que tenga una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con la región de unión al ROR-1 del anticuerpo DIO, un péptido de unión al ROR-1 que tenga una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC o un péptido de unión al ROR-1 que tenga una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con EVVSSTGVLFVKFGPC . En un aspecto, el cáncer que expresa el ROR-1 es leucemia por células B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, cáncer ovárico, de colon, pulmonar, de la piel, pancreático, testicular, de la vejiga, uterino, prostático o adrenal .

Los ejemplos proporcionan la evidencia de que los anticuerpos del ROR1, los péptidos de unión y las vacunas tienen la capacidad para inhibir la migración o metástasis de las células cancerosas ROR+.

Tratamiento En el sentido en el que se utiliza en la presente, los términos "tratado" o "tratamiento" se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o disminuir (reducir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, tal como el desarrollo o diseminación del cáncer. Os resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, de manera enunciativa, alivio de los síntomas, disminución del grado de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, retraso o disminución del progreso de la enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad, y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar la prolongación de la supervivencia en comparación con una supervivencia esperada si no se está recibiendo un tratamiento. Aquellos que necesitan de tratamiento incluyen aquellos que ya tienen la condición o trastorno así como aquellos que están propensos a tener la condición o trastorno o aquellos en los cuales se evitará la condición o trastorno.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "cáncer" o "célula cancerosa" o "cáncer que expresa el R0R1" o "célula cancerosa que expresa el R0R1" se refiere a la totalidad del crecimiento y proliferación de células neoplásticas, ya sea malignas o benignas, incluyendo todas las células transformadas y tejidos y todas las células cancerosas y tejidos. El cáncer incluye, de manera enunciativa neoplasmas, ya sea benignos o malignos, ubicados en: la próstata, el colon, el abdomen, los huesos, la mama, el sistema digestivo, el hígado, el páncreas, el peritoneo, las glándulas endocrinas (adrenales, paratiroideas, de la pituitaria, testículos, ovarios, timo, tiroides), el ojo, la cabeza y cuello, los nervioso (centrales y periféricos), el sistema linfático, pélvico, y el tejido suave, bazo, torácico, y tracto urogenital. Estos neoplasmas, en ciertas modalidades, expresan, sobre-expresan, o expresan anormalmente el ROR1.

El cáncer también incluye de manera enunciativa leucemia por células B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, cáncer ovárico, de colon, pulmonar, de la piel, pancreático, testicular, de la vejiga, uterino, prostático, y adrenal.

Los anticuerpos anti-RORl, los péptidos de unión al RORl y las vacunas del ROR1 descritas en la presente se pueden utilizar para el tratamiento o prevención de un cáncer por el RORl o para inhibir la metástasis de una célula cancerosa por el RORl en un sujeto.

Anticuerpos En ciertas modalidades terapéuticas, el anticuerpo seleccionado típicamente será un anticuerpo anti-RORl que se puede administrar sólo o en combinación con, o conjugado con, uno o más agentes terapéuticos combinatorios. Cuando los anticuerpos descritos en la presente se administran solos como agentes terapéuticos, pueden ejercer un efecto benéfico en el sujeto mediante una variedad de mecanismos. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al hROR-1 se purifican y se administran a un paciente para neutralizar una o más formas del hROR-1, para bloquear una o más actividades de hROR-1, o para bloquear o inhibir una interacción de una o más forma del hROR-1 con otro biomolécula.

Los reactivos inmunoterapéuticos de la invención pueden incluir anticuerpos humanizados, y se pueden combinar para uso terapéutico con ingredientes adicionales activos o inertes, por ejemplo, en portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, por ejemplo, adyuvantes inmunogénicos, y opcionalmente con agentes complementarios o combinatoriamente activos tales como, fármacos anti-neopláticos.

En otras modalidades, los anticuerpos terapéuticos descritos en la presente se administran coordinadamente con, se co-formulan con, o se acoplan con (por ejemplo, enlazados covalentemente) a un agente terapéutico combinatorio, por ejemplo un radionúclido, un inductor de diferenciación, un fármaco, o una toxina. Se pueden emplear diversos radionúclidos conocidos, entre los que se incluyen 90Y, 123I, 1251, 131I, 186Re, 188Re, y 211At. Los fármacos útiles para utilizarse en estas formulaciones para tratamiento combinatorio y los métodos incluyen metotrexato y pirimidina y análogo de purina. Los inductores de diferenciación adecuados incluyen forbolésteres y ácido butírico. Las toxinas adecuadas incluyen toxinas de ricina, abrina, toxina difteria, toxina de cólera, gelonina, Pseudomonas exotoxina, toxina de Shigella, y una proteína antiviral de hierba carmín. Estos agentes terapéuticos combinatorios se pueden acoplar a un anticuerpo anti-RORl ya sea directa o indirectamente (por ejemplo, vía un grupo enlazador). Es posible una reacción directa entre un agente y un anticuerpo cuando cada uno posea un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleofilico, tal como un grupo amino o sulfidrilo, en uno pueden ser capaz de reaccionar con un grupo que contenga carbonilo, tal como un anhídrido o un haluro ácido, o con un grupo alquilo que contenga un buen grupo saliente (por ejemplo, un haluro) sobre el otro. Alternativamente, puede ser conveniente acoplar un agente terapéutico combinatorio y un anticuerpo vía un grupo enlazador como un separador para distanciar un anticuerpo del agente terapéutico combinatorio para evitar la interferencia con las capacidades de unión. Un grupo enlazador también puede servir para aumentar la reactividad química de un sustituyente o un agente o un anticuerpo, y de esta forma aumentar la eficacia de acoplamiento. Será evidente adicionalmente para aquellos expertos en la téenica que se pueden emplear como un grupo enlazador una variedad de reactivos bifuncionales o polifuncionales, tanto homo- como hetero-funcionales, (tales como aquellos descritos en el catálogo del Pierce Chemical Co., Rockford, III.). El acoplamiento puede estar afectado, por ejemplo, a través de grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfidrilo u residuos de carbohidrato oxidados.

También ser conveniente acoplar más de un agente a un anticuerpo anti-RORl. En una modalidad, se acoplan múltiples moléculas de un agente a una molécula del anticuerpo. En otra modalidad, se puede acoplar más que un tipo de agente a un anticuerpo. Sin importar la modalidad particular, los inmuno-conjugados con más de un agente se pueden preparar en una variedad de formas. Por ejemplo, más de un agente puede estar acoplado directamente a una molécula de anticuerpo, o se pueden utilizar enlazadores que proporcionan múltiples sitios para la unión.

Alternativamente, se puede utilizar un portador.

Se pueden utilizar una variedad de rutas de administración para los anticuerpos e inmuno-conjugados. Típicamente, la administración es intravenosa, intramuscular, o hipodérmica.

Será evidente que la dosis precisa de un anticuerpo/inmuno-conjugado variará dependiendo de factores tales como el anticuerpo utilizado, la densidad del antigeno, y la velocidad de intercambio del anticuerpo. Una cantidad segura y efectiva de un agente anti-RORl es, por ejemplo, aquella cantidad que pudiera provocar el efecto terapéutico deseado en un paciente mientras que reduzca al mínimo los efectos secundarios no deseados. En general, una cantidad terapéuticamente efectiva es aquella suficiente para estimular la producción de una o más citoquinas y/o provocar una citotoxicidad celular complemento-mediada o dependiente del anticuerpo. El régimen de dosificación se determinará por los expertos, con base en factores tales como la naturaleza exacta de la condición que será tratada, la gravedad de la condición, la edad y condición física general del paciente, etc .

En una modalidad adicional, la invención proporciona un método para tratar o prevenir un cáncer en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto un anticuerpo que tenga la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal 99961, una vacuna comprendida de un péptido que tenga una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con la región de unión del ROR-1 humano del anticuerpo DIO, un péptido de unión ai ROR-1 que tenga una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPCor o un péptido de unión del ROR-1 que tenga una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con EVVSSTGVLFVKFGPC . En un aspecto, el cáncer es leucemia de células B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, cáncer ovárico, de colon, pulmonar, de la piel, pancreático, testicular, de la vejiga, uterino, prostático, y adrenal.

Inhibición de la metástasis al fijar como objetivo el ROR1 La diseminación de células neoplásticas desde su sitio original hacia áreas distantes del cuerpo es responsable del 90% de las muertes relacionadas con cáncer. El proceso metastásico incluye la translocación física de células tumorales primarias hacia un órgano distante y una colonización posterior. Algunas firmas génicas de pronóstico deficiente sugieren que las células en algunos tumores primarios están predispuestas a la metástasis. Sin embargo, está limitada la comprensión de los determinantes moleculares y celulares de la metástasis y los procesos mediante los cuales las células tumorales que experimentan este caso se desconocen en gran medida. Se ha enfocado una tensión reciente sobre un programa biológico celular denominado transición mesenquimal a epitelial (EMT), la cual actualmente se considera un factor notablemente en la progresión de los tumores, la obtención de motilidad, la capacidad de invasión, la metástasis, y los rasgos de auto-renovación.

La EMT confiere sobre las células epiteliales neoplásticas los rasgos biológicos necesarios para llevar a cabo la mayoría de los pasos de la cascada de metástasis por invasión. En la metástasis tanto de desarrollo normal y cáncer, la EMT parece estar regulada por señales contextúales que reciben las células epiteliales desde su micro-entorno. A través del uso de múltiples trayectorias implicadas en la morfogénesis embrionaria y la curación de heridas, las células cancerosas concomitantemente pueden obtener atributos que permitan la invasión y metástasis.

Un trabajo para definir las células madre cancerosas (CSC) que se pueden tomar en cuenta para la metástasis o recaída del cáncer después de una terapia ha identificado una variedad de rasgos asociados con una o más sub-poblaciones de las CSC en diversos tumores. Algunos de estos estudios han encontrado que la obtención de característica fenotipicas de las células en la EMT, se pueden inducir sin las CSC para ingresar en un estado similar a CSC. Por lo tanto, las células cancerosas etastásicas que presuntamente han experimentado EMT, pueden exhibir un fenotipo CSC y obtener propiedades invasivas que estimulen la supervivencia en la circulación, extravasación en un órgano distante, la angiogenesis, y el crecimiento no controlado en los sitios metastásicos.

Como se detalla adicionalmente en los Ejemplos, el alto nivel de expresión del R0R1 en las células cancerosas está asociado con mayores velocidades de una enfermedad con recaídas y/o metastásica. Los efectos de la expresión y lentificación del ROR1 en pacientes con adenocarcinoma de la mama, descritos en el Ejemplo 1, ilustran la práctica de la invención para inhibir la metástasis. Como se muestra, la lentificación de la expresión del ROR1 en líneas celulares de cáncer de mama propensas a metástasis invierte las características fenotipicas asociadas con la EMT y afecta la migración, invasión, y metástasis ín vitro e ín vivo. Además, los anticuerpos inventivos específico para el ROR1 inhiben las metástasis de las células de cáncer de mama humano xenoinjertada en ratones inmuno-deficientes. Estos estudios identifican una trayectoria anteriormente desconocida para la metástasis de cáncer de mama y validan al ROR1 como un blanco prometedor para el tratamiento del cáncer. Los bajos niveles de expresión del ROR1 se correlacionaron con una mayor supervivencia sin metástasis, y de manera más importante, la fijación como blanco terapéutico del ROR1 con los anticuerpos anti-RORl que inhiben el desarrollo de la metástasis del cáncer de mama.

La metástasis es la diseminación de las células cancerosas desde su ubicación primaria hacia otras partes del cuerpo. Una vez que el cáncer se hace metastásico, no se puede tratar efectivamente mediante cirugía ni terapia por radiación. Además, la causa predominante de la mortalidad de pacientes con cáncer es la metástasis. Se sabe que la tirosina quinasas receptoras (RTK) desempeñan funciones decisivas en muchos procesos celulares, entre los que se incluyen la diferenciación, proliferación, migración, angiogénesis y supervivencia. Aunque se ha encontrado que el ROR2 facilita la metástasis de células cancerosas de melanoma y próstata, no existe una diferencia significativa en la expresión del ROR2 entre las líneas celulares de cáncer de mama agresivo y no agresivo. Sin embargo, la expresión del ROR1 tiene una correlación importante con las líneas celulares de cáncer de mama agresivo.

Mientras que la invención no está limitada por las teorías en cuento a su mecanismo de acción, es notable que el RORl activa los genes que codifican para las proteínas implicadas en las metástasis del cáncer de mama, tales como Snail-1, Snail-2, TCF8/ZEB, CK-19, Vimentin, CXCR4 . Recientemente se reportó que ?KT estará implicado con funciones de metástasis, incluyendo la EMT, la resistencia a apoptosis y angiogénesis. Como se demuestra en los Ejemplos, el RORl sobre-regula la actividad de AKT y la exposición de células MDA-MB-231 al anticuerpo DIO anti-RORl reduce la actividad de p-AKT. Estos datos sugieren que la inhibición de la activación de AKT regulada por el RORl pueda ser un mecanismo durante el cual DIO ejerce su efecto anti-tumor.

Con respecto a la metástasis del cáncer de mama en particular, utilizando firmas de expresión génica se encontró que la expresión del RORl en tumores de mama primarios está asociada con la metástasis del cáncer de mama incluyendo la metástasis ósea, pulmonar, y cerebral. Entre 582 casos que se analizaron, el índice de recaídas fue del 55% en el grupo con alto contenido del RORl en comparación con 37% en el grupo con bajo contenido del RORl. De manera importante, éste índice de recaídas aumentó al 63% en el 75avo-100 con RORl. La expresión del RORl también está correlacionada en gran medida con marcadores tumorales de cáncer de mama clínicamente agresivo, incluyendo ER-, PR-, y Her2-. Aunque no hubo ninguna diferencia estadísticamente significativa entre los grupos con base en la etapa T del cáncer de mama, el porcentaje de pacientes con alto contenido del ROR1 aumentó del 51% al 77% en las etapas TI y T4, respectivamente. La metástasis órgano-específica (cáncer de mama a pulmón o hueso) se inhibió significativamente mediante la supresión del RORl de acuerdo con la invención. Estos datos sugieren que el RORl puede regular ciertos genes específicos de pulmón y hueso, tales como CXCR4.

Las quimiocinas humanas están comprendidas de una súper-familia de 48 ligandos que se unen a 19 diferentes receptores de quimiocinas acoplados a la proteína G. Se ha planteado como hipótesis que las células tumorales metastásicas pueden "secuestrar" las vías principales de migración celular mediada por el receptor de quimiocina. Las células tumorales de cáncer de mama expresan receptores de quimiocina seleccionados que incluyen CXCR4. La inhibición del eje CXCL12-CXCR4 de acuerdo con la invención puede bloquear la metástasis in vivo de la línea celular MDA-MB 231 hacia el pulmón. Las células MDA-MB-231 lentificadas para el RORl tienen una expresión más baja del CXCR4 que el MDA-MB-231 paternal o el MDA-MB-231 transfectado con CTRL-shRNA.

Al utilizar el análisis de expresión génica, se encontró que la expresión del R0R1 también estuvo asociada con la metástasis de pulmón (figura IB), hueso (figura 1C), y cerebro (figura ID). Con base en un análisis de indices de riesgos, se determinó que el R0R1 será un predictor incluso mejor de la metástasis ósea y pulmonar, general, que el ER, PR y HER2. El ROR1 también será un gen predictor relacionado con la metástasis con base en la tasa general de recaídas de los pacientes de cáncer de mama con recaídas generales por el estado ER y RORl. Aunque hubo alguna diferencia entre los casos de ER+ y ER- en la etapa temprana de la supervivencia sin metástasis, sólo los casos con bajo RORl y alto RORl tuvieron diferencias significativas en las últimas etapas de supervivencia sin metástasis. De esta forma, la invención proporciona una trayectoria para inhibir la metástasis y mejorar la supervivencia del paciente.

En general, la dosificación de los anticuerpos administrados del RORl, los componentes del anticuerpo del RORl, las composiciones de vacuna con un péptido de unión, los inmuno-conjugados de estos y las proteínas de fusión variarán dependiendo de factores tales como la edad, peso altura, sexo, condición médica general e historial médico anterior del paciente. Típicamente, es conveniente proporcionar al recipiente con una dosificación del componente de anticuerpos, la vacuna, el inmuno-conjugado o la proteína de fusión que esté en la variación de aproximadamente 1 ng/kg hasta 20 g/kg (cantidad del agente/peso corporal del paciente), aunque una dosificación menor o superior también se puede administrar según lo dicten las circunstancias.

La administración de anticuerpos, componentes de anticuerpos, vacunas, inmuno-conjugados o proteínas de fusión a un paciente será intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, mediante perfusión a través de un catéter regional, o mediante inyección intralesional directa. Cuando se están administrando proteínas terapéuticas, péptidos o conjugados mediante inyección, la administración puede ser mediante infusión continua o mediante un solo bolo o múltiples bolos.

Aquellos expertos en la téenica se darán cuenta de que la inyección intravenosa proporciona un modo de administración útil debido a la profundidad de la circulación en los anticuerpos que se distribuyen rápidamente. Sin embargo, la administración intravenosa, está sujeta a limitación mediante una barrera vascular que comprende células endoteliales de la vasculatura y la matriz sub-endotelial. Todavía, la barrera vascular es un problema más notable para la absorción de los anticuerpos terapéuticos por tumores sólidos. Los linfomas tienen velocidades de flujo sanguíneos relativamente altos, que contribuyen para el suministro efectivo de anticuerpos. Las rutas de administración intralinfáticas, tales como inyección subcutánea o intramuscular, o mediante caterización de vasos linfáticos, también proporciona un medios útil para el tratamiento de linfornas.

De preferencia, los anticuerpos del ROR1, los péptidos de unión, los inmuno-con ugados de los mismos y las proteínas de fusión se administran a bajas dosis de proteínas, tales como 20 hasta 3000 miligramos de proteína por dosis, una vez administrados, o repetidamente, parenteralmente . Alternativamente, la administración se realiza en dosis de 100 hasta 300 miligramos de proteína por dosis, o 300 hasta 1000 miligramos de proteína por dosis, 1000 hasta 2000 miligramos de proteína por dosis.

La presente invención también contempla métodos terapéuticos en los cuales los componentes del anticuerpo del ROR1 están radio-marcados o suple entados con la administración de un inmuno-conjugado radiomarcado o una proteína de fusión. En una variación, los anticuerpos del R0R1 se administran al igual o con anticuerpos o fragmentos del ROR1 radio-marcado a dosis bajas. Como una alternativa, los anticuerpos del ROR1 se pueden administrar con inmuno-conjugados RORl-citoquinas radio-marcados a dosis bajas.

Aquellos con experiencia normal en la téenica estarán familiarizados con moléculas de radio-marcación farmacéuticamente aceptables y sus niveles adecuados de dosificación. Para referencia, considérense "bajas dosis" de inmuno-con ugados -marcados, en donde una dosificación preferida está en la variación de 15 hasta 40 mCi, mientras que la variación más preferida es 20 hasta 30 mCi. Por el contrario, una dosificación preferida de inmuno-conjugados 90Y-marcados está en la variación de 10 hasta 30 mCi, mientras la variación más preferida es 10 hasta 20 mCi.

La invención en todos sus aspectos se ilustra adicionalmente en los siguientes Ejemplos. Sin embargo, los Ejemplos no pretenden limitar el alcance de la invención, el cual se define por las reivindicaciones anexas.

Ejemplo 1 El RORl está asociado con la recaída metastásico temprana en el adenocarcinoma de mama Se indagaron los datos del transcriptomas en la base de datos GEO sobre células de cáncer de mama aisladas de pacientes en una cohorte combinado de 582 pacientes. Aproximadamente dos terceras partes (426 de 582) de estos casos no tuvieron cáncer detectable en los ganglios linfáticos regionales en el momento de la cirugía y no se les administró terapia adyuvante. El resto de los casos tuvieron una enfermedad detectable en los ganglios linfáticos regionales y recibieron terapia hormonal adyuvante y/o quimioterapia. Entre los 582 casos, 46% recayeron (n=270), y tuvieron un tiempo medio de supervivencia sin metástasis de 22.1 meses. Se segregamos pacientes en tres grupos con base en su expresión relativa de células cancerosas del ROR1. Los pacientes con tumores que tuvieron el tercer nivel superior de la expresión de ARNm del RORl (R0R1H) tuvieron una supervivencia significativa más corta sin metástasis que los pacientes que tuvieron el tercer nivel inferior (R0R1L) o nivel intermedio (RORlM) de expresión del RORl (p<0.0001; figura 1A) . Se examinó la supervivencia sin metástasis mediante los sitios orgánicos. Se encontró que los pacientes con tumores del R0R1H tuvieron mayores indices de metástasis hacia el pulmón (p = 0.002; figura 45A), hueso (p=0.004; figura 45B), o cerebro (p=0.04; figura 45C) que los pacientes con cánceres de mama por el RORlL o R0R1M. Los cánceres por el RORlH tuvieron proporciones de tumores significativamente menores con características de pronóstico favorables, tales como los receptores de estrógenos/progesterona o el HER2, que los cánceres con R0R1L o R0R1M.

El alto nivel de expresión del RORl también se desempeño como un factor independiente para predecir la supervivencia más corta sin metástasis. Los pacientes con tumores del RORlH tuvieron un mayor índice de metástasis, recaída temprana, y supervivencia deficiente que los pacientes con tumores del R0R1L/M, sin importar el estado ER, PR, o HER2 (figuras 46A, 46B, 46C, 46D, 46E, 46F Y 46G).

Además, indagación de los datos de matriz de GSE2034, GSE2603, GSE5327, y GSE12276 para las firmas génicas EMT en cáncer de mama revelaron que los tumores del R0R1L tuvieron niveles de expresión significativamente superiores de los genes asociados con células epiteliales, tales como CDH1 (que codifica para E-Caderina), TJP1 (que codifica para Z01), y TJP3 (que codifica para Z03), aunque los menores niveles de expresión de los genes asociados con células mesenquimales, tales como SNAI1 (que codifica para Snail-1), SNAI2 (que codifica para Snail-2), CDH2 (que codifica para N-Caderina) o VIM (que codifica para Vimentin), que los tumores de R0R1H (figura IB).

Ejemplo 2 Líneas celulares de cáncer de mama del ROR1 + Se examinaron catorce distintas líneas de expresión del ROR1 de células epiteliales de cáncer de mama, incluyendo seis líneas celulares de cáncer de mama tipo basal y ocho lineas de cáncer de mama tipo luminal. El nivel de expresión del RORl fue significativamente mayor en las lineas celulares de cáncer de mama tipo basal con relación al de las lineas celulares de cáncer de mama tipo luminal, que en general no expresa el RORl. Además, los niveles de expresión relativa del RORl se correlacionan con los fenotipos de tumores agresivos, tales como ERNegPRNegHER2/NeuNeg triple negativo, y el alto nivel de capacidad de migración e invasión in vitro.

El RORl se lentificó mediante lineas celulares de cáncer de mama tipo basal, bastante invasivo (por ejemplo, MDA-MB-231) utilizando los ARN de horquilla corta (shARN) que se dirigen a cualquiera de dos secuencias diferentes del RORl. La expresión de la proteina del RORl se inhibió en células transíectadas con ya sea RORl-shRNAl o R0Rl-shRNA2, en contraste con las células transíectadas con un shRNA control (CTRL-shRNA) (figura 47A). La indagación de los datos de matriz para las diferencias de expresión génica entre MDA-MB-231 transfectado con CTRL-shRNA o RORl-shRNA (acceso GEO: GSE31631) reveló que las células lentificadas para el RORl tuvieron mayores niveles de expresión de KRT19 (que codifica para CK19), menores niveles de expresión de CXCR4 y VIM para MDA-MB-231 o MDA-MB-231 paternal transíectados con CTRL-shRNA. Estos hallazgos se confirmaron mediante qRT-PCR (figura 47B, figura 48A). Los análisis de citometría de flujo también demostraron que la expresión en la superficie celular de CXCR4 fue menor en células lentificadas para ROR1 (figura 48B).

Para evaluar las funciones potenciales del R0R1 en la regulación del EMT, se examinaron marcadores EMT asociados en células tratadas con CTRL-shRNA o RORl-shRNA. La supresión de la expresión del R0R1 con ya sea RORl-siRNA o R0R1-shRNAl/2 en cualquiera de tres distintas lineas celulares de cáncer de mama tipo basal (MDA-MB-231, HS-578T, o BT549) atenuó su expresión de ARNm y/o las proteínas codificadas asociadas con EMT (por ejemplo, vimentin, SNAIL-1/2, y ZEB1). Inversamente, la lentificación del ROR1 aumentó la expresión del ARNm y las citoqueratinas epiteliales codificadas (por ejemplo CK-19). Aunque no hubieron cambios significativos en el ARNm de TJP1 que codifica para ZO-1 en cualquiera de las 3 líneas celulares examinadas, las células lentificadas para el ROR1 tuvieron mayores niveles de expresión de esta proteína de unión firme, lo que sugiere que ZO-1 podría estar bajo control pos-traduccional (figuras 1C, ID y figuras 49A, 49B, 49C). Por último, la transfección de células MCF7 ROR1 negativas para expresar el ROR1 disminuyó la expresión de proteínas epiteliales (por ejemplo E-Caderina y CK19), y aumentó la expresión de los factores transcripcionales EMT, tales como SNAIL1/2 (figura 1E).

En cultivo, las células MDA-MB-231 HS-578T, o BT549 típicamente había exhibido una morfología estrellada la cual es similar a la de las células mesenquimales in vi tro. Sin embargo, después de la transfección con RORl-shRNA estas células asumieron una morfología más esférica, que fue similar a la de las células epiteliales (figura 2A). La transfección de estas células con CTRL-shRNA no indujo estos cambios. Además, los tinción por inmunoflorescencia reveló que la transfección con RORl-shRNA indujo que las células MDA-MB-231 expresen niveles modestos de E-Caderina y mayores niveles de CK-19, aunque redujo la expresión de Vimentin (figura 2B). También se observaron resultados similares para las células HS-578T o BT549. Por otro lado, en comparación con las células no tratadas o las células transíectadas con un vector control, las células MCF7 RORl-negativas desarrollaron una semejanza morfológica con las células mesenquimales y tuvieron una expresión disminuida de marcadores epiteliales (por ejemplo CK19 y E-Caderina), y una expresión aumentada de marcadores mesenquimales, tales como Vimentin, cuando se transfectaron para expresar el ROR1. Además, las células lentificadas para el ROR1 tuvieron menos capacidad de migración/invasión en comparación con las células tratadas con CTRL-shRNA (figuras 2E y 2F). También se encontró que la quimiotaxis hacia CXCL12 se redujo significativamente en las células lentificadas para el R0R1 (figuras 48A, 48B y 48C). Se obtuvieron resultados virtualmente idénticos utilizando células lentificadas con ya sea RORl-shRNAl o R0Rl-shRNA2. Colectivamente, estos resultados indican que la expresión del RORl puede contribuir a EMT y metástasis tumoral.

Ejemplo 3 La lentificación del RORl Inhibe la metástasis pulmonar ortotópica Cultivo celular Las lineas celulares de cáncer de mama MDA-MB-231, HS-578T, BT549, MDA-MB-415, MDA-MB-435s, MDA-MB-436, MDA-MB- 157, MDA-MB-134, MCF7, BT-474, MDA-MB-453, SKBR3, MDA-MB-330, y BT-483 se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC) y se mantuvieron como se describió anteriormente (Neve et al. Cáncer Cell, 10:515 (2006)).

Supresión del RORl La supresión del RORl se alcanzó al tener como objetivo las secuencias 5'-TCC GGA TTG GAA TTC CCA TG-3' (shRNAl), y 5'- CTT TAC TAG GAG ACG CCA ATA-3' (shRNA2) como se describió anteriormente (Zhang, S. Et al., Cáncer Cell 16:67 (2009)). Se creó un control de shRNA no especifico al tomar como objetivo las secuencias 5'- AGC GGA CTA AGT CCA TTG C-3'. Se utilizaron sistemas de expresión lentiviral VirapowerMR (Invitrogen) para expresar el shRNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las estructuras de ROR1-shRNAl y CTRL-shRNAl también codificaron para la proteina de fluorescencia roja (RFP). Los oligonucleótidos para las estructuras RORl-shRNAl y CTRL-shRNAl se sintetizaron (Integrated DNA Technologies) y se insertaron en el vector RFP-pLKO.l. Las estructuras RORl-shRNA2 y CTRL-shRNA2 se adquirieron de Open Biosystems (Rockford, IL). Las partículas virales para infección de las líneas celulares de cáncer de mama se obtuvieron mediante transfección de la línea celular de empacado 293-FT y se recolectaron de los sobrenadantes celulares a las 48 y 72 hrs después de la transfección. Los sobrenadantes se filtraron y se sometieron a centrifugación a 43,000 x g para concentrar las partículas virales, que se utilizaron para infectar cultivos sub-confluentes en presencia de 5 mg/ml de polibreno durante la noche.

Veinticuatro horas después de la transfección, las células se seleccionaron con 2 pg/ml de puromicina. Las células suprimidas se clasificaron mediante citometría de flujo utilizando un mAb anti-RORl (4A5). Las células clasificadas que expresan establemente shRNAl o shRNA2 se designaron RORl-shRNAl o R0Rl-shRNA2, respectivamente. Las poblaciones reunidas de células suprimidas, obtenidas en las primeras 10 generación después de la clasificación celular sin subclonación, se inyectaron en ratones rag-/-y-/- para experimentos in vivo. La eficacia de la supresión del R0R1 se confirmó mediante PCR cuantitativa con análisis para expresión génica verde Sybr de transcripción inversa (qRT-PCR) (Applied Biosystems), o análisis de inmuno-transferencia Western (anticuerpo anti-RORl, S41Q2, Señalización Celular). Se utilizaron p2-microglobulina y actina como controles endógenos para qRT-PCR y transferencia Western, respectivamente.

Análisis de migración e invasión Trans-well Las células cancerosas se acondicionaron durante la noche en medio de Eagle modificado con Dulbecco suplementado con 0.2% de suero bovino fetal (FBS) sin factores de crecimiento. El siguiente dia, las células se trataron con tripsina y se resuspendieron en 0.2% de medio FBS DMEM sin factores de crecimiento. Las células tumorales se sembraron a una densidad de 25,000 células por pocilio en insertos trans-well (tamaño de poro 3 mM, BD Falcon) para análisis de migración o a una densidad de 50,000 células por pocilio en cámaras de invasión, con factor de crecimiento reducido, recubiertas con matrigel (tamaño de poro 8 mM, BD Biosciences) . Los pocilios se lavaron con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y se fijaron con 4% de paraformaldehído después de 6 h para los análisis de migración o después de 22 h para los análisis de invasión. Las células sobre el costado apical de cada inserto se retiraron mediante raspado. Las células que habían migrado hacia el costado basal de la membrana se tiñeron y se visualizaron con un microscopio invertido Nikon.

Análisis del ARNm y la expresión proteínica El ARN total se purificó utilizando el kit RNeasy (Qiagen) y se utilizaron 2 mg de cada muestra para generar el ADNc utilizando los kits de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (ABI). Cada uno de los ADNc se analizó por triplicado utilizando un sistema PCR en tiempo real rápido ABI 7500 (Applied Biosystem). Los niveles para expresión de proteina se evaluaron mediante análisis de inmuno-transferencia con lisados celulares (40-60 pg) en tampón de lisis (20 mm HEPES (pH 7.9), 25% de glicerol, NaCl 0.5 N, EDTA 1 mm, 1% de NP-40, ditiotreitol 0.5 mm, y 0.1% de desoxicolato ) que contuvo los inhibidores de proteasa (Roche) utilizando anti-RORl (Señalización Celular) y anticuerpos ant ?-b-actina (Señalización Celular).

Citometría de flujo Las células de cáncer de mama se tiñeron o se recolectaron clasificadas mediante citometría de flujo. Las células se lavaron y se resuspendieron en albúmina al 2% de suero bovino (BSA) (Sigma) en solución de PBS y se tiñeron para la expresión del RORl utilizando un anticuerpo Alex488-conjugado (clon 4A5 o clon DIO) o un control de isotipos IgG2b o IgG2a, Alex488-conjugado de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los datos de citometría de flujo se recolectaron utilizando un citómetro FACSCalibur (BD Biosciences) y analizaron utilizando el software FlowJo.

Análisis de inmunoflorescencia e inmunohistoquímica Se fijaron pulmones de ratón con 4% de parafor aldehído y se incrustaron en parafina o se congelaron en OCT para examen histopatológico. Las secciones de tejido (5 mm de grueso) se prepararon y se tiñeron con hematoxílina y eosina (H&E) o los anticuerpos primarios p-AKT (Ser473, D9E, Señalización Celular), p-Creb (Serl33, 87G3, Señalización Celular) , CK-19 (RCK108, Dako), o Vimentin (D21H3, Señalización Celular). Las imágenes se recolectaron utilizando un microscopio Delta Visión y se procesaron con el software SPOT.

Análisis de la metástasis Se inyectaron ratones Rag-/-y-/- hembras con: una recolección de células MDA-MB-231 RORl-shRNAl (grupo 1), y células shRNA control para MDA-MB-231 paternal (grupo 2). Las células se inyectaron intravenosamente a través de la vena lateral de la cola en 100 ml de PBS (5 * 105 para los grupos 1-2; 2 x 105 para los grupos 3-4) o se administraron mediante inyección intracardiaca en 100 ml PBS (1*105 para los grupos 5-6). La formación de imágenes por luminiscencia no invasiva se realizó semanalmente mediante los sistemas para formación de imágenes IVIS 200. Todos los ratones gue no murieron con anterioridad o parecieron enfermos se sacrificaron a las 3-4 semanas después de la inyección, y se retiraron sus pulmones y se fijaron en 10% de for alina.

Para estudiar el efecto del R0R1 sobre la metástasis in vivo de un xenoinjerto de almohadilla mamaria, se indujeron tumores de cáncer de mama en ratones hembra Rag-/—y—/— de ocho semanas de edad al inyectar 100 m? de una suspensión celular única (1*106 células viables/ratón) subcutáneamente en la segunda área de almohadilla de grasa de la glándula mamaria abdominal derecha. El tamaño del tumor se midió cada 3 dias. Los tumores se retiraron cuando los volúmenes del tumor alcanzan 300mm3. Para estudiar el efecto terapéutico de los anticuerpos monoclonales anti-RORl en la metástasis del cáncer de mama, los tumores del cáncer de mama se indujeron en ratones hembra Rag-/-y-/- de ocho semanas de edad a través de la inyección intravenosa de 100 ml de una suspensión celular única (5><105 células/ratón). Semanalmente se inyectaron intravenosamente mAb IgG o anti-RORl de ratón. Se realizó semanalmente una formación de imágenes por bioluminiscencia no invasiva. Cinco semanas después del establecimiento del xenoinjerto, los ratones se sacrificaron y los pulmones se retiraron y se fijaron en 10% de formalina.

Análisis de datos para la expresión génica con Oncomine Se compiló un conjunto de datos de micromátriz de 582 pacientes a partir de la base de datos GEO (GEO2603, GSE5327, GSE2034 y GSE12276). Estos conjuntos de datos se transformaron mediante log2 y cada micromátriz se centró en la media de todas las soluciones de ensayo. Para cada paciente, la supervivencia sin metástasis se definió como el intervalo de tiempo entre la cirugía y el diagnóstico de la metástasis. Los niveles relativos de la expresión de ARNm del RORl en tejidos humanos se determinaron mediante análisis del a base de datos Oncomine Cáncer (www.oncomine.org) de un conjunto de datos publicados de la expresión génica. Los datos se transformaron mediante log-2, con el ajuste medio a cero y el ajuste s.d. a uno.

Análisis estadísticos. Utilizando la prueba de rango logarítmico se realizaron comparaciones entre las curvas Kaplan-Meier. Los datos se presentan como ± error estándar de la media (SEM). Se utilizó una prueba t de Student no pareada para comparar dos grupos a menos que se indique lo contrario. Un p<0.05 se consideró estadísticamente significativo.

El desempeño del ROR1 para predecir la supervivencia sin metástasis se analizó mediante análisis multivariables con modelos de regresión en riesgo proporcional Cox. Se reportan la proporción de riesgo de cada covariable y su 95% de intervalo de confianza. Los valores P se calculan con base en la distribución normal, evaluando la probabilidad de la hipótesis nula (proporción en riesgo = 1, es decir sin significancia predictiva) que será verdadera.

El potencial metastásico de CTRL-shRNA transfectado se comparó con las células MDA-MB-231 del RORl-shRNA transfectado, que se transfectaron establemente utilizando un vector de expresión de luciferasa/GFP en un modelo ortotópico (figura 3A). La inyección de 2.5-10><105 células en la almohadilla de grasa mamaria subcutánea de ratones RAG-/-yc-/- inmunodeficientes generó tumores primarios en el sitio de inyección que se podrían monitorear vía bioluminiscencia. No se observaron diferencias significativas en los aumentos progresivos en la bioluminiscencia de tumores que resultaron de la inyección de células transíectadas con CTRL-shRNA contra células transíectadas con RORl-shRNA hasta 3 o más semanas después de la inyección de al menos 1*106 células, como se observó en estudios anteriores. Para examinar las diferencias en las velocidades de metástasis "espontánea" del cáncer, los tumores primarios que resultan de la inyección de IcIO6 células se retiraron quirúrgicamente cuando alcanzaron un volumen de 300mm3 (linea punteada, figura 3B). Debido a las diferentes velocidades de crecimiento, el número promedio de días desde la inyección de las células hasta la eliminación quirúrgica de los tumores primarios fue significativamente mayor para los ratones inyectados con las células lentificadas para el ROR1 (40 ± 2.5 días) que para los ratones que recibieron números iguales de células transíectadas con CTRL-shRNA (31 ± 0.5 días) (figura 3B). Los tumores primarios extirpados tuvieron volumen, peso y bioluminiscencia ex vivo, similares (figuras 3C, 3D y 3E). Después del retiro del tumor primario, se monitorearon para enfermedad metastásica vía bioluminiscencia. Los animales inyectados con las células transíectadas con CTRL-shRNA tuvieron una bioluminiscencia significativamente mayor en el pulmón o hígado en el momento de la escisión del tumor primero que los ratones injertados con las células lentificadas para el ROR1 en el último momento cuando tuvieron sus tumores primarios extirpados (figuras 3E y 3F). Los animales inyectados con las células lentificadas para el ROR1 tuvieron un menor aumento detectable en la bioluminiscencia del pulmón con relación a los ratones inyectados con las células transíectadas con CTRL-shRNA (figura 3G). Los animales se sacrificaron 21 días después de que se les extirparon sus tumores primarios para examinar la bioluminiscencia ex vivo, el tamaño, y la histología del pulmón (figuras 3H, 31 y 3J) y el hígado (figura 3K y 3L). Los pulmones e hígados extirpados de los ratones inyectados con las células transí ectadas con CTRL-shRNA tuvieron bioluminiscencia y peso significativamente mayores que aquellos ratones inyectados con las células con el ROR1 lentificado. Además, los pulmones e hígados de ratones inyectados con las células transíectadas con CTRL-shRNA tuvieron una enfermedad metastásica extensiva, lo cual no se observó en los tejidos de ratones inyectados con las células del RORl-lentificado (figuras 3J y 3L).

Ejemplo 4 La lentificación del RORl inhibe la metástasis experimental en pulmón y huesos Las células MDA-MB-231 transíectadas con RORl-shRNA o CTRL-shRNA se administraron a ratones Rag/_g de 6 semanas de edad vía intravenosa (5><105 células) o mediante inyección intracardiaca (IcIO5 células) para evaluar las diferencias en el potencial metastásico de las células inyectadas en la sangre ya sea venosa o arterial. Todos los animales que recibieron las células transíectadas con CTRL-shRNA en la vena lateral de la cola murieron en un término de 32 días de la inyección debido a la metástasis pulmonar. Los animales que tuvieron números iguales de células transíectadas con RORl-shRNA inyectadas en la vena de la cola sobrevivieron significativamente por mayor tiempo (figura 4A). los animales inyectados con las células transíectadas con CTRL-shRNA tuvieron una bioluminiscencia mayor de 19 veces o 60 veces en los pulmones en el día 21 o el día 28, respectivamente, que los ratones inyectaron con las células lentificadas para el ROR1 (figura 4B). También se sacrificaron los animales en otro experimento en diversos momentos para examinar los pulmones para la enfermedad metastática. Mientras que se detectaron fácilmente focos metastásicos nacientes a los 3 días después de la inyección de las células transfectadas con CTRL-shRNA, unos cuantos, si no es que cualquiera, de los focos metastásicos se podrían detectar en los pulmones de los animales inyectados con las células con el ROR1 lentificado, incluso en puntos de tiempo posteriores (figuras 4C, 4D y 4E). Además, los pulmones extirpados de ratones inyectados con las células transíectadas con CTRL-shRNA tuvieron bioluminiscencia y peso medio ex vivo significativamente mayores y (3 veces y 6 veces en los dias 21 y 28, respectivamente) que los pulmones de los ratones inyectados con las células con el ROR1 lentificado (figuras 4F y 4G, datos no mostrados) . Los focos metastásicos que se desarrollaron en animales inyectados con las células transíectadas con CTRL-shRNA también expresaron mayores niveles de fosfo-AKT y fosfo-CREB y tuvieron mayores proporciones de células proliferantes que los pocos focos metastásicos que se detectaron en ratones inyectados con células del RORl lentificado, lo cual en lugar de esto expreso mayores niveles de CK-19 y menores niveles de Vimentin (figuras 47A y 47B).

También se examinaron para enfermedad metastásica después de la inyección de 1c105 células en el ventrículo cardiaco izquierdo. Todos los ratones que recibieron las células transíectadas con CTRL-shRNA murieron en un término de 30 días de esta inyección, mientras que los animales inyectados con las células del RORl lentificado sobrevivieron significativamente por mayor tiempo (figura 4H). Los ratones inyectados con las células transíectadas con CTRL-shRNA desarrollaron bioluminiscencia sustancial en el área femoral/pélvica , la cual no se detectó en los ratones inyectados con células tumorales lentificadas para el ROR1 (figuras 41 y 4J). Los animales se sacrificaron en el día 21 y se encontró que los huesos femorales/pélvicos aislados de los ratones inyectados con las células transíectadas con CTRL-shRNA tuvieron una alta bioluminiscencia (figura 4K) debido a una metástasis extensiva de la médula (figura 4L) lo cual no fue evidente en ratones inyectados con las células lentificadas para el ROR1.

Estudios recientes han encontrado que diferentes sitios de tejido imponen diferentes necesidades para el establecimiento de metástasis por las células cancerosas en circulación. Las líneas celulares de cáncer de mama humano BoM1833 y LM2-4175 se seleccionaron a partir de MDA-MB-231 para tener diferentes tropismo tisular. BoM-1833 de preferencia realiza la metástasis hacia el hueso y LM2-4175 de preferencia realiza la metástasis hacia el pulmón. Se encontró que cada una de estas líneas celulares conservó la expresión del RORl (figura 5A). La transfección de cada línea celular con RORl-shRNA2 lentificó la expresión del RORl (figura 5B y 5C), permitiendo examinar la dependencia del RORl de la metástasis órgano-específica después de la inyección intravenosa de 2><105 LM2-4175 o la inyección intracardiaca de 1*105 BoM-1833 en ratones RG-/-yc-/- de 6 semanas de edad. Los ratones inyectados con LM2-4175 lentificado para el R0R1 tuvieron un aumento medio significativamente menor en la bioluminiscencia pulmonar y una supervivencia media significativamente mayor que los ratones inyectados con LM2-4175 transfectado con CTRL-shRNA (figura 5D y 5E). Consistente con estas observaciones, los pulmones de ratones aislados 21 dias después de la inyección del LM2-4175 con el R0R1 lentificado tuvieron un peso medio, bioluminiscencia ex vivo, significativamente menores, y focos metastásicos menores y más lentos que los ratones inyectados con LM2-4175 transfectado con CTRL-shRNA (figuras 5F, 5G y 5H). Similarmente, los ratones inyectados con BoM-1833 lentificado para el R0R1 tuvieron aumentos significativamente menores en la bioluminiscencia esquelética que los ratones inyectados con números iguales de BoM-1833 transíectados con CTRL-shRNA (figura 51 y 5J). Además, la necropsia de los animales sacrificaron 21 dias después de la inyección intracardiaca revelaron, unos cuantos, si no es que ningún, foco metastásico detectable en el hueso o hígado. Esto estuvo en contraste marcado con la enfermedad metastásica extensiva detectada en cada uno de estos sitios en los animales inyectados con el BoM-1833 transfectado con CTRL-shRNA (figura 5J y 5K).

Ejemplo 5 Un anticuerpo Anti-RORl inhibe la metástasis del cáncer Se generaron anticuerpos monoclonales (mAb) específicos para el dominio extracelular del ROR1 y uno, designado DIO, podría inducir una rápida sub-modulación del R0R1 superficial a 37°C (figura 5A). El tratamiento de MDA-MB-231 con DIO provocó la internalización del ROR1, según se evaluó con microscopía confocal (figura 5B). Esto dio por resultado en una reducción significativa del RORl superficial, según se evaluó mediante citometría de flujo utilizando un diferente mAb específico para un epítope de bloqueo sin cruce, distinto, del RORl (figura 5C). El tratamiento de MDA-MB-231 con DIO también redujo la expresión de la Vimentin citoplásmica (figura 5D) que se unió al RORl en estudios de co-inmuno-precipitación (figura 5E) . El tratamiento con DIO también inhibió significativamente la capacidad de migración e invasión de MDA-MB-231 in vitro (figura 5F y 5G). DIO también podría inhibir la capacidad de migración/invasión de otras líneas celulares cancerosas del ROR1+ (por ejemplo HS-578T y BT549 (figuras 9A, 9B, 9C, 9D, 9E, 9F, 9G, 9H, 919J, 9K)).

DIO se evaluó para la inhibición de la invasión y metástasis de MDA-MB-231 inyectada en la vena de la cola de ratones RAG-/-yc-/-. Después de la inyección de 5><105 células, a los ratones se les administró una inyección intravenosa del IgG o DIO control a 5 mg/kg y luego se sacrificaron 3 dias más tarde. La bioluminiscencia ex vivo de los pulmones de animales a los que se les administró DIO fue significativamente menor que la de los animales tratados con el IgG control (figura 5H). Además, los pulmones de animales que recibieron el IgG control tuvieron focos metastásicos múltiples los cuales no se pudieron detectar en ratones tratado con DIO. En otro experimento, cada ratón recibió una inyección intravenosa de 5*105 MDA-MB-231 y luego se les administro 3 inyecciones intravenosas semanalmente del IgG o DIO control a 5 mg/kg. Los ratones tratados con DIO desarrollaron bioluminiscencia pulmonar significativamente menor que los ratones a los que se les administró el IgG control (figuras 51 y 5J). Cuando se sacrificaron en el día 35, los pulmones de los ratones tratados con DIO tuvieron un peso significativamente menor (figura 5K) y menos focos metastásicos (figura 5L) que los pulmones de los animales a los que se les administró el IgG control. Colectivamente, estos datos indican que DIO puede inhibir la metástasis en ratones inmuno-deficientes.

En conclusión, por lo tanto se demuestra que el ROR1 puede mediar la metástasis del cáncer de mama y que la selección como objetivo terapéutico del ROR1 puede retrasar el desarrollo de metástasis de cáncer de mama. Aunque las células madre embrionarias expresan la proteina del ROR1 detectable y la pérdida del ROR1 puede intensificar las anormalidades cardiacas y esqueléticas en ratones ROR2 deficientes, los tejidos de adultos mayores raramente expresan la proteina del ROR1, excepto a bajos niveles en el páncreas y el tejido adiposo, mientras proporcionando los anticuerpos y métodos para su uso de la invención con especificidad del cáncer del ROR1.

Ejemplo 6 Anticuerpos con alta afinidad del ROR1 Estudios en epítopes se realizaron sobre el anticuerpo DIO del ROR1, descrito anteriormente. Se generaron una serie de proteínas quiméricas con tramos del ROR1 humano y de ratón para mapear los epítopes reconocidos por DIO que pueden sub-regular el ROR1, llevar a cabo la reducción en la expresión de Vimentin, e inhibir la migración in vitro de células cancerosas (un buen marcador sustituto de la capacidad del cáncer para formar metástasis). La única región del ROR1 que está implicada es el dominio similar a Ig que está sobre el término amino del ROR1. Cada estructura contiene un dominio similar a Ig quimérico y el CRD humano y el dominio Kringle (la porción del ratón es clara y la porción humana es oscura). Aquí solo se muestran los dominios similares a Ig (figura 6). Estas estructuras se expresaron en 293 células de estilo libre. Se utilizaron medios de cultivo, se utilizaron para ELISA proteínas de inmuno-transferencia y purificadas. Debido a que el mAb de DIO anti-RORl reconoció el ROR1 humano, pero no el ROR1 de ratón, el hallazgo de cuáles de estas estructuras se podrían o no unir podría ayudar a mapear el epítope reconocido por DIO. Los resultados indican que el anticuerpo DIO se une al ROR1 en el término C del dominio similar a Ig contiguo al dominio CRD (figura 7). La figura 8, muestras el mapeo del epítope para el anticuerpo 4A5 del ROR1. Como se indica, el epítope 4A5 difiere del epítope DIO.

Como se describió anteriormente, un anticuerpo anti-RORl, es decir DIO, puede inhibir la metástasis pulmonar de la célula MDA-MB-231 in vivo. El anticuerpo monoclonal DIO facilita la internalización del receptor R0R1 (figuras 9A y 9B) . Las células MDA-MB-231 se tiñeron con iso-Alex647, o Dl0-Alex647 durante 30 min en hielo. Las células teñidas luego se separaron en dos fracciones. Una fracción se mantuvo en hielo durante 1 h y la otra fracción se transfirió a 37°C durante 15 min, 30 min. El tratamiento de veinticuatro horas del anticuerpo DIO anti-RORl disminuyó la expresión superficial del ROR1 en las células MDA-MB-231 (figura 9C).

El R0R1 forma un complejo con Vimentin en la células MDA-MB-231 de cáncer de mama (figura 9D). El tratamiento del anticuerpo DIO in vitro podría disminuir la expresión de Vimentin (figura 9E). Los anticuerpos anti-RORl disminuyeron la migración in vitro del cáncer de mama. (Figura 9F). El anticuerpo monoclonal DIO inhibe la metástasis pulmonar MDA-MB-231 en etapa temprana (día 2) del cáncer de mama (figura 9G). El anticuerpo monoclonal DIO inhibe la metástasis pulmonar MDA-MB-231 del cáncer de mama (figura 9H). Los ratones con xenoinjerto se inyectaron intravenosamente (í.v.) con 200 mg del anticuerpo anti-RORl en el día 1, y 100 mg del anticuerpo anti-RORl en los día 3, 7, 14, y 21. Se muestran los fotoflujos normalizados a partir del pulmón de ratones que portan MDA-MB-231. Los ratones representativos inyectados con las células 5E5 MDA-MB-231 se muestran en la posición dorsal (figura 91). El tratamiento del anti-RORl redujo el peso pulmonar de los ratones que portan MDA-MB-231 (figura 9J) . La histología H&E pulmonar representativa a partir de ratones que portan MDA-MB-231 después del tratamiento con el anticuerpo anti-RORl (figura 9K). Las barras de error indican SEM; *p<0.05, **p<0.01; con base en una prueba t de Student bilateral no pareada.

Las estructuras representadas en la figura 6 se utilizaron para seleccionar anticuerpos recombinantes de alta afinidad. Los nativos occidentales también indicaron la totalidad de tres mAb similares a DIO humanizado objetivos del mismo epitope que DIO y requirieron el aminoácido 138 para la unión al ROR1 humano (figura 10). Las estructuras ROl-ex humanos y quiméricos se transfectaron en 293 células. Esto permitió la producción de proteínas RORl recombinantes quiméricas de humano-ratón que se podrían dimensionar por separado en un gel PAGE sin desnaturalizar o un gel SDS PAGE para análisis de inmuno-transferencia con diferentes mAb anti-RORl. Los resultados indican que los anticuerpos tanto DIO como 99961 se unen a la misma región, en el término C del dominio similar a Ig, y que DIO y 99961 se pueden unir al RORl bajo condiciones tanto desnaturalizadas como naturales. El dominio extracelular humano completo se proporciona en la línea izquierda de cualquier gel (figura 11). El anticuerpo 99961 tuvo una afinidad de unión 50x mayor para el RORl que DIO y redujo la carga leucémica más que DIO (figuras 12A, 12B y 12C). El anticuerpo 99961 se humanizó para producir cuatro anticuerpos designados 99961.1, 99961.2, 99961.3 y 99961.4.

Caracterización del anticuerpo 99961 del RORl Se realizaron análisis para demostrar la actividad específica del 99961 contra las células CLL en ratones inmuno-deficientes con sangre umbilical humana reconstituida.

Los ratones rag-/-y-/- con células de sangre umbilical (CB) humana reconstituida para desarrollar un sistema inmunitario humano se inyectaron i.p. con CLL PBMC recién preparado o congelado. Al siguiente día, a los ratones se les administraron 1 mg/kg de 99961 o DIO o mlgG control i.v. Siete dias después, las células CLL PBMC provenientes de la cavidad peritoneal se recolectaron y se analizaron mediante citometria de flujo (figura 13A). Los datos indican gue 99961 elimina el >90% de las células CLL y no tuvo efecto sobre el desarrollo normal de células humanas B o T (figuras 13B, 13C).

También se realizaron estudios para demostrar la actividad especifica de 99961 en AML primario del ROR+. Los resultados indican que 99961 disminuye la supervivencia de las colonias primarias y las capacidades de auto-renovación de las colonias secundarias (figuras 14A, 14B y 14C).

El mapeo de epitopes del mAb 99961 demostró que este epitope sólo se expresa en diversos cánceres y no en la célula de la sangre umbilical o las células adultas humanas o progenitoras o las células madre derivadas del hígado fetal (figura 15). También se ha mostrado que 99961 se une a células leucémicas pero no realiza reacción cruzada con tejidos normales de adulto (figura 16). La matriz ulti-tejidos de linfoma provino de Lifescan Biosciences (LS- SLYCA5) con secciones provenientes de 40 linfomas, hubieron 5 casos donde Ab9991 se unió a las células malignas. La matriz de multi-tejidos normales de Biomax (FDA999) con secciones provenientes de múltiples tejidos normales diferentes no mostró áreas de unión especificas con 99961. La inmuno-histoquímica se realizó utilizando una recuperación de antigenos inducida por calor con un tampón a alto pH proveniente de DAKO (Carpenteria, CA) seguido por intensificación utilizando amplificación con biotiniltiramida (CSA kit de DAKO).

Se realizaron estudios PK de 99961 con el anticuerpo 1 mg/ratón inyectado i.v. en ratones Rag -/-y-/- . Se extrajo sangre en diferentes puntos de tiempo y se midieron mediante ELISA los niveles del mAb 99961 en plasma. Los resultados indican que la vida media del anticuerpo fue 11.4 dias, el volumen fue 1.18 mL (47 mL/kg) y el intercambio fue 0.072 mL/día (0.12 mL/hr/kg) todos consistentes con otras macromoléculas y anticuerpos utilizados clínicamente (figuras 17A y 17B).

Ejemplo 7 Vacuna peptídica del ROR1 Como se analizó anteriormente, se ha mostrado que DIO se une en el término carboxi del dominio similar a Ig que está contiguo al dominio CRD del ROR1. El anticuerpo 4A5 se une a un diferente epitope en el dominio similar a Ig y carece de actividad biológica. Los epitopes de los Ab se confirmaron mediante ex- y sitios-mutación del R0R1 quimérico de los diferentes aminoácidos entre el R0R1 humano y de ratón. Se construyeron péptidos correspondientes al dominio extracelular del R0R1 donde se unen los anticuerpos DIO, 4A5 y otro del R0R1, A19, R22 y K19. El péptido Al9 corresponde al epitope reconocido por el mAb 4A5; el péptido R22 corresponde al epitope reconocido por el mAb de DIO, el mAb 99961 (es decir VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC), y los mAb 99961 humanizamos; y el péptido K19 corresponde a una región en el dominio Kringle que se reconoce por el otro mAb especifico para el RORl (figura 18). Cada uno de los tres péptidos se conjugó en el término C con hemocianina de lapa californiana (KLH) para inmunización en adyuvante de Freund completo (CFA) o adyuvante de Freund incompleto (IFA). Se agregó cisteina (C) al término C y se utilizó para conjugación con el KLH con MBS (figura 20). La reacción de conjugación se representa en la figura 19. Se mostró que los péptidos conjugados se unen a DIO y 99961 (figura 21). Se inmunizaron ratones C57BL/6 y transgénicos con los péptidos conjugados. Los títulos de anticuerpos se recolectaron 4 semanas después de la inmunización. La vacuna de R22-KLH indujo los mayores títulos de antisuero anti-RORl en ya sea ratones C57BL/6 o ratones de RORl-Tg (figura 28). Este experimento se repitió con un péptido del aminoácido 16 del epitope DIO, R16 que también indujo anticuerpos que reaccionaron con la proteina del ROR1 humano, aunque los títulos en general fueron menores que aquellos inducidos por R22-KLH (datos no mostrados).

Se mostró que los anticuerpos anti-RORl inducidos mediante R22-KLH se unen al ROR1 superficial presente en las células EW36, JeKo-1, o CLL (figura 29). Para este estudio, se incubó una dilución de antisueros proveniente de ratones inmunizados con R22-KLH con las células durante 20 minutos a 4°C. Las células luego se lavaron y luego se marcaron con un Ig antí-ratón de cabra que se conjugó con un fluorocromo para detección mediante citometria de flujo. Los histogramas abiertos son las células teñidas con el Ig anti-ratón de cabra sin incubar primero las células con los antisueros R22-KLH . Los histogramas sombreados son la fluorescencia de las células que se incubaron primero con los antisueros anti-R22-KLH. El aumento de fluorescencia de las células es debido a que los anticuerpos anti-RORl de ratón se unen a la superficie, los cuales luego se detectaron con el Ig anti ratón de cabra. Los antisueros de pre-inmunización de estos ratones o los antisueros de ratones inmunizados con KLH no se unieron a estas células (figura 29).

Los anti-sueros inducidos por R22-KLH se probaron para citotoxicidad de complemento dependiente. Las células EW36, Jeko-1, CLL-1 y CLL-2 se lavaron y se colocaron en placas a 25 ml con 5*105 células por pocilio en RPMI/10% de FBS en placas de 96 pocilios de fondo redondo (Corning Costar). Se agregaron por pocilio los antisueros diluidos (25 ml) y 25 m? de una dilución 1:5 de complemento de conejo bebé. Como un control positivo se utilizó mAb DIO. Todas las condiciones se realizaron por triplicado. Las placas se incubaron durante 4 h a 37°C, y las células se cuantificaron inmediatamente para viabilidad mediante tinción con DÍ0C6/PI y Análisis de Citometría de Flujo. Este estudio indica que ya sea DIO o los antisueros generados contra el péptido R22 podrían dirigir la lisis complemento mediada de las células que portan el ROR1 humano (figura 30). Las células que no portan el ROR1 no se exterminaron.

Se examinaron las sub-clases Ig de los anticuerpos inducidos por R22-KLH. Para esto, se utilizó una ELISA utilizando placas recubiertas con el ROR1 humano las cuales luego se incubaron con antisueros diluidos, se lavaron y luego se detectaron utilizando anticuerpos secundarios conjugados con enzimas específicos para cada uno de las subclases IgG, según se indica en el eje x. Los resultados muestran que IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3 todos se indujeron en grados variables. IgG2a, IgG2b e IgG3 están asociados con el perfil Thl y el IgGl está asociado con el perfil Th2. Estos resultados indican que las células T auxiliares CD4+ de Thl y Th2 ambas se activan después de la vacunación.

R22-KLH se utilizó para inmunizar ratones C57BL/6 como se muestra en la figura 31. La primera inyección del péptido KLH o R22-KLH fue en CFA. La segunda y posteriores inyecciones fueron en IFA. Los animales se sangraron en los dias marcados con la flecha púrpura. Cuarenta cuatro días después del día de la primera inyección, los ratones C57BL/6 se inocularon con células CLL que expresan el R0R1 humano que se originaron en un ratón transgénico con el ROR1 humano. Este ratón fue transgénico para la leucimia 1 por células T (gen TCL1). Ambos transgenes están bajo el control de un promotor/intensificador específico de células B (E-Cp). Esta leucemia asemeja la CLL humana y expresa el RORl superficial humano .

Los antisueros recolectados produjeron una reducción significativa en la carga celular de leucemia en ratones inmunizados con R22-KLH, pero no en ratones inmunizados con KLH. (Figuras 32A y 32B).

Ratones C57BL/6 R22-KLH se utilizó para inmunizar ratones C57BL/6 de acuerdo con el esquema como se muestra en la figura 33. La primera inyección del péptido KLH o R22-KLH fue en CFA. La segunda y posteriores inyecciones fueron en IFA. Los animales se sangraron en los dias marcados con la flecha púrpura. Cuarenta cuatro dias después del dia de la primera inyección, los ratones C57BL/6 se inocularon con células CLL que expresan el ROR1 humano que se originaron en un ratón transgénico con el ROR1 humano que también fue transgénico para la leucemia por células T (gen TCLl). Ambos transgenes están bajo el control de un promotor/intensificador especifico de células B (E-Cp). Esta leucemia asemeja la CLL humana y expresa el R0R1 superficial humano.

Se observó la respuesta de anticuerpos hacia el ROR1 humano en ratones inmunizados con R22-KLH en el dia 42, pero no en ratones inmunizados con KLH. Los 4 ratones inmunizados con R22-KLH generaron anticuerpos de títulos altos contra el ROR1 humano según se detectó vía ELISA utilizando placas recubiertas con el dominio extra-celular de la proteína del RORl humano recombinante. Estos datos indican que la inmunización con el péptido R22-KLH puede interrumpir la auto-tolerancia hacia el RORl, que se expresa en todas las células B de estos ratones con el RORl-Tg. Los bazos de los ratones a los que se les administró el péptido R22-KLH permanecieron similares a los de los animales control, aunque los ratones KLH tuvieron bazos significativamente más grandes (figuras 34A y 34B).

Citometrí de flujo de esplenocitos provenientes de ratones C57BL/6 inmunizados con ya sea KLH o R22-KLH, utilizando el mAb conjugado con flurocromo especifico para CD5 o ROR1. El mAb utilizado para teñir las células se une a un epítope sin bloqueo cruzado de ROR1 distinto a los anticuerpos inducidos por R22-KLH. Obsérvese que existen mucho menos, si no es que ninguna, células de leucemia en los bazos de ratones inmunizados con la vacuna de R22-KLH (figura 39).

El número total de células de leucemia encontradas en los bazos de ratones C57BL/6 inyectados con el péptido R22-KLH, 30 días antes con 1c105 células de CLL del ROR1+ humano fue significativamente menor que los bazos de ratones inyectaron con KLH. El número de células de leucemia por bazos se derivó al multiplicar el porcentaje de células de leucemia en las poblaciones de esplenocitos (según se evaluó vía citometría de flujo) por el número de esplenocitos recolectados del bazo (figuras 34A y 34B).

El número de células CD8t en los bazos de ratones inmunizados con KLH o R22-KLH se determinó mediante citometría de flujo. Después de la inmunización con R22-KLH hubieron aumentos dramáticos en las células CD8 T, las cuales no se aumentaron en los ratones inmunizados con KLH. La flecha inferior indica el número absoluto de celulas T CD8 recolectadas a partir de los bazos de los ratones en el día 75 (figuras 37A y 37B).

Ratones transgénicos C57BL/6 ROR1 Se inyectaron ratones trasngénicos con ya sea R22-KLH o KLH como se muestra en la figura 38. Los ratones son transgénicos para el ROR1 humano bajo un promotor/intensificador específico para células B (E-Cp). La primera inyección del péptido KLH o R22-KLH fue en CFA. La segunda y posteriores inyecciones fueron en IFA. Los animales se sangraron en los días marcados con la flecha púrpura. Cuarenta y cuatro días después del día de la primera inyección, los ratones C57BL/6 se inocularon con células CLL que expresan el ROR1 humano que se originaron en un ratón RORl-Tg que también fue transgénico para la leucemia 1 de células T (gen TCL1). Ambos transgenes están bajo el control de un promotor/intensificador específico para células B (E-Cp) . Por lo tanto, estos ratones RORl-Tg tuvieron células B que expresan el ROR1 humano. Los resultados demuestran que el péptido R22-KLH puede inducir una inmunidad anti-RORl protectora en ratones que expresan el RORl y por lo tanto interrumpir la auto-tolerancia.

Se observó una respuesta de anticuerpos hacia el ROR1 humano en ratones RORl-Tg inmunizados con R22-KLH en el dia 42, pero no en ratones inmunizados con KLH. Los 4 ratones inmunizados con R22-KLH generaron anticuerpos de títulos altos contra el ROR1 humano según se detectó vía ELISA utilizando placas recubiertas con el dominio extra-celular de la proteína del ROR1 humano recombinante. Análisis adicionales mediante citometría de flujo demostraron que existen menos, sí es que ninguna, células de leucemia en los bazos de ratones inmunizados con la vacuna R22-KLH que con los ratones inmunizaron con KLH (figura 40). El análisis FAC también mostró que el ROR1 se sub-moduló en los ratones inmunizados con R22-KLH pero no en los ratones inmunizados con KLH. Los bazos provenientes de ratones inmunizados con R22-KLH tuvieron significativamente menos células de leucemia en comparación con los ratones inmunizados con KLH. Al igual que con los ratones C57BL/6, la inmunización con KLH del péptido R22 condujo a aumentos dramáticos en las células T CD8, las cuales no se aumentaron en los ratones inmunizadas con KLH (figura 39). Se observaron resultados similares con células T CD4+ (figuras 43A y 43B) y células T CD3+ (figura 42) .

Ratones BALB/c Se inmunizaron ratones BALB/c con KLH o R22-KLH como se muestra en la figura 22. Para esto, cada péptido KLH o conjugado con KLH se formó en una emulsión con un adyuvante (CFA o IFA). CFA se utilizó para la primera inmunización y IFA se utilizó para el refuerzo posterior. Se indican los dias de sangrado e inyección del péptido.

Mediante ELISA se determinaron los niveles de anticuerpo de anti-RORl inducidos por R22-KLH. El dominio extra-celular del ROR1 purificado se recubrió sobre una placa de 96 pocilios y los anti-sueros se incubaron con tiempos de dilución indicados a partir de los días de sangrado individuales. Los resultados de ELISA indicaron que la concentración de los anticuerpos anti-RORl se indujeron en ratones BALB/c inmunizados a través del tiempo. Los sueros provenientes de estos animales recolectados antes de la inmunización no reaccionaron con la proteína del ROR1, incluso a una baja dilución del suero.

Los análisis de inmuno-transferencia también indicaron que los anticuerpos anti-RORl generados por la inmunización con R22-KLH de ratones BALB/c produjeron anticuerpos anti-RORl que tuvieron la misma especificidad del epítope que DIO (figura 23). Además, parece que los antisueros también reaccionan con la proteína del ratón.

El análisis FAC confirmó la unión de los antisueros provenientes de ratones R22-KLH inmunizados con BALB/c para el ROR1 sobre la superficie de las células.

Ratones transgénicos Be inmunizaron ratones transgénicos con ya sea KLH o R22-KLH como se muestra en la figura 24. El péptido conjugado con KLH se mezcló con un adyuvante (CFA o IFA). CFA se usó para la primera inmunización e IFA se utilizó para el siguiente refuerzo. Los resultados de ELISA indican que las concentraciones de los anticuerpos anti-RORl se indujeron en ratones transgénicos con el ROR1 inmunizados con R22-KLH a través del tiempo. El análisis FACS confirmó la unión de los anti-sueros provenientes de ratones transgénicos con el ROR1 inmunizados con R22-KLH hacia el ROR1 sobre la superficie de las células.

Los antisueros provenientes de ratones inmunizados con R22-KLH se examinaron para la capacidad de internalización del receptor RORl. Las células MDA-MB-231 se incubaron con anti-sueros provenientes de ratones transgénicos a 4°C o 37°C durante 1 h y luego se tiñeron con el isotipo Alexa647, o 4A5-Alexa647 durante 30 min sobre hielo del análisis FACS de la expresión del RORl. Los resultados muestran que los sueros anti-RORl provenientes de ratones transgénicos inmunizados con R22-KLH indujeron la internalización del receptor ROR1 (figura 25).

Los antisueros provenientes de ratones inmunizados con R22-KLH se examinaron para determinar su afecto sobre la migración del cáncer de mama. Las células migradas se observaron bajo un aumento 10* después de 1 h del tratamiento con anti-sueros y luego a 16 h de la incubación a 37°C. Los resultados son la media ± s.e.m. n=3. **p<0.01. Los resultados indican que los sueros anti-RORl provenientes de ratones transgénicos podrían disminuir la migración in vi tro del cáncer de mama (figuras 26D y 26B).

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES :

1. Un anticuerpo anti-RORl aislado, caracterizado porque tiene la misma especificidad de unión que el anticuerpo 99961.

2 . El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo se une a los aminoácidos 130-160 del hROR-1.

3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo requiere que el aminoácido 138 del ROR1 sea ácido glutámico para la unión al hROR-1.

4 . El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:l, la SEC ID NO:5, la SEC ID NO:9, la SEC ID NO:13 y la SEC ID NO:17, y la región variable de cadena ligera se selecciona del grupo que consiste de la SEC ID NO:3, la SEC ID NO:7, la SEC ID NO:ll, la SEC ID NO:15 y la SEC ID NO:19.

5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo con una afinidad de unión está entre aproximadamente 500 pM y aproximadamente 6 nM.

6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la afinidad de unión es de aproximadamente 800 pM.

7. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de 99961, 99961.1, 99961.2, 99961.3 y 99961.4.

8. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la metástasis.

9. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el anticuerpo es humano, humanizado o quimérico.

10. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica para el anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-9.

11. Una vacuna contra las células que expresan el ROR-1, la vacuna caracterizado porque comprende una composición farmacéuticamente aceptable de un péptido aislado o producido sintéticamente que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con la región de unión al ROR-1 del anticuerpo DIO.

12. La vacuna de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos de la región de unión al ROR-1 del anticuerpo DIO es VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC.

13. La vacuna de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos de la región de unión al ROR-1 del anticuerpo DIO es EVVSSTGVLFVKFGPC.

14. La vacuna de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la célula de expresión del ROR-1 es una célula cancerosa.

15. La vacuna de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste de: leucemia por células B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, cáncer ovárico, de colon, pulmonar, de la piel, pancreático, testicular, de la vejiga, uterino, prostético y adrenal.

16. La vacuna de conformidad con las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizada además porque comprende un adyuvante inmunogénico.

17. La vacuna de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el adyuvante es un péptido portador inmunogénico conjugado con el péptido de unión.

18. La vacuna de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos del péptido de unión es VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC y el péptido portador inmunogénico es hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino u ovalbúmina.

19. La vacuna de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos del péptido de unión es EVVSSTGVLFVKFGPC y el péptido portador inmunogénico es hemocianina de lapa californiana (KLH).

20. Un péptido de unión al ROR1 caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC.

21. El péptido de unión de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el péptido es de origen mamífero.

22. Un ácido nucleico aislado que codifica para el péptido de unión de conformidad con la reivindicación 20.

23. Un péptido de unión al RORl caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con EVVSSTGVLFVKFGPC.

24. El péptido de unión de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el péptido es de mamífero .

25. Un ácido nucleico aislado que codifica para péptido de unión de conformidad con la reivindicación 23.

26. Un método para suprimir la metástasis del cáncer que expresa el ROR-1, el método caracterizado porque comprende interrumpir la transición mesenquimal a epitelial de las células tumorales al administrar un anticuerpo que tenga la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal 99961, una vacuna comprendida de un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con la región de unión al ROR-1 del anticuerpo DIO, un péptido de unión al ROR-1 que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC o un péptido de unión ROR-1 que tiene un secuencia de aminoácidos con al menos 95% de identidad de secuencia con EVVSSTGVLFVKFGPC.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el cáncer que expresa el ROR-1 se selecciona del grupo que consiste de: leucemia por células B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, cáncer ovárico, de colon, pulmonar, de la piel, pancreático, testicular, de la vejiga, uterino, prostético, y adrenal.

28. Un método para tratar o prevenir un cáncer en un sujeto, el método caracterizado porque comprende administrar al sujeto un anticuerpo que tenga la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal 99961, una vacuna comprendida de un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con la región de unión al ROR-1 del anticuerpo DIO, un péptido de unión al ROR-1 que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC o un péptido de unión al ROR-1 que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 95% de identidad de secuencia con EVVSSTGVLFVKFGPC.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de: leucemia por células B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, cáncer ovárico, de colon, pulmonar, de la piel, pancreático, testicular, de la vejiga, uterino, prostático, y adrenal .