ES2231817T3 - Anticuerpos del factor anti-tejido injertados a cdr y procedimientos de uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION PROPORCIONA ANTICUERPOS CDR ONTRA EL FACTOR TISULAR HUMANO QUE MANTIENEN LA ALTA AFINIDAD DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES DE ROEDORES CONTRA EL FACTOR TISULAR, PERO CON UNA INMUNOGENICIDAD REDUCIDA. ESTOS ANTICUERPOS HUMANIZADOS SON POTENTES ANTICOAGULANTES Y, POR CONSIGUIENTE, UTILES PARA EL TRATAMIENTO Y PROFILAXIS DE LA ENFERMEDAD TROMBOTICA EN EL HOMBRE. LA INVENCION TAMBIEN PROPORCIONA METODOS DE OBTENCION DE ANTICUERPOS CDR FARMACEUTICAS PARA ATENUAR O PREVENIR LA COAGULACION.

Description

Anticuerpos del factor anti-tejido injertados a CDR y procedimientos de uso de los mismos.

Ambito de la invención

Los anticuerpos monoclonales capaces de inhibir el factor tisular (TF) son útiles como coagulantes. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales de roedores convencionales, tienen un uso limitado en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico en humanos debido a la inmunogenicidad y la corta vida media del suero. La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales injertados a la CDR contra el TF que retienen la alta afinidad de unión de los anticuerpos de los roedores pero que tienen inmunogenicidad reducida. Los presentes anticuerpos humanizados son potentes anticoagulantes y, por ello, son útiles en el tratamiento y profilaxis de la enfermedad trombótica humana. Igualmente, la presente invención proporciona procedimientos para la obtención de anticuerpos injertados en la CDR y composiciones farmacéuticas para la atenuación o prevención de la coagulación.

Fundamentos de la invención

La coagulación de la sangre implica una serie en cascada de reacciones que conducen a la formación de fibrina. La cascada de coagulación consiste en dos vías solapadas, ambas de las cuales son necesarias para la hemostasis. La vía intrínseca comprende factores proteínicos presentes en la sangre en circulación, en tanto que la vía extrínseca requiere el factor tisular, el cual se expresa sobre la superficie de la célula de una diversidad de tejidos en respuesta a la lesión vascular (Davie y otros, Biochemistry, vol. 30, pág. 10363, (1991)). Los agentes que interfieren con la cascada de coagulación, tales como los derivados de heparina y cumarina, son usos terapéuticos bien conocidos en la profilaxis de la trombosis venosa (Goodman y Gilman, eds., The Pharmacological Basis of Therapeutics, NacMillan Publishing Co., Inc., New York, (1980)).

El factor tisular ha sido investigado como un objetivo diana para la terapia anticoagulante. El TF es una glucoproteína de membrana que funciona como un receptor para el Factor VII y VIIa y, de esta forma, inicia la vía extrínseca de la cascada de coagulación en respuesta a la lesión vascular. Además de su papel en el mantenimiento de la hemostasis mediante la iniciación de la coagulación de la sangre, al TF se le ha implicado en estados patogénicos. Específicamente, la síntesis y expresión de la superficie de la célula del TF se la ha implicado en la enfermedad vascular (Wilcox y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 86, pág. 2839, (1989)) y en el choque séptico gram-negativo (Warr y otros, Blood, vol. 75, pág. 1481, (1990)).

Ruf y otros (Thrombosis and Haemostasis, vol. 66, pág. 529, (1991)), han caracterizado el potencial anticoagulante de los anticuerpos monoclonales múridos contra el TF humano. La inhibición de la función del TF por la mayoría de los anticuerpos monoclonales que fueron evaluados, fue dependiente de la disociación del complejo TF/VIIa que se forma rápidamente cuando el TF entra en contacto con el plasma. Por ello, dichos anticuerpos fueron inhibidores relativamente lentos del TF en plasma. Un anticuerpo monoclonal, el TF8-5G9, fue capaz de inhibir el complejo TF/VIIa sin disociar el complejo, proporcionando, de esta forma, un efecto anticoagulante inmediato en el plasma. Ruf y otros, sugieren que el mecanismo que inactiva al complejo TF/VIIa, en lugar de prevenir su formación, puede proporcionar estrategias para la interrupción de la coagulación in vivo.

El uso terapéutico de anticuerpos monoclonales contra el TF es limitado, dado que los monoclonales normalmente disponibles son de origen roedor. El uso de anticuerpos de roedores en la terapia humana presenta numerosos problemas, siendo el más significativo de ellos la inmunogenicidad. Se ha encontrado que dosis repetidas de anticuerpos monoclonales de roedores provocan una respuesta anti-inmunoglobulina denominada anticuerpo anti-ratón humano (HAMA), lo que puede dar como resultado la enfermedad complejo-inmune y/o la neutralización del anticuerpo monoclonal. Véase, p. ej., Jaffers y otros, Transplantation, vol. 41, pág. 572, (1986). Si bien el uso de anticuerpos monoclonales humanos se enfrentaría con esta limitación, se ha demostrado que es difícil generar grandes cantidades de anticuerpos monoclonales humanos mediante la tecnología de hibridoma convencional.

La tecnología recombinante se ha usado en un esfuerzo para construir anticuerpos "humanizados" que mantengan la alta afinidad de unión de los anticuerpos monoclonales de roedores, pero que muestren inmunogenicidad reducida en humanos. Se han producido anticuerpos quiméricos en los cuales la región variable (V) de un anticuerpo de ratón está combinada con la región constante (C) de un anticuerpo humano en un esfuerzo para mantener la especificidad y afinidad del anticuerpo del roedor, pero reduciendo la cantidad de proteína que es no-humana y, por ello, inmunogénica. Aunque la respuesta inmune a anticuerpos quiméricos es, generalmente, reducida con respecto al anticuerpo del roedor correspondiente, la respuesta inmune no puede eliminarse completamente, puesto que la región V del ratón es capaz de provocar una respuesta inmune (Lobuglio y otros, Proc. Natl. Ascad, Sci., vol. 86, pág. 4220, (1989); Jaffers y otros, Transplantation, vol. 41, pág. 572, (1986)).

En un reciente camino para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos de roedores, únicamente las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) del roedor, en lugar del dominio V entero, se transplantaron a un anticuerpo humano. Dichos anticuerpos humanizados se conocen como anticuerpos injertados a la CDR. Las CDRs son regiones de hipervariabilidad en las regiones V que están flanqueadas por regiones relativamente conservadas conocidas como regiones de marco de lectura (FR). Cada dominio V contiene tres CDRs flanqueadas por cuatro FRs. Las CDRs se pliegan para formar el sitio de unión del antígeno del anticuerpo, en tanto que los FRs soportan las conformaciones estructurales de los dominios V. De esta forma, mediante el transplante de las CDRs de roedores a un anticuerpo humano, puede igualmente teóricamente transferirse el dominio de unión del antígeno. Owens y otros, en J. Immunol. Methods, vol. 168, pág. 149, (1994) y Winer y otros, en Immunology Today, vol. 14, pág. 243, (1993), revisan el desarrollo de anticuerpos injertados a la CDR.

Orlandi y otros, en Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 86, pág. 3833, (1989), han construido un anticuerpo humanizado contra el hapteno relativamente simple nitrofenilacetilo (NP). El anticuerpo injertado a la CDR contenía CDRs de ratón y FRs humanos, y mostró actividad de unión al NP similar al del anticuerpo de ratón nativo. Sin embargo, la construcción de anticuerpos injertados a la CDR que reconocen antígenos más complejos, ha dado como resultado anticuerpos que tienen actividad de unión significativamente más baja que los anticuerpos de roedores nativos. En numerosos casos, se ha demostrado que la mera introducción de las CDRs de roedores dentro de una base genética de anticuerpo humano es insuficiente para mantener la actividad de unión completa, debido, posiblemente, a la distorsión de la conformación de la CDR por el FR humano.

Por ejemplo, Gorman y otros, en Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 88, pág. 4181, (1991), han comparado dos anticuerpos humanizados contra CD4 humano y han observado avideces considerablemente diferentes, dependiendo de la región del marco de lectura humano particular del anticuerpo humanizado. Co y otros, en Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 88, pág. 2869, (1991), precisaron un modelo de computadora refinado del anticuerpo múrido de interés con el fin de identificar los aminoácidos críticos a considerar en el diseño de un anticuerpo humanizado. Kettelborough y otros, en Protein Engineering, vol. 4, pág. 773, (1991), informan de la influencia de los restos del FR particular de un anticuerpo injertado a la CDR sobre la unión del antígeno, y proponen que los restos pueden interactuar directamente con el antígeno, o pueden alterar la conformación de las hélices de la CDR. De manera similar, Singer y otros, en J. Immunol., vol. 150, pág. 2844, (1993), informan que la humanización óptima de un anticuerpo monoclonal múrido anti-CD18, depende de la capacidad del FR seleccionado para soportar la CDR en la conformación de la unión del antígeno apropiada. De acuerdo con ello, la recreación del sitio de unión del antígeno requiere la consideración de las potenciales interacciones intracadena entre el FR y la CDR, y la manipulación de los restos de aminoácidos del FR que mantienen contactos con las hélices formadas por las CDRs. Aunque se han propuesto directrices teóricas generales para el diseño de anticuerpos humanizados (véase, p.ej., Owens y otros), en todos los casos el procedimiento debe construirse a la medida y optimizarse para el anticuerpo de roedor particular de interés.

Existe una necesidad en la técnica de anticuerpos humanizados con inmunogenicidad reducida y afinidad de unión comparable con relación al anticuerpo de roedor progenitor para diversas aplicaciones terapéuticas. En particular, existe una necesidad de un anticuerpo humanizado contra el factor tisular humano que tenga actividad anticoagulante y sea útil en el tratamiento y la prevención de la enfermedad trombótica.

Resumen de la invención

La presente invención se dirige a anticuerpos injertados a la CDR capaces de inhibir el factor tisular humano, en los que las CDRs derivan a partir de un anticuerpo monoclonal no-humano contra el factor tisular y las regiones FR y constante (C) derivan a partir de uno o más anticuerpos humanos. En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal múrido es el TF8-5G9.

En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de un anticuerpo injertado a la CDR capaz de inhibir el factor tisular humano, cuyo procedimiento comprende la construcción de uno o más vectores de expresión que contienen ácidos nucléicos conteniendo la codificación de cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo injertado a la CDR, la transfección de células huéspedes adecuadas con el vector o vectores de expresión, el cultivo de las células huéspedes transfectadas, y la recuperación del anticuerpo injertado a la CDR.

La presente invención proporciona igualmente un procedimiento para la atenuación de la coagulación, el cual comprende la administración de un anticuerpo injertado a la CDR capaz de inhibir el factor tisular humano a un paciente que necesite de dicha atenuación.

La presente invención proporciona además un procedimiento de tratamiento o prevención de la enfermedad trombótica, el cual comprende la administración de un anticuerpo injertado a la CDR capaz de inhibir el factor tisular humano a un paciente que necesite de dicho tratamiento o prevención. En una realización preferida, la enfermedad trombótica es la coagulación intravascular, la restenosis arterial o la arterioesclerosis.

Otra realización de la presente invención está dirigida a una composición farmacéutica, la cual comprende anticuerpos injertados a la CDR capaces de inhibir el factor tisular humano y que, además, comprende un vehículo aceptable farmacéuticamente.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 proporciona el nucleótido y las secuencias de aminoácidos deducidas de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9.

La Figura 2 proporciona el nucleótido y las secuencias de aminoácidos deducidas de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9.

La Figura 3 es un gráfico que representa la capacidad del anticuerpo injertado a la CDR, TF8HCDR1 x TF8LCDR1, para unirse al factor tisular humano y para competir con el anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9 por la unión al factor tisular. Los símbolos rellenados indican la unión directa de TF8HCDR1 x TF8LCDR1 y el control positivo quimérico TF8-5G9 al factor tisular. Los símbolos sin rellenar indican la unión de competencia de TF8HCDR1 x TF8LCDR1 o del quimérico TF8-5G9 con el anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9.

La Figura 4 presenta la secuencia de DNA del vector de expresión pEe6TF8HCDR20 y la secuencia de aminoácidos de las regiones de codificación de la cadena pesada injertada a la CDR de TF8HCDR20.

La Figura 5 presenta la secuencia de DNA del vector de expresión pEe12TF8LCDR20 y la secuencia de aminoácidos de las regiones de codificación de la cadena ligera injertada a la CDR de TF8LCDR3.

La Figura 6 es un gráfico que representa la capacidad del anticuerpo injertado a la CDR, TF8HCDR20 x
TF8LCDR3, para unirse al factor tisular humano.

La Figura 7 es un gráfico que representa la capacidad del anticuerpo injertado a la CDR, TF8HCDR1 x TF8LCDR1, para competir con el anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9 por la unión al factor tisular.

La Figura 8 es un gráfico que representa la capacidad del anticuerpo injertado a la CDR, TF8HCDR1 x TF8LCDR1, para inhibir la activación del factor X.

La Figura 9 proporciona el vector de expresión pEe6TF8HCDR20 que resulta de la subclonación de la cadena pesada injertada a la CDR de TF8HCDR20 dentro del vector de expresión del mieloma pEehCMV-BglI. Se han usado las abreviaturas siguientes: VH es la región variable de la cadena pesada injertada a la CDR; C\gamma4 es la región constante de IgG4 humano; pA es la señal de poliadenilación; ampR es el gen \beta-lactamasa; y hCMV es citomegalovirus humano.

La Figura 10 proporciona el vector de expresión pEe12TF8LCDR3 que resulta de la subclonación de la cadena ligera injertada a la CDR de TF8LCDR3 dentro del vector de expresión del mieloma pEe12. Se han usado las abreviaturas siguientes: VL es la región variable de la cadena ligera injertada a la CDR; CK es la región constante kappa humana; SVE es el promotor temprano SV40; GS es el cDNA de glutamina sintetasa. Otras abreviaturas son tal como se han indicado en la Figura 9.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos injertados a la CDR capaces de inhibir el factor tisular humano, en los que las CDRs derivan a partir de un anticuerpo monoclonal no-humano contra el factor tisular y las regiones FR y C derivan a partir de uno o más anticuerpos humanos. La presente invención proporciona, además, procedimientos para la obtención y uso de los anticuerpos sujetos injertados a la CDR.

De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo injertado a la CDR es un anticuerpo, en el cual las CDRs derivan a partir de un anticuerpo monoclonal no-humano capaz de unirse e inhibir la función del factor tisular humano, y las regiones FR y C del anticuerpo derivan a partir de uno o más anticuerpos humanos. Las CDRs derivadas a partir del anticuerpo no-humano tiene, preferiblemente, desde aproximadamente 90% hasta aproximadamente 100% de identidad con las CDRs del anticuerpo no-humano, aunque se contemplan cualquiera y todas las modificaciones, incluyendo substituciones, inserciones y deleciones, siempre y cuando que el anticuerpo injertado a la CDR mantenga la capacidad para unirse e inhibir el factor tisular. Las regiones de los anticuerpos injertados a la CDR que derivan a partir de anticuerpos humanos no necesitan tener un 100% de identidad con los anticuerpos humanos. En una realización preferida, son retenidos tantos restos de aminoácidos humanos como es posible con el fin de que la inmunogenicidad sea despreciable, pero los restos humanos, en particular los restos de la región FR, son substituidos cuando es preciso y tal como se expone aquí más adelante de acuerdo con la presente invención. Dichas modificaciones tal como se describen aquí, son necesarias para soportar el sitio de unión del antígeno formado por las CDRs, al mismo tiempo que se maximiza simultáneamente la humanización del anticuerpo.

Los anticuerpos monoclonales no-humanos contra el factor tisular a partir de los cuales pueden derivarse las CDRs, son conocidos en la técnica (Ruf y otros, (1991); Morrisey y otros, Trombosis Research, vol. 52, pág. 247, (1988)), o pueden producirse por procedimientos bien conocidos de producción de anticuerpos monoclonales (véase, p. ej., Harlow y otros, eds., (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York). El factor tisular humano purificado contra cuyos anticuerpos monoclonales puede generarse, es, de manera similar, bien conocido (Morrisey y otros, Cell, vol. 50, pág. 129, (1987)) y disponible para el técnico experto. Los anticuerpos monoclonales múridos, y en particular el anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9 descrito por Ruf y otros y Morrisey y otros, en Trombosis Research, vol. 52, pág. 247, (1988), y en la Patente de EE.UU. No. 5.223.427, son particularmente preferidos.

El técnico normalmente experto puede determinar las secuencias de las CDRs por referencias a la literatura científica o los bancos de datos de secuencias publicados, o mediante clonación y secuenciación de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos mediante metodología convencional. De acuerdo con la presente invención, se proporcionan el cDNA y las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada (SEC ID NOS: 1 y 2, respectivamente) y de la cadena ligera SEC ID NOS: 3 y 4, respectivamente) del anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9. En la Figura 1, se proporciona el cDNA y la secuencia de aminoácidos deducida de la cadena pesada del múrido TF8-5G9. En la Figura 2, se proporciona el cDNA y la secuencia de aminoácidos deducida de la cadena ligera del múrido TF8-5G9.

Cada una de las regiones variables de la cadena pesada y ligera contienen tres CDRs que se combinan para formar el sitio de unión del antígeno. Las tres CDRs están rodeadas por cuatro regiones FR que funcionan fundamentalmente para soportar las CDRs. Las secuencias de las CDRs comprendidas dentro de las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, pueden identificarse mediante alineamiento ayudado por ordenador, de acuerdo con Kabat y otros, en Sequences of Proteins of Inmmunological Interest, 4th ed., United States Department of Health and Human Services, US Goverment Printing Office, Washington, D.C., (1987), o mediante formación de modelos moleculares de las regiones variables, por ejemplo usando el programa ENCAD tal como ha sido descrito por Levitt, en J. Mol. Biol., vol. 168, pág. 505, (1983).

En una realización preferida, las CDRs derivan a partir del anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9. Las CDRs de cadena pesada preferida tienen las secuencias siguientes:

	CDR1	DYYMH	(SEC ID NO:5)
	CDR2	LIDPENGNTIYDPKFQG	(SEC ID NO:6)
	CDR3	DNSYYFDY	(SEC ID NO:7)

Las CDRs de cadena ligera preferida tienen las secuencias siguientes:

	CDR1	KASQDIRKYLN	(SEC ID NO:8)
	CDR2	YATSLAD	(SEC ID NO:9)
	CDR3	LQHGESPYT	(SEC ID NO:10)

Las secuencias de las CDRs del múrido u otro anticuerpo no-humano, y en particular las secuencias de las CDRs del TF8-5G9, pueden modificarse mediante inserciones, substituciones y deleciones, hasta un grado tal que el anticuerpo injertado a la CDR mantenga la capacidad para unirse e inhibir el factor tisular humano. El técnico experto normal puede cercionarse del mantenimiento de esta actividad realizando los ensayos funcionales descritos aquí más adelante. Las CDRs tienen, por ejemplo, desde aproximadamente 50% hasta aproximadamente 100% de homología con las CDRs de las SEC ID NOS:5-10. En una realización preferida, las CDRs tienen desde aproximadamente 80% hasta aproximadamente 100% de homología con las CDRs de las SEC ID NOS:5-10. En una más realización preferida, las CDRs tienen desde aproximadamente 90% hasta aproximadamente 100% de homología con las CDRs de las SEC ID NOS:5-10. En realización la más preferida, las CDRs tienen desde aproximadamente 100% de homología con las CDRs de las SEC ID NOS:5-10.

Las regiones FR y C de los anticuerpos injertados a la CDR de la presente invención, derivan de uno o más anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanos de la misma clase y tipo que el anticuerpo a partir del cual derivan las CDRs, son los preferidos. El FR de la región variable de la cadena pesada deriva, preferiblemente, del anticuerpo humano KOL (Schmidt y otros, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., vol. 364, pág. 713, (1983)). El FR de la región variable de la cadena ligera deriva, preferiblemente, del anticuerpo humano REI (Epp y otros, Eur. J. Biochem., vol. 45, pág. 513, (1974)). De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que ciertos restos del FR humano son reemplazados, preferiblemente, por el resto correspondiente del anticuerpo no-humano a partir del cual derivan las CDRs. Por ejemplo, ciertos restos del FR del TF8-5G9 son, preferiblemente, retenidos para lograr la unión óptima al antígeno.

Por conveniencia, se ha adoptado aquí el esquema de numeración de Kabat y otros. Los restos se han designado mediante minúsculas o guiones según fuera necesario, para conformar las secuencias presentes a la secuencia estándar numerada de Kabat.

De acuerdo con la presente invención, los restos que son retenidos en la región FR, es decir, restos que no han sido reemplazados por restos FR humanos, se determinan de acuerdo con la directrices siguientes. Los restos que son idiosincráticos con el anticuerpo progenitor, p. ej., TF6-5G9, con respecto a la secuencia de consenso human de Kabat y otros, son retenidos. Los restos del anticuerpo progenitor que están de acuerdo con la secuencia de consenso, son retenidos si el resto correspondiente del anticuerpo humano, p. ej., KOL o REI, es idiosincrático. Los restos que forman parte de las estructuras canónicas en hélice del anticuerpo definidas por Chotia y otros, en Nature, vol. 342, pág. 877, (1989), tal como el resto 71 de las cadenas pesada y ligera, son retenidos. Los restos previstos para formar hélices, tales como los restos 28-30 de la cadena pesada, son retenidos. Los restos previstos para influir en la conformación de las CDRs, tales como los restos 48 y 49 de la CDR2 precedente de la cadena pesada, son retenidos. Los restos que han demostrado ser críticos en la humanización de otros anticuerpos pueden, igualmente, ser retenidos. Las directrices anteriores son seguidas hasta el punto necesario como para soportar el sitio de unión del antígeno formado por las CDRs, al mismo tiempo que simultáneamente se maximiza la humanización del anti-
cuerpo.

La secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada injertada a la CDR representativa, derivada a partir del anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9 y del anticuerpo monoclonal humano KOL, se muestra más adelante. La cadena pesada injertada a la CDR se designó como TF8HCDR1; los restos múridos se retuvieron en el FR en los restos 6, 17, 23, 24, 28, 29, 30, 48, 49, 68, 71, 73, 78, 88 y 91. Las CDRs están subrayadas.

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La secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera injertada a la CDR representativa, derivada a partir del anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9 y del anticuerpo monoclonal humano REI, se muestra más adelante. La cadena ligera injertada a la CDR se designó como TF8LCDR1; los restos múridos se retuvieron en el FR en los restos 39, 41, 46 y 105. Las CDRs están subrayadas.

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Un anticuerpo injertado a la CDR que contenía las regiones variables TF8HCDR1 y TF8LCDR1 se ha demostrado, de acuerdo con la presente invención, que es tan eficaz como el anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9 en la unión al factor tisular humano. Además, se ha descubierto que, de acuerdo con la presente invención, mediante el examen de la estructura molecular del anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9, y mediante el diseño, construcción y análisis de los anticuerpos injertados a la CDR, que las regiones FR pueden humanizarse adicionalmente sin pérdida de actividad de unión al antígeno. En particular, la región FR puede retener el resto FR humano en los restos 6, 17, 68, 73 y 78 de la cadena pesada, y los restos 39, 41, 16 y 105 de la cadena ligera, con mantenimiento de la actividad de unión al antígeno.

En una realización la más preferida, la región variable de cadena pesada contiene un FR derivado a partir del anticuerpo humano KOL, en la que los restos del anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9 están retenidos en los aminoácidos 23, 24, 28, 29, 30, 48, 49, 71, 88 y 91. La región variable de cadena pesada preferida se designó como TF8HCDR20 y tiene la secuencia siguiente:

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En una realización la más preferida, la región variable de cadena ligera contiene un FR derivado a partir del anticuerpo humano REI, en la que los restos del anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9 están retenidos en los aminoácidos 39 y 105. La región variable de cadena ligera preferida se designó como TF8LCDR3 y tiene la secuencia siguiente:

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Entra dentro del conocimiento del técnico experto normal el realizar modificaciones menores de las secuencias anteriores, incluyendo substituciones, deleciones e inserciones de aminoácidos. Cualquiera de dichas modificaciones entran dentro del alcance de la presente invención, siempre y cuando que el anticuerpo injertado a la CDR resultante mantenga la capacidad para unirse e inhibir el factor tisular humano. El técnico experto normal puede evaluar la actividad del anticuerpo injertado a la CDR con referencia los ensayos descritos aquí más adelante.

La región constante humana de los anticuerpos injertados a la CDR de la presente invención se selecciona con el fin de minimizar la función efectora. El uso al que se destinan los anticuerpos injertados a la CDR de la presente invención es el de bloquear la cascada de coagulación mediante la inhibición del factor tisular y, por ello, funciones efectoras del anticuerpo, tal como la fijación del complemento, no son deseables. Los anticuerpos con funciones efectoras mínimas incluyen IgG2, IgG4, IgA, IgD e IgE. En una realización preferida de la presente invención, la región constante de cadena pesada es la región constante IgG4 humana, y la región constante de cadena ligera es la región constante IgG4 kappa humana.

Dado que las funciones efectoras pueden no ser deseables para usos terapéuticos, la presente invención contempla además fragmentos activos de los anticuerpos injertados a la CDR, y en particular fragmentos Fab y fragmentos F(ab')_{2}. Los fragmentos activos son aquellos fragmentos capaces de inhibir el factor tisular humano. Los fragmentos Fab y fragmentos F(ab')_{2} pueden obtenerse por medios convencionales, por ejemplo, por escisión de los anticuerpos injertados a la CDR de la invención con la enzima proteolítica apropiada tal como papaína o pepsina, o por producción recombinante. Los fragmentos activos mantienen los sitios de unión al antígeno de los anticuerpos injertados a la CDR y, de esta forma, son similarmente útiles terapéuticamente.

La capacidad de los anticuerpos injertados a la CDR diseñados y construidos tal como se expone de acuerdo con la presente invención para unirse e inhibir el factor tisular humano, puede evaluarse mediante ensayos funcionales. Por ejemplo, en un ensayo rápido y conveniente, los vectores de expresión que contienen ácidos nucléicos con la codificación de las cadenas pesada y ligera injertadas a la CDR, pueden co-transfectarse dentro células huéspedes adecuadas y expresarse transitoriamente. Los anticuerpos resultantes pueden evaluarse mediante ensayos estándar con el fin de determinar la capacidad para unirse al factor tisular humano, y para determinar la capacidad para competir por la unión al factor tisular con el anticuerpo no-humano a partir del cual derivan las CDRs.

Por ejemplo, la expresión transitoria de ácidos nucléicos que contienen la codificación de las cadenas pesada y ligera injertas a la CDR en células COS, proporciona un sistema rápido y conveniente para comprobar la expresión y función del gen anticuerpo. Los ácidos nucléicos que contienen la codificación de las cadenas pesada y ligera injertas a la CDR, respectivamente, son clonados dentro de un vector de expresión de célula de mamífero, por ejemplo pSG5, descrito por Green y otros, en Nucleic Acids Res., vol. 16, pág. 369, (1988), y comercialmente disponible de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA. El vector de expresión pSG5 proporciona sitios de restricción únicos para la inserción de los genes de cadena pesada y ligera, y la expresión in vivo está bajo el control del promotor temprano SV40. La terminación transcripcional está señalada por la secuencia de la señal de poliadenilación de SV40.

Los vectores de expresión basados en el pSG5 que contienen los ácidos nucléicos con la codificación de las cadenas pesada y ligera, son co-transfectados dentro de células COS y cultivados bajo condiciones adecuadas para la expresión transitoria. A continuación, los medios de cultivo de células son recolectados y examinados para determinar su expresión de anticuerpos, por ejemplo mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA), con el fin de determinar qué niveles adecuados de anticuerpo se han producido. A continuación, puede usarse un ensayo ELISA para evaluar la capacidad del anticuerpo injertado a la CDR para unirse al factor tisular humano. El factor tisular humano se inmoviliza sobre una placa de microvaloración y se agrega el sobrenadante de células COS que contiene el anticuerpo injertado a la CDR, seguido de una incubación a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora. A continuación, las placas se lavan con un tampón que contiene detergente adecuado tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS)/Tween, seguido de la adición de los componentes de un sistema de detección adecuado. Por ejemplo, se agrega anticuerpo policlonal de cadena kappa anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante, seguido de lavado y, a continuación, la adición de substrato para la peroxidasa de rábano picante, y detección. Los anticuerpos injertados a la CDR que entran dentro del alcance de la presente invención, son aquellos que son capaces de unirse al factor tisular humano hasta un grado comparable al del anticuerpo no-humano a partir del cual derivan las CDRs, tal como se determina mediante el ensayo anterior.

La capacidad de los anticuerpos injertados a la CDR para inhibir la actividad del factor tisular humano in vivo, puede evaluarse de manera conveniente mediante el ensayo in vitro siguiente, el cual imita los episodios de coagulación in vivo. En respuesta a la lesión vascular in vivo, el factor tisular se une al factor VII y facilita la conversión del factor VII en una serina proteasa (factor VIIa). El complejo factor VIIa-factor tisular convierte el factor X en una serina proteasa (factor Xa). El factor Xa forma un complejo con el factor Va (procedente de la vía de coagulación intrínseca), dando como resultado la conversión de protrombina en trombina, la cual, a su vez, da como resultado la conversión de fibrinógeno en fibrina. En un ensayo funcional in vitro conveniente, el factor tisular se incuba en presencia del factor VIIa y el anticuerpo del factor anti-tisular injertado a la CDR producido en el sistema de expresión transitorio anteriormente descrito. Se agrega el factor X y se incuba la mezcla de reacción, seguido de un ensayo para determinar la actividad del factor Xa usando un substrato cromogénico para el factor Xa (Sprectrozyme FXa, American Diagnostica, Inc., Greenwich, CT). De esta forma, la capacidad del anticuerpo injertado a la CDR para inhibir la activación del factor X proporciona una medida de la capacidad del anticuerpo injertado a la CDR para inhibir la actividad del factor tisular humano.

Los anticuerpos injertados a la CDR incluidos dentro del alcance de la presente invención, son aquellos que son capaces de inhibir el factor tisular humano hasta un grado comparable al del anticuerpo no-humano a partir del cual derivan las CDRs, tal como se determina mediante el ensayo anterior. En una realización, el anticuerpo injertado a la CDR tiene al menos un 50% de la actividad inhibidora del TF8-5G9 por el factor tisular humano. En una realización preferida, el anticuerpo injertado a la CDR tiene al menos un 70% de la actividad inhibidora del TF8-5G9 por el factor tisular humano. En una realización más preferida, el anticuerpo injertado a la CDR tiene al menos un 80% de la actividad inhibidora del TF8-5G9 por el factor tisular humano. En una realización la más preferida, el anticuerpo injertado a la CDR tiene al menos un 90% de la actividad inhibidora del TF8-5G9 por el factor tisular humano.

En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de un anticuerpo injertado a la CDR capaz de inhibir el factor tisular humano. El procedimiento comprende la construcción de un vector de expresión que contiene un ácido nucléico con la codificación de la cadena pesada del anticuerpo injertado a la CDR y un vector de expresión que contiene un ácido nucléico con la codificación de la cadena ligera del anticuerpo injertado a la CDR, la transfección de las células huéspedes adecuadas con los vectores de expresión, el cultivo de las células huéspedes transfectadas bajo condiciones adecuadas para la expresión de las cadenas pesada y ligera, y la recuperación del anticuerpo injertado a la CDR. Como alternativa, puede usarse un vector de expresión que contenga ácidos nucléicos con la codificación de las cadenas pesada y ligera.

Las técnicas de biología molecular estándar, por ejemplo las descritas por Sambrook y otros, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989), pueden usarse para obtener ácidos nucléicos con la codificación de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos injertados a la CDR de la presente invención. Un ácido nucléico con la codificación del dominio variable injertado a la CDR, puede construirse aislando el cDNA con la codificación del anticuerpo a humanizar, p. ej., el anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9, mediante metodología de clonación convencional a partir del hibridoma que produce el anticuerpo, o mediante la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los genes de la región variable, tal como ha sido descrita por ejemplo por Winter y otros, seguido de mutagénesis dirigida al sitio, para substituir nucleótidos que contienen la codificación de los restos humanos deseados dentro de las regiones del FR. Como alternativa, puede aislarse el cDNA que contiene la codificación del anticuerpo humano, seguido de mutagénesis dirigida al sitio, para substituir los nucleótidos que contienen la codificación de los restos múridos deseados dentro de las CDRs.

Los ácidos nucléicos que contienen la codificación del dominio variable injertado a la CDR, pueden igualmente sintetizarse mediante ensamblado de oligonucleótidos sintéticos, por ejemplo usando DNA polimerasa y DNA ligasa. A continuación, las regiones variables sintéticas resultantes pueden amplificarse mediante PCR. Los ácidos nucléicos que contienen la codificación de dominios variables injertados a la CDR, pueden igualmente construirse mediante procedimientos de solapado de hebras por PCR que son conocidos en la técnica y han sido revisados por Oewns y otros.

De acuerdo con ello, una vez determinadas las secuencias de aminoácidos deseadas de los dominios variables injertados a la CDR de acuerdo con la presente invención, el técnico experto normal puede obtener ácidos nucléicos que contengan la codificación de los dominios variables. Además, el técnico experto sabe que, debido a la degeneración del código genético, pueden construirse varias secuencias de ácidos nucléicos que contienen el código de dominios variables injertados a la CDR. Todas dichas secuencias de ácido nucléico son contempladas por la presente invención.

Los ácidos nucléicos que contienen la codificación de los dominios variables injertados a la CDR están ligados a los ácidos nucléicos apropiados que contienen la codificación de la región constante de cadena pesada o ligera del anticuerpo humano. Las secuencias de ácidos nucléicos que contienen la codificación de las regiones constantes de cadena pesada o ligera humanas son conocidas en la técnica. Entra dentro del conocimiento del técnico experto normal el incluir secuencias que faciliten la transcripción, traducción y secreción, por ejemplo codones de iniciación, secuencias líderes, la secuencia de consenso de Kozak (Kozak, J. Mol. Biol., vol. 196, pág. 947, (1987)) y similares, así como sitios de endonucleasa de restricción para facilitar la clonación dentro de vectores de expresión.

De acuerdo con ello, la presente invención proporciona además ácidos nucléicos que contienen la codificación de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos injertados a la CDR, capaces de inhibir el factor tisular humano, en los que las CDRs derivan a partir de un anticuerpo minoclonal múrido contra el factor tisular y las regiones FR y C derivan a partir de uno o más anticuerpos humanos.

De acuerdo con la presente invención, se construyeron los ácidos nucléicos representativos que contienen la codificación de las cadenas pesada y ligera injertadas a la CDR. La cadena pesada injertada a la CDR comprende una región variable que contiene regiones del FR derivadas a partir del anticuerpo humano KOL y CDRs derivadas a partir del anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9 y, además comprende una región constante derivada a partir de la cadena pesada de IgG4 humano. La cadena ligera injertada a la CDR comprende una región variable que contiene regiones del FR derivadas a partir del anticuerpo humano REI y CDRs derivadas a partir del anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9 y, además comprende una región constante derivada a partir de la cadena kappa de IgG4 humano. Los ácidos nucléicos que contienen la codificación de las cadenas pesada y ligera se construyeron mediante el ensamblado de las regiones variables procedentes de nucleótidos sintéticos, la amplificación de las regiones variables ensambladas mediante PCR, la purificación de los ácidos nucléicos amplificados, y el ligamiento del ácido nucléico que contiene la codificación de la región variable dentro de un vector que contiene un ácido nucléico con la codificación de la región constante humana apropiada.

Las secuencias de los ácidos nucléicos representativos que contienen la codificación de las cadenas pesada y ligera injertadas a la CDR, se presentan como los nucleótidos 1-2360 de la SEC ID NO:15 y los nucleótidos 1-759 de la SEC ID NO:20, respectivamente.

La secuencia de ácido nucléico que contiene la codificación de una cadena pesada preferida (nucleótidos 1-2360 de la SEC ID NO:15) se ha designado como el gen TF8HCDR20. La secuencia de ácido nucléico contiene las regiones siguientes: sitio de restricción 5' EcoRI (nucleótidos 1-6); secuencia de Kozak (nucleótidos 7-15); codón de iniciación y secuencia conductora (nucleótidos 16-72); región variable injertada a la CDR (nucleótidos 73-423); dominio CH1 de IgG4 humano (nucleótidos 424-717); intrón 2 de IgG4 humano (nucleótidos 718-1110); bisagra de IgG4 humano (nucleótidos 1111-1146); intrón 3 de IgG4 humano (nucleótidos 1147-1267); dominio CH2 de IgG4 humano (nucleótidos 1268-1594); intrón 4 de IgG4 humano (nucleótidos 1595-1691); dominio CH3 de IgG4 humano (nucleótidos 1692-2012); región no traducida 3' (nucleótidos 2013-2354); extremo 3' BamHI cortado y empalmado al sitio BclI del vector de expresión (nucleótidos 2355-2360).

La secuencia de ácido nucléico que contiene la codificación de un gen de cadena ligera preferida (nucleótidos 1-759 de la SEC ID NO:20) se ha designado como el gen TF8LCDR3. La secuencia de ácido nucléico contiene las regiones siguientes: sitio de restricción 5' EcoRI (nucleótidos 1-5); secuencia de Kozak (nucleótidos 6-8); codón de iniciación y secuencia conductora (nucleótidos 9-68); región variable injertada a la CDR (nucleótidos 69-392); región constante kappa humana (nucleótidos 393-710); región no traducida 3' (nucleótidos 711-753); extremo 3' BamHI cortado y empalmado al sitio BclI del vector de expresión (nucleótidos 758-759).

Las secuencias preferidas anteriores pueden modificarse por el técnico experto normal para tener en cuenta la degeneración del código genético, y para realizar adiciones, deleciones, y substituciones conservadoras y no conservadoras que den como resultado un mantenimiento de la función del ácido nucléico, es decir, que contenga el código de una cadena pesada o ligera de un anticuerpo injertado a la CDR capaz de inhibir el factor tisular humano. Los sitios de restricción y las secuencias que facilitan la transcripción y traducción pueden alterarse o substituirse según sea necesario, dependiendo del vector y del sistema huésped elegido para la expresión.

Los vectores de expresión y húespedes adecuados para la producción de los anticuerpos injertados a la CDR de la presente invención, son conocidos por el técnico experto normal. Los vectores de expresión contienen secuencias reguladoras, tales como replicones y promotores, capaces de dirigir la replicación y expresión de secuencias de ácidos nucléicos heterólogos en una célula huésped particular. Igualmente, los vectores pueden contener genes de selección, potenciadores, secuencias señal, sitios de unión de ribosoma, sitios de corte y empalme de RNA, sitios de poliadenilación, secuencias terminadoras de transcripción, etc. Los vectores pueden construirse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, u obtenerse a partir de fuentes comerciales. Preferiblemente, los vectores de expresión tienen sitios de restricción convenientes en los cuales se insertan los ácidos nucléicos que contienen la codificación de las cadenas del anticuerpo de la invención. Los vectores de expresión de mieloma en los cuales la expresión del gen del anticuerpo es impulsado por el promotor-potenciador citomegalovirus humano or son los preferidos.

Los vectores de expresión que contienen un ácido nucléico con la codificación de la cadena pesada injertada a la CDR bajo el control de un promotor adecuado y los vectores de expresión que contienen un ácido nucléico con la codificación de la cadena ligera injertada a la CDR bajo el control de un promotor adecuado, son co-transfectados dentro de una célula huésped adecuada. En otra realización, se proporcionan ácidos nucléicos que contienen la codificación tanto de la cadena pesada como la ligera, en un único vector para transfección de una célula huésped adecuada.

Las células huéspedes o líneas de células adecuadas para la expresión de los anticuerpos injertados a la CDR de la presente invención, incluyen células bacterianas, células de levaduras, células de insectos, y células de mamíferos tales como células de ovario de hamster chino (CHO), células COS, células fibroblasto y células mieloides. Las células de mamífero son las preferidas. Las células CHO, COS y mieloma son particularmente preferidas. Las células de mieloma son preferidas para el establecimiento de líneas de células productoras de anticuerpos injertados a la CDR permanentes. La expresión de anticuerpos en células de mieloma, bacterias y levadora ha sido revisada por Sandhu en Critical Reviews in Biotechnology, vol. 12, pág. 437, (1992). La expresión en células de mamíferos ha sido revisada por Owens y otros.

La transfección de células huéspedes mediante la expresión de vectores que contienen ácidos nucléicos con la codificación de las cadenas pesada y ligera injertadas a la CDR, puede realizarse mediante procedimientos bien conocidos para un experto normal en la técnica. Dichos procedimientos incluyen, por ejemplo, transfección con cloruro cálcico, transfección con fosfato cálcico, lipofección y electroporación. Los procedimientos y condiciones de cultivo adecuados para la producción de los anticuerpos injertados a la CDR son, igualmente, bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos injertados a la CDR pueden purificarse mediante procedimientos convencionales, incluyendo precipitación con sulfato amónico, cromatografía de afinidad, electroforésis en gel, y similares. La capacidad de los anticuerpos injertados a la CDR para unirse e inhibir el factor tisular humano puede evaluarse mediante los ensayos in vitro descritos anteriormente.

Los anticuerpos injertados a la CDR de la presente invención tienen una diversidad de utilidades. Por ejemplo, los anticuerpos son capaces de unirse al factor tisular humano y, de esta forma, son útiles en ensayos para determinar el factor tisular humano a partir de muestras de flúido corporal, para la purificación del factor tisular humano, etc.

Los anticuerpos injertados a la CDR de la presente invención son capaces de inhibir el factor tisular humano. El factor tisular humano es bien conocido por ser un elemento esencial en la cascada de coagulación humana. La capacidad de los anticuerpos de la presente invención para interrumpir la cascada de coagulación se demuestra mediante ensayos in vitro, en los cuales los anticuerpos previenen la activación del factor X. De acuerdo con ello, los presentes anticuerpos son útiles en la atenuación de la coagulación. Por ello, la presente invención proporciona un procedimiento de atenuación de la coagulación que comprende la administración de una cantidad eficaz terapéuticamente del anticuerpo injertado a la CDR capaz de inhibir el factor tisular humano a un paciente que necesite dicha atenuación.

Numerosos trastornos trombóticos se caracterizan por una excesiva o inapropiada coagulación y son tratados o prevenidos eficazmente mediante la administración de agentes que interfieren con la cascada de coagulación. De acuerdo con ello, la presente invención proporciona además un procedimiento de tratamiento o prevención de un trastorno trombótico que comprende la administración de una cantidad eficaz terapéuticamente del anticuerpo injertado a la CDR capaz de inhibir el factor tisular humano a un paciente que necesite dicho tratamiento o prevención. En una realización preferida, el trastorno trombótico es la coagulación intravascular, restenosis arterial o la arterioesclerosis. Los anticuerpos de la invención pueden usarse en combinación con otros anticuerpos o agentes terapéuticos.

Una cantidad eficaz terapéuticamente de los anticuerpos de la presente invención puede determinarse por el técnico experto normal con respecto al estado del paciente, la condición a tratar, el procedimiento de administración, etc. Una cantidad eficaz terapéuticamente es la dosificación necesaria para aliviar, eliminar, o prevenir el trastorno trombótico, tal como se determina mediante parámetros convencionales. Por ejemplo, una dosis eficaz terapéuticamente de un anticuerpo injertado a la CDR de la presente invención puede ser desde aproximadamente 0,1 mg hasta aproximadamente 20 mg por 70 kg de peso corporal. Una dosificación preferida es aproximadamente 1,0 mg hasta aproximadamente 5 mg por 70 kg de peso corporal.

Un paciente que necesite de dicho tratamiento es un paciente que sufre de un trastorno caracterizado por una inapropiada o excesiva coagulación, o un paciente con riesgo de dicho trastorno. Por ejemplo, una terapia anticoagulante es útil para prevenir la trombosis venosa postoperatoria, y la restenosis arterial posterior a la angioplastia de balón.

Los anticuerpos injertados a la CDR de la presente invención son útiles de la misma manera como agentes terapéuticos comparables, y el nivel de dosificación es del mismo orden de magnitud que el generalmente usado con los agentes terapéuticos comparables. Los anticuerpos presentes pueden administrarse en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente mediante procedimientos conocidos por un experto normal en la técnica.

Otra realización de la presente invención está dirigida a una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo injertado a la CDR capaz de inhibir el factor tisular humano y que comprende, además, un vehículo aceptable farmacéuticamente. Tal como aquí se usa, un "vehículo aceptable farmacéuticamente" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antihongos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares. El uso de dichos medios y agentes para substancias activas farmacéuticamente es bien conocido en la técnica. Excepto en tanto en cuanto cualquier medio o agente sea incompatible con el ingrediente activo, su uso se contempla en las composiciones terapéuticas. Igualmente, pueden incorporarse dentro de las composiciones ingredientes activos suplementarios.

Los anticuerpos pueden administrarse por vías bien conocidas incluyendo la oral y parenteral, p. ej., intravenosa, intramuscular, intranasal, intradérmica, subcutánea, y similares. La administración parenteral y particularmente la administración intravenosa es la preferida. Dependiendo de la vía de administración, la composición farmacéutica puede requerir recubrimientos protectores.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable, incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación en su momento de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma de solución final deber ser estéril y fluida. Los vehículos típicos incluyen un disolvente o medio de dispersión conteniendo, por ejemplo, soluciones acuosas tamponadas (es decir, tampones biocompatibles), etanol, poliol tal como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, mezclas adecuadas de los mismos, tensioactivos y aceites vegetales. Los anticuerpos pueden incorporarse dentro de liposomas para administración parenteral. La esterilización puede realizarse mediante procedimientos reconocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, la adición de agentes antibacterianos o antihongos, por ejemplo, paraben, clorobutanol, fenol, ácido sórbico o timersal. Además, pueden incorporarse dentro de las composiciones sujeto, agentes isotónicos tales como azúcares o cloruro sódico.

La producción de soluciones inyectables estériles conteniendo los anticuerpo sujeto, se realiza mediante la incorporación de estos anticuerpos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado, con diversos de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización, preferiblemente esterilización por filtración. Para obtener un polvo estéril, las soluciones anteriores se secan al vacío o se criodesecan, según sea necerario.

Los ejemplos siguientes ilustran adicionalmente la presente invención.

Ejemplo 1 Aislamiento y secuenciación de la cadena ligera (LC) y la cadena pesada (HC) de TF8-5G9

Se generaron dos DNA bibliotecas a partir de RNA hibridoma de TF8-5G9 cebado con oligo (dt), usando procedimientos de biología molecular estándar tal como han sido descritos por Sambrook y otros. El cDNA se clonó dentro del vector plásmido Librarian II de Invitrogen (San Diego, CA), y las bibliotecas se rastrearon para determinar los clones cDNA que contenían el código de la HC y LC de IgG múrido. A pesar de la construcción de dos bibliotecas independientes, no pudo aislarse un clon cDNA de longitud total para la cadena pesada. Para obtener la secuencia 5' perdida de la cadena pesada, se generó un cDNA biblioteca de TF8-5G9 cebado aleatoriamente. En consecuencia, el cDNA de cadena pesada tenía dos piezas: un clon 5' de 390 nucleótidos y un clon 3' de 1392 nucleótidos. Los dos clones de HC se solapan en 292 nucleótidos.

Los clones de HC y LC se secuenciaron completamente mediante el procedimiento de terminación de cadena dideoxi de Sanger y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 74, pág. 5463, (1977)). Con el fin de verificar la secuencia de la región variable, la secuencia se obtuvo a partir de cDNA amplificado mediante PCR que había sido sintetizado a partir de RNA hibridoma de TF8-5G9 total. El RNA hibridoma de TF8-5G9 total se aisló mediante el procedimiento de tiocianato de guanidinio de Chrigwin y otros (Biochemistry, vol. 18, pág. 5294, (1970)). El cDNA se sintetizó usando el juego GeneAmp RNA Polymerasa Chain Reaction (PCR) de Perkin Elmer (Norwalk, CT), con un cebador oligo (dt). Los componentes del mismo juego se usaron en la PCR para amplificar las regiones variables de la LC y HC usando cebadores basados en la secuencia que había sido obtenida para los clones cDNA. Los fragmentos de región variable amplificada se purificaron sobre gel y se secuenciaron de acuerdo con el procedimiento de Tracy y otros (BioTechniques, vol. 11, pág. 68, (1991)) sobre un secuenciador de DNA fluorescente automatizado Modelo 373A de Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA). La secuencia para la LC y HC de TF8-5G9 a partir de la amplificación de RNA y la secuencia obtenida a partir de los clones cDNA estaban de acuerdo. La secuencia de la región variable de la HC de TF8-5G9 con la traducción de la proteína se muestra en la Figura 1 y la SEC ID NO:1, y la de la LC se muestra en la Figura 2 y la SEC ID NO:3.

Ejemplo 2 Construcción del vector de expresión de LC y HC quiméricas

Con el fin de ensayar la actividad de unión de la LC y HC anti-TF injertada a la CDR individualmente, se construyeron LC y HC de TF8-5G9 quiméricas. Esto permitió ensayar la LC injertada a la CDR para determinar la capacidad de unión de TF en combinación con la HC quimérica, y ensayar la HC injertada a la CDR en combinación con la LC quimérica.

Se diseñaron cebadores para amplificar la región variable de la LC de TF8-5G9 usando como moldes clones cDNA en el vector Librarian II. El cebador 5' se diseñó con un sitio EcoRI, en tanto que el cebador 3' se diseñó con un sitio NarI. Se usó la PCR para amplificar la región variable de la LC, generándose un fragmento de 433 bp con un extremo 5' EcoRI y un extremo 3' NarI. El fragmento incluía la secuencia de señal procedente del clon cDNA de la LC de TF8-5G9, pero incorporaba un cambio en 2 bases en el codón arginina inmediatamente después del codón de iniciación ATG. Este cambio retuvo el resto arginina, pero hizo que la secuencia estuviera de acuerdo con la secuencia de consenso de Kozak con el fin de mejorar potencialmente la traducción del mRNA de la LC. El fragmento de región variable de la LC amplificado mediante PCR se digerió con las enzimas de restricción EcoRI y NarI y se purificó mediante electroforésis sobre un gel de agarosa Nusieve al 2% y Seakem al 1% (FMC Bio Products, Rockland,
ME).

El DNA se extrajo de las capas de gel y se purificó mediante el procedimiento Geneclean (Bio 101, La Jolla, CA). El gen de la LC de TF8-5G9 quimérico de longitud total se genera mediante la clonación de este DNA dentro de los sitios EcoRI y NarI de un vector pSP73 (Promega, Madison, WI), el cual contiene la región constante kappa humana. El gen se aisló a partir del vector pSP73 mediante digestión con EcoRI y se subclonó dentro del sitio EcoRI del vector de expresión de célula de mamífero pSG5 (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA).

El gen de la HC de TF8-5G9 quimérico se ensambló de una manera similar a la de la HC quimérica. Puesto que no se aisló el cDNA de la HC de longitud total a partir de las bibliotecas de cDNA del vector Librarian II, el fragmento de región variable de la HC que se generó mediante la PCR a partir del RNA de la célula del hibridoma TF8-5G9 total, se usó como el molde. Los cebadores que incorporaron un sitio EcoRI en el extremo 5' y un sitio SacI en el extremo 3', se usaron en la PCR para generar un fragmento de 430 bp que contenía la secuencia de Kozak, el codón de iniciación, la secuencia señal y la región variable de la HC de TF8-5G9. Este fragmento se digerió con las enzimas de restricción EcoRI y SacI, y se purificó sobre gel usando el mismo procedimiento usado con la construcción de la LC quimé-
rica.

El gen de la HC quimérica de TF78-5G9 de longitud total se construyó clonando el fragmento de la región variable dentro de los sitios EcoRI y SacI del vector de expresión pSG5 que contiene la región constante IgG4 humana.

Ejemplo 3 Diseño y construcción de los genes de la cadena pesada y ligera injertada a la CDR

Los dominios de la región variable de los genes de la HC y LC injertados a la CDR, se diseñaron con un EcoRI colgante en el extremo 5' seguido de una secuencia de Kozak para mejorar la expresión del anticuerpo. Las secuencias conductoras se derivaron a partir de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoclonal múrido B72.3 (Whittle y otros, Protein Engineering, vol. 1, pág. 499, (1987)). El extremo 3' de las regiones variables se diseñó de forma que tuviera colgantes que permitieran el corte y empalme al DNA de región constante humano apropiado.

En las cadenas pesada y ligera del TF8-5G9 injertado a la CDR inicialmente diseñado, las CDRs se derivaron a partir de la secuencia de TF8-5G9 múrido, mientras que los marcos de lectura se derivaron fundamentalmente a partir de la secuencia del anticuerpo humano. El anticuerpo humano KOL (Schmidt y otros) se usó para los marcos de lectura de la cadena pesada, mientras que el dímero de anticuerpo humano (Epp y otros) se usó para los marcos de lectura de la cadena ligera.

Se usaron diversos criterios para la selección de los restos de marco de lectura múrido en el diseño de las regiones variables de la cadena pesada y ligera injertada a la CDR de TF8-5G9. Los restos del marco de lectura que, en una posición particular, son idiosincráticos con TF8-5G9, se retuvieron como secuencia múrida asumiéndose que contribuían a sus características de unión única. Igualmente, los restos múridos TF8-5G9 se retuvieron en las posiciones del marco de lectura en las cuales estaban de acuerdo con la secuencia de consenso humana, pero en las cuales los restos correspondientes en KOL o REI fueron idiosincráticas. Los restos que forman parte de estructuras canónicas en hélice del anticuerpo, tal como el resto 71 (numeración de acuerdo con Kabat y otros) de las cadenas pesada y ligera, se retuvieron igualmente como secuencia múrida. Los restos del marco de lectura que forman hélices, tales como los restos 26-30 de la HC, se mantuvieron como secuencia múrida TF8-5G9 en las posiciones en las que la secuencia múrida difiere de la humana. Los restos de los que se sabe que influyen directamente en la conformación de las CDRs, tales como 48 y 49 que preceden inmediatamente a la CDR2 de la HC, se retuvieron igualmente como secuencia
múrida.

La secuencia de aminoácidos de la región variable para la HC de TF8-5G9 injertada a la CDR inicialmente diseñada, la TF8HCDR1, se muestra en la SEC ID NO:1. Los restos múridos se retuvieron en las posiciones del marco de lectura 6, 17, 23, 24, 28, 29, 30, 48, 49, 68, 71, 73, 78, 88 y 91. La región variable de la HC injertada a la CDR se unió a una región constante IgG4 humana.

La secuencia de aminoácidos de la región variable para la LC de TF8-5G9 injertada a la CDR inicialmente diseñada, la TF8LCDR1, se muestra en la SEC ID NO:12. Los restos múridos se retuvieron en las posiciones del marco de lectura 39, 41, 46 y 105. La región variable de la LC injertada a la CDR se unió a una región constante kappa huma-
na.

La región variable para la HC y la LC injertada a la CDR descrita anteriormente, se ensamblaron cada una a partir de 13 oligonuclótidos sintéticos, los cuales fueron sintetizados por Research Genetics, Inc., Huntsville, AL. Estos oligonucleótidos tenían unas longitudes comprendidas dentro del intervalo de desde 42 hasta 80 bases, y contenían la codificación de ambas hebras de región variable. Cuando los 6 pares de oligonucleótidos complementarios se reasociaron, los colgantes generados tuvieron una longitud de 17 a 24 bases. Estos pares de oligonucleótidos se combinaron, se reasociaron a sus colgantes complementarios, y se ligaron, proporcionando las regiones variables de doble hebra de longitud total.

Los oligonucleótidos de la región variable de la HC se ensamblaron dentro de un fragmento de 452 bp, el cual contenía un sitio 5' EcoRI y un sitio 3' SacI. La reacción en cadena de la polimerasa se usó para amplificar este fragmento. El DNA amplificado resultante se purificó sobre un gel de agarosa Nusieve al 2% y Seakem al 1% (FMC). La banda de tamaño apropiado de DNA se escindió y el DNA se recuperó mediante el procedimiento Geneclean (Bio 101). A continuación, el fragmento se digerió con EcoRI y SacI, y se purificó nuevamente mediante el procedimiento Geneclean. Este fragmento de región variable de la HC con los extremos EcoRI y SacI se clonó dentro de los sitios EcoRI y SacI del vector pSport-1 (GIBCO-BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD). El DNA procedente de diversos clones se aisló y secuenció con el fin de verificar el ensamble de la región variable apropiada. Todos los clones tenían cambios de bases inesperados. Un clon con los menores cambios de bases (dos desapareamientos en las bases 133 y 140) fue el seleccionado para corregirlo mediante mutagénesis dirigida al sitio, de acuerdo con Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 82, pág. 488, (1985)). En resumen, las células competentes CJ236 (ung-, dut-) (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), se transformaron con el vector pSport que contenía la región variable de la HC injertada a la CDR con el desapareamiento de las dos bases. Los moldes de DNA incorporados con uridina, de hebra doble, se purificaron a partir del fago después de la infección del fago ayudante M13 (Stratagene Cloning Systems) de las células transformadas. Los oligos de la mutagénesis que contenían los cambios de bases deseados se sintetizaron sobre un sintetizador de DNA Modelo 380A de Applied Biosystems. Los oligos de la mutagénesis se reasociaron al DNA molde, y se usó DNA Polymerase T7 y DNA Lygase T4 (Mutagene INVitro Mutagenesis Kit, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) para incorporar el oligo en una hebra de DNA recién sintetizada. Las células competentes DH5\alpha (GIBCO-BRL Life Technologies) se transformaron con el DNA de doble hebra. La hebra incorporada a uridina original se destruyó, mientras que la hebra recién sintetizada que contenía el oligo de la mutagénesis se replicó. El DNA fagémido se preparó a partir de los clones resultantes de la mutagénesis y las regiones variables se secuenciaron con el fin de identificar los clones que tenían incorporados los cambios deseados. El fragmento de región variable EcoRI/SacI de la HC corregida se escindió del vector pSport, se purificó y se ligó dentro de los sitios EcoRI/SacI de un vector pSG5 que contenía la región constante IgG4 humana. Esto dió como resultado la generación de un gen de la HC de TF8-5G9 humanizado de longitud total, el TF8HCDR1, en el vector de expresión pSG5 de la célula COS. El vector se designó como pSG5TF8HCDR1.

La región variable de la LC de TF8-5G9 injertada a la CDR, se amplificó igualmente mediante la PCR a partir de los oligonucleótidos sintéticos ensamblados dentro de un fragmento de 433 bp que contenía un sitio 5' EcoRI y un sitio 3' NarI. Este fragmento se purificó tal como se ha descrito anteriormente para la HC, se digerió con EcoRI y NarI y se purificó mediante el procedimiento Geneclean. Este fragmento se clonó dentro de los sitios EcoRI y NarI de un vector pSG5 que contenía la región constante kappa humana. Esto dió como resultado la generación de un gen de la LC de TF8-5G9 humanizado de longitud total, el TF8LCDR1, en el vector de expresión pSG5 de la célula COS. Se secuenciaron siete clones, encontrándose que uno tenía la secuencia de la LC injertada a la CDR deseada. El vector se designó como pSG5TF8LCDR1.

Ejemplo 4 Expresión de los genes de las cadenas pesada y ligera injertadas a la CDR en células COS

La expresión transitoria de genes anticuerpo en células COS-1 proporciona un sistema rápido y conveniente para determinar la expresión y función del gen anticuerpo. Las células COS-1 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (CRL 1650) y se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, de GIBCO BRL Life Technologies) con suero vacuno fetal al 10%. El factor de expresión de pSG5TF8HCDR1 se co-transfectó dentro de células COS con el vector de expresión pSG5 de la LC quimérica usando el procedimiento DEAE-dextrano, seguido de choque con DMSO, tal como ha sido descrito por Lopata y otros, en Nucleic Acids Res., vol. 14, pág. 5707, (1984). Después de 4 días de cultivo, los medios se recolectaron de las cavidades y se examinaron para determinar los niveles de expresión de anticuerpo.

Los niveles de anticuerpo se determinaron mediante un ensayo de ensamblado basado en ELISA. Las placas se recubrieron con un anticuerpo específico Fc anti-humano de cabra. Se agregaron diversas diluciones del sobrenadante de células COS que contenían el anticuerpo secretado, se incubaron durante una hora y se lavaron. Se agregó un anticuerpo de cadena kappa anti-humano de cabra ligado a peroxidasa de rábano picante, se incubó durante una hora y se lavó. Con fines de detección, se agregó el substrato para la peroxidasa de rábano picante. Se encontró que los niveles de anticuerpo en los medios de células COS eran casi indectables para el TF8HCDR1 x LC quimérica. Después de un examen más profundo de la secuencia de la región variable de TF8HCDR1, se encontró que un cambio de base no esperado, el cual se había producido durante el procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio descrito en el Ejemplo 3, introdujo un codón de parada dentro del marco de lectura 4 del gen TF8HCDR1. Esta substitución se corrigió mediante la mutagénesis dirigida al sitio anteriormente descrita. La secuenciación completa de la región variable confirmó que se había realizado la corrección sin introducirse ningún cambio adicional. Mediante la transfección de este gen TF8HCDR1 corregido con la LC quimérica, se obtuvieron niveles de expresión razonables.

Las células COS que habían sido co-transfectadas con el vector de expresión de la LC injertada a la CDR, el pSGTF8LCDR1, y o bien la HC quimérica o el TF8HCDR1, produjeron anticuerpo a niveles razonables. Los niveles de anticuerpo en los sobrenadantes de células COS variaron desde 0,5 \mug hasta 10,0 \mug por ml.

Ejemplo 5 Unión del TF8-5G9 injertado a la CDR al factor tisular

Se usó un ensayo ELISA para determinar la capacidad del anticuerpo TF8-5G9 injertado a la CDR, el TF8HCDR1 x TF8LCDR1, para unirse al factor tisular. El factor tisular se inmovilizó sobre una placa de microvaloración. El sobrenadante de célula COS de ensayo, que contenía el anticuerpo injertado a la CDR, se agregó a la cavidad, y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados con PBS/Tween, se agregó un anticuerpo policlonal de cadena kappa anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante, se incubó durante una hora a temperatura ambiente y se lavó. Con fines de detección, se agregó el substrato para la peroxidasa de rábano picante. El control positivo fue el anticuerpo quimérico TF8-5G9. El anticuerpo TF8-5G9 injertado a la CDR fue capaz de unirse al factor tisular hasta un grado comparable al del anticuerpo TF8-5G9 quimérico (Figura 3, símbolos rellenados).

Igualmente, se examinó la capacidad del anticuerpo humanizado para competir con el TF8-5G9 múrido por la unión al factor tisular. Se agregaron simultáneamente cantidades variables del sobrenadante de células COS que contenían el anticuerpo injertado a la CDR de ensayo y una cantidad fija de TF8-5G9 múrido a cavidades recubiertas con factor tisular. Se dejó que la unión se produjera durante una hora a temperatura ambiente. La cavidades se lavaron tres veces con PBS/Tween. Se agregó un anticuerpo de cadena kappa anti-humano de cabra ligado a peroxidasa de rábano picante, se incubó durante una hora y se lavó. Con fines de detección, se agregó el substrato para la peroxidasa de rábano picante. El anticuerpo positivo compitió tan bien como el anticuerpo quimérico con el TF8-5G9 quimérico por la unión al TF.

Estos datos indican que el anticuerpo injertado a la CDR inicialmente diseñado, el TF8HCDR1 x TF8LCDR1, fue aproximadamente tan activo como el TF8-5G9 quimérico en la unión al TF y en la competencia con el anticuerpo múrido por la unión al TF.

Ejemplo 6 Construcción y caracterización de cadenas pesadas injertadas a la CDR adicionales

Durante el examen de la estructura molecular del TF8-5G9 múrido, se encontró que los restos del marco de lectura en las posiciones 27, 68, 73 y 78 estaban situados sobre la superficie del anticuerpo y no tenían un contacto visible con las CDRs. Estos restos del marco de lectura eran de la secuencia múrida en TF8HCDR1, pero cambiaron a la secuencia KOL humana en diversas combinaciones con el fin de generar una serie de cadenas pesadas injertadas a la CDR con variaciones en los restos del marco de lectura. Los cambios se realizaron mediante el procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio tal como se ha descrito en el Ejemplo 3. Cada versión de cadena pesada injertada a la CDR se expresó en células COS en combinación con la LC injertada a la CDR, TF8LCDR1, y se ensayó para determinar su capacidad para unirse al FT y competir con el TF8-5G9 múrido por la unión. Cada versión de la cadena pesada injertada a la CDR en combinación con TF8LCDR1 se mostró que se unía al TF con una afinidad comparable al TF8-5G9 quimérico. Cada HC injertada a la CDR en combinación con TF8LCDR1 fue capaz de competir con el TF8-5G9 múrido por la unión al TF hasta un grado comparable al del anticuerpo quimérico.

Los cambios en la secuencia desde el múrido al humano para las posiciones del marco de lectura de la HC 6, 17, 68, 73 y 78, no afectaron negativamente la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo. La versión de la HC injertada a la CDR que tenía secuencia humana en todas estas posiciones, y que por ello fue la HC más humanizada, fue la TF8HCDR20.

Se determinó la secuencia completa del gen TF8HCDR20. La secuencia de DNA se muestra en forma de un inserto EcoRI/BamHI de 2360 bp con traducción de proteína en el vector de expresión pEe6TF8HCDR20 en la Figura 4 y en la SEC ID NO:15.

Las regiones esenciales del gen son las siguientes:

Nucleótido #	\hskip1cm Región
1-6	Sitio de restricción 5' EcoRI
7-15	Secuencia de Kozak
16-72	Codón de iniciación y secuencia conductora
73-423	Región variable injertada a la CDR
424-717	Dominio CH1 de IgG4 humano
718-1110	Intrón 2 de IgG4 humano
1111-1146	Bisagra de IgG4 humano
1147-1267	Intrón 3 de IgG4 humano
1268-1594	Dominio CH2 de IgG4 humano
1595-1691	Intrón 4 de IgG4 humano
1692-2012	Dominio CH3 de IgG4 humano
2013-2354	Región 3' no traducida
2355-2260	Extremo 3' BamHI cortado y empalmado al sitio BclI del vector de expresión

Ejemplo 7 Construcción y caracterización de cadenas ligeras injertadas a la CDR adicionales

La LC injertada a la CDR inicialmente diseñada, la TF8LCDR1, contenía cuatro restos de marco de lectura procedentes de la secuencia TF8-5G9 múrida. En dos de estas posiciones, 39 y 105, la secuencia de marco de lectura REI humana es única de REI; sin embargo, la secuencia de la LC de TF8-5G9 múrida está de acuerdo con la secuencia de consenso humana. Los otros dos restos de marco de lectura múridos, trp41 y thr46, son únicos de TF8-5G9. Se generaron diversas versiones de la LC injertada a la CDR, en las cuales la secuencia en estas cuatro posiciones se cambiaron del múrido al REI humano en diversas combinaciones. Estos cambios se realizaron mediante mutagénesis dirigida al sitio. Cada versión de la LC injertada a la CDR se expresó en células COS en combinación con la HC injertada a la CDR, la TF8HCDR20, y se ensayó para determinar la capacidad para unirse al factor tisular y competir con el TF8-5G9 múrido por la unión. Cada versión de la LC injertada a la CDR, en combinación con TF8HCDR20, se mostró que se unía al TF con una afinidad comparable al TF8-5G9. Igualmente, cada versión de la LC injertada a la CDR, en combinación con TF8HCDR20, fue capaz de competir con el TF8-5G9 múrido por la unión al TF de una manera comparable al del control TF8-5G9 quimérico.

Los cambios en la secuencia desde el múrido al humano para las posiciones del marco de lectura de la LC 39, 41 y 105, no afectaron negativamente la capacidad del anticuerpo para reconocer al antígeno. La HC injertada a la CDR elegida fue la TF8LCDR3, en la cual la secuencia TF8-5G) múrida se usó en las posiciones 39 y 105, ya que estas están de acuerdo con la secuencia de consenso humana. El anticuerpo TF8-5G9 injertado a la CDR preferido es el TF8HCDR20 x TF8LCDR3.

Se determinó la secuencia completa del gen TF8LCDR3, la cual se muestra como un inserto EcoRI/BamHI de 759 bp con traducción de proteína en el vector de expresión pEe12TF8LCDR3 en la Figura 5 y en la SEC ID NO:20. Las regiones esenciales del gen son las siguientes:

Nucleótido #	\hskip1cm Región
1-5	Sitio de restricción 5' EcoRI
6-8	Secuencia de Kozak
9-68	Codón de iniciación y secuencia conductora
69-392	Región variable injertada a la CDR
393-710	Región constante kappa humana
711-753	Región 3' no traducida
754-759	Extremo 3' BamHI cortado y empalmado al sitio BclI del vector de expresión

Ejemplo 8 El anticuerpo TF8-5G9 injertado a la CDR, TF8HCDR20 x TF8LCDR3, inhibe el factor humano tisular

La unión del anticuerpo TF8-5G9 injertado a la CDR, TF8HCDR20 x TF8LCDR3, al TF se comprobó tal como se ha descrito en el Ejemplo 5, encontrándose que era comparable a la del TF8-5G9 quimérico tal como se ilustra en la Figura 6. La capacidad del TF8-5G9 injertado a la CDR para competir con el anticuerpo múrido por la unión al TF es comparable a la del TF8-5G9 quimérico tal como se muestra en la Figura 7.

Para medir el nivel de inhibición de la activación del factor X por el anticuerpo TF8-5G9 injertado a la CDR, se usó un ensayo in vitro. En este ensayo, el TF forma un complejo proteolítico activo con el factor VII. A continuación, este complejo convierte el factor X en el factor Xa mediante proteolísis. El Xa activado enzimáticamente escinde un substrato, el Spectrozyme FXa, el cual libera un cromógeno. El nivel de cromógeno, tal como se determina mediante densidad óptica, es una indicación de la activación del factor X debida a la actividad TF-factor VIIa.

Se prepararon las mezclas de reacción siguientes en tubos de vidrio de borosilicato de 12x75 mm:

25 \mul de TBS (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM),

15 \mul de CaCl_{2} 20 mM/suero bovino fetal (BSA) al 1%,

20 \mul de solución de factor tisular placental humano (preparado mediante la reconstitución de un vial de Thromborel S, Curtin Matheson Scientific #269-338, con 4,0 ml de dH_{2}O y diluyendo a 1:10 en TBS),

30 \mul de Factor VII (Enzyme Research Labs #HFVII 1007 a 237,66 ng/ml en TBS),

30 \mul de TBS o TF8-5G9 o TF8MCDR20 x TF8LCDR3 a 1,18 \mug/ml o tal como se indica en la Figura 8.

Las mezclas de reacción se incubaron a 37ºC durante diez minutos antes de la adición del Factor X. (En algunos casos, la mezcla de reacción se pre-incubó durante cinco minutos antes de la adición del Factor VII o del anticuerpo, seguido de una incubación de diez minutos antes de la adición del Factor X). Se agregaron 30 \mul de solución del Factor X (Enzyme Research Labs, DHFX, 247,38 \mu/ml en TBS) y la mezcla se incubó a 37ºC durante tres minutos. La activación del Factor X se terminó pipeteando 40 \mug de la mezcla de reacción dentro de 160 \mul de tampón de parada (Tris 50 mM, pH 7,4, EDTA 100 mM, NaCl 150 mM) en placas de microvaloración de 96 cavidades. Cada tubo de mezcla de reacción se pipeteó dentro de tres cavidades de microvaloración. A cada cavidad se agregaron 50 \mul de substrato Spectrozyme FXa (American Diagnostica #222, 1 \muM/ml en TBS). La DO_{405} se leyó sobre un lector de placa cinética de Molecular Devices con lecturas tomadas cada veinte segundos durante diez minutos. La actividad del Factor X se registró como mDO/minuto, y las velocidades de la enzima sobre la porción lineal de la curva de reacción se compararon con el fin de determinar la inhibición de la activación del factor X mediante los anticuerpos anti-FT.

Tal como se muestra en la Figura 8, el anticuerpo F8-5G9 injertado a la CDR es aproximadamente tan eficaz como el TF8-5G9 múrido en la inhibición de la activación del factor X. Esto indica que el TF8-5G9 injertado a la CDR es funcionalmente activo.

Ejemplo 9 Construcción de los vectores de expresión de mieloma de cadena pesada y ligera injertadas a la CDR

Con el fin de establecer una línea de producción de anticuerpo injertado a la CDR permanente, los genes
TF8HCDR20 y TF8LCDR3 se subclonaron dentro de vectores de expresión de células de mieloma. El TF8HCDR20 de cadena pesada se subclonó dentro de los sitios EcoRI y BclI del vector de expresión de mieloma pEe6hCMV-BqlII descrito por Stephens y otros en Nucleic Acids Res., vol. 17, pág. 7110, (1989), para producir el pEe6TF8HCDR20. El TF8LCDR3 de cadena ligera se subclonó dentro de los sitios EcoTI y BclI del vector de expresión de mieloma pEe12, para producir el pEe12TF8LCDR3. Los vectores de expresión de cadena pesada y ligera se ilustran en las Figuras 9 y 10, respectivamente. En ambos vectores, la transcripción del gen anticuerpo fue impulsada por el promotor-potenciador citomegalovirus humano (hCMV), el cual se sitúa directamente en 5' con respecto al sitio de clonación múltiple. La secuencia de la señal de poliadenilación se sitúa 3' con respecto al sitio de clonación múltiple y las señales de terminación de transcripción. Cada vector contiene el gen \beta-lactamasa para permitir la selección por ampicilina en E. coli. El vector pEe12 contiene un gen cDNA glutamino sintetasa bajo el control transcripcional del promotor temprano SV40. La glutamino sintetasa permite que los transfectantes de células de mieloma sean seleccionados en medios libres de glutamina. Las células de mieloma están exentas de actividad glutamino sintetasa y dependen de un suministro de glutamina en los medios de cultivo. Las células que han sido transfectadas con el vector pEe12, las cuales contienen el gen glutamino sintetasa, son capaces de sintetizar glutamina a partir de glutamato y pueden sobrevivir en ausencia de glutamina.

El vector de expresión pEe6TF8HCDR20 es un plásmido de 7073 bp cuya secuencia de DNA se muestra en la Figura 4 y la SEC ID NO:15. Las regiones de codificación del gen TF8HCDR20 están traducidas. Las regiones esenciales de este vector son las descritas a continuación:

1. Nucleótidos #1-2360: El gen de la HC injertada a la CDR, el TF8HCDR20, se describe en el Ejemplo 6. El gen de la HC se insertó en un fragmento EcoRI/BamHI dentro de los sitios EcoRI/BclI del vector pEe6hCMV-BqlII.

2. Nucleótidos #2361-2593: Esta región contiene la codificación de la señal de poliadenilación del gen temprano SV40 (nucleótidos 2770-2537 de SV40), el cual actúa como un terminador transcripcional. Este fragmento está flanqueado por un sitio 5' BclI y un sitio 3' BamHI. El extremo 3' BamHI del gen de cadena pesada se cortó y empalmó al sitio 5' BclI de la señal de poliadenilación, eliminándose, de esta forma, ambos sitios.

3. Nucleótidos #2594-3848: Esta región es un fragmento BamHI-BglI procedente de pBR328 (nucleótidos 375-2422), pero con una deleción entre los sitios SaI y AvaI (nucleótidos 651-1425 de pBR328), seguido de la adición de un ligador SalI al sitio AvaI. Esta región contiene el origen bacteriano de replicación Col E1.

4. Nucleótidos #3849-4327: Este es un sitio del fragmento BglI-XmnI procedente del gen \beta-lactamasa de pSP64 (Promega Corporation, Madison, WI). Este gen proporciona resistencia a la ampicilina a bacterias transformadas con este vector.

5. Nucleótidos #4328-4885: Este es un fragmento XmnI-HindIII del plásmido pCT54 basado en Col E1, descrito por Emtage y otros, en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 80, pág. 3671, (1983). El sitio HindIII se convirtió en un sitio BqlII mediante la adición de un ligador, seguido de la adición del promotor hCMV descrito más abajo.

6. Nucleótidos #4886-7022: Estos nucleótidos contienen la codificación del fragmento Pst-lm de la cepa AD 169 del citomegalovirus humano (hCMV), descrito por Geenway y otros, en Gene, vol. 18, pág. 355, (1982), el cual contiene la región de codificación para el promotor temprano intermedio central hCMV. Este fragmento Pst-lm se clonó dentro del sitio HindIII de pEe6hCMV mediante la adición de oligonucleótidos de la secuencia siguiente a cualquier extremo del fragmento:

\hskip3cm

5' GTCACCGTCCTTGACACGA 3'

\hskip3cm

3' ACGTCAGTGGCAGGAACTGTGCTTCGA 5'

El fragmento de 2100 bp resultante se insertó de manera tal que el promotor dirigió la transcripción hacia el sitio EcoRI de pEe6hCMV. El oligonucleótico anterior sirvió para recrear la secuencia no traducida 5' completa del gen hCMV-MIE, la secuencia irrelevante agregada en el extremo 5' verdadero del fragmento. El sitio HindIII en el extremo 5' se convirtió, posteriormente, en un sitio BglII mediante la adición de un ligador adicional.

7. Nucleótidos #7023-7073: El poliligador pSP64 con los sitios BamHI y SaII separados.

El vector de expresión pEe12TF8LCDR3 es un plásmido de 7864 bp cuya secuencia de DNA se muestra en la Figura 5 y la SEC ID NO:20. Las regiones de codificación del gen TF8LCDR3 están traducidas. Las regiones esenciales de este vector son las descritas a continuación:

1. Nucleótidos #1-759: El gen de la LC injertada a la CDR, el TF8HLDR3, se describe en el Ejemplo 3. El gen se insertó en un fragmento EcoRI/BamHI dentro de los sitios EcoRI/BclI del vector de expresión pEe12.

2. Nucleótidos #760-3284: Estas regiones del pEe12 son idénticas a las regiones codificadas por los nucleótidos 2361-4885 del vector pEe6TF8HCDR20 descrito anteriormente (regiones #2-5).

3. Nucleótidos #3285-5736: Esta región contiene la codificación del cDNA glutamino sintetasa de ovario de hamster chino bajo el control transcripcional del promotor temprano SV40 y seguido por las señales de poliadenilación y de corte y empalme de SV40 procedentes del vector pSV2.dhfr, descrito por Subramani y otros, en Mol. Cell. Biol., vol. 1, pág. 854, (1981). Lo que sigue a continuación describe la modificación de esta región: Un fragmento NaeI-PvuII de 1200 bp, el cual contenía una secuencia de codificación de GS completa, se escindió del clon \lambdaGS1.1 del cDNA de ovario de hamster chino, descrito por Hayward y otros, en Nucleic Acids Res., vol. 14, pág. 999, (1986). Después de la adición de un ligador HindIII al sitio NaeI y un ligador BglII al sitio PvuII (con la destrucción, en consecuencia de los sitios NaeI y PvuII), el fragmento de 1200 bp se clonó en lugar de las secuencias DHFR en pSV2.dhfr, entre los sitios HindIII y BglII, para formar pSV2.GS. El único sitio PvuII restante en pSV2BamGS se convirtió en un sitio BamHI mediante la adición de un ligador oligonucleótido para formar pSV2BamGS. Un sitio EcoRI en el cDNA de GS se destruyó mediante mutagénesis dirigida al sitio sin alterar la secuencia de aminoácidos en pSV2BamGS y el sitio HindIII se destruyó rellenándole con DNA polimerasa I. Un fragmento BamHI de 2451 bp procedente de este plásmido, el cual contenía la unidad de transcripción del híbrido SV40-GS completa, se escindió e insertó en el sitio BglII del sitio pEe6hCMV-BglII de pEe6hCMV- BglII, de manera que dicha transcripción a partir del promotor temprano SV40 se desarrolló hacia el promotor hCMV.

4. Nucleótidos #5734-7864: Esta región es idéntica a la del promotor hCMV y al poliligador pSP64 codificada por los nucleótidos 4886-7073 del vector pEe6TF8HCDR20 descritos anteriormente (regiones 6 y 7).

Con el fin de asegurar que ambos vectores pEe6TF8HCDR20 y pEe12TF8LCDR3 co-transfectaron células de mieloma, los vectores se unieron en concatémeros. Ambos vectores pEe6TF8HCDR20 y pEe12TF8LCDR3 se digerieron en el único sitio SalI. El vector pEe6TF8HCDR20 linealizado en SalI se fosfatasó en sus extremos 5' con el fin de prohibir el ligamiento de dos vectores pEe6TF8HCDR20 entre sí. Este vector de la HC fosfatasado se ligó en una relación molar de 2:1 al pEe12TF8LCDR3 linealizado en SalI. Los concatémeros resultantes tenían más probablemente la composición siguiente:

5

Este DNA concatemerizado se extrajo con fenol y cloroformo, y se precipitó con acetato amónico y etanol. El precipitado de DNA se resuspendió en agua destilada hasta una concentración de 1 \mug/\mul y se usó para transfectar células de mieloma.

Ejemplo 10 Desarrollo de líneas de células de expresión NSO

Las líneas de células transformadas establemente que expresan el anticuerpo TF8-5G9 humanizado, se prepararon mediante la transfección de vectores de expresión de cadena pesada y ligera injertadas a la CDR dentro de células de mieloma de ratón NSO. La selección de las células transfectadas se realizó usando el gen marcador seleccionable dominante, glutamino sintetasa (GS).

La línea de células de mieloma de ratón NSO, obtenida de Celltech, Ltd., es un subclon derivado a partir de NS-1 y no expresa cadenas ligeras intracelulares. Estas células se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con adición de glutamina y suero bovino fetal (FBS) al 10%. Para preparar la transfección, las células se recolectaron en fase semi-log del ciclo de desarrollo, se centrifugaron durante 5 minutos, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se centrifugaron nuevamente, y el gránulo de células se resuspendió en 2,2 ml de PBS. La concentración de células final fue de 2,18x10^{7} ml. Las células se mantuvieron sobre hielo durante todo el procedimiento.

El DNA a transfectar (pEe12TF8LCDR3 x pEe6TF8HCDR20) se preparó en forma de un concatémero tal como se ha descrito en el Ejemplo 9. El DNA y las células NSO se agregaron a una cubeta BioRad Gene Pulser de 0,4 cm en el orden siguiente:

40 \mul (40 \mug) de DNA concatémero,

320 \mul de agua doblemente destilada,

40 \mul de 10 x PBS,

400 \mul de células NSO (8,72x10^{6} células).

La transfección se realizó mediante electroporación, siguiendo un protocolo suministrado por Celltech, Ltd. En este procedimiento, las células y el DNA en tampón PBS se expusieron una breve descarga de alto voltaje de electricidad que produjo la formación de microporos transitorios sobre la membrana de la célula. La transferencia de DNA se produce a través de estas aberturas. Para preparar la eletroporación, la suspensión de células NSO y de DNA se mezcló suavemente y se incubó sobre hielo durante 5 minutos. La cubeta se colocó en un BioRad Gene Pulser y se administraron 2 descargas eléctricas consecutivas fijadas a 3 \muF (capacitancia) y 1,5 V (voltaje). Después de la electroporación, la cubeta se volvió a colocar sobre el hielo durante 5 minutos. A continuación, la suspensión se diluyó en medio de desarrollo precalentado y se distribuyó dentro de siete placas de 96 cavidades. Las placas de control que contenían las células electroporadas sin DNA se prepararon igualmente al mismo tiempo para medir la presencia de mutantes espontáneos. Las placas se introdujeron en una incubadora a 37ºC con CO_{2} al 5%.

La glutamino sintetasa, codificada por el gen GS, es una enzima que convierte el glutamato en glutamina. Las células NSO requieren glutamina para su desarrollo debido a los niveles inadecuados de expresión de gen GS endógeno. En el DNA concatémero, este gen está localizado sobre el vector pEe12TF8LCDR3. Las células transfectadas que incorporan el gen GS se transforman en glutamino-independientes. Las células que no integran el gen GS dentro de su genoma permanecen glutamino-dependientes y no sobreviven en medio libre de glutamina. Aproximadamente 18 horas después de la electroporación, a todas las placas se las suministró medio de selección libre de glutamina y se devolvieron a la incubadora hasta que aparecieron colonias viables.

Aproximadamente 3 semanas después de la transfección, se observaron colonias macroscópicas distintas. Estas se rastrearon para determinar la expresión del anticuerpo humanizado intacto usando el conjunto ELISA tal como se ha descrito en el Ejemplo 5. Los sobrenadantes del cultivo de tejidos procedentes de las cavidades que contenían las colonias, se rastrearon a una dilución de 1:10. Las cavidades que mostraron actividad positiva superior al estándar de 25 ng/ml, se subcultivaron y expandieron para análisis posterior.

Para la selección de altos productores, la producción de anticuerpo se cuantificó después de un período de desarrollo de 96 horas. Los matraces de cultivo de tejidos se sembraron con 2x10^{5} células en 10 ml de medio de selección y se incubaron a 37ºC, con CO_{2} al 5%, durante 96 horas. Al final de dicho período de tiempo, se tomó una parte alícuota para determinar la concentración de células y el título del anticuerpo. La evaluación de la producción de anticuerpo se calculó en forma de \mug/ml y pg/célula/96 horas. Los más altos productores a partir de esta transfección fueron:

Línea de células	\mug/ml	pg/célula/96 horas
\hskip-2mm 2B1	26,3	24,3
3E11	27,6	59,9
\hskip-2mm 4G6	30,2	41,9

Ejemplo 11 El anticuerpo injertado a la CDR, el TF8HCDR20 x TF8LCDR3, inhibe el factor tisular in vivo

El anticuerpo injertado a la CDR, el TF8HCDR20 x TF8LCDR3, se comparó con el anticuerpo múrido TF8-5G9 para determinar su capacidad para proteger ratas a partir de la coagulación intravascular diseminada (DIC) inducida experimentalmente. En el modelo DIC, las ratas se expusieron con tromboplastina humana (un extracto de tejido bruto que contenía actividad TF), dando como resultado la consunción del fibrinógeno y la muerte. El pretratamiento de las ratas con anticuerpo anti-TF se demostró que protegía a las ratas de la consunción del fibrinógeno y la posterior muerte.

La tromboplastina humana se preparó tal como se describe en la Patente de EE.UU. 5.223.427. La solución salina de control o los 30 \mu/ml del anticuerpo TF8-5G9 o del injertado a la CDR, se inyectó a través de la vena de la cola de las ratas, seguido de la inyección de tromboplastina equivalente a 200 ng de TF recombinante. Los tiempos de coagulación se determinaron a los minutos T=0 y T=1 como una medida de la concentración de fibrinógeno. Los tiempos de coagulación son proporcionales a la concentración de fibrinógeno, con un tiempo de coagulación de 60 segundos correspondiente a una reducción del 80% en la concentración de fibrinógeno. Los tiempos de coagulación superiores a 60 segundos no pueden medirse con exactitud y se registraron como 60 segundos.

A continuación, se muestra la supervivencia y los tiempos de coagulación para tres estudios representativos.

\newpage

Supervivientes

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6

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Tiempos de coagulación

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7

8

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Tiempos de coagulación

\vskip1.000000\baselineskip

9

\newpage

Tiempos de coagulación

10

Treinta y tres de las veinticuatro ratas de control tenían tiempos de coagulación superiores a 60 segundos, lo que indica que virtualmente todas las ratas no tratadas consumieron más del 80% de su fibrinógeno. Tanto las ratas tratadas con anticuerpo múrido como injertado a la CDR tuvieron tiempos de coagulación similares a un minuto de 44,5 y 40 segundos. Además, únicamente seis de las ratas tratadas con anticuerpo múrido y nueve de las ratas tratadas con anticuerpo injertado a la CDR tuvieron tiempos de coagulación superiores a 60 segundos. De acuerdo con ello, tanto los anticuerpos múrido como injertado a la CDR fueron capaces de neutralizar el TF y, de esta forma, proteger a las ratas de la consunción del fibrinógeno y la muerte.

<110> ORTHO PHARMACEUTICAL CORPORATION

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<120> ANTICUERPOS DEL FACTOR ANTI-TEJIDO INJERTADOS A LA CDR Y PROCEDIMIENTOS PARA USO DE LOS MISMOS

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<130> P018373EP

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\vskip0.400000\baselineskip

<140> EP 96922399.9

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1996-06-06

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> PCT/US96/09287

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1996-06-06

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 08/480120

\vskip0.400000\baselineskip

<151>1995-06-07

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 20

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

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<211> 1489

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<212> DNA

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<213> Mus sp.

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<220>

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<221> CDS

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<222> (11)...(1390)

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<400> 1

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11

12

13

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<210> 2

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<211> 460

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<212> PRT

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<213> Mus sp.

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<400> 2

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14

15

16

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<210> 3.

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<211> 937

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<212> DNA

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<213> Mus sp.

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CDS

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<222> (5)...(706)

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<400> 3

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17

18

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<210> 3.

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<211> 937

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<212> DNA

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<213> Mus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (5)...(706)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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19

20

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

21

22

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<210> 5

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<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Tyr Tyr Met His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> MUS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe Gln}

\sac{Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> MUS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Asn Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> MUS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Tyr Leu Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> MUS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> MUS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Mus sp. quimérico; homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

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23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp. quimérico; homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp. quimérico; homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

26

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<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Chimeric Mus sp.; homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

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27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 7073

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<212> DNA

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<213> Mus sp. quimérico; homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (61)..(717)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1111)..(1146)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1268)..(1594)

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1692)..(2012)

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 15

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28

29

30

31

32

33

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

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<211> 219

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<212> PRT

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<213> Mus sp. quimérico; homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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34

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<210> 17

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Mus sp. quimérico; homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

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\sa{Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro}

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<210> 18

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Chimeric Mus sp.; homo sapiens

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<400> 18

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35

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\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 19

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> Mus sp. quimérico; homo sapiens

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<400> 19

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36

37

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<210> 20

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<211> 7864

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<212> DNA

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<213> Mus sp. quimérico; homo sapiens

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<220>

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<221> Diversas características

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<222> (4324)..(4324)

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<223> n es a, c, g ó t

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<400> 20

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38

39

40

41

42

Claims (27)

1. Un anticuerpo injertado a la CDR capaz de inhibir el factor tisular humano, en el que las regiones determinantes complementarias (CDRs) derivan a partir de un anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9 y las regiones constante (C) y de marco de lectura (FR) derivan a partir de uno o más anticuerpos humanos, en el que la cadena pesada comprende restos derivados del anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9 en las posiciones 23, 24, 28, 29, 30, 48, 49, 71, 78, 88 y 91, y la cadena ligera comprende restos derivados a partir del anticuerpo monoclonal múrido TF8-5G9 en las posiciones 39 y 105, en el que los restos están numerados de acuerdo con el sistema de numeración de
Kabat.

2. El anticuerpo injertado a la CDR de la Reivindicación 1, en el que dichas CDRs de la cadena pesada tienen las secuencias de aminoácidos:

CDR1 DYYMH (SEC ID NO:5) CDR2 LIDPENGNTIYDPKFQG (SEC ID NO:6) CDR3 DNSYYFDY (SEC ID NO:7)

y dichas CDRs de la cadena ligera tienen las secuencias de aminoácidos:

CDR1 KASQDIRKYLN (SEC ID NO:8) CDR2 YATSLAD (SEC ID NO:9) CDR3 LQHGESPYT (SEC ID NO:10).

3. El anticuerpo injertado a la CDR de la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, en el que el FR de la cadena pesada deriva a partir del anticuerpo humano KOL.

4. El anticuerpo injertado a la CDR de la Reivindicación 1 o la Reivindicación 3, en el que el FR de la cadena ligera deriva a partir del anticuerpo humano REI.

5. El anticuerpo injertado a la CDR de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en el que la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:11.

6. El anticuerpo injertado a la CDR de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, en el que la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:12.

7. El anticuerpo injertado a la CDR de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en el que la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:13.

8. El anticuerpo injertado a la CDR de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4 o la Reivindicación 7, en el que la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:14.

9. El anticuerpo injertado a la CDR de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en el que la región constante de la cadena pesada es la región constante IgG4 humana.

10. El anticuerpo injertado a la CDR de la Reivindicación 9, en el que la región constante de la cadena ligera es la región constante kappa humana.

11. El anticuerpo injertado a la CDR, TF8HCDR1 x TF8LCDR1, en el que TF8HCDR1 comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia dada en la SEC ID NO:11 unida a una región constante IgG4 humana y en el que TF8LCDR1 comprende una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia dada en la SEC ID NO:12 unida a una región constante kappa humana.

12. El anticuerpo injertado a la CDR, TF8HCDR20 x TF8LCDR3, en el que TF8HCDR20 comprende la región variable de cadena pesada que tiene la secuencia dada en la SEC ID NO:13 y TF8LCDR3 comprende la región variable de cadena ligera que tiene la secuencia dada en la SEC ID NO:14.

13. El anticuerpo injertado a la CDR de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 12, para la inhibición del factor tisular humano.

14. Un fragmento del anticuerpo injertado a la CDR de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho fragmento es capaz de inhibir el factor tisular humano.

15. Un fragmento de la Reivindicación 14, en el que dicho fragmento es un fragmento Fab o F(ab')_{2}.

16. Un procedimiento para la producción del anticuerpo injertado a CDR de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 17, que comprende la co-transfección de una célula huésped con un vector de expresión que comprende un ácido nucléico que contiene la codificación de la cadena pesada del anticuerpo injertado a la CDR y un vector de expresión que comprende un ácido nucléico que contiene la codificación de la cadena ligera del anticuerpo injertado a la CDR; el cultivo de la célula huésped transfectada; y la recuperación de dicho anticuerpo injertado a la CDR.

17. Un procedimiento para la producción del anticuerpo injertado a CDR de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 13, que comprende la transfección de una célula huésped con un vector de expresión que comprende un ácido nucléico que contiene la codificación de la cadena pesada del anticuerpo injertado a la CDR y un ácido nucléico que contiene la codificación de la cadena ligera del anticuerpo injertado a la CDR; el cultivo de la célula huésped transfectada; y la recuperación de dicho anticuerpo injertado a la CDR.

18. El procedimiento de la Reivindicación 16 o la Reivindicación 17, en el que dicho ácido nucléico que contiene la codificación de la cadena pesada del anticuerpo injertado a la CDR tiene la secuencia de nucleótidos 1-2369 de la SEC ID NO:15 y, preferiblemente, en el que dicho vector de expresión que comprende un ácido nucléico que contiene la codificación de la cadena pesada del anticuerpo injertado a la CDR es pEe6TF8HCDR20.

19. El procedimiento de una cualquiera de las Reivindicaciones 16 a 18, en el que dicho ácido nucléico que contiene la codificación de la cadena ligera injertado a la CDR tiene la secuencia de nucleótidos 1-759 de la SEC ID NO:20 y, preferiblemente, en el que dicho vector de expresión que comprende un ácido nucléico que contiene la codificación de la cadena ligera del anticuerpo injertado a la CDR es pEe12TF8LCDR3.

20. El procedimiento de una cualquiera de las Reivindicaciones 16 a 19, en el que dicha célula huésped es una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de mamífero, tal como una célula CHO, una célula COS o una célula de mieloma.

21. Un ácido nucléico que contiene la codificación de la cadena pesada del anticuerpo injertado a la CDR o un fragmento del mismo, de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 15.

22. Un ácido nucléico que contiene la codificación de la cadena ligera del anticuerpo injertado a la CDR o un fragmento del mismo, de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 15.

23. El ácido nucléico de la Reivindicación 21, que tiene la secuencia de nucleótidos 1-2360 de la SEC ID NO:15.

24. El ácido nucléico de la Reivindicación 22, que tiene la secuencia de nucleótidos 1-759 de la SEC ID NO:20.

25. Un anticuerpo injertado a la CDR de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 13, o un fragmento del mismo de acuerdo con la Reivindicación 14 ó 15, capaz de inhibir el factor tisular humano para uso en la atenuación de la coagulación o para uso en el tratamiento o la prevención de un trastorno trombótico.

26. Una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo injertado a la CDR de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 13, o un fragmento del mismo de acuerdo con la Reivindicación 14 ó 15, capaz de inhibir el factor tisular humano y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

27. La composición farmacéutica de la Reivindicación 26, para uso en la atenuación de la coagulación o para uso en el tratamiento o la prevención de un trastorno trombótico.