DE69632465T2

DE69632465T2 - Cdr-transplantierte antikörper gegen "tissue factor" und verfahren zur deren verwendung

Info

Publication number: DE69632465T2
Application number: DE69632465T
Authority: DE
Inventors: K. Linda JOLIFFE; A. Robert ZIVIN; L. Virginia PULITO
Original assignee: Ortho McNeil Pharmaceutical Inc
Current assignee: Janssen Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2005-06-23
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: WO1996040921A1; JPH11507524A; PT833911E; DE69632465D1; EP0833911A1; US20080226628A1; US20100298544A1; US20070238869A1; CA2223491C; DK0833911T3; JP4423680B2; ES2231817T3; AU716282B2; US7235380B1; AU6328296A; ATE266726T1; US7777018B2; EP0833911B1; US7544790B2; CA2223491A1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Monoklonale Antikörper, die dazu in der Lage sind Gewebefaktor (GF) zu inhibieren, sind als Antikoagulantien nützlich. Übliche monoklonale Nagetierantikörper haben jedoch aufgrund ihrer Immunogenität und ihrer kurzen Serumhalbwertszeit eine beschränkte Verwendung bei therapeutischen und diagnostischen Anwendungen beim Menschen. Die vorliegende Erfindung stellt CDR-verpflanzte monoklonale Antikörper gegen GF zur Verfügung, die die hohe Bindungsaffinität der Nagetierantikörper beibehalten, aber eine geringere Immunogenität aufweisen. Die vorliegenden humanisierten Antikörper sind wirksame Antikoagulantien und sind daher bei der Behandlung und Prophylaxe einer menschlichen thrombotischen Erkrankung nützlich. Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung der CDR-verpflanzten Antikörper und pharmazeutische Zusammensetzungen für die Verlangsamung oder Verhinderung der Koagulation zur Verfügung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Koagulation des Bluts beinhaltet kaskadierende Reaktionsserien, die zu der Bildung von Fibrin führen. Die Koagulationskaskade besteht aus zwei sich überlappenden Reaktionswegen von dem beide für die Hämostase erforderlich sind. Der intrinsische Reaktionsweg umfaßt Proteinfaktoren, die in zirkulierendem Blut vorhanden sind, während der extrinsische Reaktionsweg Gewebefaktor erfordert, der an der Zelloberfläche eine Vielzahl von Geweben in Antwort auf eine vaskuläre Verletzung exprimiert wird. Davie et al., 1991, Biochemistry 30: 10363. Mittel, die die Koagulationskaskade beinträchtigen, wie Heparin- und Coumarin-Derivate weisen gut bekannte therapeutische Verwendung in der Prophylaxe venöse Thrombose auf. Goodmann and Gilmann, Herausgeber, 1980, The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan Publishing Co., Inc., New York.
Gewebefaktor (GF) ist als ein Ziel für die Antikoagulationstherapie untersucht worden. GF ist ein Membranglycoprotein, das als Rezeptor für den Faktor VII und VIIa fungiert und dadurch den extrinsischen Reaktionsweg der Koagulationskaskade in Antwort auf vaskuläre Verletzung initiiert. Zusätzlich zu seiner Rolle in dem Erhalt der Hämostase durch die Initiation der Blutverklumpung ist GF mit pathogenen Zuständen in Verbindung gebracht worden. Insbe sondere die Synthese und die Zelloberflächenexpression von GF ist mit vaskulärer Erkrankung (Wilcox et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 2839) und gram-negativen septischem Schock in Verbindung gebracht worden (Warr et al., 1990, Blood 75: 1481).
Ruf et al. (1991, Thrombosis and Haemostasis 66: 529) charakterisierten die antikoagulierende Wirksamkeit von monoklonalen Mäuseantikörpern gegen menschliches GF. Die Behinderung der GF-Funktion durch die meisten monoklonalen Antikörper, die untersucht wurden, hing von der Dissoziation des GF/VIIa-Komplexes ab, der bei Kontakt von GF mit Plasma rasch gebildet wird. Solche Antikörper waren daher im Plasma relativ langsame Inhibitoren des GF. Ein monoklonaler Antikörper, TF8-5G9 war zur Inhibition des GF/VIIa-Komplexes ohne eine Dissoziation des Komplexes in der Lage, wodurch eine unmittelbare antikoagulierende Wirkung im Plasma zur Verfügung gestellt wurde. Ruf et al., legte nahe, daß die Mechanismen die den GF/VIIa-Komplex inaktivieren statt seine Bildung zu behindern, möglicherweise Strategien für die Unterbrechung der Koagulation in vivo zur Verfügung stellen.
Die therapeutische Verwendung monoklonaler Antikörper gegen GF ist dadurch beschränkt, daß die gegenwärtig erhältlichen Monoklonalen von Nagetieren stammen. Die Verwendung von Nagetierantikörpern in der menschlichen Therapie erzeugt eine Vielzahl von Problemen, von denen das bedeutendste die Immunogenität ist. Für wiederholte Dosen monoklonaler Nagetierantikörper ist gefunden worden, daß sie eine Anti-Immunglobulinantwort, die menschliche Anti-Maus Antikörper (HAMA = „human anti-mouse antibody"), hervorrufen, die zu einer Erkrankung des Immunkomplexes und/oder zur Neutralisierung der therapeutischen Antikörper führen kann. Siehe z. B. Jaffers et al. (1986) Transplantation 42: 572. Während die Verwendung menschlicher monoklonaler Antikörper diese Beschränkung angehen würde, hat es sich als schwierig erwiesen große Mengen menschlicher monoklonaler Antikörper durch übliche Hybridomtechnologie zu erzeugen.
Die rekombinante Technologie ist in einem Versuch verwendet worden, „humanisierte" Antikörper zu konstruieren, die die hohe Bindungsaffinität der monoklonalen Nagetierantikörper beibehalten aber eine verringern Immunogenität im Menschen zeigen. Es sind chimäre Antikörper produziert worden, in dem die variable (V) Region eines Maus-Antikörpers mit der konstanten (C) Region eines menschlichen Antikörpers verbunden wurde in einem Versuch die Spezifität und Affinität des Nagetierantikörpers beizubehalten aber die Menge des Proteins zu verringern, das nicht menschlich und daher immunogen ist. Während die Immunant wort gegen chimäre Antikörper im allgemeinen im Vergleich zu den entsprechenden Nagetierantikörper verringert ist, kann die Immunantwort nicht vollständig beseitigt werden, da die Mäuse V-Region dazu in der Lage ist eine Immunantwort auszulösen. Lobuglio et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 4220; Jaffers et al. (1986) Transplantation 41: 572.
In einem kürzlich durchgeführten Versuch die Immunogenität von Nagetierantikörpern zu verringern, wurde statt der gesamten V-Domäne nur die Nagetierkomplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDRs = „complementarity determining regions") auf einen menschlichen Antikörper übertragen. Solche humanisierten Antikörper sind als CDR-verpflanzte Antikörper bekannt. Die CDRs sind Regionen der Hypervariabilität in den V-Region, die von konservierten Regionen flankiert werden, die als Gerüstregion (FR = „Framework") bekannt sind. Jede V-Domäne enthält drei CDRs, die durch vier FRs flankiert werden. Die CDRs falten sich, um die Antigen-Bindungsstelle des Antikörpers zu binden, während die FRs die strukturellen Konformationen der V-Domänen unterstützt. Somit kann durch die Übertragung der Nagetier-CDRs auf einen menschlichen Antikörper theoretisch auch die Antigen-Bindungsdomäne übertragen werden. Owens et al. (1994) J. Immunol. Methods 168: 149 und Winter et al. (1993) Immunology 14: 243 stellen übersichtsartig die Entwicklung CDR-verpflanzter Antikörper dar.
Orlandi et al. (189) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833 konstruierten einen humanisierten Antikörper gegen das relative einfache Hapten Nitrophenacetyl (NP). Der CDR-verpflanzte Antikörper enthielt Mäuse-CDRs und menschliche FRs und zeigte eine NP-Bindungsaktivität, die der des nativen Mäuseantikörpers ähnlich waren. Die Konstruktion von CDR-verpflanzten Antikörpern, die komplexere Antigene erkennen, hat jedoch zu Antikörpern geführt, die eine Bindungsaktivität aufweisen, welche bedeutend niedriger war als die der nativen Nagetierantikörper. In vielen Fällen ist es gezeigt worden, daß die Einführung lediglich der Nagetier-CDRs in einen menschlichen Antikörper-Hintergrund nicht ausreichend dafür ist, die volle Bindungsaktivität beizubehalten, vielleicht aufgrund der Verzerrung der CDR-Konformation durch die menschliche FR.
Beispielsweise verglichen Gorman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 4181 zwei humanisierte Antikörper gegen menschliches CD4 und beobachteten, abhängig von der jeweiligen menschlichen Gerüstregion des humanisierten Antikörpers deutlich unterschiedliche Bindungsstärke. Co et al. (1991) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 88: 2869 bedurften eines verbesser ten Computermodells des interessierenden Mäuseantikörpers, um die kritischen Aminosäuren, die in dem Design des menschlichen Antikörpers berücksichtigt werden sollten, zu identifizieren. Kettleborough et al. (1991) Protein Engineering 4: 773 berichteten über den Einfluß bestimmter FR-Reste auf einen CDR-verpflanzten Antikörper im Hinblick auf die Antigenbindung und schlugen vor, daß die Reste direkt mit dem Antigen interagieren können oder die Konformation der CDR-Schleifen ändern können. Gleichermaßen berichten Singer et al. (1993) J. Immunol. 150: 2844, daß die optimale Humanisierung des monoklonalen anti-CD18 Mäuseantikörpers von der Fähigkeit abhängt, ob die ausgewählte FR dazu in der Lage ist das CDR in der angemessenen Antigen-Bindungskonformation zu unterstützen. Dementsprechend erfordert die Wiedererzeugung der Antigen-Bindungsstelle eine Berücksichtigung der möglichen Intraketteninteraktion zwischen dem FR und dem CDR und die Veränderung von Aminosäureresten des FRs, die eine Berührung mit dem durch die CDRs geformten Schlaufen aufrechterhalten. Wobei allgemeine theoretische Richtlinien für den Entwurf humanisierter Antikörper vorgeschlagen wurden (siehe z. B. Owens et al.), muß das Verfahren in allen Fällen für den jeweils interessierenden Nagetierantikörper angepaßt und optimiert werden.
Es besteht daher im Stand der Technik ein Bedürfnis nach humanisierten Antikörpern mit einer verringerten Immunogenität und einer vergleichbaren Bindungsaffinität im Vergleich zu dem Ausgangsnagetierantikörper für verschiedene therapeutische Anwendungen. Insbesondere besteht ein Bedürfnis nach einem humanisierten Antikörper gegen menschlichen Gewebefaktor, der eine antikoagulierende Aktivität aufweist und in der Behandlung oder Verhinderung thrombotischer Erkrankungen nützlich ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf CDR-verpflanzte Antikörper gerichtet, die dazu in der Lage sind menschlichen Gewebefaktor zu inhibieren, wobei die CDRs aus einem nicht-menschlichen monoklonalen Antikörper gegen Gewebefaktor und die FR- und konstanten (C) Bereiche von einem oder mehreren menschlichen Antikörpern abgeleitet sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der monoklonale Mäuseantikörper TF8-5G9.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung eines CDR-verpflanzten Antikörpers zur Verfügung, der dazu in der Lage ist menschlichen Gewebefaktor zu inhibieren, wobei das Verfahren die Konstruktion eines oder mehrerer Expressionsvektoren umfaßt, die Nukleinsäuren enthalten, die für CDR-verpflanzte Antikörper schwere und leichte Ketten kodieren, das Transfizieren geeigneter Wirtszellen mit dem Expressionsvektor oder den -vektoren, das Kultivieren der transfizierten Wirtszellen und Wiedergewinnen des CDR-verpflanzten Antikörpers.
Die vorliegenden Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Verlangsamung der Koagulation zur Verfügung, das die Verabreichung eines CDR-verpflanzten Antikörpers, der dazu in der Lage ist menschlichen Gewebefaktor zu inhibieren, an einen Patienten, der einer solchen Verlangsamung bedarf, umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt des weiteren ein Verfahren für die Behandlung oder die Verhinderung einer thrombotischen Erkrankung zur Verfügung, das die Verabreichung eines CDR-verpflanzten Antikörpers, der dazu in der Lage ist menschlichen Gewebefaktor zu inhibieren, an einen Patienten, der einer solchen Behandlung oder Verhinderung bedarf, umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die thrombotische Erkrankung eine intravaskuläre Koagulation, eine arterielle Restenose oder eine Arteriosklerose. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf eine pharmazeutische Zusammensetzung gerichtet, die CDR-verpflanzte Antikörper, die dazu in der Lage sind menschlichen Gewebefaktor zu inhibieren, umfaßt und des weiteren einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt die Nukleotid- und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der schweren Kette des monoklonalen Mäuseantikörpers TF8-5G9 zur Verfügung.
2 stellt die Nukleotid- und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der leichten Kette des monoklonalen Mäuseantikörpers TF8-5G9 zur Verfügung.
3 ist eine Kurve, die die Fähigkeit des CDR-verpflanzten Antikörpers TF8 HCDR1 × TF8LCDR1 wiedergibt an menschlichen Gewebefaktor zu binden und mit den monoklonalen Mäuseantikörper TF8-5G9, um die Bindung an Gewebefaktor zu kompetitieren. Die ausgefüllten Symbole geben die direkte Bindung des TF8HCDR1 × TF8LCDR1 und die positive Kontrolle die des chimären TF8-5G9 an Gewebefaktor an. Die leeren Symbole geben die kompetetive Bindung von TF8HCDR1 × TFBLCDR1 oder chimären TF8-5G9 mit dem monoklonalen Mäuseantikörper TF8-5G9 an.
4 gibt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pEe6TF8HCDR20 und die Aminosäuresequenz der kodierenden Region der CDR-verpflanzten schweren Kette TF8HCDR20 wieder.
5 gibt die DNA-Sequenz des Expressionsvektors pEe12TF8LCDR3 und die Aminosäuresequenz der kodierenden Region der CDR-verpflanzten leichten Kette TF8LCDR3 wieder.
6 ist eine Kurve, die die Fähigkeit des CDR-verpflanzten Antikörpers TF8HCDR20 × TF8LCDR3 an menschlichen Gewebefaktor zu binden, darstellt.
7 ist eine Kurve, die die Fähigkeit des CDR-verpflanzten Antikörpers TF8HCDR20 × TF8LCDR3 mit dem monoklonalen Mäuseantikörper TF8-5G9, um die Bindung an Gewebefaktor zu kompetitieren, darstellt.
8 ist eine Kurve, die die Fähigkeit des CDR-verpflanzten Antikörpers TF8HCDR20 × TF8LCDR3 die Faktor X-Aktivierung zu inhibieren, darstellt.
9 stellt den Expressionsvektor pEe6TF8HCDR20 dar, der sich aus der Subklonierung der CDR-verpflanzten schweren Kette TF8HCDR20 in eine Myelomexpressionsvektor pEehCMV-BglI ergibt. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet: VH ist die variable Region der CDR-verpflanzten schweren Kette; Cγ4 ist die menschliche IgG4 konstante Region; Pa ist das Polyadenylierungssignal; ampR ist das β-Lactamasegen; und hCMV ist der menschliche Cytomegalovirus.
10 stellt den Expressionsvektor pEe12TF8LCDR3 zur Verfügung, der sich aus der Subklonierung der CDR-verpflanzten leichten Kette TF8LCDR3 in einen Myelomexpressionsvektor pEe12 ergibt. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet: VL ist die variable Region der CDR-verpflanzten leichten Kette; CK ist die menschliche konstante Kappa-Region; SVE ist der SV40-früher Promotor; GS ist die Glutaminsynthetase cDNA. Die anderen Abkürzungen sind wie in 9 bemerkt.
DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt CDR-verpflanzte Antikörper zur Verfügung, die dazu in der Lage sind, menschlichen Gewebefaktor zu inhibieren, wobei die CDRs aus einem nicht-menschlichen monoklonalen Antikörper gegen Gewebefaktor abgeleitet sind und die FR- und die C-Region aus einem oder mehreren menschlichen Antikörpern abgeleitet sind. Die vorliegende Erfindung stellt des weiteren Verfahren der Herstellung und der Verwendung der vorliegenden CDR-verpflanzten Antikörper zur Verfügung.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist der CDR-verpflanzte Antikörper ein Antikörper in dem die CDRs von einem nicht-menschlichen Antikörper abgleitet sind, der dazu in der Lage ist, an menschlichen Gewebefaktor zu binden und dessen Funktion zu behindern und die FR- und C-Region des Antikörpers sind von einem oder mehreren menschlichen Antikörpern abgeleitet. Die CDRs, die aus dem nicht-menschlichen Antikörper abgeleitet sind, weisen vorzugsweise von 90% bis etwa 100% Identität mit den CDRs des nicht-menschlichen Antikörpers auf, obwohl jede und alle Modifizierungen die Substitutionen, Insertionen und Deletionen umfassen, erwogen werden, solange der CDR-verpflanzte Antikörper seine Fähigkeit bewart an Gewebefaktor zu binden und ihn zu inhibieren. Die Regionen der CDR-verpflanzten Antikörper die von menschlichen Antikörpern abgeleitet sind müssen keine 100%ige Identität mit dem menschlichen Antikörpern aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden so viele menschliche Aminosäurereste wie möglich beibehalten, um die Immunogenität vernachlässigbar zu halten, aber die menschlichen Reste, insbesondere die Reste der FR-Region werden wie erforderlich und wie hierin weiter unten in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gelehrt, substituiert. Solche, wie die hierin offenbarten Modifikationen sind notwendig, um die Antigen-Bindungsstelle, die durch die CDRs gebildet wird, zu unterstützen, während gleichzeitig die Humanisierung des Antikörpers maximiert wird.
Nicht-menschliche monoklonale Antikörper gegen menschlichen Gewebefaktor aus denen CDRs abgeleitet werden können, sind im Stand der Technik bekannt (Ruf et al., 1991; Morrisey et al., 1988, Thrombosis Research 52: 247) oder können durch gut bekannte Verfahren der monoklonalen Antikörperherstellung hergestellt werden (siehe z. B. Harlow et al., Herausgeber, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York). Gereinigter menschlicher Gewebefaktor gegen den monoklonale Antikörper gezüchtet werden können, ist gleichermaßen gut bekannt (Morrisey et al., 1987, Cell 50: 129) und für den Fachmann verfügbar. Monoklonale Mäuseantikörper und insbesondere der monoklonale Antikörper TF8-5G9, der durch Ruf et al. und Morrisey et al., 1988, Thrombosis Research 52: 247 und U.S. Patent Nr. 5,223,427 offenbart wird, sind besonders bevorzugt. Der Durchschnittsfachmann kann die Sequenzen der CDRs durch Verweis auf die publizierte wissenschaftliche Literatur oder Sequenzdatenbanken oder durch die Klonierung und Sequenzierung der schweren und leichten Ketten der Antikörper durch übliche Methoden bestimmen. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sind die cDNA- und die Aminosäuresequenzen der schweren Kette (SEQ ID NO: 1 und bzw. 2) und der leichten Ketten (SEQ ID NO: 3 bzw. 4) des monoklonalen Mäuseantikörpers TF8-5G9 zur Verfügung gestellt. Die cDNA- und die abgeleitete Aminosäuresequenz der Mäuse TF8-5G9 schweren Kette wird in 1 zur Verfügung gestellt. Die cDNA- und die abgeleitete Aminosäuresequenz der Mäuse TF8-5G9 leichten Kette wird in 2 zur Verfügung gestellt.
Jede der variablen Regionen der schweren und leichten Kette enthalten drei CDRs, die zusammenkommen, um die Antigen-Bindungsstelle zu bilden. Die drei CDRs werden von vier FR-Bereichen umgeben, die in erster Linie bei der Unterstützung der CDRs wirken. Die Sequenzen der CDRs innerhalb der Sequenzen der variablen Region der schweren und der leichten Ketten kann durch Computer-unterstützte Anordnung gemäß Kabat et al., (1987) in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Ausgabe, United States Department of Health and Human Services, US Goverment Printing Office, Washington, D. C. oder durch molekulare Modellierung der variablen Region beispielsweise unter Verwendung des ENCAD-Programms wie durch Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168: 595 beschrieben, identifiziert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die CDRs aus dem monoklonalen Mäuseantikörper TF8-5G9 abgeleitet. Die bevorzugten CDRs der schweren Kette weisen die folgenden Sequenzen auf:
Die bevorzugten CDRs der leichten Kette weisen die folgenden Sequenzen auf:
Die Sequenzen der CDRs des Mäuse- oder eines anderen nicht menschlichen Antikörpers und insbesondere die Sequenzen der CRDs des TF8-5G9 können durch die Insertion, Substitution und Deletion in dem Umfang modifiziert werden, so daß der CDR-verpflanzte Antikörper die Fähigkeit beibehält an menschlichen Gewebefaktor zu binden und ihn zu inhibieren. Der Durchschnittsfachmann kann das Beibehalten dieser Aktivität durch das Durchführen der hierin unten beschrieben funktionellen Testverfahren herausfinden. Die CDRs können beispielsweise von etwa 50% zu etwa 100% Homologie zu den CDRs der SEQ ID NR: 5–10 aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die CDRs von etwa 80% bis etwa 100% Homologie zu den CDRs der SEQ ID NR: 5–10 auf. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform weisen die CDRs von etwa 90% bis etwa 100% Homologie zu den CDRs der SEQ ID NR: 5–10 auf. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform weisen die CDRs von etwa 100% Homologie zu den CDRs der SEQ ID NR: 5–10 auf.
Die FR- und C-Regionen der CDR-verpflanzten Antikörper der vorliegenden Erfindung sind von einem oder mehreren menschlichen Antikörpern abgeleitet. Menschliche Antikörper derselben Klasse und desselben Typs wie der Antikörper von dem die CDRs abgeleitet sind, sind bevorzugt. Die FR der variablen Region der schweren Kette wird vorzugsweise von dem menschlichen Antikörper KOL abgeleitet (Schmidt et al., 1983, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 364: 713). Die FR der variablen Region der leichten Kette wird vorzugsweise von dem menschlichen Antikörper REI abgeleitet (Epp et al., 1974, Eur. J. Biochem. 45: 513). In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist es entdeckt worden, daß bestimmte Reste der menschlichen FR vorzugsweise durch die entsprechenden Reste des nicht-menschlichen Antikörpers, von dem die CDRs abgeleitet sind, ersetzt werden. Beispielsweise werden bestimmte FR-Reste des TF8-5G9 vorzugsweise erhalten, um eine optimale Bindung an das Antigen zu erzielen.
Der Einfachheit halber ist hierin das Numerierungsschema von Kabat et al. übernommen worden. Die Reste werden durch tiefergestellte Nummer oder Bindestriche, wie notwendig, bezeichnet, um die vorliegenden Sequenzen in Übereinstimmung mit der Standard-Kabat bezifferten Sequenz zu bringen.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden Reste, die in der FR-Region zurückbehalten werden, d. h. Reste die nicht durch menschliche FR-Reste ersetzt werden, gemäß der folgenden Richtlinien bestimmt. Reste, die für den Ausgangsantikörper z. B. TF8-5G9 idiosynkratisch im Vergleich zu der menschlichen Konsenssequenz von Kabat et al. sind, werden beibehalten. Reste des Ausgangsantikörpers, die in Übereinstimmung mit der Konsenssequenz sind, werden beibehalten, wenn der entsprechende Rest des menschlichen Antikörpers z. B. KOL oder REI idiosynkratisch ist. Reste, die Teil der kanonischen Strukturen der Antikörperschleife sind, die durch Chothia et al. (1989) Nature 342: 877 definiert sind, wie die Reste 71 der schweren und der leichten Ketten werden beibehalten. Die FR-Reste, für die vorhergesagt wird, daß sie Schleifen bilden wie die Reste 28–30 der schweren Kette, werden beibehalten. Die FR-Reste, für die vorausgesagt wird, daß sie die Konformation der CDRs beeinflussen, wie die Reste 48 und 49, die der CDR2 der schweren Kette vorausgehen, werden beibehalten. Reste, für die gezeigt worden ist, daß sie kritisch bei der Humanisierung anderer Antikörper sind, können auch beibehalten werden. Den vorangehenden Richtlinien wird in dem Ausmaß gefolgt, wie es notwendig ist, um die durch die CDRs gebildeten Antigen-Bindungsstellen zu unterstützen, während gleichzeitig die Humanisierung des Antikörpers maximiert wird.
Die Aminosäuresequenz einer repräsentativen CDR-verpflanzten variablen Region einer schweren Kette, die aus dem monoklonalen Mäuseantikörper TF8-5G9 und dem menschlichen Antikörper KOL abgeleitet ist, wird unten gezeigt. Die CDR-verpflanzte schwere Kette wird als TF8HCDR1 bezeichnet; Mäusereste wurden in der FR an den Resten 6, 17, 23, 24, 28, 29, 30, 48, 49, 68, 71, 73, 78, 88, 91 zurückbehalten. Die CDRs sind unterstrichen.
Die Aminosäuresequenz einer repräsentativen CDR-verpflanzten variablen Region einer leichten Kette, die von dem monoklonalen Mausantikörper TF8-5G9 und dem menschlichen Antikörper REI abgeleitet ist, wird unten gezeigt. Die CDR-verpflanzte leichte Kette wird als TF8LCDR1 bezeichnet; Mäusereste wurden in der FR an den Resten 39, 41, 46 und 105 beibehalten. Die CDRs sind unterstrichen.
Für einen CDR-verpflanzten Antikörper, der die variable Region in TF8HCDR1 und TF8LCDR1 enthält, ist gezeigt worden, daß er in der Bindung an menschlichen Gewebefaktor so wirksam ist wie der monoklonale Mäuseantikörper TF8-5G9. Es ist des weiteren in Übereinstimung mit der vorliegenden Erfindung durch Untersuchung der molekularen Struktur des monoklonalen Mäuseantikörpers TF8-5G9 und durch das Design, die Konstruktion und die Analyse der CDR-verpflanzten Antikörper entdeckt worden, daß die FR-Regionen ohne den Verlust der Antigen-Bindungaktivität weiter humanisiert werden können. Insbesondere kann die FR-Region die menschlichen FR-Reste an den Resten 6, 17, 68, 73 und 78 der schweren Kette und an den Resten 39, 41, 16 und 105 der leichten Kette unter Bewahrung der Antigen-Bindungsaktivität beibehalten.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform enthält die variable Region der schweren Kette eine FR, die von dem menschlichen Antikörper KOL abgeleitet ist, in der die Reste des monoklonalen Mäuseantikörpers TF8-5G9 an den Aminosäuren 23, 24, 28, 29, 30, 48, 49, 71, 88 und 91 beibehalten werden. Die bevorzugte variable Region der schweren Kette, wird als TF8HCDR20 bezeichnet und hat die folgende Sequenz.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform enthält die variable Region der leichten Kette eine FR, die von dem menschlichen Antikörper REI abgeleitet ist, in der die Reste des monoklonalen Mäuseantikörpers TF8-5G9 an den Aminosäuren 39 und 105 beibehalten wer den. Die bevorzugte variable Region der leichten Kette wird als TF8LCDR30 bezeichnet und hat die folgende Sequenz.
Es liegt im Rahmen der Fähigkeit des Durchschnittsfachmanns kleine Modifikationen der vorangehenden Sequenzen einzuführen, die Aminosäuresubstitution, -deletion und -insertion umfassen. Alle solche Modifikationen sind vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfaßt, solange wie der sich ergebende CDR-verpflanzte Antikörper die Fähigkeit beibehält an menschlichen Gewebefaktor zu binden und ihn zu inhibieren. Der Durchschnittsfachmann kann die Aktivität des CDR-verpflanzten Antikörpers mit Verweis auf die hierin unten beschrieben funktionellen Testverfahren bestimmen.
Die menschliche konstante Region der CDR-verpflanzten Antikörper der vorliegenden Erfindung wird ausgewählt, um die Effektorfunktion zu minimieren. Die beabsichtigte Verwendung der CDR-verpflanzten Antikörper der vorliegenden Erfindung ist die Blockierung der Koagulationskaskaden durch die Behinderung von Gewebefaktor und daher sind Antikörper-Effektorfunktionen, wie die Fixierung von Komplement nicht wünschenswert. Antikörper mit minimalen Effektorfunktionen umfassen IgG2, IgG4, IgA, IgD und IgE. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die konstante Region der schweren Kette die konstante Region des menschlichen IgG4 und die konstante Region der leichten Kette ist die konstante Region des menschlichen IgG4 Kappa.
Da die Effektorfunktionen für die therapeutische Verwendung nicht wünschenswert sein können, erwägt die vorliegende Erfindung des weiteren aktive Fragmente der CDR-verpflanzten Antikörper und insbesondere Fab-Fragmente und F(ab')₂-Fragmente. Aktive Fragmente sind die Fragmente, die dazu in der Lage sind, menschlichen Gewebefaktor zu inhibieren. Die Fab-Fragmente und F(ab')₂-Fragmente können durch übliche Mittel beispielsweise durch die Spaltung der CDR-verpflanzten Antikörper der Erfindung mit einem geeigneten proteolytischen Enzym wie Papain oder Pepsin oder durch die rekombinante Herstellung erhalten werden. Die aktiven Fragmente bewahren die Antigen-Bindungsstellen der CDR-verpflanzten Antikörper und sind daher gleichermaßen therapeutisch nützlich.
Die Fähigkeit der CDR-verpflanzten Antikörper, die in Übereinstimmung mit der Lehre der vorliegenden Erfindung entworfen und konstruiert wurden, um menschlichen Gewebefaktor zu binden und zu inhibieren, können durch funktionelle Testverfahren bewertet werden. Beispielsweise können in einem raschen und bequemen Testverfahren Expressionsvektoren, die die Nukleinsäuren enthalten, die für die CDR-verpflanzten schweren und leichten Ketten kodieren, in geeignete Wirtszellen co-transfiziert und transient exprimiert werden. Die sich ergebenden Antikörper können durch Standardtestverfahren im Hinblick auf ihre Fähigkeit menschlichen Gewebefaktor zu binden und im Hinblick auf ihre Fähigkeit mit nicht-menschlichen Antikörpern von denen die CDRs abgeleitet sind um die Bindung an menschlichen Gewebefaktor zu kompetitieren, untersucht werden.
Beispielsweise stellt die transiente Expression von Nukleinsäuren, die für die CDR-verpflanzten schweren und leichten Ketten kodieren, in COS-Zellen stellt ein schnelles und bequemes System zum Testen der Antikörper-Genexpressionsfunktion dar. Nukleinsäuren, die für die CDR-verpflanzten schweren bzw. leichten Ketten kodieren, werden in einen Säugetierzellexpressionsvektor beispielsweise pSG5, wie durch Green et al. (1988) Nucleic Acids Research 16: 369 beschrieben und kommerziell erhältlich von Stratagene Cloning System, La Jolla, CA kloniert. Der pSG5 Expressionsvektor stellt einzelne Restriktionsstellen für die Einführung der Gene der schweren und leichten Kette zur Verfügung und die in vivo Expression steht unter Kontrolle des SV40-Frühen Promotors. Die transkriptionelle Termination wird durch die SV40-Polyadenylierungssignalsequenz signalisiert.
Die auf pSG5 beruhenden Expressionsvektoren, die Nukleinsäuren enthalten, die für die schweren und leichten Ketten kodieren, werden in COS-Zellen co-transfiziert und unter Bedingungen kultiviert, die für die transiente Expression geeignet sind. Das Zellkulturmedium wird dann geerntet und auf die Antikörperexpression hin untersucht, beispielsweise durch einen Enzym-verknüpften Immunosorbent-Test (ELISA = „Enzyme linked immunosorbent assay"), um zu bestimmen, ob angemessene Antikörpermengen hergestellt worden sind. Ein ELISA kann verwendet werden, um die Fähigkeit des CDR-verpflanzten Antikörpers an menschlichen Gewebefaktor zu binden, zu bewerten. Der menschliche Gewebefaktor wird auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert und der COS-Zellüberstand, der den CDR-verpflanzten Antikörper enthält, wird hinzugefügt, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für etwa eine Stunde. Die Platten werden dann mit einem geeigneten Puffer, der eine oberflächenaktive Substanz enthält, wie Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS = „Phosphat buffered saline")/Tween gewaschen, gefolgt von dem Hinzufügen der Komponenten eines geeigneten Detektionssystems. Beispielsweise wird ein polyklonaler Meerrettichperoxidase-konjugierter anti-menschliche Kappakette Ziegenantikörper hinzugefügt, gefolgt vom Waschen, gefolgt von dem Hinzufügen eines Substrats für die Meerrettichperoxidase und dem Nachweis. Die CDR-verpflanzten Antikörper im Umfang der vorliegenden Erfindung sind die, die dazu in der Lage sind, an menschlichen Gewebefaktor in einem Maße zu binden, das zu dem nicht-menschlichen Antikörper vergleichbar ist von dem die CDRs abgeleitet sind, wie durch das vorangehende Testverfahren bestimmt.
Die Fähigkeit der CDR-verpflanzten Antikörper die Aktivität menschlichen Gewebefaktors in vivo zu inhibieren, kann bequem durch das folgende in vitro Testverfahren, das die in vivo Koagulationsereignisse nachahmt, bewertet werden. In Antwort auf eine vaskuläre Verletzung in vivo bindet Gewebefaktor an Faktor VII und ermöglicht die Umwandlung des Faktor VII zu einer Serinprotease (Faktor VIIa). Der Faktor VIIa-Gewebefaktorkomplex wandelt Faktor X zu einer Serinprotease (Faktor Xa) um. Faktor Xa bildet einen Komplex mit dem Faktor Va (aus dem intrinsischen Koagulationsreaktionsweg), was zu einer Umwandlung des Prothrombins zu Thrombin führt, was wiederum zu einer Umwandlung des Fibrinogens zu Fibrin führt. In einem bequemen funktionellen in vitro Testverfahren wird Gewebefaktor in der Gegenwart von Faktor VIIa und des CDR-verpflanzten Anti-Gewebefaktorantikörper, der in dem oben beschriebenen transienten Expressionssystem produziert wurde, inkubiert. Faktor X wird hinzugefügt, das Reaktionsgemisch wird inkubiert worauf ein Testverfahren für die Faktor Xa-Aktivität, das ein chromogenen Substrat für Faktor Xa (Spektrozym FXa, American Diagnostica, Inc., Greenwich, CT) verwendet, erfolgt. Die Fähigkeit des CDR-verpflanzten Antikörpers die Faktor X-Aktivierung zu inhibieren, stellt somit ein Maß für die Fähigkeit des CDR-verpflanzten Antikörpers dar, die Aktivität menschlichen Gewebefaktors zu inhibieren.
Die CDR-verpflanzten Antikörper im Umfang der vorliegenden Erfindung sind die, die dazu in der Lage sind menschlichen Gewebefaktor in einem Maße zu inhibieren, das dem des nicht-menschlichen Antikörpers, von dem die CDRs abgeleitet sind, vergleichbar ist wie durch das vorangehende Testverfahren bestimmt. In einer Ausführungsform weist der CDR-verpflanzte Antikörper für menschlichen Gewebefaktor mindestens 50% der inhibitorischen Aktivität von TF8-5G9 auf. In einer bevorzugten Ausführungsform weist der CDR-verpflanzte Antikörper für Gewebefaktor mindestens 70% der inhibitorischen Aktivität von TF8-5G9 auf. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform weist der CDR-verpflanzte Antikörper für Gewebefaktor mindestens 80% der inhibitorischen Aktivität des TF8-5G9 auf. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform weist der CDR-verpflanzte Antikörper für den menschlichen Gewebefaktor mindestens 90% der inhibitorischen Aktivität des TF8-5G9 auf.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Erzeugung eines CDR-verpflanzten Antikörpers zur Verfügung, der dazu in der Lage ist, menschlichen Gewebefaktor zu inhibieren. Das Verfahren umfaßt die Konstruktion eines Expressionsvektors, der eine Nukleinsäure enthält, die für die CDR-verpflanzte Antikörper schwere Kette kodiert, und einen Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure enthält, die für die CDR-verpflanzte Antikörper leichte Kette kodiert, das Transfizieren geeigneter Wirtszellen mit den Expressionsvektoren, das Kultivieren der transfizierten Wirtszellen unter Bedingungen, die für die Expression der schweren und leichten Ketten geeignet sind, und das Gewinnen der CDR-verpflanzten Antikörper. Alternativ kann ein Expressionsvektor, der die Nukleinsäuren, die für die schwereren und leichten Ketten kodieren, enthält, verwendet werden.
Übliche molekularbiologische Techniken, wie beispielsweise durch Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, offenbart, können verwendet werden, um Nukleinsäuren zu erhalten, die für die schweren und leichten Ketten der CDR-verpflanzten Antikörper der vorliegenden Erfindung kodieren. Eine Nukleinsäure, die für die CDR-verpflanzte variable Domän kodiert, kann durch Isolierung der cDNA, die für den zu humanisierenden Antikörper kodiert, z. B. den monoklonalen Mäuseantikörper TF8-5G9 durch übliche Klonierungsverfahren aus dem Hybridom, das den Antikörper herstellt oder durch Polymerasekettenreaktionvervielfältigung (PCR = „Polymerase chain reaction") der Gene der variablen Region wie beispielsweise durch Winter et al., beschrieben, gefolgt von Orts-gesteuerter Mutagenese, um in den FR-Regionen Nukleotide einzuführen, die für die gewünschten menschlichen Reste kodieren, konstruiert werden. Alternativ kann die cDNA, die für den menschlichen Antikörper kodiert, isoliert werden. Gefolgt von der Orts-gesteuerten Mutagenese, um Nukleotide, die für die gewünschten Mäusereste in den CDRs kodieren, einzuführen.
Nukleinsäuren, die für die CDR-verpflanzte variable Domäne kodieren, können auch durch das Zusammensetzen synthetischer Oligonukleotide beispielsweise unter Verwendung der DNA-Polymerase und DNA-Ligase synthetisiert werden. Die sich ergebenden synthetischen variablen Regionen können dann durch PCR vervielfältigt werden. Die Nukleinsäuren, die für CDR-verpflanzte variablen Domänen kodieren, können auch durch PCR-Strangüberlappungsverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind und über die von Owens et al. ein Überblick gegeben wird, konstruiert werden.
Dementsprechend kann, nachdem die gewünschten Aminosäuresequenzen der CDR-verpflanzten variablen Domänübereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung bestimmt worden sind, der Durchschnittsfachmann die Nukleinsäuren erhalten, die für die variablen Domänen kodieren. Des weiteren ist der Fachmann sich bewußt, daß aufgrund der Degeneration des genetischen Codes verschiedene Nukleinsäuresequenzen konstruiert werden können, die für die CDR-verpflanzten variablen Domänen kodieren. Alle solche Nukleinsäuresequenzen werden in der vorliegenden Erfindung erwogen.
Die Nukleinsäure, die für die CDR-verpflanzten variablen Domänen kodieren, sind mit geeigneten Nukleinsäuren, die für die konstante Region der menschlichen Antikörper schweren oder leichten Kette kodieren, verknüpft. Nukleinsäuresequenzen, die für die konstanten Regionen der menschlichen schweren und leichten Kette kodieren, sind im Stand der Technik bekannt. Es liegt im Rahmen der Kenntnis des Durchschnittsfachmanns Sequenzen aufzunehmen, die die Transkription, die Translation und die Sekretion ermöglichen, beispielsweise Startcodons, Führungssequenzen, die Kozak-Konsenssequenz (Kozak, 1987, J. Mol. Biol. 196: 947) und ähnliche sowie Restriktionsendonukleasestellen, um die Klonierung in Expressionsvektoren zu ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung stellt des weiteren Nukleinsäuren zur Verfügung, die für die schweren und leichten Ketten der CDR-verpflanzten Antikörper kodieren, die dazu in der Lage sind, menschlichen Gewebefaktor zu inhibieren, wobei die CDRs von einem monoklonalen Mäuseantikörper gegen Gewebefaktor abgeleitet sind und die FR- und die C-Region von einem oder mehreren menschlichen Antikörpern abgeleitet sind.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurden repräsentative Nukleinsäuren, die für CDR-verpflanzte schwere und leichte Ketten kodieren, konstruiert. Die CDR- verpflanzte schwere Kette umfaßt eine variable Region, die FR-Regionen enthält, die von dem menschlichen Antikörper KOL abgeleitet sind, und CDRs, die von dem monoklonalen Mäuseantikörper TF8-5G9 abgeleitet sind, und umfaßt des weiteren eine konstante Region, die von der schweren Kette des menschlichen IgG4 abgeleitet ist. Die CDR-verpflanzte leichte Kette umfaßt eine variable Region, die die FR-Regionen enthält, die von dem menschlichen Antikörper REI abgeleitet sind, und CDRs, die von dem monoklonalen Mäuseantikörper TF8-5G9 abgeleitet sind, und umfaßt des weiteren eine konstante Region, die von der menschlichen IgG4 Kappa-Kette abgeleitet ist. Nukleinsäuren, die für die schweren und leichten Ketten kodieren, wurden durch das Zusammensetzen der variablen Region aus synthetischen Nukleotiden, das Vervielfältigen der zusammengesetzten variablen Region durch PCR, das Reinigen der vervielfältigten Nukleinsäuren und das Ligieren der Nukleinsäuren, die für die variable Region kodieren, in einen Vektor, der eine Nukleinsäure enthält, die für die geeignete menschliche konstante Region kodiert, konstruiert.
Die Sequenzen der repräsentativen Nukleinsäuren, die für CDR-verpflanzte schwere und leichte Ketten kodieren, sind als die Nukleotide 1–2360 der SEQ ID NR: 15 bzw. die Nukleotide 1–759 der SEQ ID NR: 20 wiedergegeben.
Die Nukleinsäuresequenz, die für eine bevorzugte schwere Kette (Nukleotide 1–2360 der SEQ ID NR: 15) kodiert, wird als TF8HCDR20-Gen bezeichnet. Die Nukleinsäure enthält die folgenden Bereiche: 5'-EcoRI-Restriktionsstelle (Nukleotide 1–6); Kozak-Sequenz (Nukleotide 7–15); Startcodon und Führungssequenz (Nukleotide 16–72); CDR-verpflanzte variable Region (Nukleotide 73–423); humane IgG4 CH1-Domäne (Nukleotide 424–717); humanes IgG4 Intron 2 (Nukleotide 718–1110); das humane IgG4 Scharnier (Nukleotide 1111–1146); das humane IgG4 Intron 3 (Nukleotide 1147–1267); die humane IgG4 CH2-Domäne (Nukleotide 1268–1594); das humane IgG4 Intron 4 (Nukleotide 1595–1691); die humane IgG4 CH3-Domäne (Nukleotide 1692–2012); 3'-nicht-translatierte Region (Nukleotide 2013–2354); das 3'-BamHI-Ende, das an die BclI-Stelle Expressionsvektors gespliced ist (Nukleotide 2355–2360).
Die Nukleinsäuresequenz, die für ein bevorzugtes Gen der leichten Kette kodiert (Nukleotide 1–759 der SEQ ID NR: 20), wird als das TF8LCDR3-Gen bezeichnet. Die Nukleinsäuresequenz enthält die folgenden Bereiche: 5'-EcoRI-Restriktionsstelle (Nukleotide 1–5); die Kozak-Sequenz (Nukleotide 6–8); Startcodon und Führungssequenz (Nukleotide 6–68); die CDR- verpflanzte variable Region (Nukleotide 69–392); die menschliche Kappa-konstante Region (Nukleotide 393–710); 3'-nicht-translatierte Region (Nukleotide 711–753); das 3'-BamHI-Ende, das an die BclI-Stelle des Expressionsvektor gespliced ist (Nukleotide 754–759).
Die vorangehende bevorzugten Sequenzen können durch den Durchschnittsfachmann modifiziert werden, um die Degeneration des genetischen Codes zu berücksichtigen und um Hinzufügung, Deletion und konservative und nicht-konservative Substitution durchzuführen, die zu einem Erhalt der Funktion der Nukleinsäure führen, d. h. das sie für eine schwere oder leichte Kette eines CDR-verpflanzten Antikörpers kodiert, der dazu in der Lage ist menschlichen Gewebefaktor zu inhibieren. Die Restriktionsstellen und die Sequenzen, die die Transkription und die Translation ermöglichen, können wie notwendig abhängig von dem für die Expression gewählten Vektor und Wirtsystem verändert oder ersetzt werden.
Geeignete Expressionsvektoren und Wirte für die Herstellung der CDR-verpflanzten Antikörper der vorliegenden Erfindung sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Die Expressionsvektoren umfassen regulatorische Sequenzen, wie Replikons und Promotoren, die dazu in der Lage sind, die Replikation und die Expression der heterologen Nukleinsäuresequenzen in einer bestimmten Wirtszelle zu steuern. Die Vektoren können auch Selektionsgene, Enhancer, Signalsequenzen, Ribosombindungsstellen, RNA-Splicestellen, Polyadenylierungsstellen, transkriptionelle Terminationssequenzen usw. enthalten. Die Vektoren können durch üblich Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, konstruiert werden oder von kommerziellen Quellen erhalten werden. Die Expressionsvektoren haben vorzugsweise geeignete Restriktionsstellen an denen die Nukleinsäuren, die für die Antikörperketten der Erfindung kodieren, insertiert werden. Myelom-Expressionsvektoren, in denen die Antikörper-Genexpression durch den menschlichen Cytomegalovirus Promotor-Enhancer vorangetrieben wird sind besonders bevorzugt.
Die Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure, welche für die CDR-verpflanzte schwere Kette kodiert, unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors enthalten und Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure, welche für die CDR-verpflanzte leichte Kette kodiert, unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors enthalten, werden in eine geeignete Wirtszelle co-transfiziert. In einer weiteren Ausführungsform werden die Nukleinsäuren, die sowohl für die schwere und die leichte Kette kodieren in einem einzelnen Vektor für die Transfektion einer geeigneten Wirtszelle zur Verfügung gestellt.
Geeignete Wirtszellen oder Zellinien für die Expression der CDR-verpflanzten Antikörper der vorliegenden Erfindung umfassen bakterielle Zellen, Hefezellen, Insektenzellen, und Säugetierzellen wie chinesische Hamster-Ovarialzellen (CHO), COS-Zellen, Fibroplasten und myeloide Zellen. Säugetierzellen sind bevorzugt. CHO-, COS- und Myelomzellen sind besonders bevorzugt. Die Myelomzellen sind für die Etablierung permanenter Zellinien, die CDR-verpflanzte Antikörper produzieren, bevorzugt. Die Expression von Antikörpern in Myelomzellen, Bakterien und Hefen wird durch Sandhu (1992) Critical Reviews in Biotechnology 12: 437 übersichtsartig dargestellt. Die Expression in Säugetierzellen wird durch Owen et al. übersichtsartig dargestellt.
Die Transfektion von Wirtszellen durch Expressionsvektoren, die Nukleinsäuren enthalten, welche für die CDR-verpflanzten schweren und leichten Ketten kodieren, kann durch Verfahren die einem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind, erreicht werden. Solche Methoden umfassen beispielsweise die Kalziumchloridtransfektion, die Kalziumphosphattransfektion, die Lipofektion und die Elektroporation. Geeignete Kulturverfahren und Bedingungen für die Erzeugung der CDR-verpflanzten Antikörper sind gleichermaßen im Stand der Technik gut bekannt. Die CDR-verpflanzten Antikörper können durch übliche Verfahren gereinigt werden, die die Amoniumsulfatpräzipitation, die Affinitätschromatographie, die Gelelektrophorese und ähnliches umfassen. Die Fähigkeit der CDR-verpflanzten Antikörper an menschlichen Gewebefaktor zu binden und ihn zu inhibieren kann durch die oben beschriebenen in vitro Testverfahren bewertet werden.
Die CDR-verpflanzten Antikörper der vorliegenden Erfindung haben eine Vielzahl von Verwendungen. Beispielsweise sind die Antikörper dazu in der Lage an menschlichen Gewebefaktor zu binden und sind daher in Testverfahren auf menschlichen Gewebefaktor aus Körperflüssigkeitsproben für die Reinigung menschlichen Gewebefaktors usw. nützlich.
Die CDR-verpflanzten Antikörper der vorliegenden Erfindung sind dazu in der Lage menschlichen Gewebefaktor zu inhibieren. Für den menschlichen Gewebefaktor ist es gut bekannt, daß er ein wesentliches Element in der menschliche Koagulationskaskade darstellt. Die Fähigkeit der Antikörper der vorliegenden Erfindung die Koagulationskaskade zu unterbrechen wird durch in vitro Testverfahren, in denen die Antikörper die Faktor X-Aktivierung verhindern, gezeigt. Dem entsprechend sind die vorliegenden Antikörper bei der Verlangsamung der Koagulation nützlich. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren für die Verlangsamung der Koagulation zur Verfügung, daß die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des CDR-verpflanzten Antikörpers, der dazu in der Lage ist menschlichen Gewebefaktor zu inhibieren, an einen Patienten, der einer solchen Verlangsamung bedarf, umfaßt, zur Verfügung.
Eine Vielzahl thrombotischer Erkrankungen sind durch die übermäßige oder unangemessene Koagulation charakterisiert und werden wirksam durch die Verabreichung von Mitteln, die mit der Koagulationskaskade interferieren, behandelt oder verhindert. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung des weiteren ein Verfahren für die Behandlung oder die Verhinderung thrombotischer Erkrankungen zur Verfügung, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines CDR-verpflanzten Antikörpers, der dazu in der Lage ist menschlichen Gewebefaktor zu inhibieren, an einen Patienten, der einer solchen Behandlung oder Verhinderung bedarf, umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die thrombotische Erkrankung die intravaskuläre Koagulation, die arterielle Restenose oder die Arteriosklerose. Die Antikörper der Erfindung können in Kombination mit anderen Antikörpern und therapeutischen Mitteln verwendet werden.
Eine therapeutisch wirksame Menge des Antikörpers der vorliegenden Erfindung kann durch den Durchschnittsfachmann unter Berücksichtigung des Zustands des Patienten, des zu behandelnden Zustands, des Verfahrens zur Verabreichung usw. bestimmt werden. Eine therapeutisch wirksame Menge ist die Dosierung, die notwendig ist, um thrombotische Erkrankungen zu lindern, zu beseitigen oder zu verhindern, wie durch üblich Parameter bewertet werden kann. Beispielsweise kann eine therapeutisch wirksame Dosis eines CDR-verpflanzten Antikörpers der vorliegenden Erfindung von etwa 0,1 mg bis etwa 20 mg pro 70 kg Körpergewicht betragen, Eine bevorzugte Dosierung beträgt etwa 1,0 mg bis etwa 5 mg pro 70 kg Körpergewicht.
Ein Patient, der einer solchen Behandlung bedarf, ist ein Patient, der an einer Erkrankung leidet die durch unangemessene oder übermäßige Koagulation charakterisiert ist oder ein Patient, der ein Risiko für eine solche Erkrankung aufweist. Beispielsweise kann die antikoagulative Therapie nützlich sein, um die postoperative venöse Thrombose und eine arterielle Restenose nach einer Ballon-Angionplastie zu verhindern.
Die CDR-verpflanzten Antikörper der vorliegenden Erfindung sind in derselben Weise nützlich wie vergleichbare therapeutische Mittel und die Dosierungsmenge liegt in derselben Größenordnung wie sie im allgemeinen mit diesen vergleichbaren therapeutischen Mitteln verwendet wird. Die vorliegenden Antikörper können in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger mit Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, verabreicht werden.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf eine pharmazeutische Zusammensetzung gerichtet, die mindestens einen CDR-verpflanzten Antikörper umfaßt, der dazu in der Lage ist, menschlichen Gewebefaktor zu inhibieren und des weiteren eine pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt. Wie hierin verwendet umfaßt „pharmazeutisch annehmbarer Träger" jede und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und Antipilzmittel, isotonische und Absorptions-verzögernde Mittel und ähnliches. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutische aktive Substanzen ist im Stand der Technik bekannt. Mit der Ausnahme, daß irgendein übliches Medium oder Mittel mit dem aktiven Wirkstoff nicht kompatibel ist, wird seine Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen erwogen. Ergänzende aktive Wirkstoffe können auch in die Zusammensetzungen aufgenommen werden.
Die Antikörper können über gut bekannte Wege verabreicht werden, die oral und parenteral, z. B. intravenös, intramuskulär, intranasal, intradermal, subkutan und ähnliches umfassen. Die parenterale Verabreichung und insbesondere die intravenöse Verabreichung ist bevorzugt. Abhängig von dem Verabreichungsweg kann die pharmazeutische Zusammensetzung schützende Beschichtung erfordern.
Die pharmazeutischen Formulierungen, die für die Injektionsverwendung geeignet sind, umfassen sterile wäßrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die unvorbereitete Zubereitung steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen. In allen Fällen muß die letztliche Lösungsformulierung steril und flüssig sein. Typische Träger umfassen Lösungsmittel und Dispersionsmedien, die beispielsweise Wasser, gepufferte wäßrige Lösung (d. h. biokompatible Puffer), Ethanol, Polyol wie Glycerin, Propylen, Glykol, Polyethylenglycol, geeignete Gemische davon, oberflächenaktive Substanzen und Pflanzenöle enthalten. Die Antikörper können für die parenterale Verabreichung in Liposomen aufgenommen werden. Die Sterilisierung kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren, die das Hinzufügen anti- bakterieller oder Antipilzmittel, beispielsweise Paraben, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure oder Thimersal umfassen, erreicht werden. Des weiteren können isotonische Mittel, wie Zucker oder Natriumchlorid in die vorliegende Zusammensetzung aufgenommen werden.
Die Herstellung steriler injizierbarer Lösungen, die die vorliegenden Antikörper enthalten, wird durch Aufnahme dieser Antikörper in der erforderlichen Menge in das geeignete Lösungsmittel mit verschiedenen Inhaltsstoffen, die oben aufgeführt wurden, wie erforderlich gefolgt durch eine Sterilisation vorzugsweise eine Filtersterilisation erreicht. Um ein steriles Pulver zu erhalten, werden die obigen Lösungen wie notwendig Vakuum-getrocknet oder Gefrier-getrocknet.
Die folgenden Beispiele stellen die vorliegende Erfindung weiter da.
BEISPIEL 1
Isolierung und Sequenzierung der TF8-5G9 leichten Kette (LK) und der schweren Kette (SK)
Zwei DNA-Bibliotheken wurden aus Oligo(dT)-geprimten TF8-5G9 Hybridom-RNA unter Verwendung von molekularbiologischen Standardverfahren, wie durch Sambrook et al. beschrieben, erzeugt. Die Ziel-DNA wurde in den Librarian II Plasmidvektor von Invitrogen (San Diego, CA) kloniert und die Bibliotheken wurden auf cDNA-Klone durchsucht, die für Mäuse IgG SK und LK kodieren. Ein cDNA-Klon voller Länge konnte für die schwere Kette, trotz der Konstruktion zweier unabhängiger Bibliotheken nicht isoliert werden. Eine Zufalls-geprimte TF8-5G9 cDNA-Bibliothek wurde erzeugt, um die fehlenden 5'-Sequenzen der schweren Kette zu erhalten. Dementsprechend lag die cDNA der schweren Kette in zwei Stücken vor: ein 5'-Klon mit 390 Nukleotiden und ein 3'-Klon mit 1392 Nukleotiden. Die zwei SK-Klone überlappten für 292 Nukleotide.
Die SK- und LK-Klone wurden vollständig durch das Dideoxykettenterminationsverfahren von Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. SCi. USA 74: 5463 sequenziert. Um die Sequenz der variablen Region zu bestätigen wurde eine Sequenz aus PCR-vervielfältigter cDNA erhalten, die aus Gesamt-TF8-5G9-Hybridom RNA synthetisiert worden war. Die Gesamt-TF8-5G9-Hybridom RNA wurde durch das Guadininthiocynatverfahren von Chrigwin et al. (1970) Biochemistry 18: 5294 isoliert. Die cDNA wurde unter Verwendung des Perkin Elmer (Norwalk, CT) GeneAmp RNA-Polymerasekettenreaktion Kits (PCR) mit einem Oligo(dT)- Primer synthetisiert. Die Bestandteile des selben Kits wurden in der PCR verwendet, um die variablen Regionen der LK und SK unter Verwendung von Primern, die auf der Sequenz basieren, die für die cDNA-Klone erhalten worden war, zu vervielfältigen. Die vervielfältigten Fragmente der variablen Region wurden Gel-gereinigt und gemäß dem Verfahren von Tracy et al. (1991) BioTechniques 11: 68 auf einem Modell 373A Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) automatisierten Fluoreszenz-DNA-Sequenzer sequenziert. Die Sequenz für TF8-5G9 LK und SK, die aus der RNA-Vervielfältigung erhalten wurde, und die Sequenz, die für die cDNA-Klone erhalten wurde, stimmten überein. Die Sequenz der TF8-5G9 SK variable Region mit der Proteintranslation wird in der 1 und der SEQ ID NR: 1 gezeigt und die für LK wird in der 2 und in der SEQ ID NR: 3 gezeigt.
BEISPIEL 2
Chimäre LK- und SK-Expressionsvektorkonstruktion
Um die Bindungsaktivität des CDR-verpflanzten Anti-GF LK und SK einzeln zu überprüfen wurden Maus-Mensch-chimäre TF8-5G9 LK und SK konstruiert. Diese erlaubten es die CDR-verpflanzte LK auf ihre TF-Bindungsfähigkeit im Zusammenhang mit der chimären SK zu testen und die CDR-verpflanzte SK in Kombination mit der chimären LK zu testen.
Die Primer wurden entworfen, um die TF8-5G9 LK variable Region unter Verwendung der cDNA-Klone in dem Librarian II-Vektor als Vorlage zu vervielfältigen. Der 5'-Primer wurde mit einer EcoRI-Stelle entworfen während der 3'-Primer mit einer NarI-Stelle entworfen wurde. Die PCR wurde verwendet, um die LK variable Region zu vervielfältigen wodurch ein 433 bp-Fragment mit einem 5'-EcoRI-Ende und einem 3'-NarI-Ende erzeugt wurde. Das Fragment umfaßt die Signalsequenz aus dem TF8-5G9 LK cDNA-Klon aber beinhaltete eine Änderung von zwei Basen in dem Arginincodon, das dem ATG-Startcodon unmittelbar folgt. Diese Änderung erhielt den Arginin-Rest veränderte aber die Sequenz so, daß sie der Kozak-Konsenssequenz entsprach, um möglicherweise die Translation der LK mRNA zu verbessern. Das PCR-vervielfältigte Fragment der LK variablen Region wurde mit EcoRI- und NarI-Restriktionsenzymen verdaut und durch Elektrophorese auf einem 2% Nusieve, 1% Seakemagarosegel (FMC Bio Products, Rockland, ME) gereinigt.
Die DNA wurde aus dem Gelstück extrahiert und durch Geneclean (Bio 101, La Jolla, CA) Verfahren gereinigt. Das chimäre TF8-5G9 LK-Gen voller Länge wurde durch die Klonie rung dieser DNA in die EcoRI- und NarI-Stellen des pSP73-Vektors (Promega, Madison, WI) kloniert, der die menschliche konstante Kappa-Region enthält. Das Gen wurde aus dem pSP73-Vektor durch EcoRI-Verdau isoliert und in die EcoRI-Stelle des Säugetierzellexpressionsvektors pSG5 (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) subkloniert.
Das chimäre TF8-5G9 SK-Gen wurde in einer ähnlichen Weise zu der des chimären LK-Gens zusammengesetzt. Da aus den Librarian II Vektor cDNA-Bibliotheken keine SK-cDNA voller Länge isoliert wurde, wurde das SK-Fragment der variablen Region das durch PCR aus der Gesamt-TF8-5G9-Hybridomzell-RNA erzeugt wurde, als Vorlage verwendet. Die Primer, die eine EcoRI-Stelle an dem 5'-Ende und eine SacI-Stelle an den 3'-Ende beinhalteten, wurden in der PCR verwendet, um ein 430 bp Fragment zu erzeugen, das die TF8-5G9 SK-Kozaksequenz, ein Startcodon, eine Signalsequenz und die variable Region enthielt. Dieses Fragment wurde mit dem Restriktionsenzymen EcoRI und SacI verdaut und unter Verwendung desselben Verfahrens, das für die Konstruktion der chimären LK verwendet wurde, über ein Gel gereinigt.
Das chimäre SK-Gen voller Länge wurde durch die Klonierung des Fragments der variablen Region in die EcoRI- und die SacI-Stellen des pSG5-Expressionsvektors, der die menschliche IgG4 konstante Region enthielt, konstruiert.
BEISPIEL 3
Design und Konstruktion der CDR-verpflanzten Gene der schweren und leichten Kette
Die Domäne der variablen Region der CDR-verpflanzten SK- und LK-Gene wurde mit einem EcoRI-Überhang an dem 5'-Ende gefolgt von einer Kozaksequenz entworfen, um die Antikörperexpression zu verbessern. Die Führungssequenzen wurden aus den schweren und leichten Ketten des monoklonalen Mäuseantikörpers B72.3 (Whittle et al. (1987) Protein Engineering 1: 499) abgeleitet. Das 3'-Ende der variablen Region wurde entworfen, um Überhänge aufzuweisen, die das Splicen an die entsprechende DNA einer menschlichen konstanten Region erlaubten.
In den anfänglich entworfenen CDR-verpflanzten TF8-5G9 schweren und leichten Ketten waren die CDRs aus der Mäuse-TF8-5G9-Sequenz abgeleitet, während die Gerüste in erster Linie aus menschlicher Antikörpersequenz abgeleitet waren. Der menschliche Antikörper KOL (Schmidt et al.) wurde für die Gerüste der schweren Kette verwendet während das menschliche Antikörperdimer (Epp et al.) für die Gerüste der leichten Kette verwendet wurde.
Mehrere Kriterien wurden verwendet, um die Reste des Mäusegerüsts für das Design der variablen Region der TF8-5G9 CDR-verpflanzten schweren und leichten Kette auszuwählen. Die Gerüstreste die an der jeweiligen Position zu TF8-5G9 idiosynkratisch sind, wurden als Mäusesequenzen beibehalten unter der Annahme, daß sie zu besonderen Bindungscharakteristika beitragen. Die TF8-5G9 Mäusereste wurden auch an Gerüstpositionen beibehalten, bei denen sie in Übereinstimmung mit der menschlichen Konsenssequenz waren, aber bei denen die entsprechenden Reste in KOL oder in REI idiosynkratisch waren. Die Reste die Teil der kanonischen Strukturen der Antikörperschlaufe sind, wie der Rest 71 (Bezifferung gemäß Kabat et al.) der schweren und leichten Ketten wurden auch als Mäusesequenz beibehalten. Die Gerüstreste, die die Schleifenform bilden, wie die Reste 26–30 der SK wurden als TF8-5G9 Mäusesequenz an den Positionen beibehalten an denen die Mäusesequenz von dem Menschen differierte. Reste von denen bekannt war, daß sie die Konformation der CDRs direkt beeinflussen, wie 48 und 49, die unmittelbar dem CDR2 der SK vorangehen, wurden auch als Mäusesequenz beibehalten.
Die Aminosäuresequenz der variablen Region der anfänglich entworfenen CDR-verpflanzten TF8-5G9 SK, TF8HCDR1 ist in SEQ ID NR: 11 gezeigt. Die Mäusereste wurden an den Gerüstpositionen 6, 17, 23, 24, 28, 29, 30, 48, 49, 68,71, 73, 78, 88 und 91 beibehalten. Die CDR-verpflanzte SK variable Region wurde an der menschlichen IgG4 konstanten Region befestigt.
Die Aminosäuresequenz der variablen Region für die anfänglich entworfene CDR-verpflanzten TF8-5G9 LK, TF8LCDR1 ist in SEQ ID NR: 12 gezeigt. Die Mäusereste wurden an den Gerüstpositionen 39, 41, 46 und 105 beibehalten. Die CDR-verpflanzte LK variable Region wurde an einer konstanten menschlichen Kappa-Region befestigt.
Die variable Region für die oben beschriebene CDR-verpflanzte SK und LK wurden jeweils auf 13 synthetischen Oligonukleotiden, die durch Research Genetics, Inc., Huntsville, AL synthetisiert wurden, zusammengesetzt. Diese Oligonukleotide erreichten eine Länge von 42 bis 80 Basen und kodierten beide Stränge der variablen Region. Als die sechs komplementären Oligonukleotidepaare aneinandergelagert wurden wiesen die erzeugten Überhänge eine Länge von 17 bis 24 Basen auf. Diese Oligonukleotidpaare wurden verbunden, an ihren komplementären Überhängen aneinander gelagert und ligiert, um die endgültigen doppelsträngigen variablen Regionen voller Länger zu ergeben.
Die Oligonukleotide der SK variablen Region wurden in einer 452 bp Fragment zusammengesetzt, das eine 5'-EcoRI-Stelle und eine 3'-SacI-Stelle enthielt. Die Polymerasekettenreaktion wird verwendet, um dieses Fragment zu vervielfältigen. Die sich ergebende vervielfältigte DNA wurde auf einem 2% Nusieve, 1% Seakemagarosegel (FMC) gereinigt. Eine Bande geeigneter Größe der DNA wurde ausgeschnitten und die DNA wurde durch das Geneclean (Bio101)-Verfahren wiedergewonnen. Das Fragment wurde dann mit EcoRI und SacI verdaut und wiederum durch das Geneclean-Verfahren gereinigt. Dieses SK-Fragment der variablen Region mit EcoRI- und SacI-Enden wurde in die EcoRI- und SacI-Stellen des pSport-1-Vektors (GIBCO-BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) kloniert. DNA aus mehreren Klonen wurde isoliert und sequenziert, um den Zusammenbau der richtigen variablen Region zu bestätigen. Alle Klone wiesen unerwartete Basenänderungen auf. Ein Klon mit der geringsten Anzahl der Basenänderung (zwei Fehlpaarungen an den Basen 133 und 144) wurde ausgewählt, um durch Orts-gesteuerte Mutagenese gemäß Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 korrigiert zu werden. In Kürze CJ236 (ung-, dut-) kompetente Zellen (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) wurden mit dem pSport-Vektor, der die CDR-verpflanzte SK variable Region mit den zwei Basenfehlpaarungen enthielt, transformiert. Einzelsträngige, DNA-Vorlagen, die Uridin aufgenommen haben, wurden nach M13-Helferphageninfektion (Stratagene Cloning Systems) der transformierten Zellen aus den Phagen gereinigt. Mutageneseoligos, die die gewünschten Basenänderungen enthielten, wurden auf einem Applied Biosystems Modell 380B DNA-Syntheziser synthetisiert. Die Mutageneseoligos wurden an die Vorlagen-DNA angelagert und T7 DNA-Polymerase und T4 DNA-Ligase (MutaGene InVitro Mutagenesis Kit, Bo-Rad Laboratories, Richmond, CA) wurden verwendet, um das Oligo in einen neu synthetisierten DNA-Strang aufzunehmen. DH5α kompetente Zellen (GIBCO-BRL Life Technologies) wurden mit der doppelsträngigen DNA transformiert. Der ursprüngliche Strang, der Uridin aufgenommen hat, wird zerstört während der neu synthetisierte Strang, der das Mutageneseoligo enthält, repliziert wird. Die Phagemid-DNA wurde aus den sich ergebenden Mutageneseklonen zubereitet und die variablen Regionen wurden sequenziert, um die Klone, die die gewünschten Änderungen aufgenommen hatten, zu identifizieren. Das berichtigte SK EcoRI/SacI Fragment der variablen Region wurde aus dem pSport-Vektor ausgeschnitten, gereinigt und in die EcoRI/SacI-Stellen des pSG5-Vektors, der die menschliche IgG4 konstante Region enthielt, ligiert. Dies führte zur Erzeugung eines humanisierten TF8-5G9 SK-Gens voller Länge, TF8HCDR1, in dem pSG5 COS-Zellexpressionsvektor. Der Vektor wurde als pSG5TF8HCDR1 bezeichnet.
Die CDR-verpflanzte TF8-5G9 LK variable Region wurde auch ausgehend von den zusammengesetzten synthetischen Oligonukleotiden zu einem 433 bp Fragment vervielfältigt, das eine 5'-EcoRI-Stelle und eine 3'NarI-Stelle enthielt. Dieses Fragment wurde wie oben für die SK beschrieben gereinigt, mit EcoRI und NarI verdaut und mit dem Genecleanverfahren gereinigt. Diese Fragment wurde in die EcoRI- und NarI-Stellen des pSG5-Vektors kloniert, der die menschliche konstante Kappa-Region enthielt. Dies führte in dem pSG5 COS-Zellexpressionsvektor zur Erzeugung eines humanisierten TF8-5G9 LK-Gens voller Länge, TF8LCDR1. Sieben Klone wurden sequenziert und für einen wurde gefunden das er die gewünschte CDR-verpflanzte LK-Sequenz aufwies. Der Vektor wurde als pSQ5TF8LCDR1 bezeichnet.
BEISPIEL 4
Expression der CDR-verpflanzten Gene der schweren und der leichten Kette in COS-Zellen
Die transiente Expression von Antikörpergenen in COS-1-Zellen stellt ein rasches und bequemes System zum Testen der Antikörpergenexpression und Funktion zur Verfügung. Die COS-1-Zellen wurden aus der American Typ Culture Collection (CRL 650) erhalten und in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, von GIBCO BRL Life Technologies) mit 10% fötalem Kälberserum kultiviert. Der pSG5TF8HCDR1 Expressionsfaktor wurde mit dem pSG5 chimären LK-Expressionsvektor unter Verwendung der DEAE-Dextranmethode gefolgt von einem DMSO-Schock wie durch Lopata et al. (1984) Nucleic Acids Res. 14: 5707 beschrieben in COS-Zellen co-transfiziert. Nach vier Tagen der Kultivierung wurde das Medium aus den Vertiefungen geerntet und auf die Antikörperexpressionsmengen hin untersucht.
Die Antikörpermengen wurden durch ein Zusammensetzungstestverfahren bestimmt, das auf einen ELISA beruht. Die Platten wurden mit einem anti-Mensch-spezischen Fc Ziegenantikörper beschichtet. Verschiedene Verdünnungen des COS-Zellüberstands, der sezernierte Antikörper enthielt wurden hinzugefügt, für eine Stunde inkubiert und gewaschen. Ein mit Meerrettichperoxidase gekoppelter anti-menschliche Kappakette Ziegenantikörper wurde hinzugefügt, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und gewaschen. Das Substrat für die Meerrettichperoxidase wurde für den Nachweis hinzugefügt. Die Antikörpermengen in dem COS-Zellmedium wurde für den TF8HCDR1 × chimären LK als nahezu nicht nachweisbar gefunden. Nach genauerer Untersuchung des TF8HCDR1-Sequenz der variablen Region wurde gefunden, daß eine unerwartete Basenänderung, die während des in Beispiel 3 beschriebenen Orts-gesteuerten Mutageneseprozeß auftrat, ein Stopcodon in das Gerüst 4 des TF8HCDR1-Gens einführte. Diese Substitution wurde durch eine Orts-gesteuerte Mutagenese, wie oben beschrieben korrigiert. Eine gründliche Sequenzierung der variablen Region bestätigte, daß die Korrektur ohne die Einfügung weiterer Änderungen gemacht wurde. Nach der Transfektion dieses korrigierten TF8HCDR1-Gens mit dem chimären LK wurden vernünftige Expressionsmengen erhalten.
Die COS-Zellen, die mit dem CDR-verpflanzten LK-Expressionsvektor pSGTF8LCDR1 und entweder dem chimären SK oder TF8HCDR1 co-transfiziert wurden, erzeugten Antikörper in vernünftigen Mengen. Die Antikörpermengen in allen COS-Zellüberständen reichten von 0,5 μg bis 10,0 μg pro ml.
BEISPIEL 5
Bindung des CDR-verpflanzten TF8-5G9 an Gewebefaktor
Ein ELISA wurde verwendet, um die Fähigkeit des CDR-verpflanzten TF8-5G9 Antikörpers, TF8HCDR1 × TF8LCDR1, an Gewebefaktor zu binden, zu bestimmen. Gewebefaktor wurde auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Der Test-COS-Zellüberstand, der den CDR-verpflanzten Antikörper enthielt, wurde zu der Vertiefung hinzugefügt, für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach drei Wäschen mit PBS/Tween wurde ein polyklonaler anti-menschliche Kappakette Ziegenantikörper der mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, hinzugefügt, für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und gewaschen. Ein Substrat für die Meerrettichperoxidase wurde für den Nachweis hinzugefügt. Die positive Kontrolle war der TF8-5G9 chimäre Antikörper. Der CDR-verpflanzte TF8-5G9-Antikörper war dazu in der Lage an Gewebefaktor in einem Maße zu binden, das zu dem des chimären TF8-5G9 Antikörpers vergleichbar war (3, gefüllte Symbole).
Die Fähigkeit des humanisierten Antikörpers mit dem Mäuse-TF8-5G9 um die Bindung an Gewebefaktor zu kompetitieren, wurde auch untersucht. Verschiedene Mengen des COS-Zellüberstands, der den CDR-verpflanzten Testantikörper enthielt, und eine festgelegte Men ge des Mäuse-TF8-5G9 wurden gleichzeitig zu den Vertiefungen, die mit Gewebefaktor beschichtet waren, hinzugefügt. Es wurde der Bindung erlaubt für eine Stunde bei Raumtemperatur stattzufinden. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit PBS/Tween gewaschen. Ein anti-menschliche Kappakette Ziegenantikörper, der an Meerrettichperoxidase konjugiert war, wurde hinzugefügt, für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und gewaschen. Ein Substrat für die Meerrettichperoxidase wurde für den Nachweis hinzugefügt. Der positive Antikörper kompetitierte so gut wie der chimäre Antikörper mit dem Mäuse-TF8-5G9 um die Bindung an GF.
Diese Daten deuten darauf hin, daß der anfänglich entworfene CDR-verpflanzte Antikörper TF8HCDR1 × TF8LCDR1 in der Bindung an GF und in der Kompetition mit dem Mäuseantikörper für die Bindung an GF in etwa so aktiv wie der chimäre TF8-5G9 war.
BEISPIEL 6
Konstruktion und Charakterisierung weiterer CDR-verpflanzter schwerer Ketten
Nach der Untersuchung der molekularen Struktur des Mäuse-TF8-5G9 wurde gefunden, daß die Gerüstreste an den Positionen 27, 68, 73 und 78 auf der Oberfläche des Antikörpers lagen und keinen erkennbaren Kontakt mit den CDRs hatten. Diese Gerüstreste stammten von der Mäusesequenz in TF8HCDR1 wurden aber in verschiedenen Kombinationen in die menschliche KOL-Sequenz umgeändert, um eine Reihe von CDR-verpflanzten schweren Ketten mit Gerüstrestvariationen zu erzeugen. Diese Änderungen wurden durch das Verfahren der Orts-gesteuerten Mutagenese wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Jede Version der CDR-verpflanzten schweren Ketten wurde in COS-Zellen zusammen mit der CDR-verpflanzten LK TF8-LCDR1 exprimiert, und auf ihre Fähigkeit hin getestet an GF zu binden und um die Bindung daran mit Mäuse-TF8-5G9 zu kompetitieren. Für frühere Versionen der CDR-verpflanzten schweren Kette im Zusammenhang mit TF8LCDR1 wurde gezeigt, daß sie mit einer zu dem chimären TF8-5G9 vergleichbaren Affinität an GF bindet. Jede CDR-verpflanzte SK in Kombination mit TF8LCDR1 war dazu in der Lage mit dem Mäuse-TF8-5G9 um die Bindung an GF in einem Maße zu kompetitieren die zu dem chimären Antikörper vergleichbar war.
Veränderungen der Sequenz von Maus zu Mensch für die SK-Gerüstpositionen 6, 17, 68, 73 und 78 hatten keinen negativen Einfluß auf die Antigenbindungsfähigkeit des Antikörpers.
Die CDR-verpflanzte SK-Version, die humane Sequenzen an all diesen Positionen aufwies und daher die am meisten humanisierte SK war, war TF8HCDR20.
Die gesamte Sequenz des TF8HCDR20-Gens wurde bestimmt. Die DNA-Sequenz ist als ein 2360 bp EcoRI/BamHI-Insert mit Proteintranslation in dem pEe6TF8HCDR20 Expressionsvektor in 4 und der SEQ ID NR: 15 gezeigt.

Die wesentlichen Regionen des Gens sind wie folgt:

Nukleotid #	Region
1–6	5'-EcoRI-Restriktionsstelle
7–15	Kozaksequenz
16–72	Startcodon und Führungssequenz
73–423	CDR-verpflanzte variable Region
424–717	Menschliche IgG4 CH1-Domäne
718–1110	Humanes IgG4 Intron 2
1111–1146	Humanes IgG4 Scharnier
1147–1267	Humanes IgG4 Intron 3
1268–1594	Humane IgG4 CH2-Domäne
1595–1691	Humanes IgG4 Intron 4
1692–2012	Humane IgG4 CH3-Domäne
2013–2354	3'-nicht-translatierte Region
2355–2360	3'-BamHI-Ende an die BclI-Stelle des Expressionsvektors gespliced

BEISPIEL 7
Konstruktion und Charakterisierung weiterer CDR-verpflanzter leichter Ketten
Die anfänglich entworfene CDR-verpflanzte SK TF8LCDR1 enthielt vier Gerüstreste aus der Mäuse-TF8-5G9-Sequenz. An zwei dieser Positionen 39 und 105 ist die menschliche REI-Gerüstsequenz auf REI beschränkt; die Murine-TF8-5G9 LK-Sequenz steht jedoch in Übereinstimmung mit der menschlichen Konsenssequenz. Die anderen zwei Mäusegerüstreste Trp41 und Thr46 sind auf TF8-5G9 beschränkt. Mehrere Versionen der CDR-verpflanzten LK wurden erzeugt, in dem die Sequenz an diesen vier Positionen in verschiedenen Kombina tionen von der Maus zu der menschlichen REI geändert wurde. Diese Änderungen wurden durch Orts-gesteuerte Mutagenese ausgeführt. Jede Version der CDR-verpflanzten LK wurde in COS-Zellen in Kombination mit CDR-verpflanzten SK TF8HCDR20 exprimiert und auf die Fähigkeit hin getestet an Gewebefaktor zu binden und mit Mäuse-TF8-5G9 um die Bindung daran zu kompetitieren. Für jede Version der CDR-verpflanzten LK in Kombination mit TF8HCDR20 wurde gezeigt, das sie mit einer zu TF8-5G9 vergleichbaren Affinität an GF bindet. Auch war jede CDR-verpflanzte LK-Version in Kombination mit TF8HCDR20 dazu in der Lage, mit dem Mäuse-TF8-5G9 um die Bindung an GF in einer Weise zu kompetitieren, die zu der chimäre TF8-5G9 Kontrolle vergleichbar war.
Änderungen der Sequenz von Maus zu Mensch für die LK-Gerüstposition 39, 41, 46 und 105 beeinflußten die Fähigkeit des Antikörpers das Antigen zu erkennen nicht negativ. Die CDR-verpflanzte LK der Wahl war TF8LCDR3 wobei die Mäuse-TF8-5G9 Sequenz an der Position 39 und 105 verwendet wurde da diese in Übereinstimmung mit der menschlichen Konsenssequenz war. Der bevorzugte CDR-verpflanzte TF8-5G9 Antikörper ist TF8HCDR20 × TF8LCDR3.

Die komplette Sequenz des TF8LCDR3-Gens wurde bestimmt und ist als ein 759 bp EcoRI-BamHI-Insert mit Proteintranslation in dem pEe12TF8LCDR3-Expressionsvektor in 5 und in der SEQ ID NR: 20 gezeigt. Die wesentlichen Regionen des Gens sind wie folgt:

Nukleotid #	Region
1–5	5'-EcoRI-Restriktionsstelle
6–8	Kozak-Sequenz
9–68	Startcodon und Führungssequenz
69–392	CDR-verpflanzte variable Region
393–710	Menschliche konstante Kappa-Region
711–753	3'-nicht-translatierte Region
754–759	3'-BamHI-Ende an die BclI-Stelle des Expressionsvektors gespliced

BEISPIEL 8
CDR-verpflanzter TF8-5G9 Antikörper TF8HCDR20 × TF8LCDR3 inhibiert menschlichen Gewebefaktor
Die Bindung des CDR-verpflanzten TF8-5G9 Antikörpers TF8HCDR20 × TF8LCDR3 an GF wurde wie im Beispiel 5 beschrieben, bewertet und es wurde dafür gefunden, das sie, wie in 6 gezeigt, zu der des chimären TF8-5G9 vergleichbar war. Die Fähigkeit des CDR-verpflanzten TF8-5G9 mit dem Mäuseantikörper um die Bindung an GF zu kompetitieren, ist, wie in 7 gezeigt, zu der des chimären TF8-5G9 vergleichbar.
Ein in vitro Testverfahren wurde verwendet, um die Menge der Inhibition der Faktor X-Aktivierung durch den CDR-verpflanzten TF8-5G9-Antikörper zu messen. In diesem Testverfahren bildet GF einen aktiven proteolytischen Komplex mit Faktor VII. Dieser Komplex wandelt dann durch Proteolyse den Faktor X in den Faktor Xa um. Der aktivierte Xa spaltet enzymatisch ein Substrat, Spektrozym FXa, das ein Chromogen freisetzt. Die Menge des Chromogens, das durch die optische Dichte bestimmt wird, ist ein Hinweis der Faktor X-Aktivierung aufgrund der GF-Faktor VIIa-Aktivität.
Die folgenden Reaktionsgemische wurden in 12 × 75 mm Borosilikat Glasröhrchen zubereitet.
25 μl TBS (50 mmol Tris, pH 7,4, 150 mmol NaCl)
15 μl 20 mmol CaCl₂/1% Rinderserumalbumin (BSA = "Bovine serum albumin")
20 μl menschliche plazentale Gewebefaktorlösung (durch die Rekonstruktion einer Röhre von Thromborel S, Curtin Matheson Scientific, #269–338 mit 4,0 ml dH₂O und Verdünnung 1 : 10 in TBS zubereitet)
30 μl Faktor VII (Enzym Research Labs # HFVII 1007 mit 237,66 ng/ml in TBS)
30 μl TBS oder TF8-5G9 oder TF8mCDR20 × TF8LCDR3 mit 1,18 μg/ml oder wie in 8 angezeigt.
Die Reaktionsgemische wurden vor dem Hinzufügen von Faktor X für 10 Minuten bei 37°C inkubiert. (In einigen Fällen wurde das Reaktionsgemisch vor dem Hinzufügen von Faktor VII oder Antikörper für 5 Minuten inkubiert gefolgt von einer Inkubation für 10 Minuten vor der Zugabe von Faktor X). Dreißig μl der Faktor X-Lösung (Enzym Research Labs, DHFX 330, 247,38 μg/ml TBS) wurde hinzugefügt und das Gemisch wurde bei 37°C für drei Minuten inkubiert. Die Faktor X-Aktivierung wurde durch Pipettieren von 40 μg des Reaktionsgemischs in 160 μl Stop-Puffer (50 mmol/1 Tris, pH 7,4, 100 mmol/1 EDTA, 150 mmol/1 NaCl) in 96 Vertiefungsmikrotiterplatten gestoppt. Jede Röhre des Reaktionsgemisches wurde in drei Mikrotitervertiefungen pipettiert. 50 μl des Spektrozym FXa-Substrats (American Diagnostica #222, 1 μmol/ml TBS) wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Der OD₄₀₅ wurde auf einem Molecular Devices kinetischen Plattenleser gelesen, wobei für 10 Minuten alle 20 Sekunden Meßwerte genommen wurden. Die Faktor X-Aktivierung wurde als mOD/Minute aufgezeichnet und die Enzymgeschwindigkeiten über den linearen Teil der Reaktionskurve wurden verglichen, um die Inhibition der Faktor X-Aktivierung durch die Anti-GF-Antikörper zu bestimmen.
Wie in 8 gezeigt, ist der CDR-verpflanzte TF8-5G9-Antikörper bei der Inhibition der Faktor X-Aktivierung in etwa so wirksam wie der Mäuse-TF8-5G9. Dies deutet darauf hin das der CDR-verpflanzte TF8-5G9 funktionell aktiv ist.
BEISPIEL 9
Konstruktion der CDR-verpflanzten schwere und leichte Kette Myelomexpressionsvektoren
Zum Zweck der Etablierung einer permanenten CDR-verpflanzten Antikörper-produzierenden Zellinie wurden die TF8HCDR20- und TF8LCDR3-Gene in Myelomzellexpressionsvektoren subkloniert. Die schwere Kette TF8HCDR20 wurde in die EcoRI- und BclI-Stellen des pEehCMV-BglII-Myelomexpressionsvektors, der durch Stevens et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7101 beschrieben wurde, subkloniert, um pEe12TF8LCDR3 herzustellen. Die leichte Kette TF8LCDR3 wurde in die EcoRI- und die BclI-Stellen des pEe12-Myelomexpressionsvektor kloniert, um pEe12TF8LCDR3 herzustellen. Die Expressionsvektoren der schweren und leichten Kette sind in den 9 bzw. 10 dargestellt. In beiden Vektoren wird die Transkription des Antikörpergens durch den menschlichen Cytomegalovirus (hCMV) Promotor-Enhancer gesteuert, der direkt 5' zu der Mehrfachklonierungsstelle liegt. Die Polyadenylierungssignalsequenz liegt 3' zu der Mehrfachklonierungsstelle und zeigt die Terminierung der Transkription an. Jeder Vektor enthält das β-Laktamasegen, um die Ampicillinselektion in E. coli zu erlauben. Der pEe12-Verktor enthält ein Glutaminsynthetase-cDNA-Gen unter der transkriptionellen Kontrolle des SV40-frühen Promotors. Die Glutaminsynthetase erlaubt es Myelomzelltransfektanten in Glutamin-freien Medium zu selektieren. Myelomzellen fehlt die Glutaminsynthetaseaktivität und sie sind von einer Glutaminversorgung in dem Kulturmedium abhängig. Zellen, die mit dem pEe12-Vektor, der das Glutamin synthetasegen enthält, transfiziert worden sind, sind dazu in der Lage aus Glutamat Glutamin zu synthetisieren und können in der Abwesenheit von Glutamin überleben.
Der pEe6TF8HCDR20-Expressionsvektor ist ein 7073 bp Plasmid dessen DNA-Sequenz in der 4 und der SEQ ID NR: 15 gezeigt wird. Die kodierenden Regionen des TF8HCDR20-Gens werden translatiert. Die wesentlichen Regionen dieses Vektors werden unten beschrieben:

1. Nukleotide #1–2360: Das TF8HCDR20-CDR-verpflanzte-SK-Gen wird im Beispiel 6 beschrieben. Das SK-Gen wurde als ein EcoRI/BamHI-Fragment in die EcoRI/BclI-Stellen des pEe6hCMV-BglII-Vektors eingefügt.
2. Nukleotide #2361–2593: Diese Region kodiert für das SV40-frühe-Gen-Polyadenylierungssignal (SV40-Nukleotid 2770–2537) das als ein transkriptioneller Terminator wirkt. Dieses Fragment wird durch eine 5'-BclI-Stelle und eine 3'-BamHI-Stelle flankiert. Das 3'-BamHI-Ende des schwere Kette Gens wurde an die 5'-BclI-Stelle des Polyadenylierungssignals gespliced wodurch beide Stellen zerstört wurden.
3. Die Nukleotide #2594–3848: Diese Region ist ein BamHI-BglI-Fragment aus pBR328 (Nukleotide 375–2422) aber mit einer Deletion zwischen den SalI- und AvaI-Stellen (pBR Nukleotide 651–1425) gefolgt von der Hinzufügung eines SalI-Linkers an die AvaI-Stelle. Diese Region enthält den bakteriellen Replikationsursprung Col E1.
4. Nukleotide #3849–4327: Dies ist ein Fragment der BglI-XmnI-Stelle des β-Laktamase-Gens von pSP64 (Promega Corporation, Madison, WI). Dieses Gen stellt Bakterien, die mit diesem Vektor transformiert sind die Ampicillin-Resistenz zur Verfügung.
5. Die Nukleotide #4328–4885: Dies ist ein XmnI-HindIII-Fragment des auf ColEl beruhendem Plasmids pCT45, das durch Emtage et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3671 beschrieben wurde. Die HindIII-Stelle wurde zu eine BglII- Stelle durch das Hinzufügen eines Linkers nach dem Hinzufügen des unten beschriebenen hCMV-Promotors umgewandelt.
6. Die Nukleotide #4886–7022: Diese Nukleotide kodieren das Pst-1m-Fragment des menschlichen Cytomegalovirus-Stamms (hCMV) AD 169 der durch Greenway et al. (1982) Gene 18: 355 beschrieben wurde, der die Region, die für den mittleren hCMV-unmittelbar frühen Promotor kodiert, enthält. Dieses Pst-1m-Fragment wurde in die HindIII-Stelle des pEe6HCMV durch das Hinzufügen eines Oligonukleotids folgender Sequenz an eines der Enden des Fragments kloniert: 5' GTCACCGTCCTTGACACGA 3' 3' ACGTCAGTGGCAGGAACTGTGCTTCGA 5' Das sich ergebende 2100 bp-Fragment wurde so insertiert, das der Promotor die Transkription in Richtung der EcoRI-Stelle des pEe6hCMVs steuerte. Die obigen Oligonukleotide dienten dazu, die vollständige 5' nicht-translatierte Sequenz des hCMV-MIE-Gens wiederzuerzeugen, das ganz an dem 5'-Ende des Fragments irrelevante Sequenz hinzufügte. Die HindIII-Stelle an dem 5'-Ende wurde anschließend durch das Hinzufügen eines weiteren Linkers zu einer Bgl-Stelle umgewandelt.
7. Nukleotide #7023–7073: Der pSP64-Polylinker mit dem BamHI- und SalII-Stellen entfernt.

Der pEe12TF8LCDR3-Expressionsvektor ist ein 7864 bp-Plasmid dessen DNA-Sequenz in 5 und der SEQ ID NR: 20 gezeigt wird. Die kodierenden Regionen des TF8LCDR3-Gens werden translatiert. Die wesentlichen Regionen dieses Expressionsvektors werden unten beschrieben:

1. Nukleotide #1–759: Das TF8LCDR3-CDR-verpflanzte LK-Gen wird in Beispiel 7 beschrieben. Das Gen wurde als ein EcoRI/BamHI-Fragment in die EcoRI/BclII-Stellen des pEe12-Expressionsvektors eingefügt.
2. Nukleotide #760–3284: Diese Regionen des pEe12 sind identisch zu einer Region die durch die Nukleotide 2361–4885 des oben beschriebenen pEe6TFHCDR20-Vektors kodiert wird (Regionen #2–5).
3. Nukleotide #3285–5736: Diese Region kodiert für die Glutaminsynthetase cDNA von chinesischen Hamster Ovarialzellen unter der transkriptionellen Kontrolle des SV40-frühen Promotors und wird gefolgt von den SV40-Polyadenylierungs- und Splicesignalen aus dem durch Subramani et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1: 854 beschriebenen pSV2.dhfr-Vektor. Das folgende beschreibt die Ableitung dieser Region. Ein 1200 bp NaeI-PvuII-Fragment, das die komplette GS-kodierende Sequenz enthielt, wurde aus dem cDNA-Klon λGS1.1 chinesischer Hamster Ovarialzellen, der durch Hayward et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14: 999 beschrieben wurde, ausgeschnitten. Nach dem Hinzufügen eines HindIII-Linkers an die NaeI-Stelle und eines BglII-Linkers an die PvuII-Stelle (wodurch die NaeI- und PvuII-Stellen zerstört wurden) wurde das 1200 bp-Fragment anstelle der DHFR-Sequenzen in dem pSV2.dhfr zwischen die HindIII und BglII-Stellen kloniert, um pSV2.GS zu bilden. Die einzige verbleibende PvuII-Stelle in dem pSV2BamGS wurde durch das Hinzufügen eines Oligonukleotidlinkers zu einer BamHI-Stelle umgewandelt, um pSV2BamGS zu bilden. Eine EcoRI-Stelle in der GS-cDNA wurde durch Orts-gerichtete Mutagenese ohne eine Veränderung der Aminosäuresequenz in pSV2BamGS zerstört und die HindIII-Stelle wurde durch das Auffüllen mit DNA-Polymerase I zerstört. Das 2451 bp BamHI-Fragment aus diesem Plasmid, das die komplette SV40-GS hybride Transkriptionseinheit enthielt, wurde ausgeschnitten und an der BglII-Stelle des pEe6HCMV-BglII eingefügt, so daß die Transkription des SV40-frühen Promotors in Richtung auf den hCMV-Promotor fortschreitet.
4. Nukleotide #5737–7864: Diese Region ist identisch zu dem oben beschriebenen hCMV-Promotor und dem pSP64-Polylinker, der durch die Nukleotide 4886–7073 des pEe6TF8HCDR20-Vektors kodiert wird (Region 6 und 7).

Um sicherzustellen, daß sowohl die Vektoren pEe6TF8HCDR20 als auch pEe12TF8LCDR3 die Myelomzellen co-transfizieren, wurden die Vektoren zu linearen Concatameren verbun den. Sowohl die pEe6TF8HCDR20- als auch die pEe12TF8LCDR3-Vektoren wurden an der einzelnen SalI-Stelle verdaut. Der SalI-linearisierte pEe6TF8HCDR20-Vektor wurde an seinem 5'-Enden mit Phosphatase behandelt, um die Ligation von zwei pEe6TF8HCDR20-Vektoren aneinander zu verhindern. Dieser Phosphatase-behandelte SK-Vektor wurde in einem 2 : 1 molaren Verhältnis mit dem Sal-linearisierten pEe12TF8LCDR3 ligiert. Die sich ergebenden Concatamere wiesen am wahrscheinlichsten die folgende Zusammensetzung auf:
Einkleben der Figur Seite 52 im Original
Diese concatamerisierte DNA wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Ammoniumazetat und Ethanol präzipitiert. Die DNA-Präzipitate wurden in destilliertem Wasser mit einer Konzentration von 1 μg/μl re-suspendiert und verwendet, um Myelomzellen zu transfizieren.
BEISPIEL 10
Entwicklung der NSO-Expressionszellinien
Stabil transformierte Zellinien, die humanisierten TF8-5G9-Antikörper exprimieren, wurden durch die Transfektion von CDR-verpflanzten schwere Ketten und leichte Ketten Expressionsvektoren in NSO-Maus-Myelomzellen hergestellt. Die Selektion der transfizierten Zellen wurde unter Verwendung des dominanten selektierbaren Markergens Glutaminsynthetase (GS) ausgeführt.
Die NSO-Maus-Myelomzellinie, die von Celltech, Ltd. erhalten wurde, ist ein Subklon, der von NS-1 abgeleitet wurde, und der die intrazellulären leichten Ketten nicht exprimiert. Diese Zellen wurden in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) mit hinzugefügten Glutamin und 10% fötalem Kälberserum (FBS = „fetal bovine serum") kultiviert. Um sie für die Transfektion vorzubereiten wurden die Zellen in einer mittleren LOG-Phase des Wachstumszyklus geerntet, für 5 Minuten zentrifugiert, mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, erneut zentrifugiert und der Zellniederschlag wurde in 2,2 ml PBS resuspendiert. Die schließliche Zellkonzentration betrug 2,18 × 10⁷ ml. Die Zellen wurden während des gesamten Verfahrens auf Eis gehalten.
Die zu transfizierende DNA (pEe12TF8LCDR3 × pEe6TF8HCDR20) wurde wie im Beispiel 9 beschrieben, als Concatamer zubereitet. Die DNA und die NSO-Zellen wurden zu einer 0,4 cm BioRad Gene Pulser Küvette in der folgenden Reihenfolge hinzugefügt.
40 μl (40 μg) DNA-Concatamer
320 μl doppeldestilliertes Wasser
40 μl 10 × PBS
400 μl NSO-Zellen (8,72 × 10⁶ Zellen)
Die Transfektion wurde durch Elektroporation nach dem von Celltech, Ltd. zur Verfügung gestellten Protokoll durchgeführt. In diesem Verfahren wurden die Zellen und die DNA in PBS-Puffer gegenüber einem kurzen, elektrischen Puls hoher Voltzahl ausgesetzt was die Bildung vorübergehender Mikroporen auf der Zellmembran auslöst. Der DNA-Transfer findet durch diese Öffnungen statt. Um sie auf die Elektroporation vorzubereiten wurde die Suspension der NSO-Zellen und die DNA vorsichtig gemischt und für 5 Minuten auf Eis inkubiert. Die Küvette wurde in einem BioRad Gene Pulser eingebracht und hier wurden zwei aufeinander folgende elektrische Pulse mit den Einstellung 3 μF (Kapazität) und 1,5 V (Spannung) gegeben. Nach der Elektroporation wurde die Küvette für 5 Minuten auf das Eis zurück gegeben. Die Suspension wurde dann in vorgewärmtem Wachstumsmedium verdünnt und in 96-Vertiefungsplatten verteilt. Kontrollplatten, die elektrophorierte Zellen ohne DNA enthielten, wurden zur selben Zeit zubereitet, um die Gegenwart spontaner Mutanten zu messen. Die Platten wurden in einem 37°C Inkubator bei 5% CO₂ gesetzt.
Die Glutaminsynthetase, die durch das GS-Gen kodiert wird, ist ein Enzym, das Glutamat zu Glutamin umwandelt. Die NSO-Zellen erfordern aufgrund unzureichender Mengen endogener GS-Genexpression für das Wachstum Glutamin. In dem DNA-Concatamer ist dieses Gen auf dem pEe12TF8LCDR3-Vektor angeordnet. Die transfizierten Zellen, die das GS-Gen aufnehmen, werden Glutamin-unabhängig. Zellen, die das GS-Gen nicht in ihr Genom aufnehmen, würden Glutamin-abhängig bleiben und würden nicht im Glutamin-freiem Medium überleben. Ungefähr 18 Stunden nach der Elektroporation wurde allen Platten Glutamin-freies Selektionsmedium gefiltert und sie wurden in den Inkubator zurück gebracht bis lebensfähige Kolonien erschienen.
Ungefähr 3 Wochen nach der Transfektion wurden unterscheidbare makroskopische Kolonien beobachtet. Diese wurden unter Verwendung des Zusammensetzungs-ELISA's wie im Bei spiel 5 beschrieben auf die Expression intakter humanisierter Antikörper untersucht. Gewebekulturüberstände aus Vertiefungen, die Kolonien enthielten, wurden mit einer 1 : 10-Verdünnung durchsucht. Positive Vertiefungen, die eine größere Aktivität als 25 mg/ml Standard zeigten, wurden subkultiviert und für die weitere Analyse vermehrt.
Für die Auswahl von Hochproduzierenden wurde die Antikörperproduktion nach einer 96 Stunden Wachstumsperiode quantifiziert. Gewebekulturflaschen wurden mit 2 × 10⁵ Zellen/ml in 10 ml des Selektionsmediums eingesetzt und bei 37°, 5% CO₂ für 96 Stunden inkubiert. Am Ende des Zeitraums wurde eine Teilmenge genommen, um die Zellkonzentration und den Antikörpertiter zu bestimmen. Die Evaluierung der Antiköperproduktion wurde als μg/ml berechnet und als pg/Zelle/96 Stunden. Die stärksten Erzeuger dieser Transfektion waren:
BEISPIEL 11
CDR-verpflanzter Antikörper TF8HCDR20 × TF8LCDR3 Inhibiert Gewebefaktor In Vivo
Der CDR-verpflanzte Antikörper TF8HCDR20 × TF8LCDR3 wurde mit dem Mäuseantikörper TF8-5G9 auf seine Fähigkeit hin verglichen Ratten gegen eine experimentell induzierte verbreitete intravaskuläre Koagulation (DIC = „disseminated intravascular coagulation") zu schützen. In den DIC-Modell werden Ratten mit menschlichen Thromboplastin (ein Rohgewebeextrakt, der GF-Aktivität enthält, herausgefordert, was zu Fibrinogen-Verbrauch und Tod führt). Für die Vorbehandlung von Ratten mit dem Anti-GF-Antikörper wurde gezeigt, das sie die Ratten vor dem Fibrinogen-Verbrauch und dem Tod wie folgt schützen.
Das menschliche Thromboplastin wurde wie in U.S. Patent 5,223,427 beschrieben zubereitet. Eine Salzkontrolle oder 30 μ/ml des TF8-5G9 oder des CDR-verpflanzten Antikörpers wurde durch die Schwanzvene der Ratte injiziert gefolgt durch die Injektion eines Thromboplastinäquivalenz von bis zu 200 ng rekombinanten GF. Die Verklumpungszeiten wurden bei T = 0 und T = 1 Minuten als Maß der Fibrinogen-Konzentration bestimmt. Die Verklumpungszeiten sind proportional zu der Fibrinogen-Konzentration wobei ein Verklumpungszeit von 60 Sekunden mit einer 80%igen Reduktion der Fibrinogen-Konzentration korrespondiert. Verklumpungszeiten von mehr als 60 Sekunden können nicht genau gemessen werden und wurden als 60 Sekunden aufgezeichnet. Überlebensrate und Verklumpungszeiten für drei charakteristische Studien werden unten gezeigt.
Überlebende
Verklumpungszeiten Kontrollen
Verklumpungszeiten Mäuse-TF8-5G9
Verklumpungszeit CDR-verpflanzte TF8-5G9
23 der 24 Kontrollratten wiesen Verklumpungsszeiten von mehr als 60 Sekunden auf was darauf hindeutet, daß nahezu alle unbehandelten Ratten mehr als 80% ihres Fibrinogens verbraucht hatten. Sowohl die Ratten die mit CDR-verpflanzten als auch mit Mäuseantikörper behandelt wurden, hatten vergleichbare Verklumpungszeiten von 44,5 und 40 Sekunden bei 1 Minute. Des weiteren wiesen nur 6 der mit Mäuseantikörper behandelten Ratten und 9 der mit CDR-verpflanzten Antikörper behandelten Ratten Verklumpungszeiten von mehr als 60 Sekunden auf. Dementsprechend waren sowohl die Mäuse als auch die CDR-verpflanzten Mäuseantikörper dazu in der Lage GF zu neutralisieren und somit die Ratten gegen den Fibrinogen-Verbrauch und Tod zu schützen.
Sequenzprotokoll

Claims

CDR-verpflanzter Antikörper, der in der Lage ist menschlichen Gewebefaktor zu hemmen, wobei die Komplementaritäts bestimmenden Regionen (CDR = "complementority determining regions") von dem monoklonalen Mäuseantikörper TF8-SG9 abgeleitet sind und die konstanten (C = "constant") und die Gerüst (FR = "framework") Regionen von einem oder mehreren menschlichen Antikörpern abgeleitet sind, wobei die schwere Kette an den Positionen 23, 24, 28, 29, 30, 48, 49, 71, 88 und 91 Reste umfaßt, die aus dem monoklonalen Mäuseantikörper TF8-SG9, abgeleitet sind, und die leichte Kette an den Positionen 39 und 105 Reste umfaßt, die aus dem monoklonalen Mäuseantikörper TF8-SG9 abgeleitet sind, wobei die Reste gemäß dem Kabat Numerierungssystem nummeriert sind.
CDR-verpflanzter Antikörper nach Anspruch 1, wobei die CDRs der schweren Kette die Aminosäuresequenzen:
aufweisen und die CDRs der leichten Kette die Aminosäuresequenzen:
aufweisen.
CDR-verpflanzter Antikörper nach Anspruch 1 oder nach Anspruch 2, wobei die FR der schweren Kette von dem menschlichen Antikörper KOL abgeleitet ist.
CDR-verpflanzter Antikörper nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, wobei die FR der leichten Kette von dem menschlichen Antikörper REI abgeleitet ist.
CDR-verpflanzter Antikörper nach einem Ansprüche 1 bis 4, wobei die variable Region der schweren Kette die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 11 aufweist.
CDR-verpflanzter Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die variable Region der leichten Kette die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 12 aufweist.
CDR-verpflanzter Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die variable Region der schweren Kette die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 13 aufweist.
CDR-verpflanzter Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder Anspruch 7, wobei die variable Region der leichten Kette die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 14 aufweist.
CDR-verpflanzter Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die konstante Region der schweren Kette die humane IgG4 konstante Region ist.
CDR-verpflanzter Antikörper nach Anspruch 9, wobei die konstante Region der leichten Ketten die menschliche konstante Kappa Region ist.
CDR-verpflanzter monoklonaler Antikörper TF8HCDR1 × TF8LCDR1, wobei TF8HCDR1 eine variable Region der schweren Kette umfaßt, die die Sequenz, die in SED ID NR: 11 wiedergegeben ist, verknüpft mit einer menschliche IgG4 konstanten Region aufweist, und wobei TF8LCDR1 eine variable Region der leichten Kette umfaßt, die die Sequenz, die in SEQ ID NR: 12 wiedergegeben ist, verknüpft mit einer menschlichen konstanten Kappa Region aufweist.
CDR-verpflanzter monoklonaler Antikörper TF8HCDR20 × TF8LCDR3, wobei TF8HCDR20 die variable Region der schweren Kette umfaßt, die die Sequenz, die in SEQ ID NR: 13 wiedergegeben ist, aufweist und TF8LCDR die variable Region der leichten Kette umfaßt, die die Sequenz, die in SEQ ID NR: 14 wiedergegeben ist, aufweist.
CDR-verpflanzter Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 12 für die Hemmung menschlichen Gewebefaktors.
Fragment des CDR-verpflanzten Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Fragment in der Lage ist menschlichen Gewebefaktor zu hemmen.
Fragment nach Anspruch 14, wobei das Fragment ein Fab oder ein F(ab')₂-Fragment ist.
Verfahren zur Herstellung des CDR-verpflanzten Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 17, das das Cotransfizieren einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure, die für eine CDR-verpflanzte schwere Antikörperkette kodiert, umfaßt, und einem Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure, die für eine CDR-verpflanzte leichte Antikörperkette kodiert, umfaßt; das Kultivieren der transfizierten Wirtszelle; und das Gewinnen des CDR-verpflanzten Antikörpers umfaßt.
Verfahren zur Herstellung des CDR-verpflanzten Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 13, das das Transfizieren einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure, die für eine CDR-verpflanzte Antikörper-schwere Kette kodiert, und eine Nukleinsäure, die für eine CDR-verpflanzte Antikörper-leichte Kette kodiert, umfaßt; das Kultivieren der transfizierten Wirtszelle und das Gewinnen des CDR-verpflanzten Antikörpers umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, wobei die Nukleinsäure, die für die CDR-verpflanzte schwere Antikörperkette kodiert, die Sequenz der Nukleotide 1–2360 der SEQ ID NR: 15 aufweist und wobei der Expressionsvektor vorzugsweise eine Nukleinsäure umfaßt, in der die kodierte CDR-verpflanzte schwere Antikörperkette pEe6TF8HCDR20 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Nukleinsäure, die die CDR-verpflanzte leichte Kette kodiert, die Sequenz der Nukleotide 1–759 der SEQ ID NR: 20 aufweist, wobei der Expressionsvektor vorzugsweise eine Nukleinsäure umfaßt, in der die CDR-verpflanzte leichte Antikörperkette pEe12TF8LCDR3 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei die Wirtzelle eine bakterielle Zelle, eine Hefezelle, eine Insektenzelle oder eine Säugetierzelle wie eine CHO-Zelle, eine COS-Zelle oder eine Myelom-Zelle ist.
Nukleinsäure, die für eine schwere Kette des CDR-verpflanzten Antikörpers oder ein Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 15 kodiert.
Nukleinsäure, die für die leichte Kette des CDR-verpflanzten Antikörpers oder ein Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 15 kodiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 21, die die Sequenz der Nukleotide 1–2360 nach SEQ ID NR: 15 aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 22, die die Sequenz der Nukleotide 1–750 SEQ ID NR: 20 aufweist.
CDR-verpflanzter Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder ein Fragment davon gemäß Anspruch 14 oder 15, der in der Lage ist menschlichen Gewebefaktor zu hemmen, für die Verwendung bei der Verlangsamung der Koagulation oder für die Verwendung bei der Behandlung oder Verhinderung einer thrombotischen Erkrankung.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend mindestens einen CDR-verpflanzten Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 oder ein Fragment davon gemäß Anspruch 14 oder 15, der dazu in der Lage ist menschlichen Gewebefaktor zu hemmen, und ein pharmazeutisch annehmbarer Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26 für die Verwendung bei der Verlangsamung der Koagulation oder für die Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer thrombotischen Erkrankung.