MXPA05001468A - Anticuerpos de glicoproteina asociados con anti-mielina (mag). - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a anticuerpos alterados para glicoproteina asociada con mielina (MAG), formulaciones farmaceuticas que las contienen y al uso de dichos anticuerpos en el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades/trastornos neurologicos.

Description

ANTICUERPOS DE GLICOPROTEINA ASOCIADOS CON ANTI- MIELINA (MAG) CAMPO DE DE LA INVENCION La presente invención se refiere a anticuerpos alterados que se unen a glicoproteína asociada con mielina (MAG) y neutralizan la función de la misma, polinucleótidos que codifican dichos anticuerpos, formulaciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos y al uso de dichos anticuerpos en el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades neurológicas. Otros aspectos, objetos y ventajas de la presente invención se volverán aparentes a partir de la siguiente descripción.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El derrame cerebral es la causa principal de muerte y discapacidad en el Mundo Occidental. No hay ninguna terapia aprobada para el tratamiento de derrame cerebral diferente de t-PA el cual tiene que ser administrado dentro de las tres horas del ataque después de una exploración CT para excluir la hemorragia. A la fecha la mayoría de los agentes terapéuticos que se dirigen hacia el tratamiento de derrame cerebral agudo (es decir, neuroprotección), tienen predominantemente involucrada la activación de receptores de glutamato y sus trayectorias de señalización de corriente descendiente que se sabe que se involucran en la muerte aguda de células. Sin embargo a la fecha se ha probado que estas estrategias no son exitosas en evaluaciones clínicas y por lo general están asociadas con efectos laterales que limitan la dosis (Hill & Hachinski, The Lancet, 352: (suppl III) 10-14 (1998). Por consiguiente existe la necesidad de métodos novedosos dirigidos hacia la mejora de la muerte de células después de que cesa el flujo sanguíneo. Después del ataque del derrame cerebral, se observó algún grado de recuperación funcional espontánea en muchos pacientes, sugiriendo que el cerebro tiene la habilidad (en cierto grado limitada) de repararse y/o remodelarse después del daño. Los agentes que tienen el potencial de mejorar esta recuperación pueden por lo tanto permitir la intervención que se hará después (potencialmente días) después del ataque de la isquemia cerebral. Los agentes son capaces de ofrecer tanto neuroprotección como recuperación funcional mejorada puede proveer ventajas significativas sobre las estrategias neuroprotectoras potenciales actuales. Los mecanismos que subyacentes de recuperación funcional son actualmente conocidos. El desarrollo de axones dañados o no dañados ha sido propuesto como un mecanismo posible. Sin embargo, aunque los estudios in vivo has mostrado que el tratamiento de el daño en la espina dorsal o derrame cerebral con factores neurotróf icos da como resultado la recuperación funcional mejorada y un grado de desarrollo de axones, esto no prueba un enlace directo entre el grado de desarrollo de axones y la extensión de la recuperación funcional (Jakeman, y otros, 1998, Exp. Neurol, 154: 170-184, Kawamata y otros, 1997, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 94:8179-8184, Ribotta y otros, 2000, J.Neurosci. 20: 5144-5152). Además, el desarrollo de axones requiere una neurona viable. En las enfermedades tales como el derrame cerebral que están asociadas con una muerte de células extensiva, el mejoramiento de la recuperación funcional ofrecida por un agente dado después del derrame cerebral puede por consiguiente ser a través de mecanismos diferentes del desarrollo de axones tales como la diferenciación de células de tallo endógenas, activación de trayectorias redundantes, cambios en la distribución del receptor o excitabilidad de neuronas o glia (Fawcett & Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391, Horner & Gage, 2000, Nature 407 963-970). La habilidad limitada del sistema nervioso central (CNS) para reparar después del daño se cree, que en parte es debido a las moléculas dentro del ambiente CNS que tienen un efecto inhibidor sobre el desarrollo de axones (producto derivado de neuritas). El mielina CNS se cree que contiene moléculas inhibidoras (Schwab ME y Caroni P (1988). J. Neurosci, 8, 2381-2193). Dos proteínas de mielina, glicoproteína asociada con mielina (MAG) y Nogo han sido clonados e identificados como inhibidores putativos del producto derivado de neurita (Sato S. y otros (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm, 163, 1473-1480; McKerracher L otros (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay G y otros (1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K y Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262; Schafer y otros (1996) Neuron 16, 1107-1113; W09522344; W09701352; Prinjha R y otros (2000) Nature 403, 383-384; Chen S y otros (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre T y otros (2000) Nature 403, 439-444; US005250414A; WO200005364A1 ; WO0031235). La glicoproteína asociada con mielina es una molécula de transmembrana de la superficie de la célula expresada en la superficie de la mielina que consiste de cinco dominios de inmunoglobulina extracelular, un dominio de transmembrana individual, y un dominio intracelular. La expresión de AG está restringida a mielización de glia en el CNS y sistema nervioso periférico (PNS). MAG se cree que interactúa con el receptor(es) neuronal el cual media los efectos en la citoesqueleto neuronal incluyendo la fosforilación del neurofilamento y la inhibición del crecimiento de neurita in vitro. Aunque los antagonistas de MAG han sido postulados como útiles para la promoción del desarrollo de axones después del daño (W09522344, WO9701352 y WO970 810) , estas declaraciones no están soportadas por datos in vivo. Además, el papel de MAG como un inhibidor del crecimiento de axones a partir de neuronas CMS in vivo no está probado (Li CM y otros (1994) Nature 369, 747-750; Montag, D y otros (1994) Neuron 13, 229-246; Lassmann H y otros (1997) GLIA 19, 104-110; Li C y otros (1998) J. Neuro. Res 51, 210-217; Yin X y otros (1998) J, Neurosci, 18, 1953-1962; Bartsch U y otros (1995) Neuron 15 1375-1381; Li M y otros (1996) 46, 404-414).

Los anticuerpos típicamente comprenden cadenas pesadas enlazadas juntas a través de enlaces de disulfuro y dos cadenas ligeras. Cada cadena ligera está enlazada a una cadena pesada respectiva a través de enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo y un dominio constante en su otro extremo. El dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. El dominio constante de la cadena ligera está alienado con el primer dominio constante de la cadena pesada. Los dominios constantes están alineados con el primer dominio constante de la cadena pesada. Los dominios constantes en la cadena ligera y pesada no están involucrados directamente en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de cada par de cadenas ligera y pesada forman el sitio de unión del antígeno. Los dominios variables de la cadenas ligera y pesada tiene la misma estructura general y cada domino comprende una estructura de cuatro regiones, cuyas secuencias están relativamente conservadas, conectadas mediante tres regiones determinantes complementarías (CDRs), por lo general referidas como regiones hipervariables. Las cuatro regiones de estructura en su mayor parte adoptan una conformación de capa delgada beta y las CDRs forman los bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de capa ligera beta. Las CDRs se mantienen en una proximidad cercana a través de las regiones de la estructura y, con las CDRs del otro dominio, contribuyen a la formación del sitio de unión del antigeno. Las CDRs y las regiones de estructura de los anticuerpos puede ser determinadas a través de la referencia a Kabat y otros ("Secuencias de proteínas de interés inmunológico" Departamento de Salud y Servicios Humanos de EUA, Oficina de Impresión del Gobierno de EUA, 1987). Ahora se ha encontrado que un anticuerpo monoclonal anti-MAG, descrito (Poltorak y otros (1987) Journal of Cell Biology 105, 1893-1899, DeBellard y otros (1996) Mol. Cell, Neurosci. 7, 89-101 ; Tang y otros (1997) Mol. Cell, Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K y Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262) y comercialmente disponible (MAB1567 (Chemicon)) cuando se administra ya sea directamente dentro del cerebro o intravenosamente después de la isquemia cerebral focal en la rata (un modelo de derrame cerebral), proporciona neuroproteccion y mejora la recuperación funcional. Por consiguiente los anticuerpos anti- AG proporcionan agentes terapéuticos potenciales tanto para la neuroproteccion aguda asi como para la promoción de recuperación funcional después del derrame cerebral. Este anticuerpo es un anticuerpo de murino. Aunque los anticuerpos de murino por lo general se utilizan como agentes de diagnóstico, su utilidad como un agente terapéutico ha sido probada solamente en algunos casos. Su aplicación limitada se debe en parte a la administración repetida de monoclonales de murino en humanos, que usualmente provocan respuestas inmunes humanas contra estas moléculas. Para superar estas propiedades indeseables intrínsecas de los anticuerpos "alterados" monoclonales de murino diseñados para incorporar regiones de anticuerpos humanos, han sido desarrollados y están bien establecidos en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado contiene complementaridad que determina las regiones ("CDRs) de origen no humano y la mayoría del resto de la estructura se deriva de un anticuerpo humano. El proceso de neurodegeneración desarrolla muchas enfermedades/trastornos neurológícos incluyendo enfermedades agudas tales como derrame cerebral, daño traumático al cerebro, y daño a la espina dorsal así como enfermedades crónicas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, demencias fronto-temporales (tauopatías), neuropatía periférica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, y esclerosis múltiple. Las mabs anti-Mag por lo tanto pueden ser útiles en el tratamiento de estas enfermedades/trastornos, tanto a través del mejoramiento de la muerte de células asociado con estas enfermedades/trastornos como promoviendo la recuperación funcional. Todas las publicaciones, tanto de revista como de patente, descritas en la presente especificación están expresamente y enteramente incorporadas aquí por referencia.

COMPENDIO DE LA INVENCION La invención provee un anticuerpo alterado o fragmento funcional del mismo, el cual se une a, y neutraliza MAG y comprende una o más de las siguientes CDRs. Las CDRs se identifican según descritas por Kabat y otros ("Secuencias de proteínas de interés inmunológico" Departamento de Salud y Servicios Humanos de EUA, publicación NIH No. 91-3242. Las CDRs preferiblemente son como se definen por Kabat, pero siguiendo los principios de la estructura de proteína y plegándose como se define a través de Chothia y Lesk, (Chothia y otros, (1989) Conformaciones de regiones hipervariables de Inmunoglobulina; Nature 342, p877-883), se apreciará que los residuos adicionales también pueden ser considerados como siendo parte de la región de unión del antígeno y de esta forma se abarcan a través de la presente invención.

CDRs de cadena ligera COR De acuerdo con Kabat L1 KSSHSVLYSSNQKNYLA (ID DE SECUENCIA NO: 1) L2 WASTRES (ID DE SECUENCIA NO: 2) L3 HQYLSSLT (ID DE SECUENCIA NO:3) CDRs de cadena pesada La presente invención también se refiere a un anticuerpo que se une al mismo epítopo como un anticuerpo que tiene las CDRs descritas anteriormente. Los ensayos de inhibición competitiva se utilizan para representar los epítopos del antígeno. De esta forma también se provee un anticuerpo anti-MAG (alterado o no alterado) el cual competitivamente inhibe la unión del anticuerpo alterado que tiene las CDRs descritas supra a MAG, preferiblemente MAG humano. En un aspecto adicional, la presente invención provee un anticuerpo alterado o fragmento funcional del mismo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una o más CDRs seleccionadas de CDRH1 , CDRH2, y CDRH3, y/o un dominio variable de cadena ligera que comprende una o más CDRs seleccionadas de CDRL1 , CDRL2, y CDRL3. La invención además provee un anticuerpo anti-MAG alterado o fragmento funcional del mismo que comprende: a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende CDRH1 , CDRH2, y CDRH3 en secuencia. y/o b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende CDRL1, CDRL2, y CDRL3 en secuencia. Un aspecto adicional de la invención provee una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-MAG alterado de la presente invención o fragmento funcional del mismo junto con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto más, la presente invención provee un método para el tratamiento o profilaxis de derrame cerebral y otras enfermedades neurológicas en un ser humano, que comprende la administración a dicho ser humano en la necesidad del mismo, de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-MAG de la invención o fragmentos funcionales del mismo. En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-MAG de la invención o un fragmento funcional del mismo en la preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de derrame cerebral y otras enfermedades neurológicas.

En un aspecto adicional, la presente invención provee un método para inhibir neurodegeneracion y/o promover la recuperación funcional en un paciente ser humano afectado con, o en riesgo de desarrollar, un derrame cerebral u otra enfermedad neurológica, que comprende la administración a dicho ser humano en la necesidad del mismo de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-MAG de la invención o un fragmento funcional del mismo. En aún otro aspecto, la invención provee el uso de un anticuerpo anti-MAG de la invención o un fragmento funcional del mismo en la preparación de un medicamento para inhibir neurodegeneración y/o promover la recuperación funcional en un paciente ser humano afectado con, o en riesgo de desarrollar, un derrame cerebral y otras enfermedades neurológicas. Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen además en la descripción detallada y las modalidades preferidas de la misma.

DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1 : Secuencia de una cadena pesada del anticuerpo anti- MAG quimérico de ratón/ser humano (SEC ID No: 27). Figura 2: Secuencia de una cadena ligera del anticuerpo anti- MAG quimérico de ratón/ser humano (SEC ID No: 28). Figura 3: Secuencia de una cadena pesada del anticuerpo anti- MAG quimérico de ratón/ser humano (SEC ID No: 29). Figura 4: El anticuerpo anti-MAG quimérico se une a MAG de rata . Figura 5: Secuencias del anticuerpo anti-MAG humanizado.

Figura 6: Los anticuerpos anti-MAG humanizados se unen a MAG de rata. Figura 7: Los anticuerpos anti-MAG humanizados se unen a MAG de rata. Figura 8: Los anticuerpos anti-MAG humanizados se unen a MAG de ser humano. Figura 9: Competencia de ELISA con MAG de anticuerpos anti-MAG de ratón y humanizados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION Anticuerpo anti-MAG El anticuerpo alterado de la invención es preferiblemente un anticuerpo monoclonal (mAb) y es preferiblemente quimérico, humanizado o remodelado, de estos humanizados es particularmente preferido. El anticuerpo alterado preferiblemente tiene la estructura de un anticuerpo natural o fragmento del mismo. El anticuerpo puede por lo tanto comprender un anticuerpo completo, un fragmento (Fab1)?, un fragmento Fab, un dímero de cadena ligera o un dímero de cadena pesada. El anticuerpo puede ser un IgG 1 , lgG2, lgG3, o lgG4; o IgM; IgA, IgE o IgD o una variante modificada de los mismos. El dominio constante de la cadena pesada del anticuerpo por consiguiente puede ser seleccionado Por consiguiente el dominio constante de la cadena ligera puede ser un dominio constante kappa o lambda. Además, el anticuerpo puede comprender modificaciones de todas las clases de dímeros eg IgG, mutantes Fe que ya no se unen a receptores Fe o median la unión a Clq (anticuerpos de bloqueo). El anticuerpo también puede ser un anticuerpo quimérico del tipo descrito en WO86/01533 que comprende una región de unión a antígeno y una región no de inmunoglobulina. La región de unión a antígeno es un anticuerpo de dominio variable de cadena ligera de o dominio variable de cadena pesada. Típicamente la región de unión a antígeno comprende ambos dominios variables, de cadena ligera y de cadena pesada. La región de no inmunoglobulina se fusiona en su término C a la región de unión de antígeno. La región de no inmunoglobulina es típicamente una proteína no de inmunoglobulina y puede ser una enzima, una toxina o proteina que tiene especificidad de unión conocida. Las dos regiones de este tipo de anticuerpo quimérico pueden estar conectadas a través de una secuencia enlazadora divisible. Las inmunoadhesinas que tienen las CDRs como se describió aquí anteriormente, también se contemplan en la presente Invención. La región constante se selecciona de acuerdo con la funcionalidad requerida. Normalmente un I g G 1 demostrará la habilidad lítica a través de la unión que complementa y/o mediará ADCC (citotoxicidad de célula dependiente de anticuerpo. Un lgG4 será preferido si un anticuerpo de bloqueo no citotóxico es requerido. Sin embargo, los anticuerpos lgG4 pueden demostrar inestabilidad en la producción y por lo tanto será más preferible modificar el I g G 1 generalmente más estable. Las modificaciones sugeridas se describen en las modificaciones preferidas EPO307434 incluidas en las posiciones 235 y 237. La invención por lo tanto proporciona una forma lítica o no lítica de un anticuerpo de acuerdo con la invención.

En un aspecto preferido el anticuerpo preferido es clase IgG, más preferiblemente I g G 1. En formas preferidas por lo tanto, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo I g G 1 no litico de longitud completa que tiene los CDRs descritos supra. En las formas más preferidas se provee un anticuerpo lgG1 no lítico de longitud completa que tiene las CDRs de SEC I D NO.13 y 16 y un anticuerpo I g G 1 no litico de longitud completa que tiene las CDRs de SEC. ID. O: 15 y 18. En un aspecto adicional, la invención proporciona polinucleótidos que codifican CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL2 y CDRL3. Las secuencias de polinucleótido preferidas son CDRs de cadena ligera CDR L1 AAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTA CCTGGCC (SECUENCIA ID NO: 7 L2 TGGGCCAGCACCCGCGAGAGC (SECUENCIA ID NO: 8 L3 CACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC (SECUENCIA ID NO:9) CDRs de cadena pesada En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica una región de cadena variable de un anticuerpo anti- AG alterado incluyendo por lo menos una CDR seleccionada de CDRL1, CDRL2 y CDRL3, más preferiblemente incluyendo las 3 CDRs en secuencia. En un aspecto más de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-MAG alterado incluyendo por lo menos una CDR seleccionada de CDRH1, CDRH2, y CDRH3, más preferiblemente incluyendo las tres CDRs en secuencia. En un aspecto particularmente preferido, el anticuerpo anti-MAG de la invención es un anticuerpo humanizado. La invención por consiguiente además proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento funcional del mismo que se une a y neutraliza MAG, el cual comprende una región variable de cadena pesada que comprende una de las siguientes secuencias de aminoácido: QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEW MGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCA RNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS (SEC ID No 13).

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYG NWVRQAPGQGLEW MGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCA RNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS (Secuencia ID No 14) QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYG NWVRQAPGQGLEW GWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYFCA RNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS (Secuencia ID No 15) En un aspecto adicional de la invención se proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento funcional del mismo que se une a MAG, el cual comprende la región variable de cadena pesada de la Secuencia Id No 13, 14, o 15 junto con una región variable de cadena ligera que comprende las Secuencias de aminoácido, Secuencia Id No 16, 17, 18 o 19: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYLS SLTFGQGTKLEIKRTV (SEC ID No 16) D IV TQS DSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQK YLAW YQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIINLQAEDVAVYYCHQYLS SLTFGQGTKLEIKRTV (SEC ID No 17) DIV TQSPD5LAVSLGERATINCKSSHSVLYSS QKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWAST ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLHTEDVAVYYCHQYLS SLTFGQGTKLEIKRTV (SEC ID No 18) DI TQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIINLHTED AVYYCHQYLS SLTFGQGTKLEIKRTV (SEC ID No 19) En un aspecto adicional de la presente invención se provee un anticuerpo humanizado que comprende: un fragmento variable de cadena pesada que comprende SEC ID No 13, 14 o 15 y una parte constante del fragmento del mismo de una cadena pesada humana y un fragmento variable de cadena ligera que comprende SEC ID No. 16, 17, 18 o 19 y una parte constante o fragmento del mismo de una cadena ligera humana. En un aspecto preferido, el anticuerpo humanizado es clase 1gG más preferiblemente 1gG1. Los anticuerpos preferidos de la invención comprenden: Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 13 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 16; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 13 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 17; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID 5 No 13 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 18; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 13 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 19; 10 Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 14 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 16; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 14 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID 15 No 17; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 14 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 18; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID 20 No 14 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 19; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 15 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 16; 25 Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 15 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 17; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 15 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 18; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 15 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 19. En un aspecto adicional, la invención proporciona polinucleótidos que codifican la región variable de cadena pesada que comprende las Secuencias ID Nos 13, 14 y 15 y las regiones variables de cadena ligera que comprenden la Secuencia ID No 16, 17, 18 y 19. La Secuencia de polinucleótido preferida que codifica la Secuencia de aminoácido SEC ID NO 13 es CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGC TCAGTGAFFTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACG GCATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTGAGTGGATG GGATGG ATC AAC ACCTACACCGGCGAGCCACC ACGCCGACG ACTTC ACCGGCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATAT CTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGT GCGCAAACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGA TGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA (SEC ID La secuencia de polinucleótido preferida que codifica la Secuencia de aminoácido ID No 14 es: CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGC CTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCCTGGATACACCTTCACTAACT ACGGC ATG AACTGGGTGCGACAGGCCCCTGG ACAAGGGCTTGAGTG GATGGGATGG ATC AAC ACCTAC ACCGGCGAGCC ACCTACGCCGAAC GACTTCACGGCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCRGTCAGCACG GCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTAT TTCTGRGCGAGAAAACCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGG CTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCT CA (SEC ID No 21 ).

La secuencia de polinucleótido que codifica la Secuencia de aminoácido ID No 15 es: CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGC CTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGTTCTGGATACACCTTCACTAACTAC GGC ATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGAT GGGATGG ATC AAC ACCTAC ACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGAC TTCACCGGCCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGC ATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCACCTATTT CTGTGCGAGAAACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCT ACGTG ATGG ACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA (SEC ID No 22).

La secuencia de polinucleótido que codifica la Secuencia de aminoácido ID No 16 es: GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCC AC AG CGTGCTGTGTA CAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTTGGCCTGGTACCAGGCAGAAACC AGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGC ATCTACCDCGGGAA TCCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATT TCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATT ACTGTCACCAGACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGC TGG AGATC AAACGTACGGTG (SEC ID No 23).

La secuencia de polinucleótido que codifica la Secuencia de aminoácido ID No 17 es: GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAATCTGCAAGAGCAGCC ACAGCGTGCTGTAC AGCAGCAACCAGAAGAACTACCTTGGCCTGGCCAAGCAGAAACCAG GACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCC GGGGTCCCTGACCCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCA CTCTCACCATC AT ACC ACCCTGC AGGCTG AAG ATGTGGCAGTTTATTA CTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAAGGGGACCAAG CTGGAGATCAAACGTACGGTG (SEC ID No 24) El polinucleótido preferido que codifica SEC ID No 18 es: GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAACTGAAGAGCAGCCACAGCGTFCTGTACAG CAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGAC AGCCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGC ATCTACCCGGGAATCCGG GGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTC TCACCATCAGCAGCCTGCACACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTC ACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAG ATCAAACGTACGGTG (SEC ID No 25).

El polinucleótido preferido que codifica SEC ID No 19 es: GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CG AGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCC ACAGCGTGCTGTAC AGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAG GACAGCCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGC ATCTACCCGGGAATC CGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCA CTCTCACCATC ATC AACTGC AC ACC GAAGATGTGGCAGTTTATTACTG TCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGG AGATCAAACGTAGGTG (SEC ID No 26).

"Neutralización" se refiere a la inhibición, ya sea total o parcial, de la función MAG incluyendo su unión a neuronas y la inhibición del desarrollo de neurita. "Anticuerpo alterado" se refiere a una proteína codificada mediante una región de codificación de inmunoglobulina, la cual puede ser obtenida a través de la expresión en una célula huésped seleccionada. Dichos anticuerpos alterados incluyen anticuerpos diseñados (por ejemplo, quimérico, remodelado, humanizado o anticuerpos vectoreados) o fragmentos de anticuerpo que carecen de toda o una parte de la región constante de inmunoglobulina, por ejemplo, Fv, Fab, o F(ab)2 y similares. "Región que codifica la inmunoglobulina alterada" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo alterado. Cuando el anticuerpo alterado es un anticuerpo injertado o humanizado CDR, las secuencias que codifican las regiones determinantes de la complementaridad (CDRs) de una inmunoglobulina no humana se insertan dentro de un primer patrón de inmunoglobulina que comprende secuencias de estructura variable humanas. Opcionalmente, el primer patrón de inmunoglobulina está operativamente enlazado a un segundo patrón de inmunoglobulina.

"Primer patrón de inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una estructura humana o región variable de inmunoglobulina humana en la cual las regiones que codifican CDR nativo (o de existencia natural) son reemplazadas por las regiones que codifican CDR de un anticuerpo donador. La región variable humana puede ser una cadena pesada de inmunoglobulina, una cadena ligera (o ambas cadenas), un análogo o fragmentos funcionales del mismo. Dichas regiones CDR, localizadas dentro de la región variable de los anticuerpos (inmunoglobulinas) pueden ser determinadas a través de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Kabat y otros (Secuencias de Proteínas de Interés Inmunolóqico, 4a. edición. Departamento de Salud y Servicios Humanos, EUA, Institutos Nacionales de Salud (1987)) describe reglas para localizar CDRs. Además, los programas de computadora conocidos que son útiles para identificar regiones/estructuras CDR.

"Segundo patrón de inmunoglobulina" se refiere a otra secuencia de nucleótido que codifica una proteína o péptido al cual el primer patrón de inmunoglobulina se fusiona en marco o a través de medios de una secuencia enlazadora convencional opcional (es decir, operativamente enlazada). Preferiblemente es un gen de inmunoglobulina. El segundo patrón de inmunoglobulina puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante completa para el mismo (es decir, homólogo - el primero y segundo anticuerpo alterado se derivan de la misma fuente) o un anticuerpo adicional (es decir, heterólogo) de interés. Puede ser una cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina (o ambas cadenas como parte de un polipéptido individual). El segundo patrón de inmunoglobulina no está limitado a una clase o i s o t i p o de inmunoglobulina particular. Además, el segundo patrón de inmunoglobulina puede comprender parte de una reg ion constante de inmunoglobulina, tal como la que se encuentra en Fab, o F(ab)2 (es decir, una parte discreta de una región constante humana apropiada o región de estructura). Dicho segundo patrón de inmunoglobulina también puede comprender una secuencia que codifica una proteína de la membrana integral expuesta en su superficie externa a una célula huésped, por ejemplo, como parte de una colección de exhibición de fago, o una secuencia que codifica una proteína para detección analítica o de diagnóstico, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, etc.

Los términos Fv, Fe, Fd, Fab, o F(ab)2 se utilizan con sus significados estándares (ver, por ejemplo, Harlow y otros, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)). Como se utiliza aquí, un "anticuerpo diseñado por ingeniería" describe un tipo de anticuerpo alterado, es decir, un anticuerpo sintético de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo quimérico, remodelado o humanizado según opuesto a un fragmento del anticuerpo) en el cual una porción de los dominios variables de cadena ligera y/o pesada de un anticuerpo aceptor seleccionado son reemplazados por partes análogas de uno o más anticuerpos donadores que tiene especificidad para el epítopo seleccionado. Por ejemplo, dichas moléculas pueden incluir anticuerpos caracterizados por una cadena pesada humanizada asociada con una cadena ligera no modificada (o cadena ligera quimérica), o viceversa. Los anticuerpos diseñados por ingeniería a través de la alteración de las secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones de estructura del dominio variable de cadena ligera y/o pesada con el fin de retener la especificidad de unión del anticuerpo donador. Estos anticuerpos pueden comprender el reemplazo de una o más CDRs (preferiblemente todas) del anticuerpo aceptor con CDRs de un anticuerpo donador descrito aquí. Un "anticuerpo quimérico" se refiere a un tipo de anticuerpo diseñado por ingeniería que contiene una región variable de existencia natural (cadena ligera y cadenas pesadas) derivadas de un anticuerpo donador en asociación con regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada derivadas de un anticuerpo aceptor.

Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un tipo de anticuerpo diseñado por ingeniería que tiene sus CDRs derivados de una inmunoglobulina de donador no humano, las partes derivadas de inmunoglobulina restantes de la molécula siendo derivadas de una (o más) ¡nmunoglobulina(s) humanas. Además, los residuos de soporte de estructura pueden ser alterados para conservar la afinidad de unión (ver, por ejemplo, Queen y otros, Proc. Nati Acad Sci EUA 86: 10029-10032 (1989), Hodgson y otros, Bio/Technology , 9: 421 (1991)). Un anticuerpo aceptor humano adecuado puede ser uno seleccionado de una base de datos convencional, por ejemplo, la base de datos KABAT®, la base de datos Los Alamos, y la base de datos Swiss Protein, a través de homología a las secuencias de nucleótido y de aminoácido del anticuerpo donador. Un anticuerpo humano caracterizado por una homología a las regiones de estructura del anticuerpo donador (o bases de aminoácido) pueden ser adecuadas para proveer una región constante de cadena pesada y/o región de estructura variable de cadena pesada para inserción de las CDRs del donador. Un anticuerpo aceptor adecuado capaz de donar regiones de estructura constante de cadena ligera o variable puede ser seleccionado en una forma similar. Se deberá observar que las cadenas pesada y ligera del anticuerpo aceptor no son requeridas para originarse del mismo anticuerpo aceptor. La técnica anterior describe varias formas para producir dichos anticuerpos humanizados, ver, por ejemplo, EP-A-0239400 y EP-A-054951.

"Anticuerpo humano remodelado" se refiere a un anticuerpo alterado en el cual en grado mínimo en por lo menos una CDR de un anticuerpo de donador monoclonal humano se substituye por una CDR en un segundo anticuerpOo aceptor humano. Preferiblemente las seis CDRs son reemplazadas. Más preferiblemente, una región de combinación del antígeno completo (por ejemplo, Fv, Fab, o F(ab)2) de un primer anticuerpo monoclonal de donador humano es substituido por la región correspondiente en un segundo anticuerpo monoclonal aceptor humano. Más preferiblemente, la región Fab de un primer donador humano está operativamente enlazada a las regiones constantes apropiadas de un segundo anticuerpo aceptor humano para formar un anticuerpo monoclonal de longitud completa.

Un "anticuerpo vectoreado" se refiere a un anticuerpo al cual se ha unido un agente para mejorar el transporte a través de la barrera del cerebro sanguínea (BBB). (Revisar Pardridge; Advanced Drug Delivery Review 36, 299-321, 1999). El anexo puede ser química o alternativamente una porción que puede ser diseñada por ingeniería dentro del anticuerpo. Un ejemplo es hacer una quimera con un anticuerpo dirigido hacia un receptor eg, un anticuerpo del receptor de anti-insulina o un anticuerpo del receptor anti-transferina de célula endotelial capilar del cerebro (Saito y otros, (1995) Proc. Nati. Acad Sci. EUS 92 10227-31; Pardridge y otros (1995) Pharm, Res 12 807-816; Broadwell y otros (1996) Exp. Neurol, 142 47-65; Bickel y otros (1993) Proc Nati. Acad Sci EUA 90, 2618-2622; Friden y otros (1996) J. Pharm, Exp. Cher. 278 1491-1498, US5182107, US5154924, US5833988, US5527527). Una vez unido al receptor, ambos componentes del anticuerpo biespecífico pasan a través del BBB mediante el proceso de transcitosis. Alternativamente el agente puede ser un ligando el cual une dichos receptores de superficie de célula de eg insulina, transferina o lipoproteína de baja densidad (Descamps y otros (1996) Am. J, Physiol. 270 H1149-H1158 i Duffy y otros (1987) Brain Res. 420 32-38; Dehouck y otros (1997) J. Cell Biol 1997 877-889). Los péptidos de existencia natural tales como penetratina y SynB1 y Syn B3 los cuales se sabe que mejoran el transporte a través de BBB también pueden ser utilizados (Rouselle y otros (2000) Mol. Pharrr. 57,679-686 y Rouselle y otros (2001) Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 296, 124-131 ). El término "anticuerpo donador" se refiere a un anticuerpo (monoclonal, o recombinante) que contribuyan con las secuencias de aminoácido de sus regiones variables, CDRs, u otros fragmentos funcionales o análogos de las mismas a su primer patrón de inmunoglobulina, para así proveer la región de codificación de inmunoglobulÍna alterada y den como resultado un anticuerpo alterado expresado con su características de especificidad antigénica y actividad neutralizante del anticuerpo donador. El término "anticuerpo aceptor" se refiere a un anticuerpo (monoclonal, o recombinante) heterólogo al anticuerpo donador, que contribuye con toda la porción (o cualquier porción, pero preferiblemente toda) de las secuencias de aminoácido que codifican sus regiones de estructura de cadena pesada y/o ligera o sus regiones constantes de cadena pesada y/o ligera con el primer patrón de ¡nmunoglobulina. Preferiblemente un anticuerpo humano es el anticuerpo aceptor. "CDRs" se define como las secuencias de aminoácido de la región que determina la complementaridad de un anticuerpo que es la región hipervariable de cadenas pesada y ligera de ¡nmunoglobulina. Ver, por ejemplo, Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a. Ed., U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Existen tres CDRs de cadena pesada y tres de cadena ligera (o regiones CDR) en la porción variable de una ¡nmunoglobulina. De esta forma, las "CDRs" como se utilizan aquí se refieren a las tres CDRs de cadena pesada, o a las tres CDRs de cadena ligera (o ambas, todas las CDRs de cadena pesada y todas las CDRs de cadena ligera, si es apropiado). La estructura y el doblamiento de las proteínas del anticuerpo pueden significar que otros residuos son considerados parte de la región de unión del antígeno y se entendería esto a través de una persona con experiencia. Ver por ejemplo Chothia y otros, (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883. Por conveniencia las CDRs según definidos por Kabat en SEC ID Nos 13-26 se subrayan.

Las CDRs proveen la mayoría de los residuos de contacto para la unión del anticuerpo al antígeno o epítopo. Las CDRs de interés en esta invención se derivan de las secuencias de cadena ligera o cadena pesada variables del anticuerpo donador, e incluyen análogos de las CDRs de existencia natural, cuyos análogos también comparten o retienen la misma especificidad de unión a antígeno y/o habilidad neutralizante como el anticuerpo donador a partir del cual se derivan. Un "fragmento funcional" es una secuencia variable de cadena pesada o cadena ligera (por ejemplo, eliminaciones menores en el término amino o carboxi de la región variable de inmunoglobulina) que retienen la misma especificidad de unión a antígeno y/o habilidad neutralizante como el anticuerpo a partir del cual se deriva el fragmento. Un "análogo" es una secuencia de aminoácido modificada a través de por lo menos un aminoácido, en donde dicha modificación pueden ser química o una substitución o una reconfiguracíón de unos cuantos aminoácidos (es decir, no más de 10), cuya modificación permite a la secuencia de aminoácido retener las características biológicas, por ejemplo, especificidad de antígeno y alta afinidad, de la secuencia no modificada. Por ejemplo, se pueden construir mutaciones (silenciosas), a través de substituciones, cuando ciertos sitios de restricción de endonucleasa se crean dentro o alrededor de las regiones que codifican CDR. La presente invención contempla el uso de análogos del anticuerpo de la invención. Se sabe bien que los cambios menores en las secuencias de aminoácido o de ácido nucleico pueden dirigir eg a una forma alélica de la proteína original que retiene substancialmente propiedades similares. De esta forma los análogos del anticuerpo de la invención incluyen aquellos en donde las CDRs en la región hipervariable de cadenas pesada y ligera son por lo menos 80% homologas, preferiblemente por lo menos 90% homologas, y más preferiblemente por lo menos 95% homologas a las CDRs según definido anteriormente como CDRH1 , CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, y CDRL3 y retienen la actividad neutralizante MAG. Las secuencias de aminoácido son por lo menos 80% homologas si tienen 80% de residuos de aminoácido idénticos en una posición similar cuando las secuencias están alineadas óptimamente, los huecos o inserciones siendo contados como residuos no idénticos. La invención también contempla análogos de los anticuerpos de la invención en donde las regiones de estructura son por lo menos 80%, preferiblemente por lo menos 90%, y más preferiblemente por lo menos 90% y de preferencia por lo menos 95% homologas a las regiones de estructura establecidas en Sec ID 1-5. Las secuencias de aminoácido son por lo menos 80% homologas si tienen 80% de residuos de aminoácido idénticos en una posición similar cuando las secuencias están alineadas óptimamente, y los huecos o inserciones son contados como residuos no idénticos. Los análogos también pueden surgir como variaciones alélicas.

Una "variación o modificación alélica" es una alteración en la secuencia de ácido nucleico. Dichas variaciones o modificaciones pueden ser debido a la degeneración en el código genético o pueden ser deliberadamente diseñadas por ingeniería para proveer características deseadas. Estas variaciones o modificaciones pueden o no pueden dar como resultado alteraciones en cualquier secuencia de aminoácido codificada. El término "agentes ejecutores" se refiere a moléculas portadoras no de proteína a la cuales los anticuerpos alterados, y/o cadenas ligeras o pesadas naturales o sintéticas del anticuerpo donador u otros fragmentos del anticuerpo donador pueden estar asociadas a través de medios convencionales. Dichos portadores de no proteína pueden incluir portadores convencionales utilizados en el campo de diagnóstico, por ejemplo, poliestireno y otras perlas plásticas, polisacáridos, por ejemplo, como se utilizan en el sistema BIAcore [Pharmacia], u otras substancias no de proteina útiles en el campo médico y seguras en la administración a seres humanos y animales. Otros agentes ejecutores pueden incluir macrociclo, para la quelatación de un átomo de metal pesado, o radioisótopos. Dichos agentes ejecutores también pueden ser útiles para incrementar la vida media de los anticuerpos alterados, por ejemplo, glicol polietilénico. Un anticuerpo neutralizante especifico para MAG ha sido descrito (Poltorak y otros (1987) Journal of Cell Biology "IOS, 1893-1899, DeBellard y otros (1996) Mol. Cell Neurosci 7, 89-101; Tang y otros (1997) Mol, Cell, Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K y Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262) y está comercialmente disponible (MAB1567 (Chemicon)). Alternativamente, se pueden construir anticuerpos y fragmento inmunizando especies no humanas (por ejemplo, bovino, ovino, mono, pollo, roedores (por ejemplo, murino y rata, etc.) para generar una inmunoglobulina deseable dependiendo de la presentación con MAG nativo de cualesquiera especies contra cuyos anticuerpos interaccionan con MAG humano pueden ser generados, eg humano o de pollo. Las técnicas de hibridoma convencionales se emplean para proveer una línea de células de hibridoma que secretan un mAB no humano para MAG. Dichos hibridomas después son clasificados para la unión utilizando MAG recubriendo placas de 384 y 96 cavidades, con MAG bioteñido unido un placa recubierta con estreptavidina, o en un inmunoensayo enlazada a APC de europio homogéneo utilizando MAG bioteñido. Un anticuerpo humano nativo puede ser producido en un ratón de anticuerpo humano tal como el "Xenoratón" (Abgenix) en donde los genes de inmunoglobulina del ratón han sido removidos y los genes que codifican la inmunoglobulina humana han sido insertados en el cromosoma del ratón. Los ratones se inmunizaron como normales y desarrollaron una respuesta a anticuerpo que se deriva de genes humanos. De esta forma el ratón produce anticuerpos humanos eliminando la necesidad de humanizarlos después de la selección de hibridomas positivos. (Ver Green L.L..J Immuno/Methods Dic 10 de 1999; 231 (1-2): 11 -23). La presente invención también incluye el uso de fragmentos Fab o fragmentos F(ab)2 derivados de mAbs dirigidos contra MAG. Estos fragmentos son útiles como agentes protectores in vivo. Un fragmento Fab contiene la cadena ligera completa y una porción terminal amino de la cadena pesada; y un fragmento F(ab)2 es el fragmento formado a través de do fragmentos Fab unidos a enlaces de disulfuro. Los fragmentos Fab y los fragmentos F(ab)2 pueden ser obtenidos a través de medios convencionales, por ejemplo, la división de mAb con las enzimas proteolíticas, papaina y/o pepsina apropiadas, o a través de métodos recombinantes. Los fragmentos Fab y F(ab)2 son útiles por ellos mismos como terapéuticos o profilácticos, y como donadores de secuencias que incluyen las regiones variables y secuencias CDR en la formación de anticuerpos recombinantes o humanizados como se describe aquí. Los fragmentos Fab y F(ab)2 también pueden ser construidos a través de una colección de fago combinatoria (ver, por ejemplo, Winter y otros Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994)) o mezclando la cadena de inmunoglobulina (ver, por ejemplo, Marks y otros, Bio/Technology , 10: 779-783 (1992), las cuales ambas se incorporan aquí por referencia en su totalidad. De esta forma los fragmentos de anticuerpo humanos (Fv, scFv, Fab) específicos para MAG pueden ser aislados utilizando colecciones de exhibición de fago de fragmentos de anticuerpo humanos. Una colección de partículas de bacteriófago, la cuales exhiben las proteínas del fragmento de anticuerpo humano, se mueven contra la proteína MAG. Esos fragmentos de anticuerpo que exhiben fago que unen MAG se retienen de la colección y clonalmente se amplifican. Los genes del anticuerpo humano después se extraen del bacteriófago apropiado y se Insertan en las construcciones de expresión de I g G conteniendo las regiones constantes de IgG para formar la molécula IgG humana intacta con las regiones variables a partir del bacteriófago aislado especifico para MAG. Los anticuerpos de donador pueden aportar secuencias, tales como las secuencias de péptido de cadena pesada y/o cadena ligera, secuencias de estructura, secuencias CDR, fragmentos funcionales, y análogos de los mismos, y las secuencias de ácido nucleico que las codifican, útiles en el diseño y obtención de varios anticuerpos alterados los cuales se caracterizan a través de la especificidad del antigeno del anticuerpo donador. Tomando en cuenta la degeneración del código genético, varias secuencias de codificación pueden ser construidas, las cuales codifican las secuencias de aminoácido de cadena pesada y cadena ligera variables, y las secuencias CDR así como fragmentos funcionales y análogos de los mismos, que comparten la especificidad de antígeno del anticuerpo donador. Las secuencias de ácido nucleico, o fragmentos de las mismas, codifican las secuencias de péptido de cadena variable o las CDRs se pueden utilizar para producir anticuerpos alterados, por ejemplo, anticuerpos quiméricos o humanizados, u otros anticuerpos diseñados por ingeniería, cuando se combinan de manera operativa con un segundo patrón de inmunoglobulina. Las moléculas de inmunoglobulina alteradas pueden codificar anticuerpos alterados que incluyen anticuerpos diseñados por ingeniería tales como los anticuerpos quiméricos y humanizados. Una región de inmunoglobulina alterada deseada contiene regiones de codificación CDR que codifican péptidos que tienen especificidad de antígeno de un anticuerpo anti-MAG, preferiblemente un anticuerpo de alta afinidad, insertado de un primer patrón de inmunoglobulina (una estructura humana o una región variable de inmunoglobulina humana). Preferiblemente, el primer patrón de inmunoglobulina humano está operativamente enlazado a un segundo patrón de inmunoglobulina. El segundo patrón de inmunoglobulina se define anteriormente, y puede incluir una secuencia que codifica una segunda región de anticuerpo de interés, por ejemplo una región Fe. Los segundos patrones de inmunoglobulina también pueden incluir secuencias que codifican otra inmunoglobulina, a la cual otra región constante de cadena ligera o pesada está fusionada o a través de medios de una secuencia enlazadora. Los anticuerpos diseñados por ingeniería dirigidos contra fragmentos funcionales o análogos de MAG pueden ser diseñados para obtener una unión mejorada. El segundo patrón de inmunoglobulina también puede estar asociado con los agentes ejecutores como se definió anteriormente, incluyendo moléculas portadoras no de proteina, a las cuales el segundo patrón de inmunoglobulina puede estar operativamente enlazado a través de medios convencionales. La fusión o el enlace entre los segundos patrones de inmunoglobulina, por ejemplo, secuencias de anticuerpo, y el agente ejecutor puede ser a través de cualesquiera medios adecuados, por ejemplo, a través de enlaces covalentes o iónicos, fusiones de proteínas, o enlazadores cruzados hetero-bif uncionales, por ejemplo, carbodiimida, glutaraldehído y similares. Dichas técnicas son conocidas en la técnica y fácilmente descritas en química convencional y textos de bioquímica. Adicionalmente, las secuencias enlazadoras convencionales que simplemente proveen una cantidad deseada de espacio entre el segundo patrón de inmunoglobulina y el agente ejecutor también pueden ser construidas en una región de codificación de inmunoglobulina alterada. El diseño de dichos enlazadores es bien conocido por aquellos con experiencia en ia técnica. En aspectos adicionales de la invención, se proporcionan especies de proteína scFV de dos grupos (bivalentes o biespecíficas), de tres grupos, de cuatro grupos y otras multivalentes que tienen una o más CDRs como se describe supra que se unen a o neutralizan la función MAG. En aún otra modalidad, el anticuerpo de la invención puede tener unido un agente adicional. Por ejemplo, el procedimiento de tecnología de ADN recombinante puede ser utilizado para producir un anticuerpo diseñado por ingeniería de la invención en el cual el fragmento Fe o el dominio CH2-CH3 de una molécula del anticuerpo completa ha sido reemplazada por una enzima u otra molécula detectable (es decir, un ejecutor de polipéptído o molécula reportera ) . El segundo patrón de inmunoglobulina también puede estar operativamente enlazado a un péptido no de inmunoglobulina, proteína o fragmento de la misma heterólogo a la secuencia que contiene la CD que tiene especificidad de antigeno de un anticuerpo anti-MAG. La proteína resultante puede exhibir tanto especificidad de antígeno anti-MAG como características de no ¡nmunoglobulina dependiendo de la expresión. Las características del patrón de fusión pueden ser, por ejemplo, una característica funcional tal como otra unión o dominio del receptor, o una característica terapéutica si el patrón de fusión es por sí mismo una proteína terapéutica, o características antigénicas adicionales. Otra proteína deseable de esta invención puede comprender una molécula de anticuerpo completa, que tiene cadenas pesada y ligera de longitud completa, o cualquier fragmento discreto del mismo, tales como los fragmentos Fab o F(ab')2, un dimero de cadena pesada o cualesquiera fragmentos recombinantes mínimos del mismo tal como un anticuerpo Fv o anticuerpo de cadena individual (SCA) o cualquier otra molécula con la misma especificidad que mAb de donador seleccionado. Dicha proteina puede ser utilizada en la forma de un anticuerpo alterado, o puede ser utilizada en su forma no fusionada. Siempre que el segundo patrón de ¡nmunoglobulina se derive de un anticuerpo diferente del anticuerpo donador, por ejemplo, cualquier isótopo o clase de estructura de ¡nmunoglobulina o regiones constantes, resulta un anticuerpo diseñado por ingeniería. Los anticuerpos diseñados por ingeniería pueden comprender regiones constantes de inmunoglobulina (Ig) y regiones de estructura variable de una fuente, por ejemplo, el anticuerpo aceptor, y una o más CDRs (preferiblemente todas) del anticuerpo donador. Además, las alteraciones, por ejemplo, eliminaciones, substituciones, o adiciones, de la región de estructura del dominio ligero y/o variable mAb en el nivel de ácido nucleico y aminoácido o de las regiones CDR del donador pueden ser hechas con el fin de retener la especificidad de unión de antigeno del anticuerpo donador. Dichos anticuerpos diseñados por ingeniería se diseñan para emplear una (o ambas) cadenas pesada y/o ligera variables de mAb anti- AG o una o más CDRs de cadena ligera o pesada. Los anticuerpos diseñados por ingeniería pueden ser neutralizantes, como se definió anteriormente. Dichos anticuerpos diseñados por ingeniería pueden incluir una anticuerpo humanizado que contiene las regiones de estructura de una inmunoglobulina o subtipo humano seleccionado, o un anticuerpo quimérico que contiene las regiones constantes de cadena pesada y ligera fusionadas con los fragmentos funcionales del anticuerpo anti-MAG. Un anticuerpo aceptor humano (u otro animal) adecuado puede ser uno seleccionado de una base de datos convencional, por ejemplo, la base de datos KABAT®, las base de datos Los Alamos, y la base de datos Swiss Protein, a través de homología con las secuencias de nucleótido y aminoácido del anticuerpo donador. Un anticuerpo humano características por una homología a la regiones de estructura del anticuerpo donador (sobre bases de aminoácido) puede ser adecuado para proveer una región constante de cadena p pesada y/o región de estructura variable de cadena pesada para la inserción de las CDRs del donador. Un anticuerpo aceptor adecuado capaz de donar regiones constantes o de estructura variable de cadena ligera pueden seleccionarse en una forma similar. Se deberá observar que las cadenas pesada y ligera del anticuerpo aceptor no son requeridas para originarse del mismo anticuerpo aceptor. Deseablemente las regiones de estructura heteróloga y constantes se seleccionan de clases e isotipos de inmunoglobulina humana, tales como IgG (subtipos 1 a 4), IgM IgA, e I g E Sin embargo, el anticuerpo aceptor necesita no comprender solamente secuencias de proteína de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, un gen puede ser construido, en el cual una secuencia de ADN que codifica parte de una cadena de inmunoglobulina humana se fusiona con una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácido no de inmunoglobulina tal como un ejecutor de polipéptido o molécula reportera. Preferiblemente, en un anticuerpo humanizado, los dominios variables tanto en la cadena ligera como en la pesada han sido diseñados por ingeniería a través de un o más reemplazos de CDR. Es posible utilizar las seis CDRs, o varias combinaciones de menos de seis CDRs. Preferiblemente se reemplazan las seis CDRs. Es posible reemplazar las CDRs solamente en la cadena pesada humana, utilizando como la cadena ligera la cadena ligera no modificada del anticuerpo aceptor humano. Alternativamente, una cadena ligera compatible puede ser seieccionada de otro anticuerpo humano a través de un recurso de la base de datos de anticuerpos convencional. El restante de los anticuerpos diseñados por ingeniería puede ser derivado de cualquier inmunoglobulina humana derivada aceptora adecuada. El anticuerpo humanizado diseñado por ingeniería de esta forma, preferiblemente tiene la estructura de un anticuerpo humano natural o un fragmento del mismo, y posee la combinación de las propiedades requeridas para un uso terapéutico efectivo. Se entenderá por aquellos con experiencia en la técnica que un anticuerpo diseñado por ingeniería además puede ser modificado mediante cambios en los aminoácidos del dominio variable sin necesariamente afectar la especificidad y la alta afinidad del anticuerpo donador (es decir, análogo). Se anticipa que los aminoácidos de cadena pesada y ligera pueden ser substituidos por otros aminoácidos ya sea en las estructuras del dominio variable o CDRs o ambas. Además, la región constante puede ser alterada para mejorar o disminuir las propiedades selectivas de las moléculas de la presente invención. Por ejemplo, dimerizacíón, unión a receptores Fe, o la habilidad de unir y activar el complemento (Angal y otros, Mol. Immunol, 30: 105-108 (1993), Xu y otros, J. Biol. Chem, 269: 3469-3474 (1994), Winter y otros, EP 307,434-B). Un anticuerpo alterado que es un anticuerpo quimérico difiere de los anticuerpos humanizados descritos anteriormente al proveer la regiones variables de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo donador no humano completo, incluyendo la regiones de estructura, en asociación con regiones constantes de inmunoglobulina de otras especies, preferiblemente humanas para ambas cadenas. Preferiblemente, las secuencias de cadena ligera y/o pesada variable y las CRs de mAbs donares adecuados, y sus secuencias de ácido nucleico de codificación, se utilizan en la construcción de anticuerpos alterados, preferiblemente anticuerpos humanizados, de esta invención, a través del siguiente procedimiento. Se pueden emplear las mismas técnicas o unas similares para generar otras modalidades de esta Invención. Un hibridoma que produce un mAb donador seleccionado es convencionalmente clonado, y el ADN de estas regiones variables de cadena pesada y ligera obtenidas a través de técnicas conocidas por aquellos expertos en el arte, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y otros, Molecular Cloninq (A Laboratorv Manual), 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Las regiones variables pesada y ligera que contienen por lo menos las regiones de codificación de CDR y aquellas porciones de las regiones de estructura de dominio variables ligeras y/o pesadas de mAb aceptor requeridas con el fin de retener el carácter específico de unión de mAb donador, así como las partes derivadas de inmunoglobulina restantes de la cadena de anticuerpo derivada de una inmunoglobulina humana se obtienen usando iniciadores de polinucleótido y transcriptasa inversa. Las regiones de codificación de CDR se identifican usando una base de datos conocida y por comparación con otros anticuerpos. Un anticuerpo quimérico de ratón/humano después puede ser preparado y analizado para habilidad de unión. Dicho anticuerpo quimérico contiene todas las regiones del anticuerpo donador no humano VH y VL, en asociación con las regiones constantes Ig humanas para ambas cadenas. Las regiones de estructura homologas de una región variable de cadena pesada de un anticuerpo humano pueden ser identificadas utilizando las bases de datos computarizadas, por ejemplo, KABAT®, y un anticuerpo humano que tiene homología con el anticuerpo donador se seleccionarán como el anticuerpo aceptor. Una región de estructura variable de cadena ligera adecuada puede ser diseñada en una forma similar. Un anticuerpo humanizado puede ser derivado del anticuerpo quimérico, o preferiblemente, hecho sintéticamente insertando las regiones de codificación CDR de mAb de las cadenas pesada y ligera apropiadamente dentro de la estructura de cadena pesada y ligera seleccionada. Alternativamente, un anticuerpo humanizado puede ser hecho utilizando técnicas de mutagénesis estándares. De esta forma, el anticuerpo humanizado resultante contiene regiones de estructuras humanas y regiones de codificación CDR de mAb de donador. Puede haber una manipulación subsiguiente de los residuos de estructura. El anticuerpo humanizado resultante puede ser expresado en células huésped recombinantes, por ejemplo, COS, CHO, y células de mieloma. Un vector de expresión convencional o plásmido recombinante se produce colocando estas secuencias de codificación para el anticuerpo en asociación operativa con secuencias de control reguladoras convencionales capaces de controlar la replicación y expresión en, y/o la secreción de una célula huésped. Las secuencias reguladoras incluyes secuencias promotoras, por ejemplo, promotora CMV, y secuencias de señal, las cuales se pueden derivar de otros anticuerpos conocidos. Slmilarmente, un segundo vector de expresión puede ser producido teniendo una secuencia de ADN que codifica una cadena ligera o pesada del anticuerpo complementaria. Preferiblemente este segundo vector de expresión es idéntico al primero excepto al grado en que las secuencias y marcadores seleccionares se refieren, para así asegurar tanto como sea posible que cada cadena de polipéptido sea fu nciona I mente expresada. Alternativamente, las cadenas pesada y ligera que codifican secuencias para el anticuerpo alterado pueden residir en un vector individual. Una célula huésped seleccionada es co-transfectada a través de técnicas convencionales tanto con el primer como con el segundo vector (o simplemente transfectada a través de un vector individual) para crear la célula huésped transfectada de la invención que comprende tanto las cadenas ligera y pesada recombinantes o sintéticas. La célula transfectada entonces es cultivada a través de técnicas convencionales para producir el anticuerpo diseñado por ingeniería de la invención. El anticuerpo humanizado que incluye la asociación con ambas, la cadena pesada recombinante y/o la cadena ligera se clasifican a partir del cultivo a través de un ensayo apropiado, tal como ELISA o RIA. Se pueden emplear técnicas convencionales similares para construir otros anticuerpos y moléculas alterados. Los vectores adecuados para los pasos para la codificación y subclonación empleados en los métodos y la construcción de las composiciones de esta invención pueden seleccionarse a través de alguien con experiencia en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar las series pUC convencionales de vectores de clonación. Un vector, pUC19, está comercialmente disponible de casas de suministros, tales como Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) o Pharmacia (Uppsala, Suecia). Adicionalmente, cualquier vector que es capaz de fácilmente replicar, tiene una abundancia de sitios de clonación y genes se lecci on a b I es (por ejemplo, resistencia a antibiótico), y es fácilmente manipulado puede ser utilizado para la clonación. De esta forma, la selección del vector de clonación no es una limitante en esta invención. Similarmente, los vectores empleados para la expresión de los anticuerpos pueden seleccionarse por alguien con experiencia en la técnica de cualquier vector convencional. Los vectores también contienen secuencias reguladoras seleccionadas (tales como promotores CMV) que dirigen la replicación y la expresión de las secuencias de ADN heterologas en células huésped seleccionadas. Estos vectores contienen las secuencias de ADN anteriormente descritas que codifican el anticuerpo o región de codificación de inmunoglobulina alterada. Además, los vectores pueden incorporar las secuencias de inmunoglobulina seleccionadas modificadas a través de la inserción de los sitios de restricción para una fácil manipulación. Los vectores de expresión también pueden ser caracterizados a través de genes adecuados para la expresión de amplificación de las secuencias de ADN heterologas, por ejemplo, el gen de reductasa de dihidrofolato de mamífero (DHFR). Otras secuencias de vector preferibles incluyen una secuencia de señal poli A, tal como de hormona del crecimiento de bovino (BGH) y la secuencia promotora de betaglobina (betaglopro). Los vectores de expresión útiles aquí pueden ser sintetizados a través de técnicas bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. Los componentes de dichos vectores, por ejemplo, replicones, genes de selección mejoradores, promotores, secuencias de señal y similares, pueden ser obtenidos de fuentes comerciales o naturales o sintetizados a través de procedimientos para uso en la dirección de la expresión y/o secreción del producto del ADN recombinante en una célula huésped. Otros vectores de expresión apropiados de los cuales se conocen muchos tipos en la técnica para las expresión de mamíferos, bacterial, de insectos, de levadura y fúngicos también se pueden seleccionar para este propósito.

La presente invención también abarca una linea de células transfectada con un plásmido recombinante que contiene las secuencias de codificación de los anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina alteradas de los mismos. Las células huésped útiles para la clonación y otras manipulaciones de estos vectores de expresión también son convencionales. Sin embargo, más deseable, son las células de varias cepas de E. coli que se utilizan para la replicación de los vectores de expresión y otros pasos en la construcción de anticuerpos alterados de esta invención. Las células huésped o líneas de célula adecuadas para la expresión del anticuerpo de la invención son preferiblemente células de mamífero tales como NSO, Sp2/0, CHO, COS, una célula de fibroblasto (por ejemplo, 3T3) y células de mieloma, y más preferiblemente una célula CHO o de mieloma. Las células de seres humanos pueden ser utilizadas, de esta forma se habilita la molécula que va a ser modificada con patrones de glicolización humanos. Alternativamente, se pueden emplear otras células euca rióti cas . La selección de células huésped de mamífero y métodos para la transformación, cultivo, amplificación, clasificación y producción y purificación del producto son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook y otros, citado anteriormente. Las células bacterianas pueden probar que son útiles como células huésped adecuadas para la expresión de Fabs recombinantes de la presente invención (ver, por ejemplo, Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130: 151 -188 (1992)). Sin embargo, debido a la tendencia de las proteínas expresadas en células bacterianas de estar en una forma no plegada o inapropiadamente plegada, o en una forma no glicosilada, cualquier Fab recombinante producido en una célula bacteriana tendrá que ser clasificada para la retención de la habilidad de unión a antígeno. Si la molécula expresada a través de la célula bacteriana fue producida en una forma plegada apropiada, esa célula bacteriana sería un huésped adecuado. Por ejemplo, varías cepas de E.coli utilizadas para la expresión son bien conocidas como células huésped en el campo de la biotecnología. Varias cepas de S. subtilis, Streptomyces, otros bacilos y similares también pueden emplearse en este método. Cuando las cepas, deseadas de células de levadura conocidas por aquellos con experiencia en la técnica también están disponibles como células huésped, así como células de insecto, por ejemplo, Drosophila y Lepidoptera y sistemas de expresión viral. Ver, por ejemplo, Miller y otros, Genetic Engineering, 8: 277-298, Plenum Press (1986) y referencias citadas ahí. Los métodos generales a través de los cuales los vectores pueden ser construidos, los métodos de transfeccion requeridos para producir las células huésped de la invención, y los métodos de cultivo necesarios para producir el anticuerpo alterado de la invención de dicha célula huésped son todos técnicas convencionales. Igualmente, una vez producidos, los anticuerpos de la invención pueden ser purificados a partir del contenido del cultivo de células de acuerdo con procedimientos estándares de la técnica, incluyendo precipitación de sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía de columna, electroforesis de gel y similares. Dichas técnicas están dentro de la experiencia de la técnica y no limitan esta invención. Por ejemplo, la preparación de anticuerpos alterados se describe en WO 99/58679 y WO 96/16990. Aún otro método para la expresión de los anticuerpos puede utilizar la expresión en un animal transgénico, tal como se describe en la patente de E.U.A. No. 4,873,316. Esta se refiere a un sistema de expresión utilizando el promotor de caseína del animal el cual cuando transgénicamente se incorpora dentro de un mamífero permite que la hembra produzca la proteína recombinante deseada en su leche. Una vez expresado a través del método deseado, el anticuerpo entonces es examinado para la actividad in vitro a través del uso de un ensayo apropiado. Los formatos del ensayo ELISA convencional actualmente se emplean para evaluar cualitativa y cuantitativamente la unión del anticuerpo a MAG. Ad i c i on a I me n te , también se pueden utilizar otros ensayos in vitro para verificar la eficacia de la neutralización antes de que se realicen los estudios clínicos humanos subsiguientes para evaluar la persistencia del anticuerpo en el cuerpo a pesar de los mecanismos de eliminación usuales.

Los agentes terapéuticos de esta invención pueden ser administrados como un profiláctico o después del daño, o por el contrario según sea necesario. La dosis y la duración del tratamiento se refieren a la duración relativa de las moléculas de la presente invención en la circulación del ser humano, y pueden ser ajustadas por uno con experiencia en la técnica dependiendo de la condición que se está tratando y la salud general del paciente. El modo de administración del agente terapéutico de la invención puede ser cualquier ruta adecuada que suministra el agente al huésped. Los antagonistas y anticuerpos, y las com osiciones farmacéuticas de la invención son particularmente útiles para administración parenteral, es decir, subcutáneamente, intramuscularmente, intravenosamente, o intranasalmente. Los agentes terapéuticos de la invención pueden ser preparados como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad efectiva del antagonista o anticuerpo de la invención como un ingrediente activo en un portador farmacéuticamente aceptable. En el agente profiláctico de la invención, una suspensión o solución acuosa que contiene el anticuerpo diseñado por ingeniería, preferiblemente simplificado a un pH fisiológico, en una forma lista para inyección se prefiere. Las composiciones para administración parenteral comúnmente comprenderán una solución del antagonista o anticuerpo de la invención o un cóctel del mismo disuelto en un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Se puede emplear una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, 0.9% de salina, 0.3% de glicina, y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de materia de partículas. Estas soluciones pueden ser esterilizadas a través de técnicas de esterilización bien conocidas, convencionales (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según requeridas para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como ajusfando el pH, y agentes reguladores de pH, etc. La concentración del antagonista o anticuerpo de la invención en dicha formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de alrededor del 0.5%, usualmente al o por lo menos alrededor del 0.1% a cuando mucho el 15 o 20% en peso y se seleccionará principalmente con base en los volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado. De esta forma, una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular podría ser preparada para contener 1 mi de agua regulada en su pH estéril, y de entre a roximadamente 1 ng a aproximadamente 100 mg, por ejemplo alrededor de 50 ng a aproximadamente 30 mg o más preferiblemente, de alrededor de 5 g a aproximadamente 25 mg, de un antagonista o anticuerpo de la invención. Similarmente, una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa podría estar hecha para contener alrededor de 250 mi de solución Ringer estéril, y alrededor de 1 a aproximadamente 30 y preferiblemente 5 mg a alrededor de 25 mg de un anticuerpo diseñado por ingeniería de la invención. Los métodos actuales para preparar composiciones administrables parenteralmente son bien conocidas o pueden ser preparadas por aquellos con experiencia en la técnica y se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15a"a ed.. ack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Se prefiere que el agente terapéutico de la invención, cuando está en una preparación farmacéutica, esté presente en formas de dosis unitarias. La dosis terapéuticamente efectiva apropiada puede ser determinada fácilmente por aquellos con experiencia en la técnica. Para efectivamente tratar derrame cerebral y enfermedades neurológicas en un ser humano, una dosis de hasta 700 mg por 70 kg del cuerpo de un antagonista o anticuerpo de esta invención deberá ser administrada parenteralmente, i.v. o i.m (intramuscularmente). Dicha dosis puede, si es necesario, repetirse a intervalos de tiempo apropiados seleccionados según sea apropiado por el médico. Los anticuerpos descritos aquí pueden ser liofilizados para almacenamiento y reconstituidos en un portador adecuado antes de uso. Esta técnica ha demostrado ser efectiva con inmunoglobulinas convencionales y las técnicas de liofi lización y reconstitución conocidas en la técnica pueden ser empleadas. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-MAG de la presente invención o un fragmento funcional del mismo y un portador farmacéuticamente aceptable para el tratamiento o profilaxis de derrame cerebral y otras enfermedades neurológicas. En aún otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-MAG de la presente invención o un fragmento funcional del mismo y un portador farmacéuticamente aceptable para inhibir la neurodegeneración y/o promover la recuperación funcional en un paciente ser humano que sufre, o está en riesgo de desarrollar, un derrame cerebral u otra enfermedad neurológica. Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

EJEMPLO 1 Anticuerpo anti-MAG en un modelo de derrame cerebral Materiales y Métodos Anticuerpo monoclonal anti-MAG El anticuerpo monoclonal anti-MAG fue un MAB de anticuerpo MAG anti-pollo de ratón 1567 obtenido de Chemicon. El anticuerpo tiene las siguientes características: Antígeno: glicoproteína asociada con mielina (humana, de ratón, de rata, de bovino, de pollo, de rana). Isotipo: IgG 1 Habilidad neutralizante: ver DeBellard y otros (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tang y otros (1997) Mol. Cell Neurosci 9, 333-346 ; Torigoe K y Lundborg G (1997) Exp, Neurology 150, 254-262. El mab IgG de control se compró en + D Systems.

Inserción de cánula intra-cerebral ventricular (solamente para el estudio 1) Bajo anestesia de halotén se colocó una cánula intra-cerebral ventricular (i.c.v.) en el ventrículo cerebral lateral izquierdo (coordenadas: 1.6 mm de la línea medía, 0.8 mm del caudal del vértice, 4.1 mm de la superficie del cráneo, barra del diente incisivo - 3.2 mm por debajo de cero de acuerdo con Paxinos y Watson, 1986). Todas las ratas fueron alojadas individualmente para evitar el daño a la guía o cánula sustituía. Siete días después de la cirugía, la colocación correcta de la cánula se verificó a través de una respuesta para beber intensa a Angiotensina II (100 ng, Simpson y otros, 1978). Nueve días después, los animales experimentaron isquemia cerebral.

Isquemia Cerebral Focal Temporal Se indujo isquemia cerebral focal temporal (90 minutos) en ratas Sprague Dawley macho, cada una pesando entre 300-350 g. Los animales fueron inicialmente anestesiados con una mezcla de 5% de halotén, 60% de óxido nitroso y 30% de oxígeno, colocada en una máscara facial y la anestesia subsecuentemente se mantuvo a 1.5% de halotén. La oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) se llevó a cabo utilizando la técnica del hilo iluminado como se describió previamente (Zea Longa y otros, 1989). Los animales se mantuvieron a temperatura normal a lo largo del procedimiento quirúrgico, se les dejó recuperar durante 1 hora en un incubador, antes de ser alojados individualmente. Solamente aquellos animales con una puntuación neurológica de 3, 1 hora después de la oclusión se incluyeron en el estudio (según evaluado utilizando un sistema de puntuación de 5 puntos: 0, no déficit; 1, reflejo contralateral; 2, agarre debilitado; 3, circulando; 4, inmóvil, 5, muerto). Los animales se mantuvieron hasta 1 semana tiempo después del cual se aniquilaron a través de perfusión transcardiaca de 0.9% de salina seguido por 4% de paraformaldehído en 100 mM de regulador de pH de fosfato. Los cerebros se post-fijaron en 4% de paraformaldehído a 4°C momento en el cual se removieron de los cráneos y se cortaron en bloques de 2 mm utilizando un procesador de tejido Shandon Citadle 1000, se cortaron en secciones de 6 µ ? utilizando un bisturí y se montaron en portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina. Las secciones después se procesaron con tinción Cresyl Fast Violet (CFV).

Régimen de dosis El anticuerpo monoclonal anti-MAG y el anticuerpo de control del isotipo I g G 1 se dializaron contra cloruro de sodio al 0.9% estéril durante la noche, y se concentraron apropiadamente. Estudio 1: Los animales recibieron 2.5 µ9 de anti-MAGmab o 2.5 µg de IgG de ratón i.c.v., 1, 24 y 72 horas después de MCAO (5 ul por dosis). Estudio 2: Los animales recibieron 200 9 de mab anti-MAG o 200 9 de IgG de ratón i.v., 1 y 24 horas después de MCAO. El investigador fue incapaz de ver la Identidad de cada solución de dosificación.

Análisis Neurológico Antes de la inducción de isquemia cerebral, las ratas para el Estudio 1 recibieron entrenamiento en para caminar en la viga y la prueba de la etiqueta pegajosa. Los animales que no lograron el criterio en ambas pruebas fueron excluidas del estudio adicional. Después del entrenamiento, el resto de los animales fueron estratificados de acuerdo con el rendimiento en dos grupos balanceados. A lo largo del análisis neurológico, los investigadores fueron incapaces de ver el grupo de tratamiento del animal.

Prueba de la etiqueta Pegajosa Bilateral La prueba de la etiqueta pegajosa bilateral (Schallert y otros, Pharmacology Biochemistry and Behaviour 16: 455-462, (1983)) se utilizó para evaluar negligencia contralateral/tendencia ipsilateral. Esto modela la extinción táctil observada en pacientes con derrame cerebral (Rose y otros, 1994). Esta prueba ha sido descrita en detalle previamente (Hunter, y otros, Neuropharmacology 39: 806-816 (2000); Virley y otros Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 20: 563-582 (2000)). Brevemente, una etiqueta de papel pegajosa, redonda se colocó firmemente alrededor del área sin pelo de las patas delanteras con una igual presión con el fin de colocarla aleatoriamente (izquierda, derecha). Las sesiones de entrenamiento fueron conducidas durante 6 días antes de MCAO, los datos del día 6 se utilizaron como la línea de base pre-operativa (Día 0). Se les dieron a los animales evaluaciones 24 y 7 días después de MCAO, los datos representan una media para las dos evaluaciones. La latencia para contactar y remover las etiquetas se registró y se analizó utilizando la prueba logrank (Cox, J. Royal Statistical Society B 34: 187-220 (1972)).

Moverse a lo largo de la viga Moverse a lo largo de la viga se utilizó como una medida de coordinación de la pata delantera y la pata trasera a través de medios de distancia viajada a través de una viga elevada a 100 cm (2.3 cm de diámetro, 48 cm del piso) como se describió previamente en detalle (Virley y otros, Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 20: 563-582 (2000)). Las ratas se entrenaron para cruzar la viga desde el inicio hasta el fin. A partir de las pruebas, cada a cada rata se le hicieron dos evaluaciones a 24 horas y 7 días después de MCAO, los datos representan una media de las dos evaluaciones. El análisis estadístico fue ANOVA seguido por la prueba t de Student.

La puntuación neurológica de 27 puntos (Estudio-1 ) Este estudio consiste de una batería de pruebas para evaluar el estado neurológico incluyendo, colocación de la pata, alcanzar la pata trasera visual, barra horizontal, rotación contra lateral, plano inclinado, reflejo corregido, reflejo contra lateral, motilidad y condición general, como se describió previamente (Hunter, y otros, Neuropharmacology 39: 806- 816 (2000)) con la adición de mediciones de la resistencia al agarre (puntuaciones de 2 para un agarre de la pata trasera derecha bueno, 1 para el agarra débil). Puntuación total= 27 para un animal normal. Para el estudio 2 esta prueba se modificó adicionalmente: Resistencia de agarre - puntuaciones normales 3, bueno - 2, débil -1, muy débil - 0; Motilidad - puntuaciones normales 4, excelente - 3, muy bueno - 2, bueno - 1, promedio - 0; Condición general: puntuaciones normales 4, excelente - 3, muy buena - 2, buena -1, promedio - 0; Girando - ninguna puntuación 5, puntuaciones de un lado a favor 4, círculo grande - 3, círculo medio -2, círculo pequeño -1, girando - 0). Puntuación total = 32 para un animal normal. En ambos estudios los animales se probaron 1, 24, 48 horas y 7 días después de MCAO, un animal con salud normal tuvo una puntuación de 27 o 32 respecti amente. Los datos se presentan como valores medios, el análisis estadístico fue Kruskil Wallis ANOVA.

Evaluación de lesión Estudio 1- Para cada animal, las áreas de la lesión fueron evaluadas en secciones de tres niveles predeterminados en el cerebro (0, -2.0 y -6.0 mm desde el vértice respectivamente). El daño neuronal se evaluó utilizando tinción cresyl fast violet y el área del daño se midió utilizando el paquete formador de imágenes Optimas 6.1. Los datos se expresaron como el área media (mm2) ± sem. Estudio 2 - Para cada animal, las áreas de la lesión se evaluaron en secciones de siete niveles predeterminados en el cerebro ( + 3 mm, a -8 mm w.r.t. vértice). El daño neuronal se evaluó utilizando tinción cresyl fast violet y el área del daño se midió utilizando el paquete formador de imágenes Optimas 6.1. Los datos se expresaron como el área media (mm2) ± sem.

Resultados Estudio 1 - Administración ventricular i ntra-cerebral (i.c.v.) de mab anti-MAG Puntuación neurológica Una hora después de MCAO los animales en ambos grupos del tratamiento mostraron un deterioro marcado en la puntuación neurológica (puntuación media 12 en cada grupo). No hubo una diferente significati a entre los grupos en este momento. Sin embargo, 24 (p = 0.02), 48 (p = 0.005) horas y 7 días (p = 0.006) después de MCAO los animales tratados con mab anti-MAG (2.5 ng, 1, 24 y 72 horas después de MCAO) mostraron una puntuación Neurológica Total significativamente mejorada comparada con aquellos tratados con IgG de control. Las puntuaciones neurológicas medias 24, 48 horas y 7 días después de MCAO en el grupo tratado con IgG, fueron 15, 14, y 18 respecti amente comparado con 19.5, 21.5 y 22 en los animales tratados con mab anti-MAG. En un análisis adicional de los comportamientos individuales que comprende la puntuación total, este significativo mejoramiento fue principalmente atribuido al rendimiento mejorado en las siguientes pruebas: colocación de la pata (24 horas, p = 0.045; 48 horas, p = 0.016; 7 días, p = 0.008), resistencia del agarre (24 horas, p = 0.049; 48 horas, p = 0.0495; 7 días, p = 0.243), motilidad (24 horas, p = 0.199; 48 horas, p = 0.012; 7 días, p = 0.067), barra horizontal (24 horas, p = 0.065; 48 horas, p = 0.005; 7 días, p = 0.016), plano inclinado (24 horas, p = 0.006; 48 horas, p = 0.006; 7 días, p = 0.169), alcanzar la pata trasera visual (48 horas, p = 0.049; 7 días, p = 0.008) y el grado de giro (24 horas, p = 0.417; 48 horas, p = 0.034; 7 días, p = 0.183).

Caminar sobre la viga Antes de la cirugía todos los animales se entrenaron para cruzar la viga (100 cm). Veinticuatro horas después de la cirugía hubo un significativo deterioro en la distancia viajada en la viga tanto en los animales tratados con anti- AG (50+18 cm) como con Igd (22±14 cm) comparado con los valores pre-operativos. Aunque no fue importante, los anímales tratados con anti-MAG mostraron un mejoramiento marcado sobre los animales tratados con IgG, en que éstos viajaron el doble de la distancia de los animales tratados con IgG, 24 horas después de tMCAO. Siete días después de la cirugía sin embargo, mientras ambos grupos mostraron un mejoramiento marcado durante el tiempo, el rendimiento de los anímales tratados con IgG permaneció significativamente deteriorado comparado con la línea de base (55-15 crn; p = 0.005). En contraste sin embargo, 7 días después de MCAO, los animales tratados con mab anti-MAG (25 pg 1, 24 y 72 horas, i.c.v. después de MCAO) el rendimiento no fue significativamente diferente de la linea de base (75r15 cm; p = 0.07). Estos datos muestran que tratamiento mab anti-MAG acelera la recuperación de esta tarea de caminar en la viga comparado con controles tratados con IgG, de ratón.

Etiqueta pegajosa Antes de la cirugía, los animales en cada uno de los grupos de tratamiento fácilmente contactaron y removieron las etiquetas de cada pata trasera, no hubo una diferencia importante en los grupos antes del tratamiento (Cuadro 1). Veinticuatro horas y 7 días después de MCAO la latencia para contactar la pata izquierda en cada uno de los grupos de tratamiento permaneció relativamente sin alteraciones, mientras que aquel de la derecha fue marcadamente incrementado. Sin embargo no hubo diferencias importantes entre los tiempos de remoción en los animales tratados con anti-MAG e IgG,. Además, 24 horas después de MCAO, la latencia para la remoción de tanto la pata trasera izquierda como de la derecha se incremento significativamente en ambos grupos del tratamiento comparado con la línea de base, sin embargo en los animales tratados con anti-MAG la latencia para la remoción de la pata trasera fue significativamente más corta que aquella de los animales tratados con IgG, (p = 0.03). También hubo una tendencia hacia la latencia reducida para la remoción de la pata trasera en animales tratados con anti-MAG comparado con aquellos tratados con IgG, (p = 0.08 (Cuadro 1). A 7 días hubo algún grado de recuperación en los animales tratados con I g G ! en que la latericia a los tiempos de la remoción para cada pata trasera fue reducida comparada con aquellos a las 24 horas (Cuadro 1). Estos datos sugieren que el tratamiento de ratas con mab anti-MAG acelera la recuperación en esta prueba de la etiqueta pegajosa después de t CAO.

CUADRO 1 Datos de la etiqueta pegajosa (*P = 0.03 anti-MAG vs IgG, utilizando la prueba de logrank) Mediciones del área del daño La administración de mab anti-MAG i.v.x. significativamente reduce el área de la lesión en dos de los tres niveles del cerebro examinados comparados con aquellos animales tratados con cantidades iguales de IgG, de ratón, cuando se examinaron 7 días después de tMCAO (Cuadro 2).

CUADRO 2 (*p = 0.02, *p=0.03, *p=0.06, antí-MAG contra Igd , Una dirección, Prueba t de Students no deteriorada.

Estudio 2. Administración intravenosa (i.v.) Puntuación neurológica Una y 24 hora después de MCAO los animales en ambos grupos mostraron un deterioro marcado en la puntuación neurológica. No hubo una diferencia significativa entre los grupos en este momento, las puntuaciones medias 24 horas después del tratamiento mab anti-MAG e IgGt fueron de 20 y 18 respecti amente (p = 0.5). Cuarenta y ocho horas después de MCAO, los animales se trataron con mab anti-MAG (200 ug, i.v., 1 y 24 horas después de MCAO) mostraron un mejoramiento significativo en la colocación de la pata (p = 0.048) y la resistencia del agarre (p = 0.033). Siete días después del comienzo de la isquemia cerebral los animales tratados con mab anti-MAG continuaron mejorando (colocación de pata p = 0.041; resistencia de agarre, p = 0.048; motilidad, p = 0.05) y mostraron un mejoramiento significativo en la puntuación neurológica total (puntuación media 25) comparada con aquellos tratados con IgG, de ratón (puntuación media 23, p = 0.047).

Mediciones del área de la lesión El anticuerpo anti -MAG cuando se administró MCAO i.v. significativamente redujo el área de la lesión en 5 de 7 niveles de cerebro predeterminados ( + 3 a -8 mm w.r.t. Vértice) comparado con los controles de isotipo. cuando se examinaron 7 días después de MCAO. *p<0.05 - Prueba t de Students una dirección, no deteriorada.

Conclusiones Un anticuerpo monoclonal anti-MAG administrado ya sea directamente dentro de CSF o intravenosamente después de la oclusión de la arteria cerebral media temporal en la rata, ambas reducen el área de la muerte de célula y mejoran la recuperación funcional comparado con animales de control tratados. El grado de neuroproteccion visto en estos estudios sugiere que este efecto no puede ser atribuido al desarrollo de axones ya que esto no darla resultado en el ahorro de neuronas. El mejoramiento en la recuperación funcional visto 24 y 48 horas después de MCAO probablemente refleja el grado de neuroproteccion ofrecido por este anticuerpo comparado con los animales de control tratados. Sin embargo, a través del tiempo los animales parecen mejorar además, sugiriendo que el bloqueo de la actividad MAG también puede mejorar la recuperación funcional a través del tiempo. Los estudios presentados aquí proporcionan evidencia de que al bloquear las acciones de MAG se provee tanto neuroproteccion como recuperación funcional mejorada en un modelo de rata de derrame cerebral, y por consiguiente los anticuerpos anti-MAG proveen agentes terapéuticos potenciales para neutroprotección aguda y/o la promoción de recuperación funcional después del derrame cerebral. Las cantidades bajas de anticuerpo administradas a través de la ruta i.v. y los niveles de suero bajos resultantes del anticuerpo sugerirían concentraciones de anticuerpo extremadamente bajas en el cerebro debido a las limitantes de la barrera del cerebro sanguínea para la penetración del anticuerpo. Sorprendentemente, sin embargo, esto aún resulta en ambos, la neuroproteccion y la recuperación funcional mejorada que se observan. Los anticuerpos anti-MAG también tienen un uso potencial en el tratamiento de otros trastornos neurológicos en donde la degeneración de las células y/o fibras de nervio es aparente, tales como daño en la espina dorsal, daño en el cerebro traumático, neuropatía periférica, enfermedad de Alzheimer, demencias f ronto-tempora les (tauopatías), enfermedad de Parklnson, enfermedad de Huntington, y Esclerosis Múltiple. En los ejemplos que siguen las CDRs de anticuerpos quiméricos y humanizados descritos aquí son las CDRs del anticuerpo del ejemplo 1.

EJEMPLO 2 Anticuerpo quimérico Los anticuerpos alterados incluyen anticuerpos quiméricos que comprenden reglones variables que se derivan de una especie enlazada a regiones constantes de otras especies. Ejemplos de cadenas de inmunoglobulina antl-MAG quiméricas de ratón-ser humano de la invención se proveen en las Figuras 1, 2 y 3. Las quimeras de ratón-ser humano que utilizan reglones constantes I g G 1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM, IgD humanas pueden ser producidas, según las quimeras pueden asociar las regiones variables de ratón con regiones constantes de cadena pesada y ligera de especies no humanas. La Figura 1 (Sec ID No. 27) provee la secuencia de aminoácido de una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica en la cual la región variable de cadena pesada anti-MAG de murino está asociada con un secuencia de señal de secreción de inmunoglobulina funcional y con una forma alterada de la región constate I g G 1 humana, en la cual los residuos Kabat 248 y 250 han sido mutados a alanina con el fin de deshabilitar las funciones ejecutoras de unión a FcvRi y la proteína de complemento C1q (Duncan, A. R. y Winter, G. Localization of the Clq binding site on antibodies by surface scanning, Nature 332, 738-740, 1988. Duncan, A. R., Woolf, J. . , Partridge, L. J., Burton, D. R. y Winter, G. Localization of the binding site for human FcRt on IgG. Nature 332, 563-564, 1988). Dichas mutaciones se hacen opcionalmente con el fin de adaptar las propiedades de un anticuerpo alterado para lograr un efecto terapéutico particular, por ejemplo, la unión a y bloqueo de la función de un antigeno sin activar los mecanismos ejecutores Uticos. La Figura 2 (Sec ID No. 28) provee la secuencia de aminoácido de una cadena ligera de inmunoglobulina quimérica en la cual la región variable de cadena ligera anti- AG de murino está asociada con una secuencia de señal de secreción de inmunoglobulina funcional y con la región constante kappa humana. Similarmente, las regiones variables anti-MAG pueden estar asociadas con las regiones constantes de inmunoglobulina que carecen de mutaciones que deshabllitan las funciones ejecutoras. La Figura 3 (Sec ID No. 29) provee la secuencia de aminoácido de una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica en la cual la región variable de cadena pesada anti-MAG de murino está asociada con una secuencia de señal de secreción de inmunoglobulina funcional, y con un forma de tipo silvestre de la región constante IgG humana.

A partir de la información provista en las Figuras 1 a 3, los insertos de ADNc que codifican estas cadenas quiméricas pueden ser preparados a través de técnicas de biología molecular estándares bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. Brevemente, el código genético se utiliza para Identificar codones de nucleótido que codifican los aminoácidos deseados, creando una secuencia de ADNc virtual que codifica la proteína quimérica. Si el inserto de ADNc se desea que sea expresado en un organismo particular, entonces los codones particularmente preferidos pueden ser seleccionados de acuerdo con tendencias del uso del codón. La secuencia de nucleótido deseada entonces es sintetizada a través de medios de amplificación PCR de una plantilla que comprende traslapar oligonucleótidos sintéticos los cuales, como un contig, representan la secuencia deseada. El producto resultante también puede ser modificado a través de PCR o mutagénesis para anexar sitios de restricción para facilitar la clonación dentro de un plásmido adecuado para la expresión o manipulaciones adicionales.

EJEMPLO 3 Uniones del anticuerpo quimérico a MAG de rata en ELISA El anticuerpo anti-MAG quimérico que contiene las CDRs de cadena pesada y ligera de la invención se produjo a través de transfección temporal de células CHO. Para esto, se utilizó el reactivo de transfección Transfast (Promega: E2431) y transí ecciones llevadas a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En breve, se colocaron en placas aproximadamente 106 células CHO por cavidad en placas de cultivo de 6 cavidades. Al día siguiente se mezcló el ADN de vector de expresión de mamífero que codifica la cadena pesada o ligera apropiada a una relación de 1:1 (5 µ g de ADN total) en medio (Optimenl con Glutamax; Gibco #51985-026). El reactivo de transfección temporal se agregó y la solución se transfirió a cavidades con capas de célula confluentes. Después de 1 hora a 37°C en el incubador de células, la mezcla de ADN/Transfast se recubrió con 2 mi de medio Optimem y se dejó durante 48-72 horas en eí incubador. Los sobrenadantes se cosecharon, se purificaron a través de centrifugación y se pasaron a través de filtros de 0.2 µ?t?. La concentración de anticuerpo en el sobrenadante de cultivo de célula CHO se determinó a través de ELISA y se estimó como siendo de alrededor de 0.5 9/?t??. Para la unión de MAG, se utilizó AG-Fc de rata comercialmente disponible. Debido a la fusión con Fe humano los anticuerpos quiméricos de enlace no se pudieron detectar utilizando anticuerpos secundarios IgG antí-humanos. Más bien, se utilizó el anticuerpo especifico de cadena ligera kappa antihumano. La Figura 4 muestra que este anticuerpo quimérico se une a MAG aún a una dilución de 1/64. Un anticuerpo humanizado no relacionado y el sobrenadante de cultivo de células transfectadas mock no generaron ninguna señal en este ensayo.

Procedimiento: Se recubrieron placas de microtitulación ELISA (Nunc Maxisorp) con 1 µ g / m I de proteína de fusión MAG-Fc de rata (R&S Systems; 538-MG) en PBS a 4°C durante la noche. Las placas se lavaron dos veces con PBS y después se bloquearon con PBS/BSA (1% de p/v) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Los sobrenadantes de cultivo de células CHO transfectadas temporalmente se pasaron a través de filtros de 0.2 ?G? y se diluyeron serialmente en PBS/BSA iniciando en el sobrenadante nítido a una dilución de 1/64. Las diluciones de muestra se dejaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas después se lavaron tres veces con PBS/Tween 20 (0.1% v/v). El anticuerpo de detección fue conjugado de peroxidasa específico de cadena ligera kappa anti-humano de cabra (Sigma A-7164) diluido a 1/2000 en PBS/BSA. El anticuerpo de detección se incubó a durante 1 hora a temperatura ambiente y las placas se lavaron como anteriormente. La solución del substrato (Sigma Fast OPD P-9187) se agregó y se incubó hasta que se detectó el desarrollo del color apropiado y después se detuvo utilizando 3M de H2S04. El desarrollo del color se leyó a 490 nm.

EJEMPLO 4 Anticuerpos humanizados Los anticuerpos alterados incluyen anticuerpos humanizados que comprenden regiones variables humanizadas enlazadas a la regiones constantes humanas. Ejemplos de cadenas de inmunoglobulina anti-MAG humanizadas de la invención se proveen en la Figura 5. Los anticuerpos humanizados utilizando las reglones constantes I g G 1 , lgG2, lgG3, lgG4, I g A , IgE, IgM, IgD pueden ser producidas. La Figura 5 (Sec ID No: 30) provee un ejemplo de la secuencia de aminoácido de una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada en la cual la región variable de cadena pesada anti-MAG humanizada está asociada con una secuencia de señal de secreción de inmunoglobulina funcional, y con una forma alterada de la región constante I g G 1 humana, en la cual los residuos Kabat 248 y 250 han sido mutados a alanina con el fin de deshabilitar las funciones ejecutoras de unión a FcyRI y la proteína de complemento C1q (Duncan, A. R. y Winter, G. Localization of the Clq binding site on antibodies by surface scanning, Nature 332, 738-740, 1988. Duncan, A. R., Woolf, J. M. , Partridge, L. J., Burton, D. R. y Winter, G Localization of the binding site for human FcRt on IgG. Nature 332, 563-564, 1988). Dichas mutaciones se hacen opcionalmente con el fin de adaptar las propiedades de un anticuerpo alterado para lograr un efecto terapéutico particular, por ejemplo, la unión a y bloqueo de la función de un antígeno sin activar los mecanismos ejecutores líticos. La Figura 5 (Sec ID No. 31) provee la secuencia de aminoácido de una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada en la cual la región variable de cadena ligera anti-MAG humanizada está asociada con una secuencia de señal de secreción de inmunoglobulina funcional y con la región constante kappa humana. Similarmente, las regiones variables anti-MAG pueden estar asociadas con las regiones constantes de inmunoglobulina que carecen de mutaciones que deshabilitan las funciones ejecutoras. La Figura 5 (Sec ID No. 32) provee la secuencia de aminoácido de una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada en la cual la región variable de cadena pesada anti-MAG humanizada está asociada con una secuencia de señal de secreción de inmunoglobulina funcional, y con un forma de tipo silvestre de la región constante I g G 1 humana.

A partir de la información provista en la Figuras 5, los insertos de ADNc que codifican estas cadenas humanizadas pueden ser preparados a través de técnicas de biología molecular estándares bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. Brevemente, el código genético se utiliza para identificar codones de nucleótido que codifican los aminoácidos deseados, creando una secuencia de ADNc virtual que codifica la proteína. Si el inserto de ADNc se desea que sea expresado en un organismo particular, entonces los codones particularmente preferidos pueden ser seleccionados de acuerdo con tendencias del uso del codón. La secuencia de nucleótido deseada entonces es sintetizada a través de medios de amplificación PCR de una plantilla que comprende traslapar oligonucleótidos sintéticos los cuales, como un contig, representan la secuencia deseada. El producto resultante también puede ser modificado a través de PCR o mutagénesis para anexar sitios de restricción para facilitar la clonación dentro de un plásmido adecuado para la expresión o manipulaciones adicionales.

EJEMPLO 5 Unión de Anticuerpos anti-MAG humanizados a MAG de rata y de ser humano en Elisa 1) Unión directa de ELISA a proteina de fusión MAG-Fc de rata de cantidades normalizadas del sobrenadante de cultivo para 9 combinaciones de cadena pesada y ligera humanizadas Los anticuerpos anti-MAG humanizados que contienen las CDRS de cadena ligera y pesada de la invención se produjeron a través de la transfección temporal de células CHO. Para esto, se utilizó el reactivo de transfección Transfast (Promega: E2431) y transfecciones llevadas a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En breve, se colocaron en placas apro imadamente 106 células CHO por cavidad en placas de cultivo de 6 cavidades. Al dia siguiente se mezcló el ADN de vector de expresión de mamífero que codifica la cadena pesada o ligera apropiada a una relación de 1 :1 (5 ug de ADN total) en medio (Optimenl con Glutamax; Gibco #51985-026). El reactivo de transfección temporal se agregó y la solución se transfirió a cavidades con capas de célula confluentes. Después de 1 hora a 37°C en el incubador de células, la mezcla de ADN/Transfast se recubrió con 2 mi de medio Optimem y se dejó durante 48-72 horas en el incubador. Los sobrenadantes se cosecharon, se purificaron a través de centrifugación y se pasaron a través de filtros de 0.2 um. Se produjeron 9 combinaciones de cadena variable ligera y pesada de las secuencias mostradas en el siguiente cuadro y las regiones constantes de cadena pesada de I g G 1 fueron funcionales de acuerdo con la Sec. ID.

La concentración del anticuerpo se determinó a través de ELISA y las cantidades de sobrenadante utilizadas en los ensayos normalizados a una concentración de 250 o 500 ng/ml (dependiendo de la concentración del sobrenadante de cultivo). Como antígeno, se utilizó rat AG-Fc comercialmente disponible (R&Systems; 538- G). Debido a la fusión de este antígeno con Fe humano, los anticuerpos quiméricos unidos no pudieron ser detectados utilizando anticuerpos secundarios IgG anti-humanos generales. Más bien, se utilizó el anticuerpo específico de cadena ligera kappa anti-humano. La Figura 6 muestra que los 9 anticuerpos humanizados examinados se unieron a MAG de rata con curvas de unión muy similares de forma descendente a aproximadamente 4 ng/ml. El anticuerpo quimérico utilizado como una referencia mostró características de unión que caen dentro del grupo de los anticuerpos humanizados examinados aquí. Aunque no es absoluto, esto puede sugerir que las afinidades de los anticuerpos humanizados examinados aquí yacen muy cerca dentro del rango de afinidad del anticuerpo quimérico no humanizado utilizado como una referencia aquí.

Procedimiento Se recubrieron placas axisorp de 96 cavidades durante la noche a 4°C con proteína de fusión MAG-Fc de rata (1 jig/ml; R&D Systems; No. Cat. 538- G) en PBS: Las placas se lavaron dos veces con PBS conteniendo Tween20 (0.1% v/v; PBST) y se bloquearon con PBS conteniendo BSA (0.1% p/v) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Las cantidades variables de sobrenadantes de cultivo se diluyeron de forma serial en regulador de pH de bloqueo y se agregaron a las cavidades bloqueadas iniciando a roximadamente a 500 o 250 ng/ml. Las concentraciones de anticuerpo del sobrenadante se basaron en ensayos independientes midiendo la cantidad de anticuerpo humanizado presente en cada sobrenadante de cultivo. El anticuerpo de ratón-ser humano quimérico (no humanizado) también se incluyó como referencia. Las muestras de anticuerpo se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y las placas después se lavaron tres veces con PBST. El anticuerpo secundario (conjugado de peroxidasa específico de cadena ligera anti-humano de cabra; Sigma A-7164) se agregó a una dilución de 1/5000 en regulador de pH de bloqueo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavaron tres veces como anteriormente y la unión se detectó a través de la adición del substrato (tabletas OPD disueltas de acuerdo con las instrucciones; Sigma P-9187). El desarrollo del color se monitoreó y la reacción se detuvo utilizando 3M de H2S04. El desarrollo del color se leyó a 490 nm. 2) Unión directa de ELISA a proteína de fusión MAG-Fc de rata de dos combinaciones de cadena pesada-ligera del anticuerpo anti-MAG humanizado purificado Dos anticuerpos humanizados que consisten de combinaciones de la región variable de cadena pesada y ligera BVh1/Cvl1 y BVh3/CVI3 (cuadro Figura 5) y una región constante I g G 1 mutada se ejemplificaron a través de SEC.I.D.NO: 30 (la cual es I g G 1 mutado BVh1/CVM , aquellos con experiencia en la técnica pueden fácilmente derivar la secuencia del equivalente BVh3/CVI3) se produjeron a través de una versión escalada hacia arriba de la transfecclón temporal descrita en el Ejemplo 3 y purificada utilizando cromatografía de afinidad de proteina A. El material del anticuerpo purificado se dializó contra PBS y la concentración se determinó a través de la lectura OD280. Las concentraciones del anticuerpo se ajustaron a 5000 ng/ml y se utilizaron como diluciones seriales en MAG-FC de rata uniéndose a ELISA. La Figura 7 muestra que el material de anticuerpo purificado se une a MAG-Fc de rata y que ambas combinaciones de la región variable de cadena pesada y ligera probadas aquí son extremadamente similares.

Método: Se recubrieron placas Maxisorp Nunc de 96 cavidades durante la noche a 4°C con proteina de fusión MAG-Fc de rata (2.5 ug/ml; R&D Systems; No. Cat. 538-MG) en PBS: Las placas se lavaron dos veces con PBS conteniendo Tween20 (0.1% v/v; PBST) y se bloquearon con PBS conteniendo BSA (0.1% p/v) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). El anticuerpo humanizado purificado se ajustó a una concentración inicial de 5 µ9/??? en regulador de pH de bloqueo y después se diluyó serialmente. Las muestras del anticuerpo se incubaron 1 hora a temperatura ambiente y las placas se lavaron 3 veces con PBST. El anticuerpo secundario (conjugado de peroxidasa específico de cadena ligera anti-humano de cabra; Sigma A-7164) se agregó a una dilución de 1/5000 en regulador de pH de bloqueo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavaron tres veces como anteriormente y la unión se detectó a través de la adición del substrato (tabletas OPD disueltas de acuerdo con las instrucciones; Sigma P-9187). El desarrollo del color se monitoreó y la reacción se detuvo utilizando 3M de H2S04. El desarrollo del color se leyó a 490 nm.

Resultados: Ambos anticuerpos humanizados purificados que llevaron ninguna o varias mutaciones de estructura mostraron una unión extremadamente similar a MAG de rata. Los resultados se ven en la Figura 7. 3) Unión a MAG humano expresado en células CHO de cantidades normalizadas de sobrenadante de cultivo de dos combinaciones de cadena pesada y ligerea humanizadas Las mismas combinaciones de cadena pesada y ligera variables humanizadas descritas en el Ejemplo 5 2) fueron probadas como sobrenadantes de cultivo purificados contra MAG humano expresado en la superficie de células CHO. La cantidad de sobrenadante de cultivo utilizada para cada anticuerpo fue normalizada en base a las concentraciones del anticuerpo determinadas por ELISA. Para esto, se recubrieron placas de 96 cavidades (Nunc Maxisorp) durante la noche a 4"C con cadena IgG (gama) anti-humano de cabra (Sigma I-3382; en regulador de pH de bicarbonato pH 9.6; 2 ng/ml). Al día siguiente, las placas se lavaron dos veces con regulador de pH de lavado (PBST) y se bloquearon a través de la adición de por lo menos 75 µ? de regulador de pH de bloqueo (PBS conteniendo BSA 1% p/v) durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución de muestra del anticuerpo se diluyó de forma serial en regulador de pH de bloqueo (iniciando con una dilución pura o ½ ) en duplicado. El estándar Ab fue anticuerpo I g G 1 humanizado purificado de una especificidad no relacionada y concentración conocida. La solución estándar también se diluyó de forma serial a través de las placas iniciando a 500 ng/ml. Todas las soluciones de anticuerpo se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces como anteriormente y después se incubaron con conjugado de peroxidasa específico de cadena (libre y enlazado) ligera (kappa) anti-humana de cabra (Sigma; A-7164) a 1/5000 en regulador de ph de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se volvieron a lavar tres veces como anteriormente y se incubaron con una solución de substrato (tabletas OPD; Sigma P-9187 utilizando desarrollo de color fuerte). El desarrollo del color se detuvo a través de la adición de 25 µ? de 3M de H2S04 y la placa se leyó a 490 nm. La Figura 8 muestra que ambos anticuerpos probados aquí reconocen MAG humano y son muy similares en sus características de unión. CHO/- son controles negativos de células CHO con no MAG expresado.

Método para ELISA basado en células Eu Se rellenaron placas de 96 cavidades (Costar 3595) con 100 µ? de suspensión de célula/cavidad (ver cuadro siguiente para el número de células recomendado para llevar a cabo el ensayo en los días , 2, 3, o 4).

Día Número de célula/ml 1 3 x 105 2 1 x 105 3 5 x 104 4 1 x 104 El medio de cultivo se removió y las placas se removieron con DMEM/F12 (Sigma D6421), conteniendo FCS (10%), BSA (1%), Na N3 (1%; regulador de pH de bloqueo) durante 1 hora temperatura ambiente. La solución de bloqueo después se removió y se agregó la muestra (en regulador de pH de bloque 50 µ?/cavidad). Las muestras se incubaron a 4°C durante 1 hora. Las placas después se lavaron tres veces con PBS utilizando un lavador de placas Skatron. Después del lavado, las células se fijaron con 5% de paraformaldehído (diluido en PBS) durante 20 minutos a 4°C y se volvieron a lavar como anteriormente. Se agregaron 50 µ?/cavidad de anticuerpo secundario conjugado de Europio diluido en regulador de pH de Europio (50 mM base Tris, 150 mM de NaCI, 0.5% de BSA, 0,1 g/l, Tween20, 7.86 mg/l de DTPA a un pH de 7.3) y se incubaron durante 1 hora a 4°C. A las placas lavadas como se mencionó anteriormente se le agregaron 200 µ? de mejorador Delphia de solución/cavidad. La solución se incubó a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Las cavidades se leyeron dentro de las 24 horas en un Víctor. 4) Competición de ELISA para la unión a proteína de fusión MAG-Fc de rata de dos anticuerpos humanizados purificados y el anticuerpo monoclonal de ratón no humanizado Método: Se recubrieron placas axisorp Nunc de 96 cavidades durante la noche a 4°C con proteína de fusión MAG-Fc de rata (2.5 µ?/???; R&D Systems; No. Cat. 538-MG) en PBS: Las placas se lavaron dos veces con PBS conteniendo Tween20 (0.1% v/v; PBST) y se bloquearon con PBS conteniendo BSA (0.1% p/v) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). El anticuerpo humanizado purificado se ajustó a una concentración inicial de 200 ng/ml y se mezcló a un volumen igual con moléculas competidoras hechas en regulador de pH de bloqueo en la escala de 6000 a 0 ng/ml. Las competidoras fueron ya sea anticuerpo monoclonal de ratón parenteral (anti-MAG) o un anticuerpo monoclonal de ratón no relacionado (INN1) a las mismas concentraciones (BVh1/CVI1 solo). Las soluciones de anticuerpo/ competidora se incubaron durante 1 hora temperatura ambiente y las placas después se lavaron tres veces con PBST. El anticuerpo secundario (conjugado de peroxidasa especifico de cadena ligera anti-humano de cabra; Sigma A-7164) se agregó a una dilución de 1/5000 en regulador de pH de bloqueo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavaron tres veces como se mencionó anteriormente y la unión se detectó a través de la adición del substrato (tabletas OPD disueltas de acuerdo con las instrucciones; Sigma P-9187). El desarrollo del color se midió a 490 nm.

Resultados: Ambas preparaciones de anticuerpo purificado compiten ¡gualmente a través del anticuerpo monoclonal de ratón original pero no a través de un anticuerpo monoclonal de ratón que tiene una especificidad no relacionada, ver Figura 9. Esto muestra que el anticuerpo monoclonal de ratón original y los anticuerpos humanizados probados aquí probablemente reconocen el mismo epítopo y posiblemente tienen afinidades muy similares a AG de rata .

Claims (26)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo alterado o fragmento funcional del mismo que se une a y neutraliza MAG y que comprende una o más de las 5 siguientes CDRs. CDRs de cadena ligera CDRs de cadena pesada 5

2. Un anticuerpo alterado o fragmento funcional del mismo que (1 comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una o más CDRs seleccionadas de CDRH1, CDRH2, y CDRH3 y/o un dominio variable de cadena ligera que comprende una o más CDRs seleccionadas de CDRL1, CDRL2, y CDRL3. 3. Un anticuerpo anti-MAG alterado o fragmento funcional del 5 mismo que comprende: un dominio variable de cadena pesada ( V H ) que comprende regiones hipervariables en secuencia CDRH1 , CDRH2 y CDRH3 y/o un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende regiones hipervariables en secuencia CDRL1 , CDRL2 y CDRL3. 4. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, el cual es monoclonal. 5. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4, el cual es humanizado. 6. Un anticuerpo o fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una de las siguientes secuencias de aminoácido: QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEW MGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEPTAVYYCA RNPI NYYGI NYEG Y MDYWGQGTLVTVSS (SEC ID No 13).

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGM WVRQAPGQGLEW GWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCA RNPI NYYGI NYEGYVMDYWGQGTLVTVSS (Secuencia ID No 14)

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYG NWVRQAPGQGLEW GWINTYTGEPTYADDFTGRF FSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYFCA RN PIN Y YGI NYEGYVMDYWGQGTLVTVSS (Secuencia ID No 15) 7. Un anticuerpo o fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 6, que además comprende una región variable de cadena ligera que comprende la Secuencia de aminoácido ID No 16, 17, 18 o 19; DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC SSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYLS SLTFGQGTKLEIKRTV (SEC ID No 16)

DI VMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIINLQAEDVAVYYCHQYLS SLTFGQGTKLEIKRTV (SEC ID No 12) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLHTEDVAVYYCHQYLS SLTFGQGTKLEIKRTV (SEC ID No 18)

DIV TQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIINLHTEDVAVYYCHQYLS SLTFGQGTKLEI RTV (SEC ID No 19) 8. Un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 6-7, que comprende: un fragmento variable de cadena pesada que comprende SEC

ID No 13, 14 o 15 y una parte constante del fragmento del mismo de una caáena pesada humana y un fragmento variable de cadena ligera que comprende SEC ID

No. 16, 17, 18 o 19 y una parte constante o fragmento del mismo de una cadena ligera humana. 9. Un anticuerpo humanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes seleccionado de los anticuerpos que comprenden: Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 13 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 16; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 13 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 17; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 13 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 18; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID

No 13 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 19; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 14 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 16; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 14 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 17; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 14 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID

No 18; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 14 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 19; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID

No 15 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 16; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 15 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 17; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 15 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 18; Una región variable de cadena pesada que comprende Sec ID No 15 y una región variable de cadena ligera que comprende Sec ID No 19. 10. Un po I i n u cleót id o que codifica la región variable de cadena pesada que comprende la Secuencia Id No. 15. CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAG AAGCCTGGGGC CTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGTTCTGGATACACCTTCACTAACTAC GGC ATG AACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGG AT GGGATGGATC AAC ACCTAC ACCGGCG AGCCC ACCTACGCCG ACGAC TTCACCGGCCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGC ATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCACCTATTT CTGTGCGAGAAACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCT

ACGTG ATGG ACT ACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA 11. Una secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácido ID No 14 es: CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGC CTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCCTGGATACACCTTCACTAACT ACGGCATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTG GATGGGATGG ATC AAC ACCTAC ACCGGCGAGCC ACCTACGCCGAAC GACTTCACGGCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCRGTCAGCACG GCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTAT TTCTGRGCGAGAAAACCC ATCAACTACTACGGCATC AACTACG AGGG CTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCT CA 12. Una secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácido ID No 15 es: CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGC CTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGTTCTGGATACACCTTCACTAACTAC GGCATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGAT GGGATGG ATC AAC ACCTAC ACCGGCGAGC CC ACCTACGCCGACG AC TTCACCGGCCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGC ATATCTGC AG ATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGG ACACTGCC ACCT ATTT CTGTGCGAGAAACCCC ATCAACTACTACGGCATC AACTACG AGGGCT ACGTG ATGG ACT ACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTC A

13. Un polinucleótido que codifica la Secuencia de aminoácido Id No 16 es: GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTGTA CAGCAGCAACC AGAAG AACTACCTTGGCCTGGTACCAGGCAGAAACC AGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGC ATCTACCDCGGGAA TCCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATT TCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATT ACTGTCACCAGACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGC TGGAGATCAAACGTACGGTG

14. Un polinucleótido que codifica la Secuencia de aminoácido Id No 17 es: GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAATCTGCAAG AGCAGCC ACAGCGTGCTGTAC AGCAGCAACCAGAAGAACTACCTTGGCCTGGCCAAGCAGAAACCAG GACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGG AATCC GGGGTCCCTGACCCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCA CTCTCACCATCATACCACCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTA CTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAAGGGGACCAAG CTGGAGATCAAACGTACGGTG (SEC ID No 24)

15. Un polinucleótido que codifica la Secuencia de aminoácido Id No 18 es: GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAG AGG G CC ACCATCAACTGAAG AGCAGCC ACAGC GTFCTG TAC AG C AGCAACC AGAAG AACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGAC AGCCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGC ATCTACCCGGGAATCCGG GGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTC TCACCATCAGCAGCCTGCACACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTC ACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAG ATCAAACGTACGGTG

16. Un polinucleótido que codifica la Secuencia de aminoácido Id No 15 es: GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGG CGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTAC AGCAGC AACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAG GACAGCCCTCCTAAG CTGCTCATTTACTGGGC ATCTACCCGGGAATC CGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCA CTCTCACCATCATCAACTGCACACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTG TCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGG AG ATCAAACGTACGGTG

17. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-MAG alterado o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1-8 junto con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.

18. Un método para el tratamiento o profilaxis de derrame cerebral u otras enfermedades/trastornos neurológicos en un ser humano, que comprende la administración a dicho ser humano en la necesidad del mismo de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-MAG, de acuerdo con las reivindicaciones 1-8 incluyendo anticuerpos alterados o un fragmento funcional de los mismos.

19. El uso de un anticuerpo anti-MAG de acuerdo con las reivindicaciones 1-8, incluyendo anticuerpos alterados o un fragmento funcional de los mismos, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de derrame cerebral u otras enfermedades/trastornos neurológicos.

20. Un método para inhibir la neurodegeneración y/o promover la recuperación funcional en un paciente ser humano que sufre, o está en riesgo de desarrollar, un derrame cerebral u otras enfermedades/trastornos neurológicos que comprende administrar a dicho ser humano en la necesidad del mismo una cantidad efectiva de un anticuerpo antl-MAG de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, incluyendo anticuerpos alterados o un fragmento funcional de los mismos.

21. El uso de un anticuerpo anti-MAG de acuerdo con las reivindicaciones 1-8, incluyendo anticuerpos alterados o un fragmento funcional de los mismos, en la preparación de un medicamento para inhibir la neurodegeneración y/o promover la recuperación funcional en un paciente ser humano que sufre, o está en riesgo de desarrollar, un derrame cerebral u otras enfermedades/trastornos neurológicos.

22. Un método para el tratamiento o profilaxis de derrame cerebral u otras enfermedades/trastornos neurológicos en un ser humano que comprende el paso de la administración parenteral de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-MAG a dicho ser humano.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el anticuerpo anti-MAG se administra intravenosamente.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 18, 20 o 24, en donde las otras enfermedades/trastornos neurológicos se seleccionan del grupo que consiste de: daño traumático al cerebro, y daño a la espina dorsal, enfermedad de Alzheimer, demencias fronto-temporales (tauopatias), neuropatía periférica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, y esclerosis múltiple.

25. Un método para promover el desarrollo de axones que comprende el paso de poner en contacto un axón humano con un anticuerpo anti-MAG de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el método es in vitro.