PL211014B1 - Humanizowane przeciwciało anty-MAG, środek farmaceutyczny i zastosowanie tego przeciwciała - Google Patents

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 375405 (22) Data zgłoszenia: 05.08.2003 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

05.08.2003, PCT/EP03/008749 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

19.02.2004, WO04/014953 (11) 211014 (13) B1 (51) Int.Cl.

C07K 16/28 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) A61P 25/00 (2006.01)

Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy

Humanizowane przeciwciało anty-MAG, środek farmaceutyczny i zastosowanie tego przeciwciała

(30) Pierwszeństwo: 06.08.2002, GB, 0218230.1	(73) Uprawniony z patentu: GLAXO GROUP LIMITED, Greenford, GB
06.08.2002, GB, 0218232.7 06.08.2002, GB, 0218234.3 06.08.2002, GB, 0218229.3	(72) Twórca(y) wynalazku: JONATHAN HENRY ELLIS, Stevenage, GB
	VOLKER GERMASCHEWSKI, Stevenage, GB
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
28.11.2005 BUP 24/05	(74) Pełnomocnik:
	rzecz. pat. Sulima Zofia
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.03.2012 WUP 03/12	SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH spółka jawna

PL 211 014 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest humanizowane przeciwciało anty-MAG, zawierający je środek farmaceutyczny i zastosowanie tego przeciwciała do wytwarzania leku użytecznego w leczeniu i/lub profilaktyce chorób neurologicznych.

Przeciwciała według wynalazku stanowią zmienione przeciwciała, które wiążą glikoproteinę związaną z mieliną (MAG) oraz neutralizują jej działanie.

Udar jest główną przyczyną śmierci i niepełnosprawności w krajach zachodu. Brak jest zatwierdzonej terapii do leczenia udaru innej niż t-PA, która musi zostać podana w przeciągu trzech godzin od wystąpienia po analizie CT w celu wykluczenia krwotoku. Obecnie większość środków terapeutycznych do leczenia ostrego udaru (tj. neuroochronnych) obejmuje głównie środki ukierunkowane na receptory glutaminianu i ich efektorowe ścieżki przekazywania sygnału, co do których wiadomo, że są związane z ostrą śmiercią komórek. Jednakże dotychczasowe strategie te okazały się nieskuteczne w próbach klinicznych oraz często są związane z ograniczającymi dawkę skutkami ubocznymi (Hill i Hachinski, The Lancet, 352: (suplement III) 10-14 (1998)). Zatem istnieje potrzeba opracowania nowych rozwiązań skierowanych na zmniejszenie śmierci komórek po ustaniu przepływu krwi.

Zaraz po wystąpieniu udaru u wielu pacjentów obserwuje się pewien stopień spontanicznego odzyskania funkcji, co sugeruje, że mózg ma pewną (jakkolwiek ograniczoną) zdolność do naprawy i/lub przebudowania po urazie. Zatem środki, które wykazują zdolność pobudzania tego odzyskania funkcji umożliwiają wprowadzenie interwencji znacznie później (potencjalnie po kilku dniach) od wystąpienia niedokrwienia mózgu. Środki, które są w stanie zapewnić zarówno doraźne działanie neuroochronne, jak i pobudzić odzyskanie funkcji, mogą umożliwić osiągnięcie znaczących korzyści w porównaniu z obecnie dostępnymi potencjalnymi strategiami neuroochronnymi.

Mechanizmy leżące u podstaw odzyskania funkcji nie są obecnie znane. Jako możliwy mechanizm zaproponowano kiełkowanie uszkodzonych lub nieuszkodzonych aksonów. Jednakże chociaż badania in vivo wykazały, że leczenie czynnikami neurotropowymi urazu rdzenia kręgowego lub udaru powoduje pobudzenie odzyskania funkcji i stopnia kiełkowania aksonów, nie udowadnia to bezpośredniego związku pomiędzy stopniem kiełkowania aksonów a zakresem odzyskania funkcji (Jakeman i in., 1998, Exp. Neurol. 154:170-184, Kawamata i in., 1997, Proc Natl Acad. Sci. USA., 94:8179-8184, Ribotta i in., 2000, J Neurosci. 20:5144-5152). Ponadto, kiełkowanie aksonów wymaga żywych neuronów. Zatem w takich chorobach jak udar, który jest związany z rozległą śmiercią komórek, pobudzenie odzyskania funkcji po podaniu danego środka po udarze może zachodzić poprzez mechanizmy inne niż kiełkowanie aksonów, takie jak różnicowanie endogennych komórek macierzystych, aktywacja nadmiarowych szlaków, zmiany w rozmieszczeniu lub pobudliwości receptorów neuronów lub gleju (Fawcett i Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49:377-391, Horner i Gage, 2000, Nature 407:963-970).

Uważa się, że ograniczona zdolność ośrodkowego układu nerwowego (OUN) do naprawy po uszkodzeniu wynika częściowo z występowania w środowisku OUN cząsteczek, które wywierają hamujące działanie na kiełkowanie aksonów (wzrost neurytów). Uważa się, że mielina w OUN zawiera cząsteczki hamujące (Schwab ME i Caroni P (1988) J. Neurosci 8, 2381-2193). Dwa białka mielinowe, glikoproteinę związaną z mieliną (MAG) i Nogo sklonowano i zidentyfikowano jako przypuszczalne inhibitory wzrostu neurytów (Sato S. i in., (1989) Biochem. Biophys Res Comm 163, 1473-1480; McKerracher L i in., (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay G i in., (1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K i Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262; Schafer i in., (1996) Neuron 16, 11071113; WO 9522344; WO 9701352; Prinjha R i in., (2000) Nature 403, 383-384; Chen MS i in., (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre T i in., (2000) Nature 403, 439-444; US 005250414A; WO 200005364A1; WO 0031235).

Glikoproteina związana z mieliną jest transbłonową cząsteczką powierzchni komórki, eksprymowaną na powierzchni mieliny, składającą się z pięciu zewnątrzkomórkowych domen immunoglobulinowych, pojedynczej domeny transbłonowej i domeny wewnątrzkomórkowej. Ekspresja MAG jest ograniczona do mielinizującego gleju w OUN i obwodowym układzie nerwowym (PNS). Uważa się, że MAG oddziałuje z receptorem (receptorami) neuronalnym(i), które pośredniczą w oddziaływaniu na cytoszkielet neuronalny, włącznie z fosforylacją neurowłókien i hamowaniem wzrostu neurytów in vitro. Chociaż postulowano, że antagoniści MAG znajdują zastosowanie w poprawianiu kiełkowania aksonów po urazie (WO 9522344, WO 9701352 i WO 9707810), stwierdzenia te nie są poparte danymi in vivo. Ponadto rola MAG jako inhibitora kiełkowania aksonów z neuronów OUN in vivo nie została udowodniona (Li CM i in., (1994) Nature 369, 747-750; Montag, D i in.,

PL 211 014 B1 (1994) Neuron 13, 229-246; Lassmann H i in., (1997) GLIA 19, 104-110; Li C i in., (1998) J. Neuro. Res 51, 210-217; Yin X i in., (1998) J. Neurosci, 18, 1953-1962; Bartsch U i in., (1995) Neuron 15, 1375-1381; Li M i in., (1996) 46, 404-414).

Przeciwciała typowo zawierają dwa łańcuchy ciężkie, połączone ze sobą przez wiązania disulfidowe, oraz dwa łańcuchy lekkie. Każdy łańcuch lekki jest połączony z odpowiednim łańcuchem ciężkim wiązaniami disulfidowymi. Każdy łańcuch ciężki zawiera na jednym końcu domenę zmienną, po której występuje kilka domen stałych. Każdy łańcuch lekki zawiera domenę zmienną na jednym końcu i domenę stałą na swoim drugim końcu. Domena zmienna łańcucha lekkiego jest dopasowana do domeny zmiennej łańcucha ciężkiego. Domena stała łańcucha lekkiego jest dopasowana do domeny stałej łańcucha ciężkiego. Domeny stałe łańcuchów lekkiego i ciężkiego nie są bezpośrednio związane z wiązaniem przeciwciała z antygenem.

Domeny zmienne każdej pary łańcuchów lekkiego i ciężkiego tworzą miejsce wiążące antygen. Dwie domeny zmienne łańcuchów lekkiego i ciężkiego mają taką samą ogólną strukturę, przy czym każda domena zawiera cztery regiony zrębowe, których sekwencje są stosunkowo konserwatywne, połączone przez trzy regiony determinujące dopasowanie (regiony CDR), często nazywane regionami hiperzmiennymi. Cztery regiony zrębowe w dużym stopniu przyjmują konformację β-kartki, a regiony CDR tworzą pętle łączące i w niektórych przypadkach tworzą część struktury β-kartki. Regiony CDR są utrzymywane w bliskim sąsiedztwie przez regiony zrębowe z regionami CDR drugiej domeny, co tworzy miejsce wiążące antygen. Regiony CDR i regiony zrębowe przeciwciał można określić przez odniesienie do Kabat i in. („Sequences of proteins of immunological interest US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987).

Obecnie stwierdzono, że opisane przeciwciało monoklonalne anty-MAG (Poltorak i in., (1987) Journal of Cell Biology 105, 1893-1899, DeBellard i in., (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tang i in., (1997) Mol. Cell, Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K i Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254262) oraz dostępne w handlu (MAB1567 (Chemicon)), podawane bezpośrednio do mózgu lub dożylnie po ogniskowym niedokrwieniu mózgu u szczurów (model udaru), zapewnia neuroochronę i pobudza odzyskanie funkcji. Zatem przeciwciała anty-MAG dostarczają potencjalne środki terapeutyczne zarówno w doraźnej neuroochronie, jak i pobudzają odzyskanie funkcji po udarze. Przeciwciało to jest przeciwciałem mysim. Chociaż mysie przeciwciała często stosuje się jako środki diagnostyczne, ich użyteczność jako środków terapeutycznych wykazano tylko w kilku przypadkach. Ograniczenie ich stosowania częściowo wynika z tego, że powtarzanie podawania ludziom mysich przeciwciał monoklonalnych zazwyczaj wywołuje u człowieka odpowiedzi immunologiczne przeciw tym cząsteczkom. Aby przezwyciężyć te nieodłączne niepożądane właściwości mysich przeciwciał monoklonalnych, w dziedzinie wynalazku opracowano i dobrze określono „zmienione przeciwciała zaprojektowane tak, aby zawierały regiony ludzkich przeciwciał. Przykładowo, przeciwciało humanizowane zawiera regiony determinujące dopasowanie („CDR) nie pochodzące od człowieka, a większość pozostałej struktury pochodzi z ludzkiego przeciwciała.

Proces neurodegeneracji leży u podstaw wielu chorób/zaburzeń neurologicznych, w tym chorób ostrych, takich jak udar, urazowe uszkodzenie mózgu i uraz rdzenia kręgowego, a także chorób przewlekłych, w tym choroby Alzheimera, otępień czołowo-skroniowych (tauopatii), neuropatii obwodowej, choroby Parkinsona, choroby Huntingtona i stwardnienia rozsianego. Zatem przeciwciała monoklonalne anty-MAG mogą znaleźć zastosowanie w leczeniu tych chorób/zaburzeń, zarówno przez osłabienie umierania komórek związanego z tymi zaburzeniami/stanami, jak i pobudzanie odzyskania funkcji.

Wynalazek dotyczy humanizowanego przeciwciała anty-MAG, które wiąże się z MAG i neutralizuje ją, które to przeciwciało zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 15 oraz domenę zmienną łańcucha lekkiego wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19.

Korzystnie humanizowane przeciwciało anty-MAG zawiera ponadto stałą część ludzkiego łańcucha lekkiego lub jej fragment oraz stałą część ludzkiego łańcucha ciężkiego lub jej fragment.

Korzystnie domenę zmienną łańcucha ciężkiego stanowi SEQ ID NO: 13.

Korzystnie domenę zmienną łańcucha ciężkiego stanowi SEQ ID NO: 14.

Korzystnie domenę zmienną łańcucha ciężkiego stanowi SEQ ID NO: 15.

Korzystnie domenę zmienną łańcucha lekkiego stanowi SEQ ID NO: 16.

Korzystnie domenę zmienną łańcucha lekkiego stanowi SEQ ID NO: 17.

Korzystnie domenę zmienną łańcucha lekkiego stanowi SEQ ID NO: 18.

Korzystnie domenę zmienną łańcucha lekkiego stanowi SEQ ID NO: 19.

PL 211 014 B1

Wynalazek dotyczy także środka farmaceutycznego zawierającego humanizowane przeciwciało anty-MAG zdefiniowane powyżej oraz dodatkowo farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik lub nośnik.

Wynalazek dotyczy również zastosowania humanizowanego przeciwciała anty-MAG zdefiniowanego powyżej do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki udaru.

Korzystnie przeciwciało podaje się dożylnie.

Przeciwciało anty-MAG

Opracowano zmienione przeciwciało, które wiąże i neutralizuje MAG oraz zawiera jeden lub większą liczbę z poniższych regionów CDR. Regiony CDR zidentyfikowano w sposób opisany przez Kabata (Kabat i in., (1991) Sequences of proteins of immunological interest; piąte wydanie; US Department of Health and Human Services; publikacja NIH nr 91-3242). Szczególne regiony CDR są takie jak zdefiniował Kabat, ale zgodne z zasadami strukturalnymi i zasadami fałdowania białek zdefiniowanymi przez Chothia i Lesk, (Chothia i in., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883), przy czym należy zdawać sobie sprawę, że dodatkowe reszty mogą także być brane pod uwagę jako część regionu wiążącego antygen.

Regiony CDR łańcucha lekkiego

CDR	Według Kabata
L1	KSSHSVLYSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 1)
L2	WASTRES (SEQ ID NO: 2)
L3	HQYLSSLT (SEQ ID NO: 3)

Regiony CDR łańcucha ciężkiego

CDR	Według Kabata
H1	NYGMN (SEQ ID NO: 4)
H2	WINTYTGEPTYADDFTG (SEQ ID NO: 5)
H3	NPINYYGINYEGYVMDY (SEQ ID NO: 6)

Możliwy jest sposób hamowania neurodegeneracji i/lub pobudzenia odzyskania funkcji u pacjenta będącego człowiekiem, dotkniętego lub z ryzykiem wystąpienia udaru lub innych chorób neurologicznych, który obejmuje podawanie człowiekowi potrzebującemu takiego leczenia skutecznej ilości opisanego tutaj przeciwciała anty-MAG. Zatem przeciwciało można stosować do wytwarzania leku do hamowania neurodegeneracji i/lub pobudzenia odzyskania funkcji w preparacie leku do hamowania neurodegeneracji i/lub pobudzania odzyskania funkcji u pacjenta będącego człowiekiem, dotkniętego lub z ryzykiem wystąpienia udaru lub innej choroby neurologicznej.

Opisane tu zmienione przeciwciało jest korzystnie przeciwciałem monoklonalnym (mAb) oraz korzystnie jest chimeryczne, humanizowane lub ma zmieniony kształt, przy czym humanizowane przeciwciała stanowią przedmiot wynalazku.

Zmienione przeciwciało ma strukturę naturalnego przeciwciała lub jego fragmentu. Zatem przeciwciało może obejmować pełne przeciwciało, fragment (Fab')2, fragment Fab, dimer łańcucha lekkiego lub dimer łańcucha ciężkiego.

Przeciwciałem może być IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4; albo IgM; IgA, IgE lub IgD albo jego zmodyfikowany wariant. Zgodnie z tym może zostać wybrana stała domena łańcucha ciężkiego przeciwciała. Domeną stałą łańcucha lekkiego może być domena stała κ lub λ. Przeciwciało może ponadto zawierać modyfikacje wszystkich klas, np. dimery IgG, mutanty Fc, które już nie wiążą receptorów Fc lub nie pośredniczą w wiązaniu C1q (przeciwciała blokujące). Przeciwciało może być także przeciwciałem chimerycznym typu opisanego w WO 86/01533, które zawiera region wiązania antygenu i region nieimmunoglobulinowy. Regionem wiązania antygenu jest domena zmienna łańcucha lekkiego lub domena zmienna łańcucha ciężkiego. Zazwyczaj region wiążący antygen zawiera domeny zmienne łańcuchów zarówno lekkiego, jak i ciężkiego. Region nieimmunoglobulinowy jest połączony na swoim C-końcu z regionem wiążącym antygen. Regionem nieimmunoglobulinowym jest zazwyczaj nieimmunoglobulinowe białko, które może stanowić enzym, toksyna lub białko o znanej specyficzności wiązania. Dwa regiony przeciwciała chimerycznego tego typu mogą być połączone przez rozszczepialną sekwencję łącznikową. Rozważa się również immunoadhezyny zawierające regiony CDR, opisane powyżej.

PL 211 014 B1

Region stały jest wybrany na podstawie wymaganej funkcjonalności. Normalnie IgG1 będzie wykazywać zdolność lityczną przez wiązanie z dopełniaczem i/lub będzie pośredniczyć w ADCC (cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał). IgG4 będzie korzystne, jeżeli wymagane jest niecytotoksyczne przeciwciało blokujące. Jednakże przeciwciała IgG4 mogą wykazywać niestabilność przy wytwarzaniu, a zatem bardziej korzystne może być zmodyfikowanie ogólnie bardziej trwałe IgG1. Sugerowane modyfikacje opisano w EP0307434, a korzystne modyfikacje obejmują pozycje 235 i 237. Zatem rozważa się lityczną i nielityczną postać przeciwciała według wynalazku.

W szczególnej postaci zmienione przeciwciało jest klasy IgG, a zwłaszcza IgG1.

Zatem przeciwciało może być pełnej długości przeciwciałem nielitycznym IgG1, zawierającym opisane powyżej regiony CDR. W szczególności przeciwciałem może być nielityczne przeciwciało IgG1 pełnej długości zawierające regiony CDR o SEQ ID NO: 13 i 16 oraz nielityczne przeciwciało IgG1 pełnej długości zawierające regiony CDR o SEQ ID NO: 15 i 18.

Rozważa się także polinukleotydy kodujące CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3. Szczególnymi sekwencjami polinukleotydowymi są:

Regiony CDR łańcucha lekkiego

CDR
L1	AAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCC (SEQ ID NO: 7)
L2	TGGGCCAGCACCCGCGAGAGC (SEQ ID NO: 8)
L3	CACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC (SEQ ID NO: 9)

Regiony CDR łańcucha ciężkiego

CDR
H1	AACTACGGCATGAAC (SEQ ID NO: 10)
H2	TGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGC (SEQ ID NO: 11)
H3	AACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTAC (SEQ ID NO: 12)

Rozważa się także polinukleotyd kodujący region zmienny łańcucha lekkiego zmienionego przeciwciała anty-MAG, zawierający co najmniej jeden region CDR wybrany spośród CDRL1, CDRL2 i CDRL3, korzystniej zawierający kolejno wszystkie 3 regiony CDR.

Rozważa się także polinukleotyd kodujący region zmienny łańcucha ciężkiego zmienionego przeciwciała anty-MAG zawierający co najmniej jeden region CDR wybrany z CDRH1, CDRH2 i CDRH3, korzystniej zawierający kolejno wszystkie 3 regiony CDR.

Przeciwciało anty-MAG według wynalazku jest przeciwciałem humanizowanym.

Zatem wynalazek dostarcza humanizowane przeciwciało, które wiąże się z MAG i neutralizuje ją, które to przeciwciało zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający jedną z poniższych sekwencji aminokwasowych:

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTG EPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 13).

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTG EPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 14)

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTG EPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYFCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 15)

Humanizowane przeciwciało według wynalazku oprócz regionu zmiennego łańcucha ciężkiego o SEQ ID NO: 13, 14 lub 15, zawiera region zmienny łańcucha lekkiego zawierający sekwencje aminokwasowe o SEQ ID NO: 16, 17, 18 lub 19:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV (SEQ ID NO: 16)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVP DRFSGSGSGTDFTLTIINLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV (SEQ ID NO: 17)

PL 211 014 B1

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESG VPDRFSGSGSGTDFTLTISSLHTEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV (SEQ ID NO: 18)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESG VPDRFSGSGSGTDFTLTIINLHTEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV (SEQ ID NO: 19)

W kolejnej postaci wynalazek dostarcza humanizowane przeciwciało zawierające:

fragment regionu zmiennego łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 13, 14 lub 15 oraz stałą część ludzkiego łańcucha ciężkiego lub jej fragment oraz fragment regionu zmiennego łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: 16, 17, 18 lub 19 oraz stałą część ludzkiego łańcucha lekkiego lub jej fragment.

W szczególnej postaci humanizowane przeciwciało jest klasy IgG, a zwłaszcza IgG1.

Korzystne przeciwciała według wynalazku zawierają:

Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 16;

Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 17;

Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 18;

Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 19;

Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 16;

Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 17;

Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 18;

Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 19;

Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 16;

Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 17;

Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 18;

Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 19;

Rozważa się także polinukleotydy kodujące region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 13, 14 i 15 oraz regiony zmienne łańcucha lekkiego zawierające SEQ ID NO: 16, 17, 18 o 19.

Szczególną sekwencją polinukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 13 jest:

D NO: 13 oraz region zmienny łańcucha

D NO: 13 oraz region zmienny łańcucha

D NO: 13 oraz region zmienny łańcucha

D NO: 13 oraz region zmienny łańcucha

D NO: 14 oraz region zmienny łańcucha

D NO: 14 oraz region zmienny łańcucha

D NO: 14 oraz region zmienny łańcucha

D NO: 14 oraz region zmienny łańcucha

D NO: 15 oraz region zmienny łańcucha

D NO: 15 oraz region zmienny łańcucha

D NO: 15 oraz region zmienny łańcucha

D NO: 15 oraz region zmienny łańcucha

CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA GTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATG AACTGGGTGCGAGAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATC AACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTT GTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGC CTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAACCCCATCAAC TACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGC ACACTAGTCACAGTCTCCTCA {SEQ ID No 20)

Szczególną sekwencją polinukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 14 jest:

PL 211 014 B1

CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA GTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATG AACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATC AACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTT GTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGC CTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAAC TACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGC ACACTAGTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID No 21)

Szczególną sekwencją polinukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 15 jest:

CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA GTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATG AACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATC AACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTT GTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGC CTAAAGGCTGAGGACACTGCCACCTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAAC TACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGOACTACTGGGGCCAGGGC ACACTAGTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID No 22)

Szczególną sekwencją polinukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 16 jest:

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAG

AGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAAC

CAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAG

CTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTC

AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAG

GCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC

TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG (SEQ ID No

23)

Szczególną sekwencją polinukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 17 jest:

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAG

AGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAAC CAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAG CTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTC AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCATCAACCTGCAG GCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG {SEQ ID No

24)

Szczególną sekwencją polinukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 18 jest:

PL 211 014 B1 gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgag

AGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAAC

CAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAG

CTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTC

AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAC

ACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC

TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG (SEQ ID No

25)

Szczególną sekwencją polinukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 19 jest:

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAG

AGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAAC ęAGĄAGAĄCTĄęęTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGAĆAGCCTĆCTAAG ctgctcatttactgggcatctacccgggaatccggggtccctgagcgattc AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCATCAACCTGCAC ACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG (SEQ ID No

26)

Określenie „neutralizujące dotyczy hamowania, całkowitego lub częściowego, działania MAG, obejmującego jej wiązanie z neuronami i hamowanie wzrostu neurytów.

Określenie „zmienione przeciwciało oznacza białko kodowane przez region kodujący zmienioną immunoglobulinę, które można otrzymać w wyniku ekspresji w wybranej komórce gospodarzu. Takie zmienione przeciwciała obejmują zmodyfikowane przeciwciała (np. chimeryczne, o zmienionym kształcie, humanizowane lub wektorowe przeciwciała) lub fragmenty przeciwciał niezawierające części lub całości regionu stałego immunoglobuliny, np. Fv, Fab lub F(ab)2 itp.

Określenie „region kodujący zmienioną immunoglobulinę“ dotyczy sekwencji kwasu nukleinowego kodującej zmienione przeciwciało. Gdy zmienione przeciwciało jest przeciwciałem szczepionym CDR lub humanizowanym przeciwciałem, sekwencje kodujące regiony determinujące dopasowanie (CDR) z immunoglobuliny, nie będącej ludzką immunolgobuliną, wstawia się do pierwszego partnera immunoglobulinowego zawierającego sekwencje zrębowe ludzkiej domeny zmiennej. Ewentualnie pierwszy partner immunoglobulinowy jest funkcjonalnie połączony z drugim partnerem immunoglobulinowym.

Określenie „pierwszy partner immunoglobulinowy dotyczy sekwencji kwasu nukleinowego kodującej ludzki region zrębowy lub ludzki region zmienny immunoglobuliny, w którym natywne (lub naturalnie występujące) regiony kodujące regiony CDR zastąpione są przez regiony kodujące regiony CDR przeciwciała donorowego. Ludzki region zmienny może stanowić łańcuch ciężki immunoglobuliny, łańcuch lekki (lub obydwa łańcuchy), ich analog lub funkcjonalny fragment. Takie regiony CDR, zlokalizowane w regionie zmiennym przeciwciał (immunoglobuliny) można określić znanymi metodami. Przykładowo Kabat i in. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. wydanie, U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)) ujawniają zasady lokalizacji regionów CDR. Ponadto znane są programy komputerowe, które są przydatne do identyfikowania regionów/struktur CDR.

Określenie „drugi partner immunoglobulinowy dotyczy innej sekwencji nukleotydowej kodującej białko lub peptyd, z którym połączony jest pierwszy partner immunoglobulinowy w ramce odczytu lub przez ewentualną standardową sekwencję łącznikową (tj. połączony funkcjonalnie). Korzystnie jest to gen immunoglobulinowy. Drugi partner immunoglobulinowy może obejmować sekwencję kwasu nukleinowego kodującą cały region stały dla tego samego (tj. homologicznego - pierwsze i drugie przeciwciało pochodzą z tego samego źródła) lub dodatkowego (tj. heterologicznego) interesującego przeciwciała. Może nim być łańcuch ciężki immunoglobuliny lub łańcuch lekki (lub obydwa łańcuchy jako część pojedynczego polipeptydu). Drugi partner immunoglobulinowy nie jest ograniczony do konkretPL 211 014 B1 nej klasy lub izotypu immunoglobuliny. Ponadto drugi partner immunoglobulinowy może zawierać część regionu stałego immunoglobuliny, takiego jak występujący w Fab lub F(ab)2 (czyli oddzielną część odpowiedniego ludzkiego regionu stałego lub regionu zrębowego). Taki drugi partner immunoglobulinowy może także zawierać sekwencję kodującą integralne białko błonowe eksponowane na zewnętrznej powierzchni komórki gospodarza, np. jako część biblioteki prezentacji fagowej, lub sekwencję kodującą białko do wykrywania analitycznego lub diagnostycznego, np. peroksydazę chrzanową, β-galaktozydazę itd.

Określenia Fv, Fc, Fd, Fab lub F(ab)2 stosuje się w ich zwykłym znaczeniu (patrz np. Harlow i in., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).

W użytym tutaj znaczeniu określenie „zmodyfikowane przeciwciało opisuje typ zmienionego przeciwciała, czyli pełnej długości przeciwciało syntetyczne (np. chimeryczne, o zmienionym kształcie lub humanizowane przeciwciało, w odróżnieniu od fragmentu przeciwciała), w którym część domen zmiennych łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego wybranego przeciwciała akceptorowego jest zastąpiona przez analogiczne części z jednego lub większej liczby przeciwciał donorowych, które wykazują specyficzność względem wybranego epitopu. Przykładowo, takie cząsteczki mogą obejmować przeciwciała charakteryzujące się humanizowanym łańcuchem ciężkim, związanym z niemodyfikowanym łańcuchem lekkim (lub chimerycznym łańcuchem lekkim) albo na odwrót. Zmodyfikowane przeciwciała mogą także charakteryzować się zmienioną sekwencją kwasu nukleinowego kodującego regiony zrębowe domeny zmiennej łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego przeciwciała akceptorowego w celu zachowania specyficzności wiązania przeciwciała donorowego. Przeciwciała te mogą zawierać zastąpienie jednego lub większej liczby regionów CDR (korzystnie wszystkich) z przeciwciała akceptorowego opisanymi tutaj regionami CDR z przeciwciała donorowego.

Określenie „przeciwciało chimeryczne oznacza typ zmodyfikowanego przeciwciała, które zawiera naturalnie występujący region zmienny (łańcuchów lekkiego i ciężkiego) pochodzący z przeciwciała donorowego, związany z regionami stałymi łańcuchów lekkiego i ciężkiego pochodzącymi z przeciwciała akceptorowego.

Określenie „przeciwciało humanizowane oznacza typ zmodyfikowanego przeciwciała zawierającego regiony CDR pochodzące z immunoglobuliny donorowej, nie pochodzącej od człowieka, przy czym pozostałe części pochodzące z immunoglobuliny pochodzą z jednej (lub większej liczby) immunoglobulin ludzkich. Ponadto, zrębowe reszty podporowe mogą być zmienione tak, aby zachować powinowactwo wiązania (patrz np. Queen i in., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson i in., Bio/Technology, 9:421 (1991)). Odpowiednim ludzkim przeciwciałem akceptorowym może być jedno z wybranych ze standardowej bazy danych, np. bazy danych KABAT®, bazy danych Los Alamos oraz bazy danych Swiss Protein, przez homologię z sekwencjami nukleotydową i aminokwasową donorowego przeciwciała. Ludzkie przeciwciało charakteryzujące się homologią z regionami zrębowymi przeciwciała donorowego (na podstawie aminokwasów) może być odpowiednie do dostarczenia regionu stałego łańcucha ciężkiego i/lub regionu zrębowego domeny zmiennej do wstawienia donorowych regionów CDR. Odpowiednie przeciwciało akceptorowe odpowiednie do wykorzystania jego regionów stałych i zrębowych domeny zmiennej łańcucha lekkiego może zostać wybrane w podobny sposób. Należy podkreślić, że łańcuchy ciężki i lekki przeciwciała akceptorowego nie muszą pochodzić z tego samego przeciwciała akceptorowego. Opisano kilka sposobów wytwarzania takich przeciwciał humanizowanych - patrz np. EP-A-0239400 i EP-A-054951.

Określenie „przeciwciało ludzkie o zmienionym kształcie dotyczy zmienionego przeciwciała, w którym minimalnie co najmniej jeden region CDR z pierwszego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała donorowego jest podstawiony regionem CDR drugiego przeciwciała akceptorowego. Korzystnie zastąpione są wszystkie sześć regionów CDR. Korzystniej cały region łączący antygen (np., Fv, Fab lub F(ab')2) z pierwszego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała donorowego jest podstawiony odpowiadającym regionem drugiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała akceptorowego. Korzystniej region Fab z pierwszego ludzkiego donora jest funkcjonalnie połączony z odpowiednimi regionami stałymi drugiego przeciwciała akceptorowego z wytworzeniem pełnej długości przeciwciała monoklonalnego.

Określenie „przeciwciało wektorowe dotyczy przeciwciała, do którego przyłączono środek, który ułatwia transport przez barierę krew-mózg (BBB) (praca przeglądowa, patrz, Pardridge; Advanced Drug Delivery Review 36, 299-321, 1999). Przyłączenie może być chemiczne, albo alternatywnie, ugrupowanie może zostać wprowadzone do przeciwciała. Jeden przykład stanowi wytworzenie chimery z przeciwciałem skierowanym do receptora komórek śródbłonka naczyń włosowatych mózgu, np. przeciwciałem przeciw receptorowi insuliny (Saito i in., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 10227-31;

PL 211 014 B1

Pardridge i in., (1995) Pharm. Res 12 807-816; Broadwell i in., (1996) Exp. Neurol, 142 47-65; Bickel i in., (1993) Proc. Natl. Acad Sci, USA 90, 2618-2622; Friden i in., (1996) J. Pharm, Exp. Cher. 278 1491-1498, US 5182107, US 5154924, US 5833988, US 5527527). Po związaniu z receptorem obydwa składniki przeciwciała bispecyficznego przechodzą przez BBB na drodze transcytozy. Alternatywnie, środek może być ligandem wiążącym takie receptory na powierzchni komórki, np. insuliną, transferyną lub lipoproteiną o niskiej gęstości (Descamps i in., (1996) Am. J. Physiol. 270 H1149-H1158; Duffy i in., (1987) Brain Res. 420 32-38; Dehouck i in., (1997) J. Cell Biol. 1997 877-889). Można także zastosować naturalnie występujące peptydy takie jak penetratyna, SynB1 i SynB3, które są znane jako czynniki ułatwiające transport przez BBB (Rouselle i in., (2000) Mol. Pharm. 57, 679-686 oraz Rouselle i in., (2001) Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 296, 124-131).

Określenie „przeciwciało donorowe dotyczy przeciwciała (monoklonalnego lub rekombinowanego), które wprowadza sekwencje aminokwasowe swoich regionów zmiennych, regionów CDR lub innych fragmentów funkcjonalnych, lub ich analogów do pierwszego partnera immunoglobulinowego, tak aby dostarczyć region kodujący zmienioną immunoglobulinę oraz w rezultacie zmienione eksprymowane przeciwciało o specyficzności antygenowej i aktywności neutralizującej przeciwciała donorowego.

Określenie „przeciwciało akceptorowe dotyczy przeciwciała (monoklonalnego lub rekombinowanego) heterologicznego względem przeciwciała donorowego, które wprowadza wszystkie (lub którąkolwiek część, ale korzystnie wszystkie) sekwencje aminokwasowe kodujące regiony zrębowe jego łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego, oraz/albo regiony stałe jego łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego, do pierwszego partnera immunoglobulinowego. Korzystnie przeciwciałem akceptorowym jest przeciwciało ludzkie.

Określenie „CDR definiuje się jako sekwencje aminokwasowe regionu determinującego dopasowanie przeciwciała, które są hiperzmiennymi regionami łańcuchów immunoglobulinowych ciężkiego i lekkiego. Patrz np. Kabat i in.. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. wyd., U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). W części zmiennej immunoglobuliny występują trzy regiony CDR w łańcuchu ciężkim oraz trzy regiony CDR w łańcuchu lekkim. Zatem „CDR” w użytym tutaj znaczeniu dotyczy wszystkich trzech regionów CDR łańcucha ciężkiego lub wszystkich trzech regionów CDR łańcucha lekkiego (albo, gdy jest to stosowne, regionów CDR zarówno łańcucha ciężkiego, jak i lekkiego). Struktura oraz ufałdowanie cząsteczki białka przeciwciała może spowodować, że inne reszty staną się częścią regionu wiążącego antygen i fachowiec będzie je za takie uważać. Patrz np. Chothia i in., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, str. 877-883. Dla jasności regiony CDR według definicji Kabata podkreślono w SEQ ID NO: 13-26.

Regiony CDR dostarczają większość reszt kontaktowych do wiązania przeciwciała z antygenem lub epitopem. Interesujące regiony CDR pochodzą z sekwencji regionów zmiennych łańcuchów ciężkiego i lekkiego przeciwciała donorowego oraz obejmują one analogi naturalnie występujących regionów CDR, które to analogi wykazują lub zachowują taką samą specyficzność wiązania i/lub neutralizacji antygenu jak przeciwciało donorowe z którego pochodzą.

Określenie „fragment funkcjonalny oznacza część sekwencji regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub lekkiego (np. z niewielkimi delecjami na N- lub C-końcu regionu zmiennego immunoglobuliny), która zachowuje taką samą specyficzność wiązania i/lub neutralizacji antygenu jak przeciwciało z którego pochodzi ten fragment.

Określenie „analog oznacza sekwencję aminokwasową zmodyfikowaną o co najmniej jeden aminokwas, przy czym wspomniana modyfikacja może być modyfikacją chemiczną, podstawieniem lub przegrupowaniem kilku aminokwasów (czyli nie więcej niż 10), która to modyfikacja umożliwia zachowanie przez sekwencję aminokwasową charakterystyki biologicznej, np. specyficzności antygenowej i wysokiego powinowactwa niemodyfikowanej sekwencji. Przykładowo, przez podstawienia można skonstruować (ciche) mutacje, gdy pewne miejsca dla endonukleaz restrykcyjnych wprowadza się do lub w otoczeniu regionów kodujących regiony CDR. Rozważa się tutaj zastosowanie analogów przeciwciała według wynalazku. Ogólnie wiadomo, że niewielkie zmiany sekwencji aminokwasowej lub kwasu nukleinowego mogą doprowadzić np. do wytworzenia allelicznej formy oryginalnego białka, która zachowuje zasadniczo podobne właściwości. Zatem analogi przeciwciała według wynalazku obejmują te, w których regiony CDR w regionie hiperzmiennym łańcuchów ciężkiego i lekkiego są co najmniej w 80% homologiczne, korzystnie co najmniej w 90% homologiczne, a najkorzystniej co najmniej w 95% homologiczne z regionami CDR, które zdefiniowano powyżej jako CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3, oraz zachowują aktywność neutralizacji MAG. Sekwencje aminokwasowe są co najmniej w 80% homologiczne, gdy zawierają 80% identycznych reszt aminokwasoPL 211 014 B1 wych w podobnej pozycji, gdy sekwencje przypasowuje się optymalnie, przy czym przerwy lub insercje liczy się jako nieidentyczne reszty. Rozważa się tutaj także analogi przeciwciał według wynalazku, w których regiony zrębowe są co najmniej w 80%, korzystnie co najmniej w 90%, a najkorzystniej co najmniej w 95% homologiczne z regionami zrębowymi przedstawionymi w SEQ ID NO: 1-5. Sekwencje aminokwasowe są co najmniej w 80% homologiczne, gdy zawierają 80% identycznych reszt aminokwasowych w podobnej pozycji, gdy sekwencje przypasowuje się optymalnie, przy czym przerwy lub insercje liczy się jako nieidentyczne reszty.

Analogi mogą także powstać jako zmiany alleliczne. Określenie „zmiana lub modyfikacja alleliczna dotyczy zmiany w sekwencji kwasu nukleinowego. Takie zmiany lub modyfikacje mogą wynikać ze zdegenerowania kodu genetycznego lub mogą być celowo wprowadzone dla wywołania pożądanej charakterystyki. Te zmiany lub modyfikacje mogą, ale nie muszą, spowodować zmiany w kodowanej sekwencji aminokwasowej.

Określenie „czynniki efektorowe dotyczy niebiałkowych cząsteczek nośnikowych, które mogą być związane w zwykły sposób ze zmienionymi przeciwciałami i/lub naturalnymi lub syntetycznymi łańcuchami lekkimi lub ciężkimi przeciwciała donorowego albo innymi fragmentami donorowego przeciwciała. Takie niebiałkowe nośniki mogą obejmować zwykłe nośniki stosowane w dziedzinie diagnostyki, np. perełki z polistyrenu lub innych tworzyw sztucznych, polisacharydy, np. takie jak stosowane w systemie BIAcore [Pharmacia] lub inne niebiałkowe substancje znajdujące zastosowanie w dziedzinie medycyny, bezpieczne przy podawaniu ludziom i zwierzętom. Inne czynniki efektorowe mogą obejmować makrocykl do chelatowania atomu metalu ciężkiego lub radioizotopów. Takie czynniki efektorowe mogą także znaleźć zastosowanie do wydłużania okresu półtrwania zmienionych przeciwciał, np. glikol polietylenowy.

Neutralizujące przeciwciało specyficzne względem MAG opisano (Poltorak i in., (1987) Journal of Cell Biology 105, 1893-1899, DeBellard i in., (1996) Mol. Cell Neurosci, 7, 89-101; Tang i in., (1997) Mol. Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K i Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262) i jest ono dostępne w handlu (MAB1567 (Chemicon)).

Alternatywnie można skonstruować przeciwciała, zmienione przeciwciała i fragmenty, przez immunizację gatunków nie będących ludźmi (np. bydła, owiec, małp, kurcząt, gryzoni (np., myszy i szczurów) itd.) w celu wytworzenia pożądanej immunoglobuliny po prezentacji natywnej MAG z jakiegokolwiek gatunku, przeciw któremu mogą zostać wytworzone przeciwciała reaktywne krzyżowo z ludzką MAG, np. człowieka lub kurczęcia. Standardowe techniki hybrydom stosuje się do wytworzenia linii komórek hybrydom wydzielających mAb przeciw MAG, nie będące pochodzenia ludzkiego. Następnie takie hybrydomy selekcjonuje się pod względem wiązania przy użyciu powlekanych MAG płytek 384- lub 96-studzienkowych, z biotynylowaną MAG związaną z płytką powleczoną streptawidyną, albo w homogennym teście immunologicznym z europem związanym z APC, przy użyciu biotynylowanej MAG.

Natywne przeciwciało ludzkie można wytworzyć w myszy z ludzkimi przeciwciałami, takiej jak „Xenomouse (Abgenix), w której geny immunoglobulinowe zostały usunięte i do mysiego chromosomu wprowadzono geny kodujące ludzkie immunoglobuliny. Myszy immunizuje się normalnie i rozwijają one normalną odpowiedź immunologiczną, która pochodzi z ludzkich genów. Ta więc mysz wytwarza ludzkie przeciwciała bez konieczności ich humanizowania po wyselekcjonowaniu pozytywnych hybrydom. (patrz, Green L.L., J. Immunol Methods 1999, 10 grudnia; 231 (1-2): 11-23)

Możliwe jest także zastosowanie fragmentów Fab lub F(ab')2 pochodzących z mAb, skierowanych przeciw MAG. Fragmenty te znajdują zastosowanie jako czynniki ochronne in vivo. Fragment Fab zawiera cały łańcuch lekki i N-końcową część łańcucha ciężkiego; a fragment F(ab')2 jest fragmentem tworzonym przez dwa fragmenty Fab związane przez mostki disulfidowe. Fragmenty Fab i F(ab')2 można otrzymać znanymi sposobami, np. przez rozszczepienie mAb odpowiednimi enzymami proteolitycznymi, papainą i/lub pepsyną, albo metodami rekombinacyjnymi. Fragmenty Fab i F(ab')2 znajdują jako takie zastosowanie jako środki terapeutyczne i profilaktyczne oraz jako donory sekwencji, w tym sekwencji regionów zmiennych i sekwencji regionów CDR użytecznych do wytwarzania opisanych rekombinowanych lub humanizowanych przeciwciał.

Fragmenty Fab i F(ab')2 można także konstruować z zastosowaniem kombinatoryjnej biblioteki fagowej (patrz np. Winter i in., Ann. Rev. Inmunol., 12:433-455 (1994)) albo poprzez tasowanie łańcuchów immunoglobuliny (patrz np. Marks i in., Bio/Technology, 10:779-783 (1992).

Tak więc fragmenty ludzkich przeciwciał (Fv, scFv, Fab) specyficzne względem MAG można wyizolować z użyciem bibliotek fragmentów ludzkiego przeciwciała w prezentacji fagowej. Bibliotekę

PL 211 014 B1 cząstek bakteriofagów, które prezentują fragmenty białka ludzkiego przeciwciała, przeszukuje się względem białka MAG. Te fagi prezentujące fragmenty przeciwciała, które wiążą MAG, wybiera się z biblioteki i amplifikuje klonalnie. Następnie geny ludzkich przeciwciał wycina się ze specyficznego bakteriofaga i wstawia do konstruktów ekspresyjnych ludzkiej IgG zawierających regiony stałe ludzkiej IgG, z wytworzeniem całej cząsteczki ludzkiej IgG z regionami zmiennymi z wyizolowanego bakteriofaga specyficznego względem MAG.

Przeciwciała donorowe mogą wprowadzać sekwencje, takie jak sekwencje peptydowe regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego, sekwencje zrębowe, sekwencje CDR, ich funkcjonalne fragmenty lub analogi oraz kodujące je sekwencje kwasu nukleinowego, znajdujące zastosowanie do projektowania i uzyskiwania różnych zmienionych przeciwciał, które cechują się specyficznością wiązania antygenu przeciwciała donorowego.

Uwzględniając zdegenerowanie kodu genetycznego można skonstruować różne sekwencje kodujące sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego oraz sekwencje CDR, a także ich funkcjonalne fragmenty i analogi wykazujące specyficzność antygenową przeciwciała donorowego. Izolowane sekwencje kwasu nukleinowego lub ich fragmenty, kodujące sekwencje peptydowe regionu zmiennego łańcucha lub regionów CDR, można stosować do wytwarzania zmienionych przeciwciał, np. przeciwciał chimerycznych lub humanizowanych albo innych zmodyfikowanych przeciwciał, gdy połączy się je funkcjonalnie z drugim partnerem immunoglobulinowym.

Zmienione cząsteczki immunoglobulin mogą kodować zmienione przeciwciała, które obejmują zmodyfikowane przeciwciała, takie jak przeciwciała chimeryczne lub przeciwciała humanizowane. Pożądany region kodujący zmienioną immunoglobulinę zawiera regiony kodujące regiony CDR, które kodują peptydy o specyficzności antygenowej przeciwciała anty-MAG, korzystnie przeciwciała o wysokim powinowactwie, wstawione do pierwszego partnera immunoglobulinowego (ludzkiego regionu zrębowego lub ludzkiego regionu zmiennego immunoglobuliny).

Korzystnie, pierwszy partner immunoglobulinowy jest funkcjonalnie połączony z drugim partnerem immunoglobulinowym. Drugi partner immunoglobulinowy został zdefiniowany powyżej i może on zawierać sekwencję kodującą interesujący region drugiego przeciwciała, np. region Fc. Drudzy partnerzy immunoglobulinowi mogą także obejmować sekwencje kodujące inną immunoglobulinę, z którą połączono region stały łańcucha lekkiego lub ciężkiego w ramce odczytu albo za pomocą sekwencji łącznikowej. Można zaprojektować zmodyfikowane przeciwciała skierowane przeciw funkcjonalnym fragmentom lub analogom MAG tak, aby wywoływały one silniejsze wiązanie.

Drugi partner immunoglobulinowy może być także związany ze zdefiniowanymi powyżej czynnikami efektorowymi, w tym z niebiałkowymi cząsteczkami nośnikowymi, z którymi znanymi sposobami może zostać związany funkcjonalnie drugi partner immunoglobulinowy.

Fuzja lub połączenie pomiędzy drugimi partnerami immunoglobulinowymi, np. sekwencjami przeciwciała, a czynnikiem efektorowym może zachodzić w jakikolwiek dogodny sposób, np. przez standardowe wiązania kowalencyjne lub jonowe, fuzje białkowe albo z zastosowaniem heterobifunkcyjnych związków sieciujących, takich jak np. karbodiimid, aldehyd glutarowy itd. Takie techniki są znane i przystępnie opisane w zwykłych tekstach chemicznych i biochemicznych.

Ponadto w regionie kodującym zmienioną immunoglobulinę można także skonstruować standardowe sekwencje łącznikowe, które w prosty sposób zapewniają wystarczającą przestrzeń pomiędzy drugim partnerem immunoglobulinowym, a czynnikiem efektorowym. Projektowanie takich łączników jest dobrze znane fachowcom. Rozważa się także diaciała (dwuwartościowe lub bispecyficzne), triaciała, tetraciała oraz inne wieloważne rodzaje białek scFV, zawierające jeden lub większą liczbę regionów CDR, jak opisano powyżej, które wiążą się z oraz neutralizują działanie MAG.

Przeciwciało może być przyłączone do dodatkowego środka. Przykładowo, można zastosować procedurę technologii rekombinacji DNA do wytworzenia zmodyfikowanego przeciwciała w którym fragment Fc lub domena CH2-CH3 pełnej cząsteczki przeciwciała została zastąpiona przez enzym lub inną wykrywalną cząsteczkę (tj. polipeptydową cząsteczkę efektorową lub reporterową).

Drugi partner immunoglobulinowy może być także funkcjonalnie połączony z nieimmunoglobulinowym peptydem, białkiem lub jego fragmentem heterologicznym względem sekwencji zawierającej region CDR o specyficzności antygenowej przeciwciała anty-MAG. Powstałe białko po ekspresji może wykazywać zarówno specyficzność przeciw antygenowi MAG, jak i cechy cząsteczki nie będącej immunoglobuliną. Taką cechą partnera fuzyjnego może być np. cecha funkcjonalna, taka jak inna domena wiążąca lub receptorowa, albo cecha terapeutyczna, jeżeli partner fuzyjny jest sam z siebie białkiem terapeutycznym, albo dodatkowa charakterystyka antygenowa.

PL 211 014 B1

Inne opisane tu pożądane białko może zawierać pełną cząsteczkę przeciwciała, zawierającą pełnej długości łańcuchy ciężki i lekki, albo którykolwiek ich oddzielny fragment, taki jak fragmenty Fab lub F(ab')2, dimer łańcucha ciężkiego lub którekolwiek ich minimalne fragmenty rekombinowane, takie jak Fv lub przeciwciało jednołańcuchowe (SCA) albo jakąkolwiek inną cząsteczkę wiążącą o tej samej specyficzności co wybrane donorowe mAb. Takie białko może być stosowane w postaci zmienionego przeciwciała albo może być stosowane w postaci innej niż fuzyjna.

Gdy drugi partner immunoglobulinowy pochodzi z przeciwciała innego niż przeciwciało donorowe, np. z regionów zrębowych lub stałych jakiegokolwiek izotypu lub klasy immunoglobuliny, powstaje zmodyfikowane przeciwciało. Zmodyfikowane przeciwciała mogą zawierać regiony stałe lub regiony zrębowe domeny zmiennej immunoglobuliny (Ig) z jednego źródła, np. z przeciwciała akceptorowego, oraz jeden lub większą liczbę (korzystnie wszystkie) regionów CDR z przeciwciała donorowego. Ponadto, do regionu zrębowego domeny zmiennej łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego mAb akceptorowego lub do donorowych regionów CDR, można wprowadzić zmiany, np. delecje, podstawienia lub addycje, na poziomie kwasu nukleinowego lub aminokwasowym, w celu zachowania specyficzności wiązania antygenu przeciwciała donorowego.

Takie zmodyfikowane przeciwciała projektuje się z wykorzystaniem domen zmiennych jednego z (lub obydwu) łańcuchów ciężkiego i/lub lekkiego anty-MAG mAb lub jednego lub większej liczby regionów CDR łańcucha ciężkiego lub lekkiego. Zmodyfikowane przeciwciała mogą być neutralizujące, jak zdefiniowano powyżej.

Takie zmodyfikowane przeciwciała mogą obejmować humanizowane przeciwciało zawierające regiony zrębowe wybranej ludzkiej immunoglobuliny lub jej podtypu, albo chimeryczne przeciwciało zawierające regiony stałe ludzkich łańcuchów ciężkiego i lekkiego połączone z funkcjonalnymi fragmentami przeciwciała anty-MAG. Odpowiednie ludzkie (lub zwierzęce) przeciwciało może być wybrane ze standardowej bazy danych, np. bazy danych KABAT®, bazy danych Los Alamos oraz bazy danych Swiss Protein, przez homologię z sekwencjami nukleotydową i aminokwasową przeciwciała donorowego. Ludzkie przeciwciało charakteryzujące się homologią z regionami zrębowymi przeciwciała donorowego (na poziomie sekwencji aminokwasowej) może być odpowiednie do dostarczenia regionu stałego łańcucha ciężkiego i/lub regionu zrębowego domeny zmiennej łańcucha ciężkiego do wstawienia donorowych regionów CDR. Odpowiednie przeciwciało akceptorowe, które może dostarczyć region stały łańcucha lekkiego i/lub regiony zrębowe domeny zmiennej łańcucha lekkiego można wybrać w podobny sposób. Należy podkreślić, że łańcuchy ciężki i lekki przeciwciała akceptorowego nie muszą pochodzić z tego samego przeciwciała akceptorowego.

Wskazane jest, aby heterologiczne regiony zrębowe i stałe były wybrane z klas i izotypów ludzkich immunoglobulin, takich jak IgG (podtypy 1 do 4), IgM, IgA i IgE. Jednakże przeciwciało akceptorowe nie musi zawierać tylko sekwencji białkowych ludzkich immunoglobulin. Przykładowo, można skonstruować gen, w którym sekwencja DNA kodująca część łańcucha ludzkiej immunoglobuliny jest połączona z sekwencją DNA kodującą nieimmunoglobulinową sekwencję aminokwasową, taką jak polipeptydowa cząsteczka efektorowa lub reporterowa.

W humanizowanym przeciwciele domeny zmienne w obydwu ludzkich łańcuchach ciężkim i lekkim mogą być zmodyfikowane przez zastąpienie jednego lub większej liczby regionów CDR. Możliwe jest zastosowanie wszystkich sześciu regionów CDR, lub różnych połączeń mniej niż sześciu regionów CDR. Korzystnie zastępuje się wszystkie sześć regionów CDR. Możliwe jest zastąpienie regionów CDR tylko w ludzkim łańcuchu ciężkim, przy zastosowaniu jako łańcucha lekkiego nie zmodyfikowanego łańcucha lekkiego z ludzkiego przeciwciała akceptorowego. Alternatywnie, kompatybilny łańcuch lekki można wybrać z innego ludzkiego przeciwciała na podstawie standardowych baz danych przeciwciał. Pozostała część zmodyfikowanego przeciwciała może być wyprowadzona z jakiejkolwiek dogodnej ludzkiej immunoglobuliny akceptorowej.

Zatem zmodyfikowane humanizowane przeciwciało ma strukturę naturalnego ludzkiego przeciwciała lub jego fragmentu oraz wykazuje połączenie właściwości wymaganych do skutecznego zastosowania terapeutycznego.

Specjalista w dziedzinie wynalazku zrozumie, że zmodyfikowane przeciwciało może być dalej modyfikowane przez zmiany aminokwasów domeny zmiennej, a zatem bez wpływu na specyficzność oraz wysokie powinowactwo przeciwciała donorowego (tj., analog). Przewiduje się, że aminokwasy łańcuchów ciężkiego i lekkiego można podstawić jakimikolwiek innymi aminowkasami w regionach zrębowych domeny zmiennej lub regionów CDR lub obydwu z nich.

PL 211 014 B1

Ponadto, region stały można zmienić w celu wzmocnienia lub osłabienia wybranych właściwości cząsteczek według wynalazku i innych tu opisanych. Przykładowo można zastosować dimeryzację, wiązanie z receptorami Fc lub zdolność do wiązania i aktywowania dopełniacza (patrz np. Angal i in., Mol. Immunol, 30:105-108 (1993), Xu i in., J. Biol. Chem, 269: 3469-3474 (1994), Winter i in., EP 307434-B).

Zmienione przeciwciało, które jest przeciwciałem chimerycznym, różni się od opisanych powyżej przeciwciał humanizowanych tym, że dostarcza całe regiony zmienne łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego, włącznie z regionami zrębowymi przeciwciała donorowego nie pochodzącego od człowieka, związane z regionami stałymi immunoglobulin pochodzącymi z innych gatunków, korzystnie od ludzi, dla obydwu łańcuchów.

Sekwencje domen zmiennych łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego oraz regiony CDR odpowiednich donorowych mAb oraz kodujące je sekwencje kwasów nukleinowych, można stosować do skonstruowania zmienionych przeciwciał, korzystnie humanizowanych przeciwciał według wynalazku w następujący sposób. Takie same lub podobne techniki można także stosować do wytworzenia innych opisanych cząsteczek.

Hybrydomę wytwarzającą wybrane mAb donorowe klonuje się w standardowy sposób, a DNA regionów zmiennych jej łańcuchów ciężkiego i lekkiego uzyskuje się technikami znanymi specjaliście w dziedzinie wynalazku, np. technikami opisanymi w Sambrook i in., (Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. wydanie, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Regiony zmienne łańcuchów ciężkiego i lekkiego, zawierające co najmniej regiony kodujące regiony CDR oraz te części regionów zrębowych domen zmiennych łańcuchów lekkiego i/lub ciężkiego akceptorowego mAb, wymagane do zachowania specyficzności wiązania donorowego mAb, a także pozostałe części łańcucha przeciwciała wyprowadzone z ludzkiej immunoglobuliny uzyskuje się za pomocą starterów polinukleotydowych oraz odwrotnej transkryptazy. Regiony kodujące regiony CDR identyfikuje się na podstawie znanej bazy danych oraz przez porównanie z innymi przeciwciałami.

Tak więc można wytworzyć mysio/ludzkie przeciwciało chimeryczne i zbadać jego zdolność wiązania. Takie przeciwciało chimeryczne zawiera całe regiony VH i VL przeciwciała donorowego nie pochodzącego od człowieka, związane z regionami stałymi ludzkiej Ig dla obydwu łańcuchów.

Homologiczne regiony zrębowe domeny zmiennej łańcucha ciężkiego z ludzkiego przeciwciała można zidentyfikować na podstawie komputerowych baz danych, np. KABAT®, a jako przeciwciało akceptorowe zostanie wybrane ludzkie przeciwciało wykazujące homologię względem przeciwciała donorowego. Odpowiedni region zrębowy domeny zmiennej łańcucha lekkiego można zaprojektować w podobny sposób.

Humanizowane przeciwciało może być wyprowadzone z chimerycznego przeciwciała lub korzystnie wytworzone syntetycznie przez wstawienie kodujących regiony CDR regionów donorowego mAb z łańcuchów ciężkiego i lekkiego odpowiednio do wybranego zrębu łańcucha ciężkiego i lekkiego. Alternatywnie, humanizowane przeciwciało można wytworzyć z zastosowaniem standardowych technik mutagenezy. Zatem wytworzone humanizowane przeciwciało zawiera ludzkie regiony zrębowe oraz regiony donorowego mAb, kodujące regiony CDR. Można przeprowadzić następne manipulacje na resztach zrębowych. Powstałe humanizowane przeciwciało może być eksprymowane w rekombinowanych komórkach gospodarzach, np. komórkach COS, CHO lub szpiczaka.

Standardowy wektor ekspresyjny lub rekombinowany plazmid wytwarza się przez umieszczenie tych sekwencji kodujących przeciwciało w funkcjonalnym związku z regulatorowymi sekwencjami kontrolnymi, zdolnymi do kontrolowania replikacji i ekspresji w komórce gospodarzu i/lub wydzielania z komórki gospodarza. Sekwencje regulatorowe obejmują sekwencje promotorowe, np. promotor CMV oraz sekwencje sygnałowe, które mogą być wyprowadzone z innych znanych przeciwciał. Podobnie można wytworzyć drugi wektor ekspresyjny o sekwencji DNA, która koduje komplementarny łańcuch lekki lub ciężki przeciwciała. Korzystnie ten drugi wektor ekspresyjny jest identyczny z pierwszym wektorem, za wyjątkiem sekwencji kodujących oraz markerów selekcyjnych, tak, aby umożliwić, aby każdy łańcuch polipeptydowy był eksprymowany funkcjonalnie w takim stopniu, w jakim jest to tylko możliwe. Alternatywnie, sekwencje kodujące łańcuch ciężki i lekki dla zmienionego przeciwciała mogą się znajdować w pojedynczym wektorze.

Wybraną komórkę gospodarza kotransfekuje się standardowymi technikami zarówno pierwszym, jak i drugim wektorem (lub po prostu transfekuje się jednym wektorem) w celu wytworzenia transfekowanej komórki gospodarza, zawierającej zarówno rekombinowane, jak i syntetyczne łańcuchy lekki i ciężki. Następnie transfekowane komórki hoduje się standardowymi technikami w celu wytworzenia zmodyfikowanego przeciwciała według wynalazku i innych tu opisanych. Humanizowane

PL 211 014 B1 przeciwciało zawierające związane rekombinowane łańcuchy ciężki i/lub lekki testuje się w hodowli za pomocą odpowiedniego testu, takiego jak ELISA lub RIA. Podobne standardowe techniki można zastosować do skonstruowania innych zmienionych przeciwciał i cząsteczek.

Specjalista w dziedzinie wynalazku może wybrać odpowiednie wektory do etapów klonowania i subklonowania stosowane w sposobach oraz w konstruowaniu preparatów według wynalazku i innych tu opisanych. Przykładowo, można zastosować standardowe wektory do klonowania serii pUC. Jeden z takich wektorów, pUC19, jest dostępny w handlu z takich firm jak Amersham (Buckinghamshire, Wielka Brytania) lub Pharmacia (Uppsala, Szwecja). Ponadto do klonowania można zastosować jakikolwiek wektor, który łatwo się replikuje, ma dużo miejsc do klonowania oraz geny selekcyjne (np., oporności antybiotykowej) oraz łatwo ulega manipulacjom.

Podobnie, spośród dowolnych standardowych wektorów specjalista w dziedzinie wynalazku może wybrać wektory do ekspresji przeciwciał. Wektory zawierają także wybrane sekwencje regulatorowe (takie jak promotory CMV), które kierują replikacją i ekspresją heterologicznych sekwencji DNA w wybranych komórkach gospodarzach. Wektory te zawierają opisane powyżej sekwencje DNA, które kodują przeciwciało lub region kodujący zmienioną immunoglobulinę. Ponadto, wektory mogą zawierać wybrane sekwencje immunoglobulinowe, zmodyfikowane przez wstawienie pożądanych miejsc restrykcyjnych do łatwej manipulacji.

Wektory ekspresyjne mogą się także charakteryzować genami odpowiednimi do wzmocnienia ekspresji heterologicznych sekwencji DNA, np. ssaczy gen reduktazy dihydrofolianu (DHFR). Inne korzystne sekwencje wektorowe obejmują sekwencję sygnału poli-A, taką jak sekwencję bydlęcego hormonu wzrostu (BGH) i sekwencję promotora β-globiny (β-glopro). Znajdujące tutaj zastosowanie wektory ekspresyjne można syntetyzować technikami dobrze znanymi specjalistom w dziedzinie wynalazku.

Składniki takich wektorów, np. replikony, geny selekcyjne, wzmacniacze, promotory, sekwencje sygnałowe itp., można otrzymać ze źródeł handlowych lub naturalnych albo syntetyzować z zastosowaniem znanych procedur stosowanych do kierowania ekspresją i/lub wydzielaniem produktu rekombinowanego DNA u wybranego gospodarza. W tym celu można wybrać także inne odpowiednie wektory ekspresyjne do ekspresji u ssaków, bakterii, owadów, drożdży i grzybów, których wiele typów znanych jest w dziedzinie wynalazku.

Rozważa się tu także linię komórek transfekowanych rekombinowanym plazmidem zawierającym sekwencje kodujące przeciwciała lub ich zmienione cząsteczki immunoglobulinowe. Komórki gospodarze znajdujące zastosowanie w klonowaniu oraz inne manipulacje tych wektorów do klonowania są także standardowe. Jednakże do replikacji wektorów do klonowania oraz w innych etapach w konstruowaniu zmienionych przeciwciał według wynalazku i innych tu opisanych stosuje się w szczególności komórki z różnych szczepów E. coli.

Odpowiednimi komórkami gospodarzami lub liniami komórkowymi do ekspresji przeciwciała według wynalazku i innych tu opisanych są przykładowo komórki ssacze, takie jak NS0, Sp2/0, CHO, COS, fibroblasty (np. 3T3) oraz komórki szpiczaka, a w szczególności komórki CHO lub komórki szpiczaka. Można stosować komórki ludzkie, co umożliwia modyfikację cząsteczki za pomocą wzorów glikozylacji występujących u ludzi. Alternatywnie można zastosować inne linie komórek eukariotycznych. Dobór odpowiednich ssaczych komórek gospodarzy oraz sposobów transformacji, hodowania, amplifikacji, przeszukiwania oraz wytwarzania i oczyszczania produktu jest znany w dziedzinie wynalazku. Patrz np. Sambrook i in., jak zacytowano powyżej.

Komórki bakteryjne mogą okazać się użyteczne jako komórki gospodarze do ekspresji opisanych tu rekombinowanych Fab (patrz np. Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)). Jednakże ze względu na tendencję białek eksprymowanych w komórkach bakteryjnych do występowania w postaci niesfałdowanej lub nieprawidłowo sfałdowanej, albo w postaci nieglikozylowanej, jakikolwiek rekombinowany Fab wytworzony w komórce bakteryjnej powinien być zbadany pod względem zdolności wiązania antygenu. Jeżeli cząsteczka eksprymowana przez komórkę bakteryjną została wytworzona w postaci odpowiednio sfałdowanej, wówczas ta komórka bakteryjna będzie pożądanym gospodarzem. Przykładowo, różne szczepy E. coli stosowane do ekspresji są dobrze znane jako komórki gospodarze w dziedzinie biotechnologii. Różne szczepy B. subtilis, Streptomyces, innych laseczek itp. można także stosować w tym sposobie.

Jeżeli jest to pożądane, jako komórki gospodarze dostępne są także znane specjalistom w dziedzinie wynalazku szczepy komórek drożdżowych, jak również komórki owadzie, np. Drosophila i Lepidoptera oraz wirusowe układy ekspresji. Patrz np. Miller i in., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) oraz pozycje tam cytowane.

PL 211 014 B1

Ogólne sposoby umożliwiające skonstruowanie wektorów, sposoby transfekcji wymagane do wytworzenia opisanych tu komórek gospodarzy oraz sposoby hodowania wymagane do wytworzenia zmienionego przeciwciała według wynalazku i innych tu opisanych z takiej komórki gospodarza są standardowymi technikami. Podobnie, po wytworzeniu przeciwciała według wynalazku i inne tu opisane można oczyszczać od składników hodowli komórkowej z zastosowaniem standardowych procedur z dziedziny wynalazku, w tym wytrącania siarczanem amonu, zastosowania kolumn powinowactwa, chromatografii kolumnowej, elektroforezy żelowej itp. Takie techniki są znane specjaliście w dziedzinie wynalazku. Przykładowo, preparaty zmienionych przeciwciał opisano w WO 99/58679 i WO 96/16990.

Jeszcze inny sposób eksprymowania przeciwciał może wykorzystywać ekspresję w transgenicznym zwierzęciu, tak jak opisano w opisie patentowym US nr 4873316. Dotyczy on układu ekspresyjnego wykorzystującego zwierzęcy promotor kazeinowy, który po transgenicznym wprowadzeniu do organizmu ssaka umożliwia wytwarzanie przez samicę pożądanego rekombinowanego białka w mleku.

Po eksprymowaniu z zastosowaniem pożądanego sposobu przeciwciało bada się pod względem aktywności in vitro przez zastosowanie odpowiedniego testu. Obecnie standardowe formaty testu ELISA stosuje się do jakościowego i ilościowego oszacowania wiązania przeciwciała z MAG. Ponadto inne testy in vitro można także stosować do potwierdzenia wydajności neutralizującej przed późniejszymi badaniami klinicznymi na ludziach, przeprowadzanymi w celu określenia utrzymywan ia się przeciwciała w organizmie pomimo występowania normalnych mechanizmów klirensu.

Środki terapeutyczne według wynalazku i inne tu opisane można także podawać profilaktycznie lub po urazie albo w innych przypadkach, gdy jest to potrzebne. Dawka oraz czas trwania leczenia zależy od względnego czasu utrzymywania się cząsteczek według wynalazku i innych tu opisanych w krwioobiegu człowieka i mogą one być dostosowane przez specjalistę w dziedzinie wynalazku, zależnie od leczonego stanu oraz ogólnego zdrowia pacjenta.

Środek terapeutyczny według wynalazku i inne tu opisane mogą być podawane w jakikolwiek odpowiedni sposób, który dostarcza środek do organizmu pacjenta. Antagoniści i przeciwciała oraz środki farmaceutyczne według wynalazku i inne tu opisane są szczególnie odpowiednie do podawania pozajelitowego, tj. podskórnego, domięśniowego, dożylnego lub donosowego.

Środki terapeutyczne według wynalazku i inne tu opisane można wytwarzać jako środki farmaceutyczne zawierające skuteczną ilość antagonisty lub przeciwciała według wynalazku i innego tu opisanego, jako składnika czynnego, w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku. W przypadku środka profilaktycznego korzystna jest zawiesina wodna lub roztwór zawierający zmodyfikowane przeciwciało, korzystnie buforowane przy fizjologicznym pH, w postaci gotowej do zastrzyku. Preparaty do podawania pozajelitowego standardowo będą zawierać roztwór antagonisty lub przeciwciała według wynalazku lub innego tu opisanego albo ich koktajl rozpuszczony w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, korzystnie w wodnym nośniku. Można stosować wiele różnych wodnych nośników, np. 0,9% roztwór soli, 0,3% roztwór glicyny itp. Roztwory te są jałowe i ogólnie wolne od cząstek substancji stałych. Roztwory te można wyjałowić z zastosowaniem standardowych, dobrze znanych technik sterylizacji (np. przez filtracje). Preparaty mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze wymagane do przybliżenia warunków fizjologicznych, takie jak środki do nastawiania pH i środki buforujące itd. Stężenie antagonisty lub przeciwciała według wynalazku lub innego tu opisanego w takim preparacie farmaceutycznym może się różnić w szerokim zakresie, tj. od mniej niż około 0,5%, zazwyczaj przy lub co najmniej około 1% aż do 15 lub 20% (wag.) oraz zostanie wybrane głównie w oparciu o objętość płynu, lepkość itd., zgodnie z konkretnym wybranym sposobem podawania.

Zatem środek farmaceutyczny według wynalazku lub inny tu opisany do zastrzyków domięśniowych można przygotować tak, aby zawierał 1 ml jałowej buforowanej wody oraz pomiędzy około 1 ng do około 100 mg, np. około 50 ng do około 30 mg lub korzystniej, około 5 mg do około 25 mg, antagonisty lub przeciwciała według wynalazku lub innego tu opisanego. Podobnie preparat farmaceutyczny według wynalazku lub inny tu opisany do wlewu dożylnego można przygotować tak, aby zawierał około 250 ml jałowego płynu Ringera oraz około 1 do około 30 oraz korzystnie 5 mg do około 25 mg zmodyfikowanego przeciwciała według wynalazku lub innego tu opisanego. Obecne sposoby wytwarzania preparatów podawanych pozajelitowo są dobrze znane i oczywiste dla specjalistów w dziedzinie wynalazku i są opisane bardziej szczegółowo np. w Remington's Pharmaceutical Science, 15. wyd.,

Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Środek terapeutyczny według wynalazku lub inny tu opisany, gdy jest obecny w preparacie farmaceutycznym, może być obecny w postaci pojedynczej dawki. Odpowiednią terapeutycznie skuteczną dawkę może łatwo określić specjalista w dziedzinie wynalazku. W celu skutecznego leczenia

PL 211 014 B1 udaru i innych chorób neurologicznych u ludzi należy podawać jedną dawkę zawierającą do 700 mg, na 70 kg masy ciała, antagonisty lub przeciwciała, pozajelitowo, korzystnie dożylnie lub i.m. (domięśniowo). Taka dawka może być, jeżeli jest to potrzebne, powtórzona z odpowiednimi przerwami czasowymi, wybranymi w odpowiedni sposób przez lekarza.

Przeciwciała tutaj opisane można liofilizować do przechowywania i roztwarzać w odpowiednim nośniku przed zastosowaniem. Wykazano, że technika ta jest skuteczna dla standardowych immunoglobulin i można stosować znane w dziedzinie wynalazku techniki liofilizacji i roztwarzania.

Środek farmaceutyczny zawierający przeciwciało anty-MAG według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik może być przeznaczony do leczenia lub profilaktyki udaru oraz innych chorób neurologicznych.

Środek farmaceutyczny zawierający przeciwciało anty-MAG według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik może być także przeznaczony do hamowania neurodegeneracji i/lub pobudzania odzyskania funkcji u pacjenta będącego człowiekiem, cierpiącego na lub z ryzykiem wystąpienia udaru lub innej choroby neurologicznej.

Poniżej opisano figury rysunku powołane w opisie wynalazku.

Fig. 1: Sekwencja łańcucha ciężkiego chimerycznego przeciwciała mysio/ludzkiego anty-MAG (SEQ ID NO: 27).

Fig. 2: Sekwencja łańcucha lekkiego chimerycznego przeciwciała mysio/ludzkiego anty-MAG (SEQ ID NO: 28).

Fig. 3: Sekwencja łańcucha ciężkiego chimerycznego przeciwciała mysio/ludzkiego anty-MAG (SEQ ID NO: 29).

Fig. 4: Chimeryczne przeciwciało anty-MAG wiąże szczurzą MAG.

Fig. 5: Sekwencje humanizowanych przeciwciał anty-MAG.

Fig. 6: Humanizowane przeciwciała anty-MAG wiążą szczurzą MAG.

Fig. 7: Humanizowane przeciwciała anty-MAG wiążą szczurzą MAG.

Fig. 8: Humanizowane przeciwciała anty-MAG wiążą ludzką MAG.

Fig. 9: Konkurencyjny test ELISA z przeciwciałami anty-MAG, mysim i humanizowanymi

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.

P r z y k ł a d 1. Przeciwciało anty-MAG w modelu udaru

Materiały i metody

Przeciwciało monoklonalne anty-MAG

Przeciwciałem monoklonalnym anty-MAG było mysie przeciwciało przeciw kurzej MAG MAB 1567 uzyskane z Chemicon. Przeciwciało to wykazuje następujące cechy:

Antygen: glikoproteina związana z mieliną (ludzka, mysia, szczurza, bydlęca, kurza, żabia)

Izotyp: IgG1

Zdolność neutralizacji: patrz DeBellard i in., (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tang i in., (1997) Mol. Cell Neurosci 9, 333-346; Torigoe K i Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262.

Kontrolne IgG1 mAb zakupiono z R+D Systems.

Śródmózgowa kaniulacja komorowa (tylko do badania 1)

Pod znieczuleniem halotanem śródmózgową komorową (i.c.v.) kaniulę umiejscowiono w lewej bocznej komorze mózgowej (współrzędne: 1,6 mm od linii przyśrodkowej, 0,8 mm ogonowo od bregmy, 4,1 mm od powierzchni czaszki, łuk sieczny - 3,2 mm poniżej zero według Paxinos i Watson, 1986). Wszystkie szczury umieszczono pojedynczo, aby zapobiec uszkodzeniu naprowadzającej lub pozorującej kaniuli. Siedem dni po operacji prawidłowe umiejscowienie kaniuli potwierdzono przez zbadanie odpowiedzi na angiotensynę II (100 ng, Simpson i in. 1978) przejawiającej się intensywnym pragnieniem. Dziewięć dni później szczury przeszły niedokrwienie mózgu.

Przejściowe ogniskowe niedokrwienie mózgu

Przejściowe (90 minut) miejscowe niedokrwienie mózgu wywołano u samców szczurów Sprague Dawley, z których każdy ważył 300-350 g. Początkowo zwierzęta znieczulono mieszaniną 5% halotanu, 60% podtlenku azotu i 30% tlenu, podaną przez maskę, a następnie znieczulenie utrzymywano przy 1,5% halotanu. Zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej (MCAO) przeprowadzono z zastosowaniem techniki wykorzystującej nić wewnątrz światła przewodu jak wcześniej opisano (Zea Longa i in., 1989). U zwierząt utrzymywano prawidłową temperaturę ciała podczas procedury chirurgicznej, a następnie pozostawiono je do odzyskania sił na 1 godzinę w inkubatorze, po czym umieszczono je w pojedynczych klatkach. Tylko zwierzęta z punktacją neurologiczną 3 po 1 godzinie zamknięcia tętnicy włączono do badania (co oszacowano za pomocą systemu 5-stopniowej skali: 0, brak objawów; 1, odruch przeciwstronny; 2, osłabiony

PL 211 014 B1 uścisk; 3, chodzenie w kółko; 4, nieruchomość; 5, śmierć). Zwierzęta utrzymywano do czasu jednego tygodnia, a następnie uśmiercono je przez perfuzję przezsercową 0,9% roztworu soli, a następnie 4% paraformaldehydu w 100 mM buforze fosforanowym. Następnie mózgi utrwalano w 4% paraformaldehydzie w 4°C przez 48 godzin, po czym usunięto je z czaszek i pocięto na 2 mm bloki za pomocą przyrządu „a rat brain matrix”. Następnie 2 mm przekroje zatopiono w parafinie za pomocą urządzenia do obróbki tkanek Shandon Citadel 1000, pocięto na 6 μm skrawki za pomocą mikrotonu i umieszczono na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną. Następnie próbki poddano obróbce w celu wybarwienia Cresyl Fast Violet (CFV) (szybkie wybarwienie fioletem krezolowym).

Tryb dawkowania

Przeciwciało monoklonalne anty-MAG i mysie przeciwciało kontrolne izotypu IgG1 dializowano względem jałowego 0,9% chlorku sodu przez noc i odpowiednio zagęszczono.

Badanie 1: Zwierzęta otrzymały 2,5 μg mAb anty-MAG lub 2,5 μg mysiego IgG i.c.v. po 1, 24 i 72 godzinach od MCAO (5 μl na dawkę).

Badanie 2: Zwierzęta otrzymały 200 μg mAb anty-MAG lub 200 μg mysiego IgG i.v. po 1 i 24 godzinach od MCAO.

Dane dotyczące każdego dawkowanego roztworu nie były znane badaczowi.

Ocena neurologiczna

Przed wywołaniem niedokrwienia mózgowego szczury z Badania 1 trenowano w testach chodzenia po równoważni oraz nalepki. Zwierzęta niespełniające kryteriów obu tych testów wykluczono z dalszych badań. Po treningu pozostałe zwierzęta podzielono zależnie od sprawności na dwie zbalansowane grupy. Podczas badania neurologicznego dane dotyczące badanej grupy zwierząt nie były znane dla badacza.

Obustronny test nalepki

Obustronny test nalepki (Schallert i in., Pharmacology Biochemistry and Behaviour 16:455-462, (1983)) zastosowano do oszacowania zaniedbania przeciwstronnego/tendencji jednostronnych. Jest to model zaniku dotykowego obserwowanego u pacjentów z udarem (Rose i in., 1994). Test ten wcześniej opisano szczegółowo (Hunter i in., Neuropharmacology 39:806-816 (2000); Virley i in., Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 20:563-582 (2000)). W skrócie, okrągłą nalepkę umiejscowiono dokładnie wokół pozbawionego futra obszaru przednich łap z równym naciskiem, z losową kolejnością umieszczania (lewa, prawa). Przeprowadzono sesje treningowe przez 6 dni przed MCAO, dane z dnia 6 zastosowano jako przedoperacyjną linię podstawową (dzień 0). Zwierzęta poddano dwóm próbom po 24 godzinach i 7 dniach po MCAO, przy czym dane stanowią średnią z dwóch prób. Opóźnienie dotknięcia i usunięcia nalepek zanotowano i analizowano za pomocą testu logarytmicznego rang (Cox, J. Royal Statistical Society B 34:187-220 (1972)).

Chodzenie po równoważni

Chodzenie po równoważni zastosowano do zmierzenia koordynacji kończyn przednich i tylnych na podstawie dystansu przebytego wzdłuż podniesionej 100 cm równoważni (średnica 2,3 cm, 48 cm ponad podłogą) jak wcześniej opisano szczegółowo (Virley i in., Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 20:563-582 (2000)). Szczury trenowano w przechodzeniu równoważni od początku do końca. W badaniach każdego szczura poddano dwu próbom po 24 godzinach i 7 dniach od MCAO, dane odpowiadają średniej z dwóch prób. Jako analizę statystyczną zastosowano ANOVA, a następnie test t-Studenta.

27-punktowa skala neurologiczna (Badanie 1)

Badanie to obejmowało zestaw testów oceniających stan neurologiczny włącznie z umiejscowieniem łap, wizualnym zasięgiem łapy przedniej, testem poziomego drążka, obrotem przeciwstronnym, testem równi pochyłej, odruchem prawostronnym, odruchem przeciwstronnym, ruchliwością i ogólnym stanem, jak wcześniej opisano (Hunter i in., Neuropharmacology 39:806-816 (2000)) z dodaniem pomiaru siły uścisku (2 punkty za dobry uścisk przedniej łapy, 1 punkt za słaby uścisk). Całkowita punktacja = 27 dla prawidłowego zwierzęcia.

W Badaniu 2 test ten dalej zmodyfikowano: siła uścisku - normalna 3 punkty, dobra - 2, słaba - 1, bardzo słaba - 0; ruchliwość - normalna 4 punkty, doskonała - 3, bardzo dobra - 2, dobra - 1, słaba - 0; ogólny stan - normalny 4 punkty, doskonały - 3, bardzo dobry - 2, dobry - 1, słaby - 0; chodzenie w kółko - brak 5 punktów, z tendencją na jedną stronę - 4 punkty, duże kółka - 3, średnie kółka - 2, małe kółka - 1, wirowanie - 0. Całkowita punktacja = 32 dla prawidłowego zwierzęcia.

W obydwu badaniach zwierzęta zbadano po 1, 24, 48 godzinach oraz 7 dniach od MCAO, zdrowe i prawidłowe zwierzęta otrzymały odpowiednio 27 lub 32 punkty. Dane przedstawiono w postaci wartości median, a jako analizę statystyczną zastosowano analizę Kruskil Wallis ANOVA.

PL 211 014 B1

Ocena uszkodzenia

Badanie 1 - Dla każdego zwierzęcia obszary uszkodzenia oceniono w skrawkach z trzech wstępnie określonych poziomów w mózgu (odpowiednio 0, -2,0 oraz -6,0 mm od Bregmy). Uszkodzenie neuronalne określono stosując szybkie barwienie fioletem krezolowym oraz program do obrazo₂ wania Optimas 6.1. Dane wyrażono jako średni obszar (mm²) ± sem.

Badanie 2 - Dla każdego zwierzęcia obszary uszkodzenia oceniono w skrawkach z siedmiu wstępnie określonych poziomów w mózgu (od +3 mm do -8 mm względem Bregmy). Uszkodzenie neuronalne określono stosując szybkie barwienie fioletem krezolowym oraz program do obrazowania ₂

Optimas 6.1. Dane wyrażono jako średni obszar (mm²) ± sem.

Wyniki

Badanie 1 - Podanie przez śródmózgową kaniulę komorową (i.c.v.) mAb anty-MAG

Punktacja neurologiczna

Godzinę po MCAO zwierzęta z obydwu badanych grup wykazywały wyraźne zaburzenie punktacji neurologicznej (mediana punktacji 12 w każdej grupie). W tym punkcie czasowym brak było istotnych różnic pomiędzy grupami. Jednakże 24 (p = 0,02), 48 (p = 0,005) godziny oraz 7 dni (p = 0,006) po MCAO zwierzęta leczone mAb anty-MAG (2,5 μg, 1, 24 i 72 godziny po MCAO) wykazywały znaczącą poprawę całkowitej punktacji neurologicznej w porównaniu ze zwierzętami traktowanymi kontrolną IgG. Mediany punktacji neurologicznych po 24, 48 godzinach oraz 7 dniach od MCAO w grupie leczonej IgG1 wynosiły odpowiednio 15, 14 i 18, w porównaniu z wartościami 19,5, 21,5 oraz 22 dla zwierząt leczonych mAb anty-MAG. W dalszej analizie dotyczącej poszczególnych zachowań składających się na całkowitą punktację, znaczącą poprawę przypisano głównie poprawie sprawności w następujących testach: umiejscowienia łap (24 godziny, p = 0,045; 48 godzin, p = 0,016; 7 dni p = 0,008); siły uścisku (24 godziny, p = 0,049; 48 godzin, p = 0,0495; 7 dni p = 0,243), ruchliwości (24 godziny, p = 0,199; 48 godzin, p = 0,012; 7 dni p = 0,067), poziomego drążka (24 godziny, p = 0,065; 48 godzin, p = 0,005; 7 dni p = 0,016), równi pochyłej (24 godziny, p = 0,006; 48 godzin, p = 0,006; 7 dni p = 0,0169), wizualnego zasięgu łapy przedniej (48 godzin, p = 0,049; 7 dni p = 0,049) oraz stopnia chodzenia w kółko (24 godziny, p = 0,417; 48 godzin, p = 0,034; 7 dni p = 0,183).

Chodzenie po równoważni

Przed operacją wszystkie zwierzęta trenowano w przechodzeniu przez równoważnię (100 cm). Dwadzieścia cztery godziny po operacji zaobserwowano znaczne skrócenie dystansu przechodzonego przez zwierzęta z grup leczonych zarówno przeciwciałem anty-MAG (50±18 cm), jak i IgG1 (22±14 cm) w porównaniu z wartościami przedoperacyjnymi. Chociaż nie było to istotne statystycznie, zaobserwowano wyraźne polepszenie w porównaniu ze zwierzętami leczonymi IgG1 pod tym względem, że zwierzęta przechodziły dwukrotnie dłuższy dystans niż leczone IgG1 w 24 godziny po MCAO. Siedem dni po operacji, chociaż obydwie grupy wykazały poprawę z biegiem czasu, sprawność zwierząt leczonych IgG pozostała znacząco zaburzona w porównaniu z wartością podstawową (55±15 cm; p = 0,005). Jednakże w odróżnieniu od tego 7 dni po MCAO sprawność zwierząt leczonych mAb antyMAG (2,5 μg 1, 24 i 72 godziny, i.c.v po MCAO) nie różniła się istotnie od wartości podstawowej (75±15 cm; p = 0,07). Dane te pokazują, że leczenie mAb anty-MAG przyspieszało powrót sprawności w zadaniu chodzenia po równoważni w porównaniu z kontrolnymi myszami leczonymi IgG1.

Test nalepki

Przed operacją zwierzęta w każdej grupie szybko dotknęły i usunęły nalepki z każdej z przednich łap, przy czym brak było istotnej różnicy w grupach przed leczeniem (tabela 1). Dwadzieścia cztery godziny oraz 7 dni po MCAO opóźnienie dotknięcia lewej łapy w każdej z leczonych grup pozostało względnie niezmienione, podczas gdy dla prawej łapy wyraźnie się wydłużyło. Jednakże nie stwierdzono istotnych różnic pomiędzy czasami usuwania u zwierząt leczonych przeciwciałem antyMAG i IgG1. Ponadto 24 godziny po MCAO, opóźnienie usunięcia z zarówno lewej, jak i prawej przedniej łapy było istotnie wydłużone w obu badanych grupach w porównaniu z poziomem podstawowym, jednakże u zwierząt leczonych przeciwciałem anty-MAG opóźnienie usunięcia nalepki z lewej łapy było istotnie krótsze niż u zwierząt leczonych IgG1 (p = 0,03). Zaobserwowano także trend skrócenia opóźnienia usunięcia z prawej łapy u zwierząt leczonych przeciwciałem anty-MAG w porównaniu ze zwierzętami leczonymi IgG1 (p = 0,08) (tabela 1). Siódmego dnia zaobserwowano pewien stopień powrotu do normy u zwierząt leczonych IgG1, pod tym względem, że opóźnienie usunięcia dla każdej z przednich łap było skrócone w porównaniu z danymi dla 24 godzin (tabela 1). Dane te sugerują, że leczenie szczurów mAb anty-MAG przyśpiesza powrót do normy w teście nalepki po MCAO.

PL 211 014 B1

T a b e l a 1. Dane z testu nalepki

Dzień	Leczenie	Czas do dotknięcia (s) (średnia ± sem)	Czas do usunięcia (s) (średnia ± sem)
Lewa łapa przednia	Prawa łapa przednia	Lewa łapa przednia	Prawa łapa przednia
0	Anty-MAG	2,4 ± 0,2	3,6 ± 0,5	12 ± 2	12 ± 2
0	igGi	3,3 ± 0,6	4,2 ± 0,7	10 ± 1	9 ± 1
1	Anty-MAG	5,9 ± 3,7	109,6 ± 27,5	*61 ± 26	96 ± 26
1	IgGi	3,6 ± 0,5	71,8 ± 31,7	130 ± 21	156 ± 19
7	Anty-MAG	3,8 ± 1	36,4 ± 10,2	54 ± 23	80 ± 30
7	IgGi	2,8 ± 0,3	64 ± 28	23 ± 8	87 ± 20

(*p = 0,03, mAb anty-MAG względem IgG1 przy zastosowaniu testu logarytmicznego rang)

Pomiar obszaru uszkodzenia

Podawanie mAb anty-MAG i.c.v, istotnie zmniejszyło obszar uszkodzenia w dwóch z trzech zbadanych poziomów mózgu w porównaniu ze zwierzętami leczonymi równymi ilościami mysiego IgG1 przy badaniu 7 dni po tMCAO (tabela 2).

T a b e l a 2.

	Średni obszar uszkodzenia ± sem (mm2) 7 dni po tMCAO
Leczenie	0 mm wzgl. Bregmy	-2 mm wzgl. Bregmy	-6 mm wzgl. Bregmy
mAb anty-MAG (n = 8)	*9 ± 2	$4 ± 3	#3 ± 1
Mysie IgG1 (n = 9)	14 ± 1	12 ± 1	5 ± 1

(*p = 0,02, $p=0,03, #p = 0,06, mAb anty-MAG względem IgG1, jednostronny test T Studenta dla prób niezależnych)

Badanie 2 - Podawanie dożylne (i.v.)

Punktacja neurologiczna

Godzinę i 24 godziny po MCAO zwierzęta w obydwu grupach wykazywały znaczne upośledzenie punktacji neurologicznej. W tych punktach czasowych nie zaobserwowano istotnej różnicy, a mediany punktacji wynosiły 20 i 18 po 24 godzinach po leczeniu odpowiednio mAb anty-MAG i IgG1 (p = 0,5). Czterdzieści osiem godzin po MCAO zwierzęta leczone mAb anty-MAG (200 μg, i.v. 1 i 24 godziny po MCAO) wykazywały istotną poprawę w umiejscowieniu łap (p = 0,048) oraz sile uścisku (p = 0,033). Siedem dni po rozpoczęciu niedokrwienia mózgowego u zwierząt leczonych mAb antyMAG obserwowano kontynuację poprawy (umiejscowienie łap p = 0,041; siła uścisku, p = 0,048; ruchliwość, p = 0,05) oraz wykazywały one istotną poprawę całkowitej punktacji neurologicznej (mediana punktacji 25) w porównaniu z leczonymi mysim IgG1 (mediana punktacji 23, p = 0,047).

Pomiary obszaru uszkodzenia

Przeciwciało anty-MAG podane i.v. po MCAO istotnie zmniejszyło obszar uszkodzenia w 5 z 7 wstępnie określonych poziomach mózgu (od +3 do -8 mm względem Bregmy) w porównaniu z izotopowymi kontrolami, przy badaniu 7 dni po MCAO.

Poziom mózgu wzgl. Bregmy	Średni obszar uszkodzenia ± sem (mm2) - leczone anty-MAG	Średni obszar uszkodzenia ± sem (mm2) - leczone mysim IgG1
3 mm	*0,38 ± 0,27	1,77 ± 0,45
1 mm	*5,82 ± 1,65	9,627 ± 1,14
-1 mm	8,98 ± 2,58	12,07 ± 1,57
-2 mm	7,28 ± 1,92	10,04 ± 1,87
-4 mm	*5,57 ± 1,06	10,38 ± 1,39
-6 mm	*1,36 ± 0,51	4,43 ± 1,95
-8 mm	*0,27 ± 0,27	1,93 ± 0,56

*p < 0,05, jednostronny test T Studenta dla prób niezależnych

PL 211 014 B1

Wnioski

Przeciwciało monoklonalne anty-MAG podawane zarówno bezpośrednio do CSF, jak i dożylnie po przejściowym zamknięciu środkowej tętnicy mózgowej u szczurów zmniejszało obszar śmierci komórek oraz polepszało odzyskanie funkcji w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Stopień neuroochrony obserwowany w tych badaniach sugeruje, że efektu tego nie można przypisać kiełkowaniu aksonów, gdyż nie spowodowałoby to zachowania neuronów. Poprawa odzyskania funkcji obserwowana po 24 i 48 godzinach od MCAO prawdopodobnie odzwierciedla stopień neuroochrony wywoływany przez to przeciwciało w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Jednakże, wraz z upływem czasu stan zwierząt dalej się poprawiał, co sugeruje, że blokowanie aktywności MAG może także poprawić odzyskanie funkcji wraz z czasem.

Przedstawione tutaj badania dostarczają dowód, że blokowanie działania MAG zapewnia zarówno neuroochronę, jak i poprawę odzyskania funkcji w szczurzym modelu udaru, a zatem przeciwciała anty-MAG dostarczają potencjalne środki terapeutyczne do doraźnej neuroochrony i/lub pobudzania odzyskania funkcji po udarze. Małe ilości przeciwciała podawane na drodze i.v. oraz wynikające z nich niskie poziomy przeciwciała w surowicy będą z kolei sugerować występowanie w mózgu bardzo niskich stężeń przeciwciał, ze względu na ograniczenia przenikania przeciwciał przez barierę krew-mózg. Jednakże nieoczekiwanie wywoływały one nadal zarówno neuroochronę, jak i pobudzenie odzyskania funkcji. Przeciwciała anty-MAG wykazują także potencjał stosowania w leczeniu innych zaburzeń neurologicznych w których widoczna jest degeneracja komórek oraz włókien nerwowych, takich jak uraz rdzenia kręgowego, traumatyczny uraz mózgu, neuropatia obwodowa, choroba Alzheimera, otępienia czołowo-skroniowe (tauopatie), choroba Parkinsona, choroba Huntingtona oraz stwardnienie rozsiane. W poniższych przykładach regiony CDR opisanych tutaj chimerycznych i humanizowanych przeciwciał stanowią regiony CDR przeciwciała z przykładu 1.

P r z y k ł a d 2. Przeciwciało chimeryczne

Zmienione przeciwciała obejmują przeciwciała chimeryczne, które zawierają regiony zmienne pochodzące z jednego gatunku połączone z regionami zmiennymi z innego gatunku. Przykłady mysioludzkich chimerycznych łańcuchów immunoglobulin anty-MAG przedstawiono na fig. 1, 2 i 3. Można wytwarzać mysio-ludzkie chimery, zawierające regiony stałe IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgD, a także chimery łączące mysie regiony zmienne z regionami stałymi łańcuchów lekkiego lub ciężkiego z gatunków innych niż człowiek.

Fig. 1 (SEQ ID NO: 27) przedstawia sekwencję aminokwasową chimerycznego lekkiego łańcucha immunoglobulinowego, w którym region zmienny łańcucha ciężkiego mysiego anty-MAG jest związany z funkcjonalną immunoglobulinową wydzielniczą sekwencją sygnałową oraz ze zmienioną postacią regionu stałego ludzkiego IgG1, w którym reszty Kabat 248 i 250 zmutowano do alaniny w celu zablokowania funkcji efektorowych wiązania z FcyRI oraz białkiem dopełniacza C1q (Duncan, A.R. i Winter, G. Localization of the C1q binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738-740, 1988. Duncan, A.R., Woolf, J.M., Partridge, L.J., Burton, D.R. i Winter, G. Localisation of the binding site for human FcR1 on IgG. Nature 332, 563-564, 1988). Takie mutacje dodatkowo wprowadza się w celu dostosowania indywidualnych właściwości zmienionego przeciwciała w celu osiągnięcia konkretnego efektu terapeutycznego - np. wiązania z oraz blokowania działania antygenu bez aktywacji litycznych mechanizmów efektorowych.

Fig. 2 (SEQ ID NO: 28) przedstawia sekwencję aminokwasową chimerycznego lekkiego łańcucha immunoglobulinowego, w którym mysi region zmienny łańcucha lekkiego anty-MAG jest związany z funkcjonalną immunoglobulinową wydzielniczą sekwencją sygnałową oraz z ludzkim regionem stałym kappa.

Podobnie, regiony zmienne anty-MAG mogą być związane z regionami stałymi immunoglobuliny, w których brak jest mutacji blokujących funkcje efektorowe. Fig. 3 (SEQ ID NO: 29) dostarcza sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w którym region zmienny łańcucha ciężkiego anty-MAG jest związany z funkcjonalną immunoglobulinową wydzielniczą sekwencją sygnałową oraz formą typu dzikiego regionu stałego ludzkiego IgG1.

Korzystając z informacji podanych na fig. 1 do 3, standardowymi technikami biologii molekularnej znanymi specjaliście w dziedzinie wynalazku można przygotować wstawki cDNA, kodujące te łańcuchy chimeryczne. W skrócie, kod genetyczny stosuje się do zidentyfikowania kodonów nukleotydowych kodujących pożądane aminokwasy, wytwarzając wirtualną sekwencję cDNA, kodującą chimeryczne białko. Jeżeli pożądane jest, aby wstawka cDNA była eksprymowana w konkretnym organizmie, można wybrać szczególnie korzystne kodony w oparciu o znane preferencje w użyciu kodonów.

PL 211 014 B1

Następnie pożądaną sekwencję nukleotydową syntetyzuje się drogą amplifikacji PGR na matrycy zawierającej nachodzące na siebie syntetyczne oligonukleotydy, które, jako kontig, stanowią pożądaną sekwencję. Powstały produkt można także zmodyfikować drogą PCR lub mutagenezy, tak by przyłączyć miejsca restrykcyjne ułatwiające klonowanie do odpowiedniego plazmidu do ekspresji lub dalszych manipulacji.

P r z y k ł a d 3. Chimeryczne przeciwciało wiąże się ze szczurzą MAG w teście ELISA

Chimeryczne przeciwciało anty-MAG zawierające opisane tu regiony CDR łańcucha lekkiego i ciężkiego wytworzono przez przejściową transfekcję komórek CHO. W tym celu zastosowano odczynnik do transfekcji Transfast (Promega; E2431), a transfekcję przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, w 6-studzienkowych płytkach do hodowli wysiano ~10⁶ komórek CHO na studzienkę. Następnego dnia ssaczy wektor ekspresyjny DNA, kodujący odpowiedni łańcuch ciężki lub lekki, zmieszano w stosunku 1:1 (5 μg całkowitego DNA) z pożywką (Optimem1 z Glutamax; Gibco #51985-026). Odczynnik do transfekcji Transfast dodano i roztwór przeniesiono do studzienek z konfluentnymi warstwami komórek. Po 1 godzinie w 37°C w inkubatorze do komórek, na mieszaninę DNA/Transfast naniesiono 2 ml pożywki Optimem i pozostawiono na 48-72 godziny w inkubatorze. Zebrano supernatanty, oczyszczono je przez odwirowanie i przepuszczono przez 0,2 μm filtry. Stężenie przeciwciał w supernatancie z hodowli komórek CHO oznaczono metodą ELISA i oszacowano, że wynosiło ono około 0,5 μg/ml. Do wiązania MAG zastosowano dostępne w handlu białko fuzyjne szczurza MAG-Fc. Ze względu na fuzję z ludzkim Fc chimeryczne przeciwciała nie mogły być wykryte za pomocą drugorzędowych przeciwciał przeciw ludzkiej IgG. Zamiast tego zastosowano specyficzne przeciwciało przeciw ludzkiemu lekkiemu łańcuchowi kappa. Fig. 4 przedstawia, że to chimeryczne przeciwciało wiąże MAG nawet w rozcieńczeniu 1/64. Niespokrewnione przeciwciało humanizowane i supernatant z hodowli komórek pozornie transfekowanych nie wytwarzały żadnego sygnału w tym teście.

Procedura

Płytki do mikromiareczkowania ELISA (Nunc Maxisorp) powlekano 1 μg/ml białka fuzyjnego szczurza MAG-Fc (R&D systems; 538-MG) w PBS w 4°C przez noc. Płytki przemyto dwukrotnie PBS i zablokowano PBS/BSA (1% wag./obj.) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Supernatanty z hodowli przejściowo transfekowanych komórek CHO przefiltrowano przez filtry 0,2 μm i kolejno rozcieńczono w PBS/BSA, rozpoczynając od czystego supernatantu do rozcieńczenia 1/64. Rozcieńczone próbki pozostawiono w RT przez 1 godzinę. Następnie płytki przemyto trzykrotnie PBS/Tween 20 (0,1% obj./obj.). Przeciwciałem wykrywającym było kozie przeciwciało specyficzne wobec ludzkiego łańcucha lekkiego kappa, sprzężone z peroksydazą (Sigma A-7164) rozcieńczone w stosunku 1/2000 w PBS/BSA. Przeciwciało wykrywające inkubowano przez 1 godzinę w RT, a następnie płytki przemyto jak powyżej. Następnie dodano roztwór substratu (Sigma Fast OPD P-9187) i inkubowano do czasu wykrycia wywołania odpowiedniego zabarwienia, a następnie zatrzymano za pomocą 3M H2SO4. Wywołanie zabarwienia odczytano przy 490 nm.

P r z y k ł a d 4. Przeciwciała humanizowane

Zmienione przeciwciała obejmują przeciwciała humanizowane, zawierające humanizowane regiony zmienne połączone z ludzkimi regionami stałymi. Przykłady humanizowanych łańcuchów immunoglobulin anty-MAG według wynalazku zamieszczono na fig. 5. Można wytworzyć przeciwciała humanizowane stosując stałe regiony IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM i IgD.

Fig. 5 (SEQ ID NO: 30) przedstawia przykład sekwencji aminokwasowej humanizowanego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, w którym humanizowany region zmienny łańcucha ciężkiego antyMAG jest połączony z funkcjonalną wydzielniczą sekwencją sygnałową oraz ze zmienionym regionem stałym IgG1, w którym reszty Kabat 248 i 250 zostały zmutowane do alaniny w celu zablokowania funkcji efektorowych wiązania z FcyRI oraz białkiem dopełniacza C1q (Duncan, A.R. i Winter, G. Localization of the C1q binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738-740, 1988. Duncan, A.R., Woolf, J.M., Partridge, LJ., Burton, D.R. i Winter, G. Localisation of the binding site for human FcR1 on IgG. Nature 332, 563-564, 1988). Takie mutacje ewentualnie wprowadza się w celu dostosowania właściwości zmienionego przeciwciała tak, aby osiągnąć konkretny efekt terapeutyczny - np. wiązanie z oraz blokowanie działania antygenu bez aktywacji litycznych mechanizmów efektorowych.

Fig. 5 (SEQ ID NO: 31) przedstawia także przykład sekwencji aminokwasowej humanizowanego łańcucha lekkiego immunoglobuliny, w którym humanizowany region zmienny łańcucha ciężkiego anty-MAG jest połączony z funkcjonalną wydzielniczą sekwencją sygnałową oraz z regionem stałym kappa.

PL 211 014 B1

Podobnie regiony zmienne anty-MAG mogą być związane z regionami stałymi immunoglobuliny nie zawierającymi mutacji blokujących funkcje efektorowe. Fig. 5 (SEQ ID NO: 32) przedstawia sekwencję aminokwasową humanizowanego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w którym region zmienny łańcucha ciężkiego anty-MAG jest związany z funkcjonalną wydzielniczą sekwencją sygnałową oraz z regionem stałym ludzkiego IgG1 typu dzikiego.

Na podstawie informacji dostarczonej na fig. 5, standardowymi technikami biologii molekularnej znanymi specjaliście w dziedzinie wynalazku można wytworzyć wstawki cDNA, kodujące te humanizowane łańcuchy. W skrócie, kod genetyczny stosuje się do zidentyfikowania kodonów nukleotydów kodujących pożądane aminokwasy, wytworzenia wirtualnej sekwencji cDNA kodującej białko. Jeżeli pożądane jest, żeby wstawka cDNA była eksprymowana w konkretnym organizmie, można wybrać szczególnie korzystne kodony w oparciu o znane preferencje w użyciu kodonów. Następnie pożądaną sekwencję nukleotydową syntetyzuje się drogą amplifikacji PCR na matrycy zawierającej nachodzące na siebie syntetyczne oligonukleotydy, które, jako kontig, stanowią pożądaną sekwencję. Powstały produkt można także zmodyfikować drogą PCR lub mutagenezy tak, aby przyłączyć miejsca restrykcyjne ułatwiające klonowanie do odpowiedniego plazmidu do ekspresji lub dalszych manipulacji.

P r z y k ł a d 5. Humanizowane przeciwciała anty-MAG wiążą szczurzą i ludzką MAG w teście ELISA

1) Test ELISA bezpośredniego wiązania białka fuzyjnego szczurza MAG-Fc z normalizowanymi ilościami supernatantu z hodowli dla 9 kombinacji humanizowanych łańcuchów ciężkiego i lekkiego.

Humanizowane przeciwciała anty-MAG zawierające opisane tu regiony CDR łańcucha lekkiego i ciężkiego wytworzono przez przejściową transfekcję komórek CHO. W tym celu zastosowano odczynnik do transfekcji Transfast (Promega; E2431) i transfekcję przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, w 6-studzienkowych płytkach do hodowli wysiano ~10⁶ komórek CHO na studzienkę. Następnego dnia ssaczy wektor ekspresyjny DNA kodujący odpowiedni łańcuch ciężki lub lekki zmieszano w stosunku 1:1 (5 μg całkowitego DNA) z pożywką (Optimem1 z Glutamax; Gibco #51985-026). Dodano odczynnik do transfekcji Transfast i roztwór przeniesiono do studzienek z konfluentnymi warstwami komórek warstwami komórek. Po 1 godzinie w 37°C w inkubatorze do komórek, na mieszaninę DNA/Transfast naniesiono 2 ml pożywki Optimem i pozostawiono na 48-72 godziny w inkubatorze. Zebrano supernatanty, oczyszczono je przez odwirowanie i przepuszczono przez 0,2 μm filtry. Z sekwencji przedstawionych w tabeli poniżej wytworzono 9 kombinacji łańcuchów ciężkiego i lekkiego, a regiony stałe IgG1 były funkcjonalne według SEQ ID.

SEQ ID NO (regiony V)	Opis	Alternatywna nazwa
13	Humanizowany Vh	BVh1
14	Humanizowany Vh	BVh2
15	Humanizowany Vh	BVh3
16	Humanizowany VI	CVI1
17	Humanizowany VI	CVI2
18	Humanizowany VI	CVI3
19	Humanizowany VI	CVI4

Stężenie przeciwciał oznaczono za pomocą testu ELISA, a ilości supernatantu stosowane w teście normalizowano do wyjściowego stężenia 250 lub 500 ng/ml (zależnie od stężenia supernatantu z hodowli). Jako antygen zastosowano dostępne w handlu białko fuzyjne szczurza MAG-Fc (R&S Systems; 538-MG). Ze względu na fuzję tego antygenu z ludzkim Fc, związane chimeryczne przeciwciała nie mogły być wykryte za pomocą ogólnych drugorzędowych przeciwciał przeciw ludzkiej IgG. Zamiast tego zastosowano specyficzne przeciwciało przeciw ludzkiemu lekkiemu łańcuchowi kappa. Fig. 6 przedstawia, że wszystkie 9 zbadanych humanizowanych przeciwciał wiązało szczurzą MAG z bardzo podobnymi krzywymi wiązania do ~ 4 ng/ml. Przeciwciało chimeryczne zastosowane jako odniesienie wykazywało charakterystykę wiązania z grupy badanych tutaj przeciwciał humanizowanych. Jakkolwiek nie jest to niepodważalne, może to sugerować, że powinowactwa badanych tutaj przeciwciał humanizowanych znajdują się bardzo blisko zakresu powinowactwa niehumanizowanego przeciwciała chimerycznego stosowanego tutaj jako odniesienie.

PL 211 014 B1

Procedura

96-studzienkowe płytki Nunc Maxisorp powlekano przez noc w 4°C białkiem fuzyjnym szczurza MAG-Fc (1 μg/ml; R&D Systems; nr katalogowy 538-MG) w PBS. Płytki przemyto dwukrotnie PBS zawierającym Tween 20 (0,1% obj./obj.; PBST) i blokowano PBS zawierającym BSA (1% wag./obj.) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Zmienne ilości supernatantów z hodowli kolejno rozcieńczono w buforze blokującym i dodano do zablokowanych studzienek rozpoczynając od około 500 lub 250 ng/ml. Stężenia przeciwciał w supernatantach były oparte na niezależnych testach mierzących ilość humanizowanego przeciwciała obecną w każdym supernatancie z hodowli. Włączono także chimeryczne przeciwciało mysio-ludzkie (niehumanizowane) jako odniesienie. Próbki przeciwciał inkubowano przez 1 godzinę w RT, a następnie płytki przemyto 3x PBST. Dodano drugorzędowe przeciwciało (kozie przeciwciało specyficzne wobec ludzkiego łańcucha lekkiego, sprzężone z peroksydazą; Sigma A-7164) rozcieńczone w stosunku 1/5000 w buforze blokującym i inkubowano przez 1 godzinę w RT. Następnie studzienki przemyto trzykrotnie jak opisano powyżej i wiązanie wykryto przez dodanie substratu (tabletki OPD rozpuszczono zgodnie z instrukcjami producenta; Sigma P-9187). Wywołanie zabarwienia monitorowano i reakcję zatrzymano za pomocą 3M H2SO4. Wywołanie zabarwienia odczytano przy 490 nm.

2) Test ELISA bezpośredniego wiązania białka fuzyjnego szczurza MAG-Fc z dwiema oczyszczonymi kombinacjami łańcucha ciężkiego-lekkiego humanizowanego przeciwciała anty-MAG

Dwa humanizowane przeciwciała zawierające kombinacje regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego BVh1/CVl1 i BVh3/CVl3 (tabela i fig. 5) oraz zmutowany region stały IgG1, jak przedstawiono przykładowo w SEQ ID NO: 30 (która przedstawia BVh1/CVl1 zmutowane IgG1, specjaliści w dziedzinie wynalazku mogą łatwo wyprowadzić sekwencję dla odpowiednika BVh3/CVl3) wytworzono z zastosowaniem procedury przejściowej transfekcji, opisanej w przykładzie 3, w wersji dla większej skali i oczyszczono stosując chromatografię powinowactwa do białka A. Oczyszczony materiał przeciwciał dializowano względem PBS i stężenie oznaczono przez odczyt OD280. Stężenie przeciwciał doprowadzono do 5000 ng/ml i stosowano w kolejnych rozcieńczeniach w teście ELISA wiązania szczurzej MAG-Fc. Fig. 7 przedstawia, że oczyszczony materiał przeciwciała wiąże szczurza MAG-Fc oraz, że badane połączenia regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego są wyjątkowo podobne.

Procedura

96-studzienkowe płytki Nunc Maxisorp powlekano przez noc w 4°C białkiem fuzyjnym szczurza MAG-Fc (2,5 μg/ml; R&D Systems; nr katalogowy 538-MG) w PBS. Płytki przemyto dwukrotnie PBS zawierającym Tween 20 (0,1% obj./obj.; PBST) i blokowano PBS zawierającym BSA (1% wag./obj.) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Oczyszczone humanizowane przeciwciało doprowadzono do wyjściowego stężenia 5 μg/ml w buforze blokującym a następnie kolejno rozcieńczono. Próbki przeciwciał inkubowano przez 1 godzinę w RT, a następnie płytki przemyto 3x PBST. Dodano drugorzędowe przeciwciało (kozie przeciwciało specyficzne wobec ludzkiego łańcucha lekkiego sprzężonego z peroksydazą; Sigma A-7164) rozcieńczone do 1/5000 w buforze blokującym i inkubowano przez 1 godzinę w RT. Następnie studzienki przemyto trzykrotnie jak opisano powyżej i wiązanie wykryto przez dodanie substratu (tabletki OPD rozpuszczone zgodnie z instrukcjami producenta; Sigma P-9187). Wywołanie zabarwienia monitorowano i reakcję zatrzymano za pomocą 3M H2SO4. Wywołanie zabarwienia odczytano przy 490 nm.

Wyniki

Obydwa oczyszczone humanizowane przeciwciała nie niosące mutacji lub niosące kilka mutacji w regionie zrębowym wykazują wyjątkowo podobne wiązanie ze szczurzą MAG. Wyniki przedstawiono na fig. 7.

3) Wiązanie ludzkiej MAG eksprymowanej na komórkach CHO przez normalizowane ilości supernatantów z hodowli dwóch kombinacji humanizowanych łańcuchów ciężkiego i lekkiego

Takie same kombinacje humanizowanych łańcuchów ciężkiego i lekkiego jak opisane w przykładzie 5 2) zbadano jako czyste supernatanty względem ludzkiej MAG eksprymowanej na powierzchni komórek CHO. Ilość supernatantu stosowanego dla każdego przeciwciała normalizowano w oparciu o stężenia przeciwciał oznaczone za pomocą testu ELISA. W tym celu 96-studzienkowe płytki (Nunc Maxisorp) powlekano przez noc w 4°C kozim przeciwciałem przeciwko ludzkiemu łańcuchowi IgG (gamma) (Sigma I-3382; w buforze wodorowęglanowym pH 9,6; 2 μg/ml). Następnego dnia płytki przemyto dwukrotnie buforem do przemywania (PBST) i blokowano przez dodanie co najmniej 75 μl buforu blokującego (PBS zawierający BSA 1% wag./obj.) przez 1 godzinę w RT. Roztwory próbek przeciwciał kolejno rozcieńczono w buforze blokującym (rozcieńczenie wyjściowe: nierozcieńczoPL 211 014 B1 ne lub 1/2) w dwóch powtórzeniach. Standardowym Ab było oczyszczone humanizowane przeciwciało IgG1 o nie pokrewnej specyficzności oraz znanym stężeniu. Roztwór standardowy rozcieńczono także kolejno na płytce rozpoczynając od 500 ng/ml. Wszystkie roztwory przeciwciał inkubowano przez 1 godzinę w RT. Płytki przemyto 3x jak opisano powyżej, a następnie inkubowano z kozim przeciwciałem specyficznym wobec ludzkiego łańcucha lekkiego (kappa) (wolnym i związanym) sprzężonym z peroksydazą (Sigma A-7164) rozcieńczonym w stosunku 1/5000 w buforze blokującym i inkubowano przez 1 godzinę w RT. Następnie płytki ponownie przemyto 3x jak opisano powyżej i inkubowano z roztworem substratu (tabletki OPD; Sigma P-9187 do czasu wywołania silnego zabarwienia). Wywołanie zabarwienia monitorowano i zatrzymano przez dodanie 25 μΙ 3M H₂SO₄, a następnie płytkę odczytano przy 490 nm.

Fig. 8 przedstawia, że obydwa zbadane tutaj przeciwciała rozpoznają ludzką MAG i są bardzo podobne w swojej charakterystyce wiązania. CHO/- przedstawiają kontrole negatywne, z komórkami CHO nieeksprymującymi MAG.

Procedura testu Eu ELISA opartego na komórkach

96-studzienkowe płytki (Costar 3595) wypełniono 100 μΙ zawiesiny komórek/studzienkę (patrz tabela poniżej, zalecana liczba komórek do przeprowadzenia testu w dniach 1, 2, 3 lub 4.

Dzień	liczba komórek/ml
1	3 x 105
2	1 x 105
3	5 x 104
4	1 x 104

Pożywkę hodowlaną usunięto i płytki blokowano pożywką DMEM/F12 (Sigma D6421) zawierającą FCS (10%), BSA (1%), NaN₃ (1%; bufor blokujący) przez 1 godzinę w RT. Następnie usunięto roztwór blokujący i dodano próbkę (w buforze blokującym 50 μΙ/studzienkę). Próbki inkubowano w 4°C przez 1 godzinę. Następnie płytki przemyto 3x PBS za pomocą urządzenia do przemywania płytek Skatron. Po przemyciu komórki utrwalano 0,5% paraformaldehydem (rozcieńczonym w PBS) przez 20 minut w 4°C i ponownie przemyto jak powyżej. Następnie dodano 50 μl/studzienkę drugorzędowego przeciwciała sprzężonego z europem w buforze europowym (50 mM zasada Tris, 150 mM NaCl, 0,5% BSA, 0,1 g/l Tween 20, 7,86 mg/l DTPA w pH 7,3) i inkubowano przez 1 godzinę w 4°C. Płytki przemyto jak powyżej i dodano 200 μl roztworu wzmacniającego Detphia/studzienkę. Roztwór inkubowano w RT przez 5-10 minut. Studzienki odczytano w przeciągu 24 h na urządzeniu Victor.

4) Konkurencyjny test ELISA wiązania białka fuzyjnego szczurza MAG-Fc przez dwa oczyszczone humanizowane przeciwciała oraz niehumanizowane mysie przeciwciało monoklonalne

Procedura

96-studzienkowe płytki Nunc Maxisorp powlekano przez noc w 4°C białkiem fuzyjnym szczurza MAG-Fc (2,5 μg/ml; R&D Systems; nr katalogowy 538-MG) w PBS. Płytki przemyto dwukrotnie PBS zawierającym Tween 20 (0,1% obj./obj.; PBST) i blokowano PBS zawierającym BSA (1% wag./obj.) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Oczyszczone humanizowane przeciwciało doprowadzono do stężenia 200 ng/ml i zmieszano z równą objętością konkurujących cząsteczek w buforze blokującym w ilości od 6000 do 0 ng/ml. Konkurującymi przeciwciałami były wyjściowe mysie przeciwciało monoklonalne (anty-MAG) lub niespokrewnione mysie przeciwciało monoklonalne (INN1) w takich samych stężeniach (tylko BVh1/CVl1). Próbki przeciwciało/przeciwciało współzawodnicze inkubowano przez 1 godzinę w RT, a następnie płytki przemyto 3x PBST. Dodano drugorzędowe przeciwciało (kozie przeciwciało specyficzne wobec ludzkiego łańcucha lekkiego, sprzężone z peroksydazą; Sigma A-7164) rozcieńczone do 1/5000 w buforze blokującym i inkubowano przez 1 godzinę w RT. Następnie studzienki przemyto trzykrotnie jak opisano powyżej i wiązanie wykryto przez dodanie substratu (tabletki OPD rozpuszczone zgodnie z instrukcjami producenta; Sigma P-9187). Wywołanie zabarwienia odczytano przy 490 nm.

Wyniki

Obydwa preparaty oczyszczonych przeciwciał tak samo konkurowały z oryginalnym mysim przeciwciałem monoklonalnym, ale nie z mysim przeciwciałem monoklonalnym o niespokrewnionej specyficzności - patrz fig. 9. Pokazuje to, że oryginalne mysie przeciwciało monoklonalne oraz badane tutaj humanizowane przeciwciała prawdopodobnie rozpoznają ten sam epitop oraz możliwe jest, że wykazują bardzo podobne powinowactwa do szczurzej MAG.

PL 211 014 B1

Wykaz sekwencji

SEQ ID NO: 1

Sekwencja aminokwasowa CDRL1

KSSHSVLYSSNQKNYLA

SEQ ID NO: 2

Sekwencja aminokwasowa CDRL2

WASTRES

SEQ ID NO: 3

Sekwencja aminokwasowa CDRL3

HQYLSSLT

SEQ ID NO: 4

Sekwencja aminokwasowa CDRH1

NYGMN

SEQ ID NO: S

Sekwencja aminokwasowa CDRH2

WINTYTGEPTYADDFTG

SEO ID NO: 6

Sekwencja aminokwasowa CDRH3

NPINYYGINYEGYVMDY

SEQ ID NO: 7

Sekwencja polinukleotydowa kodująca CDRL1

AAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCC

SEQ ID NO: 8

Sekwencja polinukleotydowa kodująca CDRL2

PL 211 014 B1

TGGGCCAGCACCCGCGAGAGC

SEQ ID NO: 9

Sekwencja polinukleotydowa kodująca CDRL3

CACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC

SEQ ID NO: 10

Sekwencja polinukleotydowa kodująca CDRH1

AACTACGGCATGAAC

SEQ ID NO: 11

Sekwencja polinukleotydowa kodująca CDRH2

TGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGC

SEQ ID NO: 12

Sekwencja polinukleotydowa kodująca CDRH3

AACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTAC

SEQ ID NO: 13

Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha ciężkiego QVQLVQSGSELKKPGASyKVSCKASGYTFTNYQMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYA

DDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQ1SSLKAEDTAVYYCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLV

TVSS

SEQ ID NO: 14

Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha ciężkiego QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT»YGMNWVRQAPGQGŁEWMGWINTYTGEPTYA

DDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARKPINYYGIKYEGYVMDYWGQGTDV

TVSS

PL 211 014 B1

SEQ ID NO: 15

Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha ciężkiego

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYA

DDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYFCARMPIHYYGINYEGYVMDYWGQGTLV

TVSS

SEQ ID NO: 16

Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha lekkiego

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSBSVŁYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLŁIYWASTRE

SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV

SEQ ID NO: 17

Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha lekkiego DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSKQKNYŁAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRE

SGVPDRFSGSGSGTDFTLTIINLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV

SEQ ID NO: 18

Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha lekkiego DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKS3HSYLYgSlTQKNYLAWYQQKPGQFFKIiLIYWASTRB

SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSŁHTEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV

SEQ ID NO: 19 sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha lekkiego DIVMTQSPDSIJ\VSLGERATINCKgSBgVLYSSHQKKYI.AWYQQKPGQPPKLLIYWASTRB

SGVPDRFSGSGSGTDFTLTIINŁBTEDVAVYYCHQYL5SŁTFGQGTKLEIKRTV

SEQ ID NO: 20

Sekwencja polinukleotydowa kodująca sekwencję aminokwasową o

SEQ ID NO: 13

PL 211 014 B1

CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA

GTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATG

AACTGGGTGOGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATG

AACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTT

GTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGC

CTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAACCCCATCAAC

TACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGC

ACACTAGTCACAGTCTCCTCA

SEQ ID NO: 21

Sekwencja polinukleotydowa kodująca sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 14

CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA gtgaaggtttcctgcaaggcttctggatacaccttcactaactacggcatg

AACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATC

AACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGll^wr gtcttctccttggacacctctgtcagcacggcatatctgcagatcagcagc

CTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAAC tactacggcatcaactacgagggctacgtgatggactactggggccagggc

ACACTAGTCACAGTCTCCTCA

SEQ ID NO: 22

Sekwencja polinukleotydowa kodująca sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 15

CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA

GTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATG

AACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATC

AACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTT

GTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGC

CTAAAGGCTGAGGACACTGCCACCTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAAC

TACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGC

ACACTAGTCACAGTCTCCTCA

SEQ ID NO: 23

Sekwencja polinukleotydowa kodująca sekwencję aminokwasową o

SEQ ID NO: 16

PL 211 014 B1

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCKAG

AGGGCCACCATCAACTrGCAAGAGGAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAAC

CAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAG

CTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTC

AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAG

GCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC

TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAOGTACGGTG

SEQ ID NO: 24

Sekwencja polinukleotydowa kodująca sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 17

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAG

AGGGCCAGCATŁAACTGCAAGAOCAGCCACAGCGTGCTGTACAGGAGCAAC

CAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAG

CTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCCjATTC agtggcagcgggtctgggacacatttcactctcaccatcatcaacctgcag

GCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAOTACCTGAGCAGCCTGACC

TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG

SEQ ID NO: 25

Sekwencja polinukleotydowa kodująca sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 1S

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAG

AGGGCCAGCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAOCAAC

CAGAAGAACTACgTGGCefGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAG

CTGCTTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTC

AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAC

ACCGAAGATGTGGCAGTTTAlN-ACTGTCACCAgTACCTGAGCAGCCTGACC

TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG

SEQ ID NO: 26

Sekwencja polinukleotydowa kodująca sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 19

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAG

AGGGCCACCATCAAOTGCAAGAGCAGCCACAGCgrGCTGTACAGCAGCAAC

CAGAAflAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAC^ACAGCCTCCTAAG

CTGCTGATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCGTGACCGATTC

AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCATCAACCTGCAC

ACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC

TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGCrrG

PL 211 014 B1

SEQ ID NO: 27

Sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego chimerycznego przeciwciała mysio/ludzkiego przeciw-MAG

MGWSCIILFLVATATGVHSEIQLVQSGPELKKPGETNKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKW

MGWINTYTGEPTYADDFTGRFAFSLETSASTAYIjQISNLKNEDTATYFCARNPINYYGINYEGYVM

DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCIiVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF

PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAG

APSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHHAKTKPREEQYNSTYRV

VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL

VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTrPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN

HYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 28

Sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego chimerycznego przeciwciała mysio/ludzkiego przeciw-MAG

MGWSCIILFLVATATGVHSNIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKS SHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPG QSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIINVHTEDLAVYYCHQYLSSLTFGTGTKLEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGIiSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 29

Sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego chimerycznego przeciwciała mysio/ludzkiego przeciw-MAG MGWSCI ILFLVATATGVHSEIQLVQSGPELKKPGETNKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKW MGWINTYTGEPTYADDFTGRFAFSLETSASTAYIiQISNLKNEDTATYFCARNPINYYGINYEGYVM DYWGQGTLVWSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA1TSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVFSSSL3TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVŁHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNGVSLTCI. yKGFYPSDIAyEWESNGOPEHNYKTTPPyLDSDGSFFLYSKLTyDKSRWpOGNyFfiCfiyMTraŁT.WM HYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 30

Sekwencja aminokwasowa humanizowanego łańcucha ciężkiego im munoglobuliny

PL 211 014 B1

MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGM

NWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSL

KAEDTAVYYCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVS5ASTKGPSVFPLAP

5SKST5GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS

WTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGA

PSVFLEPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK

PREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP

REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP

VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF5CSVMHEALHNHYTQK5LSLSPGK

SEQ ID NO: 31

Sekwencja aminokwasowa humanizowanego łańcucha lekkiego immu noglobuliny

MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSPDSLAVSLGERAnNCKSSHSVl.YSSN

QKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAE

DVAVYYCHQYLSSŁTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL

NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 32

Sekwencja aminokwasowa humanizowanego łańcucha ciężkiego im munoglobuliny

MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGM

NWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSL

KAEDTAVYYCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP

SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS

WTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG

PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK

PREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP

REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP

VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

PL 211 014 B1

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Humanizowane przeciwciało anty-MAG, które wiąże się z MAG i neutralizuje ją, które to przeciwciało zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 15, oraz domenę zmienną łańcucha lekkiego wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19.
2. 2. Humanizowane przeciwciało anty-MAG według zastrz. 1, które zawiera ponadto stałą część ludzkiego łańcucha lekkiego lub jej fragment oraz stałą część ludzkiego łańcucha ciężkiego lub jej fragment.
3. 3. Humanizowane przeciwciało anty-MAG według zastrz. 1 albo 2, w którym domenę zmienną łańcucha ciężkiego stanowi SEQ ID NO: 13.
4. 4. Humanizowane przeciwciało anty-MAG według zastrz. 1 albo 2, w którym domenę zmienną łańcucha ciężkiego stanowi SEQ ID NO: 14.
5. 5. Humanizowane przeciwciało anty-MAG według zastrz. 1 albo 2, w którym domenę zmienną łańcucha ciężkiego stanowi SEQ ID NO: 15.
6. 6. Humanizowane przeciwciało anty-MAG według zastrz. 3 - 5, w którym domenę zmienną łańcucha lekkiego stanowi SEQ ID NO: 16.
7. 7. Humanizowane przeciwciało anty-MAG według zastrz. 3 - 5, w którym domenę zmienną łańcucha lekkiego stanowi SEQ ID NO: 17.
8. 8. Humanizowane przeciwciało anty-MAG według zastrz. 3 - 5, w którym domenę zmienną łańcucha lekkiego stanowi SEQ ID NO: 18.
9. 9. Humanizowane przeciwciało anty-MAG według zastrz. 3 - 5, w którym domenę zmienną łańcucha lekkiego stanowi SEQ ID NO: 19.
10. 10. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera humanizowane przeciwciało antyMAG zdefiniowane w zastrz. 1-9 oraz dodatkowo farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik lub nośnik.
11. 11. Zastosowanie humanizowanego przeciwciała anty-MAG zdefiniowanego w zastrz. 1 - 9 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki udaru.
12. 12. Zastosowanie według zastrz. 11, w którym przeciwciało podaje się dożylnie.