PL211014B1 - Humanizowane przeciwciało anty-MAG, środek farmaceutyczny i zastosowanie tego przeciwciała - Google Patents
Humanizowane przeciwciało anty-MAG, środek farmaceutyczny i zastosowanie tego przeciwciałaInfo
- Publication number
- PL211014B1 PL211014B1 PL375405A PL37540503A PL211014B1 PL 211014 B1 PL211014 B1 PL 211014B1 PL 375405 A PL375405 A PL 375405A PL 37540503 A PL37540503 A PL 37540503A PL 211014 B1 PL211014 B1 PL 211014B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antibody
- seq
- mag
- human
- antibodies
- Prior art date
Links
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 33
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 102000017099 Myelin-Associated Glycoprotein Human genes 0.000 abstract description 35
- 108010013731 Myelin-Associated Glycoprotein Proteins 0.000 abstract description 35
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 20
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 abstract description 11
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 abstract description 11
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 abstract description 3
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 85
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 64
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 63
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 63
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 49
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 26
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 26
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 26
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 23
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 23
- 206010008089 Cerebral artery occlusion Diseases 0.000 description 21
- 201000007309 middle cerebral artery infarction Diseases 0.000 description 21
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 20
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 17
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 12
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 11
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 8
- 101100455946 Rattus norvegicus Mag gene Proteins 0.000 description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 8
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 7
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 101000616778 Homo sapiens Myelin-associated glycoprotein Proteins 0.000 description 7
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 7
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 7
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 7
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 7
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 230000036541 health Effects 0.000 description 7
- 102000051756 human MAG Human genes 0.000 description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 7
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 6
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 6
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 5
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 5
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 5
- 210000004744 fore-foot Anatomy 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 4
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 4
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 3
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N halothane Chemical compound FC(F)(F)C(Cl)Br BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960003132 halothane Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Substances N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 3
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N Nitrous Oxide Chemical compound [O-][N+]#N GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000034799 Tauopathies Diseases 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000003727 cerebral blood flow Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- -1 e.g. Proteins 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- XJCPMUIIBDVFDM-UHFFFAOYSA-M nile blue A Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4[O+]=C3C=C(N)C2=C1 XJCPMUIIBDVFDM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- CUKWUWBLQQDQAC-VEQWQPCFSA-N (3s)-3-amino-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s,3s)-1-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(1s)-1-carboxyethyl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-3-(1h-imidazol-5-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-ox Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 CUKWUWBLQQDQAC-VEQWQPCFSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- AQSOTOUQTVJNMY-UHFFFAOYSA-N 7-(dimethylamino)-4-hydroxy-3-oxophenoxazin-10-ium-1-carboxylic acid;chloride Chemical compound [Cl-].OC(=O)C1=CC(=O)C(O)=C2OC3=CC(N(C)C)=CC=C3[NH+]=C21 AQSOTOUQTVJNMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 1
- 102000005862 Angiotensin II Human genes 0.000 description 1
- 101800000733 Angiotensin-2 Proteins 0.000 description 1
- 208000031104 Arterial Occlusive disease Diseases 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000018899 Glutamate Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010027915 Glutamate Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 102000010410 Nogo Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010077641 Nogo Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100396986 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) INN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000012452 Xenomouse strains Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229950006323 angiotensin ii Drugs 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 208000021328 arterial occlusion Diseases 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010442 axonal sprouting Effects 0.000 description 1
- TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L barium sulfate Chemical compound [Ba+2].[O-]S([O-])(=O)=O TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004781 brain capillary Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000010405 clearance mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- XPYGGHVSFMUHLH-UUSULHAXSA-N falecalcitriol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(O)(C(F)(F)F)C(F)(F)F)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C XPYGGHVSFMUHLH-UUSULHAXSA-N 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003194 forelimb Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000003140 lateral ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 150000002678 macrocyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000003657 middle cerebral artery Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 238000010984 neurological examination Methods 0.000 description 1
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 description 1
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001272 nitrous oxide Substances 0.000 description 1
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 108010043655 penetratin Proteins 0.000 description 1
- MCYTYTUNNNZWOK-LCLOTLQISA-N penetratin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 MCYTYTUNNNZWOK-LCLOTLQISA-N 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000035922 thirst Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000031998 transcytosis Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Neurology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Psychology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 375405 (22) Data zgłoszenia: 05.08.2003 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
05.08.2003, PCT/EP03/008749 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
19.02.2004, WO04/014953 (11) 211014 (13) B1 (51) Int.Cl.
C07K 16/28 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) A61P 25/00 (2006.01)
Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy
Humanizowane przeciwciało anty-MAG, środek farmaceutyczny i zastosowanie tego przeciwciała
| (30) Pierwszeństwo: 06.08.2002, GB, 0218230.1 | (73) Uprawniony z patentu: GLAXO GROUP LIMITED, Greenford, GB |
| 06.08.2002, GB, 0218232.7 06.08.2002, GB, 0218234.3 06.08.2002, GB, 0218229.3 | (72) Twórca(y) wynalazku: JONATHAN HENRY ELLIS, Stevenage, GB |
| VOLKER GERMASCHEWSKI, Stevenage, GB | |
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: | |
| 28.11.2005 BUP 24/05 | (74) Pełnomocnik: |
| rzecz. pat. Sulima Zofia | |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.03.2012 WUP 03/12 | SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH spółka jawna |
PL 211 014 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest humanizowane przeciwciało anty-MAG, zawierający je środek farmaceutyczny i zastosowanie tego przeciwciała do wytwarzania leku użytecznego w leczeniu i/lub profilaktyce chorób neurologicznych.
Przeciwciała według wynalazku stanowią zmienione przeciwciała, które wiążą glikoproteinę związaną z mieliną (MAG) oraz neutralizują jej działanie.
Udar jest główną przyczyną śmierci i niepełnosprawności w krajach zachodu. Brak jest zatwierdzonej terapii do leczenia udaru innej niż t-PA, która musi zostać podana w przeciągu trzech godzin od wystąpienia po analizie CT w celu wykluczenia krwotoku. Obecnie większość środków terapeutycznych do leczenia ostrego udaru (tj. neuroochronnych) obejmuje głównie środki ukierunkowane na receptory glutaminianu i ich efektorowe ścieżki przekazywania sygnału, co do których wiadomo, że są związane z ostrą śmiercią komórek. Jednakże dotychczasowe strategie te okazały się nieskuteczne w próbach klinicznych oraz często są związane z ograniczającymi dawkę skutkami ubocznymi (Hill i Hachinski, The Lancet, 352: (suplement III) 10-14 (1998)). Zatem istnieje potrzeba opracowania nowych rozwiązań skierowanych na zmniejszenie śmierci komórek po ustaniu przepływu krwi.
Zaraz po wystąpieniu udaru u wielu pacjentów obserwuje się pewien stopień spontanicznego odzyskania funkcji, co sugeruje, że mózg ma pewną (jakkolwiek ograniczoną) zdolność do naprawy i/lub przebudowania po urazie. Zatem środki, które wykazują zdolność pobudzania tego odzyskania funkcji umożliwiają wprowadzenie interwencji znacznie później (potencjalnie po kilku dniach) od wystąpienia niedokrwienia mózgu. Środki, które są w stanie zapewnić zarówno doraźne działanie neuroochronne, jak i pobudzić odzyskanie funkcji, mogą umożliwić osiągnięcie znaczących korzyści w porównaniu z obecnie dostępnymi potencjalnymi strategiami neuroochronnymi.
Mechanizmy leżące u podstaw odzyskania funkcji nie są obecnie znane. Jako możliwy mechanizm zaproponowano kiełkowanie uszkodzonych lub nieuszkodzonych aksonów. Jednakże chociaż badania in vivo wykazały, że leczenie czynnikami neurotropowymi urazu rdzenia kręgowego lub udaru powoduje pobudzenie odzyskania funkcji i stopnia kiełkowania aksonów, nie udowadnia to bezpośredniego związku pomiędzy stopniem kiełkowania aksonów a zakresem odzyskania funkcji (Jakeman i in., 1998, Exp. Neurol. 154:170-184, Kawamata i in., 1997, Proc Natl Acad. Sci. USA., 94:8179-8184, Ribotta i in., 2000, J Neurosci. 20:5144-5152). Ponadto, kiełkowanie aksonów wymaga żywych neuronów. Zatem w takich chorobach jak udar, który jest związany z rozległą śmiercią komórek, pobudzenie odzyskania funkcji po podaniu danego środka po udarze może zachodzić poprzez mechanizmy inne niż kiełkowanie aksonów, takie jak różnicowanie endogennych komórek macierzystych, aktywacja nadmiarowych szlaków, zmiany w rozmieszczeniu lub pobudliwości receptorów neuronów lub gleju (Fawcett i Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49:377-391, Horner i Gage, 2000, Nature 407:963-970).
Uważa się, że ograniczona zdolność ośrodkowego układu nerwowego (OUN) do naprawy po uszkodzeniu wynika częściowo z występowania w środowisku OUN cząsteczek, które wywierają hamujące działanie na kiełkowanie aksonów (wzrost neurytów). Uważa się, że mielina w OUN zawiera cząsteczki hamujące (Schwab ME i Caroni P (1988) J. Neurosci 8, 2381-2193). Dwa białka mielinowe, glikoproteinę związaną z mieliną (MAG) i Nogo sklonowano i zidentyfikowano jako przypuszczalne inhibitory wzrostu neurytów (Sato S. i in., (1989) Biochem. Biophys Res Comm 163, 1473-1480; McKerracher L i in., (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay G i in., (1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K i Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262; Schafer i in., (1996) Neuron 16, 11071113; WO 9522344; WO 9701352; Prinjha R i in., (2000) Nature 403, 383-384; Chen MS i in., (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre T i in., (2000) Nature 403, 439-444; US 005250414A; WO 200005364A1; WO 0031235).
Glikoproteina związana z mieliną jest transbłonową cząsteczką powierzchni komórki, eksprymowaną na powierzchni mieliny, składającą się z pięciu zewnątrzkomórkowych domen immunoglobulinowych, pojedynczej domeny transbłonowej i domeny wewnątrzkomórkowej. Ekspresja MAG jest ograniczona do mielinizującego gleju w OUN i obwodowym układzie nerwowym (PNS). Uważa się, że MAG oddziałuje z receptorem (receptorami) neuronalnym(i), które pośredniczą w oddziaływaniu na cytoszkielet neuronalny, włącznie z fosforylacją neurowłókien i hamowaniem wzrostu neurytów in vitro. Chociaż postulowano, że antagoniści MAG znajdują zastosowanie w poprawianiu kiełkowania aksonów po urazie (WO 9522344, WO 9701352 i WO 9707810), stwierdzenia te nie są poparte danymi in vivo. Ponadto rola MAG jako inhibitora kiełkowania aksonów z neuronów OUN in vivo nie została udowodniona (Li CM i in., (1994) Nature 369, 747-750; Montag, D i in.,
PL 211 014 B1 (1994) Neuron 13, 229-246; Lassmann H i in., (1997) GLIA 19, 104-110; Li C i in., (1998) J. Neuro. Res 51, 210-217; Yin X i in., (1998) J. Neurosci, 18, 1953-1962; Bartsch U i in., (1995) Neuron 15, 1375-1381; Li M i in., (1996) 46, 404-414).
Przeciwciała typowo zawierają dwa łańcuchy ciężkie, połączone ze sobą przez wiązania disulfidowe, oraz dwa łańcuchy lekkie. Każdy łańcuch lekki jest połączony z odpowiednim łańcuchem ciężkim wiązaniami disulfidowymi. Każdy łańcuch ciężki zawiera na jednym końcu domenę zmienną, po której występuje kilka domen stałych. Każdy łańcuch lekki zawiera domenę zmienną na jednym końcu i domenę stałą na swoim drugim końcu. Domena zmienna łańcucha lekkiego jest dopasowana do domeny zmiennej łańcucha ciężkiego. Domena stała łańcucha lekkiego jest dopasowana do domeny stałej łańcucha ciężkiego. Domeny stałe łańcuchów lekkiego i ciężkiego nie są bezpośrednio związane z wiązaniem przeciwciała z antygenem.
Domeny zmienne każdej pary łańcuchów lekkiego i ciężkiego tworzą miejsce wiążące antygen. Dwie domeny zmienne łańcuchów lekkiego i ciężkiego mają taką samą ogólną strukturę, przy czym każda domena zawiera cztery regiony zrębowe, których sekwencje są stosunkowo konserwatywne, połączone przez trzy regiony determinujące dopasowanie (regiony CDR), często nazywane regionami hiperzmiennymi. Cztery regiony zrębowe w dużym stopniu przyjmują konformację β-kartki, a regiony CDR tworzą pętle łączące i w niektórych przypadkach tworzą część struktury β-kartki. Regiony CDR są utrzymywane w bliskim sąsiedztwie przez regiony zrębowe z regionami CDR drugiej domeny, co tworzy miejsce wiążące antygen. Regiony CDR i regiony zrębowe przeciwciał można określić przez odniesienie do Kabat i in. („Sequences of proteins of immunological interest US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987).
Obecnie stwierdzono, że opisane przeciwciało monoklonalne anty-MAG (Poltorak i in., (1987) Journal of Cell Biology 105, 1893-1899, DeBellard i in., (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tang i in., (1997) Mol. Cell, Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K i Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254262) oraz dostępne w handlu (MAB1567 (Chemicon)), podawane bezpośrednio do mózgu lub dożylnie po ogniskowym niedokrwieniu mózgu u szczurów (model udaru), zapewnia neuroochronę i pobudza odzyskanie funkcji. Zatem przeciwciała anty-MAG dostarczają potencjalne środki terapeutyczne zarówno w doraźnej neuroochronie, jak i pobudzają odzyskanie funkcji po udarze. Przeciwciało to jest przeciwciałem mysim. Chociaż mysie przeciwciała często stosuje się jako środki diagnostyczne, ich użyteczność jako środków terapeutycznych wykazano tylko w kilku przypadkach. Ograniczenie ich stosowania częściowo wynika z tego, że powtarzanie podawania ludziom mysich przeciwciał monoklonalnych zazwyczaj wywołuje u człowieka odpowiedzi immunologiczne przeciw tym cząsteczkom. Aby przezwyciężyć te nieodłączne niepożądane właściwości mysich przeciwciał monoklonalnych, w dziedzinie wynalazku opracowano i dobrze określono „zmienione przeciwciała zaprojektowane tak, aby zawierały regiony ludzkich przeciwciał. Przykładowo, przeciwciało humanizowane zawiera regiony determinujące dopasowanie („CDR) nie pochodzące od człowieka, a większość pozostałej struktury pochodzi z ludzkiego przeciwciała.
Proces neurodegeneracji leży u podstaw wielu chorób/zaburzeń neurologicznych, w tym chorób ostrych, takich jak udar, urazowe uszkodzenie mózgu i uraz rdzenia kręgowego, a także chorób przewlekłych, w tym choroby Alzheimera, otępień czołowo-skroniowych (tauopatii), neuropatii obwodowej, choroby Parkinsona, choroby Huntingtona i stwardnienia rozsianego. Zatem przeciwciała monoklonalne anty-MAG mogą znaleźć zastosowanie w leczeniu tych chorób/zaburzeń, zarówno przez osłabienie umierania komórek związanego z tymi zaburzeniami/stanami, jak i pobudzanie odzyskania funkcji.
Wynalazek dotyczy humanizowanego przeciwciała anty-MAG, które wiąże się z MAG i neutralizuje ją, które to przeciwciało zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 15 oraz domenę zmienną łańcucha lekkiego wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19.
Korzystnie humanizowane przeciwciało anty-MAG zawiera ponadto stałą część ludzkiego łańcucha lekkiego lub jej fragment oraz stałą część ludzkiego łańcucha ciężkiego lub jej fragment.
Korzystnie domenę zmienną łańcucha ciężkiego stanowi SEQ ID NO: 13.
Korzystnie domenę zmienną łańcucha ciężkiego stanowi SEQ ID NO: 14.
Korzystnie domenę zmienną łańcucha ciężkiego stanowi SEQ ID NO: 15.
Korzystnie domenę zmienną łańcucha lekkiego stanowi SEQ ID NO: 16.
Korzystnie domenę zmienną łańcucha lekkiego stanowi SEQ ID NO: 17.
Korzystnie domenę zmienną łańcucha lekkiego stanowi SEQ ID NO: 18.
Korzystnie domenę zmienną łańcucha lekkiego stanowi SEQ ID NO: 19.
PL 211 014 B1
Wynalazek dotyczy także środka farmaceutycznego zawierającego humanizowane przeciwciało anty-MAG zdefiniowane powyżej oraz dodatkowo farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik lub nośnik.
Wynalazek dotyczy również zastosowania humanizowanego przeciwciała anty-MAG zdefiniowanego powyżej do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki udaru.
Korzystnie przeciwciało podaje się dożylnie.
Przeciwciało anty-MAG
Opracowano zmienione przeciwciało, które wiąże i neutralizuje MAG oraz zawiera jeden lub większą liczbę z poniższych regionów CDR. Regiony CDR zidentyfikowano w sposób opisany przez Kabata (Kabat i in., (1991) Sequences of proteins of immunological interest; piąte wydanie; US Department of Health and Human Services; publikacja NIH nr 91-3242). Szczególne regiony CDR są takie jak zdefiniował Kabat, ale zgodne z zasadami strukturalnymi i zasadami fałdowania białek zdefiniowanymi przez Chothia i Lesk, (Chothia i in., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883), przy czym należy zdawać sobie sprawę, że dodatkowe reszty mogą także być brane pod uwagę jako część regionu wiążącego antygen.
Regiony CDR łańcucha lekkiego
| CDR | Według Kabata |
| L1 | KSSHSVLYSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 1) |
| L2 | WASTRES (SEQ ID NO: 2) |
| L3 | HQYLSSLT (SEQ ID NO: 3) |
Regiony CDR łańcucha ciężkiego
| CDR | Według Kabata |
| H1 | NYGMN (SEQ ID NO: 4) |
| H2 | WINTYTGEPTYADDFTG (SEQ ID NO: 5) |
| H3 | NPINYYGINYEGYVMDY (SEQ ID NO: 6) |
Możliwy jest sposób hamowania neurodegeneracji i/lub pobudzenia odzyskania funkcji u pacjenta będącego człowiekiem, dotkniętego lub z ryzykiem wystąpienia udaru lub innych chorób neurologicznych, który obejmuje podawanie człowiekowi potrzebującemu takiego leczenia skutecznej ilości opisanego tutaj przeciwciała anty-MAG. Zatem przeciwciało można stosować do wytwarzania leku do hamowania neurodegeneracji i/lub pobudzenia odzyskania funkcji w preparacie leku do hamowania neurodegeneracji i/lub pobudzania odzyskania funkcji u pacjenta będącego człowiekiem, dotkniętego lub z ryzykiem wystąpienia udaru lub innej choroby neurologicznej.
Opisane tu zmienione przeciwciało jest korzystnie przeciwciałem monoklonalnym (mAb) oraz korzystnie jest chimeryczne, humanizowane lub ma zmieniony kształt, przy czym humanizowane przeciwciała stanowią przedmiot wynalazku.
Zmienione przeciwciało ma strukturę naturalnego przeciwciała lub jego fragmentu. Zatem przeciwciało może obejmować pełne przeciwciało, fragment (Fab')2, fragment Fab, dimer łańcucha lekkiego lub dimer łańcucha ciężkiego.
Przeciwciałem może być IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4; albo IgM; IgA, IgE lub IgD albo jego zmodyfikowany wariant. Zgodnie z tym może zostać wybrana stała domena łańcucha ciężkiego przeciwciała. Domeną stałą łańcucha lekkiego może być domena stała κ lub λ. Przeciwciało może ponadto zawierać modyfikacje wszystkich klas, np. dimery IgG, mutanty Fc, które już nie wiążą receptorów Fc lub nie pośredniczą w wiązaniu C1q (przeciwciała blokujące). Przeciwciało może być także przeciwciałem chimerycznym typu opisanego w WO 86/01533, które zawiera region wiązania antygenu i region nieimmunoglobulinowy. Regionem wiązania antygenu jest domena zmienna łańcucha lekkiego lub domena zmienna łańcucha ciężkiego. Zazwyczaj region wiążący antygen zawiera domeny zmienne łańcuchów zarówno lekkiego, jak i ciężkiego. Region nieimmunoglobulinowy jest połączony na swoim C-końcu z regionem wiążącym antygen. Regionem nieimmunoglobulinowym jest zazwyczaj nieimmunoglobulinowe białko, które może stanowić enzym, toksyna lub białko o znanej specyficzności wiązania. Dwa regiony przeciwciała chimerycznego tego typu mogą być połączone przez rozszczepialną sekwencję łącznikową. Rozważa się również immunoadhezyny zawierające regiony CDR, opisane powyżej.
PL 211 014 B1
Region stały jest wybrany na podstawie wymaganej funkcjonalności. Normalnie IgG1 będzie wykazywać zdolność lityczną przez wiązanie z dopełniaczem i/lub będzie pośredniczyć w ADCC (cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał). IgG4 będzie korzystne, jeżeli wymagane jest niecytotoksyczne przeciwciało blokujące. Jednakże przeciwciała IgG4 mogą wykazywać niestabilność przy wytwarzaniu, a zatem bardziej korzystne może być zmodyfikowanie ogólnie bardziej trwałe IgG1. Sugerowane modyfikacje opisano w EP0307434, a korzystne modyfikacje obejmują pozycje 235 i 237. Zatem rozważa się lityczną i nielityczną postać przeciwciała według wynalazku.
W szczególnej postaci zmienione przeciwciało jest klasy IgG, a zwłaszcza IgG1.
Zatem przeciwciało może być pełnej długości przeciwciałem nielitycznym IgG1, zawierającym opisane powyżej regiony CDR. W szczególności przeciwciałem może być nielityczne przeciwciało IgG1 pełnej długości zawierające regiony CDR o SEQ ID NO: 13 i 16 oraz nielityczne przeciwciało IgG1 pełnej długości zawierające regiony CDR o SEQ ID NO: 15 i 18.
Rozważa się także polinukleotydy kodujące CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3. Szczególnymi sekwencjami polinukleotydowymi są:
Regiony CDR łańcucha lekkiego
| CDR | |
| L1 | AAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCC (SEQ ID NO: 7) |
| L2 | TGGGCCAGCACCCGCGAGAGC (SEQ ID NO: 8) |
| L3 | CACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC (SEQ ID NO: 9) |
Regiony CDR łańcucha ciężkiego
| CDR | |
| H1 | AACTACGGCATGAAC (SEQ ID NO: 10) |
| H2 | TGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGC (SEQ ID NO: 11) |
| H3 | AACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTAC (SEQ ID NO: 12) |
Rozważa się także polinukleotyd kodujący region zmienny łańcucha lekkiego zmienionego przeciwciała anty-MAG, zawierający co najmniej jeden region CDR wybrany spośród CDRL1, CDRL2 i CDRL3, korzystniej zawierający kolejno wszystkie 3 regiony CDR.
Rozważa się także polinukleotyd kodujący region zmienny łańcucha ciężkiego zmienionego przeciwciała anty-MAG zawierający co najmniej jeden region CDR wybrany z CDRH1, CDRH2 i CDRH3, korzystniej zawierający kolejno wszystkie 3 regiony CDR.
Przeciwciało anty-MAG według wynalazku jest przeciwciałem humanizowanym.
Zatem wynalazek dostarcza humanizowane przeciwciało, które wiąże się z MAG i neutralizuje ją, które to przeciwciało zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający jedną z poniższych sekwencji aminokwasowych:
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTG EPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 13).
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTG EPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 14)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTG EPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYFCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 15)
Humanizowane przeciwciało według wynalazku oprócz regionu zmiennego łańcucha ciężkiego o SEQ ID NO: 13, 14 lub 15, zawiera region zmienny łańcucha lekkiego zawierający sekwencje aminokwasowe o SEQ ID NO: 16, 17, 18 lub 19:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV (SEQ ID NO: 16)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVP DRFSGSGSGTDFTLTIINLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV (SEQ ID NO: 17)
PL 211 014 B1
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESG VPDRFSGSGSGTDFTLTISSLHTEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV (SEQ ID NO: 18)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESG VPDRFSGSGSGTDFTLTIINLHTEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV (SEQ ID NO: 19)
W kolejnej postaci wynalazek dostarcza humanizowane przeciwciało zawierające:
fragment regionu zmiennego łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 13, 14 lub 15 oraz stałą część ludzkiego łańcucha ciężkiego lub jej fragment oraz fragment regionu zmiennego łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: 16, 17, 18 lub 19 oraz stałą część ludzkiego łańcucha lekkiego lub jej fragment.
W szczególnej postaci humanizowane przeciwciało jest klasy IgG, a zwłaszcza IgG1.
Korzystne przeciwciała według wynalazku zawierają:
Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 16;
Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 17;
Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 18;
Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 19;
Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 16;
Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 17;
Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 18;
Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 19;
Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 16;
Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 17;
Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 18;
Region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ lekkiego zawierający SEQ ID NO: 19;
Rozważa się także polinukleotydy kodujące region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 13, 14 i 15 oraz regiony zmienne łańcucha lekkiego zawierające SEQ ID NO: 16, 17, 18 o 19.
Szczególną sekwencją polinukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 13 jest:
D NO: 13 oraz region zmienny łańcucha
D NO: 13 oraz region zmienny łańcucha
D NO: 13 oraz region zmienny łańcucha
D NO: 13 oraz region zmienny łańcucha
D NO: 14 oraz region zmienny łańcucha
D NO: 14 oraz region zmienny łańcucha
D NO: 14 oraz region zmienny łańcucha
D NO: 14 oraz region zmienny łańcucha
D NO: 15 oraz region zmienny łańcucha
D NO: 15 oraz region zmienny łańcucha
D NO: 15 oraz region zmienny łańcucha
D NO: 15 oraz region zmienny łańcucha
CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA GTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATG AACTGGGTGCGAGAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATC AACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTT GTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGC CTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAACCCCATCAAC TACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGC ACACTAGTCACAGTCTCCTCA {SEQ ID No 20)
Szczególną sekwencją polinukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 14 jest:
PL 211 014 B1
CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA GTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATG AACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATC AACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTT GTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGC CTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAAC TACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGC ACACTAGTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID No 21)
Szczególną sekwencją polinukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 15 jest:
CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA GTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATG AACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATC AACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTT GTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGC CTAAAGGCTGAGGACACTGCCACCTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAAC TACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGOACTACTGGGGCCAGGGC ACACTAGTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID No 22)
Szczególną sekwencją polinukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 16 jest:
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAG
AGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAAC
CAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAG
CTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTC
AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAG
GCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC
TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG (SEQ ID No
23)
Szczególną sekwencją polinukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 17 jest:
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAG
AGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAAC CAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAG CTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTC AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCATCAACCTGCAG GCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG {SEQ ID No
24)
Szczególną sekwencją polinukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 18 jest:
PL 211 014 B1 gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgag
AGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAAC
CAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAG
CTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTC
AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAC
ACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC
TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG (SEQ ID No
25)
Szczególną sekwencją polinukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 19 jest:
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAG
AGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAAC ęAGĄAGAĄCTĄęęTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGAĆAGCCTĆCTAAG ctgctcatttactgggcatctacccgggaatccggggtccctgagcgattc AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCATCAACCTGCAC ACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG (SEQ ID No
26)
Określenie „neutralizujące dotyczy hamowania, całkowitego lub częściowego, działania MAG, obejmującego jej wiązanie z neuronami i hamowanie wzrostu neurytów.
Określenie „zmienione przeciwciało oznacza białko kodowane przez region kodujący zmienioną immunoglobulinę, które można otrzymać w wyniku ekspresji w wybranej komórce gospodarzu. Takie zmienione przeciwciała obejmują zmodyfikowane przeciwciała (np. chimeryczne, o zmienionym kształcie, humanizowane lub wektorowe przeciwciała) lub fragmenty przeciwciał niezawierające części lub całości regionu stałego immunoglobuliny, np. Fv, Fab lub F(ab)2 itp.
Określenie „region kodujący zmienioną immunoglobulinę“ dotyczy sekwencji kwasu nukleinowego kodującej zmienione przeciwciało. Gdy zmienione przeciwciało jest przeciwciałem szczepionym CDR lub humanizowanym przeciwciałem, sekwencje kodujące regiony determinujące dopasowanie (CDR) z immunoglobuliny, nie będącej ludzką immunolgobuliną, wstawia się do pierwszego partnera immunoglobulinowego zawierającego sekwencje zrębowe ludzkiej domeny zmiennej. Ewentualnie pierwszy partner immunoglobulinowy jest funkcjonalnie połączony z drugim partnerem immunoglobulinowym.
Określenie „pierwszy partner immunoglobulinowy dotyczy sekwencji kwasu nukleinowego kodującej ludzki region zrębowy lub ludzki region zmienny immunoglobuliny, w którym natywne (lub naturalnie występujące) regiony kodujące regiony CDR zastąpione są przez regiony kodujące regiony CDR przeciwciała donorowego. Ludzki region zmienny może stanowić łańcuch ciężki immunoglobuliny, łańcuch lekki (lub obydwa łańcuchy), ich analog lub funkcjonalny fragment. Takie regiony CDR, zlokalizowane w regionie zmiennym przeciwciał (immunoglobuliny) można określić znanymi metodami. Przykładowo Kabat i in. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. wydanie, U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)) ujawniają zasady lokalizacji regionów CDR. Ponadto znane są programy komputerowe, które są przydatne do identyfikowania regionów/struktur CDR.
Określenie „drugi partner immunoglobulinowy dotyczy innej sekwencji nukleotydowej kodującej białko lub peptyd, z którym połączony jest pierwszy partner immunoglobulinowy w ramce odczytu lub przez ewentualną standardową sekwencję łącznikową (tj. połączony funkcjonalnie). Korzystnie jest to gen immunoglobulinowy. Drugi partner immunoglobulinowy może obejmować sekwencję kwasu nukleinowego kodującą cały region stały dla tego samego (tj. homologicznego - pierwsze i drugie przeciwciało pochodzą z tego samego źródła) lub dodatkowego (tj. heterologicznego) interesującego przeciwciała. Może nim być łańcuch ciężki immunoglobuliny lub łańcuch lekki (lub obydwa łańcuchy jako część pojedynczego polipeptydu). Drugi partner immunoglobulinowy nie jest ograniczony do konkretPL 211 014 B1 nej klasy lub izotypu immunoglobuliny. Ponadto drugi partner immunoglobulinowy może zawierać część regionu stałego immunoglobuliny, takiego jak występujący w Fab lub F(ab)2 (czyli oddzielną część odpowiedniego ludzkiego regionu stałego lub regionu zrębowego). Taki drugi partner immunoglobulinowy może także zawierać sekwencję kodującą integralne białko błonowe eksponowane na zewnętrznej powierzchni komórki gospodarza, np. jako część biblioteki prezentacji fagowej, lub sekwencję kodującą białko do wykrywania analitycznego lub diagnostycznego, np. peroksydazę chrzanową, β-galaktozydazę itd.
Określenia Fv, Fc, Fd, Fab lub F(ab)2 stosuje się w ich zwykłym znaczeniu (patrz np. Harlow i in., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).
W użytym tutaj znaczeniu określenie „zmodyfikowane przeciwciało opisuje typ zmienionego przeciwciała, czyli pełnej długości przeciwciało syntetyczne (np. chimeryczne, o zmienionym kształcie lub humanizowane przeciwciało, w odróżnieniu od fragmentu przeciwciała), w którym część domen zmiennych łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego wybranego przeciwciała akceptorowego jest zastąpiona przez analogiczne części z jednego lub większej liczby przeciwciał donorowych, które wykazują specyficzność względem wybranego epitopu. Przykładowo, takie cząsteczki mogą obejmować przeciwciała charakteryzujące się humanizowanym łańcuchem ciężkim, związanym z niemodyfikowanym łańcuchem lekkim (lub chimerycznym łańcuchem lekkim) albo na odwrót. Zmodyfikowane przeciwciała mogą także charakteryzować się zmienioną sekwencją kwasu nukleinowego kodującego regiony zrębowe domeny zmiennej łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego przeciwciała akceptorowego w celu zachowania specyficzności wiązania przeciwciała donorowego. Przeciwciała te mogą zawierać zastąpienie jednego lub większej liczby regionów CDR (korzystnie wszystkich) z przeciwciała akceptorowego opisanymi tutaj regionami CDR z przeciwciała donorowego.
Określenie „przeciwciało chimeryczne oznacza typ zmodyfikowanego przeciwciała, które zawiera naturalnie występujący region zmienny (łańcuchów lekkiego i ciężkiego) pochodzący z przeciwciała donorowego, związany z regionami stałymi łańcuchów lekkiego i ciężkiego pochodzącymi z przeciwciała akceptorowego.
Określenie „przeciwciało humanizowane oznacza typ zmodyfikowanego przeciwciała zawierającego regiony CDR pochodzące z immunoglobuliny donorowej, nie pochodzącej od człowieka, przy czym pozostałe części pochodzące z immunoglobuliny pochodzą z jednej (lub większej liczby) immunoglobulin ludzkich. Ponadto, zrębowe reszty podporowe mogą być zmienione tak, aby zachować powinowactwo wiązania (patrz np. Queen i in., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson i in., Bio/Technology, 9:421 (1991)). Odpowiednim ludzkim przeciwciałem akceptorowym może być jedno z wybranych ze standardowej bazy danych, np. bazy danych KABAT®, bazy danych Los Alamos oraz bazy danych Swiss Protein, przez homologię z sekwencjami nukleotydową i aminokwasową donorowego przeciwciała. Ludzkie przeciwciało charakteryzujące się homologią z regionami zrębowymi przeciwciała donorowego (na podstawie aminokwasów) może być odpowiednie do dostarczenia regionu stałego łańcucha ciężkiego i/lub regionu zrębowego domeny zmiennej do wstawienia donorowych regionów CDR. Odpowiednie przeciwciało akceptorowe odpowiednie do wykorzystania jego regionów stałych i zrębowych domeny zmiennej łańcucha lekkiego może zostać wybrane w podobny sposób. Należy podkreślić, że łańcuchy ciężki i lekki przeciwciała akceptorowego nie muszą pochodzić z tego samego przeciwciała akceptorowego. Opisano kilka sposobów wytwarzania takich przeciwciał humanizowanych - patrz np. EP-A-0239400 i EP-A-054951.
Określenie „przeciwciało ludzkie o zmienionym kształcie dotyczy zmienionego przeciwciała, w którym minimalnie co najmniej jeden region CDR z pierwszego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała donorowego jest podstawiony regionem CDR drugiego przeciwciała akceptorowego. Korzystnie zastąpione są wszystkie sześć regionów CDR. Korzystniej cały region łączący antygen (np., Fv, Fab lub F(ab')2) z pierwszego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała donorowego jest podstawiony odpowiadającym regionem drugiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała akceptorowego. Korzystniej region Fab z pierwszego ludzkiego donora jest funkcjonalnie połączony z odpowiednimi regionami stałymi drugiego przeciwciała akceptorowego z wytworzeniem pełnej długości przeciwciała monoklonalnego.
Określenie „przeciwciało wektorowe dotyczy przeciwciała, do którego przyłączono środek, który ułatwia transport przez barierę krew-mózg (BBB) (praca przeglądowa, patrz, Pardridge; Advanced Drug Delivery Review 36, 299-321, 1999). Przyłączenie może być chemiczne, albo alternatywnie, ugrupowanie może zostać wprowadzone do przeciwciała. Jeden przykład stanowi wytworzenie chimery z przeciwciałem skierowanym do receptora komórek śródbłonka naczyń włosowatych mózgu, np. przeciwciałem przeciw receptorowi insuliny (Saito i in., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 10227-31;
PL 211 014 B1
Pardridge i in., (1995) Pharm. Res 12 807-816; Broadwell i in., (1996) Exp. Neurol, 142 47-65; Bickel i in., (1993) Proc. Natl. Acad Sci, USA 90, 2618-2622; Friden i in., (1996) J. Pharm, Exp. Cher. 278 1491-1498, US 5182107, US 5154924, US 5833988, US 5527527). Po związaniu z receptorem obydwa składniki przeciwciała bispecyficznego przechodzą przez BBB na drodze transcytozy. Alternatywnie, środek może być ligandem wiążącym takie receptory na powierzchni komórki, np. insuliną, transferyną lub lipoproteiną o niskiej gęstości (Descamps i in., (1996) Am. J. Physiol. 270 H1149-H1158; Duffy i in., (1987) Brain Res. 420 32-38; Dehouck i in., (1997) J. Cell Biol. 1997 877-889). Można także zastosować naturalnie występujące peptydy takie jak penetratyna, SynB1 i SynB3, które są znane jako czynniki ułatwiające transport przez BBB (Rouselle i in., (2000) Mol. Pharm. 57, 679-686 oraz Rouselle i in., (2001) Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 296, 124-131).
Określenie „przeciwciało donorowe dotyczy przeciwciała (monoklonalnego lub rekombinowanego), które wprowadza sekwencje aminokwasowe swoich regionów zmiennych, regionów CDR lub innych fragmentów funkcjonalnych, lub ich analogów do pierwszego partnera immunoglobulinowego, tak aby dostarczyć region kodujący zmienioną immunoglobulinę oraz w rezultacie zmienione eksprymowane przeciwciało o specyficzności antygenowej i aktywności neutralizującej przeciwciała donorowego.
Określenie „przeciwciało akceptorowe dotyczy przeciwciała (monoklonalnego lub rekombinowanego) heterologicznego względem przeciwciała donorowego, które wprowadza wszystkie (lub którąkolwiek część, ale korzystnie wszystkie) sekwencje aminokwasowe kodujące regiony zrębowe jego łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego, oraz/albo regiony stałe jego łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego, do pierwszego partnera immunoglobulinowego. Korzystnie przeciwciałem akceptorowym jest przeciwciało ludzkie.
Określenie „CDR definiuje się jako sekwencje aminokwasowe regionu determinującego dopasowanie przeciwciała, które są hiperzmiennymi regionami łańcuchów immunoglobulinowych ciężkiego i lekkiego. Patrz np. Kabat i in.. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. wyd., U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). W części zmiennej immunoglobuliny występują trzy regiony CDR w łańcuchu ciężkim oraz trzy regiony CDR w łańcuchu lekkim. Zatem „CDR” w użytym tutaj znaczeniu dotyczy wszystkich trzech regionów CDR łańcucha ciężkiego lub wszystkich trzech regionów CDR łańcucha lekkiego (albo, gdy jest to stosowne, regionów CDR zarówno łańcucha ciężkiego, jak i lekkiego). Struktura oraz ufałdowanie cząsteczki białka przeciwciała może spowodować, że inne reszty staną się częścią regionu wiążącego antygen i fachowiec będzie je za takie uważać. Patrz np. Chothia i in., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, str. 877-883. Dla jasności regiony CDR według definicji Kabata podkreślono w SEQ ID NO: 13-26.
Regiony CDR dostarczają większość reszt kontaktowych do wiązania przeciwciała z antygenem lub epitopem. Interesujące regiony CDR pochodzą z sekwencji regionów zmiennych łańcuchów ciężkiego i lekkiego przeciwciała donorowego oraz obejmują one analogi naturalnie występujących regionów CDR, które to analogi wykazują lub zachowują taką samą specyficzność wiązania i/lub neutralizacji antygenu jak przeciwciało donorowe z którego pochodzą.
Określenie „fragment funkcjonalny oznacza część sekwencji regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub lekkiego (np. z niewielkimi delecjami na N- lub C-końcu regionu zmiennego immunoglobuliny), która zachowuje taką samą specyficzność wiązania i/lub neutralizacji antygenu jak przeciwciało z którego pochodzi ten fragment.
Określenie „analog oznacza sekwencję aminokwasową zmodyfikowaną o co najmniej jeden aminokwas, przy czym wspomniana modyfikacja może być modyfikacją chemiczną, podstawieniem lub przegrupowaniem kilku aminokwasów (czyli nie więcej niż 10), która to modyfikacja umożliwia zachowanie przez sekwencję aminokwasową charakterystyki biologicznej, np. specyficzności antygenowej i wysokiego powinowactwa niemodyfikowanej sekwencji. Przykładowo, przez podstawienia można skonstruować (ciche) mutacje, gdy pewne miejsca dla endonukleaz restrykcyjnych wprowadza się do lub w otoczeniu regionów kodujących regiony CDR. Rozważa się tutaj zastosowanie analogów przeciwciała według wynalazku. Ogólnie wiadomo, że niewielkie zmiany sekwencji aminokwasowej lub kwasu nukleinowego mogą doprowadzić np. do wytworzenia allelicznej formy oryginalnego białka, która zachowuje zasadniczo podobne właściwości. Zatem analogi przeciwciała według wynalazku obejmują te, w których regiony CDR w regionie hiperzmiennym łańcuchów ciężkiego i lekkiego są co najmniej w 80% homologiczne, korzystnie co najmniej w 90% homologiczne, a najkorzystniej co najmniej w 95% homologiczne z regionami CDR, które zdefiniowano powyżej jako CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3, oraz zachowują aktywność neutralizacji MAG. Sekwencje aminokwasowe są co najmniej w 80% homologiczne, gdy zawierają 80% identycznych reszt aminokwasoPL 211 014 B1 wych w podobnej pozycji, gdy sekwencje przypasowuje się optymalnie, przy czym przerwy lub insercje liczy się jako nieidentyczne reszty. Rozważa się tutaj także analogi przeciwciał według wynalazku, w których regiony zrębowe są co najmniej w 80%, korzystnie co najmniej w 90%, a najkorzystniej co najmniej w 95% homologiczne z regionami zrębowymi przedstawionymi w SEQ ID NO: 1-5. Sekwencje aminokwasowe są co najmniej w 80% homologiczne, gdy zawierają 80% identycznych reszt aminokwasowych w podobnej pozycji, gdy sekwencje przypasowuje się optymalnie, przy czym przerwy lub insercje liczy się jako nieidentyczne reszty.
Analogi mogą także powstać jako zmiany alleliczne. Określenie „zmiana lub modyfikacja alleliczna dotyczy zmiany w sekwencji kwasu nukleinowego. Takie zmiany lub modyfikacje mogą wynikać ze zdegenerowania kodu genetycznego lub mogą być celowo wprowadzone dla wywołania pożądanej charakterystyki. Te zmiany lub modyfikacje mogą, ale nie muszą, spowodować zmiany w kodowanej sekwencji aminokwasowej.
Określenie „czynniki efektorowe dotyczy niebiałkowych cząsteczek nośnikowych, które mogą być związane w zwykły sposób ze zmienionymi przeciwciałami i/lub naturalnymi lub syntetycznymi łańcuchami lekkimi lub ciężkimi przeciwciała donorowego albo innymi fragmentami donorowego przeciwciała. Takie niebiałkowe nośniki mogą obejmować zwykłe nośniki stosowane w dziedzinie diagnostyki, np. perełki z polistyrenu lub innych tworzyw sztucznych, polisacharydy, np. takie jak stosowane w systemie BIAcore [Pharmacia] lub inne niebiałkowe substancje znajdujące zastosowanie w dziedzinie medycyny, bezpieczne przy podawaniu ludziom i zwierzętom. Inne czynniki efektorowe mogą obejmować makrocykl do chelatowania atomu metalu ciężkiego lub radioizotopów. Takie czynniki efektorowe mogą także znaleźć zastosowanie do wydłużania okresu półtrwania zmienionych przeciwciał, np. glikol polietylenowy.
Neutralizujące przeciwciało specyficzne względem MAG opisano (Poltorak i in., (1987) Journal of Cell Biology 105, 1893-1899, DeBellard i in., (1996) Mol. Cell Neurosci, 7, 89-101; Tang i in., (1997) Mol. Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K i Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262) i jest ono dostępne w handlu (MAB1567 (Chemicon)).
Alternatywnie można skonstruować przeciwciała, zmienione przeciwciała i fragmenty, przez immunizację gatunków nie będących ludźmi (np. bydła, owiec, małp, kurcząt, gryzoni (np., myszy i szczurów) itd.) w celu wytworzenia pożądanej immunoglobuliny po prezentacji natywnej MAG z jakiegokolwiek gatunku, przeciw któremu mogą zostać wytworzone przeciwciała reaktywne krzyżowo z ludzką MAG, np. człowieka lub kurczęcia. Standardowe techniki hybrydom stosuje się do wytworzenia linii komórek hybrydom wydzielających mAb przeciw MAG, nie będące pochodzenia ludzkiego. Następnie takie hybrydomy selekcjonuje się pod względem wiązania przy użyciu powlekanych MAG płytek 384- lub 96-studzienkowych, z biotynylowaną MAG związaną z płytką powleczoną streptawidyną, albo w homogennym teście immunologicznym z europem związanym z APC, przy użyciu biotynylowanej MAG.
Natywne przeciwciało ludzkie można wytworzyć w myszy z ludzkimi przeciwciałami, takiej jak „Xenomouse (Abgenix), w której geny immunoglobulinowe zostały usunięte i do mysiego chromosomu wprowadzono geny kodujące ludzkie immunoglobuliny. Myszy immunizuje się normalnie i rozwijają one normalną odpowiedź immunologiczną, która pochodzi z ludzkich genów. Ta więc mysz wytwarza ludzkie przeciwciała bez konieczności ich humanizowania po wyselekcjonowaniu pozytywnych hybrydom. (patrz, Green L.L., J. Immunol Methods 1999, 10 grudnia; 231 (1-2): 11-23)
Możliwe jest także zastosowanie fragmentów Fab lub F(ab')2 pochodzących z mAb, skierowanych przeciw MAG. Fragmenty te znajdują zastosowanie jako czynniki ochronne in vivo. Fragment Fab zawiera cały łańcuch lekki i N-końcową część łańcucha ciężkiego; a fragment F(ab')2 jest fragmentem tworzonym przez dwa fragmenty Fab związane przez mostki disulfidowe. Fragmenty Fab i F(ab')2 można otrzymać znanymi sposobami, np. przez rozszczepienie mAb odpowiednimi enzymami proteolitycznymi, papainą i/lub pepsyną, albo metodami rekombinacyjnymi. Fragmenty Fab i F(ab')2 znajdują jako takie zastosowanie jako środki terapeutyczne i profilaktyczne oraz jako donory sekwencji, w tym sekwencji regionów zmiennych i sekwencji regionów CDR użytecznych do wytwarzania opisanych rekombinowanych lub humanizowanych przeciwciał.
Fragmenty Fab i F(ab')2 można także konstruować z zastosowaniem kombinatoryjnej biblioteki fagowej (patrz np. Winter i in., Ann. Rev. Inmunol., 12:433-455 (1994)) albo poprzez tasowanie łańcuchów immunoglobuliny (patrz np. Marks i in., Bio/Technology, 10:779-783 (1992).
Tak więc fragmenty ludzkich przeciwciał (Fv, scFv, Fab) specyficzne względem MAG można wyizolować z użyciem bibliotek fragmentów ludzkiego przeciwciała w prezentacji fagowej. Bibliotekę
PL 211 014 B1 cząstek bakteriofagów, które prezentują fragmenty białka ludzkiego przeciwciała, przeszukuje się względem białka MAG. Te fagi prezentujące fragmenty przeciwciała, które wiążą MAG, wybiera się z biblioteki i amplifikuje klonalnie. Następnie geny ludzkich przeciwciał wycina się ze specyficznego bakteriofaga i wstawia do konstruktów ekspresyjnych ludzkiej IgG zawierających regiony stałe ludzkiej IgG, z wytworzeniem całej cząsteczki ludzkiej IgG z regionami zmiennymi z wyizolowanego bakteriofaga specyficznego względem MAG.
Przeciwciała donorowe mogą wprowadzać sekwencje, takie jak sekwencje peptydowe regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego, sekwencje zrębowe, sekwencje CDR, ich funkcjonalne fragmenty lub analogi oraz kodujące je sekwencje kwasu nukleinowego, znajdujące zastosowanie do projektowania i uzyskiwania różnych zmienionych przeciwciał, które cechują się specyficznością wiązania antygenu przeciwciała donorowego.
Uwzględniając zdegenerowanie kodu genetycznego można skonstruować różne sekwencje kodujące sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego oraz sekwencje CDR, a także ich funkcjonalne fragmenty i analogi wykazujące specyficzność antygenową przeciwciała donorowego. Izolowane sekwencje kwasu nukleinowego lub ich fragmenty, kodujące sekwencje peptydowe regionu zmiennego łańcucha lub regionów CDR, można stosować do wytwarzania zmienionych przeciwciał, np. przeciwciał chimerycznych lub humanizowanych albo innych zmodyfikowanych przeciwciał, gdy połączy się je funkcjonalnie z drugim partnerem immunoglobulinowym.
Zmienione cząsteczki immunoglobulin mogą kodować zmienione przeciwciała, które obejmują zmodyfikowane przeciwciała, takie jak przeciwciała chimeryczne lub przeciwciała humanizowane. Pożądany region kodujący zmienioną immunoglobulinę zawiera regiony kodujące regiony CDR, które kodują peptydy o specyficzności antygenowej przeciwciała anty-MAG, korzystnie przeciwciała o wysokim powinowactwie, wstawione do pierwszego partnera immunoglobulinowego (ludzkiego regionu zrębowego lub ludzkiego regionu zmiennego immunoglobuliny).
Korzystnie, pierwszy partner immunoglobulinowy jest funkcjonalnie połączony z drugim partnerem immunoglobulinowym. Drugi partner immunoglobulinowy został zdefiniowany powyżej i może on zawierać sekwencję kodującą interesujący region drugiego przeciwciała, np. region Fc. Drudzy partnerzy immunoglobulinowi mogą także obejmować sekwencje kodujące inną immunoglobulinę, z którą połączono region stały łańcucha lekkiego lub ciężkiego w ramce odczytu albo za pomocą sekwencji łącznikowej. Można zaprojektować zmodyfikowane przeciwciała skierowane przeciw funkcjonalnym fragmentom lub analogom MAG tak, aby wywoływały one silniejsze wiązanie.
Drugi partner immunoglobulinowy może być także związany ze zdefiniowanymi powyżej czynnikami efektorowymi, w tym z niebiałkowymi cząsteczkami nośnikowymi, z którymi znanymi sposobami może zostać związany funkcjonalnie drugi partner immunoglobulinowy.
Fuzja lub połączenie pomiędzy drugimi partnerami immunoglobulinowymi, np. sekwencjami przeciwciała, a czynnikiem efektorowym może zachodzić w jakikolwiek dogodny sposób, np. przez standardowe wiązania kowalencyjne lub jonowe, fuzje białkowe albo z zastosowaniem heterobifunkcyjnych związków sieciujących, takich jak np. karbodiimid, aldehyd glutarowy itd. Takie techniki są znane i przystępnie opisane w zwykłych tekstach chemicznych i biochemicznych.
Ponadto w regionie kodującym zmienioną immunoglobulinę można także skonstruować standardowe sekwencje łącznikowe, które w prosty sposób zapewniają wystarczającą przestrzeń pomiędzy drugim partnerem immunoglobulinowym, a czynnikiem efektorowym. Projektowanie takich łączników jest dobrze znane fachowcom. Rozważa się także diaciała (dwuwartościowe lub bispecyficzne), triaciała, tetraciała oraz inne wieloważne rodzaje białek scFV, zawierające jeden lub większą liczbę regionów CDR, jak opisano powyżej, które wiążą się z oraz neutralizują działanie MAG.
Przeciwciało może być przyłączone do dodatkowego środka. Przykładowo, można zastosować procedurę technologii rekombinacji DNA do wytworzenia zmodyfikowanego przeciwciała w którym fragment Fc lub domena CH2-CH3 pełnej cząsteczki przeciwciała została zastąpiona przez enzym lub inną wykrywalną cząsteczkę (tj. polipeptydową cząsteczkę efektorową lub reporterową).
Drugi partner immunoglobulinowy może być także funkcjonalnie połączony z nieimmunoglobulinowym peptydem, białkiem lub jego fragmentem heterologicznym względem sekwencji zawierającej region CDR o specyficzności antygenowej przeciwciała anty-MAG. Powstałe białko po ekspresji może wykazywać zarówno specyficzność przeciw antygenowi MAG, jak i cechy cząsteczki nie będącej immunoglobuliną. Taką cechą partnera fuzyjnego może być np. cecha funkcjonalna, taka jak inna domena wiążąca lub receptorowa, albo cecha terapeutyczna, jeżeli partner fuzyjny jest sam z siebie białkiem terapeutycznym, albo dodatkowa charakterystyka antygenowa.
PL 211 014 B1
Inne opisane tu pożądane białko może zawierać pełną cząsteczkę przeciwciała, zawierającą pełnej długości łańcuchy ciężki i lekki, albo którykolwiek ich oddzielny fragment, taki jak fragmenty Fab lub F(ab')2, dimer łańcucha ciężkiego lub którekolwiek ich minimalne fragmenty rekombinowane, takie jak Fv lub przeciwciało jednołańcuchowe (SCA) albo jakąkolwiek inną cząsteczkę wiążącą o tej samej specyficzności co wybrane donorowe mAb. Takie białko może być stosowane w postaci zmienionego przeciwciała albo może być stosowane w postaci innej niż fuzyjna.
Gdy drugi partner immunoglobulinowy pochodzi z przeciwciała innego niż przeciwciało donorowe, np. z regionów zrębowych lub stałych jakiegokolwiek izotypu lub klasy immunoglobuliny, powstaje zmodyfikowane przeciwciało. Zmodyfikowane przeciwciała mogą zawierać regiony stałe lub regiony zrębowe domeny zmiennej immunoglobuliny (Ig) z jednego źródła, np. z przeciwciała akceptorowego, oraz jeden lub większą liczbę (korzystnie wszystkie) regionów CDR z przeciwciała donorowego. Ponadto, do regionu zrębowego domeny zmiennej łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego mAb akceptorowego lub do donorowych regionów CDR, można wprowadzić zmiany, np. delecje, podstawienia lub addycje, na poziomie kwasu nukleinowego lub aminokwasowym, w celu zachowania specyficzności wiązania antygenu przeciwciała donorowego.
Takie zmodyfikowane przeciwciała projektuje się z wykorzystaniem domen zmiennych jednego z (lub obydwu) łańcuchów ciężkiego i/lub lekkiego anty-MAG mAb lub jednego lub większej liczby regionów CDR łańcucha ciężkiego lub lekkiego. Zmodyfikowane przeciwciała mogą być neutralizujące, jak zdefiniowano powyżej.
Takie zmodyfikowane przeciwciała mogą obejmować humanizowane przeciwciało zawierające regiony zrębowe wybranej ludzkiej immunoglobuliny lub jej podtypu, albo chimeryczne przeciwciało zawierające regiony stałe ludzkich łańcuchów ciężkiego i lekkiego połączone z funkcjonalnymi fragmentami przeciwciała anty-MAG. Odpowiednie ludzkie (lub zwierzęce) przeciwciało może być wybrane ze standardowej bazy danych, np. bazy danych KABAT®, bazy danych Los Alamos oraz bazy danych Swiss Protein, przez homologię z sekwencjami nukleotydową i aminokwasową przeciwciała donorowego. Ludzkie przeciwciało charakteryzujące się homologią z regionami zrębowymi przeciwciała donorowego (na poziomie sekwencji aminokwasowej) może być odpowiednie do dostarczenia regionu stałego łańcucha ciężkiego i/lub regionu zrębowego domeny zmiennej łańcucha ciężkiego do wstawienia donorowych regionów CDR. Odpowiednie przeciwciało akceptorowe, które może dostarczyć region stały łańcucha lekkiego i/lub regiony zrębowe domeny zmiennej łańcucha lekkiego można wybrać w podobny sposób. Należy podkreślić, że łańcuchy ciężki i lekki przeciwciała akceptorowego nie muszą pochodzić z tego samego przeciwciała akceptorowego.
Wskazane jest, aby heterologiczne regiony zrębowe i stałe były wybrane z klas i izotypów ludzkich immunoglobulin, takich jak IgG (podtypy 1 do 4), IgM, IgA i IgE. Jednakże przeciwciało akceptorowe nie musi zawierać tylko sekwencji białkowych ludzkich immunoglobulin. Przykładowo, można skonstruować gen, w którym sekwencja DNA kodująca część łańcucha ludzkiej immunoglobuliny jest połączona z sekwencją DNA kodującą nieimmunoglobulinową sekwencję aminokwasową, taką jak polipeptydowa cząsteczka efektorowa lub reporterowa.
W humanizowanym przeciwciele domeny zmienne w obydwu ludzkich łańcuchach ciężkim i lekkim mogą być zmodyfikowane przez zastąpienie jednego lub większej liczby regionów CDR. Możliwe jest zastosowanie wszystkich sześciu regionów CDR, lub różnych połączeń mniej niż sześciu regionów CDR. Korzystnie zastępuje się wszystkie sześć regionów CDR. Możliwe jest zastąpienie regionów CDR tylko w ludzkim łańcuchu ciężkim, przy zastosowaniu jako łańcucha lekkiego nie zmodyfikowanego łańcucha lekkiego z ludzkiego przeciwciała akceptorowego. Alternatywnie, kompatybilny łańcuch lekki można wybrać z innego ludzkiego przeciwciała na podstawie standardowych baz danych przeciwciał. Pozostała część zmodyfikowanego przeciwciała może być wyprowadzona z jakiejkolwiek dogodnej ludzkiej immunoglobuliny akceptorowej.
Zatem zmodyfikowane humanizowane przeciwciało ma strukturę naturalnego ludzkiego przeciwciała lub jego fragmentu oraz wykazuje połączenie właściwości wymaganych do skutecznego zastosowania terapeutycznego.
Specjalista w dziedzinie wynalazku zrozumie, że zmodyfikowane przeciwciało może być dalej modyfikowane przez zmiany aminokwasów domeny zmiennej, a zatem bez wpływu na specyficzność oraz wysokie powinowactwo przeciwciała donorowego (tj., analog). Przewiduje się, że aminokwasy łańcuchów ciężkiego i lekkiego można podstawić jakimikolwiek innymi aminowkasami w regionach zrębowych domeny zmiennej lub regionów CDR lub obydwu z nich.
PL 211 014 B1
Ponadto, region stały można zmienić w celu wzmocnienia lub osłabienia wybranych właściwości cząsteczek według wynalazku i innych tu opisanych. Przykładowo można zastosować dimeryzację, wiązanie z receptorami Fc lub zdolność do wiązania i aktywowania dopełniacza (patrz np. Angal i in., Mol. Immunol, 30:105-108 (1993), Xu i in., J. Biol. Chem, 269: 3469-3474 (1994), Winter i in., EP 307434-B).
Zmienione przeciwciało, które jest przeciwciałem chimerycznym, różni się od opisanych powyżej przeciwciał humanizowanych tym, że dostarcza całe regiony zmienne łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego, włącznie z regionami zrębowymi przeciwciała donorowego nie pochodzącego od człowieka, związane z regionami stałymi immunoglobulin pochodzącymi z innych gatunków, korzystnie od ludzi, dla obydwu łańcuchów.
Sekwencje domen zmiennych łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego oraz regiony CDR odpowiednich donorowych mAb oraz kodujące je sekwencje kwasów nukleinowych, można stosować do skonstruowania zmienionych przeciwciał, korzystnie humanizowanych przeciwciał według wynalazku w następujący sposób. Takie same lub podobne techniki można także stosować do wytworzenia innych opisanych cząsteczek.
Hybrydomę wytwarzającą wybrane mAb donorowe klonuje się w standardowy sposób, a DNA regionów zmiennych jej łańcuchów ciężkiego i lekkiego uzyskuje się technikami znanymi specjaliście w dziedzinie wynalazku, np. technikami opisanymi w Sambrook i in., (Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. wydanie, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Regiony zmienne łańcuchów ciężkiego i lekkiego, zawierające co najmniej regiony kodujące regiony CDR oraz te części regionów zrębowych domen zmiennych łańcuchów lekkiego i/lub ciężkiego akceptorowego mAb, wymagane do zachowania specyficzności wiązania donorowego mAb, a także pozostałe części łańcucha przeciwciała wyprowadzone z ludzkiej immunoglobuliny uzyskuje się za pomocą starterów polinukleotydowych oraz odwrotnej transkryptazy. Regiony kodujące regiony CDR identyfikuje się na podstawie znanej bazy danych oraz przez porównanie z innymi przeciwciałami.
Tak więc można wytworzyć mysio/ludzkie przeciwciało chimeryczne i zbadać jego zdolność wiązania. Takie przeciwciało chimeryczne zawiera całe regiony VH i VL przeciwciała donorowego nie pochodzącego od człowieka, związane z regionami stałymi ludzkiej Ig dla obydwu łańcuchów.
Homologiczne regiony zrębowe domeny zmiennej łańcucha ciężkiego z ludzkiego przeciwciała można zidentyfikować na podstawie komputerowych baz danych, np. KABAT®, a jako przeciwciało akceptorowe zostanie wybrane ludzkie przeciwciało wykazujące homologię względem przeciwciała donorowego. Odpowiedni region zrębowy domeny zmiennej łańcucha lekkiego można zaprojektować w podobny sposób.
Humanizowane przeciwciało może być wyprowadzone z chimerycznego przeciwciała lub korzystnie wytworzone syntetycznie przez wstawienie kodujących regiony CDR regionów donorowego mAb z łańcuchów ciężkiego i lekkiego odpowiednio do wybranego zrębu łańcucha ciężkiego i lekkiego. Alternatywnie, humanizowane przeciwciało można wytworzyć z zastosowaniem standardowych technik mutagenezy. Zatem wytworzone humanizowane przeciwciało zawiera ludzkie regiony zrębowe oraz regiony donorowego mAb, kodujące regiony CDR. Można przeprowadzić następne manipulacje na resztach zrębowych. Powstałe humanizowane przeciwciało może być eksprymowane w rekombinowanych komórkach gospodarzach, np. komórkach COS, CHO lub szpiczaka.
Standardowy wektor ekspresyjny lub rekombinowany plazmid wytwarza się przez umieszczenie tych sekwencji kodujących przeciwciało w funkcjonalnym związku z regulatorowymi sekwencjami kontrolnymi, zdolnymi do kontrolowania replikacji i ekspresji w komórce gospodarzu i/lub wydzielania z komórki gospodarza. Sekwencje regulatorowe obejmują sekwencje promotorowe, np. promotor CMV oraz sekwencje sygnałowe, które mogą być wyprowadzone z innych znanych przeciwciał. Podobnie można wytworzyć drugi wektor ekspresyjny o sekwencji DNA, która koduje komplementarny łańcuch lekki lub ciężki przeciwciała. Korzystnie ten drugi wektor ekspresyjny jest identyczny z pierwszym wektorem, za wyjątkiem sekwencji kodujących oraz markerów selekcyjnych, tak, aby umożliwić, aby każdy łańcuch polipeptydowy był eksprymowany funkcjonalnie w takim stopniu, w jakim jest to tylko możliwe. Alternatywnie, sekwencje kodujące łańcuch ciężki i lekki dla zmienionego przeciwciała mogą się znajdować w pojedynczym wektorze.
Wybraną komórkę gospodarza kotransfekuje się standardowymi technikami zarówno pierwszym, jak i drugim wektorem (lub po prostu transfekuje się jednym wektorem) w celu wytworzenia transfekowanej komórki gospodarza, zawierającej zarówno rekombinowane, jak i syntetyczne łańcuchy lekki i ciężki. Następnie transfekowane komórki hoduje się standardowymi technikami w celu wytworzenia zmodyfikowanego przeciwciała według wynalazku i innych tu opisanych. Humanizowane
PL 211 014 B1 przeciwciało zawierające związane rekombinowane łańcuchy ciężki i/lub lekki testuje się w hodowli za pomocą odpowiedniego testu, takiego jak ELISA lub RIA. Podobne standardowe techniki można zastosować do skonstruowania innych zmienionych przeciwciał i cząsteczek.
Specjalista w dziedzinie wynalazku może wybrać odpowiednie wektory do etapów klonowania i subklonowania stosowane w sposobach oraz w konstruowaniu preparatów według wynalazku i innych tu opisanych. Przykładowo, można zastosować standardowe wektory do klonowania serii pUC. Jeden z takich wektorów, pUC19, jest dostępny w handlu z takich firm jak Amersham (Buckinghamshire, Wielka Brytania) lub Pharmacia (Uppsala, Szwecja). Ponadto do klonowania można zastosować jakikolwiek wektor, który łatwo się replikuje, ma dużo miejsc do klonowania oraz geny selekcyjne (np., oporności antybiotykowej) oraz łatwo ulega manipulacjom.
Podobnie, spośród dowolnych standardowych wektorów specjalista w dziedzinie wynalazku może wybrać wektory do ekspresji przeciwciał. Wektory zawierają także wybrane sekwencje regulatorowe (takie jak promotory CMV), które kierują replikacją i ekspresją heterologicznych sekwencji DNA w wybranych komórkach gospodarzach. Wektory te zawierają opisane powyżej sekwencje DNA, które kodują przeciwciało lub region kodujący zmienioną immunoglobulinę. Ponadto, wektory mogą zawierać wybrane sekwencje immunoglobulinowe, zmodyfikowane przez wstawienie pożądanych miejsc restrykcyjnych do łatwej manipulacji.
Wektory ekspresyjne mogą się także charakteryzować genami odpowiednimi do wzmocnienia ekspresji heterologicznych sekwencji DNA, np. ssaczy gen reduktazy dihydrofolianu (DHFR). Inne korzystne sekwencje wektorowe obejmują sekwencję sygnału poli-A, taką jak sekwencję bydlęcego hormonu wzrostu (BGH) i sekwencję promotora β-globiny (β-glopro). Znajdujące tutaj zastosowanie wektory ekspresyjne można syntetyzować technikami dobrze znanymi specjalistom w dziedzinie wynalazku.
Składniki takich wektorów, np. replikony, geny selekcyjne, wzmacniacze, promotory, sekwencje sygnałowe itp., można otrzymać ze źródeł handlowych lub naturalnych albo syntetyzować z zastosowaniem znanych procedur stosowanych do kierowania ekspresją i/lub wydzielaniem produktu rekombinowanego DNA u wybranego gospodarza. W tym celu można wybrać także inne odpowiednie wektory ekspresyjne do ekspresji u ssaków, bakterii, owadów, drożdży i grzybów, których wiele typów znanych jest w dziedzinie wynalazku.
Rozważa się tu także linię komórek transfekowanych rekombinowanym plazmidem zawierającym sekwencje kodujące przeciwciała lub ich zmienione cząsteczki immunoglobulinowe. Komórki gospodarze znajdujące zastosowanie w klonowaniu oraz inne manipulacje tych wektorów do klonowania są także standardowe. Jednakże do replikacji wektorów do klonowania oraz w innych etapach w konstruowaniu zmienionych przeciwciał według wynalazku i innych tu opisanych stosuje się w szczególności komórki z różnych szczepów E. coli.
Odpowiednimi komórkami gospodarzami lub liniami komórkowymi do ekspresji przeciwciała według wynalazku i innych tu opisanych są przykładowo komórki ssacze, takie jak NS0, Sp2/0, CHO, COS, fibroblasty (np. 3T3) oraz komórki szpiczaka, a w szczególności komórki CHO lub komórki szpiczaka. Można stosować komórki ludzkie, co umożliwia modyfikację cząsteczki za pomocą wzorów glikozylacji występujących u ludzi. Alternatywnie można zastosować inne linie komórek eukariotycznych. Dobór odpowiednich ssaczych komórek gospodarzy oraz sposobów transformacji, hodowania, amplifikacji, przeszukiwania oraz wytwarzania i oczyszczania produktu jest znany w dziedzinie wynalazku. Patrz np. Sambrook i in., jak zacytowano powyżej.
Komórki bakteryjne mogą okazać się użyteczne jako komórki gospodarze do ekspresji opisanych tu rekombinowanych Fab (patrz np. Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)). Jednakże ze względu na tendencję białek eksprymowanych w komórkach bakteryjnych do występowania w postaci niesfałdowanej lub nieprawidłowo sfałdowanej, albo w postaci nieglikozylowanej, jakikolwiek rekombinowany Fab wytworzony w komórce bakteryjnej powinien być zbadany pod względem zdolności wiązania antygenu. Jeżeli cząsteczka eksprymowana przez komórkę bakteryjną została wytworzona w postaci odpowiednio sfałdowanej, wówczas ta komórka bakteryjna będzie pożądanym gospodarzem. Przykładowo, różne szczepy E. coli stosowane do ekspresji są dobrze znane jako komórki gospodarze w dziedzinie biotechnologii. Różne szczepy B. subtilis, Streptomyces, innych laseczek itp. można także stosować w tym sposobie.
Jeżeli jest to pożądane, jako komórki gospodarze dostępne są także znane specjalistom w dziedzinie wynalazku szczepy komórek drożdżowych, jak również komórki owadzie, np. Drosophila i Lepidoptera oraz wirusowe układy ekspresji. Patrz np. Miller i in., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) oraz pozycje tam cytowane.
PL 211 014 B1
Ogólne sposoby umożliwiające skonstruowanie wektorów, sposoby transfekcji wymagane do wytworzenia opisanych tu komórek gospodarzy oraz sposoby hodowania wymagane do wytworzenia zmienionego przeciwciała według wynalazku i innych tu opisanych z takiej komórki gospodarza są standardowymi technikami. Podobnie, po wytworzeniu przeciwciała według wynalazku i inne tu opisane można oczyszczać od składników hodowli komórkowej z zastosowaniem standardowych procedur z dziedziny wynalazku, w tym wytrącania siarczanem amonu, zastosowania kolumn powinowactwa, chromatografii kolumnowej, elektroforezy żelowej itp. Takie techniki są znane specjaliście w dziedzinie wynalazku. Przykładowo, preparaty zmienionych przeciwciał opisano w WO 99/58679 i WO 96/16990.
Jeszcze inny sposób eksprymowania przeciwciał może wykorzystywać ekspresję w transgenicznym zwierzęciu, tak jak opisano w opisie patentowym US nr 4873316. Dotyczy on układu ekspresyjnego wykorzystującego zwierzęcy promotor kazeinowy, który po transgenicznym wprowadzeniu do organizmu ssaka umożliwia wytwarzanie przez samicę pożądanego rekombinowanego białka w mleku.
Po eksprymowaniu z zastosowaniem pożądanego sposobu przeciwciało bada się pod względem aktywności in vitro przez zastosowanie odpowiedniego testu. Obecnie standardowe formaty testu ELISA stosuje się do jakościowego i ilościowego oszacowania wiązania przeciwciała z MAG. Ponadto inne testy in vitro można także stosować do potwierdzenia wydajności neutralizującej przed późniejszymi badaniami klinicznymi na ludziach, przeprowadzanymi w celu określenia utrzymywan ia się przeciwciała w organizmie pomimo występowania normalnych mechanizmów klirensu.
Środki terapeutyczne według wynalazku i inne tu opisane można także podawać profilaktycznie lub po urazie albo w innych przypadkach, gdy jest to potrzebne. Dawka oraz czas trwania leczenia zależy od względnego czasu utrzymywania się cząsteczek według wynalazku i innych tu opisanych w krwioobiegu człowieka i mogą one być dostosowane przez specjalistę w dziedzinie wynalazku, zależnie od leczonego stanu oraz ogólnego zdrowia pacjenta.
Środek terapeutyczny według wynalazku i inne tu opisane mogą być podawane w jakikolwiek odpowiedni sposób, który dostarcza środek do organizmu pacjenta. Antagoniści i przeciwciała oraz środki farmaceutyczne według wynalazku i inne tu opisane są szczególnie odpowiednie do podawania pozajelitowego, tj. podskórnego, domięśniowego, dożylnego lub donosowego.
Środki terapeutyczne według wynalazku i inne tu opisane można wytwarzać jako środki farmaceutyczne zawierające skuteczną ilość antagonisty lub przeciwciała według wynalazku i innego tu opisanego, jako składnika czynnego, w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku. W przypadku środka profilaktycznego korzystna jest zawiesina wodna lub roztwór zawierający zmodyfikowane przeciwciało, korzystnie buforowane przy fizjologicznym pH, w postaci gotowej do zastrzyku. Preparaty do podawania pozajelitowego standardowo będą zawierać roztwór antagonisty lub przeciwciała według wynalazku lub innego tu opisanego albo ich koktajl rozpuszczony w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, korzystnie w wodnym nośniku. Można stosować wiele różnych wodnych nośników, np. 0,9% roztwór soli, 0,3% roztwór glicyny itp. Roztwory te są jałowe i ogólnie wolne od cząstek substancji stałych. Roztwory te można wyjałowić z zastosowaniem standardowych, dobrze znanych technik sterylizacji (np. przez filtracje). Preparaty mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze wymagane do przybliżenia warunków fizjologicznych, takie jak środki do nastawiania pH i środki buforujące itd. Stężenie antagonisty lub przeciwciała według wynalazku lub innego tu opisanego w takim preparacie farmaceutycznym może się różnić w szerokim zakresie, tj. od mniej niż około 0,5%, zazwyczaj przy lub co najmniej około 1% aż do 15 lub 20% (wag.) oraz zostanie wybrane głównie w oparciu o objętość płynu, lepkość itd., zgodnie z konkretnym wybranym sposobem podawania.
Zatem środek farmaceutyczny według wynalazku lub inny tu opisany do zastrzyków domięśniowych można przygotować tak, aby zawierał 1 ml jałowej buforowanej wody oraz pomiędzy około 1 ng do około 100 mg, np. około 50 ng do około 30 mg lub korzystniej, około 5 mg do około 25 mg, antagonisty lub przeciwciała według wynalazku lub innego tu opisanego. Podobnie preparat farmaceutyczny według wynalazku lub inny tu opisany do wlewu dożylnego można przygotować tak, aby zawierał około 250 ml jałowego płynu Ringera oraz około 1 do około 30 oraz korzystnie 5 mg do około 25 mg zmodyfikowanego przeciwciała według wynalazku lub innego tu opisanego. Obecne sposoby wytwarzania preparatów podawanych pozajelitowo są dobrze znane i oczywiste dla specjalistów w dziedzinie wynalazku i są opisane bardziej szczegółowo np. w Remington's Pharmaceutical Science, 15. wyd.,
Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
Środek terapeutyczny według wynalazku lub inny tu opisany, gdy jest obecny w preparacie farmaceutycznym, może być obecny w postaci pojedynczej dawki. Odpowiednią terapeutycznie skuteczną dawkę może łatwo określić specjalista w dziedzinie wynalazku. W celu skutecznego leczenia
PL 211 014 B1 udaru i innych chorób neurologicznych u ludzi należy podawać jedną dawkę zawierającą do 700 mg, na 70 kg masy ciała, antagonisty lub przeciwciała, pozajelitowo, korzystnie dożylnie lub i.m. (domięśniowo). Taka dawka może być, jeżeli jest to potrzebne, powtórzona z odpowiednimi przerwami czasowymi, wybranymi w odpowiedni sposób przez lekarza.
Przeciwciała tutaj opisane można liofilizować do przechowywania i roztwarzać w odpowiednim nośniku przed zastosowaniem. Wykazano, że technika ta jest skuteczna dla standardowych immunoglobulin i można stosować znane w dziedzinie wynalazku techniki liofilizacji i roztwarzania.
Środek farmaceutyczny zawierający przeciwciało anty-MAG według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik może być przeznaczony do leczenia lub profilaktyki udaru oraz innych chorób neurologicznych.
Środek farmaceutyczny zawierający przeciwciało anty-MAG według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik może być także przeznaczony do hamowania neurodegeneracji i/lub pobudzania odzyskania funkcji u pacjenta będącego człowiekiem, cierpiącego na lub z ryzykiem wystąpienia udaru lub innej choroby neurologicznej.
Poniżej opisano figury rysunku powołane w opisie wynalazku.
Fig. 1: Sekwencja łańcucha ciężkiego chimerycznego przeciwciała mysio/ludzkiego anty-MAG (SEQ ID NO: 27).
Fig. 2: Sekwencja łańcucha lekkiego chimerycznego przeciwciała mysio/ludzkiego anty-MAG (SEQ ID NO: 28).
Fig. 3: Sekwencja łańcucha ciężkiego chimerycznego przeciwciała mysio/ludzkiego anty-MAG (SEQ ID NO: 29).
Fig. 4: Chimeryczne przeciwciało anty-MAG wiąże szczurzą MAG.
Fig. 5: Sekwencje humanizowanych przeciwciał anty-MAG.
Fig. 6: Humanizowane przeciwciała anty-MAG wiążą szczurzą MAG.
Fig. 7: Humanizowane przeciwciała anty-MAG wiążą szczurzą MAG.
Fig. 8: Humanizowane przeciwciała anty-MAG wiążą ludzką MAG.
Fig. 9: Konkurencyjny test ELISA z przeciwciałami anty-MAG, mysim i humanizowanymi
Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.
P r z y k ł a d 1. Przeciwciało anty-MAG w modelu udaru
Materiały i metody
Przeciwciało monoklonalne anty-MAG
Przeciwciałem monoklonalnym anty-MAG było mysie przeciwciało przeciw kurzej MAG MAB 1567 uzyskane z Chemicon. Przeciwciało to wykazuje następujące cechy:
Antygen: glikoproteina związana z mieliną (ludzka, mysia, szczurza, bydlęca, kurza, żabia)
Izotyp: IgG1
Zdolność neutralizacji: patrz DeBellard i in., (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tang i in., (1997) Mol. Cell Neurosci 9, 333-346; Torigoe K i Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262.
Kontrolne IgG1 mAb zakupiono z R+D Systems.
Śródmózgowa kaniulacja komorowa (tylko do badania 1)
Pod znieczuleniem halotanem śródmózgową komorową (i.c.v.) kaniulę umiejscowiono w lewej bocznej komorze mózgowej (współrzędne: 1,6 mm od linii przyśrodkowej, 0,8 mm ogonowo od bregmy, 4,1 mm od powierzchni czaszki, łuk sieczny - 3,2 mm poniżej zero według Paxinos i Watson, 1986). Wszystkie szczury umieszczono pojedynczo, aby zapobiec uszkodzeniu naprowadzającej lub pozorującej kaniuli. Siedem dni po operacji prawidłowe umiejscowienie kaniuli potwierdzono przez zbadanie odpowiedzi na angiotensynę II (100 ng, Simpson i in. 1978) przejawiającej się intensywnym pragnieniem. Dziewięć dni później szczury przeszły niedokrwienie mózgu.
Przejściowe ogniskowe niedokrwienie mózgu
Przejściowe (90 minut) miejscowe niedokrwienie mózgu wywołano u samców szczurów Sprague Dawley, z których każdy ważył 300-350 g. Początkowo zwierzęta znieczulono mieszaniną 5% halotanu, 60% podtlenku azotu i 30% tlenu, podaną przez maskę, a następnie znieczulenie utrzymywano przy 1,5% halotanu. Zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej (MCAO) przeprowadzono z zastosowaniem techniki wykorzystującej nić wewnątrz światła przewodu jak wcześniej opisano (Zea Longa i in., 1989). U zwierząt utrzymywano prawidłową temperaturę ciała podczas procedury chirurgicznej, a następnie pozostawiono je do odzyskania sił na 1 godzinę w inkubatorze, po czym umieszczono je w pojedynczych klatkach. Tylko zwierzęta z punktacją neurologiczną 3 po 1 godzinie zamknięcia tętnicy włączono do badania (co oszacowano za pomocą systemu 5-stopniowej skali: 0, brak objawów; 1, odruch przeciwstronny; 2, osłabiony
PL 211 014 B1 uścisk; 3, chodzenie w kółko; 4, nieruchomość; 5, śmierć). Zwierzęta utrzymywano do czasu jednego tygodnia, a następnie uśmiercono je przez perfuzję przezsercową 0,9% roztworu soli, a następnie 4% paraformaldehydu w 100 mM buforze fosforanowym. Następnie mózgi utrwalano w 4% paraformaldehydzie w 4°C przez 48 godzin, po czym usunięto je z czaszek i pocięto na 2 mm bloki za pomocą przyrządu „a rat brain matrix”. Następnie 2 mm przekroje zatopiono w parafinie za pomocą urządzenia do obróbki tkanek Shandon Citadel 1000, pocięto na 6 μm skrawki za pomocą mikrotonu i umieszczono na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną. Następnie próbki poddano obróbce w celu wybarwienia Cresyl Fast Violet (CFV) (szybkie wybarwienie fioletem krezolowym).
Tryb dawkowania
Przeciwciało monoklonalne anty-MAG i mysie przeciwciało kontrolne izotypu IgG1 dializowano względem jałowego 0,9% chlorku sodu przez noc i odpowiednio zagęszczono.
Badanie 1: Zwierzęta otrzymały 2,5 μg mAb anty-MAG lub 2,5 μg mysiego IgG i.c.v. po 1, 24 i 72 godzinach od MCAO (5 μl na dawkę).
Badanie 2: Zwierzęta otrzymały 200 μg mAb anty-MAG lub 200 μg mysiego IgG i.v. po 1 i 24 godzinach od MCAO.
Dane dotyczące każdego dawkowanego roztworu nie były znane badaczowi.
Ocena neurologiczna
Przed wywołaniem niedokrwienia mózgowego szczury z Badania 1 trenowano w testach chodzenia po równoważni oraz nalepki. Zwierzęta niespełniające kryteriów obu tych testów wykluczono z dalszych badań. Po treningu pozostałe zwierzęta podzielono zależnie od sprawności na dwie zbalansowane grupy. Podczas badania neurologicznego dane dotyczące badanej grupy zwierząt nie były znane dla badacza.
Obustronny test nalepki
Obustronny test nalepki (Schallert i in., Pharmacology Biochemistry and Behaviour 16:455-462, (1983)) zastosowano do oszacowania zaniedbania przeciwstronnego/tendencji jednostronnych. Jest to model zaniku dotykowego obserwowanego u pacjentów z udarem (Rose i in., 1994). Test ten wcześniej opisano szczegółowo (Hunter i in., Neuropharmacology 39:806-816 (2000); Virley i in., Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 20:563-582 (2000)). W skrócie, okrągłą nalepkę umiejscowiono dokładnie wokół pozbawionego futra obszaru przednich łap z równym naciskiem, z losową kolejnością umieszczania (lewa, prawa). Przeprowadzono sesje treningowe przez 6 dni przed MCAO, dane z dnia 6 zastosowano jako przedoperacyjną linię podstawową (dzień 0). Zwierzęta poddano dwóm próbom po 24 godzinach i 7 dniach po MCAO, przy czym dane stanowią średnią z dwóch prób. Opóźnienie dotknięcia i usunięcia nalepek zanotowano i analizowano za pomocą testu logarytmicznego rang (Cox, J. Royal Statistical Society B 34:187-220 (1972)).
Chodzenie po równoważni
Chodzenie po równoważni zastosowano do zmierzenia koordynacji kończyn przednich i tylnych na podstawie dystansu przebytego wzdłuż podniesionej 100 cm równoważni (średnica 2,3 cm, 48 cm ponad podłogą) jak wcześniej opisano szczegółowo (Virley i in., Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 20:563-582 (2000)). Szczury trenowano w przechodzeniu równoważni od początku do końca. W badaniach każdego szczura poddano dwu próbom po 24 godzinach i 7 dniach od MCAO, dane odpowiadają średniej z dwóch prób. Jako analizę statystyczną zastosowano ANOVA, a następnie test t-Studenta.
27-punktowa skala neurologiczna (Badanie 1)
Badanie to obejmowało zestaw testów oceniających stan neurologiczny włącznie z umiejscowieniem łap, wizualnym zasięgiem łapy przedniej, testem poziomego drążka, obrotem przeciwstronnym, testem równi pochyłej, odruchem prawostronnym, odruchem przeciwstronnym, ruchliwością i ogólnym stanem, jak wcześniej opisano (Hunter i in., Neuropharmacology 39:806-816 (2000)) z dodaniem pomiaru siły uścisku (2 punkty za dobry uścisk przedniej łapy, 1 punkt za słaby uścisk). Całkowita punktacja = 27 dla prawidłowego zwierzęcia.
W Badaniu 2 test ten dalej zmodyfikowano: siła uścisku - normalna 3 punkty, dobra - 2, słaba - 1, bardzo słaba - 0; ruchliwość - normalna 4 punkty, doskonała - 3, bardzo dobra - 2, dobra - 1, słaba - 0; ogólny stan - normalny 4 punkty, doskonały - 3, bardzo dobry - 2, dobry - 1, słaby - 0; chodzenie w kółko - brak 5 punktów, z tendencją na jedną stronę - 4 punkty, duże kółka - 3, średnie kółka - 2, małe kółka - 1, wirowanie - 0. Całkowita punktacja = 32 dla prawidłowego zwierzęcia.
W obydwu badaniach zwierzęta zbadano po 1, 24, 48 godzinach oraz 7 dniach od MCAO, zdrowe i prawidłowe zwierzęta otrzymały odpowiednio 27 lub 32 punkty. Dane przedstawiono w postaci wartości median, a jako analizę statystyczną zastosowano analizę Kruskil Wallis ANOVA.
PL 211 014 B1
Ocena uszkodzenia
Badanie 1 - Dla każdego zwierzęcia obszary uszkodzenia oceniono w skrawkach z trzech wstępnie określonych poziomów w mózgu (odpowiednio 0, -2,0 oraz -6,0 mm od Bregmy). Uszkodzenie neuronalne określono stosując szybkie barwienie fioletem krezolowym oraz program do obrazo2 wania Optimas 6.1. Dane wyrażono jako średni obszar (mm2) ± sem.
Badanie 2 - Dla każdego zwierzęcia obszary uszkodzenia oceniono w skrawkach z siedmiu wstępnie określonych poziomów w mózgu (od +3 mm do -8 mm względem Bregmy). Uszkodzenie neuronalne określono stosując szybkie barwienie fioletem krezolowym oraz program do obrazowania 2
Optimas 6.1. Dane wyrażono jako średni obszar (mm2) ± sem.
Wyniki
Badanie 1 - Podanie przez śródmózgową kaniulę komorową (i.c.v.) mAb anty-MAG
Punktacja neurologiczna
Godzinę po MCAO zwierzęta z obydwu badanych grup wykazywały wyraźne zaburzenie punktacji neurologicznej (mediana punktacji 12 w każdej grupie). W tym punkcie czasowym brak było istotnych różnic pomiędzy grupami. Jednakże 24 (p = 0,02), 48 (p = 0,005) godziny oraz 7 dni (p = 0,006) po MCAO zwierzęta leczone mAb anty-MAG (2,5 μg, 1, 24 i 72 godziny po MCAO) wykazywały znaczącą poprawę całkowitej punktacji neurologicznej w porównaniu ze zwierzętami traktowanymi kontrolną IgG. Mediany punktacji neurologicznych po 24, 48 godzinach oraz 7 dniach od MCAO w grupie leczonej IgG1 wynosiły odpowiednio 15, 14 i 18, w porównaniu z wartościami 19,5, 21,5 oraz 22 dla zwierząt leczonych mAb anty-MAG. W dalszej analizie dotyczącej poszczególnych zachowań składających się na całkowitą punktację, znaczącą poprawę przypisano głównie poprawie sprawności w następujących testach: umiejscowienia łap (24 godziny, p = 0,045; 48 godzin, p = 0,016; 7 dni p = 0,008); siły uścisku (24 godziny, p = 0,049; 48 godzin, p = 0,0495; 7 dni p = 0,243), ruchliwości (24 godziny, p = 0,199; 48 godzin, p = 0,012; 7 dni p = 0,067), poziomego drążka (24 godziny, p = 0,065; 48 godzin, p = 0,005; 7 dni p = 0,016), równi pochyłej (24 godziny, p = 0,006; 48 godzin, p = 0,006; 7 dni p = 0,0169), wizualnego zasięgu łapy przedniej (48 godzin, p = 0,049; 7 dni p = 0,049) oraz stopnia chodzenia w kółko (24 godziny, p = 0,417; 48 godzin, p = 0,034; 7 dni p = 0,183).
Chodzenie po równoważni
Przed operacją wszystkie zwierzęta trenowano w przechodzeniu przez równoważnię (100 cm). Dwadzieścia cztery godziny po operacji zaobserwowano znaczne skrócenie dystansu przechodzonego przez zwierzęta z grup leczonych zarówno przeciwciałem anty-MAG (50±18 cm), jak i IgG1 (22±14 cm) w porównaniu z wartościami przedoperacyjnymi. Chociaż nie było to istotne statystycznie, zaobserwowano wyraźne polepszenie w porównaniu ze zwierzętami leczonymi IgG1 pod tym względem, że zwierzęta przechodziły dwukrotnie dłuższy dystans niż leczone IgG1 w 24 godziny po MCAO. Siedem dni po operacji, chociaż obydwie grupy wykazały poprawę z biegiem czasu, sprawność zwierząt leczonych IgG pozostała znacząco zaburzona w porównaniu z wartością podstawową (55±15 cm; p = 0,005). Jednakże w odróżnieniu od tego 7 dni po MCAO sprawność zwierząt leczonych mAb antyMAG (2,5 μg 1, 24 i 72 godziny, i.c.v po MCAO) nie różniła się istotnie od wartości podstawowej (75±15 cm; p = 0,07). Dane te pokazują, że leczenie mAb anty-MAG przyspieszało powrót sprawności w zadaniu chodzenia po równoważni w porównaniu z kontrolnymi myszami leczonymi IgG1.
Test nalepki
Przed operacją zwierzęta w każdej grupie szybko dotknęły i usunęły nalepki z każdej z przednich łap, przy czym brak było istotnej różnicy w grupach przed leczeniem (tabela 1). Dwadzieścia cztery godziny oraz 7 dni po MCAO opóźnienie dotknięcia lewej łapy w każdej z leczonych grup pozostało względnie niezmienione, podczas gdy dla prawej łapy wyraźnie się wydłużyło. Jednakże nie stwierdzono istotnych różnic pomiędzy czasami usuwania u zwierząt leczonych przeciwciałem antyMAG i IgG1. Ponadto 24 godziny po MCAO, opóźnienie usunięcia z zarówno lewej, jak i prawej przedniej łapy było istotnie wydłużone w obu badanych grupach w porównaniu z poziomem podstawowym, jednakże u zwierząt leczonych przeciwciałem anty-MAG opóźnienie usunięcia nalepki z lewej łapy było istotnie krótsze niż u zwierząt leczonych IgG1 (p = 0,03). Zaobserwowano także trend skrócenia opóźnienia usunięcia z prawej łapy u zwierząt leczonych przeciwciałem anty-MAG w porównaniu ze zwierzętami leczonymi IgG1 (p = 0,08) (tabela 1). Siódmego dnia zaobserwowano pewien stopień powrotu do normy u zwierząt leczonych IgG1, pod tym względem, że opóźnienie usunięcia dla każdej z przednich łap było skrócone w porównaniu z danymi dla 24 godzin (tabela 1). Dane te sugerują, że leczenie szczurów mAb anty-MAG przyśpiesza powrót do normy w teście nalepki po MCAO.
PL 211 014 B1
T a b e l a 1. Dane z testu nalepki
| Dzień | Leczenie | Czas do dotknięcia (s) (średnia ± sem) | Czas do usunięcia (s) (średnia ± sem) | ||
| Lewa łapa przednia | Prawa łapa przednia | Lewa łapa przednia | Prawa łapa przednia | ||
| 0 | Anty-MAG | 2,4 ± 0,2 | 3,6 ± 0,5 | 12 ± 2 | 12 ± 2 |
| 0 | igGi | 3,3 ± 0,6 | 4,2 ± 0,7 | 10 ± 1 | 9 ± 1 |
| 1 | Anty-MAG | 5,9 ± 3,7 | 109,6 ± 27,5 | *61 ± 26 | 96 ± 26 |
| 1 | IgGi | 3,6 ± 0,5 | 71,8 ± 31,7 | 130 ± 21 | 156 ± 19 |
| 7 | Anty-MAG | 3,8 ± 1 | 36,4 ± 10,2 | 54 ± 23 | 80 ± 30 |
| 7 | IgGi | 2,8 ± 0,3 | 64 ± 28 | 23 ± 8 | 87 ± 20 |
(*p = 0,03, mAb anty-MAG względem IgG1 przy zastosowaniu testu logarytmicznego rang)
Pomiar obszaru uszkodzenia
Podawanie mAb anty-MAG i.c.v, istotnie zmniejszyło obszar uszkodzenia w dwóch z trzech zbadanych poziomów mózgu w porównaniu ze zwierzętami leczonymi równymi ilościami mysiego IgG1 przy badaniu 7 dni po tMCAO (tabela 2).
T a b e l a 2.
| Średni obszar uszkodzenia ± sem (mm2) 7 dni po tMCAO | |||
| Leczenie | 0 mm wzgl. Bregmy | -2 mm wzgl. Bregmy | -6 mm wzgl. Bregmy |
| mAb anty-MAG (n = 8) | *9 ± 2 | $4 ± 3 | #3 ± 1 |
| Mysie IgG1 (n = 9) | 14 ± 1 | 12 ± 1 | 5 ± 1 |
(*p = 0,02, $p=0,03, #p = 0,06, mAb anty-MAG względem IgG1, jednostronny test T Studenta dla prób niezależnych)
Badanie 2 - Podawanie dożylne (i.v.)
Punktacja neurologiczna
Godzinę i 24 godziny po MCAO zwierzęta w obydwu grupach wykazywały znaczne upośledzenie punktacji neurologicznej. W tych punktach czasowych nie zaobserwowano istotnej różnicy, a mediany punktacji wynosiły 20 i 18 po 24 godzinach po leczeniu odpowiednio mAb anty-MAG i IgG1 (p = 0,5). Czterdzieści osiem godzin po MCAO zwierzęta leczone mAb anty-MAG (200 μg, i.v. 1 i 24 godziny po MCAO) wykazywały istotną poprawę w umiejscowieniu łap (p = 0,048) oraz sile uścisku (p = 0,033). Siedem dni po rozpoczęciu niedokrwienia mózgowego u zwierząt leczonych mAb antyMAG obserwowano kontynuację poprawy (umiejscowienie łap p = 0,041; siła uścisku, p = 0,048; ruchliwość, p = 0,05) oraz wykazywały one istotną poprawę całkowitej punktacji neurologicznej (mediana punktacji 25) w porównaniu z leczonymi mysim IgG1 (mediana punktacji 23, p = 0,047).
Pomiary obszaru uszkodzenia
Przeciwciało anty-MAG podane i.v. po MCAO istotnie zmniejszyło obszar uszkodzenia w 5 z 7 wstępnie określonych poziomach mózgu (od +3 do -8 mm względem Bregmy) w porównaniu z izotopowymi kontrolami, przy badaniu 7 dni po MCAO.
| Poziom mózgu wzgl. Bregmy | Średni obszar uszkodzenia ± sem (mm2) - leczone anty-MAG | Średni obszar uszkodzenia ± sem (mm2) - leczone mysim IgG1 |
| 3 mm | *0,38 ± 0,27 | 1,77 ± 0,45 |
| 1 mm | *5,82 ± 1,65 | 9,627 ± 1,14 |
| -1 mm | 8,98 ± 2,58 | 12,07 ± 1,57 |
| -2 mm | 7,28 ± 1,92 | 10,04 ± 1,87 |
| -4 mm | *5,57 ± 1,06 | 10,38 ± 1,39 |
| -6 mm | *1,36 ± 0,51 | 4,43 ± 1,95 |
| -8 mm | *0,27 ± 0,27 | 1,93 ± 0,56 |
*p < 0,05, jednostronny test T Studenta dla prób niezależnych
PL 211 014 B1
Wnioski
Przeciwciało monoklonalne anty-MAG podawane zarówno bezpośrednio do CSF, jak i dożylnie po przejściowym zamknięciu środkowej tętnicy mózgowej u szczurów zmniejszało obszar śmierci komórek oraz polepszało odzyskanie funkcji w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Stopień neuroochrony obserwowany w tych badaniach sugeruje, że efektu tego nie można przypisać kiełkowaniu aksonów, gdyż nie spowodowałoby to zachowania neuronów. Poprawa odzyskania funkcji obserwowana po 24 i 48 godzinach od MCAO prawdopodobnie odzwierciedla stopień neuroochrony wywoływany przez to przeciwciało w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Jednakże, wraz z upływem czasu stan zwierząt dalej się poprawiał, co sugeruje, że blokowanie aktywności MAG może także poprawić odzyskanie funkcji wraz z czasem.
Przedstawione tutaj badania dostarczają dowód, że blokowanie działania MAG zapewnia zarówno neuroochronę, jak i poprawę odzyskania funkcji w szczurzym modelu udaru, a zatem przeciwciała anty-MAG dostarczają potencjalne środki terapeutyczne do doraźnej neuroochrony i/lub pobudzania odzyskania funkcji po udarze. Małe ilości przeciwciała podawane na drodze i.v. oraz wynikające z nich niskie poziomy przeciwciała w surowicy będą z kolei sugerować występowanie w mózgu bardzo niskich stężeń przeciwciał, ze względu na ograniczenia przenikania przeciwciał przez barierę krew-mózg. Jednakże nieoczekiwanie wywoływały one nadal zarówno neuroochronę, jak i pobudzenie odzyskania funkcji. Przeciwciała anty-MAG wykazują także potencjał stosowania w leczeniu innych zaburzeń neurologicznych w których widoczna jest degeneracja komórek oraz włókien nerwowych, takich jak uraz rdzenia kręgowego, traumatyczny uraz mózgu, neuropatia obwodowa, choroba Alzheimera, otępienia czołowo-skroniowe (tauopatie), choroba Parkinsona, choroba Huntingtona oraz stwardnienie rozsiane. W poniższych przykładach regiony CDR opisanych tutaj chimerycznych i humanizowanych przeciwciał stanowią regiony CDR przeciwciała z przykładu 1.
P r z y k ł a d 2. Przeciwciało chimeryczne
Zmienione przeciwciała obejmują przeciwciała chimeryczne, które zawierają regiony zmienne pochodzące z jednego gatunku połączone z regionami zmiennymi z innego gatunku. Przykłady mysioludzkich chimerycznych łańcuchów immunoglobulin anty-MAG przedstawiono na fig. 1, 2 i 3. Można wytwarzać mysio-ludzkie chimery, zawierające regiony stałe IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgD, a także chimery łączące mysie regiony zmienne z regionami stałymi łańcuchów lekkiego lub ciężkiego z gatunków innych niż człowiek.
Fig. 1 (SEQ ID NO: 27) przedstawia sekwencję aminokwasową chimerycznego lekkiego łańcucha immunoglobulinowego, w którym region zmienny łańcucha ciężkiego mysiego anty-MAG jest związany z funkcjonalną immunoglobulinową wydzielniczą sekwencją sygnałową oraz ze zmienioną postacią regionu stałego ludzkiego IgG1, w którym reszty Kabat 248 i 250 zmutowano do alaniny w celu zablokowania funkcji efektorowych wiązania z FcyRI oraz białkiem dopełniacza C1q (Duncan, A.R. i Winter, G. Localization of the C1q binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738-740, 1988. Duncan, A.R., Woolf, J.M., Partridge, L.J., Burton, D.R. i Winter, G. Localisation of the binding site for human FcR1 on IgG. Nature 332, 563-564, 1988). Takie mutacje dodatkowo wprowadza się w celu dostosowania indywidualnych właściwości zmienionego przeciwciała w celu osiągnięcia konkretnego efektu terapeutycznego - np. wiązania z oraz blokowania działania antygenu bez aktywacji litycznych mechanizmów efektorowych.
Fig. 2 (SEQ ID NO: 28) przedstawia sekwencję aminokwasową chimerycznego lekkiego łańcucha immunoglobulinowego, w którym mysi region zmienny łańcucha lekkiego anty-MAG jest związany z funkcjonalną immunoglobulinową wydzielniczą sekwencją sygnałową oraz z ludzkim regionem stałym kappa.
Podobnie, regiony zmienne anty-MAG mogą być związane z regionami stałymi immunoglobuliny, w których brak jest mutacji blokujących funkcje efektorowe. Fig. 3 (SEQ ID NO: 29) dostarcza sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w którym region zmienny łańcucha ciężkiego anty-MAG jest związany z funkcjonalną immunoglobulinową wydzielniczą sekwencją sygnałową oraz formą typu dzikiego regionu stałego ludzkiego IgG1.
Korzystając z informacji podanych na fig. 1 do 3, standardowymi technikami biologii molekularnej znanymi specjaliście w dziedzinie wynalazku można przygotować wstawki cDNA, kodujące te łańcuchy chimeryczne. W skrócie, kod genetyczny stosuje się do zidentyfikowania kodonów nukleotydowych kodujących pożądane aminokwasy, wytwarzając wirtualną sekwencję cDNA, kodującą chimeryczne białko. Jeżeli pożądane jest, aby wstawka cDNA była eksprymowana w konkretnym organizmie, można wybrać szczególnie korzystne kodony w oparciu o znane preferencje w użyciu kodonów.
PL 211 014 B1
Następnie pożądaną sekwencję nukleotydową syntetyzuje się drogą amplifikacji PGR na matrycy zawierającej nachodzące na siebie syntetyczne oligonukleotydy, które, jako kontig, stanowią pożądaną sekwencję. Powstały produkt można także zmodyfikować drogą PCR lub mutagenezy, tak by przyłączyć miejsca restrykcyjne ułatwiające klonowanie do odpowiedniego plazmidu do ekspresji lub dalszych manipulacji.
P r z y k ł a d 3. Chimeryczne przeciwciało wiąże się ze szczurzą MAG w teście ELISA
Chimeryczne przeciwciało anty-MAG zawierające opisane tu regiony CDR łańcucha lekkiego i ciężkiego wytworzono przez przejściową transfekcję komórek CHO. W tym celu zastosowano odczynnik do transfekcji Transfast (Promega; E2431), a transfekcję przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, w 6-studzienkowych płytkach do hodowli wysiano ~106 komórek CHO na studzienkę. Następnego dnia ssaczy wektor ekspresyjny DNA, kodujący odpowiedni łańcuch ciężki lub lekki, zmieszano w stosunku 1:1 (5 μg całkowitego DNA) z pożywką (Optimem1 z Glutamax; Gibco #51985-026). Odczynnik do transfekcji Transfast dodano i roztwór przeniesiono do studzienek z konfluentnymi warstwami komórek. Po 1 godzinie w 37°C w inkubatorze do komórek, na mieszaninę DNA/Transfast naniesiono 2 ml pożywki Optimem i pozostawiono na 48-72 godziny w inkubatorze. Zebrano supernatanty, oczyszczono je przez odwirowanie i przepuszczono przez 0,2 μm filtry. Stężenie przeciwciał w supernatancie z hodowli komórek CHO oznaczono metodą ELISA i oszacowano, że wynosiło ono około 0,5 μg/ml. Do wiązania MAG zastosowano dostępne w handlu białko fuzyjne szczurza MAG-Fc. Ze względu na fuzję z ludzkim Fc chimeryczne przeciwciała nie mogły być wykryte za pomocą drugorzędowych przeciwciał przeciw ludzkiej IgG. Zamiast tego zastosowano specyficzne przeciwciało przeciw ludzkiemu lekkiemu łańcuchowi kappa. Fig. 4 przedstawia, że to chimeryczne przeciwciało wiąże MAG nawet w rozcieńczeniu 1/64. Niespokrewnione przeciwciało humanizowane i supernatant z hodowli komórek pozornie transfekowanych nie wytwarzały żadnego sygnału w tym teście.
Procedura
Płytki do mikromiareczkowania ELISA (Nunc Maxisorp) powlekano 1 μg/ml białka fuzyjnego szczurza MAG-Fc (R&D systems; 538-MG) w PBS w 4°C przez noc. Płytki przemyto dwukrotnie PBS i zablokowano PBS/BSA (1% wag./obj.) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Supernatanty z hodowli przejściowo transfekowanych komórek CHO przefiltrowano przez filtry 0,2 μm i kolejno rozcieńczono w PBS/BSA, rozpoczynając od czystego supernatantu do rozcieńczenia 1/64. Rozcieńczone próbki pozostawiono w RT przez 1 godzinę. Następnie płytki przemyto trzykrotnie PBS/Tween 20 (0,1% obj./obj.). Przeciwciałem wykrywającym było kozie przeciwciało specyficzne wobec ludzkiego łańcucha lekkiego kappa, sprzężone z peroksydazą (Sigma A-7164) rozcieńczone w stosunku 1/2000 w PBS/BSA. Przeciwciało wykrywające inkubowano przez 1 godzinę w RT, a następnie płytki przemyto jak powyżej. Następnie dodano roztwór substratu (Sigma Fast OPD P-9187) i inkubowano do czasu wykrycia wywołania odpowiedniego zabarwienia, a następnie zatrzymano za pomocą 3M H2SO4. Wywołanie zabarwienia odczytano przy 490 nm.
P r z y k ł a d 4. Przeciwciała humanizowane
Zmienione przeciwciała obejmują przeciwciała humanizowane, zawierające humanizowane regiony zmienne połączone z ludzkimi regionami stałymi. Przykłady humanizowanych łańcuchów immunoglobulin anty-MAG według wynalazku zamieszczono na fig. 5. Można wytworzyć przeciwciała humanizowane stosując stałe regiony IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM i IgD.
Fig. 5 (SEQ ID NO: 30) przedstawia przykład sekwencji aminokwasowej humanizowanego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, w którym humanizowany region zmienny łańcucha ciężkiego antyMAG jest połączony z funkcjonalną wydzielniczą sekwencją sygnałową oraz ze zmienionym regionem stałym IgG1, w którym reszty Kabat 248 i 250 zostały zmutowane do alaniny w celu zablokowania funkcji efektorowych wiązania z FcyRI oraz białkiem dopełniacza C1q (Duncan, A.R. i Winter, G. Localization of the C1q binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738-740, 1988. Duncan, A.R., Woolf, J.M., Partridge, LJ., Burton, D.R. i Winter, G. Localisation of the binding site for human FcR1 on IgG. Nature 332, 563-564, 1988). Takie mutacje ewentualnie wprowadza się w celu dostosowania właściwości zmienionego przeciwciała tak, aby osiągnąć konkretny efekt terapeutyczny - np. wiązanie z oraz blokowanie działania antygenu bez aktywacji litycznych mechanizmów efektorowych.
Fig. 5 (SEQ ID NO: 31) przedstawia także przykład sekwencji aminokwasowej humanizowanego łańcucha lekkiego immunoglobuliny, w którym humanizowany region zmienny łańcucha ciężkiego anty-MAG jest połączony z funkcjonalną wydzielniczą sekwencją sygnałową oraz z regionem stałym kappa.
PL 211 014 B1
Podobnie regiony zmienne anty-MAG mogą być związane z regionami stałymi immunoglobuliny nie zawierającymi mutacji blokujących funkcje efektorowe. Fig. 5 (SEQ ID NO: 32) przedstawia sekwencję aminokwasową humanizowanego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w którym region zmienny łańcucha ciężkiego anty-MAG jest związany z funkcjonalną wydzielniczą sekwencją sygnałową oraz z regionem stałym ludzkiego IgG1 typu dzikiego.
Na podstawie informacji dostarczonej na fig. 5, standardowymi technikami biologii molekularnej znanymi specjaliście w dziedzinie wynalazku można wytworzyć wstawki cDNA, kodujące te humanizowane łańcuchy. W skrócie, kod genetyczny stosuje się do zidentyfikowania kodonów nukleotydów kodujących pożądane aminokwasy, wytworzenia wirtualnej sekwencji cDNA kodującej białko. Jeżeli pożądane jest, żeby wstawka cDNA była eksprymowana w konkretnym organizmie, można wybrać szczególnie korzystne kodony w oparciu o znane preferencje w użyciu kodonów. Następnie pożądaną sekwencję nukleotydową syntetyzuje się drogą amplifikacji PCR na matrycy zawierającej nachodzące na siebie syntetyczne oligonukleotydy, które, jako kontig, stanowią pożądaną sekwencję. Powstały produkt można także zmodyfikować drogą PCR lub mutagenezy tak, aby przyłączyć miejsca restrykcyjne ułatwiające klonowanie do odpowiedniego plazmidu do ekspresji lub dalszych manipulacji.
P r z y k ł a d 5. Humanizowane przeciwciała anty-MAG wiążą szczurzą i ludzką MAG w teście ELISA
1) Test ELISA bezpośredniego wiązania białka fuzyjnego szczurza MAG-Fc z normalizowanymi ilościami supernatantu z hodowli dla 9 kombinacji humanizowanych łańcuchów ciężkiego i lekkiego.
Humanizowane przeciwciała anty-MAG zawierające opisane tu regiony CDR łańcucha lekkiego i ciężkiego wytworzono przez przejściową transfekcję komórek CHO. W tym celu zastosowano odczynnik do transfekcji Transfast (Promega; E2431) i transfekcję przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, w 6-studzienkowych płytkach do hodowli wysiano ~106 komórek CHO na studzienkę. Następnego dnia ssaczy wektor ekspresyjny DNA kodujący odpowiedni łańcuch ciężki lub lekki zmieszano w stosunku 1:1 (5 μg całkowitego DNA) z pożywką (Optimem1 z Glutamax; Gibco #51985-026). Dodano odczynnik do transfekcji Transfast i roztwór przeniesiono do studzienek z konfluentnymi warstwami komórek warstwami komórek. Po 1 godzinie w 37°C w inkubatorze do komórek, na mieszaninę DNA/Transfast naniesiono 2 ml pożywki Optimem i pozostawiono na 48-72 godziny w inkubatorze. Zebrano supernatanty, oczyszczono je przez odwirowanie i przepuszczono przez 0,2 μm filtry. Z sekwencji przedstawionych w tabeli poniżej wytworzono 9 kombinacji łańcuchów ciężkiego i lekkiego, a regiony stałe IgG1 były funkcjonalne według SEQ ID.
| SEQ ID NO (regiony V) | Opis | Alternatywna nazwa |
| 13 | Humanizowany Vh | BVh1 |
| 14 | Humanizowany Vh | BVh2 |
| 15 | Humanizowany Vh | BVh3 |
| 16 | Humanizowany VI | CVI1 |
| 17 | Humanizowany VI | CVI2 |
| 18 | Humanizowany VI | CVI3 |
| 19 | Humanizowany VI | CVI4 |
Stężenie przeciwciał oznaczono za pomocą testu ELISA, a ilości supernatantu stosowane w teście normalizowano do wyjściowego stężenia 250 lub 500 ng/ml (zależnie od stężenia supernatantu z hodowli). Jako antygen zastosowano dostępne w handlu białko fuzyjne szczurza MAG-Fc (R&S Systems; 538-MG). Ze względu na fuzję tego antygenu z ludzkim Fc, związane chimeryczne przeciwciała nie mogły być wykryte za pomocą ogólnych drugorzędowych przeciwciał przeciw ludzkiej IgG. Zamiast tego zastosowano specyficzne przeciwciało przeciw ludzkiemu lekkiemu łańcuchowi kappa. Fig. 6 przedstawia, że wszystkie 9 zbadanych humanizowanych przeciwciał wiązało szczurzą MAG z bardzo podobnymi krzywymi wiązania do ~ 4 ng/ml. Przeciwciało chimeryczne zastosowane jako odniesienie wykazywało charakterystykę wiązania z grupy badanych tutaj przeciwciał humanizowanych. Jakkolwiek nie jest to niepodważalne, może to sugerować, że powinowactwa badanych tutaj przeciwciał humanizowanych znajdują się bardzo blisko zakresu powinowactwa niehumanizowanego przeciwciała chimerycznego stosowanego tutaj jako odniesienie.
PL 211 014 B1
Procedura
96-studzienkowe płytki Nunc Maxisorp powlekano przez noc w 4°C białkiem fuzyjnym szczurza MAG-Fc (1 μg/ml; R&D Systems; nr katalogowy 538-MG) w PBS. Płytki przemyto dwukrotnie PBS zawierającym Tween 20 (0,1% obj./obj.; PBST) i blokowano PBS zawierającym BSA (1% wag./obj.) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Zmienne ilości supernatantów z hodowli kolejno rozcieńczono w buforze blokującym i dodano do zablokowanych studzienek rozpoczynając od około 500 lub 250 ng/ml. Stężenia przeciwciał w supernatantach były oparte na niezależnych testach mierzących ilość humanizowanego przeciwciała obecną w każdym supernatancie z hodowli. Włączono także chimeryczne przeciwciało mysio-ludzkie (niehumanizowane) jako odniesienie. Próbki przeciwciał inkubowano przez 1 godzinę w RT, a następnie płytki przemyto 3x PBST. Dodano drugorzędowe przeciwciało (kozie przeciwciało specyficzne wobec ludzkiego łańcucha lekkiego, sprzężone z peroksydazą; Sigma A-7164) rozcieńczone w stosunku 1/5000 w buforze blokującym i inkubowano przez 1 godzinę w RT. Następnie studzienki przemyto trzykrotnie jak opisano powyżej i wiązanie wykryto przez dodanie substratu (tabletki OPD rozpuszczono zgodnie z instrukcjami producenta; Sigma P-9187). Wywołanie zabarwienia monitorowano i reakcję zatrzymano za pomocą 3M H2SO4. Wywołanie zabarwienia odczytano przy 490 nm.
2) Test ELISA bezpośredniego wiązania białka fuzyjnego szczurza MAG-Fc z dwiema oczyszczonymi kombinacjami łańcucha ciężkiego-lekkiego humanizowanego przeciwciała anty-MAG
Dwa humanizowane przeciwciała zawierające kombinacje regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego BVh1/CVl1 i BVh3/CVl3 (tabela i fig. 5) oraz zmutowany region stały IgG1, jak przedstawiono przykładowo w SEQ ID NO: 30 (która przedstawia BVh1/CVl1 zmutowane IgG1, specjaliści w dziedzinie wynalazku mogą łatwo wyprowadzić sekwencję dla odpowiednika BVh3/CVl3) wytworzono z zastosowaniem procedury przejściowej transfekcji, opisanej w przykładzie 3, w wersji dla większej skali i oczyszczono stosując chromatografię powinowactwa do białka A. Oczyszczony materiał przeciwciał dializowano względem PBS i stężenie oznaczono przez odczyt OD280. Stężenie przeciwciał doprowadzono do 5000 ng/ml i stosowano w kolejnych rozcieńczeniach w teście ELISA wiązania szczurzej MAG-Fc. Fig. 7 przedstawia, że oczyszczony materiał przeciwciała wiąże szczurza MAG-Fc oraz, że badane połączenia regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego są wyjątkowo podobne.
Procedura
96-studzienkowe płytki Nunc Maxisorp powlekano przez noc w 4°C białkiem fuzyjnym szczurza MAG-Fc (2,5 μg/ml; R&D Systems; nr katalogowy 538-MG) w PBS. Płytki przemyto dwukrotnie PBS zawierającym Tween 20 (0,1% obj./obj.; PBST) i blokowano PBS zawierającym BSA (1% wag./obj.) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Oczyszczone humanizowane przeciwciało doprowadzono do wyjściowego stężenia 5 μg/ml w buforze blokującym a następnie kolejno rozcieńczono. Próbki przeciwciał inkubowano przez 1 godzinę w RT, a następnie płytki przemyto 3x PBST. Dodano drugorzędowe przeciwciało (kozie przeciwciało specyficzne wobec ludzkiego łańcucha lekkiego sprzężonego z peroksydazą; Sigma A-7164) rozcieńczone do 1/5000 w buforze blokującym i inkubowano przez 1 godzinę w RT. Następnie studzienki przemyto trzykrotnie jak opisano powyżej i wiązanie wykryto przez dodanie substratu (tabletki OPD rozpuszczone zgodnie z instrukcjami producenta; Sigma P-9187). Wywołanie zabarwienia monitorowano i reakcję zatrzymano za pomocą 3M H2SO4. Wywołanie zabarwienia odczytano przy 490 nm.
Wyniki
Obydwa oczyszczone humanizowane przeciwciała nie niosące mutacji lub niosące kilka mutacji w regionie zrębowym wykazują wyjątkowo podobne wiązanie ze szczurzą MAG. Wyniki przedstawiono na fig. 7.
3) Wiązanie ludzkiej MAG eksprymowanej na komórkach CHO przez normalizowane ilości supernatantów z hodowli dwóch kombinacji humanizowanych łańcuchów ciężkiego i lekkiego
Takie same kombinacje humanizowanych łańcuchów ciężkiego i lekkiego jak opisane w przykładzie 5 2) zbadano jako czyste supernatanty względem ludzkiej MAG eksprymowanej na powierzchni komórek CHO. Ilość supernatantu stosowanego dla każdego przeciwciała normalizowano w oparciu o stężenia przeciwciał oznaczone za pomocą testu ELISA. W tym celu 96-studzienkowe płytki (Nunc Maxisorp) powlekano przez noc w 4°C kozim przeciwciałem przeciwko ludzkiemu łańcuchowi IgG (gamma) (Sigma I-3382; w buforze wodorowęglanowym pH 9,6; 2 μg/ml). Następnego dnia płytki przemyto dwukrotnie buforem do przemywania (PBST) i blokowano przez dodanie co najmniej 75 μl buforu blokującego (PBS zawierający BSA 1% wag./obj.) przez 1 godzinę w RT. Roztwory próbek przeciwciał kolejno rozcieńczono w buforze blokującym (rozcieńczenie wyjściowe: nierozcieńczoPL 211 014 B1 ne lub 1/2) w dwóch powtórzeniach. Standardowym Ab było oczyszczone humanizowane przeciwciało IgG1 o nie pokrewnej specyficzności oraz znanym stężeniu. Roztwór standardowy rozcieńczono także kolejno na płytce rozpoczynając od 500 ng/ml. Wszystkie roztwory przeciwciał inkubowano przez 1 godzinę w RT. Płytki przemyto 3x jak opisano powyżej, a następnie inkubowano z kozim przeciwciałem specyficznym wobec ludzkiego łańcucha lekkiego (kappa) (wolnym i związanym) sprzężonym z peroksydazą (Sigma A-7164) rozcieńczonym w stosunku 1/5000 w buforze blokującym i inkubowano przez 1 godzinę w RT. Następnie płytki ponownie przemyto 3x jak opisano powyżej i inkubowano z roztworem substratu (tabletki OPD; Sigma P-9187 do czasu wywołania silnego zabarwienia). Wywołanie zabarwienia monitorowano i zatrzymano przez dodanie 25 μΙ 3M H2SO4, a następnie płytkę odczytano przy 490 nm.
Fig. 8 przedstawia, że obydwa zbadane tutaj przeciwciała rozpoznają ludzką MAG i są bardzo podobne w swojej charakterystyce wiązania. CHO/- przedstawiają kontrole negatywne, z komórkami CHO nieeksprymującymi MAG.
Procedura testu Eu ELISA opartego na komórkach
96-studzienkowe płytki (Costar 3595) wypełniono 100 μΙ zawiesiny komórek/studzienkę (patrz tabela poniżej, zalecana liczba komórek do przeprowadzenia testu w dniach 1, 2, 3 lub 4.
| Dzień | liczba komórek/ml |
| 1 | 3 x 105 |
| 2 | 1 x 105 |
| 3 | 5 x 104 |
| 4 | 1 x 104 |
Pożywkę hodowlaną usunięto i płytki blokowano pożywką DMEM/F12 (Sigma D6421) zawierającą FCS (10%), BSA (1%), NaN3 (1%; bufor blokujący) przez 1 godzinę w RT. Następnie usunięto roztwór blokujący i dodano próbkę (w buforze blokującym 50 μΙ/studzienkę). Próbki inkubowano w 4°C przez 1 godzinę. Następnie płytki przemyto 3x PBS za pomocą urządzenia do przemywania płytek Skatron. Po przemyciu komórki utrwalano 0,5% paraformaldehydem (rozcieńczonym w PBS) przez 20 minut w 4°C i ponownie przemyto jak powyżej. Następnie dodano 50 μl/studzienkę drugorzędowego przeciwciała sprzężonego z europem w buforze europowym (50 mM zasada Tris, 150 mM NaCl, 0,5% BSA, 0,1 g/l Tween 20, 7,86 mg/l DTPA w pH 7,3) i inkubowano przez 1 godzinę w 4°C. Płytki przemyto jak powyżej i dodano 200 μl roztworu wzmacniającego Detphia/studzienkę. Roztwór inkubowano w RT przez 5-10 minut. Studzienki odczytano w przeciągu 24 h na urządzeniu Victor.
4) Konkurencyjny test ELISA wiązania białka fuzyjnego szczurza MAG-Fc przez dwa oczyszczone humanizowane przeciwciała oraz niehumanizowane mysie przeciwciało monoklonalne
Procedura
96-studzienkowe płytki Nunc Maxisorp powlekano przez noc w 4°C białkiem fuzyjnym szczurza MAG-Fc (2,5 μg/ml; R&D Systems; nr katalogowy 538-MG) w PBS. Płytki przemyto dwukrotnie PBS zawierającym Tween 20 (0,1% obj./obj.; PBST) i blokowano PBS zawierającym BSA (1% wag./obj.) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Oczyszczone humanizowane przeciwciało doprowadzono do stężenia 200 ng/ml i zmieszano z równą objętością konkurujących cząsteczek w buforze blokującym w ilości od 6000 do 0 ng/ml. Konkurującymi przeciwciałami były wyjściowe mysie przeciwciało monoklonalne (anty-MAG) lub niespokrewnione mysie przeciwciało monoklonalne (INN1) w takich samych stężeniach (tylko BVh1/CVl1). Próbki przeciwciało/przeciwciało współzawodnicze inkubowano przez 1 godzinę w RT, a następnie płytki przemyto 3x PBST. Dodano drugorzędowe przeciwciało (kozie przeciwciało specyficzne wobec ludzkiego łańcucha lekkiego, sprzężone z peroksydazą; Sigma A-7164) rozcieńczone do 1/5000 w buforze blokującym i inkubowano przez 1 godzinę w RT. Następnie studzienki przemyto trzykrotnie jak opisano powyżej i wiązanie wykryto przez dodanie substratu (tabletki OPD rozpuszczone zgodnie z instrukcjami producenta; Sigma P-9187). Wywołanie zabarwienia odczytano przy 490 nm.
Wyniki
Obydwa preparaty oczyszczonych przeciwciał tak samo konkurowały z oryginalnym mysim przeciwciałem monoklonalnym, ale nie z mysim przeciwciałem monoklonalnym o niespokrewnionej specyficzności - patrz fig. 9. Pokazuje to, że oryginalne mysie przeciwciało monoklonalne oraz badane tutaj humanizowane przeciwciała prawdopodobnie rozpoznają ten sam epitop oraz możliwe jest, że wykazują bardzo podobne powinowactwa do szczurzej MAG.
PL 211 014 B1
Wykaz sekwencji
SEQ ID NO: 1
Sekwencja aminokwasowa CDRL1
KSSHSVLYSSNQKNYLA
SEQ ID NO: 2
Sekwencja aminokwasowa CDRL2
WASTRES
SEQ ID NO: 3
Sekwencja aminokwasowa CDRL3
HQYLSSLT
SEQ ID NO: 4
Sekwencja aminokwasowa CDRH1
NYGMN
SEQ ID NO: S
Sekwencja aminokwasowa CDRH2
WINTYTGEPTYADDFTG
SEO ID NO: 6
Sekwencja aminokwasowa CDRH3
NPINYYGINYEGYVMDY
SEQ ID NO: 7
Sekwencja polinukleotydowa kodująca CDRL1
AAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCC
SEQ ID NO: 8
Sekwencja polinukleotydowa kodująca CDRL2
PL 211 014 B1
TGGGCCAGCACCCGCGAGAGC
SEQ ID NO: 9
Sekwencja polinukleotydowa kodująca CDRL3
CACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC
SEQ ID NO: 10
Sekwencja polinukleotydowa kodująca CDRH1
AACTACGGCATGAAC
SEQ ID NO: 11
Sekwencja polinukleotydowa kodująca CDRH2
TGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGC
SEQ ID NO: 12
Sekwencja polinukleotydowa kodująca CDRH3
AACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTAC
SEQ ID NO: 13
Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha ciężkiego QVQLVQSGSELKKPGASyKVSCKASGYTFTNYQMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYA
DDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQ1SSLKAEDTAVYYCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLV
TVSS
SEQ ID NO: 14
Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha ciężkiego QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT»YGMNWVRQAPGQGŁEWMGWINTYTGEPTYA
DDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARKPINYYGIKYEGYVMDYWGQGTDV
TVSS
PL 211 014 B1
SEQ ID NO: 15
Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha ciężkiego
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYA
DDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYFCARMPIHYYGINYEGYVMDYWGQGTLV
TVSS
SEQ ID NO: 16
Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha lekkiego
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSBSVŁYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLŁIYWASTRE
SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV
SEQ ID NO: 17
Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha lekkiego DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSKQKNYŁAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRE
SGVPDRFSGSGSGTDFTLTIINLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV
SEQ ID NO: 18
Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha lekkiego DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKS3HSYLYgSlTQKNYLAWYQQKPGQFFKIiLIYWASTRB
SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSŁHTEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV
SEQ ID NO: 19 sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha lekkiego DIVMTQSPDSIJ\VSLGERATINCKgSBgVLYSSHQKKYI.AWYQQKPGQPPKLLIYWASTRB
SGVPDRFSGSGSGTDFTLTIINŁBTEDVAVYYCHQYL5SŁTFGQGTKLEIKRTV
SEQ ID NO: 20
Sekwencja polinukleotydowa kodująca sekwencję aminokwasową o
SEQ ID NO: 13
PL 211 014 B1
CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA
GTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATG
AACTGGGTGOGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATG
AACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTT
GTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGC
CTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAACCCCATCAAC
TACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGC
ACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 21
Sekwencja polinukleotydowa kodująca sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 14
CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA gtgaaggtttcctgcaaggcttctggatacaccttcactaactacggcatg
AACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATC
AACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGllwr gtcttctccttggacacctctgtcagcacggcatatctgcagatcagcagc
CTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAAC tactacggcatcaactacgagggctacgtgatggactactggggccagggc
ACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 22
Sekwencja polinukleotydowa kodująca sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 15
CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA
GTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATG
AACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATC
AACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTT
GTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGC
CTAAAGGCTGAGGACACTGCCACCTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAAC
TACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGC
ACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 23
Sekwencja polinukleotydowa kodująca sekwencję aminokwasową o
SEQ ID NO: 16
PL 211 014 B1
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCKAG
AGGGCCACCATCAACTrGCAAGAGGAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAAC
CAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAG
CTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTC
AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAG
GCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC
TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAOGTACGGTG
SEQ ID NO: 24
Sekwencja polinukleotydowa kodująca sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 17
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAG
AGGGCCAGCATŁAACTGCAAGAOCAGCCACAGCGTGCTGTACAGGAGCAAC
CAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAG
CTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCCjATTC agtggcagcgggtctgggacacatttcactctcaccatcatcaacctgcag
GCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAOTACCTGAGCAGCCTGACC
TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG
SEQ ID NO: 25
Sekwencja polinukleotydowa kodująca sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 1S
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAG
AGGGCCAGCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAOCAAC
CAGAAGAACTACgTGGCefGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAG
CTGCTTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTC
AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAC
ACCGAAGATGTGGCAGTTTAlN-ACTGTCACCAgTACCTGAGCAGCCTGACC
TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG
SEQ ID NO: 26
Sekwencja polinukleotydowa kodująca sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 19
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAG
AGGGCCACCATCAAOTGCAAGAGCAGCCACAGCgrGCTGTACAGCAGCAAC
CAGAAflAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAC^ACAGCCTCCTAAG
CTGCTGATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCGTGACCGATTC
AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCATCAACCTGCAC
ACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC
TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGCrrG
PL 211 014 B1
SEQ ID NO: 27
Sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego chimerycznego przeciwciała mysio/ludzkiego przeciw-MAG
MGWSCIILFLVATATGVHSEIQLVQSGPELKKPGETNKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKW
MGWINTYTGEPTYADDFTGRFAFSLETSASTAYIjQISNLKNEDTATYFCARNPINYYGINYEGYVM
DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCIiVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF
PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAG
APSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHHAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTrPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN
HYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 28
Sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego chimerycznego przeciwciała mysio/ludzkiego przeciw-MAG
MGWSCIILFLVATATGVHSNIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKS SHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPG QSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIINVHTEDLAVYYCHQYLSSLTFGTGTKLEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGIiSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 29
Sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego chimerycznego przeciwciała mysio/ludzkiego przeciw-MAG MGWSCI ILFLVATATGVHSEIQLVQSGPELKKPGETNKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKW MGWINTYTGEPTYADDFTGRFAFSLETSASTAYIiQISNLKNEDTATYFCARNPINYYGINYEGYVM DYWGQGTLVWSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA1TSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVFSSSL3TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVŁHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNGVSLTCI. yKGFYPSDIAyEWESNGOPEHNYKTTPPyLDSDGSFFLYSKLTyDKSRWpOGNyFfiCfiyMTraŁT.WM HYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 30
Sekwencja aminokwasowa humanizowanego łańcucha ciężkiego im munoglobuliny
PL 211 014 B1
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGM
NWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSL
KAEDTAVYYCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVS5ASTKGPSVFPLAP
5SKST5GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS
WTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGA
PSVFLEPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP
REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF5CSVMHEALHNHYTQK5LSLSPGK
SEQ ID NO: 31
Sekwencja aminokwasowa humanizowanego łańcucha lekkiego immu noglobuliny
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSPDSLAVSLGERAnNCKSSHSVl.YSSN
QKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAE
DVAVYYCHQYLSSŁTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL
NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK
HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 32
Sekwencja aminokwasowa humanizowanego łańcucha ciężkiego im munoglobuliny
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGM
NWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSL
KAEDTAVYYCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP
SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS
WTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP
REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PL 211 014 B1
Claims (12)
- Zastrzeżenia patentowe1. Humanizowane przeciwciało anty-MAG, które wiąże się z MAG i neutralizuje ją, które to przeciwciało zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 15, oraz domenę zmienną łańcucha lekkiego wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19.
- 2. Humanizowane przeciwciało anty-MAG według zastrz. 1, które zawiera ponadto stałą część ludzkiego łańcucha lekkiego lub jej fragment oraz stałą część ludzkiego łańcucha ciężkiego lub jej fragment.
- 3. Humanizowane przeciwciało anty-MAG według zastrz. 1 albo 2, w którym domenę zmienną łańcucha ciężkiego stanowi SEQ ID NO: 13.
- 4. Humanizowane przeciwciało anty-MAG według zastrz. 1 albo 2, w którym domenę zmienną łańcucha ciężkiego stanowi SEQ ID NO: 14.
- 5. Humanizowane przeciwciało anty-MAG według zastrz. 1 albo 2, w którym domenę zmienną łańcucha ciężkiego stanowi SEQ ID NO: 15.
- 6. Humanizowane przeciwciało anty-MAG według zastrz. 3 - 5, w którym domenę zmienną łańcucha lekkiego stanowi SEQ ID NO: 16.
- 7. Humanizowane przeciwciało anty-MAG według zastrz. 3 - 5, w którym domenę zmienną łańcucha lekkiego stanowi SEQ ID NO: 17.
- 8. Humanizowane przeciwciało anty-MAG według zastrz. 3 - 5, w którym domenę zmienną łańcucha lekkiego stanowi SEQ ID NO: 18.
- 9. Humanizowane przeciwciało anty-MAG według zastrz. 3 - 5, w którym domenę zmienną łańcucha lekkiego stanowi SEQ ID NO: 19.
- 10. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera humanizowane przeciwciało antyMAG zdefiniowane w zastrz. 1-9 oraz dodatkowo farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik lub nośnik.
- 11. Zastosowanie humanizowanego przeciwciała anty-MAG zdefiniowanego w zastrz. 1 - 9 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki udaru.
- 12. Zastosowanie według zastrz. 11, w którym przeciwciało podaje się dożylnie.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0218230A GB0218230D0 (en) | 2002-08-06 | 2002-08-06 | Antibodies |
| GB0218229A GB0218229D0 (en) | 2002-08-06 | 2002-08-06 | Antibodies |
| GB0218232A GB0218232D0 (en) | 2002-08-06 | 2002-08-06 | Antibodies |
| GB0218234A GB0218234D0 (en) | 2002-08-06 | 2002-08-06 | Antibodies |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL375405A1 PL375405A1 (pl) | 2005-11-28 |
| PL211014B1 true PL211014B1 (pl) | 2012-03-30 |
Family
ID=31721633
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL375405A PL211014B1 (pl) | 2002-08-06 | 2003-08-05 | Humanizowane przeciwciało anty-MAG, środek farmaceutyczny i zastosowanie tego przeciwciała |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7612183B2 (pl) |
| EP (1) | EP1526868B1 (pl) |
| JP (1) | JP4528121B2 (pl) |
| KR (1) | KR101078459B1 (pl) |
| CN (1) | CN100542607C (pl) |
| AR (1) | AR040778A1 (pl) |
| AU (1) | AU2003255390B2 (pl) |
| BR (1) | BR0312456A (pl) |
| CA (1) | CA2494008C (pl) |
| CY (1) | CY1114919T1 (pl) |
| DK (1) | DK1526868T3 (pl) |
| ES (1) | ES2440652T3 (pl) |
| IL (1) | IL165478A (pl) |
| IS (1) | IS7576A (pl) |
| MX (1) | MXPA05001468A (pl) |
| MY (1) | MY148409A (pl) |
| NO (1) | NO333876B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ537123A (pl) |
| PL (1) | PL211014B1 (pl) |
| PT (1) | PT1526868E (pl) |
| SI (1) | SI1526868T1 (pl) |
| TW (1) | TWI323265B (pl) |
| WO (1) | WO2004014953A2 (pl) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7981420B2 (en) | 2000-12-22 | 2011-07-19 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Foederung Der Wissenschaften E.V. | Therapeutic use of antibodies directed against repulsive guidance molecule (RGM) |
| GB0103174D0 (en) * | 2001-02-08 | 2001-03-28 | Smithkline Beecham Plc | Novel method of treatment |
| AR040778A1 (es) * | 2002-08-06 | 2005-04-20 | Glaxo Group Ltd | Anticuerpos alterados o fragmentos funcionales que se unen a mag (glicoproteina asociada a mielina). |
| GB0306309D0 (en) * | 2003-03-19 | 2003-04-23 | Glaxo Group Ltd | Method of treatment |
| EP2418278A3 (en) * | 2005-05-09 | 2012-07-04 | Ono Pharmaceutical Co., Ltd. | Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics |
| WO2007039256A2 (de) | 2005-09-30 | 2007-04-12 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Bindungsdomänen von proteinen der repulsive guidance molecule (rgm) proteinfamilie und funktionale fragmente davon sowie deren verwendung |
| SI2500030T2 (sl) | 2005-11-04 | 2018-11-30 | Genentech, Inc. | Uporaba inhibitorjev komplementarnih procesov za zdravljenje očesnih bolezni |
| EP2021373A4 (en) * | 2006-05-31 | 2010-06-02 | Hanwa Chemical Corp | MONOCLONAL ANTIBODY VCAM-1 SPECIFIC |
| RS58233B1 (sr) | 2006-11-02 | 2019-03-29 | Genentech Inc | Humanizovana anti-faktor d antitela i njihove upotrebe |
| WO2009051957A2 (en) * | 2007-10-16 | 2009-04-23 | Nuvelo, Inc. | Antibodies to irem-1 |
| US8962803B2 (en) | 2008-02-29 | 2015-02-24 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Antibodies against the RGM A protein and uses thereof |
| CR20170001A (es) | 2008-04-28 | 2017-08-10 | Genentech Inc | Anticuerpos anti factor d humanizados |
| UY31809A (es) | 2008-05-06 | 2009-12-14 | Glaxo Group Ltd | Encapsulación de agentes biológicamente activos |
| TW201029662A (en) | 2008-12-19 | 2010-08-16 | Glaxo Group Ltd | Novel antigen binding proteins |
| SG172855A1 (en) * | 2009-01-29 | 2011-08-29 | Abbott Lab | Il-1 binding proteins |
| US20110165063A1 (en) * | 2009-01-29 | 2011-07-07 | Abbott Laboratories | Il-1 binding proteins |
| BR112012013734A2 (pt) | 2009-12-08 | 2017-01-10 | Abbott Gmbh & Co Kg | anticorpos monoclonais contra a proteína rgm a para uso no tratamento da degeneração da camada de fibras nervosas da retina. |
| US8663950B2 (en) | 2010-01-11 | 2014-03-04 | Arizona Board Of Regents | Production of a monoclonal antibody therapeutic against west nile virus in plants |
| TW201210612A (en) | 2010-06-03 | 2012-03-16 | Glaxo Group Ltd | Humanised antigen binding proteins |
| EP2579895A4 (en) | 2010-06-14 | 2013-12-18 | Vaccinex Inc | ANTI-VEGF ANTIBODIES AND USES THEREOF |
| US8974782B2 (en) * | 2011-02-07 | 2015-03-10 | Glaxo Group Limited | Treatment of stroke comprising anti-MAG antibodies |
| SG11201404263TA (en) | 2012-01-27 | 2014-08-28 | Abbvie Deutschland | Composition and method for diagnosis and treatment of diseases associated with neurite degeneration |
| US9308196B2 (en) * | 2012-05-18 | 2016-04-12 | Gruenenthal Gmbh | Pharmaceutical composition comprising (1 r,4r) -6'-fluoro-N ,N-dimethyl-4-phenyl-4',9'-d ihydro-3'H-spiro[cyclohexane-1,1'-pyrano-[3,4,b]indol]-4-amine and an oxicam |
| US10093978B2 (en) | 2013-08-12 | 2018-10-09 | Genentech, Inc. | Compositions for detecting complement factor H (CFH) and complement factor I (CFI) polymorphisms |
| WO2015091144A1 (en) | 2013-12-20 | 2015-06-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Improved recombinant polypeptide production methods |
| CA2940579A1 (en) | 2014-03-13 | 2015-09-17 | Universitaet Basel | Carbohydrate ligands that bind to igm antibodies against myelin-associated glycoprotein |
| MX2016014160A (es) | 2014-05-01 | 2017-02-16 | Genentech Inc | Variantes del anticuerpo anti-factor d y sus usos. |
| IL302486A (en) | 2015-06-24 | 2023-06-01 | Hoffmann La Roche | Antibodies against the transnephrine receptor with adapted affinity |
| AU2016323377B2 (en) | 2015-09-16 | 2021-04-15 | Universität Basel | Carbohydrate ligands that bind to antibodies against glycoepitopes of glycosphingolipids |
| KR20180054824A (ko) * | 2015-09-29 | 2018-05-24 | 셀진 코포레이션 | Pd-1 결합 단백질 및 이의 사용 방법 |
| AR106189A1 (es) | 2015-10-02 | 2017-12-20 | Hoffmann La Roche | ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO |
| CN114057885A (zh) | 2015-10-02 | 2022-02-18 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法 |
| CN108472382A (zh) | 2015-10-30 | 2018-08-31 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 抗-因子d抗体变体缀合物及其用途 |
| US10407510B2 (en) | 2015-10-30 | 2019-09-10 | Genentech, Inc. | Anti-factor D antibodies and conjugates |
| US10766958B2 (en) | 2016-09-19 | 2020-09-08 | Celgene Corporation | Methods of treating vitiligo using PD-1 binding antibodies |
| BR112019004733A2 (pt) | 2016-09-19 | 2019-05-28 | Celgene Corp | métodos de tratamento de distúrbios imunes usando proteínas de ligação a pd-1 |
| CN109481673A (zh) * | 2017-09-12 | 2019-03-19 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 促进脑损伤神经修复的组合物及其应用与评价方法 |
Family Cites Families (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57106673A (en) | 1980-12-24 | 1982-07-02 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | Dibenzo(b,f)(1,4)oxazepin derivative |
| GB8422238D0 (en) | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
| GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
| DK84787D0 (da) | 1987-02-19 | 1987-02-19 | Axel Olsen | Listesystem til foering af elektriske stroemforsynings- og/eller svagstroemsledere |
| DE3883899T3 (de) | 1987-03-18 | 1999-04-22 | Sb2, Inc., Danville, Calif. | Geänderte antikörper. |
| US4873316A (en) | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
| US5250414A (en) | 1988-11-04 | 1993-10-05 | Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich | Diagnostic methods using neurite growth regulatory factors |
| US5154927A (en) * | 1989-01-19 | 1992-10-13 | Wm. Wrigley Jr. Company | Gum composition containing dispersed porous beads containing active chewing gum ingredients and method |
| US5182107A (en) | 1989-09-07 | 1993-01-26 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates |
| US5527527A (en) | 1989-09-07 | 1996-06-18 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates |
| US5154924A (en) | 1989-09-07 | 1992-10-13 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates |
| FI93513C (fi) | 1993-11-04 | 1995-04-25 | Matti Kangasvuori | Ketju sekä menetelmä ketjun tekemiseksi |
| AU703152B2 (en) * | 1994-01-25 | 1999-03-18 | Biogen Ma Inc. | Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4 |
| GB9403250D0 (en) * | 1994-02-21 | 1994-04-13 | Univ Mcgill | Therapeutic use of myelin-associated glycoprotein (mag) |
| GB9424449D0 (en) | 1994-12-02 | 1995-01-18 | Wellcome Found | Antibodies |
| US6576607B1 (en) * | 1995-04-19 | 2003-06-10 | Acorda Therapeutics | Methods using CNS neurite outgrowth modulators |
| US5792743A (en) * | 1995-04-19 | 1998-08-11 | Acorda Therapeutics | Method for promoting neural growth comprising administering a soluble neural cell adhesion molecule |
| KR19990007893A (ko) | 1995-04-19 | 1999-01-25 | 론 코헨 | 중추신경계（ｃｎｓ） 축삭 성장 모듈레이터, 이를 구현 및 사용하는 조성물, 세포 및 방법 |
| CA2225691A1 (en) * | 1995-06-27 | 1997-01-16 | Research Foundation Of Cuny, Hunter College | Compositions and methods using myelin-associated glycoprotein (mag) and inhibitors thereof |
| CN1196733A (zh) * | 1995-06-30 | 1998-10-21 | 持田制药株式会社 | 抗Fas配体抗体和利用抗Fas配体抗体的测定方法 |
| US5962434A (en) | 1995-08-25 | 1999-10-05 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Compounds for stimulating nerve growth |
| US5834597A (en) * | 1996-05-20 | 1998-11-10 | Protein Design Labs, Inc. | Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same |
| US6114506A (en) * | 1996-09-20 | 2000-09-05 | General Hospital Corporation | Composition and method for enhancing fibrinolysis |
| AU748143B2 (en) * | 1997-10-28 | 2002-05-30 | University Of British Columbia, The | Immunological compositions and methods of use to transiently alter mammalian central nervous system myelin to promote neuronal regeneration |
| EP1032420A4 (en) * | 1997-11-14 | 2004-09-15 | Euro Celtique Sa | IMMUNOGLOBULIN MOLECULES WITH SYNTHETIC VARIABLE REGION AND MODIFIED SPECIFICITY |
| WO1999053945A1 (en) | 1998-04-16 | 1999-10-28 | Samuel David | Neuron growth inhibitory molecules or derivatives thereof used to immunize mammals thereby promoting axon regeneration |
| GB9809839D0 (en) | 1998-05-09 | 1998-07-08 | Glaxo Group Ltd | Antibody |
| DK1098972T3 (da) | 1998-07-22 | 2011-01-03 | Smithkline Beecham Ltd | Protein med lighed med neuroendokrinspecifikt protein samt cDNA kodende derfor |
| MXPA01002674A (es) * | 1998-09-14 | 2002-06-04 | Ostergaard Pedersen Lars | Un metodo para producir una proteina de la superfamilia de inmunoglobulina funcional. |
| ES2529196T3 (es) | 1998-11-06 | 2015-02-17 | University Of Zurich | Secuencias de nucleótidos y proteínas de genes Nogo y métodos basados en estas |
| CA2361124A1 (en) | 1999-01-22 | 2000-07-27 | Matthew John During | Vaccine-mediated treatment of neurological disorders |
| GB9908533D0 (en) | 1999-04-14 | 1999-06-09 | Novartis Ag | Organic compounds |
| US8101553B1 (en) | 2000-02-22 | 2012-01-24 | Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. | Antibody library |
| GB0103174D0 (en) * | 2001-02-08 | 2001-03-28 | Smithkline Beecham Plc | Novel method of treatment |
| US20040002790A1 (en) * | 2002-06-28 | 2004-01-01 | Paul Senn | Sensitive devices and sensitive applications |
| AR040778A1 (es) | 2002-08-06 | 2005-04-20 | Glaxo Group Ltd | Anticuerpos alterados o fragmentos funcionales que se unen a mag (glicoproteina asociada a mielina). |
| GB0306309D0 (en) * | 2003-03-19 | 2003-04-23 | Glaxo Group Ltd | Method of treatment |
-
2003
- 2003-08-04 AR AR20030102790A patent/AR040778A1/es not_active Application Discontinuation
- 2003-08-04 TW TW092121286A patent/TWI323265B/zh not_active IP Right Cessation
- 2003-08-05 AU AU2003255390A patent/AU2003255390B2/en not_active Ceased
- 2003-08-05 WO PCT/EP2003/008749 patent/WO2004014953A2/en not_active Ceased
- 2003-08-05 MY MYPI20032945A patent/MY148409A/en unknown
- 2003-08-05 CN CNB03818477XA patent/CN100542607C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-05 CA CA2494008A patent/CA2494008C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-05 MX MXPA05001468A patent/MXPA05001468A/es active IP Right Grant
- 2003-08-05 KR KR1020057002132A patent/KR101078459B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-05 EP EP03784195.4A patent/EP1526868B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-05 PT PT37841954T patent/PT1526868E/pt unknown
- 2003-08-05 JP JP2004526901A patent/JP4528121B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-05 SI SI200332328T patent/SI1526868T1/sl unknown
- 2003-08-05 NZ NZ537123A patent/NZ537123A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-08-05 US US10/523,295 patent/US7612183B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-05 BR BR0312456-8A patent/BR0312456A/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-08-05 DK DK03784195.4T patent/DK1526868T3/da active
- 2003-08-05 PL PL375405A patent/PL211014B1/pl unknown
- 2003-08-05 ES ES03784195.4T patent/ES2440652T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-11-30 IL IL165478A patent/IL165478A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-11-30 IS IS7576A patent/IS7576A/is unknown
- 2004-12-03 NO NO20045323A patent/NO333876B1/no not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-04-01 US US12/060,555 patent/US8071731B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-01-14 CY CY20141100027T patent/CY1114919T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7612183B2 (en) | Humanised anti-mag antibody or functional fragment thereof | |
| EP1711530B1 (en) | Nogo-a neutralising immunoglobulins for treatment of neurological diseases | |
| US20080014195A1 (en) | Antagonists Of Myelin-Associated Glycoprotein And Their Use In The Treatment And/Or Prevention Of Neurological Diseases | |
| US8017115B2 (en) | Therapeutical use of anti-myelin associated glycoprotein (MAG) antibodies | |
| RU2303461C9 (ru) | Антитела против миелин-ассоциированного гликопротеина (mag) | |
| HK1077206B (en) | Anti-mag humanised antibodies and their uses for treating stroke | |
| ZA200500337B (en) | Anty-myelin associated glycoprotein (MAG) antibodies | |
| HK1100144B (en) | Nogo-a neutralising immunoglobulins for treatment of neurological diseases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification |