JP2006512899A - 抗ミエリン関連糖タンパク質（ｍａｇ）抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ミエリン関連糖タンパク質(MAG)に対する変更された抗体、この抗体を含む医薬処方物、ならびに神経学的疾患/障害の治療および/または予防におけるこのような抗体の使用に関する。

Description

本発明は、ミエリン関連糖タンパク質(MAG)に結合してその機能を中和する変更された抗体、このような抗体をコードするポリヌクレオチド、このような抗体を含む医薬処方物、ならびに神経学的疾患の治療および/または予防におけるこのような抗体の使用に関する。本発明の他の態様、目的および利点は、以下の記載から明らかとなろう。
脳卒中は、西洋社会における死亡および能力障害の主要原因である。t-PA以外には、脳卒中の治療のための承認された治療はない。t-PAは、出血を排除するために、発症後3時間以内に、CTスキャン後に投与されなければならない。今日まで、急性脳卒中の治療(すなわち、神経保護)に対するほとんどの治療剤は、急性細胞死に関与することが知られるグルタミン酸レセプターおよびその下流のシグナル伝達経路の標的化に主に関していた。しかし、今日まで、これらの戦略は、臨床試験において不成功であることが証明されており、しばしば、用量制限副作用を伴う(HillおよびHachinski, The Lancet, 352: (補遺III) 10-14 (1998))。従って、血流停止後の細胞死の軽減に対する新規アプローチが必要とされている。
脳卒中の発症後、ある程度の自発的機能回復が多くの患者で観察されており、これは、脳が損傷後に修復および/または再構築(remodel)する能力を(限定的ではあるが)有することを示唆している。従って、この回復を増強する可能性を有する薬剤により、大脳虚血発症のかなり後(潜在的に数日後)に干渉を行うことが可能になる。急性神経保護を提供しかつ機能回復を増強することの両方が可能な薬剤は、現在の潜在的な神経保護戦略に対して顕著な利点を提供し得る。
機能回復の基礎をなす機構は現在未知である。損傷した軸索または非損傷の軸索の発芽が、1つの可能性のある機構として提唱されている。しかし、in vivo研究により、神経栄養因子を用いた脊髄損傷または脳卒中の治療が、増強された機能回復およびある程度の軸索発芽を生じることが示されたものの、これらの研究は、軸索発芽の程度と機能回復の程度との間の直接的関連性を証明していない(Jakemanら、1998, Exp. Neurol. 154: 170-184, Kawamataら、1997, Proc Natl Acad. Sci. USA., 94:8179-8184, Ribottaら、2000, J Neurosci. 20: 5144-5152)。さらに、軸索発芽は、生存能力のあるニューロンを必要とする。従って、大規模な細胞死を伴う脳卒中のような疾患において、脳卒中後に与えられる薬剤によって提供される機能回復の増強は、軸索発芽以外の機構(例えば、内因性幹細胞の分化、過剰な経路の活性化、レセプター分布の変化またはニューロンもしくはグリアの興奮性)を介したものであり得る(Fawcett & Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391, Horner & Gage, 2000, Nature 407 963-970)。
中枢神経系(CNS)が損傷後に修復する限定的な能力は、軸索発芽(神経突起伸長)に対する阻害作用を有するCNS環境内の分子に一部起因すると考えられる。CNSミエリンは、阻害分子を含むと考えられている(Schwab MEおよびCaroni P (1988) J. Neurosci. 8, 2381-2193)。2つのミエリンタンパク質であるミエリン関連糖タンパク質(MAG)とNogoとが、神経突起伸長の推定阻害物質としてクローニングされ、同定されている(Sato S.ら(1989) Biochem. Biophys. Res. Comm.163,1473-1480; McKerracher Lら(1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay Gら(1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe KおよびLundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262; Schaferら(1996) Neuron 16, 1107-1113; WO9522344; WO9701352; Prinjha Rら(2000) Nature 403, 383-384; Chen MSら(2000) Nature 403, 434-439; GrandPre Tら(2000) Nature 403, 439-444; US005250414A; WO200005364A1; WO0031235)。
ミエリン関連糖タンパク質は、5つの細胞外免疫グロブリンドメイン、単一の膜貫通ドメインおよび1つの細胞内ドメインからなる、ミエリンの表面上で発現される細胞表面膜貫通分子である。MAGの発現は、CNSおよび末梢神経系(PNS)において、ミエリン化しつつあるグリアに限定されている。MAGは、ニューロフィラメントのリン酸化とin vitroでの神経突起伸長の阻害とを含むニューロン細胞骨格に対する作用を媒介するニューロンレセプターと、相互作用すると考えられている。MAGのアンタゴニストは、損傷後の軸索発芽の促進に有用であると仮定されてきた(WO9522344、WO9701352およびWO9707810)が、これらのクレームは、in vivoのデータで支持されていない。さらに、in vivoでの、CNSニューロンからの軸索発芽の阻害物質としてのMAGの役割は、証明されていない(Li CMら(1994) Nature 369, 747-750; Montag, Dら(1994) Neuron 13, 229-246; Lassmann Hら(1997) GLIA 19, 104-110; Li Cら(1998) J. Neuro. Res. 51, 210-217; Yin Xら(1998) J. Neurosci. 18, 1953-1962; Bartsch Uら(1995) Neuron 15 1375-1381; Li Mら(1996) 46,404-414)。
抗体は、典型的に、ジスルフィド結合によって一緒に結合した2本の重鎖と、2本の軽鎖とを含む。各軽鎖は、ジスルフィド結合によってそれぞれの重鎖に結合されている。各重鎖は、その一端に可変ドメインを有し、それに多数の定常ドメインが続く。各軽鎖は、その一端に可変ドメインを有し、他端に定常ドメインを有する。軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列している。軽鎖定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと整列している。軽鎖および重鎖の定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接的には関与しない。
軽鎖と重鎖の各対の可変ドメインは、抗原結合部位を形成する。軽鎖および重鎖の可変ドメインは、同じ一般構造を有し、そして各々のドメインが、4つの領域のフレームワークを含む。これらのフレームワークの配列は比較的保存されており、しばしば超可変領域と称される3つの相補性決定領域(CDR)によって連結されている。4つのフレームワーク領域は、主としてβ-シートコンホメーションを採用し、CDRは、β-シート構造を接続するかまたはある場合にはβ-シート構造の一部を形成する、ループを形成する。CDRは、フレームワーク領域によって、他のドメイン由来のCDRと近位に維持され、抗原結合部位の形成に寄与している。抗体のCDRおよびフレームワーク領域は、Kabatら(「Sequences of proteins of immunological interest」 US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987)を参照して決定され得る。
本明細書中に開示される全ての刊行物は、雑誌および特許の両方とも、明確かつ完全に、本明細書中に参照により全体が組み入れられる。
Poltorakら(1987) Journal of Cell Biology 105,1893-1899, DeBellardら(1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tangら(1997) Mol. Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe KおよびLundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262に記載された、市販の抗MAGモノクローナル抗体(MAB1567 (Chemicon))は、ラットにおける局所的大脳虚血(脳卒中のモデル)の後に、脳に直接的または静脈内のいずれかで投与される場合に、神経保護を提供し、機能回復を増強することが現在見出されている。従って、抗MAG抗体は、脳卒中後の急性の神経保護ならびに機能回復の促進の両方についての潜在的治療剤を提供する。この抗体はマウス抗体である。マウス抗体はしばしば診断剤として使用されるが、その治療剤としての有用性は、少数の場合においてのみ証明されている。ヒトに対するマウスモノクローナルの反復投与により、通常これらの分子に対するヒト免疫応答が惹起されることに一部起因して、それらの適用は限定的である。マウスモノクローナルの所望されないこれらの固有の特性を克服するために、ヒト抗体の領域を組み込むように設計された「変更された」抗体が開発されており、当技術分野で充分確立されている。例えば、ヒト化抗体は、非ヒト起源の相補性決定領域(「CDR」)を含み、その構造の残部のほとんどはヒト抗体に由来する。
神経変性のプロセスは、多くの神経学的疾患/障害(脳卒中、外傷性脳損傷および脊髄損傷のような急性疾患、ならびにアルツハイマー病、前頭側頭型痴呆(タウオパシー)、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンティングトン病および多発性硬化症を含む慢性疾患を含む)の基礎をなす。従って、抗MAG mabは、これらの疾患/障害に関連する細胞死の改善と機能回復の促進との両方によって、これらの疾患/障害の治療において有用であり得る。
本発明は、MAGに結合して中和し、かつ以下のCDRの1つまたは複数を含む、変更された抗体またはその機能的フラグメントを提供する。CDRは、Kabat(Kabatら(1991) Sequences of proteins of immunological interest;第5版; US Department of Health and Human Services; NIH publication No 91-3242)に記載されるように同定される。CDRは、好ましくは、Kabatによって定義されるとおりであるが、ChothiaおよびLesk (Chothiaら、(1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883)によって定義されるとおりのタンパク質の構造および折り畳みの原則に従うと、さらなる残基もまた抗原結合領域の一部であるとみなされ得、従って、本発明によって包含されることが理解されよう。
Figure 2006512899
本発明はまた、上記のCDRを有する抗体と同じエピトープに結合する抗体にも関する。競合的阻害アッセイが、抗原上のエピトープのマッピングのために使用される。従って、MAG(好ましくはヒトMAG)に対する、上記CDRを有する変更された抗体の結合を競合的に阻害する抗MAG抗体(変更されたものまたは非変更のもの)もまた提供される。
さらなる態様において、本発明は、CDRH1、CDRH2およびCDRH3から選択される1つまたは複数のCDRを含む重鎖可変ドメイン、ならびに/あるいはCDRL1、CDRL2およびCDRL3から選択される1つまたは複数のCDRを含む軽鎖可変ドメインを含む、変更された抗体またはその機能的フラグメントを提供する。
本発明はさらに、以下を含む、変更された抗MAG抗体またはその機能的フラグメントを提供する:
a)配列中に、CDRH1、CDRH2およびCDRH3を含む重鎖可変ドメイン(VH)、
ならびに/または
b)配列中に、CDRL1、CDRL2およびCDRL3を含む軽鎖可変ドメイン(VL)。
本発明のさらなる態様は、薬学的に許容される希釈剤または担体と共に、本発明の変更された抗MAG抗体またはその機能的フラグメントを含む医薬組成物を提供する。
さらなる態様において、本発明は、ヒトにおける脳卒中および他の神経学的疾患の治療または予防の方法を提供し、この方法は、このような治療または予防を必要とするヒトに、有効量の本発明の抗MAG抗体またはその機能的フラグメントを投与することを含む。
別の態様において、本発明は、脳卒中および他の神経学的疾患の治療または予防のための医薬の調製における、本発明の抗MAG抗体またはその機能的フラグメントの使用を提供する。
さらなる態様において、本発明は、脳卒中または他の神経学的疾患に罹患しているか、あるいはその発症の危険性があるヒト患者において、神経変性を阻害する方法および/または機能回復を促進する方法を提供し、この方法は、このような方法を必要とするヒトに、本発明の抗MAG抗体またはその機能的フラグメントの有効量を投与することを含む。
なおさらなる態様において、本発明は、脳卒中および他の神経学的疾患に罹患しているか、またはその発症の危険性があるヒト患者において、神経変性を阻害するための医薬および/または機能回復を促進するための医薬の調製における、本発明の抗MAG抗体またはその機能的フラグメントの使用を提供する。
本発明の他の態様および利点は、詳細な説明およびその好ましい実施形態において、さらに記述される。
抗MAG抗体
本発明の変更された抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体(mAb)であり、好ましくはキメラ抗体、ヒト化抗体またはリシェイプ(reshaped)抗体であり、これらのうち、ヒト化抗体が特に好ましい。
変更された抗体は、好ましくは、天然抗体またはそのフラグメントの構造を有する。従って、この抗体は、完全抗体、(Fab')2フラグメント、Fabフラグメント、軽鎖二量体または重鎖二量体を含み得る。この抗体は、IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4;またはIgM;IgA、IgEもしくはIgD、またはこれらの改変された変異体であり得る。抗体重鎖の定常ドメインは、相応に選択され得る。軽鎖定常ドメインは、κ定常ドメインまたはλ定常ドメインであり得る。さらに、この抗体は、全てのクラスの改変(例えば、IgG二量体、もはやFcレセプターに結合せずClq結合も媒介しないFc突然変異体(ブロッキング抗体))を含み得る。この抗体はまた、WO86/01533に記載される型のキメラ抗体であり得、このキメラ抗体は、抗原結合領域と非免疫グロブリン領域とを含む。この抗原結合領域は、抗体の軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインである。典型的には、この抗原結合領域は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの両方を含む。非免疫グロブリン領域は、そのC末端にて抗原結合領域と融合している。この非免疫グロブリン領域は、典型的に、非免疫グロブリンタンパク質であり、酵素、毒素または既知の結合特異性を有するタンパク質であり得る。この型のキメラ抗体の2つの領域は、切断可能なリンカー配列によって接続され得る。本明細書中で前記したようなCDRを有するイムノアドヘシンもまた、本発明において意図される。
定常領域は、要求される機能性に従って選択される。普通、IgG1は、補体への結合を介して溶解能を示し、かつ/またはADCC(抗体依存性細胞傷害)を媒介するだろう。IgG4は、非細胞傷害性ブロッキング抗体が必要とされる場合に好ましいだろう。しかし、IgG4抗体は、産生において不安定さを示し得るので、一般により安定なIgG1を改変することのほうが好ましい場合がある。示唆された改変は、EPO307434に記載され、好ましい改変には、235位および237位での改変が含まれる。従って、本発明は、本発明に従う抗体の溶解形態または非溶解形態を提供する。
好ましい態様において、変更された抗体は、クラスIgGであり、より好ましくはIgG1である。
従って、好ましい形態において、本発明の抗体は、上記CDRを有する全長非溶解性IgG1抗体である。最も好ましい形態において、本発明者らは、配列番号13および配列番号16のCDRを有する全長非溶解性IgG1抗体と、配列番号15および配列番号18のCDRを有する全長非溶解性IgG1抗体とを提供する。
さらなる態様において、本発明は、CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2およびCDRL3をコードするポリヌクレオチドを提供する。好ましいポリヌクレオチド配列は以下である:
Figure 2006512899
本発明のさらなる態様において、配列中に、CDRL1、CDRL2およびCDRL3から選択される少なくとも1つのCDRを含み、より好ましくは3つ全てのCDRを含む、変更された抗MAG抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが提供される。
本発明のさらなる態様において、配列中に、CDRH1、CDRH2およびCDRH3から選択される少なくとも1つのCDRを含み、より好ましくは3つ全てのCDRを含む、変更された抗MAG抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが提供される。
特に好ましい態様において、本発明の抗MAG抗体はヒト化抗体である。
従って、本発明はさらに、MAGに結合して中和し、かつ以下のアミノ酸配列のうち1つを含む重鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその機能的フラグメントを提供する:
Figure 2006512899
本発明のさらなる態様において、MAGに結合し、かつアミノ酸配列(配列番号16、配列番号17、配列番号18または配列番号19)を含む軽鎖可変領域と共に、配列番号13、配列番号14または配列番号15の重鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその機能的フラグメントが提供される:
Figure 2006512899
本発明のさらなる態様において、以下を含むヒト化抗体が提供される:
配列番号13、配列番号14または配列番号15を含む重鎖可変フラグメントおよびヒト重鎖の定常部分またはそのフラグメントと、
配列番号16、配列番号17、配列番号18または配列番号19を含む軽鎖可変フラグメントおよびヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメント。
好ましい態様において、このヒト化抗体は、クラスIgGであり、より好ましくはIgG1である。
本発明の好ましい抗体は、以下を含む:
配列番号13を含む重鎖可変領域および配列番号16を含む軽鎖可変領域;
配列番号13を含む重鎖可変領域および配列番号17を含む軽鎖可変領域;
配列番号13を含む重鎖可変領域および配列番号18を含む軽鎖可変領域;
配列番号13を含む重鎖可変領域および配列番号19を含む軽鎖可変領域;
配列番号14を含む重鎖可変領域および配列番号16を含む軽鎖可変領域;
配列番号14を含む重鎖可変領域および配列番号17を含む軽鎖可変領域;
配列番号14を含む重鎖可変領域および配列番号18を含む軽鎖可変領域;
配列番号14を含む重鎖可変領域および配列番号19を含む軽鎖可変領域;
配列番号15を含む重鎖可変領域および配列番号16を含む軽鎖可変領域;
配列番号15を含む重鎖可変領域および配列番号17を含む軽鎖可変領域;
配列番号15を含む重鎖可変領域および配列番号18を含む軽鎖可変領域;
配列番号15を含む重鎖可変領域および配列番号19を含む軽鎖可変領域。
さらなる態様において、本発明は、配列番号13、配列番号14および配列番号15を含む重鎖可変領域と、配列番号16、配列番号17、配列番号18および配列番号19を含む軽鎖可変領域とをコードするポリヌクレオチドを提供する。
アミノ酸配列番号13をコードする好ましいポリヌクレオチド配列は以下である。
Figure 2006512899
アミノ酸配列番号14をコードする好ましいポリヌクレオチド配列は以下である。
Figure 2006512899
アミノ酸配列番号15をコードする好ましいポリヌクレオチド配列は以下である。
Figure 2006512899
アミノ酸配列番号16をコードする好ましいポリヌクレオチド配列は以下である。
Figure 2006512899
Figure 2006512899
配列番号17をコードする好ましいポリヌクレオチド配列は以下である。
Figure 2006512899
配列番号18をコードする好ましいポリヌクレオチドは以下である。
Figure 2006512899
配列番号19をコードする好ましいポリヌクレオチドは以下である。
Figure 2006512899
「中和」とは、ニューロンへの結合および神経突起伸長の阻害を含むMAG機能の、全てまたは部分的のいずれかの阻害をいう。
「変更された抗体」とは、選択された宿主細胞における発現によって得られ得る、変更された免疫グロブリンコード領域によってコードされるタンパク質をいう。このような変更された抗体としては、操作された抗体(例えば、キメラ抗体、リシェイプ抗体、ヒト化抗体またはベクター化抗体)または免疫グロブリン定常領域の全てもしくは一部を欠く抗体フラグメント(例えば、Fv、FabまたはF(ab)2)などが含まれる。
「変更された免疫グロブリンコード領域」とは、変更された抗体をコードする核酸配列をいう。この変更された抗体がCDRグラフト(CDR-grafted)抗体またはヒト化抗体である場合、非ヒト免疫グロブリン由来の相補性決定領域(CDR)をコードする配列が、ヒト可変フレームワーク配列を含む第一の免疫グロブリンパートナー中に挿入される。必要に応じて、この第一の免疫グロブリンパートナーは、第二の免疫グロブリンパートナーに機能的に連結される。
「第一の免疫グロブリンパートナー」とは、天然の(すなわち、天然に存在する)CDRコード領域がドナー抗体のCDRコード領域によって置換された、ヒトフレームワークまたはヒト免疫グロブリン可変領域をコードする核酸配列をいう。このヒト可変領域は、免疫グロブリンの重鎖、軽鎖(または両方の鎖)、類似体またはその機能的フラグメントであり得る。抗体(免疫グロブリン)の可変領域内に位置するこのようなCDR領域は、当技術分野で公知の方法によって決定され得る。例えば、Kabatら(Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987))は、CDRを位置決めするための規則を開示している。さらに、CDR領域/構造を同定するために有用なコンピュータプログラムが公知である。
「第二の免疫グロブリンパートナー」とは、第一の免疫グロブリンパートナーがインフレームでかまたは任意の従来のリンカー配列によって融合される(すなわち、機能的に連結される)、タンパク質またはペプチドをコードする別のヌクレオチド配列をいう。好ましくは、この第二の免疫グロブリンパートナーは、免疫グロブリン遺伝子である。第二の免疫グロブリンパートナーには、目的の同じ抗体(すなわち、同種-第一および第二の変更された抗体が同じ源に由来する)またはさらなる抗体(すなわち、異種)についての定常領域全体をコードする核酸配列が含まれ得る。この第二の免疫グロブリンパートナーは、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖(あるいは、単一のポリペプチドの一部としての両方の鎖)であり得る。この第二の免疫グロブリンパートナーは、特定の免疫グロブリンのクラスにもアイソタイプにも限定されない。さらに、この第二の免疫グロブリンパートナーは、例えば、FabまたはF(ab)2中に見出される免疫グロブリン定常領域の部分(すなわち、適切なヒト定常領域またはフレームワーク領域の別個の部分)を含み得る。このような第二の免疫グロブリンパートナーはまた、宿主細胞の外側表面上に露出された完全な膜タンパク質をコードする配列を、例えば、ファージディスプレイライブラリーの一部として含み得るか、または分析的検出もしくは診断的検出のためのタンパク質(例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼなど)をコードする配列を含み得る。
用語Fv、Fc、Fd、FabまたはF(ab)2は、その標準的な意味で使用される(例えば、Harlowら、Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)を参照のこと)。
本明細書中で使用する場合、「操作された抗体」は、ある型の変更された抗体、すなわち、選択されたアクセプター抗体の軽鎖可変ドメインおよび/または重鎖可変ドメインの一部が、選択されたエピトープに対する特異性を有する1つまたは複数のドナー抗体由来の類似部分によって置換された、全長合成抗体(例えば、抗体フラグメントと対照的に、キメラ抗体、リシェイプ抗体またはヒト化抗体)を記述する。例えば、このような分子には、未改変の軽鎖(またはキメラ軽鎖)を伴うヒト化重鎖によって特徴付けられる抗体またはその逆の抗体が含まれ得る。操作された抗体はまた、ドナー抗体の結合特異性を保持するために、アクセプター抗体の軽鎖可変ドメインフレームワーク領域および/または重鎖可変ドメインフレームワーク領域をコードする核酸配列の変更によっても特徴付けられ得る。これらの抗体は、アクセプター抗体由来の1つまたは複数のCDR(好ましくは全て)の、本明細書中に記載されるドナー抗体由来のCDRによる置換を含み得る。
「キメラ抗体」は、アクセプター抗体由来の軽鎖定常領域および重鎖定常領域を伴う、ドナー抗体由来の天然に存在する可変領域(軽鎖および重鎖)を含む、ある型の操作された抗体をいう。
「ヒト化抗体」とは、非ヒトドナー免疫グロブリン由来のCDRを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分が1つ(または複数の)ヒト免疫グロブリン由来である、ある型の操作された抗体をいう。さらに、フレームワークサポート残基は、結合親和性を保存するために変更され得る(例えば、Queenら、 Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgsonら、Bio/Technology, 9:421 (1991)を参照のこと)。適切なヒトアクセプター抗体は、従来のデータベース(例えば、KABAT(登録商標)データベース、Los AlamosデータベースおよびSwiss Proteinデータベース)から、ドナー抗体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に対する相同性によって選択された抗体であり得る。ドナー抗体のフレームワーク領域に対する相同性(アミノ酸基準)によって特徴付けられたヒト抗体は、ドナーCDRの挿入のための重鎖定常領域および/または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適切であり得る。軽鎖定常領域または軽鎖可変フレームワーク領域を提供し得る適切なアクセプター抗体は、同様の方法で選択され得る。アクセプター抗体の重鎖および軽鎖が同じアクセプター抗体に起源する必要はないことに留意すべきである。先行技術は、このようなヒト化抗体を産生するいくつかの方法を記載している。例えば、EP-A-0239400およびEP-A-054951を参照のこと。
「リシェイプヒト抗体」とは、第一のヒトモノクローナルドナー抗体由来の最低少なくとも1つのCDRにより、第二のヒトアクセプター抗体中のCDRが置換された、変更された抗体をいう。好ましくは、6つ全てのCDRが置換される。より好ましくは、第一のヒトドナーモノクローナル抗体由来の抗原結合領域全体(例えば、Fv、FabまたはF(ab')2)により、第二のヒトアクセプターモノクローナル抗体中の対応する領域が置換されている。最も好ましくは、第一のヒトドナー由来のFab領域は、第二のヒトアクセプター抗体の適切な定常領域に機能的に連結されて、全長モノクローナル抗体を形成している。
「ベクター化抗体」とは、血液脳関門(BBB)を介した輸送を改善するために薬剤が結合された抗体をいう。(概論について、Pardridge; Advanced Drug Delivery Review 36, 299-321, 1999を参照のこと)。この結合は化学的でもよく、あるいは、部分が抗体へと操作され得る。一例は、脳毛細管内皮細胞レセプターに対する抗体(例えば、抗インスリンレセプター抗体または抗トランスフェリンレセプター抗体)とのキメラを作製することである(Saitoら(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 10227-31; Pardridgeら(1995) Pharm. Res. 12 807-816; Broadwellら(1996) Exp. Neurol. 142 47-65; Bickelら(1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90, 2618-2622; Fridenら(1996) J. Pharm. Exp. Ther. 278 1491-1498、米国特許第5182107号、米国特許第5154924号、米国特許第5833988号、米国特許第5527527号)。一旦レセプターに結合すると、二重特異性抗体の両方の成分は、トランスサイトーシスのプロセスによってBBBを通過する。あるいは、この薬剤は、このような細胞表面レセプターに結合するリガンド(例えば、インスリン、トランスフェリンまたは低密度リポタンパク質)であり得る(Descampsら(1996) Am. J. Physiol. 270 H1149-H1158; Duffyら(1987) Brain Res. 420 32-38; Dehouckら(1997) J. Cell Biol. 1997 877-889)。BBBを横切る輸送を改善することが公知の天然に存在するペプチド(例えば、ペネトラチンならびにSynB1およびSynB3)もまた使用され得る(Rouselleら(2000) Mol. Pharm.57, 679-686およびRouselleら(2001) Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 296,124-131)。
用語「ドナー抗体」とは、第一の免疫グロブリンパートナーに、その可変領域、CDRまたは他の機能的フラグメントもしくはその類似体のアミノ酸配列を付与して、変更された免疫グロブリンコード領域と、ドナー抗体の特徴である抗原特異性および中和活性を有する得られ、発現され、変更された抗体とを提供する、抗体(モノクローナルまたは組換え)をいう。
用語「アクセプター抗体」とは、第一の免疫グロブリンパートナーに、その重鎖および/もしくは軽鎖のフレームワーク領域、ならびに/またはその重鎖および/もしくは軽鎖の定常領域をコードするアミノ酸配列の全て(または任意の部分ではあるが、好ましくは全て)を付与する、ドナー抗体に対して異種の抗体(モノクローナルまたは組換え)をいう。好ましくは、ヒト抗体がアクセプター抗体である。
「CDR」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域である、抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列として定義される。例えば、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照のこと。免疫グロブリンの可変部分には、3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDR(すなわち、CDR領域)が存在する。このように、「CDR」は、本明細書中で使用する場合、3つ全ての重鎖CDRまたは3つ全ての軽鎖CDR(あるいは、適切な場合、全ての重鎖CDRと全ての軽鎖CDRとの両方)をいう。抗体の構造およびタンパク質折り畳みは、他の残基が抗原結合領域の一部とみなされ、当業者によってそのように理解されることを意味し得る。例えば、Chothiaら、(1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883を参照のこと。簡便さのために、配列番号13〜26においてKabatによって定義されるCDRに下線を付す。
CDRは、抗原またはエピトープへの抗体の結合のための接触残基の大部分を提供する。本発明の目的のCDRは、ドナー抗体の可変重鎖および可変軽鎖の配列に由来し、これらのCDRが由来するドナー抗体と同じ抗原結合特異性および/または中和能力を共有または保持する類似体である、天然に存在するCDRの類似体が含まれる。
「機能的フラグメント」は、このフラグメントが由来する抗体と同じ抗原結合特異性および/または中和能力を保持する、部分的な重鎖または軽鎖の可変配列(例えば、免疫グロブリン可変領域のアミノ末端またはカルボキシ末端の小さい欠失)である。
「類似体」は、少なくとも1つのアミノ酸によって改変されたアミノ酸配列であり、この改変は化学的であり得るか、あるいは数個のアミノ酸(すなわち、10以下)の置換もしくは再編成であり得、この改変により、このアミノ酸配列は、未改変配列の生物学的特徴(例えば、抗原特異性および高親和性)を保持できる。例えば、特定のエンドヌクレアーゼ制限部位がCDRコード領域内またはその周りに作出される場合、置換によって(サイレント)突然変異が構築され得る。本発明は、本発明の抗体の類似体の使用を企図する。アミノ酸配列または核酸配列中の微小な変化が、例えば、実質的に類似の特性を保持する、元のタンパク質の対立遺伝子形態を導き得ることが周知である。従って、本発明の抗体の類似体には、重鎖および軽鎖の超可変領域中のCDRが、上記定義のようなCDR(例えば、CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2およびCDRL3)に対して、少なくとも80%相同、好ましくは少なくとも90%相同、そしてより好ましくは少なくとも95%相同であり、かつMAG中和活性を保持する類似体が含まれる。アミノ酸配列は、配列が最適に整列され、ギャップまたは挿入が非同一残基として計数される場合に、同じ位置に80%の同一なアミノ酸残基を有する場合に、少なくとも80%相同である。本発明はまた、本発明の抗体の類似体を企図し、この類似体において、フレームワーク領域は、配列番号1〜5に示されるフレームワーク領域に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、そしてより好ましくは少なくとも95%相同である。アミノ酸配列は、配列が最適に整列され、ギャップまたは挿入が非同一残基として計数される場合に、同じ位置に80%の同一なアミノ酸残基を有する場合に、少なくとも80%相同である。
類似体は、対立遺伝子変異としても生じ得る。「対立遺伝子変異または対立遺伝子改変」は、核酸配列中の変更である。このような変異または改変は、遺伝コード中の縮重に起因し得るか、または所望の特徴を提供するために故意に操作され得る。これらの変異または改変は、任意のコードされたアミノ酸配列中に変更を生じても生じなくてもよい。
用語「エフェクター因子」とは、変更された抗体、および/あるいはドナー抗体の天然もしくは合成の軽鎖もしくは重鎖またはドナー抗体の他のフラグメントが従来の手段によって結合され得る、非タンパク質の担体分子をいう。このような非タンパク質担体には、診断分野において使用される従来の担体(例えば、ポリスチレンもしくは他のプラスチックビーズ)、多糖類(例えば、BIAcore [Pharmacia]システムにおいて使用されるようなもの)、または医療分野において有用であり、かつヒトおよび動物への投与に安全な他の非タンパク質物質が含まれ得る。他のエフェクター因子には、重金属原子をキレートするためのマクロサイクルまたは放射性同位体が含まれ得る。このようなエフェクター因子はまた、変更された抗体の半減期を増大させるために有用なもの(例えば、ポリエチレングリコール)であり得る。
MAGに特異的な中和抗体は記載されており(Poltorakら(1987) Journal of Cell Biology 105,1893-1899, DeBellardら(1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tangら(1997) Mol. Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe KおよびLundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262)、市販されている(MAB1567 (Chemicon))。
あるいは、ヒトMAGと交差反応性の抗体が生成され得る任意の種(例えば、ヒトまたはニワトリ)由来の天然のMAGを用いて非ヒト種(例えば、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリ、げっ歯類(例えば、マウスおよびラット)など)を免疫して、提示の際に所望される免疫グロブリンを生成することによって、抗体、変更された抗体およびフラグメントを構築できる。従来のハイブリドーマ技術が、MAGに対する非ヒトmAbを分泌するハイブリドーマ細胞系を提供するために使用される。次いで、このようなハイブリドーマは、384ウェルまたは96ウェルのプレートに被覆されたMAGを使用して、ストレプトアビジン被覆したプレートに結合したビオチン化MAGを用いて、またはビオチン化MAGを使用する同種ユーロピウム-APC結合イムノアッセイにおいて、結合についてスクリーニングされる。
天然のヒト抗体は、ヒト抗体マウス(例えば、「Xenomouse」(Abgenix))において産生され得る。このヒト抗体マウスでは、マウス免疫グロブリン遺伝子が除去され、ヒト免疫グロブリンをコードする遺伝子がマウス染色体中に挿入されている。このマウスは、通常通りに免疫され、ヒト遺伝子由来の抗体応答を生じる。従って、このマウスはヒト抗体を産生し、陽性ハイブリドーマの選択後にヒト化される必要性を除く(Green L.L., J Immunol Methods 1999 Dec 10;231(1-2):11-23を参照のこと)。
本発明はまた、MAGに対するmAb由来のFabフラグメントまたはF(ab')2フラグメントの使用を包含する。これらのフラグメントは、in vivoで保護剤として有用である。Fabフラグメントは全軽鎖と重鎖のアミノ末端部分とを含み、F(ab')2フラグメントはジスルフィド結合によって結合された2つのFabフラグメントによって形成されるフラグメントである。FabフラグメントおよびF(ab')2フラグメントは、従来の手段(例えば、適切なタンパク質分解酵素、パパインおよび/またはペプシンによるmAbの切断)、または組換え方法によって獲得され得る。FabフラグメントおよびF(ab')2フラグメントは、それ自体、治療剤または予防剤として、本明細書中に記載されるような組換え抗体またはヒト化抗体の形成において有用な可変領域とCDR配列とを含む配列のドナーとして、有用である。
FabフラグメントおよびF(ab')2フラグメントはまた、コンビナトリアルファージライブラリー(例えば、Winterら、Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994)を参照のこと)または免疫グロブリン鎖シャッフリング(例えば、Marksら、Bio/Technology, 10:779-783 (1992)を参照のこと)によっても構築され得る(これらの文献は両方とも、本明細書中にその全体が参照により組み入れられる)。
従って、MAGに特異的なヒト抗体フラグメント(Fv、scFv、Fab)は、ヒト抗体フラグメントファージディスプレイライブラリーを使用して単離され得る。ヒト抗体フラグメントタンパク質を提示するバクテリオファージ粒子のライブラリーは、MAGタンパク質に対してパニングされる(panned)。MAGに結合する抗体フラグメントを提示するファージは、このライブラリーから維持され、クローン的に増幅される。次いで、ヒト抗体遺伝子が特定のバクテリオファージから切り出され、ヒトIgG定常領域を含むヒトIgG発現構築物中に挿入されて、MAGに特異的な単離されたバクテリオファージ由来の可変領域を有する無傷なヒトIgG分子を形成する。
ドナー抗体は、ドナー抗体の抗原結合特異性によって特徴付けられる種々の変更された抗体を設計および獲得するのに有用な、可変重鎖および/または可変軽鎖のペプチド配列、フレームワーク配列、CDR配列、機能的フラグメントおよびそれらの類似体などの配列、ならびにこれらをコードする核酸配列を付与し得る。
遺伝コードの縮重を考慮して、ドナー抗体の抗原特異性を共有する、可変重鎖および軽鎖のアミノ酸配列とCDR配列、ならびにその機能的フラグメントおよび類似体をコードする種々のコード配列が構築され得る。可変鎖ペプチド配列またはCDRをコードする単離された核酸配列またはそのフラグメントは、第二の免疫グロブリンパートナーと機能的に合わされた場合、変更された抗体(例えば、キメラ抗体もしくはヒト化抗体、または他の操作された抗体)を産生するために使用され得る。
変更された免疫グロブリン分子は、キメラ抗体およびヒト化抗体のような操作された抗体を含む変更された抗体をコードし得る。所望の変更された免疫グロブリンコード領域は、第一の免疫グロブリンパートナー(ヒトフレームワークまたはヒト免疫グロブリン可変領域)中に挿入された、抗MAG抗体、好ましくは高親和性抗体の抗原特異性を有するペプチドをコードする、CDRコード領域を含む。
好ましくは、第一の免疫グロブリンパートナーは、第二の免疫グロブリンパートナーに機能的に連結される。第二の免疫グロブリンパートナーは、上記のように定義され、これには、目的の第二の抗体領域(例えば、Fc領域)をコードする配列が含まれ得る。第二の免疫グロブリンパートナーには、インフレームでまたはリンカー配列によって軽鎖または重鎖の定常領域が融合される、別の免疫グロブリンをコードする配列もまた含まれ得る。MAGの機能的フラグメントまたは類似体に対する操作された抗体は、結合の増強を惹起するように設計され得る。
第二の免疫グロブリンパートナーはまた、第二の免疫グロブリンパートナーが従来の手段によって機能的に連結され得る、上記定義のようなエフェクター因子(非タンパク質担体分子を含む)と結合され得る。
第二の免疫グロブリンパートナー(例えば、抗体配列)とエフェクター因子との間の融合または連結は、任意の適切な手段(例えば、従来の共有結合もしくはイオン結合、タンパク質融合、またはヘテロ二官能性架橋剤(例えば、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなど))によるものであり得る。このような技術は、当技術分野で公知であり、従来の化学および生化学の教科書に容易に記載されている。
さらに、第二の免疫グロブリンパートナーとエフェクター因子との間の所望の量の間隔を単に提供する従来のリンカー配列もまた、変更された免疫グロブリンコード領域へと構築され得る。このようなリンカーの設計は、当業者に周知である。本発明の更なる態様において、本発明者らは、MAGに結合し、その機能を中和する、上記のような1つまたは複数のCDRを有する、ジアボディ(diabodies)(二価または二重特異性)、トリアボディ(triabodies)、テトラボディ(tetrabodies)および他の多価scFVタンパク質種を提供する。
なおさらなる実施形態において、本発明の抗体は、さらなる薬剤に結合され得る。例えば、組換えDNA技術の手順が、完全抗体分子のFcフラグメントまたはCH2-CH3ドメインが、酵素または他の検出可能な分子(すなわち、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子)によって置換された、本発明の操作された抗体を産生するために使用され得る。
第二の免疫グロブリンパートナーはまた、抗MAG抗体の抗原特異性を有するCDR含有配列に対して異種の、非免疫グロブリンペプチド、タンパク質またはそのフラグメントに、機能的に連結され得る。得られたタンパク質は、発現の際に、抗MAG抗原特異性と非免疫グロブリンの特徴との両方を示し得る。この融合パートナーの特徴は、例えば、別の結合ドメインもしくはレセプタードメインのような機能的特徴であり得るか、またはこの融合パートナー自体が治療タンパク質の場合には治療的特徴であり得、あるいはさらなる抗原特徴であり得る。
本発明の別の所望のタンパク質は、全長の重鎖と軽鎖とを有する完全抗体分子、またはその任意の別個のフラグメント(例えば、FabまたはF(ab')2フラグメント)、重鎖二量体、またはその任意の最小の組換えフラグメント(例えば、Fvまたは単鎖抗体(SCA))、または選択されたドナーmAbと同じ特異性を有する任意の他の分子を含み得る。このようなタンパク質は、変更された抗体の形態で使用され得るか、またはその非融合形態で使用され得る。
第二の免疫グロブリンパートナーがドナー抗体とは異なる抗体(例えば、免疫グロブリンのフレームワークまたは定常領域の任意のアイソタイプまたはクラス)由来であれば、操作された抗体が生じる。操作された抗体は、1つの供給源(例えば、アクセプター抗体)由来の免疫グロブリン(Ig)の定常領域および可変フレームワーク領域と、ドナー抗体由来の1つまたは複数の(好ましくは全ての)CDRとを含み得る。さらに、核酸レベルまたはアミノ酸レベルでのアクセプターmAbの軽鎖および/または重鎖可変ドメインフレームワーク領域、あるいはドナーCDR領域の変更(例えば、欠失、置換または付加)が、ドナー抗体の抗原結合特異性を保持するためになされ得る。
このような操作された抗体は、抗MAG mAbの可変重鎖および/または軽鎖の1つ(または両方)、あるいは1つまたは複数の重鎖または軽鎖CDRを使用するように設計される。これらの操作された抗体は、上記定義のような中和抗体であり得る。
このような操作された抗体には、選択されたヒト免疫グロブリンまたはサブタイプのフレームワーク領域を含むヒト化抗体、あるいは抗MAG抗体の機能的フラグメントに融合されたヒトの重鎖および軽鎖の定常領域を含むキメラ抗体が含まれうる。適切なヒト(または他の動物)のアクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に対する相同性によって、従来のデータベース(例えば、KABAT(登録商標)データベース、Los AlamosデータベースおよびSwiss Proteinデータベース)から選択された抗体であり得る。ドナー抗体のフレームワーク領域に対する(アミノ酸基準)相同性によって特徴付けられるヒト抗体は、ドナーCDRの挿入のための重鎖定常領域および/または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適切であり得る。軽鎖定常領域または可変フレームワーク領域を提供し得る適切なアクセプター抗体は、同様の様式で選択され得る。アクセプター抗体の重鎖および軽鎖は、同じアクセプター抗体に由来する必要がないことに留意すべきである。
望ましくは、異種のフレームワーク領域および定常領域は、ヒト免疫グロブリンのクラスおよびアイソタイプ(例えば、IgG(サブタイプ1〜4)、IgM、IgAおよびIgE)から選択される。しかし、アクセプター抗体は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む必要はない。例えば、ヒト免疫グロブリン鎖の一部をコードするDNA配列が非免疫グロブリンのアミノ酸配列(例えば、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子)をコードするDNA配列に融合された遺伝子が構築され得る。
好ましくは、ヒト化抗体において、ヒト重鎖および軽鎖の両方における可変ドメインは、1つまたは複数のCDR置換によって操作されている。6つ全てのCDR、または6つ未満のCDRの種々の組み合わせを使用することが可能である。好ましくは、6つ全てのCDRが置換される。ヒトアクセプター抗体由来の未改変の軽鎖を軽鎖として使用して、ヒト重鎖中のCDRのみを置換することが可能である。あるいは、適合性の軽鎖が、従来の抗体データベースに頼って、別のヒト抗体から選択され得る。操作された抗体の残部は、任意の適切なアクセプターヒト免疫グロブリン由来であり得る。
このように、操作されたヒト化抗体は、好ましくは、天然のヒト抗体またはそのフラグメントの構造を有し、かつ有効な治療的使用に必要な特性の組み合わせを保有する。
操作された抗体は、ドナー抗体の特異性および高い親和性に必ずしも影響することなく、可変ドメインアミノ酸中の変化によってさらに改変され得る(すなわち、類似体)ことが、当業者に理解されるだろう。重鎖および軽鎖のアミノ酸は、可変ドメインフレームワークもしくはCDRまたはその両方のいずれかにおいて、他のアミノ酸によって置換され得ると予想される。
さらに、定常領域は、本発明の分子の選択的特性を増強または低減するために変更され得る。例えば、二量体化、Fcレセプターへの結合、または補体に結合して活性化する能力が挙げられる(例えば、Angalら、Mol. Immunol, 30:105-108 (1993), Xuら、J. Biol. Chem, 269:3469-3474 (1994), Winterら、EP 307,434-Bを参照のこと)。
キメラ抗体である変更された抗体は、他の種(好ましくは両方の鎖についてヒト)由来の免疫グロブリン定常領域と共に、フレームワーク領域を含む非ヒトドナー抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の全体を提供することによって、上記ヒト化抗体とは異なる。
好ましくは、適切なドナーmAbの可変軽鎖および/もしくは重鎖の配列およびCDR、ならびにこれらをコードする核酸配列は、以下のプロセスによって、本発明の変更された抗体(好ましくはヒト化抗体)の構築において利用される。同じまたは類似の技術も、本発明の他の実施形態を生成するために使用され得る。
選択されたドナーmAbを産生するハイブリドーマは、従来のようにクローン化され、そしてその重鎖および軽鎖の可変領域のDNAは、当業者に公知の技術(例えば、Sambrookら、(Molecular Cloning (A Laboratory Manual),第二版, Cold Spring Harbor Laboratory (1989))に記載される技術)によって得られる。ドナーmAbの結合特異性を保持するために必要とされるアクセプターmAbの軽鎖および/または重鎖の可変ドメインフレームワーク領域の少なくともCDRコード領域とその部分とを含む可変重鎖および軽鎖領域、ならびにヒト免疫グロブリン由来の抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来部分は、ポリヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素を使用して得られる。CDRコード領域は、既知のデータベースを使用して、他の抗体との比較によって同定される。
次いで、マウス/ヒトキメラ抗体が調製され、結合能力についてアッセイされ得る。このようなキメラ抗体は、非ヒトドナー抗体のVH領域およびVL領域の全体を、両方の鎖についてのヒトIg定常領域と共に含む。
ヒト抗体由来の重鎖可変領域の相同なフレームワーク領域は、コンピュータ化されたデータベース(例えば、KABAT(登録商標))を使用して同定され得、ドナー抗体に対する相同性を有するヒト抗体は、アクセプター抗体として選択されるだろう。適切な軽鎖可変フレームワーク領域は、同様の様式で設計され得る。
ヒト化抗体は、キメラ抗体に由来し得るか、または好ましくは選択された重鎖および軽鎖のフレームワーク内に、重鎖および軽鎖由来のドナーmAb CDRコード領域を適切に挿入することによって、合成により作製され得る。あるいは、ヒト化抗体は、標準的な突然変異誘発技術を使用して作製され得る。従って、得られたヒト化抗体は、ヒトフレームワーク領域とドナーmAb CDRコード領域とを含む。フレームワーク残基は引き続いて操作され得る。得られたヒト化抗体は、組換え宿主細胞(例えば、COS細胞、CHO細胞またはミエローマ細胞)中で発現され得る。
従来の発現ベクターまたは組換えプラスミドは、宿主細胞における複製および発現ならびに/または宿主細胞からの分泌とを制御し得る従来の調節制御配列と、これらの抗体のコード配列を機能的に配置することによって生成される。調節配列には、プロモーター配列(例えば、CMVプロモーター)および他の既知の抗体に由来し得るシグナル配列が含まれる。同様に、相補的抗体の軽鎖または重鎖をコードするDNA配列を有する第二の発現ベクターが生成され得る。好ましくは、この第二の発現ベクターは、各ポリペプチド鎖が機能的に発現されることを可能な限り確実にするように、コード配列および選択マーカーが考慮される限り、それ以外は第一の発現ベクターと同一である。あるいは、変更された抗体についての重鎖および軽鎖のコード配列は、単一のベクター上に存在し得る。
選択された宿主細胞を、第一のベクターと第二のベクターとの両方を用いて従来技術によって同時トランスフェクトし(または単一のベクターによって単純にトランスフェクトし)て、組換えまたは合成の軽鎖および重鎖の両方を含む本発明のトランスフェクトされた宿主細胞を作出する。次いで、このトランスフェクトされた細胞を、従来技術によって培養して、本発明の操作された抗体を産生する。組換え体の重鎖および/または軽鎖の両方の結合を含むヒト化抗体は、適切なアッセイ(例えば、ELISAまたはRIA)によって、培養物からスクリーニングされる。同様の従来技術が、他の変更された抗体および分子を構築するために使用され得る。
本発明の方法および組成物の構築において使用されるクローニングステップおよびサブクローニングステップに適切なベクターは、当業者によって選択され得る。例えば、従来のpUCシリーズのクローニングベクターが使用され得る。1つのベクターpUC19は、Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom)またはPharmacia (Uppsala, Sweden)のような供給業者から市販される。さらに、容易に複製し得、クローニング部位および選択遺伝子(例えば、抗生物質耐性)を豊富に有し、かつ容易に操作される任意のベクターが、クローニングのために使用され得る。従って、クローニングベクターの選択は、本発明の限定要因ではない。
同様に、抗体の発現のために使用されるベクターは、任意の従来のベクターから、当業者によって選択され得る。これらのベクターはまた、選択された宿主細胞において異種のDNA配列の複製と発現とを指令する、選択された調節配列(例えば、CMVプロモーター)を含む。これらのベクターは、抗体をコードする上記DNA配列または変更された免疫グロブリンコード領域を含む。さらに、これらのベクターは、即座の操作のために所望される制限部位の挿入によって改変された、選択された免疫グロブリン配列を組み込み得る。
発現ベクターもまた、異種DNA配列(例えば、哺乳動物のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子(DHFR))の発現を増幅するのに適切な遺伝子によって特徴付けられ得る。他の好ましいベクター配列には、例えばウシ成長ホルモン(BGH)由来のポリAシグナル配列と、βグロビンプロモーター配列(betaglopro)とが含まれる。本明細書において有用な発現ベクターは、当業者に周知の技術によって合成され得る。
このようなベクターの成分(例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列など)は、選択された宿主における組換えDNAの産物の発現および/または分泌を指令する際の使用のために、商業供給源もしくは天然供給源から得られ得るか、または公知の手順によって合成され得る。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母および真菌での発現のための、多数の型が当技術分野で公知の他の適切な発現ベクターもまた、この目的のために選択され得る。
本発明はまた、抗体またはその変更された免疫グロブリン分子のコード配列を含む組換えプラスミドでトランスフェクトされた細胞系を包含する。これらのクローニングベクターのクローニングおよび他の操作に有用な宿主細胞もまた、従来型のものである。しかし、最も望ましくは、大腸菌(E.coli)の種々の株由来の細胞が、本発明の変更された抗体の構築におけるクローニングベクターの複製および他のステップのために使用される。
本発明の抗体の発現に適切な宿主細胞または細胞系は、好ましくは、例えば、NS0、Sp2/0、CHO、COS、繊維芽細胞(例えば、3T3)およびミエローマ細胞のような哺乳動物細胞であり、より好ましくはCHOまたはミエローマ細胞である。このように、分子がヒトグリコシル化パターンで改変されるのを可能にするヒト細胞が使用され得る。あるいは、他の真核生物細胞系が使用され得る。形質転換、培養、増幅、スクリーニングならびに産物の産生および精製に適切な哺乳動物宿主細胞および方法の選択は、当技術分野で公知である。例えば、上記で引用したSambrookらを参照のこと。
細菌細胞は、本発明の組換えFabの発現に適切な宿主細胞として有用でありうると判明している(例えば、Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)を参照のこと)。しかし、細菌細胞において発現されたタンパク質が折り畳まれない形態もしくは不適切に折り畳まれた形態、または非グリコシル化形態になる傾向に起因して、細菌細胞中で産生される任意の組換えFabは、抗原結合能の保持についてスクリーニングされなければならないだろう。細菌細胞によって発現される分子が適切に折り畳まれた形態で産生されれば、その細菌細胞は望ましい宿主となろう。例えば、発現のために使用される種々の株の大腸菌は、バイオテクノロジーの分野で宿主細胞として周知である。枯草菌(B.subtilis)、ストレプトミセス(Streptomyces)、他の桿菌などの種々の株もまた、この方法において使用され得る。
所望の場合、当業者に公知の酵母細胞の株、ならびに昆虫細胞(例えば、ショウジョウバエ(Drosophila)および鱗翅目(Lepidoptera))およびウイルスの発現系もまた、宿主細胞として利用可能である。例えば、Millerら、Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986)とこの文献中で引用される参考文献を参照のこと。
ベクターが構築され得る一般的な方法、本発明の宿主細胞を生成するために必要なトランスフェクション方法、およびこのような宿主細胞から本発明の変更された抗体を産生するために必要な培養方法は、全て従来技術である。同様に、一旦産生されると、本発明の抗体は、当技術分野の標準手順(硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む)に従って、細胞培養物の内容物から精製され得る。このような技術は、当業者の範囲内であり、本発明を限定しない。例えば、変更された抗体の調製は、WO99/58679およびWO96/16990に記載されている。
抗体発現のなお別の方法は、米国特許第4,873,316号に記載されているような、トランスジェニック動物における発現を利用し得る。この特許は、動物のカゼインプロモーターを使用する発現系に関し、このプロモーターは、哺乳動物中にトランスジェニックで組み込まれる場合、メスに、その乳汁中に所望の組換えタンパク質を産生させる。
所望の方法によって一旦発現されると、次いで、抗体は、適切なアッセイの使用によって、in vitro活性について試験される。現在、従来のELISAアッセイ形式は、MAGに対する抗体の質的および量的結合を評価するために使用される。さらに、他のin vitroアッセイも、通常のクリアランス機構にもかかわらず身体における抗体の永続性を評価するために実施されるその後のヒト臨床試験の前に、中和効力を確認するために使用され得る。
本発明の治療剤は、予防剤としてまたは損傷後に、あるいは他に必要な場合に投与され得る。治療の用量および持続期間は、ヒト循環における本発明の分子の相対的持続期間に関し、患者の治療されている状態および全体的健康に依存して、当業者によって調整され得る。
本発明の治療剤の投与様式は、宿主に対してその薬剤を送達する任意の適切な経路であり得る。本発明のアンタゴニストおよび抗体、ならびに医薬組成物は、非経口投与(すなわち、皮下、筋内、静脈内または鼻腔内)に特に有用である。
本発明の治療剤は、薬学的に許容される担体中の活性成分として本発明のアンタゴニストまたは抗体の有効量を含む医薬組成物として調製され得る。本発明の予防剤において、注射用に準備された形態の、好ましくは生理学的pHに緩衝化された操作された抗体を含む水性懸濁物または水溶液が好ましい。非経口投与用の組成物は、一般に、薬学的に許容される担体(好ましくは水性担体)中に溶解された、本発明のアンタゴニストもしくは抗体またはそのカクテルの溶液を含む。種々の水性担体(例えば、0.9%生理食塩水、0.3%グリシンなど)が使用され得る。これらの溶液は、滅菌であり、一般に粒子状の物質を含まない。これらの溶液は、従来の周知の滅菌技術(例えば、濾過)によって滅菌され得る。これらの組成物は、生理学的条件に近づけることが必要な場合、薬学的に許容される補助物質(例えば、pH調整剤および緩衝化剤など)を含み得る。このような医薬処方物中の本発明のアンタゴニストまたは抗体の濃度は、選択された特定の投与様式に従って、広範に(すなわち、約0.5重量%未満、通常約1重量%または少なくとも約1重量%〜15重量%または20重量%程度)変動し得、流体の体積、粘度などに基づいて主に選択されるだろう。
従って、筋内注射用の本発明の医薬組成物は、1mLの滅菌緩衝化水と、約1ng〜約100mg、例えば、約50ng〜約30mg、またはより好ましくは約5mg〜約25mgの本発明のアンタゴニストまたは抗体とを含むように調製され得る。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約250mlの滅菌リンゲル溶液と、約1mg〜約30mg、好ましくは5mg〜約25mgの本発明の操作された抗体を含むように作製され得る。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は周知であるか、または当業者に明らかであり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science,第15版, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania中により詳細に記載されている。
本発明の治療剤は、医薬調製物中にある場合、単位投与形態で存在することが好ましい。適切な治療有効用量は、当業者によって容易に決定され得る。ヒトにおいて脳卒中および他の神経学的疾患を効果的に治療するために、体重70kg当たり700mgまでの、本発明のアンタゴニストまたは抗体の1用量が、非経口的に、好ましくは静脈内(i.v.)または筋内(i.m.)に投与されるべきである。必要に応じて、このような用量は、医師によって適切に選択された適切な時間間隔で繰り返され得る。
本明細書中に記載される抗体は、保存のために凍結乾燥されて、使用前に適切な担体中で再構成され得る。この技術は、従来の免疫グロブリンで有効であることが示されており、当技術分野で公知の凍結乾燥および再構成の技術が使用され得る。
別の態様において、本発明は、本発明の抗MAG抗体またはその機能的フラグメントと薬学的に許容される担体とを含む、脳卒中および他の神経学的疾患の治療または予防のための医薬組成物を提供する。
なおさらなる態様において、本発明は、本発明の抗MAG抗体またはその機能的フラグメントと薬学的に許容される担体とを含む、脳卒中または他の神経学的疾患に罹患しているかまたはその発症の危険性のあるヒト患者において、神経変性を阻害するため、および/または機能回復を促進するための医薬組成物を提供する。
以下の実施例は、本発明を実証する。
実施例1-脳卒中モデルにおける抗MAG抗体
材料および方法
抗MAGモノクローナル抗体
抗MAGモノクローナル抗体は、Chemicon製のマウス抗ニワトリMAG抗体であるMAB 1567であった。この抗体は、以下の特徴を有する:
抗原:ミエリン関連糖タンパク質(ヒト、マウス、ラット、ウシ、ニワトリ、カエル)
アイソタイプ:IgG1
中和能: DeBellardら(1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tangら(1997) Mol. Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe KおよびLundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262を参照のこと。
対照IgG1 mabは、R+D Systemsから購入した。
大脳脳室内カニューレ挿入(研究1についてのみ)
ハロタン麻酔下で、大脳脳室内(i.c.v.)カニューレを、左大脳側脳室に配置した(座標: PaxinosおよびWatson、1986に従って、正中線から1.6mm、ブレグマから0.8mm尾側、頭蓋骨表面から4.1mm、切歯棒は0の下-3.2mm)。全てのラットを1匹ずつ収容して、ガイドカニューレまたはダミーカニューレへの損傷を回避した。手術の7日後、正確なカニューレ配置を、アンギオテンシンII(100ng、Simpsonら、1978)に応答した激しい飲水によって確認した。9日後、動物は大脳虚血を受けた。
一過性局所大脳虚血
一過性(90分)の局所大脳虚血を、オスSprague Dawleyラット(各々、体重300〜350gの間)において誘導した。これらの動物を、5%ハロタン、60%亜酸化窒素および30%酸素の混合物で最初に麻酔し、フェイスマスクに配置し、引き続き1.5%ハロタンで麻酔を維持した。中大脳動脈閉塞(MCAO)を、以前に記載されたように、腔内糸上げ技術を使用して実施した(Zea Longaら、 1989)。手術手順中、動物を常温に維持し、インキュベータ中で1時間回復させ、その後1匹ずつ収容した。閉塞の1時間後に3の神経学的スコアを有する動物のみを、研究に含めた(5点のスコアリングシステムを使用して評価した場合:0、欠損なし;1、対側性反射;2、握力の弱化;3、旋回;4、動けず;5、死亡)。動物を1週間まで維持し、その時点で、0.9%生理食塩水とその後の100mMホスフェート緩衝液中の4%パラホルムアルデヒドの経心的灌流によって屠殺した。脳を4%パラホルムアルデヒド中にて4℃で48時間にわたって後固定し、その時点で、脳を頭蓋骨から取り出して、ラット脳マトリックスを使用して2mmのブロックに切断した。次いで、これらの2mm切片を、Shandon Citadel 1000組織プロセッサを使用してパラフィン包埋し、ミクロトームを使用して6μm切片に切断し、ポリL-リジン被覆したスライドに載せた。次いで、これらの切片を、クレジルファストバイオレット(Cresyl Fast Violet(CFV))染色のために処理した。
用量レジメン
抗MAGモノクローナル抗体およびマウスIgG1アイソタイプ対照抗体を、滅菌0.9%塩化ナトリウムに対して一晩透析して、適切に濃縮した。
研究1: MCAOの1時間後、24時間後および72時間後に、動物に2.5μgの抗MAG mabまたは2.5μgのマウスIgG i.c.v. (1用量当たり5μl)を投与した。
研究2:MCAOの1時間後および24時間後に、動物に200μgの抗MAG mabまたは200μgのマウスIgG i.v.を投与した。
研究者は各投薬溶液の同定について盲検とした。
神経学的評価
大脳虚血の誘導前に、研究1用のラットは、梁歩行(beam walking)および粘着ラベル試験の訓練を受けた。両方の試験の基準に達しない動物を、更なる研究から除外した。訓練後、残りの動物を、能力に従って2つのバランスをとった群に層化した。神経学的評価の間、研究者は、動物の処置群について盲検化した。
両側性粘着ラベル試験
両側性粘着ラベル試験(Schallertら、Pharmacology Biochemistry and Behaviour 16: 455-462, (1983))を使用して、対側無視/同側注視を評価した。これは、ヒト脳卒中患者において観察される触覚消衰のモデルである(Roseら、1994)。この試験は、以前に詳細に記載されている(Hunterら、Neuropharmacology 39: 806-816 (2000); Virleyら、Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 20: 563-582 (2000))。簡潔には、丸い粘着性の紙ラベルを、無作為な配置順序(左、右)で等しい圧力にて前肢の無毛領域の周りに堅固に配置した。訓練セッションを、MCAOの前に6日間にわたって実施し、6日目のデータを、手術前のベースライン(0日目)として利用した。動物に、MCAOの24時間後および7日後に2つの試験を与えた。データは、2つの試験の平均を示す。ラベルを接触させ除去する潜時を記録し、ログランク検定を使用して分析した(Cox, J. Royal Statistical Society B 34: 187-220 (1972))。
梁歩行
梁歩行を、以前に詳細に記載されたように(Virleyら、Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 20: 563-582 (2000))、高架梁(100cm)(直径2.3cm、床から48cm)を渡って移動した距離によって、後肢と前肢との協調の測定値として使用した。ラットを、最初から最後まで梁を横切るように訓練した。試験のために、各ラットに、MCAOの24時間後および7日後に2つの試験を与えた。データは、2つの試験の平均を示す。統計的分析はANOVAであり、その後スチューデントt検定を行った。
27点の神経学的スコア(研究-1)
この研究は、握力測定値(良好な右前肢握力についてスコア2、弱い握力についてスコア1)を加えた、以前に記載されたような(Hunterら、Neuropharmacology 39: 806-816 (2000))、肢の配置、目で見た前肢の伸び、水平バー、対側回転、傾斜平面、正向反射、対側反射、運動性および全体的状態を含む神経学的状態を評価するための一連の試験からなる。正常動物についての合計スコアは27である。
研究2について、この試験は、さらに以下を改変した:握力-正常スコア3、良好-2、弱い-1、非常に弱い-0;運動性-正常スコア4、優れている-3、非常に良好-2、良好-1、普通-0;全体的状態-正常スコア4、優れている-3、非常に良好-2、良好-1、普通-0;旋回-なしの場合のスコア5、一方に偏る場合のスコア4、大きい旋回-3、中程度の旋回-2、小さい旋回-1、スピン-0)。正常な動物の合計スコアは32である。
両方の研究において、動物を、MCAOの1時間後、24時間後、48時間後および7日後に試験し、それぞれ、健康な正常動物のスコアは27または32である。データは、中央値として示す。統計的分析は、Kruskil Wallis ANOVAであった。
病変評価
研究1-各動物について、病変面積を、脳における予め決定された3つのレベル(それぞれ、ブレグマから0mm、-2.0mmおよび-0.6mm)由来の切片において評価した。ニューロン損傷は、クレジルファストバイオレット染色を使用して評価し、損傷面積は、Optimas 6.1画像化パッケージを使用して測定した。データは、平均面積(mm2)±標準誤差(sem)として示す。
研究2-各動物について、病変面積を、脳における予め決定された7つのレベル(+3mmから-8mm w.r.t. ブレグマ)由来の切片で評価した。ニューロン損傷は、クレジルファストバイオレット染色を使用して評価し、損傷面積は、Optimas 6.1画像化パッケージを使用して測定した。データは、平均面積(mm2)±標準誤差として示す。
結果
研究1-抗MAG mabの大脳脳室内(i.c.v.)投与
神経学的スコア
MCAOの1時間後、両方の処置群の動物は、神経学的スコアにおいて顕著な減少を示した(各群におけるスコア中央値12)。この時点で、群間に有意差はなかった。しかし、MCAOの24時間後(p=0.02)、48時間後(p=0.005)および7日後(p=0.006)、抗MAG mab(MCAOの1時間後、24時間後および72時間後に2.5μg)で処置した動物は、対照IgGで処置した動物と比較して、有意に改善された合計神経学的スコアを示した。IgG1処置群におけるMCAOの24時間後、48時間後および7日後の中央神経学的スコアは、抗MAG mab処置した動物における19.5、21.5および22と比較して、それぞれ、15、14および18であった。合計スコアを含む個々の挙動のさらなる分析において、この有意な改善は、以下の試験における改善された能力に主に起因した:肢の配置(24時間、p=0.045;48時間、p=0.016;7日、p=0.008)、握力(24時間、p=0.049;48時間、p=0.0495;7日、p=0.243)、運動性(24時間、p=0.199;48時間、p=0.012;7日、p=0.067)、水平バー(24時間、p=0.065;48時間、p=0.005;7日、p=0.016)、傾斜平面(24時間、p=0.006;48時間、p=0.006;7日、p=0.169)、目で見た前肢の伸び(48時間、p=0.049;7日、p=0.049)および旋回の程度(24時間、p=0.417;48時間、p=0.034;7日、p=0.183)。
梁歩行
手術前に、全ての動物を、梁(100cm)を渡るように訓練した。手術の24時間後に、手術前の値と比較して、抗MAG(50±18cm)およびIgG1(22±14cm)で処置した動物の両方において、梁の上の移動距離について、優位な減少がみられた。有意ではないものの、抗MAG処置した動物がtMCAOの24時間後に、IgG1処置した動物の2倍の距離を移動したという点で、抗MAG処置した動物は、IgG1処置した動物を超える顕著な改善を示した。しかし、手術の7日後、両方の群が経時的に顕著な改善を示したものの、IgGで処置した動物の能力は、ベースラインと比較して、有意に減少したままであった(55±15cm; p=0.005)。しかし対照的に、MCAOの7日後、抗MAG mab(MCAOの1時間後、24時間後および72時間後、大脳脳室内に2.5μg)で処置した動物の能力は、ベースラインから有意には異ならなかった(75±15cm;p=0.07)。このデータは、抗MAG mab処置が、IgG1処置した対照マウスと比較して、梁歩行課題の回復を加速させたことを示す。
粘着ラベル
手術前に、各処置群の動物で、ラベルを迅速に接触させて各前肢から除去したところ、処置前の群において有意差はなかった(表1)。MCAOの24時間後および7日後に、各処置群における左肢の接触の潜時は、比較的変更されないままで維持されたが、右の潜時は顕著に増加した。しかし、抗MAGで処置した動物での除去時間とIgG1で処置した動物での除去時間との間には、有意差はなかった。さらに、MCAOの24時間後、左前肢および右前肢の両方からの除去の潜時は、ベースラインと比較して両方の処置群において有意に増加したが、抗MAG処置した動物においては、左肢からの除去の潜時は、IgG1処置した動物の潜時よりも有意に短かった(p=0.03)。また、IgG1で処置した動物と比較して、抗MAGで処置した動物における右肢からの除去の潜時は減少する傾向があった(p=0.08)(表1)。7日目に、各前肢についての除去時間の潜時が24時間目での潜時と比較して減少したという点において、IgG1で処置した動物においてある程度の回復がみられた(表1)。このデータは、抗MAG mabでのラットの処置が、tMCAO後のこの粘着ラベル試験における回復を加速することを示唆する。
Figure 2006512899
病変面積測定値
抗MAG mab i.c.vの投与は、tMCAOの7日後に試験した場合、等量のマウスIgG1で処置した動物と比較して、試験した3つの脳レベルのうち2つにおいて、病変面積を有意に減少させた(表2)。
Figure 2006512899
研究2-静脈内(i.v.)投与
神経学的スコア
MCAOの1時間後および24時間後に、両方の群の動物は神経学的スコアにおける有意な減少を示した。この時点では群間に有意差はなく、抗MAG mab処置およびIgG1処置の24時間後のスコア中央値は、それぞれ、20および18であった(p=0.5)。MCAOの48時間後、抗MAG mab(MCAOの1時間後および24時間後、静脈内で200μg)で処置した動物は、肢の配置(p=0.048)および握力(p=0.033)において有意な改善を示した。大脳虚血の発症の7日後に、抗MAG mabで処置した動物は、改善し続け(肢の配置p=0.041;握力、p=0.048;運動性、p=0.05)、マウスIgG1で処置した動物(スコア中央値23、p=0.047)と比較して、合計神経学的スコアにおける有意な改善(スコア中央値25)を示した。
病変面積測定値
MCAOを静脈内投与した場合、抗MAG抗体は、MCAOの7日後に試験した場合、7つの予め決定された脳レベル(+3〜-8 mm w.r.t. ブレグマ)のうち5つにおいて、アイソタイプ対照と比較して、病変面積を有意に減少させた。
Figure 2006512899
結論
ラットにおいて、一過性の中大脳動脈閉塞の後に、CSFに直接にまたは静脈内のいずれかに投与された抗MAGモノクローナル抗体は、対照処置した動物と比較して、細胞死の面積を低減し、かつ機能回復を改善した。これらの研究において見られた神経保護の程度は、この効果が、ニューロン予備を生じないのと同様に、軸索発芽に寄与できないことを示唆する。MCAOの24時間後および48時間後に見られる機能回復の改善は、おそらく、対照処置された動物と比較して、この抗体によって付与された神経保護の程度を反映する。しかし、これらの動物は経時的にさらに改善するようであり、このことは、MAG活性の遮断もまた、経時的に機能回復を増強し得ることを示唆する。
本明細書中に示される研究は、MAG作用の遮断が、ラット脳卒中モデルにおいて神経保護と機能的回復の増強との両方を提供するという証拠を提供し、従って、抗MAG抗体が、脳卒中後の急性の神経保護および/または機能回復の促進のための潜在的な治療剤を提供する。静脈内経路を介して投与された低量の抗体と、その結果生じた抗体の低い血清レベルとは、続いて、抗体の貫通に対する血液脳関門の制限に起因した、脳における非常に低い抗体濃度を示唆する。しかし、驚くべきことに、これにより、なお、神経保護と機能回復の増強との両方が観察される。抗MAG抗体はまた、細胞および/または神経線維の変性が明らかな他の神経学的障害(例えば、脊髄損傷、外傷性脳損傷、末梢神経障害、アルツハイマー病、前頭側頭型痴呆(タウオパシー)、パーキンソン病、ハンティングトン病および多発性硬化症)の治療においても潜在的な用途を有する。以下の実施例において、本明細書において開示されるキメラ抗体およびヒト化抗体のCDRは、実施例1の抗体のCDRである。
実施例2-キメラ抗体
変更された抗体には、別種由来の定常領域に連結された、1つの種由来の可変領域を含むキメラ抗体が含まれる。本発明のマウス-ヒトキメラ抗MAG免疫グロブリン鎖の例は、図1、図2および図3に提供される。ヒトのIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、IgDの定常領域を使用するマウス-ヒトキメラが産生され得、マウス可変領域を非ヒト種由来の重鎖または軽鎖定常領域と結合させるキメラであり得る。
図1(配列番号27)は、マウス抗MAG重鎖可変領域が機能的免疫グロブリン分泌シグナル配列と、ヒトIgG1定常領域の変更された形態とに結合した、キメラ免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列を提供し、この配列において、Kabat残基248および250は、FcγRIおよび補体タンパク質C1qに対する結合のエフェクター機能を不能にするために、アラニンに突然変異されている(Duncan, A.R.およびWinter, G. Localization of the C1q binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738-740, 1988. Duncan, A.R., Woolf, J.M., Partridge, L.J., Burton, D.R. およびWinter, G. Localisation of the binding site for human FcR1 on IgG. Nature 332, 563-564, 1988)。このような突然変異は、特定の治療効果(例えば、溶解性エフェクター機構を活性化することなしの、抗原への結合および抗原機能の遮断)を達成するために、変更された抗体の特性をカスタマイズするために、必要に応じて生成される。
図2(配列番号28)は、マウス抗MAG軽鎖可変領域が、機能的免疫グロブリン分泌シグナル配列とヒトκ定常領域とに結合した、キメラ免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列を提供する。
同様に、抗MAG可変領域は、エフェクター機能を不能にする突然変異を欠く免疫グロブリン定常領域に結合され得る。図3(配列番号29)は、マウス抗MAG重鎖可変領域が、機能的免疫グロブリン分泌シグナル配列とヒトIgG1定常領域の野生型形態とに結合した、キメラ免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列を提供する。
図1〜3に提供される情報から、これらのキメラ鎖をコードするcDNA挿入物を、当業者に周知の標準的な分子生物学的技術によって調製し得る。簡潔には、遺伝コードを、所望のアミノ酸をコードするヌクレオチドコドンを同定するために使用し、キメラタンパク質をコードする実際のcDNA配列を作出する。このcDNA挿入物を特定の生物において発現させることが望まれる場合、特に好まれるコドンは、既知のコドン用法の偏りに従って選択され得る。次いで、所望のヌクレオチド配列を、重複する合成オリゴヌクレオチドを含むテンプレート(これは、コンティグ(contig)のように、所望の配列を示す)のPCR増幅によって合成する。得られた産物はまた、発現またはさらなる操作のために適切なプラスミドへのクローニングを容易にするために制限部位を付与するように、PCRまたは突然変異誘発によって改変され得る。
実施例3-キメラ抗体は、ELISAにおいてラットMAGに結合する
本発明の軽鎖および重鎖のCDRを含むキメラ抗MAG抗体を、CHO細胞の一過的トランスフェクションによって産生した。これに関して、Transfastトランスフェクション試薬(Promega; E2431)を使用し、製造業者の指示書に従ってトランスフェクションを実行した。簡潔には、6ウェルの培養プレートの1ウェル当たり約106個のCHO細胞をプレートした。次の日、適切な重鎖または軽鎖をコードする哺乳動物発現ベクターDNAを、培地(Glutamaxを有するOptimem1; Gibco #51985-026)中で1:1の比(合計5μgのDNA)で混合した。Transfastトランスフェクション試薬を添加して、その溶液をコンフルエントな細胞層を有するウェルに移した。細胞インキュベータ中で37℃にて1時間の後、DNA/Transfast混合物を、2mlのOptimem培地と共に重ねて、インキュベータ中で48〜72時間放置した。上清を回収し、遠心分離によって清浄化して、0.2μmのフィルタを通過させた。CHO細胞培養上清中の抗体濃度を、ELISAによって決定し、約0.5μg/mlであると概算した。MAG結合について、市販のラットMAG-Fcを使用した。ヒトFcとの融合に起因して、結合したキメラ抗体は、抗ヒトIgG二次抗体を使用して検出できなかった。その代わり、抗ヒトκ軽鎖特異的抗体を使用した。図4は、このキメラ抗体が、1/64希釈でさえ、MAGに結合することを示す。無関係ヒト化抗体およびモックトランスフェクトした細胞由来の培養上清は、このアッセイにおいてシグナルを全く生じなかった。
手順:
ELISAマイクロタイタープレート(Nunc Maxisorp)を、PBS中1μg/mlのラットMAG-Fc融合タンパク質(R&D systems; 538-MG)で、4℃にて一晩被覆した。プレートをPBSで2回洗浄し、次いで、PBS/BSA (1% w/v)で室温(RT)にて1時間ブロッキングした。一過的にトランスフェクトしたCHO細胞由来の培養上清を、0.2μmのフィルタを通過させ、ニート上清で開始して1/64希釈まで、PBS/BSA中に連続希釈した。サンプル希釈物を、室温で1時間放置した。次いで、プレートをPBS/Tween 20 (0.1% v/v)で3回洗浄した。検出抗体は、PBS/BSA中に1/2000で希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的‐ペルオキシダーゼコンジュゲート(Sigma A-7164)であった。この検出抗体を室温で1時間インキュベートし、プレートを上記のように洗浄した。基質溶液(Sigma Fast OPD P-9187)を添加して、適切な発色が検出されるまでインキュベートし、次いで、3M H2SO4を使用して停止させた。発色を、490nmで読み取った。
実施例4-ヒト化抗体
変更された抗体には、ヒト定常領域に連結されたヒト化可変領域を含むヒト化抗体が含まれる。本発明のヒト化抗MAG免疫グロブリン鎖の例は、図5に提供される。ヒトのIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、IgD定常領域を使用したヒト化抗体が産生され得る。
図5(配列番号30)は、ヒト化抗MAG重鎖可変領域が、機能的免疫グロブリン分泌シグナル配列とヒトIgG1定常領域の変更された形態とに結合した、ヒト化免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列の例を提供し、この配列において、Kabat残基248および250は、FcγRIおよび補体タンパク質C1qへの結合のエフェクター機能を不能にするために、アラニンに突然変異されている(Duncan, A.R.およびWinter, G. Localization of the C1q binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738-740, 1988. Duncan, A.R., Woolf, J.M., Partridge, L.J., Burton, D.R.およびWinter, G. Localisation of the binding site for human FcR1 on IgG. Nature 332, 563-564, 1988)。このような突然変異は、特定の治療効果(例えば、溶解性エフェクター機構を活性化することなしの、抗原への結合および抗原機能の遮断)を達成するために、変更された抗体の特性をカスタマイズするために、必要に応じて生成される。
図5(配列番号31)はまた、ヒト化抗MAG軽鎖可変領域が、機能的免疫グロブリン分泌シグナル配列とヒトκ定常領域とに結合された、ヒト化免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列の例も提供する。
同様に、抗MAG可変領域は、エフェクター機能を不能にする突然変異を欠く免疫グロブリン定常領域に結合され得る。図5(配列番号32)は、ヒト化抗MAG重鎖可変領域が、機能的免疫グロブリン分泌シグナル配列と、ヒトIgG1定常領域の野生型形態とに結合した、ヒト化免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列を提供する。
図5に提供される情報から、これらのヒト化鎖をコードするcDNA挿入物を、当業者に周知の標準的な分子生物学的技術によって調製し得る。簡潔には、遺伝コードを、所望のアミノ酸をコードするヌクレオチドコドンを同定するために使用し、このタンパク質をコードする実際のcDNA配列を作出する。このcDNA挿入物を特定の生物において発現させることが望まれる場合、特に好まれるコドンは、既知のコドン用法の偏りに従って選択され得る。次いで、所望のヌクレオチド配列を、重複する合成オリゴヌクレオチドを含むテンプレート(これは、コンティグのように、所望の配列を示す)のPCR増幅によって合成する。得られた産物はまた、発現またはさらなる操作のために適切なプラスミドへのクローニングを容易にするために制限部位を付与するように、PCRまたは突然変異誘発によって改変され得る。
実施例5:ヒト化抗MAG抗体は、ELISAにおいて、ラットおよびヒトのMAGに結合する
1)9つのヒト化重鎖と軽鎖との組み合わせについて、正規化された量の培養上清のラットMAG-Fc融合タンパク質に対する、直接結合ELISA
本発明の軽鎖および重鎖のCDRを含むヒト化抗MAG抗体を、CHO細胞の一過的トランスフェクションによって産生した。これに関して、Transfastトランスフェクション試薬(Promega; E2431)を使用し、製造業者の指示書に従ってトランスフェクションを実行した。簡潔には、6ウェルの培養プレートの1ウェル当たり約106個のCHO細胞をプレートした。次の日、適切な重鎖または軽鎖をコードする哺乳動物発現ベクターDNAを、培地(Glutamaxを有するOptimem1; Gibco #51985-026)中で1:1の比(合計5μgのDNA)で混合した。Transfastトランスフェクション試薬を添加して、その溶液をコンフルエントな細胞層を有するウェルに移した。細胞インキュベータ中で37℃にて1時間の後、DNA/Transfast混合物を、2mlのOptimem培地と共に重ねて、インキュベータ中で48〜72時間放置した。上清を回収し、遠心分離によって清浄化して、0.2μmのフィルタを通過させた。9つの重鎖可変と軽鎖可変との組み合わせを、以下の表に示される配列から産生し、IgG1重鎖定常領域は、配列番号に従って機能的であった。
Figure 2006512899
抗体濃度を、ELISAによって決定し、アッセイにおいて使用した上清の量を、(培養上清の濃度に依存して)250ng/mlまたは500ng/mlの出発濃度に対して正規化した。抗原として、市販のラットMAG-Fc(R&D Systems; 538-MG)を使用した。ヒトFcとのこの抗原の融合に起因して、結合したキメラ抗体は、一般的な抗ヒトIgG二次抗体を使用して検出できなかった。その代わり、抗ヒトκ軽鎖特異的抗体を使用した。図6は、本明細書中で試験した9つ全てのヒト化抗体が、非常に類似した結合曲線で、約4ng/mlまでラットMAGに結合したことを示す。参照として使用したキメラ抗体は、本明細書中で試験したヒト化抗体の群内に入る結合特徴を示した。絶対的ではないものの、このことは、本明細書中で試験したヒト化抗体の親和性が、本明細書中で参照として使用した非ヒト化キメラ抗体の親和性範囲内に非常に厳密に入ることを示唆し得る。
手順
96ウェルのNunc Maxisorpプレートを、PBS中のラットMAG-Fc融合タンパク質(1μg/ml; R&D Systems; Cat.No. 538-MG)を用いて、4℃で一晩被覆した。プレートを、Tween20を含むPBS(0.1% v/v; PBST)で2回洗浄し、室温(RT)にて1時間、BSAを含むPBS(1%w/v)でブロッキングした。培養上清の可変量を、ブロッキング緩衝液中で連続希釈し、約500ng/mlまたは250ng/mlで開始して、ブロッキングしたウェルに添加した。上清の抗体濃度は、各培養上清中に存在するヒト化抗体の量を測定する独立したアッセイに基づいた。キメラマウス-ヒト(非ヒト化)抗体もまた、参照として含めた。抗体サンプルを、室温にて1時間インキュベートし、次いでPBSTで3回洗浄した。ブロッキング緩衝液中に1/5000希釈した二次抗体(ヤギ抗ヒト軽鎖特異的‐ペルオキシダーゼコンジュゲート;Sigma A-7164)を添加し、室温で1時間インキュベートした。ウェルを上記のように3回洗浄し、結合を基質(指示に従って溶解させたOPD錠剤;Sigma P-9187)の添加によって検出した。発色をモニタリングし、反応を、3M H2SO4を使用して停止させた。発色を、490nmで読み取った。
2)2つの精製ヒト化抗MAG抗体重鎖-軽鎖組み合わせの、ラットMAG-Fc融合タンパク質への直接結合ELISA
重鎖と軽鎖の可変領域の組み合わせ(BVh1/CVl1およびBVh3/CVl3(表図5))と、配列番号30によって例示されるような突然変異IgG1定常領域(これは、BVh1/CVl1突然変異IgG1であり、当業者は、BVh3/CVl3等価物についての配列を容易に導き得る)とからなる2つのヒト化抗体を、実施例3に記載される一過的トランスフェクションのスケールアップ版によって産生し、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製した。精製した抗体材料をPBSに対して透析し、濃度をOD280読み取りによって決定した。抗体濃度を5000 ng/mlに調整して、ラットMAG-Fc結合ELISAにおいて連続希釈物として使用した。図7は、精製抗体材料がラットMAG-Fcに結合することを示し、本明細書中で試験した両方の重鎖および軽鎖の可変領域の組み合わせが、非常に類似していることを示す。
方法:
96ウェルのNunc Maxisorpプレートを、PBS中のラットMAG-Fc融合タンパク質(2.5μg/ml; R&D Systems; Cat.No. 538-MG)を用いて、4℃で一晩被覆した。プレートを、Tween20を含むPBS(0.1% v/v; PBST)で2回洗浄し、室温(RT)にて1時間、BSAを含むPBS(1%w/v)でブロッキングした。精製したヒト化抗体を、ブロッキング緩衝液中5μg/mlの出発濃度に調整し、次いで連続希釈した。抗体サンプルを、室温にて1時間インキュベートし、次いでプレートをPBSTで3回洗浄した。ブロッキング緩衝液中に1/5000希釈した二次抗体(ヤギ抗ヒト軽鎖特異的‐ペルオキシダーゼコンジュゲート;Sigma A-7164)を添加し、室温で1時間インキュベートした。ウェルを上記のように3回洗浄し、結合を基質(指示に従って溶解させたOPD錠剤;Sigma P-9187)の添加によって検出した。発色をモニタリングし、反応を、3M H2SO4を使用して停止させた。発色を、490nmで読み取った。
結果:
フレームワーク突然変異を全く保有しないかまたはいくつかを保有する、両方の精製したヒト化抗体は、ラットMAGに対する非常に類似した結合を示す。これらの結果は、図7に示される。
3)2つのヒト化重鎖と軽鎖との組み合わせについて正規化した量の培養上清の、CHO細胞上で発現されたヒトMAGに対する結合
実施例5の2)に記載される、同じヒト化可変重鎖と軽鎖との組み合わせを、CHO細胞の表面上に発現されたヒトMAGに対して、清浄化した培養上清として試験した。各抗体について使用した培養上清の量を、ELISAによって決定した抗体濃度に基づいて正規化した。これについて、96ウェルプレート(Nunc Maxisorp)を、ヤギ抗ヒトIgG(γ)鎖(Sigma I-3382;重炭酸緩衝液(pH9.6)中;2μg/ml)で、4℃にて一晩被覆した。次の日、プレートを洗浄緩衝液(PBST)で2回洗浄し、少なくとも75μlのブロッキング緩衝液(BSAを含むPBS、1% w/v)の添加によって、室温で1時間ブロッキングした。抗体サンプル溶液を、ブロッキング緩衝液中で二重で連続希釈した(出発希釈はニートまたは1/2)。Ab標準は、無関係の特異性および既知の濃度の、精製されたヒト化IgG1抗体であった。標準溶液もまた、500ng/mlで開始して、プレートにわたって連続希釈した。全ての抗体溶液を、室温にて1時間インキュベートした。プレートを上記のように3回洗浄し、次いで、ブロッキング緩衝液中1/5000のヤギ抗ヒト軽鎖(κ)特異的(遊離および結合)ペルオキシダーゼコンジュゲート(Sigma; A-7164)と共に、室温で1時間インキュベートした。プレートを再度上記のように3回洗浄し、強い発色が生じるまで基質溶液(OPD錠剤; Sigma P-9187)と共にインキュベートした。発色を、25μlの3M H2SO4を添加して停止させ、プレートを、490nmで読み取った。
図8は、本明細書中で試験した両方の抗体が、ヒトMAGを認識し、その結合特徴が非常に類似していることを示す。CHO/-は、MAG発現を有さない、CHO細胞の陰性対照である。
Eu細胞ベースのELISAの方法
96ウェルプレート(Costar 3595)を、1ウェル当たり100μlの細胞懸濁液で満たした(1日目、2日目、3日目または4日目に実施するアッセイについての推奨される細胞数については、以下の表を参照のこと)。
Figure 2006512899
培養培地を除去し、プレートをFCS (10%)、BSA (1%)、NaN3 (1%;ブロッキング緩衝液)を含むDMEM/F12 (Sigma D6421)で、室温にて1時間ブロッキングした。次いで、ブロッキング溶液を除去し、サンプルを添加した(1ウェル当たり50μlのブロッキング緩衝液中)。サンプルを4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートをSkatronプレート洗浄器を使用してPBSで3回洗浄した。洗浄後、細胞を、0.5%パラホルムアルデヒド(PBS中に希釈)で、4℃にて20分間固定し、再度上記のように洗浄した。ユーロピウム緩衝液(50mM Tris 塩基、150mM NaCl、0.5% BSA、0.1g/l、Tween 20、7.86mg/l DTPA (pH 7.3))中に希釈した、50μl/ウェルのユーロピウムコンジュゲート二次抗体を添加し、4℃で1時間インキュベートした。
プレートを上記のように洗浄し、1ウェル当たり200μlのDelphia増強溶液を添加した。溶液を室温で5〜10分間インキュベートした。ウェルを、Victorで24時間以内に読み取った。
4)2つの精製されたヒト化抗体および非ヒト化マウスモノクローナル抗体の、ラットMAG-Fc融合タンパク質に対する結合についての競合的ELISA
方法:
96ウェルのNunc Maxisorpプレートを、PBS中のラットMAG-Fc融合タンパク質(2.5μg/ml; R&D Systems; Cat.No. 538-MG)で4℃にて一晩被覆した。プレートをTween20を含むPBS (0.1% v/v; PBST)で2回洗浄し、BSAを含むPBS(1%w/v)で室温(RT)にて1時間ブロッキングした。精製したヒト化抗体を、200ng/mlの濃度に調整し、ブロッキング緩衝液中で6000〜0ng/mlの範囲にされた競合分子と、等量で混合した。競合物は、同じ濃度の、親マウスモノクローナル抗体(抗MAG)または無関係のマウスモノクローナル抗体(INN1)のいずれかであった(BVh1/CVl1のみ)。抗体/競合物溶液を室温で1時間インキュベートし、次いでプレートをPBSTで3回洗浄した。ブロッキング緩衝液中に1/5000希釈した二次抗体(ヤギ抗ヒト軽鎖特異的‐ペルオキシダーゼコンジュゲート;Sigma A-7164)を添加し、室温で1時間インキュベートした。ウェルを上記のように3回洗浄し、結合を基質(指示に従って溶解させたOPD錠剤;Sigma P-9187)の添加によって検出した。発色を、490nmで読み取った。
結果:
両方の精製した抗体調製物は、元のマウスモノクローナル抗体によって同程度に競合されるが、無関係の特異性を有するマウスモノクローナル抗体によっては競合されない。図9を参照のこと。このことは、本明細書中で試験した元のマウスモノクローナル抗体およびヒト化抗体が、おそらく、同じエピトープを認識し、ラットMAGに対する非常に類似した親和性を有する可能性があることを示す。
図１は、マウス/ヒトキメラ抗MAG抗体重鎖の配列(配列番号27)を示す。 図２は、マウス/ヒトキメラ抗MAG抗体軽鎖の配列(配列番号28)を示す。 図３は、マウス/ヒトキメラ抗MAG抗体重鎖の配列(配列番号29)を示す。 図４は、キメラ抗MAG抗体がラットMAGに結合することを示す。 図５は、ヒト化抗MAG抗体の配列を示す。 図６は、ヒト化抗MAG抗体がラットMAGに結合することを示す。 図７は、ヒト化抗MAG抗体がラットMAGに結合することを示す。 図８は、ヒト化抗MAG抗体がヒトMAGに結合することを示す。 図９は、マウスおよびヒト化抗MAG抗体を用いた競合的ELISAを示す。

Claims (26)

  1. MAGに結合して中和し、かつ以下のCDRの1つまたは複数を含む、変更された抗体またはその機能的フラグメント。
    Figure 2006512899
  2. CDRH1、CDRH2およびCDRH3から選択される1つまたは複数のCDRを含む重鎖可変ドメイン、ならびに/またはCDRL1、CDRL2およびCDRL3から選択される1つまたは複数のCDRを含む軽鎖可変ドメインを含む、変更された抗体またはその機能的フラグメント。
  3. 配列中に超可変領域CDRH1、CDRH2およびCDRH3を含む重鎖可変ドメイン(VH)
    ならびに/または、
    配列中に超可変領域CDRL1、CDRL2およびCDRL3を含む軽鎖可変ドメイン(VL)
    を含む、変更された抗Mag抗体またはその機能的フラグメント。
  4. モノクローナル抗体である、請求項3に記載の抗体。
  5. ヒト化抗体である、請求項4に記載の抗体。
  6. 以下のアミノ酸配列のうち1つを含む重鎖可変領域を含む、請求項5に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
    Figure 2006512899
  7. アミノ酸配列番号16、配列番号17、配列番号18または配列番号19を含む軽鎖可変領域をさらに含む、請求項6に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
    Figure 2006512899
    Figure 2006512899
  8. 配列番号13、配列番号14または配列番号15を含む重鎖可変フラグメントおよびヒト重鎖の定常部分またはそのフラグメントと、
    配列番号16、配列番号17、配列番号18または配列番号19を含む軽鎖可変フラグメントおよびヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメントと、
    を含む、請求項6または7に記載の抗体。
  9. 配列番号13を含む重鎖可変領域および配列番号16を含む軽鎖可変領域;
    配列番号13を含む重鎖可変領域および配列番号17を含む軽鎖可変領域;
    配列番号13を含む重鎖可変領域および配列番号18を含む軽鎖可変領域;
    配列番号13を含む重鎖可変領域および配列番号19を含む軽鎖可変領域;
    配列番号14を含む重鎖可変領域および配列番号16を含む軽鎖可変領域;
    配列番号14を含む重鎖可変領域および配列番号17を含む軽鎖可変領域;
    配列番号14を含む重鎖可変領域および配列番号18を含む軽鎖可変領域;
    配列番号14を含む重鎖可変領域および配列番号19を含む軽鎖可変領域;
    配列番号15を含む重鎖可変領域および配列番号16を含む軽鎖可変領域;
    配列番号15を含む重鎖可変領域および配列番号17を含む軽鎖可変領域;
    配列番号15を含む重鎖可変領域および配列番号18を含む軽鎖可変領域;
    配列番号15を含む重鎖可変領域および配列番号19を含む軽鎖可変領域、
    を含む抗体から選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
  10. 配列番号15を含む重鎖可変領域をコードする、以下のポリヌクレオチド。
    Figure 2006512899
  11. アミノ酸配列番号14をコードする、以下のポリヌクレオチド配列。
    Figure 2006512899
  12. アミノ酸配列番号15をコードする、以下のポリヌクレオチド配列。
    Figure 2006512899
    Figure 2006512899
  13. アミノ酸配列番号16をコードする、以下のポリヌクレオチド。
    Figure 2006512899
  14. アミノ酸配列番号17をコードする、以下のポリヌクレオチド配列。
    Figure 2006512899
  15. アミノ酸配列番号18をコードする、以下のポリヌクレオチド。
    Figure 2006512899
  16. アミノ酸配列番号15をコードする、以下のポリヌクレオチド。
    Figure 2006512899
  17. 薬学的に許容される希釈剤または担体と共に、請求項1〜8のいずれか1項に記載の変更された抗MAG抗体またはその機能的フラグメントを含む、医薬組成物。
  18. ヒトにおける脳卒中および他の神経学的疾患/障害の治療または予防の方法であって、このような治療または予防を必要とする前記ヒトに、変更された抗体またはその機能的フラグメントを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗MAG抗体の有効量を投与することを含む、前記方法。
  19. 脳卒中および他の神経学的疾患/障害の治療または予防のための医薬の調製における、変更された抗体またはその機能的フラグメントを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗MAG抗体の使用。
  20. 脳卒中または他の神経学的疾患/障害を罹患しているか、あるいはその発症の危険性があるヒト患者において、神経変性を阻害するかつ/または機能回復を促進する方法であって、このような方法を必要とする前記ヒトに、変更された抗体またはその機能的フラグメントを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗MAG抗体の有効量を投与することを含む、前記方法。
  21. 脳卒中および他の神経学的疾患/障害に罹患しているか、またはその発症の危険性があるヒト患者において、神経変性を阻害するための医薬および/または機能回復を促進するための医薬の調製における、変更された抗体またはその機能的フラグメントを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗MAG抗体の使用。
  22. ヒトにおける脳卒中または他の神経学的疾患/障害の治療または予防の方法であって、前記ヒトに、抗MAG抗体の治療有効量を非経口で投与するステップを含む、前記方法。
  23. 上記抗MAG抗体が静脈内投与される、請求項22に記載の方法。
  24. 上記他の神経学的疾患/障害が、外傷性脳損傷、脊髄損傷、アルツハイマー病、前頭側頭型痴呆(タウオパシー)、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンティングトン病および多発性硬化症からなる群より選択される、請求項18、20または24に記載の方法。
  25. ヒト軸索を、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗MAG抗体と接触させるステップを含む、軸索発芽を促進する方法。
  26. 上記方法がin vitroである、請求項25に記載の方法。
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