TWI323265B - Antibodies - Google Patents

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1323265 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明是有關可結合骨髓磷脂相關糖蛋白（MAG)並中和 其功能之改造抗體，編碼此抗體之聚核苷酸，含該抗體之 醫藥調配物，及此抗體在神經學疾病治療及/或預防上之用

I t 途。本發明其他方面，主題及優點由以下說明更為明白。 【先前技術】 中風是西方世界死亡及失能之主因。中風之治療除了 t-PA外並無許可之療法’此劑需在發作3小時内投予，繼之 籲 行CT掃描以排除出血。迄今直接針對急性中風之治療（即神 經保護），大多數之治療劑主要涉及對準穀胺酸受體及已知 涉及急性細胞死亡之其順流之傳訊路徑。然而目前這些策 絡在臨床試驗上已證明並未成功’且常與劑量_限制之副作 用有關（Hill & Hachinski，The Lancet., 352: (suppl III) 10-14 (1998))。因此直接針對血流停止後細胞死亡之纾緩，此中 需有新穎的途徑。 在中風發作開始後，可在許多病人中觀察到某些程度之 籲 自主功能恢復現象，推知在受傷後腦子有修補及/或重塑（雖 i 然是有限的）之能力。因此有加強此恢復潛力之作用物，將 ； 可能在腦絕血發作後在較往後時（可能數天後）介入。可提供 急性神經保護及加強功能性恢復之作用物，可提供較目前 可能的神經保護性策略更為顯著之優點。 關於基礎功Hb恢復之機制目前尚未知。已受傷的或未受 傷軸突之芽出，已提出是一個可能的機制。然而，雖然活 87116 1323265 體内研究已示出，以神經營養因子治療脊柱損傷或中風可 造成功能性恢復加強及某程度之軸突芽出，但這些無法證 明在軸突芽出程度及功能性恢復程度間有直接之關聯 (Jakeman, et al., 1998, Exp. Neurol. 154:170-184，Kawamata et al. 1997, Proc Natl Acad. Sci. USA.. 94:8 1 79-81 R4. Ribotta, et al. 2000, J Neurosci. 20:5144-5 T 52)。再者，軸突之芽出需 要有生命力之神經元。在如中風之疾病中，其與大範圍細 胞死亡有關，因此在中風後由特定作用物提供功能性恢復 之加強，勢必經由抽突芽出以外之機制，如内源幹細胞之 分化，多餘路徑之活化，受體分佈之改變或神經元或神經 膠質之激發力（Fawcett & Asher，1999，Brain Res. Bulletin. 49:377-391, Horner & Gage, 2000, Nature 407 963-970) ° 中樞神經系統（CNS)在受傷後修補之有限能力，被視為部 份歸因於在CNS環境内之分子，具有對軸突芽出之抑制作 用（軸突向外生長）。CNS骨髓磷脂被視為含有抑制性分子 (Schwab ME and Caroni P (1988) J. Neurosci. 8, 2381-2193) »二種骨髓磷脂蛋白質，骨髓磷脂相關糖蛋白（MAG) 及Nogo，已被選殖並鑑知為軸突向外生長推想之抑制劑 (Sato S. et al (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163, 1473-1480; McKerracher L et al (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay G et al (1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K and Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262; Schafer et al (1996) Neuron 16, 1107-1113; WO 9522344; WO 9701352; Prinjha R et al (2000) Nature 403, 383-384; Chen MS et al 87116 1323265 (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre T et al (2000) Nature 403, 439-444; US 005250414A; WO 200005364A1; WO 0031235)。 骨髓磷脂相關糖蛋白是一種表現在骨髓磷脂表面之細胞 表面穿膜分子，由五個細胞外免疫球蛋白功能部位，一個 單一穿膜功能部位及一個細胞外功能部位所組成。MAG表 現限於CNS及周邊神經系統（PNS)中之骨髓磷脂化神經膠 質。MAG被認為可與神經受體交互作用，可調介神經細胞 骨架上之作用，包括神經絲磷醯化作用及試管内軸突向外 生長之抑制。雖然MAG之拮抗劑被認為可用於促進受傷後 軸突之芽出（WO 9522344， WO 9701352及 WO 9707810)， 這些聲明並不為活體内數據所支持。再者，MAG作為軸突 於活體内自CNS神經之芽出抑制劑之角色並未被證實（Li CM et al (1994) Nature 369, 747-750; Montag, D et al (1994) Neuron 13, 229-246; Lassmann H et al (1997) GLIA 19, 104-110; Li C et al (1998) J. Neuro. Res. 51, 210-217; Yin X et al (1998) J. Neurosci. 18, 1953-1962; Bartsch U et al (1995) Neuron 15 1375-1381; Li M et al (1996) 46, 404-414)。 抗體通常含二個重鏈，由雙硫鍵將之連結在一起，及二 個輕鏈。各輕鏈由雙硫鍵連結至個別之重鏈。各重鏈在一 端有一個可變功能部位，繼之許多的固定功能部位β各輕 鏈在一端有一個可變功能部位，及另一端有一個固定功能 部位。輕鏈可變功能部位與重鏈可變功能部位成一線。輕 鏈固定功能部位與重鏈第一個固定功能部位成一線。在輕 87116 1323265 及重鏈中之固定功能部位並不直接涉入抗體與抗原之結 合。 輕及重鏈各對之可變功能部位形成抗原結合位。在輕及 重鏈上之可變功能部位具有相同的一般結構，且各功能部 位含有四個區域之架構，其序列相當保守，由三個互補性 決定區域（CDRs)連接，常稱為超變區。四個架構區大多採β 片構型，且CDRs形成環帶，連結（且在某些例子中為構成部 份的）β片結構。CDRs由架構區緊密靠在一起’且與來自另 外功能部位之CDRs構成抗原決定位置。抗體之CDRs及架構 區，可參見 Kabat ev al 而決定（"Sequences of proteins of

Immunological Interest" US Dept, of Health and Human Services，US Government Printing Office, 1987)。 目前頃發現’所描述的（P〇lt〇rak et al (1987) Journal of Cell Biology 105, 1893-1899, DeBellard et al (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tang et al (1997) Mol. Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K and Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262)及已上市的（MAB 1567 (Chemicon))抗-MAG單 株抗體，當直接投予或靜脈内投予至局蹇'性腦絕血後之大 鼠腦内（一種中風模式），可提供神經保護及加強功能性恢 復。因此，抗-MAG抗體對中風後之急性神經保護及功能性 恢復之促進，可提供有力之治療劑。此抗體是一種鼠類抗 體。雖然鼠類抗體常作為診斷劑，其充作治療劑之利用價 值僅在數例中證實。此有限的應用部份是因重複投予鼠類 單株抗體至人類常會誘使人類生成拮抗這些分子之免疫反 1323265 應。為克服鼠類單株抗體這些内在非欲求之特性，因此發 展出納有人類抗體區域之"改造的”抗體，並在技藝中已充 份發展。例如，人類化的抗體含有源自非人類之互補性決 定區（nCDRV)，且結構其餘部份大多衍生自人類抗體。 神經退化過程是許多神經學疾病/失調症構成之基礎，包 括急性疾病如中風，外傷性腦傷及脊柱損傷以及慢性疾 病，包括阿滋海默氏病，額-顳癡呆（tauopathies)，周邊神經 病變，巴金森氏病，亨丁頓氏病及多發性硬化。抗-MAG mabs因此可用於治療這些疾病/失調症，不僅可纟f緩與這些 疾病/失調症有關之細胞死亡，且可促進功能恢復。 在此說明書中揭示的所有刊物，包括期刊及專利，均明 白且完全列為本案參考用。 【發明内容】 本發明提出一種改造的抗體或其功能性片段，其可結合 並中和MAG，且含有一個以上的下列CDR's。CDR's如Kabat (Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest; Fifth Edition; US Department of Health and Human Services; NIH publication No 91-3242)所述地鑑知。CDRs較 好如Kabat所定義，但依循蛋白質結構原則，及如Chothia and Lesk，所定義地折疊（Chothia et al.，（1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883)，很明顯地額外的殘基也可視為是抗原結合區的一部 份，且因此也涵蓋在本發明内。 87116 -10- 輕鏈CDRs CDR 依據Kabat L1 KSSHSVLYSSNQKNYLA(^aiDNO:l) L2 WASTRES(序列ID NO: 2) L3 HQYLSSLT(序列ID NO: 3) 重鏈CDRs CDR 依據Kabat HI NYGMN(序列 ID NO: 4) H2 WINTYTGEPTYADDFTG(序列 ID NO: 5) H3 NPINYYGINYEGYVMDY(序列 ID NO: 0) 1323265 本發明也是有關可與具上述CDRs抗體有相同表位結合 之抗體。可使用競爭抑制分析法，定出抗原上表位之舆圖。 因此，此中也提出抗-MAG抗體（經改造的或未改造的），其 可競爭性抑制改造抗體之結合，此抗體具有MAG(較好是人 類MAG)上述之CDRs。 又在進一步方面，本發明提出經改造的抗體或其功能性 片段，其含有一個重鍵可變功能部位，其中含有一或多個 CDRs，選自CDRH1，CDRH2及CDRH3及/或一個輕鏈可變 功能部位，其含一或多個CDRs，選自CDRL1，CDRL2及 CDRL3。 本發明進一步提出經改造之抗-MAG抗體或其功能性片 段，其含 a)—個重鏈可變功能部位（VH)，其依序含CDRH1，CDRH2 及CDRH3， 87116 -11 - 1323265 及/或 b)—個輕鏈可變功能部位（VL)，其依序含CDRL1，CDRL2 及CDRL3。 本發明進一步方面提出一種醫藥組合物，其含本發明改 造的抗-MAG抗體或其功能性片段，加上醫藥上可接受之稀 釋劑或載劑。 在進一步方面，本發明提出治療或預防人類中風及其他 神經學疾病之方法，此方法包括對有所需之人類投予有效 劑量之本發明抗-MAG抗體或其功能片段。 在另一方面，本發明提出本發明抗-MAG抗體或其功能性 片段在製成醫藥品上之用途，可治療或預防中風及其他神 經學疾病。 在進一步方面，本發明提出在罹患或有發展成中風或其 他神經學疾病危險群之人類患者中，抑制神經退化及/或促 進功能性恢復之方法，此方法包括對有所需之人類投予有 效劑量之本發明抗-MAG抗體或其功能性片段。 又進一步方面，本發明提出本發明抗-MAG抗體或其功能 性片段之用途，可製成醫藥品以在罹病或有發展成中風及 其他神經學疾病危險群人類患者中，抑制神經退化及/或促 進功能性恢復。 本發明其他方面及優點在以下說明及較佳具體實例中進 一步說明。 【實施方式】 抗- MAG抗體 87116 -12- 1323265 本發明之改造抗體較好是單株抗體（mAb)且較好是嵌合 的，人體化或改造的，此中以人體化為特佳。 經改造的抗體較好有天然抗體結構或其片段。因此抗體 含一個完全的抗體，（Fab%片段，Fab片段，輕鏈二聚體或 重鏈二聚體。抗體可為IgGl，IgG2，IgG3或IgG4 ;或IgM ; IgA，IgE或IgD或其修飾之變型。抗體重鏈之固定功能部位 可因此予以選擇。輕鏈固定功能部位可為κ或λ固定功能部 位。再者，抗體可包括所有類型之修飾，如IgG二聚體，Fc 變型其不再與Fc受體結合或調介Clq之結合（阻斷性抗體）。 抗體也可以是W0 86/01533中所述型式之嵌合抗體，其含一 個抗原結合區及一個非免疫球蛋白區。抗原結合區是抗體 輕鏈可變功能部位或重鏈可變功能部位。通常，抗原結合 區含輕及重鏈可變功能部位。非免疫球蛋白區，在其C末端 稠合至抗原結合區。非免疫球蛋白區通常是一種非免疫球 蛋白之蛋白質，且可為已知具結合特異性之酵素，毒素或 蛋白質。此種嵌合抗體型式的二區可經由可解離之連接子 序列連結。具如上述CDRs之免疫黏著素也包括在本發明 内。 固定區依據所需之功能性選擇。通常IgGl經由結合至補 體及/或調介ADCC(抗體有關之細胞胞毒性）可明示出溶解 能力。若需非-胞毒性之阻斷性抗體時，則以IgG4為較佳。 然而，IgG4抗體在製造中不穩定，因此通常是變化大體上 較為穩定的IgGl。所建議之修飾述於ΕΡ Ο 307 434，而較佳 的修飾包括在第235及237位置。因此本發明提出依據本發 87116 -13- 1323265 明抗體之溶解或非溶解型式。 在一個較佳方面，經改造的抗體屬於IgG類型，又較好是 IgG 1 〇 因此本發明抗體之較佳型式是具有上述CDRs之全長非-溶解性IgGl抗體。在最佳型式中，吾等提出具有SEQ ID NO: 13及16之CDRs之全長非溶解性IgGl抗體，及具有SEQ ID NO: 15及18之CDRs之全長非溶解性IgGl抗體。 又在進一步方面，本發明提出編碼CDRH1，CDRH2， CDRH3，CDRL1，CDRL2及CDRL3之聚核甞酸。較佳之聚 核铝酸序列為 輕鏈CDRs CDR L1 AAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAA CCAGAAGAACTACCTGGCC (SEQ ID NO: 7) L2 TGGGCCAGCACCCGCGAGAGC(SEQ ID NO: 8) L3 CACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC(SEQ ID NO: 9) 重鏈CDRs CDR HI AACTACGGCATGAAC(SEQ ID NO: 10) H2 TGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTAC GCCGACGACTTCACCGGC(SE〇 ID NO: 11) H3 AACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAG GGCTACGTGATGGACTAC(SEQ ID NO: 12) 在本發明進一步方面，提出編碼改造的抗-MAG抗體之輕 87116 -14- 1323265 鏈可變區之聚核甞酸，包括至少一個CDR選自CDRLl， CDRL2及CDRL3，又較好包括依序3種所有CDRs。 本發明又進一步方面提出編碼改造的抗-MAG抗體之重 鏈可變區之聚核甞酸，包括至少一個CDR選自CDRH1 , CDRH2及CDRH3，又較好包括依序3種所有CDRs。 在一個特佳方面’本發明之抗-MAG抗體是一種人體化之 抗體。 因此本發明提出可與MAG結合並中和之人體化抗體或其 功能片段’其包括一個重鏈可變區，含有下列胺基酸序列 之一：- QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWI NTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARNPIN YYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID No 13). QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWI NTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARNPIN YYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS (Sequence ID No 14)

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWI NTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYFCARNPIN YYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS (sequence ID No 15) 在本發明進一步方面提出一種可結合MAG之人體化抗體 或其功能性片段，其包括序列ID NO: 13，14或15之重鏈可 變區，加上序列ID NO: 16，17，18或19胺基酸序列之輕鏈 可變區： DIVMTQS PDS LAVS LGERATINCKS SHSVLYS SNQKNYLAWYQQKPGQPPK LLI ΥΝΑ5ΤΙΙΕ5〇νΡΡΙ^〇5〇30ΤΡΡΤΚΓΙ55Ι)〇ΑΕ〇νΑνΥΥαί<3ΥΙί53Ι/Γ FGQGTKLEIKRTV (SEQ ID No 16) 87116 •15- 1323265 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPK LLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTI/TIINLQAEDVAVYYCHQYLSSLT FGQGTKLEIKRTV (SEQ ID No 17) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPK LLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLHTEDVAVYYCHQYLSSLT FGQGTKLEIKRTV (SEQ ID No 18) DITTOS PDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPK LLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIINLHTEDVAVYYCHQYLSSLT FGQGTKLEIKRTV (SEQ ID No 19) 在本發明進一步方面，提出一種人體化之抗體，其包括： —個重鏈可變片段’含SEQ ID No: 13，14或15 及一個人類重鏈之固定部份或其片段。 及 一個輕鏈可變片段，含SEq ID No·· 16，17，18或19 及一個人類輕鏈之固定部份或其片段 在一個較佳方面，人類化抗體是IgG類型，又較好是IgCH。 本發明較佳之抗體含： 重鏈可變區含Seq ID No: 13及輕鏈可變區含Seq ID N〇: 16 ； 重鏈可憂區含Seq ID No: 13及輕鏈可變區含；§eq id No: 17 ； 重鏈可是區含Seq ID No: 13及輕鏈可變區含seq id No: 18 ； 重鏈可變區含Seq ID No: 13及輕鏈可變區含Seq ID N〇: 87116 -16- 19 ； 19 ；1323265 重鏈可變區含Seq ID No: 14及輕鏈可變區含seq ID No: 16 ； 重鏈可變區含Seq ID No: 14及輕鏈可變區含Seq id No: 17 ； 重鏈可變區含Seq ID No: 14及輕鏈可變區含Seq ID No: 18 ； 重鏈可變區含Seq ID No: 14及輕鏈可變區含Seq ID No: 19 ； 重鏈可變區含Seq ID No: 15及輕鏈可變區含Seq ID No: 16 ； 重鏈可變區含Seq ID No: 15及輕鏈可變區含Seq ID No: 17 ； 重鏈可變區含Seq ID No: 15及輕鏈可變區含Seq ID No: 18 ； 重鏈可變區含Seq ID No: 15及輕鏈可變區含Seq ID No: 19 〇 在進一步方面，本發明提出編碼重鏈可變區，包括序列 ID Nos: 13，14及15之聚核甞酸及輕鏈可變區包括序列ID Nos: 16，17，18及19之聚核苷酸。 編碼SEQ ID NO: 13胺基酸之較佳聚核苷酸序列為：

CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA

GTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATG

AACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATQGATC

AACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTT 87116 -17· 1323265 GTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGC CTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAACCCCATCAAC TACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGC ACACTAGTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID No 20) 編碼SEQ ID No: 14胺基酸之較佳聚核甞酸序列為： CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA GTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATG AACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATC AACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTT GTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGC CTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAAC TACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGC ACACTAGTCACAGTCTCCTCA (SEQ 工D No 21) 編碼SEQ ID No: 1 5胺基酸之較佳聚核：y：酸序列為：

CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA GTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATG AACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATC AACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTT GTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGC CTAAAGGCTGAGGACACTGCCACCTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAAC TACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGC ACACTAGTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID No 22) 編碼SEQ ID No: 1 6胺基酸之較佳聚核:y：酸序列為：

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAG

AGGGCCACCATCA^CTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAAC

CAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAG

CTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTC

AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAG GCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG (SEQ ID No 23) 87116 -18 - 1323265 編碼SEQ ID No: 17較佳之聚核：酸序列為：

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAG

AGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAAC cagaagaactacctggcctggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaag CTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTC AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCATCAACCTGCAG GCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG (SEQ ID No 24) 編碼SEQ ID No: 18較佳之聚核苷酸序列為：

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAG

AGGGCCACCATCAACTGCAAQAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAAC CAGAAGAACTACCTGGCCTQGTACCAGCAGAAACCAGGACAnrrTrrTAAn

CTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTC

AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAC

ACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG (SEQ ID No 25) 編碼SEQ ID No: 19較佳之聚核苷酸序列為： GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAG AGGGCCACCATCAACTGCAAQAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAAC CAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAG CTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTC AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCATCAACCTGCAC ACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACC TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG (SEQ ID No 26) ”中和"指MAG功能之抑制，或全部或部份，包括其結合 至神經元及軸突向外生長之抑制。 改造的抗體"指為改造的免疫球蛋白編碼區所編碼之蛋 87116 -19· 1323265 白質，其可由在所選定宿主細胞中表現而得。此改造抗體 包括經遺傳操作之抗體（如嵌合的，改造的，人體化或加有 載體之抗體）或缺乏所有或部份免疫球蛋白固定區之抗體 片段，如Fv、Fab或F(ab)2等。 ”改造的免疫球蛋白編碼區''指編碼改造抗體之核酸序 列。當改造抗體是CDR-接枝的或人體化抗體時，編碼非人 類免疫球蛋白之互補性決定區（CDRs)之序列，嵌入含有人 類可變架構序列之第一免疫球蛋白配對。視所需地，第一 免疫球蛋白配對操作連結至第二免疫球蛋白配對。 ”第一免疫球蛋白配對’’指編碼人類架構或人類免疫球蛋 白可變區之核酸序列，其中天然的（或自然發生的）CDR-編 碼區為供者抗體之CDR-編碼區所取代。人類可變區可為免 疫球蛋白重鏈，輕鏈（或二種鏈），其類似物或功能片段。此 CDR區，位在抗體之可變區内（免疫球蛋白）可以技藝中已知 方 去決定。磕口 Kabat et al_ (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987))揭 示定位CDRs之法則。此外，可用於鑑定CDR區/結構之電腦 程式是已知的。 "第二免疫球蛋白配對”指編碼蛋白質或肽之另一核苷酸 序列，此中第一免疫球蛋白與之在架構上融合或利用視所 需之傳統連接子序列（即操作性連結）。較好其是一種免疫球 蛋白基因。第二免疫球蛋白配對可包括編碼相同於重點抗 體（即同源的一第一及第二改造抗體衍自相同來源）或額外 87116 -20- 1323265 的（即異源的）整個固定區之核酸序列。其可為免疫球蛋白重 鏈或輕鏈（或二種鏈為單一多肽之部份）。第二免疫球蛋白配 對並不限於特定免疫球蛋白種類或同型。此外，第二免疫 球蛋白配對可含有部份的免疫球蛋白固定區，如見於Fab或 F(ab)2(即，適合的人類固定區或架構區之分開部份）。此第 二免疫球蛋白配對也可包括編碼曝於宿主細胞外表面之完 整的膜蛋白（如為噬菌體呈現庫之一部份）之序列，或編碼可 供分析或診斷偵測之蛋白質之序列，如辣根過氧化酶，β -半乳糖苷酶等。 而所用之Fv、Fc、Fd、Fab或F(ab)2術語有其標準意義（如 見 Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, (1988) ° 如此中所用之”經遺傳操作之抗體”描述一種改造抗體型 式，即全長的合成抗體（和抗體片段相反之嵌合，改造的或 人體化抗體），其中所選定之受者抗體輕及/或重鏈可變功能 部位部份，可以一個以上對選定表位有特異性之供者抗體 中類似部份所取代。例如，此分子可包括特徵為人體化重 鏈加上未修飾輕鏈（或欲合之輕鏈），反之亦然，之抗體。遺 傳操作抗體特徵也可以是編碼受者抗體輕及/或重鏈可變 功能部位架構區核酸序列之變化，以保有供者抗體之結合 特異性。這些抗體包括受者抗體一個以上的CDRs(較好是所 有的），為來自此中所述供者抗體之CDRs所取代。 "嵌合抗體"指一種遺傳操作抗體型式，其含有衍自供者 抗體自然生成之可變區（輕鏈及重鏈），加上衍自受者抗體輕 87116 -21 - 1323265 及重鏈固定區。 "人體化抗體"指一種遺傳操作抗體型式，其CDRs衍自非 人類供者免疫球蛋白，分子其餘免疫球蛋白衍生部份衍自 一種（或以上）人類免疫球蛋白。此外，支撐架構之殘基可改 造以保有結合親和力（見如，Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA. 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology. 2:421 (1991))。適合的人類受者抗體可選自傳統的資料庫， 如KABAT®資料庫，Los Alamos資料庫及Swiss Protein資料 庫，係與供者抗體之核苷酸及胺基酸序列同源。特徵為與 供者抗體架構區同源（在胺基酸基礎上）之人類抗體，也適於 提供重鏈固定區及/或重鏈可變架構區以嵌入供者CDRs。可 提供輕鏈固定或可變架構區之適合的受者抗體，可以類似 方式選擇。應注意，受者抗體重及輕鏈未必要源自相同之 受者抗體。先前技藝已描述產製此人體化抗體的許多方 式，如見EP-A-0239400及EP-A-054951。 ”改造的人類抗體”指改造的抗體，其中最低程度來自第 一人類單株供者抗體至少一個CDR，替代第二人類受者抗 體中的CDR。較好六個CDRs均被取代。又較好，來自第一 人類供者單株抗體完整的抗原結合區（如Fv，Fab或F(at〇2) 替代了第二人類受者單株抗體中之相當區域。最好來自第 一人類供者之Fab區，操作連結至第二人類受者抗體適合的 固定區，以形成全長單株抗體。 ”加有載體之抗體”指抗體上黏附有作用物，以改進穿越 血腦障壁（BBB)之運送。（總覽見Pardridge; Advanced Drug 87116 -22- 1323265

Delivery Review 36, 299-321，1999)。此黏附作用可以是化 學的，或者該部份係經遺傳操作至抗體内。一個實例是直 接針對腦毛細管内皮細胞受體以抗體製成嵌合體，如抗-胰 島素受體抗體或抗-鐵傳遞蛋白受體抗體（Saito et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 10227-31; Pardridge et al (1995) Pharm. Res. 12 807-816; Broadwell et al (1996) Exp. Neurol. 142 47-65; Bickel et al (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90, 2618-2622; Friden et al (1996) J. Pharm. Exp. Ther. 278 1491-1498, US5182107，US5 154924，US5833988, US5527527) 。一旦與受體結合，雙特異抗體的二個組份均可由穿越細 胞過程通過BBB。另外，此作用物可以是配體，並可結合 至此細胞表面受體上，如胰島素，鐵傳遞蛋白或低密度脂 蛋白（Descamps et al (1996) Am. J. Physiol. 270 H1149-H1158;

Duffy et al (1987) Brain Res. 420 32-38; Dehouck et al (1997) J. Cell Biol. 1997 877-889)。也可使用已知可改進穿越BBB 之運送之自然生成的肽，如穿入素（penetratin)及SynB 1及 SynB3(Rouselle et al (2000) Mol. Pharm. 57, 679-686 及 Rouselle et al (2001) Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 296, 124-131)。 而'’供者抗體"指可貢獻其可變區，CDRs或其他功能性片 段或其類似物之胺基酸序列至第一免疫球蛋白配對之抗體 (單株抗體或重組體），如此提供改造的免疫球蛋白編碼區， 且使生成且表現之改造抗體有供者抗體特有之抗原特異性 及中和活性。 87116 -23- 1323265 "受者抗體"指異源於供者抗體之抗體（單株抗體，或重組 體），其貢獻其編碼重及/或輕鏈架構區及/或其重及/或輕鏈 固定區所有的胺基酸序列（或任一部份，但較好是所有的） 至第一免疫球蛋白配對。較好人類抗體是受者抗體。 "CDRs”定義為抗體之互補性決定區胺基酸序列，其為免 疫球蛋白重及輕鏈之超變區。如見，Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)。在免疫球蛋白可變區部份有三個重鏈及三 個輕鏈CDRs(或CDR區）。因此，此中所用之"CDRs"指所有 三個重鏈CDRs，或所有三個輕鏈CDRs(或若適當時所有重 及所有輕鏈CDRs)。抗體之結構及蛋白質折疊可表示其他殘 基可視為抗原結合區的一部份，且可為精藝者了解如此。 如見 Chothia et al.，（1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883。為方便起見， 在SEQ ID Nos: 13-26中由Kabat定義之CDR’s底下劃線。 CDRs可提供大多數接觸殘基，可供抗體與抗原或表位結 合。本發明之重點CDRs係衍自供者抗體可變重及輕鏈序 列，且包括自然生成CDRs之類似物，類似物也共有或保有 如其衍生出處之供者抗體相同的抗原結合特異性及/或中 和能力。 "功能性片段"是部份的重或輕鏈可變序列（如在免疫球蛋 白可變區胺基或羧基末端上微小之删除），其保有如片段衍 生出處抗體相同的抗原結合特異性及/或中和能力。 87116 •24- 1323265 "類似物"是有至少一個胺基酸被修飾之胺基酸序列，其 中該修飾可以是化學的或一些胺基酸（即不超過丨0個）之取 代或重排，此修飾使胺基故序列保有未修飾序列之生物特 性，如柷原特異性及高親和力。例如’當在Cdr_編碼區之 内或四週生成某些核酸内切限制位置時，（沉默）突變可經由 取代作用而構築。本發明包括本發明抗體類似物之用途。 已熟知’在胺基酸或核酸序列中少量的變化，可造成如原 先蛋白質之等位型式，其保有實質上相似的特性。因此本 發明抗體之類似物包括其在重及輕鏈超變區之Cdrs與如 上定義之CDRm，CDRH2, CDRH3，CDRL1，CDRL2 及CDRL3 之CDRs有至少80%同源，較好至少9〇%同源又較好至少95% 同源，且保有MAG中和活性之抗體。當序列最適當下列成 ’’·泉且將取口或飲入算為非·相同殘基時，胺基酸序列有至 少80%同源是指若其在類似位置上有8〇%相同的胺基酸殘 基而s »本發明也包括本發明抗體之類似物，其中架構區 與Seq ID 1-5所示之架構區有至少8〇%，較好至少9〇%且又 較好至少95%同源。當序列最適當下列成線’且將裂口或 嵌入算為非-相同殘基時，胺基酸序列有至少8〇%同源是指 右·其在類似位置上有8〇q/c)相同的胺基酸殘基而言。 類似物也可生成等位變化。"等位變化或修飾”是在核酸 序列中之變化》此變化或修飾可因遺傳密碼中之簡併性所 致，或可被精巧地遣傳操作以提供欲求的特性。這些變化 或修飾在任何編碼的胺基酸序列中，可或可能不會造成變 化。 87116 •25· 1323265 ••效應物"指非蛋白質之載體分子，此中改造抗體及/或天 然或合成的供者抗體之輕或重鏈或供者抗體其他片段，可 經由傳統方法與之相連。此非蛋白質載體包括診斷領域中 所用之傳統載體，如聚苯乙烯或其他塑質珠粒，多醣類， 如在BIAcore [Pharmacia]系統中所用的或其他醫學領域中 有用之非蛋白質物質，且可安全投予至人體及動物。其他 的效應物包括巨環，以螯合重金屬原子，或放射同位素。 此效應物也可用來增加改造抗體之半衰期，如聚乙二醇。 與MAG特異之中和抗體也已描述（Poltorak et al (1987) Journal of Cell Biology 105, 1893-1899, DeBellard et al (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tang et al (1997) Mol. Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K and Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262)且已有上市（MAB1567 (Chemicon))。 另外，吾等可構築抗體，改造抗體及片段，係免疫非人 類種類（如，牛、羊、猴、雞、老鼠（如鼠及大鼠）等）以產生 欲求之免疫球蛋白，而一旦有任何種類中提出天然的 MAG，則因拮抗此可產生與人類MAG可交又反應之抗體， 如人類或雞。可應用傳統的融合瘤技術以提出可分泌相對 於MAG之非人類mAb之融合瘤細胞株。再利用MAG塗佈在 384-或96-孔洞盤，生物素化之MAG結合至塗佈有鏈抗生物 素蛋白盤，以結合篩選出此融合瘤。或利用生物素化之MAG 在均質銪-APC連結之免疫分析法中測試。 可在人類抗體老鼠，如π異種老鼠（Xenomouse)"(Abgenix) ，其中老鼠免疫球蛋白基因已被移出且編碼人類免疫球蛋 87116 -26- 1323265 白之基因已嵌入老鼠染色體中，產生天然的人類抗體。老 鼠如常地免疫接種，並發展出由人類基因衍生之抗體反 應。因此老鼠產生出人類抗體，排除了陽性融合瘤篩選後 需予以人體化之必要性。（見Green L.L., J Immunol Methods 1999 Dec 10; 231(1-2):1 1-23)。 本發明也包括由直接拮抗MAG由mAbs衍生之Fab片段或 F(ab')2片段之用途。這些片段可作為活體内具保護性之有用 作用物。Fab片段含有整個輕鏈及重鏈之胺基末端部份； F(ab')2片段是二個Fab片段以二硫鍵結合所形成之片段。Fab 片段及F(ab')2片段可由傳統方法獲得，如以適合的蛋白水解 酶，木瓜酯素及/或胃蛋白酶解離mAb或利用重組體方法。 Fab及F(ab')2片段本身是有用的治療或預防劑，且可作為序 列之供者包括可變區及CDR序列，可如此中所述用於形成 重組體或人體化之抗體。

Fab及F(aV)2片段也可經由組合的噬菌體庫（如見Winter et al.，Ann. Rev. Immunol.. 12:433-455 (1 994))或經由免疫球 蛋白鏈洗牌（如見 Marks et al., Bio/Technology. 10:779-783 (1992))而構築，其二者已全文列為本案參考。 因此與MAG特異之人類抗體片段（Fv，scFv，Fab)可利用 人類抗體片段噬菌體呈現庫予以分離。可呈現出人類抗體 片段蛋白質之噬菌體粒子庫，相對於MAG蛋白質而淘洗選 別之。可與MAG結合之呈現抗體片段之噬菌體，可保留在 庫中並予以選殖擴大。再自特異噬菌體中切出人類抗體基 因，並嵌入含有人類IgG固定區之人類IgG表現構體内，以 87116 -27- 1323265 形成完整的人類IgG分子，其中可變區來自與MAG特異之經 分離的嗟菌體。 供者抗體可貢獻序列，如可變的重及/或輕鏈肽序列，架 構序列，CDR序列，功能性片段及其類似物，及編碼彼等 之核酸序列，用於設計及獲得各種改造抗體，且特徵是有 供者抗體之抗原結合特異性。 將遺傳密碼子之簡併性列入考量，可構築各種編碼序 列，其編碼可變的重及輕鏈胺基酸序列及CDR序列以及共 有供者抗體抗原特異性之其功能性片段及類似物。經分離 之核酸序列或其片段，編碼可變鏈肽序列或CDRs可用來產 生改造抗體，如嵌合或人體化抗體，或當與第二免疫球蛋 白配對操作性組合時之其他經遺傳操作之抗體。 改造的免疫球蛋白分子可編碼改造抗體，其包括遺傳操 作之抗體如嵌合抗體及人體化抗體。欲求之改造免疫球蛋 白編碼區含有CDR-編碼區，其編碼之肽具有抗-MAG抗體 之抗原特異性，較好是高親和力抗體，嵌入第一免疫球蛋 白配對内（人類架構或人類免疫球蛋白可變區）。 較好，第一免疫球蛋白配對操作連結至第二免疫球蛋白 配對。第二免疫球蛋白配對如上文般定義，且可包括編碼 重點之第二抗體區之序列，如F c區。第二免疫球蛋白配對 也包括編碼另外免疫球蛋白之序列，其中輕或重鏈固定區 在架構上融合或利用一個連接子序列融合。也可設計直接 相對於功能性片段或MAG類似物之經遺傳操作之抗體，以 誘生加強之結合力。 87116 -28- 1323265 第二免疫球蛋白配對也可加上如上文定義之效應物，包 括非蛋白質載體分子，此中第二免疫球蛋白配對可經由傳 統方法操作連結。 弟一免疫球蛋白配對’如抗體序列’及效應物間之融合 或連結’可採用任何適合的方法，如利用傳統的共價或離 子鍵，蛋白質融合體或異··雙官能交叉連接子，如碳化二酿 亞胺，戊二醛等。此技術是技藝中已知的，且明白地描述 於傳統的化學及生化教科書中。 另外，傳統的連接子序列，其在第二免疫球蛋白配對及 效應物間單純地提供欲求量之空間，也可構築至改造的免 疫球蛋白編碼區内。此連接子之設計是精藝者熟知的，在 本發明進一步方面提出二元抗體（diab〇dies)(二價或雙特異 的），三元抗體，四元抗體及其他多價scFv蛋白質，其具有 一個以上如上述可結合並中和MAG功能之cDRs。 又在進-#具體實例巾，本發明的抗體其上可黏附額外 的作用物。如’可使用重組體DNA技術之步竭來產生本發 明之遺傳操作抗體，其中完全抗體分子之&片段或CH2_ ch3功⑯部位已為酵素或其他可彳貞測分子所取代（即，多肤 效應物或告知子分子）。 第-免疫球蛋白配對也可操作連結至與含CDR岸列且且 有抗_MAG抗體抗原特異性異源之非免疫球蛋白肽，蛋白質 或其片段。所生成之蛋白質可呈現抗·MAG抗原特異性及一 旦表現有非免疫球蛋白之特性。此融合配對特性，可以是 功此技特改，如另一結合或受體功能部位，或治療特性， 87116 •29- 1323265 若融合配對本身是一種治療性蛋白質，或額外的抗原特性。 本發明另一欲求蛋白質可包括完全的抗體分子，具有全 長之重及輕鏈，或其任何分開的片段，如Fab或F(ab')2片段， 重鏈二聚體或其任何最低程度之重組片段，如Fv或單鏈抗 體（SCA)，或與所選擇之供者mAb有相同特異性之其他任何 分子。此蛋白質可以改造抗體型式使用，或可以其未融合 型式使用。 不論何時，第二免疫球蛋白配對衍自異於供者抗體之抗 體時，如免疫球蛋白架構或固定區之任何同型或類型，均 可生成遺傳操作之抗體。遺傳操作抗體可包括來自一源（如 受者抗體）之免疫球蛋白（Ig)固定區及可變架構區，及來自 供者抗體一個以上的（較好是全部）CDRs。此外，不同地， 均可在受者mAb輕及/或重鏈可變功能部位架構區之核酸或 胺基酸層次或供者CDR區中製作如刪除，置換或加入，以 保有供者抗體之抗原結合特異性。 此經遺傳操作抗體，經設計可應用抗-MAG mAb可變重及 /或輕鍵之一（或二者）或一或多個的重或輕鍵CDRs ^遺傳操 作抗體可如上文定義般被中和。 此遺傳操作抗體可包括人體化抗體，含有所選定人類免 疫球蛋白或亞型之架構區，或嵌合抗體，含有人類重及輕 鏈固定區融合至抗-MAG抗體功能性片段。適合的人類（或 其他動物）受者抗體可選自傳統的資料庫，如KABAT®資料 庫，Los Alamos資料庫及Swiss Protein資料庫，係同源於供 者抗體之核苷酸及胺基酸序列。與供者抗體架構區同源（在 87116 -30- 1323265 胺基酸基礎上）之人類抗體，適於提供重鏈固定區及/或重鏈 可變架構區以嵌入供者CDRs。可提供輕鏈固定或可變架構 區之適合的受者抗體，可以類似方式選擇。應注意到，受 者抗體重及輕鏈並不需源自相同的受者抗體。 欲求地，異質架構及固定區可選自人類免疫球蛋白類型 及同型，如IgG(亞型1至4)，IgM，IgA及IgE。然而，受者 抗體未必要僅含人類免疫球蛋白蛋白質序列。例如，可構 築-基因，其中編碼部份人類免疫球蛋白鏈之DNA序列係融 合至編碼非免疫球蛋白胺基酸序列之DNA序列上，如多肽 效應物或告知者分子。 較好，在人體化抗體中，人類重及輕鏈二者之可變功能 部位已經一或多個CDR取代而遺傳操作。也可使用所有六 個CDRs，或少於六個CDRs之各種組合。較好六個CDRs全 取代。也可僅取代人類重鏈中之CDRs，利用如輕鏈般來自 人類受者抗體之未修飾輕鏈。另外，經採用傳統的抗體資 料庫，可相容之輕鏈可選自另一人類抗體。其餘的遺傳操 作抗體可由任何適合的受者人類免疫球蛋白中衍生。 因此，遺傳操作之人體化抗體具有天然人類抗體或其片 段之結構，並有有效治療應用所需之特性組合。 精藝者應了解，經由變化可變功能部位胺基酸但未必影 響供者抗體之特異性及高親和力下（即類似物）可進一步變 化遺傳操作抗體。期待重及輕鏈胺基酸可為其他的胺基酸 所取代，不論是在可變功能部位架構或CDRs上或二者中。 此外，可改變固定區以加強或減弱本發明分子所選定之 87116 -31 · 1323265 特性。例如，二聚化作用，結合至Fc受體，或結合及活化 補體之能力（如見 Angal et al·，Mol. Immunol, 30:105-108 (1993), Xu et al., J. Biol. Chem. 269:3469-3474 (1994)， Winter et al.，EP 307, 434-B)。 與上述人體化抗體不同的嵌合抗體之改造抗體，係可提 供完整的非人類供者抗體重鏈及輕鏈可變區，包括架構 區，加上來自其他種屬之免疫球蛋白固定區，較好鏈均來 自人類。 較好適當供者mAbs之可變輕及/或重鏈序列及CDRs，及 其編碼核酸序列，均可利用於構築本發明之改造抗體，較 好是人體化抗體，並利用以下方法。為產製本發明其他具 體實例，也可應用相同或類似技術。 可產製所選定供者mAb之融合瘤可被以傳統方式選殖， 且其重及輕鏈可變區之DNA再以精藝者已知之技術獲得， 如述於Sambrook et al·, (Molecular Cloning (A Laboratory Manual-), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)) 之技術。含有至少CDR-編碼區之可變重及輕鏈區以及受者 mAb輕及/或重可變功能部位架構區部份，是獲得供者mAb 結合特異性所必要的，且衍自人類免疫球蛋白之抗體鏈其 餘的免疫球蛋白衍生部份，均可利用聚核苷酸引子及反轉 錄酶獲得。CDR-編碼區利用已知之資料庫再與其他抗體比 較而鑑知。 之後可再製備老鼠/人類嵌合抗體，並行結合能力分析。 此嵌合抗體含有整個非人類供者抗體VH及VL區，加上人類 87116 -32- 1323265 ig固定區（二鏈均然）。 來自人類抗體之重鏈可變區同源架構區，可利用電腦化 資料庫鑑定，如KABAT®，且與供者抗體同源之人類抗體 再選出作為受者抗體。以類似方式可設計適合的輕鏈可變 架構區。 人體化抗體可衍生自嵌合抗體，或較好由供者mAb CDR-編碼區，由重及輕鏈適當地嵌入所選定之重及輕鏈架構内 而合成製備。另外，也可利用標準的突變形成技術製備人 體化抗體。因此所生成之人體化抗體含有人類架構區及供 者mAb CDR-編碼區。接下來架構殘基再行操作。所生成之 人體化抗體可在重組體宿主細胞中表現，如COS，CHO或 骨髓瘤細胞。 傳統表現載體或重組體質體之產生可將抗體之編碼序列 操作結合以傳統的調控序列，其可控制在宿主細胞内之複 製及表現，及/或分泌。調控序列包括啟動子序列，如CMV 啟動子，及訊號序列，其可衍自其他已知抗體。類似地， 也可產生第二表現載體，其中之DNA序列係編碼互補抗體 之輕或重鏈。較好，此第二表現載體和第一者相同，除了 相關之編碼序列及所選擇之標幟外，以儘可能確保各多肽 鏈在功能上有所表現。另外，改造抗體之重及輕鏈編碼序 列也可留在單一載體内。 所選定之宿主細胞以傳統技術與第一及第二載體共轉感 (或單純地由單一載體轉染），以生成含有重組體或合成的輕 及重鏈之本發明經轉感之宿主細胞。所轉感之細胞再以傳 87116 -33- 1323265 統技術培養，以產生本發明經遺傳操作之抗體。人體化抗 體，其包括有重組體重鏈及/或輕鏈之結合，以適合的分析 法，如ELISA或RIA，自培養物中篩選。可應用類似的傳統 技術構築其他改造抗體及分子。 在本發明組合物方法及構築中所應用之選殖及繼代選殖 適合載體，可由精藝者選擇。例如，可使用傳統的pUC系 列選殖載體。其一，pUC 19，可購自廢商如Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom)或 Pharmacia (Uppsala, Sweden)。另外，任何可容易地複製，有許多選殖位置及可 選擇基因（如抗生素抗性）且容易操作之載體均可用於選 殖。因此，選殖載體之選用並非本發明之限制因素。 類似地，用於表現抗體之載體，可為精藝者由任何傳統 載體中選擇。載體也含有所選定之調控序列（如CMV啟動 子），其可指令異質DNA序列在所選定之宿主細胞中之複製 及表現。這些載體含有上述DNA序列，其可指導合成抗體 或改造之免疫球蛋白編碼區。此外，載體内可納有所選定 之免疫球蛋白序列，因嵌有欲求之限制位置使易於操作而 被修飾。 表現載體也可有具特性之基因，適於擴大異質DNA序列 之表現，如哺乳動物二氫葉酸還原酶基因（DHFR)。其他較 佳之載體序列包括聚A訊號序列，如來自牛生長激素（BGH) 及β球蛋白啟動子序列（betaglopro)。此中有用之表現載體可 以精藝者熟知之技術合成。 此載體之組份，如複製子，選擇基因，加強子，啟動子， 87116 -34- 1323265 訊號序列等，可得自商業或天然來源，或以已知步驟合成， 應用於指令重組體DNA產物在所選定宿主中之表現及/或 分泌。其他許多型式之適合的表現載體，係技藝中已知的， 可供哺乳動物，細菌，昆蟲，酵母及真菌表現，也可針對 此目的而選用。 本發明也包括以含有抗體或其改造之免疫球蛋白分子編 碼序列之重組質體所轉感之細胞株。這些選殖載體用於選 殖及其他操作之宿主細胞也是傳統的。然而，最企求是使 用各種E. coli株之細胞，應用於選殖載體之複製及本發明改 造抗體構築中之其他步驟上。 本發明抗體表現之適合宿主細胞或細胞株，較好是哺乳 動物細胞，如NS0，Sp2/0，CHO，COS，纖維母細胞（如3T3) 及骨髓瘤細胞，且較好是CHO或骨髓瘤細胞。可使用人類 細胞，因此使分子以人類糖基化型式修飾。另外，也可應 用其他的真核細胞株。適合哺乳動物宿主細胞之選擇，及 轉形、培養、擴大、篩選及產物產製及純化之方法是技藝 中已知的。如見Sambrook et al.，上示。 已證知細菌細胞可充作有用的宿主細胞，適於本發明重 組體 Fabs表現（如見，Pluckthun, A., Immunol. Rev.. 130:151-188 (1992))。然而由於在細菌細胞中表現之蛋白質有呈未 折疊或不當折疊型式或未糖基化型式之傾向，因此在細菌 細胞中產生的任何重組體Fab，均必須進行抗原結合能力保 留之篩選。若由細菌細胞表現之分子以正確折疊型式被產 製，則該細菌細胞將是欲求宿主。例如，用於表現之各種 87116 -35- 1323265 E 株已熱知疋生物技術領域中之宿主細胞。芽孢桿 菌、鏈黴菌，其他桿菌屬之各種菌株等，也可應用於本方 法中》 必要時也可應用技藝中已知之酵母細胞株，以及昆蟲細 胞、如果蠅及鱗翅目及病毒表現系為宿主細胞。如見，龍e: et al·，基:277 298, 卩代“（1986) 及此中所示之參考文獻。 載體構築之-般方法’產製本發明改造抗體所必要之轉 感方法，及自此宿主細胞中產製本發明改造抗體所需之培 養方法，均為傳統技術。另外，一旦被產製，本發明抗體 可自細胞培養内容物中依據技藝中之標準步驟純化，包括 硫酸銨沉澱，親和力管柱，管柱層析，凝膠電泳等。此技 術係在技藝之技術内的，且不限制本發明。例如改造抗體 之製備述於W0 99/58679及W0 96/16990。 又抗體另一表現方法可利用在導入外來基因動物中之表 現，如U_S. Pat. No. 4,873,316中所述。此是有關利用動物之 酶蛋白啟動子之表現系，其當轉基因地納入哺乳動物内， 可使雌性在其乳汁中產生欲求之重组體蛋白質。 一旦以欲求方法表現’再利用適合之分析法檢查抗體之 試管内活性。目前傳統的ELISA分析型式可用來定性及定量 評估抗體與MAG之結合。另外，在行人類臨床研究前可先 使用其他試管内分析法以證實中和效力，以評估抗體在體 内之持久性，而不論一般的清除機制。 本發明之治療劑可以預防性或受傷後投予，或另有所需 87116 -36· 予。治療之劑量及作用期和本發明分予在人體循環内 目：作用期有關，且可由精藝者依病人接受治療及一般 展狀況而予以調整。 之I明㈣劑投藥模式可以是任何將作用物遞送至宿主 合路徑。拮抗劑及抗體及本發明之醫藥組合物特別適 :腸外投藥’即皮下，肌内，靜脈内或鼻内方式。 本發明 < 治療劑可製成醫藥組合物，在醫藥上可接受之 、劑中含有有效劑量之本發明拮抗劑或抗體為活性組份。 在本發明之預防性作用物中，以含有遺傳操作抗體之水性 懸履劑或溶液劑，較好是在生理{)1£值下緩衝的呈即可注 ^型式為較佳。供腸外投藥之組合物通常含本發明结抗劑 或抗體或其摻合液之溶液，溶於醫藥上可接受之載劑中， 較好是水性載劑。可應用各樣的水性裁劑，如G 9%食鹽水， 0.3%甘油等。這些溶液是無菌的’且通常無微粒物質。這 一’合液劑可以傳統且熟知之減菌技術（如過濾）予以消毒。組 。物中可3有醫藥上可接受之佐劑物質，依所需以接近生 理狀况，如pH調整及緩衝劑等。在此醫藥調配物中，本發 明拮抗劑或抗體之濃度可有大的變化，即由約〇 5%，通常 在或至少約1〇/0至最多15或2〇%按重計，且主要依流體體 和，黏度等為基礎，依所選用之特定投藥模式而選擇。 因此，本發明供肌内注射之醫藥組合物可製成含有1毫升 揲菌緩衝水，及介於約i毫微克至約100毫克間，如約50毫 微克至約30毫克以上，又較好約5毫克至約25毫克之本發明 拮杬劑或抗體。類似地，本發明供靜脈内輸注之醫藥組合 87116 -37· 1323265 物可製成含有約250毫升無菌林格氏液，及約1至約30，且 較好5毫克至約25毫克之本發明經遺傳操作抗體。製備腸外 可投予組合物之確實方法是熟知的，或對精藝者顯而易見 的，詳述可見於如 Remington’s Pharmaceutical Science, 15th ed·，Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania。 本發明之治療劑，當呈醫藥製劑時較好呈單位劑型。適 合之治療有效劑量，可由精藝者容易地決定。為有效治療 人類之中風及其他神經疾病，單一劑量每70公斤體重可高 達700毫克之本發明拮抗劑或抗體，可採腸外，較好是i.v. 或i.m.(肌内）投藥。若必要時，此劑量可在適合之時間間隔 下重複投予，由主治醫師於適當下選擇。 此中所述之抗體可冷凍乾燥以供貯存及在使用前以適合 的載劑重組。以傳統的免疫球蛋白已知此技術是有效的， 且可應用技藝中已知之冷凍乾燥及重組技術。 在另一方面，本發明提出醫藥組合物，其中含有本發明 之抗-MAG抗體或其功能片段，及醫藥上可接受之載劑以治 療或預防中風及其他神經性疾病。 在另一方面，本發明提出醫藥組合物，其中含有本發明 之抗-MAG抗體或其功能片段及醫藥上可接受之載劑，可供 罹患有，或有發展成中風或其他神經學疾病危險性之人類 患者抑制神經退化及/或促進功能恢復。 以下實例說明本發明。 實例1-在中風模式中之抗-MAG抗體 材料及方法 87116 -38- 1323265 抗-MAG單株抗體 抗-MAG單株抗體是老鼠抗-雞MAG抗體MAB 1567，得自 Chemicon。抗體具有以下特性： 抗原：骨髓磷脂相關糖蛋白（人類’老鼠，大鼠，牛，雞， 青蛙） 同型：IgGl 中和能力：見 DeBellard et al (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tang et al (1997) Mol. Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K and Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262。 對照用IgGl購自R+D系統。 腦室内套管（僅供研究1) 在氟烷麻醉下，腦室内（i.c.v.)套管放在左側腦室内（座 標：距中線1.6毫米，0.8毫米尾距前囪，距髓表面4.1毫米， 切開橫線-零點下3.2毫米，依Paxinos and Watson，1986)。所 有大鼠均單獨圈養以避免損及引導或倣造之導管。手術後7 天，以對血管收縮素11(100毫微克，Simpson，et al· 1978)之 強烈飲水反應來證實導管之正確安置。9天後，動物給予腦 絕血。 短暫的病灶絕血 在雄性Sprague Dawley大鼠中謗生短暫的（90分鐘）病灶 腦絕血，各大鼠重約300-350克。動物先以5%氟烷，60%氧 化亞氮及30%氧之混合物麻醉，加在面具上再維持於1.5% 87116 -39· 1323265 氟烷下麻醉。利用先前所述之管腔内絲線技術進行中腦動 脈閉鎖（MCAO)(Zea Longa, et al.，1989)。整個手術過程中病 人維持正常氣溫，在單獨圈養前先在培育箱中恢復1小時。 對於閉鎖後神經學指數在3之動物才納入研究内（利用5點 指數系統來評估：0，無缺陷；1，對側反射；2，虛弱的抓 握；3，打轉；4，不能行動；5，死亡）。動物維持1週，此 時殺死動物先以0.9%食鹽水穿透心臟灌注，再以4%仲醛於 100 mM磷酸鹽緩衝溶液注入。之後以4%仲醛在4°C下固定 48小時，此時自顱骨中移出，並以鼠腦間質切成2毫米塊 狀。此2毫米之切片再以石蠘包埋，利用Shandon Citadel 1000組織處理機，再切成6微米切片，利用切片機，並覆在 聚-L-賴胺酸塗佈之玻片上。處理切片以染上甲酚基快紫 (Cresyl Fast Violet(CFV)) 〇 劑量療程 抗-MAG單株抗體及老鼠IgGl同型對照抗體以0.9%無菌 的食鹽水透析一夜，再適當地濃縮。 研究1 :動物接受2.5微克抗-MAG mab或2.5微克老鼠IgG i.c.v.，於MCAO後1，24及72小時（每劑5微升）。 研究2 :動物接受200微克抗-MAG mab或200微克老鼠IgG i.v. 於MCAO後1及24小時。 對各給藥溶液，檢視者是盲目的。 神經學評估 在誘生腦絕血之前，研究1之大鼠接受橫樑步行（beam walking)及黏性標籤試驗（sticky label test)。在二個試驗中 87116 •40· 1323265 未達到準則之動物排除在進一步試驗外。訓練後，其餘的 動物依據行為分成二個平衡組。在整個神經學評估中，檢 視者對動物處理組是盲目的。 二側黏性標籤試驗 二側黏性標籤試驗（Schallert et al.，Pharmacology Biochemistry and Behaviour 16:455-462. (1983))係用來評估 對側息慢/同側歪斜。此表現出在人類中風病人中可見之觸 覺消失（Rose，et al. 1994)。此試驗先前詳述過（Hunter，et al., Neuropharmacology 39:806-816 (2000); Virley et al Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 20:563-582 (2000)) 〇 簡 言之，將一片圓形且具黏性的紙標蕺堅固地放在前腳無毛 髮區，以相同壓力但任意次序放置（左，右）。訓練段落在 MCAO前進行6天，以第6天之數據為操作前之基線（第〇 天）。在MCAO後24小時及7天時給予二次試驗，其中數據代 表二次試驗之平均值。記錄接觸及移去標籤之潛伏期，並 利用對數等級試驗分析（Cox, J. Royal Statistical Society B 14:187-220 (1972)) ° 橫樑步行（Beam walking) 橫樑步行係用來偵測後肢及前肢協調性，利用穿越高100 公分橫樑之有距離行走（2·3公分直徑，高出地板48公分）如 先前所詳述（Virley et al -Tournal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 20:563-582 (2000))。大鼠由開始至完成均作穿 越橫樑之訓練。於試驗時，各大鼠在MCAO後24小時及7天 給予二次試驗，數據代表二次試驗之平均。統計分析依循 87116 -41 - 1323265 史都頓t-檢定為ANOVA(變異數分析）。 27-點的神經學分數（研究· 1) 此研究由一套試驗組成，以1平估神經學狀況，包括：腳 安置，前腳可見之伸展，水平橫桿，對側旋轉’傾斜平面， 右側反射，對側反射，運動力及一般狀況，如先前所述 (Hunter, et al. Neuropharmacology (2000))並加上 握抓強度測定（右前肢握抓良好為分數2，弱的握抓為丨”正 常動物之總分=27。 於研究2中’此試驗進一步修飾：握抓強度_正常分數3, 良好-2，弱-1，極弱·〇;運動力-正常分數4,極佳_3，很好 -2，好-1 ’順利·〇 ; 一般狀況·正常分數4，極佳_3，很好·2， 好-1，順利_〇 ;打轉-無分數5，喜一側_4，大圈圈_3，中圈 -2 ’小圈-1 ’自旋_〇。正常動物之總分=32。 在一個試驗中，動物均在MCAO後1，24，48小時及7天 時進行’正常健康的動物分數分別為27或32分。數據以中 值數值示出’統計分析是克瓦變異數分析（Kruskil Wallis ANOVA) 〇 傷處評估 研究1-於各動物，在腦中三個預定層次取出之切片上評 估傷處（分別距前囪0，-2.0及-6.0毫米）。神經元損傷利用曱 盼基快紫染色評估，且以Optimas 6.1影像分析套組測出受 傷區域。數據以平均面積（毫米2)士sem表示。 研死2-於各動物，在腦中7個預定層次取出之切片上評估 傷處（+3毫米至-8毫米w.r.t.前囪）。神經元損傷利用酚基快 87116 -42- ’ j染色〇平估’且以〇ptimas 6· 1影像分析套組測出受傷區 域。數據以平均面積（mm2)土平均標準誤差表示。 結果 研究N腦室内（i.c.v.)投予抗-MAG mab 神經學分數 在MCAO後1小時，動物在二個處理組中均顯示神經學分 數有顯著的損傷（在各組中之中間分數是12)。此時二組間無 顯著的差異，然而，MCAO後24小時（p=〇.〇2)，48小時（p= 0.005)及7天（ρ=〇·006)，以抗_MAG mab處理的動物（25微 克’ MCAO後1 ’ 24及72小時）與以對照組igG處理組比較， 神經學總分有顯著的改進。在1§〇1處理組中，於MCa〇後 24 ’ 48小時及7天之中間值神經學分數分別是丨5，丨4及丨8， 相較於抗-MAG mab處理组之19.5，21.5及22。包括總分在 内之個別行為進一步分析，顯著的改進主要歸因於在下列 試驗中有改進之行為：腳之安置（24小時，ρ=〇·〇45; 48小時， ρ=0·016 ; 7天，ρ=〇·〇〇8)，握抓強度（24小時，ρ=〇·〇49，48 小時，ρ=0.0495 ; 7天，ρ=〇·243)，運動力（24小時，ρ=〇.199， 48小時，ρ=〇_〇 12 ; 7天，ρ=〇_〇67)，水平橫桿（24小時， ρ=0_065，48 小時 ’ ρ=0.〇〇5 ; 7天，ρ=0·016)，傾斜平面（24 小時，ρ=0·006，48小時，ρ=〇·〇〇6 ; 7天，ρ=0.169)，可見之 前腳伸展（48小時，ρ=0.〇49 ; 7天，ρ = 0·049)及打轉程度（24 小時 ’ ρ=0.417 ’ 48小時，ρ=〇.〇34 ; 7天，ρ = 0·183)。 橫操步行 在手術前，所有動物均訓練穿越橫樑（100公分）。以抗 87116 -43- 1323265 -MAG(50±18公分）及IgGK22土14公分）處理之動物，橫樑上 行走距離於手術後24小時較手術前有顯著的損害^雖然不 顯著，以抗-MAG處理之動物較1§(?1動物有更顯著之改善， 因tMCAO後24小時，其步行距離二倍長於、^動物。然而 手術後7天，雖然二組隨時間有顯著之改善，但與基線比較 (55 士 15公分；p=0.〇〇5)以IgG處理之動物行為仍顯著損害。 然而相反的，於MCAO後7天，以抗-MAG mab處理之動物 (2.5微克，卜24及72小時，i.c.v. MCAO後）其行為並不顯著 異於基線（75±15公分；ρ=〇·〇7)。此數據顯示，與老鼠經IgGi 處理之對照組比較，抗-MAG mab處理可加速此橫樑步行試 驗之恢復。 黏性標籤 手術前’各處理組之動物快速接觸及撕去各前腳之標 籤，此中在處理前各組無顯著差異（表丨）。MCao後24小時 及7天，各處理組中與左腳接觸之潛伏期仍相當沒變化，而 右腳則顯著增加。然而在抗_MAG及IgG!處理動物中，移去 時間之間並無顯著差異。此外，MCA〇後24小時，與基線 比較下在二處理组中，自左及右腳移去之潛伏期均有顯著 增加，而抗-MAG组自左腳移去之潛伏期顯著短於“(^組 (P=〇_〇3)。抗-MAG組和IgG,組在右腳移去方面，也有類似 減短之傾向（ρ=〇·〇8)(表1)〇 7天後，在1§(}1組有某些程度之 恢復，因為和24小時比較下自各腳移除之潛伏時間均較為 減短（表1)。此中之數據推知’以抗_MAG mab處理動物可加 速tMCAO後自此黏性標籤試驗中之恢復。 87116 • 44- 1323265 衣1-黏 天數 性楛籤驭 處理 也豕 _______1 接觸時間(秒)(平均±sem) 移去時間(; 吵)(平均土sem) 左腳 右腳 左腳 右腳 〇 抗-MAG 2.4±0.2 3.6 土 0·5 12±2 12±2 0 IgGi 3_3 土 0.6 4.2 土 0·7 10 土 1 9±1 1 抗-MAG 5.9±3.7 109.6 士 27.5 *61±26 96±26 1 IgGi 3.6±0.5 71.8±31.7 130±21 156±19 7 抗-MAG 3.8 士 1 36.4±10.2 54±23 80±30 7 IgGi _ 2.8±0_3 64±28 23 土 8 87±20 (*p=0.03抗-MAG v's IgG!利用對數等級試驗） 受損區域測度 在tMCAO後7天時檢查，i.c.v·投予抗-MAG mab和以等量 老鼠IgGi處理比較，前者在三個腦層次受檢區中有二個的 受損區域顯著減少（表2)。 表2 平均受指 !區域士sem(毫米2)，tMCAO後7天 處理 0毫米wrt前囪 -2毫米wrt前囪 -6毫米wrt前囪 抗-MAG mab(n=8) *9±2 $4±3 1— — #3±1 老鼠 14±1 12±1 5±1 (*p=0,02，$p=0.03 ’ #p=0.06 ’ 抗.MAG v’s IgG!，單向，未 成對的史都頓氏檢定） 研究2-靜脈内（i.v_)投藥 神經學分數 MCAO後1及24小時，二組動物之神經學分數均有顯著的 87116 -45- 1323265 受損。此時二組間無顯著差異，抗-MAGmab及4〇,處理後 24小時之中間值分數分別是20及18(p=0.5)。MCAO後48小 時，以抗-MAG mab處理之動物（200微克，i.v. 1及24小時 MCAO後）在腳之安置（p=0.048)及握抓強度（ρ=0·033)上均有 顯著改進。腦部絕血開始後7天，以抗-MAG mab處理的動 物繼續有所改進（腳安置=0.041 ;握抓強度，p=0.048 ;運動 力，ρ=0·05)和老鼠IgG,組比較（中間值分數23，p=0.047)在 神經學總分上（中間值分數25)有顯著改進。 受損區域偵測 抗-MAG抗體當以i.v.投予時，在MCAO後7天檢查且與同 型對照組比較，在7個預定腦層次中有5個（+3至-8毫米w.r.t. 前囪）受損區域MCAO有顯著減少狀況。 腦層次wrt前囪 平均受損區域士 SEM(毫米2) 平均受損區域±SEM(毫米2) -抗-MAG處理 -老鼠IgG!處理 3毫米 *0.38 土 0.27 1.77±0.45 1毫米 *5.82 土 1.65 9.627士 1.14 -1毫米 8.98±2.58 12.07±1.57 -2毫米 7.28 土 1.92 10_04 士 1.87 -4毫米 *5_57 士 1_06 10.38 士 1.39 -6毫米 *1.36±0.51 4.43±1.95 -8毫米 *0.27±0.27 1.93±0.56 *p<0.05-未成對，單向史都頓氏T-檢定 結論 在大鼠短暫性中腦動脈阻塞後，抗-MAG單株抗體不論是 87116 -46- 1323265 直接投予至CSF或靜脈内方式，與對照組處理動物比較下， 均可減低細胞死亡面積，並改善功能性恢復。在這些研究 中所觀察到之神經保護程度可推知，此作用並不可歸因於 軸突之芽出，因為如此不致造成神經元之空出。此點在 MCAO後24及48小時所觀察到之功能恢復之改進，反映出 和對照組動物比較下此抗體可提供某程度之神經保護作 用。然而，隨著時間動物似乎有更進一步的改進，推知阻 斷MAG活性也可加強隨時間變化之功能性恢復。 在此提出之研究以證據顯示，阻斷MAG作用可在大鼠中 風模式中提供神經保護作用及加強功能性恢復，因此針對 中風後之急性神經保護及/或功能恢復之促進，抗-MAG抗 體可提供具潛力之治療劑。經由i.v路徑投予低量抗體及所 造成之低血清抗體水平接著可推知，因為血腦障壁限制抗 體穿透因此腦中是極低之抗體濃度。然而令人驚訝的是， 此仍可造成所觀察到之神經保護作用及加強之功能恢復。 抗-MAG抗體在治療其他神經學失調症上也有具潛力之用 途，此失調症是指細胞及/或神經纖維之退化十分明顯時， 如脊柱損傷，外傷性腦傷，周圍神經病變，阿滋海默氏症， 前額-顳癡呆（tauopathies)，巴金森氏病，亨丁頓氏病及多發 性硬化。在以下之實例中，此中揭示之嵌合型及人體化抗 體之CDRs是實例1抗體之CDRs。 實例2-嵌合抗體 改造抗體包括嵌合抗體，其包括由一種類所衍生之可變 區，連接來自另一種類之固定區。本發明之老鼠-人類嵌合 87116 •47- 1323265 抗-MAG免疫球蛋白鏈之實例示於圖1，2及3。利用人類 IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE ’ IgM，IgD固定區之 老鼠-人類嵌合體可被產生，如同老鼠可變區加上來自非人 類種類重或輕鏈固定區之嵌合體。 圖l(Seq ID No: 27)提出嵌合免疫球蛋白重鏈之胺基酸序 列，其中鼠類抗-MAG重鏈可變區加上具功能之免疫球蛋白 分泌訊號序列，以及加上人類IgG 1固定區之改造型式，其 中Kabat殘基248及250已突變成丙胺酸，以使結合至FcyRI 及補體蛋白質Clq之效應物功能失去能力（Duncan, A.R. and Winter, G. Localization of the Clq binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738-740, 1988. Duncan, A.R., Woolf, J.M., Partridge, L.J., Burton, D.R. and Winter, G. Localisation of the binding site for human FcRl on IgG. Nature 332, 563-564, 1988)。此種突變是視所需製作，以定 做成改造抗體可達到特殊治療作用之特性-如結合及阻斷 抗原之功能，但不會活化溶解性效應物之機制。 圖2(Seq ID No: 28)提出嵌合免疫球蛋白輕鏈之胺基酸序 列，其中鼠類抗-MAG輕鏈可變區結合以具功能之免疫球蛋 白分泌訊號序列，以及人類κ鏈固定區。 類似地，抗-MAG可變區可加上免疫球蛋白固定區，其無 使效應物功能失能之突變。圖3(Seq ID No: 29)提出嵌合免 疫球蛋白重鏈之胺基酸序列，其中鼠類抗-MAG重鏈可變區 加上具功能之免疫球蛋白分泌訊號序列以及人類IgGl固定 區之野生型。 87116 -48- 1323265 由圖1至3所提供之資訊中，以精藝者熟知之標準分子生 物技術可製備編碼這些嵌合鏈之cDNA嵌入子。簡言之，使 用遺傳密碼來鑑定編碼欲求胺基酸之核苷酸密碼子，生成 編碼嵌合蛋白質之實質的cDNA序列。若欲將cDNA嵌入子 在特殊有機體中表現，則可依據已知之密碼子使用偏見選 用特別有益之密碼子。欲求之核苷酸序列再利用模板行 pcr擴大作用合成之，模板中含有重疊的合成寡核：y：酸， 其作為連續性，代表欲求序列。所生成之產物-可以PCR或 突變形成予以修飾，以接附上限制位置以促進選殖至適合 的質體以供表現或進一步操作。

實例3-ELISA中嵌合抗體結合至大鼠MAG 含有本發明輕及重鏈CDRs之嵌合抗-MAG抗體，由CHO 細胞之瞬時轉感產生。基於此，使用Transfast轉感試劑 (Promega; E243 1)，再依操作指示進行轉感。簡言之，〜106 CHO細胞塗佈在6孔洞培養盤之各孔洞中。次日，編碼適合 重或輕鏈之哺乳動物表現載體DNA，以1 : 1比例（5微克之 總 DNA)混合至培養基中（Optimeml with Glutamax; Gibco #5 1985-〇26)。加入Transfast轉感試劑且溶液轉移至有匯集 細胞層之孔洞中。在37°C之細胞培育箱中1小時後，DNA/ Transfast混合物上覆上2毫升之Optimem培養基，再置培育 箱48-72小時。回收上清液，以離心使澄明化再通過0.2微米 之濾膜。以ELIS A決定在CHO細胞培養上清液中抗體之濃 度，據估計約0.5微克/毫升。於MAG結合時，使用商品化 之大鼠MAG-Fc。由於與人類Fc融合，因此以抗-人類IgG二 87116 -49- 1323265 次抗體無法測及所結合之嵌合抗體。反之，可使用抗-人類 K輕鏈-特異的抗體。圖4示出此嵌合抗體即使在1/64稀釋下 仍可與MAG結合。不相關的人體化抗體及來自偽轉感細胞 之培養物上清液，在此分析中不會產生任何訊號。 步驟： ELISA微滴定盤（Nunc Maxisorp)以1微克/毫升大鼠MAG-Fc融合蛋白質（R&D systems; 538-MG)在PBS中塗佈，在4°C 下歷一夜。盤以PBS洗二次，再以PBS/BSA(l%w/v)阻斷， RT下1小時。來自瞬時轉感CHO細胞之培養物上清液通過 0.2微米濾膜，並以PBS/BSA連續稀釋，由純的上清液開始 到1/64稀釋。樣品稀釋液置RT下1小時，盤再以PBS/Tween 20 (0.1 % v/v)洗三次。偵測抗體是山羊抗-人類κ輕鏈特異之 過氧化酶共軛物（Sigma A-7164)以PBS-BSA稀釋1/2000。偵 測抗體在RT下培育1小時，盤再如上述般洗滌。加入受質溶 液（Sigma Fast OPD-9187)，並培育直到可測及適當之呈色為 止，再加3 M H2S04使停止。於490毫微米下讀取呈色。 實例4-人體化之抗體 改造抗體包括人體化抗體，其含有人體化可變區連接至 人類固定區。本發明人體化抗-MAG免疫球蛋白鏈之實例示 於圖5。可產生利用人類IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，IgA， IgE，IgM，IgD固定區之人體化抗體。 圖5(Seq ID No: 30)示出人體化免疫球蛋白重鏈之胺基酸 序列實例，其中人體化之抗-MAG重鏈可變區，加上具功能 之免疫球蛋白分泌訊號序列，並加上人類IgG 1固定區之改 87116 -50- 1323265 造型，其中Kabat殘基248及250已突變成丙胺酸以使與 FcyRI及補體蛋白質Clq結合之效應物功能失能（Duncan， A.R. and Winter, G. Localization of the Clq binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738-740, 1988. Duncan, A.R., Woolf, J.M., Partridge, L.J., Burton, D.R. and Winter, G. Localisation of the binding site for human FcRl on IgG. Nature 3 32, 5 63_564, 1988)。此種突變是視所需製作以 定製改造抗體達到特殊治療作用之特性-如結合及阻斷抗 原之功能，但不會活化溶解效應物機制。 圖5(Seq ID No: 31)也提出人體化免疫球蛋白輕鏈之胺基 酸序列，其中人體化抗-MAG輕鏈可變區，加上具功能的免 疫球蛋白分泌訊號序列，及人類κ固定區。 類似地，抗-MAG可變區可加上免疫球蛋白固定區，其中 缺乏可使效應物功能失能之突變（Seq ID No: 32)生成人體 化免疫球蛋白重鏈之胺基酸序列，其中人體化抗-MAG重鏈 可變區，加上功能性免疫球蛋白分泌訊號序列，以及野生 型人類IgGl固定區。 由圖5所提供之資料，編碼這些人體化鏈之cDNA可由精 藝者熟知之標準分子生物技術製備。簡言之，使用遣傳密 碼來鑑定編碼欲求胺基酸之核苷酸密碼子，生成編碼蛋白 質之確實cDNA序列。若欲在特殊有機體中表現cDNA嵌入 子，則可依據已知之密碼子使用偏見選用特別有益之密碼 子。欲求之核苷酸序列再利用模板PCR擴大作用合成之， 模板中含有重疊的合成寡核甞酸，其充作連續性，代表欲 87116 -51 - 1323265 求之序列。所生成之產物也可以PCR或突變形成修飾，以 黏附上限制位置以促進選殖至適合質體以表現或進一步操 作。

實例5-人體化抗-MAG抗體結合至ELISA中之大鼠及人類 MAG 1) 針對9種人體化重及輕鏈組合，常規化量之培養物上 清液直接結合ELISA至大鼠MAG-Fc融合蛋白 含有本發明輕及重鏈CDRs之人體化抗-MAG抗體，可由 CHO細胞之瞬時轉感產生。針對此，使用Transfast轉感作用 試劑（Promega; E2431)並依操作指示進行轉感。簡言之，6 孔洞之培養盤，每孔洞中塗佈約106 CHO細胞。次日，編碼 適合重或輕鏈之哺乳動物表現載體DNA，以1 : 1比例（5微 克總DNA)混合在培養基中（Optimeml加上Glutamax; Gibco #51985-026)。加入Transfast轉感試劑，且溶液轉移至有融 合狀細胞層之孔洞内。在3 7 °C之細胞培育箱中1小時後， DNA/Transfast混合物上覆以2毫升Optimem培養基，並再置 培育箱中48-72小時。回收上清液，以離心使澄明化，再通 過0.2微米濾膜。由下表所示之序列中產生9種重及輕可變 鏈組合，且依據SEQ ID，IgGl重鏈固定區是有功能的。 SEQIDNo.(V-區） 說明 不同名稱 13 人體化Vh BVhl 14 人體化Vh BVh2 15 人體化Vh BVh3 16 人體化VI CV11 87116 -52- 17 人體化VI CV12 18 人體化VI CV13 19 人體化VI CV14 1323265 抗體濃度以ELIS A決定，且用於分析中之上清液含量常規 化至250或500毫微克/毫升之始濃度（依培養物上清液之濃 度而定）。至於抗原則使用商品化之大鼠MAG-Fc(R&D Systems; 538-MG)。由於此抗原與人類Fc之融合，因此利用 一般的抗-人類IgG二次抗體無法測及結合之嵌合抗體。反 之，使用抗-人類κ輕鏈-特異的抗體。圖6示出此中受檢的 所有9種人體化抗體，其以低至約4毫微克/毫升之極類似結 合曲線結合至大鼠MAG ^充作參考品之嵌合抗體，其示出 之結合特性屬於此中受檢之人體化抗體群内。雖非絕對 的，但由此可推知此處受檢之人體化抗體，其親和力與充 作此中參考品之非人體化嵌合抗體之親和力範圍十分接 近。 步驟 96孔洞之Nunc Maxisorp盤，以大鼠MAG-Fc融合蛋白（1 微克/毫升；R&D Systems; Cat. No. 538-MG)於 PBS，在 4°C 下塗佈一夜。盤以含有Tween 20之PBS (0.1% v/v ; PBST)洗 二次，再以含有BSA之PBS(1% w/v)阻斷，在室溫下1小時。 可變量之培養物上清液連續稀釋於阻斷緩衝溶液中，並由 約500或250毫微克/毫升開始，加至受阻斷之孔洞中。上清 液中抗體濃度以偵測各培養物上清液中存在之人體化抗體 含量之獨立分析法為依據。可將嵌合老鼠-人類（非-人體化） 87116 -53- 1323265 抗體納入充作參考品。抗體在RT下培育1小時，盤再以PBST 洗3X。加入以阻斷緩衝溶液1/5〇〇〇稀釋之二次抗體（山羊抗 -人類κ輕鏈特異的過氧化酶共軛物；sigma A- 7164)，並在 RT下培育1小時。孔洞如上述般洗三次，再加入受質（依操 作指示溶解OPD錠，Sigma P-9187)以偵測結合《追踪呈色， 且加入3 Μ ΗΑ〇4停止反應。在49〇毫微米下讀取呈色。 2) 二種純化之人體化抗-MAG抗體重-輕鏈組合，直接結 合ELISA至大鼠MAG-Fc融合蛋白 由重及輕鏈可變區组合BVhl/CVll及BVh3/CV13(圖5)及 突變的IgGl固定區，如SEQ ID NO: 30所示，組成之二種人 體化抗體（其係BVhl/CVll突變的igGl，精藝者可容易地衍 生用於BVh3/CV13同等位之序列）可由實例3所述之瞬時轉 感擴大版產製’並利用蛋白質A親和力層析純化。純化的抗 體以PBS透析’再以OD280讀值決定濃度《抗體濃度調至 5000毫微克/毫升，並以連續稀釋液應用於大鼠MAG-Fc結 合ELISA中。圖7示出純化的抗體可結合大鼠MAG-Fc，且此 中受試之重及輕鏈可變區組合均極類似。 方法：

96-孔洞之Nunc Maxisorp盤以大鼠MAG-Fc融合蛋白（2.5 微克/毫升；R&D Systems; Cat. No_ 538-MG)於PBS，在 4°C 下塗佈一夜。盤以含有Tween 20之PBS (0.1% v/v ; PBST)洗 二次，再以含BSA之PBS(1% w/v)阻斷，於RT下1小時。純 化的人體化抗體以阻斷緩衝溶液調至起始之5微克/毫升濃 度，再連續稀釋。抗體樣品在RT下培育1小時，盤再以PBST 87116 -54- 1323265 洗3X。加入以阻斷緩衝溶液稀釋1/5 000之二次抗體（山羊抗 -人類輕鏈特異的過氧化酶共輛物；Sigma A-7164)，再於RT 下培育1小時。孔洞如上述般洗三次，再加入受質（依操作 指示溶解OPD錠，Sigma P-9187)以測定結合。追腙呈色， 且反應以3 M H2S04停止之。在490毫微米下讀取呈色。 結果： 攜有無一者或數個架構突變之純化的人體化抗體，二者 與大鼠MAG有極類似之結合。結果見於圖7。

3) 針對二種人體化重及輕鏈組合，常規化量之培養物上 清液結合至表現在CHO細胞上之人類MAG 和述於實例5 2)中相同之人體化可變重及輕鏈組合，以澄 清培養物上清液型式，對表現在CHO細胞表面之人類MAG 進行測試。針對各抗體所使用之培養物上清液含量，依 ELISA所決定之抗體濃度而常規化。於此，96孔洞盤（Nunc Maxisorp)以山羊抗-人類 IgG(y)鏈（Sigma 1-3382;於 pH 9.6 之碳酸氫鹽緩衝溶液中；2微克/毫升）在4°C下塗佈一夜。次 日，盤以洗滌緩衝溶液（PBST)洗二次，再加入至少75微升 之阻斷缓衝溶液（含有BSA之PBS，1% w/v)於RT下阻斷1小 時。抗體樣品溶液以阻斷緩衝溶液連續稀釋（起始稀釋是純 的或1/2)，並成二份。Ab標準品是未相關特異性之純的人 體化IgGl抗體，且有已知濃度。 標準溶液也由500毫微克/毫升開始連續稀釋。所有抗體 溶液均在RT下培育1小時。盤如上述洗3X，再與山羊抗-人 類輕（κ)鏈特異的（自由態及結合態）過氧化酶共軛物 87116 -55- 1323265 (Sigma ; A-7164，以阻斷緩衝溶液1/5000稀釋）在RT下培育1 小時。盤如上述再次洗3X，並與受質溶液（OPD錠；Sigma P-9187)共培育直到有強烈呈色為止。加25微升3 M H2S04 停止呈色，且於490毫微米下讀取。 圖8示出此中受試的二種抗體均可確認人類MAG，且其結 合特性十分類似。CHO/-為無MAG表現之CHO細胞負面對 照組。 用於Eu細胞-為基礎之ELISA之方法

96孔洞盤（Costar 3595)充填以100微升細胞上清液/孔洞 (見下表，於第1，2，3或4天進行分析時所建議之細胞數目）。 天數 細胞數目/毫升 1 3x 105 2 1 X 105 3 5x 104 4 1 x 104

移出培養基，且盤以DMEM/F12 (Sigma D6421)其中含有 FCS (10%)，BSA (1%)，NaN3 (1% ;阻斷緩衝溶液）阻斷， RT下1小時。再移出阻斷溶液，並加入樣品（於阻斷緩衝溶 液，50微升/孔洞）。樣品在4°C下培育1小時。盤再以PBS利 用Skatron洗盤機洗3X。洗後，細胞以0.5%仲醛（稀釋於PBS) 固定，4°C下20分鐘，並如上述般再次洗滌。加入於銪缓衝 溶液（50 mM Tris鹼，150 mM NaCM， 0.5% BS A，0.1 克/升，

Tween 20，7.86毫克/升DTPA，於pH 7.3)中之經稀釋的50微 升/孔洞銪-共軛之二次抗體，並在4°C下培育1小時。如上述 87116 -56- 1323265 般洗盤，再每孔洞加入200微升Delphia加強溶液。溶液在RT 下培育5-10分鐘。孔洞於24小時内在Victor上讀取。 4) 二種純化的人體化抗體及非-人體化老鼠單株抗體，競 爭性£1^18八結合至大鼠]^八0-?(；融合蛋白 方法： 96孑L洞Nunc Maxisorp盤，以大鼠MAG-Fc融合蛋白（2.5微 克/毫升；R&D Systems; Cat. No. 538-MG)於PBS在 4°C 下塗 佈一夜。盤以含有 Tween 20之 PBS (0.1% v/v ; PBST)洗二 次，再以含BSA之PBS(1% w/v)於室溫下阻斷1小時。純化 的人體化抗體調至200毫微克/毫升濃度，並等體積混合以 於阻斷緩衝溶液中製成之競爭物分子，其範圍由6000至0毫 微克/毫升。競爭物或是親代老鼠單株抗體（抗-MAG)，或是 不相關之老鼠單株抗體（INN1)，在相同濃度下（僅BVhl/ CV11)。抗體/競爭物溶液在RT下培育1小時，盤再以PBST 洗3X。加入以阻斷緩衝溶液1/5000稀釋之二次抗體（山羊抗 -人類輕鏈特異性-過氧化酶共輛物；Sigma A-7164)，並在 RT下培育1小時。孔洞如上述般洗三次，再加入受質（依據 操作指示溶解OPD錠；SigmaP-9187)以偵測結合。在490毫 微米下偵測呈色。 結果： 二種純抗體製劑均可為原先之老鼠單株抗體同等地競 爭，但有不相關特異性之老鼠單株抗體則否-見圖9。此顯 示原先之老鼠單株抗體及此中受試之人體化抗體均可能可 確認相同的表位，且對大鼠MAG可能有極類似之親和力。 87116 -57- 1323265 98. 9. -4 , 年月日修(吏)正替換Η 第092121286號專利申請案 中文說明書替換頁(98年9月） 【圖式簡單說明】

圖1 :老鼠/人類嵌合型抗-MAG抗體重鏈之序列（Seq ID

No: 27) 〇

圖2:老鼠/人類嵌合型抗-MAG抗體輕鏈之序列（Seq ID

No: 28) °

圖3 :老鼠/人類嵌合型抗-MAG抗體重鏈之序列（Seq ID

No: 29) ° 圖4 :抗-MAG嵌合體結合至大鼠MAG。 圖5 :人體化抗-MAG抗體序列。 圖6 : MAG結合以常規量之上清液。 圖7 :由OD280決定之純化抗體濃度。 圖8 :人體化抗-MAG抗體結合至人類MAG。 圖9:二種純化的人體化抗體及未人體化老鼠單株抗體與 大鼠MAG-Fc融合蛋白質結合之競爭ELISA。 87116-980904.doc 58- <400〉 5 1323265 第092121286號專利申請案 中文補充序列表(98年9月） 序列表 <110〉英商葛籣素争團有限公司（GLAXO GROUP LIMITED) <120〉抗體(ANTIBODIES) <130> PG4912 <140〉 092121286 <141〉 2003-08-05 <150〉0218229.3 <151〉 2003-08-04 <160> 32 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210〉 1 <211> 17 <212> PRT <213〉小鼠 <400〉 1

Lys Ser Ser His Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu <210〉 2 <211> 7 <212> PRT <213〉小鼠 <400> 2

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser <210> 3 <211> 8 <212〉 PRT <213〉小鼠 <400〉 3

His Gin Tyr Leu Ser Ser Leu Thr <210> 4 <211> 5 <212〉 PRT <213〉小鼠 <400〉 4

Asn Tyr Gly Met Asn <210〉 5 <211〉 17 <212> PRT <213〉小鼠

Trp lie Asn TTir Tyr Hir Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Thr 15 10 15

Gly 87116·序列表-980904.doc 83ν97-Τ^---~ 手月日修(楚)正本i

1323265 <210> 6 <211> 17 <212〉 PRT <213〉小鼠 <400> 6

Asn Pro lie Asn Tyr Tyr Gly lie Asn Tyr Glu Gly Tyr Val Met Asp 15 10 15

Tyr <210〉 7 <211> 51 <2I2> DNA <213〉小鼠 <400〉 7 aagagcagcc acagcgtgct gtacagcagc aaccagaaga actacctggc c <210〉 8 <400〉 8 000 <210〉 9 <211〉 24 <212〉 DNA <213〉小鼠 <400> 9 caccagtacc tgagcagcct gacc <210〉 10 <211〉 15 <212> DNA <213〉小鼠 <400> 10 aactacggca tgaac <210> 11 <211〉 51 <212〉 DNA <213〉小鼠 <400> 11 tggatcaaca cctacaccgg cgagcccacc tacgccgacg acttcaccgg c <210〉 12 <211> 51 <212〉 DNA <213〉小鼠 <400〉 12 aaccccatca actactacgg catcaactac gagggctacg tgatggacta c <210〉 13 <211> 126 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人體化重鏈可變區 <400〉 13

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 87116-序列表-980904.doc 1323265

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin lie Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Pro lie Asn Tyr Tyr Gly lie Asn Tyr Glu Gly Tyr Val 100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 14 <211〉 126 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人體化重鏈可變區 <400〉 14

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin lie Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Pro lie Asn Tyr Tyr Gly lie Asn Tyr Glu Gly Tyr Val 100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 15 <211〉 126 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>人體化重鏈可變區 <400> 15

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin lie Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Pro lie Asn Tyr Tyr Gly lie Asn Tyr Glu Gly Tyr Val 100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210〉 16 <211> 115 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人體化輕鏈可變區 <400> 16

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15 871 丨 6·序列表·980904·(1〇〇 1323265

Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser His Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30

Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gin 85 90 95

Tyr Leu Ser Ser Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

Arg Thr Val 115 <210〉 17 <211〉 115 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人體化輕鏈可變區 <400> 17

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser His Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30

Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie lie Asn Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gin 85 90 95

Tyr Leu Ser Ser Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

Arg Thr Val 115 <210〉 18 <211> 115 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人體化輕鏈可變區 <400〉 18

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser His Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30

Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu His Thr Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gin 85 90 95

Tyr Leu Ser Ser Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

Arg Thr Val 115 <210> 19 <211〉 115 <212〉 PRT <213〉人工序列 4 87116-序列表-980904.doc m 1323265 <220〉 <223〉人體化輕鏈可變區 <400> 19

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser His Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30

Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie lie Asn Leu His Thr Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gin 85 90 95

Tyr Leu Ser Ser Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

Arg Thr Val 115 <210〉 20 <211〉 378 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人體化重鏈可變區 <400> 20

Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys 15 10 15

Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Ala Gly Thr Thr 20 25 30

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys 35 40 45

Thr Cys Ala Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Thr Thr Cys Cys Thr 50 55 60

Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Ala 65 70 75 80

Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Ala Cys Thr Ala Ala Cys Thr Ala Cys 85 90 95

Gly Gly Cys Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Cys 100 105 110

Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala 115 120 125

Ala Gly Gly Gly Cys Thr Thr Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Gly 130 135 140

Gly Gly Ala Thr Gly Gly Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Cys Cys Thr 145 150 155 160

Ala Cys Ala Cys Cys Gly Gly Cys Gly Ala Gly Cys Cys Cys Ala Cys 165 170 175

Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Thr Thr Cys 180 185 190

Ala Cys Cys Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Thr Gly Thr Cys Thr 195 200 205

Thr Cys Thr Cys Cys Thr Thr Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Thr Cys 210 215 220

Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Cys Gly Gly Cys Ala Thr Ala Thr 225 230 235 240

Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys 245 250 255

Thr Ala Ala Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys 260 265 270

Thr Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr 275 280 285

Gly Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Cys Cys Ala Thr Cys Ala 290 295 300

Ala Cys Thr Ala Cys Thr Ala Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys Ala Ala 305 310 315 320

Cys TTir Ala Cys Gly Ala Gly Gly Gly Cys Thr Ala Cys Gly Ήιγ Gly 325 330 335

Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys 340 345 350 87 丨 16-序列表-980904.doc 1323265

Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys Ala Cys Thr Ala Gly Thr Cys Ala Cys 355 360 365

Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala 370 375 <210〉 21 <211〉 378 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人體化重鏈可變區 <400〉 21 caggtgcagc tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact aactacggca tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacacct acaccggcga gcccacctac 180 gccgacgact tcaccggccg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag cacggcatat 240 ctgcagatca gcagcctaaa ggctgaggac actgccgtgt atttctgtgc gagaaacccc 300 atcaactact acggcatcaa ctacgagggc tacgtgatgg actactgggg ccagggcaca 360 ctagtcacag tctcctca 378 <210〉 22 <211〉 378 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人體化重鏈可變區 <400〉 22 caggtgcagc tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact aactacggca tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacacct acaccggcga gcccacctac 180 gccgacgact tcaccggccg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag cacggcatat 240 ctgcagatca gcagcctaaa ggctgaggac actgccacct atttctgtgc gagaaacccc 300 atcaactact acggcatcaa ctacgagggc tacgtgatgg actactgggg ccagggcaca 360 ctagtcacag tctcctca 378 <210> 23 <211〉 345 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人體化輕鏈可變區 <400〉 23 gacatcgtga atcaactgca tggtaccagc gaatccgggg atcagcagcc ctgacctttg tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 agagcagcca cagcgtgctg tacagcagca accagaagaa ctacctggcc 120 agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180 tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcaccagta cctgagcagc 300 gccaggggac caagctggag atcaaacgta cggtg 345 <210> 24 <211〉 345 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人體化輕鏈可變區 <400〉 24 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agagcagcca cagcgtgctg tacagcagca accagaagaa ctacctggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcatcaacc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcaccagta cctgagcagc 300 ctgacctttg gccaggggac caagctggag atcaaacgta cggtg 345

<210> 25 <211> 345 <212〉 DNA -6- 87116-序列表-980904.doc is ] 1323265 <213〉人工序列 <220〉 <223〉人體化輕鏈可變區 <400> 25 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc atcaactgca agagcagcca cagcgtgctg tacagcagca accagaagaa ctacctggcc tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc atcagcagcc tgcacaccga agatgtggca gtttattact gtcaccagta cctgagcagc ctgacctttg gccaggggac caagctggag atcaaacgta cggtg <210> 26 <211> 345 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人體化輕鏈可變區 <400> 26 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc atcaactgca agagcagcca cagcgtgctg tacagcagca accagaagaa ctacctggcc tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc atcatcaacc tgcacaccga agatgtggca gtttattact gtcaccagta cctgagcagc ctgacctttg gccaggggac caagctggag atcaaacgta cggtg <210> 27 <211> 475 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人體化重鏈 <400> 27

Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15

Val His Ser Glu lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30

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Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 87116·序列表-980904.doc 1323265 290 295 300

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 315 320

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Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15

Val His Ser Asn lie Met Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val 20 25 30

Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser His Ser Val 35 40 45

Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys 50 55 60

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Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 130 135 140

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Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser 180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly 210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210〉 29 <211> 475 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人體化重鏈 <400〉 29 -8- 87116-序列表-980904.doc is 1 1323265

Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu 1 5

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Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 305 310

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Asn Tyr Tyr Gly lie Asn Tyr Glu 125

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Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15

Val His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys 20 25 30 -9- 87116-序列表-980904.doc 1323265

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Glu Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80

Asp Asp Phe Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gin lie Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Pro lie Asn Tyr Tyr Gly lie Asn Tyr Glu 115 120 125

Gly Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 130 】35 340

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 145 150 155 160

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 165 170 175

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 180 185 190

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 195 200 205

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin 210 215 220

Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 225 230 235 240

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 245 250 255

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260 265 270

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275 280 285

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290 295 300

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 315 320

Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325 330 335

Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340 345 350

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Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 370 375 380

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Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 405 410 415

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420 425 430

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Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 31 <211〉 238 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人體化輕鏈 <400> 31

Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15

Val His Ser Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val 20 25 30

Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser His Ser Val 35 40 45

Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys 50 55 60 -10· 871 丨 6-序列表-980904.doc is i 1323265

Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 65 70 75 80

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Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175

Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser 180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly 210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 32 <211> 475 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人體化重鏈 <400> 32

Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15

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Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325 330 335 -11 - 87116-序列表 _980904.doc 1323265

Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340 345 350

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys 355 360 365

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr- Leu Pro Pro Ser Arg Asp 370 375 380

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Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 405 410 415

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420 425 430

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 435 440 445

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Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 -12- 87116-序列表-980904.doc

Claims (1)

1323265

第092121286號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(98年9月） 拾、申請專利範圍： 1. 一種可結合及中和MAG之人體化抗-MAG抗體，其包含選自 由下列組成之群之重鏈可變區：SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14及SEQ ID NO. 15，以及選自由下列組成之群之輕鏈 可變區：SEQ ID NO.16、SEQ ID N0.17、SEQ ID N0.18 及 SEQ ID NO.19。 2. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1之可結合及中和MAG 之人體化抗-MAG抗體，並進一步包含醫藥上可接受之稀 釋劑或載劑。 3. 如請求項1之可結合及中和MAG之人體化抗-MAG抗體，其進 一步包含人類輕鏈之恆定部分或其月段及人類重鏈之恆 定部分或其片段。 4. 一種可結合並中和MAG之人體化抗-MAG抗體，其包含： 具SEQ ID NO.13之重鏈可變區，及 具SEQ ID NO.16之輕鏈可變區。 5. 一種可結合並中和MAG之人體化抗-MAG抗體，其包含： 具SEQ ID NO.13之重鏈可變區，及 具SEQIDNO.17之輕鏈可變區。 6. —種可結合並中和MAG之人體化抗-MAG抗體，其包含： 具SEQ ID NO.13之重鏈可變區，及 具SEQ ID NO.18之輕鏈可變區。 7. 一種可結合並中和MAG之人體化抗-MAG抗體，其包含： 具SEQIDNO.13之重鏈可變區，及 具SEQ ID NO.19之輕鏈可變區。 87116-980904.doc 1323265 8. 一種可結合並中和MAG之人體化抗-MAG抗體，其包含： 具SEQIDNO.14之重鏈可變區，及 具SEQIDNO.16之輕鏈可變區。 9. 一種可結合並中和MAG之人體化抗-MAG抗體，其包含： 具SEQ ID NO.14之重鏈可變區，及 具SEQIDNO.17之輕鏈可變區。 10. —種可結合並中和MAG之人體化抗-MAG抗體，其包含： 具SEQIDNO.14之重鏈可變區，及 具SEQ ID NO.18之輕鏈可變區。 11. 一種可結合並中和MAG之人體化抗-MAG抗體，其包含： 具SEQIDNO.14之重鏈可變區，及 具SEQ ID NO.19之輕鏈可變區。 12. —種可結合並中和MAG之人體化抗-MAG抗體，其包含： 具SEQ ID NO.15之重鏈可變區，及 具SEQ ID NO.16之輕鏈可變區。 13. —種可結合並中和MAG之人體化抗-MAG抗體，其包含： 具SEQ ID NO.15之重鏈可變區，及 具SEQ ID NO.17之輕鏈可變區。 14. 一種可結合並中和MAG之人體化抗-MAG抗體，其包含： 具SEQ ID NO.15之重鏈可變區，及 具SEQIDN0.18之輕鏈可變區。 15. —種可結合並中和MAG之人體化抗-MAG抗體，其包含： 具SEQIDNO.15之重鏈可變區，及 具SEQIDNO.19之輕鏈可變區。 87116-980904.doc -2-