NL2002255C2

NL2002255C2 - Antilichamen tegen myostatine.

Info

Publication number: NL2002255C2
Application number: NL2002255A
Authority: NL
Inventors: Eva Rose Chin; Chikwendu Ibebunjo; Philip Albert Krasney; Junming Yie
Original assignee: Pfizer; Amgen Fremont Inc
Priority date: 2005-04-25
Filing date: 2008-11-25
Publication date: 2009-09-24
Also published as: MX2007013217A; EP1877075A2; WO2006116269A2; CR9466A; ZA200709291B; NL1033650A1; NL2002255A1; KR20080011403A; EP2295466A3; IL186739A0; EP2295466A2; TW200724548A; BRPI0610248A2; EA200702327A1; CA2605723A1; NL1033650C2; JP2008539241A; AP2007004243A0; AU2006239860B2; AU2006239860A1

Description

Titel: Antilichamen tegen myostatine

Achtergrond van de uitvinding 5

[0001] Een groeiend lichaam van bewijs geeft aan dat myostatine (mstn, groei en differentiatiefactor-8 of GDF-8) skeletgroei negatief reguleert. Bijvoorbeeld, een myostatine-nulmutatie in een kind werd geassocieerd met dramatische spierhypertrofie zonder enige duidelijke abnormaliteiten 10 (Schuelke et al. (2004) Myostatin Mutation Associated with Gross Muscle Hypertrofie in a Child, New Engl. J. Med. 350:2682-8). Een negatieve correlatie tussen spiermyostatine-eiwitniveaus en skeletspiermassa werd ook gedemonstreerd (Schulte, J.N. en Yarasheski, K.E. (2001). Effecten van weerstandtraining op de snelheid van spiereiwitsynthese in tengere oudere 15 mensen. Int. J. Sport Nutr. Exerc. Metab. 11 suppl.: Slll-820; Walker KS et al. (2004) Resistance training alters plasma myostatin but not IGF-1 in healty men. Med. Sci Sports Exerc. 36(5):787-93). Bijvoorbeeld, is er een toegenomen expressie van spiermyostatineniveaus met leeftijd en toegenomen myostatine-expressie werd ook getoond bij te dragen aan 20 muscle wasting in HlV-geïnfecteerde patiënten (Gonzalez-cadavid et al. (1998) Organization of the human myostatin gene en expression in healthy men and HIV-infected men with muscle wasting. PNAS 95:14938-4321). Daarbij, zijn verhoogde myostatineniveaus gevonden in polulaties van ouderen. (Yarasheski KE et al., (2002) Serum myostatin-immunoreactive 25 protein is increased in 62-92 year old women en men with muscle wasting. J. Nutr. Health Aging 6(5):343-8). Myostatine beïnvloedt ook botmassa aangezien myostatine-deficiënte muizen toegenomen botmineraaldichtheid hebben (Hamrick et al., (2003) Bone Architecture en Disc Degeneration in the Lumbar Spin of Mice lacking GDF-8 (Myostatin). J. Orthopaedic Res. 30 21:1025-1032 (en referenties daarin).

2

[0002] Antilichamen tegen circulerend myostatine zijn getoond toegenomen spiermassa en verbeterde glucosehomeostase te veroorzaken in muizenmodellen van type 2 diabetes mellitus. Inhibitie van myostatine door ip-injectie van een neutraliserend antilichaam verhoogt skelet spier massa, 5 verlaagt vastend bloedglucose en verbetert glucosegevoeligheid in obese diabetische muizen (Li X. et al. (2002) Inhibition of myostatin increases muscle mass en improves glucose sensitivity in obese, diabetic mice. Poster #224, in Keystone Symposia: Diabetes Mellitus: Molecular Mechanisms, Genetics en New Therapies). Daarbij A'Va muizen zijn bekend 10 insulineresistentie te ontwikkelen en worden toegepast als een model voor type 2-diabetes. Wanneer A>’/a muizen myostatinemissend worden gemaakt door deletie van het myostatine locus, hebben zij normaal gevoede glucose-en insulineniveaus, en verlagen dramatisch glucoseniveaus volgend op een exogene glucosetoediening in vergelijking met normale A-v/a muizen 15 (McPherron et al. (2002) J. Clin. Invest. 109:595-601).

[0003] De schadelijk spier, bot en metabolische defecten geassocieerd met myostatine inachtgenomen, is er een urgente noodzaak voor antilichamen als therapeutica die specifiek zijn voor myostatine en welke condities 20 voorkomen of behandelen door reduceren van myostatineactiviteit, zowel antilichamen als diagnostica om individuen te identificeren die behandeling om myostatineactiviteit te reduceren nodig hebben.

Samenvatting van de uitvinding 25

[0004] De uitvinding verschaft anti-myostatine antilichamen, nucleïnezuren hiervoor coderende, vectoren en gastheercellen voor produceren van de antilichamen, samenstellingen en kits omvattende de antilichamen en werkwijzen voor maken en toepassen van de 30 antilichamen.Verschillende uitvoeringsvormen van de uitvinding 3 beschreven in de volgende genummerde paragrafen omvatten, maar zijn niet beperkt tot deze.

1. Een humaan, chimeer of gehumaniseerd monoklonaal 5 antilichaam of een antigeenbindend gedeelte daarvan dat specifiek bindt aan myostatine.

2. Het monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte volgens paragraaf 1 waarin het myostatine humaan myostatine is.

10 3. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte volgens paragraaf 1, waarin genoemd antlichaam of gedeelte selectief ten minste 50-maal meer myostatine bindt dan GDFll.

15 4. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte volgens paragraaf 3, en waarin genoemd antilichaam of gedeelte myostatinebinding aan een activine type I of type II receptor inhibeert.

5. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte 20 volgens paragraaf 1, waarin het antilichaam of gedeelte daarvan ten minste een eigenschap heeft geselecteerd uit de groep bestaande uit: (a) wedijvert voor binding aan myostatine met een antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 25 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; (b) bindt aan hetzelfde epitoop van myostatine als een 30 antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit 1_116_1; 1_136_3; 4 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46__1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_lL-I85V; 2_112_lH-L8lM, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L I85V; en 2_112_lH-L81M, L-5 F581,185V; c ) bindt aan myostatine met substantieel dezelfde Kd als een antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 10 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; en d) bindt aan myostatine met substantieel dezelfde off-rate als een antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit 1_116_1; 1_136_3; 15 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V.

20 6. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende: (a) een CDR-set, CDR1, CDR2 en CDR3, die opeenvolgend 25 samen ten minste 90% identiek zijn in aminozuursequentie aan zware keten CDR's, CDR1, CDR2, en CDR3, opeenvolgend samen, die zijn omvat in de aminozuursequentie uiteengezet in een van SEQ ID NOs: 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85 en 118; (b) een CDR-set, CDR1, CDR2, en CDR3, die opeenvolgend 30 samen ten minste 90% identiek zijn in aminozuursequentie aan lichte keten 5 CDR's, CDRl, CDR2, en CDR3, opeenvolgend samen, die zijn omvat in de aminozuursequentie uiteengezet een van SEQ ID NOs: 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 83, 87 en 120; of ( c) een eerste CDR-set van (a) , en een tweede CDR-set van 5 (b).

7. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan volgens paragraaf 1, waarin genoemd antilichaam omvat zware keten CDR's CDRl, CDR2, en CDR3, die opeenvolgend samen ten minste 10 90% identiek in aminozuursequentie zijn aan zware keten CDR's, CDRl, CDR2, en CDR3, opeenvolgend samen, die zijn omvat in de aminozuursequentie uiteengezet in een van SEQ ID NOs: 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85 en 118.

15 8. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan volgens paragraaf 1, waarin genoemd antilichaam omvat lichte keten CDR's CDRl, CDR2, en CDR3, die opeenvolgend samen ten minste 90% identiek zijn in aminozuursequentie aan lichte keten CDR's, CDRl, CDR2, en CDR3, opeenvolgend samen, die zijn omvat in de 20 aminozuursequentie uiteengezet in een van SEQ ID NOs: 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 83, 87 en 120.

9. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte volgens paragraaf 1, waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend 25 gedeelte de zware keten CDRl, CDR2 en CDR3 sequenties omvat gevonden in een van SEQ ID NOs: 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85 of 118.

10. Een monoklaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte volgens paragraaf 1, waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend 6 gedeelte de lichte keten CDRl, CDR2 en CDR3 sequenties omvat gevonden in een van SEQ ID NOs: 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87 of 120.

11. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte 5 volgens paragraaf 1, waarin genoemd antilichaam of gedeelte omvat een zware keten dat toepast een humaan VH 1-02 gen, een humaan VH 3-21 gen of een humaan VH 3-23 gen.

12. Een monoklonaal antilichaam of een antigeenbindend gedeelte 10 volgens paragraaf 1, waarin genoemd antilichaam of gedeelte omvat een lichte keten dat toepast een humaan VkL2 gen, een humaan VkA3 gen of een humaan VkA30 gen.

13. Een monoklonaal antilichaam volgens paragraaf 1 omvattende 15 een Vu domein ten minste 90% identiek in aminozuursequentie aan het Vh domein in een van SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 of 115.

14. Een monoklonaal antilichaam volgens paragraaf 1 omvattende 20 een Vl domein ten minste 90% identiek in aminozuursequentie aan het Vl domein in een van SEQ ID NOs:4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 of 117.

15. Een monoklonaal antilichaam of een antigeenbindend gedeelte 25 volgens paragraaf 1 dat specifiek myostatine bindt, waarin: (a) de zware keten omvat de zware keten CDRl, CDR2 en CDR3 aminozuursequenties van een antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit: 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 30 1_66_1; 2^43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 7 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; (b) de lichte keten omvat de lichte keten CDR1, CDR2 en 5 CDR3 aminozuursequenties van een antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, 10 L I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; of (c ) het antilichaam omvat een zware keten van (a) en een lichte keten van (b).

16. Een monoklonaal antlichaam volgens paragraaf 12 verder 15 omvattende een Vl domein ten minste 90% identiek in aminozuursequentie aan het variabele domein in een van SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 of 117.

17. Een monoklonaal antilichaam geselecteerd uit de groep 20 bestaande uit: (a) een antilichaam omvattende aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 2 en SEQ ID NO: 4.

(b) een antilichaam omvattende aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 6 en SEQ ID NO: 8; 25 (c) een antilichaam omvattende aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 10 en SEQ ID NO: 12; (d) een antilichaam omvattende aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 14 en SEQ ID NO: 16; (e) een antilichaam omvattende aminozuursequenties 30 uiteengezet in SEQ ID NO: 18 en SEQ ID NO: 20; 8 (f) een antilichaam omvattende aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 22 en SEQ ID NO: 24; (g) een antilichaam omvattende aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 26 en SEQ ID NO: 28; 5 (h) een antilichaam omvattende aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 30 en SEQ ID NO: 32; (i) een antilichaam omvattende aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 34 en SEQ ID NO: 36; (j) een antilichaam omvattende aminozuursequenties 10 uiteengezet in SEQ ID NO: 38 en SEQ ID NO: 40; (k) een antilichaam omvattende aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 42 en SEQ ID NO: 44; and (l) een antilichaam omvatten de aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 115 en SEQ ID NO: 117.

15 18. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan geselecteerd uit de groep bestaande uit: (a) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte

omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ

20 ID NO: 2 en SEQ ID NO: 4.

(b) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 6 en SEQ ID NO: 8; (c) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte

25 omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ

ID NO: 10 en SEQ ID NO: 12; (d) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 14 en SEQ ID NO: 16; 9 (e) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 18 en SEQ ID NO: 20; (f) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte

5 omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ

ID NO: 22 en SEQ ID NO: 24; (g) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 26 en SEQ ID NO: 28; 10 (h) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 30 en SEQ ID NO: 32; (i) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte

omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ

15 ID NO: 34 en SEQ ID NO: 36; (j) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 38 en SEQ ID NO: 40; (k) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte

20 omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ

ID NO: 42 en SEQ ID NO: 44; and (l) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 115 en SEQ ID NO: 117.

25 19. Een monoklonaal antihchaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende een eerste CDR sequentieset omvattende een eerste CDR1, eerste CDR2 en eerste CDR3 en een tweede CDR sequentieset omvattende een tweede CDR1, tweede CDR2 en tweede CDR3, waarin 30 genoemde eerste CDR set en genoemde tweede CDR set elk opeenvolgend 10 samen ten minste 90% identiteit hebben aan de CDRl, CDR2 en CDR3 sequenties, opeenvolgend samen, van: (a) SEQ ID NO: 2 en SEQ ID NO: 4, respectievelijk; (b) SEQ ID NO: 6 en SEQ ID NO: 8, respectievelijk; 5 (c) SEQ ID NO: 10 en SEQ ID NO: 12, respectievelijk; (d) SEQ ID NO: 14 en SEQ ID NO: 16, respectievelijk; (e) SEQ ID NO: 18 en SEQ ID NO:20, respectievelijk; (f) SEQ ID NO:22 en SEQ ID NO:24, respectievelijk; (g) SEQ ID NO:26 en SEQ ID NO:28, respectievelijk; 10 (h) SEQID N0:30 en SEQ ID NO:32, respectievelijk; (i) SEQ ID NO:34 en SEQ ID NO:36, respectievelijk; (j) SEQ ID NO:38 en SEQ ID N0:40, respectievelijk; (k) SEQ ID NO:42 en SEQ ID N0:44, respectievelijk; en (l) SEQ ID NO.115 en SEQ ID NO:117, respectievelijk.

15 20. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende een eerste CDR sequentieset omvattende een eerste CDRl, eerste CDR2 en eerste CDR3 en een tweede sequentieset omvattende een tweede CDRl, tweede CDR2 en tweede CDR3, waarin 20 genoemde eerste CDR set en genoemde tweede CDR set elk de CDRl, CDR2 en CDR3 sequenties zijn, opeenvolgend samen, van a) SEQ ID NO: 2 en SEQ ID NO: 4, respectievelijk; (b) SEQ ID NO: 6 en SEQ ID NO: 8, respectievelijk; (c) SEQ ID NO: 10 en SEQ ID NO: 12, respectievelijk; 25 (d) SEQ ID NO:14 en SEQ ID NO: 16, respectievelijk; (e) SEQ ID NO: 18 en SEQ ID NO:20, respectievelijk; (f) SEQ ID NO:22 en SEQ ID NO:24, respectievelijk; (g) SEQ ID NO:26 en SEQ ID NO:28, respectievelijk; (b) SEQID N0:30 en SEQ ID NO:32, respectievelijk; 30 (i) SEQ ID NO:34 en SEQ ID NO:36, respectievelijk; 11 (k) SEQ ID NO:38 en SEQ ID N0:40, respectievelijk; (l) SEQ ID NO:42 en SEQ ID N0:44, respectievelijk; en (m) SEQ ID N0:115 en SEQ ID N0:117, respectievelijk.

5 21. Een monoklonaal antilichaam dat specifiek myostatine bindt omvattende de zware keten aminozuursequentie uiteengezet in SEQ ID NO: 115 en de lichte keten aminizuursequentie uiteengezet in SEQ ID NO:117.

10 22. Een monoklonaal antilichaam of een antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende de variabele regio's omvat in SEQ ID NO: 115 en SEQ ID NO:117.

23. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte 15 daarvan, die specifiek myostatine bindt omvattende CDRs CDR1, CDR2, en CDR3 omvat in SEQ ID NO:115 en SEQ ID NO:117.

24. Een monoklonaal antilichaam of een antigeenbindend gedeelte daarvan genoemd monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte 20 bindt aan peptide 1 en peptide 5 gedeelten van myostatine, waarin peptide 1 omvat de aminozuursequentie van SEQ ID NO: 103 en peptide 5 omvat de aminozuursequentie van SEQ ID NO: 107.

25. Een antilichaam geproduceerd door een cel hebbende ATCC 25 Deposit Designation Number geselecteerd uit de groep bestaande uit PTA- 6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, en PTA-6576.

26. Een farmaceutische samenstelling omvattende een antilichaam of een antigeenbindend gedeelte volgens een van paragrafen 1 - 25 en een 30 farmaceutisch acceptabele drager.

12 27. Een farmaceutische samenstelling volgens paragraaf 26, verder omvattende ten minste een therapeutisch agens.

5 28. Een werkwijze omvattende de stap van toediening aan genoemde patiënt van een antilichaam of een antigeenbindend gedeelte volgens een van paragrafen 1 - 25 of de farmaceutische samenstelling volgens paragraaf 26, waarin genoemd antilichaam, antigeenbindend gedeelte of farmaceutische samenstelling myostatineactiviteit inhibeert, 10 waarin genoemde patient het nodig heeft spiermassa te laten toenemen, het promoten van skeletspierontwikkeling, de behandeling van een spier wasting-ziekte of het versterken van skeletspiergroei.

29. Een geïsoleerde cellijn die produceert een antilichaam of een 15 antigeenbindend gedeelte volgens een van paragrafen 1 - 25 of de zware keten of lichte keten van genoemd antilichaam of genoemd antigeenbindend gedeelte.

30. Een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul omvattende een 20 nucleotidesequentie die codeert voor de zware keten of een antigeenbindend gedeelte daarvan of de lichte keten of een antigeenbindend gedeelte daarvan van een antilichaam volgens een van paragrafen 1 - 25.

31. Een vector omvattende het nucleïnezuurmolecuul volgens 25 paragraaf 30, waarin de vector optioneel omvat een expressie controlesequentie operabel verbonden aan het nucleïnezuurmolecuul.

32. Een gastheercel omvattende de vector volgens paragraaf 31 of het nucleïnezuurmolecuul volgens paragraaf 30.

30 13 33. Een werkwijze voor het produceren van een anti-myostatine antilichaam of een antigeenbindend gedeelte daarvan, omvattende het kweken van de gastheercel volgens paragraaf 32 of de cellijn volgens paragraaf 29 onder geschikte condities en het terugwinnen van genoemd 5 antilichaam of antigeenbindend gedeelte.

34. Een niet-humaan transgeen organisme dragende het nucleïnezuur volgens paragraaf 30 ofwel chromosomaal ofwel extrachromosomaal, waarin het niet-humane transgene organisme 10 genoemd nucleïnezuur tot expressie brengt.

35. Een werkwijze voor het isoleren van een antilichaam of een antigeenbindend gedeelte daarvan dat specifiek bindt aan myostatine, omvattende de stap van het isoleren van het antilichaam uit het niet- 15 humane transgene organisme volgens paragraaf 34.

36. Een werkwijze voor het behandelen van een patiënt die het nodig heeft met een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan dat specifiek bindt aan myostatine omvattende de stappen van: 20 (a) toedienen aan genoemde patiënt van een effectieve hoeveelheid van een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul volgens paragraaf 30; en (b) het tot expressie brengen van genoemd nucleïnezuurmolecuul.

25 37. Een werkwijze voor het produceren van een humaan monoklonaal antilichaam dat specifiek bindt aan myostatine, omvattende de stappen van: (a) het immuniseren van niet-humaan transgeen dier dat in 30 staat is om humane antilichamen met myostatine te produceren, een 14 immunogeen gedeelte van myostatine, of een cel of weefsel myostatine tot expressie brengende; (b) het toestaan van het niet-humane transgene dier om een immuunrespons tegen myostatine op te bouwen; 5 (c) het isoleren van B lymfocytes uit het niet-humane transgene dier; en (d) het isoleren van een monoklonaal antilichaam dat specifiek bindt aan myostatine uit genoemde geïsoleerde B lymfocyten.

10 38. Een geïsoleerd antilichaam geproduceerd door de werkwijze volgens paragraaf 37.

39. Een werkwijze voor het inhiberen van de binding van myostatine aan cellen tot expressie brengende een activine type II of IIB 15 receptor omvattende het in contact brengen van het myostatine met een antilichaam of antigeenbindend gedeelte volgens een van paragrafen 1 -25, waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend gedeelte myostatineactiviteit inhibeert.

20 40. Een werkwijze voor het laten toenemen van myoblast proliferatie omvattende het in contact brengen van een samenstelling omvattende myoblasten en myostatine met een antilichaam of antigeenbindend gedeelte volgens een van paragrafen 1 - 25, waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend gedeelte myoastatineactiviteit 25 inhibeert.

41. Een werkwijze omvattende het toedienen aan een patient van een antilichaam of een antigeenbindend gedeelte daarvan volgens een van paragrafen 1 - 25, waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend 30 gedeelte myostatineactiviteit inhibeert, waarin genoemde patiënt het nodig 15 heeft glucosehomeostase te verbeteren, vetmassa te verminderen, insulinegevoeligheid toe te laten nemen, nierfunctie te verbeteren, vetaccumulatie af te laten nemen, een ziekte of conditie gekarakteriseerd door botverlies, genoemde ziekte of conditie omvattende osteoporose, 5 osteopenie, osteoarthritis en botfracturen te behandelen, te voorkomen of te inhiberen, metaboolsyndroom te behandelen, "muscle wasting" tegen te gaan door gedurige toediening van een glucocorticoid of een steroid hormoon gedurende de tijd dat genoemde patiënt behandeling ondergaat met een glucocorticoid of een steroid hormoon.

10 42. Een werkwijze voor het reduceren van myostatineactiviteit in een patient die het nodig heeft omvattende de stap van het toedienen aan genoemde patiënt van een monoklonaal antilichaam of een antigeenbindend gedeelte daarvan volgens een van paragrafen 1 - 25, waarin genoemd 15 monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte myostatineactiviteit inhibeert.

43. Een werkwijze voor het omkeren van leeftijdgerelateerde afname in spiermassa in een patiënt die het nodig heeft omvattende de stap 20 van het toedienen aan genoemde patiënt van een antilichaam of een antigeenbindend gedeelte volgens een van paragrafen 1 - 25, waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend gedeelte myostatineactiviteit inhibeert.

25 44. Een werkwijze voor het laten toenemen van myoblastproliferatie en differentiatie in een patiënt die het nodig heeft omvattende de stap van het toedienen aan genoemde patiënt van een antilichaam of antigeenbindend gedeelte volgens een van paragrafen 1 - 25, waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend gedeelte 30 myostatineactiviteit inhibeert.

16 45. Een werkwijze voor het reduceren van myostatine-geïnduceerde activine type IIA of IIB membraanreceptor gemedieerde celsignalering in een patiënt die het nodig heeft omvattende de stap van het toedienen aan 5 genoemde patiënt van een antilichaam of antigeenbindend gedeelte volgens een van paragrafen 1 - 25, waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend gedeelte myostatineactiviteit inhibeert.

46. Een werkwijze voor het verminderen van myostatine-10 gemedieere activatie van een activine type I membraanreceptor in een patiënt die het nodig heeft omvattende de stap van het toedienen aan genoemde patiënt van een antilichaam of antigeenbindend gedeelte volgens een van paragrafen 1 - 25, waarin genoemde antilichaam of antigeenbindend gedeelte myostatineactiviteit inhibeert.

15 47. Een werkwijze voor het reduceren van myostatine-gemedieerde fosforylatie van een of meer R-smad eiwitten geselecteerd uit de groep bestaande uit: Smad 2 en Smad 3 in een patiënt die het nodig heeft omvattende de stap van het toedienen aan genoemde patiënt van een 20 antilichaam of antigeenbindend gedeelte volgens een van paragrafen 1 - 18, waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend gedeelte myostatineactiviteit inhibeert.

48. Een werkwijze voor het verhogen van expressie van een gen 25 geselecteerd uit de groep bestaande uit: myoD, myf5 en myogenine, in een patiënt die het nodig heeft omvattende de stap van het toedienen aan genoemde patiënt van een antilichaam of antigeenbindend gedeelte volgens een van paragrafen 1 - 25, waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend gedeelte myostatineactiviteit inhibeert.

30 17 49. Een werkwijze voor het bevorderen van spiergroei, gewichtstoename of het helpen in de preventie van zwakte in vee, varkens, schapen, kippen, kalkoenen, paarden, vissen, honden en katten, die het nodig hebben omvattende de stap van het toedienen aan genoemde patiënt 5 van een antilichaam of antigeenbindend gedeelte volgens een van paragrafen 1 - 25, waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend gedeelte myostatineactivieit inhibeert.

50. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte 10 geselecteerd uit de groep bestaande uit: (a) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 45 en SEQ ID NO:47;

(b) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan 15 omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ

ID NO:49 en SEQ ID NO:51; (c) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 53 en SEQ ID NO:55; 20 (d) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO:57 en SEQ ID NO:59;

(e) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ

25 ID NO:61 en SEQ ID NO:63; (f) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO:65 en SEQ ID NO:67; 18 (g) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO:69 en SEQ ID NO:71;

(h) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan 5 omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ

ID NO:73 en SEQ ID NO:75; (i) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO:77 en SEQ ID NO:79; 10 (j) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO:81 en SEQ ID NO:83; en

(k) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ

15 ID NO:85 en SEQ ID NO:87; en (l) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 118 en SEQ ID N0:120.

20 51. Een werkwijze voor het behandelen van metabool syndroom in een patiënt die het nodig heeft omvattende de stap van het toedienen aan genoemde patiënt van een antilichaam of antigeenbindend gedeelte volgens een van paragrafen 1 - 25, waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend gedeelte myostatineactiviteit inhibeert.

25 52. Een zoogdier gastheercellijn omvattende polynucleotiden die coderen voor de zware en lichte ketens van een humaan, chimeer of gehumaniseerd monoklonaal antilichaam dat wedijvert voor binding aan myostatine met een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, 19 waarin het antilichaam of gedeelte daarvan ten minste een eigenschap heeft geselecteerd uit de groep bestaande uit: (a) wedijvert voor binding aan myostatine met een antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 5 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, LI85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; (b) bindt aan hetzelfde epitoop van myostatine als een 10 antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L I85V; en 2_112_1H-L81M, L-15 F581,185 V; (c ) bindt aan myostatine met substantieel dezelfde Kd als een antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 20 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L I85V; en 2_112_1H-L81M; L-F58I, I85V; en (d) bindt aan myostatine met substantieel dezelfde off-rate als een antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit 1_116_1; 1_136_3; 25 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L I85V; en 2_112_1H-L81M; L-F581,185V.

30 20 53. Een zoogdier gastheercellijn omvattende polynucleotiden coderende voor de zware en lichte ketens van een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan dat wedijvert voor binding aan myostatine met een antilichaam omvattende: 5 (a) een zware keten die toepast een humaan Vu 1-02 gen, een humaan Vh 3-21 gen of een humaan Vh 3-23 gen; en (b) een licht keten dat toepast een humaan Vk L2 gen, een humaan Vk A3 gen of een humaan Vk A30 gen.

10 54. Een zoogdier gastheercellijn omvattende polynucleotiden coderende voor de zware en lichte ketens van een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte van genoemd monoklonaal antilichaam hebbende dezelfde aminozuursequentie als het antilichaam geproduceerd door een hybridomacellijn hebbende ATCC Deposit Designation Number 15 geselecteerd uit de groep bestaande uit PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, en PTA-6576.

55. Een zoogdier gastheercelllijn omvattende polynucleotiden 20 coderende voor een antilichaam hebbende dezelfde aminozuursequentie als het antilichaam geproduceerd door een hybridomacel hebbende ATCC Deposit Designation Number geselecteerd uit de groep bestaande uit PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, en PTA-6576.

25 56. Een werkwijze omvattende het tot expressie brengen van genoemd humaan monoklonaal antilichaam in genoemde zoogdier gastheercellijn van een van paragrafen 52 - 55 en het terugwinnen van genoemd humaan monoklonaal antilichaam.

30 21 57. Een hybridomacellijn geselecteerd uit de groep bestaande uit ATCC Deposit Designation Numbers PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, en PTA-6576 5 58. Een zoogdier gastheercellijn omvattende polynucleotiden coderende voor de zware en lichte ketens van een humaan, chimeer of gehumaniseerd monoklonaal antihchaam, waarin het antilichaam of gedeelte daarvan ten minste een eigenschap heeft geselecteerd uit de groep 10 bestaande uit: (a) wedijvert voor binding aan mysostatine met een antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-15 L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_lH-L81M, L-I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; (b) bindt aan hetzelfde epitoop van myostatine als een antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit:l_116_l; 1_136_3; 20 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F581,185V; 25 (c) is een antilichaam hebbende dezelfde aminozuursequentie als het antilichaam geproduceerd door een hybridomacel hebbende een ATCC Deposit Designation Number geselecteerd uit de groep bestaande uit PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, en PTA-6576; en 22 (d) is een hybridomacellijn geselecteerd uit de groep bestaande uit ATCC Deposit Designation Numbers PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, en PTA-6576.

5

Korte beschrijving van de figuren

[0005] Figuur 1 toont de resultaten van een myostatine-responsive reporter gen assay. Zoals getoond, inhiberen neutraliserende anti- 10 myostatine antilichamen myostatine geïnduceerde luciferaseactiviteit in A204-cellen. Menselijke antilichaamvarianten 1_116_1L—Q45K; 1_257-1L-L211; 1_314_1H-T92A en 2_112_1H-12V, L-F 581, 185V inhibeerden luciferaseactiviteit in dezelfde mate als wildtype antilichamen.

[0006] Figuur 2 toont de resultaten van een L6-Aurora beta-15 lactamaseassay. Zoals getoond, inhiberen neutraliseren anti-myostatine antilichamen myostatine geïnduceerde beta-lactamaseactiviteit in L6-ratmyoblasten. Humane antilichaamvarianten 1_116_1L-Q45K; 1_257-1L-L211; 1_314_1H-T92A en 2_112_1H-112V, L-F581, |85V inhibeerden beta-lactamaseactiviteit in dezelfde mate als de wildtype antilichamen.

20 [0007] Figuur 3 toont de resultaten van een western blot. Zoals getoond, inhiberen neutraliserende anti-myostatine antilichamen van de uitvinding myostatine geïnduceerde smad2-fosforylatie in HepG2-cellen door wester blot.

[0008] Figuur 4 toont de resultaten van myf5 mRNA-expressieassays. (A) 25 Neutraliserende anti-myostatine antilichamen 1_268_1, 2_177_1 en 2_122_1 redden myfö-genexpressie-geïnhibeerd door myostatine in C2C12-muizenmyoblasten, terwijl een niet-neutraliserend antilichaam 1_159_1 het niet kon. Myf5 mRNA-niveau werd gedetecteerd door TaqMan PCR. (B) 1_116_1 redde myfö-genexpressie op een dosisafhankelijke wijze.

23

[0009] Figuur 5 toont de resultaten van C2C12-spierceldifferentiatieassays. (A) Neutraliserende anti-myostatine antilichamen 2_43_1,1_314_1 en 1_257_1 redden myostatinegeblokkeerde spierdifferentiatie in C2Cl2-muisspiercellen. Embrio myosine-zware 5 keten(MHC)-eiwitniveau werd toegepast een marker om C2C12-differentiatie te meten. (B) Antilichamen 2_112_1,1_46_1 en 1_116_1 reddden myostatine-geblokkeerde C2Cl2-spierdifferentiatie.

[0010] Figuur 6 (A) illustreert peptiden gegenereerd uit matuur GDF8 (SEQ ID NO: 89) om anti-myostatine antilichaambinding te testen.

10 Aminozuren in kleine letters zijn de aminozuren die verschillend zijn van GDF11 (B) Samenvatting van peptidebinding. Zoals getoond in de figuur, binden sommige antilichamen niet aan een van de peptiden. Sommige antilichamen binden aan niet-aaneengesloten peptiden. (C) Voorspelde GD F8-structuur met de illustratie van peptidebinding van de humane anti-15 myostatine antilichamen. GDF8-structuur werd gegenereerd SWISS-MODEL toepassende; een volledig geautomatiseerde eiwitstructuurhomologie-modellerende server, toegankelijk via de ExPASy web server, of van het programma DeepView (Swiss Pdb-Viewer). De eerste zeven aminozuren misten uit de voorspelde structuur. Matuur GDF8 is een 20 homodimeereiwit. Maar een subunit is getoond. De antilichamen hierin beschreven binden aan GDF8 als een homodimeer. Zoals getoond in de figuur, binden humane monoklonale antilichamen 2_43_1,2_112_1 en 2_177_1 aan zowel peptide 1 als 5. Peptiden 1 en 5 zijn ruimtelijk vlakbij maar niet in primaire structuur.

25 [0011] Figuur 7 toont de aminozuursequenties van peptide 1-11 en corresponderende sequence identifiers (SEQ ID NOs: 101-113).

[0012] Figuur 8 toont epitoopbinding. Epitoopbinding van de humane anti-myostatine antilichamen van de uitvinding werd in kaart gebracht door kruis-competitie-experimenten een BIAcoreTM-instrument 3000 30 toepassende. Antilichamen zijn getoond als gelabelde cellen. Antilichamen 24 in een cirkel wedijveren met antilichamen in overlappende cirkels. Bijvoorbeeld, antilichaam 1_46_1 wedijvert met antilichaam 1_136_3, maar antilichaam 1_46_1 wedijvert niet met antilichaam 1_268_1. Indien twee of meer antilichamen in dezelfde cirkel zijn kan hun respectievelijke binding 5 niet worden onderscheiden.

[0013] Figuur 9 toont de resultaten van een immunoprecipitatiestudie om de mogelijkheid van humane anti-myostatine antilichamen van de uitvinding om matuur GDF8 en matuur GDF8/propeptide latent complex naar beneden te trekken, te testen. Geconditioneerd medium bevattende 10 293T-cellen getransfecteerd met GDF8 werd toegepast. Zoals getoond in de figuur, antilichamen 2_112_1,2_43_1 en 2_177_1 trokken naar beneden matuur GDF8, matuur GDF8/propeptidecomplex, en niet-geprocessed GDF8; antilichaam 1_66_1 trok naar beneden matuur GDF8 en matuur GDF8/propeptide; geen andere antilichamen trokken naar beneden matuur 15 GDF8, propeptide, of niet-geprocessed GDF8. Lane 4 is de 1/10-mediumgeladen controle, en lane 7 is immunoprecipitatiecontrole met medium alleen.

[0014] Figuur 10 toont de resultaten van een immunoprecipitatiestudie om de mogelijkheid van anti-myostatine antilichamen van de uitvinding om 20 matuur GDF8 uit muizenserum naar beneden te trekken, te testen. Zoals getoond is de figuur, antilichamen 2_112_1, 2_43_1 en 2_177_1 trokken naar beneden matuur GDF8 uit het muizenserum, terwijl antilichamen 1_116_1 en 1_66_1 het niet konden.

[0015] Figuur 11 is een sequentie-alignment van matuur humaan GDF8 25 en GDF11. Matuur GDF8 (SEQ ID NO: 89) en GDF11 (SEQ ID NO: 90) delen ongeveer 90% identieke aminozuursequenties. Zowel matuur GDF8 als GDF11 vormen homodimeren. Zowel matuur GDF8 als GDF11 hebben negen cysteines, welke vier interne disulfidebindingen vormen en een intermoleculaire disulfidebinding. Zoals getoond in de figuur, zijn cysteïnen 30 die een disulfidebond met elkaar vormen, gelabeld met dezelfde punten of 25 plus. Een cysteine (cys73) die intermoleculaire disulfidebinding vormt, werd gelabeld met een ster. GDF8-structuur werd voorspeld SWISS-MODEL toepassende (zie figuur 6C).

[0016] Figuur 12 is een tabel in vitro assaygegevens samenvattende.

5 [0017] Figuur 13 is een tabel gen toepassing, epitope binding en peptidebinding samenvattende.

[0018] Figuren 14 en 15 tonen de effecten op spiermassa in muizen volgende op in vivo behandeling met anti-myostatine antilichamen zoals vergeleken met drager voor de gastrocnemius-pantaris-sloeus (GPS)-, 10 tibilalis anterior (TA)- en quadriceps (Quads)-spieren.

[0019] Figuur 16 toont de effecten op spiergewicht en kracht in SCID-muizen volgend op in vivo behandeling met een anti-myostatine antilichaam (2_112_K).

[0020] Figuur 17 illustreert de effecten op spiergewicht in SCID-muizen 15 volgende op in vivo behandeling met verschillende doses van een anti- myostatine-antilichaaam (2_112_K).

[0021] Figuur 18 is een dosis (A) en concentratie (B) responsanalyse van verschillende doses van een anti-myostatine antilichaam (2_112_K) en hun effecten op spiergewicht.

20 [0022] Figuur 19 is een alignment van de zware en lichte keten variabele regio's van antilichamen 2_112_1 (zware keten: SEQ ID NO: 77; lichte keten: SEQ ID NO: 79) en 2_112_K (zware keten: SEQ ID NO: 118; lichte keten: SEQ ID NO: 120).

[0023] Figuur 20 toont de effecten op spiermassa (A) en adipose massa (B) 25 in muizen volgend op een in vivo behandeling met cortison met een anti-myostatine antilichaam (2_112_K) zoals vergeleken met drager voor de gastrocemius-pantaris-sloeus (GPS)-, tibilalis anterior (TA)- en quadriceps (Quads)-spieren (in 20A) en de inguinale, epididymale en abdominale vetkussentjemassa's (in 20B).

30 26

Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding Definities en algemene technieken 5 [0024] Tenzij anderszins hierin gedefinieerd, zullen wetenschappelijke en technische termen hierin toegepast in verband met de onderhavige uitvinding de betekenissen hebben die gebruikelijk worden begrepen door die van normale vaardigheid in de kunst. Verder, tenzij anders vereist door context, zullen enkele termen meervouden omvatten en meervoudige 10 termen zullen het enkelvoud omvatten. In het algemeen, naamgeving toegepast in verband met, en technieken van, cel- en weefselcultuur, moleculaire biologie, immunologie, microbiologie, genetica en eiwit- en nucleïnezuurchemie en hybridisatie bescreven hierin zijn deze welbekend en gebruikelijk toegepast in de kunst.

15 [0025] De werkwijzen en technieken van de onderhavige uitvinding worden algemeen uitgevoerd volgens conventionele werkwijzen goed bekend in de kunst en zoals beschreven in verschillende algemene en meer specifieke referenties die geciteerd en beschreven worden door de onderhavige beschrijving tenzij anderszins aangegeven. Zie, b.v., Sambrook et al., 20 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2de editie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates (1992) en Harlow en Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), hierin opgenomen door 25 referentie. Enzymatische reacties en zuiveringstechnieken worden uitgevoerd volgens de specificaties van de fabrikant, zoals gewoonlijk bereikt in de kunst of zoals hierin beschreven. De naamgeving toegepast in verband met, en de laboratoriumprocedures en -technieken van, analytische chemie, synthetische organische chemie, en medicinale en 30 farmaceutische chemie hierin beschreven zijn deze goed bekend en 27 gebruikelijk toegepast in de kunst. Standaardtechnieken worden toegepast voor chemische syntheses, chemische analyses, farmaceutische vervaardiging, formulering, en aflevering, en behandeling van patiënten.

[0026] De volgende termen, tenzij anderszins aangegeven, moeten worden 5 begrepen de volgende betekenissen te hebben:

[0027] De term "polypeptide" omvat natieve of artificiële eiwitten, eiwitfragmenten en polypeptideanalogen van een eiwitsequentie. Een polypeptide kan monomeer zijn of polymeer.

[0028] De term "geïsoleerd eiwit", "geïsoleerd polypeptide" of "geïsoleerd 10 antilichaam is een eiwit, polypeptide of antilichaam dat dankzij zijn oorsprong of bron van derivatie (1) niet geassocieerd is met natuurlijk geassocieerde componenten die het vergezellen in zijn natieve staat, (2) is vrij van andere eiwitten van dezelfde soort, (3) wordt tot uitdrukking gebracht door een cel van een ander soort, of (4) komt niet voor in de 15 natuur. Dus, een polypeptide dat chemisch gesynthetiseerd is of gesynthetiseerd in een cellulair systeem verschillend van de cel waarvan het natuurlijk afkomt, zal "geïsoleerd" zijn van zijn natuurlijk geassocieerde componenten. Een eiwit kan ook worden verkregen substantieel vrij van natuurlijk geassocieerde componenten door isolatie, 20 eiwitzuiveringstechnieken goed bekend in de kunst toepassende.

[0029] In verschillende uitvoeringsvormen is een geïsoleerd anti-myostatine antilichaam een die eiwit A-gezuiverd is (zie, b.v., voorbeeld XVI), een die gesynthetiseerd is door een hybridoma of andere cellijn in vitro, en/of een humaan anti-myostatine antilichaam verkregen van een 25 transgene muis.

[0030] Een eiwit of polypeptide is "substantieel zuiver", "substantieel homogeen" of "substantieel gezuiverd" wanneer ten minste ongeveer 60 tot 75% van een monster een enkel soort van polypeptide toont. Het polypeptide of eiwit kan monomeer of multimeer zijn. Een substantieel 30 zuiver polypeptide of eiwit zal typisch ongeveer 50%, 60%, 70%, 80% of 90% 28 ge wicht/ge wicht omvatten van een eiwitmonster, meer gebruikelijk ongeveer 95%, en zal bij voorkeur meer dan 99% zuiver zijn. Eiwitzuiverheid of homogeniteit kan worden aangegeven door een aantal middelen goed bekend in de kunst, zoals polyacrylamidegelelektroforese 5 van een eiwitmonster, gevolgd door visualisatie van een enkele polypeptideband bij kleuring van de gel met een kleuring goed bekend in de kunst. Voor bepaalde doeleinden, kan een hogere resolutie worden voorzien door HPLC of andere middelen goed bekend in de kunst toe te passen voor zuivering.

10 [0031] De term "niet-humaan transgeen organisme" zoals hierin toegepast refereert aan een niet-humaan transgeen individueel levend ding, omvattende een niet-humaan transgeen dier, plant, bacterie, protist, of schimmel.

[0032] De term "polypeptidefragment" zoals hierin toegepast refereert aan 15 een polypeptide dat een aminoterminaal en/of carboxyterminale deletie heeft, maar waarin de overblijvende aminozuursequentie identiek is aan de corresponderende posities in een natuurlijk voorkomende sequentie . In sommige uitvoeringsvormen, zijn fragmenten ten minste 5, 6, 8 of 10 aminozuren lang. In andere uitvoeringsvormen zijn de fragmenten ten 20 minste 14, ten minste 20, ten minste 50, of ten minste 70, 80, 90, 100, 150 of 200 aminozuren lang.

[0033] De term "polypeptideanaloog" zoals hierin toegepast refereert aan een polypeptide die een segment omvat dat een substantiële identiteit heeft met een gedeelte van een aminozuursequentie en dat ten minste een van de 25 volgende eigenschappen heeft: (1) specifieke binding aan myostatine onder geschikte bindingscondities, (2) mogelijkheid myostatine te inhiberen of activeren. Typisch, omvatten polypeptideanalogen een conservatieve aminozuursubstitutie (of -insertie of -deletie) met betrekking tot de natieve sequentie . Analogen zijn typisch ten minste 20 of 25 aminozuren lang, bij 30 voorkeur ten minste 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 of 200 aminozuren lang of 29 langer, en kunnen vaak zo lang zijn als een gehele lengte polypeptide. Sommige uitvoeringsvormen van de uitvinding omvatten polypeptidefragmenten of polypeptideanaloge antilichamen met 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 of 17 substituties van de 5 stamlijnaminozuursequentie.

[0034] In bepaalde uitvoeringsvormen, zijn aminozuursubstituties aan een anti-myostatine antilicbaam of antigeenbindend gedeelte daarvan deze welke: (1) gevoeligheid voor proteolyse verminderen, (2) gevoeligheid voor oxidatie verminderen, (3) bindingsaffiniteit voor vorming van 10 eiwitcomplexen veranderen, en (4) andere fysisch chemische of functionele eigenschappen van zulke analogen verlenen of veranderen, maar nog steeds specifieke binding aan myostatine behouden. Analogen kunnen verschillende veranderingen van een sequentie omvatten anders dan de normaal voorkomende peptidesequentie. Bijvoorbeeld, enkele of 15 meervoudige aminozuursubstituties, bij voorkeur conservatieve aminozuursubstituties, kunnen worden gemaakt in de normaal voorkomende sequentie, bij voorkeur in het gedeelte van het polypeptide buiten het (de) domein(en) intermoleculaire contacten vormende. Een conservatieve aminozuursubstitutie moet de structurele eigenschappen van 20 de oude sequentie niet substantieel veranderen; b.v., een vervangend aminozuur moet de anti-parallele 6-sheet die het immunoglobuline bindingsdomein vormt die voorkomt in de oudersequentie niet veranderen, of andere typen van secundaire structuur die de oudersequentie karakteriseert, verbreken. In het algemeen, zouden glycine en proline niet 25 worden toegepast in een anti-parallele β-sheet. Voorbeelden van door de kunst erkende polypeptide secundaire en tertiaire structuren worden beschreven in Proteins, Structures en Molecular Principles (Creighton, Ed. W.H. Freeman en Company, New York (1984); Introduction to Protein Structure (C. Branden en J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, 30 N.Y. (1991)); en Thornton et al., Nature 354:105 (1991), hierin opgenomen door referentie.

[0035] Niet-polypeptide analogen worden gewoonlijk toegepast in de farmaceutische industrie als medicijnen met eigenschappen analoog aan 5 deze van het templatepeptide. Deze typen van niet-polypeptide verbindingen worden "polypeptide mimetica" of "peptidomimetica" genoemd. Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber en Freidinger, TINS blz. 392 (1985); en Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987), hierin opgenomen door referentie. Zulke verbindingen worden vaak ontwikkeld 10 met behulp van gecomputeriseerde moleculaire modellering. Peptide mimetica die structureel vergelijkbaar zijn aan therapeutisch bruikbare peptiden kunnen worden toegepast om een equivalent therapeutisch of profylactisch effect te produceren. In het algemeen, zijn peptidomimetica structureel vergelijkbaar met een paradigmapolypeptide (dat wil zeggen, 15 een polypeptide dat een gewenste biochemische eigenschap of farmacologische activiteit heeft), zoals een humaan antilichaam, maar heeft een of meer polypeptidebindingen optioneel vervangen door een binding geselecteerd uit de groep bestaande uit: —CH2NH—, —CH2S—, —CH2—CH2—, —CH=CH—(cis en trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- en -CH2SO-, door 20 werkwijzen goed bekend in de kunst. Systematische substitutie van een of meer aminozuren van een consensussequentie met een D-aminozuur van hetzelfde type (b.v,, D-lysine in plaats van L-lysine) kan ook worden toegepast om meer stabiele peptiden te genereren. Daarbij, kunnen constraintpeptiden omvattende een consensussequentie of een substantieel 25 identieke consensussequentievariatie worden gegenereerd door werkwijzen bekend in de kunst (Rizo en Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), hierin opgenomen door referentie); bijvoorbeeld, door toevoeging van interne cysteineresiduen in staat intramoleculaire disulfldebruggen te vormen welke het peptide ringvormig maken.

31

[0036] Waar aan een "antilichaam" wordt gerefereerd hierin met betrekking tot de uitvinding, wordt het normaal begrepen dat een antigeenbindend gedeelte daarvan ook gebruikt kan worden. Een antigeenbindend gedeelte wedijvert met het intacte antilichaam voor 5 specifieke binding. Zie in het algemeen, Fundamental Immunology, hoofdst. 7 (Paul, W. ed., 2de ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (in zijn geheel opgenomen door referentie voor alle doeleinden). Antigeenbindende gedeelten kunnen worden geproduceerd door recombinante DNA-technieken of door enzymatisch of chemische klieving van intacte anti-lichamen. In sommige 10 uitvoeringsvormen, omvatten antigeenbindende gedeelten Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, en complementair determinerende regio (CDR)-fragmenten, enkele keten antilichamen (scFv), chimere antilichamen, dialichamen, en polypeptiden die ten minste een gedeelte van een antilichaam omvatten dat voldoende is om specifieke antigeenbinding aan 15 het polypeptide te bewerkstelligen.

[0037] Van N-terminus naar C-terminus, omvatten zowel de mature lichte als zware keten-variabele domeinen, achtereenvolgens, de regio's FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 en FR4. de toekenning van aminozuren aan elk domein hierin is in overeenstemming met de definities van Kabat, 20 Sequences of Proteins of Immunogical Interest (National Institutes of Health Bethesda, Md. (1987 en 1991)), Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) of Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).

[0038] Zoals hierin toegepast, is een antilichaam waaraan wordt gerefereerd door een nummer hetzelfde als een monoklonaal antilichaam 25 dat wordt verkregen van de hybridoma van hetzelfde nummer. Bijvoorbeeld, monoklonaal antilichaam 2_112 is hetzelfde antilichaam als een verkregen van hydridoma 2_112, of een subkloon daarvan, zoals 2_112_1,2_112_2 en dergelijke. De enige uitzondering is 1_136_3 welke een verschillend hybridoma is van subklonen 1_136_1 en 1_136_2.

32

[0039] Zoals hierin toegepast, betekent een Fd-fragment een antilichaamfragment dat bestaat uit de Vu- en Cnl-domeinen; een Fv-fragment bestaat uit Vl- en Vh-domeinen van een enkele arm van een antilichaam; en een dAb-fragment (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989) 5 bestaat uit een VH-domein.

[0040] In sommige uitvoeringsvormen, is het antilichaam een enkele-keten antilichaam (scFv) waarin Vl- en VH-domeinen zijn gepaard om monovalente moleculen te vormen via een synthetische linker die hen in staat stelt gemaakt te worden als een enkele eiwitketen. (Bird et al., 10 Science: 242-423-426 (1988) en Huston et al., Proc. Natl. Acad. Scie. V.S., 85:5879-5883 (1988).) In sommige uitvoeringsvormen zijn de antilichamen diahodies, dat wil zeggen, zijn bivalente antilichamen waarin Vh- en Vl-domeinen tot uitdrukking worden gebracht op een enkele polypeptideketen, maar een linker toepassende die tekort is om paring toe te staan tussen de 15 twee domeinen op dezelfde keten, daardoor de domeinen forcerende te paren met complementaire domeinen van een andere keten en twee antigeenbindingsplaatsen te creëren (zie, b.v., Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Scie. V.S. 90:6444-6448 (1993), en Poljak R.J. et al., Structure 2:1121-1123 (1994).) In sommige uitvoeringsvormen, kunnen een of meer CDR's 20 van een antilichaam van de uitvinding worden opgenomen in een molecuul ofwel covalent of noncovalent om het een immunoadhesine te maken dat specifiek bindt aan myostatine. In zulke uitvoeringsvormen, kunnen CDR's worden opgenomen als deel van een grotere polypeptideketen, kunnen covalent worden verbonden aan een andere polypeptideketen of kunnen 25 noncovalent worden opgenomen. Verder, kunnen de frameworkregio's (FR's) worden verkregen van een van de anti-myostatine antilichamen waarvan een of meer van de CDR's zijn genomen of van een of meer verschillende humane antilichamen.

33

[0041] In uitvoeringsvormen hebbende een of meer bindingsplaatsen, kunnen de bindingsplaatsen identiek zijn aan elkaar of kunnen verschillend zijn.

[0042] Zoals hierin toegepast, betekent de term "humaan antilichaam" een 5 antilichaam waarin de variabele en constante domeinsequenties humane sequenties zijn. De term omvat antilichamen met sequenties verkregen van (d.w.z., die toepassen) humane genen, maar welke veranderd zijn, bijvoorbeeld om mogelijke immunogeniciteit te verminderen, affiniteit te verhogen, cysteïnen te ebmineren die ongewenste vouwing kunnen 10 veroorzaken, etc. De term omvat zulke antilichamen geproduceerd recombinant in niet-humane cellen, welke glycosylatie niet typisch voor humane cellen zou kunnen verlenen. Deze antilichamen kunnen worden bereid op verschillende manieren, zoals beneden beschreven.

[0043] De term "chimeer antilichaam" zoals hierin toegepast betekent een 15 antilichaam dat regio's van twee of meer verschillende antilichamen omvat.

In een uitvoeringsvorm, zijn een of meer van de CDR's van het chimere antilichaam verkregen van een humaan anti-myostatine antilichaam. In een andere uitvoeringsvorm, zijn alle CDR's verkregen van een humaan anti-myostatine antilichaam. In een andere uitvoeringsvorm, zijn de CDR's 20 van meer dan een humane anti-myostatine antilichamen gecombineerd in een chimeer antilichaam. Bijvoorbeeld, een chimeer antilichaam kan een CDRl omvatten van de lichte keten van een eerste humaan anti-myostatine antilichaam, een CDR2 van de lichte keten van een tweede humaan anti-myostatine antilichaam en een CDR3 van de lichte keten van een derde 25 humaan anti-myostatine antilichaam, en CDR's van de zware keten kunnen worden verkregen van een of meer andere anti-myostatine antilichamen. Verder, kunnen de frameworkregio's worden verkregen van een van de anti-myostatine antilichamen waarvan een of meer van de CDR's zijn genomen of van een of meer verschillende humane antilichamen.

34

[0044] In sommige uitvoeringsvormen, is een chimeer antilichaam van de uitvinding een gehumaniseerd anti-myostatine antilichaam. Een gehumaniseerd anti-myostatine antilichaam van de uitvinding omvat de aminozuursequentie van een of meer frameworkregio's en/of de 5 aminozuursequentie van ten minste een gedeelte van de constante regio van een of meer humane anti-myostatine antilichamen van de uitvinding en omvat verder sequenties verkregen van een niet-humaan anti-myostatine antilichaam, bijvoorbeeld CDR-sequenties.

[0045] Fragmenten of analogen van antilichamen of 10 immunoglobulinemoleculen kunnen eenvoudig worden bereid door deze van normale vaardigheid in de kunst die de lessen van deze beschrijving volgen. Geprefereerde amino- en carboxyuiteinden van fragmenten of analogen treden op nabij grenzen van functionele domeinen. Structurele en functionele domeinen kunnen worden geïdentificeerd door vergelijking van 15 de nucleotide- en/of aminozuursequentiegegevens met publieke of private sequentiedatabasen. Bij voorkeur, worden gecomputeriseerde vergelijkingswerkwijzen toegepast om sequentiemotieven of voorspelde eiwitconformatiedomeinen te identificeren die optreden in andere eiwitten van bekende structuur en/of functie. Werkwijzen om eiwitsequenties te 20 identificeren die vouwen in een bekende driedimensionale structuur zijn bekend. Zie Bowie et al., Science 253:164 (1991).

[0046] De term " oppervlakteplasmonresonantie", zoals hierin toegepast, refereert aan een optisch fenomeen dat de analyse van real-time-biospecifieke interacties door detectie van veranderingen in 25 eiwitconcentraties binnen een biosensormatrix toestaat, bijvoorbeeld het BIACORE™-systeem toepassende (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Zweden en Piscataway, N.J.). Voor verdere beschrijvingen, zie Johnsson U. et al., Ann. Biol. Clin. 51:19-26 (1993); Jonsson U. et al. , Biotechniques 11:620-627 (1991); Jonsson B. et al., J. Mol. Recognit. 8:125-131 (1995); en 30 Johnsson B. et al. , Anal. Biochem 198:268-277 (1991).

35

[0047] De term "Kd" betekent de evenwichtsdissociatieconstante van een specifieke antilichaam-antigeen interactie.

[0048] De term " off rate" betekent de dissociatiesnelheidconstante van een specifieke antilichaam-antigeen interactie.

5 [0049] De term "epitoop" omvat een eiwitdeterminant in staat tot specifieke binding aan een immunoglobuline of T-celrecptor of anderszins interactie met een molecuul. Epitoopdeterminante bestaan in het algemeen uit chemisch actieve oppervlaktegroeperingen van moleculen zoals aminozuren of koolhydraat- of suikerzijketens en hebben in het algemeen 10 specifieke driedimensionale structuureigensehappen, zowel als specifieke ladingseigenschappen. Een epitoop kan " lineair" of "conformationeel" zijn. In een lineair epitoop, treden alle punten van interactie tussen het eiwit en het interacterende molecuul (zoals een antilichaam) lineair op langs de primaire aminozuursequentie van het eiwit. In een conformationeel epitoop, 15 treden de punten van interactie op tussen aminozurenresiduen op het eiwit die gescheiden zijn van elkaar. Een antilichaam wordt gezegd specifiek te binden aan een antigeen wanneer de dissociatiecontstant < 1 mM is, bij voorkeur< 100 nM en meest geprefereerd < 10 nM. In bepaalde uitvoeringsvormen, is de Kd 1 pM tot 500 pM. In andere uitvoeringsvormen, 20 is de Kd tussen 500 pM tot 1 mM. In andere uitvoeringsvormen, is de Kd tussen 1 mM tot 100 nM. In andere uitvoeringsvormen, is de Kd tussen 100 mM tot 10 nM. Eenmaal een gewenst epitoop op een antigeen is bepaald, is het mogelijk antilichamen te genereren tegen dat epitoop, b.v., toepassende technieken beschreven in de onderhavige uitvinding. Alternatief, gedurende 25 het ontdekkingsproces, kunnen de generatie en karakterisering van antilichamen informatie verhelderen over gewenste epitopen. Van deze informatie, is het dan mogelijk om competitief antilichamen te screenen voor binding aan hetzelfde epitoop. Een benadering om dit te bereiken is om cross-competitiestudies uit te voeren om antilichamen te vinden die 30 competitief binden aan elkaar, b.v., de antilichamen wedijveren voor 36 binding aan het antigeen. Een high throughput-proces voor "hinderende" antilichamen gebaseerd op hun kruis-competitie wordt beschreven in internationale Octrooiaanvrage nr. WO 03/48731.

[0050] Zoals hierin toegepast, volgen de twintig conventionele aminozuren 5 en hun afkortingen conventioneel gebruik. Zie Immunology - A Synthesis (2de editie, E.S. Golub en D.R. Gren, Eds. Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), hierin opgenomen door referentie.

[0051] De term "polynucleotide" zoals hierin gerefereerd betekent een polymere vorm van nucleotides van ten minste 10 basen in lengte, ofwel 10 ribonucleotiden of deoxynucleotiden of een gemodificeerde vorm van elk van deze typen van nucleotide. De term omvat enkel- en dubbelstrengsvormen.

[0052] De term "geïsoleerd polynucleotide" zoals hierin toegepast betekent een polynucleotide van genoom, cDNA of synthetische oorsprong of enige combinatie daarvan, welke dankzij zijn oorsprong het "geïsoleerd 15 polynucleotide" (1) niet geassocieerd is met geheel of een gedeelte van een polynecleotiden met welke de "geïsoleerde polynucleotide" wordt gevonden in de natuur, (2) is operabel verbonden aan een polynucleotide waaraan het niet is verbonden in de natuur, of (3) treedt niet op in de natuur als deel van een grotere sequentie.

20 [0053] De term "natuurlijk voorkomende nucleotiden" zoals hierin toegepast omvat deoxyribonucleotiden en ribonucleotiden. De term "gemodificeerde nucleotides" zoals hier in toegepast omvat nucleotiden met gemodificeerde of gesubstitueerde suikergroepen en dergelijke. De term "olignucleotidebindingen" hierin gerefereerd omvat 25 oligonucleotidenbindingen zoals fosforothioaat, fosforodithioaat, fosforoselenoaat, fosferodiselenoaat, fosforoanilothioaat, fosforaniladaat, fosforoamidaat, en dergelijke. Zie, b.v., LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stee et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 30 (1991); Zon et al., Oligonucleotides en Analogues: A Practical Approach, biz.

37 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); V.S. Octrooi nr. 5,151,510; Uhlmann en Peyman, Chemical Reviews 90: 543 (1990), waarvan de beschrijvingen hierin opgenomen zijn door referentie. Een oligonucleotide kan een label voor detectie omvatten, indien gewenst.

5 [0054] "Operabel verbonden" sequenties omvatten zowel expressie controlesequenties die aangrenzend zijn met het gen van interesse en expressie controlesequenties die in trans of op afstand werken om het gen van interesse te controleren. De term "expressie controlesequentie" zoals hierin toegepast betekent polynucleotidesequenties die nodig zijn de 10 expressie en processing van coderende sequenties waaraan zij geligeerd zijn te effectueren. Expressie controlesequenties omvatten geschikte transcriptieinitiatie, terminatie, promotor en enhancersequenties; efficiënte RNA-processingsignalen zoals zoals splicing en polyadenylatiesignalen; sequenties die cytoplasmatisch mRNA stabiliseren; sequenties die 15 translatie-efficiëntie versterken (d.w.z., Kozak-consesussequentie); sequenties die eiwitstabiliteit versterken; en indien gewenst, sequenties die proteïnesecretie verhogen. De aard van zulke controlesequenties verschilt afhankelijk van het gastheerorganisme. In prokaryoten, omvatten zulke controlesequenties in het algemeen een promotor, ribosomale 20 bindingsplaats, en transcriptieterminatiesequentie; in eukaryoten, in het algemeen, omvatten zulke controlesequenties promotors en transcriptieterminatiesequentie. De term "controlesequenties" wordt bedoeld te omvatten, ten minste, alle componenten waarvan aanwezigheid essentieel is voor expressie en processing, en kan ook omvatten additionele 25 componenten waarvan aanwezigheid voordelig is, bijvoorbeeld leadersequenties en fusiepartnersequenties.

[0055] De term "vector", zoals hierin toegepast, betekent een nucleïnezuurmolecuul in staat een ander nucleïnezuur waaraan het verbonden is te transporteren. In sommige uitvoeringsvormen, is de vector 30 een plasmide, d.w.z., een circulair dubbelstrengs stuk van DNA waarin 38 additionele DNA-segmenten geligeerd kunnen zijn. In sommige uitvoeringsvormen, is de vector een virale vector, waarin additionele DNA-segmenten geligeerd kunnen worden in het virale genoom. In sommige uitvoeringsvormen, zijn de vectoren in staat tot autonome replicatie in een 5 gastheercel waarin zij geïntroduceerd zijn (b.v, bacteriele vectoren hebbende een bacteriële origine van replicatie en episomale zoogdiervectoren). In andere uitvoeringsvormen, kunnen de vectoren (b.v., niet-episomale zoogdiervectoren) geïntegreerd worden in het genoom van een gastheercel bij introductie in een gastheercel, en worden daardoor 10 gerepliceerd tezamen met het gastheergenoom. Daarbij, zijn bepaalde vectoren in staat de expressie van genen waaraan zij operatief verbonden zijn te richten. Zulke vectoren worden hierin gerefereerd als "recombinante expressievectoren" (of eenvoudig, "expressievectoren").

[0056] De term "recombinante gastheercel" (of eenvoudig "gastheercel"), 15 zoals hierin toegepast, betekent en cel waarin een recombinante expressievector geïntroduceerd is. Het moet worden begrepen dat "recombinante gastheercel" en "gastheercel" niet alleen de specifieke cel van onderwerp betekenen maar ook de nakomelingen van zo'n cel. Omdat bepaalde modificaties kunnen optreden in opeenvolgende generaties door 20 ofwel mutatie of omgevingsinvloeden, zouden zulke afstammelingen, in feite, niet identiek kunnen zijn aan de oudercel, maar zijn nog steeds omvat binnen de omvang van de term "gastheercel" zoals hierin toegepast.

[0057] De term "selectief hybridiseren" zoals hierin gerefereerd betekent detecteerbaar en specifiek te binden. Polynucleotiden, oligonucleotiden en 25 fragmenten daarvan volgens de uitvinding hybridiseren selectief aan nucleïnezuurstringen onder hybridisatie en wascondities die waarneembare hoeveelheden van detecteerbare binding aan niet-specifieke nucleïnezuren minimaliseren. "Hoge stringentie" of "hoog stringente" condities kunnen worden toegepast om selectieve hybridisatiecondities te bereiken zoals 30 bekend in de kunst en hierin beschreven. Een voorbeeld van de "hoge 39 stringentie" of "hoog stringente" conditie is de incubatie van een polynucleotide met een ander polynucleotide, waarin een polynucleotide bevestigd kan zijn aan een vast oppervlak zoals een membraan, in een hybridisatiebuffer van 6X SSPE of SSC, 50% formamide, 5X Denhardt's 5 reagens, 0,5% SDS, 100μg/ml gedenatureerd, gefragmenteerd zalmsperma-DNA bij een hybridisatietemperatuur van 42°C gedurende 12-16 uur, gevolgd door tweemaal wassing bij 55°C toepassende een wasbuffer van IX SSC, 0,5% SDS. Zie ook Sambrook et al., supra, blz. 9.50-9.55.

[0058] De term "percentage sequentie-identiteit" in de context van 10 nucleïnezuursequenties bedoelt de residuen in twee sequenties die hetzelfde zijn wanneer op een lijn gezet voor maximale correspondentie. De lengte van sequentie-identiteitvergelijking kan zijn over een lengte van ten minste negen nucleotiden, gebruikelijk ten minste ongeveer 18 nucleotiden, meer gebruikelijk ten minste ongeveer 24 nucleotiden, typisch ten minste 15 ongeveer 28 nucleotiden, en meer typisch ten minste ongeveer 32 nucleotiden, en bij voorkeur ten minste ongeveer 36, 48 of meer nucleotiden. Er is een aantal van verschillende algoritmen bekend in de kunst welke toegepast kunnen worden om nucleotidesequentie-identiteit te meten. Bijvoorbeeld, kunnen polynucleotidesequenties worden vergeleken 20 FASTA toepassende, Gap of Bestfit, welke programma's zijn in Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Groeup (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, welke omvat, b.v., de programma's FASTA2 en FASTA3, verschaft alignments en percentagesequentie-identiteit van de regio's van de beste overlap tussen de gevraagde en zoeksequenties 25 (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998); hierin opgenomen door referentie). Tenzij anderszins gespecificeerd, worden standaardwaardeparameters voor een specifiek programma of algoritme toegepast. Bijvoorbeeld, percentage 30 sequentieovereenkomst tussen nucleïnezuursequenties kan worden 40 vastgesteld FASTA toepassende met zijn standaardwaardeparameters (een woordgrootte van 6 en de NOPAM-factor voor de scoringsmatrix) of Gap toepassende met zijn standaardwaardeparameters zoals voorzien in GCG Versie 6.1, hierin opgenomen door referentie.

5 [0059] Een referentie aan een nucleotidesequentie omvat zijn complement tenzij anderszins gespecificeerd. Dus, een referentie aan een nucleïnezuur hebbende een specifieke sequentie moeten worden begrepen zijn complementaire streng te omvatten, met zijn complementaire sequentie.

[0060] Zoals hierin toegepast, worden de termen "percentage sequentie-10 identiteit en "percentage sequentie homologie" uitwisselbaar toegepast.

[0061] De term "substantiële gelijkenis" of "substantiële sequentiegelijkenis", wanneer refererende aan een nucleïnezuur of fragment daarvan, betekent dat wanneer optimaal op een lijn gezet met geschikte nucleotide-insertie (of -deletie) met een ander nucleïnezuur (of 15 zijn complementaire streng), er een nucleotide sequentie-identiteit is in ten minste ongeveer 85%, bij voorkeur ten minste ongeveer 90%, en meer bij voorkeur ongeveer 95%, 96%, 97%, 98% of 99% van de nucleotidebasen, zoals gemeten door een goed bekend algoritme van sequentie-identiteit, zoals FASTA, BLAST of Gap, zoals hierboven besproken.

20 [0062] Wanneer toegepast op polypeptiden, betekent de term "substantiële identiteit" dat twee peptidesequenties, wanneer optimaal op een lijn gebracht, zoals door de programma's Gap of BESTFIT standaardwaarde gewichten toepassende zoals verschaft met de programma's, ten minste 70%, 75% of 80% sequentie-identiteit delen, bij voorkeur ten minste 90% of 25 95% sequentie-identiteit, en meer bij voorkeur ten minste 97%, 98% of 99% sequentie-identiteit. In bepaalde uitvoeringsvormen, verschillen residuposities die niet identiek zijn door conservatieve aminozuursubstituties. Een "conservatieve aminozuursubstitutie" is een in welke een aminozuurresidu vervangen wordt door een ander 30 aminozuurresidu hebben een zijketen R-groep met vergelijkbare chemische 41 eigenschappen (b.v., lading of hydrofobiciteit). In het algemeen, zal een conservatieve aminozuursubstitutie de functionele eigenschappen van een eiwit niet substantieel veranderen. In gevallen waarin twee of meer aminozuursequenties van elkaar verschillen door conservatieve 5 substituties, kan het percentage sequentie-identiteit worden aangepast naar boven om te corrigeren voor de conservatieve natuur van de substitutie. Middelen voor het maken van deze aanpassing zijn goed bekend aan deze vaardig in de kunst. Zie, b.v., Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994). Voorbeelden van groepen van aminozuren die zijketens 10 hebben met vergelijkbare chemische eigenschappen omvatten 1) alifatische zijketens: glycine, alanine, valine, leucine en isoleucine; 2) alifatische hydroxylzijketens: serine en threonine; 3) amideomvattende zijketens: asparagine en glutamine; 4) aromatische zijketens: fenylalanine, tyrosine en tryptofaan; 5) basische zijketens: lysine, arginine en histidine; 6) zure 15 zijketens: aspartaanzuur en glutamaatzuur; en 7) zwavelbevattende zijketens: cysteïne en methionine. Conservatieve aminozuursubstitutiegroepen zijn: valine-leucine-isoleucine, fenylalanine-tyrosine, lysine-arginine, alanine-valine, glutamaat-aspartaat en asparagine- glutamine.

20 [0063] Alternatief, is een conservatieve vervanging een verandering met een positieve waarde in de PAM250 logwaarschijnlijkheidsmatrix beschreven in Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992), hierin opgenomen door referentie. Een "gemiddeld conservatieve" vervanging is een verandering met een niet-negatieve waarde in de PAM250 25 logwaarschijnlijkheidsmatrix.

[0064] Sequentie-identiteit voor polypeptides wordt typisch gemeten sequentieanalysesoftware toepassende. Eiwitanalysesoftware vergelijkt sequenties toepassende metingen van gelijkenis toekend aan verschillende substituties, deleties en andere modificaties, omvattende conservatieve 30 aminozuursubstituties. Bijvoorbeeld, GCG omvat programma's zoals "Gap" 42 en "BESTFIT" welke kunnen worden toegepast met standaardwaardeparameters zoals gespecificeerd door de programma's om sequentiehomologie van sequentie-identiteit vast te stellen tussen sterk gerelateerde polypeptiden, zoals homologe polypeptiden van verschillende 5 soorten van organismen of tussen een wildtype eiwit en een mutant daarvan. Zie, b.v., GCG Versie 6.1 (University of Wisconsin, WI). Polypeptide-sequenties kunnen ook worden vergeleken FASTA toepassende onder gebruikmaking van standaardwaarden of geadviseerde parameters, zie GCG Versie 6.1. FASTA (b.v., FASTA2 en FASTA3) verschaft 10 alignments en percentage sequentie-identiteit van de regio's van de beste overlap tussen de gevraagde en zoeksequenties (Pearson, Methods Ezymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)). Een ander geprefereerd algoritme wanneer vergelijkende een sequentie van de uitvinding met een database omvattende een groot aantal van sequenties 15 van verschillende organismen is het computerprogramma BLAST, specifiek blastp of tblastn, standaardwaardeparameters toepassende zoals verschaft met de programma's. Zie, b.v., Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997).

[0065] De lengte van polypeptidesequenties vergeleken voor homologie zal 20 in het algemeen ten minste ongeveer 16 aminozuurresiduen zijn, gebruikelijk ten minste ongeveer 20 residuen, meer gebruikelijk ten minste ongeveer 24 residuen, typisch ten minste ongeveer 28 residuen, en bij voorkeur meer dan ongeveer 35 residuen. Wanneer onderzoekende een databasis omvattende sequenties van een groot aantal van verschillende 25 organismen, is het geprefereerd aminozuursequenties te vergelijken.

[0066] Zoals hierin toegepast, refereren de termen "label" of "gelabeld" naar inbouw van een ander molecuul in het antilichaam. In een uitvoeringsvorm, is het label een detecteerbare marker, b.v., inbouw van een radiogelabeld aminozuur of verbinding aan een polypeptide of 30 biotinyleenheden dat kan worden gedetecteerd door gemarkeerd avidine 43 (b.v., streptavidine omvattende een fluorescente marker of enzymatische activiteit die kan worden gedetecteerd door optische of colorimetrische werkwijzen ). In een ander uitvoeringsvormen, kan het label of de marker therapeutisch zijn, b.v., een drugconjugaat of toxine. Verschillende 5 werkwijzen voor labelling van polypeptiden en glycoproteïnen zijn bekend in de kunst en kunnen worden toegepast. Voorbeelden van labels voor polypeptiden omvatten, maar zijn niet beperkt tot, de volgende: radio-isotopen of radionuchdes (b.v., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, "Tc, mIn, 125I, 131I), fluorescente labels (b.v., FITC, rhodamine, lanthanidefosfors), 10 enzymatische labels (b.v., horseradishperoxidase, 8-galactosidase, luciferase, alkalinefosfatase), chemoluminiscente markers, biotinylgroepen, vooraf vastgestelde polypeptide-epitopen herkend door een secundaire reporter (b.v., leucinezipperpaarsequenties, bindingsplaatsen voor secundaire antilichamen, metaalbindende domeinen, epitooplabels), 15 magnetische agentia, zoals gadoliniumchelaten, toxinen zoals pertussistoxine, taxol, cytochalasin B, gramicidine D, ethidiumbromide, emetine, mitomycine, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicine, doxorubicine, daunorubicine, dihydroxyanthzacinedion, mitoxantron, mithramycine, actinomycine D, 1—dehydrotestosteron, 20 glucocorticoïden, procaine, tetracaine, lidocaïne, propanolol, en puromycine en analogen of homologen daarvan. In sommige uitvoeringsvormen, zijn labels verbonden door spacer-armen van verschillende lengten om potentiële sterische hindering te verminderen.

[0067] Door heel deze beschrijving en claims, zal het woord "omvatten", of 25 variaties zoals "omvat" of "omvattende", worden begrepen te impliceren de inclusie van een aangegeven element of groep van elementen maar niet de exclusie van een ander element of groep van elementen.

44

Humane anti-mvostatine antilichamen en karakterisering daarvan

[0068] De uitvinding verschaft hierin anti-myostatine antilichamen. In sommige uitvoeringsvormen, zijn de antilichamen humaan. In andere uitvoeringsvormen, zijn de antilichamen gehumaniseerd. In sommige 5 uitvoeringsvormen, zijn humane myostatine antilichamen geproduceerd door immunisatie van een niet-humaan transgeen dier, b.v., een knaagdier, waarvan het genoom humane immunoglobulinegenen omvat zodat het transgene dier humane antilichaam produceert.

[0069] Een anti-myostatine antilichaam van de uitvinding kan een 10 humane kappa- of een humane lambda-lichte keten omvatten of een aminozuursequentie daarvan verkregen. In sommige uitvoeringsvormen omvattende een kappa-lichte keten, past het lichte keten-variahele domein (Vl) een humaan A30, A3 of L2 VK-gen toe.

[0070] In sommige uitvoeringsvormen, omvat de Vl van het anti-15 myostatine antilichaam een of meer aminozuursubstituties, -deleties of - inserties (addities) in vergelijking met de stamlijn Vk-aminozuursequentie. In sommige uitvoeringsvormen, omvat de Vl van het anti-myostatine antilichaam 1, 2, 3, 4 of 5 amionozuursubstituties in vergelijking met de stamlijn VK-aminozuur-sequentie. In sommige uitvoeringsvormen, is een of 20 meer van de substituties van stamlijn in de CDR-regio's van de lichte keten. In sommige uitvoeringsvormen, zijn de VK-aminozuursubstituties in vergelijking met de stamlijn op een of meer van dezelfde posities als de substituties in vergelijking met de stamlijn gevonden in een of meer van de Vl van de antilichamen hierin verschaft. Bijvoorbeeld, kan de Vl van een 25 anti-myostatine antilichaam van de uitvinding een of meer van de aminozuursubstituies omvatten in vergelijking met de stamlijn gevonden in de Vl van antilichaam 1_257_1. Er kunnen ook een of meer aminozuursubstituties zijn vergeleken met de stamlijn gevonden in de Vl van antilichaam 1_116_1, welke hetzelfde VK-gen toepast als antilichaam 30 1_257_1. In sommige uitvoeringsvormen, zijn de aminozuurveranderingen 45 op een of meer van dezelfde posities, maar omvatten een verschillende substitutie dan in het referentieantilichaam. In alle gevallen , is de omschrijving van een antilichaamkloon met streepjes equivalent aan dezelfde antilichaamkloon met puntjes (b.v., 1_257_1 = 1.257.1).

5 [0071] In sommige uitvoeringsvormen, treden aminozuursubstituties in vergelijking met de stamlijn op een of meer dezelfde posities op als substituties van de stamlijn in een van de Vl van antilichamen 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L211; 1_314_1H-T92A; 10 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-112V; 2_112_1L-F581; 2_112_1L-185V; 2_112_1H-L81M, L-F581; 2_112_1H-L81M, L-185V; of 2_112_1H-L81M, L-F581, 185V, maar de substituties kunnen conservatieve aminozuursubstituties representeren op zulke positie(s) in vergelijking met het aminozuur in het referentieantilichaam. Bijvoorbeeld, als een specifieke 15 positie in een van deze antilichamen is veranderd in vergelijking met de stamlijn en glutamaat is, mag iemand aspartaat substitueren op die positie. Vergelijkbaar, als een aminozuur substitutie vergeleken met de stamlijn in een voorbeeldantilichaam serine is, mag iemand threonine voor serine op die positie conservatief substitueren. Conservatieve aminozuursubstituties 20 zijn hierboven besproken, door heel deze aanvrage.

[0072] In sommige uitvoeringsvormen, omvat het anti-myostatine antilichaam een lichte keten-aminozuursequentie geselecteerd uit de groep bestaande uit SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40 en 44. In andere uitvoeringsvormen, omvat de lichte keten de lichte keten-25 aminozuursequentie van antilichaam 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L211; 2_112_1L-F581; 2_112_1L-185V of 2_112_1L-F581,185V. In sommige uitvoeringsvormen, omvat de lichte keten van het humane anti-myostatine antilichaam de VL-aminozuursequentie van antilichaam 1_116_1 (SEQ ID NO: 4); 1_136_3 (SEQ ID NO: 12); 1_257_1 (SEQ ID NO: 16); 1_46_1 (SEQ 30 ID NO: 24); 2_112_1 (SEQ ID NO: 28); 1_314_1 (SEQ ID NO: 20); 1_66_1 46 (SEQ ID NO: 36); 2_43_1 (SEQ ID NO: 44); 2_177_1 (SEQ ID NO: 40); 1_132_1 (SEQ ID NO: 8); of 1_268_1 (SEQ ID NO: 32) of genoemde aminozuursequentie hebbende tot en met 1, 2, 3, 4 of 5 conservatieve aminozuursubstituies en/of een totaal van tot en met 3 niet-conservatieve 5 aminozuursubstituties. In andere uitvoeringsvormen omvat de lichte keten van het humane anti-myostatine antilichaam de VL-aminozuursequentie van antilichaam 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 2_112_1L-F58l; 2_112__1L-I85V of 2_112_1L-F58I, I85V. In sommige uitvoeringsvormen, omvat de lichte keten de aminozuursequentie van het begin van de CDR1 10 tot het eind van CDR3 van een van de voorgaande antilichamen.

[0073] In sommige uitvoeringsvormen, kan de lichte keten de aminozuursequenties omvatten van CDRl, CDR2 en CDR3-regio's onafhankelijk geselecteerd uit de lichte keten CDRl, CDR2 en CDR3 regio's, respectievelijk, van twee of meer monoklonale antilichamen 15 geselecteerd uit 1_116_1 (SEQ ID NO: 4); 1_136_3 (SEQ ID NO: 12); 1_257_1 (SEQ ID NO: 16); 1_46_1 (SEQ ID NO: 24); 2_112_1 (SEQ ID NO: 28); 1_314_1 (SEQ ID NO: 20); 1_66_1 (SEQ ID NO: 36); 2_43_1 (SEQ ID NO: 44); 2_177_1 (SEQ ID NO: 40); 1_132_1 (SEQ ID NO: 8); of 1_268_1 (SEQ ID NO: 32), of genoemde CDR regio's elk hebbende minder dan 3 of 20 minder dan 2 conservatieve aminozuursubstituties en/of een totaal van drie of minder niet-conservatieve aminozuursubstituties.

[0074] In bepaalde uitvoeringsvormen, omvat de lichte keten van het anti-myostatine antilichaam de aminozuursequenties van de lichte keten CDRl, CDR2 en CDR3 regios van een antilichaam geselecteerd uit 1_116_1 25 (SEQ ID NO: 4); 1_136_3 (SEQ ID NO: 12); 1_257_1 (SEQ ID NO: 16); 1_46_1 (SEQ ID NO: 24); 2_112_1 (SEQ ID NO: 28); 1_314_1 (SEQ ID NO: 20); 1_66_1 (SEQ ID NO: 36); 2_43_1 (SEQ ID NO: 44); 2_177_1 (SEQ ID NO: 40); 1_132_1 (SEQ ID NO: 8); of 1_268_1 (SEQ ID NO: 32) of genoemde CDR regio's elk hebbende minder dan 3 of minder dan 2 conservatieve 47 aminezuursubstituties en/of een totaal van 3 of minder niet-conservatieve aminozuursubstituties.

[0075] Met betrekking tot de zware keten, in sommige uitvoeringsvormen, past het variabele domein(VH) een humaan Vh 1-02, Vh 3-21 of Vh 3-23 gen 5 toe. In sommige uitvoeringsvormen, omvat de Vh sequentie van het anti-myostatine antilichaam een of meer aminozuursubstituties, -deleties of -inserties (addities) collectief "mutaties", in vergelijking met de stamlijn Vh aminozuursequentie. In sommige uitvoeringsvormen, omvat het variabele domein van de zware keten 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 of 11 mutaties van de 10 stamlijn Vh aminozuursequentie. In sommige uitvoeringsvormen, zijn de mutatie(s) niet-conservatieve substituties vergeleken met de stamlijnaminezuursequentie. In sommige uitvoeringsvormen, zijn de mutaties in de CDR regio's van de zware keten.

[0076] In sommige uitvoeringsvormen, zijn aminozuursubstituties op een 15 of meer van dezelfde posities als de substituties van een stamlijn in een of meer van de Vh van antilichamen 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_H2_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, 20 L-I85V; of 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V. In andere uitvoeringsvormen, zijn de aminozuurveranderingen op een of meer van dezelfde posities maar omvatten een verschillende substitutie dan in het referentieantilichaam.

[0077] In sommige uitvoeringsvormen, omvat de zware keten een aminozuursequentie geselecteerd uit de groep bestaande uit SEQ ID NOS: 25 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 en 42. In andere uitvoeringsvormen, omvat de zware keten de zware ketenaminozuursequentie van antilichaam 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; of 2_112_1H-I12V. In sommige uitvoeringsvormen, omvat de zware keten de Vh aminozuursequentie van antilichaam 1_116_1 (SEQ ID NO: 2), 1_136_3 (SEQ ID NO: 10), 1_257_1 30 (SEQ ID NO: 14), 1_46_1 (SEQ ID NO: 22), 2_112_1 (SEQ ID NO: 26), 48 1_314_1 (SEQ ID NO: 18), 1_66_1 (SEQ ID NO: 34), 2_43_1 (SEQ ID NO: 42), 2_177_1 (SEQ ID NO: 38), 1_132_1 (SEQ ID NO: 6) en 1_268_1 (SEQ ID NO: 30); of genoemde Vh aminozuursequentie hebbende tot 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10 of 11 conservatieve aminozuursubstituties en/of een totaal van tot 5 en met 3 niet-conservatieve aminozuursubstituties. In andere uitvoeringsvormen, omvat de zware keten de Vh aminozuursequentie van antilichaam 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; of 2_112_lH-I12V. In sommige uitvoeringsvormen, omvat de zware keten de aminozuursequentie van het begin van de CDR1 tot het eind van de CDR3 van een van de 10 voorgaande antilichamen.

[0078] In sommige uitvoeringsvormen, omvat de zware keten de zware keten CDR1, CDR2 en CDR3 regio's van antilichaam 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1,1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-15 L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; of 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V of genoemde CDR regio's elk hebbende minder dan 8, minder dan 6, minder dan 4, of minder dan 3 conservatieve aminozuursubstituties en/of een totaal van drie of minder niet-conservatieve aminozuursubstituties.

20 [0079] In sommige uitvoeringsvormen, zijn de zware keten CDR regio's onafhankelijk geselecteerd uitde CDR regio's van twee of meer antilichamen geselecteerd uit antilichamen 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 25 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; of 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V. In een andere uitvoeringsvorm, omvat het antilichaam een lichte keten zoals hierboven onthuld en een zware keten zoals boven onthuld. In een verdere uitvoeringsvorm, zijn de lichte ketens CDR's en de zware ketens CDR's van 30 het hetzelfde antilichaam.

49

[0080] In verschillende uitvoeringsvormen, hebben de anti-myostatine antilichamen de gehele lengte zware keten en de gehele lengte lichte keten aminozuursequentie(s), de Vh en V l aminozuursequenties, de zware keten CDR1, CDR2 en CDR3 en lichte ketenCDRl, CDR2 en CDR3 5 aminozuursequenties of de zware keten aminozuursequentie van het begin van de CDR1 tot het eind van de CDR3 en de lichte keten aminozuursequentie van het begin van de CDR1 tot het eind van de CDR3 van een anti-myostatine antilichaam hierin verschaft..

[0081] Een type van aminozuursubstitutie dat kan worden gemaakt is 10 een of meer cysteines in het antilichaam te veranderen, welke chemisch reactief kan zijn, met een ander residu, zoals, zonder limitering, alanine of serine. In één uitvoeringsvorm, is er een substitutie van een niet-canonicaal cysteine. De substitutie kan worden gemaakt in een CDR of frameworkregio van een variabel domein of in het constante domein van een antilichaam. In 15 sommige uitvoeringsvormen, is het cysteine canonicaal.

[0082] Een ander type van aminozuursubstitutie dat kan worden gemaakt is potentiële proteolytische plaatsen in het antilichaam te verwijderen. Zulke plaatsen kunnen optreden in een CDR of frameworkregio van een variabel domein of in het constante domein van 20 antilichaam. Substitutie cysteïneresiduen en verwijdering van proteolytische plaatsen kan het risico op heterogeniteit in het antilichaamproduct verminderen en dus zijn homogeniteit verhogen. Een ander type van aminozuursubstitutie is asparagine-glycineparen te elimineren, welke potentiële deamidatieplaatsen vormen, door een of beide 25 van de residuen te veranderen.

[0083] In sommige uitvoeringsvormen, is het C-terminale lysine van de zware keten van het anti-myostatine antilichaam van de uitvinding gekliefd. In verschillende uitvoeringsvormen van de uitvinding, kunnen de zware en lichten keten van de anti-myostatine antilichamen optioneel een 30 signaalsequentie omvatten.

50

[0084] In een aspect, verschaft de uitvinding tot elf inhibitoire humane anti-myostatinemonoklonale antilichamen en de hybridomacellijnen die ze produceren. Tabel 1 somt op de sequentieidentifiers (SEQ ID NOs) van de nucleïnzuren coderende voor de gehele lengte zware en lichte ketens en 5 variabel domein omvattende gedeelten van deze ketens, en de corresponderende gehele lengte gededuceerde aminozuursequenties.

51

Tabel 1 SEQUENTIE IDENTIFIERS (SEQ ID NO)

I GEHELE LENGTE V DOMEIN omVATTEND

GEDEELTE

Mab Zware Lichte Zware Lichte

DNA I EIWIT DNA EIWIT EIWIT I DNA EIWIT DN

A

_____ _ - 3 4 45 46 47 48 1_132_1 5 6 7 8 49 50 51 52 1_136_3 9 ÏÖ Π 12 53 54 55 56 1_257_1 13 14 15 16 57 58 59 60 1_314_1 17 18 19 20 65 66 67 68 1_46_1 21 22 23 24 69 70 71 72 2_112_1 25 26 27 28 77 78 79~ 80 1_268_1 29 30 31 32 61 62 63 64 1_66_1 33 34 35 36 73 74 75 76 2_177_1 ~37 38 39 40 81 82 83 84 2_43_1 41 42 43 44 85 86 87 88

[0085] De uitvinding verschaft verder zware en/of lichte ketenvarianten 5 van bepaalde van de boven opgesomde humane anti-myostatine antilichamen, omvattende een of meer aminozuurmodificaties. Om de varianten aan te duiden, is de eerste letter het eenlettersymbool voor het aminozuur van de natuurlijk voorkomende antilichaamketen, het nummer refereert aan de positie van het aminozuur (waarin positie 1 het N-10 terminale aminozuur is van de FRI) en de tweede letter is het eenlettersymbool voor de aminozuurvariant.

[0086] De uitvinding verschaft een lichte ketenvariant van monoklonaal antilichaam 1_116_1 genoemd 1_116_1L-Q45K, welke een lysine heeft op positie 45 van SEQ ID NO: 4.

52

[0087] Een andere lichte ketenvariant is 1_257_1L-L21I, welke een isoleucineresidu heeft op positie 21 van SEQ ID NO: 16.

[0088] Een zware ketenvariant van monoklonaal antilichaam van 1_314_1 genoemd 1_314_1H-T92A welke een alanineresidu heeft op positie 5 92 vanf SEQ ID NO: 18.

[0089] De uitvinding verschaft verder een zware ketenvariant van monoklonaal antilichaam 1_46_1 genoemd 1_46_1H-L81M, welke een methionine heeft op positie 81 van SEQ ID NO: 22.

[0090] De uitvinding verschaft een zware ketenvariant (I12V) en twee 10 lichte ketenvarianten (F58I en 185V) van monoklonaal antilichaam 2_112_1. De zware keten variant genoemd 2_112_1H-I12V heeft een valine op positie 12 van SEQ ID NO: 26. Een lichte ketenvariant, 2_112_1L-F85I, heeft een isoleucine op positie 85 van SEQ ID NO: 28. De andere lichte ketenvariant, genoemd 2_112_1L-I85V, heeft een valine op 15 positie 85 van SEQ ID NO: 28. De uitvinding verschaft ook een lichte ketenvariant omvattende beide mutaties, d.w.z., 2_112_1L-F85I, I85V. De uitvinding omvat ook antilichamen omvattende de zware ketenvariant met ofwel een of beide van de lichte ketenmutaties, d.w.z., 2_112_1H-I12V, L-F58I; 2_112_1H-I12V, L-I85V; en 2_112_1H-I12V, L-F58I, I85V.

20 [0091] In nog verdere uitvoeringsvormen, omvat de uitvinding antilichamen omvattende variabele domeinaminozuursequenties met meer dan 80%, meer dan 85%, meer dan 90%, meer dan 95%, meer dan 96%, meer dan 97%, meer dan 98% of meer dan 99% sequentie-identiteit aan een variabele domeinaminozuursequentie van een van de bovenopgesomde 25 humane anti-myostatine antilichamen.

Klasse en Subklasse van anti-mvostatine antilichamen

[0092] De klasse en subklasse van anti-myostatine antilichamen kunnen worden gedetermineerd door een werkwijze bekend in de kunst. In het algemeen, kunnen de klasse en subklasse van een antilichaam worden 53 vastgesteld antilichamen toepassende die specifiek zijn voor een bepaalde klasse en subklasse van antilichaam. Zulke antilichamen zijn commercieel beschikbaar. De klasse en subklasse kunnen worden gedetermineerd door ELISA, of Western Blot zowel als andere technieken. Alternatief, kunnen 5 de klasse en subklasse worden gedetermineerd door geheel of een gedeelte van de constante domeinen van de zware en/of lichte ketens van antilichamen te sequencen, hun aminozuursequenties te vergelijken met de bekende aminozuursequenties van verschillende klasse en subklassen van immunoglobulinen, en bepalen van de klasse en subklasse van de 10 antilichamen.

[0093] In sommige uitvoeringsvormen, is het anti-myostatine-antilichaaam een monoklonaal antilichaam. Het anti-myostatine antilichaam kan een IgG, een IgM, een IgE, een IgA, of een IgD molecuul zijn. In een voorkeursuitvoering, is het anti-myostatine antilichaam een 15 IgG en is een IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 subklasse. In een andere voorkeursuitvoering, is het antilichaam subklasse IgG2.

Identificatie van Mvostatine-enitonen herkend door anti-myostatine antilichamen

[0094] De uitvinding verschaft een humaan anti-myostatine monoklonaal 20 antilichaam dat bindt aan myostatine en wedijvert of kruiswedijvert met en/of hetzelfde epitoop bindt als (a) een antilichaam geselecteerd uitl_116_l, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 25 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; of 2_112_1H-L81M, L- F58I, I85V; (b) een antilichaam dat een zware keten variabel domein omvat hebben met de aminozuursequentie van het Vb-domein in een van SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81 of 85, (c) een antilichaam dat een lichte keten variabel domein omvat 54 hebbende de aminozuursequentie van het Vl domein in een van SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83 of 87 (d) een antilichaam dat omvat zowel een zware keten variabel domein als gedefinieerd in (b) en een lichte keten variabel domein als 5 gedefinieerd in (c).

[0095] Iemand kan vaststellen of een antilichaam bindt aan hetzelfde epitoop of kruiswedijvert voor binding met een anti-myostatine antilichaam door werkwijzen bekend in de kunst toe te passen. In een uitvoeringsvorm, staat iemand het anti-myostatine antilichaam van de uitvinding toe te 10 binden aan myostatine onder verzadigende condities en meet dan de mogelijkheid van het testantilichaam om aan myostatine te binden. Als het testantilichaam in staat is te binden aan myostatine op de zelfde tijd als het referentie anti-myostatine antilichaam, dan bindt het testantilichaam aan een verschillend epitoop dan het referentie-anti-myostatine 15 antilichaam. Echter, als het testantilichaam niet in staat is te binden aan myostatine op hetzelfde moment, dan bindt het testantilichaam aan hetzelfde epitoop, een overlappend epitoop, of een epitoop dat in dichte nabijheid is met het epitoop gebonden door het anti-myostatine antilichaam van de uitvinding. Het experiment kan worden uitgevoerd onder 20 gebruikmaking van ELISA, RIA, BIACOR™, of flow-cytometrie. Om te testen of een anti-myostatine antilichaam kruiswedijvert met een ander anti-myostatine antilichaam, kan iemand de competitiewerkwijze toepassen zoals boven beschreven in twee richtingen, d.w.z. vaststellen of het bekende antilichaam test-antilichaam blokkeert en vice versa. In een 25 voorkeursuitvoeringsvorm, wordt het experiment uitgevoerd ELISA toepassende.

Inhibitie van mvostatineactiviteit door anti-mvostatine antilichaam

[0096] Iemand kan anti-myostatine monoklonale antilichamen identificeren die myostatinebinding inhiberen een aantal assays 55 toepassende. Bijvoorbeeld, neutraliserende anti-myostatine antilichamen kunnen worden geïdentificeerd door hun mogelijkheid myostatine-geïnduceerde luciferase-activiteit in A204-cellen getransfecteerd met een Smad-respons elementen / luciferase construct te blokkeren zoals 5 beschreven in voorbeeld III. Geprefereerde anti-myostatine antilichamen hebben een IC50 van niet meer dan 500nM, 250nM, lOOnM, 75nM, 50nM, 40nM, 30nM, 20nM, lOnM, InM, 0.5nM of O.lnM.

[0097] Iemand kan ook de mogelijkheid van anti-myostatine antilichaam om myostatine-geïnduceerde Smad-eiwitactivatie te blokkeren 10 determineren door L6-rattenmyoblastcellen getransfecteerd met een

Smad2/3-bindingselement/beta-lactamaseconstruct in contact te brengen met een anti-myostatine antilichaam zoals beschreven in voorbeeld IV. In verschillende uitvoeringsvormen, heeft het anti-myostatine antilichaam ICöoin deze assay van niet meer dan 500nM, 250nM, lOOnM, 75nM, 50nM, 15 40nM, 30nM, 20nM, lOnM, InM, 0.5nM of O.lnM.

[0098] Alternatief, kunnen neutraliserende anti-myostatine antilichamen worden geïdentificeerd door hun mogelijkheid Smad 2- of 3-fosforylatie te inhiberen in een Western Blot zoals beschreven in voorbeeld V.

20 [0099] In andere uitvoeringsvormen, moduleert een anti-myostatine antilichaam van de uitvinding de expressie van genen geassocieerd met spiercelproliferatie en —differentiatie. Zulke modulatie omvat maar is niet beperkt tot afnemende expressie van de celcyclusinhibitor P21-eiwit en pro-apotopisch Bax-eiwit, toenemende fosforylering van Rb, en toenemende 25 expressie van Cdk2. In sommige uitvoeringsvormen, laten antagonist-anti-myostatine antilichamen van de uitvinding de expressie van MyoD, myogenine en Myf5 toenemen. Het effect van een anti-myostatine antilichaam op genexpressie kan worden vastgesteld toepassende een van een aantal van routinetechnieken. (Zie b.v., voorbeeld VI).

δ 6

[0100] In sommige uitvoeringsvormen, versterkt een neutraliserend anti-myostatine antilichaam van de uitvinding myoblastdifferentiatie. De mogelijkheid van een antilichaam zulke profileratie en differentiatie te versterken kan worden vastgesteld door assays toepassende, b.v. C2C12- 5 cellen zoals beschreven in voorbeeld VII.

Competatieve vs non-comnetatieve humane anti-mvostatine antilichamen

[0101] Humane anti-myostatine antilichamen van de uitvinding kunnen worden gecategoriseerd als competitief en niet-competitief met andere inhibitoire myostatienebindende eiwitten immunoprecipitatie- 10 experimenten toepassende. Bijvoorbeeld, het propeptide, welke een complex vormt met matuur GDF8 is een inhibitoir eiwit. Geconditioneerd medium van 293T-cellen GDF8 tot expressie brengende omvat matuur GDF8, matuur GDF8/propeptidecomplex en niet-geprocessed GDF8.

Immunoprecipitatiestudies werden uitgevoerd om te testen de binding van 15 de humane anti-myostatine antilichamen in de uitvinding aan matuur GDF8/propeptidecomplex dit geconditioneerde medium toepassende. Zoals beschreven in voorbeeld X, bonden en immunoprecipiteerden antilichamen 2_112_1, 2_43_1 en 2_177_1 matuur GDF8, matuur GDF8/propeptidecomplex, en niet-geprocessed GDF8. Antilichaam 1_66_1 20 bond en immunoprecipiteerde matuur GDF8 en matuur GDF8/propeptidecomplex. Geen van de andere antilichamen immunoprecipiteerde matuur GDF8, propeptide, of niet-geprocessed GDF8. Antilichamen 2_112_1, 2_43_1 en 2_177_1, dus, zijn niet-competitieve antilichamen, en antilichaam 1_66_1 is ook een niet-competitief 25 antilichaam maar een die bindt aan een verschillend epitoop van myostatine. Een niet-competitief neutraliserend antilichaam, d.w.z. een die myostatine bindt in de aanwezigheid van andere inhibitoire eiwitten, zal een betere effectiviteit hebben in vivo dan een competitief antilichaam.

57

[0102] In andere uitvoeringsvormen, immunoprecipiteert een anti-myostatine antilichaam van de uitvinding matuur GDF8 uit muizenserum. Zoals beschreven in voorbeeld XI, trekken monoklonale antilichamen 2_112, 2_43_1 en 2_177 meer matuur GDF8 neer dan 1_116_1 en 1_66_1.

5 Soort specificiteit en moleculaire selectiviteit

[0103] In een ander aspect van de uitvinding, demonstreren de anti-myostatine antilichamen zowel soort specificiteit als moleculaire selectiviteit. In sommige uitvoeringsvormen, bindt het anti-myostatine antilichaam aan humaan-, muis-, Rattus norvegicus (Noorwegenrat)-, 10 Cynomolgus macaque (aap)-, Macaca fascicularis (krab-etende macaak)-, Meleagris gallopavo (kalkoen)-, Sus scrofa (varken)-, Gallus gallus (kip)-, Gallus gallus (kip)-, Canis familiaris (hond)-, Equus caballus (paard)-, Coturnix chinensis (kwartel)-, Coturnix coturnix (gewone kwartel)- en Columba livia (gedomesticeerde duif)-myostatine. De lessen van de 15 beschrijving volgende, kan iemand vaststellen de soort specificiteit voor het anti-myostatine antilichaam goed bekende werkwijzen in de kunst toepassende. Bijvoorbeeld, kan iemand de soort specificiteit vaststellen Western blot, surface plasmon resonantie, b.v. BIAcore, ELISA, immunoprocipitatie of RIA toepassende.

20 [0104] In andere uitvoeringsvormen, heeft het anti-myostatine antilichaam een selectiviteit voor myostatine over GDF11 van ten minste 50-maal of ten minste 100-maal. GDFll is een dichtbij familielid van myostatine dat 90% identiteit deelt in zijn mature eiwit. In sommige uitvoeringsvormen, toont het anti-myostatine antilichaam geen 25 waarneembare specifieke binding aan een ander eiwit anders dan myostatine. Iemand kan de selectiviteit van het anti-myostatine antilichaam voor myostatine vaststellen werkwijzen goed bekend in de kunst toepassende de lessen van de beschrijving volgende. Bijvoorbeeld kan 58 iemand de selectiviteit vaststellen toepassende Western blot, flow-cytometrie, ELISA, immunOprecipitatie of RIA.

[0105] In andere uitvoeringsvormen van de uitvinding, heeft het anti-myostatine antilichaam niet deze hoge graad van selectiviteit voor GDF8 5 overGDFll.

Werkwijzen voor het produceren van antilichamen en antilichaamproducerende cellijnen

Tmmunisatie

[0106] In sommige uitvoeringsvormen, worden humane antilichamen 10 geproduceerd door immunisatie van een niet-humaan, transgeen dier omvattende binnen zijn genoom enige of alle van humane immunoglobuline zware keten en lichte keten loei binnen een myostatineantigeen. In een voorkeursuitvoering, is het niet humane dier een XENOMOUSE™ dier. (Abgenix, Inc., Fremont, CA).

15 [0107] XENOMOUSE™ -muizen zijn ontworpen muisstammen die grote fragmenten van humane immunoglobuline zware keten en lichte keten loei omvatten en zijn deficiënt in muizenantilichaamproductie. Zie, b.v., Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) en V.S. Octrooien 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598, 6,130,364, 20 6,162,963 en 6,150,584. Zie ook WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560, en WO 00/037504.

[0108] Een ander aspect, verschaft de uitvinding een werkwijze voor het maken van anti-myostatine antilichamen van niet-humane, niet-25 muisdieren door immunisatie van niet-humane transgene dieren die humane immunoglobulineloci omvatten binnen een myostatineantigeen, omvatten. Iemand kan zulke dieren produceren toepassende de werkwijzen beschreven in de boven geciteerde documenten. De werkwijzen beschreven 59 in deze documenten kunnen worden gemodificeerd zoals beschreven in V.S. Octrooi 5,994,619, welke hierbij wordt opgenomen door referentie. U.S. Octrooi 5,994,619 beschrijft werkwijzen voor het produceren van nieuwe gekweekte binnenste celmassa (CICM)-cellen en cellijnen, verkregen van 5 varkens en koeien, en transgene CICM-cellen waarin heteroloog DNA ingebracht is. CICM-transgene cellen kunnen worden toegepast om gekloonde transgene embryo's, foetussen, en nageslacht te produceren. Het '619-Octrooi beschrijft ook werkwijzen van productie van transgene dieren die in staat zijn het heterologe DNA aan hun nageslacht over te dragen. In 10 voorkeursuitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding, zijn de niet-humane dieren zoogdieren, in het bijzonder ratten, schapen, varkens, geiten, vee, paarden of kippen.

[0109] XENOMOUSE™ -muizen produceren een volwassenachtige humaan repertoir van geheel humane antilichamen en genereren 15 antigeenspecifieke humane antilichamen. In sommige uitvoeringsvormen, omvatten XENOMOUSE™ -muizen ongeveer 80% van het humane antilichaam V-genrepertoir door introductie van megabasegrote, stamlijnconfiguratiefragmenten van de humane zware keten loei en kappa-lichte keten loei in gist artificieel chromosoom (YAC). In andere 20 uitvoeringsvormen, omvatten XENOMOUSE™ -muizen verder ongeveer geheel het humane lambda lichte ketenlocus. Zie Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green en Jakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), en WO 98/24893, de beschrijvingen welke hierbij zijn opgenomen door referentie..

25 [0110] In sommige uitvoeringsvormen, zijn het niet-humane dier omvattende humane immunoglobulinegenen, dieren die een humaan immunoglobuline "minolocus" hebben. In de minilocusbenadering, is een exogeen Ig locus nagebootst door de inclusie van individuele genen van het Ig locus. Dus, een of meer Vh genen, een of meer Dh genen, een of meer Jh 30 genen, een mu constant domein, en een tweede constant domein (bij 60 voorkeur een gamma-constant domein) worden gevormd in een construct voor invoeging in een dier. Deze benadering wordt beschreven, o.a. in V.S. Octrooi Nrs. 5,545,807, 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591,669, 5,612,205, 5,721,367, 5 5,789,215, en 5,643,763, hierbij opgenomen door referentie.

[0111] In een ander aspect, verschaft de uitvinding een werkwijze voor maken van gehumaniseerde anti-myostatine antilichamen. In sommige uitvoeringsvormen, worden niet-humane dieren geïmmuniseerd met een myostatineantigeen zoals beneden beschreven onder condities die 10 antilichaamproductie toestaan. Antilichaamproducerende cellen worden geïsoleerd uit de dieren, en nucleïnezuren coderende voor de zware en lichte keten van een anti-myostatine antilichaam van interesse worden geïsoleerd uit de geïsoleerde antilichaamproducerende cellen of uit een geïmmortaliseerde cellijn geproduceerd uit zulke cellen. De nucleïnezuren 15 worden vervolgens ontworpen technieken toepassende bekend aan dezen vaardig in de kunst en zoals verder beneden beschreven om de hoeveelheid van niet-humane sequentie te reduceren, d.w.z., het antilichaam te humaniseren om de immuunrespons in mensen te reduceren.

[0112] In sommige uitvoeringsvormen, is het myostatineantigeen 20 geïsoleerd en/of gezuiverd myostatine. In sommige uitvoeringsvormen, is het myostatineantigeen humaan myostatine. Echter, omdat het C-terminale mature myostatine uit mensen, muizen, rat, hond, kwartel, kip, kalkoen, varken, paard en apen identiek is en niet geglycosyleerd is in cellen, kan myostatine van deze soorten en andere soorten met dezelfde 25 mature eiwitsequentie ook worden toegepast als het immunogeen. In andere uitvoeringsvormen, is het myostatineantigeen een cel dat myostatine tot uitdrukking brengt of overexpresseert. In andere uitvoeringsvormen, is het myostatinantigeen een recombinant eiwit tot uitdrukking gebracht uit gist, insectencellen, bacteriën zoals E.Coli, of 30 andere bronnen door recombinante technologie.

61

[0113] Immunisatie van dieren kan door een werkwijze bekend in de kunst. Zie, b.v., Harlow en Lane, Antilichamen: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Werkwijzen voor immunisatie van niet-humane dieren, zoals muizen, ratten, schapen, geiten, varkens, vee en 5 paarden zijn goed bekend in de kunst. Zie, b.v. Harlow en Lane, bovenstaand, en U.S. Octrooi 5,994,619. In een voorkeursuitvoering, wordt het myostatineantigeen toegediend met een adjuvans om de immuunrespons te stimuleren. Voorbeeldadjuvantia omvatten compleet of incompleet Freund's adjuvans, RIBI (muramyldipeptiden) of ISCOM 10 (immuunstimulerende complexen). Zulke adjuvantie kunnen bet polypeptide beschermen tegen snelle verspreiding door te sequesteren in een lokaal depot, of zij kunnen substanties omvatten die de gastheer stimuleren om factoren uit te scheiden die chemotactisch zijn voor macrofagen en andere componenten van het immuunsysteem. Bij voorkeur, 15 als een polypeptide wordt toegediend, zal het immunisatieschema twee of meer toedieningen van het polypeptide omvatten, uitgespreid over verscheidene weken. Voorbeeld I illustreert een werkwijze voor productie van anti-myostatine monoklonale antilichamen in XenoMouse™ -muizen.

Productie van Antilichamen en antilichaamproducerende cellijnen 20 [0114] Na immunisatie van een dier met een myostatineantigeen, kunnen antilichamen en/of antilichaamproducerende cellen worden verkregen uit het dier. In sommige uitvoeringsvormen, wordt anti-myostatine antilichaam-bevattend serum verkregen van het dier door het dier te laten bloeden of op te offeren. Het serum kan worden toegepast zoals het is 25 verkregen van het dier, een immunoglobulinefractie kan worden verkregen uit het serum, of de anti-myostatine antilichamen kunnen worden gezuiverd uit het serum.

[0115] In sommige uitvoeringsvormen, worden antilichaam-producerende cellijnen bereid uit cellen geïsoleerd uit het geïmmuniseerde dier. Na 62 immunisatie, wordt het dier opgeofferd en lymfeknoop en/of milt B-cellen worden onsterfelijk gemaakt door een middel bekend in de kunst. Werkwijzen van immortaliseren van cellen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, ze te transfecteren met oncogenen, ze te infecteren met een 5 oncogeen virus en ze te kweken onder condities die selecteren voor het immortaliseren van cellen, ze te onderwerpen aan carcinogene of muterende verbindingen, ze te fuseren met een geïmmortaliseerde cel, b.v., een myelomacel, en een tumorsuppressorgen te inactiveren. Zie, b.v., Harlow en Lane, bovenstaand. Als fusie met myelomacellen wordt 10 toegepast, scheiden de myelomacellen bij voorkeur geen immunoglobulinepolypeptiden uit (een niet-uitscheidende cellijn). Geimmortaliseerde cellen worden gescreend myostatine toepassende, of een gedeelte daarvan. In een voorkeursuitvoering, wordt de initiële screening uitgevoerd toepassende een enzymlinked immunoassay (ELISA) of een 15 radioimmunoassay. Een voorbeeld van ELISA-screening wordt verschaft in WO 00/37504, hierin opgenomen door referentie..

[0116] Anti-myostatine antilichaam-producerende cellen, b.v., hybridoma's worden geselecteerd, gekloneerd en verder gescreend voor gewenste eigenschappen, inclusief robuuste groei, hoge 20 antilichaamproductie en gewenste antilichaameigenschappen, zoals verder beneden beschreven. Hybridoma's kunnen worden geëxpandeerd in vivo in syngenetische dieren, in dieren die een immuunsysteem missen, b.v., naakte muizen, of in celkweek in vitro. Werkwijzen van selecteren, kloneren en expanderen van hybridoma's zijn goed bekend aan deze van 25 normale vaardigheid in de kunst.

[0117] In een voorkeursuitvoering, is het geïmmuniseerde dier een niet-humaan dier dat humane immunoglobulinegenen tot expressie brengt en de milt B-cellen worden gefuseerd met een myelomacellijn van dezelfde soort als het niet-humane dier. In een meer geprefereerd uitvoeringsvorm, is het 30 geïmmuniseerde dier een XENOMOUSE™ -muis en is de myelomacellijn 63 een niet-secreterende muismyeloma. In een zelfs meer geprefereerde uitvoeringsvorm, is de myelomacellijn P3-X63-Ag8.653 (American Type Culture Collection). Zie, b.v., Voorbeeld I.

[0118] Dus, in één uitvoeringsvorm, verschaft de uitvinding werkwijzen 5 voor het produceren van een cellijn die een humaan monoklonaal antilichaam of een fragment daarvan produceert gericht tegen myostatine omvattende (a) immunisatie van een niet-humaan transgeen dier beschreven hierin met myostatine, een gedeelte van myostatine of een cel of weefsel myostatine tot expressie brengende; (b) het transgene dier toestaan 10 een immuunrespons op te bouwen tegen myostatine; (c) het isoleren van antilichaamproducerende cellen van een transgeen dier; (d) het immortaliseren van antilichaamproducerende cellen; (e) het creëren van individuele monoklonale populaties van de geïmmortaliseerde antilichaamproducerende cellen; en (f) het screenen van de 15 geïmmortaliseerde antilichaamproducerende cellen om een antilichaam gericht tegen myostatine de identificeren.

[0119] In een ander aspect, verschaft de uitvinding een cellijn die een humaan anti-myostatine antilichaam produceert. In sommige uitvoeringsvormen, is de cellijn een hybridomacellijn. In sommige 20 uitvoeringsvormen, zijn de hybridoma's muishybridoma's, zoals boven beschreven. In andere uitvoeringsvormen, worden de hybridoma's geproduceerd in een niet-humaan, niet-muizensoort zoals ratten, schapen, varkens, geiten, vee of paarden. In een andere uitvoeringvorm, zijn de hybridoma's humane hybridoma's.

25 [0120] In een andere uitvoeringsvorm, wordt een transgeen dier geïmmuniseerd met een myostatineantigeen, primaire cellen, bijvoorbeeld, milt of perifere bloed B-cellen, worden geïsoleerd uit een geïmmuniseerd transgeen dier en individuele cellen die antilichamen produceren specifiek voor het gewenste antigeen worden geïdentificeerd. Polygeadenyleerd 30 mRNA uit elke individuele cel wordt geïsoleerd en reverse transcription 64 polymerase chain reaction (RT-PCR) wordt uitgevoerd sense primers toepassende die gloeien tegen variabele domeinsequenties, b.v., gedegenereerde primers die meest of alle van de FRl-regio's van humane zware en lichte keten variabele domein genen herkennen en 5 antigeenprimers die gloeien tegen constante of aansluitende regiosequenties. cDNAs van de zware en lichte keten variabele domeinen worden dan gekloond en tot expressie gebracht in een geschikte gastheercel, .b.v, een myelomacel, als chimere antilichamen met respectievelijke immunoglobuline constante regio's, zoals de zware keten en k- of λ-10 constante domeinen. Zie Babcook, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48, 1996, hierin opgenomen door referentie. Anti-myostatine antilichamen kunnen dan worden geïdentificeerd en geïsoleerd zoals hierin beschreven.

[0121] In een ander uitvoeringsvorm, kunnen faag display-technieken 15 worden toegepast om bibliotheken te verschaffen omvattende een repertoir van antilichamen met verschillende affiniteiten voor myostatine. Voor productie van zulke repertoiren, is het onnodig de B-cellen uit het geïmmuniseerde dier te immortaliseren. Eerder, kunnen de primaire B-cellen direct worden toegepast als een bron van mRNA. Het mengsel van 20 cDNA's verkregen uit B-cel, b.v., verkregen uit milten, wordt toegepast om een expressiehibliotheek te bereiden, bijvoorbeeld, een faag display-bibliotheek getransfecteerd in E.coli. De resulterende cellen worden getest voor immunoreactiviteit voor myostatine. Technieken voor de identificatie van hoog affiniteit humane antilichamen uit zulke bibliotheken worden 25 beschreven door Griffiths et al., EMBO J., 13:3245-3260 (1994); Nissim et al., ibid, blz. 692-698 en by Griffiths et al., ibid, 12:725-734, welke opgenomen zijn door referentie. Uiteindelijk, worden klonen uit de bibliotheek geïdentificeerd die bindingsafliniteiten produceren van een gewenste grootte voor het antigen en het DNA coderende voor het product 30 verantwoordelijk voor zulke binding wordt teruggewonnen en 65 gemanipuleerd voor standaard recombinante expressie. Faag display-bibliotheken kunnen ook worden geconstrueerd toepassende eerder gemanipuleerde nucleotidesequenties en gescreend op een vergelijkbare manier. In het algemeen, worden de cDNA's coderende voor zware en lichte 5 ketens onafhankelijk verschaft of verbonden om Fv-analogen te vormen voor productie in de faag-bibliotheek.

[0122] De faag-bibliotheek wordt dan gescreend voor de antilichamen met de hoogste affiniteiten voor myostatine en het genetisch materiaal teruggewonnen uit de geschikte kloon. Verdere ronden van screening 10 kunnen affiniteit vergroten van het origineel geïsoleerde antilichaam.

Nucleïnezuren, vectoren, gastheercellen en_

Recombinante Werkwijzen voor het maken van Antilichamen

Nucleïnezuren

[0123] De onderhavige uitvinding omvat ook nucleïnezuurmoleculen 15 coderende voor anti-myostatine antilichamen of antigeenbindende fragmenten daarvan. In sommige uitvoeringsvormen, coderen verschillen nucleïnezuurmoleculen voor een zware keten en een lichte keten van een anti-myostatine-immonoglubuline. In andere uitvoeringsvormen, codeert hetzelfde nucleïnezuurmolecuul voor een zware keten en een lichte keten 20 van een anti-myostatine-immunoglobuline.

[0124] In sommige uitvoeringsvormen, past het nucleïnezuurmolecuul coderende voor het variabele domein van de lichte keten (Vl) een humaan A3, A30 of L2 Vk gen, en een humaan JkI, Jk3 of Jk4 gen toe. In sommige uitvoeringsvormen past het nucleïnzuurmolecuul een humaan A30, A3 of 25 L2 Vk gen en een humaan Jk4 gen toe. In andere uitvoeringsvormen, past het nucleïnezuurmolecuul een humaan A30, A3 of L2 gen en een humaan JkI gen toe. In sommige uitvoeringsvormen, codeert het nucleïnezuurmolecuul coderende voor de lichte keten voor een 66 aminozuursequentie omvattende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, of 10 substituties uit de stamlijn aminozuursequentie(s). In sommige uitvoeringsvormen, omvat het nucleïnezuurmolecuul een nucleotidesequentie die codeert voor een Vl aminozuursequentie omvattende 1, 2, 3, 4 of 5 conservatieve 5 aminozuursubstituties en/of 1, 2, of 3 niet-conservatieve substituties vergeleken met stamlijn Vk en Jk sequenties. Substituties kunnen zijn in de CDR-regio's, de frameworkregio's of in het constante domein.

[0125] In sommige uitvoeringsvormen, codeert het nucleïnezuurmolecuul voor een Vl aminozuursequentie omvattende een of meer mutaties 10 vergeleken met de stamlijnsequentie die identiek zijn aan de mutaties uit stamlijn gevonden in de Vl van een van antilichamen 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, 15 L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; of 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V.

[0126] In sommige uitvoeringsvormen, codeert het nucleïnezuurmolecuul voor ten minste drie aminozuursubstituties vergeleken met de stamlijnsequentie gevonden in de Vl van een van de antilichamen 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 20 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; of 2_112_lH-L81M, L-F58I, I85V.

[0127] In sommige uitvoeringsvormen, omvat het nucleïnezuur molecuul 25 een nucleotidesequentie die codeert voor de Vl aminozuursequentie van monoclonal antilichaam 1_116_1 (SEQ ID NO: 4); 1_136_3 (SEQ ID NO: 12); 1_257_1 (SEQ ID NO: 16); 1_46_1 (SEQ ID NO: 24); 2_112_1 (SEQ ID NO: 28); 1_314_1 (SEQ ID NO: 20-0; 1_66_1 (SEQ ID NO: 36); 2_43_1 (SEQ ID NO: 28); 2_177_1 (SEQ ID NO: 40); 1_132_1 (SEQ ID NO: 8); of 30 1_268_1 (SEQ ID NO: 32) of een variant of gedeelte daarvan. In sommige 67 uitvoeringsvormen, codeert het nucleïnezuurmolecuul voor een aminozuursequentie omvattende de lichte keten CDR's van een van genoemde boven opgesomde antilichamen. In sommige uitvoeringsvormen, is genoemd gedeelte een aangrenzend gedeelte omvattende CDR1-CDR3.

5 [0128] In sommige uitvoeringsvormen, omvat het nucleïnezuurmolecuul een nucleotidesequentie die codeert voor de aminozuursequentie van een van de SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83 of 87. In sommige uitvoeringsvormen, omvat het nucleïnezuurmolecuul de nucleotidesequente van SEQ ID NOs: 3, 7, 11, 15, 10 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 48, 52, 56, 60, 68, 72, 80, 64, 76, 84 of 88 of een gedeelte daarvan. In sommige uitvoeringsvormen, codeert het nucleïnzuur voor de aminozuursequentie van de lichte keten of een, twee of alle drie CDR's van genoemd antilichaam. In sommige uitvoeringsvormen, codeert genoemd gedeelte voor een aangrenzende regio van CDR1-CDR3 van de 15 lichte keten van een anti-myostatine antilichaam.

[0129] In sommige uitvoeringsvormen, codeert het nucleïnezuurmolecuul voor een Vl aminozuursequentie die ten minste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% of 99% identiek is aan de Vl aminozuursequentie van een van antilichamen 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 20 1_66_1, 2_43_1, 2^177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L- L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_lH-I12V; 2_112_lL-F58I; 2_112_1L-I85V; of 2_112_1H-L81M, L-F58I;-2_112_1H-L81M, L-I85V; of 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V, of aan de aminozuursequentie van de Vl regio van een van SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47, 51, 25 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83 of 87. Nucleïnzezuurmoleculen van de uitvinding omvatten nucleïnezuren die onder hoog stringente condities hybridiseren, zoals deze boven beschreven, of die ten minste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% of 99% identiek zijn aan een nucleïnezuur coderende voor de aminozuursequentie de Vl regio van SEQ ID NOs: 4, 8, 30 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83 of 87 of 68 aan een nucleïnezuur omvattende de Vl regio nucleotidesequentie van SEQ ID NOs: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 48, 52, 56, 60, 68, 72, 80, 64, 76, 84 of 88

[0130] In andere geprefereerde uitvoeringsvormen codeert het 5 nucleïnezuurmolecuul voor het variabele domein van een zware keten (Vn) dat toepast een humane 1-02, 3-21 of 3-23 Vu gensequentie of een sequentie daarvan verkregen. In verschillende uitvoeringsvormen, benut het nucleïnezuurmolecuul een humaan Vh 1-02 gen, een D4-23 gen en een humaan Jn6b gen; een humaan Vh 3-21 gen, een humaan D3-16 of D5-12 10 gen en een humaan Jh61) gen; een humaan Vu 3-21 gen, een humaan Dl-26 of D5-5 gen en een humaan Jh41) gen; een humaan Vh 3-23 gen, een humaan Dl-7 gen en een humaan JH3b gen.

[0131] In sommige uitvoeringsvormen, codeert het nucleïnezuurmolecuul voor een aminozuursequentie omvattende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 of 11 15 mutaties vergeleken met de stamlijn aminozuursequentie van de humane V, D of J genen. In sommige uitvoeringsvormen, zijn genoemde mutaties in de Vh regio. In sommige uitvoeringsvormen, zijn genoemde mutaties in de CDR regio's.

[0132] In sommige uitvoeringsvormen, codeert het nucleïnezuurmolecuul 20 voor een Vh sequentie omvattende een of meer aminozuurmutaties vergeleken met de stamlijn Vh sequentie die identiek zijn aminozuurmutaties gevonden in de Vh van monoklonaal antilichaam 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-25 T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; of 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V. In sommige uitvoeringsvormen, codeert het nucleïnezuur voor ten minste drie aminozuurmutaties vergeleken met de stamlijnsequenties die identiek zijn aan ten minste drie aminozuurmutaties gevonden in een 30 van de bovenopgesomde monoklonale antilichamen.

69

[0133] In sommige uitvoeringsvormen, omvat het nucleïnezuurmolecuul een nucleotidesequentie die codeert voor ten minste een gedeelte van de Vh aminozuursequentie van een monoklonaal antilichaam geselecteerd uit 1_116_1 (SEQ ID NO: 2); 1_136_3 (SEQ ID NO: 10); 1_257_1 (SEQ ID NO:

5 14); 1_46_1 (SEQ ID NO: 22); 2_112_1 (SEQ ID NO: 26); 1_314_1 (SEQ ID

NO: 18); 1_66_1 (SEQ ID NO: 34); 2_43_1 (SEQ ID NO: 42); 2_177_1 (SEQ ID NO: 38); 1_132_1 (SEQ ID NO: 6); of 1_268_1 (SEQ ID NO: 30), een variant daarvan, of genoemde sequentie hebbende conservatieve aminozuurmutaties en/of een totaal van drie of minder niet-conservatieve 10 aminozuursubstituties. In verschillende uitvoeringsvormen codeert de sequentie voor een of meer CDR regio's, bij voorkeur een CDR3 regio, alle drie CDR regio's, een aangrenzend gedeelte omvattende CDR1-CDR3, of de gehele Vh regio, van een boven opgesomd anti-myostatine antilichaam.

[0134] In sommige uitvoeringsvormen, omvat het nucleïnezuurmolecuul 15 een nucleotidesequentie die codeert voor de aminozuursequentie van een van de SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81 of 85. In verschillende geprefereerde uitvoeringsvormen, omvat het nucleïnezuurmolecuul ten minste een gedeelte van de nucleotidesequentie van SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 20 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82 of 86. In sommige uitvoeringsvormen, codeert genoemd gedeelte voor de Vh regio, een CDR3 regio, alle drie CDR regio's, of een aangrenzende regio omvattende CDR1-CDR3.

[0135] In sommige uitvoeringsvormen, codeert het nucleïnezuurmolecuul voor een Vh aminozuursequentie die ten minste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 25 95%, 97%, 98% of 99% identiek aan de Vh aminozuursequentie in een van SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81 of 85. Nucleïnezuurmoleculen van de uitvinding omvatten nucleïnezuren die onder hoog stringente condities hybridiseren, zoals deze boven beschreven, of die ten minste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 30 98% of 99% identiek zijn aan een nucleïnezuur coderende voor de 70 aminozuursequentie van SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 of 42 of aan een Vu regio daarvan, of aan een nucleïnezuur omvattende de nucleotidesequentie van SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37 of 41 of de nucleotidesequentie die codeert voor een Vh regio daarvan.

5 [0136] In een andere uitvoeringsvorm, codeert het nucleïnezuur voor een gehele lengte-zware keten van een antilichaam geselecteerd uit 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 10 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1II-L81M, L-I85V; of 2_112_1H-L81M, L- F58I, I85V, of een zware keten omvattende de aminozuursequentie van SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 of 42. Verder, mag het nucleïnezuur omvatten de nucleotidesequentie van SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37 of 41.

15 [0137] Een nucleïnezuurmolecuul coderende voor de zware of lichte keten van een anti-myostatine antilichaam of gedeelten daarvan kan worden geïsoleerd uit elke bron die zo'n antilichaam produceert. In verschillende uitvoeringsvormen, worden de nucleïnezuurmoleculen geïsoleerd uit een B-cel die een anti-myostatine antilichaam tot uitdrukking brengt geïsoleerd 20 uit een dier geïmmuniseerd met myostatine of uit een geïmmortaliseerde cel verkregen uit zo'n B-cel. Werkwijzen van isolatie van nucleïnezuren coderende voor een antilichaam zijn goed bekend in de kunst. Zie b.v., Sambrook et al. mRNA kan worden geïsoleerd en toegepast om cDNA te produceren voor toepassing in de polymerase chain reaction (PCR) of cDNA 25 clonering van antilichaamgenen. In een voorkeursuitvoering, wordt het nucleïnezuurmolecuul geïsoleerd uit een hybridoma dat heeft als een van zijn fusiepartners een cel uit een niet-humaan transgeen dier, genoemde cel een humaan immunoglobuline producerende. In een zelfs meer geprefereerde uitvoeringsvorm, wordt de cel humaan immunoglobuline 30 producerende, geïsoleerd uit een XENOMOUSE™ -dier. In een andere 71 uitvoeringsvorm, wordt de cel het humane immunoglobuline producerende geïsoleerd uit een niet-human, niet-muis transgeen dier, zoals boven beschreven. In een andere uitvoeringsvorm, wordt het nucleïnezuur geïsoleerd uit een niet-humaan, niet-transgeen dier. De 5 nucleïnezuurmoleculen geïsoleerd uit een niet-humaan, niet-transgeen dier kan worden toegepast, b.v., voor gehumaniseerde antilichamen die een of meer aminozuursequenties uit een humaan anti-myostatine antilichaam van de onderhavige uitvinding omvatten.

[0138] In sommige uitvoeringsvormen, kan een nucleïnezuur coderende 10 voor een zware keten of een anti-myostatine antilichaam van de uitvinding een nucleotidesequentie coderende voor een Vh domein van de uitvinding verbonden in-frame aan een nucleotidesequentie coderende voor een zware keten-constant domein uit elke bron omvatten. Vergelijkbaar, kan een nucleïnezuurmolecuul coderende voor een lichte keten van een anti-15 myostatine antilichaam van de uitvinding een nucleotidesequentie omvatten coderende voor een Vl domein van de uitvinding verbonden in frame aan een nucleotidesequentie coderende voor een lichte keten-constant domein uit elke bron.

[0139] In een verder aspect van de uitvinding, worden 20 nucleïnezuurmolecuul coderende voor het variabele domein van de zware (Vh) en/of lichte (Vl) ketens "geconverteerd" naar gehele-lengte antilichaamgenen. In één uitvoeringsvorm, worden nucleïnezuurmoleculen coderende voor de Vh of Vl domeinen geconverteerd tot gehele-lenge antilichaamgenen door insertie in een expressievector reeds coderende voor 25 zware keten-constante (Ch) of lichte keten-constante (Cl) domeinen, respectievelijk, zodat het Vh segment operatief wordt verbonden aan de Ch segment(en) binnen de vector, en/of het Vl segment wordt operatief verbonden aan het Cl segment binnen de vector. In een andere uitvoeringsvorm, worden nucleïnezuurmoleculen coderende voor de Vh en/of 30 Vl domeinen geconverteerd in geheel-lengte antilichaamgenen door 72 verbinding, bijv, ligatie, van een nucleïnezuurmolecuul coderende voor een Vh en/of Vl domeinen en een nucleïnezuurmolecuul coderende voor een Ch en/of Cl domein standaard moleculaire biologische technieken toepassende. Nucleïnezuursequenties van humane zware en lichte keten-5 immunoglobuline constante domein genen zijn bekend in de kunst. Zie, b.v., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5deEd., NIH Publ. No. 91-3242, 1991. Nucleïnezuurmoleculen coderende voor de gehele lengte zware en/of lichte ketens kunnen dan tot expressie worden gebracht uit een cel waarin zij geïntroduceerd zijn en het anti-myostatine 10 antilichaam kan worden geïsoleerd.

[0140] De nucleïnezuurmoleculen kunnen worden toegepast om recombinant grote hoeveelheden van anti-myostatine antilichamen tot expressie te brengen. De nucleïnezuurmoleculen kunnen ook worden toegepast om chimere antilichamen, bispecifieke antilichamen, enkele 15 keten-antilichamen, immunoadhesinen, diabodies, gemuteerde antilichamen en antilichaamderivaten, te produceren, zoals verder beneden beschreven. Als nueleïnezuurmolecuulen zijn verkregen uit een niet-humaan, niet-transgeen dier, kunnen de nucleïnezuurmoleculen worden toegepast voor antilichaamhumanisatie, zoals beneden beschreven.

20 [0141] In een andere uitvoeringsvorm, wordt een nucleïnezuurmolecuul van de uitvinding toegepast als een probe of PCR-primer voor een specifieke antlichaamsequentie. Bijvoorbeeld, kan het nucleïnezuur worden toegepast als een probe in diagnostische werkwijzen of als een PCR-primer om regio's van DNA die toegepast zouden kunnen worden te amplificeren, onder 25 andere, om te isoleren additionele nucleïnezuurmoleculen coderende voor variabele domeinen van anti-myostatine antilichamen. In sommige uitvoeringsvormen, zijn de nucleïnezuurmoleculen oligonucleotiden. In sommige uitvoeringsvormen, zijn de nucleotiden uit hoog variabele domeinen van de zware en licht keten van het antilichaam van interesse. In 30 sommige uitvoeringsvormen, coderen oligonucleotiden geheel of een 73 gedeelte van een of meer van de CDR's van antilichamen 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1,1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_lH-L81M, 5 L-F58I; of 2_112_1H-L81M, L-I85V; of 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V of varianten daarvan zoals hierin beschreven.

Vectoren

[0142] De uitvinding verschaft vectoren omvattende nucleïnezuurmoleculen die coderen voor de zware keten van een anti- 10 myostatine antilichaam van de uitvinding of een antigeenbindend gedeelte daarvan. De uitvinding verschaft ook vectoren omvattende nucleïnezuurmoleculen die coderen voor de lichte keten van zulke antilichamen of antigeenbindend gedeelte daarvan. De uitvinding verschaft verder vectoren omvattende nucleïnezuurmoleculen coderende 15 voor fusie-eiwitten, gemodificeerde antilichamen, antilichaamfragmenten, en probes daarvan.

[0143] In sommige uitvoeringsvormen, worden de anti-myostatine antilichamen van de uitvinding of antigeenbindende gedeelten daarvan tot uitdrukking gebracht door DNA's in te voegen coderende voor gedeeltelijk of 20 gehele lengte lichte en zware ketens, verkregen zoals boven beschreven, in expressievectoren zodat de genen operatief worden verbonden aan noodzakelijke expressie controlesequenties zoals transcriptionele en translationele controlesequenties. Expresievectoren omvatten plasmiden, retrovirussen, adenovirussen, adenogeassocieerde virussen (AAV), 25 plantenvirussen, zoals bloemkoolmozaiekvirus, tabakmozaiekvirus, cosmiden, YAC's, EBV-verkregen episomen, en dergelijke. Het antilichaamgen wordt geligeerd in een vector zodat transcriptionele en translationele controlesequenties binnen de vector hun bedoelde functie dienen van regulering van de transcriptie en translatie van het 74 antilichaamgen. De expressievector en expressie controlesequenties worden gekozen om compatibel te zijn met de toegepaste expressiegastheercel. Het antilichaam lichte keten gen en het antilichaam zware keten gen kunnen worden ingevoegd in afzonderlijke vectoren. In een voorkeursuitvoering, 5 worden beide genen ingevoegd in dezelfde expressievector. De antilichaamgenen worden ingevoegd in de expressievector door standaardwerkwijzen (b.v., ligatie van complementaire restrictieplaatsen op het antilichaam gen fragment en vector, of stomp-einde-ligatie als geen restrictieplaatsen aanwezig zijn).

10 [0144] Een gemakkelijke vector is een die codeert voor een functioneel compleet humane Ch of Cl immunoglobulinesequentie, met geschikte restrictieplaatsen zo ontworpen dat een Vu of Vl sequentie gemakkelijk kan worden ingevoegd en tot uitdrukking gebracht, zoals boven beschreven. In zulke vectoren, treedt splicing gebruikelijk op tussen de splicedonorplaats 15 in de ingevoegde J-regio en de splice-acceptorplaats voorafgaande aan het humane C-domein, en ook bij de spliceregio's die optreden binnen de humane Cu exonen. Polyandenylatie- en transcriptieterminatie treden op bij natieve chromosomale plaatsen stroomafwaarts van de coderende regio's. De recombinante expressievector kan ook coderen voor een 20 signaalpeptide dat secretie van de antilichaamketen uit een gastheercel faciliteert. Het antilichaamketengen kan ook worden gekloond in een vector zodat het signaalpeptide in frame wordt verbonden aan het amino-einde van de immunoglobulineketen. Het signaalpeptide kan een immunoglobulinesignaalpeptide of een heteroloog signaalpeptide zijn 25 (d.w.z. een signaalpeptide uit een niet-immunoglobuline-eiwit).

[0145] In aanvulling op de antilichaam keten genen, dragen de recombinante expressievectoren van de uitvinding regulatoire sequenties die de antilichaam keten genen in een gastheerceel controleren. Het zal worden begrepen door deze vaardig in de kunst dat het ontwerp van de 30 expressievector, inclusief de selectie van regulatoire sequenties af kan 75 hangen van zulke factoren als de keuze van de gastheercel om getransformeerd te worden, het niveau van expressie van gewenst eiwit, etc. Voorkeurs regulatoire sequenties voor zoogdier gastheercel expressie omvatten virale elementen die hoge niveaus van eiwitexpressie in 5 zoogdiercellen geven, zoals promotors en/of enhancers verkregen uit retrovirale LTR's, cytomegalovirus (CMV) (zoals de CMV-promotor/enhancer), Simian Virus 40 (SV40) (zoals de SV40-promotor/enhancer), adenovirus (b.v., de adenovirus major late promoter (AdMLP)), polyoma en de sterke zoogdierpromoters zoals natieve 10 immunoglobuline en actinepromotors. Voor verdere beschrijving van virale regulatoire elementen, en sequenties daarvan, zie b.v., U.S. Octrooi Nr. 5,168,062, U.S. Octrooi Nr. 4,510,245 en U.S. Octrooi Nr. 4,968,615. Werkwijzen voor expressie van antilichamen in planten, omvattende een beschrijving van promoter en vectoren, zowel als transformatie van planten 15 is bekend in de kunst. Zie, b.v., Verenigde Staten Octrooi 6,517,529, hierin opgenomen door referentie. Werkwijzen van expressie van polypeptiden in bacteriële cellen of fungale cellen, b.v. gistcellen, zijn ook goed bekend in de kunst.

[0146] In aanvulling op de antilichaam keten genen en regulatoire 20 sequenties, kunnen de recombinante expressievectoren van de uitvinding additionele sequenties dragen, zoals sequenties die replicatie van de vector in gastheercellen reguleren (b.v., oorsprongen van replicatie) en selecteerbare markergenen. Het selecteerbare markergen faciliteert selectie van gastheercellen waarin de vector geïntroduceerd is (zie, b.v. U.S.

25 octrooinummers 4,399,216, 4,634,665 en 5,179,017, hierin opgenomen door referentie). Bijvoorbeeld, verschaft het selecteerbare markergen typisch resistentie tegen medicijnen, zoals G418, hygromycine of methotrexaat, aan een gastheercel waarin de vector geïntroduceerd is. Voorkeurs selecteerbare markergenen omvatten het dihydrofolaatreductase (DHFR)-gen (voor 76 toepassing in dhfr-gastheercellen met mehotrexaat-selectie/amplificatie), het neogen (voor G418-selectie), en het glutamaatsynthetasegen.

Niet-Hybridomagastheercellen en werkwijzen van Recombinant Eiwit produceren 5 [0147] Nucleïnezuurmoleculen coderende voor anti-myostatine antilichamen en vectoren deze nucleïnezuurmoleculen omvattende kunnen worden toegepast voor transfectie van een geschikt zoogdier, plant, bacterie of gist gastheercel. Transformatie kan zijn door een bekende werkwijze voor introductie van polynucleotiden in een gastheercel. Werkwijzen voor 10 introductie van heterologe polynucleotiden in zoogdiercellen zijn goed bekend in de kunst en omvatten dextran-gemedieerde transfectie, calciumfosfaatprecipitatie, polybreen-gemedieerde transfectie, protoplasfusie, elektroporatie, inkapseling van de polynucleotide(n) in liposomen, en directe microinjectie van het DNA in nuclei. Daarbij, kunnen 15 nucleïnezuurmoleculen worden geïntroduceerd in zoogdiercellen door virale vectoren. Werkwijzen van transformeren van cellen zijn goed bekend in de kunst. Zie, b.v. U.S. Octrooi nrs. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, en 4,959,455, hierin opgenomen door referentie. Werkwijzen van transformeren van plantencellen zijn goed bekend in de kunst, omvattende, 20 b.v. ogrobacterium-gemedieerde transformatie, biolistische transformatie, directe injectie, elektroporatie en virale transformatie. Werkwijzen van transformeren van bacteriële en gistcellen zijn ook goed bekend in de kunst.

[0148] Zoogdiercellijnen beschikbaar als gastheren voor expressie zijn goed bekend in de kunst en omvatten vele geïmmortaliseerde cellijnen 25 beschikbaar uit de American Type Culture Collection (ATCC). Deze omvatten, onder andere, Chinese hamsterovarium (CHO)-cellen, NS0-cellen, SP2-cellen, HEK-293T-cellen, NIH-3T3-cellen, HeLa-cellen, babyhamsternier (BHK)-cellen, Afrikaanse groene aapniercellen (COS), humane hepatocellulaire carcinoomcellen (b.v., Hep G2), A549-cellen, en 77 een aantal van andere cellijnen. Cellijnen van specifieke voorkeur worden geselecteerd door vast te stellen welke cellijnen hoge expressieniveaus hebben.

Cellijnen anders dan deze van zoogdieroorsprong kunnen ook worden 5 toegepast. Deze omvatten insectencellijnen (zoals Sf9- of Sf21-cellen), plantencellen (omvattende deze van Nicotiana, Arabidopsis, eendekroos, maïs, tarwe, aardappel, etc.), bacteriële cellen (omvattende E. coli en Streptomyces) en gistcellen (omvattende Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae en Pichia pastoris).

10 Wanneer recombinante expressie vectoren coderende voor antilichaamgenen worden geïntroduceerd in gastheercellen, wordende antilichamen geproduceerd door het kweken van de gastheercellen gedurende een periode van tijd voldoende om expressie van het antilichaam in de gastheercellen toe te staan of, meer geprefereerd, secretie van het 15 antilichaam in het kweekmedium waarin de gastheercellen worden gegroeid. Antilichamen kunnen worden teruggewonnen uit het kweekmedium standaard eiwitzuiveringswerkwijzen toepassende.

[0149] Expressie van antilichamen van de uitvinding uit productiecellijnen kan worden versterkt een aantal van bekende technieken 20 toepassende. Bijvoorbeeld, het glutaminesynthetase genexpressiesysteem (het GS-systeem) is een gebruikelijke benadering voor het versterken van expressie onder bepaalde conditites. Het GS-systeem wordt beschreven geheel of gedeeltelijk in samenhang met Europese Octrooi nrs. 0 216 846, 0 256 055, 0 323 997 en 0 338 841.

25 [0150] Het is waarschijnlijk dat antilichamen tot uitdrukking gebracht door verschillende cellijnen of in transgene dieren verschillende glycosylatie van elkaar zullen hebben. Echter, alle antilichamen gecodeerd door de nucleïnezuurmoleculen hierin verschaft, of omvattende de aminozuursequenties hierin verschaft zijn deel van de onderhavige 30 uitvinding, onafhankelijk van de glycosylatie van de antilichamen.

78

Transgene Dieren en Planten

[0151] Anti-myostatine antilichamen van de uitvinding kunnen ook transgeen worden geproduceerd door de generatie van een dier of plant dat transgeen is voor de immunoglobuline zware en lichte keten sequenties van 5 interesse en productie van het antilichaam in een terugwinbare vorm daarvan. In samenhang met de transgene productie in dieren, kunnen anti-myostatine antilichamen worden geproduceerd in, en teruggewonnen uit, de melk van geiten, koeien, of andere zoogdieren. Zie, b.v., V.S. Octrooi nrs. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172, en 5,741,957, hierin opgenomen door 10 referentie. In sommige uitvoeringsvormen, worden niet-humane transgene dieren die humane immunoglobulineloci omvatten geïmmuniseerd met myostatine of een immunogeen gedeelte daarvan, zoals boven beschreven. Werkwijzen voor het maken van antilichamen in planten worden beschreven, b.v., in V.S. Octrooien 6,046,037 en 5,959,177, hierin 15 opgenomen door referentie.

[0152] In sommige uitvoeringsvormen, worden niet-humane transgene dieren of planten geproduceerd door introductie van een of meer nucleïnezuurmoleculen coderende voor een anti-myostatine antilichaam van de uitvinding in het dier of plant door standaardtransgene technieken.

20 Zie Hogan en V.S. Octrooi 6,417,429, bovenstaand. De transgene cellen toegepast voor het maken van het transgene dier kunnen embryonale stamcellen of somatische cellen of een bevrucht ei zijn. De transgene niet-humane organismen kunnen chimeer, niet-chimere heterozygoten en niet-chimere homozygoten zijn. Zie, b.v., Hogan et al., Manipulating the Mouse 25 Embryo: A Laboratory Manual 2de ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics en Transgenics: A Practical Approach. Oxford University Press (2000); en Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. Academic Press (1999), alle hierin opgenomen door referentie. In sommige uitvoeringsvormen, hebben de transgene niet-30 humane dieren een gerichte disruptie en vervanging door een richtend 79 construct dat codeert voor een zware keten en/of een lichte keten van interesse. In een voorkeursuitvoering, omvatten de transgene dieren en brengen tot uitdrukking nucleïnezuurmoleculen coderende voor zware en lichte ketens die specifiek binden aan myostatine, bij voorkeur humaan 5 myostatine. In sommige uitvoeringsvormen, omvatten de transgene dieren nucleïnezuurmoleculen coderende voor een gemodificeerd antilichaam zoals een enkele keten antilichaam, een chimeer antilichaam of een gehumaniseerd antilichaam. De anti-myostatine antilichamen kunnen worden gemaakt in een transgeen dier. In een voorkeursuitvoering, zijn de 10 niet humane dieren muizen, ratten, schapen, varkens, geiten, vee of paarden. Het niet-humane transgene dier brengt genoemde gecodeerde polypeptiden tot uitdrukking in bloed, melk, urine, speeksel, tranen, mucus en ander lichaamsvloeistoffen.

Faag Display -bibliotheken 15 [0153] De uitvinding verschaft een werkwijze voor het produceren van een anti-myostatine antilichaam of antigeen-bindend gedeelte daarvan omvattende de stappen van het synthetiseren van een bibiotheek van humane antilichamen op faag, de bibliotheek screnen met myostatine of een antilichaam-bindend gedeelte daarvan, de faag die bindt aan myostatine te 20 isoleren, en het verkrijgen van het antilichaam uit de phage. Als voorbeeld, omvat een werkwijze voor het bereiden van de bibliotheek van antilichamen voor toepassing in phage display-technieken de stappen van het immuniseren van een niet-humaan dier omvattende humane immunoglobulineloci met myostatine of een antigeenbindend gedeelte 25 daarvan om immuunrespons te creëren, antilichaamproducerende cellen extraherende uit het geïmmuniseerde dier; het isoleren van RNA coderende voor zware en lichte ketens van antilichamen van de uitvinding uit de geëxtraheerde cellen, het reverse overschrijven van het RNA om cDNA te produceren, het ampliferen van het cDNA primers toepassende, en het 80 invoegen van het cDNA in een faag display-vector zodat de antilichamen tot expressie wordt gebracht op de faag. Recombinante anti-myostatine antilichaam van de uitvinding kunnen worden verkregen op deze manier.

[0154] Recombinante humane anti-myostatine antilichamen van de 5 uitvinding kunnen worden geïsoleerd door het screenen van een recombinante combinatorische antilichaambibliotheek. Bij voorkeur is de bibliotheek een scFv faag display-bibliotheek, gegenereerd toepassende humane Vl en Vh cDNAs bereid uit mRNA geïsoleerd uit B-cellen. Werkwijzen voor bereiding en screening van zulke bibliotheken zijn bekend 10 in de kunst. Kits voor het genereren van faag display-bibliotheken zijn commercieel verkrijgbaar (b.v. het Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalog no. 27-9400-01; en de Stratagene SurfZAP™ phage display kit, catalog no. 240612). Er zijn ook andere werkwijzen en reagentia die kunnen worden toegepast in het genereren en screenen van antilichaam 15 display-bibliotheken (zie, b.v., U.S. Octrooi Nr. 5,223,409; PCT Publicatie Nrs. WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 20 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991); en Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 25 88:7978-7982 (1991), alle hierin opgenomen door referentie

[0155] In een uitvoeringsvorm, wordt om humane anti-myostatine antilichamen met de gewenste karakteristieken te isoleren en te produceren, een humaan anti-myostatine antilichaam zoals hierin beschreven eerst toegepast om humane zware en lichte ketensequenties 30 met vergelijkbare bindingsactiviteit voor myostatine te selecteren, de 81 epitoop inprintingswerkwijzen toepassende beschreven in PCT publatie no WO 93/06213, hierin opgenomen door referentie. De antilichaam — bibliotheken toegepast in deze werkwijze zijn bij voorkeur scFv bibliotheken bereid en gescreend als beschreven in PCT publicatie No. WO 92/01047, 5 McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); en Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993), alle hierin opgenomen door referentie. De scFv antilichaam bibliotheken worden bij voorkeur gescreend humane myostatine toepassende als het antigeen.

[0156] Wanneer initiële Vl en Vh domeinen geselecteerd zijn worden, 1.0 “mix en match” experimenten uitgevoerd, waarin verschillende paren van de initieel geselecteerde Vl en Vh segmenten worden gescreend voor myostatinebinding om geprefereerde Vl/Vh pair combinaties te selecteren. Daarbij, om de kwaliteit van het antilichaam verder te verbeteren, kunnen de Vl en Vh segmenten van de geprefereerde Vl/Vh paar (paren) 15 willekeurig gemuteerd worden, bij voorkeur binnen de CDR3-regio van Vh en/of Vl , in een proces analoog aan het in vivo somatische mutatieproces verantwoordelijk voor affmitietsmaturatie van antilichamen gedurende een natuurlijke immuunrespons. Deze in vitro affiniteitsmaturatie kan worden bereikt door amplificering van Vh en Vl domeinen PCR-primers 20 complimentair aan de Vh CDR3 of Vl CDR3 toepassende, respectievelijk, welke primers zijn "gespiked" met een willekeurig mengsel van de vier nucleotidebasen op bepaalde posities zodat de resulterende PCR-producten voor Vh en Vl segmenten coderen waarin willekeurige mutaties zijn geïntroduceerd in de Vh en/of Vl CDR3-regio's. Deze willekeurig 25 gemuteerde Vh en Vl segmenten kunnen worden gere-screened voor binding aan myostatine.

[0157] Volgend op screening en isolatie van een anti-myostatine antilichaam van de uitvinding uit een recombinante immunoglobulinedisplay-bibliotheek, kunnen nucleïnezuren coderende voor 30 het geselecteerde antilichaam worden teruggewonnen uit het display- 82 pakket (b.v., uit het faaggenoom) en gesubkloond in andere expressievectoren door standaardrecombinante DNA-technieken. Indien gewenst, kan het nucleïnezuur verder worden gemanipuleerd om andere antilichaamvormen van de uitvinding te creëren, zoals beneden beschreven.

5 Om een recombinant humaan antilichaam geïsoleerd door screening van een combinatorische bibliotheek tot uitdrukking te brengen, wordt het DNA coderende voor het antilichaam gekloond in een recombinante expressievector en geïntroduceerd in een zoogdiergastheercellen, zoals boven beschreven.

10 Klassewisseling

[0159] Een ander aspect van de uitvinding verschaft een werkwijze voor het veranderen van de klasse of subklasse van een anti-myostatine antilichaam naar een andere klasse of subklasse. In sommige uitvoeringsvormen, wordt een nucleïnezuur coderende voor een Vl of Vh dat 15 niet omvat sequenties coderende voor Cl of Ch geïsoleerd werkwijzen goed bekend in de kunst toepassende. Het nucleïnezuurmolecuul wordt dan operatief verbonden aan een nucleïnezuursequentie coderende voor een Cl of Cu van een gewenste immunoglobulineklasse of -subklasse. Dit kan worden bereikt toepassende een vector of nucleïnezuurmolecuul dat omvat 20 een Cl of Ch keten, zoals boven beschreven. Bijvoorbeeld, een anti- myostatine antilichaam dat oorspronkelijk IgM was kan worden gewisseld van klasse naar een IgG. Verder, kan de klassewisseling worden toegepast om een IgG-subklasse naar een andere te converteren, bijvoorbeeld, van IgGl naar IgG2. Een andere werkwijze voor het produceren van een 25 antilichaam van de uitvinding omvattende een gewenst isotype omvat de stappen van het isoleren van een nucleïnezuur coderende voor een zware keten van een anti-myostatine antilichaam en een nucleïnezuur coderende voor een lichte keten van een anti-myostatine antilichaam, het isoleren van de sequentie coderende voor de Vh regio, het ligeren van de Vh sequentie 83 aan een sequentie coderende voor een zware keten constant domein van het gewenste isotype, het tot expressie brengen van het lichte keten gen en het zware keten construkt in een cel, en het verzamelen van het anti-myostatine antilichaam met het gewenste isotype.

5 GedeïmmuniseerdeAntilichamen

[0159] In een ander aspect van de uitvinding, kan een antilichaam worden gedeïmmuniseerd om zijn immunogeniciteit te verminderen technieken toepassende beschreven in, b.v., PCT Publicatie Nrs. W098/52976 en WOOO/34317 (hierin opgenomen door referentie).

10 Gemuteerde Antilichamen

[0160] In een andere uitvoeringsvorm, kunnen de nucleïnezuurmoleculen, vectoren en gastheercellen worden toegepast om gemuteerde anti-myostatine antilichamen te maken. De antilichamen kunnen worden gemuteerd in de variabele domeinen van de zware en/of lichte ketens, 15 bijvoorbeeld, om een bindingseigenschap van het antilichaam te veranderen. Bijvoorbeeld kan een mutatie worden gemaakt in een of meer van de CDR regio's om de Kd van het antilichaam voor myostatine te verhogen of te verminderen, om koff te verhogen of verminderen, of om de bindingsspecificiteit van het antilichaam teveranderen.Technieken in 20 plaatsgerichte mutagenese zijn goed bekend in de kunst. Zie, b.v. Sambrook et al. en Ausubel et al., hierboven.. In een andere uitvoeringsvorm, worden een of meer mutaties gemaakt in een aminozuur residu dat bekend is veranderd te zijn vergeleken met de stamlijn in monoklonaal antilichaam 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 25 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H- T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; of 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V. De mutaties kunnen worden gemaakt in een CDR regio of 84 framework regio van een variabel domein, of in een constant domein. In een voorkeursuitvoering, worden de mutaties gemaakt in een variabel doemin. In sommige uitvoeringsvormen, worden een of meer mutaties gemaakt in een aminozuuresidu dat bekend is veranderd te zijn vergeleken met de 5 stamlijn in een CDR regio of framework regio van een variabel domein van een aminozuursequentie geselecteerd uit SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 of 87 of waarvan de nucleïnezuursequentie wordt gepresenteerd in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 10 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 of 88.

[0161] In een andere uitvoeringsvorm, wordt de frameworkregio gemuteerd zo dat resulterende frameworkregio(s) de aminozuursequentie hebben van het corresponderende stamlijngen. Een mutatie kan worden 15 gemaakt in een frameworkregio of constant domein om de halfwaardetijd van het anti-myostatine antilichaam te verhogen. Zie, b.v. PCT Publicatie Nr. WO 00/09560, hierin opgenomen door referentie. Een mutatie in een frameworkregio of constant domein kan ook worden gemaakt om de immunogeniciteit van het antilichaam te veranderen, een plaats voor 20 covalente of niet-covalente binding aan een ander molecuul te verschaffen, of om zulke eigenschappen te veranderen als complementfixatie, FcR-binding en antilichaamafhankelijke cel-gemedieerde cytoxiciteit (ADCC). Volgens de uitvinding, kan een enkel antilichaam mutaties hebben in een of meer van de CDR's of frameworkregio's van het variabele domein of in het 25 constante domein.

[0162] In sommige uitvoeringsvormen, zijn er van 1 tot 8, omvattende elk nummer er tussen in, aminozuur mutaties in ofwel de Vh ofwel de Vl domeinen van het gemuteerde anti-myostatine antilichaam vergeleken met het anti-myostatine antilichaam voorafgaand aan mutatie. In een van de 30 bovenstaande, kunnen de mutaties optreden in een of meer CDR-regio's.

85

Verder, kunnen elk van de mutaties conservatieve aminozuursubstituties zijn. In sommige uitvoeringsvormen, zijn er niet meer 5, 4, 3, 2, of 1 aminozuurveranderingen in de constant domeinen.

Gemodificeerde Antilichamen 5 [0163] In een andere uitvoeringsvorm, kan een fusieantilichaam of immunoadhesine worden gemaakt dat omvat geheel of een gedeelte van een anti-myostatine antilichaam van de uitvinding verbonden aan een ander polypeptide. In een voorkeursuitvoering, zijn alleen de variabele domeinen van het anti-myostatine antilichaam verbonden aan het polypeptide. In een 10 andere voorkeursuitvoering, is het Vh domein van een anti-myostatine antilichaam verbonden aan een eerste polypeptide, terwijl het Vl domein van een anti-myostatine antilichaam is verbonden aan een tweede polypeptide dat associeert met het eerste polypeptide op een wijze zodat de Vh en Vl domeinen interactie kunnen vertonen met elkaar om een antigeen 15 bindingsplaats te vormen. In een andere voorkeursuitvoering, is het Vh domein gescheiden van het Vl domein door een linker zodat de Vh en Vl domeinen interactie kunnen vertonen met elkaar (zie beneden onder enkele ketenantilichamen). Het Vn-linker-VL antilichaam is dan verbonden aan het polypeptide van interesse. Daarbij, kunnen fusieantilichamen worden 20 gecreëerd waarin twee (of meer) enkele ketenantilichamen zijn verbonden aan elkaar. Dit is bruikbaar als iemand een divalent of polyvalent antilichaam op een enkele polypeptideketen wil creëren, of als iemand een bispecifiek antilichaam wil creëren.

[0164] Om een enkele keten antilichaam te creëren, (scFv) worden de Vh-25 en VL-coderende DNA fragmenten operatief verbonden aan een ander fragment coderende voor een flexibele linker, bijvoorbeeld, coderende voor de aminozuursequentie (Gly4 -Ser)3, (SEQ ID NO: 122) zodat de Vh enVL sequenties tot uitdrukking kunnen worden gebracht als een aaneengesloten enkel keteneiwit, met de Vl en Vh domeinen verbonden door de flexibele 86 linker. Zie, b.v., Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). Het enkele keten antilichaam kan monovalent zijn, als alleen een enkele Vh en Vl worden toegepast, bivalent, als twee Vh en Vl 5 worden toegepast, of polyvalent, als meer dan twee Vh en Vl worden toegepast. Bispecifieke of polyvalente antilichamen kunnen worden gegenereerd die specifiek binden aan myostatine en aan een ander molecuul.

[0165] In andere uitvoeringsvormen, kunnen andere gemodificeerde 10 antilichamen worden bereid, anti-myostatine antilichaam coderende voor nucleïnezuurmoleculen toepassende. Bijvoorbeeld, "kappa-bodies" (111 et al., Protein Eng. 10: 949-57 (1997)), “Minibodies” (Martin et al., EMBOJ. 13: 5303-9 (1994)), “Diabodies” (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)), of “Janusins” (Traunecker et al., EMBOJ. 10:3655-3659 15 (1991) en Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)) kunnen worden bereid standaard moleculaire biologische technieken toepassende volgende de lessen van de beschrijving.

[0166] Bispecifieke antilichamen of antigeen-bindende fragmenten kunnen worden geproduceerd door een verscheidenheid van werkwijzen 20 omvattende fusie van hybridoma's of verbinding van Fab-fragmenten. Zie, b.v., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Daarbij, kunnen bispecifieke antilichamen worden gevormd als “diabodies” of “Janusins.” In sommige uitvoeringsvormen, bindt het bispecifieke antilichaam aan twee 25 verschilllende epitopen van myostatine. In sommige uitvoeringsvormen, heeft het bispecifieke antilichaam een eerste zware keten en een eerste lichte keten van monoklonaal antilichaam 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 30 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58l; 2_112_1L-I85V; 2_112_lH-L81M, L-F58I; 87 2_112_1H-L81M, L-I85V; of 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V en een additioneel antilichaam zware keten en lichte keten. In sommige uitvoeringsvormen, zijn de additionele lichte keten en zware keten ook van een van de boven geïdentificeerde monoklonale antilichamen, maar zijn 5 verschillend van de eerste zware en lichte ketens.

[0167] In sommige uitvoeringsvormen, worden de gemodificeerde antilichamen boven beschreven bereid toepassende een of meer van de variabele domeinen of CDR regio's van een humaan anti-myostatine monoklonaal antilichaam hierin verschaft.

10 Gederivatiseerde en gelabelde Antilichamen

[0168] Een anti-myostatine antilichaam of antigeenbindend gedeelte van de uitvinding kan worden gederivatiseerd of verbonden aan een ander molecuul (b.v., een ander peptide of eiwit). In het algemeen, zijn de antilichamen of gedeelten daarvan gederivatiseerd zodat de 15 myostatinebinding niet negatief is aangetast door de derivatisering of labelling. Overeenkomstig, zijn de antilichamen en antilichaamgedeelten van de uitvinding bedoeld te omvatten zowel intacte als gemodificeerde vormen van de humane anti-myostatine antilichamen hierin beschreven. Bijvoorbeeld, een antilichaam of een antilichaamgedeelte van de uitvinding 20 kan functioneel worden verbonden (door chemische koppeling, genetische fusie, non-covalente associatie of anderszins) aan een of meer andere moleculaire eenheden, zoals een ander antilichaam (b.v., een bisspecifiek antilichaam of diabody), een detectieagens, een farmaceutisch agens en/of een eiwit of peptide dat associatie van het antilichaam of 25 antilichaamgedeelte met een ander molecuul kan mediëren (zoals een streptavidine kernregio of een polyhistidine label).

[0169] Een type van gederivatiseerd antilichaam wordt geproduceerd door het kruisverbinden van twee of meer antilichamen (van hetzelfde type of van verschillende types, b.v. om bispecifieke antilichamen te creëren).

88

Geschikte kruislinkers omvatten deze die heterobifunctioneel zijn, hebbende twee afzonderlijke reactieve groepen gescheiden door een geschikte spacer (b.v., m-maleïmidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide-ester) of homobifunctioneel (b.v., disccunimidylsuberaat). Zulke linkers zijn 5 verkrijgbaar van Pierce Chemical Company, Rockford, II.

[0170] Een ander type van gederivatiseerd antilichamen is een gelabeld antilichaam. Bruikbare detectieagentia waarmee een antilichaam of een antigeenbindend gedeelte van de uitvinding kan worden gederivatiseerd omvat fluorescente verbindingen, omvattende fluorescine, fluorescine- 10 isothiocyanaat, rhodamine, 5-dimethylamine-l-naftaleensulfonylchloride, fyco-erytrine, lanthanidefosfors en dergelijke. Een antilichaam kan ook worden gelabeld met enzymen die bruiktbaar zijn voor detectie, zoals horseradishperoxidase, B-galactosidase, luciferase, alkalinefosfatase, glucoseoxidase en dergelijke. Wanneer een antilichaam wordt gelabeld met 15 een detecteerbaar enzym, wordt het gedetecteerd door toevoeging van additionele reagentia die het enzym toepast om een reactieproduct te produceren dat kan worden onderscheiden. Bijvoorbeeld, wanneer het agens horseradishperoxidase aanwezig is, leidt de toevoeging van waterstofperoxide en diaminobenzidine tot een gekleurd reactieproduct, 20 welke detecteerbaar is. Een antilichaam kan ook worden gelabeld met biotine, en gedetecteerd door indirecte meting van avidine- of streptavidinebinding. Een antilichaam kan ook worden gelabeld met een vooraf vastgesteld polypeptide-epitoop herkend door een secundaire reporter (b.v., leucine zipper paarsequenties, bindingsplaatsen voor 25 secundaire antilichamen, metaalbindingsdomeinen, epitooplabels). In sommige uitvoeringsvormen, zijn labels verbonden door spacer-armen van verschillende lengten om potentiële sterische hindering te verminderen.

[0171] Een anti-myostatine antilichaam kan ook worden gederivatiseerd met een chemische groep zoals polyethyleenglycol (PEG), een methyl- of 30 ethylgroep, of koolhydraatgroep. Deze groepen zijn bruikbaar om de 89 biologische eigenschappen van het antilichaam te verbeteren, bijvoorbeeld, om de serumhalfwaardetijd te verhogen.

Farmaceutische samenstellingen en kits

[0172] De uitvinding heeft ook betrekking op samenstellingen 5 omvattende een humaan anti-myostatine antilichaam met inhibitoire eigenschappen.

[0173] De antagonist-anti-myostatine antilichamen van de uitvinding zijn bruikbaar om te voorkomen of te behandelen een breed bereik van condities en aandoeningen waarin het gewenst is skeletspiermassa en/of bot toe te 10 laten nemen. In sommige gevallen, kunnen zulke condities en aandoeningen leeftijdsgerelateerd of ziektegerelateerd zijn. Een antagonist-anti-myostatine antilichaam van de uitvinding kan worden toegepast om te behandelen, te voorkomen of te inhiberen leeftijdsgerelateerd verlies van spiermassa en -sterkte omvattende spieratrofie die resulteert van, 15 bijvoorbeeld, immobilisatie.

[0174] Daarbij, is een antagonist-anti-myostatine antilichaam van de uitvinding bruikbaar om te behandelen of te voorkomen spierverlies in wasting-ziekten of andere ziekten of condities, geassocieerd met verlies van spiermassa, omvattende, maar niet beperkt tot, trauma (omvattende spier-, 20 zenuw- en bottrauma), verbranding, AIDS, kanker, heupfracturen (specifiek in de ouderen), gewrichtsvervanging, acute knieverwondingen, artritis, chronisch nierfalen (CRF), congestief hartfalen (CHF), chronische obstructieve pulmonaire ziekte (COPD), multipele sclerose (MS), de ziekte van Parkingson, chronische kritische ziekte, centraal zenuwstelsel (CNS)-25 verwonding, beroerte, cachexie, spierdystrofiesyndroom, operatie- en gewrichtsverwonding.

[0175] Antagonist-anti-myostatine antilichamen van de uitvinding zijn ook bruikbaar om metabole condities te behandelen. Zulke condities 90 omvatten type 2 diabetes mellitus, metabole syndromen zoals syndroom X, insulineresistentie, verminderde glucosetolerantie en obesitas.

[0176] Verder, is een antagonist-anti-myostatine antilichaam van de uitvinding bruikbaar om te behandelen of te voorkomen ziekten 5 geassocieerd met botverlies, omvattende maar niet beperkt tot leeftijds- of hormoongerelateerde osteoporoseosteopenia, osteoartritis,en osteoporosegerelateerde fracturen.

[0177] Behandeling kan omvatten toediening van een of meer inhibitoire anti-myostatine-monoklonale antilichamen van de uitvinding, of 10 antigeenbindende fragmenten daarvan, alleen of met een farmaceutisch acceptabele drager. Inhibitoire anti-myostatine antilichamen van de uitvinding en samenstellingen ze omvattende, kunnen worden toegediend in combinatie met een of meer andere therapeutische, diagnostische of profylactische agentia. Additionele therapeutische agentia omvatten anti-15 spierdystrofie agentia (inclusief steroïden zoals prednison, deflazacort), en anabole steroïden, albuterol, voedingssupplementen zoals creatine, en antibiotica zoals gentamycine. Additionele therapeutische agentia omvatten ook anti-diabetes agentia omvattende, maar niet beperkt tot, metformine, sulfonylureas, insuline, pramlintide (SYMLIN®), TZD's zoals rosiglitazon 20 (Avandia®) en pioglitazon (Actos®), GLP-l-analogen, zoals exenitide, en DPP-IV-inhibitoren, zoals LAF237. Verder, omvatten aanvullende therapeutische agentia anti-osteoporoseagentia omvattende, maar niet beperkt tot, bifosfonaten zoals alendronaat (Fosamax®) en risedronaat (Actonel®), cacitonine (Miacalci®), Raloxifen (Evista®), hormonale agentia 25 zoals oestrogeen en parathyroïet. Zulke aanvullende agentia kunnen worden omvat in dezelfde samenstelling of afzonderlijk toegediend. Zoals hierin toegepast, betekent "farmaceutisch acceptabele drager" ieder en alle oplosmiddelen, dispersiemedia, bekledingsmiddelen, antibacteriële en antifungale agentia, isotone en absorptievertragende agentia, en dergelijke 30 die fysiologisch compatibel zijn. Sommige voorbeelden van farmaceutisch 91 acceptabele dragers zijn water, zoutoplossing, fosfaatgebufferde zoutoplossing, dextrose, glycerol, ethanol en dergelijke, zowel als combinaties daarvan. In vele gevallen, zal het geprefereerd zijn isotone agentia te omvatten, bijvoorbeeld, suikers, polyalcoholen zoals mannitol, 5 sorbitol of natriumchloride in de samenstelling. Aanvullende voorbeelden van farmaceutisch acceptabele substanties zijn bevochtigingsagentia of kleine hoeveelheden van hulpstoffen zoals bevochtigings- of emulgerende agentia, conserveringsmiddelen of buffers, welke de plankleeftijd of effectiviteit van het antilichaam verhogen.

10 [0178] De samenstellingen van deze uitvinding kunnen in een variëteit van vormen zijn, bijvoorbeeld, vloeistof, halfvast en vaste doseringsvormen, zoals vloeibaar oplossingen (b.v , injecteerbare en infuseerbare oplossingen), dispersies of suspensies, tabletten, pillen, poeders, liposomen en zetpillen. De voorkeursvorm hangt af van de bedoelde wijze van toediening en 15 therapeutische applicatie. Typisch geprefereerde samenstellingen zijn in de vorm van injecteerbare of infuseerbare oplossingen, zoals samenstellingen vergelijkbaar aan deze toegepast voor passieve immunisatie van mensen.

De voorkeurs wij ze van toediening is parenteraal (b.v., intraveneus, subcutaan, intraperitoniaal, intramusculair). In een voorkeursuitvoering, 20 wordt het antilichaam toegediend door intraveneuze infusie of injectie. In een andere voorkeursuitvoering, wordt het antilichaam toegediend door intramusculaire of subcutane injectie.

[0179] Therapeutische samenstellingen moeten typisch steriel en stabiel zijn onder de condities van vervaardiging en opslag. De samenstelling kan 25 worden geformuleerd als een oplossing, micro-emulsie, dispersie, liposoom, of andere geordende structuur geschikt voor hoge medicijnconcentratie. Steriele en injecteerbare oplossingen kunnen worden bereid door het anti-myostatine antilichaam in te bouwen in de benodigde hoeveelheid in een geschikt oplosmiddel met een of een combinatie van ingrediënten opgesomd 30 hierboven, zoals benodigd, gevolgd door gefilterde sterilisatie. In het 92 algemeen, worden dispersies bereid door de actieve verbinding in te bouwen in een steriel vehikel dat een basisch dispersiemedium bevat en de benodigde andere ingrediënten van deze hierboven opgesomd. In het geval van steriele poeders voor de bereiding van steriele injecteerbare 5 oplossingen, zijn de voorkeurs werk wij zen van bereiding vacuümdroging en vriesdroging die een poeder van het actieve ingrediënt opbrengt plus een additioneel gewenst ingrediënt van een voorafgaand steriel gefilterde oplossing daarvan. De juiste vloeibaarheid van een oplossing kan worden behouden, bijvoorbeeld, door de toepassing van een coating zoals lecithine, 10 door het behoud van de benodigde partikelgrootte in het geval van dispersie en door de toepassing van surfactanten. Verlengde absorptie van injecteerbare samenstellingen kan worden bewerkstelligd door in de samenstelling een agens op te nemen dat absorptie vertraagt, bijvoorbeeld, monostearaatzouten en gelatine.

15 [0180] In een uitvoeringsvormen, wordt het antilichaam toegediend in een formulering als een steriele waterige oplossing hebbende een pH die varieert van ongeveer 5,0 tot ongeveer 6,5 en omvattende van ongeveer 1 mg/ml tot ongeveer 200 mg/ml antilichaam, van ongeveer 1 millimolair tot ongeveer 100 millimolair histidinebuffer, van ongeveer 0,01 mg/ml tot 10 20 mg/ml polysorbaat 80, van ongeveer 100 millimolair tot ongeveer 400 millimolair trehalose, en van ongeveer 0,01 millimolair tot ongeveer 1,0 millimolair dinatrium- EDTA- dihyraat.

[0181] De antilichamen van de onderhavige uitvinding kunnen worden toegediend door een verscheidenheid van werkwijzen bekend in de kunst, 25 alhoewel voor veel therapeutische applicaties, de voorkeursroute/wij ze van toediening subcutaan, intramusculair of intraveneuze infusie is. Zoals zal worden begrepen door de vakman, zal de route en/of wijze van toediening variëren afhankelijk van de gewenste resultaten.

[0182] In bepaalde uitvoeringsvormen, kan de actieve verbinding van de 30 antilichaamsamenstellingen verbinding worden bereid met een drager die 93 het antilichaam zal beschermen tegen snelle vrijgave, zoals een gecontroleerde vrijgaveformulering, omvattende implantaten, transdermale patches, en micro-ingekapselde afleveringssystemen. Biodegradeerbare, biocompatibele polymeren kunnen worden toegepast, zoals 5 ethyleenvinylacetaat, polyanhydriden, polyglycolzuur, collageen, polyortho-esters en meervoudig melkzuur. Vele werkwijzen voor de bereiding van zulke formuleringen zijn geoctrooieerd of algemeen bekend aan de vakmensen. Zie, b.v., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978).

10 [0183] In bepaalde uitvoeringsvormen, kan een anti-myostatine antilichaam van de uitvinding oraal worden toegediend, bijvoorbeeld, met een inert oplosmiddel of een assimileerbare eetbare drager. De verbinding (en andere ingrediënten, indien gewenst) kunnen ook worden ingesloten in een harde of zachte schil gelatinecapsule, samengeperst in tabletten, of 15 ingebouwd direct in het dieet van de patiënt. Voor orale therapeutische toediening, kunnen de anti-myostatine antilichamen worden ingebouwd met excipiënten en toegepast in de vorm van opneembare tabletten, buccale tabletten, dragees, capsules, ebxers, suspensies, siropen, wafels en dergelijke. Om een verbinding van de uitvinding toe te dienen door middel 20 van andere dan parenterale toediening, kan het nodig zijn de verbinding te coaten met, of de verbinding samen toe te dienen met, een materiaal om zijn inactivatie te voorkomen.

[0184] Additionele actieve verbindingen kunnen ook worden ingebouwd in de samenstellingen. In bepaalde uitvoeringsvormen, wordt een inhibitoir 25 anti-myostatine antilichaam van de uitvinding samen geformuleerd met en/of samen toegediend met een of meer additionele therapeutische agentia. Deze agentia omvatten, zonder beperking, antilichamen die binden andere doelen, antineoplastische agentia, antitumoragentia, chemotherapeutische agentia, peptideanalogen die myostatine inhiberen, of antilichamen of 30 andere moleculen die binden aan type II membraanreceptoren en hun 94 binding aan of activatie door myostatine voorkomen. Zulke combinatietherapieën kunnen lagere doses van het inhibitoire anti-myostatine antilichaam zowel als van de tegelijk toegediende agentia vereisen, zodoende mogelijke toxiciteiten of complicaties geassocieerd met 5 de verschillende monotherapieën vermijdende.

[0185] Inhibitoire anti-myostatine antilichamen van de uitvinding en samenstellingen ze omvattende kunnen ook worden toegediend in combinatie met andere therapeutische regimes, in het bijzonder in combinatie met oefening en/of dieet (inclusief nutritionele) supplementen. 10 [0186] In bepaalde uitvoeringsvormen, wordt een inhiberend anti- myostatine antilichaam van de uitvinding tezamen geformuleerd met en/of tezamen toegediend met een of meer additionele therapeutische agentia beschreven, bovenstaand. Deze agentia omvatten deze die myostatine inhiberen. Verder, kunnen zulke combinatietherapieën ook worden 15 toegepast om te behandelen, te voorkomen of te inhiberen een van de voornoemde ziekten en condities. Zulke combinatietherapieën kunnen lagere doses van het inhibitoire anti-myostatine antilichaam vereisen zowel als van de tezamen toegediende agentia, zo mogelijke toxiciteiten of complicaties geassocieerd met de verschillende monotherapieën 20 vermijdende.

[0187] De samenstellingen van de uitvinding kunnen omvatten een "therapeutisch effectieve hoeveelheid" of een "profylactische effectieve hoeveelheid" van een antilichaam of antigeenbindend gedeelte van de uitvinding. Een "therapeutisch effectieve hoeveelheid" refereert aan een 25 hoeveelheid effectief, in doses en gedurende perioden van tijd noodzakelijk, om het gewenste therapeutische resultaat te bereiken. Een therapeutisch effectieve hoeveelheid van het antilichaam of antilichaamgedeelte kan variëren volgens factoren zoals de ziektestatus, leeftijd, sexe, en gewicht van het individu, en de mogelijkheid van het antilichaam of 30 antilichaamgedeelte om een gewenste respons in het individu op te wekken.

95

Een therapeutisch effectieve hoeveelheid is ook een waarin toxische of schadelijke effecten van het antilichaam of antilichaamgedeelte worden gecompenseerd door de therapeutisch gunstige effecten. Een "profylactisch effectieve hoeveelheid" refereert aan een hoeveelheid effectief, in doses en 5 voor perioden van tijd noodzakelijk, om het gewenste profylactische resultaat te bereiken. Typisch, omdat een profylactische dosis wordt toegepast in patiënten voorafgaand aan of in een eerder stadium van ziekte, kan de profylactisch effectieve hoeveelheid minder zijn dan de therapeutisch effectieve hoeveelheid.

10 [0188] Dosisregimes kunnen worden aangepast om de optimaal gewenste respons te verschaffen (b.v., een therapeutische of profylactische respons). Bijvoorbeeld, een enkele bolus kan worden toegediend, verschillende verdeelde doses kunnen worden toegediend over tijd of de dosis kan proportioneel worden verminderd of vermeerderd zoals aangegeven door de 15 behoeften van de therapeutische situatie. Het is specifiek voordelig om parenterale samenstellingen te formuleren in doseseenheidsvorm voor gemak van toediening en uniformiteit van dosering. Doseringseenheidvorm zoals hierin toegepast refereert aan fysieke discrete eenheden geschikt als eenheidsdoseringen voor de zoogdierpatiënten om behandeld te worden; 20 elke eenheid omvattende een vooraf vastgestelde hoeveelheid van actieve verbinding berekend om het gewenste therapeutische effect in samenhang met de vereiste farmaceutische drager te produceren. De specificatie voor de doseringseenheidvormen van de uitvinding worden gedicteerd door en zijn direct afhankelijk van (a) de unieke eigenschappen van het anti-25 myostatine antilichaam of gedeelte daarvan en de specifieke therapeutische of profylactische effecten om bereikt te worden, en (b) de beperkingen inherent in de kunst van samenstelling van zo'n antilichaam voor de behandeling van gevoeligheid in individuen.

[0189] Een voorbeeld, niet-limiterend bereik voor een therapeutisch of 30 profylactisch effectieve hoeveelheid van een antilichaam of 96 antilichaamgedeelte van de uitvinding is 0,025 tot 50 mg/kg, meer bij voorkeur 0,1 tot 50 mg/kg, meer bij voorkeur 0,1-25, 0,1 tot 10 of 0,1 tot 3 mg/kg. In sommigeuitvoeringsvormen, omvat een formulering 5 mg/ml antilichaam in een buffer van 20 mM natriumcitraat, pH 5,5, 140 mM 5 NaCL en 0,2 mg/ml polysorbaat 80. Het moet opgemerkt worden dat doseringswaarden kunnen variëren met het type en ernst van de conditie om te verbeteren. Het moet verder worden begrepen dat voor elke specifieke patiënt, specifieke doseringsregimes moeten worden aangepast over tijd volgens de individuele behoefte en de professionele inschatting van de 10 persoon toedienende of superviserende de toediening van de samenstellingen, en dat doseringsbereiken hierin uiteengezet alleen als voorbeeld zijn en niet zijn bedoeld de omvang of praktijk van de geclaimde samenstelling te beperken.

[0190] Een ander aspect volgens de onderhavige uitvinding verschaft kits 15 omvattende een antio-myostatoire antilichaam of antigeenbindend gedeelte van de uitvinding of een samenstelling omvattende zo'n antilichaam of gedeelte. Een kit kan omvatten, in toevoeging op het antilichaam of samenstelling, diagnostische of therapeutische agentia. Een kit kan ook omvatten instructies voor toepassing in een diagnostische of therapeutische 20 werkwijze. In een voorkeursuitvoering, omvat de kit het antilichaam of een samenstelling het omvattende en een diagnostisch agens dat kan worden toegepast in een werkwijze beneden beschreven. In een andere voorkeursuitvoering, omvat de kit het antilichaam of een samenstelling het omvattende en een of meer therapeutische agentia die kunnen worden 25 toegepast in een werkwijze beneden beschreven.

97

Diagnostische werkwijzen van toepassing

[0191] In een ander aspect, verschaft de uitvinding diagnostische werkwijzen. De anti-myostatine antilichamen kunnen worden toegepast om 5 myostatine te detecteren in een biologisch monster in vitro of in vivo.

[0192] De anti-myostatine antilichamen kunnen worden toegepast in een conventionele immunoassay, omvattende, zonder beperking, een ELISA, een RIA, flowcytometrie, weefsel immunohistochemie, Western Blot of immunoprecipitatie. De anti-myostatine antilichamen van de uitvinding 10 kunnen worden toegepast om myostatine van mensen te detecteren. In een andere uitvoeringsvorm, kunnen de anti-myostatine antilichamen worden toegepast om myostatine te detecteren van, bijvoorbeeld, muizen, cynomolgus apen, rat, hond, kwartel, kip, kalkoen, varken en paard.

[0193] De uitvinding verschaft een werkwijze voor het detecteren van 15 myostatine in een biologisch monster omvattende het in contact brengen van het biologisch monster met anti-myostatine antilichaam van de uitvinding en het detecteren van het gebonden antilichaam. In een uitvoeringsvorm, is het anti-myostatine antilichaam direct gelabeld met een detecteerbaar label. In een andere uitvoeringsvorm, is het anti-myostatine 20 antilichaam (het eerste antilichaam) ongelabeld en is het tweede antilichaam of andere molecuul dat het anti-myostatine antilichaam kan binden gelabeld. Zoals goed bekend is aan een vakman, wordt een tweede antilichaam gekozen dat in staat is specifiek te binden het specifieke soort en klasse van het eerste antilichaam. Bijvoorbeeld, als het anti-myostatine 25 antilichaam een humaan IgG is, dan kan het tweede antilichaam een antihumaan IgG zijn. Andere moleculen die aan antilichamen binden kunnen omvatten, zonder beperking, eiwit A en eiwit G, welke beide commercieel verkrijgbaar zijn, b.v., van Pierce Chemical Co.

[0194] Geschikte labels voor het antilichaam of secundaire antilichaam 30 zijn boven beschreven, en omvatten verschillende enzymen, prosthetische 98 groepen, fluorescente materialen, luminiscente materialen en radioactieve materialen. Voorbeelden van geschikte enzymen omvatten horseradishperoxidase, alkalinefosfatase, 6-galactosidase, of acetylcholinesterase; voorbeelden van geschikte prosthetische 5 groepencomplexen omvatten streptavidine/biotine en avidine/biotine; voorbeelden van geschikte fluorescente materialen omvatten umbelliferoon, fluorescine, fluorescine-isothiocyanaat, rhodamine, dichlorotriazinylaminefluorescine, dansylchloride of fyco-erythrine; een voorbeeld van een luminescent materiaal omvat luminol; en voorbeelden 10 van geschikte radiactieve materialen omvatten 123I, 131I, 35S of 3H.

[0195] In andere uitvoeringsvormen, kan myostatine worden getoetst in een biologisch monster door een competitie-immunoassay myostatinestandaarden toepassende gelabeld met een detecteerbare substantie en een ongelabeld anti-myostatine antilichaam. In dit assay 15 worden het biologisch monster, de gelabelde myostatinestandaarden en het anti-myostatine antilichaam gecombineerd en de hoeveelheid gelabeld myostatinestandaard gebonden aan het ongelabelde antilichaam wordt vastgesteld. De hoeveelheid myostatine in het biologische monster is omgekeerd evenredig aan de hoeveelheid gelabeld myostatinestandaard 20 gebonden aan het anti-myostatine antilichaam.

[0196] Iemand kan de immunoassays boven beschreven toepassen voor een aantal doeleinden. Bijvoorbeeld, kunnen de anti-myostatine antilichamen worden toegepast om myostatine in gekweekte cellen te detecteren. In een voorkeursuitvoering, worden de anti-myostatine 25 antilichamen toegepast om de hoeveelheid myostatine geproduceerd door cellen die zijn behandeld met verschillende verbindingen vast te stellen. Deze werkwijze kan worden toegepast om verbindingen die myostatine-eiwitniveaus moduleren te identificeren. Volgens deze werkwijze, wordt één monster van cellen behandeld met een testverbinding gedurende een 30 periode van tijd terwijl een ander monster onbehandeld wordt gelaten. Als 99 het totale niveau van myostatine gemeten moet worden, worden de cellen gelyseerd en wordt het totale myostatineniveau gemeten één van de immunoassays boven beschreven toepassende. Het totale niveau van myostatine in de behandelde versus de onbehandelde cellen wordt 5 vergeleken om het effect van de testverbinding vast te stellen.

[0197] Een voorkeursimmunoassay voor het meten van totale myostatineniveaus is flowcytometrie of immunohistochemie. Werkwijzen zoals ELISA, RIA, flowcytometrie, Western blot, immunohistochemie, celoppervlaktelabelling van integrale membraaneiwitten en 10 immunoprecipitatie zijn goed bekend in de kunst. Zie, b.v., Harlow en Lane, bovenstaand. Daarbij, kunnen de immunoassays worden opgeschaald voor high throughput screening om een groot aantal van verbindingen te testen ofwel voor activatie of voor inhibitie van myostatine-expressie.

[0198] De anti-myostatine antilichamen van de uitvinding kunnen ook 15 worden toegepast om de niveaus van myostatine in een weefsel of serum vast te stellen. In sommige uitvoeringsvormen, is het weefsel een ziek weefsel. In sommige uitvoeringsvormen van de werkwijze, wordt een weefsel of een biopsie daarvan uitgesneden uit een patiënt. De werkwijze omvat de stappen van toediening van een detecteerbaar gelabeld anti-20 myostatine antilichaam of een samenstelling ze omvattende aan een patiënt die zo'n diagnostische test nodig heeft en onderwerpen van de patiënt aan imaging-analyse om de locatie van de myostatine tot expressie brengende weefsels vast te stellen. Imaging-analyse is goed bekend in de medische kunst, en omvat, zonder beperking, röntgenstraalanalyse, magnetische 25 resonantie-imaging (MRI) of computertomografie (CT). Het antilichaam kan zijn gelabeld met een agens geschikt voor in vivo-imaging, bijvoorbeeld een contrastagens, zoals barium, welke toegepast kan worden voor röntgenstraalanalyse, of een magnetisch contrastagens, zoals een gadoliniumchelaat, welke kan worden toegepast voor MRI of CT. Andere 30 labellingagentia omvatten, zonder beperking, radio-isotopen zoals "Tc. In 100 een andere uitvoeringsvorm, zal het anti-myostatine antilichaam niet gelabeld zijn en zal in beeld gebracht worden door toediening van een tweede antilichaam of ander molecuul dat detecteerbaar is en dat kan binden aan het anti-myostatine antilichaam. In een uitvoeringsvorm, wordt 5 een biopsie verkregen uit de patiënt om vast te stellen of het weefsel van interesse myostatine tot uitdrukking brengt.

Therapeutische werkwijzen of toepassing 10 [0199] In een andere uitvoeringsvorm, verschaft de uitvinding een werkwijze voor het inhiberen van myostatineactiviteit door toediening van een anti-myostatine antilichaam aan een patiënt die het nodig heeft. Eén van de typen van antilichamen hierin beschreven kan therapeutisch worden toegepast. In verschillende uitvoeringsvormen is het anti-15 myostatine antilichaam een humaan, chimeer of gehumaniseerd antilichaam. In een voorkeursuitvoering, is het myostatine humaan en is de patiënt een humane patiënt. Alternatief kan de patiënt een zoogdier zijn dat een myostatine tot uitdrukking brengt waarmee het anti-myostatine antilichaam kruisreageert. Het antilichaam kan worden toegediend aan een 20 niet-humaan zoogdier myostatine tot uitdrukking brengende waarmee het antilichaam kruisreageert (d.w.z. een rat, een muis of een cynomolgusaap) voor veterinaire doeleinden of als een diermodel van humane ziekte. Zulke diermodellen kunnen bruikbaar zijn voor het evalueren van de therapeutische effectiviteit van antilichamen van deze uitvinding.

25 [0200] Deze antilichamen kunnen worden toegepast in het bevorderen van spiergroei, gewichtstoename en het helpen in de preventie van zwakte in veestapel (rundvee, varkens, schapen, paarden, kippen, kalkoenen en vissen) en gezelschapsdieren (honden, katten en paarden)

[0201] In een andere uitvoeringsvorm, verschaft de uitvinding een 30 werkwijze voor het bevorderen van spiergroei, gewichtstoename en het 101 helpen in de preventie van zwakte in vee, varkens, schapen, kippen, kalkoenen, paarden, vissen, honden en katten die het nodig hebben omvattende de stap van toediening aan genoemde patiënt van een antilichaam of antigeenbindend gedeelte zoals hierin beschreven.

5 [0202] Zoals hierin toegepast, wordt de term "een conditie die kan worden voorkomen of behandeld door het reduceren van myostatineactiviteit" bedoelt te omvatten ziekten en andere aandoeningen waarin de aanwezigheid van hoge niveaus van myostatine in een patiënt die lijdt aan de aandoening getoond of verdacht is ofwel verantwoordelijk te zijn voor de 10 pathofysiologie van de aandoening of een factor die bijdraagt aan een verergering van de aandoening. Zulke aandoeningen kunnen worden aangetoond, b.v,, door een toename in de niveaus van myostatine in weefsels en vloeistoffen of gefosforyleerd Smad 2 of 3 in spierweefsel in de aangedane cellen of weefsels van een patiënt die lijdt aan de aandoening.

15 De toename in myostatineniveaus kan worden gedetecteerd, bijvoorbeeld toepassende een anti-myostatine antilichaam zoals boven beschreven.

[0203] In een andere voorkeursuitvoering, kan een anti-myostatine antilichaam worden toegediend aan een patiënt die ongepast hoge niveaus van myostatine tot uitdrukking brengt. Het is bekend in de kunst dat hoog- 20 niveau expressie van myostatine kan leiden tot een verscheidenheid aan wasting-condities, botverlies en tot accumulatie van vetmassa. In één uitvoeringsvorm, heeft genoemde werkwijze betrekking op de behandeling van ziekten en condities waarin het gewenst is te verminderen het verlies van of te verhogen skeletspiermassa, te verminderen botverlies of te 25 vermeerderen botmassa en/of te reduceren vetmassa door het neutraliseren van de effecten van myostatine. Zulke condities en ziekten zijn bovenstaand genoemd.

[0204] In een andere voorkeursuitvoering, kan een anti-myostatine antilichaam worden toegediend aan een patiënt wie niet ongepaste niveaus 30 van myostatine tot uitdrukking brengt (hoog of laag), maar wiens conditie 102 nog steeds succesvol behandeld of voorkomen zou worden door toepassing van anti-myostatinebehandeling. In één uitvoeringsvorm, heeft genoemde werkwijze betrekking op de behandeling van ziekten en condities waarin het gewenst is myostatineactiviteit te inhiberen, om het verlies te 5 behandelen van of te verbeteren skeletspiermassa, te behandelen botverlies of botmassa te doen toenemen en/of te behandelen vetmassa door neutralisatie van de effecten van myostatine. Zulke ziekten en condities zijn bekend in de kunst en zouden omvatten ziekten en condities die associëren met een verscheidenheid aan wasting-condities die kunnen omvatten 10 botverlies en accumulatie van vetmassa, bijvoorbeeld, leeftijdgerelateerde degeneratieve ziekten en niet-degeneratieve, normaal leeftijdgerelateerde condities,

[0205] Het antilichaam kan eenmalig worden toegediend, maar wordt meer geprefereerd meerdere malen toegediend. Het antilichaam kan 15 worden toegediend van driemaal daags tot eens per zes maanden of langer. Toediening kan zijn op een schema zoals driemaal daags, tweemaal daags, eenmaal daags, eenmaal per twee dagen, eenmaal per drie dagen, eenmaal per week, eenmaal per twee weken, eenmaal per maand, eenmaal per twee maanden, eenmaal per drie maanden en eenmaal per zes maanden. Het 20 antilichaam kan ook worden toegediend continu via een minipomp. Het antilichaam kan worden toegediend via een orale, muccosale, buccale, intranasale, inhaleerbare, intraveneuze, subcutane, intramusculaire of parenterale route. Het antilichaam kan worden toegediend eenmaal, ten minste tweemaal of gedurende ten minste de periode van tijd totdat de 25 conditie is behandeld, verzacht of genezen. Het antilichaam zal in het algemeen worden toegediend voor zo lang als de conditie aanwezig is. Het antilichaam zal in het algemeen worden toegediend als een deel van een farmaceutische samenstelling zoals boven beschreven. De dosering van antilichaam zal algemeen zijn in het bereik van 0,1-100 mg/kg, meer bij 30 voorkeur 0,5-50 mg/kg, meer geprefereerd 1-20 mg/kg, en zelfs meer 103 geprefereerd 1-10 mg/kg. De serumconcentratie van het antilichaam kan worden gemeten door een werkwijze bekend in de kunst.

[0206] Co-administratie van het antilichaam met een additioneel therapeutisch agens (combinatietherapie) omvat toediening van een 5 farmaceutische samenstelling omvattende het anti-myostatine antilichaam en het additionele therapeutische agens zowel als toediening van twee of meer afzonderlijke farmaceutische samenstellingen, één omvattende het anti-myostatine antilichaam en de ander(e) omvattende het (de) additionele therapeutische agens (agentia). Verder, hoewel co-administratie of 10 combinatietherapie in het algemeen betekent dat het antilichaam en additionele therapeutische agentia worden toegediend op dezelfde tijd als elkaar, omvat het ook gevallen waarin het antilichaam en additionele therapeutische agentia worden toegediend op verschillende tijden. Bijvoorbeeld, kan het antilichaam worden toegediend eenmaal per drie 15 dagen, terwijl het additionele therapeutische agens eenmaal per dag wordt toegediend. Alternatief, kan het antilichaam worden toegediend voorafgaand aan of aansluitend op behandeling van de aandoening met het additionele therapeutische agens, bijvoorbeeld nadat een patiënt niet beter is geworden van therapie met het additionele agens. Vergelijkbaar, kan 20 toediening van het anti-myostatine antilichaam worden toegediend voorafgaand aan of aansluitend op een andere therapie, zoals oefening en/of dieet (inclusief nutritionele) supplementen. Het antilichaam en een of meer additionele therapeutische agentia (de combinatietherapie) kan worden toegediend eenmaal, tweemaal of ten minste de periode van tijd tot de 25 conditie is behandeld, verlicht of genezen. Bij voorkeur wordt de combinatietherapie meerdere malen toegediend. De combinatietherapie kan worden toegediend van driemaal daags tot eenmaal per zes maanden. De toediening kan zijn op een schema zoals driemaal daags, tweemaal daags, eenmaal daags, eenmaal per twee dagen, eenmaal per drie dagen, eenmaal 30 per week, eenmaal per twee weken, eenmaal per maand, eenmaal per twee 104 maanden, eenmaal per drie maanden en eenmaal per zes maanden, of kan worden toegediend continu via een minipomp. De combinatietherapie kan worden toegediend via een orale, muccosale, buccale, intranasale, inhaleerbare, intraveneuze, subcutane, intramusculaire of parenterale 5 route.

Gentherapie

[0207] De nucleïnezuurmoleculen van de onderhavige uitvinding kunnen worden toegediend aan een patiënt die ze nodig heeft via gentherapie. De therapie kan ofwel in vivo of ex vivo zijn. In een voorkeursuitvoering, 10 worden nucleïnezuurmoleculen coderende voor zowel een zware keten als een lichte keten toegediend aan een patiënt. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm, worden de nucleïnezuurmoleculen toegediend zodat zij stabiel geïntegreerd zijn in chromosomen van B-cellen omdat deze cellen gespecialiseerd zijn voor het produceren van antilichamen. In een 15 voorkeursuitvoering, worden precursor-B-cellen of andere cellen getransfecteerd of geïnfecteerd ex vivo en geretransplanteerd in een patiënt die het nodig heeft. In een andere uitvoeringsvorm, worden precursor-B-cellen of andere cellen geïnfecteerd in vivo toepassende een virus bekend het celtype van interesse te infecteren. Typische vectoren toegepast voor 20 gentherapie omvatten liposomen, plasmiden en virale vectoren.

Voorbeelden van virale vectoren zijn retrovirus sen, adenovirussen en adenogeassocieerde virussen. Na infectie ofwel in vivo of ex vivo, kunnen niveaus van antilichaamexpressie worden gemonitord door het nemen van een monster uit de behandelde patiënt en het toepassen van een 25 immunoassay bekend in de kunst of hierin beschreven.

[0208] In een voorkeursuitvoering, omvat de gentherapiewerkwijze de stappen van het toedienen van een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul coderende voor de zware keten of een antigeenbindend gedeelte daarvan van een anti-myostatine antilichaam en het nucleïnezuurmolecuul tot 105 expressie brengende. In een andere uitvoeringsvorm, omvat de gentherapiewerkwijze de stappen van toediening van een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul coderende voor de lichte keten of een antigeenbindend gedeelte daarvan van een anti-myostatine antilichaam en 5 het nucleïnezuurmolecuul tot expressie brengende. In een meer geprefereerde werkwijze, omvat de gentherapiewerkwijze de stappen van toediening van een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul coderende voor de zware keten of een antigeenbindend gedeelte daarvan en een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul coderende voor de lichte keten of het 10 antigeenbindend gedeelte daarvan van een anti-myostatine antilichaam van de uitvinding en de nucleïnezuurmoleculen tot expressie brengende. De gentherapiewerkwijze kan ook omvatten de stap van toediening van één of meer additionele therapeutische agentia, zoals deze beschreven, bovenstaand.

15 [0209] Opdat deze uitvinding beter zal worden begrepen, worden de volgende voorbeelden uiteengezet. Deze voorbeelden zijn voor doeleinden van illustratie alleen en moeten niet worden geconstrueerd als op enige wijze beperkend voor de beschermingsomvang van de uitvinding.

106 VOORBEELD 1

Generatie van hvbridoma’s die anti-mvostatine antilichaam produceren [0210] Antilichamen van de uitvinding werden bereid, geselecteerd, en onderzocht als volgt: acht tot tien weken oude XenoMous™-muizen werden 5 intraperitoniaal geïmmuniseerd of in hun achterste voetkussentjes met ofwel een c-terminaal matuur myostatine (10 μg per dosis/muis) (R&D Systems, catalogus #788-G8) of met een gehele-lengte cynomolgus matuur myostatine. Deze dosis werd herhaald zevenmaal over een drie tot vier weken periode. Vier dagen voor fusie, kregen de muizen een laatste injectie 10 van het myostatine in PBS. De milt en lymfeknooplymfocyten van geïmmuniseerde muizen werden gefuseerd met de niet-secreterende myeloma P3 -X63-Ag8.653-cellijn, en deze gefuseerde cellen werden onderworpen aan HAT-selectie als eerder beschreven (Galfre en Milstein, Methods Enzylmol. 3:3-46, 1981). Een panel van hybridoma's werd 15 teruggewonnen die alle myostatinespecifieke human IgG2- of IgG4-antilichamen uitscheiden.

GDF8 en GDF11 ELISA assayprotocol: 20 [0211] ELISA-assay werd toegepast om antilichaambinding aan myostatine of GDFll te dectecteren. Myostatine of GDF11 werd gecoated op een 96-well Immulon microtiterplaat (NUNC-Immuno™ -plaat MaxiSorp™ -oppervlak, Nalge Nunc International, Cat. Nr.439454) in 4μg/ml in 50mM natriumbicarbonaat buffer overnacht bij 4°C. Platen 25 werden gewassen, en dan geblocked met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) omvattende 0,1% Tween-20 en 0,5 bovineserumalbumine. Antilichamen werden toegevoegd aan de geblokkeerde ELISA-platen, geïncubeerd gedurende 1 uur, en gewassen met PBS met Tween-20. Binding werd gedetecteerd door anti-humaan IgG-horseradishperoxidase 30 (Pierce Cat. No. 31420) gevolgd door de toevoeging van ABTS (Pierce Cat.

107

No. 37615). Colorimetrische metingen werden uitgevoerd bij 405 nm in een microplaatlezer (We gebruikten SpectraMax Plus 384, Molecular Devices).

[0212] Elf hybridoma's werden geselecteerd voor verder onderzoek en warden aangeduid als 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 5 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, en 1_268_1. De elf hybridoma's werden gedeponeerd onder voorwaarden overeenkomstig met het Budapest-verdrag bij de American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 op 10 februari, 2005. De volgende referentienummers zijn toegekend aan de hybridoma's: 10

Antilichaam Hybridoma Identifier ATCC

Referentie Nr.

1_116_1 PF8-1-116-1 (LN15902) PTA-6566 1_132_1 PF8-1-132-1 (LN 15903) PTA-6567 1_136_3 PF8-1-136-3 (LN 15904) PTA-6568 1_257_1 PF8-1-257-1 (LN 15905) PTA-6569 1_268_1 PF8-1-268-1 (LN 15906) PTA-6570 1_314_1 PF8-1-314-1 (LN 15907) PTA-6571 1_46_1 PF8-1-46-1 (LN 15908) PTA-6572 1_66_1 PF8-1-66-1 (LN 15909) PTA-6573 2_112_1 PF8-2-112-1 (LN 15910) PTA-6574 2_43_1 PF8-2-43-1 (LN 15911) PTA-6575 2_177_1 PF8-2-177-1 (LN 15912) PTA-6576 VOORBEELD II 15

Sequences van Anti-mvostatine antilichamen bereid volgens de uitvinding

[0213] Om de structuur van antilichamen geproduceerd volgens de uitvinding te analyseren, werden nucleïnezuren gekloond die coderen voor 108 zware en lichte keten fragmenten van hybridoma's die anti-myostatine monoklonale antilichamen produceren

[0214] Het kloneren en sequencen van de antilichaamvariabele regio's, werden als volgt bereikt: Poly(A)+ mRNA werd geïsoleerd toepassende een 5 Fast-Track kit (Invitrogen) van ongeveer 2 X 105 hybridomacellen verkregen XenoMouse™ -muizen geïmmuniseerd met myostatine. cDNA werd gesynthetiseerd uit het mRNA door toepassing van willekeurige primers. Het willekeurig geprimede cDNA werd geamplificeerd humane Vu of humane Vk familie specifieke variabele domeinprimers toepassende 10 (Marks et al., “Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes en design of family-specific oligonucleotide probes.” Eur. J. Immunol. 21:985-991 (1991)) of een universele humane Vh primer [MG-30, 5'- CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG-3'1 (SEQ ID NO: 91), in combinatie met 15 primers specifiek voor de humane Cy2 constante regio, MG-40d [5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3'] (SEQ ID NO: 92) of een Ck constante regio [1ικΡ2; zoals eerder beschreven in Green et al., 1994], Nucleïnezuurmoleculen werden verkregen die coderen voor humane zware en kappa-lichte ketentranscripten van de antimyostatineproducerende 20 hybridoma's door PCR-amplificatie van poly(A+) RNA de boven beschreven primers toepassende. De PCR-producten werden gekloond in [pCRII (Invitrogen)] een TA kloningkit (Invitrogen) toepassend en beide strengen werden gesequenced Prism dye-terminator sequencing kits (Applied

Biosystems Ine) toepassende en een ABI 377 sequencingmachine (Applied 25 Biosystems Ine). Alle sequenties werden geanalyseerd door alignment aan de “V BASE sequence directory” (Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) MacVector* (Accelrys, San Diego, CA) toepassende en Geneworks® (Hindmarsh, S.A. Australia) softwareprogramma's.

109

[0215] Om te verkrijgen de gehele lengte tot uitdrukking gebrachte nucleïnezuursequentie van antilichamen geproduceerd volgens de uitvinding, werden nucleïnezuren gekloond die coderen voor gehele-lengte zware en lichte keten coderende regio's van hybridoma's die anti-5 myostatine antilichamen produceren. Klonering en sequencing werd als volgt bereikt: Poly(A)+ nxRNA werd geïsoleerd toepassende een RNeasy Mini Kit (Qiagen) en cDNA gesynthetiseerd uit het mRNA met de Advantage RT-for-PCR kit (BD Biosciences) toepassende oligo(dT) priming. Het oligo(dT) geprimede cDNA werd geamplificeerd in twee onafhankelijke 10 reacties gedegenereerde primers toepassende ontworpen om te hybridiseren aan de 5' niet vertaalde regio (5' UTR) van humane Vh of humane Vk gensegmenten (tabel 2A en 2B) in samenhang met niet-gedegenereerde primers specifiek voor regio's in het 3'UTR van IGHG2 of IGHG4 [G_3UTR_R, 5TACGTGCCAAGCATCCTCGC] (SEQ ID NO: 93) of IGK 15 [K_3UTR_R, 5’AGGCTGGAACTGAGGAGCAGGTG] (SEQ ID NO: 94). Amplificatie werd bereikt toepassende de Expand High Fidelity PCR kit (Roche) en een PTC-200 DNA Engine (MJ Research) met cycli als volgt: 2 minuten bij 94°C; 23x (30 seconden bij 94°C, 50 seconden bij 52°C, 2 minuten bij 72°C); 8 minuten bij 72°C. Voor zowel zware als lichte 20 ketenreacties, werden de PCR-producten uit twee onafhankelijke PCR's gekloond in pCR2.1 toepassende een TOPO-TA cloning kit (Invitrogen) en beide strengen van twee klonen werden gesequenced toepassende Grills 16th BDTv3.1/dGTP chemie (Applied Biosystems Ine) en een 3730x1 DNA Analyzer (Applied Biosystems Ine).

110

TABEL 2A

Zware en lichte keten 5’ amplificatie primers:

Primernaam Primersequentie SEQ ID

VHla_5UTR_F CCCTGAGAGCATCAYMYARMAACC 95 VH3a_5UTR_F HVTHTCCACTYGGTGATCRGCACTG 96 VH3c_5UTR_F ATTYRGTGATCAGSACTGAACASAG 97 VKla_5UTR_F GS ARTC AGW C Y C WVY C AGG AC AC AGC 98 VK2_5UTR_F CACCAGGKGATTTGCATATTRTCCC 99 VK3_5UTR_F ATCAATGCCTGKGTCAGAGCYYTG ÏÖÖ 5

TABLE 2B

5’ Primers toegepast voor amplificatie van anti-mvostatine antilichaam zware en lichte ketens: 10

Kloon Voorwaartse zware Voorwaartse lichte keten primer keten primer

1_116_1 VH3a_5UTR_F VKla_5UTR_F

1_132_1 VHla_5UTR_F VK2_5UTR_F

1_136_3 VH3a_5UTR_F VKla_5UTR_F

1_257_1 VH3a_5UTR_F VKla_5UTR_F

1_314_1 VH3a_5UTR_F VKla_5UTR_F

1_46_1 VHla_5UTR_F VK2_5UTR_F

2_112_1 VH3c_5UTR_F VK3_5UTR_F

1_268_1 VH3a_5UTR_F VKla_5UTR_F

Têëlï VH3a_5UTR_F VKla_5UTR_F

2_177_1 VH3c_5UTR_F VK3_5UTR_F

2_43_1 VH3c_5UTR_F VK3_5UTR_F

Ill

Genbenuttingsanalvse

[0216] Van een nucleïnezuursequentie en voorspelde aminozuursequentie van de antilichamen, werd de genbenutting geïdentificeerd voor elke antilichaamketen. Tabel 3 zet uiteen de genbenutting van geselecteerde 5 hybridomaklonen van antilichamen in overeenstemming met de uitvinding: TABEL 3

Zware en lichte keten gen segment benutting:

Zware keten gen benutting Kappa-keten gen benutting SEQ ID Vh [DÏi Tjü |~CÏÏ SEQ ID Tv^ Jk Kloon NO: NO: JH4 1_116_1 1 V3-21 D5-5 G2 3 A30 JKl

B

Ό4- JH6 1_132_1 5 Vl-02 G2 7 A3 JK4

23 B

JH4 ' 1_136_3 9 V3-21 D5-5 G2 11 A30 JKl

B

ËÜl· JH6 1_257_1 13 V3-21 G2 15 A30 JK3

12 B

JH6 1_314_1 17 V3-21 - G2 19 A30 JKl

B

Ό4 JH6 1_46_1 21 Vl-02 G2 23 A3 JK4

23 B

JH3 2_112_1 25 V3-23 Dl-7 G4 27 L2 JK4

B

Dl· JH4 1_268_1 29 V3-21 G2 31 A30 JK4

26 B

JH4 1_66_1 33 V3-21 D5-5 G2 35 A30 JK3

B

112

I JH3 I

2_177_1 37 V3-21 Dl-7 G4 39 L2 JK4

B

— 2_43_1 41 V3-23 Dl-7 G4 43 L2 JK4

B

[0217] Mutaties die ontwikkelden gedurende antilichaammaturatie van de framework-regio's werden teruggemodificeerd naar de 5 stamlijnsequenties zoals geïllustreerd in de sequentie-alignment van figuur 19. Specifiek, werd residu 12 in de zware keten van monoklonaal antilichaam 2_112_1 (SEQ ID NOs: 26 en 77) gemodificeerd van Ile naarVal. In de lichte keten (SEQ ID NOs:28 en 79), werd residu 58 gemodificeerd van Phe naar Ile en residu 85 werd gemodificeerd van Ile 10 naar Val. Mutagenese van specifieke residuen van de zware en lichte ketens van antilichaam 2_112_1 werd uitgevoerd door het ontwerpen van primers en toepassende de QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit van Stratagene, volgens de instructies van de producent. Mutaties werden bevestigd door geautomatiseerde sequencing, en gemutageniseerde 15 inserties werden gesubkloond in expressievectoren. Deze expressievectoren werden getransfecteerd in NSO (ECACC # 85110503) en HEK-293T cellen (American Type Culture Collection) om recombinante antilichamen van de uitvinding tot expressie te brengen. Het resulterende antilichaam hebbende teruggemuteerde frameworkregio’s wordt aangeduid als antilichaam 20 2_112_K.

VOORBEELD III

Inhibitie van mvostatine door humane anti-mvostatine antilichamen (A204) luciferaseassav 25 [0218] Een myostatinegevoelig reportergenassay (see, Thies, et al.,

Growth Factors, (2001) 18:251-259.) werd toegepast om de biologische 113 activiteit van actief myostatine in vitro vast te stellen. Deze assay past reportervector pGL3(CAGA)i5 toe gekoppeld aan luciferase. De CAGA box sequentie (AGCCAGACA) (SEQ ID NO: 101) werd gerapporteerd een TGF-β-gevoelig element te zijn in de promoterregio van een TGF-β-geïnduceerd 5 gen, PAI-1. (Zawel, et al. Mol. Cell, (1998) 1:611-617). Deze reportervector werd gegenereerd door insertie van 15 kopieën van CAGA boxes in de Smal en Xhol plaatsen van pGL3-promotervector (Promega, Cat. No. E1761). De humane rhabdomyosarcomacellijn, A204 (ATCC Cell No. HTB-82), werd kortstondig getransfecteerd met pGL3(CAGA)15 enCMV β-GAL Fugene 6 10 transfectiereagens toepassende (Roche Diagnostics, Cat. No. 1814443). Getransfecteerde cellen werden gekweekt in McCoy’s 5 A medium (Invitrogen, Cat. No. 16600) gesupplementeerd met 10% foetaal bovineserum, 100 U/ml streptomycine, en 100 μg/ml penicilline gedurende 16 uur. Cellen werden gewisseld naar uithongerend medium (McCoy’s 5A 15 medium met streptomycine, penicilline, en lmg/ml bovineserumalbumine), en daarna behandeld met myostatine, GD 11, of activine gedurende 6 uur bij 37°C. Luciferaseactiviteit werd gemeten toepassende het Dual-light® luciferaseassaysysteem (Applied Biosytems, Cat. No. T1004). Myostatine activeert de reporter tot ongeveer 10 maal met EC50 rond 8 ng/ml. GDF11 20 activeert de reporter in de erg vergelijkbare respons. De neutralisatieactiviteit van een antilichaam werd vastgesteld door het antilichaam vooraf te incuberen met myostatine gedurende 30 minuten voorafgaand aan toevoeging aan de A204 cellen. Zoals getoond in figuur 1, inhibeerden humane anti-myostatine antilichamen van de uitvinding 25 myostatine gestimuleerde luciferaseactiveit in de A204 cellen. Een vergelijkbaar experiment GDF11 toepassende werd ook uitgevoerd om de specificiteiten van de antilichamen van de uitvinding te bestuderen. De gegevens zijn opgesomd in de figuur 1. Meeste antilichamen hebben veel meer potente neutraliserende activiteit tegen GDF8 dan GDFll.

114

Monoklonale antilichamenl_46_l en 1_132_1 neutraliseren zowel GDF8 als GDF11 met gelijke potentie.

VOORBEELD IV

Inhibitie van mvostatine door humane anti-mvostatine antilichamen 5 (L6 beta-lactamaseassav)

[0219] In vitro assays om myostatinebinding aan type II-membraanreceptoren te meten in de aanwezigheid van anti-myostatine antilichamen werden uitgevoerd om vast te stellen of de anti-myostatine 10 antilichamen in staat waren zulke binding te inhiberen en hun mate van inhibitie.

[0220] Een L5 Aurora-reporterassay werd uitgevoerd om de biologische activiteit van actieve myostatine in vitro vast te stellen. L6 myostatine LD 10 is een cellijn stabiel tot expressie brengende een beta- 15 lactamasereportergen. De promoterregio in de ingevoegde reporter bestaat uit 16 kopieën van Smad-bindend element (SBE, GTCTAGAC (SEQ ID NO: 102), Zawel et al., Mol. Cell 1: 611-17 (1998)). De cellen werden gekweekt in DMEM hoog glucose (Invitrogen, Cat. No. 11995) gesupplementeerd met 10% hitte geïnactiveerd foetaal bovineserum (FBS), 200-400 μg/ml Zeocin, 20 100 U/ml streptomycine en 100 μg/ml penicilline. Cellen werden uitgeplaat op 96 wells platen op dag één en veranderd naar het uithongermedium DMEM met Zeocin, streptomycine, penicilline en 0,1% FBS) in de middag van de tweede dag. Op de morgen van de derde dag, werden de cellen behandeld met myostatine, GDF11, of activine gedurende 4 uur bij 37°C. 25 Aurora CCF2 loading kit werd toegepast om beta-lactamaseactiviteit te analyseren volgens de suggestie van de fabricant (Invitrogen, Cat. No. K1032).

115

[0221] Myostatinegeactiveerde smad-gemedieerde expressie van de reporter tot ongeveer 2-3-maal met EC50 rond 5 ng/ml. GDF11 en activine activeerden de reporter in de erg vergelijkbare respons.

[0222] De neutralisatie activiteit van een antilichaam werd vastgesteld 5 door antilichaam voorafgaand met myostatine te incuberen gedurende 30 minuten voorafgaand aan toevoeging aan de L6 myostatine LDlO-cellen. Zoals getoond in figuren 2 en 11, testen alle humane anti-myostatine antilichamen geinhibeerde smad-proteïneactivatie in een bereik van ongeveer 1 tot ongeveer 225 nM.

10

VOORBEELD V

Inhibitiie van mvostatinegeïnduceerde Smad 2-forforvlatie (Western Blot) 15 [0223] HepG2 humane hepatocellulaire carcinomacellen (ATTC Cell No.

HB-8065) werden gekweekt in DMEM hoog-glucose (Invitrogen, Cat. No. 11995) gesupplementeerd met 10% foetaalbovineserum (FBS), 100 U/ml streptomycine, en 100pg/ml penicilline. 60-70% confluente cellen werden veranderd naar het uithongermedium (DMEM met streptomycine, 20 penicilline, en 0.5% FBS) overnacht. Cellen werden behandeld met myostatine gedurende 30 minuten. De neutraliserende activiteit van een antilichaam werd vastgesteld door antilichaam vooraf te incuberen met myostatine gedurende 30 minuten voorafgaand aan toevoeging aan de HepG2 cellen. Cellen werden gelyseerd voor Western blot. Gefosforyleerd 25 Smad2 werd gedecteerd toepassende een konijne-anti-fosfo-Smad2- antilichaam (Cell Signalling, Cat. No. 3101), welke dan werd gedetecteerd door antikonijn Alex 680 (Moleculaire Probes, Cat. No. A21076). De hoeveelheid van gefosforyleerd Smad2 werd gekwantificeerd toepassende Odyssey Infrared Imager (Li-Cor). Glyseraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase 30 (GAPDH) werd toegepast voor normalisatie. Zoals getoond in figuur 3, 116 inhibeerden alle van de geteste neutraliserende humane anti-myostatine antilichamen Smad2-fosforylatie.

VOORBEELD VI

5 Versterkte expressie van mvf5 door humane anti-mvostatine antilichamen

[0223] C2C12 myoblastsen (ATCC Cel No. CRL-1772) werden gekweekt in DMEM hoog-glucose (Invitrogen, Cat. No. 11995) gesupplementeerd met 10% foetaal bovineserum (FBS) en 100 μg/ml streptomycine en 100 μg/ml 10 penicilline. Cellen werden behandeld met 300 ng/ml mystatine gedurende 2 uur. De neutraliserende activiteit van een antilichaam werd vastgesteld door antilichaam te preïncuberen met myostatine gedurende 30 minuten voorafgaand aan toevoeging van de C2C12 cellen. Cellen werden geoogst en RNA gezuiverd toepassende RNeasy miniprep kit (Qiagen Cat. No. 74104). 15 Gezuiverd RNA werd gekwantificeerd met RiboGreen® RNA Quantitation Kit (Molecular Probes, Cat. No. R11490). Gelijke hoeveelheid van totaal RNA werd toegepast voor real time PCR-analyse om myfö-expressie te detecteren. Primer/probe sets voor muis myf5 RNA detectie werden gekocht van Assays-On-Demand™-gen expressie producten (Applied 20 Biosystems, Cat. No. Hs00271574_ml). Assaycondities toegepast waren volgens de aanbevelingen van de productent. Eenstaps RT-PCR werd gedraaid op het sequentie detectiesysteem ABI7900 (Applied Biosystems). Zoals getoond in figuur 4, versterkten neutraliserende humane anti-myostatine antilichamen van de uitvinding myfö-expressie. Eén niet-25 neutraliserend humaan anti-myostatine antilichaam, 1_159_1, versterkte niet myfö-expressie.

117

VOORBEELD VII

Versterking van celdifferentiatie door humane anti-mvostatine antilichamen 5 [0225] De mogelijkheid van antilichamen om myostatinegemedieerde inhibitie van myoblasdifferentiatie te inhiberen werd vastgesteld in C2C12-myoblasten. C2C12-cellen werden uitgeplaat in 96 wells platen bij 25000 cellen per well in 200 μΐ DMEM/20% FBS/Penn-Strip. Vierentwintig uur later, werd het medium opgezogen, de cellen gewassen eenmaal met HIT-10 medium DMEM/2% paardeserum/Penn-Strep), en 200 μΐ MIT-medium alleen of gesupplementeerd met 300 ng/ml GDF-8 (R&D Systems) alleen of met verschillende concentraties van toegevoegd antilichaam. Achtenveertig uur later, werd het medium opgezogen en de cellen gelyseerd in 100 μΐ van lysisbuffer (25 mM Tris pH 7,5, 3 mM EDTA, 1% NP-40, 1% deoxychlolaat, 15 0,1% SDS en 1 tablet van Roche Complete protease-inhibitor/25 ml van lysisbuffer). Embryonale myosine zware keten (MHC)-niveaus in de lysaten werden vastgesteld door spotting van 5 μΐ lysaat in individuele wells van High Bind MA6000 platen (MSD#P11XB-1, Meso Scale Discovery, MSD), drogen aan de lucht gedurende 1 uur, toevoegen 100μ1 van Blocker A 20 (MSD#R93BA-2), incuberen gedurende 1 uur bij 25°C met schudden, wassen 4x met PBS/0,05% Tween-20, toevoegen 50 μΐ van embryonaal MHC antilichaam (geconditioneerde media van ATCC #CRL-2039 hybridoma), incuberen gedurende 1,5 uur bij 25°C met schudden, wassen 4x zoals hiervoor, toevoegen 50 μΐ van Sulfo-TAG Anti-Mouse IgG (MSD #R32AC) 25 welke verdund was 1:1000 in antilichaamoplosmidddel (MSD #R50AA-2), incuberen gedurende 1,5 uur bij 25°C met schudden, wassen 4x zoals hiervoor, toevoegen 150 μΐ van lx Read Buffer (MSD#R92TC-2) en analyseren chemoluminescentie in een Sector Imager 6000 (MSD). Zoals getoond in figuur 5, keerden neutraliserende humane anti-myostatine 118 antilichamen myostatine geblokkeerde spierdifferentiatie om in de MHC-assay.

VOORBEELD VIII 5 Myostatinenet) tidebinding

[0226] Elf peptiden werden gegenereerd uit matuur GDF8 om antilichaambinding te testen en localiseren (zie figuur 6) . Peptide-ELISA werd uitgevoerd op glutaraldehyde gecoate ELISA-platen en op ongecoate 10 ELISA-platen (NUNC-Immuno™-plate MaxiSorp™-oppervlak, Nalge Nunc International, Cat. No. 439454). Glutaraldehyde gecoate platen werden bereid door het mixen van 250 μΐ glutaraldehyde (50% w/v) met 50 ml gedeïoniseerd water en het toevoegen van 200 μΐ van de oplossing in elke well. Platen werden geïncubeerd gedurende ten minste 1 uur bij 15 kamertemperatuur. Het glutaraldehyde werd uit de plaat geschud en omgekeerd neergeslagen op papieren doekjes om alle vloeistof te verwijderen voorafgaand aan toepassing.

[0227] ELISA-platen werden gecoat met peptide met 1,0 μg/well/50 μΐ (in natriumbicarbonaatbuffer, pH 9,6) gedurende ten minste 4 uur, en daarna 20 geblokkeerd met 200 μΐ blocker (1% BSA, 1% ethanolamine pH 7,4) gedurende minimaal 4 uur. Platen werden gewassen met PBST driemaal met 200 μΐ/well. 50 μΐ antilichaam (1 μg/ml in PBST, fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,05% Tween-20)-monster werd toegevoegd aan de wells gedurende 1 uur. Platen werden daarna gewassen met PBST 25 driemaal. 50 μΐ anti-humaan IgG-horseradishperoxidase (HRP) Pierce, Cat# 31420) verdund in PBST wordt toegevoegd gedurende nog een uur. De wells werden weer gewassen met TBST driemaal, en daarna tweemaal met gedeïoniseerd water. 50 μΐ ABTS (MOSS) werd toegevoegd gedurende 5 - 20 minuten, en het signaal werd gedetecteerd bij 405 nm in en colometrische 119 plaatlezer. De resultaten van het bindingsexperiment zijn getoond in figuur 6. De elf peptiden zijn getoond in figuur 7.

VOORBEELD IX 5 Enitoon manning studdies

[0228] Kruiscompetitie-experimenten werden uitgevoerd toepassende het BIACORE™ 3000 instrument (Biacore International AB, Uppsala, Sweden en Piscataway, N. J), de protocollen van de producent volgende.

10 [0229] Experimenten werden uitgevoerd in een BIACORE™ 3000 instrument bij 25°C in 0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Tween-20. Myostatine werd geïmmobiliseerd op een CM5 chip (Biacore™) standaard amine koppelingsprocedures toepassende opbrengende ongeveer 1300 RU (resonantieunits). Antilichaammonsters 15 werden bereid bij 50 nm en geïnjecteerd in paren, bijvoorbeeld, een referentie-mAB werd geïnjecteerd gedurende 10 minuten gelijk gevolgd door een 10 minuut injectie van een test-mAB. Het oppervlak werd geregenereerd en de injecties werden herhaald in omgekeerde volgorde. De procedure werd herhaald voor alle mogelijke paren van antilichamen. Een 20 kruisvergelijking van de totale respons verkregen voor een paar van antilichamen met dat verkregen voor duplicaatinjecties van elk individueel antilichaam werd toegepast om antilichamen te vinden die competitief binden met elkaar, bijvoorbeeld, de antilichaam wedijveren voor binding met het antigeen. Een respons groter dan dat geobserveerd voor een van de 25 duplicaatinjecties was indicatief voor binding aan verschillende epitopen terwijl een respons tussenliggend aan deze geobserveerd voor de duplicaatinjecties indicatief was voor binding aan dezelfde of overlappende of naastliggende epitopen. De resultaten van dit experiment zijn getoond in figuur 8 en samengevat in figuur 13.

30 120

VOORBEELD X

Immunoprecipitatie van mvostatine uit celkweekmedium

[0230] Een immunoprecipitatiestudie werd uitgevoerd om de binding van 5 myostatine antilichamen aan matuur GDF3 en matuur GDF8/propeptidecomplex te testen. 293T-cellen werden getransfecteerd met GDF-8-expressieconstruct. Geconditioneerd medium werd geoogst 7 dagen na transfectie, welke matuur GDF8 en latent complex omvatte. 100 μΐ geconditioneerd medium werd geïncubeerd met 10 μg myostatine 10 antilichamen gedurende 16 uur bij 4°C. Protein A Dynabeads (Dynal, Noorwegen) werden toegevoegd en geïncubeerd gedurende 90 minuten bij 4°C. Het immunoprecipitaat werd verzameld MPC-E-magnetische concentrator toepassende (Dynal, Noorwegen), en viermaal met PBS gewassen. Het immunoprecipitaat werd geresuspendeerd in de reducerende 15 monsterbuffer en geladen op 4-12% Bis-Tris-Nu-Page-gel (Invitrogen). Western blotting werd uitgevoerd Odyssey-infrarood-imagingsysteem toepassende (Li-Cor). Matuur GDF8 en ongeprocessed GDF8 werden gedetecteerd geit anti-myostatine antilichaam toepassende (R&D Systems, Cat# AF788). Konijne anti-propeptide polyklonaal antilichaam (gemaakt in-20 huis) werd toegepast om zowel propeptide als ongeprocessed GDF8 te detecteren. Zoals getoond in het figuur 9, immunoprecipiteerden antilichamen 2_112_1, 2_43_1, en 2_177_1 matuur GDF8, matuur GDF8/propeptidecomplex, en ongeprocessed GDF8; antilichaam 1_66_1 immunoprecipiteerde matuur GDF8 en matuur GDF8/propeptidecomplex. 25 Geen andere antilichamen immunoprecipiteerden matuur GDF8, propeptide of niet-geprocessed GDF8. Lane 4 is de 1/10-mediumgeladen controle, en lane 7 is immunoprecipitatiecontrole met medium alleen..

121

VOORBEELD XI

Immunonrecinitatie van mvostatine uit muizenserum

[0231] Een immunoprecipitatiestudie werd uitgevoerd om de binding van myostatine antilichamen aan matuur GDF8 uit muizenserum te testen. 200 5 μΐ muizenserum (Rockland, Cat # D208-00) werd geïncubeerd met 20 pg myostatine antilichamen gedurende 16 uur bij 4°C. Protein A Dynalbeads werden toegevoegd en geïncubeerd gedurende 90 minuten bij 4°C. Het immunoprecipitaat werd verzameld MPC-E magnetische concentrator (Dynal, Noorwegen) toepassende, en viermaal met PBS gewassen. Het 10 immunoprecipitaat werd geresuspendeerd in de reducerende monsterbuffer en geladen op 4-12% Bis-Tris-Nu-Page-gel (Invitrogen). Wester blotting werd uitgevoerd Odessey infrared imaging-systeem toepassende (Li-Cor). Matuur GDF8 werd gedetecteerd gebiotinyleerde geit anti-myostatine antilichaam toepassende (R&D Systems, Cat.# BAF788). Zoals getoond in 15 figuur 10, antilichamen 2_112_1, 2_43_1, en 2_177_1 immunoprecipiteerde matuur GDF8 uit het muizenserum, terwijl 1_116_1 en 1_66_1 het niet konden. Het is bekend dat matuur GDF8 in het serum bindt aan vele inhibitoire eiwiten zoals propeptide, FLRG, en GAS API (Hill et al. (2002) The myostatin propeptide en the follistatin-related gene are inhibitory 20 binding proteins of myostatin in normal serum. J. Biol. Chem. 277: 40735-40741. Hill et al. (2003) Regulation of myostatin in vivo by growth and differentiation factor-associated serum protein-1: a novel protein with protease inhibitor en follistatin domains. Mol. Endocrin. 17(6): 1144-1154). Dit experiment geeft aan dat antilichamen 2_112_1, 2_43_1, en 2_177_1 25 ware niet-competitieve neutraliserende antilchamen zijn, d.w.z., de antilichamen neutraliseren myostatine maar blokkeren niet binding van inhibitoire bindende eiwitten aanwezig in serum. Zulke niet-competitieve neutraliserende antilichamen zouden in vivo voordelig zijn.

122

VOORBEELD XII

Vergelijking van anti-mvostatine antilichamen in vivo

[0232] Vijf weken oude KKA>/a -muizen (The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine)) werden behandeld met 10 mg/kg monoklonale 5 antilichamen 2_43_1, 2_177_1, en 2_112_K of drager (PBS) toegediend subcutaan eenmaal per week gedurende vijf weken. Aan het einde van de studie werden dieren geëuthaneseerd en de gastrocnemius -plantaris-soleus (GPS), tibialis anterior (TA) en quadriceps (Quads) spiergroepen werden gedissecteerd en gewogen. Behandeling met het 2_112_k antilichaam liet 10 significant toenemen (p<0.05) absolute spiermassa voor de GPS (+15.5%) en Quads (+30.6%). Het 2_177 antilichaam liet alleen significant toenemen Quads (+11.5%). Hoewel TA toenam na behandeling met antilichaam 2_112_K (+16.8%), was de toename niet statistisch significant (p=0.330). Lichaamsgewicht nam toe gedurende de 5 weken maar was niet significant 15 verschillend tussen behandelingsgroepen op enig moment gedurende de studie. Wanneer spiermassa werd gecorrigeerd voor lichaamsgewicht (spiermassa index) waren er alleen significante verschillen met 2_112_K behandeling(+11.4% in GPS en +20.6% in Quads). De resultaten van dit experiment zijn getoond in figuren 14 en 15.

20

VOORBEELD XIII

In vivo farmacologie en werkzaamheid van antilichaam

[0233] De in vivo farmacologie en werkzaamheid van antilichaam 2_112_K werd geëvalueerd in muizen. Om potentiële immunomodulatie als 25 gevolg van een muis anti-humaan antilichaam (MAHA) respons te vermijden, werden in vivo studies uitgevoerd in immuundeficiënte Severe Combined Immunodeficient (SCID) beige muizen. Subcutane toediening van antilichaam 2_112_K aan deze muizen bij 10 mg/kg/week subcutaan gedurende 5 weken liet skeletspiermassa toenemen met 19-25% en 30 spiersterkte met ongeveer 15%. Het verlengen van de duur van deze 123 behandeling tot 10 weken resulteerde in een verdere toename in spierssterkte tot 21% maar geen verdere toename in spiermassa (met 18-27%). Tevens, leverede de dosis van 50 mg/kg/week subcutaan gedurende 10 weken niet superieure toenamen in spiermassa of -sterkte vergeleken met 5 10 mg/kg/week. De resultaten van dit experiment zijn getoond in figuur 16.

VOORBEELD XIV

Dosis en concentratie respons effecten 10 [0234] Wanneer subcutaan toegediend aan SCID-muizen bij doses variërende van geen effect tot maximaal mogelijke doses (0.01, 0.1, 1 enlO mg/kg/week), liet antilichaam 2_112_K dosis-afhankelijk skeletspiermassa toenemen met ongeveer 0%, 3%, 7% en 28%, respectievelijk na 5 weken (figuur 17). Het verlengen van de duur van behandeling tot 10 weken 15 resulteerde niet in een verdere toename in spiermassa maar neigde tibialis-spiersterkte marginaal te laten toenemen met een additionele 5%. Tevens, veranderde het antilichaam dosisafhankelijk de lichaamsvetsamenstelling van deze muizen met +10%, +1%, -10%, -22% vergeleken met PBS-controles bij de 0.01, 0.1, 1.0 enlO mg/kg/week gedurende 5 weken..

20 [0235] Niet-lineare, vierparameteranalyse van de dosis- en concentratieresponsgegevens brachten geschatte ED50- en EC50-waarden op van 3,6 mg/kg/week en 20,4 mg/ml (~136 nM), respectievelijk, aannemende dat de toename in spiermassa bereikt met de 10 mg/kg/week dosis het maximaal mogelijke is. De relatie tussen de dosis of 25 serumconcentratie van antilichaam 2_112_K versus veranderingen in spiermassa zijn getoond in figuur 18.

124

VOORBEELD XV

Werkzaamheid van antilichaam voor attenuatie van "muscle wasting"

[0236] Tien weken oude KK-muizen (JAX laboratories, Bar Harbor, Maine) werden willekeurig verdeeld in drie groepen: placebo/drager,

5 cortison/drager en cortisone/antilichaam 2_112_K. Muizen werden subcutaan gedoseerd met ofwel drager (PBS) of 10 mg/kg antilichaam 2_112_K gedurende vijf weken gevolgd door implantatie van een placebo of cortisonpellet. Vijf dagen later, werden muizen geëuthaneseerd, opgeofferd en spiermassa en vetkussentjemassa werden vastgesteld. Om spiermassa 10 vast te stellen, werden de gastrocnemius-plantaris-soleus (GPS), tibialis anterior (TA) en quadriceps (quads) spiergroepen gedissecteerd en gewogen. Cortisonimplantaat resulteerde in een significante afname (p<0,05) in spiermassa tot 85,1 ± 2,2% (GPS), 85,5 ± 3.9% (TA) en 84,1 ± 3,7% (quads) van het placebo/dragerniveau. Behandeling met antilichaam 2_112_K 15 verzachtte geheel de cortison-geïnduceerde wasting van placebo/dragerniveau voor GPS ((102,0 ± 2,2%), TA (99,5 ± 3,6) en quads (104,6 ± 2,8%). Waarden waren vergelijkbaar wanneer genormaliseerd per gram lichaamsgewicht. Om te testen of dit effect specifiek was voor spiermassa, werd vetkussentjemassa vastgesteld. Voor vetkussentjemassa, 20 werden inguïnale, epididymale en abdominale vetkussentjes gedissecteerd en gewogen. Behandeling met antilichaam 2_112_K spaarde niet significant (p<0,05) het verlies in vetkussentjemassa als gevolg van cortisonimplantaat voor inguinale, (cortison/drager (75,1 ± 4,7%) en cortison/2_112_K, (82,3 ± 5,3%)), epididymale (cortison/drager (79,3 ± 5,0%) en cortison/2_112_K (87,1 25 ± 3,9%)), of abdominale, (cortison/drager (79,5 ± 5,5%) en cortison/2_112_K

(82,2 ± 4,2%)), vetkussentjes. Waarden zijn uitgedrukt vergeleken met placebo/drager vetkussentje. De resultaten van dit experiment zijn getoond in figuren 20A en 20B.

125

VOORBEELD XVI

Eiwit A zuivering van mvostatine antilichaam

[0237] 1-2 liter geconcentreerd (10-voudig) HEK293 medium werd gefilterd (2 micron) en geladen op een uitgebalanceerde eiwit A kolom (Amersham 5 Biosciences, Piscataway, NJ) (53 mLs, uitgebalanceerd met 5 kolomvolumes van D-PBS, pH 7.0) bij 2 mL/min. De kolom werd gewassen met 5 kolomvolumes acetaatbuffer (20 mM natriumacetaat, pH 5.5) en het eiwit uitgespoeld met 4 kolomvolumes van pH 3,2-3,5 natriumacetaat (20 mM). De pH van het eluaat werd aangepast tot pH 5,5 met natriumhydroxide en 10 gefilterd indien nodig. Uiteindelijk werd het materiaal geconcentreerd tot 10 mg/ml, gedialyseerd in 140 mM natriumchloride, 20 mM natriumacetaat, pH 5,5, gefilterd en opgeslagen bij 4°C.

[0238] Alle publicaties en octrooiaanvragen geciteerd in deze beschrijving zijn hierin opgenomen door referentie alsof elke individuele publicatie of 15 octrooiaanvrage specifiek en individueel was aangegeven door referentie opgenomen te zijn. Hoewel de voorgaande uitvinding in enig detail is beschreven door middel van illustratie en voorbeeld voor doeleinden van helderheid van begrip, zal het direct duidelijk zijn aan deze van normale vaardigheid in de kunst in het licht van de lessen van deze uitvinding dat 20 bepaalde veranderingen en modificaties daartoe kunnen worden gemaakt zonder af te wijken van de geest of omvang van de toegevoegde conclusies.

126

Vertaling van de figuren Figuren 1, 2

Fold activation = maal activatie

Figuur 3 5 μg/ml antibody = μg/ml antilichaam

Figuren 4A en 4B

Relative mRNA = relatief mRNA

Figuren 5A en 5B

Plate = plaat 10 Log concentration = logconcentratie

Figuur 6

Myostatin = myostatine

Peptide bound = peptidegebonden 15 Figuur 7

Peptide number = peptidenummer

Amino acid sequence = aminozuursequentie 127

Figuur 9

Unprocessed GDF8 = niet-geprocessed GDF8

Mature GDF8 = matuur GDF8

Medium only = medium alleen 5

Figuur 12

Clone = kloon GDF11 activity = GDF11 activiteit inhibition at = inhibitie bij 10 no inhibition at = geen inhibitie bij

Figuur 13

Yes = ja

No = nee 15

Figuur 14

Muscle mass = spiermassa

Veh = drager

Figuur 15 20 Muscle mass index = spiermassaindex 128

Figuren 16A en 16B

Skeletal muscle weight = skeletspiermassa

Increase in weight vs. PBS control = toename in gewicht vs. PBS 5 controle 5-weeks = 5 weken 10-weeks = 10 weken

Tibialis muscle strength = tibialis spiersterkte

Figuren 17A en 17B

10 Tibialis muscle = tibialis spier

Weight = gewicht

Muscle complex = spiercomplex

Figuren 17C en 17D

15 Quadriceps muscle = quadricepsspier

Weight = gewicht

Pooled skeletal muscle = gepoold skeletspier 129

Figuur 18A

Dose-response = dosisrepons

% Weight change vs. PBS = % gewichtsverandering vs. BPS

5 Figuur 18B

Concentration-response = concentratierespons

Figuren 19A en 19B

Antibody = antilichaam

10 Figuur 20A

Muscle mass = spiermassa

Veh = drager

Cortisone = cortison

Figuur 20B

15 Adipose mass = vetmassa

Inguinal = inguinaal

Epididymal = epididymaal

Abdominal = abdominaal

Cortisone = cortison 20 Veh = drager

Claims

130

1. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan 5 omvattende (a) een CDR set, CDR1, CDR2, en CDR3, die opeenvolgend samen ten minste 90% identiek zijn in aminozuursequentie aan zware keten CDR's, CDR1, CDR2, en CDR3, opeenvolgend samen, die zijn omvat in de aminozuursequentie uiteengezet in SEQ ID NO: 81; 10 (b) een CDR set, CDR1, CDR2, en CDR3, die opeenvolgend samen ten minste 90% identiek zijn in aminozuursequentie aan lichte keten CDR's, CDR1, CDR2, en CDR3, opeenvolgend samen, die zijn omvat in de aminozuursequentie uiteengezet in SEQ ID NO: 83; of (c) een eerste CDR set van (a) en een tweede CDR set van (b). 15

2. Een monoklonaal antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit: (j) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 38 en SEQ ID NO: 40. 20

3. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan geselecteerd uit de groep bestaande uit: (j) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 38 en 25 SEQ ID NO: 40. 131

4. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende een eerste CDR sequentieset omvattende een eerste CDR1, eerste CDR2 en eerste CDR3 en een tweede CDR sequentieset omvattende een tweede CDRl, tweede CDR2 en tweede CDR3, waarin genoemde eerste 5 CDR set en genoemde tweede CDR set elk opeenvolgend samen ten minste 90% identiteit hebben met de CDRl, CDR2 en CDR3 sequenties, opeenvolgend samen, van: (k) SEQ ID NO:38 en SEQ ID N0:40, respectievelijk.

5 CDRl, CDR2, en CDR3, opeenvolgend samen, die zijn omvat in de aminozuursequentie uiteengezet in een van SEQ ID NOs: 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 83, 87 en 120; of (c) een eerste CDR set van (a) en een tweede CDR set van (b).

5. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende een eerste CDR sequentieset omvattende een eerste CDRl, eerste CDR2 en eerste CDR3 en een tweede CDR sequentieset omvattende een tweede CDRl, tweede CDR2 en tweede CDR3, waarin genoemde eerste CDR set en genoemde tweede CDR set elk de CDRl, CDR2 en CDR3 15 sequenties, opeenvolgend samen zijn, van: (k) SEQ ID NO:38 en SEQ ID NO:40, respectievelijk.

6. Een antilichaam geproduceerd door een cel hebbende ATCC Deposit Designation Number geselecteerd uit de groep bestaande uit PTA-6566,

7. Een monoklonaal antilichaam of een antigeenbindend gedeelte daarvan hebbende ten minste een eigenschap geselecteerd uit de groep 25 bestaande uit: 132 (a) wedijvert voor binding aan myostatine met een antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit :1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 5 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_lH-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; en 2_1I2_1H-L81M, L-F58I, I85V; en (b) bindt aan hetzelfde epitoop van myostatine als een antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 10 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_lH-L8lM, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V.

8. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan 15 dat specifiek myostatine bindt, waarin: (a) de zware keten de zware keten CDR1, CDR2 en CDR3 aminezuursequenties van een antilichaam omvat geselecteerd uit de groep bestaande uit: 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 20 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; (b) de lichte keten de lichte keten CDRl, CDR2 en CDR3 aminozuursequenties van een antilichaam omvat geselecteerd uit de groep 25 bestaande uit 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 133 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; of (c) het antilichaam een zware keten van (a) en een lichte keten van (b) omvat. 5

9. Een farmaceutische samenstelling omvattende een antilichaam of een antigeenbindend gedeelte volgens een van conclusies 1-8 en een farmaceutisch acceptabele drager.

10 SEQ ID NO: 4. (b) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 6 en SEQ ID NO: 8; (c) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de 15 variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 10 en SEQ ID NO: 12; (d) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 14 en SEQ ID NO: 16; 20 (e) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 18 en SEQ ID NO: 20; (f) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 22 en 25 SEQ ID NO: 24; 141 (g) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 26 en SEQ ID NO: 28; (h) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de 5 variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 30 en SEQ ID NO: 32; (i) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 34 en SEQ ID NO: 36; 10 (j) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 38 en SEQ ID NO: 40; (k) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 42 en

10. Een werkwijze omvattende de stap van het toedienen aan een patiënt van een antilichaam of een antigeenbindend gedeelte volgens een van conclusies 1-8 of de farmaceutische samenstelling van conclusie 9, waarin genoemd antilichaam, antigeenbindend gedeelte of farmaceutische samenstelling myostatine activiteit inhibeert, waarin genoemde patiënt het 15 nodig heeft spiermassa te laten toenemen, het promoten van skeletspierontwikkeling, het behandelen van een "muscle wasting"-ziekte of het versterken van skeletspiergroei.

11. Een geïsoleerde cellijn die een antilichaam of antigeenbindend 20 gedeelte volgens een van conclusies 1-8 produceert of de zware keten of lichte keten van genoemd antilichaam of genoemd antigeenbindend gedeelte.

12. Een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul omvattende een 25 nucleotidesequentie die codeert voor de zware keten of een antigeenbindend 134 gedeelte daarvan of de lichte keten of een antigeenbindend gedeelte daarvan van een antilichaam volgens een van conclusies 1-8.

13. Een werkwijze omvattende het toedienen aan een patiënt van een 5 antilichaam of een antigeenbindend gedeelte daarvan volgens een van conclusies 1-8, waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend gedeelte myostatineactiviteit inhibeert, waarin genoemde patiënt het nodig heeft glucosehomeostase te verbeteren, vetmassa te verminderen, insulinegevoeligheid toe te laten nemen, nierfunctie te verbeteren, 10 vetaccumulatie af te laten nemen, een ziekte of conditie gekarakteriseerd door botverlies, genoemde ziekte of conditie omvattende osteoporose, osteopenie, osteoarthritis en botfracturen te behandelen, te voorkomen of te inhiberen, metaboolsyndroom te behandelen, "muscle wasting" tegen te gaan door gedurige toediening van een glucocorticoid of een steroid 15 hormoon gedurende de tijd dat genoemde patiënt behandeling ondergaat met een glucocorticoid of een steroid hormoon.

14. Een werkwijze voor het reduceren van myostatineactiviteit in een patiënt die het nodig heeft omvattende het toedienen aan genoemde patiënt 20 van een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan volgens een van conclusies 1-8, waarin genoemd monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte myostatineactiviteit inhibeert.

15 Deposit Designation Number geselecteerd uit de groep bestaande uit PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, en PTA-6576; en (d) is een hybridomacellijn geselecteerd uit de groep bestaande uit ATCC Deposit Designation Numbers PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569,

15 SEQ ID NO: 44; and (l) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 115 en SEQ ID NO: 117.

15 NO:117.

15. Een werkwijze voor het omkeren van leeftijdsgerelateerde afname 25 in spiermassa in een patiënt die het nodig heeft omvattende het toedienen aan genoemde patiënt van een antilichaam of antigeenbindend gedeelte 135 volgens een van conclusies 1-8, waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend gedeelte myostatineactiviteit inhibeert.

16. Een zoogdier gastheercellijn omvattende polynucleotiden coderende 5 voor de zware en lichte ketens van een humaan, chimeer of gehumaniseerd monoklonaal antilichaam, waarin het antilichaam of gedeelte daarvan ten minste een eigenschap heeft geselecteerd uit de groep bestaande uit: (a) wedijvert voor binding aan myostatine met een antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit :1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 10 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; (b) bindt aan hetzelfde epitoop van myostatine als een antilichaam 15 geselecteerd uit de groep bestaande uit :1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46__1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; 20 (c) is een antilichaam dat dezelfde aminozuursequentie heeft als het antilichaam geproduceerd door een hybridomacel hebbende een ATCC Deposit Designation Number geselecteerd uit de groep bestaande uit PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, en PTA-6576; en 25 (d) is een hybridomacellijn geselecteerd uit de groep bestaande uit ATCC Deposit Designation Numbers PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, 136 PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, en PTA-6576.

17. Een werkwijze voor het bevorderen van spiergroei, gewichtstoename 5 of het helpen in de preventie van zwakte in vee, varkens, schapen, kippen, kalkoenen, paarden, vissen, honden en katten die het nodig hebben, omvattende de stap van toediening aan genoemde patiënt van een antilichaam of antigeenbindend gedeelte volgens een van conclusies 1-8, waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend gedeelte 10 myostatineactiviteit inhibeert.

18. Een monoklonaal antilichaam dat specifiek myostatine bindt omvattende de zware keten aminozuursequentie uiteengezet in SEQ ID NO: 115 en de lichte keten aminozuursequentie uiteengezet in SEQ ID

19. Een monoklonaal antilichaam of een antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende de variabele regio's omvat in SEQ ID NO:115 en SEQ ID NO: 117. 20

20 PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, en PTA- 6576.

20. Een monoklonaal antilichaam of een antigeenbindend gedeelte daarvan, dat specifiek myostatine bindt omvattende CDR's CDR1, CDR2, en CDR3 omvat in SEQ ID NO:115 en SEQ ID NO:117. 137

20 PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA- 6573, PTA-6574, PTA-6575, en PTA-6576.

21. Een humaan, chimeer of gehumaniseerd monoklonaal antilichaam of een antigeenbindend gedeelte daarvan dat specifiek bindt aan myostatine, waarin genoemd antlichaam of gedeelte selectief ten minste 50-maal meer myostatine bindt dan GDFll, en waarin genoemd antibchaam of gedeelte 5 myostatinebinding aan een activine type I of type II receptor inhibeert.

22. Een monoklonaal antilichaam of een antigeenbindend gedeelte daarvan hebbende ten minste een eigenschap geselecteerd uit de groep bestaande uit: 10 (a) wedijvert voor binding aan myostatine met een antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit :1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 15 2_112_1H-L81M, L-I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; en (b) bindt aan hetzelfde epitoop van myostatine als een antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 20 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_lL-I85V; 2_112_lH-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V.

23. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende 25 (a) een CDR set, CDR1, CDR2, en CDR3, die opeenvolgend samen ten minste 90% identiek zijn in aminozuursequentie aan zware keten CDR's, CDR1, CDR2, en CDR3, opeenvolgend samen, die zijn omvat in de 138 aminozuursequentie uiteengezet in een van SEQ ID NOs: 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77,81,85 en 118; (b) een CDR set, CDR1, CDR2, en CDR3, die opeenvolgend samen ten minste 90% identiek zijn in aminozuursequentie aan lichte keten CDR's,

24. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan dat specifiek myostatine bindt, waarin: (a) de zware keten de zware keten CDRl, CDR2 en CDR3 aminezuursequenties van een antilichaam omvat geselecteerd uit de groep bestaande uit: 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 15 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112__1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; (b) de lichte keten de lichte keten CDRl, CDR2 en CDR3 20 aminozuursequenties van een antilichaam omvat geselecteerd uit de groep bestaande uit 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_lH-L81M, 25 L-I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; of (c) het antilichaam een zware keten van (a) en een lichte keten van (b) omvat. 139

25. Een monoklonaal antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit: (a) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties uiteengezet in 5 SEQ ID NO: 2 en SEQ ID NO: 4. (b) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 6 en SEQ ID NO: 8; (c) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 10 en SEQ ID NO: 12; 10 (d) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 14 en SEQ ID NO: 16; (e) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 18 en SEQ ID NO: 20; (f) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties uiteengezet in 15 SEQ ID NO: 22 en SEQ ID NO: 24; (g) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 26 en SEQ ID NO: 28; (h) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 30 en SEQ ID NO: 32; 20 (i) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 34 en SEQ ID NO: 36; (j) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 38 en SEQ ID NO: 40; 140 (k) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 42 en SEQ ID NO: 44; en (l) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 115 en SEQ ID NO: 117. 5

26. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan geselecteerd uit de groep bestaande uit: (a) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte omvattende de variabele domein aminozuursequenties uiteengezet in SEQ ID NO: 2 en

27. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende een eerste CDR sequentieset omvattende een eerste CDRl, eerste CDR2 en eerste CDR3 en een tweede CDR sequentieset omvattende een tweede CDRl, tweede CDR2 en tweede CDR3, waarin genoemde eerste CDR set en genoemde tweede CDR set elk opeenvolgend samen ten minste 25 90% identiteit hebben met de CDRl, CDR2 en CDR3 sequenties, opeenvolgend samen, van: 142 (a) SEQ ID NO: 2 en SEQ ID NO: 4, respectievelijk; (b) SEQ ID NO: 6 en SEQ ID NO: 8, respectievelijk; (c) SEQ ID NO: 10 en SEQ ID NO: 12, respectievelijk; (d) SEQ ID NO: 14 en SEQ ID NO: 16, respectievelijk; 5 (e) SEQ ID NO: 18 en SEQ ID N0:20, respectievelijk; (f) SEQ ID NO:22 en SEQ ID NO:24, respectievelijk; (g) SEQ ID NO:26 en SEQ ID NO:28, respectievelijk; (h) SEQID NO:30 en SEQ ID NO:32, respectievelijk; (i) SEQ ID NO:34 en SEQ ID NO:36, respectievelijk; 10 (k) SEQ ID NO:38 en SEQ ID N0:40, respectievelijk; (l) SEQ ID NO:42 en SEQ ID NO:44, respectievelijk; en (m) SEQ ID NO:115 en SEQ ID NO:117, respectievelijk.

28. Een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan 15 omvattende een eerste CDR sequentieset omvattende een eerste CDR1, eerste CDR2 en eerste CDR3 en een tweede CDR sequentieset omvattende een tweede CDR1, tweede CDR2 en tweede CDR3, waarin genoemde eerste CDR set en genoemde tweede CDR set elk de CDR1, CDR2 en CDR3 sequenties, opeenvolgend samen zijn, van: 20 (a) SEQ ID NO: 2 en SEQ ID NO: 4, respectievelijk; (b) SEQ ID NO: 6 en SEQ ID NO: 8, respectievelijk; (c) SEQ ID NO: 10 en SEQ ID NO: 12, respectievelijk; 143 (d) SEQ ID NO: 14 en SEQ ID NO: 16, respectievelijk; (e) SEQ ID NO: 18 en SEQ ID N0:20, respectievelijk; (f) SEQ ID NO:22 en SEQ ID NO:24, respectievelijk; (g) SEQ ID NO:26 en SEQ ID NO:28, respectievelijk; 5 (h) SEQID N0:30 en SEQ ID NO:32, respectievelijk; (i) SEQ ID NO:34 en SEQ ID NO:36, respectievelijk; (k) SEQ ID NO:38 en SEQ ID N0:40, respectievelijk; (l) SEQ ID NO:42 en SEQ ID NO:44, respectievelijk; en (m) SEQ ID NO: 115 en SEQ ID NO: 117, respectievelijk. 10

29. Een monoklonaal antilichaam of een antigeenbindend gedeelte daarvan genoemd monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte bindt aan peptide 1 en peptide 5 gedeelten van myostatine, waarin peptide 1 de aminozuursequentie van SEQ ID NO: 103 omvat en peptide 5 de 15 aminozuursequentie van SEQ ID NO: 107 omvat.

30. Een antilichaam geproduceerd door een cel hebbende ATCC Deposit Designation Number geselecteerd uit de groep bestaande uit PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA- 20 6573, PTA-6574, PTA-6575, en PTA-6576. 144

31. Een farmaceutische samenstelling omvattende een antilichaam of een antigeenbindend gedeelte volgens een van conclusies 18-30 en een farmaceutisch acceptabele drager.

32. Een werkwijze omvattende de stap van het toedienen aan een patiënt van een antilichaam of een antigeenbindend gedeelte volgens een van conclusies 18-30 of de farmaceutische samenstelling van conclusie 31, waarin genoemd antilichaam, antigeenbindend gedeelte of farmaceutische samenstelling myostatine activiteit inhibeert, waarin genoemde patiënt het 10 nodig heeft spiermassa te laten toenemen, het promoten van skeletspierontwikkeling, het behandelen van een "muscle wasting"-ziekte of het versterken van skeletspiergroei.

33. Een geïsoleerde cellijn die een antilichaam of antigeenbindend 15 gedeelte volgens een van conclusies 18-30 produceert of de zware keten of lichte keten van genoemd antilichaam of genoemd antigeenbindend gedeelte.

34. Een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul omvattende een 20 nucleotidesequentie die codeert voor de zware keten of een antigeenbindend gedeelte daarvan of de lichte keten of een antigeenbindend gedeelte daarvan van een antilichaam volgens een van conclusies 18-30.

35. Een werkwijze omvattende het toedienen aan een patiënt van een 25 antilichaam of een antigeenbindend gedeelte daarvan volgens een van conclusies 18-30, waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend gedeelte 145 myostatineactiviteit inhibeert, waarin genoemde patiënt het nodig heeft glucosehomeostase te verbeteren, vetmassa te verminderen, insulinegevoeligheid toe te laten nemen, nierfunctie te verbeteren, vetaccumulatie af te laten nemen, een ziekte of conditie gekarakteriseerd 5 door botverlies, genoemde ziekte of conditie omvattende osteoporose, osteopenie, osteoarthritis en botfracturen te behandelen, te voorkomen of te inhiberen, metaboolsyndroom te behandelen, "muscle wasting" tegen te gaan door gedurige toediening van een glucocorticoid of een steroid hormoon gedurende de tijd dat genoemde patiënt behandeling ondergaat 10 met een glucocorticoid of een steroid hormoon.

36. Een werkwijze voor het reduceren van myostatineactiviteit in een patiënt die het nodig heeft omvattende het toedienen aan genoemde patiënt van een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan 15 volgens een van conclusies 18-30, waarin genoemd monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte myostatineactiviteit inhibeert.

37. Een werkwijze voor het omkeren van leeftijdsgerelateerde afname in spiermassa in een patiënt die het nodig heeft omvattende het toedienen 20 aan genoemde patiënt van een antilichaam of antigeenbindend gedeelte volgens een van conclusies 18-30, waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend gedeelte myostatineactiviteit inhibeert.

38. Een zoogdier gastheercellijn omvattende polynucleotiden coderende 25 voor de zware en lichte ketens van een humaan, chimeer of gehumaniseerd monoklonaal antilichaam, waarin het antilichaam of gedeelte daarvan ten minste een eigenschap heeft geselecteerd uit de groep bestaande uit: 146 (a) wedijvert voor binding aan myostatine met een antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit :1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1J268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 5 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2JL12_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; (b) bindt aan hetzelfde epitoop van myostatine als een antilichaam geselecteerd uit de groep bestaande uit :1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 10 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_lH-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; en 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; (c) is een antilichaam dat dezelfde aminozuursequentie heeft als het antilichaam geproduceerd door een hybridomacel hebbende een ATCC

39. Een werkwijze voor het bevorderen van spiergroei, gewichtstoename of het helpen in de preventie van zwakte in vee, varkens, schapen, kippen, 25 kalkoenen, paarden, vissen, honden en katten die het nodig hebben, omvattende de stap van toediening aan genoemde patiënt van een antilichaam of antigeenbindend gedeelte volgens een van conclusies 18-30, 147 waarin genoemd antilichaam of antigeenbindend gedeelte myostatineactiviteit inhibeert.