JP2008539241A - ミオスタチンに対する抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ミオスタチンに結合し、かつミオスタチンを阻害するように機能する、ヒト抗体およびその抗原結合部分を含む、抗体に関する。本発明はまた、ヒト抗ミオスタチン抗体およびその抗原結合部分にも関する。本発明はまた、キメラ抗体、二重特異性抗体、誘導体化抗体、単鎖抗体、または融合タンパク質の一部分である抗体にも関する。本発明はまた、ヒト抗ミオスタチン抗体に由来する、単離された重鎖および軽鎖免疫グロブリン、ならびにそのような免疫グロブリンをコードする核酸分子にも関する。本発明はまた、ヒト抗ミオスタチン抗体を作製する方法、これらの抗体を含む組成物、ならびに診断および治療のためにそれらの抗体および組成物を使用する方法にも関する。本発明はまた、ヒト抗ミオスタチン抗体を含む重および/または軽免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を使用する、遺伝子冶療方法も提供する。本発明はまた、本発明の核酸分子を含むトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物にも関する。

Description

発明の背景
ミオスタチン(mstn、増殖分化因子-8またはGDF-8)が骨格筋成長を抑制的に調節することを示唆する証拠が増えつつある。例えば、小児のミオスタチン無発現変異は、いかなる明らかな異常も伴わない著しい筋肥大に関連付けられている(Schuelke et al. (2004) Myostatin Mutation Associated with Gross Muscle Hypertrophy in a Child. New Engl. J. Med. 350：2682-8)。筋肉ミオスタチンタンパク質レベルと骨格筋質量との負の相関もまた、実証されている(Schulte, J.N.およびYarasheski, K.E. (2001). Effects of resistance training on the rate of muscle protein synthesis in frail elderly people. Int. J. Sport Nutr. Exerc. Metab. 11 Suppl：S111-820; Walker KS et al. (2004) Resistance training alters plasma myostatin but not IGF-1 in healthy men. Med Sci Sports Exerc. 36(5)：787-93.)。例えば、筋肉ミオスタチンレベルの発現は加齢に伴って増大し、かつミオスタチン発現の増大は、HIV感染患者における筋萎縮の一因となることも示された(Gonzalez-cadavid et al. (1998)Organization of the human myostatin gene and expression in healthy men and HIV-infected men with muscle wasting. PNAS 95：14938-4321)。さらに、ミオスタチンレベルの上昇は、高齢者集団において見出されている(Yarasheski KE et al.,(2002)Serum myostatin-immunoreactive protein is increased in 60-92 year old women and men with muscle wasting. J Nutr. Health Aging. 6(5)：343-8)。ミオスタチン欠損マウスの骨塩量が増加しているように、ミオスタチンは骨質量にも影響する(Hamrick et al.,(2003)Bone Architecture and Disc Degeneration in the Lumbar Spine of Mice Lacking GDF-8(Myostatin). J. Orthopaedic Res. 21 ：1025-1032(およびその中の参考文献))。
循環血中のミオスタチンに対する抗体は、2型糖尿病のマウスモデルにおいて筋肉質量の増加を引き起こし、かつグルコース恒常性を改善させることが示された。中和抗体の腹腔内注射によってミオスタチンを阻害すると、肥満の糖尿病マウスにおいて、骨格筋質量は増加し、空腹時血糖は低下し、かつグルコース感受性は改善する(Li X. et al. (2002)Inhibition of myostatin increases muscle mass and improves glucose sensitivity in obese, diabetic mice. Poster #224、Keystone Symposia：Diabetes Mellitus：Molecular Mechanisms, Genetics and New Therapies)。さらに、Aｙ/aマウスは、インスリン抵抗性を示すことが公知であり、2型糖尿病のモデルとして使用されている。ミオスタチンの遺伝子座を除去して、Aｙ/aマウスからミオスタチンを欠失させた場合、これらのマウスでは、給餌されたグルコースのレベルおよびインスリンレベルは正常であり、かつ、外因性のグルコース負荷後のグルコースレベルは、正常なAｙ/aマウスと比べて劇的に低い(McPherron et al. (2002)J.Clin.Invest. 109：595-601)。
ミオスタチンに関連する有害な筋肉、骨、および代謝の欠陥を考慮すれば、ミオスタチンに特異的であり、かつミオスタチン活性を低下させることによって状態を予防または治療する治療物質としての抗体、ならびにミオスタチン活性を低下させる治療を必要としている個体を同定するための診断用物質としての抗体が緊急に必要とされている。
発明の概要
本発明は、抗ミオスタチン抗体、それらをコードする核酸、抗体を作製するためのベクターおよび宿主細胞、抗体を含む組成物およびキット、ならびに抗体を作製および使用する方法を提供する。以下の番号を付けた項において説明する本発明の様々な態様が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
1.ミオスタチンに特異的に結合する、ヒトモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、もしくはヒト化モノクローナル抗体、またはそれらの抗原結合部分。
2.ミオスタチンがヒトミオスタチンである、項1記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分。
3.GDF11よりも少なくとも50倍、選択的にミオスタチンに結合する、項1記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分。
4.アクチビンのI型受容体またはII型受容体に結合するミオスタチンを阻害する、項3記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分。
5.以下からなる群より選択される少なくとも1種の特性を有する、項1記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分：
(a)ミオスタチンに結合する際に、以下からなる群より選択される抗体と競合する;
Figure 2008539241
(b)以下からなる群より選択される抗体と同じミオスタチンエピトープに結合する;
Figure 2008539241
(c)以下からなる群より選択される抗体と実質的に同じKDでミオスタチンに結合する;
Figure 2008539241
ならびに
(d)以下からなる群より選択される抗体と実質的に同じオフレートでミオスタチンに結合する。
Figure 2008539241
6.以下を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(a)SEQ ID NO：45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、および118のいずれか1つにおいて示されるアミノ酸配列に含まれている、順番に並んだ(sequentially together)重鎖CDR、すなわちCDR1、CDR2、およびCDR3とアミノ酸配列が少なくとも90％一致する、順番に並んだCDRセット、すなわちCDR1、CDR2、およびCDR3;
(b)SEQ ID NO：47、51、55、59、63、67、71、75、83、87、および120のいずれか1つにおいて示されるアミノ酸配列に含まれている、順番に並んだ軽鎖CDR、すなわちCDR1、CDR2、およびCDR3とアミノ酸配列が少なくとも90％一致する、順番に並んだCDRセット、すなわちCDR1、CDR2、およびCDR3;または
(c)(a)の第1のCDRセット、および(b)の第2のCDRセット。
7.抗体が、SEQ ID NO：45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、および118のいずれか1つにおいて示されるアミノ酸配列に含まれている、順番に並んだ重鎖CDR、すなわちCDR1、CDR2、およびCDR3とアミノ酸配列が少なくとも90％一致する、順番に並んだ重鎖CDR、すなわちCDR1、CDR2、およびCDR3を含む、項1記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
8.抗体が、SEQ ID NO：47、51、55、59、63、67、71、75、83、87、および120のいずれか1つにおいて示されるアミノ酸配列に含まれている、順番に並んだ軽鎖CDR、すなわちCDR1、CDR2、およびCDR3とアミノ酸配列が少なくとも90％一致する、順番に並んだ軽鎖CDR、すなわちCDR1、CDR2、およびCDR3を含む、項1記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
9.SEQ ID NO：45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、または118のいずれか1つにおいて存在する重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む、項1記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分。
10.SEQ ID NO：47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、または120のいずれか1つにおいて存在する軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む、項1記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分。
11.ヒトVH1-02遺伝子、ヒトVH3-21遺伝子、またはヒトVH3-23遺伝子を使用する重鎖を含む、項1記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分。
12.ヒトVκL2遺伝子、ヒトVκA3遺伝子、またはヒトVκA30遺伝子を使用する軽鎖を含む、項1記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分。
13.SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、または115のいずれか1つにおけるVHドメインとアミノ酸配列が少なくとも90％一致するVHドメインを含む、項1記載のモノクローナル抗体。
14.SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、または117のいずれか1つにおけるVLドメインとアミノ酸配列が少なくとも90％一致するVLドメインを含む、項1記載のモノクローナル抗体。
15.ミオスタチンに特異的に結合する、項1記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分であって、
(a)重鎖が、以下からなる群より選択される抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3アミノ酸配列を含み;
Figure 2008539241
(b)軽鎖が、以下からなる群より選択される抗体の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3アミノ酸配列を含み;
Figure 2008539241
または、
(c)抗体が(a)の重鎖および(b)の軽鎖を含む、
モノクローナル抗体または抗原結合部分。
16.SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、または117のいずれか1つにおける可変ドメインとアミノ酸配列が少なくとも90％一致するVLドメインをさらに含む、項12記載のモノクローナル抗体。
17.以下からなる群より選択されるモノクローナル抗体：
(a)SEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：4において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
(b)SEQ ID NO：6およびSEQ ID NO：8において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
(c)SEQ ID NO：10およびSEQ ID NO：12において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
(d)SEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：16において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
(e)SEQ ID NO：18およびSEQ ID NO：20において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
(f)SEQ ID NO：22およびSEQ ID NO：24において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
(g)SEQ ID NO：26およびSEQ ID NO：28において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
(h)SEQ ID NO：30およびSEQ ID NO：32において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
(i)SEQ ID NO：34およびSEQ ID NO：36において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
(j)SEQ ID NO：38およびSEQ ID NO：40において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
(k)SEQ ID NO：42およびSEQ ID NO：44において示されるアミノ酸配列を含む抗体;ならびに
(l)SEQ ID NO：115およびSEQ ID NO：117において示されるアミノ酸配列を含む抗体。
18.以下からなる群より選択されるモノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(a)SEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：4において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
(b)SEQ ID NO：6およびSEQ ID NO：8において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
(c)SEQ ID NO：10およびSEQ ID NO：12において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
(d)SEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：16において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
(e)SEQ ID NO：18およびSEQ ID NO：20において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
(f)SEQ ID NO：22およびSEQ ID NO：24において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
(g)SEQ ID NO：26およびSEQ ID NO：28において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
(h)SEQ ID NO：30およびSEQ ID NO：32において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
(i)SEQ ID NO：34およびSEQ ID NO：36において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
(j)SEQ ID NO：38およびSEQ ID NO：40において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
(k)SEQ ID NO：42およびSEQ ID NO：44において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;ならびに
(l)SEQ ID NO：115およびSEQ ID NO：117において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分。
19.第1のCDR1、第1のCDR2、および第1のCDR3を含む第1のCDR配列セット、ならびに第2のCDR1、第2のCDR2、および第2のCDR3を含む第2のCDR配列セットを含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該第1のCDRセットおよび該第2のCDRセットが、それぞれ順番に並んで、以下の、順番に並んだCDR1、CDR2、およびCDR3配列と少なくとも90％一致する、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(a)それぞれSEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：4;
(b)それぞれSEQ ID NO：6およびSEQ ID NO：8;
(c)それぞれSEQ ID NO：10およびSEQ ID NO：12;
(d)それぞれSEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：16;
(e)それぞれSEQ ID NO：18およびSEQ ID NO：20;
(f)それぞれSEQ ID NO：22およびSEQ ID NO：24;
(g)それぞれSEQ ID NO：26およびSEQ ID NO：28;
(h)それぞれSEQ ID NO：30およびSEQ ID NO：32;
(i)それぞれSEQ ID NO：34およびSEQ ID NO：36;
(j)それぞれSEQ ID NO：38およびSEQ ID NO：40;
(k)それぞれSEQ ID NO：42およびSEQ ID NO：44;ならびに
(l)それぞれSEQ ID NO：115およびSEQ ID NO：117。
20.第1のCDR1、第1のCDR2、および第1のCDR3を含む第1のCDR配列セット、ならびに第2のCDR1、第2のCDR2、および第2のCDR3を含む第2のCDR配列セットを含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該第1のCDRセットおよび該第2のCDRセットが、それぞれ、以下の、順番に並んだCDR1、CDR2、およびCDR3配列である、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(a)それぞれSEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：4;
(b)それぞれSEQ ID NO：6およびSEQ ID NO：8;
(c)それぞれSEQ ID NO：10およびSEQ ID NO：12;
(d)それぞれSEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：16;
(e)それぞれSEQ ID NO：18およびSEQ ID NO：20;
(f)それぞれSEQ ID NO：22およびSEQ ID NO：24;
(g)それぞれSEQ ID NO：26およびSEQ ID NO：28;
(h)それぞれSEQ ID NO：30およびSEQ ID NO：32;
(i)それぞれSEQ ID NO：34およびSEQ ID NO：36;
(k)それぞれSEQ ID NO：38およびSEQ ID NO：40;
(l)それぞれSEQ ID NO：42およびSEQ ID NO：44;ならびに
(m)それぞれSEQ ID NO：115およびSEQ ID NO：117。
21.SEQ ID NO：115において示される重鎖アミノ酸配列、およびSEQ ID NO：117において示される軽鎖アミノ酸配列を含む、ミオスタチンに特異的に結合するモノクローナル抗体。
22.SEQ ID NO：115およびSEQ ID NO：117に含まれる可変領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
23.SEQ ID NO：115およびSEQ ID NO：117に含まれるCDR、すなわちCDR1、CDR2、およびCDR3を含む、ミオスタチンに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
24.ミオスタチンのペプチド1部分およびペプチド5部分に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、ペプチド1がSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を含み、かつペプチド5がSEQ ID NO：107のアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
25.PTA-6566、PTA-6567、PTA-6568、PTA-6569、PTA-6570、PTA-6571、PTA-6572、PTA-6573、PTA-6574、PTA-6575、およびPTA-6576からなる群より選択されるATCC寄託指定番号を有する細胞によって産生される抗体。
26.項1〜25のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
27.少なくとも1種の治療物質をさらに含む、項26記載の薬学的組成物。
28.項1〜25のいずれか一項記載の抗体もしくは抗原結合部分、または項26記載の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む方法であって、該抗体、抗原結合部分、または薬学的組成物がミオスタチン活性を阻害し、該対象が、筋肉質量を増加させること、骨格筋発達を促進すること、筋萎縮障害を治療すること、または骨格筋成長を亢進することを必要としている、方法。
29.項1〜25のいずれか一項記載の抗体もしくは抗原結合部分、または該抗体もしくは該抗原結合部分の重鎖もしくは軽鎖を産生する、単離された細胞株。
30.項1〜25のいずれか一項記載の抗体の重鎖もしくはその抗原結合部分または軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
31.核酸分子に機能的に連結された発現制御配列を任意で含む、項30記載の核酸分子を含むベクター。
32.項31記載のベクターまたは項30記載の核酸分子を含む宿主細胞。
33.抗ミオスタチン抗体またはその抗原結合部分を作製するための方法であって、項32記載の宿主細胞または項29記載の細胞株を適切な条件下で培養する段階、および該抗体または抗原結合部分を回収する段階を含む、方法。
34.染色体上または染色体外のいずれかに項30記載の核酸を有し、該核酸を発現する、非ヒトトランスジェニック生物。
35.ミオスタチンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を単離するための方法であって、項34記載の非ヒトトランスジェニック生物から抗体を単離する段階を含む、方法。
36.以下の段階を含む、ミオスタチンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を用いて、治療を必要とする対象を治療するための方法：
(a)項30記載の単離された核酸分子の有効量を該対象に投与する段階;および
(b)該核酸分子を発現させる段階。
37.以下の段階を含む、ミオスタチンに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を作製するための方法：
(a)ヒト抗体を産生することができる非ヒトトランスジェニック動物を、ミオスタチン、ミオスタチンの免疫原性部分、またはミオスタチンを発現する細胞もしくは組織で免疫化する段階;
(b)非ヒトトランスジェニック動物に、ミオスタチンに対する免疫応答を開始させる段階;
(c)非ヒトトランスジェニック動物からBリンパ球を単離する段階;および
(d)該単離したBリンパ球から、ミオスタチンに特異的に結合するモノクローナル抗体を単離する段階。
38.項37記載の方法によって作製される、単離された抗体。
39.アクチビンのII型受容体またはII B型受容体を発現する細胞へのミオスタチンの結合を阻害するための方法であって、ミオスタチンを、ミオスタチン活性を阻害する項1〜25のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分と接触させる段階を含む、方法。
40.筋芽細胞の増殖を増加させるための方法であって、筋芽細胞およびミオスタチンを含む組成物を、ミオスタチン活性を阻害する項1〜25のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分と接触させる段階を含む、方法。
41.ミオスタチン活性を阻害する項1〜25のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与する段階を含む方法であって、該対象が、グルコース恒常性を改善すること、体脂肪量を減少させること、インスリン感受性を上昇させること、腎機能を改善すること、脂肪蓄積を減少させること、骨粗しょう症、骨減少症、変形性関節症、および骨折を含む骨量減少を特徴とする疾患もしくは状態を治療、予防、もしくは抑制すること、代謝症候群を治療すること、または該対象が糖質コルチコイドもしくはステロイドホルモンを用いた治療を受けている期間中に糖質コルチコイドもしくはステロイドホルモンの持続的投与に起因する筋萎縮に対抗することを必要としている、方法。
42.ミオスタチン活性を阻害する項1〜25のいずれか一項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を対象に投与する段階を含む、それを必要としている該対象においてミオスタチン活性を低下させるための方法。
43.ミオスタチン活性を阻害する項1〜25のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分を対象に投与する段階を含む、それを必要としている該対象において加齢に伴う筋肉質量の減少を逆転させるための方法。
44.ミオスタチン活性を阻害する項1〜25のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分を対象に投与する段階を含む、それを必要としている該対象において筋芽細胞の増殖および分化を亢進させるための方法。
45.ミオスタチン活性を阻害する項1〜25のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分を対象に投与する段階を含む、それを必要としている該対象において、ミオスタチンによって誘導される、アクチビンのIIA型またはIIB型膜受容体を介した細胞シグナル伝達を減少させるための方法。
46.ミオスタチン活性を阻害する項1〜25のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分を対象に投与する段階を含む、それを必要としている該対象において、アクチビンI型膜受容体のミオスタチンを介した活性化を減少させるための方法。
47.ミオスタチン活性を阻害する項1〜18のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分を対象に投与する段階を含む、それを必要としている該対象において、Smad2およびSmad3からなる群より選択される1種または複数種のR-smadタンパク質のミオスタチンを介したリン酸化を減少させるための方法。
48.ミオスタチン活性を阻害する項1〜25のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分を対象に投与する段階を含む、それを必要としている該対象において、myoD、myf5、およびミオゲニンからなる群より選択される遺伝子の発現を増大させるための方法。
49.ミオスタチン活性を阻害する項1〜25のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分を対象に投与する段階を含む、それを必要としているウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、魚、イヌ、およびネコにおいて、筋肉成長、体重増加を促進するか、または脆弱化の予防を援助するための方法。
50.以下からなる群より選択されるモノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(a)SEQ ID NO：45およびSEQ ID NO：47において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合部分;
(b)SEQ ID NO：49およびSEQ ID NO：51において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合部分;
(c)SEQ ID NO：53およびSEQ ID NO：55において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合部分;
(d)SEQ ID NO：57およびSEQ ID NO：59において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合部分;
(e)SEQ ID NO：61およびSEQ ID NO：63において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合部分;
(f)SEQ ID NO：65およびSEQ ID NO：67において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合部分;
(g)SEQ ID NO：69およびSEQ ID NO：71において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合部分;
(h)SEQ ID NO：73およびSEQ ID NO：75において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合部分;
(i)SEQ ID NO：77およびSEQ ID NO：79において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合部分;
(j)SEQ ID NO：81およびSEQ ID NO：83において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合部分;ならびに
(k)SEQ ID NO：85およびSEQ ID NO：87において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合部分;ならびに
(l)SEQ ID NO：118およびSEQ ID NO：120において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合部分。
51.ミオスタチン活性を阻害する項1〜25のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分を対象に投与する段階を含む、それを必要としている該対象において、代謝症候群を治療する方法。
52.ミオスタチンに結合する際に、以下からなる群より選択される少なくとも1種の特性を有する抗体またはその抗原結合部分と競合するヒトモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、哺乳動物宿主細胞株：
(a)ミオスタチンに結合する際に、以下からなる群より選択される抗体と競合する;
Figure 2008539241
(b)以下からなる群より選択される抗体と同じミオスタチンエピトープに結合する;
Figure 2008539241
(c)以下からなる群より選択される抗体と実質的に同じKDでミオスタチンに結合する;
Figure 2008539241
ならびに
(d)以下からなる群より選択される抗体と実質的に同じオフレートでミオスタチンに結合する。
Figure 2008539241
53.ミオスタチンに結合する際に、以下を含む抗体と競合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、哺乳動物宿主細胞株：
(a)ヒトVH1-02遺伝子、ヒトVH3-21遺伝子、またはヒトVH3-23遺伝子を使用する重鎖;および
(b)ヒトVκL2遺伝子、ヒトVκA3遺伝子、またはヒトVκA30遺伝子を使用する軽鎖。
54.PTA-6566、PTA-6567、PTA-6568、PTA-6569、PTA-6570、PTA-6571、PTA-6572、PTA-6573、PTA-6574、PTA-6575、およびPTA-6576からなる群より選択されるATCC寄託指定番号を有するハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体と同じアミノ酸配列を有する、モノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の抗原結合部分の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、哺乳動物宿主細胞株。
55.PTA-6566、PTA-6567、PTA-6568、PTA-6569、PTA-6570、PTA-6571、PTA-6572、PTA-6573、PTA-6574、PTA-6575、およびPTA-6576からなる群より選択されるATCC寄託指定番号を有するハイブリドーマ細胞によって産生される抗体と同じアミノ酸配列を有する抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、哺乳動物宿主細胞株。
56.項52〜55のいずれか一項記載の哺乳動物宿主細胞株においてヒトモノクローナル抗体を発現させる段階、および該ヒトモノクローナル抗体を回収する段階を含む方法。
57.ATCC寄託指定番号PTA-6566、PTA-6567、PTA-6568、PTA-6569、PTA-6570、PTA-6571、PTA-6572、PTA-6573、PTA-6574、PTA-6575、およびPTA-6576からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株。
58.ヒトモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む哺乳動物宿主細胞株であって、該抗体またはその一部分が、以下からなる群より選択される少なくとも1種の特性を有する、哺乳動物宿主細胞株：
(a)ミオスタチンに結合する際に、以下からなる群より選択される抗体と競合する;
Figure 2008539241
(b)以下からなる群より選択される抗体と同じミオスタチンエピトープに結合する;
Figure 2008539241
(c)PTA-6566、PTA-6567、PTA-6568、PTA-6569、PTA-6570、PTA-6571、PTA-6572、PTA-6573、PTA-6574、PTA-6575、およびPTA-6576からなる群より選択されるATCC寄託指定番号を有するハイブリドーマ細胞によって産生される抗体と同じアミノ酸配列を有する抗体である;ならびに
(d)ATCC寄託指定番号PTA-6566、PTA-6567、PTA-6568、PTA-6569、PTA-6570、PTA-6571、PTA-6572、PTA-6573、PTA-6574、PTA-6575、およびPTA-6576からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株である。
発明の詳細な説明
定義および一般的技術
本明細書において他に規定されない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈において特に指示がない限り、単数形の用語は複数形を含ものとし、かつ、複数形の用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書において説明する、細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される用語、およびそれらの技術は、当技術分野において周知であり、かつ一般に使用されるものである。
本発明の方法および技術は、一般に、当技術分野において周知である従来の方法に従って、かつ別段の定めが無い限り、本明細書の全体にわたって引用および考察される様々な一般的参考文献およびより具体的な参考文献において記載されているようにして、実施される。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook et al. Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)、ならびにAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates(1992)、ならびにHarlowおよびLane Antibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)を参照されたい。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、当技術分野において一般に遂行されているように、または本明細書において説明するようにして、実施する。本明細書において説明する分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および製薬化学に関連して使用される用語、ならびにそれらの実験室での手順および技術は、当技術分野において周知であり、かつ一般に使用されるものである。標準的な技術が、化学合成、化学分析、医薬品の調製、調剤、および送達、ならびに患者の治療のために使用される。
以下の用語は、別段の定めが無い限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
「ポリペプチド」という用語は、ネイティブなタンパク質または人工タンパク質、タンパク質断片、およびあるタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは、単量体またはポリマーでよい。
「単離されたタンパク質」、「単離されたポリペプチド」、または「単離された抗体」という用語は、その起源または由来源のおかげで、(1)ネイティブの状態では付随する、天然では結合される成分と結合していないか、(2)同じ種に由来する他のタンパク質を含まないか、(3)異なる種に由来する細胞によって発現されるか、または(4)天然では存在しない、タンパク質、ポリペプチド、または抗体である。したがって、化学合成されるか、または天然において起源である細胞とは異なる細胞系において合成されるポリペプチドは、天然では結合される成分から「単離」されると考えられる。また、当技術分野において周知のタンパク質精製技術を用いて、単離により、天然では結合される成分を実質的に含まない状態にタンパク質をすることもできる。
様々な態様において、単離された抗ミオスタチン抗体は、プロテインAによって精製されたもの(例えば実施例XVIを参照されたい)、ハイブリドーマもしくは他の細胞株によってインビトロで合成されたもの、および/またはトランスジェニックマウスに由来するヒト抗ミオスタチン抗体である。
タンパク質またはポリペプチドは、試料の少なくとも約60％〜75％が単一種のポリペプチドを示す場合、「実質的に純粋な」、「実質的に均質な」、または「実質的に精製された」状態である。ポリペプチドまたはタンパク質は、単量体または多量体でよい。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、典型的には、約50重量％、約60重量％、約70重量％、約80重量％、もしくは約90重量％、より普通には約95重量％のタンパク質試料を含み、かつ好ましくは、純度は99％を超える。タンパク質の純度または均質性は、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、続いて、当技術分野において周知の染色剤でゲルを染色した際の単一のポリペプチドバンドを可視化するような、当技術分野において周知のいくつかの手段によって示すことができる。特定の目的のためには、HPLCまたは当技術分野において周知の他の精製手段を用いることによって、より高い分解能を提供することができる。
本明細書において使用される「非ヒトトランスジェニック生物」という用語は、非ヒトトランスジェニック動物、植物、細菌、原生生物、または菌類を含む、任意の非ヒトトランスジェニックな個々の生物を意味する。
本明細書において使用される「ポリペプチド断片」という用語は、アミノ末端および/またはカルボキシ末端を欠失しているが、残存するアミノ酸配列が、天然の配列中の対応する位置と一致するポリペプチドを意味する。いくつかの態様において、断片のアミノ酸長は、少なくとも5、6、8、または10である。他の態様において、これらの断片のアミノ酸長は、少なくとも14、少なくとも20、少なくとも50、または少なくとも70、80、90、100、150、もしくは200である。
本明細書において使用される「ポリペプチド類似体」という用語は、あるアミノ酸配列の一部分と実質的に同一なセグメントを含み、かつ以下の特性のうち少なくとも1つを有するポリペプチドを意味する：(1)適切な結合条件下でのミオスタチンへの特異的結合、(2)ミオスタチンを阻害または活性化する能力。典型的には、ポリペプチド類似体は、ネイティブ配列に対して保存的なアミノ酸置換(または挿入もしくは欠失)を含む。類似体は、典型的には、少なくとも20または25のアミノ酸長、好ましくは少なくとも50、60、70、80、90、100、150、もしくは200、またはそれ以上のアミノ酸長であり、しばしば、完全長ポリペプチドと同じ長さでもよい。本発明のいくつかの態様は、生殖細胞系のアミノ酸配列からの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、または17個の置換を有する、ポリペプチド断片またはポリペプチド類似体抗体を含む。
特定の態様において、抗ミオスタチン抗体またはその抗原結合部分に対するアミノ酸置換は、(1)タンパク分解に対する感受性を低下させ、(2)酸化に対する感受性を低下させ、(3)タンパク質複合体を形成するための結合親和性を改変し、かつ(4)そのような類似体の他の物理化学的特性または機能特性を付与または変更するが、ミオスタチンへの特異的結合は引き続き保持する、置換である。類似体には、通常のペプチド配列以外の配列の様々な変異タンパク質が含まれ得る。例えば、単一または複数のアミノ酸置換、好ましくは保存的アミノ酸置換は、通常の配列中に、好ましくは、分子間接触を形成するドメインの外側のポリペプチドの部分中に、起こしてよい。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変えるべきではない。例えば、置換アミノ酸は、親配列中に存在する免疫グロブリン結合ドメインを構成する逆平行βシートを改変するべきでも、親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊すべきでもない。一般に、グリシンおよびプロリンは、逆平行βシートにおいて使用されないと考えられる。当技術分野において認識されているポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、参照により本明細書に組み入れられる、Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York(1984)); Introduction to Protein Structure(C. BrandenおよびJ. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991));ならびにThornton et al., Nature 354：105(1991)において記載されている。
非ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの特性に類似した特性を有する薬物として、製薬業界において一般に使用されている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体」または「ペプチドミメティック」と呼ばれている。参照により本明細書に組み入れられる、Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15：29(1986); VeberおよびFreidinger, TINS p.392(1985);ならびにEvans et al., J. Med. Chem. 30：1229(1987)。このような化合物は、しばしば、コンピュータによる分子モデリングを用いて開発される。治療的に有用なペプチドに構造的に類似したペプチド模倣体を用いて、同等の治療効果または予防効果を生み出すことができる。一般に、ペプチドミメティックは、ヒト抗体のような、典型的な(paradigm)ポリペプチド(すなわち、所望の生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド)と構造的に類似しているが、当技術分野において周知の方法によって、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(シスおよびトランス)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、および-CH2SO-からなる群より選択される結合によって任意で置換された、1つまたは2つのペプチド結合を有する。コンセンサス配列の1つまたは複数のアミノ酸を、同じタイプのD-アミノ酸(例えばL-リシンの代わりにD-リシン)で系統的に置換する方法も、より安定なペプチドを作製するために使用することができる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変種を含む制約されたペプチドは、当技術分野において公知の方法により(参照により本明細書に組み入れられる、RizoおよびGlerasch, Ann. Rev. Biochem. 61 ：387(1992))、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部のシステイン残基を加えることによって、作製することができる。
本発明に関して本明細書において「抗体」に言及する場合、その抗原結合部分もまた使用され得ることが、通常は理解される。抗原結合部分は、特異的結合の際に完全な抗体と競合する。一般には、Fundamental Immunology, Ch. 7(Paul, W., ed., 第2版、Raven Press, N.Y. (1989)(あらゆる目的のためにその全体が参照により組み入れられる)を参照されたい。抗原結合部分は、組換えDNA技術によって、または完全な抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって得ることができる。いくつかの態様において、抗原結合部分には、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、ならびに、ポリペプチドに特異的な抗原結合を与えるのに十分な抗体の一部分を少なくとも含む、相補性決定領域(CDR)断片、単鎖抗体(scFv)、キメラ抗体、ダイアボディ、およびポリペプチドが含まれる。
N末端からC末端に向かって、成熟した軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインはいずれも、FR1領域、CDR1領域、FR2領域、CDR2領域、FR3領域、CDR3領域、およびFR4領域を順番に含む。本明細書において、各ドメインに対するアミノ酸の割付は、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987および1991))、 ChothiaおよびLesk, J. Mol .Biol. 196：901-917(1987)、またはChothia et al., Nature 342：878-883(1989)の定義に従っている。
本明細書において使用される場合、番号によって言及される抗体は、同じ番号のハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体と同じである。例えば、モノクローナル抗体2_112は、ハイブリドーマ2_112、または2_112_1および2_112_2などそのサブクローンから得られるものと同じ抗体である。唯一の例外は1_136_3であり、これは、サブクローン1_136_1および1_136_2に由来する異なるハイブリドーマである。
本明細書において使用される場合、Fd断片とは、VHドメインおよびCH1ドメインからなる抗体断片を意味し、Fv断片は、ある抗体の短腕のVLドメインおよびVHドメインからなり、dAb断片(Ward et al., Nature 341 ：544-546(1989))は、VHドメインからなる。
いくつかの態様において、抗体は、VLドメインおよびVHドメインが、単一のタンパク質鎖として作製されるのを可能にする合成リンカーを介して対となり、一価の分子を形成している、単鎖抗体(scFv)である。(Bird et al., Science 242：423-426(1988)およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-5883(1988))。いくつかの態様において、抗体は、ダイアボディ、すなわち、VHドメインおよびVLドメインが、単一のポリペプチド鎖上で発現されているが、同じ鎖の上の2つのドメイン間の対形成を可能にさせるには短すぎるリンカーを用いることにより、別の鎖の相補的ドメインとこれらのドメインの対形成を余儀なくさせ、2つの抗原結合部位を作り出した、二価の抗体である。(例えば、Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448(1993)および Poljak R.J. et al., Structure 2：1121-1123(1994)を参照されたい)。いくつかの態様において、本発明の抗体に由来する1つまたは複数のCDRを、共有結合的にまたは非共有結合的に、ある分子中に組み入れて、ミオスタチンに特異的に結合するイムノアドヘシンにそれを変えてもよい。このような態様において、CDRは、より大型のポリペプチド鎖の一部分として組み入れてもよく、別のポリペプチド鎖に共有結合的に連結してもよく、または非共有結合的に組み入れてもよい。さらに、フレームワーク領域(FR)は、1つもしくは複数のCDRの由来元である抗ミオスタチン抗体のうちの1つ、または1つもしくは複数の異なるヒト抗体に由来してよい。
1つまたは複数の結合部位を有する態様において、これらの結合部位は、互いに同一であるか、または異なるものでよい。
本明細書において使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、可変ドメインおよび定常ドメインの配列がヒト配列である任意の抗体を意味する。この用語は、ヒト遺伝子に由来する(すなわち、使用する)が、例えば、起こり得る免疫原性を減少させるように、親和性を高めるように、望ましくないフォールディングを引き起こす可能性があるシステインを排除するように変更された配列を有する抗体を包含する。この用語は、ヒト細胞では典型的ではないグリコシル化を与え得る、非ヒト細胞において組換えによって作製されたような抗体を包含する。これらの抗体は、後述するように、様々な方法で調製することができる。
本明細書において使用される「キメラ抗体」という用語は、2種またはそれ以上の異なる抗体に由来する領域を含む抗体を意味する。1つの態様において、キメラ抗体の1つまたは複数のCDRは、ヒト抗ミオスタチン抗体に由来する。別の態様において、CDRはすべて、ヒト抗ミオスタチン抗体に由来する。別の態様において、複数のヒト抗ミオスタチン抗体に由来するCDRが、キメラ抗体中で組み合わされる。例えば、キメラ抗体は、第1のヒト抗ミオスタチン抗体の軽鎖に由来するCDR1、第2のヒト抗ミオスタチン抗体の軽鎖に由来するCDR2、および第3のヒト抗ミオスタチン抗体の軽鎖に由来するCDR3を含んでよく、かつ、重鎖に由来するCDRは、1種または複数種の他の抗ミオスタチン抗体に由来してよい。さらに、フレームワーク領域は、1つもしくは複数のCDRの由来元である抗ミオスタチン抗体のうちの1つ、または1つもしくは複数の異なるヒト抗体に由来してよい。
いくつかの態様において、本発明のキメラ抗体は、ヒト化抗ミオスタチン抗体である。本発明のヒト化抗ミオスタチン抗体は、本発明の1つもしくは複数のヒト抗ミオスタチン抗体の、1つもしくは複数のフレーム領域のアミノ酸配列、および/または定常領域の少なくとも一部分に由来するアミノ酸配列を含み、かつさらに、非ヒト抗ミオスタチン抗体に由来する配列、例えばCDR配列も含む。
当業者は、本明細書の教示に従って、抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体を容易に調製することができる。断片または類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界の近くに存在する。構造ドメインおよび機能ドメインは、ヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列のデータを、公共または私有の配列データベースと比較することによって同定することができる。好ましくは、コンピュータによる比較方法を使用して、構造および/または機能が公知である他のタンパク質中に存在する配列モチーフまたは予測されるタンパク質の立体構造ドメインを同定する。公知の三次元構造にフォールディングするタンパク質配列を同定する方法は公知である。Bowie et al., Science 253：164(1991)を参照されたい。
「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書において使用される場合、例えばBIACORE(商標)システム(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, SwedenおよびPiscataway, N.J.)を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによりリアルタイムで生体分子特異的な相互作用を解析することを可能にする、光学的現象を意味する。さらに詳しい説明については、Johnsson U. et al., Ann. Biol. Clin. 51 ：19-26(1993); Jonsson U. et al., Biotechniques 11 ：620-627(1991); Jonsson B. et al., J. Mol. Recognit. 8：125-131(1995);およびJohnsson B. et al., Anal. Biochem. 198：268-277(1991)を参照されたい。
「KD」という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の平衡解離定数を意味する。
「オフレート」という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度定数を意味する。
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンもしくはT細胞受容体に特異的に結合することができるか、または別の方法で分子と相互作用することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープの決定基は、一般に、アミノ酸または炭水化物もしくは糖の側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、かつ一般に、特殊な三次元構造特性、ならびに特殊な電荷特性を有する。エピトープは、「直鎖状」または「立体構造的」でよい。直鎖状エピトープにおいて、タンパク質と(抗体のような)相互作用する分子との相互作用が起こる箇所はすべて、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在する。立体構造的エピトープにおいて、相互作用が起こる箇所は、互いに離れている、タンパク質上のアミノ酸残基にまたがって存在する。解離定数が1mM以下、好ましくは100nM以下、および最も好ましくは10nM以下である場合、抗体は抗原に特異的に結合するとされる。特定の態様において、KDは、1pM〜500pMである。他の態様において、KDは、500pM〜1μMの間である。他の態様において、KDは、1μM〜100nMの間である。他の態様において、KDは、100mM〜10nMの間である。抗原上の所望のエピトープが一旦決定されたら、例えば本発明において説明する技術を用いて、そのエピトープに対する抗体を作製することができる。あるいは、発見する過程において、抗体の作製および特徴付けにより、望ましいエピトープに関する情報が解明される場合もある。その場合、この情報から、同じエピトープへの結合に関して抗体を競合的にスクリーニングすることができる。これを実現するためのアプローチは、互いと競合的に結合する、例えば抗原に結合する際に競合する抗体を発見するための、交差競合研究を実施することである。交差競合に基づいて抗体を「ビニング」するためのハイスループットなプロセスは、国際特許出願WO03/48731に記載されている。
本明細書において使用される場合、20種の通常のアミノ酸およびそれらの略語は、従来の用法に従う。参照により本明細書に組み入れられる、Immunology - A Synthesis(第2版、 E.S. GolubおよびD.R.Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))を参照されたい。
本明細書において言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、長さが少なくとも10塩基のヌクレオチド、すなわちリボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのポリマー型、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型を意味する。この用語は、一本鎖型および二本鎖型を含む。
本明細書において使用される「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム起源、cDNA起源、もしくは合成起源のポリヌクレオチド、またはその何らかの組合せを意味し、この起源のおかげで、この「単離されたポリヌクレオチド」は、(1)天然には「単離されたポリヌクレオチド」と共に存在するポリヌクレオチドの全部もしくは一部分と結合していないか、(2)天然には結合していないポリヌクレオチドに機能的に連結されているか、または(3)より大型の配列の一部分として、天然には存在しない。
本明細書において使用される「天然のヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書において使用される「修飾されたヌクレオチド」という用語は、修飾された糖基または置換された糖基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書において言及される「オリゴヌクレオチド結合」という用語は、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホロアニリダート(phoshoraniladate)、およびホスホロアミダートなどのオリゴヌクレオチド結合を含む。例えば、開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14：9081(1986); Stec et al., J. Am. Chem.Soc. 106：6077(1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16：3209(1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6：539(1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach, pp. 87-108(F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England(1991));米国特許第5,151,510号; UhlmannおよびPeyman, Chemical Reviews 90：543(1990)を参照されたい。所望の場合は、オリゴヌクレオチドは、検出用のラベルを含んでよい。
「機能的に連結された」配列には、対象となる遺伝子に隣接している発現制御配列、およびトランスの位置または対象となる遺伝子を制御する距離で作用する発現制御配列の双方が含まれる。本明細書において使用される「発現制御配列」という用語は、それらが連結されているコード配列の発現およびプロセッシングを実施するのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列には、適切な転写開始配列、終始配列、プロモーター配列、およびエンハンサー配列;スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルなど効率的なRNAプロセッシングシグナル;細胞質内mRNAを安定させる配列;翻訳効率を高める配列(すなわちコザックコンセンサス配列);タンパク質の安定性を高める配列;ならびに、所望の場合には、タンパク質分泌を亢進させる配列が含まれる。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物では、このような制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含む。真核生物では、一般に、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現およびプロセッシングに不可欠であるすべての構成要素を少なくとも含むことが意図され、かつ、その存在が有利である付加的な構成要素、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も含み得る。
本明細書において使用される「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミド、すなわち、付加的なDNAセグメントを連結することができる、環状二本鎖DNAである。いくつかの態様において、ベクターは、付加的なDNAセグメントをウイルスゲノム中に連結することができる、ウイルスベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、導入された宿主細胞において自律複製をすることができる(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよび哺乳動物用エピソームベクター)。他の態様において、ベクター(例えば、哺乳動物用非エピソームベクター)は、宿主細胞中に導入された際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれることができ、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、機能的に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と呼ぶ。
「組換え宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)という用語は、本明細書において使用される場合、組換え発現ベクターが導入される細胞を意味する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」は、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の子孫も意味することを理解すべきである。いくつかの改変が、変異または環境の影響のいずれかの理由から、後続の世代において生じる場合があるため、このような子孫は、実際は、親細胞と同一でなくてもよいが、それでもなお、本明細書において使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
本明細書において言及される「選択的にハイブリダイズする」という用語は、検出可能に、かつ特異的に結合することを意味する。本発明によるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびそれらの断片は、非特異的な核酸への検出可能な結合の測定可能な量を最小化するハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー」または「高度にストリンジェント」な条件を用いて、当技術分野において公知であり、かつ本明細書において考察する、選択的ハイブリダイゼーション条件を実現することができる。「高ストリンジェンシー」または「高度にストリンジェント」な条件の一例は、1つのポリペプチド(メンブレンのような固体表面に貼り付けてよい)を別のポリペプチドと共に、6×SSPEまたはSSC、50％ホルムアミド、5×デンハート試薬、0.5％SDS、100μg/mlの変性させ断片化処理したサケ精子DNAのハイブリダイゼーション緩衝液中、42℃のハイブリダイゼーション温度で12〜16時間、インキュベーションし、次いで、1×SSC、0.5％SDSの洗浄緩衝液を用いて、55℃で2回洗浄することである。Sambrook et al.,前記、pp. 9.50-9.55も参照されたい。
核酸配列に関する、「配列一致率」という用語は、最大限一致するように位置合わせした場合に同じである、2つの配列中の残基を意味する。配列一致を比較する長さは、少なくとも約9ヌクレオチド、一般に少なくとも約18ヌクレオチド、より一般には少なくとも約24ヌクレオチド、典型的には少なくとも約28ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約32ヌクレオチド、および好ましくは少なくとも約36ヌクレオチド、48ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドのストレッチを超えてよい。ヌクレオチドの配列一致を測定するために使用することができる、当技術分野において公知であるいくつかの様々なアルゴリズムがある。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group(GCG), Madison, Wisconsin中のプログラムである、FASTA, Gap、またはBestfitを用いて比較することができる。例えば、プログラムFASTA2およびFASTA3を含む、FASTAは、クエリ配列とサーチ配列が最も良く重複する領域のアライメントおよび配列一致率を提供する(参照により本明細書に組み入れられる、Pearson, Methods Enzymol. 183：63-98(1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132：185-219(2000); Pearson, Methods Enzymol. 266：227-258(1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276：71-84(1998))。別段の指定が無い限り、個々のプログラムまたはアルゴリズムに対する初期設定パラメーターを使用する。例えば、核酸配列間の配列一致率は、参照により本明細書に組み入れられる、初期設定パラメーター(ワードサイズ6およびスコアリングマトリックスに対するNOPAM因子)を用いたFASTAによって、またはGCGバージョン6.1において提供される初期設定パラメーターを用いたGapによって、決定することができる。
ヌクレオチド配列への言及は、別段の指定が無い限り、その相補体を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸への言及は、その相補的配列を有する相補鎖も包含すると理解されるべきである。
本明細書において使用される場合、「配列一致率」および「配列相同率」という用語は同義的に使用される。
「実質的な類似性」または「実質的な配列類似性」という用語は、核酸またはその断片に言及する場合、適切なヌクレオチド挿入物または欠失物を別の核酸(もしくはその相補鎖)と最適に整列させた場合に、前述したようなFASTA、BLAST、またはGapなど任意の周知の配列一致アルゴリズムによって測定すると、少なくとも約85％、好ましくは少なくとも約90％、およびより好ましくは少なくとも約95％、約96％、約97％、約98％、または約99％のヌクレオチド塩基においてヌクレオチド配列が一致していることを意味する。
ポリペプチドに対して使用される場合、「実質的な一致」という用語は、2つのペプチド配列が、プログラムと共に提供される初期設定のギャップウェイトを用いたGAPプログラムまたはBESTFITプログラムなどによって最適に整列させた場合に、少なくとも70％、75％、または80％の配列一致、好ましくは少なくとも90％または95％の配列一致、およびより好ましくは少なくとも97％、98％、または99％の配列一致を有することを意味する。特定の態様において、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、化学特性(例えば電荷または疎水性)が同様である側鎖R基を有する別のアミノ酸残基によって置換されている置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変えないと考えられる。2つまたはそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列一致率が上昇するように調整して、置換の保存的性質を補正することができる。この調整を行うための手段は、当業者には周知である。例えば、Pearson, Methods Mol. Biol. 243：307-31(1994)を参照されたい。化学特性が同様である側鎖を有するアミノ酸のグループの例には、1)脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン;2)脂肪族-ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン;3)アミドを含む側鎖：アスパラギンおよびグルタミン;4)芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン;5)塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン;6)酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸;ならびに7)硫黄を含む側鎖：システインおよびメチオニン、が含まれる。保存的アミノ酸置換のグループは、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタマート-アスパルタート、およびアスパラギン-グルタミンである。
あるいは、保存的置換とは、参照により本明細書に組み入れられるGonnet et al., Science 256：1443-45(1992)において開示されているPAM250の対数尤度の行列において正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換とは、PAM250の対数尤度の行列において負でない値を有する任意の変化である。
ポリペプチドの配列一致は、典型的には、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠失、および他の改変に割り当てられた類似性の指標を用いて、配列を照合する。例えば、GCGは、「Gap」および「Bestfit」などのプログラムを含み、これらのプログラムによって指定されている初期設定のパラメーターを用いて使用して、異なる生物種に由来する相同ポリペプチドのような近縁のポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の、配列相同性または配列一致を決定することができる。例えば、GCGバージョン6.1(University of Wisconsin, WI)を参照されたい。ポリペプチド配列は、初期設定または推奨のパラメーターを用いてFASTAを使用して比較することもできる。GCGバージョン6.1を参照されたい。FASTA(例えば、FASTA2およびFASTA3)は、クエリ配列とサーチ配列が最も良く重複する領域のアライメントおよび配列一致率を提供する(Pearson, Methods Enzymol. 183：63-98(1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132：185-219(2000))。様々な生物に由来する多数の配列を含むデータベースと本発明の配列を比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、プログラムと共に供給される初期設定パラメーターを使用する、コンピュータプログラムBLAST、特にblastpまたはtblastnである。例えば、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215：403-410(1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25：3389-402(1997)を参照されたい。
相同性に関して比較されるポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約16アミノ酸残基、普通、少なくとも約20残基、より普通には少なくとも約24残基、典型的には少なくとも約28残基、および好ましくは約35残基を超える。多数の様々な生物に由来する配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比べることが好ましい。
本明細書において使用される場合、「標識する」または「標識される」という用語は、抗体中に別の分子を組み込むことを意味する。1つの態様において、標識は、検出可能なマーカー、例えば、放射性標識アミノ酸の組込み、またはマークを付けたアビジン(例えば、蛍光マーカー、または光学的方法もしくは比色法によって検出できる酵素活性を含むストレプトアビジン)によって検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの結合である。別の態様において、標識またはマーカーは、治療物質、例えば、薬物結合体または毒素でよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が、当技術分野において公知であり、使用することができる。ポリペプチドに対する標識の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない：放射性同位体または放射性核種(例えば、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、蛍光標識(例えば、FITC、ローダミン、ランタニド蛍光体)、酵素標識(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ)、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次的レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパーの対の配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)、ガドリニウムキレートのような磁性物質、百日咳毒素のような毒素、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体またはホモログ。いくつかの態様において、標識は、潜在的な立体障害を低減させるために、様々な長さのスペーサーアームによって結合される。
本明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む(comprise)」という単語、または「comprises」もしくは「comprising」などの変形は、記載した整数もしくは整数のグループを包含するが、いかなる他の整数も整数のグループも除外しないことを意味するものと理解される。
ヒト抗ミオスタチン抗体およびその特徴付け
本発明は、本明細書において抗ミオスタチン抗体を提供する。他の態様において、抗体はヒト抗体である。いくつかの態様において、抗体はヒト化抗体である。いくつかの態様において、ヒト抗ミオスタチン抗体は、ゲノムがヒト免疫グロブリン遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック動物、例えば、げっ歯動物を免疫化して、その結果、そのトランスジェニック動物にヒト抗体を産生させることによって作製される。
本発明の抗ミオスタチン抗体は、ヒトκ軽鎖もしくはヒトλ軽鎖またはそれらに由来するアミノ酸配列を含み得る。κ軽鎖を含むいくつかの態様において、軽鎖可変ドメイン(VL)は、ヒトA30、A3、またはL2 Vκ遺伝子を使用する。
いくつかの態様において、抗ミオスタチン抗体のVLは、生殖細胞系Vκアミノ酸配列と比べて、1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、または挿入(付加)を含む。いくつかの態様において、抗ミオスタチン抗体のVLは、生殖細胞系Vκアミノ酸配列と比べて、1個、2個、3個、4個、または5個のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、生殖細胞系からの1つまたは複数の置換は、軽鎖のCDR領域中に存在する。いくつかの態様において、生殖細胞系と比べてのVκアミノ酸置換は、本明細書において提供される抗体の任意の1つまたは複数のVL中に存在する生殖細胞系と比べての置換と同じ1つまたは複数の位置に存在する。例えば、本発明の抗ミオスタチン抗体のVLは、抗体1_257_1のVL中に存在する、生殖細胞系と比較しての1つまたは複数のアミノ酸置換を含み得る。また、抗体1_257_1と同じVκ遺伝子を使用する抗体1_116_1のVL中に存在する、生殖細胞系と比較しての1つまたは複数のアミノ酸置換もあってよい。いくつかの態様において、アミノ酸変化は、1つまたは複数の同じ位置にあるが、参照抗体とは異なる置換を含む。いずれの場合においても、ダッシュ記号付きの抗体クローンの列挙は、点付きの同じ抗体クローンと等しい(例えば、1_257_1=1.257.1)。
いくつかの態様において、生殖細胞系と比べてのアミノ酸置換は、抗体
Figure 2008539241
のVLのいずれかにおける生殖細胞系からの置換と同じ1つまたは複数の位置に存在するが、これらの置換は、そのような位置における、参照抗体中のアミノ酸と比べて保存的なアミノ酸置換に相当してよい。例えば、これらの抗体のうち1種中の特定の位置が生殖細胞系と比べて変更されており、かつそれがグルタマートである場合には、その位置をアスパルタートで置換することができる。同様に、例示的な抗体における生殖細胞系と比較してのアミノ酸置換がセリンである場合、その位置のセリンをトレオニンで保存的に置換することができる。本出願の全体を通して、保存的アミノ酸置換は上記に考察される。
いくつかの態様において、抗ミオスタチン抗体は、SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、および44からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列を含む。他の態様において、軽鎖は、抗体1_116_1L-Q45K;1_257_1L-L21I;2_112_1L-F58I;2_112_1L-I85V、または2_112_1L-F58I,I85Vの軽鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ヒト抗ミオスタチン抗体の軽鎖は、抗体
Figure 2008539241
のVLアミノ酸配列、または、1個、2個、3個、4個、もしくは5個までの保存的アミノ酸置換および/または合計3個までの非保存的アミノ酸置換を有する該アミノ酸配列を含む。他の態様において、ヒト抗ミオスタチン抗体の軽鎖は、抗体1_116_1L-Q45K;1_257_1L-L21I;2_112_1L-F58I;2_112_1L-I85V、または2_112_1L-F58I,I85VのVLアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、軽鎖は、前述の抗体のいずれか1つのCDR1の始端からCDR3の末端までのアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、軽鎖は、
Figure 2008539241
から選択される2種もしくはそれ以上のモノクローナル抗体の軽鎖CDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域からそれぞれ独立に選択されるCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域、または、3個未満もしくは2個未満の保存的アミノ酸置換および/または合計3個もしくはそれ以下の非保存的アミノ酸置換をそれぞれ有する該CDR領域のアミノ酸配列を含み得る。
特定の態様において、抗ミオスタチン抗体の軽鎖は、
Figure 2008539241
から選択される抗体の軽鎖CDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域、または、3個未満もしくは2個未満の保存的アミノ酸置換および/または合計3個もしくはそれ以下の非保存的アミノ酸置換をそれぞれ有する該CDR領域のアミノ酸配列を含む。
重鎖に関しては、いくつかの態様において、可変ドメイン(VH)は、ヒトVH1-02、VH3-21、またはVH3-23遺伝子を使用する。いくつかの態様において、抗ミオスタチン抗体のVH配列は、生殖細胞系VHアミノ酸配列と比べて、1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、または挿入(付加)、まとめて「変異」を含む。いくつかの態様において、重鎖の可変ドメインは、生殖細胞系のVHアミノ酸配列からの1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、または11個の変異を含む。いくつかの態様において、変異は、生殖細胞系のアミノ酸配列と比較しての非保存的置換である。いくつかの態様において、変異は、重鎖のCDR領域中にある。
いくつかの態様において、アミノ酸置換は、抗体
Figure 2008539241
の任意の1つまたは複数のVH中の、生殖細胞系からの置換と同じ1つまたは複数の位置に存在する。他の態様において、アミノ酸変化は、1つまたは複数の同じ位置にあるが、参照抗体とは異なる置換を含む。
いくつかの態様において、重鎖は、SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、および42からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。他の態様において、重鎖は、抗体1_314_1H-T92A;1_46_1H-L81M;または2_112_1H-I12Vの重鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、重鎖は、抗体
Figure 2008539241
のVHアミノ酸配列、または1個、2個、3個、4個、6個、8個、9個、10個、もしくは11個までの保存的アミノ酸置換および/または合計3個までの非保存的アミノ酸置換を有する該VHアミノ酸配列を含む。他の態様において、重鎖は、抗体1_314_1H-T92A;1_46_1H-L81M;または2_112_1H-I12VのVHアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、重鎖は、前述の抗体のいずれか1つのCDR1の始端からCDR3の末端までのアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、重鎖は、抗体
Figure 2008539241
の重鎖CDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域、または、8個未満、6個未満、4個未満、もしくは3個未満の保存的アミノ酸置換および/または合計3個もしくはそれ以下の非保存的アミノ酸置換をそれぞれ有する該CDR領域を含む。
いくつかの態様において、重鎖CDR領域は、抗体
Figure 2008539241
より選択される2種またはそれ以上の抗体のCDR領域から独立に選択される。別の態様において、抗体は、上記に開示される軽鎖および上記に開示される重鎖を含む。別の態様において、軽鎖CDRおよび重鎖CDRは、同じ抗体に由来する。
様々な態様において、抗ミオスタチン抗体は、本明細書において提供される抗ミオスタチン抗体の、完全長重鎖および完全長軽鎖のアミノ酸配列、VHおよびVLのアミノ酸配列、重鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3ならびに軽鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列、またはCDR1の始端からCDR3の末端までの重鎖アミノ酸配列およびCDR1の始端からCDR3の末端までの軽鎖アミノ酸配列を有する。
実施され得るアミノ酸置換の1つのタイプは、化学的に反応性であり得る、抗体中の1つもしくは複数のシステインを、非限定的にアラニンまたはセリンなどの別の残基に変更するものである。1つの態様において、非古典的(non-canonical)なシステインの置換が行われる。この置換は、可変ドメインのCDRもしくはフレームワーク領域中、または抗体の定常ドメイン中で行うことができる。いくつかの態様において、システインは、古典的である。
実施され得る別のタイプのアミノ酸置換は、抗体中の潜在的なタンパク質分解部位を除去するものである。このような部位は、可変ドメインのCDRもしくはフレームワーク領域中、または抗体の定常ドメイン中に存在し得る。システイン残基の置換およびタンパク質分解部位の除去により、抗体生成物中の異質性のリスクを低減し、したがってその均質性を高めることができる。別のタイプのアミノ酸置換は、潜在的なアミド分解部位を形成するアスパラギン-グリシンの対を、これらの残基の一方または両方を改変することによって除去するものである。
いくつかの態様において、本発明の抗ミオスタチン抗体の重鎖のC末端リシンは切断される。本発明の様々な態様において、抗ミオスタチン抗体の重鎖および軽鎖は、シグナル配列を任意で含み得る。
1つの局面において、本発明は、11種の阻害性ヒト抗ミオスタチンモノクローナル抗体およびそれらを産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。表1では、完全長の重鎖および軽鎖、ならびにそれらの鎖の一部分を含む可変ドメインをコードする核酸ならびに対応する推測された完全長アミノ酸配列の配列識別子(SEQ ID NO)を一覧にしている。
（表１）
Figure 2008539241
本発明はさらに、1つまたは複数のアミノ酸の改変を含む、前述のヒト抗ミオスタチン抗体のいくつかの重鎖変異体および/または軽鎖変異体も提供する。変異体に名前を付ける場合、1番目の文字は、天然の抗体鎖のアミノ酸を表す1文字の記号であり、番号は、アミノ酸の位置を指し(1位は、FRIのN末端アミノ酸である)、かつ2番目の文字は、変異アミノ酸を表す1文字の記号である。
本発明は、SEQ ID NO：4の45位にリシンを有する、1_116_1L-Q45Kと呼ばれるモノクローナル抗体1_116_1の軽鎖変異体を提供する。
別の軽鎖変異体は、SEQ ID NO：16の21位にイソロイシン残基を有する1_257_1L-L21Iである。
SEQ ID NO：18の92位にアラニン残基を有する、1_314_1H-T92Aと呼ばれるモノクローナル抗体1_314_1の重鎖変異体。
本発明はさらに、SEQ ID NO：22の81位にメチオニンを有する、1_46_1H-L81Mと呼ばれるモノクローナル抗体1_46_1の重鎖変異体も提供する。
本発明は、モノクローナル抗体2_112_1の重鎖変異体(I12V)ならびに2種の軽鎖変異体(F58IおよびI85V)を提供する。2_112_1H-I12Vと呼ばれる重鎖変異体は、SEQ ID NO：26の12位にバリンを有する。一方の軽鎖変異体である2_112_1L-F85Iは、SEQ ID NO：28の85位にイソロイシンを有する。2_112_1L-I85Vと呼ばれるもう一方の軽鎖変異体は、SEQ ID NO：28の85位にバリンを有する。本発明はまた、両方の変異を含む軽鎖変異体、すなわち2_112_1L-F85I,I85Vも提供する。本発明はまた、軽鎖変異の一方または両方を有する重鎖変異体を含む抗体、すなわち2_112_1H-I12V,L-F58I;2_112_1H-I12V,L-I85V;および2_112_1H-I12V,L-F58I,I85Vも含む。
さらに別の態様において、本発明は、前述のヒト抗ミオスタチン抗体のいずれかの可変ドメインアミノ酸配列に対する配列一致率が80％超、85％超、90％超、95％超、96％超、97％超、98％超、または99％超である可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体を含む。
抗ミオスタチン抗体のクラスおよびサブクラス
抗ミオスタチン抗体のクラスおよびサブクラスは、当技術分野において公知である任意の方法によって決定することができる。一般に、抗体のクラスおよびサブクラスは、特定のクラスおよびサブクラスの抗体に対して特異的である抗体を用いて決定することができる。このような抗体は、市販されている。クラスおよびサブクラスは、ELISA、またはウェスタンブロット、ならびに他の技術によって決定することができる。あるいは、クラスおよびサブクラスは、抗体の重鎖および/または軽鎖の定常ドメインの全体または一部分を配列決定し、それらのアミノ酸配列を、様々なクラスおよびサブクラスの免疫グロブリンの公知のアミノ酸配列と比較し、かつそれらの抗体のクラスおよびサブクラスを決定することによって、決定することができる。
いくつかの態様において、抗ミオスタチン抗体は、モノクローナル抗体である。抗ミオスタチン抗体は、IgG分子、IgM分子、IgE分子、IgA分子、またはIgD分子でよい。好ましい態様において、抗ミオスタチン抗体はIgGであり、かつIgG1、IgG2、IgG3、IgG4サブクラスである。他の好ましい態様において、抗体は、サブクラスIgG2である。
抗ミオスタチン抗体によって認識されるミオスタチンエピトープの同定
本発明は、ミオスタチンに結合し、かつ以下の抗体と競合もしくは交差競合するか、かつ/または以下の抗体と同じエピトープに結合する、ヒト抗ミオスタチンモノクローナル抗体を提供する：(a)
Figure 2008539241
より選択される抗体、(b)SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、または85のいずれか1つのVHドメインのアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含む抗体、(c)SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、または87のいずれか1つのVLドメインのアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体、(d)(b)において定義される重鎖可変ドメインと(c)において定義される軽鎖可変ドメインの両方を含む抗体。
ある抗体が、同じエピトープに結合するか、または結合する際に抗ミオスタチン抗体と交差競合するかどうかは、当技術分野において公知である方法を用いることにより、判定することができる。1つの態様において、本発明の抗ミオスタチン抗体を飽和条件下でミオスタチンに結合させ、次いで、試験抗体がミオスタチンに結合する能力を測定する。試験抗体が、参照抗ミオスタチン抗体と同時にミオスタチンに結合することができる場合、その試験抗体は、参照抗ミオスタチン抗体と異なるエピトープに結合する。しかしながら、試験抗体が、同時にミオスタチンに結合することができない場合、その試験抗体は、同じエピトープ、重複部分があるエピトープ、または本発明の抗ミオスタチン抗体が結合するエピトープの極めて近くにあるエピトープに結合する。この実験は、ELISA、RIA、BIACORE(商標)、またはフローサイトメトリーを用いて実施することができる。抗ミオスタチン抗体が別の抗ミオスタチン抗体と交差競合するかどうかを試験するために、前述した2方向の競合方法、すなわち公知の抗体が試験抗体を妨害するか、および逆もまた同じであるかを判定する方法を使用することができる。好ましい態様において、実験はELISAを用いて実施する。
抗ミオスタチン抗体によるミオスタチン活性の阻害
いくつかのアッセイ法を用いて、ミオスタチン結合を阻害する抗ミオスタチンモノクローナル抗体を同定することができる。例えば、抗ミオスタチン中和抗体は、実施例IIIにおいて説明するSmad応答エレメント/ルシフェラーゼ構築物をトランスフェクトしたA204細胞においてミオスタチンによって誘導されるルシフェラーゼ活性をそれらが妨害する能力に基づいて同定することができる。好ましい抗ミオスタチン抗体は、500nM、250nM、100nM、75nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、1nM、0.5nM、または0.1nM以下のIC50を有する。
また、Smad2/3結合エレメント/βラクタマーゼ構築物をトランスフェクトしたL6ラット筋芽細胞を、実施例IVにおいて説明する抗ミオスタチン抗体と接触させることによって、抗ミオスタチン抗体が、ミオスタチンによって誘導されるSmadタンパク質活性化を妨害する能力を決定することもできる。様々な態様において、抗ミオスタチン抗体は、500nM、250nM、100nM、75nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、1nM、0.5nM、または0.1nM以下のIC50をこのアッセイ法において有する。
あるいは、抗ミオスタチン中和抗体は、実施例Vにおいて説明するように、ウェスタンブロットにおいてSmad2またはSmad3のリン酸化をそれらが阻害する能力に基づいて同定することもできる。
他の態様において、本発明の抗ミオスタチン抗体は、筋肉細胞の増殖および分化に関連した遺伝子の発現を調節する。このような調節には、細胞周期阻害因子P21タンパク質およびアポトーシス誘導性Baxタンパク質の発現の低減、Rbリン酸化の増加、ならびにCdk2の発現の増大が含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、本発明のアンタゴニスト抗ミオスタチン抗体は、MyoD、ミオゲニン、およびMyf5の発現を増大させる。遺伝子発現に対する抗ミオスタチン抗体の影響は、いくつかの慣用技術のいずれかを用いて決定することができる(例えば、実施例VIを参照されたい)。
いくつかの態様において、本発明の抗ミオスタチン中和抗体は、筋芽細胞の分化を亢進させる。このような増殖および分化を抗体が亢進させる能力は、実施例VIIにおいて説明するように、例えばC2C12細胞を使用するアッセイ法によって決定することができる。
競合的ヒト抗ミオスタチン抗体対非競合的ヒト抗ミオスタチン
本発明のヒト抗ミオスタチン抗体は、免疫沈降法実験によって、他の阻害性のミオスタチン結合タンパク質と競合的なものと非競合的なものとに分類することができる。例えば、成熟GDF8との複合体を形成するプロペプチドは、阻害性タンパク質である。GDF8を発現する293T細胞に由来する馴化培地は、成熟GDF8、成熟GDF8/プロペプチド複合体、およびプロセッシングされていないGDF8を含む。この馴化培地を用いて、本発明のヒト抗ミオスタチン抗体の成熟GDF8/プロペプチド複合体への結合を試験するために、免疫沈降法による研究を実施した。実施例Xにおいて説明するように、抗体2_112_1、抗体2_43_1、および抗体2_177_1は、成熟GDF8、成熟GDF8/プロペプチド複合体、およびプロセッシングされていないGDF8に結合し、かつ免疫沈降させた。抗体1_66_1は、成熟GDF8および成熟GDF8/プロペプチド複合体に結合し、かつ免疫沈降させた。他の抗体のどれも、成熟GDF8も、プロペプチドも、プロセッシングされていないGDF8も免疫沈降させなかった。したがって、抗体2_112_1、抗体2_43_1、および抗体2_177_1は非競合的抗体であり、抗体1_66_1もまた、非競合的抗体であるが、ミオスタチンの別のエピトープに結合する抗体である。非競合的中和抗体、すなわち他の阻害性タンパク質の存在下でミオスタチンに結合する抗体は、競合的抗体よりも優れた有効性をインビボで有すると考えられる。
他の態様において、本発明の抗ミオスタチン抗体は、マウス血清に由来する成熟GDF8を免疫沈降させる。実施例XIで説明するように、モノクローナル抗体2_112、2_43_1、および2_177は、1_116_1および1_66_1よりも多くの成熟GDF8を沈降させる。
種特異性および分子選択性
本発明の別の局面において、抗ミオスタチン抗体は、種特異性および分子選択性の両方を示す。いくつかの態様において、抗ミオスタチン抗体は、ヒト、マウス、ドブネズミ(Rattus norvegicus)(ノルウェーラット(Norway rat))、カニクイザル(cynomolgus macaque)(サル)、カニクイザル(Macaca fascicularis)(カニを摂食するマカク)、メレアグリス・ガロパボ(Meleagris gallopavo)(シチメンチョウ)、イノシシ(Sus scrofa)(ブタ)、セキショクヤケイ(Gallus gallus)(ニワトリ)、セキショクヤケイ(Gallus gallus)(ニワトリ)、カニス・ファミリアリス(Canis familiaris)(イヌ)、エクウス・カバルス(Equus caballus)(ウマ)、ヒメウズラ(Coturnix chinensis)(ウズラ)、コツルニキス・コツルニキス(Coturnix coturnix)(ヨーロッパウズラ)、およびカワラバト(Columba livia)(ドバト)のミオスタチンに結合する。本明細書の教示に従うことにより、当技術分野において周知の方法を用いて抗ミオスタチン抗体に対する種特異性を決定することができる。例えば、ウェスタンブロット、表面プラズモン共鳴、例えば、BIAcore、ELISA、免疫沈降法、またはRIAを用いて種特異性を決定することができる。
他の態様において、抗ミオスタチン抗体は、GDF11に対する選択性の少なくとも50倍または少なくとも100倍の、ミオスタチンに対する選択性を有する。GDF11は、成熟タンパク質において90％の一致を有する、ミオスタチンの近縁ファミリーのメンバーである。いくつかの態様において、抗ミオスタチン抗体は、ミオスタチン以外の他の任意のタンパク質に対して、いかなる測定可能な特異的結合も示さない。本明細書の教示に従い、当技術分野において周知の方法を用いて、ミオスタチンに対する抗ミオスタチン抗体の選択性を決定することができる。例えば、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、ELISA、免疫沈降法、またはRIAを用いて選択性を決定することができる。
本発明の他の態様において、抗ミオスタチン抗体は、GDF11に対してよりも程度の高いGDF8に対する選択性を有さない。
抗体を作製する方法および抗体産生細胞株
免疫化
いくつかの態様において、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子座の一部または全部をそのゲノム内に含む非ヒトトランスジェニック動物をミオスタチン抗原で免疫化することによって作製される。好ましい態様において、非ヒト動物は、XENOMOUSE(商標)動物である。(Abgenix, Inc., Fremont, CA)。
XENOMOUSE(商標)マウスは、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子座の大型断片を含み、かつマウス抗体産生に欠陥のある、操作されたマウス系統である。例えば、Green et al., Nature Genetics 7：13-21(1994)、ならびに米国特許第5,916,771号、同第5,939,598号、同第5,985,615号、同第5,998,209号、同第6,075,181号、同第6,091,001号、同第6,114,598号、同第6,130,364号、同第6,162,963号、および同第6,150,584号を参照されたい。同様に、WO 91/10741、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 96/33735、WO 98/16654、WO 98/24893、WO 98/50433、WO 99/45031、WO 99/53049、WO 00/09560、およびWO 00/037504も参照されたい。
別の局面において、本発明は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物をミオスタチン抗原で免疫化することによって、非ヒト非マウス動物から抗ミオスタチン抗体を作製するための方法を提供する。このような動物は、上記の文献において記載されている方法を用いて作製することができる。これらの文献において開示されている方法は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,994,619号に記載されているように改良することができる。米国特許第5,994,619号では、ブタおよび雌ウシに由来する、新規に培養された内部細胞塊(CICM)細胞および細胞株、ならびに異種DNAが挿入されたトランスジェニックCICM細胞を作製するための方法を記載している。CICMトランスジェニック細胞は、クローン化されたトランスジェニックな胚、胎児、および子孫を作製するために使用され得る。特許第‘619号はまた、異種DNAを子孫に伝播することができるトランスジェニック動物を作製する方法も記載している。本発明の好ましい態様において、非ヒト動物は哺乳動物、特にラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、またはニワトリである。
XENOMOUSE(商標)マウスは、完全なヒト抗体の成熟したヒトレパートリーを産生し、かつ抗原特異的なヒト抗体を生成する。いくつかの態様において、XENOMOUSE(商標)マウスは、酵母人工染色体(YAC)中にヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座のメガベースサイズの生殖細胞系配置の断片を導入することにより、ヒト抗体V遺伝子レパートリーの約80％を含む。他の態様において、XENOMOUSE(商標)マウスは、ヒトλ軽鎖遺伝子座のほぼすべてをさらに含む。開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Mendez et al., Nature Genetics 15：146-156(1997)、GreenおよびJakobovits, J. Exp. Med. 188：483-495(1998)、ならびにWO 98/24893を参照されたい。
いくつかの態様において、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン「ミニ遺伝子座(minilocus)」を有する動物である。ミニ遺伝子座のアプローチにおいて、外因性Igの遺伝子座は、Ig遺伝子座に由来する個々の遺伝子を含めることによって模倣される。したがって、1つまたは複数のVH遺伝子、1つまたは複数のDH遺伝子、1つまたは複数のJH遺伝子、mu定常ドメイン、および第2の定常ドメイン(好ましくはγ定常ドメイン)を、動物に挿入するための構築物に形成する。このアプローチは、とりわけて、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,545,807号、同第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、同第5,770,429号、同第5,789,650号、同第5,814,318号、同第5,591,669号、同第5,612,205号、同第5,721,367号、同第5,789,215号、および同第5,643,763号に記載されている。
別の局面において、本発明は、ヒト化抗ミオスタチン抗体を作製するための方法を提供する。いくつかの態様において、非ヒト動物を、抗体産生を可能にする条件下、後述するようなミオスタチン抗原で免疫化する。抗体産生細胞をこれらの動物から単離し、かつ関心対象の抗ミオスタチン抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を、単離した抗体産生細胞またはそのような細胞から作製した不死化細胞株から単離する。これらの核酸を、当業者に公知の技術を用いて、かつ下記にさらに説明するようにして続いて操作して、非ヒト配列の量を減らす。すなわち、抗体をヒト化して、ヒトにおける免疫応答を減少させる。
いくつかの態様において、ミオスタチン抗原は、単離および/または精製されたミオスタチンである。いくつかの態様において、ミオスタチン抗原はヒトミオスタチンである。しかしながら、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウズラ、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、ウマ、およびサルに由来するC末端成熟ミオスタチンは同一であり、かつ細胞中でグリコシル化されないため、これらの種、および同じ成熟タンパク質配列を有する他の種に由来するミオスタチンもまた、免疫原として使用することができる。他の態様において、ミオスタチン抗原は、ミオスタチンを発現または過剰発現する細胞である。他の態様において、ミオスタチン抗原は、酵母、昆虫細胞、大腸菌(E.coli)のような細菌、または組換え技術による他の供給源から発現させられた組換えタンパク質である。
動物の免疫化は、当技術分野において公知である任意の方法によって実施することができる。例えば、HarlowおよびLane, Antibodies：A Laboratory Manual, New York：Cold Spring Harbor Press, 1990を参照されたい。マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、およびウマなどの非ヒト動物を免疫化するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、前記のHarlowおよびLane、ならびに米国特許第5,994,619号を参照されたい。好ましい態様において、ミオスタチン抗原は、免疫応答を促進するためのアジュバントと共に投与される。例示的なアジュバントには、完全フロイントアジュバントもしくは不完全フロイントアジュバント、RIBI(ムラミルジペプチド)、またはISCOM(免疫賦活複合体)が含まれる。このようなアジュバントは、局所的な保管場所中にポリペプチドを隔離することによって急速な分散からポリペプチドを保護し得るか、または、マクロファージに対して走化性である因子を宿主が分泌するように刺激する物質、および免疫系の他の成分を含み得る。好ましくは、ポリペプチドが投与される場合、免疫化スケジュールは、数週間に渡って実施されるポリペプチドの2回またはそれ以上の投与を含む。実施例Iは、XenoMouse(商標)マウスにおいて抗ミオスタチンモノクローナル抗体を作製するための方法を例示する。
抗体および抗体産生細胞株の作製
ミオスタチン抗原で動物を免疫化した後、抗体および/または抗体産生細胞をその動物から得ることができる。いくつかの態様において、抗ミオスタチン抗体を含む血清は、その動物から血液採取するか、またはその動物を屠殺することによって得られる。血清を動物から得たまま使用してもよく、血清から免疫グロブリン画分を得てもよく、または血清から抗ミオスタチン抗体を精製してもよい。
いくつかの態様において、抗体産生細胞株は、免疫化動物から単離した細胞から調製される。免疫化後、動物を屠殺し、かつリンパ節および/または脾臓B細胞を当技術分野において公知の手段によって不死化する。細胞を不死化する方法には、癌遺伝子をそれらにトランスフェクトする方法、腫瘍ウイルスにそれらを感染させ、かつ不死化細胞を選択する条件下でそれらを培養する方法、発癌性または変異誘発性の化合物にそれらを供する方法、不死化細胞、例えば骨髄腫細胞とそれらを融合する方法、および腫瘍抑制遺伝子を不活性化する方法が含まれるが、これらに限定されるわけではない。例えば、前記のHarlowおよびLaneを参照されたい。骨髄腫細胞との融合が使用される場合、骨髄腫細胞は、好ましくは、免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない(非分泌性細胞株)。不死化細胞は、ミオスタチン、またはその一部分を用いてスクリーニングする。好ましい態様において、最初のスクリーニングは、酵素結合免疫測定法(ELISA)またはラジオイムノアッセイ法を用いて実施する。ELISAスクリーニングの例は、参照により本明細書に組み入れられるWO 00/37504において提供される。
下記にさらに考察するように、抗ミオスタチン抗体産生細胞、例えばハイブリドーマを選択し、クローン化し、かつ、着実な増殖、高レベルの抗体産生、および望ましい抗体特性を含む望ましい特性に関してさらにスクリーニングする。ハイブリドーマは、同系の動物において、免疫系を欠いた動物、例えばヌードマウスにおいてインビボで、または細胞培養においてインビトロで増殖させることができる。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、かつ増殖させる方法は、当業者には周知である。
好ましい態様において、免疫化される動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する非ヒト動物であり、脾臓B細胞は、その非ヒト動物と同じ種に由来する骨髄腫細胞株と融合される。より好ましい態様において、免疫化される動物はXENOMOUSE(商標)マウスであり、骨髄腫細胞株は、非分泌性マウス骨髄腫である。さらにより好ましい態様において、骨髄腫細胞株は、P3-X63-Ag8.653(American Type Culture Collection(米国微生物株保存機関))である。例えば実施例Iを参照されたい。
したがって、1つの態様において、本発明は、ミオスタチンを対象とするヒトモノクローナル抗体またはその断片を産生する細胞株を作製するための方法であって、(a)本明細書において説明する非ヒトトランスジェニック動物をミオスタチン、ミオスタチンの一部分、またはミオスタチンを発現する細胞もしくは組織で免疫化する段階;(b)トランスジェニック動物に、ミオスタチンに対する免疫応答を開始させる段階;(c)トランスジェニック動物から抗体産生細胞を単離する段階;(d)抗体産生細胞を不死化する段階;(e)不死化した抗体産生細胞の個別のモノクローナル集団を作製する段階;および(f)不死化した抗体産生細胞をスクリーニングして、ミオスタチンを対象とする抗体を同定する段階、を含む方法を提供する。
別の局面において、本発明は、ヒト抗ミオスタチン抗体を産生する細胞株を提供する。いくつかの態様において、細胞株はハイブリドーマ細胞株である。いくつかの態様において、ハイブリドーマは、前述したようにマウスハイブリドーマである。他の態様において、ハイブリドーマは、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマなどの非ヒト非マウス種において作製される。別の態様において、ハイブリドーマは、ヒトハイブリドーマである。
別の態様において、トランスジェニック動物をミオスタチン抗原で免疫化し、初代細胞、例えば、脾臓または末梢血B細胞を、免疫化したトランスジェニック動物から単離し、かつ所望の抗原に特異的な抗体を産生する個々の細胞を同定する。個々の各細胞に由来するポリアデニル化mRNAを単離し、かつ、可変ドメイン配列にアニールするセンスプライマー、例えば、ヒト重鎖および軽鎖の可変ドメイン遺伝子のFR1領域の大半または全体を認識する縮重プライマー、ならびに定常領域配列または結合領域配列にアニールするアンチセンスプライマーを用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法(RT-PCR)を実施する。次いで、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのcDNAを、重鎖およびκまたはλの定常ドメインなどそれぞれの免疫グロブリン定常領域を有するキメラ抗体として、任意の適切な宿主細胞、例えば骨髄腫細胞においてクローニングし、発現させる。参照により本明細書に組み入れられる、Babcook, J.S. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93：7843-48, 1996を参照されたい。次いで、本明細書において説明するようにして抗ミオスタチン抗体を同定および単離することができる。
別の態様において、ファージディスプレイ技術を用いて、ミオスタチンに対する親和性が様々である抗体レパートリーを含むライブラリーを提供することができる。このようなレパートリーを作製するために、免疫化動物由来のB細胞を不死化することは不必要である。より正確に言えば、初代B細胞をmRNA供給源として直接使用することができる。例えば脾臓に由来するB細胞から得られたcDNAの混合物は、発現ライブラリー、例えば大腸菌にトランスフェクトされるファージディスプレイライブラリーを作製するのに使用される。結果として生じる細胞を、ミオスタチンに対する免疫反応性に関して試験する。このようなライブラリーから高親和性のヒト抗体を同定するための技術は、参照により組み入れられる、Griffiths et al., EMBO J., 13：3245-3260(1994); Nissim et al., 同書、 pp. 692-698、およびGriffiths et al., 同書、12：725-734によって説明されている。最終的に、抗原に対して所望の大きさの結合親和力を生じるライブラリー由来のクローンを同定し、かつそのような結合を担う産生物をコードするDNAを回収し、標準的な組換え発現のために操作する。ファージディスプレイライブラリーは、前もって操作されたヌクレオチド配列を用いて構築し、かつ同様の様式でスクリーニングすることもできる。一般に、重鎖および軽鎖をコードするcDNAは、ファージライブラリーにおいて作製するために、独立に供給されるか、またはFv類似体を形成するように連結される。
次いで、ミオスタチンに対する親和性が最も高い抗体についてファージライブラリーをスクリーニングし、かつ適切なクローンから遺伝物質を回収する。さらにスクリーニングを繰りかえすことにより、単離した元の抗体の親和性を高めることができる。
核酸、ベクター、宿主細胞、および抗体を作製する組換法
核酸
本発明はまた、抗ミオスタチン抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子も包含する。いくつかの態様において、異なる核酸分子が、抗ミオスタチン免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする。他の態様において、同じ核酸分子が、抗ミオスタチン免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする。
いくつかの態様において、軽鎖(VL)の可変ドメインをコードする核酸分子は、ヒトA3、A30、またはL2 Vκ遺伝子、およびヒトJκ1、Jκ3、またはJκ4遺伝子を使用する。いくつかの態様において、核酸分子は、ヒトA30、A3、またはL2 Vκ遺伝子、およびヒトJκ4遺伝子を使用する。他の態様において、核酸分子は、ヒトA30、A3、またはL2遺伝子、およびヒトJκ1遺伝子を使用する。いくつかの態様において、軽鎖をコードする核酸分子は、生殖細胞系アミノ酸配列からの1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の置換を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様において、核酸分子は、生殖細胞系のVκ配列およびJκ配列と比較して、1個、2個、3個、4個、もしくは5個の保存的アミノ酸置換、および/または1個、2個、もしくは3個の非保存的アミノ酸置換を含むVLアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。置換は、CDR領域、フレームワーク領域、または定常ドメイン中に存在してよい。
いくつかの態様において、核酸分子は、抗体
Figure 2008539241
のいずれか1つのVL中に存在する生殖細胞系からの変異と同一である、生殖細胞系配列と比べての1つまたは複数の変異を含むVLアミノ酸配列をコードする。
いくつかの態様において、核酸分子は、抗体
Figure 2008539241
のいずれか1つのVL中に存在する生殖細胞系配列と比べて少なくとも3つのアミノ酸置換をコードする。
いくつかの態様において、核酸分子は、モノクローナル抗体
Figure 2008539241
またはそれらの変異体もしくは一部分のVLアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸は、前記抗体のうち1つの軽鎖CDRを含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様において、前記一部分は、CDR1〜CDR3を含む連続した部分である。
いくつかの態様において、核酸分子は、SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、または87のうち1つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸分子は、SEQ ID NO：3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、48、52、56、60、68、72、80、64、76、84、もしくは88のヌクレオチド配列またはその一部分を含む。いくつかの態様において、核酸は、前記抗体の1つ、2つ、または3つすべてのCDRの軽鎖のアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様において、前記一部分は、抗ミオスタチン抗体の軽鎖のCDR1〜CDR3に由来する連続した領域をコードする。
いくつかの態様において、核酸分子は、抗体
Figure 2008539241
のいずれか1つのVLアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、もしくは87のうちいずれか1つのVL領域のアミノ酸配列に、少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％一致するVLアミノ酸配列をコードする。本発明の核酸分子には、前述したもののような、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、またはSEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、もしくは87のVL領域のアミノ酸配列をコードする核酸、またはSEQ ID NO：3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、48、52、56、60、68、72、80、64、76、84、もしくは88のVL領域ヌクレオチド配列を含む核酸に、少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％一致する核酸が含まれる。
他の好ましい態様において、核酸分子は、ヒト1-02、3-21、もしくは3-23VH遺伝子配列またはそれらに由来する配列を使用する重鎖(VH)の可変ドメインをコードする。様々な態様において、核酸分子は、ヒトVH1-02遺伝子、D4-23遺伝子、およびヒトJH6b遺伝子;ヒトVH3-21遺伝子、ヒトD3-16またはD5-12遺伝子、およびヒトJH6b遺伝子;ヒトVH3-21遺伝子、ヒトD1-26またはD5-5遺伝子、およびヒトJH4b遺伝子;ヒトVH3-23遺伝子、ヒトD1-7遺伝子、およびヒトJH3b遺伝子を使用する。
いくつかの態様において、核酸分子は、ヒトV遺伝子、ヒトD遺伝子、またはヒトJ遺伝子の生殖細胞系アミノ酸配列と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、または11個の変異を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様において、前記変異はVH領域中にある。いくつかの態様において、前記変異はCDR領域中にある。
いくつかの態様において、核酸分子は、モノクローナル抗体
Figure 2008539241
のVH中に存在するアミノ酸変異と同一である、生殖細胞系VH配列と比べての1つまたは複数のアミノ酸変異を含むVH配列をコードする。いくつかの態様において、核酸は、前述のモノクローナル抗体のうちの1つ中に存在する少なくとも3つのアミノ酸変異と同一である、生殖細胞系配列と比べての少なくとも3つのアミノ酸変異をコードする。
いくつかの態様において、核酸分子は、
Figure 2008539241
より選択されるモノクローナル抗体のVHアミノ酸配列の少なくとも一部分、その変異体、または保存的アミノ酸変異および/もしくは合計3つもしくはそれ以下の非保存的アミノ酸置換を有する該配列をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な態様において、配列は、前述の抗ミオスタチン抗体の、1つもしくは複数のCDR領域、好ましくはCDR3領域、3つのCDR領域すべて、CDR1〜CDR3を含む連続的な部分、またはVH領域全体をコードする。
いくつかの態様において、核酸分子は、SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、または85のうち1つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な好ましい態様において、核酸分子は、SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、または86のヌクレオチド配列の少なくとも一部分を含む。いくつかの態様において、前記一部分は、VH領域、CDR3領域、3つのCDR領域すべて、またはCDR1〜CDR3を含む連続的な領域をコードする。
いくつかの態様において、核酸分子は、SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、または85のいずれか1つにおけるVHアミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％一致するVHアミノ酸配列をコードする。本発明の核酸分子には、前述したもののような、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、またはSEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、もしくは42のアミノ酸配列をコードする核酸、もしくはそのVH領域、またはSEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、もしくは41のヌクレオチド配列を含む核酸、もしくはそのVH領域をコードするヌクレオチド配列に、少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％一致する核酸が含まれる。
別の態様において、核酸は、
Figure 2008539241
より選択される抗体の完全長重鎖、またはSEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、もしくは42のアミノ酸配列を含む重鎖をコ―ドする。さらに、核酸は、SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、または41のヌクレオチド配列を含み得る。
抗ミオスタチン抗体の重鎖もしくは軽鎖またはそれらの一部分をコードする核酸分子は、このような抗体を産生する任意の供給源から単離することができる。様々な態様において、核酸分子は、ミオスタチンで免疫化された動物から単離された、抗ミオスタチン抗体を発現するB細胞から単離されるか、またはそのようなB細胞に由来する不死化細胞から単離される。抗体をコードする核酸を単離する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Sambrook et al.を参照されたい。mRNAを単離し、かつ使用して、抗体遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)またはcDNAクローニングにおいて使用するためのcDNAを作製することができる。好ましい態様において、核酸分子は、ヒト免疫グロブリンを産生する非ヒトトランスジェニック動物由来の細胞を融合相手の一方として有するハイブリドーマから単離される。さらにより好ましい態様において、ヒト免疫グロブリンを産生する細胞は、XENOMOUSE(商標)動物から単離される。別の態様において、ヒト免疫グロブリンを産生する細胞は、前述したように、非ヒト非マウストランスジェニック動物から単離される。別の態様において、核酸は、非ヒト非トランスジェニック動物から単離される。非ヒト非トランスジェニック動物から単離された核酸は、例えば、本発明のヒト抗ミオスタチン抗体に由来する1つまたは複数のアミノ酸配列を含むヒト化抗体のために使用され得る。
いくつかの態様において、本発明の抗ミオスタチン抗体の重鎖をコードする核酸は、任意の供給源に由来する重鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列にインフレームで連結された、本発明のVHドメインをコードする核酸を含み得る。同様に、本発明の抗ミオスタチン抗体の軽鎖をコードする核酸分子は、任意の供給源に由来する軽鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列にインフレームで連結された、本発明のVLドメインをコードする核酸を含み得る。
本発明の別の局面において、重鎖(VH)および/または軽鎖(VL)の可変ドメインをコードする核酸分子は、完全長抗体遺伝子に「変換」される。1つの態様において、VHドメインまたはVLドメインをコードしている核酸分子は、VHセグメントがベクター内部でCHセグメントに機能的に連結され、かつ/またはVLセグメントがベクターの内部でCLセグメントに機能的に連結されるように、重鎖定常ドメイン(CH)または軽鎖定常ドメイン(CL)をそれぞれ既にコードしている発現ベクター中に挿入することによって、完全長抗体遺伝子に変換される。別の態様において、VHドメインおよび/またはVLドメインをコードしている核酸分子は、標準的な分子生物学的技術を用いて、CHドメインおよび/またはCLドメインをコードしている核酸分子に、VHドメインおよび/またはVLドメインをコードしている核酸分子を連結、例えばライゲーションすることによって、完全長抗体遺伝子に変換される。ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の定常ドメイン遺伝子の核酸配列は当技術分野において公知である。例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版、NIH Publ. No. 91-3242, 1991を参照されたい。次いで、完全長の重鎖および/または軽鎖をコードする核酸分子を、それらを導入しておいた細胞から発現させ、抗ミオスタチン抗体を単離することができる。
核酸分子を用いて、大量の抗ミオスタチン抗体を組換えによって発現させることができる。核酸分子はまた、下記にさらに説明するように、キメラ抗体、二重特異性抗体、単鎖抗体、イムノアドヘシン、ダイアボディ、変異抗体、および抗体派生物を作製するのにも使用され得る。核酸分子が非ヒト非トランスジェニック動物に由来する場合は、同様に後述するように、これらの核酸分子を抗体ヒト化のために使用することができる。
別の態様において、本発明の核酸分子は、特定の抗体配列に対するプローブまたはPCRプライマーとして使用される。例えば、核酸は、診断的方法におけるプローブとして、または、とりわけて、抗ミオスタチン抗体の可変ドメインをコードする付加的な核酸分子を単離するために使用され得るDNA領域を増幅するためのPCRプライマーとして使用され得る。いくつかの態様において、核酸分子はオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、関心対象の抗体の重鎖および軽鎖の可変性の高いドメインに由来する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、抗体
Figure 2008539241
または本明細書において説明するそれらの変異体の1つまたは複数のCDRの全体または一部分をコードする。
ベクター
本発明は、本発明の抗ミオスタチン抗体またはその抗原結合部分の重鎖をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。本発明はまた、そのような抗体またはその抗原結合部分の軽鎖をコードする核酸分子を含むベクターも提供する。本発明はさらに、融合タンパク質、修飾抗体、抗体断片、およびそれらのプローブをコードする核酸分子含むベクターも提供する。
いくつかの態様において、前述のようにして得た、軽鎖および重鎖の一部分または完全長をコードしているDNAを、それらの遺伝子が転写制御配列および翻訳制御配列など必要な発現制御配列に機能的に連結されるように発現ベクターに挿入することによって、本発明の抗ミオスタチン抗体または抗原結合部分を発現させる。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、YAC、およびEBV由来のエピソームなどが含まれる。抗体遺伝子は、ベクター内の転写制御配列および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する所期の機能を果たすように、ベクター中にライゲーションされる。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞に適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入することができる。好ましい態様において、両方の遺伝子が、同じ発現ベクター中に挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法(例えば抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合には平滑末端のライゲーション)によって発現ベクター中に挿入される。
好都合なベクターは、機能的に完全なヒトCH免疫グロブリン配列またはヒトCL免疫グロブリン配列をコードし、前述したように、任意のVH配列またはVL配列を容易に挿入および発現させることができるように操作した適切な制限部位を有するベクターである。このようなベクターにおいて、スプライシングは通常、挿入されたJ領域中のスプライス供与部位と、ヒトCドメインの前にあるスプライス受容部位との間で起こり、かつ、ヒトCHエキソン内に存在するスプライス領域でも起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流にあるネイティブな染色体部位で起こる。組み換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドもコードし得る。シグナルペプチドが免疫グロブリン鎖のアミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクター中にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド(すなわち、免疫グロブリン以外のタンパク質に由来するシグナルペプチド)でよい。
本発明の組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子に加えて、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることは、当業者には理解されると考えられる。哺乳動物宿主細胞において発現させるための好ましい調節配列には、レトロウイルスのLTR由来のプロモーターおよび/またはエンハンサー、(CMVプロモーター/エンハンサーのような)サイトメガロウイルス(CMV)由来のプロモーターおよび/またはエンハンサー、(SV40プロモーター/エンハンサーのような)シミアンウイルス40(SV40)由来のプロモーターおよび/またはエンハンサー、アデノウイルス由来のプロモーターおよび/またはエンハンサー(例えばアデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))、ポリオーマ由来のプロモーターおよび/またはエンハンサー、ならびにネイティブな免疫グロブリンプロモータおよびアクチンプロモータなど哺乳動物の強力なプロモーターが含まれる。ウイルスの調節エレメントおよびそれらの配列のさらに詳しい説明については、例えば米国特許第5,168,062号、米国特許第4,510,245号、および米国特許第4,968,615号を参照されたい。プロモーターおよびベクターに関する説明を含む、植物において抗体を発現させるための方法、ならびに植物の形質転換は、当技術分野において公知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,517,529号を参照されたい。細菌細胞または真菌細胞、例えば酵母細胞においてポリペプチドを発現させる方法もまた、当技術分野において周知である。
本発明の組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列(例えば複製起点)および選択マーカー遺伝子など付加的な配列を有し得る。選択マーカー遺伝子により、ベクターが導入された宿主細胞の選択が容易になる(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,399,216号、同第4,634,665号、および同第5,179,017号を参照されたい)。例えば、選択マーカー遺伝子は、典型的には、G418、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターを導入された宿主細胞に与える。好ましい選択マーカー遺伝子には、(メトトレキサートによる選択/増幅と共にdhfr宿主細胞において使用するための)ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子、(G418選択用の)neo遺伝子、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子が含まれる。
非ハイブリドーマ宿主細胞および組換えによるタンパク質作製の方法
抗ミオスタチン抗体をコードする核酸分子、およびこれらの核酸分子ベクターを用いて、適切な哺乳動物、植物、細菌、または酵母の宿主細胞をトランスフェクションすることができる。形質転換は、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための任意の公知の方法によって実施することができる。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞中に導入するための方法は当技術分野において周知であり、デキストランを介したトランスフェクション、リン酸カルシウム共沈法、ポリブレンを介したトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチドの封入、および核中へのDNAの直接的なマイクロインジェクションが含まれる。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞中に導入することもできる。細胞を形質転換させる方法は、当技術分野において周知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,399,216号、同第4,912,040号、同第4,740,461号、および同第4,959,455号を参照されたい。植物細胞を形質転換する方法は、アグロバクテリウム(Agrobacterium)を介した形質転換、微粒子銃による形質転換、直接注入、エレクトロポレーション、およびウイルス形質転換を含めて、当技術分野において周知である。細菌細胞および酵母細胞を形質転換させる方法もまた、当技術分野において周知である。
発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野において周知であり、American Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な多数の不死化細胞株が含まれる。これらには、とりわけて、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NS0細胞、SP2細胞、HEK-293T細胞、NIH-3T3細胞、HeLa細胞、仔ハムスター腎臓(BHK)細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えばHepG2)、A549細胞、およびいくつかの他の細胞株が含まれる。どの細胞株が高い発現レベルを有するかを判定することによって、特に好ましい細胞株を選択する。
哺乳動物起源のもの以外の細胞株も使用することができる。これらには、昆虫細胞株(Sf9細胞またはSf21細胞など)、植物細胞(タバコ(Nicotiana)、シロイヌナズナ(Arabidopsis)、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどを含む)、細菌細胞(大腸菌およびストレプトマイセス(Streptomyces)を含む)、ならびに酵母細胞(シゾサッカロミケス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、サッカロミケス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)を含む)が含まれる。
抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを宿主細胞中に導入する場合、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞を増殖させる場である培地中への抗体の分泌を可能にさせるのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより、抗体は作製される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて、培地から回収することができる。
産生細胞株からの本発明の抗体の発現は、いくつかの公知の技術を用いて亢進させることができる。例えば、グルタミン合成酵素遺伝子発現系(GS系)は、特定の条件下で発現を亢進させるための一般的なアプローチである。GS系は、欧州特許第0216846号、同第0256055号、同第0323997号、および同第0338841号において、全体的にまたは部分的に考察されている。
様々な細胞株によって、またはトランスジェニック動物において発現される抗体のグリコシル化は互いに異なる可能性がある。しかしながら、本明細書において提供される核酸によってコードされるか、または本明細書において提供されるアミノ酸配列を含む抗体はすべて、抗体のグリコシル化に関わらず、本発明の一部分である。
トランスジェニック動物およびトランスジェニック植物
本発明の抗ミオスタチン抗体はまた、関心対象の免疫グロブリンの重鎖配列および軽鎖配列に対してトランスジェニックな哺乳動物または植物を作製し、かつそれらから回収可能な形態で抗体を産生させることによって、トランスジェニック的に作製することもできる。哺乳動物におけるトランスジェニック的作製に関連して述べると、抗ミオスタチン抗体は、ヤギ、雌ウシ、または他の哺乳動物の乳汁において産生させ、かつそれから回収することができる。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,827,690号、同第5,756,687号、同第5,750,172号、および同第5,741,957号を参照されたい。いくつかの態様において、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物は、前述したように、ミオスタチンまたはその免疫原性部分で免疫化される。植物において抗体を作製するための方法は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,046,037号および同第5,959,177号に記載されている。
いくつかの態様において、非ヒトトランスジェニック動物または非ヒトトランスジェニック植物は、本発明の抗ミオスタチン抗体をコードする1つまたは複数の核酸分子を標準的なトランスジェニック技術によって動物または植物に導入することにより、作製される。前記Hoganおよび米国特許第6,417,429号を参照されたい。トランスジェニック動物を作製するために使用されるトランスジェニック細胞は、胚性幹細胞もしくは体細胞、または受精卵でよい。非ヒトトランスジェニック生物は、キメラのヘテロ接合体、非キメラのヘテロ接合体、および非キメラのホモ接合体でよい。例えば、いずれも参照により本明細書に組み入れられる、Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual第2版, Cold Spring Harbor Press(1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics：A Practical Approach, Oxford University Press(2000);およびPinkert, Transgenic Animal Technology：A Laboratory Handbook, Academic Press(1999)を参照されたい。いくつかの態様において、非ヒトトランスジェニック動物は、関心対象の重鎖および/または軽鎖をコードするターゲティング構築物による、標的を定められた破壊および置換を受ける。好ましい態様において、トランスジェニック動物は、ミオスタチン、好ましくはヒトミオスタチンに特異的に結合する重鎖および軽鎖をコードする核酸分子を含み、かつ発現する。いくつかの態様において、トランスジェニック動物は、単鎖抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体などの修飾抗体をコードする核酸分子を含む。抗ミオスタチン抗体は、任意のトランスジェニック動物において作製することができる。好ましい態様において、非ヒト動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマである。非ヒトトランスジェニック動物は、血液、乳汁、尿、唾液、涙、粘液、および他の体液中で、コードされた前記ポリペプチドを発現する。
ファージディスプレイライブラリー
本発明は、抗ミオスタチン抗体またはその抗原結合部分を作製するための方法であって、ヒト抗体のライブラリーをファージ上で合成する段階、ミオスタチンまたはその抗体結合部分を用いてそのライブラリーをスクリーニングする段階、ミオスタチンに結合するファージを単離する段階、およびそのファージから抗体を獲得する段階を含む方法を提供する。例として、ファージディスプレイ技術で使用するための抗体ライブラリーを調製するための1つの方法は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物をミオスタチンまたはその抗原性部分で免疫化して免疫応答を生じさせる段階、免疫化した動物から抗体産生細胞を採取する段階、採取した細胞から本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードするRNAを単離する段階、そのRNAを逆転写してcDNAを作製する段階、プライマーを用いてそのcDNAを増幅させる段階、ならびに抗体がファージ上で発現されるようにそのcDNAをファージディスプレイベクター中に挿入する段階を含む。本発明の組換え抗ミオスタチン抗体はこのようにして得ることができる。
本発明の組換えヒト抗ミオスタチン抗体は、組換え抗体コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。好ましくは、このライブラリーは、B細胞から単離されたmRNAから調製されたヒトVLおよびVHのcDNAを用いて作製された、scFvファージディスプレイライブラリーである。このようなライブラリーを調製およびスクリーニングするための方法は、当技術分野において公知である。ファージディスプレイライブラリーを作製するためのキットが市販されている(例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System、カタログ番号27-9400-01およびStratagene SurfZAP(商標)ファージディスプレイキット、カタログ番号240612)。また、抗体ディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングする際に使用することができる他の方法および試薬もある(例えば、いずれも参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,223,409号;PCT公開番号WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690;Fuchs et al., Bio/Technology 9：1370-1372(1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3：81-85(1992); Huse et al., Science 246：1275-1281(1989); McCafferty et al., Nature 348：552-554(1990); Griffiths et al., EMBO J. 12：725-734(1993); Hawkins et al., J.Mol.Biol. 226：889-896(1992); Clackson et al., Nature 352：624-628(1991); Gram et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89：3576-3580(1992); Garrad et al., Bio/Technology 9：1373-1377(1991); Hoogenboom et al., Nuc.Acid Res. 19：4133-4137(1991);およびBarbas et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88：7978-7982(1991)を参照されたい)。
1つの態様において、所望の特性を有するヒト抗ミオスタチン抗体を単離および作製するために、本明細書において説明するヒト抗ミオスタチン抗体を最初に使用して、参照により本明細書に組み入れられるPCT公開番号WO 93/06213において説明されているエピトープインプリンティング法により、ミオスタチンに対して同様の結合活性を有するヒト重鎖配列およびヒト軽鎖配列を選択する。この方法において使用される抗体ライブラリーは、好ましくは、いずれも参照により本明細書に組み入れられる、PCT公開番号WO 92/01047、McCafferty et al., Nature 348：552-554(1990);およびGriffiths et al., EMBO J. 12：725-734(1993)において説明されているように調製およびスクリーニングしたscFvライブラリーである。scFv抗体ライブラリーは、好ましくは、ヒトミオスタチンを抗原として用いてスクリーニングする。
最初のヒトVLドメインおよびヒトVHドメインを選択した後、「混合およびマッチング」実験を実施し、最初に選択したVLセグメントおよびVHセグメントの様々なペアをミオスタチン結合についてスクリーニングして、好ましいVL/VHペアの組合せを選択する。さらに、抗体の質をさらに改善するために、天然の免疫応答の間に抗体の親和性成熟を司るインビボの体細胞変異プロセスに類似したプロセスで、好ましくはVHおよび/またはVLのCDR3領域内で、好ましいVL/VHペアのVLセグメントおよびVHセグメントをランダムに変異させてもよい。このインビトロの親和性成熟は、それぞれVHCDR3またはVLCDR3に相補的なPCRプライマーを用いてVHドメインおよびVLドメインを増幅させることによって達成することができる。これらのプライマーには、結果として生じるPCR生成物がVHおよび/またはVLのCDR3領域中にランダムな変異が導入されたVHセグメントおよびVLセグメントをコードするように、特定の位置に4種のヌクレオチド塩基のランダムな混合物を「添加(spike)」した。これらのランダムに変異させたVHセグメントおよびVLセグメントは、ミオスタチンへの結合について再スクリーニングすることができる。
組換え免疫グロブリンディスプレイライブラリーから本発明の抗ミオスタチン抗体をスクリーニングおよび単離した後、選択された抗体をコードしている核酸をディスプレイパッケージから(例えばファージゲノムから)回収し、かつ標準的な組換えDNA技術によって他の発現ベクター中にサブクローニングすることができる。所望の場合は、後述するように核酸をさらに操作して、本発明の他の抗体形態を作り出してもよい。コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって単離した組換えヒト抗体を発現させるために、前述したように、抗体をコードするDNAを組換え発現ベクター中にクローニングし、かつ哺乳動物宿主細胞中に導入する。
クラススイッチ
本発明の別の局面は、ある抗ミオスタチン抗体のクラスまたはサブクラスを別のクラスまたはサブクラスに変換するための方法を提供する。いくつかの態様において、CLまたはCHをコードする配列を含まない、VLまたはVHをコードする核酸分子は、当技術分野において周知の方法を用いて単離される。次いで、その核酸分子は、所望の免疫グロブリンクラスまたはサブクラスに由来するCLまたはCHをコードする核酸配列に機能的に連結される。これは、前述したように、CL鎖またはCH鎖を含むベクターまたは核酸分子を用いて達成することができる。例えば、元はIgMであった抗ミオスタチン抗体をIgGにクラススイッチすることができる。さらに、クラススイッチを用いて、1つのIgGサブクラスを別のサブクラス、例えばIgG1からIgG2に変換することもできる。所望のアイソタイプを含む本発明の抗体を作製するための別の方法は、抗ミオスタチン抗体の重鎖をコードする核酸および抗ミオスタチン抗体の軽鎖をコードする核酸を単離する段階、VH領域をコードする配列を単離する段階、所望のアイソタイプの重鎖定常ドメインをコードする配列にそのVH配列をライゲーションする段階、細胞中で軽鎖遺伝子および重鎖構築物を発現させる段階、ならびに所望のアイソタイプを有する抗ミオスタチン抗体を収集する段階を含む。
脱免疫化抗体
本発明の別の局面において、例えばPCT公開番号WO98/52976およびWO00/34317(参照により本明細書に組み入れられる)に記載されている技術を用いて抗体を脱免疫化して、その免疫原性を減少させてもよい。
変異抗体
別の態様において、核酸分子、ベクター、および宿主細胞は、変異抗ミオスタチン抗体を作製するのに使用され得る。例えば抗体の結合特性を改変するために、これらの抗体の重鎖および/または軽鎖の可変ドメインを変異させてよい。例えば、1つまたは複数のCDR領域に変異を起こさせて、ミオスタチンに対する抗体のKDを増加もしくは減少させるか、koffを増加もしくは減少させるか、または抗体の結合特異性を改変することができる。部位特異的変異誘発の技術は当技術分野において周知である。例えば、前記のSambrook et al.およびAusubel et al.を参照されたい。別の態様において、モノクローナル抗体
Figure 2008539241
中の生殖細胞系と比べて異なっていることが公知であるアミノ酸残基に1つまたは複数の変異を起こさせる。これらの変異は、可変ドメインのCDR領域もしくはフレームワーク領域中、または定常ドメイン中に起こしてよい。好ましい態様において、これらの変異は可変ドメイン中に起こされる。いくつかの態様において、1つまたは複数の変異は、SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、もしくは87より選択されるか、またはSEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、もしくは88において示される核酸配列を有するアミノ酸配列の可変ドメインのCDR領域またはフレームワーク領域中の、生殖細胞系と比べて異なっていることが公知であるアミノ酸残基に起こされる。
別の態様において、結果として生じるフレームワーク領域が対応する生殖細胞系遺伝子のアミノ酸配列を有するように、フレームワーク領域を変異させる。フレームワーク領域または定常ドメイン中に変異を起こさせて、抗ミオスタチン抗体の半減期を延長させることができる。例えば、参照により本明細書に組み入れられるPCT公開番号WO 00/09560を参照されたい。また、抗体の免疫原性を改変するため、別の分子に共有結合もしくは非共有結合するための部位を提供するため、または補体結合、FcR結合、および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)などの特性を改変するために、フレームワーク領域または定常ドメイン中に変異を起こすこともできる。本発明によれば、1つの抗体は、可変ドメインの1つもしくは複数の任意のCDRもしくはフレームワーク領域中、または定常ドメイン中に変異を有し得る。
いくつかの態様において、変異抗ミオスタチン抗体のVHドメインまたはVLドメインのいずれかには、変異前の抗ミオスタチン抗体と比べて、1個〜8個(間の任意の数を含む)のアミノ酸変異がある。上記のもののいずれかにおいて、これらの変異は、1つまたは複数のCDR領域中に存在してよい。さらに、変異のいずれかは、保存的アミノ酸置換でよい。いくつかの態様において、定常ドメイン中に5個、4個、3個、2個、または1個以下のアミノ酸変化がある。
修飾抗体
別の態様において、別のポリペプチドに連結された本発明の抗ミオスタチン抗体の全体または一部分を含む、融合抗体またはイムノアドヘシンが作製され得る。好ましい態様において、抗ミオスタチン抗体の可変ドメインのみがそのポリペプチドに連結される。別の好ましい態様において、抗ミオスタチン抗体のVHドメインは第1のポリペプチドに連結され、一方、抗ミオスタチン抗体のVLドメインは、VHドメインおよびVLドメインが互いに相互作用して抗原結合部位を形成できるような様式で第1のポリペプチドと結合する第2のポリペプチドに連結される。別の好ましい態様において、VHドメインは、VHドメインおよびVLドメインが互いに相互作用できるように、リンカーによってVLドメインから離されている(下記の単鎖抗体を参照されたい)。次いで、VH-リンカー-VL抗体は、関心対象のポリペプチドに連結される。さらに、2個(またはそれ以上)の単鎖抗体が互いに連結されている融合抗体も作り出すことができる。これは、単一のポリペプチド鎖上で二価もしくは多価の抗体を作り出したい場合、または二重特異性抗体を作り出したい場合に有用である。
単鎖抗体(scFv)を作り出すために、VHおよびVLをコードしているDNA断片を屈曲性のリンカーをコードしている別の断片、例えばアミノ酸配列(Gly4-Ser)3をコードしている別の断片(SEQ ID NO：122)に機能的に連結し、その結果、VH配列およびVL配列が、屈曲性のリンカーによって結合されたVLドメインおよびVHドメインを有する連続的な単鎖タンパク質として発現され得るようにする。例えば、Bird et al., Science 242：423-426(1988); Huston et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85：5879-5883(1988); McCafferty et al., Nature 348：552-554(1990)を参照されたい。単鎖抗体は、1つのVHおよびVLのみが使用される場合は一価であり得、2つのVHおよびVLが使用される場合は二価であり得、または2つ以上のVHおよびVLが使用される場合は多価であり得る。ミオスタチンおよび別の分子に特異的に結合する二重特異性抗体または多価抗体を作製することができる。
他の態様において、抗ミオスタチン抗体をコードする核酸分子を用いて他の修飾抗体を調製することができる。例えば、「κ抗体(Kappa body)」(Ill et al., Protein Eng. 10：949-57(1997))、「ミニ抗体」(Martin et al., EMBO J. 13：5303-9(1994))、「ダイアボティ」(Holliger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993))、または「Janusin」(Traunecker et al., EMBO J. 10：3655-3659(1991)およびTraunecker et al., Int.J.Cancer(補遺)7：51-52(1992))は、本明細書の教示に従って標準的な分子生物学的技術を用いて調製することができる。
二重特異性の抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマの融合またはFab'断片の連結を含む様々な方法によって、作製することができる。例えば、SongsivilaiおよびLachmann, Clin.Exp.Immunol. 79：315-321(1990)、Kostelny et al., J.Immunol. 148：1547-1553(1992)を参照されたい。さらに、二重特異性抗体は、「ダイアボディ」または「Janusin」として形成され得る。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、ミオスタチンの2つの異なるエピトープに結合する。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、モノクローナル抗体
Figure 2008539241
に由来する第1の重鎖および第1の軽鎖、ならびに付加的な抗体重鎖および軽鎖を有する。いくつかの態様において、付加的な軽鎖および重鎖もまた、上記に特定したモノクローナル抗体のうちの1つに由来するが、第1の重鎖および軽鎖とは異なる。
いくつかの態様において、前述の修飾抗体は、本明細書において提供するヒト抗ミオスタチンモノクローナル抗体に由来する1つまたは複数の可変ドメインまたはCDR領域を用いて調製される。
誘導体化抗体および標識抗体
本発明の抗ミオスタチン抗体または抗原結合部分は、誘導体化するか、または別の分子(例えば、別のペプチドまたはタンパク質)に連結することができる。一般に、誘導体化または標識化によってミオスタチン結合が悪影響を受けないように、抗体またはその一部分を誘導体化する。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、本明細書において説明するヒト抗ミオスタチン抗体の完全な形態および修飾された形態の両方を含むことが意図される。例えば、本発明の抗体および抗体部分は、別の抗体(例えば二重特異性抗体もしくはダイアボディ)、検出物質、薬学的物質、および/または、抗体もしくは抗体部分と別の分子(ストレプトアビジンコア領域もしくはポリヒスチジンタグなど)との結合を媒介することができるタンパク質もしくはペプチドなど1種または複数種の他の分子単位に、(化学的結合、遺伝的融合、非共有結合、または別の方法によって)機能的に連結することができる。
誘導体化抗体の1つのタイプは、(例えば二重特異性抗体を作り出すために、同じタイプまたは別のタイプの)2つまたはそれ以上の抗体を架橋結合させることによって作製される。適切な架橋剤には、ヘテロ2価性で、2種の極めて反応性の高い基が適切なスペーサーによって離されているもの(例えばm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)、またはホモ2価性のもの(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)が含まれる。このようなリンカーは、Pierce Chemical Company, Rockford, Ilから入手可能である。
別のタイプの誘導体化抗体は、標識抗体である。本発明の抗体または抗原結合部分を誘導体化することができる有用な検出物質には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、5-ジメチルアミン-1-ナフタレンスルホニル(napthalenesulfonyl)クロリド、フィコエリトリン、およびランタニド蛍光体などを含む蛍光性化合物が含まれる。抗体はまた、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびグルコースオキシダーゼなど、検出に有用である酵素で標識することもできる。検出可能な酵素で抗体が標識されている場合、抗体は、酵素が使用して識別可能な反応生成物を生成する付加的な反応物を添加することによって検出される。例えば、作用物質西洋ワサビペルオキシダーゼが存在している場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンを添加することにより、検出可能な有色の反応生成物が生じる。抗体は、ビオチンで標識し、アビジンまたはストレプトアビジンの結合を直接測定することによって検出することもできる。抗体は、二次レポーターによって認識される前もって決定したポリペプチドエピトープ(例えばロイシンジッパーの対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)で標識することもできる。いくつかの態様において、標識は、潜在的な立体障害を低減させるために、様々な長さのスペーサーアームによって結合される。
抗ミオスタチン抗体は、ポリエチレングリコール(PEG)、メチル基もしくはエチル基、または炭水化物基などの化学基で誘導体化することもできる。これらの基は、抗体の生物学的特徴を改善するために、例えば血清半減期を延長するために有用である。
薬学的組成物およびキット
本発明はまた、阻害特性を有するヒト抗ミオスタチン抗体を含む組成物にも関する。
本発明のアンタゴニスト抗ミオスタチン抗体は、骨格筋質量および/または骨を増加させることが望ましい多様な状態および障害を予防または治療するのに有用である。いくつかの場合において、このような状態および障害は、加齢に関連しているか、または疾患に関連していることがある。本発明のアンタゴニスト抗ミオスタチン抗体は、例えば不動に起因する筋肉萎縮を含む加齢による筋肉の質量および強度の低下を治療、予防、または抑制するのに使用され得る。
さらに、本発明のアンタゴニスト抗ミオスタチン抗体は、消耗症、または限定されるわけではないが、外傷(筋肉、神経、および骨の外傷を含む)、熱傷、AIDS、癌、(特に高齢者の)股関節部骨折、関節置換術、急性の膝の損傷、関節炎、慢性腎不全(CRF)、うっ血性心不全(CHF)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、多発性硬化症(MS)、パーキンソン病、慢性の重症疾患、中枢神経系(CNS)の損傷、脳卒中、悪液質、筋ジストロフィー症候群、外科手術、および関節損傷を含む、筋肉質量の減少を伴う他の疾患もしくは状態における筋肉減少を治療または予防するのに有用である。
本発明のアンタゴニスト抗ミオスタチン抗体は、代謝性疾患を治療するのにも有用である。このような疾患には、2型糖尿病、X症候群のような代謝症候群、インスリン抵抗性、耐糖能障害、および肥満が含まれる。
さらに、本発明のアンタゴニスト抗ミオスタチン抗体は、限定されるわけではないが、加齢またはホルモンに関連した骨粗しょう症、骨減少症、変形性関節症、および骨粗しょう症に関連した骨折を含む、骨量減少を伴う障害を治療または予防するのに有用である。
治療は、1種または複数種の本発明の阻害性抗ミオスタチンモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合断片を、単独で、または薬学的に許容される担体と共に投与することを含み得る。本発明の阻害性抗ミオスタチン抗体およびそれらを含む組成物は、1種または複数種の他の治療物質、診断用物質、または予防的物質と組み合わせて投与することができる。付加的な治療物質には、抗筋ジストロフィー剤(プレドニゾン、デフラザコルトなどのステロイドを含む)、およびアナボリックステロイド、アルブテロール、クレアチンのような栄養補給物、ならびにゲンタマイシンのような抗生物質が含まれる。その他の治療物質には、限定されるわけではないが、メトホルミン、スルホニル尿素、インスリン、プラムリンチド(SYMLIN(登録商標))、ロシグリタゾン(Avandia(登録商標))およびピオグリタゾン(Actos(登録商標))のようなTZD、エキセニチド(exenitide)のようなGLP-1類似体、ならびにLAF237のようなDPP-IV阻害剤を含む、抗糖尿病物質も含まれる。さらに、その他の治療物質には、限定されるわけではないが、アレンドロナート(Fosamax(登録商標))およびリセドロナート(Actonel(登録商標))などのビスホスホナート、カルシトニン(Miacalcin(登録商標))、ラロキシフェン(Evista(登録商標))、エストロゲンおよび副甲状腺ホルモンなどのホルモン剤を含む抗骨粗しょう症物質が含まれる。このような付加的物質は、同じ組成物中に含めるか、または別々に投与してよい。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」とは、生理学的に適合性である、任意およびすべての溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに等張化剤および吸収遅延剤などを意味する。薬学的に許容される担体のいくつかの例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、およびエタノールなど、ならびにそれらの組合せである。多くの場合において、等張化剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいと考えられる。薬学的に許容される物質のさらなる例は、湿潤剤、または、湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、または緩衝剤など少量の補助物質であり、これらは抗体の貯蔵寿命または有効性を向上させる。
本発明の組成物は、様々な形態、例えば、液状の溶液剤(例えば、注射用の溶液剤および注入用の溶液剤)、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム、および坐剤などの液体剤形、半固体剤形、および固体剤形であってよい。好ましい形態は、意図される投与様式および治療的用途に依存する。典型的な好ましい組成物は、ヒトの受動免疫化用に使用されるものに類似した組成物のような注射用溶液剤または注入用溶液剤の形態である。好ましい投与様式は、非経口(例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉)である。好ましい態様において、抗体は、静脈内注入または静脈注射によって投与される。別の好ましい態様において、抗体は、筋肉内注射または皮下注射によって投与される。
治療用組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で、無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散系、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の規則構造体として調剤することができる。無菌の注射液剤は、適切な溶媒中の必要とされる量の抗ミオスタチン抗体を、必要に応じて、上記に列挙した成分のうちの1つまたはそれらの組合せと混合し、続いてろ過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散剤は、基本となる分散媒体および上記に列挙したもののうち必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に活性化合物を混合することによって調製される。無菌注射液剤を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分および任意の付加的な所望の成分の粉末を、予め滅菌ろ過したその溶液から生じさせる、真空乾燥および凍結乾燥である。液剤の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散系の場合は必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって、実現することができる。
1つの態様において、抗体は、約5.0〜約6.5の範囲のpHを有し、かつ約1mg/ml〜約200mg/mlの抗体、約1ミリモル濃度〜約100ミリモル濃度のヒスチジン緩衝液、約0.01mg/ml〜約10mg/mlのポリソルベート80、約100ミリモル濃度〜約400ミリモル濃度のトレハロース、および約0.01ミリモル濃度〜約1.0ミリモル濃度のEDTA二ナトリウム二水和物を含む無菌水性溶液剤としての製剤中で投与される。
本発明の抗体は、当技術分野において公知の様々な方法によって投与することができるが、多くの治療的用途の場合、好ましい投与経路/様式は、皮下注入、筋肉内注入、または静脈内注入である。当業者には理解されるように、投与の経路および/または様式は、所望の結果に応じて異なると考えられる。
特定の態様において、抗体組成物活性化合物は、埋め込み剤、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤のように、急速な放出から抗体を保護すると考えられる担体と共に調製してよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など、生分解性かつ生体適合性のポリマーを使用することができる。このような製剤を調製するための多くの方法は、特許権を与えられており、または、一般に当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978)を参照されたい。
特定の態様において、本発明の抗ミオスタチン抗体は、例えば、不活性な希釈剤または消化吸収可能な可食性担体と共に、経口投与され得る。化合物(および、所望の場合は、他の成分)はまた、硬いもしくは軟らかい殻のゼラチンカプセル剤に封入されるか、圧縮して錠剤にされるか、または、対象の食事中に直接組み込まれてもよい。経口的な治療的投与の場合、抗ミオスタチン抗体を賦形剤と混合し、かつ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、およびカシェ剤などの形態で使用することができる。非経口投与以外によって本発明の化合物を投与するためには、不活性化を防止する材料でその化合物をコーティングするか、または、不活性化を防止する材料と共にその化合物を同時投与することが必要である場合がある。
付加的な活性化合物も、組成物中に混合することができる。特定の態様において、本発明の阻害性抗ミオスタチン抗体は、1種または複数種の付加的な治療物質と共調剤されるか、かつ/または同時投与される。これらの作用物質には、他の標的に結合する抗体、抗悪性腫瘍剤、抗腫瘍剤、化学療法剤、ミオスタチンを阻害するペプチド類似体、または、II型膜受容体に結合し、かつミオスタチンへの受容体の結合もしくはミオスタチンによる受容体の活性化を妨げる抗体もしくは他の分子が含まれるが、これらに限定されるわけではない。このような併用療法が必要とする阻害性抗ミオスタチン抗体ならびに同時投与される作用物質の投薬量はより少なく、したがって、様々な単独療法に付随する毒性または合併症の可能性を回避し得る。
本発明の阻害性抗ミオスタチン抗体およびそれらを含む組成物はまた、他の治療計画と組み合わせて、特に運動および/または(栄養補給物を含む)食事補助物と組み合わせて投与してもよい。
特定の態様において、本発明の阻害性抗ミオスタチン抗体は、前述の1種または複数種の付加的な治療物質と共調剤されるか、かつ/または同時投与される。これらの作用物質には、ミオスタチンを阻害するものが含まれる。さらに、このような併用療法は、前述の疾患および状態のいずれかを治療、予防、または抑制するのにも使用され得る。このような併用療法が必要とする阻害性抗ミオスタチン抗体ならびに同時投与される作用物質の投薬量はより少なく、したがって、様々な単独療法に付随する毒性または合併症の可能性を回避し得る。
本発明の組成物は、「治療的有効量」または「予防的有効量」の本発明の抗体または抗原結合部分を含み得る。「治療的有効量」とは、所望の治療結果を達成するのに必要な投薬量および期間で有効な量を意味する。抗体または抗体の一部分の治療的有効量は、疾患の状態、個体の年齢、性別、および体重、ならびに抗体または抗体の一部分が個体において所望の応答を誘発する能力などの因子に応じて変動し得る。治療的有効量はまた、抗体または抗体の一部分の任意の毒性作用または有害作用を、治療的に有益な作用が上回っている量でもある。「予防的有効量」とは、所望の予防的結果を達成するのに必要な投薬量および期間で有効な量を意味する。典型的には、予防的用量は疾患より前または疾患の初期段階に対象において使用されるため、予防的有効量は、治療的有効量より少量でよい。
投与計画は、最適な所望の応答(例えば治療的応答または予防的応答)を提供するように調整することができる。例えば、単回ボーラスを投与することができ、いくつかに分割した用量を時間をかけて投与することができ、または、治療状況の緊急性によって必要とされるのに応じて、比例的に用量を減量もしくは増量することができる。単位剤形の非経口組成物を調剤することは、投与を容易にし、かつ投薬量を均一にするために、特に有利である。本明細書において使用される単位剤形とは、治療しようとする哺乳動物対象に対する単位投薬量として適した物理的に個別の単位を意味し、各単位は、必要な薬剤用担体と共同して所望の治療効果を生じるように算出された所定の量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の仕様は、(a)抗ミオスタチン抗体またはその一部分の独特な特徴および達成すべき個々の治療効果または予防効果、ならびに(b)個体の感受性の治療のためにこのような活性化合物を配合する当技術分野につきものの制約、によって必然的に決められ、かつ直接的に依存している。
本発明の抗体または抗体の一部分の治療的有効量または予防的有効量の例示的な非限定的範囲は、0.025mg/kg〜50mg/kg、より好ましくは0.1mg/kg〜50mg/kg、より好ましくは0.1mg/kg〜25mg/kg、0.1mg/kg〜10mg/kg、または0.1mg/kg〜3mg/kgである。いくつかの態様において、製剤は、20mMクエン酸ナトリウム、pH5.5、140mM NaCl、および0.2mg/mlポリソルベート80からなる緩衝液中の5mg/mlの抗体を含む。投薬量の値は、軽減すべき状態のタイプおよび重症度に応じて変動し得ることに留意すべきである。任意の具体的な対象に対して、個別の必要および組成物の投与を管理または監督する人物の専門的判断に従って経時的に個々の投与計画を調整すべきであること、ならびに本明細書において示す投薬量範囲は、例示にすぎず、かつ特許請求の範囲の組成物の範囲も実施も制限しないと意図されることが、さらに理解されるべきである。
本発明の別の局面は、本発明の抗ミオスタチン抗体もしくは抗原結合部分、またはそのような抗体もしくは一部分を含む組成物を含むキットを提供する。キットは、抗体または組成物に加えて、診断用物質または治療物質を含み得る。キットはまた、診断方法または治療方法において使用するための取扱い説明書も含んでよい。好ましい態様において、キットは、抗体またはそれを含む組成物、および後述する方法において使用できる診断用物質を含む。別の好ましい態様において、キットは、抗体またはそれを含む組成物、および後述する方法において使用できる1種または複数種の治療物質を含む。
有用な診断方法
別の局面において、本発明は、診断方法を提供する。抗ミオスタチン抗体は、インビトロまたはインビボで生物試料中のミオスタチンを検出するのに使用され得る。
抗ミオスタチン抗体は、非限定的にELISA、RIA、フローサイトメトリー、組織免疫組織化学、ウェスタンブロット、または免疫沈降法を含む、従来のイムノアッセイ法において使用され得る。本発明の抗ミオスタチン抗体は、ヒト由来のミオスタチンを検出するのに使用され得る。別の態様において、抗ミオスタチン抗体は、例えば、マウス、カニクイザル、ラット、イヌ、ウズラ、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、およびウマ由来のミオスタチンを検出するのに使用され得る。
本発明は、生物試料を本発明の抗ミオスタチン抗体と接触させる段階、および結合された抗体を検出する段階を含む、生物試料中のミオスタチンを検出するための方法を提供する。1つの態様において、抗ミオスタチン抗体は、検出可能な標識で直接標識される。別の態様において、抗ミオスタチン抗体(第1の抗体)は標識されず、かつその抗ミオスタチン抗体に結合できる二次抗体または他の分子が標識される。当業者に周知のように、特定の種およびクラスの第1の抗体に特異的に結合することができる二次抗体が選択される。例えば、抗ミオスタチン抗体がヒトIgGである場合は、二次抗体は抗ヒトIgGであり得る。抗体に結合できる他の分子には、非限定的に、プロテインAおよびプロテインGが含まれ、いずれも、例えばPierce Chemical Co.から市販されている。
抗体または二次抗体に対する適切な標識は、前記に開示されており、様々な酵素、補欠分子団、蛍光性材料、発光性材料、および放射性材料が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ;適切な補欠分子団複合体の例には、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが含まれ;適切な蛍光性材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが含まれ;発光性材料の例には、ルミノールが含まれ;かつ適切な放射性材料の例には、125I、131I、35S、または3Hが含まれる。
他の態様において、ミオスタチンは、検出可能な物質で標識されたミオスタチン標準物質および非標識の抗ミオスタチン抗体を使用する競合イムノアッセイ法により、生物試料中で分析され得る。このアッセイ法では、生物試料、標識されたミオスタチン標準物質、および抗ミオスタチン抗体を混合し、かつ、非標識抗体に結合された標識ミオスタチン標準物質の量を決定する。生物試料中のミオスタチンの量は、抗ミオスタチン抗体に結合された標識ミオスタチン標準物質の量に反比例する。
上記に開示したイムノアッセイ法は、いくつかの目的のために使用することができる。例えば、抗ミオスタチン抗体は、培養細胞中のミオスタチンを検出するのに使用することができる。好ましい態様において、抗ミオスタチン抗体は、様々な化合物で処理された細胞によって産生されるミオスタチンの量を決定するのに使用される。本方法は、ミオスタチンタンパク質レベルを調節する化合物を同定するのに使用され得る。本方法によれば、1つの細胞試料を試験化合物で一定期間処理し、同時に別の試料を未処理のままにする。ミオスタチンの全レベルを測定する場合、細胞を溶解し、かつミオスタチン全体のレベルを前述のイムノアッセイ法のうち1つを用いて測定する。処理細胞および未処理細胞におけるミオスタチンの全レベルを比較して、試験化合物の影響を決定する。
全ミオスタチンレベルを測定するための好ましいイムノアッセイ法は、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学である。ELISA、RIA、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、免疫組織化学、内在性膜タンパク質の細胞表面標識、および免疫沈降法などの方法が、当技術分野において周知である。例えば、前記のHarlowおよびLaneを参照されたい。さらに、イムノアッセイ法は、ミオスタチン発現の活性化または阻害のいずれかについて多数の化合物を試験するために、ハイスループットなスクリーニング用にスケールアップすることもできる。
本発明の抗ミオスタチン抗体はまた、組織または血清中のミオスタチンレベルを測定するために使用することもできる。いくつかの態様において、この組織は罹病組織である。本方法のいくつかの態様において、組織またはその生検材料は、患者から摘出される。本方法は、検出可能に標識された抗ミオスタチン抗体またはそれらを含む組成物を、そのような診断検査を必要とする患者に投与する段階、およびその患者を画像解析に供して、ミオスタチンを発現する組織の位置を決定する段階を含む。画像解析は、医薬分野において周知であり、X線解析、磁気共鳴画像法(MRI)、またはコンピュータ断層撮影法(CT)が含まれるが、これらに限定されるわけではない。抗体は、インビボ画像処理に適した任意の薬剤、例えば、X線解析用に使用され得るバリウムのような造影剤、またはMRIもしくはCT用に使用され得るガドリニウムキレートのような磁性造影剤で標識することができる。他の標識物質には、99Tcのような放射性同位体が含まれるが、これに限定されるわけではない。別の態様において、抗ミオスタチン抗体は標識されず、検出可能であり、かつ抗ミオスタチン抗体に結合できる二次抗体または他の分子を投与することによって画像化される。ある態様において、生検材料は、関心対象の組織がミオスタチンを発現するかどうかを判定するために、患者から採取される。
有用な治療方法
別の態様において、本発明は、ミオスタチン活性を阻害するための方法であって、それを必要とする患者に抗ミオスタチン抗体を投与することによる方法を提供する。本明細書において説明するタイプの抗体のうちいずれかを治療的に使用することができる。様々な態様において、抗ミオスタチン抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である。好ましい態様において、ミオスタチンはヒトであり、患者はヒト患者である。あるいは、患者は、抗ミオスタチン抗体が交差反応するミオスタチンを発現する哺乳動物でもよい。抗体は、獣医学的目的のために、またはヒト疾患の動物モデルとして、抗体が交差反応するミオスタチンを発現する非ヒト哺乳動物(すなわち、ラット、マウス、またはカニクイザル)に投与することができる。このような動物モデルは、本発明の抗体の治療的有効性を評価するために有用な場合がある。
これらの抗体は、家畜(ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、シチメンチョウ、および魚)ならびに伴侶動物(イヌ、ネコ、およびウマ)において、筋肉成長、体重増加を促進する際、および脆弱化の予防を援助する際に使用され得る。
別の態様において、本発明は、本明細書において説明する抗体または抗原結合部分を対象に投与する段階を含む、それを必要としているウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、魚、イヌ、およびネコにおいて、筋肉成長、体重増加を促進し、かつ脆弱化の予防を援助するための方法を提供する。
本明細書において使用される場合、「ミオスタチン活性を低下させることによって予防または治療することができる状態」という用語は、障害を有する対象中に高レベルのミオスタチンが存在することが、その障害の病態生理の原因またはその障害の悪化をもたらす要因のいずれかであることが示されたか、または疑われている、疾患および他の障害を含むと意図される。このような障害は、例えば、組織および体液中のミオスタチンのレベル、またはその障害を有する対象の罹患細胞もしくは罹患組織中の筋肉組織中のリン酸化Smad2もしくはリン酸化Smad3のレベルの上昇によって立証され得る。ミオスタチンレベルの上昇は、例えば、前述の抗ミオスタチン抗体を用いて検出することができる。
別の好ましい態様において、抗ミオスタチン抗体は、不適切に高いレベルのミオスタチンを発現する患者に投与され得る。高レベルのミオスタチン発現が、様々な衰弱状態、骨量減少、および脂肪塊の蓄積を招き得ることは当技術分野において公知である。1つの態様において、該方法は、ミオスタチンの作用を中和することにより、骨格筋質量の減少を減らすこと、もしくは骨格筋質量を増加させること、骨量減少を減らすこと、もしくは骨質量を増加させること、および/または体脂肪量を減少させることが望ましい疾患および状態の治療に関する。このような状態および疾患は前記に挙げている。
別の好ましい態様において、抗ミオスタチン抗体は、不適切なレベル(高レベルまたは低レベル)のミオスタチンを発現しないが、それでもなお、抗ミオスタチン治療を用いることによって成功裡に治療または予防されると考えられる状態を有する患者に投与され得る。1つの態様において、該方法は、ミオスタチンの作用を中和することによりミオスタチン活性を阻害して、骨格筋質量の減少を治療すること、もしくは骨格筋質量を改善すること、骨量減少を治療すること、もしくは骨質量を増加させること、および/または脂肪塊を処置することが望ましい疾患および状態の治療に関する。このような疾患および状態は当技術分野において公知であり、骨量減少および脂肪塊の蓄積を含み得る様々な衰弱状態に関連する疾患および状態、例えば加齢による変性疾患および変性性ではない正常な加齢による状態が含まれると考えられる。
抗体は、1回で投与されてもよいが、より好ましくは複数回投与される。抗体は、毎日3回〜6ヶ月またはそれ以上の期間毎に1回、投与され得る。投与する段階は、毎日3回、毎日2回、毎日1回、2日毎に1回、3日毎に1回、毎週1回、2週間毎に1回、毎月1回、2ヶ月毎に1回、3ヶ月毎に1回、および6ヶ月毎に1回などのスケジュールに従ってよい。抗体はまた、ミニポンプを介して継続的に投与してもよい。抗体は、経口経路、粘膜経路、頬側の経路、鼻腔内経路、吸入経路、静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、または非経口経路を介して投与され得る。抗体は、1回、少なくとも2回、または少なくとも、状態が治療、軽減、もしくは治癒されるまでの期間、投与され得る。抗体は、一般に、状態が存在する間は投与される。抗体は、一般に、前述したような薬学的組成物の一部分として投与される。抗体の投薬量は、一般に、0.1mg/kg〜100mg/kg、より好ましくは0.5mg/kg〜50mg/kg、より好ましくは1mg/kg〜20mg/kg、およびさらにより好ましくは1mg/kg〜10mg/kgの範囲であると考えられる。抗体の血清濃度は、当技術分野において公知である任意の方法によって測定することができる。
抗体と付加的な治療物質との同時投与(併用療法)は、抗ミオスタチン抗体および付加的な治療物質を含む薬学的組成物を投与すること、ならびに1種が抗ミオスタチン抗体を含み、もう一方(他のもの)が付加的な治療物質を含む、2種またはそれ以上の別々の薬学的組成物を投与することを包含する。さらに、同時投与または併用療法は、一般に、抗体および付加的な治療物質が互いに同時に投与されることを意味するが、抗体および付加的な治療物質が別々の時点に投与される場合も包含する。例えば、抗体は、3日毎に1回投与してよいのに対し、付加的な治療物質は毎日1回投与する。あるいは、抗体は、障害の治療の前または後に、例えば、付加的な作用物質を用いた療法に患者が失敗した後に、付加的な治療物質と共に投与してよい。同様に、抗ミオスタチン抗体の投与は、運動および/または(栄養補給物を含む)食事補助物など他の療法の前または後に実施してもよい。抗体および1種または複数種の付加的な治療物質(併用療法)は、1回、2回、または少なくとも、状態が治療、軽減、もしくは治癒されるまでの期間、投与され得る。好ましくは、併用療法は、複数回実施される。併用療法は、毎日3回〜6ヶ月毎に1回、実施され得る。投与は、毎日3回、毎日2回、毎日1回、2日毎に1回、3日毎に1回、毎週1回、2週間毎に1回、毎月1回、2ヶ月毎に1回、3ヶ月毎に1回、および6ヶ月毎に1回などのスケジュールに従ってよく、またはミニポンプを介して継続的に投与してもよい。併用療法は、経口経路、粘膜経路、頬側の経路、鼻腔内経路、吸入経路、静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、または非経口経路を介して実施され得る。
遺伝子療法
本発明の核酸分子は、遺伝子療法を介して、それを必要とする患者に投与することができる。この療法は、インビボまたはエクスビボのいずれかでよい。好ましい態様において、重鎖および軽鎖の両方をコードしている核酸分子が、患者に投与される。より好ましい態様において、これらの核酸分子は、B細胞の染色体中に安定に組み込まれるように投与される。これは、B細胞が、抗体を産生するように特化されているためである。好ましい態様において、B細胞前駆体は、エクスビボでトランスフェクトまたは感染させられ、かつ、それを必要とする患者に再移植される。別の態様において、B細胞前駆体または他の細胞は、対象となる細胞型に感染することが公知であるウイルスを用いて、インビボで感染させられる。遺伝子療法用に使用される典型的なベクターには、リポソーム、プラスミド、およびウイルスベクターが含まれる。例示的なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスである。インビボまたはエクスビボのいずれかで感染させた後、抗体発現のレベルは、処置された患者から試料を採取し、かつ、当技術分野において公知であるか、または本明細書において考察する任意のイムノアッセイ法を用いることによって、モニターすることができる。
好ましい態様において、遺伝子療法の方法は、抗ミオスタチン抗体の重鎖またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与する段階、およびその核酸分子を発現させる段階を含む。別の態様において、遺伝子療法の方法は、抗ミオスタチン抗体の軽鎖またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与する段階、およびその核酸分子を発現させる段階を含む。より好ましい態様において、遺伝子療法の方法は、本発明の抗ミオスタチン抗体の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子および軽鎖もしくは抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与する段階、ならびにそれらの核酸分子を発現させる段階を含む。遺伝子療法の方法はまた、前述したもののような1種または複数種の付加的な治療物質を投与する段階も含み得る。
本発明をより良く理解することができるように、以下の実施例を説明する。これらの実施例は例証のために過ぎず、本発明の範囲を制限するものとして決して解釈されるべきではない。
実施例I
抗ミオスタチン抗体を産生するハイブリドーマの作製
本発明の抗体を以下のようにして調製し、選択し、かつ分析した：
8〜10週齢のXenoMouse(商標)マウスを、c末端成熟ミオスタチン(10μg/投与/マウス)(R&D Systems、カタログ番号788-G8)または完全長のカニクイザル成熟ミオスタチンのいずれかを腹腔内または後肢の足蹠に投与して免疫化した。この投与量を、3〜4週間に渡って7回繰り返した。融合の4日前に、PBS中ミオスタチンを最後にマウスに注射した。免疫化したマウスに由来する脾臓およびリンパ節のリンパ球を非分泌性骨髄腫P3-X63-Ag8.653細胞株と融合させ、かつこれらの融合細胞を、以前に説明されているように(GalfreおよびMilstein, Methods Enzymol. 73：3-46, 1981)、HAT選択に供した。ミオスタチンに特異的なヒトIgG2抗体またはIgG4抗体をすべてが分泌するハイブリドーマのパネルを回収した。
GDF8およびGDF11 ELISAアッセイ法のプロトコール：
ELISAアッセイ法を用いて、ミオスタチンまたはGDF11に結合する抗体を検出した。ミオスタチンまたはGDF11を96ウェルのイムロンマイクロタイタープレート(NUNC-Immuno(商標)プレートMaxiSorp(商標)表面、Nalge Nunc International、カタログ番号439454)上に、50mM炭酸水素ナトリウム緩衝液中4μg/mlの濃度にて、40℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、次いで0.1％Tween-20および0.5％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)でブロッキングした。ブロッキングしたELISAプレートに抗体を添加し、1時間インキュベートし、かつTween-20を含むPBSで洗浄した。結合は、抗ヒトIgG西洋ワサビペルオキシダーゼ(Pierce、カタログ番号31420)とそれに続くABTS(Pierce、カタログ番号37615)の添加によって検出した。比色測定をマイクロプレートリーダー中、405nmで実施した(本発明者らは、SpectraMax Plus 384, Molecular Devicesを使用した)。
さらに研究するために11種のハイブリドーマを選択し、かつ1_116_1、1_136_3、1_257_1、1_46_1、2_112_1、1_314_1、1_66_1、2_43_1、2_177_1、1_132_1、および1_268_1と名付けた。これらの11種のハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に従って、2005年2月10日にAmerican Type Culture Collection(ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209に寄託した。ハイブリドーマに以下の参照番号を割り当てた。
Figure 2008539241
実施例II
本発明に従って調製した抗ミオスタチン抗体の配列
本発明に従って作製した抗体の構造を解析するために、抗ミオスタチンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに由来する重鎖断片および軽鎖断片をコードする核酸をクローニングした。
抗体可変領域のクローニングおよび配列決定は、以下のようにして遂行した：
Fast-Trackキット(Invitrogen)を用いて、ミオスタチンで免疫化されたXenoMouse(商標)マウスに由来する約2×105個のハイブリドーマ細胞からマウスポリ(A)+mRNAを単離した。ランダムプライマーを用いて、mRNAからcDNAを合成した。ランダムにプライミングされたcDNAは、ヒトCγ2定常領域MG-40d
Figure 2008539241
またはCκ定常領域[hκP2; Green et al., 1994において以前に説明されている]に特異的なプライマーと組み合わせて、ヒトVHもしくはヒトVκファミリーに特異的な可変ドメインプライマー(Marks et al., 「Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes.」 Eur.J.Immunol. 21 ：985-991(1991))またはヒトVHのユニバーサルプライマー
Figure 2008539241
を用いて、増幅した。前述のプライマーを用いた、ポリ(A+)RNAからのPCR増幅により、抗ミオスタチンを産生するハイブリドーマに由来するヒト重鎖およびκ軽鎖の転写物をコードする核酸分子を得た。PCR生成物を、TAクローニングキット(Invitrogen)を用いてpCRII(Invitrogen)中にクローニングし、かつPrism色素ターミネーター配列決定キット(Applied Biosystems Inc)およびABI377配列決定機(Applied Biosystems Inc)を用いて、両方の鎖を配列決定した。MacVector(登録商標)(Accelrys, San Diego, CA)およびGeneworks(登録商標)(Hindmarsh, S.A.Australia)ソフトウェアプログラムを用いて、「V BASE配列ディレクトリ」(Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)に対してアライメントすることによって、すべての配列を解析した。
本発明に従って作製した抗体の完全長で発現される核酸配列を得るために、抗ミオスタチン抗体を産生するハイブリドーマに由来する完全長重鎖および軽鎖のコード領域をコードする核酸をクローニングした。クローニングおよび配列決定は、以下のようにして遂行した。RNeasy Mini Kit(Qiagen)を用いてポリ(A)+mRNAを単離し、かつオリゴ(dT)プライミングを使用するAdvantage RT-for-PCRキット(BD Biosciences)を用いて、mRNAからcDNAを合成した。オリゴ(dT)でプライミングしたcDNAを、ヒトVHまたはヒトVκの遺伝子セグメントの5'非翻訳領域(5'UTR)にハイブリダイズするように設計された縮重プライマー(表2Aおよび表2B)を、IGHG2もしくはIGHG4
Figure 2008539241
またはIGK
Figure 2008539241
の3'UTR中の領域に特異的な非縮重プライマーと組み合わせて使用する、2つの独立した反応において増幅させた。増幅は、Expand High Fidelity PCRキット(Roche)およびPTC-200 DNA Engine(MJ Research)を用いて、以下のサイクルで実現した：94℃で2分間;23×(94℃で30秒間、52℃で50秒間、72℃で2分間);72℃で8分間。重鎖反応および軽鎖反応の両方のために、2つの独立したPCRからのPCR生成物を、TOPO-TAクローニングキット(Invitrogen)を用いてpCR2.1中にクローニングし、かつ2種のクローンの両方の鎖を、Grills 16th BDTv3.1/dGTP化学(Applied Biosystems Inc)および3730xI DNA Analyzer(Applied Biosystems Inc)を用いて配列決定した。
（表２Ａ）重鎖および軽鎖の5'増幅プライマー：
Figure 2008539241
（表２Ｂ）抗ミオスタチン抗体の重鎖および軽鎖の増幅用に使用される5'プライマー：
Figure 2008539241
遺伝子使用の解析
抗体の核酸配列および予測されるアミノ酸配列から、各抗体鎖の遺伝子使用を同定した。表3は、本発明による抗体の選択されたハイブリドーマクローンの遺伝子使用を示す。
（表３）重鎖および軽鎖の遺伝子セグメントの使用：
Figure 2008539241
図19の配列アラインメントに示したように、フレームワーク領域の抗体成熟の間に発生した変異を改変して、生殖細胞系の配列に戻した。具体的には、モノクローナル抗体2_112_1(SEQ ID NO：26および77)の重鎖の残基12をIleからValに改変した。軽鎖(SEQ ID NO：28および79)においては、残基58をPheからIleに改変し、残基85をIleからValに改変した。抗体2_112_1の重鎖および軽鎖の特定の残基の変異は、プライマーを設計し、かつ製造業者の取扱い説明書に従ってStratagene社製のQuickChange Site Directed Mutagenesis Kitを用いることによって実施した。自動配列決定によって変異を確認し、かつ変異誘発された挿入物を発現ベクター中にサブクローニングした。これらの発現ベクターをNS0(ECACC 85110503番)およびHEK-293T細胞(American Type Culture Collection)にトランスフェクトして、本発明の組換え抗体を発現させた。復帰変異したフレームワーク領域を有する、結果として生じる抗体を抗体2_112_Kと呼ぶ。
実施例III
ヒト抗ミオスタチン抗体によるミオスタチンの阻害(A204ルシフェラーゼアッセイ法)
ミオスタチン応答性レポーター遺伝子アッセイ法(Thies,et al., Growth Factors,(2001)18：251-259を参照されたい)を用いて、活性なミオスタチンの生物活性をインビトロで評価した。このアッセイ法では、ルシフェラーゼに結合されたレポーターベクターpGL3(CAGA)15を使用する。CAGAボックス配列(AGCCAGACA)(SEQ ID NO：101)は、TGF-βに誘導される遺伝子PAI-1のプロモーター領域中のTGF-β応答エレメントであると報告されている(Zawel, et al.Mol.Cell,(1998)1 ：611-617)。このレポーターベクターは、CAGAボックスのコピー15個をpGL3-プロモーターベクター(Promega、カタログ番号E1761)のSmaI部位およびXhoI部位中に挿入することによって作製した。ヒト横紋筋肉腫細胞株A204(ATCC細胞番号HTB-82)を、Fugene6トランスフェクション試薬(Roche Diagnostics、カタログ番号1814443)を用いて、pGL3(CAGA)15およびCMVβ-GALで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、10％ウシ胎児血清、100U/mlストレプトマイシン、および100μg/mlペニシリンを添加したMcCoy5A培地(Invitrogen、カタログ番号16600)中で16時間培養した。細胞を飢餓培地(ストレプトマイシン、ペニシリン、および1mg/mlウシ血清アルブミンを含むMcCoy5A培地)に移し、次いで、37℃で6時間、ミオスタチン、GDF11、またはアクチビンで処理した。Dual-light(登録商標)ルシフェラーゼアッセイシステム(Applied Biosytems、カタログ番号T1004)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。ミオスタチンは、レポーターを約10倍まで活性化し、EC50は約8ng/mlである。GDF11は、非常に類似した応答でレポーターを活性化する。抗体の中和活性は、A204細胞に添加する前に30分間、ミオスタチンと共に抗体をプレインキュベートすることによって決定した。図1に示したように、本発明のヒト抗ミオスタチン抗体は、A204細胞において、ミオスタチンによって刺激されるルシフェラーゼ活性を阻害した。GDF11を用いた同様の実験も実施して、本発明の抗体の特異性を研究した。データを図1に要約する。大半の抗体は、GDF11よりもGDF8に対して、はるかに強力な中和活性を有する。モノクローナル抗体1_46_1および1_132_1は、GDF8およびGDF11の両方を等しい力価で中和する。
実施例IV
ヒト抗ミオスタチン抗体によるミオスタチンの阻害(L6β-ラクタマーゼアッセイ法)
抗ミオスタチン抗体の存在下でII型膜受容体に結合するミオスタチンを測定するためのインビトロアッセイ法を実施して、抗ミオスタチン抗体がそのような結合を阻害できるかどうかということ、およびそれらの阻害の程度を決定した。
L6 Auroraレポーターアッセイ法を実施して、活性なミオスタチンの生物活性をインビトロで評価した。L6ミオスタチンLD10は、β-ラクタマーゼレポーター遺伝子を安定に発現する細胞株である。挿入されたレポーター中のプロモーター領域は、Smad結合エレメント(SBE、GTCTAGAC(SEQ ID NO：102)、Zawel et al., Mol.Cell 1 ：611-17(1998))のコピー16個からなる。細胞を、10％の熱失活させたウシ胎児血清(FBS)、200〜400μg/ml Zeocin、100U/mlストレプトマイシン、および100μg/mlペニシリンを添加した高グルコースDMEM(Invitrogen、カタログ番号11995)中で培養した。1日目に96ウェルプレートに細胞を播種し、2日目の午後に、飢餓培地(Zeocin、ストレプトマイシン、ペニシリン、および0.1％FBSを含むDMEM)に移した。3日目の朝に、37℃で4時間、ミオスタチン、GDF11、またはアクチビンで細胞を処理した。製造業者の提案に従い、Aurora CCF2ローディングキットを用いて、β-ラクタマーゼ活性を解析した(Invitrogen、カタログ番号K1032)。
ミオスタチンは、smadの媒介によるレポーター発現を約2〜3倍まで活性化し、EC50は約5ng/mlであった。GDF11およびアクチビンは、非常に類似した応答でレポーターを活性化した。
抗体の中和活性は、LD10細胞にL6ミオスタチンを添加する前に30分間、ミオスタチンと共に抗体をプレインキュベートすることによって決定した。図2および図11に示したように、試験したヒト抗ミオスタチン抗体はすべて、約1nM〜約225nMの範囲でsmadタンパク質活性化を阻害した。
実施例V
ミオスタチンによって誘導されるSmad2リン酸化の阻害
(ウェスタンブロット)
HepG2ヒト肝細胞癌細胞(ATTC細胞番号HB-8065)を、10％ウシ胎児血清(FBS)、100U/mlストレプトマイシン、および100μg/mlペニシリンを添加した高グルコースDMEM(Invitrogen、カタログ番号11995)中で培養した。60〜70％コンフルエントな細胞を飢餓培地(ストレプトマイシン、ペニシリン、および0.5％FBSを含むDMEM)に一晩移した。ミオスタチンで細胞を30分間処理した。抗体の中和活性は、HepG2細胞に添加する前に30分間、ミオスタチンと共に抗体をプレインキュベートすることによって決定した。ウェスタンブロット用に細胞を溶解した。ウサギ抗リン酸化Smad2抗体(Cell Signalling、カタログ番号3101)を用い、次いで、抗ウサギAlex680(Molecular Probes、カタログ番号A21076)によってこれを検出して、リン酸化Smad2を検出した。リン酸化Smad2の量は、Odyssey Infrared Imager(Li-Cor)を用いて定量した。グリセルアルデヒド3‐リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)を標準化のために使用した。図3に示したように、試験したヒト抗ミオスタチン中和抗体はすべて、smad2リン酸化を阻害した。
実施例VI
ヒト抗ミオスタチン抗体によって亢進されるmyf5の発現
C2C12筋芽細胞(ATCC細胞番号CRL-1772)を、10％ウシ胎児血清(FBS)、100U/mlストレプトマイシン、および100μg/mlペニシリンを添加した高グルコースDMEM(Invitrogen、カタログ番号11995)中で培養した。300ng/mlミオスタチンで細胞を2時間処理した。抗体の中和活性は、C2C12細胞に添加する前に30分間、ミオスタチンと共に抗体をプレインキュベートすることによって決定した。細胞を回収し、かつRNeasyミニプレップキット(Qiagenカタログ番号74104)を用いてRNAを精製した。精製したRNAを、RiboGreen(登録商標)RNA Quantitation Kit(Molecular Probes、カタログ番号R11490)を用いて定量した。等量の全RNAをリアルタイムPCR解析のために使用して、myf5 RNAの発現を検出した。マウスmyf5 RNA検出用のプライマー/プローブセットをAssays-On-Demand(商標)遺伝子発現産物から購入した(Applied Biosystems、カタログ番号Hs00271574_m1)。使用したアッセイ条件は、製造業者の推奨に従った。配列検出システムABI7900(Applied Biosystems)においてワンステップRT-PCRを実施した。図4に示したように、本発明のヒト抗ミオスタチン中和抗体は、myf5の発現を亢進させた。1種類の非中和性のヒト抗ミオスタチン抗体、1_159_1はmyf5の発現を亢進させなかった。
実施例VII
ヒト抗ミオスタチン抗体による細胞分化の亢進
ミオスタチンによって媒介される筋芽細胞分化の阻害を抗体が抑制する能力を、C2C12筋芽細胞において評価した。C2C12細胞を、96ウェルプレート中のDMEM/20％FBS/ペニシリン-ストレプトマイシン200μl中に25,000細胞/ウェルの濃度で播種した。24時間後、培地を吸引し、HIT培地(DMEM/2％ウマ血清/ペニシリン-ストレプトマイシン)で細胞を1回ゆすぎ、かつHIT培地のみ200μlまたは300ng/ml GDF-8(R&D Systems)を添加したHIT培地200μlを、単独で、または様々な濃度の抗体と共に、添加した。48時間後、培地を吸引し、かつ、溶解緩衝液100μl(25mM Tris pH 7.5、3mM EDTA、1％ NP-40、1％デオキシコラート、0.1％SDS、および25ml溶解緩衝液中Roche Completeプロテアーゼインヒビター錠剤1個)中に細胞を溶解した。High Bind MA6000プレート(MSD P11XB-1番、Meso Scale Discovery、MSD)の個々のウェルに溶解物5μlをスポットし、1時間空気乾燥させ、Blocker A(MSD R93BA-2番)100μlを添加し、振とうしながら25℃で1時間インキュベーションし、PBS/0.05％Tween-20で4回洗浄し、胎児型MHC抗体(ATCC番号CRL-2039のハイブリドーマに由来する馴化培地)50μlを添加し、振とうしながら25℃で1.5時間インキュベーションし、前述のように4回洗浄し、抗体希釈液(MSD R50AA-2番)中で1：1000に希釈しておいたスルホTAG抗マウスIgG(MSD R32AC番)50μlを添加し、振とうしながら25℃で1.5時間インキュベーションし、前述のように4回洗浄し、1×Read Buffer(MSD R92TC-2番)150μlを添加し、かつSector Imager 6000(MSD)中で化学発光を解析することによって、溶解物中の胎児型ミオシン重鎖(MHC)レベルを決定した。図5に示したように、ヒト抗ミオスタチン中和抗体は、MHCアッセイ法において、ミオスタチンによって妨害された筋肉分化を元の方向に戻した。
実施例VIII
ミオスタチンペプチド結合
抗体結合を試験し、かつ位置確認するために、成熟GDF8から11種のペプチドを作製した(図6を参照されたい)。グルタルアルデヒドでコーティングしたELISAプレートおよびコーティングしていないELISAプレート(NUNC-Immuno(商標)プレートMaxiSorp(商標)表面、Nalge Nunc International、カタログ番号439454)上でペプチドELISAを実施した。グルタルアルデヒドでコーティングしたプレートは、グルタルアルデヒド(50％w/v)250μlを脱イオン水50mlと混合し、かつ各ウェルにその溶液200μlを添加することによって、調製した。プレートは、室温で少なくとも1時間インキュベートした。使用する前に、グルタルアルデヒドは、プレートを振って除き、かつペーパータオルに逆さまに叩きつけて、液体をすべて除去した。
ELISAプレートは、1.0μg/ウェル/50μl(炭酸水素ナトリウム緩衝液中、pH9.6)のペプチドで少なくとも4時間コーティングし、次いでブロッカー(1％BSA、1％エタノールアミン、pH7.4)200μlで最低4時間ブロッキングした。プレートを200μl/ウェルのPBSTで3回洗浄した。50μlの抗体試料(PBST、すなわち0.05％Tween-20を含むリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中1μg/ml)をウェルに1時間添加した。次いで、プレートをPBSTで3回洗浄した。PBST中で希釈した抗ヒトIgG西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(Pierce、カタログ番号31420)50μlをさらに1時間添加した。これらのウェルを再びTBSTで3回洗浄し、次いで脱イオン水で2回洗浄した。ABTS(MOSS)50μlを5〜20分間添加し、かつ、比色定量用プレートリーダーにおいて405nmでシグナルを検出した。結合実験の結果は図6に示す。11種のペプチドを図7に示す。
実施例IX
エピトープマッピング研究
製造業者のプロトコールに従ってBIACORE(商標)3000機器(Biacore International AB, Uppsala, SwedenおよびPiscataway, NJ)を用いて、交差競合実験を実施した。
実験は、BIACORE(商標)3000機器において、25℃、0.01M HEPES、pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％ Tween20中で実施した。標準的なアミンカップリング手順を用いて、CM5チップ(Biacore(商標))上にミオスタチンを固定化すると、約1300RU(レゾナンスユニット)が生じた。50nMの抗体試料を調製し、ペアで注入した。例えば、参照mAbを10分間注入した直後に、試験mAbを10分間注入した。表面を再生し、かつ逆の順序で注入を繰り返した。考え得る抗体ペアすべてに対してこの手順を繰り返した。抗体のペアに対して得られた全応答を、個々の各抗体のデュプリケートな注入に対して得られた応答と交差比較することにより、互いに競合的に結合する抗体、例えば抗原に結合する際に競合する抗体を発見した。デュプリケートな注入のいずれかに対して観察された応答より大きな応答は、異なるエピトープに結合することを示したのに対し、デュプリケートな注入に対して観察された応答に対して中程度の応答は、同じエピトープまたは重複もしくは隣接しているエピトープに結合することを示した。この実験の結果は図8に示し、かつ図13に要約する。
実施例X
細胞培養培地由来のミオスタチンの免疫沈降
免疫沈降研究を実施して、成熟GDF8および成熟GDF8/プロペプチド複合体に対するミオスタチン抗体の結合を試験した。293T細胞をGDF-8発現構築物でトランスフェクトした。トランスフェクション後7日目に、成熟GDF8および潜在的な複合体を含む馴化培地を回収した。馴化培地100μlを、ミオスタチン抗体10μgと共に4℃で16時間インキュベートした。プロテインA Dynabeads(Dynal, Norway)を添加し、かつ4℃で90分間インキュベートした。MPC-E磁気濃縮装置(Dynal, Norway)を用いて免疫沈降物を回収し、かつPBSで4回洗浄した。還元性試料緩衝液中に免疫沈降物を再懸濁し、かつ4％〜12％のBis- Tris NuPageゲル(Invitrogen)上に添加した。Odyssey赤外線イメージングシステム(Li-Cor)を用いてウェスタンブロット法を実施した。成熟GDF8およびプロセッシングされていないGDF8は、ヤギ抗ミオスタチン抗体(R&D systems、カタログ番号AF788)を用いて検出した。ウサギ抗プロペプチドポリクローナル抗体(施設内で作製)を用いて、プロペプチドおよびプロセッシングされていないGDF8の両方を検出した。図9に示したように、抗体2_112_1、抗体2_43_1、および抗体2_177_1は、成熟GDF8、成熟GDF8/プロペプチド複合体、およびプロセッシングされていないGDF8を免疫沈降させ、抗体1_66_1は、成熟GDF8および成熟GDF8/プロペプチド複合体を免疫沈降させた。他の抗体のどれも、成熟GDF8も、プロペプチドも、プロセッシングされていないGDF8も免疫沈降させなかった。レーン4は、1/10培地のローディングコントロールであり、レーン7は、培地のみによる免疫沈降の対照である。
実施例XI
マウス血清由来のミオスタチンの免疫沈降
免疫沈降研究を実施して、マウス血清由来の成熟GDF8に対するミオスタチン抗体の結合を試験した。マウス血清(Rockland、カタログ番号D208-00)200μlを、ミオスタチン抗体20μgと共に4℃で16時間インキュベートした。プロテインA Dynalbeadsを添加し、かつ4℃で90分間インキュベートした。MPC-E磁気濃縮装置(Dynal, Norway)を用いて免疫沈降物を回収し、かつPBSで4回洗浄した。還元性試料緩衝液中に免疫沈降物を再懸濁し、かつ4％〜12％のBis- Tris NuPageゲル(Invitrogen)上に添加した。Odyssey赤外線イメージングシステム(Li-Cor)を用いてウェスタンブロット法を実施した。ビオチン標識ヤギ抗ミオスタチン抗体(R&D systems、カタログ番号BAF788)を用いて、成熟GDF8を検出した。図10に示したように、抗体2_112_1、抗体2_43_1、および抗体2_177_1はマウス血清由来の成熟GDF8を免疫沈降させたが、1_116_1および1_66_1は沈降させることができなかった。血清中の成熟GDF8が、プロペプチド、FLRG、およびGASAP1など多くの阻害性タンパク質に結合することは公知である(Hill et al. (2002)The myostatin propeptide and the follistatin-related gene are inhibitory binding proteins of myostatin in normal serum.J.Biol.Chem. 277：40735-40741、Hill et al. (2003)Regulation of myostatin in vivo by growth and differentiation factor-associated serum protein-1 ：a novel protein with protease inhibitor and follistatin domains. Mol.Endocrin. 17(6)：1144-1154)。本実験は、抗体2_112_1、抗体2_43_1、および抗体2_177_1が、真に、非競合的な中和抗体、すなわちミオスタチンを中和するが、血清中に存在する阻害性結合タンパク質の結合を妨害しない抗体であることを示唆する。このような非競合的な中和抗体は、インビボで有利であると思われる。
実施例XII
インビボでの抗ミオスタチン抗体の比較
10mg/kgのモノクローナル抗体2_43_1、2_177_1、および2_112_Kまたはビヒクル(PBS)を1週1回、5週間皮下投与して、5週齢のKKAy/aマウス(The Jackson Laboratory(Bar Harbor, Maine))を処置した。研究の最後に、動物を安楽死させ、かつ腓腹筋-足底筋-ヒラメ筋(GPS)群、前脛骨筋(TA)群、および四頭筋(Quads)群を切断し、かつ計量した。2_112_K抗体で処置すると、GPS(+15.5％)およびQuads(+30.6％)の筋肉の絶対質量は有意に増加した(p<0.05)。2_177抗体の場合、Quads(+11.5％)のみが有意に増加した。抗体2_112_Kによる処置後TAは増加したが(+16.8％)、この増加は統計学的に有意ではなかった(p=0.330)。5週間の間に体重は増加したが、研究中の任意の時点で、処置群の間に有意な差異はなかった。筋肉質量を体重に対して補正した場合(筋肉質量指数)、2_112_K処置群でのみ有意な差異があった(GPSにおいて+11.4％、およびQuadsにおいて+20.6％)。この実験の結果は図14および図15に示す。
実施例XIII
抗体のインビボでの薬理学および有効性
抗体2_112_Kのインビボでの薬理学および有効性をマウスにおいて評価した。マウスの抗ヒト抗体(MAHA)応答に起因する潜在的な免疫調節を回避するために、免疫を欠損した重症複合免疫不全(SCID)ベージュマウスにおいてインビボ研究を実施した。これらのマウスに10mg/kg/週の抗体2_112_Kを5週間皮下投与すると、骨格筋質量は19％〜25％増加し、筋力は約15％増加した。この処置の期間を10週間に延長すると、筋力は21％までさらに増加したが、筋肉質量はそれ以上増加しなかった(18％〜27％)。同様に、50mg/kg/週の用量を10週間皮下投与しても、10mg/kg/週の場合と比較してより多い増加は筋肉質量においても筋力においても起こらなかった。この実験の結果は図16に示す。
実施例XIV
用量反応および濃度反応の影響
効果の無い用量から実現可能な最大用量までの範囲の用量(0.01、0.1、1、および10mg/kg/週)をSCIDマウスに皮下投与した場合、抗体2_112_Kは、5週間後に、骨格筋質量をそれぞれ約0％、3％、7％、および28％、用量依存的に増加させた(図17)。この処置の期間を10週間に延長しても、筋肉質量はそれ以上まったく増加しなかったが、脛骨筋の筋力をさらに5％、わずかに増加させる傾向があった。また、抗体は、0.01、0.1、1.0、および10mg/kg/週で5週間投与した場合、対照のPBSに比べて+10％、+1％、-10％、-22％だけ、これらのマウスの体脂肪組成を用量依存的に改変した。
用量反応データおよび濃度反応データの4パラメーター非線形解析により、ED50値およびEC50値はそれぞれ3.6mg/kg/週および20.4mg/mL(約136nM)と推定され、10mg/kg/週の用量によって達成された筋肉質量の増加が最大限の有効性であることが推測された。抗体2_112_Kの用量または血清濃度と筋肉質量の変化との関係を図18に示す。
実施例XV
筋萎縮を軽減するための抗体の有効性
10週齢のKKマウス(JAX研究室、Bar Harbor, Maine)を無作為に次の3群に分けた：プラセボ/ビヒクル、コルチゾン/ビヒクル、およびコルチゾン/抗体2_112_K。マウスにビヒクル(PBS)または10mg/kg抗体2_112_Kのいずれかを5週間皮下投薬し、続いてプラセボまたはコルチゾンのペレット剤を埋め込んだ。5日後、マウスを安楽死させ、屠殺し、かつ筋肉質量および脂肪パッド質量を評価した。筋肉質量を評価するために、腓腹筋-足底筋-ヒラメ筋(GPS)群、前脛骨筋(TA)群、および四頭筋(quads)群を切断し、かつ計量した。コルチゾンの埋め込みにより、筋肉質量が、プラセボ/ビヒクルでのレベルの85.1±2.2％(GPS)、85.5±3.9％(TA)、および84.1±3.7％(quads)まで有意に減少した(p<0.05)。抗体2_112_Kによる処置により、プラセボ/ビヒクルでのレベルのコルチゾンによって誘導される萎縮は完全に改善されて、GPS(102.0±2.2％)、TA(99.5±3.6)、およびquads(104.6±2.8％)となった。グラム体重当たりで標準化した場合、値は同様であった。この効果が筋肉質量に固有であるかどうかを試験するために、脂肪パッド質量を決定した。脂肪パッド質量については、鼠径部、精巣上体、および腹部の脂肪パッドを切断し、かつ計量した。抗体2_112-Kで処置しても、コルチゾン埋め込みに起因する脂肪パッド質量の減少は有意に(p<0.05)減少(spare)せず、鼠径部脂肪パッド(コルチゾン/ビヒクル(75.1±4.7％)およびコルチゾン/2_112_K(82.3±5.3％))、精巣上体脂肪パッド(コルチゾン/ビヒクル(79.3±5.0％)およびコルチゾン/2_112_K(87.1±3.9％))、または腹部脂肪パッド(コルチゾン/ビヒクル(79.5±5.5％)およびコルチゾン/2_112_K(82.2±4.2％))であった。値は、プラセボ/ビヒクルの場合の脂肪パッドに比べて表した。この実験の結果は図20Aおよび図20Bに示す。
実施例XVI
ミオスタチン抗体のプロテインA精製
1〜2リットルの(10倍)濃縮したHEK293培地をろ過(2ミクロン)し、かつ平衡化したプロテインAカラム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)(53mL、カラム容量の5倍量のD-PBS、pH7.0で平衡化)に2mL/分で添加した。カラム容量の5倍量の酢酸緩衝液(20mM酢酸ナトリウム、pH5.5)でこのカラムを洗浄し、かつカラム容量の4倍量のpH3.2〜3.5、酢酸ナトリウム(20mM)でタンパク質を溶出させた。溶出物のpHを水酸化ナトリウムでpH5.5に調整し、かつ必要な場合にはろ過した。最後に、この材料を10mg/mLまで濃縮し、140mM塩化ナトリウム、20mM酢酸ナトリウム、pH5.5中で透析し、ろ過し、かつ4℃で保存した。
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願のそれぞれが具体的かつ個別に参照により組み入れられるように示されるかのように、参照により本明細書に組み入れられる。前述の本発明は、理解を明確にするために、例示および例としていくらか詳しく説明してきたが、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、いくつかの変更および修正を加え得ることは、本発明の教示に照らして、当業者には容易に明らかになると考えられる。
ミオスタチン応答性レポーター遺伝子アッセイ法の結果を示す。図に示したように、抗ミオスタチン中和抗体は、A204細胞においてミオスタチンによって誘導されるルシフェラーゼ活性を阻害する。ヒト抗体変異体の1_116_1L-Q45K;1_257-1L-L21I;1_314_1H-T92A、および2_112_1H-I12V、L-F58I、I85Vは、野生型抗体と同程度、ルシフェラーゼ活性を阻害した。 L6オーロラ(Aurora)β-ラクタマーゼアッセイ法の結果を示す。図に示したように、抗ミオスタチン中和抗体は、L6ラット筋芽細胞においてミオスタチンによって誘導されるβ-ラクタマーゼ活性を阻害する。ヒト抗体変異体の1_116_1L-Q45K;1_257-1L-L21I;1_314_1H-T92A、および2_112_1H-I12V、L-F58I、I85Vは、野生型抗体と同程度、β-ラクタマーゼ活性を阻害した。 ウェスタンブロットの結果を示す図である。図に示したように、本発明の抗ミオスタチン中和抗体は、ウェスタンブロットによると、HepG2細胞においてミオスタチンによって誘導されるsmad2リン酸化を阻害する。 myf5 mRNA発現アッセイ法の結果を示す図である。(A)抗ミオスタチン中和抗体1_268_1、2_177_1、および2_112_1は、C2C12マウス筋芽細胞においてミオスタチンによって阻害されるmyf5遺伝子発現をレスキューしたのに対し、非中和抗体1_159_1はレスキューすることができなかった。Myf5 mRNAレベルは、TaqMan PCRによって検出された。(B)1_116_1は、用量依存的な様式で、myf5遺伝子発現をレスキューした。 C2C12筋細胞分化アッセイ法の結果を示す図である。(A)抗ミオスタチン中和抗体2_43_1、1_314_1、および1_257_1は、C2C12マウス筋細胞においてミオスタチンによって妨害された筋肉分化をレスキューした。胎児型ミオシン重鎖(MHC)のタンパク質レベルを指標として使用してC2C12分化を測定した。(B)抗体2_112_1、1_46_1、および1_116_1は、ミオスタチンによって妨害されたC2C12の筋肉分化をレスキューした。 抗ミオスタチン抗体結合を試験するために成熟GDF8(SEQ ID NO：89)から作製したペプチドを示す。小文字のアミノ酸は、GDF11と異なるアミノ酸である。 ペプチド結合の要約を示す。図に示したように、一部の抗体は、いかなるペプチドにも結合しない。一部の抗体は、連続していないペプチドに結合する。 ヒト抗ミオスタチン抗体のペプチド結合を図解した、予測されるGDF8構造である。GDF8構造は、SWISS-MODELを用いて作製した。SWISS-MODELは、完全に自動化されたタンパク質構造ホモロジーモデリングサーバーであり、ExPASyウェブサーバーを介して、またはDeepViewプログラム(Swiss Pdb-Viewer)からアクセス可能である。最初の7つのアミノ酸は、予測された構造体から無くなっていた。成熟GDF8は、ホモ二量体タンパク質である。１つのサブユニットのみを示す。本明細書において開示される抗体は、ホモ二量体としてGDF8に結合する。図に示したように、ヒトモノクローナル抗体2_43_1、2_112_1、および2_177_1は、ペプチド1およびペプチド5の双方に結合する。ペプチド1およびペプチド5は空間的に近接しているが、一次構造においては近接していない。 ペプチド1〜11のアミノ酸配列および対応する配列識別子(SEQ ID NO：103〜113)を示す。 エピトープビニング(binning)を示す図である。本発明のヒト抗ミオスタチン抗体のエピトープ結合を、BIAcore(商標) 3000機器を用いて、交差競合実験によってマッピングした。抗体は、印を付けた囲い枠として示す。１つの円の中の抗体は、重なっている円の中の抗体と競合する。例えば、抗体1_46_1は抗体1_136_3と競合するが、抗体1_46_1は、抗体1_268_1とは競合しない。2種またはそれ以上の抗体が同じ円の中にある場合、それらの個別の結合は区別することができない。 本発明のヒト抗ミオスタチン抗体が、成熟GDF8および成熟GDF8/プロペプチドの潜在的複合体を沈降させる能力を試験するための免疫沈降研究の結果を示す。GDF8をトランスフェクトした293T細胞を含む馴化培地を使用した。図に示したように、抗体2_112_1、抗体2_43_1、および抗体2_177_1は、成熟GDF8、成熟GDF8/プロペプチド複合体、およびプロセッシングされていないGDF8を沈降させた。抗体1_66_1は、成熟GDF8および成熟GDF8/プロペプチド複合体を沈降させた。他の抗体は、成熟GDF8も、プロペプチドも、プロセッシングされていないGDF8も沈降させなかった。レーン4は、1/10培地のローディングコントロールであり、レーン7は、培地のみによる免疫沈降の対照である。 本発明の抗ミオスタチン抗体が、マウス血清由来の成熟GDF8を沈降させる能力を試験するための免疫沈降研究の結果を示す。図に示したように、抗体2_112_1、抗体2_43_1、および抗体2_177_1はマウス血清由来の成熟GDF8を沈降させたが、抗体1_116_1および抗体1_66_1は沈降させることができなかった。 成熟ヒトGDF8および成熟ヒトGDF11の配列アラインメントである。成熟GDF8(SEQ ID NO：89)および成熟GDF11(SEQ ID NO：90)は、約90％一致するアミノ酸配列を共有している。成熟GDF8および成熟GDF11のどちらも、ホモ二量体を形成する。成熟GDF8または成熟GDF11のどちらも9個のシステインを有し、これらは、内部ジスルフィド結合4つおよび分子間ジスルフィド結合１つを形成している。図に示したように、互いに結合してジスルフィド結合を形成するシステインに、同じ点またはプラス記号で印を付けている。分子間ジスルフィド結合を形成する1つのシステイン(cys73)に星の印を付けた。SWISS-MODELを用いてGDF8構造を予測した(図6Cを参照されたい)。 インビトロアッセイ法のデータを要約した表である。 遺伝子の用法、エピトープビニング、およびペプチド結合を要約した表である。 抗ミオスタチン抗体によるインビボ処置後のマウスの筋肉質量に対する影響を、腓腹筋-足底筋-ヒラメ筋(GPS)、前脛骨筋(TA)、および四頭筋(Quads)について、ビヒクルの場合と比較して示す。 抗ミオスタチン抗体によるインビボ処置後のマウスの筋肉質量に対する影響を、腓腹筋-足底筋-ヒラメ筋(GPS)、前脛骨筋(TA)、および四頭筋(Quads)について、ビヒクルの場合と比較して示す。 抗ミオスタチン抗体(2_112_K)によるインビボ処置後の、SCIDマウスの筋肉の重量および強度に対する影響を示す。 様々な用量の抗ミオスタチン抗体(2_112_K)によるインビボ処置後の、SCIDマウスの筋肉の重量対する影響を示す。 様々な用量の抗ミオスタチン抗体(2_112_K)および筋肉重量に対するそれらの影響の用量応答解析である。 様々な用量の抗ミオスタチン抗体(2_112_K)および筋肉重量に対するそれらの影響の濃度応答解析である。 抗体2_112_1(重鎖：SEQ ID NO：77;軽鎖：SEQ ID NO：79)および抗体2_112_K(重鎖：SEQ ID NO：118;軽鎖：SEQ ID NO：120)の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアライメントである。 抗ミオスタチン抗体(2_112_K)と共にコルチゾンでインビボ処置した後のマウスの筋肉質量に対する影響を、腓腹筋-足底筋-ヒラメ筋(GPS)、前脛骨筋(TA)、および四頭筋(Quads)について、ビヒクルの場合と比較して示す。 抗ミオスタチン抗体(2_112_K)と共にコルチゾンでインビボ処置した後のマウスの脂肪質量に対する影響を、鼠径部、精巣上体、および腹部の脂肪パッド質量について、ビヒクルの場合と比較して示す。

Claims (22)

  1. GDF11よりも少なくとも50倍、選択的にミオスタチンに結合し、かつアクチビンのI型受容体またはII型受容体に結合するミオスタチンを阻害する、ミオスタチンに特異的に結合する、ヒトモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、もしくはヒト化モノクローナル抗体、またはそれらの抗原結合部分。
  2. 以下からなる群より選択される少なくとも1種の特性を有する、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
    (a)ミオスタチンに結合する際に、以下からなる群より選択される抗体と競合する
    Figure 2008539241
    ;ならびに
    (b)以下からなる群より選択される抗体と同じミオスタチンエピトープに結合する
    Figure 2008539241
    。
  3. 以下を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
    (a)SEQ ID NO：45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、および118のいずれか1つにおいて示されるアミノ酸配列に含まれている、順番に並んだ重鎖CDR、すなわちCDR1、CDR2、およびCDR3とアミノ酸配列が少なくとも90％一致する、順番に並んだCDRセット、すなわちCDR1、CDR2、およびCDR3;
    (b)SEQ ID NO：47、51、55、59、63、67、71、75、83、87、および120のいずれか1つにおいて示されるアミノ酸配列に含まれている、順番に並んだ軽鎖CDR、すなわちCDR1、CDR2、およびCDR3とアミノ酸配列が少なくとも90％一致する、順番に並んだCDRセット、すなわちCDR1、CDR2、およびCDR3;または
    (c)(a)の第1のCDRセットおよび(b)の第2のCDRセット。
  4. ミオスタチンに特異的に結合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
    (a)重鎖が、
    Figure 2008539241
    からなる群より選択される抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3アミノ酸配列を含み;
    (b)軽鎖が、
    Figure 2008539241
    からなる群より選択される抗体の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3アミノ酸配列を含み;または
    (c)該抗体が、(a)の重鎖および(b)の軽鎖を含む、
    モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  5. 以下からなる群より選択されるモノクローナル抗体：
    (a)SEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：4において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
    (b)SEQ ID NO：6およびSEQ ID NO：8において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
    (c)SEQ ID NO：10およびSEQ ID NO：12において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
    (d)SEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：16において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
    (e)SEQ ID NO：18およびSEQ ID NO：20において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
    (f)SEQ ID NO：22およびSEQ ID NO：24において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
    (g)SEQ ID NO：26およびSEQ ID NO：28において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
    (h)SEQ ID NO：30およびSEQ ID NO：32において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
    (i)SEQ ID NO：34およびSEQ ID NO：36において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
    (j)SEQ ID NO：38およびSEQ ID NO：40において示されるアミノ酸配列を含む抗体;
    (k)SEQ ID NO：42およびSEQ ID NO：44において示されるアミノ酸配列を含む抗体;ならびに
    (l)SEQ ID NO：115およびSEQ ID NO：117において示されるアミノ酸配列を含む抗体。
  6. 以下からなる群より選択されるモノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
    (a)SEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：4において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
    (b)SEQ ID NO：6およびSEQ ID NO：8において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
    (c)SEQ ID NO：10およびSEQ ID NO：12において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
    (d)SEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：16において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
    (e)SEQ ID NO：18およびSEQ ID NO：20において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
    (f)SEQ ID NO：22およびSEQ ID NO：24において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
    (g)SEQ ID NO：26およびSEQ ID NO：28において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
    (h)SEQ ID NO：30およびSEQ ID NO：32において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
    (i)SEQ ID NO：34およびSEQ ID NO：36において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
    (j)SEQ ID NO：38およびSEQ ID NO：40において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;
    (k)SEQ ID NO：42およびSEQ ID NO：44において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分;ならびに
    (l)SEQ ID NO：115およびSEQ ID NO：117において示される可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合部分。
  7. 第1のCDR1、第1のCDR2、および第1のCDR3を含む第1のCDR配列セット、ならびに第2のCDR1、第2のCDR2、および第2のCDR3を含む第2のCDR配列セットを含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該第1のCDRセットおよび該第2のCDRセットが、それぞれ順番に並んで、以下の、順番に並んだCDR1、CDR2、およびCDR3配列と少なくとも90％一致する、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
    (a)それぞれSEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：4;
    (b)それぞれSEQ ID NO：6およびSEQ ID NO：8;
    (c)それぞれSEQ ID NO：10およびSEQ ID NO：12;
    (d)それぞれSEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：16;
    (e)それぞれSEQ ID NO：18およびSEQ ID NO：20;
    (f)それぞれSEQ ID NO：22およびSEQ ID NO：24;
    (g)それぞれSEQ ID NO：26およびSEQ ID NO：28;
    (h)それぞれSEQ ID NO：30およびSEQ ID NO：32;
    (i)それぞれSEQ ID NO：34およびSEQ ID NO：36;
    (k)それぞれSEQ ID NO：38およびSEQ ID NO：40;
    (l)それぞれSEQ ID NO：42およびSEQ ID NO：44;ならびに
    (m)それぞれSEQ ID NO：115およびSEQ ID NO：117。
  8. 第1のCDR1、第1のCDR2、および第1のCDR3を含む第1のCDR配列セット、ならびに第2のCDR1、第2のCDR2、および第2のCDR3を含む第2のCDR配列セットを含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該第1のCDRセットおよび該第2のCDRセットが、それぞれ、以下の、順番に並んだCDR1、CDR2、およびCDR3配列である、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
    (a)それぞれSEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：4;
    (b)それぞれSEQ ID NO：6およびSEQ ID NO：8;
    (c)それぞれSEQ ID NO：10およびSEQ ID NO：12;
    (d)それぞれSEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：16;
    (e)それぞれSEQ ID NO：18およびSEQ ID NO：20;
    (f)それぞれSEQ ID NO：22およびSEQ ID NO：24;
    (g)それぞれSEQ ID NO：26およびSEQ ID NO：28;
    (h)それぞれSEQ ID NO：30およびSEQ ID NO：32;
    (i)それぞれSEQ ID NO：34およびSEQ ID NO：36;
    (k)それぞれSEQ ID NO：38およびSEQ ID NO：40;
    (l)それぞれSEQ ID NO：42およびSEQ ID NO：44;ならびに
    (m)それぞれSEQ ID NO：115およびSEQ ID NO：117。
  9. SEQ ID NO：115において示される重鎖アミノ酸配列、およびSEQ ID NO：117において示される軽鎖アミノ酸配列を含む、ミオスタチンに特異的に結合するモノクローナル抗体。
  10. SEQ ID NO：115およびSEQ ID NO：117に含まれる可変領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  11. SEQ ID NO：115およびSEQ ID NO：117に含まれるCDR、すなわちCDR1、CDR2、およびCDR3を含む、ミオスタチンに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  12. ミオスタチンのペプチド1部分およびペプチド5部分に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、ペプチド1がSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を含み、かつペプチド5がSEQ ID NO：107のアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  13. PTA-6566、PTA-6567、PTA-6568、PTA-6569、PTA-6570、PTA-6571、PTA-6572、PTA-6573、PTA-6574、PTA-6575、およびPTA-6576からなる群より選択されるATCC寄託指定番号を有する細胞によって産生される抗体。
  14. 請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
  15. 請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体もしくは抗原結合部分、または請求項14記載の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む方法であって、該抗体、抗原結合部分、または薬学的組成物がミオスタチン活性を阻害し、該対象が、筋肉質量の増加、骨格筋発達の促進、筋萎縮障害の治療、または骨格筋成長の促進を必要としている、方法。
  16. 請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体もしくは抗原結合部分、または該抗体もしくは該抗原結合部分の重鎖もしくは軽鎖を産生する、単離された細胞株。
  17. 請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体の重鎖もしくはその抗原結合部分または軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
  18. ミオスタチン活性を阻害する、請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与する段階を含む方法であって、該対象が、グルコース恒常性を改善すること、脂肪質量を減少させること、インスリン感受性を上昇させること、腎機能を改善すること、脂肪蓄積を減少させること、骨粗しょう症、骨減少症、変形性関節症、および骨折を含む、骨量減少を特徴とする疾患もしくは状態を治療、予防、もしくは抑制すること、代謝症候群を治療すること、または該対象が糖質コルチコイドもしくはステロイドホルモンを用いた治療を受けている期間中に糖質コルチコイドもしくはステロイドホルモンの持続的投与に起因する筋萎縮に対抗することを必要としている、方法。
  19. ミオスタチン活性を阻害する請求項1〜13のいずれか一項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を対象に投与する段階を含む、それを必要としている該対象においてミオスタチン活性を低下させるための方法。
  20. ミオスタチン活性を阻害する請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分を対象に投与する段階を含む、それを必要としている該対象において加齢に伴う筋肉質量の減少を逆転させるための方法。
  21. ヒトモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む哺乳動物宿主細胞株であって、該抗体またはその一部分が、以下からなる群より選択される少なくとも1種の特性を有する、哺乳動物宿主細胞株：
    (a)ミオスタチンに結合する際に、
    Figure 2008539241
    からなる群より選択される抗体と競合する;
    (b)
    Figure 2008539241
    からなる群より選択される抗体と同じミオスタチンエピトープに結合する;
    (c)PTA-6566、PTA-6567、PTA-6568、PTA-6569、PTA-6570、PTA-6571、PTA-6572、PTA-6573、PTA-6574、PTA-6575、およびPTA-6576からなる群より選択されるATCC寄託指定番号を有するハイブリドーマ細胞によって産生される抗体と同じアミノ酸配列を有する抗体である;ならびに
    (d)ATCC寄託指定番号PTA-6566、PTA-6567、PTA-6568、PTA-6569、PTA-6570、PTA-6571、PTA-6572、PTA-6573、PTA-6574、PTA-6575、およびPTA-6576からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株である。
  22. ミオスタチン活性を阻害する請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分を対象に投与する段階を含む、それを必要としているウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、魚、イヌ、およびネコにおいて、筋肉成長、体重増加を促進するか、または脆弱化の予防を援助するための方法。
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