TW201512219A - 針對ＩＬ－１β及／或ＩＬ－１７之雙特異性結合蛋白 - Google Patents

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TW201512219A
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disease
seq
binding protein
binding
syndrome
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TW103109785A
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Tariq Ghayur
Jijie Gu
Maria Harris
Carrie Goodreau
Sonal Saluja
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Abbvie Inc
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Abstract

本發明提供結合IL-1β及/或IL-17之經工程改造之多價及多特異性結合蛋白，以及製備方法及在預防、診斷及/或治療疾病方面之用途。

Description

針對IL-1β及/或IL-17之雙特異性結合蛋白
本發明提供結合IL-1β及/或IL-17之多價及多特異性結合蛋白、製備方法及其在診斷、預防及/或治療急性及慢性發炎性疾病、癌症及其他疾病方面之用途。
經工程改造之蛋白質，諸如能夠結合兩個或兩個以上抗原之多特異性結合蛋白，為此項技術中已知的。此類多特異性結合蛋白可使用細胞融合、化學結合或重組DNA技術產生。此項技術中已知多種多特異性結合蛋白結構且許多結構及方法具有明顯缺點。
已使用四源雜交瘤技術(quadroma technology)製備雙特異性抗體。然而，利用此技術引起之錯誤配對副產物之存在及顯著降低之產率意味著需要複雜的純化程序。亦可藉由兩個不同mAb之化學結合來製備雙特異性抗體。然而，此方法無法得到同源製劑。
先前所用之其他方法包括用異雙官能交聯劑偶聯兩個親本抗體、產生串聯單鏈Fv分子、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、單鏈雙功能抗體及二-雙功能抗體。然而，該等方法各自具有缺點。此外，亦已描述在IgG重鏈中包含兩個Fab重複且能夠結合四個抗原分子之多價抗體構築體(參看PCT公開案第WO 0177342號及Miller等人(2003)J.Immunol.170(9)：4854-61)。
美國專利第7,612,181號(以全文引用之方式併入本文中)提供了一種能夠以高親和力結合兩個或兩個以上抗原的新穎結合蛋白家族，其 稱為雙重可變結構域結合蛋白(DVD結合蛋白)或雙重可變結構域免疫球蛋白(DVD-IgTM)。DVD-Ig分子為可用於同時結合同一分子上之兩個不同抗原決定基或結合兩個不同分子之蛋白質。DVD為包含融合至N末端恆定區之兩個可變結構域的獨特結合蛋白。該等可變結構域可直接彼此融合或經由具有匹配長度及胺基酸組成之合成肽連接子連接。DVDIg可工程改造成具有完整功能性Fc結構域，使其介導能適當之效應功能。歸因於所選可變結構域對之可撓性、兩個抗原結合結構域之取向及接合其之連接子之長度，DVD型式可提供新穎治療模式。
儘管此項技術中提供了多種結構，其中一些具有優點及缺點，但製備具有特定特性且結合至特定靶之多價結合蛋白需要特定構築體。另外，新的可變結構域序列可進一步改善結合蛋白之特性。舉例而言，仍需要展現結合至IL-1β及/或IL-17之較佳靶向性及/或所需功效，例如以預防、診斷及/或治療自體免疫病症、發炎性病症或神經病症的構築體。因此，本文揭示了使用美國專利第7,612,181號(以全文引用之方式併入本文中)中所揭示之結合蛋白構架且含有特定第一多肽鏈及第二多肽鏈的雙重可變結構域免疫球蛋白，該等多肽鏈各自包含第一及第二可變結構域，該等可變結構域包含形成針對諸如IL-1β及/或IL-17之結合靶之功能性結合位點的序列(例如，選自表1中所列序列之序列)。在一些實施例中，該結合蛋白之第一多肽鏈及第二多肽鏈各自獨立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中：VD1為第一可變結構域；VD2為第二可變結構域；C為恆定結構域；X1為連接子；X2為存在或不存在之Fc區；n為0或1，且其中在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上之該等VD1結構域形成針對IL-1β或IL-17之第一功能性靶結合位點，且在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上之該等VD2結構域形成針對IL-1β或IL-17之第二功能性靶結合位點。在一些實施例中，在每一多肽鏈上之該第一可變結構域及該第二可變結構域(亦即，VD1 及VD2)之序列係選自表1中之序列，由此形成功能性結合位點。在一些實施例中，該第一可變結構域及該第二可變結構域之序列各自含有選自表1中所列序列之三個CDR(亦即，CDR 1-3)且其係以與表1中所示相同之次序佈置，由此形成功能性結合位點(亦即，該等結合結構域能夠結合至其靶抗原IL-1β或IL-17)。在一些實施例中，在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上的配對之可變結構域序列(亦即，在第一鏈上之VD1序列與在第二鏈上之VD1序列配對且在第一鏈上之VD2序列與在第二鏈上之VD2序列配對)形成針對結合靶IL-1β及/或IL-17之功能性結合位點。在一些實施例中，該等結合蛋白能夠以改善之結合親和力及/或中和效力結合至IL-1β及/或IL-17。
IL-1超家族包含具有多種生物學及生理學作用之發炎性過程介體，該等發炎性過程包括發熱、前列腺素合成(在例如纖維母細胞、肌肉細胞及內皮細胞)、T淋巴細胞活化及白介素-2產生。IL-1超家族之原始成員為IL-1α、IL-1β及IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra、IL-1RA、IL-1ra、IL-1Rα)。IL-1α及IL-1β為針對感染之免疫防禦中所涉及之促炎性細胞激素。IL-1α及IL-1β均係由巨噬細胞、單核細胞及樹突狀細胞產生。該等細胞激素增加內皮細胞上黏附因子之表現，從而使白血球能夠移位至感染部位且重新設定下丘腦體溫調節中心，引起體溫增加，其表現為發熱。因此，IL-1通常稱為內源性熱原質。IL-1對於調控血細胞生長亦很重要。周圍組織中IL-1β之產生亦已與發熱相關之痛覺過敏(對疼痛之敏感性增加)關聯(Morgan等人(2004)Brain Res.1022(1-2)：96-100)。IL-1使與疼痛相關之環加氧酶-2(COX-2)之表現上調。IL-1α及IL-1β亦具有類似生物特性，包括誘導發熱、慢波睡眠及嗜中性球增多症、T淋巴細胞及B淋巴細胞活化、纖維母細胞增殖、某些細胞之細胞毒性、誘導膠原蛋白酶、合成肝急性期蛋白以及增加集落刺激因子及膠原蛋白之產生。
白介素-17(IL-17，又稱為IL-17A)為一種由活化之T細胞在炎症部位處分泌的20-30 kD同二聚醣蛋白。IL-17藉由誘導各種組織中多種黏附分子、發炎性細胞激素及趨化因子之產生以募集單核細胞及嗜中性白血球至炎症部位來充當促炎性細胞激素。IL-17亦在造血祖細胞之成熟中起到重要作用。IL-17之不當或過度產生與包括類風濕性關節炎、哮喘、狼瘡、同種異體移植排斥反應、其他發炎性或自體免疫性疾病及癌症在內之各種疾病或病症的病理學相關。
此項技術中需要能夠結合IL-1β及/或IL-17之改善之多價結合蛋白。本文提供了結合IL-1β及IL-17之新穎結合蛋白。
結合蛋白
在一些實施例中，揭示了一種包含第一多肽鏈及第二多肽鏈之結合蛋白，該等多肽鏈各自獨立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中：VD1為第一可變結構域；VD2為第二可變結構域；C為恆定結構域；X1為連接子；X2為存在或不存在之Fc區；n在第一鏈及第二鏈上獨立地為0或1，且其中在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上之該等VD1結構域形成第一功能性靶結合位點，且在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上之該等VD2結構域形成第二功能性靶結合位點。在一些實施例中，該結合蛋白能夠結合IL-1β及/或IL-17。在一些實施例中，該結合蛋白包含在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上之VD1序列(亦即，在第一鏈上之VD1序列與在第二鏈上之VD1序列配對)，該等序列一起形成能夠結合選自IL-1β及IL-17之靶的結合結構域。在一些實施例中，該結合蛋白能夠在VD1及VD2兩者之位置處結合IL-1β。在一些實施例中，該結合蛋白能夠在VD1及VD2兩者之位置處結合IL-17。在一些實施例中，該結合蛋白能夠在VD1位置處結合IL-1β且在VD2位置處結合IL-17。在一些實施例中，該結合蛋白能夠在VD1位置處結合IL-17且在VD2位置處結合IL-1β。
本文所揭示之結合蛋白包含能夠結合至第一靶抗原及第二靶抗原之VD1及VD2結合結構域。如本文所使用，VD1結構域或VD2結構域，或VD1位置或VD2位置，可指在一條多肽鏈上之可變結構域(例如，VD1重鏈序列)，或在第一多肽鏈及第二多肽鏈上之可變結構域序列(例如VD1重鏈序列及VD1輕鏈序列)，該等序列一起形成功能性結合位點。
在一些實施例中，形成VD1結合位點之VD1序列係選自表1中之配對序列(例如，表1中具有SEQ ID NO：32及33之配對序列，其一起形成針對IL-1β之結合位點)。在一些實施例中，形成VD2結合位點之VD2序列係選自表1中之配對序列(例如，表1中具有SEQ ID NO：32及33之配對序列，其一起形成針對IL-1β之結合位點)。在一些實施例中，VD1及/或VD2序列包含具有選自表1之序列的CDR 1-3，但具有不同可變結構域構架序列(例如，作為表1中所揭示之序列之經CDR移植、親和力成熟、經人類化、經人類化及回復突變，或其他功能性變體的可變結構域)。
表1中可變結構域之CDR序列加下劃線。就這一點而言，對於SEQ ID NO：32，CDR1序列可見於胺基酸位置31-35，CDR2序列可見於胺基酸位置50-66，且CDR3序列可見於胺基酸位置99-108。對於SEQ ID NO：33，CDR1序列可見於胺基酸位置24-34，CDR2序列可見於胺基酸位置50-56，且CDR3序列可見於胺基酸位置89-97。對於SEQ ID NO：34，CDR1序列可見於胺基酸位置31-35，CDR2序列可見於胺基酸位置50-66，且CDR3序列可見於胺基酸位置99-108。對於SEQ ID NO：35，CDR1序列可見於胺基酸位置24-34，CDR2序列可見於胺基酸位置50-56，且CDR3序列可見於胺基酸位置89-97。對於SEQ ID NO：36，CDR1序列可見於胺基酸位置31-35，CDR2序列可見於胺基酸位置50-65，且CDR3序列可見於胺基酸位置98-111。對於SEQ ID NO：37，CDR1序列可見於胺基酸位置24-34，CDR2序列可見於胺基酸位置50-56，且CDR3序列可見於胺基酸位置89-97。對於SEQ ID NO：38，CDR1序列可見於胺基酸位置31-35，CDR2序列可見於胺基酸位置50-65，且CDR3序列可見於胺基酸位置98-111。對於SEQ ID NO：39，CDR1序列可見於胺基酸位置24-34，CDR2序列可見於胺基酸位置50-56，且CDR3序列可見於胺基酸位置89-97。對於SEQ ID NO：40，CDR1序列可見於胺基酸位置31-35，CDR2序列可見於胺基酸位置50-65，且CDR3序列可見於胺基酸位置98-111。對於SEQ ID NO：41，CDR1序列可見於胺基酸位置24-34，CDR2序列可見於胺基酸位置50-56，且CDR3序列可見於胺基酸位置89-97。對於SEQ ID NO：42，CDR1序列可見於胺基酸位置31-35，CDR2序列可見於胺基酸位置50-66，且CDR3序列可見於胺基酸位置99-110。對於SEQ ID NO：43，CDR1序列可見於胺基酸位置24-34，CDR2序列可見於胺基酸位置50-56，且CDR3序列可見於胺基酸位置89-97。對於SEQ ID NO：44，CDR1序列可見於胺基酸位置31-35，CDR2序列可見於胺基酸位置50-66，且CDR3序列可見於胺基酸位置99-115。對於SEQ ID NO：45，CDR1序列可見於胺基酸位置24-34，CDR2序列可見於胺基酸位置50-56，且CDR3序列可見於胺基酸位置89-97。對於SEQ ID NO：46，CDR1序列可見於胺基酸位置31-35，CDR2序列可見於胺基酸位置50-66，且CDR3序列可見於胺基酸位置99-115。對於SEQ ID NO：47，CDR1序列可見於胺基酸位置24-34，CDR2序列可見於胺基酸位置50-56，且CDR3序列可見於胺基酸位置89-97。
當該結合蛋白包含來自選自表1之序列的CDR，該等CDR係以表1中之序列所指定之次序佈置且藉由適合構架序列分隔，從而形成功能性結合位點。形成針對靶之功能性結合位點(亦即，針對IL-1β或IL-17之結合位點)的選自表1之配對序列，或來自該等序列之CDR，可位於 第一多肽鏈及第二多肽鏈上之VD1或VD2位置中，從而在VD1或VD2結構域處形成結合位點。舉例而言，形成針對IL-1β之結合位點的來自表1之匹配之重鏈及輕鏈可變結構域序列(例如SEQ ID NO：34及35)可位於第一多肽鏈及第二多肽鏈上之VD1位置中，從而形成針對IL-1β之VD1結合位點。在另一實例中，形成針對IL-1β之結合位點的來自表1之匹配之重鏈及輕鏈序列(例如SEQ ID NO：34及35)可位於第一多肽鏈及第二多肽鏈上之VD2位置中，從而形成針對IL-1β之VD2結合位點。相同或不同序列可佔據VD1及VD2位置。舉例而言，可使用SEQ ID NO：34及35在VD1位置處及VD2位置處形成結合結構域，或SEQ ID NO：34及35可在VD1及VD2位置中之一者處形成結合結構域，而不同序列對可經選擇以在另一位置處形成結合結構域。類似地，表1中之任何其他序列對可經選擇用於第一多肽鏈及第二多肽鏈上之VD1及VD2位置之任一者或兩者。
在一些實施例中，在結合蛋白中之第一多肽鏈及第二多肽鏈上形成針對IL-1β之功能性靶結合位點的可變結構域序列(亦即，在VD1及/或VD2位置處)可包含選自表1中序列之配對之可變結構域序列或來自該等序列之CDR 1-3。舉例而言，形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之可變結構域可包含SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39，或SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：41，或來自該等配對之可變結構域序列之CDR 1-3。舉例而言，形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之可變結構域可包含在一條多肽鏈上之來自SEQ ID NO：32之CDR 1-3(亦即，該序列中之胺基酸31-35、50-66及99-108)與另一鏈上之來自SEQ ID NO：33之CDR 1-3(亦即，該序列中之胺基酸24-34、50-56及89-97)之配對。
在一些實施例中，在結合蛋白中之第一多肽鏈及第二多肽鏈上 形成針對IL-17之功能性靶結合位點的可變結構域序列(亦即，在VD1或VD2位置處)可包含選自表1中序列之配對之重鏈及輕鏈可變結構域序列，或來自該等所選序列之CDR 1-3。舉例而言，形成針對IL-17之功能性靶結合位點之可變結構域可包含SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45，或SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47，或來自該等所選可變結構域序列之CDR 1-3。舉例而言，形成針對IL-17之功能性靶結合位點之可變結構域可包含在一條多肽鏈上之來自SEQ ID NO：42之CDR 1-3(亦即，該序列中之胺基酸31-35、50-66及99-110)與另一鏈上之來自SEQ ID NO：43之CDR 1-3(亦即，該序列中之胺基酸24-34、50-56及89-97)之配對。
在某些實施例中，揭示一種結合蛋白，其中形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之可變結構域(亦即，在VD1或VD2位置處)包含來自SEQ ID NO：34之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：35之CDR 1-3(亦即，存在於一條多肽鏈上VD1或VD2位置處的來自SEQ ID NO：34之CDR 1-3，且其與另一條鏈上相同位置處的來自SEQ ID NO：35之CDR 1-3配對，其中在每條鏈上之CDR係以指定次序佈置且藉由適合構架序列分隔，從而形成功能性結合位點)。在一個實施例中，形成針對IL-17之功能性靶結合位點之可變結構域包含來自SEQ ID NO：44之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：45之CDR 1-3(亦即，存在於一條多肽鏈上VD1或VD2位置處的來自SEQ ID NO：44之CDR 1-3，且其與另一條鏈上相同位置處的來自SEQ ID NO：45之CDR 1-3配對，其中在每條鏈上之CDR係以指定次序佈置且藉由適合構架序列分隔，從而形成功能性結合位點)。在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：34之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：35之CDR 1-3；及針對IL-17之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：44之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：45之CDR 1-3。在一個實施例中，該 結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35；及針對IL-17之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45。在一個實施例中，在第一多肽鏈上之X1連接子包含SEQ ID NO：29且在第二多肽鏈上之X1連接子包含SEQ ID NO：30。在一個實施例中，該結合蛋白包含含SEQ ID NO：104之第一多肽鏈及含SEQ ID NO：105之第二多肽鏈。在一個實施例中，該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約3.4×10-11M之KD結合IL-1β，及/或能夠以如在IL-1β中和分析中量測之至多約0.018nM之IC50抑制IL-1β，及/或該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約4.8×10-12M之KD結合IL-17，及/或能夠以如在IL-17中和分析中量測之至多約0.068nM之IC50抑制IL-17。
在某些實施例中，揭示一種結合蛋白，其中形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之可變結構域(亦即，在VD1或VD2位置處)包含來自SEQ ID NO：32之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：33之CDR 1-3(亦即，存在於一條多肽鏈上VD1或VD2位置處的來自SEQ ID NO：32之CDR 1-3，且其與另一條鏈上相同位置處的來自SEQ ID NO：33之CDR 1-3配對，其中在每條鏈上之CDR係以指定次序佈置且藉由適合構架序列分隔，從而形成功能性結合位點)。在一個實施例中，形成針對IL-17之功能性靶結合位點之可變結構域包含來自SEQ ID NO：44之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：45之CDR 1-3(亦即，存在於一條多肽鏈上VD1或VD2位置處的來自SEQ ID NO：44之CDR 1-3，且其與另一條鏈上相同位置處的來自SEQ ID NO：45之CDR 1-3配對，其中在每條鏈上之CDR係以指定次序佈置且藉由適合構架序列分隔，從而形成功能性結合位點)。在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：32之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：33之 CDR 1-3；及針對IL-17之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：44之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：45之CDR 1-3。在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33；及針對IL-17之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45。在一個實施例中，在第一多肽鏈上之X1連接子包含SEQ ID NO：29且在第二多肽鏈上之X1連接子包含SEQ ID NO：30。在一個實施例中，該結合蛋白包含含SEQ ID NO：98之第一多肽鏈及含SEQ ID NO：99之第二多肽鏈。在一個實施例中，該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約5.1×10-11M之KD結合IL-1β，及/或能夠以如在IL-1β中和分析中量測之至多約0.027nM之IC50抑制IL-1β，及/或該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約4.8×10-12M之KD結合IL-17，及/或能夠以如在IL-17中和分析中量測之至多約0.091nM之IC50抑制IL-17。
在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：32之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：33之CDR 1-3；及針對IL-17之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：42之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：43之CDR 1-3。在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33；及針對IL-17之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43。
在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：34之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：35之CDR 1-3；及針對IL-17之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：42之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：43之CDR 1-3。在一個實施例中，該 結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35；及針對IL-17之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43。
在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：36之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：37之CDR 1-3；及針對IL-17之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：42之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：43之CDR 1-3。在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：37；及針對IL-17之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43。
在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：38之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：39之CDR 1-3；及針對IL-17之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：42之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：43之CDR 1-3。在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39；及針對IL-17之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43。
在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：40之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：41之CDR 1-3；及針對IL-17之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：42之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：43之CDR 1-3。在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：41；及針對IL-17之功 能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43。
在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：36之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：37之CDR 1-3；及針對IL-17之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：44之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：45之CDR 1-3。在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：37；及針對IL-17之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45。
在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：38之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：39之CDR 1-3；及針對IL-17之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：44之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：45之CDR 1-3。在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39；及針對IL-17之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45。
在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：40之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：41之CDR 1-3；及針對IL-17之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：44之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：45之CDR 1-3。在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：41；及針對IL-17之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45。
在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：32之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：33之CDR 1-3；及針對IL-17之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：46之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：47之CDR 1-3。在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33；及針對IL-17之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47。
在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：34之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：35之CDR 1-3；及針對IL-17之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：46之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：47之CDR 1-3。在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35；及針對IL-17之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47。
在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：36之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：37之CDR 1-3；及針對IL-17之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：46之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：47之CDR 1-3。在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：37；及針對IL-17之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47。
在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：38之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：39之 CDR 1-3；及針對IL-17之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：46之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：47之CDR 1-3。在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39；及針對IL-17之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47。
在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：40之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：41之CDR 1-3；及針對IL-17之功能性靶結合位點，其包含來自SEQ ID NO：46之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：47之CDR 1-3。在一個實施例中，該結合蛋白包含針對IL-1β之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：41；及針對IL-17之功能性靶結合位點(亦即，VD1或VD2結合結構域)，其包含SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47。
在一些實施例中，如上文所述之結合蛋白包含在第一多肽鏈及第二多肽鏈中每一者上之X1連接子及在該兩條鏈中之一者上之X2Fc區。X1連接子獨立地存在或不存在於每一鏈上(亦即，n在每一條鏈上獨立地選自0或1)。若存在，則在第一多肽鏈及第二多肽鏈上之X1連接子可具有相同或不同序列。在一個實施例中，在第一多肽鏈及第二多肽鏈上之X1為短(「S」)(例如，6個胺基酸或更短)連接子。在另一實施例中，在第一多肽鏈及第二多肽鏈上之X1為長(「L」)(例如，超過6個胺基酸)連接子。在另一實施例中，在第一鏈上之X1為短連接子且在第二鏈上之X1為長連接子。在另一實施例中，在第一鏈上之X1為長連接子且在第二鏈上之X1為短連接子。在一些實施例中，在第一多肽鏈及/或第二多肽鏈上之X1連接子獨立地選自SEQ ID NO：1-31中任一者。在一些實施例中，在結合蛋白之第一多肽鏈及/或第二多 肽鏈上的X1不為完整CH1或CL結構域，但可包含該等結構域之部分。在一些實施例中，在第一鏈上之X1不為CH1，且在第二鏈上之X1不為CL，或在第一鏈上之X1不為CL且在第二鏈上之X1不為CH1。在一些實施例中，在第一多肽鏈及/或第二多肽鏈上之X1連接子的選擇可影響該結合蛋白之結合動力學(例如，選擇基於GS之連接子可顯著改善結合親和力及/或效力)。
在一些實施例中，X2(Fc區)存在於第一多肽鏈上且不存在於第二多肽鏈上，而在其他實施例中，X2存在於第二鏈上且不存在於第一鏈上，或X2不存在於第一鏈及第二鏈上。在一些實施例中，X2為變體序列Fc區。在某些實施例中，Fc區為來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD之Fc區。在一些實施例中，結合蛋白為結晶結合蛋白。
在一些實施例中，結合蛋白之第一多肽鏈(如以上所述)為重鏈，且第二多肽鏈為輕鏈。在某些實施例中，當第一多肽鏈為重鏈且第二多肽鏈為輕鏈時，X1獨立地存在或不存在於每一鏈上(亦即，n在每條鏈上獨立地選自0或1)，且X2存在於重鏈上且不存在於輕鏈上。在一些實施例中，該結合蛋白在重多肽鏈及/或輕多肽鏈上包含獨立地選自SEQ ID NO：1-31中任一者之X1連接子。
在一些實施例中，以上描述之任何結合蛋白可包含兩個第一多肽鏈及兩個第二多肽鏈以及四個功能性結合位點。舉例而言，第一多肽鏈及第二多肽鏈可在結合蛋白之一臂上配對形成兩個功能性結合位點(在VD1及VD2位置處)，而第二組第一及第二多肽鏈可在結合蛋白之另一臂上配對形成兩個另外之功能性結合位點(在VD1及VD2位置處)。圖1中顯示了具有兩個臂之四條鏈之結構的實例，每一臂包含第一多肽鏈及第二多肽鏈以及兩個功能性結合位點。在一些實施例中，在第一臂及第二臂上之VD1及VD2位置處的結合結構域相同。在其他 實施例中，第一臂及第二臂在VD1及VD2位置處含有不同結構域。在一些實施例中，VD1及VD2結合結構域包含選自表1之可變結構域序列，或包含來自所選序列之CDR。
在各種實施例中，包含第一多肽鏈及第二多肽鏈之結合蛋白(如以上所述)能夠以所需親和力(例如，高親和力或治療上有用之親和力)結合IL-1β及/或IL-17。在一些實施例中，形成針對IL-1β之功能性靶結合位點(亦即，在VD1及/或VD2位置處)的可變結構域序列可包含選自表1中序列的配對之重鏈及輕鏈可變結構域序列，其中該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振量測之至多約5.1×10-11M之KD結合IL-1β，及/或能夠以如在IL-1β中和分析中所量測之至多約2.563nM之IC50抑制IL-1β。舉例而言，形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之可變結構域可包含SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39，或SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：41，或來自該等配對之可變結構域序列之CDR 1-3。在一些實施例中，形成針對IL-17之功能性靶結合位點(亦即，在VD1及/或VD2位置處)的可變結構域序列可包含選自表1中序列的配對之重鏈及輕鏈可變結構域序列，其中該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振量測之至多約4.8×10-12M之KD結合IL-17，及/或能夠以如在IL-17中和分析中所量測之至多約1.7nM之IC50抑制IL-17。舉例而言，形成針對IL-17之功能性靶結合位點之可變結構域可包含SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45，或SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47，或來自該等配對之可變結構域序列之CDR 1-3。
在各種實施例中，具有第一多肽鏈及第二多肽鏈(如以上所述)且能夠結合IL-1β及/或IL-17之結合蛋白包含以下任一者：DVD2423(包含SEQ ID NO：48及49)；DVD2424(包含SEQ ID NO：50及51)； DVD2425(包含SEQ ID NO：52及53)；DVD2426(包含SEQ ID NO：54及55)；DVD2427(包含SEQ ID NO：56及57)；DVD2428(包含SEQ ID NO：58及59)；DVD2429(包含SEQ ID NO：60及61)；DVD2430(包含SEQ ID NO：62及63)；DVD2431(包含SEQ ID NO：64及65)；DVD2432(包含SEQ ID NO：66及67)；DVD2433(包含SEQ ID NO：68及69)；DVD2434(包含SEQ ID NO：70及71)；DVD2435(包含SEQ ID NO：72及73)；DVD2436(包含SEQ ID NO：74及75)；DVD2437(包含SEQ ID NO：76及77)；DVD2438(包含SEQ ID NO：78及79)；DVD2439(包含SEQ ID NO：80及81)；DVD2440(包含SEQ ID NO：82及83)；DVD2441(包含SEQ ID NO：84及85)；DVD2442(包含SEQ ID NO：86及87)；DVD3410(包含SEQ ID NO：88及89)；DVD3411(包含SEQ ID NO：90及91)；DVD3412(包含SEQ ID NO：92及93)；DVD3413(包含SEQ ID NO：94及95)；DVD3414(包含SEQ ID NO：96及97)；DVD3415(包含SEQ ID NO：98及99)；DVD3416(包含SEQ ID NO：100及101)；DVD3417(包含SEQ ID NO：102及103)；DVD3418(包含SEQ ID NO：104及105)；DVD3419(包含SEQ ID NO：106及107)；DVD3420(包含SEQ ID NO：108及109)；DVD3421(包含SEQ ID NO：110及111)；DVD3422(包含SEQ ID NO：112及113)；DVD3423(包含SEQ ID NO：114及115)；DVD3424(包含SEQ ID NO：116及117)；及DVD3425(包含SEQ ID NO：118及119)。在某些實施例中，該結合蛋白包含以下任一者：DVD2424、DVD2425、DVD2426、DVD2427、DVD2428、DVD2429、DVD2430、DVD3415及DVD3418。在某些實施例中，該結合蛋白包含DVD3415或DVD3418。為進一步說明DVD結合蛋白結構及組織，參看下表2。
在各種實施例中，上文描述之結合蛋白可包含選自野生型及突變型序列之恆定區胺基酸序列。在一些實施例中，使用了野生型人類 κ輕鏈恆定區序列。在一些實施例中，使用了野生型人類λ輕鏈恆定區序列。在一些實施例中，使用了野生型或突變型人類IgG重鏈恆定區序列。在一些實施例中，使用了野生型或突變型人類IgG1重鏈恆定區序列。在某些實施例中，該突變型序列為表2a中所示之序列。在一些實施例中，本文所揭示之結合蛋白包含野生型人類κ輕鏈恆定區序列。在一些實施例中，DVD2423-DVD2442包含野生型人類κ輕鏈恆定區序列且亦包含野生型人類重鏈IgG1恆定區序列。在一些實施例中，DVD3410-DVD3425包含野生型人類κ輕鏈恆定區序列且亦包含突變體人類重鏈IgG1恆定區序列(例如，表2b中所示DVD3418之序列)。
在一個實施例中，提供的結合蛋白包含結合IL-1β及/或IL-17之多肽鏈，其中該多肽鏈包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1為第一可變結構域，VD2為第二可變結構域，C為恆定結構域，X1表示胺基酸或多肽，X2表示存在或不存在之Fc區，且n為0或1。在一個實施例中，該結合蛋白中之VD1及/或VD2為重鏈可變結構域。在一個實施例中，該結合蛋白中之VD1及/或VD2為輕鏈可變結構域。在另一實施例中，VD1及VD2能夠結合相同抗原。在另一實施例中，VD1及VD2能夠結合不同抗原。在又一實施例中，C為重鏈恆定結構域。舉例而言，X1為連接子，其限制條件為X1不為CH1。
在一個實施例中，本文所揭示之結合蛋白包含結合IL-1β及/或IL-17之多肽鏈，其中該多肽鏈包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1為第一重鏈可變結構域，VD2為第二重鏈可變結構域，C為重鏈恆定結構域，X1為連接子且X2為存在或不存在之Fc區。在一個實施例中，X1為連接子，其限制條件為其不為CH1。
在一個實施例中，本文所揭示之結合蛋白包含結合IL-1β及/或IL-17之多肽鏈，其中該多肽鏈包含VD1-(X1)n-VD2-C，其中VD1為第一輕鏈可變結構域，VD2為第二輕鏈可變結構域，C為輕鏈恆定結構 域，X1為連接子且X2不存在。在一個實施例中，X1為連接子，其限制條件為其不為CL。
在另一實施例中，結合IL-1β及/或IL-17之結合蛋白包含兩條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1為第一重鏈可變結構域，VD2為第二重鏈可變結構域，C為重鏈恆定結構域，X1為第一連接子，且X2為Fc區；且第二多肽鏈包含VD1-(X1)n-VD2-C，其中VD1為第一輕鏈可變結構域，VD2為第二輕鏈可變結構域，C為輕鏈恆定結構域，X1為第二連接子且X2不存在(亦即，在第二多肽鏈上不存在Fc)。在一些實施例中，在第一多肽鏈及第二多肽鏈上之X1相同。在其他實施例中，在第一多肽鏈及第二多肽鏈上之X1不同。在一些實施例中，第一X1不為CH1結構域及/或第二X1不為CL結構域。在一個實施例中，第一X1及第二X1為短(例如6個胺基酸)連接子。在另一實施例中，第一X1及第二X1為長(例如超過6個胺基酸)連接子。在另一實施例中，第一X1為短連接子且第二X1為長連接子。在另一實施例中，第一X1為長連接子且第二X1為短連接子。
在一個實施例中，本發明提供包含四條多肽鏈之雙重可變結構域(DVD)結合蛋白，其中第一個兩條多肽鏈各自包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1為第一重鏈可變結構域，VD2為第二重鏈可變結構域，C為重鏈恆定結構域，X1為第一連接子，且X2為Fc區；且第二個兩條多肽鏈各自包含VD1-(X1)n-VD2-C，其中VD1為第一輕鏈可變結構域，VD2為第二輕鏈可變結構域，C為輕鏈恆定結構域，X1為第二連接子且X2不存在(亦即，在第二個兩條多肽鏈上不存在Fc)。此類DVD結合蛋白具有四個抗原結合位點。在一些實施例中，在DVD結合蛋白之每一臂上，第一個兩條多肽鏈相同，且第二個兩條多肽鏈相同，其中該等第一多肽鏈之一與該等第二多肽鏈之一配對，形成兩個靶結合位點。在一些實施例中，在第一多肽鏈及第二多肽鏈上之X1 相同。在其他實施例中，在第一多肽鏈及第二多肽鏈上之X1不同。在一些實施例中，第一X1不為完整CH1結構域及/或第二X1不為完整CL結構域。在另一實施例中，本文所揭示之結合蛋白能夠結合IL-1β及IL-17。因此，在一些實施例中，該等結合蛋白包含能夠在任一取向上結合IL-1β及IL-17(亦即，能夠在VD1位置處結合IL-1β或IL-17，且在VD2位置處結合IL-1β或IL-17)的至少兩個可變結構域序列(例如，VD1及VD2)。在一些實施例中，VD1及VD2係獨立選擇的。因此，在一些實施例中，VD1及VD2可包含相同SEQ ID NO，且在其他實施例中，VD1及VD2可包含不同SEQ ID NO。
在一個實施例中，本發明提供一種結合蛋白，其包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，該等多肽鏈各自獨立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1為第一可變結構域；VD2為第二可變結構域；C為恆定結構域；X1為連接子，其限制條件為其不為CH1；X2為存在於一條多肽鏈上且不存在於另一鏈上之Fc區；且n為0或1，其中在第一多肽鏈及第二多肽鏈上之VD1結構域形成第一功能性靶結合位點且在第一多肽鏈及第二多肽鏈上之VD2結構域形成第二功能性靶結合位點，且其中該結合蛋白能夠結合IL-1β及IL-17，其中(i)形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之可變結構域包含選自由SEQ ID NO：32-41組成之群之序列，及/或該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約5.1×10-11M或至多約3.4×10-11M之KD結合IL-1β，或能夠以如在IL-1β中和分析中所量測之至多約2.563nM、或至多約2.067nM、或至多約1.568nM、或至多約0.424nM之IC50抑制IL-1β，及/或(ii)形成針對IL-17之功能性靶結合位點之可變結構域包含選自由SEQ ID NO：42-47組成之群之序列，及/或該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約4.8×10-12M之KD結合IL-17，或能夠以如在IL-17中和分析中所量測之至多約1.7nM、或至多約0.863nM、或至多約0.549nM 之IC50抑制IL-17。
在一個實施例中，提供一種結合蛋白，其包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，該等多肽鏈各自獨立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1為第一可變結構域；VD2為第二可變結構域；C為恆定結構域；X1為連接子，其限制條件為其不為CH1；X2為存在於一條多肽鏈上且不存在於另一鏈上之Fc區；且n為0或1，其中在第一多肽鏈及第二多肽鏈上之VD1結構域形成第一功能性靶結合位點且在第一多肽鏈及第二多肽鏈上之VD2結構域形成第二功能性靶結合位點，且其中(a)該結合蛋白能夠結合IL-1β及IL-17，其中(i)形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之可變結構域包含：來自SEQ ID NO：32之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：33之CDR 1-3、來自SEQ ID NO：34之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：35之CDR 1-3、來自SEQ ID NO：36之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：37之CDR 1-3、來自SEQ ID NO：38之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：39之CDR 1-3，或來自SEQ ID NO：40之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：41之CDR 1-3；及/或該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約5.1×10-11M或至多約3.4×10-11M之KD結合IL-1β，或能夠以如在IL-1β中和分析中所量測之至多約2.563nM、或至多約2.067nM、或至多約1.568nM、或至多約0.424nM之IC50抑制IL-1β，及/或(ii)形成針對IL-17之功能性靶結合位點之可變結構域包含來自SEQ ID NO：42之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：43之CDR 1-3；來自SEQ ID NO：44之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：45之CDR 1-3；或來自SEQ ID NO：46之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：47之CDR 1-3；及/或該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約4.8×10-12M之KD結合IL-17，或能夠以如在IL-17中和分析中所量測之至多約1.7nM、或至多約0.863nM、或至多約0.549nM之IC50抑制IL-17。
在一個實施例中，提供一種結合蛋白，其中該第一多肽鏈包含 第一VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1為第一重鏈可變結構域；VD2為第二重鏈可變結構域；C為重鏈恆定結構域；X1為連接子，其限制條件為其不為CH1；X2為Fc區；n為0或1，且其中該第二多肽鏈包含第二VD1-(X1)n-VD2-C，其中VD1為輕鏈可變結構域；VD2為第二輕鏈可變結構域；C為輕鏈恆定結構域；X1為連接子，其限制條件為其不為CH1；n為0或1；且該鏈不包含Fc區；且n為0或1，其中在第一多肽鏈及第二多肽鏈上之VD1結構域形成第一功能性靶結合位點且在第一多肽鏈及第二多肽鏈上之VD2結構域形成第二功能性靶結合位點。
在一個實施例中，(a)結合蛋白能夠結合IL-1β及IL-17，其中(i)形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之可變結構域包含：(1)SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33，(2)SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35，(3)SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：37，(4)SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39，或(5)SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：41；及/或(ii)形成針對IL-17之功能性靶結合位點之可變結構域包含：(1)SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43，(2)SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45，或(3)SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47。
在一個實施例中，該結合蛋白包含第一多肽鏈，其包含具有SEQ ID NO：34之外部可變結構域、在外部可變結構域與內部可變結構域之間的具有SEQ ID NO：29之連接子，及具有SEQ ID NO：44之內部可變結構域；及/或該結合蛋白包含第二多肽鏈，其包含具有SEQ ID NO：35之外部可變結構域、在外部可變結構域與內部可變結構域之間的具有SEQ ID NO：30之連接子，及具有SEQ ID NO：45之內部可變結構域。在一個實施例中，該結合蛋白包含第二多肽鏈，其包含具有SEQ ID NO：34之外部可變結構域、在外部可變結構域與內部可變結構域之間的具有SEQ ID NO：29之連接子，及具有SEQ ID NO：44之內部可變結構域；及/或該結合蛋白包含第一多肽鏈，其包含具有SEQ ID NO：35之外部可變結構域、在外部可變結構域與內部可變結構域之間的具有SEQ ID NO：30之連接子，及具有SEQ ID NO：45之內部可變結構域。在某些實施例中，該結合蛋白包含含SEQ ID NO：104之第一多肽鏈及含SEQ ID NO：105之第二多肽鏈。
在一個實施例中，該結合蛋白包含第一多肽鏈，其包含具有SEQ ID NO：32之外部可變結構域、在外部可變結構域與內部可變結構域之間的具有SEQ ID NO：29之連接子，及具有SEQ ID NO：44之內部可變結構域；及/或該結合蛋白包含第二多肽鏈，其包含具有SEQ ID NO：33之外部可變結構域、在外部可變結構域與內部可變結構域之間的具有SEQ ID NO：30之連接子，及具有SEQ ID NO：45之內部可變結構域。在一個實施例中，該結合蛋白包含第二多肽鏈，其包含具有SEQ ID NO：32之外部可變結構域、在外部可變結構域與內部可變結構域之間的具有SEQ ID NO：29之連接子，及具有SEQ ID NO：44之內部可變結構域；及/或該結合蛋白包含第一多肽鏈，其包含具有SEQ ID NO：33之外部可變結構域、在外部可變結構域與內部可變結構域之間的具有SEQ ID NO：30之連接子，及具有SEQ ID NO：45之內部可變結構域。在某些實施例中，該結合蛋白包含含SEQ ID NO：98之第一多肽鏈及含SEQ ID NO：99之第二多肽鏈。
在一個實施例中，該結合蛋白包含兩條第一多肽鏈及兩條第二多肽鏈，其中該結合蛋白包含四個功能性靶結合位點。
在一個實施例中，本發明提供一種能夠結合IL-1β及IL-17之結合蛋白，其中該結合蛋白包含以下任一者：DVD2423(包含具有SEQ ID NO：48及49之第一多肽鏈及第二多肽鏈)；DVD2424(包含SEQ ID NO：50及51)；DVD2425(包含SEQ ID NO：52及53)；DVD2426(包含SEQ ID NO：54及55)；DVD2427(包含SEQ ID NO：56及57)；DVD2428(包含SEQ ID NO：58及59)；DVD2429(包含SEQ ID NO：60 及61)；DVD2430(包含SEQ ID NO：62及63)；DVD2431(包含SEQ ID NO：64及65)；DVD2432(包含SEQ ID NO：66及67)；DVD2433(包含SEQ ID NO：68及69)；DVD2434(包含SEQ ID NO：70及71)；DVD2435(包含SEQ ID NO：72及73)；DVD2436(包含SEQ ID NO：74及75)；DVD2437(包含SEQ ID NO：76及77)；DVD2438(包含SEQ ID NO：78及79)；DVD2439(包含SEQ ID NO：80及81)；DVD2440(包含SEQ ID NO：82及83)；DVD2441(包含SEQ ID NO：84及85)；DVD2442(包含SEQ ID NO：86及87)；DVD3410(包含SEQ ID NO：88及89)；DVD3411(包含SEQ ID NO：90及91)；DVD3412(包含SEQ ID NO：92及93)；DVD3413(包含SEQ ID NO：94及95)；DVD3414(包含SEQ ID NO：96及97)；DVD3415(包含SEQ ID NO：98及99)；DVD3416(包含SEQ ID NO：100及101)；DVD3417(包含SEQ ID NO：102及103)；DVD3418(包含SEQ ID NO：104及105)；DVD3419(包含SEQ ID NO：106及107)；DVD3420(包含SEQ ID NO：108及109)；DVD3421(包含SEQ ID NO：110及111)；DVD3422(包含SEQ ID NO：112及113)；DVD3423(包含SEQ ID NO：114及115)；DVD3424(包含SEQ ID NO：116及117)；及DVD3425(包含SEQ ID NO：118及119)。在一個實施例中，該結合蛋白為DVD3415(包含具有SEQ ID NO：98及99之第一多肽鏈及第二多肽鏈)或DVD3418(包含具有SEQ ID NO：104及105之第一多肽鏈及第二多肽鏈)。
在另一實施例中，該結合蛋白包含如本文表1中所示的配對之重鏈及輕鏈序列，由該等配對之重鏈及輕鏈形成功能性結合位點。
重鏈、輕鏈、兩條鏈或四條鏈實施例中任一者可包括至少一個X1連接子，其包含AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO：1)；AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：2)；AKTTPKLGG(SEQ ID NO：3)；SAKTTPKLGG(SEQ ID NO：4)；SAKTTP(SEQ ID NO：5)； RADAAP(SEQ ID NO：6)；RADAAPTVS(SEQ ID NO：7)；RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO：8)；RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO：9)；SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：10)；ADAAP(SEQ ID NO：11)；ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO：12)；TVAAP(SEQ ID NO：13)；TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO：14)；QPKAAP(SEQ ID NO：15)；QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO：16)；AKTTPP(SEQ ID NO：17)；AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO：18)；AKTTAP(SEQ ID NO：19)；AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO：20)；ASTKGP(SEQ ID NO：21)；ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO：22)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：23)；GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO：24)；GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO：25)；或GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO：26)；TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO：27)；ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO：28)；GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：29)；GGSGGGGSG(SEQ ID NO：30)；或基於G/S之序列(例如，G4S及G4S重複序列；SEQ ID NO：31)。在一個實施例中，X1不為恆定區、不為CH區及/或不為CL區。在一個實施例中，連接子在第一鏈上為GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：29)及/或在第二鏈上為GGSGGGGSG(SEQ ID NO：30)。在一個實施例中，連接子在第一鏈上為GGSGGGGSG(SEQ ID NO：30)及/或在第二鏈上為GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：29)。
在一個實施例中，X2是Fc區。在另一實施例中，Fc區為變體Fc區。在又一實施例中，若存在，則Fc區為天然序列Fc區或變體序列Fc區。在又一實施例中，Fc區為來自IgG1之Fc區、來自IgG2之Fc區、來自IgG3之Fc區、來自IgG4之Fc區、來自IgA之Fc區、來自IgM之Fc區、來自IgE之Fc區或來自IgD之Fc區。
結合蛋白特性
用作人類治療劑(例如消炎劑或神經學藥劑)之結合蛋白的開發及製備可能不僅僅需要能夠結合至一或多個所需靶之結合蛋白之鑑別。本文所揭示之結合蛋白展現以下一或多個類別之有利特性：(a)內部及外部抗原結合結構域之結合動力學(締合速率、解離速率及親和力)；(b)在各種生物化學及細胞生物分析中之效力；(c)在相關腫瘤模型中之活體內功效；(d)藥物動力學及藥效學特性；(e)可製造性，包括所選細胞株中之蛋白質表現量、可調能力、轉譯後修飾、物理化學特性(諸如單體百分比)、溶解性及穩定性(固有穩定性、冷凍/解凍穩定性、儲存穩定性等)；(f)調配特性；(g)潛在免疫原性風險；(h)毒理學特性；及(i)結合模式及價態。結合模式及價態可能影響分子之結合特性及細胞效力。
本文所揭示之結合蛋白展現以上所列之一些或每一類別之有利特性，包括在VD1及VD2位置處之意外地高結合親和力。在某些實施例中，展現以上所列一些或每一類別之特別有利之特性的結合蛋白含有包含SEQ ID NO：104及SEQ ID NO：105之第一多肽鏈及第二多肽鏈，或包含SEQ ID NO：98及SEQ ID NO：99之第一多肽鏈及第二多肽鏈。在某些實施例中，該結合蛋白包含DVD3415或DVD3418。已發現，該等結合蛋白可在VD1及VD2位置處展現意外地高結合親和力。例如參看表10。亦已意外地發現，在一些實施例中，如與包含不同可變結構域及/或連接子序列之其他結合蛋白相比較，DVD3415及DVD3418可展現一或多種特性之優良組合，諸如以下一或多者：有效之結合動力學、改善之中和能力、增強之活體內功效、優良之可調配性、所需之糖基化模式、有利之藥物動力學型態及在宿主細胞中之高效表現。
舉例而言，已意外地發現，本文所揭示之許多結合蛋白以與其個別親本抗體大致相當(亦即，在相同數量級範圍內)之親和力結合其 靶。例如參看表3-6中親本抗體與結合蛋白之比較。由於由使用雙重可變結構域結合結構可預先預期結合親和力之損失，故此為意外的。具體言之，已發現，如與包含靶向IL-1β及IL-17之不同可變結構域及/或不同連接子序列之其他結合蛋白相比較，包含SEQ ID NO：104及SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：98及SEQ ID NO：99之結合蛋白(例如DVD3415及DVD3418)對其兩個靶展現優良之結合親和力。此外，已意外地發現，結合蛋白(諸如DVD3415及DVD3418)組合起來展現優於其他結合蛋白之物理化學特性。舉例而言，工程改造成在其IL-17結合結構域中缺少脫醯胺位點之結合蛋白DVD3415及DVD3418意外地展現優於本文所揭示之其他結合蛋白，或如與靶向IL-1β及IL-17之其他DVD-Ig結合蛋白(諸如DVD 1274、DVD1275、DVD1601、DVD1602、DVD1631、DVD1661及DVD1662)相比較之特性組合。例如參看表13。該等有益特性包括優良之宿主細胞表現、保持之針對IL-1β及IL-17之靶效力、改善之溶解性、改善之穩定性及可調配性、降低之與其他抗原或與來自非靈長類動物物種之IL-1β及IL-17的交叉反應性、改善之活體內功效及降低之免疫原性(包括如與抗IL-1β抗體及抗IL-17抗體之雙重投藥相比較，及如與諸如靶向IL-17及TNF之替代性結合蛋白相比較有所降低之免疫原性)。兩種結合蛋白意外地在含15mM組胺酸(pH 5.5)之高濃度(例如超過25mg/ml)液體調配物中穩定。兩種結合蛋白對靈長類動物IL-1β及IL-17之選擇性亦高於來自其他物種之抗原，且展現針對靈長類動物IL-1β及IL-17之中和特性。例如參看表14。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO：104及SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：98及SEQ ID NO：99之結合蛋白(例如DVD3415及DVD3418)能夠例如濃縮至大於25mg/ml，及/或可濃縮至與其親本抗體類似之程度。在一些實施例中，如與本文所揭示之其他結合蛋白相比較，或如 與靶向IL-1β及IL-17之其他DVD-Ig結合蛋白(諸如DVD1274、DVD 1275、DVD1601、DVD1602、DVD1631、DVD1661)相比較，包含SEQ ID NO：104及SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：98及SEQ ID NO：99之結合蛋白(例如DVD3415及DVD3418)展現延長之半衰期、至少中等之血漿清除率及/或與生殖系序列之顯著同源性(此可引起免疫原性之降低)。例如參看表11及13。舉例而言，DVD3415及/或DVD3418可展現約20-40天(例如20、25、30、35或40天，或其間任何時間段)之血清半衰期。在一些實施例中，DVD3415及/或DVD3418展現之清除率低於關於靶向IL-1β及IL-17之其他DVD-Ig結合蛋白所觀測之清除率，例如小於0.1毫升/小時/千克體重，或小於0.09、0.08、0.07、0.06、0.05毫升/小時/千克體重之清除率(或其間之任何清除率)。
在一些實施例中，如與本文所揭示之其他結合蛋白相比較，及/或如與靶向IL-1β及IL-17之其他結合蛋白相比較，包含SEQ ID NO：104及SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：98及SEQ ID NO：99之結合蛋白(例如DVD3415及DVD3418)展現意外地有利之物理化學特徵，包括溶解性、黏度、對冷凍解凍之穩定性及/或在熱應激期間沒有其他顯著變化。因此，DVD3415及/或DVD3418可適於調配穩定高濃度液體調配物，例如在包含10、15、20mM組胺酸(pH 5.0、5.5或6.0)之液體調配物中大於15、20、25、30、35、40、45或50mg/ml之濃度(或其間之組蛋白、組胺酸之任何濃度或任何pH值)。例如參看表12。在一些實施例中，如與抗IL-1β抗體及抗IL-17抗體之雙重投藥相比較，及/或如與諸如靶向IL-17及TNF之結合蛋白之替代性結合蛋白相比較，DVD3415及/或DVD3418在活體內展現降低之免疫原性。
在各種實施例中，如與其他針對發炎性病狀、自體免疫病狀或神經學病狀之治療相比較，包含SEQ ID NO：104及SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：98及SEQ ID NO：99之結合蛋白(例如DVD3415及 DVD3418)展現改善之特性，例如改善之安全性、增加之穩定性、增大之效力、減少之發炎或免疫反應，或其他有益的活體內人類治療特性。適於進行比較之治療可包括例如投與小分子消炎劑或神經學藥劑，或投與僅針對IL-1β之抗體或其與針對IL-17之抗體的組合，或投與包含其他可變結構域序列且形成針對IL-1β及IL-17之結合位點之DVD-Ig結合蛋白。在一些實施例中，DVD3415及/或3418針對自體免疫病狀、發炎性病狀或神經學病狀展現優於當前護理治療標準的改善之特性。舉例而言，該結合蛋白可展現改善之結合動力學、優良之活體內治療功效、增強之可調配性(包括減少之聚集及改善之儲存穩定性)、改善之藥物動力學、減少之發炎或免疫反應及/或增強之宿主細胞表現量。
製備結合蛋白
在另一態樣中，本發明提供一種製備結合IL-1β及/或IL-17之結合蛋白的方法。在一個實施例中，該製備結合IL-1β及/或IL-17之結合蛋白的方法包含以下步驟：a)獲得結合IL-1β及/或IL-17之第一親本抗體或其抗原結合部分；b)獲得結合IL-1β及/或IL-17之第二親本抗體或其抗原結合部分；c)測定該等親本抗體或其抗原結合部分之可變結構域之序列；d)使用該等可變結構域序列製備編碼本文所述之任何結合蛋白的構築體；及e)表現該等多肽鏈，由此產生結合IL-1β及/或IL-17之結合蛋白。
在本文之任何實施例中，VD1重鏈可變結構域(若存在)及輕鏈可變結構域(若存在)可形成第一親本抗體或其抗原結合部分；VD2重鏈可變結構域(若存在)及輕鏈可變結構域(若存在)可形成第二親本抗體或其抗原結合部分。第一親本抗體與第二親本抗體可相同或不同。
在一個實施例中，第一親本抗體或其抗原結合部分結合第一抗原，且第二親本抗體或其抗原結合部分結合第二抗原。在一個實施例 中，第一抗原與第二抗原為相同抗原。在另一實施例中，該等親本抗體結合同一抗原上之不同抗原決定基。在另一實施例中，第一抗原與第二抗原為不同抗原。在另一實施例中，第一親本抗體或其抗原結合部分結合第一抗原之效力不同於第二親本抗體或其抗原結合部分結合第二抗原之效力。在又一實施例中，第一親本抗體或其抗原結合部分結合第一抗原之親和力不同於第二親本抗體或其抗原結合部分結合第二抗原之親和力。
在另一實施例中，第一親本抗體或其抗原結合部分，及第二親本抗體或其抗原結合部分，為人類抗體、CDR移植之抗體、人類化抗體及/或親和力成熟之抗體。
在另一實施例中，結合蛋白具有由第一親本抗體或其抗原結合部分，或第二親本抗體或其抗原結合部分所展現之至少一種所需特性。或者，第一親本抗體或其抗原結合部分及第二親本抗體或其抗原結合部分具有由該結合蛋白所展現之至少一種所需特性。在一個實施例中，該所需特性為一或多個抗體參數。在另一實施例中，該等抗體參數為抗原特異性、對抗原之親和力、效力、生物功能、抗原決定基識別、穩定性、溶解性、產生效率、免疫原性、藥物動力學、生物利用率、組織交叉反應性或直系同源抗原結合。在一個實施例中，該結合蛋白為多價的。在另一實施例中，該結合蛋白為多特異性的。本文所述之多價及或多特異性結合蛋白具有所需特性，特別是自治療觀點看。舉例而言，該多價及或多特異性結合蛋白可(1)比二價抗體更快地被表現該等抗體所結合之抗原的細胞內化(及/或分解代謝)；(2)為促效劑結合蛋白；及/或(3)誘導表現該多價結合蛋白能夠結合之抗原之細胞的細胞死亡及/或細胞凋亡。「親本抗體」提供該多價及或多特異性結合蛋白之至少一種抗原結合特異性，其可為經表現該抗體所結合之抗原的細胞內化(及/或分解代謝)者；及/或可為促效劑、細胞死 亡誘導性及/或細胞凋亡誘導性抗體，且如本文所述之多價及或多特異性結合蛋白可呈現該等特性中之一或多者之改善。此外，當構築為如本文所述之多價結合蛋白形式時，親本抗體可缺乏該等特性中任一者或多者，但可獲得其中一或多者。舉例而言，不同Fc突變體可防止FcR，C'結合或延長半衰期。
在另一實施例中，如藉由表面電漿子共振所量測，該結合蛋白對一或多個靶之締合速率常數(Kon)為至少約102M-1s-1、至少約103M-1s-1、至少約104M-1s-1、至少約105M-1s-1或至少約106M-1s-1。在一個實施例中，如藉由表面電漿子共振所量測，該結合蛋白對一或多個靶之締合速率常數(Kon)為102M-1s-1至約103M-1s-1；約103M-1s-1至約104M-1s-1；約104M-1s-1至約105M-1s-1；或約105M-1s-1至約106M-1s-1。
在另一實施例中，如藉由表面電漿子共振所量測，該結合蛋白對一或多個靶之解離速率常數(Koff)為至多約10-3s-1；至多約10-4s-1；至多約10-5s-1；或至多約10-6s-1。在一個實施例中，該結合蛋白對一或多個靶之解離速率常數(Koff)為約10-3s-1至約10-4s-1；約10-4s-1至約10-5s-1；或約10-5s-1至約10-6s-1。
在另一實施例中，該結合蛋白對一或多個靶之解離常數(Kd)為至多約10-7M；至多約10-8M；至多約10-9M；至多約10-10M；至多約10-11M；至多約10-12M；或至多10-13M。在一個實施例中，該結合蛋白對其靶之解離常數(Kd)為約10-7M至約10-8M；約10-8M至約10-9M；約10-9M至約10-10M；約10-10M至約10-11M；約10-11M至約10-12M或約10-12M至約10-13M。
在另一實施例中，該結合蛋白為另外包含一種藥劑之結合物。在一個實施例中，該藥劑為免疫黏附分子、顯影劑、治療劑或細胞毒性劑。在一個實施例中，該顯影劑為放射性標記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記或生物素。在另一實施例中，該放 射性標記為3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。在又一實施例中，該治療劑或細胞毒性劑為抗代謝物、烷基化劑、抗生素、生長因子、細胞激素、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環黴素(anthracycline)、毒素或細胞凋亡劑，或免疫抑制劑。
在另一實施例中，該結合蛋白為結晶結合蛋白且以晶體形式存在。在一個實施例中，該晶體為無載劑之控制釋放型醫藥晶體。在另一實施例中，該結晶結合蛋白在活體內之半衰期比該結合蛋白之可溶性對應物長。在又一實施例中，該結晶結合蛋白保持生物活性。
在另一實施例中，本文所述之結合蛋白為糖基化的。舉例而言，糖基化模式為人類糖基化模式。
亦提供了編碼本文所揭示之任一結合蛋白之分離之核酸。另一實施例提供了一種載體，其包含本文所揭示之分離之核酸，其中該載體為pcDNA；pTT(Durocher等人(2002)Nucleic Acids Res.30(2))；pTT3(具有其他多選殖位點之pTT)；pEFBOS(Mizushima及Nagata(1990)Nucleic Acids Res.18(17))；pBV；pJV；pcDNA3.1 TOPO；pEF6 TOPO；pBOS；pHybE；或pBJ。在一個實施例中，該載體為美國專利公開案第20090239259號中所揭示之載體。
在另一態樣中，宿主細胞經本文所揭示之載體轉型。在一個實施例中，宿主細胞為原核細胞，例如大腸桿菌。在另一實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如原生生物細胞、動物細胞、植物細胞或真菌細胞。在一個實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞，包括(但不限於)CHO、COS、NS0、SP2、PER.C6；或真菌細胞，諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；或昆蟲細胞，諸如Sf9。在一個實施例中，例如具有不同特異性之兩種或兩種以上結合蛋白係在單一重組宿主細胞中產生。舉例而言，抗體混合物之表現已稱為OligoclonicsTM(Merus B.V.,The Netherlands)，美國專利第7,262,028號及第7,429,486 號。
本文揭示一種產生結合蛋白之方法，其包含在培養基中在足以產生該結合蛋白之條件下培養本文所揭示之宿主細胞中任一者。在一個實施例中，由該方法產生之結合蛋白中有50%-75%為雙重特異性四價結合蛋白(例如，DVD結合蛋白)。在另一實施例中，由該方法產生之結合蛋白中有75%-90%為雙重特異性四價結合蛋白。在另一實施例中，所產生之結合蛋白中有90%-95%為雙重特異性四價結合蛋白。
一個實施例提供一種用於釋放結合蛋白之組合物，其中該組合物包含結晶結合蛋白、成分及至少一種聚合物載劑。在一個實施例中，該聚合物載劑為聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(胺基酸)、聚(酸酐)、聚(縮肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA、聚(b-羥基丁酸酯)、聚(己內酯)、聚(二氧環己酮)、聚(乙二醇)、聚(羥丙基)甲基丙烯醯胺、聚[(有機)磷氮烯]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯啶酮)、順丁烯二酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、普洛尼克多元醇(pluronic polyol)、白蛋白、海藻酸鹽、纖維素、纖維素衍生物、膠原蛋白、纖維蛋白、明膠、玻尿酸、寡醣、葡糖胺聚糖、硫酸化多醣，或其摻合物及共聚物。在一個實施例中，該成分為白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明膠、羥丙基-β-環糊精、甲氧基聚乙二醇或聚乙二醇。
另一實施例提供一種用於治療哺乳動物之方法，其包含向哺乳動物投與有效量之本文所揭示之組合物的步驟。
提供一種醫藥組合物，其包含本文所揭示之結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，該醫藥組合物包含至少一種用於治療病症之其他治療劑。舉例而言，該其他藥劑可為治療劑、顯影劑、細胞毒性劑、血管生成抑制劑(包括(但不限於)抗VEGF抗體或VEGF-trap)、激酶抑制劑(包括(但不限於)KDR及TIE-2抑制劑)、共刺 激分子阻斷劑(包括(但不限於)抗-B7.1、抗-B7.2、CTLA4-Ig、抗-CD20)、黏附分子阻斷劑(包括(但不限於)抗LFA-1抗體、抗E/L選擇素抗體、小分子抑制劑)、抗細胞激素抗體或其功能片段(包括(但不限於)抗-IL-18、抗-TNF及抗-IL-6/細胞激素受體抗體)、甲胺喋呤(methotrexate)、環孢素(cyclosporin)、雷帕黴素(rapamycin)、FK506、可偵測標記或報導子、TNF拮抗劑、抗風濕藥、肌肉鬆弛劑、麻醉藥、非類固醇消炎藥(NSAID)、鎮痛劑、麻醉劑、鎮定劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、牛皮癬藥、皮質類固醇、同化類固醇、紅血球生成素、免疫接種、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素代用藥、放射性藥品、抗抑鬱劑、抗精神病藥、刺激劑、哮喘藥物、β促效劑、吸入性類固醇、腎上腺素或類似物、細胞激素或細胞激素拮抗劑。
治療及診斷應用
提供了一種用於治療罹患能夠經本文所揭示之結合蛋白結合之一或多個靶有害的病症之人類個體的方法，其包含向該人類個體投與本文所揭示之結合蛋白，由此抑制該人類個體中該一或多個靶之活性，且減輕一或多種症狀或實現治療。本文提供之結合蛋白可用於治療罹患自體免疫疾病(諸如與炎症有關之該等疾病)的人類。在一個實施例中，使用了本文提供之結合蛋白或其抗原結合部分來治療哮喘、過敏症、過敏性肺病、過敏性鼻炎、異位性皮炎、發炎性膿皰性皮膚病、貝賽特氏病(Behcet's disease)、全身性青少年特發性關節炎、家族性地中海熱、新生兒發作型多系統發炎性疾病、急性心臟衰竭、梗塞後重構、肺高血壓、1型糖尿病、增殖性糖尿病性視網膜病變、先天性高胰島素血症、薛尼茲勒氏症候群(Schnitzler Syndrome)、痛風發作、壞疽性膿皮病、慢性阻塞性肺病(COPD)、纖維化、囊腫性纖維化(CF)、纖維性肺病、特發性肺部纖維化、肝纖維化、狼瘡、B型 肝炎相關性肝病及纖維化、敗血病、全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、絲球體腎炎、發炎性皮膚病、牛皮癬、糖尿病、胰島素依賴性糖尿病、由HIV引起之感染性疾病、發炎性腸病(IBD)、潰瘍性結腸炎(UC)、克羅恩氏病(Crohn's disease，CD)、類風濕性關節炎(RA)、骨關節炎(OA)、多發性硬化(MS)、移植物抗宿主疾病(GVHD)、移植排斥反應、缺血性心臟病(IHD)、乳糜瀉、接觸性過敏、酒精性肝病、貝賽特氏病、動脈粥樣硬化性血管疾病、眼表發炎性疾病或萊姆病(Lyme disease)。
在另一實施例中，欲治療之病症或病狀包含人體之由病毒感染引起之症狀，其係由例如HIV、人類鼻病毒、腸病毒、冠狀病毒、疱疹病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒或腺病毒引起。
本文提供之結合蛋白可用於治療神經病症。在一個實施例中，使用了本文提供之結合蛋白，或其抗原結合部分來治療涉及神經元再生及脊髓損傷之神經退化性疾病及病狀。
在一個實施例中，可用本文所揭示之組合物及方法治療或診斷的疾病包括(但不限於)原發性及轉移性癌症，包括乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰臟癌、肝癌、膽囊癌及膽管癌、小腸癌、尿道癌(包括腎癌、膀胱癌及尿路上皮癌)、女性生殖道癌(包括子宮頸癌、子宮癌及卵巢癌，以及絨毛膜癌及妊娠滋養細胞疾病)、男性生殖道癌(包括前列腺癌、精囊癌、睾丸癌及生殖細胞腫瘤)、內分泌腺癌(包括甲狀腺癌、腎上腺癌及垂體腺癌)及皮膚癌，以及血管瘤、黑素瘤、肉瘤(包括起源於骨骼及軟組織之該等肉瘤，以及卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma))、腦腫瘤、神經腫瘤、眼部腫瘤及腦膜腫瘤(包括星形細胞瘤、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經瘤、神經母細胞瘤、許旺細胞瘤(Schwannoma)及腦膜瘤)，起源於諸如白血病之血液科惡性疾病的實體腫瘤，及淋 巴瘤(霍奇金氏(Hodgkin's)及非霍奇金氏淋巴瘤)。
另一實施例提供該結合蛋白用於治療疾病或病症之用途，其中該疾病或病症為類風濕性關節炎；骨關節炎；青少年慢性關節炎；敗血性關節炎；萊姆關節炎(Lyme arthritis)；牛皮癬性關節炎；反應性關節炎；脊柱關節病；全身性紅斑性狼瘡症；克羅恩氏病；潰瘍性結腸炎；發炎性腸病；胰島素依賴性糖尿病；甲狀腺炎；哮喘；過敏性疾病；牛皮癬；皮炎；硬皮病；移植物抗宿主疾病；器官移植排斥；與器官移植有關之急性或慢性免疫疾病；類肉瘤病；動脈粥樣硬化；散播性血管內凝血；川崎氏病；葛瑞夫茲氏病；腎病症候群；慢性疲勞症候群；韋格納氏肉芽腫病；亨偌-絲奇恩賴紫癜；腎顯微性血管炎；慢性活動性肝炎；葡萄膜炎；敗血性休克；中毒休克症候群；敗血病症候群；惡病質；感染性疾病；寄生蟲病；後天免疫缺乏症候群；急性橫貫性脊髓炎；亨爾頓氏舞蹈病；帕金森氏病；阿茲海默氏病；中風；原發性膽汁性肝硬化；溶血性貧血；惡性疾病；心臟衰竭；阿狄孫氏病；偶發性I型多腺體分泌不足症及II型多腺體分泌不足症；史米特氏症候群；成人(急性)呼吸窘迫症候群；禿頭症；斑禿；關節病；瑞特氏病；牛皮癬性關節病；潰瘍性結腸炎性關節病；腸病性滑膜炎；衣原體、耶爾森菌及沙門氏菌相關性關節病；動脈粥樣化疾病/動脈硬化症；異位性過敏症；自體免疫性水皰病；尋常天疱瘡；落葉型天疱瘡；類天疱瘡；線性IgA疾病；自體免疫性溶血性貧血；庫姆氏陽性溶血性貧血(Coombs positive haemolytic anaemia)；後天性惡性貧血；青少年惡性貧血；肌痛性腦炎/皇家自由疾病；慢性皮膚黏膜念珠菌病；巨細胞動脈炎；原發性硬化性肝炎；隱原性自體免疫性肝炎；後天免疫缺乏相關疾病；B型肝炎；C型肝炎；一般變異性免疫缺乏症(一般變異性低丙種球蛋白血症)；擴張型心肌症；女性不孕；卵巢功能衰竭；卵巢早衰；纖維性肺病；隱原性纖維化肺泡 炎；發炎後間質性肺病；間質性肺炎；結締組織疾病相關性間質性肺病；混合型結締組織疾病相關性肺病；全身性硬化症相關性間質性肺病；類風濕性關節炎相關性間質性肺病；全身性紅斑性狼瘡症相關性肺病；皮肌炎/多肌炎相關性肺病；休格連氏病相關性肺病；僵直性脊椎炎相關性肺病；血管炎性擴散性肺病；血鐵黃素沈積症相關性肺病；藥物誘發之間質性肺病；纖維化；放射性纖維化；阻塞性細支氣管炎；慢性嗜伊紅血球性肺炎；淋巴細胞性浸潤性肺病；感染後間質性肺病；痛風性關節炎；自體免疫性肝炎；1型自體免疫性肝炎(經典自體免疫性肝炎或類狼瘡性肝炎)；2型自體免疫性肝炎(抗LKM抗體肝炎)；自體免疫介導之低血糖症；伴發黑棘皮病之B型胰島素抗性；副甲狀腺低能症；與器官移植有關之急性免疫疾病；與器官移植有關之慢性免疫疾病；骨性關節病；原發性硬化性膽管炎；1型牛皮癬；2型牛皮癬；特發性白細胞減少症；自體免疫性嗜中性球減少症；腎病NOS；絲球體腎炎；腎顯微性血管炎；萊姆病；盤狀紅斑狼瘡；特發性或NOS男性不育；精液自體免疫性；多發性硬化(所有亞型)；交感性眼炎；因結締組織疾病繼發之肺高血壓；古巴士德氏症候群(Goodpasture's syndrome)；結節性多動脈炎之肺表現；急性風濕熱；類風濕性脊椎炎；斯蒂爾氏病(Still's disease)；全身性硬化症；休格連氏症候群；高安氏病(Takayasu's disease)/動脈炎；自體免疫性血小板減少症；特發性血小板減少症；自體免疫性甲狀腺病；甲狀腺機能亢進；甲狀腺腫性自體免疫性甲狀腺低能症(橋本氏病(Hashimoto's disease橋))；萎縮性自體免疫性甲狀腺低能症；原發性黏液水腫；晶狀體性葡萄膜炎；原發性血管炎；白斑症；急性肝病；慢性肝病；酒精性肝硬化；酒精誘發之肝損傷；膽汁淤積；特異性肝病；藥物誘發之肝炎；非酒精性脂肪變性肝炎；過敏症及哮喘；B群鏈球菌(GBS)感染；精神障礙；抑鬱；精神分裂症；Th2型及Th1型介導之疾病； 急性及慢性疼痛；不同形式之疼痛；癌症，肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、胰臟癌、卵巢癌、前列腺癌、直腸癌；血液科惡性疾病，白血病、淋巴瘤；無β脂蛋白血症；凍瘡；急性及慢性寄生蟲或感染過程；急性白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；急性骨髓白血病(AML)；急性或慢性細菌感染；急性胰臟炎；急性腎衰竭；腺癌；心房異位搏動；AIDS癡呆複合症；酒精誘發之肝炎；過敏性結膜炎；過敏性接觸性皮炎；過敏性鼻炎；同種異體移植排斥反應；α-1-抗胰蛋白酶缺乏；肌萎縮性側索硬化；貧血；心絞痛；前角細胞變性；抗cd3療法；抗磷脂症候群；抗受體過敏反應；主動脈瘤及周圍動脈瘤；主動脈剝離；動脈性高血壓；動脈硬化症；動靜脈瘻；共濟失調；心房微顫(持續性或陣發性)；心房撲動；房室傳導阻滯；B細胞淋巴瘤；骨骼移植物排斥反應；骨髓移植(BMT)排斥反應；束支傳導阻滯；伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)；燒傷；心律不整；心臟頓抑症候群；心臟腫瘤；心肌症；心肺繞道發炎反應；軟骨移植排斥反應；小腦皮層變性；小腦病症；紊亂性或多源性房性心動過速；化學療法相關性病症；慢性骨髓性白血病(CML)；慢性酒精中毒；慢性發炎性病變；慢性淋巴球性白血病(CLL)；慢性阻塞性肺病(COPD)；慢性水楊酸鹽中毒；結腸直腸癌；充血性心臟衰竭；結膜炎；接觸性皮炎；肺原性心臟病；冠狀動脈疾病；伊茨費爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)；培養陰性敗血病；囊腫性纖維化；細胞激素療法相關性病症；拳擊手癡呆；脫髓鞘疾病；出血性登革熱；皮炎；皮膚病狀；糖尿病(diabete)；糖尿病(diabetes mellitus)；糖尿病性動脈硬化性疾病；泛發性路易體疾病(diffuse Lewy body disease)；擴張型充血性心肌症；基底神經結之病症；中年型唐氏症候群(Down's syndrome in middle age)；由阻斷CNS多巴胺受體之藥物誘發的藥物誘發性運動障礙；藥物敏感；濕疹；腦脊髓炎；心內膜 炎；內分泌病；會厭炎；艾伯斯坦-巴爾病毒感染(epstein-barr virus infection)；胺端紅痛症；錐體外及小腦病症；家族性噬血淋巴組織細胞瘤病；胎兒胸腺植入排斥反應；弗里德賴希氏共濟失調(Friedreich's ataxia)；功能性周圍動脈疾病；真菌性敗血病；氣疽；胃潰瘍；絲球體腎炎；任何器官或組織之移植物排斥反應；革蘭氏陰性敗血病(gram negative sepsis)；革蘭氏陽性敗血病；由細胞內生物體引起之肉芽瘤；毛細胞白血病；哈勒沃登-斯帕特茲病(Hallervorden-Spatz disease)；橋本氏甲狀腺炎；枯草熱；心臟移植排斥反應；血色素沉著病；血液透析；溶血性尿毒症症候群/血栓性血小板減少性紫癜；出血；A型肝炎；希氏束心律不整(His bundle arrythmias)；HIV感染/HIV神經病；霍奇金氏病；過動性運動障礙；過敏反應；過敏性肺炎；高血壓；少動性運動障礙；下丘腦-垂體-腎上腺軸評估；特發性阿狄孫氏病；特發性肺部纖維化；抗體介導之細胞毒性；無力；嬰兒脊髓性肌萎縮；主動脈炎症；a型流感；電離輻射曝露；虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎；缺血再灌注損傷；缺血性中風；青少年類風濕性關節炎；青少年脊髓性肌萎縮；卡堡氏肉瘤；腎移植排斥反應；退伍軍人症；利什曼體病(leishmaniasis)；麻瘋；皮質脊髓系統病變；脂性水腫；肝移植排斥反應；淋巴水腫；瘧疾；惡性淋巴瘤；惡性組織細胞增多病；惡性黑素瘤；腦膜炎；腦膜炎球菌血症；代謝性/特發性偏頭痛；粒線體多系統病症；混合性結締組織疾病；單株γ-球蛋白病；多發性骨髓瘤；多系統退化(曼氏(Mencel)、德傑林-托馬斯(Dejerine-Thomas)、夏伊-德雷格(Shi-Drager)及馬查多-約瑟夫(Machado-Joseph))；細胞內禽結核桿菌病；結核分枝桿菌病；骨髓發育不良症候群；心肌梗塞；心肌缺血症；鼻咽癌；新生兒慢性肺部疾病；腎炎；腎病；神經退化性疾病；神經原性肌萎縮；發燒性嗜中性白血球低下症；非霍奇金氏淋巴瘤；腹主動 脈及其分支閉塞；閉塞性動脈症；okt3療法；睾丸炎/附睾炎；睾丸炎/輸精管復通術；內臟增大；骨質疏鬆症；胰臟移植排斥反應；胰臟癌；腫瘤相關症候群/惡性血鈣過多；副甲狀腺移植排斥反應；盆腔炎；季節性鼻炎；心包疾病；周圍動脈粥樣硬化疾病；周圍血管病症；腹膜炎；惡性貧血；卡氏肺囊蟲肺炎；肺炎；POEMS症候群(多發性神經病、內臟增大、內分泌病、單株γ-球蛋白病及皮膚變化症候群)；灌注後症候群；泵後症候群；MI心切開術後症候群；子癇前症；進行性核上麻痺；原發性肺高血壓；輻射療法；雷諾氏症候群(Raynaud's phenomenon)及疾病；雷諾氏病；雷夫蘇姆氏病(Refsum's disease)；規則性QRS波狹窄型心動過速；腎血管性高血壓；再灌注損傷；窄縮性心肌症；肉瘤；硬皮病；老年性舞蹈病；路易體型老年癡呆；血清陰性關節病；休克；鐮形細胞性貧血；皮膚同種異體移植排斥反應；皮膚變化症候群；小腸移植排斥反應；實體腫瘤；特異性心律不整；脊髓共濟失調；脊髓小腦退化症；鏈球菌肌炎；小腦結構病變；亞急性硬化性全腦炎；暈厥；心血管系統梅毒；全身性過敏反應；全身性發炎性反應症候群；全身發作型青少年類風濕性關節炎；T細胞或FAB ALL；毛細管擴張症；血栓閉塞性脈管炎；血小板減少症；中毒；移植；外傷/出血；III型過敏反應；IV型過敏；不穩定型心絞痛；尿毒症；尿路敗血症；心臟瓣膜病；靜脈曲張；血管炎；靜脈疾病；靜脈栓塞；心室纖維性顫動；病毒及真菌感染；病毒性腦炎/無菌性腦膜炎；病毒相關吞噬血細胞症候群；韋尼克-科爾薩科夫症候群(Wernicke-Korsakoff syndrome)；韋爾森氏病(Wilson's disease)；任何器官或組織之異種移植物排斥反應；急性冠狀動脈症候群；急性特發性多神經炎；急性發炎性脫髓鞘多神經根神經病變；急性缺血；成人斯蒂爾氏病(adult Still's disease)；全身性過敏反應；抗磷脂抗體症候群；再生不全性貧血；異位性濕疹；異位性皮炎；自體免疫性皮 炎；與鏈球菌感染相關之自體免疫病症；自體免疫性腸病；自體免疫性聽力喪失；自體免疫性淋巴細胞增殖症候群(ALPS)；自體免疫性心肌炎；自體免疫性卵巢早衰；瞼緣炎；支氣管擴張症；大皰性類天疱瘡；心血管疾病；災難性抗磷脂症候群；乳糜瀉；頸椎關節黏連；慢性缺血；瘢痕性類天疱瘡；伴以多發性硬化症風險之單一臨床症狀(cis)；兒童期發作之精神病症；淚囊炎；皮肌炎；糖尿病性視網膜病變；椎間盤突出症；椎間盤下垂；藥物誘發之免疫溶血性貧血；子宮內膜異位；眼內炎；上鞏膜炎；多形性紅斑；重症多形性紅斑；妊娠性類天疱瘡；格林-巴利症候群(Guillain-Barré syndrome，GBS)；休斯症候群(Hughes syndrome)；特發性帕金森氏病；特發性間質性肺炎；IgE介導之過敏症；免疫溶血性貧血；包涵體肌炎；感染性眼部發炎性疾病；發炎性脫髓鞘疾病；發炎性心臟病；發炎性腎病；IPF/UIP；虹膜炎；角膜炎；乾燥性角膜結膜炎；庫斯毛爾病(Kussmaul disease)或庫斯毛爾-梅爾氏病(Kussmaul-Meier disease)；蘭德里氏癱瘓(Landry's paralysis)；蘭格罕氏細胞組織球增生症(Langerhan's cell histiocytosis)；網狀青斑；黃斑變性；顯微鏡下多血管炎；白赫鐵列夫症(morbus bechterev)；運動神經元病症；黏膜類天疱瘡；多重器官衰竭；重症肌無力；骨髓發育不良症候群；心肌炎；神經根病症；神經病；非A非B型肝炎；視神經炎；骨質溶解；少關節性JRA；周圍動脈閉塞性疾病(PAOD)；周圍血管疾病(PVD)；周圍動脈疾病(PAD)；靜脈炎；結節性多動脈炎(或結節性動脈周圍炎)；多軟骨炎；白髮症；多關節性JRA；多內分泌缺陷症候群；多發性肌炎；風濕性多肌痛(PMR)；原發性帕金森氏症；前列腺炎；單純紅血球發育不全；原發性腎上腺機能不全；復發性視神經脊髓炎；再狹窄；風濕性心臟病；sapho(滑膜炎、痤瘡、膿皰病、骨肥厚及骨炎)；繼發性澱粉樣變性；休克肺；鞏膜炎；坐骨神經痛；繼發性腎 上腺機能不全；聚矽氧相關性結締組織疾病；史奈頓-威爾金森皮膚病(sneddon-wilkinson dermatosis)；僵直性脊椎炎；史蒂文斯-瓊森症候群(Stevens-Johnson syndrome，SJS)；顳動脈炎；弓形蟲性視網膜炎；中毒性表皮壞死鬆解症；橫貫性脊髓炎；TRAPS(腫瘤壞死因子受體)、1型過敏反應；II型糖尿病；尋常型間質性肺炎(UIP)；血管炎；春季結膜炎；病毒性視網膜炎；小柳原田症候群(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome，VKH症候群)；濕性黃斑變性；或創傷癒合。在一些實施例中，可使用本文所揭示之任一結合蛋白來治療以上所列之病症。在某些實施例中，用於治療本文所論述之任何病症的結合蛋白為DVD2424-3425中之一或多者。在某些實施例中，該結合蛋白為DVD2424、DVD2425、DVD2426、DVD2427、DVD2428、DVD2429、DVD2430、DVD3415或DVD3418。在某些實施例中，該結合蛋白為DVD3415或DVD3418。在一些實施例中，使用結合蛋白(例如DVD3418)有效治療病症可藉由量測血清或組織標記物IL-6、PGE-2、G-CSF、CXCL-1、CXCL-5、MMP-3或MMP-13中一或多者之表現的減少來偵測。
在一個實施例中，使用了本文所揭示之結合蛋白來治療關節炎、類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、僵直性脊椎炎、ANCA血管炎、風濕性多肌痛或乾眼病。在一個實施例中，使用該結合蛋白治療關節炎。在一個實施例中，使用該結合蛋白治療類風濕性關節炎。在一個實施例中，使用該結合蛋白治療牛皮癬性關節炎。在一個實施例中，使用該結合蛋白治療僵直性脊椎炎。在一些實施例中，該結合蛋白為DVD2424-3425中之一或多者。在某些實施例中，該結合蛋白為DVD2424、DVD2425、DVD2426、DVD2427、DVD2428、DVD2429、DVD2430、DVD3415或DVD3418。在一個實施例中，該結合蛋白為DVD3415或DVD3418。
在一些實施例中，可使用結合蛋白(例如DVD3415或DVD3418)來治療對於抗TNF療法具有抗性之類風濕性關節炎。舉例而言，靶向IL-1β及IL-17之結合蛋白(例如DVD3415或DVD3418)可堅持比抗TNF抗體循環更長時間，由此提供更長持續時間之治療作用且有可能實現投藥頻率之降低，而此又可降低所投與之藥劑誘發免疫反應的風險。儘管抑制TNF在關節炎動物模型中展現之治療益處優於抑制單獨IL-1β或IL-17，但已意外地發現，如與抗TNF單藥療法相比較，IL-1β及IL-17之雙重抑制可提供某些改善之治療成果。
在一些實施例中，結合蛋白可引起的類風濕性關節炎相關性炎症之減少高於可藉由投與抗TNF抗體所達成之減少，或該減少可高於在針對IL-1β及IL-17之單獨抗體之雙重投藥後由抑制作用總和所達成之減少。炎症可例如藉由量測IL-6、CXCL-1、PGE-2、CXCL-5、G-CSF或MMP3之表現量來評估。在一些實施例中，使用結合蛋白使炎症、軟骨損失及/或骨骼破壞減少之量可大於使用TNF抗體或使用作為單藥療法之組合投與之IL-1β及IL-17抗體可達成之量。舉例而言，如與IL-1β或IL-17抗體當單獨投與時相比較，本文所揭示之結合蛋白可展現小鼠膠原蛋白誘發之關節炎模型中炎症減輕之增加。在一些實施例中，結合蛋白亦可以不依賴於TNF之方式意外地提供骨骼保護作用。因此，使用結合蛋白(例如DVD3415或DVD3418)靶向發炎性介體之組合對患者症狀之控制可比藉由個別單藥療法可達成之控制完全。
在某些實施例中，可投與結合蛋白(例如DVD3415或DVD3418)來治療對於抗TNF抗體具有抗性之患者群的類風濕性關節炎。在某些實施例中，可投與結合蛋白(例如DVD3415或DVD3418)來治療處於類風濕性關節炎後期之可能對抗TNF療法無反應之疾病(患者患關節炎之部分對用抗TNF劑或抗細胞激素單藥療法進行之治療無反應)。在一些實施例中，可使用結合蛋白(例如DVD3415或DVD3418)來降低與風 濕性多肌痛相關之IL-1β及IL-17含量升高，同時不改變TH1細胞中IFN-γ之產生。在一些實施例中，可使用結合蛋白(例如DVD3418)來減少乾眼症患者之淚液中所見且與乾眼症相關之炎症有關的IL-1β及IL-17表現。
在一個實施例中，當單獨使用或組合使用放射療法及/或化學治療劑時，使用結合蛋白或其抗原結合部分治療癌症或者預防或抑制由本文所述之腫瘤引起之轉移。
在另一態樣中，提供了治療罹患病症之患者的方法，其包含在投與第二藥劑之前、同時或之後投與本文所揭示之任一結合蛋白的步驟。在一個實施例中，該第二藥劑為布替耐德(budenoside)；表皮生長因子；皮質類固醇；環孢素；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；胺基水楊酸鹽；6-巰基嘌呤；硫唑嘌呤(azathioprine)；甲硝唑(metronidazole)；脂肪加氧酶抑制劑；美塞拉明(mesalamine)；奧沙拉秦(olsalazine)；巴柳氮(balsalazide)；抗氧化劑；血栓素抑制劑；IL-1受體拮抗劑；抗IL-1β mAb；抗IL-6或IL-6受體mAb；生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；吡啶基-咪唑化合物；TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF之抗體或促效劑；針對CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配位體之抗體；甲胺喋呤；環孢素；FK506；雷帕黴素；黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)；來氟米特(leflunomide)；NSAID；布洛芬(ibuprofen)；潑尼松龍(prednisolone)；磷酸二酯酶抑制劑；腺苷促效劑；抗血栓劑；補體抑制劑；腎上腺素激導劑；IRAK；NIK；IKK；p38；MAP激酶抑制劑；IL-1β轉化酶抑制劑；TNFα轉化酶抑制劑；T細胞信號傳導抑制劑；金屬蛋白酶抑制劑；柳氮磺吡啶；硫唑嘌呤；6-巰基嘌呤；血管收縮素轉化酶抑制劑；可溶 性細胞激素受體；可溶性p55 TNF受體；可溶性p75 TNF受體；sIL-1RI；sIL-1RII；sIL-6R；消炎性細胞激素；IL-4；IL-10；IL-11；IL-13；或TGFβ。在一個特定實施例中，本文所揭示之醫藥組合物係藉由非經腸、皮下、肌肉內、靜脈內、關節內、支氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、大腸內、子宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊椎內、滑膜內、胸腔內、子宮內、膀胱內、快速注射、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內或經皮投藥來投與患者。
亦提供了針對本文所揭示之結合蛋白之抗個體基因型抗體。抗個體基因型抗體包括包含免疫球蛋白分子之至少一部分的任何含蛋白質或肽之分子，該至少一部分諸如為(但不限於)重鏈或輕鏈或其配位體結合部分之至少一個互補決定區(CDR)、重鏈或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈恆定區、構架區或其任何部分，其可併入本文提供之結合蛋白中。
提供了一種測定測試樣品中IL-1β及/或IL-17或其片段之存在、量或濃度的方法。該方法包含藉由免疫分析針對抗原或其片段來分析測試樣品。免疫分析(i)採用了至少一種結合蛋白及至少一個可偵測標記且(ii)包含將測試樣品中由可偵測標記產生的作為抗原或其片段之存在、量或濃度之直接或間接指示之信號與對照物或校準劑中所產生的作為抗原或其片段之存在、量或濃度之直接或間接指示之信號相比較。校準劑視情況為一系列校準劑中之一部分，其中該等校準劑各自與該系列中之其他校準劑在抗原或其片段之濃度方面不同。該方法可包含(i)使測試樣品與至少一種結合至該抗原或其片段上之抗原決定基之捕捉劑接觸，由此形成捕捉劑/抗原或其片段複合物；(ii)使該捕捉劑/抗原或其片段複合物與至少一種偵測劑接觸以形成捕捉劑/抗原或 其片段/偵測劑複合物，該偵測劑包含可偵測標記且結合至該抗原或其片段上未結合該捕捉劑之抗原決定基；及(iii)基於(ii)中所形成之捕捉劑/抗原或其片段/偵測劑複合物中由可偵測標記產生之信號，確定測試樣品中該抗原或其片段之存在、量或濃度，其中至少一種捕捉劑及/或至少一種偵測劑為至少一種結合蛋白。
或者，該方法可包含(i)使測試樣品與至少一種結合至該抗原或其片段上之抗原決定基之捕捉劑接觸，由此形成捕捉劑/抗原或其片段複合物，且同時或依序，以任一次序使測試樣品與標記可偵測物之抗原或其片段接觸，該抗原或其片段可與測試樣品中之任何抗原或其片段競爭結合於至少一種捕捉劑，其中測試樣品中存在之任何抗原或其片段與標記可偵測物之抗原相互競爭以分別形成捕捉劑/抗原或其片段複合物及捕捉劑/標記可偵測物之抗原或其片段複合物；及(ii)基於(i)中所形成之捕捉劑/標記可偵測物之抗原或其片段複合物中由可偵測標記產生之信號，確定測試樣品中該抗原或其片段之存在、量或濃度，其中至少一種捕捉劑為至少一種結合蛋白且其中捕捉劑/標記可偵測物之抗原或其片段複合物中由可偵測標記產生之信號與測試樣品中抗原或其片段之量或濃度呈反比例。
測試樣品可來自患者，在此情形中，該方法可進一步包含診斷、預測或評估該患者之治療性/預防性治療之功效。若該方法進一步包含評估該患者之治療性/預防性治療之功效，則該方法視情況進一步包含根據需要改進該患者之治療性/預防性治療以改善功效。該方法可經改編以用於自動化系統或半自動化系統中。因此，亦可使用本文所述之方法來確定個體是否患有指定疾病、病症或病狀，或有發展指定疾病、病症或病狀之風險。具體而言，此類方法可包含以下步驟：
(a)測定來自個體之測試樣品中分析物或其片段之濃度或量(例 如，使用本文所述之方法，或此項技術中已知之方法)；及(b)將步驟(a)中所測定之分析物或其片段之濃度或量與預定水準相比較，其中若步驟(a)中所測定之分析物之濃度或量相對於預定水準為有利的，則確定該個體未患指定疾病、病症或病狀，或無患指定疾病、病症或病狀之風險。然而，若步驟(a)中所測定之分析物之濃度或量相對於預定水準為不利的，則確定該個體患有指定疾病、病症或病狀，或有患指定疾病、病症或病狀之風險。
此外，本文提供監測個體中疾病之進展的方法。最佳地，該方法包含以下步驟：(a)測定來自個體之測試樣品中分析物之濃度或量；(b)測定稍後來自該個體之測試樣品中分析物之濃度或量；及(c)將步驟(b)中所測定之分析物之濃度或量與步驟(a)中所測定之分析物之濃度或量相比較，其中若步驟(b)中所測定之分析物之濃度或量當與步驟(a)中所測定之分析物之濃度或量相比較時未改變或不利，則確定該個體之疾病仍持續、進展或惡化。藉由比較，若如步驟(b)中所測定之分析物之濃度或量當與如步驟(a)中所測定之分析物之濃度或量相比較時為有利的，則確定該個體之疾病已中斷、消退或改善。
視情況，該方法進一步包含將如步驟(b)中所測定之分析物之濃度或量例如與預定水準相比較。此外，若該比較顯示如步驟(b)中所測定之分析物之濃度或量例如相對於預定水準有不利地改變，則視情況該方法包含用一或多種醫藥組合物治療該個體一段時間。
亦提供一種用於分析測試樣品中之IL-1β及/或IL-17或其片段之套組。該套組包含至少一種用於分析該測試樣品中之抗原或其片段的組分，及有關分析該測試樣品中之抗原或其片段的說明書，其中該至少一種組分包括至少一種包含本文所揭示之結合蛋白的組合物，其中該結合蛋白視情況為標記可偵測物的。
圖1為雙重可變結構域(DVD)結合蛋白構築體之示意性表示。
提供能夠結合IL-1β及/或IL-17之多價及/或多特異性結合蛋白。亦提供雙重可變結構域結合蛋白(DVD結合蛋白)或雙重可變結構域免疫球蛋白(DVD-IgTM)，及其醫藥組合物，以及用於製備此類DVD結合蛋白之核酸、重組表現載體及宿主細胞。亦提供使用DVD結合蛋白在活體外或活體內偵測特定抗原之方法。
除非本文另作定義，否則本文使用之科技術語具有熟習此項技術者通常所瞭解之含義。若存在任何潛在不明確性，則本文提供之定義先於任何詞典或外加定義。除非上下文另外需要，否則單數形式之術語應包括複數形式且複數形式之術語應包括單數形式。除非另作規定，否則使用「或」意謂「及/或」。使用之術語「包括(including)」以及其他形式，諸如「包括(includes)」及「包括(included)」並非限制性的。除非另作規定，否則本文所揭示之任何範圍意欲涵蓋該範圍之終點。
一般而言，與本文所述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白質及核酸化學及雜交學結合使用之命名法為此項技術中已知且常用者。除非另作指示，否則本文提供之方法及技術一般係根據此項技術中熟知之習知方法且如本說明書全篇所引用及論述之各種通用及更特定之參考文獻中所述來進行。酶促反應及純化技術係根據製造商之說明、如此項技術中通常所實現或如本文所述進行。與本文所述之分析化學、合成有機化學以及醫學及藥物化學結合使用之命名法及其實驗程序及技術為此項技術中熟知且常用者。使用標準技術來進行化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及遞送以及患者之治療。
為了更容易地瞭解本發明，選擇術語定義於下。
術語「抗體」係指免疫球蛋白(Ig)分子，其一般包含四條多肽鏈，即，兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈，或其保持Ig分子之抗原決定基結合特徵之功能片段、突變體、變體或衍生物。此類片段、突變體、變體或衍生物抗體型式為此項技術中已知的。在全長抗體之實施例中，每條重鏈包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區(CH)。CH包含三個結構域，CH1、CH2及CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)。CL包含單一CL結構域。VH及VL可進一步細分成稱為互補決定區(CDR)之高可變性區，其中散佈有更為保守之區域，稱為構架區(FR)。一般而言，每個VH及VL係由自胺基末端至羧基末端按以下次序佈置之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。免疫球蛋白分子可屬於任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞類。
術語「雙特異性抗體」係指在其兩個結合臂之一(一對HC/LC)上結合一個抗原(或抗原決定基)且在其另一結合臂(一對不同之HC/LC)上結合不同抗原(或抗原決定基)的抗體。雙特異性抗體具有兩個截然不同之抗原結合臂(在特異性及CDR序列方面)，且對於其結合之每一抗原決定基而言為單價的。雙特異性抗體包括由四源融合瘤技術(Milstein及Cuello(1983)Nature 305(5934)：537-40)、藉由兩種不同單株抗體之化學結合(Staerz等人(1985)Nature 314(6012)：628-31)或藉由在Fc區中引入突變之旋鈕-至-空穴(knob-into-hole)或類似方法(Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(14)：6444-6448)所產生之抗體。
「親和力成熟」抗體為在其一或多個CDR中具有一或多種變化之抗體，與不具有此等變化之親本抗體相比，該或該等變化引起該抗體對抗原之親和力之改善。例示性親和力成熟抗體將對靶抗原具有奈莫 耳濃度或甚至皮莫耳濃度之親和力。親和力成熟抗體係藉由此項技術中已知之程序產生。Marks等人(1992)BioTechnology 10：779-783描述了藉由VH及VL結構域改組進行之親和力成熟。CDR及/或構架殘基之隨機突變誘發描述於Barbas等人(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813；Schier等人(1995)Gene 169：147-155；Yelton等人(1995)J.Immunol.155：1994-2004；Jackson等人(1995)J.Immunol.154(7)：3310-9；Hawkins等人(1992)J.Mol.Biol.226：889-896中，且在選擇性突變誘發位置、接觸或超突變位置處用活性增強之胺基酸殘基進行之突變如美國專利第6,914,128號中所述。
術語「CDR移植之抗體」係指包含重鏈及輕鏈可變區序列且其中VH及/或VL之一或多個CDR區的序列經另一抗體之CDR序列置換的抗體。舉例而言，該兩個抗體可來自不同物種，諸如具有鼠類重鏈及輕鏈可變區且其中一或多個鼠類CDR已經人類CDR序列置換的抗體。
術語「人類化抗體」係指已變成更「類似於人類」(亦即，更類似於人類生殖系序列)的來自非人類物種之抗體。一類人類化抗體為將非人類CDR序列引入人類VH及VL序列中以置換相應人類CDR序列的CDR移植之抗體。「人類化抗體」亦為包含實質上具有人類抗體之胺基酸序列(例如與人類抗體之胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致)之構架區(FR)序列及至少一個實質上具有非人類抗體之胺基酸序列之CDR的抗體或其變體、衍生物、類似物或片段。人類化抗體可包含至少一個且通常兩個可變結構域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)的實質上全部序列，其中全部或實質上全部CDR區之序列對應於非人類免疫球蛋白(亦即，供體抗體)之該等序列，且全部或實質上全部FR區之序列係人類免疫球蛋白之該等序列。人類化抗體亦可包括重鏈之CH1、鉸鏈區、CH2、CH3及CH4區。在一個實施例中，人類化抗體亦包含人類免疫球蛋白Fc區之 至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化輕鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化重鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅含有輕鏈之人類化可變結構域及/或重鏈之人類化可變結構域。在一些實施例中，人類化抗體含有輕鏈以及至少重鏈之可變結構域。在一些實施例中，人類化抗體含有重鏈以及至少輕鏈之可變結構域。
術語「雙重可變結構域結合蛋白」及「雙重可變結構域免疫球蛋白」係指在兩個結合臂(例如一對HC/LC)中各自具有兩個可變結構域之結合蛋白(參見PCT公開案第WO 02/02773號)，該等結合臂各自能夠結合抗原。在一個實施例中，每個可變結構域結合不同抗原或抗原決定基。在另一實施例中，每個可變結構域結合相同抗原或抗原決定基。在另一實施例中，雙重可變結構域結合蛋白具有兩個一致之抗原結合臂，具有一致之特異性及一致之CDR序列，且對於其結合之每個抗原而言為二價的。在一個實施例中，DVD結合蛋白可為單特異性的，亦即，能夠結合一個抗原；或多特異性的，亦即，能夠結合兩個或兩個以上抗原。包含兩個重鏈DVD多肽及兩個輕鏈DVD多肽之DVD結合蛋白稱為DVD-IgTM。在一個實施例中，四條鏈之DVD結合蛋白之每一半包含重鏈DVD多肽及輕鏈DVD多肽，及兩個抗原結合位點。在一個實施例中，每個結合位點包含重鏈可變結構域及輕鏈可變結構域，且每個抗原結合位點之抗原結合涉及總計6個CDR。
術語「抗個體基因型抗體」係指針對另一抗體之抗原組合位點之胺基酸序列所產生的抗體。抗個體基因型抗體可經投與以增強針對抗原之免疫反應。
術語「生物活性」係指一個分子之任一種或多種生物特性(不管是如在活體內發現之天然存在的，或是藉由重組方式提供或實現的)。生物特性包括(但不限於)結合受體、誘導細胞增殖、抑制細胞生 長、誘導其他細胞激素、誘導細胞凋亡及酶活性。
術語「中和」係指當結合蛋白特異性結合於抗原時抵消該抗原之生物活性。在一個實施例中，中和結合蛋白結合於抗原(例如細胞激素)且使其生物活性降低至少約20%、40%、60%、80%、85%或更多。
「特異性」係指結合蛋白選擇性結合抗原之能力。
「親和力」為結合蛋白與抗原之間相互作用之強度，且藉由結合蛋白之CDR之序列以及抗原之性質(諸如其大小、形狀及/或電荷)所測定。結合蛋白可針對親和力進行選擇以提供所需治療終點，同時使負面副作用最少。親和力可使用熟習此項技術者已知之方法量測(US 20090311253)。
術語「效力」係指結合蛋白達成所需作用之能力且為其治療功效之量度。效力可使用熟習此項技術者已知之方法評估(US 20090311253)。
術語「交叉反應性」係指結合蛋白結合除其產生所針對之靶外的靶之能力。一般而言，結合蛋白將以適當地高親和力結合其靶組織/抗原，但將對非靶正常組織呈現適當地低親和力。個別結合蛋白一般經選擇以滿足兩個標準。(1)適於針對抗體靶之已知表現進行組織染色。(2)在人類與來自相同器官之tox物種(小鼠及食蟹獼猴)組織之間具有類似染色模式。評估交叉反應性之該等及其他方法為熟習此項技術者已知的(US 20090311253)。
術語「生物功能」係指結合蛋白在活體外或活體內之特定作用。結合蛋白可靶向若干類別之抗原且經由多種作用機制達成所需治療成果。結合蛋白可靶向可溶性蛋白質、細胞表面抗原以及細胞外蛋白質沈積物。結合蛋白可促進、拮抗或中和其靶之活性。結合蛋白可有助於清除其結合之靶，或當結合至細胞時可引起細胞毒性。兩個或 兩個以上抗體之部分可併入多價型式中以在單一結合蛋白分子中達成截然不同之功能。用於評估生物功能之活體外分析及活體內模型為熟習此項技術者已知的(US 20090311253)。
「穩定」結合蛋白為這樣一種結合蛋白，其中該結合蛋白在儲存時基本上保持其物理穩定性、化學穩定性及/或生物活性。在活體外在各種溫度下穩定一段較長時間段之多價結合蛋白為合乎需要的。使結合蛋白穩定及評估其在各種溫度下之穩定性的方法為熟習此項技術者已知的(US 20090311253)。
術語「溶解性」係指蛋白質保持分散於水溶液中之能力。蛋白質於水性調配物中之溶解性取決於疏水性及親水性胺基酸之適當分配，且因此，溶解性可與正確摺疊之蛋白質之產生相關。熟習此項技術者將能夠使用常規HPLC技術及熟習此項技術者已知之方法(US 20090311253)偵測結合蛋白溶解性之增加或降低。
結合蛋白可使用多種宿主細胞產生或可在活體外產生，且每次嘗試之相對產率確定「產生效率」。影響產生效率之因素包括(但不限於)宿主細胞類型(原核或真核的)、表現載體之選擇、核苷酸序列之選擇及所用之方法。用於產生結合蛋白之材料及方法以及產生效率之量測為熟習此項技術者已知的(US 20090311253)。
術語「免疫原性」意謂一種物質誘導免疫反應之能力。治療性結合蛋白之投與可引起免疫反應之某種發生。可能以多價型式誘導免疫原性之潛在要素可在親本抗體之選擇期間進行分析，且在將親本抗體序列併入多價結合蛋白型式中之前，可採用降低此類風險之步驟優化該等親本抗體。降低抗體及結合蛋白之免疫原性的方法為熟習此項技術者已知的(US 20090311253)。
術語「標記」及「可偵測標記」意謂附接至特定結合對之成員(諸如抗體或其分析物)以使該特定結合對之成員之間的反應(例如結 合)可偵測的部分。該特定結合對之經標記成員稱為「標記可偵測物的」。因此，術語「經標記結合蛋白」係指併入標記以提供對結合蛋白之鑑別的蛋白質。在一個實施例中，該標記為一種可偵測標記物，其可產生可藉由目測或儀器方式偵測之信號，例如併入放射性標記之胺基酸或附接至具有可藉由經標記抗生物素蛋白偵測之生物素基部分之多肽(例如含有螢光標記物或酶活性之抗生蛋白鏈菌素，其可藉由光學或比色方法偵測)。用於多肽之標記的實例包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核種(例如，3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm)、色原體、螢光標記(例如，FITC、若丹明(rhodamine)、鑭系元素磷光體)、酶標記(例如，辣根過氧化酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光標記物、生物素基團、由第二報導子識別之預定多肽抗原決定基(例如，白胺酸拉鏈對序列、第二抗體之結合位點、金屬結合結構域、抗原決定基標籤)，及磁性試劑(諸如釓螯合物)。常用於免疫分析之標記的代表性實例包括產生光之部分(例如吖啶鎓化合物)及產生螢光之部分(例如螢光素)。就這一點而言，該部分本身可能不為標記可偵測物的而是可在與又另一部分反應後變為可偵測的。
術語「結合物」係指以化學方式連接至第二化學部分(諸如治療劑或細胞毒性劑)之結合蛋白，諸如抗體。術語「試劑」包括化合物、化合物之混合物、生物大分子或由生物材料製成之提取物。在一個實施例中，該治療劑或細胞毒性劑包括(但不限於)百日咳毒素、紫杉醇(taxol)、細胞遲緩素B(cytochalasin B)、短桿菌素D(gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、小紅莓(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮 (dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-脫氫睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質激素(glucocorticoid)、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)，以及其類似物或同系物。當用於免疫分析之情形中時，該結合物抗體可為用作偵測抗體的標記可偵測物之抗體。
術語「晶體」及「結晶」係指以晶體形式存在之結合蛋白(例如抗體)或其抗原結合部分。晶體為固態物質之一種形式，其不同於諸如非晶形固態或液晶態之其他形式。晶體係由原子、離子、分子(例如蛋白質，諸如抗體)或分子集合體(例如抗原/抗體複合物)規則、重複之三維陣列構成。該等三維陣列係根據本領域中充分瞭解之特定數學關係佈置。在晶體中重複之基本單元或構築嵌段稱為不對稱單元。不對稱單元以符合既定、定義明確之結晶學對稱性之佈置重複提供了晶體之「單位晶胞」。單位晶胞在所有三個維度中藉由規則平移之重複提供了晶體。參看Giege,R.及Ducruix,A.Barrett,CRYSTALLIZATION OF NUCLEIC ACIDS AND PROTEINS,A PRACTICAL APPROACH，第2版，第20 1-16頁，Oxford University Press,New York,New York,(1999)。
術語「載體」係指一種核酸分子，其能夠轉運已與其連接之另一核酸。一類載體為「質體」，其係指其中可接合其他DNA區段之環狀雙股DNA環。另一類載體為病毒載體，其中可將其他DNA區段接合至病毒基因組中。其他載體包括RNA載體。某些載體能夠在引入該等載體之宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞中後可整合至該宿主細胞之基因組中，且由此隨宿主基 因組一起複製。某些載體能夠引導可操作地與其連接之基因的表現。此等載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。一般而言，重組DNA技術中利用之表現載體通常為質體形式。在本說明書中，由於質體為載體之最常用形式，故「質體」與「載體」可互換使用。然而，亦包括用於相同作用之其他表現載體形式，諸如病毒載體(例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。一組pHybE載體(美國專利申請案序號61/021,282)用於親本抗體及DVD-結合蛋白選殖。來源於pJP183；pHybE-hCg1,z,non-a V2之V1用於抗體及具有野生型恆定區之DVD重鏈的選殖。來源於pJP191；pHybE-hCk V3之V2用於抗體及具有κ恆定區之DVD輕鏈的選殖。來源於pJP192；pHybE-hC1 V2之V3用於抗體及具有λ恆定區之DVD輕鏈的選殖。用λ信號肽及κ恆定區構建之V4用於具有λ-κ雜交V結構域之DVD輕鏈之選殖。用κ信號肽及λ恆定區構建之V5用於具有κ-λ雜交V結構域之DVD輕鏈之選殖。來源於pJP183；pHybE-hCg1,z,non-a V2之V7用於抗體及具有(234,235 AA)突變體恆定區之DVD重鏈的選殖。
術語「重組宿主細胞」或「宿主細胞」係指已引入外源DNA之細胞。該等術語不僅係指特定個體細胞，而且亦指此類細胞之子代。由於某些修飾可因突變或環境影響而出現於後代中，故事實上，此子代可能不同於親代細胞，但仍包括在如本文中所用之術語「宿主細胞」之範疇內。在一個實施例中，宿主細胞包括原核及真核細胞。在一個實施例中，真核細胞包括原生生物、真菌、植物及動物細胞。在另一實施例中，宿主細胞包括(但不限於)原核細胞株大腸桿菌；哺乳動物細胞株CHO、HEK 293、COS、NS0、SP2及PER.C6；昆蟲細胞株Sf9；及真菌細胞釀酒酵母。
術語「轉染」涵蓋常用於將外源核酸(例如DNA)引入宿主細胞中之多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-葡聚糖轉染及其類似 技術。
術語「細胞激素」係指由一個細胞群所釋放的作為細胞間介體作用於另一細胞群之蛋白質。術語「細胞激素」包括來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白質及天然序列細胞激素之生物活性等效物。
術語「生物樣品」意謂來自活物質或先前之活物質的一些物質。此類物質包括(但不限於)血液(例如全血)、血漿、血清、尿液、羊水、滑膜液、內皮細胞、白細胞、單核細胞、其他細胞、器官、組織、骨髓、淋巴結及脾。
術語「組分」係指一種組合物之成分。就診斷套組而言，例如，組分可為捕捉抗體、偵測或結合物抗體、對照物、一種校準劑、一系列校準劑、靈敏度試片(sensitivity panel)、容器、緩衝液、稀釋劑、鹽、酶、酶之輔因子、偵測試劑、預處理試劑/溶液、受質(例如，溶液形式)、終止溶液及可包括在套組中用於分析測試樣品之類似物。因此，「組分」可包括諸如藉由結合於抗分析物(例如抗多肽)抗體固定於固體支撐物上的如以上之多肽或其他分析物。一些組分可為溶液形式或供復原以用於分析中之凍乾形式。
「對照物」係指已知不為分析物(「負對照物」)或含有分析物(「正對照物」)之組合物。正對照物可包含已知濃度之分析物。「對照物」、「正對照物」及「校準劑」在本文中可互換使用以指包含已知濃度之分析物的組合物。「正對照物」可用於確定分析之效能特徵且為試劑(例如分析物)完整性之有用指示劑。
「預定截止點」及「預定水準」一般係指分析截止值，其藉由比較分析結果與預定截止點/水準而用於評估診斷/預後/治療功效結果，其中該預定截止點/水準已與各種臨床參數(例如疾病之嚴重程度、進展/無進展/改善等)相關聯或有關。儘管本發明可提供例示性預 定水準，但熟知截止值可取決於免疫分析之性質(例如所採用之抗體等)而變化。另外，使本文之揭示內容適合於其他免疫分析以獲得免疫分析特異性截止值用於基於本發明之該等其他免疫分析恰在熟習此項技術者之技能範圍內。儘管預定截止點/水準之精確值可隨分析而變化，但如本文所述之相關性(若存在的話)一般可為可適用的。
如在本文所述之診斷分析中所使用，「預處理試劑」，例如溶胞、沈澱及/或溶解試劑，為溶解測試樣品中存在之任何細胞及/或溶解其中任何分析物之試劑。如本文進一步描述，預處理未必用於所有樣品。其中，溶解分析物(例如所關注之多肽)可為自樣品中存在之任何內源結合蛋白中釋放分析物所必需的。預處理試劑可為同源(不需要分離步驟)或異源的(需要分離步驟)。在進行至該分析之下一步驟之前，利用異源預處理試劑，自測試樣品中移除任何沈澱之分析物結合蛋白。
在本文所述之免疫分析及套組之上下文中，「品質控制試劑」包括(但不限於)校準劑、對照物及靈敏度試片。通常使用「校準劑」或「標準品」(例如一或多種，諸如複數個)以便確定校準(標準)曲線用於內插分析物(諸如抗體或分析物)之濃度。或者，可使用接近預定正/負截止值之單一校準劑。可結合使用多種校準劑(亦即，超過一種校準劑或不同量之校準劑)，由此包含「靈敏度試片」。
術語「特異性結合搭配物」為特異性結合對之成員。特異性結合對包含經由化學或物理方式彼此特異性結合之兩個不同分子。因此，除抗原與抗體特異性結合外，其他特異性結合對可包括生物素與抗生物素蛋白(或抗生蛋白鏈菌素)、碳水化合物與凝集素、互補核苷酸序列、效應子與受體分子、輔因子與酶、酶抑制劑與酶，及其類似物。此外，特異性結合對可包括作為原始特異性結合成員之類似物的成員，例如分析物類似物。免疫反應性特異性結合成員包括抗原、抗 原片段及抗體(包括單株抗體及多株抗體)，以及其複合物、片段及變體(包括變體之片段)，無論其為分離的或是重組產生的。
術語「Fc區」定義免疫球蛋白重鏈之C末端區域，其可藉由完整抗體之木瓜蛋白酶消化來產生。Fc區可為天然序列Fc區或變體Fc區。免疫球蛋白之Fc區一般包含兩個恆定結構域，CH2結構域及CH3結構域，且視情況包含CH4結構域。置換Fc部分中之胺基酸殘基以改變抗體效應功能為此項技術中已知的(例如美國專利第5,648,260號及第5,624,821號)。Fc區介導若干重要之效應功能，例如細胞激素誘導、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、補體依賴性細胞毒性(CDC)以及抗體及抗原-抗體複合物之半衰期/清除率。取決於治療目標，在一些情形中，該等效應功能為治療性免疫球蛋白所需的，但在其他情形中可能並非必需的或甚至是有害的。
術語結合蛋白之「抗原結合部分」意謂結合蛋白(例如抗體)的保持特異性結合至抗原之能力的一或多個片段。結合蛋白之抗原結合部分可藉由全長抗體，以及雙特異性、雙重特異性或多特異性型式之片段進行；特異性結合至兩個或兩個以上不同抗原。術語結合蛋白之「抗原結合部分」內所涵蓋之結合片段的實例包括(i)Fab片段，一種由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，一種包含在鉸鏈區處藉由二硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體單一臂之VL及VH結構域組成之Fv片段；(v)dAb片段，其包含單一可變結構域；以及(vi)分離之互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個結構域VL及VH係由單獨基因編碼，但其可使用重組方法，藉由合成連接子接合，該合成連接子使其成為單一蛋白質鏈，其中VL區與VH區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv))。預期此等單鏈抗體亦涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗體。此 外，單鏈抗體亦包括「線性抗體」，其包含一對串聯之Fv區段(VH-CH1-VH-CH1)，其連同互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區。
術語「多價結合蛋白」意謂包含兩個或兩個以上抗原結合位點之結合蛋白。在一個實施例中，該多價結合蛋白經工程改造成具有三個或三個以上抗原結合位點，且不為天然存在之抗體。術語「多特異性結合蛋白」係指能夠結合兩個或兩個以上相關或不相關靶之結合蛋白。在一個實施例中，本文提供之雙重可變結構域(DVD)結合蛋白包含兩個或兩個以上抗原結合位點且為四價或多價結合蛋白。
術語「連接子」意謂一個胺基酸殘基或包含藉由肽鍵(用於連接兩個多肽)接合在一起之兩個或兩個以上胺基酸殘基(例如，兩個VH或兩個VL結構域)的多肽。此類連接子多肽為此項技術中熟知的(參看例如Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak等人(1994)Structure 2：1121-1123)。
術語「Kabat編號」、「Kabat定義」及「Kabat標記」在本文中可互換使用。該等術語為此項技術中認可的，意指對胺基酸殘基進行編號之系統，該等胺基酸殘基之變化性高於抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變區中之其他胺基酸殘基(亦即，高變的)(Kabat等人(1971)Ann.NY Acad.Sci.190：382-391；及Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版號91-3242)。對於重鏈可變區，高變區對於CDR1在胺基酸位置31至35範圍內，對於CDR2在胺基酸位置50至65範圍內且對於CDR3在胺基酸位置95至102範圍內。對於輕鏈可變區，高變區對於CDR1在胺基酸位置24至34範圍內，對於CDR2在胺基酸位置50至56範圍內且對於CDR3在胺基酸位置89至97範圍內。
術語「CDR」意謂在免疫球蛋白可變區序列內之互補決定區。在 重鏈及輕鏈之每一可變區中存在三個CDR，對於每一重鏈及輕鏈可變區，其命名為CDR1、CDR2及CDR3。術語「CDR組」係指存在於能夠結合抗原之單一可變區中的一組三個CDR。已根據不同系統，以不同方式定義該等CDR之確切邊界。由Kabat(Kabat等人(1987)及(1991))描述之系統不僅提供適用於抗體之任何可變區之明確殘基編號系統，而且亦提供界定三個CDR之精確殘基邊界。該等CDR可稱為Kabat CDR。Chothia及同事(Chothia及Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人(1989)Nature 342：877-883)發現，在Kabat CDR內之某些子部分採用了幾乎一致之肽主鏈構型，不過在胺基酸序列層面上具有極大多樣性。該等子部分命名為L1、L2及L3或H1、H2及H3，其中「L」及「H」分別表示輕鏈及重鏈。該等區域可稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊之邊界。界定與Kabat CDR重疊之CDR的其他邊界已描述於Padlan(1995)FASEB J.9：133-139及MacCallum(1996)J.Mol.Biol.262(5)：732-45中。又其他CDR邊界定義可能未嚴格遵循本文之系統之一，但仍將與Kabat CDR重疊，不過依據特定殘基或殘基組或甚至是整個CDR不顯著影響抗原結合之預測或實驗發現，其可能變短或變長。本文所使用之方法可利用根據該等系統中任一者所定義之CDR，不過某些實施例使用了Kabat或Chothia定義之CDR。
術語「抗原決定基」意謂抗原的由結合蛋白所結合之區域，例如能夠特異性結合至免疫球蛋白或T細胞受體之多肽及/或其他決定子。在某些實施例中，抗原決定基決定子包括具化學活性之表面分子群，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且在某些實施例中，其可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。在一個實施例中，抗原決定基包含抗原(或其片段)中已知結合至特異性結合搭配物上之互補位點的區域之胺基酸殘基。抗原片段可含有超過一個抗原決定基。 在某些實施例中，當結合蛋白識別其在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中之靶抗原時，其特異性結合該抗原。若抗體交叉競爭(一種抗體防止另一抗體之結合或調節其作用)，則結合蛋白「結合至相同抗原決定基」。此外，抗原決定基之結構定義(重疊、類似、一致)資訊豐富；且功能定義涵蓋結構(結合)及功能(調節、競爭)參數。蛋白質之不同區域可執行不同功能。舉例而言，細胞激素之特定區域與其細胞激素受體相互作用以使受體活化，而該蛋白質之其他區域可為使細胞激素穩定所需的。為了消除細胞激素信號傳導之負面影響，可用特異性結合至受體相互作用區之結合蛋白靶向該細胞激素，由此防止其受體之結合。或者，結合蛋白可靶向負責細胞激素穩定化之區域，由此使該蛋白質降解。觀測並模型化抗原決定基識別之方法為熟習此項技術者已知的(US 20090311253)。
「藥物動力學」係指藥物經生物體吸收、分配、代謝及排泄之過程。為了產生具有所需藥物動力學型態之多價結合蛋白分子，選擇具有類似所需藥物動力學型態之親本單株抗體。所選親本單株抗體之PK型態可使用熟習此項技術者已知之方法在嚙齒動物中容易地測定(US 20090311253)。
「生物利用率」係指在投藥後達到其靶之活性藥物的量。生物利用率隨先前所述若干特性(包括穩定性、溶解性、免疫原性及藥物動力學)而變化，且可使用熟習此項技術者已知之方法進行評估(US 20090311253)。
術語「表面電漿子共振」意謂允許藉由例如使用BIAcore®系統(BIAcore International AB,GE Healthcare company,Uppsala,Sweden and Piscataway,NJ)偵測生物感測器基質內蛋白質濃度之改變來分析實時生物特異性相互作用的光學現象。有關進一步描述，參看Jönsson等人(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26。術語「Kon」意謂結合蛋 白(例如抗體或DVD-Ig)與抗原締合形成例如DVD-Ig/抗原複合物之締合速率常數。術語「Kon」亦意謂「締合速率常數」或「ka」，其在本文中可互換使用。該值指示了結合蛋白與其靶抗原之結合速率或結合蛋白(例如抗體)與抗原之間之複合物形成之速率，亦如以下等式顯示：抗體(「Ab」)+抗原(「Ag」) → Ab-Ag
術語「Koff」意謂結合蛋白(例如抗體或DVD-Ig)自例如DVD-Ig/抗原複合物解離之速率常數(off rate constant)或「解離速率常數(dissociation rate constant)」。該值指示了結合蛋白(例如抗體)與其靶抗原解離或Ab-Ag複合物隨時間分離成游離抗體及抗原之速率，如以下等式所示：Ab+Ag ← Ab-Ag
術語「Kd」及「平衡解離常數」意謂平衡時在滴定量測中獲得的值，或藉由用解離速率常數(Koff)除以締合速率常數(Kon)得到之值。締合速率常數、解離速率常數及平衡解離常數用於表示結合蛋白(例如抗體或DVD-Ig)與抗原之結合親和力。用於測定締合及解離速率常數之方法為此項技術中熟知的。使用基於螢光之技術提供高靈敏度且能夠檢查平衡時生理性緩衝液中之樣品。可使用其他實驗方法及儀器，諸如BIAcore®(生物分子相互作用分析)分析(例如，可購自BIAcore International AB,GE Healthcare company,Uppsala,Sweden之儀器)。此外，亦可使用可購自Sapidyne Instruments(Boise,Idaho)之KinExA®(動力學排斥分析)分析。
術語「變體」意謂胺基酸序列因胺基酸之添加(例如插入)、缺失或保守取代而不同於給定多肽，但保持該給定多肽之生物活性的多肽(例如，變體IL-17抗體可與抗IL-17抗體競爭結合於IL-17)。胺基酸之保守取代，亦即，一個胺基酸經具有類似特性(例如，親水性以及帶 電區域之程度及分佈)之不同胺基酸置換，在此項技術中被公認為通常涉及極小變化。如此項技術中所瞭解，該等極小變化可部分藉由考慮胺基酸之親水指數來鑑別(參看例如Kyte等人(1982)J.Mol.Biol.157：105-132)。胺基酸之親水指數係基於考慮其疏水性及電荷。此項技術中已知蛋白質中具有類似親水指數之胺基酸可經取代且蛋白質仍保持蛋白質功能。在一個態樣中，親水指數為±2之胺基酸經取代。胺基酸之親水性亦可用於揭露將產生保持生物功能之蛋白質之取代。在肽之情形中考慮胺基酸之親水性容許計算出該肽之最大局部平均親水性，此為已報導的與抗原性及免疫原性充分相關之一種有用措施(參看例如美國專利第4,554,101號)。如此項技術中所瞭解，具有類似親水性值之胺基酸的取代可產生保持生物活性(例如免疫原性)之肽。在一個態樣中，取代係用親水性值彼此在±2範圍內之胺基酸進行。胺基酸之疏水指數及親水性值均受該胺基酸之特定側鏈之影響。與該觀察結果一致，如藉由疏水性、親水性、電荷、大小及其他特性所揭露，與生物功能相容之胺基酸取代應理解為取決於胺基酸之相對相似性及該等胺基酸之特定側鏈。術語「變體」亦包括已經不同方式加工，諸如藉由蛋白水解、磷酸化或其他轉譯後修飾加工，仍保持其生物活性或抗原反應性(例如結合至IL-17之能力)的多肽或其片段。除非另作定義，否則術語「變體」涵蓋變體之片段。變體可與野生型序列99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%或75%一致。
I.結合蛋白之產生
提供了能夠結合IL-1β及/或IL-17之結合蛋白及其製備方法。該結合蛋白可使用各種技術產生。提供了表現載體、宿主細胞及產生該結合蛋白之方法且其為此項技術中熟知的。
A.親本單株抗體之產生
DVD結合蛋白之可變結構域可自親本抗體獲得，包括能夠結合所關注抗原之多株Ab及mAb。該等抗體可為天然存在的或可藉由重組技術產生。熟習此項技術者非常熟悉許多用於產生抗體之方法，包括(但不限於)使用融合瘤技術；選擇性淋巴細胞抗體法(SLAM)；使用噬菌體、酵母或RNA-蛋白質融合呈現或其他文庫；對包含至少一些人類免疫球蛋白基因座之非人類動物進行免疫接種；及製備嵌合抗體、CDR移植之抗體及人類化抗體。參看例如美國專利公開案第20090311253 A1號。亦可使用親和力成熟技術製備可變結構域。
B.用於選擇親本單株抗體之標準
提供的一個實施例包含選擇具有DVD結合蛋白分子中所需之至少一種或多種特性的親本抗體。在一個實施例中，所需特性為一或多個抗體參數，諸如抗原特異性、對於抗原之親和力、效力、生物功能、抗原決定基識別、穩定性、溶解性、產生效率、免疫原性、藥物動力學、生物利用率、組織交叉反應性或直系同源抗原結合。參看例如美國專利公開案第20090311253號。
C.結合蛋白分子之構築
該結合蛋白可經設計以使來自兩個不同親本單株抗體之兩個不同輕鏈可變結構域(VL)直接或經由連接子藉由重組DNA技術串聯連接，隨後連接輕鏈恆定結構域CL。類似地，重鏈包含直接或經由連接子串聯連接的兩個不同重鏈可變結構域(VH)，隨後連接有恆定結構域CH1及Fc區(圖1)。
該等可變結構域可使用重組DNA技術自藉由本文所述之任一方法產生之親本抗體獲得。在一個實施例中，可變結構域係鼠類重鏈或輕鏈可變結構域。在另一實施例中，可變結構域係CDR移植或人類化可變重鏈或輕鏈結構域。在一個實施例中，可變結構域係人類重鏈或 輕鏈可變結構域。
連接子序列可為單一胺基酸或多肽序列。在一個實施例中，連接子序列之選擇係基於若干Fab分子之晶體結構分析。在Fab或抗體分子結構中的可變結構域與CH1/CL恆定結構域之間存在天然可撓性鍵聯。此天然鍵聯包含約10-12個胺基酸殘基，4-6個殘基由V結構域之C末端貢獻且4-6個殘基由CL/CH1結構域之N末端貢獻。使用CL或CH1之N末端5-6個胺基酸殘基或11-12個胺基酸殘基分別作為輕鏈及重鏈中之連接子來產生DVD結合蛋白。CL或CH1結構域之N末端殘基，特別是前5-6個胺基酸殘基，可呈現環狀構型，而非較強之二級結構，且因此可充當兩個可變結構域之間之可撓性連接子。CL或CH1結構域之N末端殘基為可變結構域之天然延伸，因為其為Ig序列之一部分，且因此其使用在很大程度上使潛在地由連接子及接合點引起之任何免疫原性減到最小。
在又一實施例中，重鏈、輕鏈、兩條鏈或四條鏈實施例中任一者包括至少一個連接子，其包含AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO：1)；AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：2)；AKTTPKLGG(SEQ ID NO：3)；SAKTTPKLGG(SEQ ID NO：4)；SAKTTP(SEQ ID NO：5)；RADAAP(SEQ ID NO：6)；RADAAPTVS(SEQ ID NO：7)；RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO：8)；RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO：9)；SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：10)；ADAAP(SEQ ID NO：11)；ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO：12)；TVAAP(SEQ ID NO：13)；TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO：14)；QPKAAP(SEQ ID NO：15)；QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO：16)；AKTTPP(SEQ ID NO：17)；AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO：18)；AKTTAP(SEQ ID NO：19)；AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO：20)；ASTKGP(SEQ ID NO：21)；ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO：22)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：23)；GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO：24)；GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO：25)；或GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO：26)；TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO：27)；ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO：28)；GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：29)；GGSGGGGSG(SEQ ID NO：30)；或基於G/S之序列(例如，G4S及G4S重複序列；SEQ ID NO：31)。在一個實施例中，X2是Fc區。在另一實施例中，X2為變體Fc區。
其他連接子序列可包括CL/CH1結構域之任何長度之任何序列，但並非CL/CH1結構域之所有殘基；例如，CL/CH1結構域之前5-12個胺基酸殘基；輕鏈連接子可來自Cκ或Cλ；且重鏈連接子可來源於任何同型之CH1，包括Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、C δ、C ε及Cμ。連接子序列亦可來源於其他蛋白質，諸如類Ig蛋白質(例如TCR、FcR、KIR)；基於G/S之序列(例如，G4S重複序列；SEQ ID NO：31)；鉸鏈區來源之序列；及來自其他蛋白質之其他天然序列。
在一個實施例中，使用重組DNA技術將恆定結構域連接至兩個相連之可變結構域。在一個實施例中，包含相連之重鏈可變結構域之序列連接至重鏈恆定結構域且包含相連之輕鏈可變結構域之序列連接至輕鏈恆定結構域。在一個實施例中，該等恆定結構域分別為人類重鏈恆定結構域及人類輕鏈恆定結構域。在一個實施例中，DVD重鏈進一步連接至Fc區。Fc區可為天然序列Fc區或變體Fc區。在另一實施例中，Fc區為人類Fc區。在另一實施例中，Fc區包括來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD之Fc區。
在一個實施例中，揭示了抗體或其功能性抗原結合片段，其包含具有能夠結合IL-1β或IL-17之功能性結合位點且具有包含選自表1中所列序列對的配對之VH及VL序列之可變區或包含該等VH及VL區之CDR區的抗體。舉例而言，該抗體或其功能性抗原結合片段能夠結合 IL-1β且具有包含SEQ ID NO：32及33之可變區。同樣，抗體或其功能性抗原結合片段能夠結合IL-17且具有包含例如SEQ ID NO：44及45或SEQ ID NO：46及47之可變區。所揭示的類似抗體包含表1中之其餘序列對。在一個實施例中，揭示了以上描述之抗體之功能性抗原結合片段，其中該抗原結合片段保持足以形成能夠結合靶抗原之結合位點的可變序列。舉例而言，該抗原結合片段可包含自表1中的配對之VH及VL序列獲得的CDR區，或含或不含Fc結構域之完整VH及VL序列。功能性抗原結合片段可包括尤其例如人類化抗體、完整人類抗體、駱駝抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、合成抗體、重組抗體、雜交抗體、突變抗體、回復突變抗體或CDR移植之抗體，或Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb片段、VHH(又稱為奈米抗體)，或保持抗原結合功能之任何其他抗體片段，包括雙特異性或多特異性抗體。
在一個實施例中，揭示了包含選自表1之可變結構域之結合蛋白(例如雙重可變結構域結合蛋白)。在一些實施例中，該結合蛋白包含第一多狀鏈及第二多肽鏈，其各自包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，且其中該結合蛋白之第一鏈及第二鏈一起形成兩個功能性結合位點，其中該等結合位點能夠結合IL-1β及/或IL-17。在一些實施例中，VD1及VD2序列係獨立地選擇(亦即，用於VD1位置之VH及VL序列之選擇不影響用於VD2位置之序列的選擇，且反之亦然)。在一個實施例中，每一功能性結合位點包含選自表1中所列序列對的配對之VH及VL序列(例如，SEQ ID NO：32及33之配對之VH及VL序列，形成針對IL-1β之結合位點)，或其包含該等VH及VL序列之CDR區。在一些實施例中，第一鏈包含在位置VD1處之第一VH序列及在位置VD2處之第二VH序列，二者均選自表1，或VD1及VD2結構域含有來自該等選定之VH序列之CDR序列，而第二鏈包含在位置VD1處之第一VL序列及在位置VD2處之第二VL序列，二者均選自表1，或VD1及VD2結構域含 有來自該等選定之VL序列之CDR序列。在其他實施例中，第一或第二結合位點之VH-VL佈置係在兩條多肽鏈內翻轉，由此使每條鏈包含接合至VL序列之VH序列，同時兩條鏈一起仍形成兩個功能性結合位點。舉例而言，第一多肽鏈可包含在VD1位置處之VH序列及在VD2位置處之VL序列，而第二鏈將包含在VD1位置處的配對之VL序列(形成第一功能性結合位點)及在VD2位置處的配對之VH序列(形成第二結合位點)。
在一個實施例中，兩條第一鏈多肽及兩條第二鏈多肽組合形成具有兩個臂及四個結合位點之DVD-Ig結合蛋白。具有兩個臂及四個結合位點之DVD-Ig結合蛋白結構之實例顯示於圖1中。在一個實施例中，DVD-Ig結合蛋白在每一臂之VD1及VD2位置處包含至少一個，或至少兩個、至少三個或至少四個呈任何取向的表1中所列之VH及VL序列對。在一些實施例中，形成結合位點之序列對係獨立地選擇(例如，用於一臂上VD1位置之VH及VL序列之選擇不影響用於另一臂上VD1位置之序列的選擇，亦不影響用於任一臂上VD2位置之序列的選擇)。下表1中所提供之VH及VL序列包含互補決定區(CDR)及構架序列。在一些實施例中，一或多個構架序列經例如來自此項技術中已知結合至相同抗原之結合蛋白的其他構架序列置換，而不喪失功能。
在另一實施例中，兩個重鏈DVD-Ig多肽及兩個輕鏈DVD-Ig多肽組合形成DVD-Ig結合蛋白。表1A-1C列出了可用於治療疾病之例示性抗體之VH及VL區的胺基酸序列。在一個實施例中，提供了包含至少兩個呈任何取向之表1中所列VH及/或VL區的DVD-Ig。在一些實施例中，VD1及VD2係獨立選擇的。因此，在一些實施例中，VD1及VD2包含相同SEQ ID NO，且在其他實施例中，VD1及VD2包含不同SEQ ID NO。以下提供之VH及VL結構域序列包含此項技術中已知或易於使用此項技術中已知之方法辨別的互補決定區(CDR)及構架序列。在 一些實施例中，該等CDR及/或構架序列中之一或多者經來自此項技術中已知結合至相同抗原之結合蛋白的其他CDR及/或構架序列置換，而不喪失功能。
表1中所列每一VH及VL序列之CDR 1-3帶下劃線。舉例而言，CDR 1-3對於SEQ ID NO：32在胺基酸位置31-35、50-66及99-108處帶下劃線。能夠結合特定靶之特定DVD結合蛋白之詳細說明以及其製備方法提供於本發明全文及以下實例部分中。
D.結合蛋白之產生
本文提供之結合蛋白可藉由此項技術中已知之多種技術產生。舉例而言，自宿主細胞表現，其中編碼DVD-Ig重鏈及DVD-Ig輕鏈之表現載體已藉由標準技術轉染至宿主細胞中。儘管有可能在原核或真核宿主細胞中表現本文提供之DVD-Ig結合蛋白，但DVD-Ig結合蛋白較佳係在真核細胞(例如哺乳動物宿主細胞)中表現，因為該等真核細胞(且特別是哺乳動物細胞)比原核細胞更可能組裝並分泌適當摺疊且具有免疫活性之DVD-Ig結合蛋白。
在用於重組表現DVD-Ig蛋白質之例示性系統中，將編碼DVD-Ig重鏈及DVD-Ig輕鏈之重組表現載體藉由磷酸鈣介導之轉染引入dhfr-CHO細胞中。在重組表現載體內，DVD-Ig重鏈及輕鏈序列各自可操作地連接至CMV增強子/AdMLP啟動子調控元件以驅動基因之高水準轉錄。重組表現載體亦載有DHFR基因，其允許使用甲胺喋呤選擇/擴增來選擇已經載體轉染之CHO細胞。所選轉型體宿主細胞經培養以允許表現DVD-Ig重鏈及輕鏈且自培養基中回收完整DVD-Ig蛋白質。使用標準分子生物學技術來製備重組表現載體、轉染宿主細胞、選擇轉型體、培養宿主細胞及自培養基回收DVD-Ig蛋白質。亦提供了藉由在適合培養基中培養本文提供之宿主細胞直至合成DVD-Ig蛋白質來合成本文提供之DVD-Ig蛋白質的方法。該方法可進一步包含自培養基分離DVD-Ig蛋白質。
DVD-Ig結合蛋白之一個重要特性在於，其可以類似於習知抗體之方式產生及純化。DVD-Ig結合蛋白之製備產生一種具有所需雙重特異性活性之同源單一主要產物，而無需恆定區之序列修飾或化學修飾。先前描述的產生「雙特異性」、「多特異性」及「多特異性多價」全長結合蛋白之其他方法可使得細胞內或分泌產生組裝的無活性、單特異性、多特異性、多價全長結合蛋白與具有不同結合位點組合之多價全長結合蛋白的混合物
意外地是，本文提供之「雙重特異性多價全長結合蛋白」的設計產生主要組裝成所需「雙重特異性多價全長結合蛋白」之雙重可變結構域輕鏈及雙重可變結構域重鏈。
在一些實施例中，該等經組裝及表現之雙重可變結構域免疫球蛋白分子中至少50%、至少75%及至少90%為所需雙重特異性四價蛋白，且因此具有增強之商業效用。因此，在各種實施例中，提供了一種在單一細胞中表現雙重可變結構域輕鏈及雙重可變結構域重鏈，從 而產生「雙重特異性四價全長結合蛋白」之單一主要產物的方法。
提供了在單一細胞中表現雙重可變結構域輕鏈及雙重可變結構域重鏈，從而產生「雙重特異性四價全長結合蛋白」之「主要產物」的方法，其中「主要產物」佔包含雙重可變結構域輕鏈及雙重可變結構域重鏈在內之所有組裝蛋白質之超過50%，諸如超過75%且超過90%。
II.結合蛋白之用途
已知本文提供之結合蛋白能夠結合至兩個或兩個以上抗原，故其可用於使用習知免疫分析(諸如酶連免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或組織免疫組織化學)進行的抗原(例如，在生物樣品中，諸如血清或血漿)偵測。該結合蛋白直接或間接標記有可偵測物質以便利經結合或未結合抗體之偵測。適合的可偵測物質包括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料及放射性材料。適合酶之實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；適合螢光材料之實例包括傘酮、螢光素、螢光異硫氰酸鹽、若丹明、二氯三嗪胺、螢光素、丹醯氯或藻紅素。發光材料之實例為魯米諾(luminol)且適合放射性材料之實例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho及153Sm。
在一個實施例中，本文提供之結合蛋白能夠在活體外及活體內中和其抗原靶之活性。因此，此類結合蛋白可用於例如在含有該等抗原之細胞培養物中、在人類個體中或在具有與本文提供之結合蛋白交叉反應之抗原的其他哺乳動物個體中抑制抗原活性。在另一實施例中，提供了用於降低罹患抗原活性有害之疾病或病症的個體中之抗原活性的方法。本文提供之結合蛋白可投與人類個體用於治療目的。
術語「抗原活性有害之病症」意欲包括罹患該病症之個體中抗 原之存在已顯示引起或懷疑引起該病症之病理生理學或作為導致該病症惡化之因素的疾病及其他病症。因此，抗原活性有害之病症為預期降低抗原活性可減輕該病症之症狀及/或減慢其進展的病症。此類病症可例如由罹患該病症之個體之生物流體中抗原濃度之增加(例如，個體之血清、血漿、滑液等中抗原濃度之增加)所證實。可用本文提供之結合蛋白治療的病症之非限制性實例包括下文論述及涉及包含該等結合蛋白之醫藥組合物之部分中所論述的病症。
DVD結合蛋白可用作治療劑同時阻斷兩個不同靶，以增強功效/安全性及/或增加患者覆蓋率。
此外，本文提供之DVD結合蛋白可用於組織特異性遞送(靶向組織標記物及疾病介體以增強局部PK，由此提供較高功效及/或較低毒性)，包括細胞內遞送(靶向內化受體及細胞內分子)、遞送至腦內部(靶向運鐵蛋白受體及CNS疾病介體，以橫過血腦屏障)。DVD結合蛋白亦可充當載體蛋白以經由結合至該抗原之非中和性抗原決定基將抗原遞送至特定位置，以及增加該抗原之半衰期。此外，DVD結合蛋白可設計成以物理方式連接至植入患者中之醫療裝置或靶向該等醫療裝置(參看Burke等人(2006)Advanced Drug Deliv.Rev.58(3)：437-446；Hildebrand等人(2006)Surface and Coatings Technol.200(22-23)：6318-6324；Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis,Wu(2006)Biomaterials 27(11)：2450-2467；Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices,Marques(2005)Biodegradable Systems in Tissue Engineer.Regen.Med.377-397)。簡言之，將適當類型細胞引導至醫學植入物部位可促進癒合及恢復正常組織功能。或者，亦提供對裝置植入後由偶聯至靶或裝置之DVD所釋放之介體(包括(但不限於)細胞激素)之抑制。
A.結合蛋白在各種疾病中之用途
本文提供之結合蛋白分子可用作治療分子以治療由例如該等結合蛋白所識別之靶有害的各種疾病。此類結合蛋白可結合特定疾病中所涉及之一或多個靶。亦已顯示，抑制IL-1β及/或IL-17可增強動物模型中之抗病毒疫苗且可有益於治療HIV及其他感染性疾病，例如人類鼻病毒、其他腸病毒、冠狀病毒、疱疹病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒或腺病毒。
另外提供了有關某些疾病病狀之資訊，其不打算限制本發明。
1.人類自體免疫反應及發炎性反應
IL-1β及/或IL-17已牽涉於一般自體免疫反應及發炎性反應中，包括例如哮喘、過敏症、過敏性肺病、過敏性鼻炎、異位性皮炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、纖維化、囊腫性纖維化(CF)、纖維性肺病、特發性肺部纖維化、肝纖維化、狼瘡、B型肝炎相關性肝病及纖維化、敗血病、全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、絲球體腎炎、發炎性皮膚病、牛皮癬、糖尿病、胰島素依賴性糖尿病、發炎性腸病(IBD)、潰瘍性結腸炎(UC)、克羅恩氏病(CD)、類風濕性關節炎(RA)、骨關節炎(OA)、多發性硬化(MS)、移植物抗宿主疾病(GVHD)、移植排斥反應、缺血性心臟病(IHD)、乳糜瀉、接觸性過敏、酒精性肝病、貝塞特氏病、動脈粥樣硬化性血管疾病、眼表發炎性疾病或萊姆病。因此，在一些實施例中，本文所揭示之結合蛋白可用於治療該等病狀。
本文提供之結合蛋白亦可用於治療神經病症。在一個實施例中，使用本文提供之結合蛋白或其抗原結合部分來治療神經退化性疾病及涉及神經元再生及脊髓損傷之病狀。
2.哮喘
過敏性哮喘係以存在嗜伊紅血球、杯狀細胞化生、上皮細胞變化、氣道過度反應性(AHR)，及Th2及Th1細胞激素表現以及血清IgE含量升高為特徵。皮質類固醇為目前哮喘之最重要消炎性治療，然 而，其作用機制係非特異性的且存在安全性問題，尤其是在青少年患者群體中。因此，需要開發更具特異性之靶向療法。
IL-1β由於在引起與哮喘有關之病理反應方面具有關鍵作用而牽涉其中。開發抗IL-1β mAb療法以降低IL-1β在肺中之作用係一種激動人心之新方法，其作為哮喘之新穎治療而提供相當大的前景。然而，不同免疫路徑之其他介體亦涉及哮喘之發病，且除IL-1β外，阻斷該等介體可提供額外治療益處。此類靶對包括(但不限於)IL-1β及促炎性細胞激素，諸如IL-17。越來越多證據證實IL-17涉及哮喘之發病。在哮喘中，IL-17誘導嗜中性白血球進入氣道中且亦增強T輔助2(Th2)細胞介導之嗜伊紅血球氣道炎症。近期之研究已證實，IL-17之抑制劑及其他各種調控劑在動物哮喘模型中減少抗原誘發之氣道炎症、支氣管過度反應及Th2細胞激素含量(有關評述，參看Park及Lee(2010)Respiratory Res.,11：78)。因此，在一些實施例中，本文所揭示之結合蛋白可用於治療哮喘。
可評估炎症及AHR之動物模型(諸如OVA誘發哮喘小鼠模型)為此項技術中已知的且可用於確定各種結合蛋白分子治療哮喘之能力。用於研究哮喘之動物模型揭示於Coffman等人(2005)J.Exp.Med.201(12)：1875-1879；Lloyd等人(2001)Adv.Immunol.77：263-295；Boyce等人(2005)J.Exp.Med.201(12)：1869-1873；及Snibson等人(2005)J.Brit.Soc.Allergy Clin.Immunol.35(2)：146-52中。除有關該等靶對之常規安全性評估外，亦可能需要有關免疫抑制程度之特定測試且其有助於選擇最佳靶對(參看Luster等人(1994)Toxicol.92(1-3)：229-43；Descotes等人(1992)Dev.Biol.Standard.77：99-102；Hart等人(2001)J.Allergy Clin.Immunol.108(2)：250-257)。
3.類風濕性關節炎
類風濕性關節炎(RA)，一種全身性疾病，以關節滑膜中之慢性 發炎性反應為特徵，且與軟骨退化及近關節骨骼侵蝕相關。許多促炎性細胞激素、趨化因子及生長因子在患病關節中均有表現。近期之研究指出，RA中涉及到T細胞在很大程度上受IL-17介導。動物研究已顯示，在發生類似於人類RA之關節損害之小鼠中偵測到IL-17表現之明顯增加。在該疾病之各種動物模型中亦觀察到IL-17阻斷之有益作用(有關評述，參看Witowski等人(2004)Cell.Mol.Life Sci.61：567-579)。結合蛋白分子是否能用於治療類風濕性關節炎可使用臨床前動物RA模型(諸如膠原蛋白誘發關節炎之小鼠模型)來評估。其他有用模型亦為此項技術中熟知的(參看Brand(2005)Comp.Med.55(2)：114-22)。基於人類及小鼠直系同源物之親本抗體的交叉反應性(例如，人類及小鼠TNF、人類及小鼠IL-15等之反應性)，可用「相配之代用抗體」來源之結合蛋白分子在小鼠CIA模型中進行驗證研究；簡言之，基於兩種(或兩種以上)小鼠靶特異性抗體之結合蛋白可在可能之程度上與用於人類結合蛋白構築之親本人類或人類化抗體之特徵相配(例如類似親和力、類似中和效力、類似半衰期等)。因此，在一些實施例中，本文所揭示之結合蛋白可用於治療類風濕性關節炎。
4.骨關節炎
OA之起始、維持及進展係由IL-1起到關鍵作用之機械及生物化學路徑的複雜級聯所介導。不僅單核細胞、巨噬細胞及嗜中性白血球，而且關節組織中之細胞(諸如軟骨細胞、滑膜纖維母細胞及破骨細胞)均產生IL-1α及IL-1β(參看例如Dinarello等人(2009)Ann.Rev.Immunol.27：519-550)。在活體外，IL-1可刺激軟骨細胞及滑膜細胞產生軟骨破壞中所涉及之蛋白酶，從而引起OA(參看例如，Dayer等人(1977)Science 195：181-183；Dayer等人(1984)Biochem.Pharmacol.33：2893-2899；McGuire-Goldring等人(1984)Arthritis Rheum.27：654-662)，且抑制蛋白聚糖及II型膠原蛋白(正常透明素軟骨之細胞外 基質(ECM)的主要組分)之合成(參看例如，Goldring等人(1987)J.Biol.Chem.262：16724-16729；Goldring等人(1988)J.Clin.Investig.82：2026-2037)。臨床前及臨床研究提供了有關IL-1在OA發病中之作用的進一步證據。舉例而言，將IL-1關節內(ia)注射至動物膝中引起白細胞浸潤及軟骨損失(Pettiphar等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8749-8753)。相比之下，ia注射IL-1拮抗劑引起實驗性OA之進展的顯著減慢(參看例如，Pelletier等人(1997)Arthritis Rheum.40：1012-1019；Caron等人(1996)Arthritis Rheum.39：1535-1544)；Fernandes等人(1999)Am.J.Pathol.154：11590-11690)；Zhang等人(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.341：202-208)。此外，亦發現當與野生型對應物相比較時，IL-1基因剔除(KO)之小鼠對手術誘發之軟骨損害具有抗性(Glasson等人(2009)Osteoarthritis Cartilage,18：572-580)。
IL-1α及IL-1β在人類OA患者之滑膜、軟骨及滑液中有表現(參看例如Farahat等人(1993)Ann.Rheum.Dis.52：870-875)。IL-1拮抗劑阿那白滯素(Anakinra；一種IL-1受體拮抗劑)及AMG-108(一種IL-1受體單株抗體)已在OA試驗中關於症狀及軟骨保護展現某種功效(「Results from a Randomized Controlled Trial of AMG 108(a fully human monoclonal antibody to IL-1R type I)in Patients With Osteoarthritis of the Knee」Cohen等人，ACR2007)。因此，在一些實施例中，本文所揭示之結合蛋白可用於治療骨關節炎。
5.全身性紅斑性狼瘡症(SLE)
SLE之免疫發病標誌為多株B細胞活化，其導致高球蛋白血症、自體抗體產生及免疫複合物形成。已在全身性紅斑性狼瘡症患者中偵測到IL-17含量之顯著增加(Morimoto等人(2001)Autoimmunity,34(1)：19-25；Wong等人(2008)Clin Immunol.127(3)：385-93)。IL-17為 SLE發病中之重要細胞激素。在SLE患者中以及患有類狼瘡疾病之動物中已顯示IL-17產生之增加。動物模型已證實，阻斷IL-17會減少狼瘡表現(有關評述，參看Nalbandian等人(2009)157(2)：209-215)。基於人類及小鼠直系同源物之親本抗體的交叉反應性(例如人類及小鼠CD20、人類及小鼠干擾素α等之反應性)，可用「相配之代用抗體」來源之結合蛋白分子在小鼠狼瘡模型中進行驗證研究。簡言之，可將基於兩種(或兩種以上)小鼠靶特異性抗體之結合蛋白在可能之程度上與用於人類結合蛋白構築之親本人類或人類化抗體之特徵相配(例如，類似親和力、類似中和效力、類似半衰期等)。因此，在一些實施例中，本文所揭示之結合蛋白可用於治療SLE。
6.多發性硬化
多發性硬化(MS)為具有主要未知之病因的複雜人類自體免疫型疾病。整個神經系統中髓鞘鹼性蛋白(MBP)之免疫破壞為多發性硬化之主要病理。主要考慮的是引起自體免疫性發生之免疫機制。詳言之，有助於平衡/調節其他T細胞(諸如Th1及Th2細胞)的抗原表現、細胞激素及白細胞相互作用以及調控性T細胞為治療目標鑑別之重要方面。在MS中，在腦損害中以及自血液及腦脊髓液分離之單核細胞中均已偵測到IL-17之表現增加。在活動性MS損害中大量富集產生IL-17之細胞，表明中和此細胞激素可能為有益的(有關評述，參看Witowski等人(2004)Cell.Mol.Life Sci.61：567-579)。因此，在一些實施例中，本文所揭示之結合蛋白可用於治療MS。
此項技術中已知用於評估結合蛋白治療MS之有用性的若干動物模型(參看Steinman等人(2005)Trends Immunol.26(11)：565-71；Lublin等人(1985)Springer Semin.Immunopathol.8(3)：197-208；Genain等人(1997)J.Mol.Med.75(3)：187-97；Tuohy等人(1999)J.Exp.Med.189(7)：1033-42；Owens等人(1995)Neurol.Clin.13(1)：51-73；及Hart 等人(2005)J.Immunol.175(7)：4761-8.)。基於人類及動物物種直系同源物之親本抗體的交叉反應性，可用「相配之代用抗體」來源之結合蛋白分子在小鼠EAE模型中進行驗證研究。簡言之，可將基於兩種(或兩種以上)小鼠靶特異性抗體之結合蛋白在可能之程度上與用於人類結合蛋白構築之親本人類或人類化抗體之特徵相配(例如，類似親和力、類似中和效力、類似半衰期等)。相同之觀念適用於其他非嚙齒動物物種中之動物模型，其中將選擇「相配之代用抗體」來源之結合蛋白用於預期之藥理學及可能之安全性研究。除有關該等靶對之常規安全性評估外，亦可能需要有關免疫抑制程度之特定測試且其有助於選擇最佳靶對(參看Luster等人(1994)Toxicol.92(1-3)：229-43；Descotes等人(1992)Devel.Biol.Standard.77：99-102；Jones(2000)IDrugs 3(4)：442-6)。
7.敗血病
不可抵抗之發炎性及免疫反應為敗血性休克之基本特徵且在組織損害、多重器官衰竭及由敗血病誘發之死亡之發病中起到關鍵作用。已顯示，細胞激素為敗血性休克之介體。該等細胞激素對組織具有直接的有毒作用；其亦使磷脂酶A2活化。該等及其他作用使得血小板活化因子之濃度增加、促進一氧化氮合成酶活性、促進嗜中性白血球之組織浸潤及促進嗜中性白血球活性。經顯示，敗血病之IL-17含量與臨床預後負面地相關。中和IL-17A可顯著改善敗血病患者之存活率(參看Flierl等人(2008)FASEB J.22：2198-2205)。
一個實施例係關於能夠結合敗血病中所涉及之一或多個靶(諸如IL-1β及IL-17)之結合蛋白。此類結合蛋白治療敗血病之功效可在此項技術中已知之臨床前動物模型中評估(參看Buras等人(2005)Nat.Rev.Drug Discov.4(10)：854-65；及Calandra等人(2000)Nat.Med.6(2)：164-70)。因此，在一些實施例中，本文所揭示之結合蛋白可用於治療敗 血病。
8.神經病症 a.神經退化性疾病
神經退化性疾病為慢性(在此情形中其通常為年齡依賴性的)或急性的(例如中風、創傷性腦損傷、脊髓損傷等)。其以神經元功能之進行性喪失(例如，神經元細胞死亡、軸突損失、神經炎性營養不良、脫髓鞘)、活動能力喪失及記憶喪失為特徵。該等慢性神經退化性疾病代表了多種細胞類型與介體之間之複雜相互作用。此類疾病之治療策略有限且主要在於用非特異性消炎劑(例如皮質類固醇、COX抑制劑)阻斷發炎性過程或用藥劑預防神經元損失及/或突觸功能。該等治療無法停止疾病進展。靶向超過一種疾病介體之特異性療法針對慢性神經退化性疾病提供的治療功效甚至優於用靶向單一疾病機制所觀察到之功效(參看Deane等人(2003)Nature Med.9：907-13；及Masliah等人(2005)Neuron.46：857)。
本文提供之結合蛋白分子可結合諸如阿茲海默氏病之慢性神經退化性疾病中所涉及之一或多個靶。結合蛋白分子之功效可在臨床前動物模型中驗證，諸如過表現澱粉樣前驅蛋白或RAGE且發展類阿茲海默氏病症狀的轉殖基因小鼠。此外，可構築結合蛋白分子且針對其在動物模型中之功效進行測試，且可選出最佳治療性結合蛋白在人類患者中進行測試。結合蛋白分子亦可用於治療諸如帕金森氏病之其他神經退化性疾病。
b.神經元再生及脊髓損傷
儘管有關病理機制之知識增加，但脊髓損傷(SCI)仍為一種破壞性病狀且代表了以高醫學需求為特徵之醫學適應症。大多數脊髓損傷為鈍挫傷或及壓迫傷，且在原發性損傷之後通常為繼發性損傷機制(發炎性介體，例如細胞激素及趨化因子)，其使初始損傷惡化且導致 損害面積之顯著擴大，有時超過10倍。IL-17為繼發性退化之一種介體，其引起神經炎症且阻礙了功能恢復。使用IL-17KO小鼠進行之研究證實，IL-17在神經性損傷之後引起神經發炎性反應及疼痛之過度敏感(Kim及Moalem-Taylor(2010)J Pain.12(3)：370-83)。IL-17缺乏改善了小鼠在脊髓鈍挫傷之後的運動恢復及組織防護(Hill等人(2011)Neurosci Lett.487(3)：363-7)。因此，在一些實施例中，本文所揭示之結合蛋白可用於神經元再生及脊髓修復。
結合蛋白分子之功效可在臨床前脊髓損傷動物模型中進行驗證。此外，可構築該等結合蛋白分子且針對其在動物模型中之功效進行測試，且可選出最佳治療性結合蛋白在人類患者中進行測試。一般而言，抗體無法以有效及相關方式跨過血腦屏障(BBB)。然而，在某些神經疾病(例如中風、創傷性腦損傷、多發性硬化等)中，BBB可能受損且使得滲透至腦中之結合蛋白及抗體增加。在其他神經病狀中，當BBB滲漏未發生時，可採用在BBB之血管內皮處內源轉運系統之靶向，包括載體介導之轉運蛋白(諸如葡萄糖及胺基酸載體)及受體介導之穿胞運輸介導的細胞結構/受體，由此能夠跨BBB轉運結合蛋白。在BBB處實現此類轉運之結構包括(但不限於)胰島素受體、運鐵蛋白受體、LRP及RAGE。此外，策略亦能夠使用結合蛋白作為梭子(shuttle)以將潛在藥物轉運至CNS中，包括低分子量藥物、奈米粒子及核酸(Coloma等人(2000)Pharm Res.17(3)：266-74；Boado等人(2007)Bioconjug.Chem.18(2)：447-55)。
9.腫瘤病症
單株抗體療法已作為癌症之重要治療模式而出現(von Mehren等人(2003)Annu.Rev.Med.54：343-69)。與單特異性療法相比較，使用靶向兩個單獨腫瘤介體之雙重特異性抗體將可能得到額外益處。已提出IL-17可能藉由刺激血管生成而支持腫瘤生長。IL-1β亦在抗腫瘤免 疫及腫瘤生長之調控中起到重要作用。
在一個實施例中，可用本文所提供之組合物及方法治療或診斷的疾病包括(但不限於)原發性及轉移性癌症，包括乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰臟癌、肝癌、膽囊癌及膽管癌、小腸癌、尿道癌(包括腎癌、膀胱癌及尿路上皮癌)、女性生殖道癌(包括子宮頸癌、子宮癌及卵巢癌，以及絨毛膜癌及妊娠滋養細胞疾病)、男性生殖道癌(包括前列腺癌、精囊癌、睾丸癌及生殖細胞腫瘤)、內分泌腺癌(包括甲狀腺癌、腎上腺癌及垂體腺癌)及皮膚癌，以及血管瘤、黑素瘤、肉瘤(包括起源於骨骼及軟組織之該等肉瘤，以及卡堡氏肉瘤)、腦腫瘤、神經腫瘤、眼部腫瘤及腦膜腫瘤(包括星形細胞瘤、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經瘤、神經母細胞瘤、許旺細胞瘤及腦膜瘤)，起源於諸如白血病之血液科惡性疾病的實體腫瘤，及淋巴瘤(霍奇金氏(Hodgkin's)及非霍奇金氏淋巴瘤)。
在一個實施例中，當單獨使用或組合使用放射療法及/或化學治療劑時，使用本文所提供之抗體及結合蛋白或其抗原結合部分治療癌症或者預防由本文所述之腫瘤引起之轉移。
10.基因療法
在一個特定實施例中，投與編碼本文所提供之結合蛋白之核酸序列或者本文提供之另一預防劑或治療劑以藉助於基因療法來治療、預防、管理或緩解病症或其一或多種症狀。基因療法係指藉由向個體投與經表現或可表現之核酸來進行之療法。在此實施例中，核酸產生本文所提供之其編碼抗體或者預防劑或治療劑，其介導預防或治療作用。
此項技術中可用之基因療法之任何方法均可用於本文提供之方法中。有關基因療法之方法之總體評述，參看Goldspiel等人(1993) Clin.Pharmacy 12：488-505；Wu及Wu(1991)Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev(1993)Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan(1993)Science 260：926-932；Morgan及Anderson(1993)Ann.Rev.Biochem.62：191-217；及May(1993)TIBTECH 11(5)：155-215。此項技術中通常已知的可用重組DNA技術的方法描述於以下中：Ausubel等人(編)，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY(1993)；及Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)。有關各種基因療法方法之詳細說明揭示於美國專利公開案第US20050042664號中。
III.醫藥組合物
在各種實施例中，提供了醫藥組合物，其包含單獨或與預防劑、治療劑及/或醫藥學上可接受之載劑組合的一或多種結合蛋白。包含本文提供之結合蛋白的醫藥組合物可用於(但不限於)診斷、偵測或監測病症；預防、治療、管理或緩解病症或者其一或多種症狀；及/或研究。單獨或與預防劑、治療劑及/或醫藥學上可接受之載劑組合的醫藥組合物之調配為熟習此項技術者已知的(美國專利公開案第20090311253 A1號)。
在各種實施例中，提供一種醫藥調配物，其包含一或多種胺基酸、一或多種多醣及/或聚山梨酸酯，及以介於約0.1與200mg/ml之間且包括終點在內(例如0.1-10、1-10、0.1-50、1-50、1-100、10-150、25-100、25-50或50-100mg/ml)濃度存在的結合蛋白，其中該調配物之pH值介於約5.0與7.0之間且包括終點在內(例如，pH值為約5.0-6.0、5.5-6.0、5.0-6.5、5.5-6.5或6.0-7.0)。在一個實施例中，該調配物包含約10-20mM組胺酸(例如10、15或20mM組胺酸或其間任何濃度)。在一個實施例中，該調配物包含約15mM組胺酸、濃度為約100mg/ml且pH值為約5.5之結合蛋白。在各種實施例中，該調配物中之結 合蛋白為DVD3415或DVD3418。
投與本文提供之醫藥組合物或者預防劑或治療劑的方法包括(但不限於)非經腸投藥(例如皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內及皮下)、硬膜外投藥、腫瘤內投藥、黏膜投藥(例如鼻內及經口途徑)及肺部投藥(例如利用吸入器或噴霧器投與之霧化之化合物)。用於特定投藥途徑之醫藥組合物的調配及各種投藥方法必需之材料及技術為可獲得的且為熟習此項技術者所知(例如，美國專利公開案第20090311253 A1號)。
劑量方案可經調整以提供最佳的所需反應(例如治療或預防反應)。舉例而言，可投與單一大丸劑；可隨時間投與若干分次劑量；或可按治療情況之緊急性指示按比例減小或增加劑量。為投藥之簡便性及劑量之均一性，將非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。術語「單位劑型」係指適合作為單一劑量用於待治療之哺乳動物個體的物理離散單元；每一單元含有經計算以產生所需治療作用之預定量的活性化合物與所需醫藥載劑之組合。本文提供之單位劑型的規格係由以下因素規定且直接取決於以下因素：(a)活性化合物之獨特特徵及有待達成之特定治療或預防作用，及(b)此項技術中混配此類活性化合物用於治療個體之敏感性所固有的侷限。
本文提供之結合蛋白之治療或預防有效量的例示性非限制性範圍為0.1-20mg/kg，例如1-10mg/kg。應注意，劑量值可隨有待減輕之病狀之類型及嚴重性而變化。亦應瞭解，對於任何特定個體，可根據個體需要及投與或監督該等組合物之投與之人員的專業判斷，隨時間調整具體劑量方案，且本文所陳述之劑量範圍僅為例示性的且不意欲限制所主張之組合物的範疇或實踐。
IV.組合療法
本文提供之結合蛋白亦可與一或多種可用於治療各種疾病之其 他治療劑一起投與，該其他藥劑係由熟習此項技術者針對其預定目的來選擇。舉例而言，該其他藥劑可為技術認可為可用於治療由本文提供之抗體所治療之疾病或病狀的治療劑。該組合亦可包括超過一種之其他藥劑，例如兩種或三種其他藥劑。
組合療法藥劑包括(但不限於)抗癌劑、放射療法、化學療法，諸如DNA烷基化劑、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、抗微管蛋白劑(anti-tubulin agent)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇、小紅莓、吉西他賓(gemcitabine)、健擇(gemzar)、蒽環黴素(anthracycline)、阿德力黴素(adriamycin)、拓撲異構酶I抑制劑、拓撲異構酶II抑制劑、5-氟尿嘧啶(5-FU)、亞葉酸(leucovorin)、伊立替康(irinotecan)、受體酪胺酸激酶抑制劑(例如埃羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib))、COX-2抑制劑(例如，塞來昔布(celecoxib))、激酶抑制劑及siRNA。
治療自體免疫疾病及發炎性疾病之組合可包括添加非類固醇消炎藥，亦稱為NSAIDS，其包括如布洛芬之藥物。其他組合為皮質類固醇，包括潑尼松龍；可藉由逐漸減少當與本文提供之結合蛋白組合以治療患者時所需的類固醇劑量來減少或甚至消除熟知的使用類固醇之副作用。可與本文提供之結合蛋白或其結合部分組合的用於類風濕性關節炎之治療劑的非限制性實例包括以下：細胞激素抑制性消炎藥(CSAID)；針對其他人類細胞激素或生長因子(例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21、IL-23、干擾素、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF)之抗體或拮抗劑。本文提供之結合蛋白或其抗原結合部分可與針對細胞表面分子(諸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90、CTLA或其配位體，包括CD154(gp39或CD40L))之抗體組合。
治療劑之組合可在自體免疫及隨後之發炎性級聯中之不同時間點進行干預；因此，以下一或多者可與本文所揭示之結合蛋白組合投與。實例包括本文所揭示之結合蛋白及TNF拮抗劑，如嵌合、人類化或人類TNF抗體，阿達木單抗(Adalimumab)(PCT公開案第WO 97/29131號)、CA2(RemicadeTM)、CDP 571、可溶性p55或p75 TNF受體或其衍生物(p75TNFR1gG(EnbrelTM)或p55TNFR1gG(Lenercept))、TNFα轉化酶(TACE)抑制劑或IL-1抑制劑(白介素-1轉化酶抑制劑、IL-1RA等)。其他組合包括本文所揭示之結合蛋白及白介素11。又另一組合包括在自體免疫反應中起關鍵作用者，其可與IL-12功能平行作用、取決於IL-12功能或與IL-12功能協作；尤其相關的為IL-18拮抗劑，包括IL-18抗體、可溶性IL-18受體或IL-18結合蛋白。經顯示，IL-12及IL-18具有重疊但不同之功能，且針對該兩者之拮抗劑的組合可為最有效的。又另一組合為本文所揭示之結合蛋白與非消耗性抗CD4抑制劑。又其他組合包括本文所揭示之結合蛋白及共刺激路徑CD80(B7.1)或CD86(B7.2)之拮抗劑，包括抗體、可溶性受體或拮抗性配位體。
本文提供之結合蛋白亦可與一種藥劑組合，該藥劑諸如為甲胺喋呤、6-MP、硫唑嘌呤、柳氮磺吡啶、美沙拉嗪(mesalazine)、奧沙拉秦、氯奎寧(chloroquinine)/羥基氯喹、青黴胺(pencillamine)、金硫蘋果酸鹽(aurothiomalate)(肌肉內及經口)、硫唑嘌呤、秋水仙鹼(cochicine)、皮質類固醇(經口、吸入及局部注射)、β-2腎上腺素受體促效劑(沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline)、沙美特羅(salmeteral))、黃嘌呤(茶鹼(theophylline)、胺茶鹼(aminophylline))、色甘酸鹽(cromoglycate)、奈多羅米(nedocromil)、酮替芬(ketotifen)、異丙托銨(ipratropium)、氧托銨(oxitropium)、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸嗎啉乙酯、來氟米特、NSAID(例如布洛芬)、皮質類固 醇(諸如潑尼松龍)、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷促效劑、抗血栓劑、補體抑制劑、腎上腺素激導劑、干擾由諸如TNF-α或IL-1之促炎性細胞激素之信號傳導的藥劑(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑)、IL-1β轉化酶抑制劑、TNFα轉化酶(TACE)抑制劑、T細胞信號傳導抑制劑(諸如激酶抑制劑)、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、血管收縮素轉化酶抑制劑、可溶性細胞激素受體或其衍生物(例如，可溶性p55或p75 TNF受體或衍生物p75TNFRIgG(EnbrelTM)或p55TNFRIgG(Lenercept)、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、消炎性細胞激素(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13及TGFβ)、塞來昔布、葉酸、硫酸羥基氯喹(hydroxychloroquine sulfate)、羅非昔布(rofecoxib)、依他普特(etanercept)、英利昔單抗(infliximab)、萘普生(naproxen)、伐地考昔(valdecoxib)、柳氮磺吡啶、甲基潑尼松龍、美洛昔康(meloxicam)、乙酸甲基潑尼松龍、金硫丁二鈉、阿司匹林(aspirin)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、萘磺酸丙氧芬(propoxyphene napsylate)/對乙醯胺基酚(apap)、葉酸鹽、萘丁美酮(nabumetone)、雙氯芬酸(diclofenac)、吡羅昔康(piroxicam)、依託度酸(etodolac)、雙氯芬酸鈉、奧沙普秦(oxaprozin)、鹽酸羥考酮(oxycodone hcl)、重酒石酸二氫可待因酮(hydrocodone bitartrate)/對乙醯胺基酚、雙氯芬酸鈉/米索前列醇(misoprostol)、芬太尼(fentanyl)、阿那白滯素(人類重組體)、鹽酸曲馬多(tramadol hcl)、雙水楊酯(salsalate)、舒林酸(sulindac)、氰基鈷胺素(cyanocobalamin)/fa/吡多辛(pyridoxine)、乙醯胺基酚(acetaminophen)、阿侖膦酸鈉(alendronate sodium)、潑尼松龍、硫酸嗎啡(morphine sulfate)、鹽酸利多卡因(lidocaine hydrochloride)、吲哚美辛(indomethacin)、硫酸葡糖胺(glucosamine sulf)/軟骨素(chondroitin)、鹽酸阿米替林(amitriptyline hcl)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、鹽酸羥考酮/乙醯胺基酚、鹽酸奧洛他 定(olopatadine hcl)、米索前列醇(misoprostol)、萘普生鈉(naproxen sodium)、奧美拉唑(omeprazole)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、利妥昔單抗(rituximab)、IL-1 TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18BP、抗IL-18、抗IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、羅氟司特(Roflumilast)、IC-485、CDC-801或美索普蘭(Mesopram)。 組合包括甲胺喋呤或來氟米特及在中度或重度類風濕性關節炎情況下環孢素。
在一個實施例中，結合蛋白或其抗原結合部分係與以下用於治療類風濕性關節炎之藥劑之一組合投與：KDR之小分子抑制劑、Tie-2之小分子抑制劑；甲胺喋呤；潑尼松(prednisone)；塞來昔布；葉酸；硫酸羥基氯喹；羅非昔布；依他普特；英利昔單抗；來氟米特；萘普生；伐地考昔；柳氮磺吡啶；甲基潑尼松龍；布洛芬；美洛昔康；乙酸甲基潑尼松龍；金硫丁二鈉；阿司匹林；硫唑嘌呤；曲安奈德；萘磺酸丙氧芬/對乙醯胺基酚；葉酸鹽；萘丁美酮；雙氯芬酸；吡羅昔康；依託度酸；雙氯芬酸鈉；奧沙普秦；鹽酸羥考酮；重酒石酸二氫可待因酮/對乙醯胺基酚；雙氯芬酸鈉/米索前列醇；芬太尼；阿那白滯素，人類重組體；鹽酸曲馬多；雙水楊酯；舒林酸；氰基鈷胺素/fa/吡多辛；乙醯胺基酚；阿侖膦酸鈉；潑尼松龍；硫酸嗎啡；鹽酸利多卡因；吲哚美辛；硫酸葡糖胺/軟骨素；環孢素；鹽酸阿米替林；磺胺嘧啶；鹽酸羥考酮/乙醯胺基酚；鹽酸奧洛他定；米索前列醇；萘普生鈉；奧美拉唑；黴酚酸嗎啉乙酯；環磷醯胺；利妥昔單抗；IL-1 TRAP；MRA；CTLA4-IG；IL-18 BP；IL-12/23；抗IL 18；抗IL 15；BIRB-796；SCIO-469；VX-702；AMG-548；VX-740；羅氟司特；IC-485；CDC-801；或美索普蘭。
可與本文提供之結合蛋白組合用於發炎性腸病之治療劑的非限制性實例包括以下：布替耐德；表皮生長因子；皮質類固醇；環孢 素、柳氮磺吡啶；胺基水楊酸鹽；6-巰基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂肪加氧酶抑制劑；美塞拉明；奧沙拉秦；巴柳氮；抗氧化劑；血栓素抑制劑；IL-1受體拮抗劑；抗IL-1β mAb；抗IL-6 mAb；生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；吡啶基-咪唑化合物；針對其他人類細胞激素或生長因子(例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF)之抗體或拮抗劑。本文提供之抗體或其抗原結合部分可與針對細胞表面分子(諸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配位體)之抗體組合。本文提供之抗體，或其抗原結合部分亦可與一種藥劑組合，該藥劑諸如為甲胺喋呤、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸嗎啉乙酯、來氟米特、NSAID(例如布洛芬)、皮質類固醇(諸如潑尼松龍)、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷促效劑、抗血栓劑、補體抑制劑、腎上腺素激導劑、干擾由諸如TNF-α或IL-1之促炎性細胞激素之信號傳導的藥劑(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑)、IL-1β轉化酶抑制劑、TNFα轉化酶抑制劑、T細胞信號傳導抑制劑(諸如激酶抑制劑)、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、血管收縮素轉化酶抑制劑、可溶性細胞激素受體或其衍生物(例如，可溶性p55或p75 TNF受體、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)或消炎性細胞激素(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13或TGFβ)或bcl-2抑制劑。
可與結合蛋白組合用於克羅恩氏病之治療劑的實例包括以下：TNF拮抗劑，例如抗TNF抗體阿達木單抗(PCT公開案第WO 97/29131號；HUMIRA)、CA2(REMICADE)、CDP 571、TNFR-Ig構築體(p75TNFRIgG(ENBREL)或p55TNFRIgG(LENERCEPT))抑制劑或PDE4抑制劑。本文提供之抗體，或其抗原結合部分可與例如布地奈德及地塞米松(dexamethasone)之皮質類固醇組合。本文提供之結合蛋 白或其抗原結合部分亦可與諸如以下藥劑組合：柳氮磺吡啶、5-胺基水楊酸及奧沙拉秦，或干擾諸如IL-1之促炎性細胞激素之合成或作用的藥劑，例如IL-1β轉化酶抑制劑或IL-1ra。本文提供之抗體或其抗原結合部分亦可與T細胞信號傳導抑制劑(例如酪胺酸激酶抑制劑或6-巰基嘌呤)一起使用。本文提供之結合蛋白或其抗原結合部分可與IL-11組合。本文提供之結合蛋白或其抗原結合部分可與以下組合：美塞拉明、潑尼松、硫唑嘌呤、巰基嘌呤、英利昔單抗、甲基潑尼松龍琥珀酸鈉、地芬諾酯(diphenoxylate)/硫酸阿托品(atrop sulfate)、硫酸洛哌丁胺(loperamide hydrochloride)、甲胺喋呤、奧美拉唑(omeprazole)、葉酸鹽、環丙沙星(ciprofloxacin)/右旋糖-水、重酒石酸二氫可待因酮/對乙醯胺基酚、鹽酸四環素(tetracycline hydrochloride)、氟輕鬆(fluocinonide)、甲硝唑、硫柳汞(thimerosal)/硼酸、考來烯胺(cholestyramine)/蔗糖、鹽酸環丙沙星、硫酸莨菪鹼(hyoscyamine sulfate)、鹽酸哌替啶(meperidine hydrochloride)、鹽酸咪達唑侖(midazolam hydrochloride)、鹽酸羥考酮/乙醯胺基酚、鹽酸普敏太定(promethazine hydrochloride)、磷酸鈉、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)/三甲氧苄啶(trimethoprim)、塞來昔布、聚卡波非(polycarbophil)、萘磺酸丙氧芬、氫化可的松(hydrocortisone)、多維生素(multivitamin)、巴柳氮二鈉、磷酸可待因(codeine phosphate)/對乙醯胺基酚、鹽酸考來維侖(colesevelam hcl)、氰基鈷胺素、葉酸、左氧氟沙星(levofloxacin)、甲基潑尼松龍、那他珠單抗(natalizumab)或干擾素-γ。
可與本文提供之結合蛋白組合用於多發性硬化之治療劑的非限制性實例包括以下：皮質類固醇；潑尼松龍；甲基潑尼松龍；硫唑嘌呤；環磷醯胺；環孢素；甲胺喋呤；4-胺基吡啶；替紮尼定(tizanidine)；干擾素-β1a(AVONEX；Biogen)；干擾素-β1b (BETASERON；Chiron/Berlex)；干擾素α-n3)(Interferon Sciences/Fujimoto)、干擾素-α(Alfa Wassermann/J&J)、干擾素β1A-IF(Serono/Inhale Therapeutics)、聚乙二醇干擾素(Peginterferon)α 2b(Enzon/Schering-Plough)、共聚物1(Cop-1；COPAXONE；Teva Pharmaceutical Industries,Inc.)；高壓氧；靜脈內免疫球蛋白；克拉屈濱(clabribine)；針對其他人類細胞激素或生長因子及其受體(例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-23、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF)之抗體或拮抗劑。本文提供之結合蛋白可與針對細胞表面分子(諸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90或其配位體)之抗體組合。本文提供之結合蛋白亦可與一種藥劑組合，該藥劑諸如為甲胺喋呤、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸嗎啉乙酯、來氟米特、NSAID(例如布洛芬)、皮質類固醇(諸如潑尼松龍)、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷促效劑、抗血栓劑、補體抑制劑、腎上腺素激導劑、干擾由諸如TNF-α或IL-1之促炎性細胞激素之信號傳導的藥劑(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑)、IL-1β轉化酶抑制劑、TACE抑制劑、T細胞信號傳導抑制劑(諸如激酶抑制劑)、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、血管收縮素轉化酶抑制劑、可溶性細胞激素受體或其衍生物(例如，可溶性p55或p75 TNF受體、sIL-1RI、sIL-1RII、SIL-6R)或消炎性細胞激素(例如，IL-4、IL-10、IL-13或TGFβ)或bcl-2抑制劑。
可與本文提供之結合蛋白組合用於多發性硬化之治療劑的實例包括干擾素-β，例如INFβ1a及IFNβ1b；克帕松(copaxone)；皮質類固醇；卡斯蛋白酶抑制劑(caspase inhibitor)，例如卡斯蛋白酶-1抑制劑；IL-1抑制劑；TNF抑制劑；及針對CD40配位體及CD80之抗體。
可與本文提供之結合蛋白組合用於哮喘之治療劑的非限制性實 例包括以下：沙丁胺醇、沙美特羅(salmeterol)/氟替卡松(fluticasone)、孟魯司特鈉(montelukast sodium)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、布地奈德、潑尼松、昔美酸沙美特羅(salmeterol xinafoate)、鹽酸左旋沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇/異丙托銨、潑尼松龍磷酸鈉、曲安奈德、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、異丙托溴銨(ipratropium bromide)、阿奇黴素(azithromycin)、乙酸吡布特羅(pirbuterol acetate)、潑尼松龍、無水茶鹼、甲基潑尼松龍琥珀酸鈉、克拉黴素(clarithromycin)、紮魯司特(zafirlukast)、反丁烯二酸福莫特羅(formoterol fumarate)、流感病毒疫苗、甲基潑尼松龍、三水合阿莫西林(amoxicillin trihydrate)、氟尼縮松(flunisolide)、過敏症注射液、色甘酸鈉、鹽酸非索非那定(fexofenadine hydrochloride)、氟尼縮松/薄荷腦(menthol)、阿莫西林/克拉維酸鹽(clavulanate)、左氧氟沙星(levofloxacin)、吸入劑輔助裝置(inhaler assist device)、愈創甘油醚(guaifenesin)、地塞米松磷酸鈉(dexamethasone sodium phosphate)、鹽酸莫西沙星(moxifloxacin hcl)、鹽酸多西環素(doxycycline hyclate)、愈創甘油醚/右美沙芬(d-methorphan)、偽麻黃鹼(p-ephedrine)/cod/氯苯那敏(chlorphenir)、加替沙星(gatifloxacin)、鹽酸西替利嗪(cetirizine hydrochloride)、糠酸莫米松(mometasone furoate)、昔美酸沙美特羅、苯佐那酯(benzonatate)、頭孢胺苄(cephalexin)、pe/氫可酮(hydrocodone)/氯苯那敏、鹽酸西替利嗪(cetirizine hcl)/偽麻黃鹼(pseudoephed)、去氧腎上腺素(phenylephrine)/cod/普敏太定、可待因/普敏太定、頭孢丙烯(cefprozil)、地塞米松、愈創甘油醚/偽麻黃鹼、氯菲安明(chlorpheniramine)/氫可酮、奈多羅米鈉(nedocromil sodium)、硫酸特布他林(terbutaline sulfate)、腎上腺素、甲基潑尼松龍、硫酸非諾特羅(metaproterenol sulfate)。
可與本文提供之結合蛋白組合用於COPD之治療劑的非限制性實例包括以下：硫酸沙丁胺醇/異丙托銨、異丙托溴銨、沙美特羅/氟替卡松、沙丁胺醇、昔美酸沙美特羅、丙酸氟替卡松、潑尼松、無水茶鹼、甲基潑尼松龍琥珀酸鈉、孟魯司特鈉、布地奈德、反丁烯二酸福莫特羅、曲安奈德、左氧氟沙星、愈創甘油醚、阿奇黴素、二丙酸倍氯米松、鹽酸左旋沙丁胺醇、氟尼縮松、頭孢曲松鈉(ceftriaxone sodium)、三水合阿莫西林、加替沙星、紮魯司特、阿莫西林/克拉維酸鹽、氟尼縮松/薄荷腦、氯菲安明/氫可酮、硫酸非諾特羅、甲基潑尼松龍、糠酸莫米松、偽麻黃鹼/cod/氯苯那敏、乙酸吡布特羅、偽麻黃鹼/氯雷他定(loratadine)、硫酸特布他林、噻托溴銨(tiotropium bromide)、(R,R)-福莫特羅、TgAAT、西洛司特(Cilomilast)、羅氟司特。
可與本文提供之結合蛋白組合用於牛皮癬之治療劑的非限制性實例包括以下：KDR之小分子抑制劑、Tie-2之小分子抑制劑、卡泊三醇(calcipotriene)、丙酸氯倍他索(clobetasol propionate)、曲安奈德、丙酸鹵倍他索(halobetasol propionate)、他紮羅汀(tazarotene)、甲胺喋呤、氟輕鬆、增強型二丙酸倍他米松(betamethasone diprop augmented)、醋酸氟輕鬆(fluocinolone acetonide)、阿維A酸(acitretin)、焦油洗髮精(tar shampoo)、戊酸倍他米松(betamethasone valerate)、糠酸莫米松、酮康唑(ketoconazole)、普莫卡因(pramoxine)/氟輕鬆、戊酸氫化可的松(hydrocortisone valerate)、氟氫縮松(flurandrenolide)、尿素(urea)、倍他米松、丙酸氯倍他索/依莫林特(emoll)、丙酸氟替卡松、阿奇黴素、氫化可的松、保濕配方(moisturizing formula)、葉酸、地奈德(desonide)、吡美莫司(pimecrolimus)、煤焦油(coal tar)、二乙酸二氟拉松(diflorasone diacetate)、葉酸依他普特(etanercept folate)、乳酸、甲氧沙林 (methoxsalen)、hc/鹼式沒食子酸鉍(bismuth subgal)/znox/resor、乙酸甲基潑尼松龍、潑尼松、防曬劑(sunscreen)、哈西奈德(halcinonide)、水楊酸、地蒽酚(anthralin)、特戊酸氯可托龍(clocortolone pivalate)、煤提取物(coal extract)、煤焦油/水楊酸、煤焦油/水楊酸/硫、去羥米松(desoximetasone)、地西泮(diazepam)、依莫林特(emollient)、氟輕鬆/依莫林特、礦物油/蓖麻油/na lact、礦物油/花生油、石油/十四烷酸異丙酯、補骨脂素(psoralen)、水楊酸、肥皂/三溴沙侖(tribromsalan)、硫柳汞/硼酸、塞來昔布、英利昔單抗、環孢素、阿法賽特(alefacept)、依法利珠單抗(efalizumab)、他克莫司(tacrolimus)、吡美莫司(pimecrolimus)、PUVA、UVB、柳氮磺吡啶。
可與本文提供之結合蛋白組合用於SLE(狼瘡)之治療劑的實例包括以下：NSAIDS，例如雙氯芬酸、萘普生、布洛芬、吡羅昔康、吲哚美辛；COX2抑制劑，例如塞來昔布、羅非昔布、伐地考昔；抗瘧疾劑，例如羥基氯喹；類固醇，例如潑尼松、潑尼松龍、布地奈德、地塞米松；細胞毒性劑，例如硫唑嘌呤、環磷醯胺、黴酚酸嗎啉乙酯、甲胺喋呤；PDE4抑制劑或嘌呤合成抑制劑，例如驍悉(Cellcept)。本文提供之結合蛋白亦可與諸如以下藥劑組合：柳氮磺吡啶、5-胺基水楊酸、奧沙拉秦、移護寧(Imuran)，及干擾諸如IL-1之促炎性細胞激素之合成、產生或作用的藥劑，例如卡斯蛋白酶抑制劑，如IL-1β轉化酶抑制劑及IL-1ra。本文提供之結合蛋白亦可與T細胞信號傳導抑制劑(例如酪胺酸激酶抑制劑)；或靶向T細胞活化分子之分子(例如CTLA-4-IgG或抗B7家族抗體、抗PD-1家族抗體)一起使用。本文提供之結合蛋白可與IL-11或抗細胞激素抗體(例如芳妥珠單抗(fonotolizumab)，抗IFNg抗體)或抗受體抗體(例如抗IL-6受體抗體及針對B細胞表面分子之抗體)組合。本文提供之抗體或其抗原結合部分亦可與LJP 394(阿貝莫司(abetimus))；使B細胞耗盡或失活之藥 劑，例如利妥昔單抗(抗CD20抗體)、林非斯特(lymphostat-B)(抗BlyS抗體)；TNF拮抗劑，例如抗TNF抗體、阿達木單抗(PCT公開案第WO 97/29131號；HUMIRA)、CA2(REMICADE)、CDP 571、TNFR-Ig構築體(p75TNFRIgG(ENBREL)及p55TNFRIgG(LENERCEPT))及bcl-2抑制劑，因為bcl-2在轉殖基因小鼠中過表現已證實可引起類狼瘡表型(參看Marquina)。本文提供之醫藥組合物可包括「治療有效量」或「預防有效量」的本文提供之結合蛋白。「治療有效量」係指以必需之劑量且在必需時間段內有效達成所需治療結果的量。結合蛋白之治療有效量可由熟習此項技術者確定且可根據諸多因素而變化，諸如疾病狀態；個體之年齡、性別及體重；以及結合蛋白在個體中引起所需反應之能力。治療有效量亦為治療有益作用超過抗體或抗原結合部分之任何有毒或有害作用的量。「預防有效量」係指以必需之劑量且在必需時間段內有效達成所需預防結果的量。通常，由於預防劑量係在疾病之前或疾病早期用於個體，故預防有效量將低於治療有效量。
V.診斷
本文之揭示內容亦提供診斷應用，包括(但不限於)診斷分析方法、含有一或多種結合蛋白之診斷套組以及該等方法及套組用於自動化及/或半自動化系統中之改編型式。所提供之方法、套組及改編型式可用於偵測、監測及/或治療個體之疾病或病症。此將於下文進一步闡明。
A.分析方法
本發明亦提供一種使用至少一種如本文所述之結合蛋白確定測試樣品中分析物或其片段之存在、量或濃度的方法。如此項技術中已知之任何適合分析均可用於該方法中。實例包括(但不限於)免疫分析及/或採用質譜法之方法。
本發明所提供之免疫分析可包括夾心免疫分析、放射免疫分析 (RIA)、酶免疫分析(EIA)、酶連免疫吸附劑分析(ELISA)、競爭性抑制免疫分析、螢光偏振免疫分析(FPIA)、酶放大免疫分析技術(EMIT)、生物發光共振能量轉移(BRET)及均相化學發光分析等。
化學發光微粒免疫分析，特別是採用ARCHITECT®自動分析儀(Abbott Laboratories,Abbott Park,IL)者，為免疫分析之一個實例。
本發明提供了採用質譜法之方法，且其包括(但不限於)MALDI(基質輔助雷射脫附/電離)或SELDI(表面增強之雷射脫附/電離)。
使用免疫分析及質譜法收集、處理、加工及分析生物測試樣品之方法將為熟習此項技術者所熟知，且提供用於實踐本發明(US 2009-0311253 A1)。
B.套組
亦提供針對測試樣品中分析物或其片段之存在、量或濃度來分析測試樣品的套組。該套組包含至少一種用於分析測試樣品中之分析物或其片段的組分，及有關分析該測試樣品中之分析物或其片段的說明書。該至少一種用於分析測試樣品中之分析物或其片段的組分可包括包含如本文所揭示之結合蛋白，及/或抗分析物結合蛋白(或其片段、變體或變體之片段)的組合物，其視情況固定在固相上。
視情況，該套組可包含校準劑或對照物，其可包含分離或純化之分析物。該套組可包含至少一種藉由免疫分析及/或質譜法分析測試樣品中之分析物的組分。該套組之組分，包括分析物、結合蛋白及/或抗分析物結合蛋白或其片段，可視情況使用技術上已知之可偵測標記進行標記。所提供的用於實踐本發明之材料及方法將為熟習此項技術者所知(US 2009-0311253 A1)。
C.套組及方法之改編型式
該套組(或其組分)以及藉由諸如免疫分析(如本文所述)之分析來確定測試樣品中分析物之存在、量或濃度的方法可經改編用於多種自 動化及半自動化系統(包括固相包含微粒之該等系統)，如例如美國專利第5,089,424號及第5,006,309號中所述，以及如市面上由例如Abbott Laboratories(Abbott Park,IL)以ARCHITECT®銷售的。
可購自Abbott Laboratories之其他平台包括(但不限於)AxSYM®、IMx®(參看例如，美國專利第5,294,404號)、PRISM®、EIA(珠粒)及QuantumTM II，以及其他平台。此外，該等分析、套組及套組之組分可以其他形式例如在電化學或其他手持式或現場護理分析系統上使用。本發明例如適用於進行夾心免疫分析之市售Abbott Point of Care(i-STAT®,Abbott Laboratories)電化學免疫分析系統。在一次性使用測試裝置中免疫感測器以及其製造及操作方法描述於例如美國專利第5,063,081號、第7,419,821號及第7,682,833號；以及美國公開案第20040018577號、第20060160164號及US 20090311253中。
熟習此項技術者將易於瞭解，對本文所述方法之其他適合修改及改編為顯而易見的且可在不偏離本文所揭示之實施例之範疇的情況下使用適合等效物進行。現已詳細描述了某些實施例，但參照以下實例將更清楚地對其進行瞭解，該等實例係僅出於說明之目的納入且不意欲作限制。
實例 實例1：抗-IL-1β及抗-IL-17雙重可變結構域(DVD)結合蛋白之產生及表徵
使用親本抗體，藉由合成編碼雙重可變結構域(DVD)結合蛋白可變重鏈及DVD結合蛋白可變輕鏈序列之多核苷酸片段且根據技術上已知之方法將該等片段選殖至pHybC-D2載體中來產生兩條鏈及四條鏈之DVD結合蛋白，例如DVD-IgTM。根據技術上已知之方法，將DVD結合蛋白構築體選殖至293細胞中且使其在該等細胞中表現，並加以純化。DVD結合蛋白之DVD VH及VL鏈提供於下。表2最左邊一欄中 所列之SEQ ID NO係指該表中該列中所標識之DVD結合蛋白的完整可變結構域之序列。表2最右邊一欄中每一列提供三個SEQ ID NO。第一個數字係指外部可變結構域序列之SEQ ID NO，第二個數字係指連接子之SEQ ID NO，且第三個數字係指內部可變結構域序列之SEQ ID NO，其一起見於完整DVD可變結構域序列內(亦即，包含VD1-X1-VD2之完整DVD可變結構域)。
以上所列之所有DVD-Ig結合蛋白均可進一步包含人類輕鏈κ恆定區。DVD2423-DVD2442亦可包含人類重鏈野生型IgG1恆定區，而DVD3410-DVD3425可包含來自人類IgG1突變體(IgG1,z,non-a mut(234,235))之重鏈恆定區。該等重鏈及輕鏈恆定區之序列顯示於下表2a中。舉例而言，DVD3418可進一步包含來自人類IgG1突變體(IgG1,z,mut(234,235))之重鏈恆定區及來自人類輕鏈κ恆定區之輕鏈恆定區(參看表2b，其顯示了DVD3418之第一鏈及第二鏈之胺基酸序列，其中CDR序列加下劃線且X1連接子以粗體表示，且以斜體顯示潛在之恆定結構域序列，其中該重鏈上之突變之恆定結構域胺基酸以粗體加下劃線表示)。
實例2：用於測定親本抗體及DVD-Ig蛋白質之功能活性的分析實例2.1：IL-β生物分析及中和分析
以每孔1.5-2×104個細胞(體積100μl)接種MRC5細胞且在37℃、5% CO2下培育隔夜。在完全MEM培養基中製備20μg/ml之工作儲備液(4x濃縮)。在Marsh稀釋盤中以完全MEM進行八點連續稀釋(5μg/ml-0.0003μg/ml)。一式四份，將七十五微升/孔每一抗體稀釋液及75μl之200pg/ml IL-1β溶液添加至96孔v形底(Costar# 3894)盤中。對照孔接受75μl 200pg/ml IL-1β(4x濃縮)加75μl MEM培養基，且培養基對照孔接受150μl培養基。1小時培育之後，將100μl Ab/Ag混合物添加至MRC5細胞中。所有孔體積均等於200μl。接著對所有盤試劑進行1x濃縮。16-20小時培育之後，將孔內含物(150μl)轉移至96孔圓底盤(Costar# 3799)中，並置放於-20℃冷凍器中。藉由使用人類IL-8 ELISA套組(R&D Systems,Minneapolis,MN)或hIL-8化學發光套組(MDS)測試上清液中hIL-8含量。藉由計算相對於僅含IL-1β之對照物值之抑制百分比來確定中和效力。結果示於表3中。
在N末端或C末端位置中含有來自AB268、AB269、AB270、AB271或AB272之VD的所有DVD-Ig均在MRC5 IL-1β中和分析中展現中和作用。
實例2.2：IL-17生物分析及中和分析
人類HS27細胞株(ATCC #CRL-1634)響應IL-17而分泌IL-6。藉由中和抗IL-17抗體將抑制IL-17誘導之IL-6分泌(參看例如，J.Imm.155：5483-5486(1995)或Cytokine 9：794-800(1997))。
將HS27細胞維持在分析培養基(含10%胎牛血清(Gibco#26140)、4mM L-麩醯胺酸、1mM丙酮酸鈉、青黴素G(100U/500ml)及鏈黴素(streptomycin)(100μg/500ml)之DMEM高葡萄糖培養基(Gibco #11965))中。使細胞在T150燒瓶中生長，直至其在分析當天達到約80-90%匯合。在不含Ca2+及Mg2+之無菌PBS中將人類IL-17(R&D Systems,#317-IL/CF)復原，冷凍儲存，新鮮解凍待用且在分析培養基中稀釋至40ng/ml(4X)。在單獨盤中製備抗體之連續稀釋液(4X濃度)，將其與等體積之40ng/ml(4X)人類IL-17混合且在37℃下培育1小時。將HS27細胞(通常在50μl分析培養基中有約20,000個細胞)添加至96孔平底組織培養盤(Costar #3599)之每一孔中，隨後添加50μl預培育之抗體或DVD-Ig蛋白質加IL-17之混合物。IL-17之最終濃度為10ng/ml。細胞在37℃下培育約24小時。接著收集培養基上清液。藉由使用市售Meso Scale Discovery套組，根據製造商之說明書測定上清液中IL-6之量來量測IL-17中和程度。使用抗體或DVD-Ig蛋白質之對數對比IL-6量可變斜率擬合來獲得IC50值。參看表4。
在N末端或C末端位置中含有來自AB273、AB420或AB461之VD的所有DVD-Ig均在HS27 IL-17中和分析中顯示中和作用。
實例2.3：使用BIACORE技術進行之親和力測定
BIACORE方法：
BIACORE分析(GE,Healthcare Piscataway,NJ)利用締合速率及解離速率常數之動力學量測測定了抗體或DVD-Ig蛋白質之親和力。在25℃下，利用Biacore T200，使用來自GE Healthcare之HBS-EP+操作緩衝液，藉由基於表面電漿子共振之量測來測定抗體或DVD-Ig蛋白質與靶抗原(例如，純化之重組靶抗原)的結合。除非另作描述，否則所有化學試劑均自GE Healthcare獲得。舉例而言，根據製造商之說明書，使用標準胺偶聯套組將在10mM乙酸鈉(pH 4.5)中稀釋的約5000 RU山羊抗小鼠IgG，(Fcγ)片段特異性多株抗體(Pierce Biotechnology Inc,Rockford,IL)直接固定在整個CM5研究級生物感測器晶片上。用乙醇胺阻斷該生物感測器表面上未反應之部分。使用流動池1中經修飾之羧甲基葡聚糖表面作為參考表面。藉由得到在0.8-100nM範圍內之不同抗原濃度下的動力學結合量測值來得出速率常數。隨時間變化記錄結合，且計算動力學速率常數。在本分析中，評估締合速率5分鐘且監測解離10分鐘。對於動力學篩選分析，使用Biaevaluation軟體，將由1：1結合模型得出之速率等式同時與所有注射液之締合相及解離相擬合(使用全局擬合分析，其中Rmax局部擬合以說明捕捉變化)。純化之抗體或DVD-Ig蛋白質在HEPES-緩衝生理食鹽水中稀釋以橫過山羊抗小鼠IgG特異性反應表面進行捕捉。以5μl/min之流動速率將有待捕捉之抗體或DVD-Ig蛋白質作為配位體注射於反應基質上。在50μl/min之連續流動速率下，測定締合及解離速率常數kon(M-1s-1)及koff(s-1)。藉由得到在0.8-100nM範圍內之不同抗原濃度下的動力學結合量測值來得出速率常數。隨時間變化記錄結合，且計算動力學速 率常數。在本分析中，評估締合速率5分鐘且監測解離10分鐘。參看表6。
由Biacore技術表徵之所有DVD-Ig蛋白質之結合均得以維持且與親本抗體之結合相當。所有可變結構域均以與親本抗體類似之高親和力結合。
實例3：抗體及DVD-Ig蛋白質之表徵
純化之DVD-Ig蛋白質抑制功能活性之能力係例如使用如實例2.1及2.2中所述之細胞激素生物分析測定。DVD-Ig蛋白質與重組人類抗原之結合親和力係使用如實例2.3中所述之表面電漿子共振(Biacore®) 量測來測定。對由生物分析得到之IC50值以及抗體及DVD-Ig蛋白質之親和力進行排序。選擇完全維持親本mAb之活性的DVD-Ig蛋白質作為未來研究之候選物。對前2-3種最有利之DVD-Ig蛋白質進行進一步表徵。
實例3.1：人類化抗體或DVD-Ig蛋白質之藥物動力學分析
在斯普拉-道來大鼠(Sprague-Dawley rat)及食蟹獼猴中進行藥物動力學研究。對雄性及雌性大鼠及食蟹獼猴靜脈內或皮下給與單次劑量之4mg/kg mAb或DVD-Ig蛋白質，且使用抗原捕捉ELISA分析樣品，並藉由非房室分析測定藥物動力學參數。簡言之，用山羊抗生物素抗體(5mg/ml，4℃，隔夜)塗覆ELISA盤，用Superblock(Pierce)阻斷且與含50ng/ml生物素化人類抗原之10% Superblock TTBS一起在室溫下培育2小時。對血清樣品進行連續稀釋(含0.5%血清、10% Superblock之TTBS)且在該盤上在室溫下培育30分鐘。用HRP標記之山羊抗人類抗體進行偵測，且藉助於使用四參數邏輯斯諦擬合(four parameter logistic fit)得到之標準曲線測定濃度。藉由非房室模型，使用WinNonlin軟體(Pharsight Corporation,Mountain View,CA)測定藥物動力學參數之值。選出具有良好藥物動力學型態(T1/2為8-13天或更佳，具有低清除率及優良之生物利用率50-100%)之人類化mAb。
實例3.2：人類化單株抗體及DVD-Ig蛋白質之物理化學及活體外穩定性分析 尺寸排阻層析法
用水將抗體或DVD-Ig蛋白質稀釋至2.5mg/mL且取20mL在Shimadzu HPLC系統上使用TSK gel G3000 SWXL管柱(Tosoh Bioscience，目錄號k5539-05k)進行分析。用211mM硫酸鈉、92mM磷酸鈉(pH 7.0)，以0.3mL/min之流動速率自該管柱溶離出樣品。HPLC系統操作條件如下： 移動相：211mM Na2SO4、92mM Na2HPO4*7H2O，pH 7.0
梯度：等濃度
流動速率：0.3mL/min
偵測波長：280nm
自動進樣器冷卻器溫度：4℃
管柱烘箱溫度：環境溫度
運行時間：50分鐘
表7含有如藉由以上方案測定的親本抗體及DVD-Ig蛋白質之純度資料，以單體(具有預期分子量之未聚集蛋白質)百分比表示。
DVD-Ig蛋白質顯示出優良之SEC型態，其中大多數DVD-Ig蛋白質顯示>90%單體。此DVD-Ig蛋白質型態類似於關於親本抗體所觀察之型態。
SDS-PAGE
藉由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，在還原及非還原條件下分析抗體及DVD-Ig蛋白質。使用阿達木單抗批號AFP04C作為對照物。對於還原條件，將樣品與含100mM DTT之2X tris甘胺酸SDS-PAGE樣品緩衝液(Invitrogen，目錄號LC2676，批號1323208)以1：1混合，且在60℃下加熱30分鐘。對於非還原條件，將樣品與樣品緩衝液以1：1混合，且在100℃下加熱5分鐘。將還原樣品(每一泳道10mg)裝載至12%預澆注之tris-甘胺酸凝膠(Invitrogen，目錄號EC6005box，批號6111021)上，且非還原樣品(每一泳道10mg)裝載至8%-16%預澆注之tris-甘胺酸凝膠(Invitrogen，目錄號EC6045box，批號6111021)上。使用SeeBlue Plus 2(Invitrogen，目錄號LC5925，批號 1351542)作為分子量標記物。使凝膠在XCell SureLock小型池凝膠盒(Invitrogen，目錄號EI0001)中跑膠，且藉由首先施加電壓75以在凝膠中堆疊樣品，隨後施加恆定電壓125，直至染料前鋒到達凝膠之底部來分離蛋白質。所用電泳緩衝液為自10X tris甘胺酸SDS緩衝液(ABC,MPS-79-080106)製備之1X tris甘胺酸SDS緩衝液。凝膠用膠體藍染色劑(Invitrogen目錄號46-7015、46-7016)染色隔夜且用Milli-Q水去染色，直至背景變澄清。接著使用Epson Expression掃描儀(型號1680，S/N DASX003641)掃描經染色之凝膠。
沈積速度分析
將抗體或DVD-Ig蛋白質裝載至三個標準兩區式碳環氧樹脂中心杯中每一個的樣品室中。該等中心杯具有1.2cm光學路徑長度且用藍寶石窗構建。使用PBS作為參考緩衝液且每個室含有140μL。在Beckman ProteomeLab XL-I分析超離心機(序列號PL106C01)中使用4孔(AN-60Ti)轉子同時檢查所有樣品。
運轉條件係經程序化且離心機控制係使用ProteomeLab(v5.6)進行。在分析前，使樣品及轉子熱平衡一小時(20.0±0.1℃)。適當池裝載係以3000rpm確定且記錄每一池之單一掃描。沈積速度條件如下：樣品池體積：420mL
參考池體積：420mL
溫度：20℃
轉子速度：35,000rpm
時間：8：00小時
UV波長：280nm
徑向步長：0.003cm
資料收集：每一步一個資料點，無需信號平均化。
總掃描次數：100次
完整抗體之LC-MS分子量量測
藉由LC-MS分析完整抗體及DVD-Ig蛋白質之分子量。用水將每一抗體或DVD-Ig蛋白質稀釋至約1mg/mL。使用具有蛋白質微型阱(Michrom Bioresources,Inc，目錄號004/25109/03)之1100 HPLC(Agilent)系統進行脫鹽且將5mg樣品引入API Qstar pulsar i質譜儀(Applied Biosystems)中。使用短梯度來溶離樣品。用移動相A(含0.08% FA、0.02% TFA之HPLC水)及移動相B(含0.08% FA及0.02% TFA之乙腈)以50mL/min之流動速率執行梯度。質譜儀係以4.5千伏(kvolt)電噴霧電壓及自2000至3500質菏比之掃描範圍操作。
抗體以及DVD-Ig蛋白質輕鏈及重鏈之LC-MS分子量量測
藉由LC-MS分析抗體以及DVD-Ig蛋白質輕鏈(LC)、重鏈(HC)及脫糖基化HC之分子量量測值。用水將抗體及DVD-Ig蛋白質稀釋至1mg/mL且在37℃下，以10mM DTT之最終濃度將樣品還原成LC及HC，保持30分鐘。為了使抗體及DVD-Ig蛋白質脫糖基化，將100mg抗體或DVD-Ig蛋白質與2mL PNGase F、5mL 10% N-辛基糖苷(總體積100mL)在37℃下一起培育隔夜。脫糖基化之後，在37℃下以10mM DTT之最終濃度將樣品還原，保持30分鐘。使用具有C4管柱(Vydac，目錄號214TP5115,S/N 060206537204069)之Agilent 1100 HPLC系統進行脫鹽且將樣品(5mg)引入API Qstar pulsar i質譜儀(Applied Biosystems)中。使用短梯度來溶離樣品。用移動相A(含0.08% FA、0.02% TFA之HPLC水)及移動相B(含0.08% FA及0.02% TFA之乙腈)以50mL/min之流動速率執行梯度。質譜儀係以4.5千伏電噴霧電壓及自800至3500質菏比之掃描範圍操作。
肽定位
在室溫下，以75mM碳酸氫銨中最終濃度為6M之鹽酸胍將抗體或DVD-Ig蛋白質變性15分鐘。在37℃下，以10mM DTT之最終濃度 將變性之樣品還原，保持60分鐘，隨後在37℃下於暗處用50mM碘乙酸(IAA)進行烷基化，持續30分鐘。烷基化之後，在4℃下，針對4公升10mM碳酸氫銨對樣品透析隔夜。用10mM碳酸氫銨(pH 7.8)將透析之樣品稀釋至1mg/mL，且在37℃下，用胰蛋白酶(Promega，目錄號V5111)或Lys-C(Roche，目錄號11 047 825 001)以1：20(w/w)之胰蛋白酶/Lys-C：抗體或DVD-Ig蛋白質比率消化100mg抗體或DVD-Ig蛋白質，持續4小時。用1mL 1N HCl淬滅消化物。對於利用質譜儀偵測進行肽定位，藉由逆相高效液相層析法(RPHPLC)，在C18管柱(Vydac，目錄號218TP51,S/N NE9606 10.3.5)上利用Agilent 1100 HPLC系統分離40mL消化物。以使用移動相A(含0.02% TFA及0.08% FA之HPLC級水)及移動相B(含0.02% TFA及0.08% FA之乙腈)之梯度以50mL/min之流動速率執行肽分離。API QSTAR Pulsar i質譜儀係在正離子模式下以4.5千伏電噴霧電壓及自800至2500質菏比之掃描範圍操作。
二硫鍵定位
為了使抗體變性，將100mL抗體或DVD-Ig蛋白質與300mL含8M鹽酸胍之100mM碳酸氫銨混合。檢查pH值以確保其介於7與8之間且在室溫下，在最終濃度6M之鹽酸胍中使樣品變性15分鐘。用Milli-Q水將變性樣品之一部分(100mL)稀釋至600mL，得到1M之最終鹽酸胍濃度。在37℃下，用胰蛋白酶(Promega，目錄號V5111，批號22265901)或Lys-C(Roche，目錄號11047825001，批號12808000)以1：50胰蛋白酶或1：50 Lys-C：抗體或DVD-Ig蛋白質(w/w)比率(4.4mg酶：220mg樣品)消化樣品(220mg)，持續約16小時。再添加5mg胰蛋白酶或Lys-C至樣品中且使消化在37℃下再進行2小時。藉由添加1mL TFA至每一樣品中來停止消化。藉由RPHPLC，使用C18管柱(Vydac，目錄號218TP51 S/N NE020630-4-1A)在Agilent HPLC系統上分離消化 之樣品。以與用於肽定位相同之梯度，使用移動相A(含0.02% TFA及0.08% FA之HPLC級水)及移動相B(含0.02% TFA及0.08% FA之乙腈)以50mL/min之流動速率執行分離。HPLC操作條件與用於肽定位之條件相同。API QSTAR Pulsar i質譜儀係在正離子模式下以4.5千伏電噴霧電壓及自800至2500質菏比之掃描範圍操作。藉由將所觀察的肽之MW與由二硫鍵連接之胰蛋白酶或Lys-C肽之預測MW相匹配來指定二硫鍵。
游離硫氫基測定
用於定量抗體或DVD-Ig蛋白質中之游離半胱胺酸的方法係基於埃爾曼氏試劑(Ellman's reagent)，即5,5-二硫-雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)與硫氫基(SH)之反應，其產生一種特有的發色產物5-硫-(2-硝基苯甲酸)(TNB)。該反應以下式說明：DTNB+RSH ® RS-TNB+TNB-+H+
在412nm下使用Cary 50分光光度計量測TNB-之吸光度。使用2巰基乙醇(b-ME)稀釋液作為游離SH標準品繪製吸光度曲線且由樣品在412nm下之吸光度測定蛋白質中游離硫氫基之濃度。
b-ME標準儲備液係藉由用HPLC級水連續稀釋14.2M b-ME直至0.142mM最終濃度來製備。接著，一式三份製備每種濃度之標準品。使用amicon ultra 10,000 MWCO離心過濾器(Millipore，目錄號UFC801096，批號L3KN5251)將抗體或DVD-Ig蛋白質濃縮至10mg/mL，且將緩衝液更換為用於阿達木單抗之調配物緩衝液(5.57mM磷酸二氫鈉、8.69mM磷酸一氫鈉、106.69mM NaCl、1.07mM檸檬酸鈉、6.45mM檸檬酸、66.68mM甘露糖醇(pH 5.2)、0.1%(w/v)Tween)。在震盪器上，在室溫下混合樣品20分鐘。接著，將180mL之100mM Tris緩衝液(pH 8.1)添加至每一樣品及標準品中，隨後添加300mL含2mM DTNB之10mM磷酸鹽緩衝液(pH 8.1)。充分混合之 後，在Cary 50分光光度計上在412nm下量測樣品及標準品之吸收。藉由將游離SH之量與b-ME標準品之OD412nm作圖來獲得標準曲線。基於此曲線，在減去空白值後計算出樣品之游離SH含量。
弱陽離子交換層析法
用10mM磷酸鈉(pH 6.0)將抗體或DVD-Ig蛋白質稀釋至1mg/mL。使用具有WCX-10 ProPac分析管柱(Dionex，目錄號054993,S/N 02722)之Shimadzu HPLC系統分析電荷不均一性。將樣品以80%移動相A(10mM磷酸鈉，pH 6.0)及20%移動相B(10mM磷酸鈉、500mM NaCl，pH 6.0)裝載至管柱上且以1.0mL/min流動速率溶離。
寡醣型態分析
用2-胺基苯甲醯胺(2-AB)標記試劑對在PNGase F處理抗體或DVD-Ig蛋白質之後釋放的寡醣進行衍生化。藉由正相高效液相層析(NPHPLC)分離螢光標記之寡醣，且基於與已知標準品之滯留時間比較來表徵不同形式之寡醣。
首先用PNGaseF消化抗體或DVD-Ig蛋白質以自重鏈之Fc部分裂解N連接之寡醣。將抗體或DVD-Ig蛋白質(200mg)連同2mL PNGase F及3mL 10% N-辛基糖苷一起置放於500mL艾本多夫管(Eppendorf tube)中。添加磷酸緩衝之生理食鹽水以使最終體積達到60mL。在37℃下，在設定為700 RPM之艾本多夫熱混合器中培育樣品隔夜。亦用PNGase F消化阿達木單抗批號AFP04C作為對照物。
在PNGase F處理之後，在95℃下，在設定為750 RPM之艾本多夫熱混合器中培育樣品5分鐘以使蛋白質沈澱析出，接著將樣品置放於10,000 RPM之艾本多夫離心機中2分鐘以對沈澱之蛋白質進行短暫離心。將含有寡醣之上清液轉移至500mL艾本多夫管中且在真空離心濃縮器(speed-vac)中在65℃下乾燥。
用2AB，使用購自Prozyme之2AB標記套組(目錄號GKK-404， 批號132026)對寡醣進行標記。根據製造商之說明書製備標記試劑。將乙酸(150mL，套組中提供)添加至DMSO小瓶(套組中提供)中且藉由用移液管上下吸取溶液若干次來進行混合。將乙酸/DMSO混合物(100mL)轉移至含2-AB染料之小瓶中(在即將使用前)且混合直至該染料完全溶解。接著，將染料溶液添加至含還原劑之小瓶(套組中提供)中且充分混合(標記試劑)。將標記試劑(5mL)添加至每一乾燥之寡醣樣品小瓶中，且充分混合。將反應小瓶置放於設定為65℃及700-800 RPM之艾本多夫熱混合器中，反應2小時。
標記反應之後，使用來自Prozyme之GlycoClean S藥筒(目錄號GKI-4726)移除過量之螢光染料。在添加樣品之前，用1mL milli-Q水，隨後用5 ish之1mL 30%乙酸溶液洗滌藥筒。在即將添加樣品之前，將1mL乙腈(Burdick and Jackson，目錄號AH015-4)添加至藥筒中。
在所有乙腈均通過藥筒之後，將樣品點在新鮮洗滌之盤中心且使其吸附於該盤上，保持10分鐘。用1mL乙腈隨後5 ish之1mL 96%乙腈洗滌該盤。將藥筒置放於1.5mL艾本多夫管上且用3 ish(400mL/ish)milli Q水溶離2-AB標記之寡醣。
使用連接至Shimadzu HPLC系統之Glycosep N HPLC(目錄號GKI-4728)分離寡醣。Shimadzu HPLC系統由系統控制器、脫氣器、二元泵、帶有樣品冷卻器之自動進樣器及螢光偵測器組成。
在高溫下之穩定性
抗體或DVD-Ig蛋白質之緩衝液為5.57mM磷酸二氫鈉、8.69mM磷酸一氫鈉、106.69mM NaCl、1.07mM檸檬酸鈉、6.45mM檸檬酸、66.68mM甘露糖醇、0.1%(w/v)Tween，pH 5.2；或10mM組胺酸、10mM甲硫胺酸、4%甘露糖醇，pH 5.9，使用Amicon超離心過濾器。抗體或DVD-Ig蛋白質之最終濃度用適當緩衝液調至2mg/mL。接 著對抗體或DVD-Ig蛋白質進行過濾滅菌且在無菌條件下製備0.25mL等分試樣。使等分試樣在-80℃、5℃、25℃或40℃下保持1週、2週或3週。在培育期結束時，藉由尺寸排阻層析法及SDS-PAGE分析樣品。
藉由SDS-PAGE在還原及非還原條件下分析樣品之穩定性。所用程序與本文所述相同。凝膠用膠體藍染色劑(Invitrogen目錄號46-7015、46-7016)染色隔夜且用Milli-Q水去染色，直至背景變澄清。接著使用Epson Expression掃描儀(型號1680，S/N DASX003641)掃描經染色之凝膠。為獲得更高靈敏度，使用銀染色套組(Owl Scientific)對該等凝膠進行銀染色且使用由製造商給定之推薦程序。
動態掃描螢光測定法
在10mM檸檬酸鹽10mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.0)中對DVD-Ig蛋白質進行透析，得到1mg/ml之最終濃度。每一DVD-Ig蛋白質重複執行三次。對於每一樣品，在96孔盤之孔中添加27μl DVD-Ig蛋白質且與3μl 4X稀釋之SYPRO橙色染料(Invitrogen)混合。該染料係以5000X濃度供應於DMSO中且在水中稀釋至4X工作濃度。將該盤離心30秒以確保染料及蛋白質沈降至孔底部且藉由用移液管尖小心抽吸來確保完全混合。接著用黏合膜密封該盤。
使用實時PCR(Applied Biosciences，7500系列)量測螢光強度隨溫度之變化。該盤以約0.5℃/min之溫度勻變速率自25℃加熱至95℃且使用TAMRA濾光器收集發射螢光。將資料輸出至Microsoft Excel且將溫度對每一DVD-Ig蛋白質之螢光度作圖。將熔融起始溫度記錄為溫譜圖升高超過基線螢光之溫度。SYPRO橙為一種疏水性染料且優先結合至展開之蛋白質分子中暴露之疏水性殘基。因此，如藉由螢光度增加所量測之展開起始溫度指示了DVD-Ig蛋白質之熱穩定性。DVD-Ig蛋白質之展開溫度可見於表8中。
大多數DVD-Ig蛋白質顯示展開溫度>50。此DVD-Ig蛋白質型態類似於關於親本抗體所觀察之型態。
溶解性測定
在15mM His(pH 6.0)中對DVD-Ig蛋白質候選物進行透析。此後將其在具有30K截止點之centricon中濃縮至50μl。藉由在4℃下儲存之後不存在沈澱來目測確定溶解性且藉由在280nm下之UV吸光度量測值來定量測定溶解性。參看表9(「ppt」指示沈澱)。
大多數DVD-Ig蛋白質顯示澄清外觀且可濃縮至超過25mg/ml。此DVD-Ig蛋白質型態類似於關於親本抗體所觀察之型態。
實例4：篩選漏斗(Screening Funnel)
為了產生具有類似藥物之特性的IL-1β/IL-17 DVD-Ig，產生一大組DVD-Ig結合蛋白，包括製備含有五個不同抗IL-1β可變結構域(E26.13、E26.35、1B12.1、1B12.3、1B12.6)之一、三個不同抗IL-17可變結構域(10F7M11、B6-5、B6-17)之一、三個不同連接子組合(SS、LS、SL)之一及兩種定向之一(亦即，IL-17作為內部或外部可變結構域結合位點)的DVD-Ig且藉由尺寸排阻層析(SEC)、親和力分析、效力分析及預調配分析進行篩選。該等DVD-Ig均未達到所有預調配標準之所需臨限值。
基於自DVD-Ig之初始篩選獲得之資訊，製備一小組額外的DVD-Ig結合蛋白。該等DVD-Ig含有抗IL-1β可變結構域E26.13或E26.35以及抗IL-17可變結構域B6-5G或B6-17G、在重鏈及輕鏈上的包含Gly-Ser重複之X1連接子(稱為「GS」連接子)及僅一種定向(內部結構域：IL-17及外部結構域：IL-1β)。抗IL-17結構域(B6-5G、B6-17G)係自先前之IL-17結構域B6-5及B6-17工程改造得到，其中在HC-CDR3處N突變成G以消除一個脫醯胺位點。在IL-1β效力分析中針對人類包皮纖維母細胞MRC-5細胞株中IL-8之釋放及在IL-17效力分析中針對人類胎肺纖維母細胞HS27細胞中IL-6之釋放來篩選DVD-Ig。如表10中所示，DVD3415及DVD3418在中和IL-1β及IL-17活性方面展現高效力，其中IC50在低pM範圍內。表10中提供之資料反映了來自針對I1-1β之2個實驗及針對IL-17之3-4個實驗的平均值+/-標準偏差。在所測試之DVD- Ig中，DVD3415及DVD3418展現的IL-17效力值最接近親本抗體。
對於來自表10之DVD-Ig之物理化學特性的進一步評估證實，DVD3415及DVD3418展現之特性超出每一預調配標準之所需臨限值(參看表11)。DVD3415及DVD3418在15mM組胺酸(pH 5.5)中之高濃度液體調配物下穩定。所有候選物均藉由質譜法且在還原及肽定位水準上確定。任一候選物對於熱應力無顯著變化。
發生風險-顏色代碼：低風險中等風險高風險
經顯示，DVD3415及DVD3418為具有良好特性之分析，具有高效力及所需之物理化學特性。二者共有相同之抗IL-17結構域(B6- 17G)及類似的抗IL-1β結構域(DVD3415中之E26.13及DVD3418中之E26.35)。E26.35僅在重鏈(HC)中有4個胺基酸殘基(一個在CDR3中且3個在FR3中)與E26.13不同。如與含有E26.13作為其抗IL-1β結構域之DVD3415相比較，含有E26.35作為其抗IL-1β結構域之DVD3418展現較高效力且具有更多生殖系序列。因此，選擇DVD3418進行進一步評估。
相應地，對DVD3418進行額外的調配測試。當在15mM組胺酸(pH 5.5)中調配時，100mg/ml劑量之DVD3418展現有利之物理化學特徵，包括溶解性、黏度及對冷凍解凍之穩定性。DVD-Ig之熔融(亦即，展開)起始溫度係使用差示掃描熱量測定(DSC)來量測。冷凍/解凍穩定性係藉由評估在四輪冷凍解凍之後高分子量(HMW)產物之增加百分比來量測。加速之穩定性係藉由量測在25℃及40℃下培育21-28天之後的單體損失來評估。DVD3418之物理化學特性概述於下表12中，且與每一特性之臨限值標準相比較(cP=厘泊，Ton=熔融溫度)。
表12中之資料顯示在熱應力(例如在40℃下培育21天)期間DVD-Ig無顯著變化，表明該DVD-Ig可調配為穩定的高濃度液體調配物，諸如10-20mM組胺酸(pH 5-6)(例如，15mM組胺酸，pH 5.5)。
儘管DVD3418與少數其他DVD-Ig(例如DVD1274、DVD1601、DVD1631及DVD1661)共有一致之抗IL-1β可變結構域(E26.35)及類似 之抗IL-17可變結構域(DVD3418中之B6-17G與其他中之B6-17之間僅一個胺基酸不同)，但DVD3418展現優良之溶解性及穩定性，而其他DVD-Ig或展現降低之宿主細胞表現量(例如DVD1661)，或展現不太優良之物理化學特性(例如DVD1274、1601、1631)(參看表13)。該等其他DVD-Ig均具有不同連接子序列，且連接子序列可影響DVD-Ig之物理化學特性，因為整體序列(包括可變結構域及連接子)決定了DVD-Ig分子之物理化學特性。
DVD3418對於靈長類動物IL-1β及IL-17之選擇性亦優於來自其他物種之抗原。DVD3418以與人類IL-1β相當之效力中和食蟹獼猴IL- 1β，以約不到100倍之效力中和兔IL-1β，以約不到1000倍之效力中和小鼠IL-1β，且在最高測試濃度500mM下無法中和大鼠IL-1β(參看表14)。如與人類IL-17相比較，DVD3418以在人類IL-17之2倍範圍內之IC50中和食蟹獼猴IL-17，以約不到50倍之效力中和兔IL-17，且以至少200倍效力中和大鼠及小鼠IL-17(參看表14)。
實例5：活體內測試
在大鼠及食蟹獼猴中測試DVD3418之半衰期及免疫原性。下表15中顯示了在向斯普拉道來大鼠靜脈內投與5mg/kg劑量之後的藥物動力學參數(t1/2=半衰期，Cmax=最大血清濃度，Vss=在穩態下之分佈體積，AUC=曲線下面積，CLp=血漿清除率，MRT=平均滯留時間)。DVD3418呈現長半衰期(約10天)、適度之CL(約0.37ml/h/kg)及較小Vss(約113ml/kg)。當測定該等平均值時，一隻動物因可能之ADA而忽略。
亦對食蟹獼猴靜脈內投與DVD-Ig，且在700小時時期內收集血清樣品。DVD3418展現約24天之長半衰期、0.06ml/h/kg之低清除率及約48ml/kg之較小Vss；未觀察到表觀ADA(抗藥物抗體)。基於此資料，約36天之預測人類半衰期指示，該DVD可適於每月給藥，無需其他延長半衰期之突變。
以上提及之若干DVD-Ig結合蛋白之重鏈及輕鏈序列提供於表16中。亦標識出用於製備結合蛋白之內部及外部可變結構域之親本抗體可變結構域。X1連接子序列係以粗體標識。
以引用之方式併入
在本申請案通篇引用的所有引用之參考文獻(包括文獻參考、專利、專利申請案及網頁)的內容以及其中引用之參考文獻均以全文引用之方式清楚地併入本文中用於任何目的。除非另作指示，否則本發明將採用免疫學、分子生物學及細胞生物學之習知技術，此為此項技術中熟知的。
本發明亦以全文引用之方式併入分子生物學及藥物遞送領域中 之熟知技術。該等技術包括(但不限於)以下出版物中所述之技術：Ausubel et al.(eds.),CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley & Sons,NY(1993)；Ausubel,F.M.et al.eds.,SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(4th Ed.1999)John Wiley & Sons,NY.(ISBN 0-471-32938-X)；CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY,DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984)；Giege,R.and Ducruix,A.Barrett,CRYSTALLIZATION OF NUCLEIC ACIDS AND PROTEINS,a Practical Approach,2nd ea.,pp.20 1-16,Oxford University Press,New York,New York,(1999)；Goodson,in MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE,vol.2,pp.115-138(1984)；Hammerling,et al.,in：MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)；Harlow et al.,ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Kabat et al.,SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)and(1991)；Kabat,E.A.,et al.(1991)SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242；Kontermann and Dubel eds.,ANTIBODY ENGINEERING(2001)Springer-Verlag.New York.790 pp.(ISBN 3-540-41354-5).
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等效物
本發明可在不偏離其精神或基本特徵之情況下以其他特定形式體現。因此，前述實施例應在所有方面視為說明性的而非限制本發明。由此，本發明之範疇係由隨附申請專利範圍而非前述說明指示，且因此在申請專利範圍之等效內容含義及範圍內的所有改編均意欲包含在本文中。
<110> 美商艾伯維有限公司
<120> 針對IL-1β及/或IL-17之雙特異性結合蛋白
<130> 12252.0157-00304
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Claims (78)

  1. 一種包含第一多肽鏈及第二多肽鏈之結合蛋白，該等多肽鏈各自獨立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1為第一可變結構域；VD2為第二可變結構域；C為恆定結構域；X1為連接子，其限制條件為其不為CH1；X2為存在或不存在之Fc區；n為0或1，其中在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上之該等VD1結構域形成第一功能性靶結合位點且在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上之該等VD2結構域形成第二功能性靶結合位點，且其中該結合蛋白能夠結合IL-1β及IL-17，其中(i)形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含：來自SEQ ID NO：34之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：35之CDR 1-3，來自SEQ ID NO：32之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：33之CDR 1-3，來自SEQ ID NO：36之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：37之CDR 1-3，來自SEQ ID NO：38之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：39之CDR 1-3，或來自SEQ ID NO：40之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：41之CDR 1-3；及/或 該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約5.1×10-11M之KD結合IL-1β，或能夠以如在IL-1β中和分析中所量測之至多約2.563nM之IC50抑制IL-1β，及/或(ii)形成針對IL-17之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含來自SEQ ID NO：44之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：45之CDR 1-3；來自SEQ ID NO：42之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：43之CDR 1-3；或來自SEQ ID NO：46之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：47之CDR 1-3；及/或該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約4.8×10-12M之KD結合IL-17，或能夠以如在IL-17中和分析中所量測之至多約1.7nM之IC50抑制IL-17。
  2. 一種包含第一多肽鏈及第二多肽鏈之結合蛋白，該等多肽鏈各自獨立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1為第一可變結構域；VD2為第二可變結構域；C為恆定結構域；X1為連接子，其限制條件為其不為CH1；X2為存在或不存在之Fc區；n為0或1，其中在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上之該等VD1結構域形成第一功能性靶結合位點且在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上之該等VD2結構域形成第二功能性靶結合位點，且其中該結合蛋白能夠結合IL-1β及IL-17，其中 (i)形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含選自由SEQ ID NO：32-41組成之群之序列，及/或該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約5.1×10-11M之KD結合IL-1β，或能夠以如在IL-1β中和分析中所量測之至多約2.563nM之IC50抑制IL-1β，及/或(ii)形成針對IL-17之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含選自由SEQ ID NO：42-47組成之群之序列，及/或該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約4.8×10-12M之KD結合IL-17，或能夠以如在IL-17中和分析中所量測之至多約1.7nM之IC50抑制IL-17。
  3. 如請求項1或2之結合蛋白，其中該第一多肽鏈包含第一VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1為第一重鏈可變結構域；VD2為第二重鏈可變結構域；C為重鏈恆定結構域；X1為連接子，其限制條件為其不為CH1；X2為存在或不存在之Fc區；n為0或1，且其中該第二多肽鏈包含第二VD1-(X1)n-VD2-C，其中VD1為第一輕鏈可變結構域；VD2為第二輕鏈可變結構域；C為輕鏈恆定結構域；X1為連接子，其限制條件為其不為CH1；n為0或1，其中在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上之該等VD1結構域形成第一功能性靶結合位點，且在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上 之該等VD2結構域形成第二功能性靶結合位點。
  4. 如請求項1至3中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白能夠結合IL-1β及IL-17，且其中(i)形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含：(1)SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33，(2)SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35，(3)SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：37，(4)SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39，或(5)SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：41；及/或(ii)形成針對IL-17之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含：(1)SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43，(2)SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45，或(3)SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47。
  5. 如請求項1至4中任一項之結合蛋白，其包含兩個第一多肽鏈及兩個第二多肽鏈，其中該結合蛋白包含四個功能性靶結合位點。
  6. 如請求項1至5中任一項之結合蛋白，其中X1為SEQ ID NO：1-31中任一者。
  7. 如請求項1至6中任一項之結合蛋白，其中X1不為CL。
  8. 如請求項1至7中任一項之結合蛋白，其中該Fc區為變體序列Fc區。
  9. 如請求項1至8中任一項之結合蛋白，其中該Fc區為來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD之Fc區。
  10. 如請求項1至9中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白為結晶結 合蛋白。
  11. 一種能夠結合IL-1β及IL-17之結合蛋白，其中該結合蛋白包含以下任一者：DVD2423(包含SEQ ID NO：48及49)；DVD2424(包含SEQ ID NO：50及51)；DVD2425(包含SEQ ID NO：52及53)；DVD2426(包含SEQ ID NO：54及55)；DVD2427(包含SEQ ID NO：56及57)；DVD2428(包含SEQ ID NO：58及59)；DVD2429(包含SEQ ID NO：60及61)；DVD2430(包含SEQ ID NO：62及63)；DVD2431(包含SEQ ID NO：64及65)；DVD2432(包含SEQ ID NO：66及67)；DVD2433(包含SEQ ID NO：68及69)；DVD2434(包含SEQ ID NO：70及71)；DVD2435(包含SEQ ID NO：72及73)；DVD2436(包含SEQ ID NO：74及75)；DVD2437(包含SEQ ID NO：76及77)；DVD2438(包含SEQ ID NO：78及79)；DVD2439(包含SEQ ID NO：80及81)；DVD2440(包含SEQ ID NO：82及83)；DVD2441(包含SEQ ID NO：84及85)；DVD2442(包含SEQ ID NO：86及87)；DVD3410(包含SEQ ID NO：88及89)；DVD3411(包含SEQ ID NO：90及91)；DVD3412(包含SEQ ID NO：92及93)；DVD3413(包含SEQ ID NO：94及95)；DVD3414(包含SEQ ID NO：96及97)；DVD3415(包含SEQ ID NO：98及99)；DVD3416(包含SEQ ID NO：100及101)；DVD3417(包含SEQ ID NO：102及103)；DVD3418(包含SEQ ID NO：104及105)；DVD3419(包含SEQ ID NO：106及107)；DVD3420(包含SEQ ID NO：108及109)；DVD3421(包含SEQ ID NO：110及111)；DVD3422(包含SEQ ID NO：112及113)；DVD3423(包含SEQ ID NO：114及115)；DVD3424(包含SEQ ID NO：116及117)；及DVD3425(包含SEQ ID NO：118及119)。
  12. 一種結合蛋白結合物，其包含如請求項1至11中任一項之結合蛋 白，該結合蛋白結合物進一步包含免疫黏附分子、顯影劑、治療劑或細胞毒性劑。
  13. 如請求項12之結合蛋白結合物，其中該顯影劑為放射性標記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記或生物素。
  14. 如請求項13之結合蛋白結合物，其中該放射性標記為3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
  15. 如請求項12之結合蛋白結合物，其中該治療劑或細胞毒性劑為抗代謝物、烷基化劑、抗生素、生長因子、細胞激素、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環黴素、毒素或細胞凋亡劑。
  16. 一種分離之核酸，其編碼如請求項1至11中任一項之結合蛋白胺基酸序列。
  17. 一種載體，其包含如請求項16之分離之核酸。
  18. 如請求項17之載體，其中該載體為pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO、pEF6、pHybE、TOPO或pBJ。
  19. 一種宿主細胞，其包含如請求項17之載體。
  20. 如請求項19之宿主細胞，其中該宿主細胞為原核細胞、大腸桿菌、真核細胞、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、Sf9細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、昆蟲細胞、CHO細胞或COS細胞。
  21. 一種產生結合蛋白之方法，其包含在培養基中在足以產生該結合蛋白之條件下培養如請求項19或20之宿主細胞。
  22. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至11中任一項之結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
  23. 如請求項22之醫藥組合物，其進一步包含至少一種其他治療 劑。
  24. 如請求項23之醫藥組合物，其中該其他治療劑為顯影劑、細胞毒性劑、血管生成抑制劑、激酶抑制劑、共刺激分子阻斷劑、黏附分子阻斷劑、抗細胞激素抗體或其功能片段、甲胺喋呤(methotrexate)、環孢素(cyclosporin)、雷帕黴素(rapamycin)、FK506、可偵測標記或報導子、TNF拮抗劑、抗風濕藥、肌肉鬆弛劑、麻醉藥、非類固醇消炎藥(NSAID)、鎮痛劑、麻醉劑、鎮定劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、牛皮癬藥、皮質類固醇、同化類固醇、紅血球生成素、免疫接種、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素代用藥、放射性藥品、抗抑鬱劑、抗精神病藥、刺激劑、哮喘藥物、β促效劑、吸入性類固醇、腎上腺素或類似物、細胞激素或細胞激素拮抗劑。
  25. 一種治療個體之疾病或病症的方法，其係藉由向該個體投與如請求項1至11中任一項之結合蛋白來進行。
  26. 如請求項25之方法，其中該病症為關節炎；骨關節炎；青少年慢性關節炎；敗血性關節炎；萊姆關節炎(Lyme arthritis)；牛皮癬性關節炎；反應性關節炎；脊柱關節病；全身性紅斑性狼瘡症；克羅恩氏病(Crohn's disease)；潰瘍性結腸炎；發炎性腸病；胰島素依賴性糖尿病；甲狀腺炎；哮喘；過敏性疾病；牛皮癬；皮炎；硬皮病；移植物抗宿主疾病；器官移植排斥反應；與器官移植有關之急性或慢性免疫疾病；類肉瘤病；動脈粥樣硬化；散播性血管內凝血；川崎氏病(Kawasaki's disease)；葛瑞夫茲氏病(Grave's disease)；腎病症候群；慢性疲勞症候群；韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)；亨偌-絲奇恩賴紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)；腎顯微性血管炎；慢性活 動性肝炎；葡萄膜炎；敗血性休克；中毒休克症候群；敗血病症候群；惡病質；感染性疾病；寄生蟲病；急性橫貫性脊髓炎；亨爾頓氏舞蹈病(Huntington's chorea)；帕金森氏病(Parkinson's disease)；阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)；中風；原發性膽汁性肝硬化；溶血性貧血；惡性疾病；心臟衰竭；心肌梗塞；阿狄孫氏病(Addison's disease)；偶發性I型多腺體分泌不足症及II型多腺體分泌不足症；史米特氏症候群(Schmidt's syndrome)；成人(急性)呼吸窘迫症候群；禿頭症；斑禿；血清陰性關節病；關節病；瑞特氏病(Reiter's disease)；牛皮癬性關節病；潰瘍性結腸炎性關節病；腸病性滑膜炎；衣原體、耶爾森菌及沙門氏菌相關性關節病；脊柱關節病；動脈粥樣化疾病/動脈硬化症；異位性過敏症；自體免疫性水皰病；尋常天疱瘡；落葉型天疱瘡；類天疱瘡；線性IgA疾病；自體免疫性溶血性貧血；庫姆氏陽性溶血性貧血(Coombs positive haemolytic anaemia)；後天性惡性貧血；青少年惡性貧血；肌痛性腦炎/皇家自由疾病(Royal Free Disease)；慢性皮膚黏膜念珠菌病；巨細胞動脈炎；原發性硬化性肝炎；隱原性自體免疫性肝炎；後天免疫缺乏症候群；後天免疫缺乏相關疾病；B型肝炎；C型肝炎；一般變異性免疫缺乏症(一般變異性低丙種球蛋白血症)；擴張型心肌症；女性不孕；卵巢功能衰竭；卵巢早衰；纖維性肺病；隱原性纖維化肺泡炎；發炎後間質性肺病；間質性肺炎；結締組織疾病相關性間質性肺病；混合型結締組織疾病相關性肺病；全身性硬化症相關性間質性肺病；類風濕性關節炎相關性間質性肺病；全身性紅斑性狼瘡症相關性肺病；皮肌炎/多肌炎相關性肺病；休格連氏病相關性肺病(Sjögren's disease associated lung disease)；僵直性脊椎炎相關性肺病；血管炎性擴 散性肺病；血鐵黃素沈積症相關性肺病；藥物誘發之間質性肺病；纖維化；放射性纖維化；阻塞性細支氣管炎；慢性嗜伊紅血球性肺炎；淋巴細胞性浸潤性肺病；感染後間質性肺病；痛風性關節炎；自體免疫性肝炎；1型自體免疫性肝炎(經典自體免疫性肝炎或類狼瘡性肝炎)；2型自體免疫性肝炎(抗LKM抗體肝炎)；自體免疫介導之低血糖症；伴發黑棘皮病之B型胰島素抗性；副甲狀腺低能症；與器官移植有關之急性免疫疾病；與器官移植有關之慢性免疫疾病；骨性關節病；原發性硬化性膽管炎；1型牛皮癬；2型牛皮癬；特發性白細胞減少症；自體免疫性嗜中性球減少症；腎病NOS；絲球體腎炎；腎顯微性血管炎；萊姆病(lyme disease)；盤狀紅斑狼瘡；特發性或NOS男性不育；精液自體免疫性；多發性硬化(所有亞型)；交感性眼炎；因結締組織疾病繼發之肺高血壓；古巴士德氏症候群(Goodpasture's syndrome)；結節性多動脈炎之肺表現；急性風濕熱；類風濕性脊椎炎；斯蒂爾氏病(Still's disease)；全身性硬化症；休格連氏症候群；高安氏病(Takayasu's disease)/動脈炎；自體免疫性血小板減少症；特發性血小板減少症；自體免疫性甲狀腺病；甲狀腺機能亢進；甲狀腺腫性自體免疫性甲狀腺低能症(橋本氏病(Hashimoto's disease))；萎縮性自體免疫性甲狀腺低能症；原發性黏液水腫；晶狀體性葡萄膜炎；原發性血管炎；白斑症；急性肝病；慢性肝病；酒精性肝硬化；酒精誘發之肝損傷；膽汁淤積；特異性肝病；藥物誘發之肝炎；非酒精性脂肪變性肝炎；過敏症及哮喘；B群鏈球菌(GBS)感染；精神障礙(例如抑鬱及精神分裂症)；Th2型及Th1型介導之疾病；急性及慢性疼痛(不同形式之疼痛)；及癌症，諸如肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、胰臟癌、卵巢癌、前列腺癌及直腸癌，及血液科惡性疾 病(白血病及淋巴瘤)；無β脂蛋白血症；凍瘡；急性及慢性寄生蟲或感染過程；急性白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；急性骨髓白血病(AML)；急性或慢性細菌感染；急性胰臟炎；急性腎衰竭；腺癌；心房異位搏動；AIDS癡呆複合症；酒精誘發之肝炎；過敏性結膜炎；過敏性接觸性皮炎；過敏性鼻炎；同種異體移植排斥反應；α-1-抗胰蛋白酶缺乏；肌萎縮性側索硬化；貧血；心絞痛；前角細胞變性；抗cd3療法；抗磷脂症候群；抗受體過敏反應；主動脈瘤及周圍動脈瘤；主動脈剝離；動脈性高血壓；動脈硬化症；動靜脈瘻；共濟失調；心房微顫(持續性或陣發性)；心房撲動；房室傳導阻滯；B細胞淋巴瘤；骨骼移植物排斥反應；骨髓移植(BMT)排斥反應；束支傳導阻滯；伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)；燒傷；心律不整；心臟頓抑症候群；心臟腫瘤；心肌症；心肺繞道發炎反應；軟骨移植排斥反應；小腦皮層變性；小腦病症；紊亂性或多源性房性心動過速；化學療法相關性病症；慢性骨髓性白血病(CML)；慢性酒精中毒；慢性發炎性病變；慢性淋巴球性白血病(CLL)；慢性阻塞性肺病(COPD)；慢性水楊酸鹽中毒；結腸直腸癌；充血性心臟衰竭；結膜炎；接觸性皮炎；肺原性心臟病；冠狀動脈疾病；伊茨費爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)；培養陰性敗血病；囊腫性纖維化；細胞激素療法相關性病症；拳擊手癡呆；脫髓鞘疾病；出血性登革熱；皮炎；皮膚病狀；糖尿病(diabete)；糖尿病(diabetes mellitus)；糖尿病性動脈硬化性疾病；泛發性路易體疾病(Diffuse Lewy body disease)；擴張型充血性心肌症；基底神經結之病症；中年型唐氏症候群(Down's Syndrome in middle age)；由阻斷CNS多巴胺受體之藥物誘發的藥物誘發性運動障礙；藥物敏感；濕疹；腦脊髓炎；心內膜 炎；內分泌病；會厭炎；艾伯斯坦-巴爾病毒感染(epstein-barr virus infection)；肢端紅痛症；錐體外及小腦病症；家族性噬血淋巴組織細胞瘤病；胎兒胸腺植入排斥反應；弗里德賴希氏共濟失調(Friedreich's ataxia)；功能性周圍動脈疾病；真菌性敗血病；氣疽；胃潰瘍；任何器官或組織之移植物排斥反應；革蘭氏陰性敗血病；革蘭氏陽性敗血病；由細胞內生物體引起之肉芽瘤；毛細胞白血病；哈勒沃登-斯帕特茲病(Hallerrorden-Spatz disease)；橋本氏甲狀腺炎；枯草熱；心臟移植排斥反應；血色素沉著病；血液透析；溶血性尿毒症症候群/血栓性血小板減少性紫癜；出血；A型肝炎；希氏束心律不整(His bundle arryhthmias)；HIV感染/HIV神經病；霍奇金氏病(Hodgkin's disease)；過動性運動障礙；過敏反應；過敏性肺炎；高血壓；少動性運動障礙；下丘腦-垂體-腎上腺軸評估；特發性阿狄孫氏病；特發性肺部纖維化；抗體介導之細胞毒性；無力；嬰兒脊髓性肌萎縮；主動脈炎症；a型流感；電離輻射曝露；虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎；缺血再灌注損傷；缺血性中風；青少年類風濕性關節炎；青少年脊髓性肌萎縮；卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)；腎移植排斥反應；退伍軍人症；利什曼體病(leishmaniasis)；麻瘋；皮質脊髓系統病變；脂性水腫；肝移植排斥反應；淋巴水腫；瘧疾；惡性淋巴瘤；惡性組織細胞增多病；惡性黑素瘤；腦膜炎；腦膜炎球菌血症；代謝性/特發性偏頭痛；粒線體多系統病症；混合性結締組織疾病；單株γ-球蛋白病；多發性骨髓瘤；多系統退化(曼氏(Mencel)、德傑林-托馬斯(Dejerine-Thomas)、夏伊-德雷格(Shy-Drager)及馬查多-約瑟夫(Machado-Joseph))；重症肌無力；細胞內禽結核桿菌病；結核分枝桿菌病；骨髓發育不良症候群；心肌缺血症；鼻咽癌；新生 兒慢性肺部疾病；腎炎；腎病；神經退化性疾病；神經原性肌萎縮；發燒性嗜中性白血球低下症；非霍奇金氏淋巴瘤；腹主動脈及其分支閉塞；閉塞性動脈症；okt3療法；睾丸炎/附睾炎；睾丸炎/輸精管復通術；內臟增大；骨質疏鬆症；胰臟移植排斥反應；胰臟癌；腫瘤相關症候群/惡性血鈣過多；副甲狀腺移植排斥反應；盆腔炎；季節性鼻炎；心包疾病；周圍動脈粥樣硬化疾病；周圍血管病症；腹膜炎；惡性貧血；卡氏肺囊蟲肺炎；肺炎；POEMS症候群(多發性神經病、內臟增大、內分泌病、單株γ-球蛋白病及皮膚變化症候群)；灌注後症候群；泵後症候群；MI心切開術後症候群；子癇前症；進行性核上麻痺；原發性肺高血壓；輻射療法；雷諾氏症候群(Raynaud's phenomenon)及疾病；雷諾氏病；雷夫蘇姆氏病(Refsum's disease)；規則性QRS波狹窄型心動過速；腎血管性高血壓；再灌注損傷；窄縮性心肌症；肉瘤；硬皮病；老年性舞蹈病；路易體型老年癡呆；血清陰性關節病；休克；鐮形細胞性貧血；皮膚同種異體移植排斥反應；皮膚變化症候群；小腸移植排斥反應；實體腫瘤；特異性心律不整；脊髓共濟失調；脊髓小腦退化症；鏈球菌肌炎；小腦結構病變；亞急性硬化性全腦炎；暈厥；心血管系統梅毒；全身性過敏反應；全身性發炎性反應症候群；全身發作型青少年類風濕性關節炎；T細胞或FAB ALL；毛細管擴張症；血栓閉塞性脈管炎；血小板減少症；中毒；移植；外傷/出血；III型過敏反應；IV型過敏；不穩定型心絞痛；尿毒症；尿路敗血症；蕁痳疹；心臟瓣膜病；靜脈曲張；血管炎；靜脈疾病；靜脈栓塞；心室纖維性顫動；病毒及真菌感染；病毒性腦炎/無菌性腦膜炎；病毒相關吞噬血細胞症候群；韋尼克-科爾薩科夫症候群；韋爾森氏病(Wilson's disease)；任何器官或組織之異種移植物排斥反應；急性冠狀動脈症候群；急性特發性多神經炎；急性發炎性脫髓鞘多神經根神經病變；急性缺血；成人斯蒂爾氏病；全身性過敏反應；抗磷脂抗體症候群；再生不全性貧血；異位性濕疹；異位性皮炎；自體免疫性皮炎；與鏈球菌感染相關之自體免疫病症；自體免疫性腸病；自體免疫性聽力喪失；自體免疫性淋巴細胞增殖症候群(ALPS)；自體免疫性心肌炎；自體免疫性卵巢早衰；瞼緣炎；支氣管擴張症；大皰性類天疱瘡；心血管疾病；災難性抗磷脂症候群；乳糜瀉；頸椎關節黏連；慢性缺血；瘢痕性類天疱瘡；伴以多發性硬化症風險之單一臨床症狀(cis)；兒童期發作之精神病症；淚囊炎；皮肌炎；糖尿病性視網膜病變；椎間盤突出症；椎間盤下垂；藥物誘發之免疫溶血性貧血；子宮內膜異位；眼內炎；上鞏膜炎；多形性紅斑；重症多形性紅斑；妊娠性類天疱瘡；格林-巴利症候群(Guillain-Barré syndrome，GBS)；枯草熱；休斯症候群；特發性帕金森氏病；特發性間質性肺炎；IgE介導之過敏症；免疫溶血性貧血；包涵體肌炎；感染性眼部發炎性疾病；發炎性脫髓鞘疾病；發炎性心臟病；發炎性腎病；IPF/UIP；虹膜炎；角膜炎；乾燥性角膜結膜炎；庫斯毛爾病(Kussmaul disease)或庫斯毛爾-梅爾氏病(Kussmaul-Meier disease)；蘭德里氏癱瘓(Landry's paralysis)；蘭格罕氏細胞組織球增生症(Langerhan's cell histiocytosis)；網狀青斑；黃斑變性；顯微鏡下多血管炎；白赫鐵列夫症(morbus bechterev)；運動神經元病症；黏膜類天疱瘡；多重器官衰竭；骨髓發育不良症候群；心肌炎；神經根病症；神經病；非A非B型肝炎；視神經炎；骨質溶解；卵巢癌；少關節性JRA；周圍動脈閉塞性疾病(PAOD)；周圍血管疾病(PVD)；周圍動脈疾病 (PAD)；靜脈炎；結節性多動脈炎(或結節性動脈周圍炎)；多軟骨炎；風濕性多肌痛；白髮症；多關節性JRA；多內分泌缺陷症候群；多發性肌炎；泵後症候群；原發性帕金森氏症；前列腺及直腸癌以及血液科惡性疾病(白血病及淋巴瘤)；前列腺炎；單純紅血球發育不全；原發性腎上腺機能不全；復發性視神經脊髓炎；再狹窄；風濕性心臟病；sapho(滑膜炎、痤瘡、膿皰病、骨肥厚及骨炎)；硬皮病；繼發性澱粉樣變性；休克肺；鞏膜炎；坐骨神經痛；繼發性腎上腺機能不全；聚矽氧相關性結締組織疾病；史奈頓-威爾金森皮膚病(sneddon-wilkinson dermatosis)；僵直性脊椎炎；史蒂文斯-瓊森症候群(Stevens-Johnson syndrome，SJS)；全身性發炎性反應症候群；顳動脈炎；弓形蟲性視網膜炎；中毒性表皮壞死鬆解症；橫貫性脊髓炎；TRAPS(腫瘤壞死因子受體)、1型過敏反應；II型糖尿病；尋常型間質性肺炎(UIP)；春季結膜炎；病毒性視網膜炎；小柳原田症候群(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome，VKH症候群)；濕性黃斑變性；或創傷癒合。
  27. 如請求項25或26之方法，其中該結合蛋白經調配用於非經腸、皮下、肌肉內、靜脈內、關節內、支氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、大腸內、子宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊椎內、滑膜內、胸腔內、子宮內、膀胱內、快速注射、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內或經皮投藥。
  28. 一種藉由免疫分析測定測試樣品中至少一個靶或其片段之存在、量或濃度的方法，其中該免疫分析包含使該測試樣品與至少一種結合蛋白及至 少一個可偵測標記接觸，且其中該至少一種結合蛋白包含如請求項1至11中任一項之結合蛋白。
  29. 如請求項28之方法，其進一步包含：(i)使該測試樣品與該至少一種結合蛋白接觸，其中該結合蛋白結合於該靶或其片段上之抗原決定基，從而形成第一複合物；(ii)使該複合物與該至少一個可偵測標記接觸，其中該可偵測標記結合於該結合蛋白或在該靶或其片段上之未結合該結合蛋白之抗原決定基，從而形成第二複合物；及(iii)基於該第二複合物中該可偵測標記所產生之信號，偵測該測試樣品中該靶或其片段之存在、量或濃度，其中該靶或其片段之存在、量或濃度與該可偵測標記產生之信號直接相關。
  30. 如請求項28之方法，其進一步包含：(i)使該測試樣品與該至少一種結合蛋白接觸，其中該結合蛋白結合於該靶或其片段上之抗原決定基，從而形成第一複合物；(ii)使該複合物與該至少一個可偵測標記接觸，其中該可偵測標記與該靶或其片段競爭結合於該結合蛋白，從而形成第二複合物；及(iii)基於該第二複合物中該可偵測標記所產生之信號，偵測該測試樣品中該靶或其片段之存在、量或濃度，其中該靶或其片段之存在、量或濃度與該可偵測標記產生之信號間接相關。
  31. 如請求項28之方法，其中該測試樣品係來自患者，且該方法進一步包含診斷、預測或評估該患者之治療性/預防性治療之功效，且 其中若該方法進一步包含評估該患者之治療性/預防性治療之功效，則該方法進一步包含根據需要改進該患者之治療性/預防性治療以改善功效。
  32. 如請求項28之方法，其中該方法經改編以用於自動化系統或半自動化系統中。
  33. 如請求項28之方法，其中該測試樣品係來自患者且該方法確定該樣品中超過一個靶之存在、量或濃度。
  34. 一種用於對測試樣品分析該樣品中靶或其片段之存在、量或濃度之套組，該套組包含(a)有關分析該測試樣品中該靶或其片段之說明書，及(b)至少一種包含如請求項1至11中任一項之結合蛋白的結合蛋白。
  35. 一種包含第一多肽鏈及第二多肽鏈之結合蛋白，該等多肽鏈各自獨立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1為第一可變結構域；VD2為第二可變結構域；C為恆定結構域；X1為連接子；X2為存在或不存在之Fc區；且n為0或1；其中在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上之該等VD1結構域形成第一功能性靶結合位點且在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上之該等VD2結構域形成第二功能性靶結合位點，且其中該結合蛋白能夠結合IL-1β及IL-17，其中(i)形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含選自由SEQ ID NO：32-41組成之群之序列；且 (ii)形成針對IL-17之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含選自由SEQ ID NO：42-47組成之群之序列。
  36. 一種包含第一多肽鏈及第二多肽鏈之結合蛋白，該等多肽鏈各自獨立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1為第一可變結構域；VD2為第二可變結構域；C為恆定結構域；X1為連接子；X2為存在或不存在之Fc區；n為0或1，其中在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上之該等VD1結構域形成第一功能性靶結合位點且在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上之該等VD2結構域形成第二功能性靶結合位點，且其中該結合蛋白能夠結合IL-1β及IL-17，其中(i)形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含：來自SEQ ID NO：32之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：33之CDR 1-3，來自SEQ ID NO：34之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：35之CDR 1-3，來自SEQ ID NO：36之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：37之CDR 1-3，來自SEQ ID NO：38之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：39之CDR 1-3，或來自SEQ ID NO：40之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：41之CDR 1-3， 及/或(ii)形成針對IL-17之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含來自SEQ ID NO：42之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：43之CDR 1-3，來自SEQ ID NO：44之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：45之CDR 1-3，或來自SEQ ID NO：46之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：47之CDR 1-3。
  37. 如請求項35或36之結合蛋白，其中該第一多肽鏈包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1為第一重鏈可變結構域；VD2為第二重鏈可變結構域；C為重鏈恆定結構域；X1為連接子；X2為存在或不存在之Fc區；n為0或1，且其中該第二多肽鏈包含VD1-(X1)n-VD2-C，其中VD1為第一輕鏈可變結構域；VD2為第二輕鏈可變結構域；C為輕鏈恆定結構域；X1為連接子；n為0或1，其中在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上之該等VD1結構域形成第一功能性靶結合位點，且在該第一多肽鏈及該第二多肽鏈上之該等VD2結構域形成第二功能性靶結合位點。
  38. 如請求項35至37中任一項之結合蛋白，其中 (i)該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約5.1×10-11M之KD結合IL-1β，或能夠以如在IL-1β中和分析中所量測之至多約2.563nM之IC50抑制IL-1β，及/或(ii)該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約4.8×10-12M之KD結合IL-17，或能夠以如在IL-17中和分析中所量測之至多約1.7nM之IC50抑制IL-17。
  39. 如請求項35至38中任一項之結合蛋白，其中(i)形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含：(1)SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33，(2)SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35，(3)SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：37，(4)SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39，或(5)SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：41；且(ii)形成針對IL-17之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含：(1)SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43，(2)SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45，或(3)SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47。
  40. 如請求項35至39中任一項之結合蛋白，其包含兩個第一多肽鏈及兩個第二多肽鏈以及四個功能性靶結合位點。
  41. 如請求項35至40中任一項之結合蛋白，其中X1為SEQ ID NO：1-31中任一者。
  42. 如請求項35至41中任一項之結合蛋白，其中X1不為CH1或CL。
  43. 如請求項35至42中任一項之結合蛋白，其中該Fc區為變體序列 Fc區，及/或其中該Fc區為來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD之Fc區。
  44. 如請求項35至43中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白包含(a)重鏈恆定區，其包含(i)野生型人類IgG1重鏈序列，或(ii)藉由一或多個胺基酸改變進行修飾之人類IgG1重鏈序列，視情況其中該等改變包含在該恆定區序列之胺基酸位置234及235處之取代，視情況其中該等改變包含在位置234及235處白胺酸經丙胺酸取代；及/或(b)輕鏈恆定區，其包含(i)野生型人類κ輕鏈恆定區序列，或(ii)野生型人類λ輕鏈恆定區序列。
  45. 如請求項35至10中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白為結晶結合蛋白。
  46. 如請求項35至45中任一項之結合蛋白，其中(i)形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含來自SEQ ID NO：32之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：33之CDR 1-3，且(ii)形成針對IL-17之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含來自SEQ ID NO：44之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：45之CDR 1-3。
  47. 如請求項46之結合蛋白，其中(i)形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33， 且(ii)形成針對IL-17之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45。
  48. 如請求項46或47之結合蛋白，其中在一條多肽鏈上之X1包含SEQ ID NO：29且在另一條多肽鏈上之X1包含SEQ ID NO：30。
  49. 如請求項46至48中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白包含DVD3415(含有包含SEQ ID NO：98及99之第一多肽鏈及第二多肽鏈)。
  50. 如請求項46至49中任一項之結合蛋白，其中：(i)該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約5.1×10-11M之KD結合IL-1β，或能夠以如在IL-1β中和分析中所量測之至多約0.027nM之IC50抑制IL-1β，及/或(ii)該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約4.8×10-12M之KD結合IL-17，或能夠以如在IL-17中和分析中所量測之至多約0.091nM之IC50抑制IL-17。
  51. 如請求項35至45中任一項之結合蛋白，其中(i)形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含來自SEQ ID NO：34之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：35之CDR 1-3，且(ii)形成針對IL-17之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含來自SEQ ID NO：44之CDR 1-3及來自SEQ ID NO：45之CDR 1-3。
  52. 如請求項51之結合蛋白，其中(i)形成針對IL-1β之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35， 且(ii)形成針對IL-17之功能性靶結合位點之該等可變結構域包含SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45。
  53. 如請求項51或52之結合蛋白，其中在一條多肽鏈上之X1包含SEQ ID NO：29且在另一條多肽鏈上之X1包含SEQ ID NO：30。
  54. 如請求項51至53中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白包含DVD3418(含有包含SEQ ID NO：104及105之第一多肽鏈及第二多肽鏈)。
  55. 如請求項51至54中任一項之結合蛋白，其中：(i)該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約3.4×10-11M之KD結合IL-1β，或能夠以如在IL-1β中和分析中所量測之至多約0.018nM之IC50抑制IL-1β，及/或(ii)該結合蛋白能夠以如藉由表面電漿子共振所量測之至多約4.8×10-12M之KD結合IL-17，或能夠以如在IL-17中和分析中所量測之至多約0.068nM之IC50抑制IL-17。
  56. 一種能夠結合IL-1β及IL-17之結合蛋白，其中該結合蛋白包含以下任一者：DVD2423(包含SEQ ID NO：48及49)；DVD2424(包含SEQ ID NO：50及51)；DVD2425(包含SEQ ID NO：52及53)；DVD2426(包含SEQ ID NO：54及55)；DVD2427(包含SEQ ID NO：56及57)；DVD2428(包含SEQ ID NO：58及59)；DVD2429(包含SEQ ID NO：60及61)；DVD2430(包含SEQ ID NO：62及63)；DVD2431(包含SEQ ID NO：64及65)； DVD2432(包含SEQ ID NO：66及67)；DVD2433(包含SEQ ID NO：68及69)；DVD2434(包含SEQ ID NO：70及71)；DVD2435(包含SEQ ID NO：72及73)；DVD2436(包含SEQ ID NO：74及75)；DVD2437(包含SEQ ID NO：76及77)；DVD2438(包含SEQ ID NO：78及79)；DVD2439(包含SEQ ID NO：80及81)；DVD2440(包含SEQ ID NO：82及83)；DVD2441(包含SEQ ID NO：84及85)；DVD2442(包含SEQ ID NO：86及87)；DVD3410(包含SEQ ID NO：88及89)；DVD3411(包含SEQ ID NO：90及91)；DVD3412(包含SEQ ID NO：92及93)；DVD3413(包含SEQ ID NO：94及95)；DVD3414(包含SEQ ID NO：96及97)；DVD3415(包含SEQ ID NO：98及99)；DVD3416(包含SEQ ID NO：100及101)；DVD3417(包含SEQ ID NO：102及103)；DVD3418(包含SEQ ID NO：104及105)；DVD3419(包含SEQ ID NO：106及107)；DVD3420(包含SEQ ID NO：108及109)；DVD3421(包含SEQ ID NO：110及111)；DVD3422(包含SEQ ID NO：112及113)；DVD3423(包含SEQ ID NO：114及115)；DVD3424(包含SEQ ID NO：116及117)；及 DVD3425(包含SEQ ID NO：118及119)。
  57. 一種結合蛋白結合物，其包含如請求項35至56中任一項之結合蛋白，該結合蛋白結合物進一步包含免疫黏附分子、顯影劑、治療劑或細胞毒性劑。
  58. 如請求項57之結合蛋白結合物，其中該顯影劑為放射性標記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記或生物素。
  59. 如請求項58之結合蛋白結合物，其中該放射性標記為3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
  60. 如請求項57之結合蛋白結合物，其中該治療劑或細胞毒性劑為抗代謝物、烷基化劑、抗生素、生長因子、細胞激素、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環黴素、毒素或細胞凋亡劑。
  61. 一種分離之核酸，其編碼如請求項35至56中任一項之結合蛋白胺基酸序列。
  62. 一種載體，其包含如請求項61之分離之核酸。
  63. 如請求項62之載體，其中該載體包含pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO、pEF6、pHybE、TOPO或pBJ。
  64. 一種宿主細胞，其包含如請求項62或63之載體。
  65. 如請求項64之宿主細胞，其中該宿主細胞為原核細胞、大腸桿菌、真核細胞、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、Sf9細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、昆蟲細胞、CHO細胞或COS細胞。
  66. 一種產生結合蛋白之方法，其包含在培養基中在足以產生該結合蛋白之條件下培養如請求項64或65之宿主細胞。
  67. 一種醫藥組合物，其包含如請求項35至56中任一項之結合蛋白 及醫藥學上可接受之載劑。
  68. 如請求項67之醫藥組合物，其進一步包含至少一種其他治療劑。
  69. 如請求項68之醫藥組合物，其中該其他治療劑為顯影劑、細胞毒性劑、血管生成抑制劑、激酶抑制劑、共刺激分子阻斷劑、黏附分子阻斷劑、抗細胞激素抗體或其功能片段、甲胺喋呤、環孢素、雷帕黴素、FK506、可偵測標記或報導子、TNF拮抗劑、抗風濕藥、肌肉鬆弛劑、麻醉藥、非類固醇消炎藥(NSAID)、鎮痛劑、麻醉劑、鎮定劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、牛皮癬藥、皮質類固醇、同化類固醇、紅血球生成素、免疫接種、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素代用藥、放射性藥品、抗抑鬱劑、抗精神病藥、刺激劑、哮喘藥物、β促效劑、吸入性類固醇、腎上腺素或類似物、細胞激素或細胞激素拮抗劑。
  70. 一種治療個體之疾病或病症的方法，其係藉由向該個體投與如請求項35至56中任一項之結合蛋白來進行。
  71. 如請求項70之方法，其中該病症為關節炎；骨關節炎；青少年慢性關節炎；敗血性關節炎；萊姆關節炎；牛皮癬性關節炎；反應性關節炎；脊柱關節病；全身性紅斑性狼瘡症；克羅恩氏病；潰瘍性結腸炎；發炎性腸病；胰島素依賴性糖尿病；甲狀腺炎；哮喘；過敏性疾病；牛皮癬；皮炎；硬皮病；移植物抗宿主疾病；器官移植排斥；與器官移植有關之急性或慢性免疫疾病；類肉瘤病；動脈粥樣硬化；散播性血管內凝血；川崎氏病；葛瑞夫茲氏病；腎病症候群；慢性疲勞症候群；韋格納氏肉芽腫病；亨偌-絲奇恩賴紫癜；腎顯微性血管炎；慢性活動性肝炎；葡萄膜炎；敗血性休克；中毒休克症候群；敗血病症候 群；惡病質；感染性疾病；寄生蟲病；急性橫貫性脊髓炎；亨爾頓氏舞蹈病；帕金森氏病；阿茲海默氏病；中風；原發性膽汁性肝硬化；溶血性貧血；惡性疾病；心臟衰竭；心肌梗塞；阿狄孫氏病；偶發性I型多腺體分泌不足症及II型多腺體分泌不足症；史米特氏症候群；成人(急性)呼吸窘迫症候群；禿頭症；斑禿；血清陰性關節病；關節病；瑞特氏病；牛皮癬性關節病；潰瘍性結腸炎性關節病；腸病性滑膜炎；衣原體、耶爾森菌及沙門氏菌相關性關節病；脊柱關節病；動脈粥樣化疾病/動脈硬化症；異位性過敏症；自體免疫性水皰病；尋常天疱瘡；落葉型天疱瘡；類天疱瘡；線性IgA疾病；自體免疫性溶血性貧血；庫姆氏陽性溶血性貧血；後天性惡性貧血；青少年惡性貧血；肌痛性腦炎/皇家自由疾病；慢性皮膚黏膜念珠菌病；巨細胞動脈炎；原發性硬化性肝炎；隱原性自體免疫性肝炎；後天免疫缺乏症候群；後天免疫缺乏相關疾病；B型肝炎；C型肝炎；一般變異性免疫缺乏症(一般變異性低丙種球蛋白血症)；擴張型心肌症；女性不孕；卵巢功能衰竭；卵巢早衰；纖維性肺病；隱原性纖維化肺泡炎；發炎後間質性肺病；間質性肺炎；結締組織疾病相關性間質性肺病；混合型結締組織疾病相關性肺病；全身性硬化症相關性間質性肺病；類風濕性關節炎相關性間質性肺病；全身性紅斑性狼瘡症相關性肺病；皮肌炎/多肌炎相關性肺病；休格連氏病相關性肺病；僵直性脊椎炎相關性肺病；血管炎性擴散性肺病；血鐵黃素沈積症相關性肺病；藥物誘發之間質性肺病；纖維化；放射性纖維化；阻塞性細支氣管炎；慢性嗜伊紅血球性肺炎；淋巴細胞性浸潤性肺病；感染後間質性肺病；痛風性關節炎；自體免疫性肝炎；1型自體免疫性肝炎(經典自體免疫性肝炎或類狼瘡性肝炎)；2型自體免疫性 肝炎(抗LKM抗體肝炎)；自體免疫介導之低血糖症；伴發黑棘皮病之B型胰島素抗性；副甲狀腺低能症；與器官移植有關之急性免疫疾病；與器官移植有關之慢性免疫疾病；骨性關節病；原發性硬化性膽管炎；1型牛皮癬；2型牛皮癬；特發性白細胞減少症；自體免疫性嗜中性球減少症；腎病NOS；絲球體腎炎；腎顯微性血管炎；萊姆病；盤狀紅斑狼瘡；特發性或NOS男性不育；精液自體免疫性；多發性硬化(所有亞型)；交感性眼炎；因結締組織疾病繼發之肺高血壓；古巴士德氏症候群；結節性多動脈炎之肺表現；急性風濕熱；類風濕性脊椎炎；斯蒂爾氏病；全身性硬化症；休格連氏症候群；高安氏病/動脈炎；自體免疫性血小板減少症；特發性血小板減少症；自體免疫性甲狀腺病；甲狀腺機能亢進；甲狀腺腫性自體免疫性甲狀腺低能症(橋本氏病)；萎縮性自體免疫性甲狀腺低能症；原發性黏液水腫；晶狀體性葡萄膜炎；原發性血管炎；白斑症；急性肝病；慢性肝病；酒精性肝硬化；酒精誘發之肝損傷；膽汁淤積；特異性肝病；藥物誘發之肝炎；非酒精性脂肪變性肝炎；過敏症及哮喘；B群鏈球菌(GBS)感染；精神障礙(例如抑鬱及精神分裂症)；Th2型及Th1型介導之疾病；急性及慢性疼痛(不同形式之疼痛)；及癌症，諸如肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、胰臟癌、卵巢癌、前列腺癌及直腸癌，及血液科惡性疾病(白血病及淋巴瘤)；無β脂蛋白血症；凍瘡；急性及慢性寄生蟲或感染過程；急性白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；急性骨髓白血病(AML)；急性或慢性細菌感染；急性胰臟炎；急性腎衰竭；腺癌；心房異位搏動；AIDS癡呆複合症；酒精誘發之肝炎；過敏性結膜炎；過敏性接觸性皮炎；過敏性鼻炎；同種異體移植排斥反應；α-1-抗胰蛋白酶缺乏；肌萎縮性側索硬化；貧血；心絞 痛；前角細胞變性；抗cd3療法；抗磷脂症候群；抗受體過敏反應；主動脈瘤及周圍動脈瘤；主動脈剝離；動脈性高血壓；動脈硬化症；動靜脈瘻；共濟失調；心房微顫(持續性或陣發性)；心房撲動；房室傳導阻滯；B細胞淋巴瘤；骨骼移植物排斥反應；骨髓移植(BMT)排斥反應；束支傳導阻滯；伯基特氏淋巴瘤；燒傷；心律不整；心臟頓抑症候群；心臟腫瘤；心肌症；心肺繞道發炎反應；軟骨移植排斥反應；小腦皮層變性；小腦病症；紊亂性或多源性房性心動過速；化學療法相關性病症；慢性骨髓性白血病(CML)；慢性酒精中毒；慢性發炎性病變；慢性淋巴球性白血病(CLL)；慢性阻塞性肺病(COPD)；慢性水楊酸鹽中毒；結腸直腸癌；充血性心臟衰竭；結膜炎；接觸性皮炎；肺原性心臟病；冠狀動脈疾病；伊茨費爾特-雅各布病；培養陰性敗血病；囊腫性纖維化；細胞激素療法相關性病症；拳擊手癡呆；脫髓鞘疾病；出血性登革熱；皮炎；皮膚病狀；糖尿病(diabete)；糖尿病(diabetes mellitus)；糖尿病性動脈硬化性疾病；泛發性路易體疾病；擴張型充血性心肌症；基底神經結之病症；中年型唐氏症候群；由阻斷CNS多巴胺受體之藥物誘發的藥物誘發性運動障礙；藥物敏感；濕疹；腦脊髓炎；心內膜炎；內分泌病；會厭炎；艾伯斯坦-巴爾病毒感染；肢端紅痛症；錐體外及小腦病症；家族性噬血淋巴組織細胞瘤病；胎兒胸腺植入排斥反應；弗里德賴希氏共濟失調；功能性周圍動脈疾病；真菌性敗血病；氣疽；胃潰瘍；任何器官或組織之移植物排斥反應；革蘭氏陰性敗血病；革蘭氏陽性敗血病；由細胞內生物體引起之肉芽瘤；毛細胞白血病；哈勒沃登-斯帕特茲病；橋本氏甲狀腺炎；枯草熱；心臟移植排斥反應；血色素沉著病；血液透析；溶血性尿毒症症候群/血栓性血小板減少性紫 癜；出血；A型肝炎；希氏束心律不整；HIV感染/HIV神經病；霍奇金氏病；過動性運動障礙；過敏反應；過敏性肺炎；高血壓；少動性運動障礙；下丘腦-垂體-腎上腺軸評估；特發性阿狄孫氏病；特發性肺部纖維化；抗體介導之細胞毒性；無力；嬰兒脊髓性肌萎縮；主動脈炎症；a型流感；電離輻射曝露；虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎；缺血再灌注損傷；缺血性中風；青少年類風濕性關節炎；青少年脊髓性肌萎縮；卡堡氏肉瘤；腎移植排斥反應；退伍軍人症；利什曼體病；麻瘋；皮質脊髓系統病變；脂性水腫；肝移植排斥反應；淋巴水腫；瘧疾；惡性淋巴瘤；惡性組織細胞增多病；惡性黑素瘤；腦膜炎；腦膜炎球菌血症；代謝性/特發性偏頭痛；粒線體多系統病症；混合性結締組織疾病；單株γ-球蛋白病；多發性骨髓瘤；多系統退化(曼氏、德傑林-托馬斯、夏伊-德雷格及馬查多-約瑟夫)；重症肌無力；細胞內禽結核桿菌病；結核分枝桿菌病；骨髓發育不良症候群；心肌缺血症；鼻咽癌；新生兒慢性肺部疾病；腎炎；腎病；神經退化性疾病；神經原性肌萎縮；發燒性嗜中性白血球低下症；非霍奇金氏淋巴瘤；腹主動脈及其分支閉塞；閉塞性動脈症；okt3療法；睾丸炎/附睾炎；睾丸炎/輸精管復通術；內臟增大；骨質疏鬆症；胰臟移植排斥反應；胰臟癌；腫瘤相關症候群/惡性血鈣過多；副甲狀腺移植排斥反應；盆腔炎；季節性鼻炎；心包疾病；周圍動脈粥樣硬化疾病；周圍血管病症；腹膜炎；惡性貧血；卡氏肺囊蟲肺炎；肺炎；POEMS症候群(多發性神經病、內臟增大、內分泌病、單株γ-球蛋白病及皮膚變化症候群)；灌注後症候群；泵後症候群；MI心切開術後症候群；子癇前症；進行性核上麻痺；原發性肺高血壓；輻射療法；雷諾氏症候群及疾病；雷諾氏病；雷夫蘇姆氏病；規則性 QRS波狹窄型心動過速；腎血管性高血壓；再灌注損傷；窄縮性心肌症；肉瘤；硬皮病；老年性舞蹈病；路易體型老年癡呆；血清陰性關節病；休克；鐮形細胞性貧血；皮膚同種異體移植排斥反應；皮膚變化症候群；小腸移植排斥反應；實體腫瘤；特異性心律不整；脊髓共濟失調；脊髓小腦退化症；鏈球菌肌炎；小腦結構病變；亞急性硬化性全腦炎；暈厥；心血管系統梅毒；全身性過敏反應；全身性發炎性反應症候群；全身發作型青少年類風濕性關節炎；T細胞或FAB ALL；毛細管擴張症；血栓閉塞性脈管炎；血小板減少症；中毒；移植；外傷/出血；III型過敏反應；IV型過敏；不穩定型心絞痛；尿毒症；尿路敗血症；蕁痳疹；心臟瓣膜病；靜脈曲張；血管炎；靜脈疾病；靜脈栓塞；心室纖維性顫動；病毒及真菌感染；病毒性腦炎/無菌性腦膜炎；病毒相關吞噬血細胞症候群；韋尼克-科爾薩科夫症候群；韋爾森氏病；任何器官或組織之異種移植物排斥反應；急性冠狀動脈症候群；急性特發性多神經炎；急性發炎性脫髓鞘多神經根神經病變；急性缺血；成人斯蒂爾氏病；全身性過敏反應；抗磷脂抗體症候群；再生不全性貧血；異位性濕疹；異位性皮炎；自體免疫性皮炎；與鏈球菌感染相關之自體免疫病症；自體免疫性腸病；自體免疫性聽力喪失；自體免疫性淋巴細胞增殖症候群(ALPS)；自體免疫性心肌炎；自體免疫性卵巢早衰；瞼緣炎；支氣管擴張症；大皰性類天疱瘡；心血管疾病；災難性抗磷脂症候群；乳糜瀉；頸椎關節黏連；慢性缺血；瘢痕性類天疱瘡；伴以多發性硬化症風險之單一臨床症狀(cis)；兒童期發作之精神病症；淚囊炎；皮肌炎；糖尿病性視網膜病變；椎間盤突出症；椎間盤下垂；藥物誘發之免疫溶血性貧血；子宮內膜異位；眼內炎；上鞏膜炎；多形性紅斑；重 症多形性紅斑；妊娠性類天疱瘡；格林-巴利症候群(GBS)；枯草熱；休斯症候群；特發性帕金森氏病；特發性間質性肺炎；IgE介導之過敏症；免疫溶血性貧血；包涵體肌炎；感染性眼部發炎性疾病；發炎性脫髓鞘疾病；發炎性心臟病；發炎性腎病；IPF/UIP；虹膜炎；角膜炎；乾燥性角膜結膜炎；庫斯毛爾病或庫斯毛爾-梅爾氏病；蘭德里氏癱瘓；蘭格罕氏細胞組織球增生症；網狀青斑；黃斑變性；顯微鏡下多血管炎；白赫鐵列夫症；運動神經元病症；黏膜類天疱瘡；多重器官衰竭；骨髓發育不良症候群；心肌炎；神經根病症；神經病；非A非B型肝炎；視神經炎；骨質溶解；卵巢癌；少關節性JRA；周圍動脈閉塞性疾病(PAOD)；周圍血管疾病(PVD)；周圍動脈疾病(PAD)；靜脈炎；結節性多動脈炎(或結節性動脈周圍炎)；多軟骨炎；風濕性多肌痛；白髮症；多關節性JRA；多內分泌缺陷症候群；多發性肌炎；泵後症候群；原發性帕金森氏症；前列腺及直腸癌以及血液科惡性疾病(白血病及淋巴瘤)；前列腺炎；單純紅血球發育不全；原發性腎上腺機能不全；復發性視神經脊髓炎；再狹窄；風濕性心臟病；sapho(滑膜炎、痤瘡、膿皰病、骨肥厚及骨炎)；硬皮病；繼發性澱粉樣變性；休克肺；鞏膜炎；坐骨神經痛；繼發性腎上腺機能不全；聚矽氧相關性結締組織疾病；史奈頓-威爾金森皮膚病；僵直性脊椎炎；史蒂文斯-瓊森症候群(SJS)；全身性發炎性反應症候群；顳動脈炎；弓形蟲性視網膜炎；中毒性表皮壞死鬆解症；橫貫性脊髓炎；TRAPS(腫瘤壞死因子受體)、1型過敏反應；II型糖尿病；尋常型間質性肺炎(UIP)；春季結膜炎；病毒性視網膜炎；小柳原田症候群(VKH症候群)；濕性黃斑變性；或創傷癒合。
  72. 如請求項70或71之方法，其中該病症為自體免疫病症、哮喘、 類風濕性關節炎、骨關節炎、全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、多發性硬化、敗血病、神經退化性疾病或腫瘤病症。
  73. 如請求項70至72中任一項之方法，其中該結合蛋白經調配用於非經腸、皮下、肌肉內、靜脈內、關節內、支氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、大腸內、子宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊椎內、滑膜內、胸腔內、子宮內、膀胱內、快速注射、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內或經皮投藥。
  74. 一種藉由免疫分析測定測試樣品中至少一個靶或其片段之存在、量或濃度的方法，其中該免疫分析包含使該測試樣品與至少一種結合蛋白及至少一個可偵測標記接觸，且其中該至少一種結合蛋白包含如請求項35至56中任一項之結合蛋白。
  75. 如請求項74之方法，其進一步包含：(i)使該測試樣品與該至少一種結合蛋白接觸，其中該結合蛋白結合於該靶或其片段上之抗原決定基，從而形成第一複合物；(ii)使該複合物與該至少一個可偵測標記接觸，其中該可偵測標記結合於該結合蛋白或在該靶或其片段上之未結合該結合蛋白之抗原決定基，從而形成第二複合物；及(iii)基於該第二複合物中該可偵測標記所產生之信號，偵測該測試樣品中該靶或其片段之存在、量或濃度，其中該靶或其片段之存在、量或濃度與該可偵測標記產生之信號直接相關。
  76. 如請求項74之方法，其進一步包含： (i)使該測試樣品與該至少一種結合蛋白接觸，其中該結合蛋白結合於該靶或其片段上之抗原決定基，從而形成第一複合物；(ii)使該複合物與該至少一個可偵測標記接觸，其中該可偵測標記與該靶或其片段競爭結合於該結合蛋白，從而形成第二複合物；及(iii)基於該第二複合物中該可偵測標記所產生之信號，偵測該測試樣品中該靶或其片段之存在、量或濃度，其中該靶或其片段之存在、量或濃度與該可偵測標記產生之信號間接相關。
  77. 一種用於對測試樣品分析該樣品中靶或其片段之存在、量或濃度之套組，該套組包含(a)有關分析該測試樣品中該靶或其片段之說明書，及(b)至少一種包含如請求項35至56中任一項之結合蛋白的結合蛋白。
  78. 一種如請求項35至60中任一項之結合蛋白之用途，其係用於製造供治療疾病或病症之藥物。
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