JP4942644B2 - 抗IgSF4抗体及びその利用 - Google Patents
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Description
ヒトゲノムの全塩基配列が決定されたことにより、ゲノム上にコードされた全タンパク質のアミノ酸一次配列は推定可能である。正常細胞で使用されない遺伝子の異常発現により癌化が起こり、その遺伝子産物が膜タンパク質であれば、HER2/ハーセプチンの例で示されるごとく抗体の標的となる。この考え方に基づいてDNAマイクロアレイを用いて癌細胞と正常細胞の転写産物の質的および量的差を解析する研究が、世界中の多くの研究室で実施されている。
成人T細胞白血病(Adult T cell Leukemia;ATL)は日本の西南地方(沖縄、鹿児島、宮崎、長崎各県のキャリア率は約5%に及ぶ。)およびカリブ海沿岸に集中して発生し、リンパ増殖性疾患のなかでもっとも治療成績が悪い極めて予後不良なヘルパーT細胞性の白血病である。今日ではヒトレトロウイルス(Human Retrovirus)であるHTLV-1(Human T cell Leukemia Virus Type 1)の感染がATLの発症の重要な因子であることが明らかにされている。幼少時に母乳を介し母親から感染し、HTLV‐1キャリアに5〜10%の頻度で発症し、2年以内にほとんど死亡する。日本全国のHTLV‐1キャリア数は約100万人、ATL発症数は年間約700例といわれており、現在有効なATL治療法が確立されていない。
リツキサン(anti-CD20)は現在最も良く知られる癌治療抗体であり、既に非ホジキン型リンパ腫にしか治療能が無い事が知られている。本取得された抗体はフローサイトメトリー(FCM)の結果、非常に特異的にIgSF4発現型ATLに対する結合能があり、本抗体を用いたIgSF4発現型ATL診断或いは毒素やRIコンジュゲートした本取得抗体はIgSF4発現型ATLの治療に有用であると考えられる。
本発明は以上の成果に基づき、IgSF4に対する特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。
本発明の抗体は、IgSF4に対する特異的結合性を有することを特徴とする。一態様では本発明の抗体はIgSF4を介して細胞障害活性を発揮する。好ましい一態様では、本発明の抗体はIgSF4を介してADCC活性を有する。また、好ましい他の態様では、本発明の抗体はIgSF4を介して細胞増殖活性を発揮する。
本発明の抗体の一態様は、配列番号:2〜4、10〜12、18〜20、26〜28、34〜36、42〜44、50〜52、58〜60、222〜224、230〜232、及び238〜249のいずれかのアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含むCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号:6〜8、14〜16、22〜24、30〜32、38〜40、46〜48、54〜56、62〜64、226〜228、234〜236、及び242〜244のいずれかのアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含むCDRを有する軽鎖可変領域とを備えることを特徴とする。
本発明の抗体の一態様は、以下のa〜vからなる群より選択される組合せの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を備えることを特徴とする。
(a)配列番号2のCDR1、配列番号:3のCDR2、及び配列番号:4のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:6のCDR1、配列番号:7のCDR2、及び配列番号:8のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(b)配列番号:10のCDR1、配列番号:11のCDR2、及び配列番号:12のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:14のCDR1、配列番号:15のCDR2、及び配列番号:16のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(c)配列番号:18のCDR1、配列番号:19のCDR2、及び配列番号:20のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:22のCDR1、配列番号:23のCDR2、及び配列番号:24のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(d)配列番号:26のCDR1、配列番号:27のCDR2、及び配列番号:28のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:30のCDR1、配列番号:31のCDR2、及び配列番号:32のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(e)配列番号:34のCDR1、配列番号:35のCDR2、及び配列番号:36のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:38のCDR1、配列番号:39のCDR2、及び配列番号:40のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(f)配列番号:42のCDR1、配列番号:43のCDR2、及び配列番号:44のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:46のCDR1、配列番号:47のCDR2、及び配列番号:48のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(g)配列番号:50のCDR1、配列番号:51のCDR2、及び配列番号:52のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:54のCDR1、配列番号:55のCDR2、及び配列番号:56のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(h)配列番号:58のCDR1、配列番号:59のCDR2、及び配列番号:60のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:62のCDR1、配列番号:63のCDR2、及び配列番号:64のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(i)配列番号:1のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号:5のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(j)配列番号:9のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号:13のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(k)配列番号:17のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号:21のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(l)配列番号:25のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号:29のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(m)配列番号:33のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号:37のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(n)配列番号:41のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号:45のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(o)配列番号:49のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号:53のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(p)配列番号:57のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号:61のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(q)配列番号:222のCDR1、配列番号:223のCDR2、及び配列番号:224のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:226のCDR1、配列番号:227のCDR2、及び配列番号:228のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(r)配列番号:230のCDR1、配列番号:231のCDR2、及び配列番号:232のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:234のCDR1、配列番号:235のCDR2、及び配列番号:236のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(s)配列番号:238のCDR1、配列番号:239のCDR2、及び配列番号:240のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:242のCDR1、配列番号:243のCDR2、及び配列番号:244のCDR3からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(t)配列番号:221のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号:225のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(u)配列番号:229のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号:233のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ、
(v)配列番号:237のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の重鎖可変領域と、配列番号:241のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の軽鎖可変領域との組合せ。
本発明の一態様ではヒト抗体又はヒト化抗体が提供される。また、本発明の抗体は様々な形態として構築される。例えばIgG、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、又はdsFv抗体として構築される。
本発明は更に、抗IgSF4抗体のCDRを提供する。本発明のCDRは配列番号:2〜4、6〜8、10〜12、14〜16、18〜20、22〜24、26〜28、30〜32、34〜36、38〜40、42〜44、46〜48、50〜52、54〜56、58〜60、62〜64、222〜224、226〜228、230〜232、234〜236、238〜240、及び242〜244のいずれかのアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、本発明の抗体の重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域、又は本発明のCDRをコードする単離された核酸分子を提供する。
本発明はさらに、当該分子を発現可能に保持するベクター、当該核酸分子が導入されている形質転換体に関する。
本発明は他の局面として、上記本発明の抗体を有効成分として含む癌治療剤を提供する。
本発明はさらに他の局面として、抗IgSF4抗体を含んでなる、肝癌検査用、成人T細胞白血病検査用、肝癌研究用、又は成人T細胞白血病研究用試薬を提供する。さらに、当該試薬と、使用説明書を含んでなる、肝癌検査用、成人T細胞白血病検査用、肝癌研究用、又は成人T細胞白血病研究用のキットも提供する。
本発明は更なる局面として、肝癌又は成人T細胞白血病診断用の情報を取得する方法であって、
(1)生体から分離された被検細胞を用意するステップ、及び
(2)前記被検細胞を対象としてIgSF4を検出するステップ、
を含む方法を提供する。
さらに、肝癌細胞の悪性度を判定する方法であって、
(1)生体から分離された被検肝細胞を用意するステップ、及び
(2)前記被検肝細胞を対象としてIgSF4を検出するステップ、
を含む方法も提供される。
本発明はさらに、肝癌細胞又は成人T細胞白血病細胞に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング法であって、
(1)IgSF4と試験化合物とを接触させるステップ、
(2)試験化合物のIgSF4に対する結合性を評価するステップ、
を含むスクリーニング法を提供する。
また、肝癌の治療に有効なIgSF4結合性化合物のスクリーニング法であって、
(1)IgSF4遺伝子を発現する細胞を用意するステップ、
(2)前記細胞に試験化合物を接触させるステップ、
(3)癌細胞の死滅及び減少を評価するステップ、
を含むスクリーニング法を提供する。
また、成人T細胞白血病の治療に有効なIgSF4結合性化合物のスクリーニング法であって、
(1)成人T細胞白血病細胞を用意するステップ、
(2)前記細胞に試験化合物を接触させるステップ、
(3)前記細胞の死滅又は減少を評価するステップ、
を含むスクリーニング法を提供する。
本発明は更に、IgSF4の抗原としての用途を提供する。この用途では癌治療用抗体を作製するための抗原としてIgSF4が使用される。ここでのIgSF4として以下のいずれかを用いることができる。
(1)大腸菌の発現系を用いて生産されたIgSF4、
(2)動物細胞の発現系を用いて培地中に分泌させたIgSF4、
(3)動物細胞の発現系を用いて細胞表面上に発現させたIgSF4、
(4)T抗原を発現していて一過性の発現が可能である動物細胞の発現系を用いて、培地中に分泌させた又は細胞表面上に発現させたIgSF4。
一方、IgSF4の細胞外領域を抗原として用いて、癌治療用抗体を作製してもよい。
本発明はまた、癌細胞を保有する対象に抗IgSF4抗体を投与するステップを含む癌治療法も提供する。抗IgSF4抗体としてADCC活性を有するものが好適に使用される。また、成人T細胞白血病細胞を保有する対象に抗IgSF4抗体を投与するステップ、を含む成人T細胞白血病治療法も提供される。
説明の便宜上、本明細書に使用される用語の一部についてその定義をまとめて以下に示す。
本明細書において用語「〜を含む」又は「〜を含んでなる」は、「〜からなる」の意味をも含む表現として使用される。したがって例えば、「複数の要素(部材)を含んで構成される物(又は方法)」と記載した場合には、それが意味するものとして「当該複数の要素(部材)から構成される物(又は方法)」も当然に考慮される。
本明細書において用語「単離された核酸」とは、もともと天然に存在している核酸(例えばヒト生体内の核酸)の場合、典型的には、天然状態において共存するその他の核酸から分離された状態の核酸をいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えばゲノムDNAの場合の「単離された核酸」の好ましい形態では、天然状態において共存する他のDNA成分(天然状態において隣接するDNA配列を含む)を実質的に含まない。
例えばcDNA分子など遺伝子組み換え技術によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない状態の核酸をいう。同様に、化学合成によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、dNTPなどの前駆体(原材料)や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない状態の核酸をいう。
ベクターや組成物の一部として核酸が存在していても、又は外来性分子として細胞内に核酸が存在していても、人為的操作の結果として存在している限り「単離された核酸」と言える。尚、特に言及しない限り、本明細書において単に「核酸」と記載した場合には「単離された状態の核酸」を意味する。
一方、「単離された抗体」には、天然であって且つ何ら外的操作(人為的操作)が施されていない抗体、即ちある個体の体内で産生され、そこに留まっている状態の抗体は含まれない。尚、単離された抗体は、典型的には、他の種類の抗体が混在していない状態、即ち単独で(同種の抗体の集合として)存在している。CDR領域の場合の「単離された」状態には、単独で存在している状態に加え、抗体の他の領域とともに存在している状態も含まれる。即ち、用語「単離されたCDR」には、単独で存在しているCDRは勿論のこと、単離された抗体の一部として存在しているCDRも含まれる。
二つのアミノ酸が実質的に同一であるか否かは、各アミノ酸配列を含む抗体(他の領域の配列は同一)のIgSF4に対する結合特異性(以下、特に記載のない限り「特異性」は「IgSF4に対する特異性」を意味する)を比較することによって判定できる。例えば、基準となる抗体の生理食塩水環境下でのIgSF4に関する解離定数(Kd)をAとしたとき、比較対象の抗体のKdがA×10-1〜A×10の範囲であれば実質的な同一性を認定できる。
高分化型癌細胞は、本来の組織の性質の多くを保持し、浸潤能ないし転移能はそれほど高くない。他方、分化度が低くなるに従って、その細胞起源が把握し難くなり、浸潤能ないし転移能も高くなる。分化度の低い癌細胞では治療が困難であり、未分化癌ではその予後は極めて不良である。
重鎖(H鎖)、軽鎖(L鎖)、重鎖可変領域(VH)、軽鎖可変領域(VL)、相補性決定領域(CDR)、第1相補性決定領域(CDR1)、第2相補性決定領域(CDR2)、第3相補性決定領域(CDR3)重鎖の第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖の第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖の第3相補性決定領域(VH CDR3)軽鎖の第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖の第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖の第3相補性決定領域(VL CDR3)
(a)重鎖CDR3:配列番号:4のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:8のアミノ酸配列
(b)重鎖CDR3:配列番号:12のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:16のアミノ酸配列
(c)重鎖CDR3:配列番号:20のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:24のアミノ酸配列
(d)重鎖CDR3:配列番号:28のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:32のアミノ酸配列
(e)重鎖CDR3:配列番号:36のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:40のアミノ酸配列
(f)重鎖CDR3:配列番号:44のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:48のアミノ酸配列
(g)重鎖CDR3:配列番号:52のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:56のアミノ酸配列
(h)重鎖CDR3:配列番号:60のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:64のアミノ酸配列
(i)重鎖CDR3:配列番号:224のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:228のアミノ酸配列
(j)重鎖CDR3:配列番号:232のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:236のアミノ酸配列
(k)重鎖CDR3:配列番号:240のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:244のアミノ酸配列
これらは上から順に035-029抗体、035-212抗体、035-215抗体、035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、051-054抗体、051-181抗体、051-129抗体、035-130抗体、及び035-169抗体におけるCDR3の組合せであり、IgSF4に対する高い特異性を期待できる。
(l)重鎖CDR2:配列番号:3のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:4のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:7のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:8のアミノ酸配列
(m)重鎖CDR2:配列番号:11のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:12のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:15のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:16のアミノ酸配列
(n)重鎖CDR2:配列番号:19のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:20のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:23のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:24のアミノ酸配列の
(o)重鎖CDR2:配列番号:27のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:28のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:31のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:32のアミノ酸配列
(p)重鎖CDR2:配列番号:35のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:36のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:39のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:40のアミノ酸配列
(q)重鎖CDR2:配列番号:43のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:44のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:47のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:48のアミノ酸配列
(r)重鎖CDR2:配列番号:51のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:52のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:55のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:56のアミノ酸配列
(s)重鎖CDR2:配列番号:59のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:60のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:63のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:64のアミノ酸配列
(t)重鎖CDR2:配列番号:223のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:224のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:227のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:228のアミノ酸配列
(u)重鎖CDR2:配列番号:231のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:232のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:235のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:236のアミノ酸配列
(v)重鎖CDR2:配列番号:239のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:240のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:243のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:244のアミノ酸配列
これらは上から順に035-029抗体、035-212抗体、035-215抗体、035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、051-054抗体、051-181抗体、051-129抗体、035-130抗体、及び035-169抗体におけるCDR2とCDR3の組合せであり、IgSF4に対する一層高い特異性を期待できる。
(A)重鎖CDR1:配列番号:2のアミノ酸配列、重鎖CDR2:配列番号:3のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:4のアミノ酸配列、軽鎖CDR1:配列番号:6のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:7のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:8のアミノ酸配列
(B)重鎖CDR1:配列番号:10のアミノ酸配列、重鎖CDR2:配列番号:11のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:12のアミノ酸配列、軽鎖CDR1:配列番号:14のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:15のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:16のアミノ酸配列
(C)重鎖CDR1:配列番号:18のアミノ酸配列、重鎖CDR2:配列番号:19のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:20のアミノ酸配列、軽鎖CDR1:配列番号:22のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:23のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:24のアミノ酸配列
(D)重鎖CDR1:配列番号:26のアミノ酸配列、重鎖CDR2:配列番号:27のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:28のアミノ酸配列、軽鎖CDR1:配列番号:30のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:31のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:32のアミノ酸配列
(E)重鎖CDR1:配列番号:34のアミノ酸配列、重鎖CDR2:配列番号:35のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:36のアミノ酸配列、軽鎖CDR1:配列番号:38のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:39のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:40のアミノ酸配列
(F)重鎖CDR1:配列番号:42のアミノ酸配列、重鎖CDR2:配列番号:43のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:44のアミノ酸配列、軽鎖CDR1:配列番号:46のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:47のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:48のアミノ酸配列
(G)重鎖CDR1:配列番号:50のアミノ酸配列、重鎖CDR2:配列番号:51のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:52のアミノ酸配列、軽鎖CDR1:配列番号:54のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:55のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:56のアミノ酸配列
(H)重鎖CDR1:配列番号:58のアミノ酸配列、重鎖CDR2:配列番号:59のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:60のアミノ酸配列、軽鎖CDR1:配列番号:62のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:63のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:64のアミノ酸配列
(I)重鎖CDR1:配列番号:222のアミノ酸配列、重鎖CDR2:配列番号:223のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:224のアミノ酸配列、軽鎖CDR1:配列番号:226のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:227のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:228のアミノ酸配列
(J)重鎖CDR1:配列番号:230のアミノ酸配列、重鎖CDR2:配列番号:231のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:232のアミノ酸配列、軽鎖CDR1:配列番号:234のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:235のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:236のアミノ酸配列
(K)重鎖CDR1:配列番号:238のアミノ酸配列、重鎖CDR2:配列番号:239のアミノ酸配列、重鎖CDR3:配列番号:240のアミノ酸配列、軽鎖CDR1:配列番号:242のアミノ酸配列、軽鎖CDR2:配列番号:243のアミノ酸配列、軽鎖CDR3:配列番号:244のアミノ酸配列
これらは上から順に035-029抗体、035-212抗体、035-215抗体、035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、051-054抗体、051-181抗体、051-129抗体、035-130抗体、及び035-169抗体におけるCDR1〜CDR3の組合せであり、IgSF4に対するより一層高い特異性を期待できる。
ヒト型キメラ抗体は例えば、上記のH鎖可変領域の構造及び/又はL鎖可変領域の構造を有する抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域に置換することにより作製することができる。ヒト抗体の定常領域としては公知のものを採用することができる。以下に、ヒト型キメラ抗体の作製方法の一例を示す。
まず、マウス抗IgSF4抗体を産生するハイブリドーマよりmRNAを抽出し、常法に従ってcDNAを合成する。合成したcDNAをベクターに組み込みcDNAライブラリーを構築する。このcDNAライブラリーから、H鎖遺伝子フラグメント及びL鎖遺伝子フラグメントをプローブとして用いることにより、H鎖遺伝子及びL鎖遺伝子を含有するベクターを選択する。選択されたベクターの挿入配列のシークエンシングを行うことにより、H鎖可変領域及びL鎖可変領域の遺伝子の配列が決定される。このようにして得られた配列データを基にH鎖可変領域をコードするDNAを化学合成、生化学的切断/再結合等により作製する。得られたH鎖可変領域をコードするDNAを、ヒトH鎖定常領域をコードするDNAとライゲーションして発現用ベクターに組込むことによりH鎖発現ベクターを作製する。発現ベクターとしては例えばSV40 virus basedベクター、EB virus basedベクター、BPV(パピローマウイルス)basedベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。一方、同様の方法によりL鎖発現ベクターを作製する。これらH鎖発現ベクター及びL鎖発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としてはCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣)(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immunol.160, 3393-3402 (1998))、SP2/0細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.5,512-519 (1996),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.50,1495-1502 (1990))などが好適に用いられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P.L.Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran法等が好適に用いられる。
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型キメラ抗体を分離する。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて利用することができる。
具体的なCDRの塩基配列として例えば以下の塩基配列を用いることができる。
H鎖CDR1(VH CDR1):配列番号:66、74、82、90、98、106、114、122、246、254、及び262のいずれかの塩基配列
H鎖CDR2(VH CDR2):配列番号:67、75、83、91、99、107、115、123、247、255、及び263のいずれかの塩基配列
H鎖CDR3(VH CDR3):配列番号:68、76、84、92、100、108、116、124、248、256、及び264のいずれかの塩基配列
L鎖CDR1(VL CDR1):配列番号:70、78、86、94、102、110、118、126、250、258、及び266のいずれかの塩基配列
L鎖CDR2(VL CDR2):配列番号:71、79、87、95、103、111、119、127、251、259、及び267のいずれかの塩基配列
L鎖CDR3(VL CDR3):配列番号:72、80、88、96、104、112、120、128、252、260、及び268のいずれかの塩基配列
(1)VH CDR1:配列番号:66の塩基配列、VH CDR2:配列番号:67の塩基配列、VH CDR3:配列番号:68の塩基配列、VL CDR1:配列番号:70の塩基配列、VL CDR2:配列番号:71の塩基配列、及びVL CDR3:配列番号:72の塩基配列の組合せ
(2) VH CDR1:配列番号:74の塩基配列、VH CDR2:配列番号:75の塩基配列、VH CDR3:配列番号:76の塩基配列、VL CDR1:配列番号:78の塩基配列、VL CDR2:配列番号:79の塩基配列、及びVL CDR3:配列番号:80の塩基配列の組合せ
(3) VH CDR1:配列番号:82の塩基配列、VH CDR2:配列番号:83の塩基配列、VH CDR3:配列番号:84の塩基配列、VL CDR1:配列番号:86の塩基配列、VL CDR2:配列番号:87の塩基配列、及びVL CDR3:配列番号:88の塩基配列の組合せ
(4) VH CDR1:配列番号:90の塩基配列、VH CDR2:配列番号:91の塩基配列、VH CDR3:配列番号:92の塩基配列、VL CDR1:配列番号:94の塩基配列、VL CDR2:配列番号:95の塩基配列、及びVL CDR3:配列番号:96の塩基配列の組合せ
(5)VH CDR1:配列番号:98の塩基配列、VH CDR2:配列番号:99の塩基配列、VH CDR3:配列番号:100の塩基配列、VL CDR1:配列番号:102の塩基配列、VL CDR2:配列番号:103の塩基配列、及びVL CDR3:配列番号:104の塩基配列の組合せ
(6) VH CDR1:配列番号:106の塩基配列、VH CDR2:配列番号:107の塩基配列、VH CDR3:配列番号:108の塩基配列、VL CDR1:配列番号:110の塩基配列、VL CDR2:配列番号:111の塩基配列、及びVL CDR3:配列番号:112の塩基配列の組合せ
(7) VH CDR1:配列番号:114の塩基配列、VH CDR2:配列番号:115の塩基配列、VH CDR3:配列番号:116の塩基配列、VL CDR1:配列番号:118の塩基配列、VL CDR2:配列番号:119の塩基配列、及びVL CDR3:配列番号:120の塩基配列の組合せ
(8) VH CDR1:配列番号:122の塩基配列、VH CDR2:配列番号:123の塩基配列、VH CDR3:配列番号:124の塩基配列、VL CDR1:配列番号:126の塩基配列、VL CDR2:配列番号:127の塩基配列、及びVL CDR3:配列番号:128の塩基配列の組合せ
(9) VH CDR1:配列番号:246の塩基配列、VH CDR2:配列番号:247の塩基配列、VH CDR3:配列番号:248の塩基配列、VL CDR1:配列番号:250の塩基配列、VL CDR2:配列番号:251の塩基配列、及びVL CDR3:配列番号:252の塩基配列の組合せ
(10) VH CDR1:配列番号:254の塩基配列、VH CDR2:配列番号:255の塩基配列、VH CDR3:配列番号:256の塩基配列、VL CDR1:配列番号:258の塩基配列、VL CDR2:配列番号:259の塩基配列、及びVL CDR3:配列番号:260の塩基配列の組合せ
(11) VH CDR1:配列番号:262の塩基配列、VH CDR2:配列番号:263の塩基配列、VH CDR3:配列番号:264の塩基配列、VL CDR1:配列番号:266の塩基配列、VL CDR2:配列番号:267の塩基配列、及びVL CDR3:配列番号:268の塩基配列の組合せ
尚、これらは上から順に035-029抗体、035-212抗体、035-215抗体、035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、051-054抗体、051-181抗体、051-129抗体、035-130抗体、及び035-169抗体における各CDRの組合せに相当する。
次に、これらいずれかの方法により選択したFRと上記CDRとを組み合わせることによりH鎖可変領域及びL鎖可変領域をコードするDNAを設計する。この設計を基にH鎖可変領域をコードするDNAとL鎖可変領域をコードするDNAを化学合成、生化学的切断/再結合等によりそれぞれ作製する。そしてH鎖可変領域をコードするDNAを、ヒト免疫グロブリンH鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込みH鎖発現ベクターを構築する。同様に、L鎖可変領域をコードするDNAを、ヒト免疫グロブリンL鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込みL鎖発現ベクターを構築する。発現ベクターとしては例えばSV40 virus basedベクター、EB virus basedベクター、BPV(パピローマウイルス)basedベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
以上の方法で作製されたH鎖発現ベクター及びL鎖発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としてはCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣)(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immunol.160, 3393-3402 (1998))、SP2/0細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.5,512-519 (1996),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.50,1495-1502 (1990))などが好適に用いられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P.L.Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran法等が好適に用いられる。
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型CDR移植抗体を分離する。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて利用することができる。
Fabは、IgGをシステイン存在下パパイン消化することにより得られる、L鎖とH鎖可変領域、並びにCH1ドメイン及びヒンジ部の一部からなるH鎖フラグメントとから構成される分子量約5万の断片である。本発明では、上記抗体をパパイン消化することにより得ることができる。また、上記抗体のH鎖の一部及びL鎖をコードするDNAを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりFabを調製することもできる。
Fab'は、後述のF(ab')2のH鎖間のジスルフィド結合を切断することにより得られる分子量が約5万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化し、還元剤を用いてジスルフィド結合を切断することにより得られる。また、Fab同様に、Fab'をコードするDNAを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
F(ab')2は、IgGをペプシン消化することにより得られる、L鎖とH鎖可変領域、並びにCH1ドメイン及びヒンジ部の一部からなるH鎖フラグメントとから構成される断片(Fab')がジスルフィド結合で結合した分子量約10万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化することにより得られる。また、Fab同様に、F(ab')2をコードするDNAを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
scFvは、H鎖可変領域とL鎖可変領域とからなるFvを、片方の鎖のC末端と他方のN末端とを適当なペプチドリンカーで連結し一本鎖化した抗体断片である。ペプチドリンカーとしては例えば柔軟性の高い(GGGGS)3などを用いることができる。例えば、上記抗体のH鎖可変領域及びL鎖可変領域をコードするDNAとペプチドリンカーをコードするDNAを用いてscFv抗体をコードするDNAを構築し、これを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりscFvを調製することができる。
dsFvは、H鎖可変領域及びL鎖可変領域の適切な位置にCys残基を導入し、H鎖可変領域とL鎖可変領域とをジスルフィド結合により安定化させたFv断片である。各鎖におけるCys残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。本発明では例えば上記抗体のH鎖可変領域及びL鎖可変領域のアミノ酸配列から立体構造を予測し、かかる予測に基づき変異を導入したH鎖可変領域及びL鎖可変領域をそれぞれコードするDNAを構築し、これを適当なベクターに組み込み、そして当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりdsFvを調製することができる。
尚、適当なリンカーを用いてscFv抗体、dcFv抗体などを連結させたり、ストレプトアビジンを融合させたりして抗体断片を多量体化することもできる。
本発明の抗体(抗体断片を含む)に低分子化合物、タンパク質、標識物質などを融合又は結合させることにより、融合抗体又は標識化抗体を構成することができる。標識物質としては125I等の放射性物質、ペルオキシダーゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミンイソチオシアネート(RITC)、アルカリホスファターゼ、ビオチンなどを用いることができる。
さらには、本発明の抗体を、薬物等を肝癌細胞特異的に送達させるための媒体(運搬体)として利用することもできる。即ち、本発明の抗体の用途として、肝癌細胞を標的としたDDS(Drug delivery system)が想定される。
ここで、本発明者らが取得に成功した抗体を用いた免疫染色実験において、035-273抗体、051-054抗体は分化度の低い肝癌細胞を特異的に認識することが明らかとなった。分化度の低い肝癌を治療することは一般に困難であり、予後が極めて不良である。035-273抗体など、このような治療困難な癌細胞を特異的に認識することができるものであり、治療用途及び診断用途において高い価値を有する。例えば、035-273抗体を薬剤の運搬体として用いれば低分化型肝癌特異的に薬剤を送達すること可能となり、高い治療効果を望める。また、当該抗体を免疫染色用の抗体として用いれば、分化度を反映した染色結果を得ることができる。即ち当該抗体を用いれば癌細胞の分化度を高精度で判定することが可能である。このように当該抗体は診断用途でも非常に有用である。
尚、本発明の抗体の各用途については以下に詳述される。
本発明の他の局面は、IgSF4が肝癌細胞特異的に発現しているという知見に基づき、IgSF4の診断マーカーとしての利用に関する。この局面の一態様は肝癌又は成人T細胞白血病診断用の情報を取得する方法に関し、次のステップを含む。
ステップ(1):生体から分離された被検細胞を用意するステップ。
ステップ(2):被検細胞を対象としてIgSF4を検出するステップ。
当該方法で得られる情報(検出結果)は、被検細胞が肝癌細胞に該当するか否かを判定するため、又は被検細胞が成人T細胞白血病細胞に該当するか否かを判定するために利用される。
ここで、後述の実施例に示すように、悪性度(分化度)の異なる複数の肝癌細胞を、抗IgSF4抗体を用いて免疫染色したところ染色性に顕著な違いを認めた。即ち、肝癌細胞の悪性度とIgSF4の発現量との間に強い関連性が存在することが明らかとなり、肝癌細胞の悪性度判定用のマーカーとしてもIgSF4が有効であることが判明した。この知見に基づき本発明の他の一態様では、上記ステップの検出結果を被検肝細胞の悪性度を判定するために利用した方法、即ち肝癌細胞の悪性度を判定する方法が提供される。
一方、患者以外の者、即ち肝癌が認定されていない者を対象とした場合に得られた情報は、肝癌に関して罹患の有無の判定、罹患リスクの評価等に利用できる。本発明の方法によれば遺伝子の発現量という客観性に優れた指標を基に肝癌の診断を行えることから、その価値は非常に高いといえる。
1.ステップ(1)
ステップ(1)では対象(被検者、生体)から分離された細胞を用意する。患者(肝癌患者又は成人T細胞白血病患者)に限らず、健常者(肝癌又は成人T細胞白血病のおそれがある者を含む)をここでの対象とすることもできる。例えば、バイオプシー(生検)で採取した、対象の肝臓の一部を被検細胞として本発明の方法に供することができる。
本発明において「被検細胞(被検肝細胞又は被検T細胞)」とは、本発明の方法における検出をする際の試料(対象)となる細胞である。被検細胞は生体より分離される。即ち、生体より分離された状態の被検細胞に対して本発明が適用される。「生体より分離された」とは、被検細胞が存在する生体組織の一部を摘出することによって、被検細胞がその由来の生体と完全に隔離されている状態をいう。ステップ(2)において免疫学的検出法を採用する場合には通常、被検細胞は生体で存在していた状態、即ち周囲の細胞と結合した状態で(組織片として)調製され、本発明の方法に使用される。尚、被検細胞を周囲の細胞から分離(単離)した後に本発明の方法に使用してもよい。
本発明において「肝癌」は広義に解釈することとし、肝癌腫及び肝肉腫を含む。また、本発明において用語「癌」は「腫瘍」と互換的に使用される。また、病理学的に診断が確定される前の段階、すなわち腫瘍としての良性、悪性のどちらかが確定される前には、良性腫瘍、良性悪性境界病変、悪性腫瘍を総括的に含む場合もあり得る。
ステップ(2)では、用意した被検細胞を対象としてIgSF4を検出する。「IgSF4を検出する」とは、IgSF4が発現しているか否か(発現の有無)を調べること、又はIgSF4の発現量を絶対量として又は相対量として把握することをいう。ここでの相対量の基準を例えば、悪性度に応じて用意した標準試料のIgSF4量にすることができる。通常は、IgSF4の発現の有無、及び発現している場合にはその量が調べられることになる。IgSF4を検出する際に厳密にIgSF4量を定量することは必須でない。例えば、被検細胞として肝細胞を用い、被検細胞(被検肝細胞)の悪性度を判定するためにIgSF4を検出する場合には、悪性度の指標となる対照のIgSF4量と比較することによって被検肝細胞の悪性度を判定することが可能な程度にIgSF4量を測定できればよい。
本発明の一態様ではIgSF4の転写産物であるmRNAをターゲットとした検出法を実施する。mRNAの検出(測定)にはRT-PCR法、特異的なプローブを用いた各種ハイブリダイゼーション法(例えばノザンハイブリダイゼーション、in situハイブリダイゼーション)などの常法を採用できる。本発明の他の態様では、IgSF4の発現産物(タンパク質)をターゲットとした検出法を実施する。
免疫学的手法(例えば免疫組織化学的染色法)でIgSF4を検出することが好ましい。免疫学的手法では抗IgSF4抗体が使用され、当該抗体の結合性(結合量)を指標としてIgSF4タンパク質が検出される。免疫学的検出法によれば迅速で感度のよい検出が可能となる。また、操作も簡便である。尚、検出方法としては例えば、ELISA法、ラジオイムノアッセイ、FCM、免疫沈降法、イムノブロッティング等の方法が挙げられる。
免疫組織化学的染色法によれば、迅速に且つ感度よくIgSF4を検出できる。また、操作も簡便である。従って、IgSF4の検出に伴う被検者(患者)への負担も小さくなる。
免疫組織化学的染色法では通常、まず被検細胞に抗IgSF4抗体を接触させるステップを実施し、その後、抗IgSF4の結合量を調べる。具体的には、以下に示す免疫組織化学的染色法に従って本発明の方法を実施することができる。
(1)固定・パラフィン包埋
外科的に生体より採取した組織をホルマリンやパラフォルムアルデヒド、無水エチルアルコール等によって固定する。その後パラフィン包埋する。一般にアルコールで脱水した後キシレンで処理し、最後にパラフィンで包埋する。パラフィンで包埋された標本を所望の厚さ(例えば3〜5μm厚)に薄切し、スライドガラス上に伸展させる。尚、パラフィン包埋標本に代えてアルコール固定標本、乾燥封入した標本、凍結標本などを用いる場合もある。
(2)脱パラフィン
一般にキシレン、アルコール、及び精製水で順に処理する。
(3)前処理(抗原賦活)
必要に応じて抗原賦活のために酵素処理、加熱処理及び/又は加圧処理等を行う。
(4)内因性ペルオキシダーゼ除去
染色の際の標識物質としてペルオキシダーゼを使用する場合、過酸化水素水で処理して内因性ペルオキシダーゼ活性を除去しておく。
(5)非特異的反応阻害
切片をウシ血清アルブミン溶液(例えば1%溶液)で数分から数十分程度処理して非特異的反応を阻害する。尚、ウシ血清アルブミンを含有させた抗体溶液を使用して次の一次抗体反応を行うこととし、この工程を省略してもよい。
(5)一次抗体反応
適当な濃度に希釈した抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(6)標識試薬の添加
標識物質としてペルオキシダーゼが頻用される。ペルオキシダーゼを結合させた2次抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(7)発色反応
トリス緩衝液にDAB(3,3'-diaminobenzidine)を溶解する。続いて過酸化水素水を添加する。このようにして調製した発色用溶液を数分間(例えば5分間)切片に浸透させ、発色させる。発色後、切片を水道水で十分に洗浄し、DABを除去する。
(8)核染色
マイヤーのヘマトキシリンを数秒〜数十秒反応させて核染色を行う。流水で洗浄し色出しする(通常、数分間)。
(9)脱水、透徹、封入
アルコールで脱水した後、キシレンで透徹処理し、最後に合成樹脂やグリセリン、ゴムシロップなどで封入する。
免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。抗原(IgSF4又はその一部)を調製し、これを用いてウサギ等の動物に免疫を施す。抗原としては、ヒトIgSF4の他、マウスIgSF4などヒト以外の種のIgSF4を用いることができる。これらのIgSF4は、生体試料を精製することにより得ることができる。また、組換えIgSF4を用いることもできる。組換えヒトIgSF4は例えば、IgSF4をコードする遺伝子(遺伝子の一部であってもよい)を、ベクターを用いて適当な宿主に導入し、得られた組換え細胞内で発現させることにより調製される。
免疫惹起作用を増強するために、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いてもよい。キャリアタンパク質としてはKLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)、BSA(Bovine Serum Albumin)、OVA(Ovalbumin)などが使用される。キャリアタンパク質の結合にはカルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、MBS(マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド)法などを使用できる。一方、IgSF4(又はその一部)を、GST、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク、又はヒスチジン(His)タグ等との融合タンパク質として発現させた抗原を用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。
一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず、上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物(例えばマウス)の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製には、プロテインG、プロテインA等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。
本発明の更なる局面は、IgSF4が癌細胞に特異的に発現しており、ADCCを利用した細胞障害の標的になるという知見に基づき、癌治療用途におけるIgSF4の利用に関する。また、成人T細胞白血病とIgSF4との間に関連性が認められるという知見に基づき、成人T細胞白血病治療用途におけるIgSF4の利用に関する。尚、ADCC活性等による細胞障害の標的としてIgSF4が有効であることは、本発明者らが取得に成功した肝癌特異的抗体の抗原を同定する過程において初めて判明したものである。この成果によって、抗IgSF4抗体が癌細胞特異的な傷害に有効な薬剤となると判断された。
この局面ではまず、IgSF4を標的として利用することで、癌細胞特異的に作用し傷害することが可能な薬剤(癌治療剤)及びそれを用いた治療方法、或いは成人T細胞白血病細胞に作用し傷害することが可能な薬剤(成人T細胞白血病治療剤)及びそれを用いた治療方法が提供される。本発明の薬剤の一態様では、抗IgSF4抗体が有効成分として含有される。本発明の薬剤の好ましい一態様では、ADCC活性を有する抗IgSF4抗体が有効成分として含有される。この態様の薬剤では、ADCC活性を利用した細胞障害によって治療効果を得ることができる。ADCC活性を有する抗IgSF4抗体として、後述の実施例に示す035-029抗体、035-273抗体、051-054抗体等(IgSF4に対する特異的結合性及びADCC活性を維持する限りにおいて一部改変したものであってもよい)、又はこれを基に構築されたタイプの異なる抗体(例えばIgG型)を用いる。これらの抗体はIgSF4に対する特異的結合性とADCC活性を併せ持つ。従って、IgSF4を発現する癌細胞に特異的に結合し、その後ADCC活性を発揮し、癌細胞に傷害を与えることが可能である。本発明の薬剤の標的となる癌細胞は特に限定されないが、例えば肝癌細胞、肺癌細胞等を標的とすることができる。
本発明の免疫複合体に含有させる活性成分として、所望の生物活性を有するタンパク質又はペプチドを使用してもよい。このような目的において使用可能なタンパク質等の候補として、アブリン、リシンA、シュードモナス・エキソトキシン、ジフテリア毒素、腫瘍壊死因子、インターフェロン-γ、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-6(IL-6)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)リンホカインを例示できる。
アンチセンス核酸としてDNA分子を使用する場合、本タンパク質をコードするmRNAの翻訳開始部位(例えば-10〜+10の領域)を含む領域に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
アンチセンス核酸は例えば市販の自動DNA合成装置(例えばアプライド・バイオシステムズ社等)を使用するなど、常法で合成することができる。核酸修飾体や誘導体の作製には例えば、Stein et al.(1988), Nucl. Acids Res. 16:3209やSarin et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451等を参照することができる。
アンチセンス核酸の発現は、哺乳動物細胞(好ましくはヒト細胞)で機能することが知られている任意のプロモーター(誘導性プロモーター又は構成的プロモーター)によって行うことができる。例えば、SV40初期プロモーター領域 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3'末端領域由来のプロモーター(Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797)、疱疹チミジン・キナーゼ・プロモーター(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)等のプロモーターを使用することができる。
尚、RNAiは様々な細胞種(例えば、HeLa細胞、NIH/3T3細胞、COS 細胞、293細胞等)において遺伝子発現を減少させる効果的な手段であることが確認されている。また、通常は、アンチセンス法よりも効果的に発現阻害を行える。
アンチセンス法の場合と同様に、例えば安定性やターゲット能を向上させることを目的として、修飾されたオリゴヌクレオチドを用いてリボザイムを構築してもよい。効果的な量のリボザイムを標的細胞内で生成させるために、例えば、強力なプロモーター(例えばpol IIやpol III)の制御下に、当該リボザイムをコードするDNAを配置した核酸コンストラクトを使用することが好ましい。
本発明の薬剤を用いた治療においては、癌細胞又は成人T細胞白血病細胞を保有する対象(患者)に本発明の薬剤が投与される。本発明の薬剤はその形態に応じて経口投与又は非経口投与(静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射、標的細胞への直接導入など)によって対象(患者)に適用され得る。
薬剤の投与量は症状、患者の年齢、性別、及び体重などによって異なるが、当業者であれば適宜適当な投与量を設定することが可能である。例えば、成人(体重約60kg)を対象として一日当たりの有効成分量が約0.001mg〜約100mgとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの設定においては、患者の病状や薬剤の効果持続時間などを考慮することができる。
本発明は更に、肝癌細胞又は成人T細胞白血病細胞に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング法を提供する。本発明のスクリーニング法は次のステップを含む。
(1)IgSF4と試験化合物とを接触させるステップ。
(2)試験化合物のIgSF4に対する結合性を評価するステップ。
以下、ステップ毎にその詳細を説明する。
ステップ(1)ではIgSF4と試験化合物とを接触させる。具体的には例えば、プレートや膜、或いはビーズ等の不溶性支持体に固定したIgSF4に反応用溶液内で試験化合物を接触させる。所定時間経過した後、適当な溶液で洗浄することで非特異的結合成分を除去する。
反応用溶液は特に限定されず、公知又は市販の緩衝液、生理食塩水などを用いることができる。反応条件(反応用溶液の組成及びpH等、並びに反応温度、反応時間等)は例えば、IgSF4とそれに対する特異的結合分子の一つである抗IgSF4抗体を用いた結合実験の結果を基に容易に設定することが可能である。例えば、反応用溶液としてはリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、トリス酢酸緩衝液などを用いることができ、そのpHは例えばpH6.0〜pH8.0、好ましくはpH6.5〜pH7.5とする。また、反応温度は例えば4℃〜45℃、好ましくは4℃〜40℃とすることができる。反応時間については例えば1分〜24時間の範囲で設定できる(具体的には例えばオーバーナイトで反応させる)。
試験化合物を抗IgSF4抗体と競合的にIgSF4に接触させることにしてもよい。即ち、試験化合物の存在下及び非存在下でそれぞれ、IgSF4と抗IgSF4抗体を接触させる実験系を採用してもよい。IgSF4に対する結合活性を試験化合物が有すれば、試験化合物の存在によって、抗IgSF4抗体のIgSF4に対する結合が阻害される。従って、IgSF4に結合した抗IgSF4抗体の量を、試験化合物の存在下で抗IgSF4抗体を接触させた場合と、試験化合物の非存在下で抗IgSF4抗体を接触させた場合との間で比較すれば、間接的に試験化合物のIgSF4に対する結合活性を求めることができる。
本発明のスクリーニング法に供する試験化合物としては、様々な分子サイズの有機化合物(核酸、ペプチド、タンパク質、脂質(単純脂質、複合脂質(ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等)、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド等))又は無機化合物を用いることができる。試験化合物は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。尚、細胞抽出液、培養上清などを試験化合物として用いてもよい。
ステップ(2)では、試験化合物のIgSF4に対する結合性を評価する。即ち、試験化合物のIgSF4への結合量を測定し、測定結果から結合活性を求める。IgSF4に対する結合量の測定は、試験化合物の種類、性状などに応じて適当な方法で実施される。例えば試験化合物がタンパク質性分子であれば、IgSF4に結合した成分を回収した後にタンパク質量を測定することや、試験化合物に特異的に結合性を有する抗体を用いた免疫学的手法などの利用によって、IgSF4に結合した試験化合物量を算出することができる。これらの方法は単なる一例であって、IgSF4への結合量を測定できる限りにおいて任意の測定法を採用することができる。
上記のように抗IgSF4抗体を用いた実験系を採用した場合には、IgSF4に結合した抗IgSF4抗体の量が測定対象となる。そして、測定結果(抗IgSF4抗体の結合量)から試験化合物の結合活性が求められる。
(1)IgSF4遺伝子を発現する細胞を用意するステップ。
(2)前記細胞に試験化合物を接触させるステップ。
(3)癌細胞の死滅又は減少を評価するステップ。
以下、ステップ毎にその詳細を説明する。
ステップ(1)では、IgSF4遺伝子(標準的なヒトIgSF4遺伝子の塩基配列が配列番号:146に示される)を発現する細胞を用意する。好ましくはヒトIgSF4遺伝子を発現する細胞が使用されるが、ヒト以外の種のIgSF4遺伝子(例えばマウスやラットのIgSF4遺伝子)を発現する細胞を使用することもできる。
ヒト以外の動物細胞(例えばマウス、ラット、ウサギ、ニワトリなど)であることを条件として、生体から分離されていない状態(即ち生体を構成している状態)の細胞を使用してもよい。
ステップ(2)では、用意した細胞に試験化合物を接触させる。試験化合物の接触は例えば、培養液中に試験化合物が存在する条件下で細胞を所定時間培養することによって実施される。或いは、試験化合物又はそれを含む溶液などを直接細胞に接触させることにしてもよい。
投与量は任意に設定可能である。例えば、細胞に致死的な影響を与えない範囲で可能な限り最大の投与量とすることができる。
接触時間は特に限定されない。例えば、接触時間を1分〜10日の範囲内で設定することができる。間隔をおいて連続的に接触させてもよい。
ステップ(3)では、試験化合物の接触後、癌細胞の死滅又は減少を評価する。例えば、試験化合物を接触させる細胞(試験群)と試験化合物を接触させない細胞(対照群)とを用意し、試験群、対照群それぞれについて癌細胞数を計測し、比較する。対照群に比較して試験群の生存細胞数が少ない場合、即ち試験化合物に癌細胞死滅作用が認められる場合には、当該試験化合物が肝癌に有効であると判定できる。従って、このような化合物を肝癌治療薬の候補として選抜する。試験群において顕著な細胞の死滅が認められる場合には、当該試験化合物が肝癌に特に有効な化合物であると判定できる。従って、このような化合物を肝癌治療薬の非常に有望な候補として選抜する。
(1)成人T細胞白血病細胞を用意するステップ。
(2)前記細胞に試験化合物を接触させるステップ。
(3)前記細胞の死滅又は減少を評価するステップ。
以下、ステップ毎にその詳細を説明する。尚、特に言及しない事項については、上記の「肝癌の治療に有効なIgSF4結合性化合物のスクリーニング法」における対応する説明が準用される。
ステップ(1)では、成人T細胞白血病細胞を用意する。成人T細胞白血病細胞株としてKK1、KOB、ST1が樹立されており、これらの中のいずれかを本発明の方法に供することができる。患者由来の細胞を用いることもできる。
ステップ(2)では、用意した細胞に試験化合物を接触させる。試験化合物の接触方法や投与量、接触時間、使用される試験化合物などは上記の説明に準ずる。
ステップ(3)では、試験化合物の接触後、成人T細胞白血病細胞の死滅又は減少を評価する。例えば、試験化合物を接触させる細胞(試験群)と試験化合物を接触させない細胞(対照群)とを用意し、試験群、対照群それぞれについて成人T細胞白血病細胞数を計測し、比較する。対照群に比較して試験群の生存細胞数が少ない場合、即ち試験化合物に成人T細胞白血病細胞死滅作用が認められる場合には、当該試験化合物が成人T細胞白血病に有効であると判定できる。従って、このような化合物を成人T細胞白血病治療薬の候補として選抜する。試験群において顕著な細胞の死滅が認められる場合には、当該試験化合物が成人T細胞白血病に特に有効な化合物であると判定できる。従って、このような化合物を成人T細胞白血病治療薬の非常に有望な候補として選抜する。
本発明は更に、肝癌細胞で特異的に発現することが明らかとなったIgSF4遺伝子の研究用途に関する。この局面の一態様では配列番号:146の塩基配列を有する単離された核酸、又はその相同核酸を含む肝癌研究用試薬が提供される。本発明の他の態様では配列番号:145のアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質、又はその相同タンパク質を含む肝癌研究用試薬が提供される。
本発明の試薬は肝癌の発症メカニズムや症状の進展メカニズムなどを研究するための実験ツールとして利用され得る。また、本発明の方法(肝癌診断用の情報を取得する方法、肝癌の悪性度判定法、スクリーング方法など)を実施するための試薬として、又は本発明の薬剤の構成成分として利用することができる。本発明の試薬を、肝癌のモデル動物としてのキメラマウスやトランスジェニックマウスの作製に利用することもできる。
本発明の試薬において核酸は、例えば、適当なベクター(例えば発現ベクター)に挿入された状態で含有される。
相同核酸の更に他の例として、SNPに代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相違が認められる核酸を挙げることができる。
本発明の各方法(スクリーニング法、診断用の情報を取得する方法など)を、キット化した試薬等を用いて実施してもよい。本発明の他の局面はこのような目的に使用されるキットを提供する。例えば、本発明の方法における検出に利用される核酸(プローブやプライマー)、反応用試薬、希釈液、反応容器などをキットに含めることができる。尚、本発明のキットには通常、使用説明書が添付される。
キットを用いることによって、本発明の方法をより簡便に且つより短時間で実施することが可能となる。
また一方で、タグやキャリアタンパク質(以下、タグ等という)との融合タンパク質を抗原として作製した抗IgSF4抗体を使用する場合には、用いたタグ等をキットに更に含めることにしてもよい。キットを構成する抗IgSF4抗体中に、その作製過程で使用したタグ等に反応性を有する抗体が混在しているおそれのある場合に当該タグ等が必要となる。以下のように当該タグ等を利用すれば、キットを使用して得られた染色性が抗IgSF4抗体とIgSF4抗体との特異的結合に基づくものであることを確認することができる。まず、このタグ等で抗IgSF4抗体を処理する。処理後の抗IgSF4抗体を用いて検体の免疫染色を行う。得られた染色像と、未処理の抗IgSF4抗体を使用して得られた染色像とを比較する。両者の間で染色性に相違がなければ、後者の染色像における染色性は抗IgSF4抗体とIgSF4との特異的結合に基づくものであることを確認できる。
本発明のキットに、抗原抗体反応や染色等、免疫染色を実施する上で必要な一以上の試薬(例えば、組織固定・包埋用のホルマリンやパラフィン、非特異的結合を阻害するためのBSA、DAB等の発色試薬、核染色用のヘマトキシリン溶液など)や器具などを更に含めてもよい。また通常は、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。
本発明の更なる局面は、IgSF4を抗原として利用することに関する。つまり、IgSF4を抗原として利用することによって、IgSF4に特異的結合性を有する抗体を取得する方法が提供される。例えば、古典的な免疫学的手法による免疫用抗原として、又はファージディスプレイ法などの遺伝子工学的手法を用いた抗体作製法におけるスクリーニング用抗原としてIgSF4が用いられる。
抗原としてのIgSF4として、以下のいずれかのIgSF4を用いることができる。
(1)大腸菌の発現系を用いて生産されたIgSF4、
(2)動物細胞の発現系を用いて培地中に分泌させたIgSF4、
(3)動物細胞の発現系を用いて細胞表面上に発現させたIgSF4、
(4)T抗原を発現していて一過性の発現が可能である動物細胞の発現系を用いて、培地中に分泌させた又は細胞表面上に発現させたIgSF4。
また、抗原として用いる場合、IgSF4は膜タンパクであるため、細胞外ドメインの部分タンパクを抗原として用いることが好ましく、さらに好ましくは細胞に発現されている状態の膜画分、最も好ましくはIgSF4高発現細胞自身を抗原としてIgSF4抗体取得に用いるのが好ましい。これらIgSF4細胞外ドメインを認識する抗体は免疫染色に用いられるだけでなくADCC活性を呈するポテンシャルがあり、IgSF4を抗原として結合抗体を得る方法は治療用抗体を取得する方法として有効である。
1-1 scFv抗体遺伝子ライブラリーを作製するためのベクターの作製
図1に概念的に示すように、pTZ19Rファージミドベクター(ファルマシア)にM13ファージのpelB(シグナル配列)、His6タグ配列、M13ファージのcp3蛋白質(Δcp3(198aa-406aa)N端欠失キャプシド蛋白質3)配列、proteinA蛋白質配列を適当な制限酵素部位で組み込みベクターpAALFabを作製した(Iba Y. et al., Gene 194 : 35-46, 1997. 参照)。このpAALFabから組み込み用ベクターpFCAH9-E8dを作成した。
用いたプライマー:
527 Reverse(配列番号:147):
5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'
599 E8VHf-PstR:(配列番号:148)
3'-CGGCTCCAAGTCGACGTCGTCA-5'
544 E8VHf-PstF:(配列番号:149)
5'-CAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAA-3'
545 E8VHf-XbaR:(配列番号:150)
3'-AGACCGAAGTTGTAATTTCTGTGGATATACGTGACCCACTTCGTCTCCGGACTTTTCCCAGATCTCACCTAACCTTCCTAA-5'
546 E8VHf-XbaF:(配列番号:151)
5'-AAGGGTCTAGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAGTGGTAATACTAAATATGACCCGAAGGACAAGGCCACTATAACAGCA-3'
547 E8VHf-EcoR(配列番号:152)
3'-TTCCTGTTCCGGTGATATTGTCGTCTGTGTAGGAGGTTGTGTCGGATGGATGTCGACTTAAGGGAC-5'
548 E8VHf-EcoF(配列番号:153)
5'-CAGCTGAATTCCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTGGT-3'
549 E8VHf-BstR(配列番号:154):
3'-CAGATAATGACACGACCAATACTAATGCCGTTGAAACTGATGACCCCGGTTCCGTGGTGCCAGTGGCACAAGG-5'
590 His6-SmaR(配列番号:155):
3'-GGTTCTCTAACAGTAGTGGTAGTAGTGGTAATTATTCTCGATAGGGCCCTCGAA-5'
542 E8VLf-SacF(配列番号:156):
5'-GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCAGCCTCCCTTTCTGCGTCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGT-3'
539 E8VLf-KpnR(配列番号:157):
3'-TGACAGTGGTAGTGTACAGCTCGTTCACCCTTATAAGTGTTAATAAATCGTACCATGGTCGTC-5'
542 E8VLf-KpnF(配列番号:158):
5'-GCATGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTAT-3'
543 E8VLf-BamR(配列番号:159):
3'-GGAGTCGAGGACCAGATATTACGTTTTTGGAATCGTCTACCACACGGTAGTTCCAAGTCACCGTCACCTAGGCCTTGTGTT-5'
562 E8VLf-XhoR(配列番号:160):
3'-TCATGAGGCACCTGCAAGCCACCTCCGTGGTTCGAGCTCTAGTTT-5'
563 E8VLf-XhoF(配列番号:161):
5'-AGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTCGAGATCAAA-3'
613 NheR(配列番号:162):
3'-ATCGACAGCT-5'
600 E8VLKpnXhoR(配列番号:163):
3'-AAGCCACCTCCATGGTTCGAGCTCTAGTTT-5'
LCP3ASC(配列番号:164):
3'-TCGAAGTTGTCCTTACTCACAAGCCGCGCGGTCAGCTGAGGTAA-5'
hCH1Bst(配列番号:165):
5'-ACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGG-3'
hCH1midAS(配列番号:166):
3'-GGGAGTCGTCGCAGCACTGGCACGGGAGGTCGTCGAA-5'
hCH1midS(配列番号:167):
5'-GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTCGTGACCGTGCCC-3'
hCH1H6(配列番号:168):
3'-GGGTCGTTGTGGTTCCACCTGTTCTTTCAACTCGGGTTTAGAACAGTAGTGGTAGTAGTGGTA-5'
hCH1H6Sma(配列番号:169):
3'-GGGTTTAGAACAGTAGTGGTAGTAGTGGTAATTATTCTCGATAGGGCCCTCGAACG-5'
702 BstXhoF(配列番号:170):
5'-GGCACCACGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACC-3'
1)pAALFabを鋳型にして527-599を用いたPCR, 547-590を用いたPCRを行いDNA断片を作製した。
2)544-545,546-547,548-549にてPCRを行いDNA断片を作製した。
3)1)2)を混合し527,590によるPCRを行い、これをpAALFabのHindIII-SmaI siteにクローンニングした。
4)542-562, 561-613を用いたPCRを行いDNA断片を作製した。
5)538-539,542-543にてPCRを行いDNA断片を作製した。
6)4)5)を混合し538,562によるPCRを行い、これをpAALFabのSacI-NheI siteにクローンニングした。
7)VH stuffer部分の作製
pFCAH3-E8TをXbaI,EcoRIにて消化、klenow fragmentを作用させて平滑末端に変えた後self ligationさせてVH部分のstufferを作製した。
8)VL stuffer部分の作製
pFCAH3-E8Tを鋳型にして527-600にてPCR。7)のHindIII-XhoI siteにクローニングした。
9)これをKpnIにて消化、self ligationさせてVL部分のstufferを作製した。
10)SfiI,NcoI,SpeI siteの導入
pFCAH3-E8Tを鋳型にして527-663にてPCR。1)のHindIII-SacI siteにクローニングした。
11)AscI siteの導入
pFCAH3-E8Tを鋳型にして527-LCP3ASCにてPCRし、それをSacI完全消化、SalI部分消化した2)にクローニングした。
12)gammaCH1部分をヒト遺伝子に変換
ヒトgammaCH1部分にはBstPI siteが存在するためこれをなくす設計でクローニングを行った。ヘントウ腺cDNAを鋳型にしてhCH1Bst-hCH1midS, hCH1midAS-hCH1H6にてPCRしたのち、これを混合してhCH1Bst-hCH16SmaにてPCRし、そのDNA断片を3)のBstPI-Sma siteにクローニングした
13)Xho siteの導入
12)を鋳型に702-663にてPCRを行い、これを12)のBstPI-SacI siteにクローニングした。
pFCAH9-E8d 3μg(3μL)(図1Dを参照)をBstPI(3U/μL)3μL、10×H buffer 5μL、DW39μLと混合し、37℃で2時間、制限酵素処理を行った。処理後、エタノール沈殿して得られた沈殿を10μLのTEバッファーに溶解した。これに、SacI(10 U/μL )1μL、10×L buffer 5μL、DW34μLを混合して37℃で2時間、制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動して、4.7kb断片を回収した。回収物をエタノール沈殿して10μLとした(pFCAH9-E8d BstPI- SacI断片)。
プライマーlinF(配列番号:173)
GTCACCGTCTCGAGAGGCGGTGGCGGATCAGGTGGCGGTGGAAGTGGCGGTGGTGGGTCCATGGCCGACATCGAGCT
プライマーlinR(配列番号:174)
CGATGTCGGCCATGGACCCACCACCGCCACTTCCACCGCCACCTGATCCGCCACCGCCTCTCGAGACG
公知の手法(Iba Y. et al., Gene 194:35-46, 1997.参照)に従って、まずpAALFabベクター(図1A)を作製した。pAALFabベクターのXbaIからEcoRIの間を欠落させ、新たに制限酵素切断部位Kpn I, Sfi I, Nco I, Spe Iを付加して、pFCAH3-E8T(図1B)を経て、VH(重鎖可変領域)をクローニング可能としたベクターpscFvCA-E8VHd(図1C)を作製し、重鎖可変領域を一時的にクローニングするためのベクターとした。図4−1〜図4−2にpscFvCA-E8VHdのインサートの塩基配列(配列番号:175)及び制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列(配列番号:176)を示した。
610 scBstSpeSacF(配列番号:177):
5'-CACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGTGGCGGATCAGGTGGCGGTGGAAGTGGCGGTGGTGGGTCTACTAGTGACATCGAGCTCACCCAG-3'
611 scBstSpeSacR(配列番号:178):
3'-GTGGTGCCAGTGGCAGAGGAGTCCGCCACCGCCTAGTCCACCGCCACCTTCACCGCCACCACCCAGATGATCACTGTAGCTCGAGTGGGTC-5'
527 Reverse(配列番号:179):
5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'
619 E8VHf-SfiNcoPstR(配列番号:180):
3'-GACGCCGGGTCGGCCGGTACCGGCTCCAAGTCGACGTCGTCA-5'
2-1 PCRを用いたイムノグロブリン軽鎖遺伝子の単離
骨髄細胞(検体No.59)4×107 cells、および臍帯血と末梢血のリンパ球から、市販のキット(Pharmacia Biotech社製 QuickPrep Micro mRNA Purification Kit)を用いて、2.6μgのmRNAを得た。このmRNAからcDNAを作製した。cDNAは、GibcoBRL社製 SuperScriptPreamplification Systemによって作製した。プライマーには、オリゴdTを用いた。得られたcDNAを鋳型にして、軽鎖遺伝子の取得用5’プライマー(κ1 〜κ6、λ1〜λ6 )と3’プライマー(hCKASCプライマーまたはhCLASCプライマー)を用いて、PCRを行った。PCR産物は、フェノール処理後、エタノール沈殿して10μLのTEバッファーに懸濁した。用いたプライマーの塩基配列とPCRの条件は以下のとおりである。軽鎖遺伝子取得用プライマーの塩基配列中、下線部はNcoIサイト、AscIサイトを示す。
hVK1a(配列番号:181):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GACATCCAGATGACCCAGTCTCC
hVK2a(配列番号:182:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC
hVK3a(配列番号:183):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC
hVK4a(配列番号:184):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GACATCGTGATGACCCAGTCTCC
hVK5a(配列番号:185):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAAACGACACTCACGCAGTCTCC
hVK6a(配列番号:186):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC
5’-プライマーλ1〜λ6
hVL1(配列番号:187):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC
hVL2(配列番号:188):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC
hVK3a(配列番号:189):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC TCCTATGTGCTGACTCAGCCACC
hVL3b(配列番号:190):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC
hVL4(配列番号:191):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CACGTTATACTGACTCAACCGCC
hVL5(配列番号:192):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGCC
hVL6(配列番号:193):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA
3’-プライマーhCKASC(配列番号:194):
TCGACTGGCGCGCCGAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTG
3’-プライマーHCLASC(配列番号:195):
TCGACTGGCGCGCCGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTTCTC
cDNA 2μL
10× buffer ♯1(KODに添付) 10μL
dNTP mix(2.0mM) 10μL
25mM MgCl2 4μL
5'側プライマー(100pmol/μL) 1μL
3'側プライマー(100pmol/μL) 1μL
滅菌済MilliQ 71μL
KOD DNA polymerase(東洋紡2.5U/μL) 1μL
94℃ 1分、55℃ 2分、74℃ 1分を35サイクル
1で得たPCR産物を以下の条件で制限酵素処理した。
PCR産物 10μL
10×NEB4(AscIに添付) 5μL
滅菌済MilliQ 33μL
AscI (NEB社 10 U/μL) 1μL
NcoI (宝酒造社 10 U/μL) 1μL
制限酵素処理したpscFvCA9-E8VHdVLd 2μL
制限酵素処理したPCR産物 1μL
10×ligation buffer 1.5μL
(T4 DNA ligaseに添付)
10mM ATP 1.5μL
滅菌済MilliQ 8μL
T4 DNA ligase (宝酒造 10 U/μL) 1μL
得られたligated DNAを用いて以下のように大腸菌DH12Sを形質転換した。即ち、ligated DNA を一旦エタノール沈殿し、1/5TE(TEを滅菌済MilliQで5倍希釈したもの)3μLに溶解した。そのうち、1.5μLをコンピテントセルDH12S(GIBCO BRL製)20μLに懸濁し、以下の条件でエレクトロポレーションを行った。
エレクトロポレーター
BRL社Cell-Porator(Cat.series 1600)
設定条件;voltage booster 4kΩ
capacitance 330μF
DC volts LowΩ
charge rate Fast
bacto-tryptone 20g
bacto-yeast extract 5g
NaCl 0.5g
2×YT培地:900mLの精製水に次の成分を加えて振とうし、完全に溶解した後5N NaOHでpHを7.0に調製し、精製水を加えて1000mLとした。オートクレーブで20分間滅菌して使用した。
bacto-tryptone 16g
bacto-yeast extract 10g
NaCl 5g
その他の試薬は以下から購入した。
メーカー 品名
シグマ アンピシリンナトリウム
和光純薬 フェノール
シグマ BSA
DIFCO 2×YT培地
和光純薬 カナマイシン硫酸塩
ナカライテスク ポリエチレングリコール6000
ナカライテスク Tween20
片山化学 NaCl
和光純薬 IPTG
和光純薬 スキムミルク
和光純薬 アジ化ナトリウム
和光純薬 トリエチルアミン
和光純薬 過酸化水素
和光純薬 OPD錠
和光純薬 エタノール
-------------------------------------------------
family in vivoでの VLライブラリー KL200での
使用頻度(%)* での構成比率(%) 構成比率(%)
Vκ1 39 37 30.7
Vκ2 12 12 19.8
Vκ3 36 35 33.7
Vκ4 12 12 10.9
Vκ5 1 2 5.0
Vκ6 -** 2*** 0.0
-------------------------------------------------
* Griffith AD et al. EMBO J. (1994) 13, 3245-60.
**発表時記載なし。
*** プライマーVK6-2で作製したcDNAとプライマーVK6-3で作製したcDNAを等量混合。
-------------------------------------------------
family in vivoでの VLライブラリー KL200での
使用頻度(%)* での構成比率(%) 構成比率(%)
Vλ1 43 41 34.1
Vλ2 15 15*3 15.2
Vλ3 34 32*4 25.3
Vλ4 0 1.5*5 0.0
Vλ5 0 1.0*6 11.1
Vλ6 0 1.0 14.1
Vλ7 6 6 0.0
Vλ8 1 1 0.0
Vλ9 1 1 0.0
Vλ10 -*2 1 0.0
-------------------------------------------------
* Griffith AD et al. EMBO J. (1994) 13, 3245-60.
*2 発表時記載なし。
*3 プライマーVL2で作製したcDNA5%とプライマーVL2-2で作製したcDNA10%を混合。
*4 プライマーVL3a-2で作製したcDNA17%とプライマーVL3bで作製したcDNA15%を混合。
*5 プライマーVL4aで作製したcDNA0.5%とプライマーVL4bで作製したcDNA0.5%とプライマーVL4cで作製したcDNA0.5%を混合。
*6 プライマーVL5abdeで作製したcDNA0.5%とプライマーVL5cで作製したcDNA0.5%を混合。
3-1-1 PCRを用いたイムノグロブリン重鎖遺伝子の単離
2-1と同様の手順を用いて臍帯血、骨髄液、および末梢血のリンパ球、並びに扁桃腺からhuman μ primer(以下に示すプライマーの634)あるいはrandom hexamerを用いてcDNAを調製し、このcDNAを鋳型にして、以下に示すヒト抗体重鎖遺伝子の取得用5’プライマー(VH1〜VH7)と3’プライマー(human JHプライマー4種を等量混合したもの、以下に示すプライマーの697〜700)、または、humanμプライマー(以下に示すプライマーの634)を用いて、PCRを行った。表中、下線をつけた部分はSfiIサイトを示す。hVH2aはgerm line VH2 familyに対応していないため、新たにVH2a-2を設計した。またhVH4aではVH4ファミリー全体に対応していないため、新たにhVH4a-2を設計した。VH5aもgerm line VH5 subfamilyに対応していなかったため新たにVH5a-2を設計した。またVH7に対応するprimerとしてhVH7を設計した。これらについても遺伝子増幅を行い、pscFvCA-E8VHdに組み込み、どのような遺伝子がとれたのかを塩基配列決定した。hVH5a-2についてはhVH1aと配列が酷似しているため、hVH1aで増幅させたものと同様の遺伝子産物が得られることが予想されるためこれについては使用しなかった。PCR産物は、フェノール処理後、エタノール沈殿して10μLのTEバッファーに懸濁した。
ATGGAGTCGGGAAGGAAGTC
各VH familyの増幅に使用したprimer
Human VH primer SfiI siteを下線で示す。
628 hVH1a(配列番号:197):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG
629 hVH2a(配列番号:198):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG
630 hVH3a(配列番号:199):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG
631 hVH4a(配列番号:200):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG
632 hVH5a(配列番号:201):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC
633 hVH6a(配列番号:202):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG
629-2 hVH2a-2(配列番号:203):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGRTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCC
631-2 hVH4a-2(配列番号:204):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG
632-2 hVH5a-2(配列番号:205):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG
712 hVH7(配列番号:206):
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGT
Human JH primer BstPI, XhoI siteを下線で示す。
697 hJH1-2(配列番号:207):
GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTGC
698 hJH3(配列番号:208):
GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCATTGTCC
699 hJH4-5(配列番号:209):
GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTTC
700 hJH6(配列番号:210):
GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCGTGGTCC
cDNA 2μL
10× buffer ♯1(KODに添付) 10μL
dNTP mix(2.0mM) 10μL
25mM MgCl2 4μL
5'側プライマー(100pmol/μL) 1μL
3'側プライマー(100pmol/μL) 1μL
滅菌済MilliQ 71μL
KOD DNA polymerase(東洋紡2.5U/μL) 1μL
PCR条件:94℃ 1分、55℃ 2分、74℃ 1分を35サイクル
3-1-1で得たPCR産物を以下の条件で制限酵素処理した。
PCR産物 10μL
10×K buffer(宝酒造) 5μL
滅菌済MilliQ 33μL
SfiI (NEB社10 U/μL) 1μL
XhoI (宝酒造12 U/μL) 1μL
37℃で2時間反応後、そのうち10μL分をアガロース電気泳動し、400bp付近のバンドを切り出して、ジーンクリーンIIキット(フナコシ株式会社)で精製した。PCR産物と同様に制限酵素処理したpscFvCA-E8VHdをジーンクリーンIIキットで精製し、制限酵素処理したPCR産物と以下の条件で16℃で4時間〜一晩反応させることによりライゲーションした。
制限酵素処理したpscFvCA-E8VHd 2μL
制限酵素処理したPCR産物 1μL
10×ligation buffer 1.5μL
(T4 DNA ligaseに添付)
10mM ATP 1.5μL
滅菌済MilliQ 8μL
T4 DNA ligase (宝酒造 10 U/μL) 1μL
得られたDNAを大腸菌DH12Sに形質転換した。具体的には DNA を一旦エタノール沈殿し、1/5TE(TEを滅菌済MilliQで5倍希釈したもの)3μLに溶解する。そのうち、1.5μLをコンピテントセルDH12S(GIBCO BRL製)20μLに懸濁し、エレクトロポレーション法により形質転換を行った。
エレクトロポレーター
BRL社Cell-Porator(Cat.series 1600)
設定条件;voltage booster 4kΩ
capacitance 330μF
DC volts LowΩ
charge rate Fast
-------------------------------------
family in vivoでの VLライブラリー
使用頻度(%)* での構成比率(%)
VH1 25 29**
VH2 6.6 7
VH3 40 40
VH4 19 19***
VH5 5 - **
VH6 3.8 4
VH7 1.2 2
-------------------------------------
*Griffith AD et al. EMBO J. (1994) 13, 3245-60.
** 実際にはVH1とVH5は同一のプライマーで増幅されるため、分離して集計できない。
***VH4プライマーで作製したcDNAとVH4-2プライマーで作製したcDNAを混合してこの割合とした。
VHライブラリー200μgを下記条件でHindIIIとXhoIで消化し、重鎖遺伝子を切り出して、ジーンクリーンIIキットで精製した。
VHライブラリー200μg 100μL
10×K buffer(宝酒造) 40μL
滅菌済MilliQ 205μL
HindIII (宝酒造40 U/μL) 30μL
XhoI (宝酒造50 U/μL) 25μL
VLライブラリーの挿入されたベクターpscFvCA9-E8VHdVLdについても下記条件でHindIIIとXhoIで消化し、軽鎖遺伝子を含む断片を、ジーンクリーンIIキットで精製した。
VLライブラリーを挿入したpscFvCA9-E8VHdVLd 100μg 100μL
10×K buffer(宝酒造) 40μL
滅菌済Milli-Q 230μL
HindIII (宝酒造40 U/μL) 15μL
XhoI (宝酒造50 U/μL) 15μL
制限酵素処理した
VHライブラリー断片 10μg 50μL
制限酵素処理した
VLライブラリーの断片
を含むpscFvCA9-E8VHdVLd 40μg 50μL
10×ligation buffer
(T4 DNA ligaseに添付) 100μL
10mM ATP 100μL
滅菌済MilliQ 670μL
T4 DNA ligase (宝酒造 10 U/μL) 30μL
反応の終了したDNAを用いて大腸菌DH12Sを形質転換した。具体的にはDNAを一旦エタノール沈殿し、1/5TE(TEを滅菌済MilliQで5倍希釈したもの)30μLに溶解した。これをコンピテントセルDH12S(GIBCO BRL製)500μLに懸濁し、エレクトロポレーションを行った。
BRL社Cell-Porator(Cat.series 1600)
設定条件;voltage booster 4kΩ
capacitance 330μF
DC volts LowΩ
charge rate Fast
1%グルコース及び100μg/mL のアンピシリンを加えた2×YT培地300mLを入れた5リットルのフラスコ16本にAIMS-5懸濁液を2.5mLを加え、37℃で振とう培養し1時間おきに波長600nmにおける吸光度を測定しながら、吸光度が1.0になるまで増殖させた。培養液にヘルパーファージ液(M13KO7)をフラスコ当たり12mL加えてヘルパーファージを感染させ、37℃で2時間培養し、ヘルパーファージ感染済みDH12Sとした。
5リットルのフラスコ24本に2×YT培地600mLと100μg/mLのアンピシリン0.6mL、50μg/m、38Lのカナマイシン0.8mL、ヘルパーファージ感染済みDH12S 200mLを加えて37℃で20時間振とう培養した。
回収したファージ溶液の力価は以下のようにチェックした。すなわち、ファージ溶液をPBSで106、107、108倍希釈し、その10μLをDH12S 990μLに感染させ、37℃で1時間培養した。これをLBGAプレートに100μL播いて30℃で18時間培養した。コロニーの数をカウントすることにより希釈前の原液の力価を算出した。ファージ溶液原液を0.05% NaN3を含むPBSに2×1014/mLになるよう懸濁した。
5-1 肝癌細胞株HepG2、Nuk-1を使用したスクリーニング
まずHepG2細胞を15cm ディッシュで培養し、それを2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco BRL)でディッシュから解離させた。それを冷却したPBSで洗い、4x107を使用した。これに1x1013cfuのヒト抗体ファージライブラリーを混ぜ、反応液の終濃度を1%BSA-0.1%NaN3/MEM、容積1.6mlとし、4℃にて4時間ゆっくり回転させて反応させた。反応終了後、反応液を二つに分け、それぞれを0.6mlの有機溶液(dibutyl phtalate cycloheximide 9:1)の上に重層し、マイクロ遠心機にて3000rpmの遠心力を2分間作用させ、細胞をチューブの底に沈降させた。それぞれのチューブについて、溶液を捨て、細胞を0.7mlの1%BSA/MEMで懸濁、0.7mlの有機溶媒の上に重層して遠心した。この操作をもう一度繰り返したのち、溶液を捨て、細胞を0.3mlのPBSで懸濁、液体窒素で凍結し、37℃で融解した。
2edスクリーニングには培養細胞2x107と1stファージ1x1010を使用し、反応液の容積を0.8mlとした。反応液は1%BSA-0.1%NaN3/MEMで、全体のスケールを1stスクリーニングの半分で行った。
3rdスクリーニングは2ndファージ1x109を使用する以外は2ndスクリーニングと同じ条件で行った。
C型肝炎患者由来の肝癌細胞株についてのスクリーニングもHepG2に対するスクリーニングと同様にして行った。
HepG2についての3rdスクリーニングの段階で回収率が上がったことから(図5)、この段階でHepG2細胞特異的な抗体クローンが濃縮されたと判断し、480個のクローンをピックアップした。これらについて、抗体発現チェックを行い、発現陽性のクローン225個を選択した。次にこれらの陽性のクローンについて、H鎖部分の塩基配列解析を行ったところ、130種類に分類されることがわかった。それら130個について、抗体サンプルを調整し、3人の患者より得た手術材料について、肝癌部と肝非癌部についての組織染色を行ったところ、癌特異的な染色が観察されたのは33個であった。これらのうち、特に癌の膜部分を染色していたものは19個であった(図6)。同様にC型肝炎患者由来の肝癌細胞株NUK-1をスクリーニングし(図5)、肝癌部の細胞膜を特異的に染色する抗体クローン8個を得た(図6)。これらの抗体クローンについて、不死化肝細胞THLE-3、肝癌細胞株HepG2, HLFについての細胞染色を行い、癌細胞膜特異的認識を示す抗体クローンを選別した。その結果、035-029, 035-212, 035-215, 035-273, 035-283, 040-131, 051-054, 051-181, 051-129、035-130、及び035-169が特に癌細胞特異性が高いことが示された。
図7、8に抗体クローン035-273による肝癌組織の染色像を示す。同様に、図9に抗体クローン051-129による肝癌組織の染色像を、図10に抗体クローン035-169による肝癌組織の染色像をそれぞれ示す。図7〜10より明らかなように、これらの抗体は癌部の細胞膜を特異的に染色し、非癌部の組織は染色しない。また、図11に示すように、抗体035-273は低分化型肝癌細胞株HepG2, 未分化型肝癌細胞株HLF, C型肝炎患者由来細胞株Nuk-1を染色するが、高分化型肝癌細胞株HuH-7や不死化肝細胞THLE-3はほとんど染色しなかった。尚、抗体クローン035-029, 035-212, 035-215, 035-283, 040-131, 051-054, 051-181によっても同様の染色結果が得られた(結果を図示せず)。
尚、細胞染色及び組織染色はそれぞれ次の手順で行った。
細胞は2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco BRL)でディッシュから解離させたのち、10%FBS/D MEMにて回収し、1x105を使用した。これを2.5%BSA, 0.05%NaN3/PBS(BSA液)にて洗浄したのち、2.5% normal goat serum/BSA液100μlに懸濁して氷上に30分静置したのち、cp3型抗体を5μg/mlになるように加えて、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、抗cp3マウスモノクローナル抗体(株式会社医学生物学研究所)5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、Alexa488結合抗マウスIgGヤギ抗体(Molecularprobe社製)5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて二度洗浄したのち、上清を捨て、これにベックマン・コールター社製OptiLyse B 50μlを加えて室温にて10分間静置し、細胞を固定した。これに1ng DAPI/BSA液950μlを加え、室温にて10分静置、遠心して細胞を集め、ICN社製MULTITEST SLIDEに封入して顕微鏡観察した。
(1)抗体サンプルの調製
大腸菌通夜培養液0.5mlを10mlの2xYTAI(2xYT, 200μg/ml ampicillin sulfate,0.5mM IPTG)に植えて30℃にて通夜培養、マイクロ遠心機にて15000rpm 5分間遠心して上清を回収した。これに等量の飽和硫安を加えて室温に30分静置したのち、室温にて10000rpm 5分間遠心して上清を捨て、得られた沈殿物を1mlのPBS-0.05%NaN3, プロテアーゼインヒビター液にて懸濁、4℃にて15000rpm 5分間遠心して上清を回収した。
(2)組織染色用切片作製
摘出された組織は5mm×5mm×10mmほどの大きさにし、4℃の4%PFA/0.01%グルタールアルデヒド/0.1Mカコジル酸バッファーに入れ(PFAは和光純薬、グルタールアルデヒドは関東化学、カコジル酸ナトリウムはSIGMA)、電子レンジ(SHARP)を用いてマイクロウェーブ固定した後に、同固定液にて4℃で1時間再固定した。それから10%sucrose/PBSに移し4℃にて4時間浸漬後、15%sucrose/PBSに置換して4℃にて4時間浸漬したのち、20%/sucrose/PBSに置換して4℃にて一晩浸漬させ、OTC compoundにて包埋、ドライアイス・ヘキサン中で急速に凍結した。これを、クリオスタット(Reichert-Jung 2800 FRIGCUT E)にて4μmの厚さに薄切し、シランコートスライドガラス(MATSUNAMI)に貼り付け、冷風ドライヤーにて30分風乾した。
(3)組織染色
切片を貼付したスライドガラスは、PBS中で5分間ずつ3回浸漬して親水化した。次に50μlの0.3%H2O2/0.1%NaN3を滴下し、室温にて10分間反応させて内因性ペルオキシダーゼのブロッキングをおこなった後、PBSで5分間ずつ3回洗浄した。そして2%BSA/PBS中で室温で10分間反応させ、非特異反応のブロッキングをした。その後、余分な液を落としたところへ抗体サンプル50μlを滴下し、室温にて1時間反応させたのち、PBSで5分間ずつ3回洗浄した。次に、50μlの抗CP3ウサギ抗体5μg/mlを滴下し、室温にて45分間二次抗体反応させたのち、PBSで5分間ずつ3回洗浄した。そして50μlのパーオキシダーゼ標識デキストラン結合抗ウサギイムノグロブリン・ヤギポリクローナル抗体(DAKO)を滴下して、室温にて30分間三次抗体反応を行った。これをPBSで5分間ずつ3回洗浄したのち、50μlのDAB・H2O2発色液を滴下し、褐色に発色後、蒸留水を満たしたバットに移して反応を停止させた。その後10分間水洗したのち、ヘマトキシリンによる核染後、脱水・透徹し、マリノールにて封入し、鏡検した。
スクリーニングによって得られた大腸菌を希釈して、100μg/mlのampicillinの入った普通寒天培地に蒔き、得られるコロニーをピックアップして2xYTGA培地にて30℃通夜培養、クラボウのPI-50にてDNAを抽出、dideoxy法で塩基配列を決定した。また、この通夜培養0.05mlを1.2mlの2xYTAI(2xYT, 200μg/ml ampicillin sulfate,0.5mM IPTG)に植えて30℃にて通夜培養、マイクロ遠心機にて15000rpm 5分間遠心して上清をとった。
(1)035-029抗体
VH:配列番号:1、VH CDR1:配列番号:2、VH CDR2:配列番号:3、VH CDR3:配列番号:4
VL:配列番号:5、VL CDR1:配列番号:6、VL CDR2:配列番号:7、VL CDR3:配列番号:8、VLCL:配列番号:129
(2)035-212抗体
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VL:配列番号:13、VL CDR1:配列番号:14、VL CDR2:配列番号:15、VL CDR3:配列番号:16、VLCL:配列番号:131
(3)035-215抗体
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(4)035-273抗体
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(5)035-283抗体
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(6)040-131抗体
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(7)051-054抗体
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(1)035-029抗体
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(2)035-212抗体
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(3)035-215抗体
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(4)035-273抗体
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(6)040-131抗体
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(7)051-054抗体
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(8)051-181抗体
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(9)051-129抗体
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(10)035-130抗体
VH:配列番号:229、VH CDR1:配列番号:230、VH CDR2:配列番号:231、VH CDR3:配列番号:232
VL:配列番号:233、VL CDR1:配列番号:234、VL CDR2:配列番号:235、VL CDR3:配列番号:236
(11)035-169抗体
VH:配列番号:237、VH CDR1:配列番号:238、VH CDR2:配列番号:239、VH CDR3:配列番号:240
VL:配列番号:241、VL CDR1:配列番号:242、VL CDR2:配列番号:243、VL CDR3:配列番号:244
7-1 pp型抗体発現大腸菌の作製
得られた抗体クローンはcp3型で、その構築は図12−1、12−2に示したとおりである(この図では全ての抗体クローンの共通構造を示す)。VH領域、VLCL領域にはそれぞれ図12−1、12−2に示したVH配列及びVLCL配列が挿入されている。このDNAをクラボウPI-50にて抽出し、制限酵素SalIにて消化、自己再結合させたのち大腸菌DH12Sに導入して形質転換したのちLBGAプレートに蒔いて30℃にて通夜培養、得られた大腸菌コロニーを2xYTGAにて通夜培養し、pp型抗体発現大腸菌液を得た。
pp型の抗体クローンを発現するプラスミドを組み込んだ大腸菌10mlをYTGAに植菌し、30℃にて一昼夜震盪培養した(前培養液)。これを4lの2xYT,0.05%glucose,100μg/ml Ampicillinに加え、30℃にて培養した。菌のO.D.が0.5になったとき、1M IPTGを4ml加え、その後30℃にて一昼夜震盪培養した。培養終了後、冷却遠心機にて10000g、4℃、10分間遠心し、得られた培養上清に等量の飽和硫酸アンモニウム水溶液を加え、室温にて1時間攪拌した。この溶液を冷却遠心機にて10000g、4℃、15分間遠心したのち、上清を捨て、得られた沈澱をPBS-NaN3溶液20mlにて懸濁したのち、冷却遠心機にて10000g、4℃、5分間遠心し上清を回収した。これをPBSにて一昼夜透析した。これに、0.05%NaN3/PBSにて平衡化したIgG sepharose 6 Fast Flow(AmershamBiosciences社)2mlを添加し4℃にて一昼夜震盪させながら反応させた。この混合液をカラムに移したのち自然滴下させてビーズに反応しなかった成分をパススルーさせた。このカラムをPBS 100mlにて2回洗浄したのち、0.1%Tween20/PBS 30mlにて4回洗浄、さらにPBS 100mlにて2回洗浄した。これに0.2M Glycine-HCl pH3 4mlを3回ゆっくり加えて溶出成分を回収したのち、3M Tris 80μlを添加して中和した(抗体溶液)。これをMILLEX-GP 0.22μmフィルターにて濾過した後O.D.を測定し、抗体収量を求めた。
まず、抗体溶液をカップリング緩衝溶液(0.1M NaHCO3-NaOH pH9)にて透析した。すなわち、抗体溶液を透析膜(Snake Skin Pleated Dialysis Tubing 10,000 MWCO)に封入し、これをカップリング緩衝溶液(0.1M NaHCO3-NaOH pH9)1.5Lに沈め、4℃でスターラーにて2〜3時間撹拌したのち、緩衝溶液を交換して更に2〜3時間透析した。その後もう一度緩衝溶液を交換して一昼夜透析した。
次に固相化に使用する活性化CNBr-activated Sepharose 4Bを調整した。即ち、Amersham Biosciences社製CNBr-activated Sepharose 4Bを1mM HClにて膨潤させた後、アスピレーターで吸引した。これにカップリング緩衝溶液50mlを添加し撹拌してからアスピレーターで吸引し、吸引したまま、さらにカップリング緩衝溶液を加えた。
抗体の固相化は以下のようにして行った。即ち、5mgの抗体溶液10mlに対して活性化ゲル1mlを加え、室温にて2時間反応させた。反応終了後、ゲルをカラムに移し、カップリング緩衝溶液1mlにて10回洗浄し、未反応抗体の有無をO.D.測定により確認した。固相化ゲルは、0.2M Glycine-NaOH pH8溶液5mlにて2回置換し、さらに同液5mlを添加して室温にて2時間静置したのち、液を自然滴下し、これに0.2M Glycine-HCl pH3 5mlを添加して置換、さらに同液5ml添加し5分間静置したのち自然滴下した。最後にカラムをPBS 20mlにて置換したのち自然滴下し、1%NP40,プロテアーゼインヒビター,0.05%NaN3/PBSを添加してゲルを回収した。
培養肝癌細胞株のビオチン標識は以下のようにして行った。即ち、5枚の15cmディッシュにて培養した培養細胞HLFをPBSにて2回洗浄したのち、cell dissociation buffer(GIBCO社製)にて5mg/ml濃度に調整したcollagenaseI(GIBCO社製)を加えて、CO2インキュベータにて37℃で反応させ、細胞を遊離させたのち、培地にて回収、これをPBS(-)にて2回洗浄したのち、血球計算盤にて細胞数を算出、5x107/mlくらいになるようPBS(-)にて懸濁した。これにPBSにて1mg/mlになるように調整したEZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit(PIERCE社)を等量加え、室温にて30分静置したのち、PBSにて2回洗浄した。
ビオチン標識細胞についてのcell lysateの調整は以下のようにして行った。即ち、上記のビオチン標識細胞に4mlのlysis buffer(1% NP40/detergent base solution, detergent base solutionの組成は20mM HEPES pH8.0, 140mM NaCl, プロテアーゼインヒビター)を加え、細胞を懸濁し、これを冷却しておいたダウンスホモジナイザーに入れてホモジナイズしたのち、溶液に1/2量(2ml)のdetergent mix solution(1%NP40, tritonX-100,b-D-Maltoside,n-Octyl b-D-Glucoside, n-Octyl b-D-Maltoside, n-Decyl b-D-Maltoside,デオキシコール酸各0.5%/detergent base solution)を加え4℃にて4時間回転混和した。この溶液を100,000rpmにて30分間遠心したのちMILLEX-GP 0.22μmフィルターにて濾過した。
まず、固相化された抗体(以降、抗体ビーズと表記)約60μl分(溶液150μl分くらい)を2mlチューブに入れ、そこに4mM biotinを1/10 volume(15μl程)添加した。これに、ディッシュ0.5枚分のlysate(600μl)と60μlのbiotin液を混合したものを加え、4℃にて撹拌させながら数時間反応させた後、チューブを遠心(5500g,1分, 4℃)し、上清を除いた。これに洗浄用biotin/lysis-T buffer(0.5mM biotin, 0.1%Tween20/PBS)を800μl加え、転倒混和を2、3回行ったのち、チューブを遠心(5500g, 1分, 4℃)し、上清を除いた。この洗浄操作を再度行った後、抗体ビーズに溶出用クエン酸液(50mMクエン酸pH2.5)を30μl加え、撹拌したのち、チューブを遠心(5500g, 1min, 4℃)し、上清を回収した。残った抗体ビーズに再度溶出用クエン酸溶液を30μl加え、撹拌し、チューブを遠心(5500g, 1min, 4℃)し、上清を回収した。この溶出操作をさらに3回繰り返してサンプル溶液を回収し、それに3M Trisを加えて中和した。このサンプルをSDS-PAGEにて泳動し、銀染色にてバンドの確認を行った。このサンプルについては、同時にストレプトアビジン−HRP(Anti-Streptavidin, IgG Fraction, Conjugated to Peroxidase CORTEX biochem 社)を使用したウエスタンブロットを行いビオチン化された膜蛋白のバンドを検出した(図13)。
7-6-1 ゲル内トリプシン消化
検出された膜蛋白に対応する部分をゲル内でトリプシン消化し、ペプチドを回収した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を常法に従い行い、クマシーブリリアントブルーで染色することで得られたバンドを切り出した。これを200mM重炭酸アンモニウム-50%アセトニトリル溶液に浸し、37℃で45分間振盪後、溶液を廃棄して、同じ操作を2回繰り返すことでクマシーブリリアントブルーを除いた。このゲルを減圧乾燥し、それに40mM重炭酸アンモニウム(pH8.1)-10%アセトニトリルに溶かしたトリプシン(20μg/ml)をゲルスライスの単位面積(mm2)あたり4μl加えて、室温で1時間置いて充分に浸潤させた。これに先に加えた量の2.5倍量のトリプシン溶液を加えて、37℃で18時間静置した。これをポアサイズが0.22μmのフィルター付きチューブで濾過して、トリプシンにより抗原が切断されて生じたペプチドを回収した。
ゲル内トリプシン消化により得られた試料を、エレクトロスプレーイオン化方式イオントラップ四重極型質量分析装置につないだHPLCにかけた。HPLCの逆相クロマトグラフィーカラムから、0.1%TFAを含む0%から80%のアセトニトリルの直線濃度勾配変化により、疎水性の違いで順次溶出される各ペプチドをエレクトロスプレー法でイオン化し、各ペプチドの質量を分析した。
8-1 IgSF4 cDNA断片の単離
(1)RNA精製
HLF細胞を15cmディッシュ7枚にて培養したのち、GIBCO社製TRYSIN-EDTA(1X)にて遊離させたのち、培地にて回収、PBS(-)にて2回洗浄したのち、Amersham Pharmacia社製RNA Extraction Kitにてtotal RNAを抽出した。すなわち、細胞にExtraction buffer 5mlを加えたのち、21G針を10回通過させ、これを日立社製13PAチューブに入れた5mlのCsTFAの上に重層し、日立社製himac CP80betaを用いて15℃、36000rpm、20時間遠心し、得られた沈殿物をRNase free TEにて懸濁、822μgのtotal RNAを得た。
(2)逆転写反応
逆転転写反応にはInvitrogen社製のSuperscript First-Strand Synthesis System For RT-PCRを使用した。反応条件は次の通りとした。
HLF total RNA 10μg
200pmol/μl hIgSF4B 1.2μl
10mM dNTP 2μl
QW 20.8μl
hIgSF4B:5'-GTGTGCGGCCGCCTAGATGAAGTACTCTTTCTTTTC-3'(配列番号:211)
これらをよく混ぜた後65℃にて5分処理し、氷上に2分静置した。次に以下の試薬を加えて42℃にて2分間静置した。
5x First Strand buffer 8μl
1M DTT 4μl
Rnase inhibitor 2μl
続いてSuperscript II 2μlを加え、42℃にて50分間反応させた後、70℃にて15分処理して逆転写反応を停止した。これにRibonucleaseH 2μlを加えて37℃にて15分処理した後、フェノール/クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿を行い、最後にQW 80μlに懸濁した。
(1)ベクター
IgSF4のcDNAを発現させるためのベクターpCMVSalNotの構築を行った。ベクター構築にはクロンテク社製のpCMV-Scriptを使用した。これをSacIとKpnIにて消化したのち、0.7%アガロースゲルにて電気泳動して4.3kbのバンドを切り出し、タカラ社製suprec01にてDNA断片を抽出、これをフェノール/クロロホルム処理したのちエタノール沈殿し、得られたDNAをQWにて懸濁した。
(2)インサート
合成DNA CMKM-SacIFとCMKM-KpnIRを95℃にて5分間処理したのち室温に戻したのち、SacIとKpnIにて消化し、それをフェノール/クロロホルムにて抽出、エタノール沈殿を行ったのち、QWにて懸濁した。
CMKM-SacIF: 5'caaaagctggagctcgtcgactacccagaattcaagcttattcgcgcggccgcggtaccaggtaagtg3'(配列番号:212)
CMKM-KpnIR: 5'cacttacctggtaccgcggccgcgcgaataatctttccttctgggtagtcgacgagctccagcttttg3'(配列番号:213)
(3)結合反応
上記のベクターとインサートとを混ぜて結合反応を行い、得られた反応液を用いて大腸菌DH12Sを形質転換してLBGKプレートに蒔き、30℃にて通夜培養して大腸菌コロニーを得た。これを2mlの2xYTKにて30℃通夜培養し、得られた菌液をクラボウ社製PI-50にて処理してDNA液を得た。次にこのDNA 4μlを85℃にて5分間処理したのち、T7プライマー3.2pmol/μl 2μlとDTCSクイックスタートミックス4μlを入れ、96℃ 20sec、50℃ 20sec、60℃ 4minの処理を40サイクル行ったのち、得られた反応液をベックマン社製SEQ 2000 DNA Analysis Systemにて解析し、塩基配列を決定した。
IgSF4のcDNAクローンを単離するため、東洋紡社製KODを使用してPCR反応を行った。反応条件は次の通りとした。
200pmol/μl hIgSF4A 0.25μl
200pmol/μl hIgSF4B 0.25μl
cDNA 1μl
10xKOD buffer 5μl
25mM MgSO4 2μl
2mM dNTP 1μl
KOD plus 1μl
QW 35.5μl
hIgSF4A:5'-GAGAGTCGACGCCACCATGGCGAGTGTAGTGCTGCCGAGC-3'(配列番号:214)
hIgSF4B:5'-GTGTGCGGCCGCCTAGATGAAGTACTCTTTCTTTTC-3'(配列番号:211)
これらを氷上で混ぜたのち、ミネラルオイルを重層し、94℃にて3分間処理し、次に以下ののサイクルを33回行った。
94℃ 30秒
68℃ 3分
反応産物を0.8%アガロースゲルにて電気泳動し、約1.4kbのバンドを切り出した。これをQIAGEN社製Gel Extraction Kitにて回収したのち、制限酵素SalIとNotIによる消化を行い、得られたDNA断片を動物細胞用発現ベクターpCMV-SalNotに組み込んだ。これを用いて大腸菌DH12Sを形質転換したものをLBGKプレートに蒔いて30℃にて通夜培養し、大腸菌コロニーを得た。これを2mlの2xYTKにて30℃通夜培養した後、得られた菌液をクラボウ社製PI-50にて処理してDNAを得た。DNAはベックマン社製SEQ DTCK-Quick Start Kitにて反応した。反応は以下のとおり。DNA 4μlを85℃にて5分間処理したのち、以下のプライマー(T3またはT7プライマー)3.2pmol/μl 2μlとDTCSクイックスタートミックス4μlを入れ、96℃ 20sec、50℃ 20sec、60℃ 4minの処理を40サイクル行った。
プライマー
T3プライマー:AATTAACCCTCACTAAAGGG(配列番号:215)
T7プライマー:TAATACGACTCACTATAGGG(配列番号:216)
得られた反応液をベックマン社製SEQ 2000 DNA Analysis Systemにて解析し、塩基配列を決定した。その結果、IgSF4 cDNAクローンとしてIgSF4N(cDNA1:図15−1、15−2:配列番号217)とIgSF4X(cDNA2:図16―1、16−2:配列番号218)の2種類が単離された。
まず、導入DNA 12μgとOpti-MEM(GIBCO社製)を0.75ml混ぜ、室温にて5分静置した。これにOpti-MEM(GIBCO社製)0.75mlとlipofectamine 2000 30μlを混ぜ、室温にて5分間静置したものを加え、よく混ぜて室温にて20分間静置した。これを10cmディッシュで培養したNIH3T3-13C7細胞に加え、CO2培養器にて37℃で1日間培養した。
細胞は2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco BRL)でデイッシュから解離させたのち、10%FBS/D MEMにて回収した。これを2.5%BSA, 0.05%NaN3/PBS(BSA液)にて洗浄したのち、2.5% normal goat serum/BSA液100μlに懸濁して氷上に30分静置したのち、cp3型抗体(035-029, 035-212, 035-215, 035-273, 035-283, 040-131, 051-054, 051-181, YA14)を5μg/mlになるように加えて、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、抗cp3マウスモノクローナル抗体(株式会社医学生物学研究所)5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、Alexa488結合抗マウスIgGヤギ抗体(Molecularprobe社製)5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて二度洗浄したのち、BSA液500μlにて懸濁し、セルストレイナー(Becton Dickinson社製)にて処理したのち、Becton Dickinson社製FACScaliver(FCM)にて細胞集団の蛍光強度を解析した。
FCMの結果を図17に示す。遺伝子導入をしていないNIH3T3-13C7はほとんど染色されていなかった。一方、IgSF4(cDNA1又はcDNA2)を強制発現させたNIH3T3-13C7では蛍光強度は約2倍になっていることが観察された。
IgSF4を強制発現させた細胞を免疫染色した結果を図18に示す。IgSF4(cDNA1又はcDNA2)を強制発現させた細胞集団では明かな染色を認め、この結果は上記のFCM結果と一致していた。
9-1 d-siRNAの作製
鋳型としてHepG2のcDNAよりhIGSF4C, hIGSF4Dプライマーにて増幅させた880bpのDNA断片を使用した。
hIGSF4C (24mer):5'-TTCAGGGACTTCAGGCCTTTGAAG-3'(配列番号:219)
hIGSF4D (24mer):5'-CACCGATCACGGCATGATCCACTG-3'(配列番号:220)
siRNAの作製方法はINVITROGEN社のプロトコールに従った。即ち、鋳型DNA 100ngにT7リンカーを結合させたのち、2本のチューブに分け、一方はhIGSF4CとT7プライマーでPCR反応を行い、アンチセンス発現用DNA断片を作製、もう一方はhIGSF4DプライマーとT7プライマーでPCR反応を行い、センス発現用DNA断片を作製した。これらのDNA断片それぞれについて、T7 RNA polymeraseによる反応を行ったのち、RNAi Purification Kitを用いて合成RNAを回収し、それぞれ約30 μgのRNA産物を得た。これらを混合したチューブを沸騰した水に入れてやきなましを行い、double strand RNAを作製した。これにDicerを加えて37℃にて17時間反応したのち、RNAi Purification Kitを用いて21 μg のd-siRNAを回収した。
細胞は高分化型肝癌細胞株HLFを使用した。細胞は前日に6穴プレート(Falcon 3516)にて継代したものを使用した。まず、Invitrogen社のlipofectamine 2000 10 μgをGIBCO社製Opti-MEM 500μgと混ぜたのち、d-siRNA 1 μgを加え、ゆっくりと混合したのち、室温にて15分間静置、これを細胞に加え、CO2培養器にて2日間培養した。
細胞は2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco BRL)でデイッシュから解離させたのち、10%FBS/D MEMにて回収した。これを2.5%BSA, 0.05%NaN3/PBS(BSA液)にて洗浄したのち、2.5% normal goat serum/BSA液100μlに懸濁して氷上に30分静置したのち、cp3型抗体(035-029, 035-212, 035-215, 035-273, 035-283, 040-131, 051-054, 051-181)を5μg/mlになるように加えて、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、抗cp3マウスモノクローナル抗体(株式会社医学生物学研究所)5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、Alexa488結合抗マウスIgGヤギ抗体(Molecularprobe社製)5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて二度洗浄したのち、BSA液500μlにて懸濁し、セルストレイナー(Becton Dickinson社製)にて処理したのち、Becton Dickinson社製FACScaliver(FCM)にて細胞集団の蛍光強度を解析した。
10-1 誘導型RNAiベクターの構築
細胞培養液中のテトラサイクリン(tetracyclin)存在下にてRNAiにおける干渉RNAを発現させ、対象遺伝子発現をノックダウン、コントロールできるシステムを用いてIgSF4のRNAi実験を行った。
IgSF4翻訳領域配列の一部GGCCCAACCTGTTCATCAATA(配列番号:269)をRNAi標的とした。ベクターの構築はInvitrogenのBlock-iT Inducible Lentiviral RNAi Systemのマニュアルに従った。即ち、1x anneling buffer条件にて合成DNA 832(5'-CACCAGGCTCAACTTGTTCGTCAATATTCAAGAGATATTGATGAACAGGTTGGGCC-3':配列番号:270)と833(5'-GGCCCAACCTGTTCATCAATATCTCTTGAATATTGACGAACAAGTTGAGCCT-3':配列番号:271)をそれぞれ50μMの濃度になるように混ぜ、95℃にて4分間熱処理したのち、室温にて5分間静置、これを1x anneling bufferにて1万倍希釈した。この2重鎖ds oligo 5μlと1μlのpENTR/H1/TOを混ぜ、附属のligation systemにて結合反応を行ったのち、附属のOne Shot TOP10 Competent E.coliにて形質転換し、50mM Kanamycinプレートに蒔いて形質転換体コロニーを得た。これを50mM Kanamycinn入りのLB培地にて培養したのち、QiagenのQIAprep Spin Miniprep kitにてDNAを調製し、H1 forward primerとV5 reverse primerを使用して、Beckman Coulter社製のGenomeLab DTCS-Quick Start Kitにてsequence反応を行い、得られた配列を解析してpENTR/H1/TO の2138より合成DNA832配列を組み込んだ目的のクローンを得た(Entry clone)。このEntry clone100ngとpLenti4/BLOCK-iT-DEST vector 150ngを混ぜて、TE buffer(pH8.0)にて8μlにメスアップしたのち、附属のLR clonase II enzyme mix 2μlを混ぜて25℃にて1時間静置、得られた反応物をOne Shot Stbl3 Competent E.coliにて形質転換し、100mg/mlアンピシリンプレートに蒔いて形質転換体コロニーを得た。これを100mM ampicillin入りのLB培地にて培養したのち、QiagenのQIAprep Spin Miniprep kitにてDNAを調製し、H1 forward primer(5'-TGTTCTGGGAAATCACCATA-3':配列番号:272)とV5 reverse primer(5'-ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT-3':配列番号:273)を使用して、Beckman Coulter社製のGenomeLab DTCS-Quick Start Kitにてsequence反応を行い、得られた配列を解析したところ、entry vectorと同じ配列が得られたことから、下記に示す配列部分(下線部が合成DNAによる挿入配列(配列番号:274))がpLenti4/BLOCK-iT-DESTに組み込まれた、と判断した(pLenti4/BLOCK-iT-DEST expression construct)。
2087-GAAATCCCTATCAGTGATAGAGACTTATAAGTTCCCTATCAGTGATAGACA CACCAGGCTCAACTTGTTCGTCAATATTCAAGAGATATTGATGAACAGGTTGGGCC TTTTTTGTCGAGCTT
Entry clone段階でRNAi作用があることを以下の方法にて確認した。前日に下記のrepressor発現HLF host cell lineを50%コンフリエントになるように10cmディッシュ2枚に継代しておいた(培地は3μg/ml Blasticidin, 10%FBS, 1% penicillin /streptomycin -D MEM)。当日細胞は80-90%コンフリエントであったので、培地を10%FBS-D MEM培地(抗生物質なし)に置き換えた。
Entry cloneのプラスミド10μgにGibco BRL社製のOpti-MEM 1.5mlを入れ、ゆっくりと混ぜた。別のチューブにてInvitrogenのlipofectamine 2000 36μlとOpti-MEM 1.5mlを入れ、ゆっくりと混ぜた。これらを室温にて5分間静置したのち、混ぜ、さらに室温にて20分間静置した。これを、repressor発現HLF host cell lineに加え、ゆっくりと混和したのち、CO2インキュベータにて培養した。6時間後、培地を3μg/mlBlasticidin, 10%FBS(tetracycline tested), 1%penicillin/streptomycin-D MEMに交換した。翌日、一方のディッシュは1μg/ml tetracycline, 3μg/ml Blasticidin, 10%FBS(tetracycline tested), 1%penicillin/streptomycin-D MEM培地(tetracyclineあり)にて培地交換し、もう一方のディッシュは3μg/ml Blasticidin, 10%FBS(tetracycline tested), 1%penicillin/streptomycin-D MEM培地(tetracyclineなし)にて培地交換した。Tetracycline作用後48時間時点にて細胞を回収し、FCMにてRNAi作用を確認した。
細胞は2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco BRL)でディッシュから解離させたのち、10%FBS/D MEMにて回収した。これを5%BSA, 0.05%NaN3/PBS(BSA液)にて洗浄したのち、2.5% normal goat serum/BSA液100μlに懸濁して氷上に30分静置したのち、35-273cp3を5μg/mlになるように加えて、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、抗cp3ウサギポリクローナル抗体(MBL社特注)5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、Alexa488結合抗ウサギIgGヤギ抗体(Molecularprobe社製)5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて二度洗浄したのち、PBS 1mlにて懸濁し、セルストレイナー(Becton Dickinson社製)にて処理したのち、Becton Dickinson社製FACScaliver(FCM)にて細胞集団の蛍光強度を解析した。その結果、tetracyclineを作用させたものでは作用させないものに比較して細胞集団の蛍光強度が顕著に減少していることが観察された。
Tetracycline repressor発現用プラスミドpLenti6/TRと上記のpLenti4/BLOCK-iT-DEST expression constructについて、Lentivirusの調製を行った。方法は以下のとおりである。293FT細胞は実験当日に約90%コンフリエントになるよう継代しておいた。当日DNA感作実験の前に抗生物質を抜いた培地におきかえた。プラスミド3μgと附属のViraPower Packaging Mix 9μgを混ぜ、これにGibco BRLのOpti-MEM 1.5mlを入れ、ゆっくりと混ぜた。別のチューブにてInvitrogenのlipofectamine 2000 36μlとOpti-MEM 1.5mlを入れ、ゆっくりと混ぜた。これらを室温にて5分間静置したのち、混ぜ、さらに室温にて20分間静置した。これに、トリプシンではがした293FT細胞1.2x106個を加え、ゆっくりと混和したのち、10cmディッシュに移し、CO2インキュベータにて培養した。翌日培地を10%FBS, 2mM L-glutamine, 0.1mM MEM Non Essential Amino Acids, 1%penicillin/streptomycin, 1mM MEM Sodium Pyruvate入りのD MEMに交換して、さらに2日間培養した。DNA感作後72時間時点にて培地を回収し、0.22μmフィルターにて濾過滅菌した。
HLF細胞を培養し、実験前日に約25%コンフリエントになるよう6 well plateにて継代し、実験当日に約30-50%コンフリエントになるようにした。当日は、培地(10%FBS, 1%penicillin/streptomycin-D MEM)で希釈したVirus液1mlを作製し、これを各wellに作用させたのち、Polybleneを終濃度6μg/mlになるように入れ、CO2インキュベータにて1日培養した。翌日、培地交換を行った。翌々日、培地をselection mediumに交換した。pLenti6/TR virusのものについては3μg/mlBlasticidin, 10%FBS, 1%penicillin/streptomycin-D MEMを使用した。pLenti4/BLOCK-iT-DEST expression constructについては、まず細胞をトリプシンではがしたのち、10cmディッシュにて100μg/mlZeocin, 10%FBS, 1%penicillin/streptomycin-D MEM培地で培養した。培地交換後2週間にて形成されたコロニーを数え、それよりvirus液のtiterを算出した。その間、培地交換は2日ごとに行った。
上記のpLenti6/TR virusの titer checkより得られたコロニーを10個ピックアップして個別に3μg/mlBlasticidin, 10%FBS, 1%penicillin/streptomycin-D MEM培地にて培養したのち、細胞をトリプシンにて回収してPBSにて洗浄、PBSにて懸濁した。これをSonifierにて超音波処理したのち、Micro BCAにてタンパク量を測定、20μg分をSDS-PAGEにて泳動し、Mo Bi Tec社製の抗tetracycline repressorウサギポリクローナル抗体にてwestern blotを行い、repressor発現の良いクローンを得た。
上記のTetracycline repressor発現Host cell lineを3μg/mlBlasticidin, 10%FBS, 1%penicillin/streptomycin-D MEM培地にて培養し、前日に25%コンフリエントになるように10cmディッシュにて継代した。当日はこれにpLenti4/BLOCK-iT-DEST expression construct virusを約200コロニー分感染させ、polybraneを作用させた。翌日培地交換した。翌々日、トリプシンではがして細胞を回収し、3段階の希釈系列を作って15cmディッシュにて継代した。培地は50mM HEPES, 3μg/ml blasticidin,100μg/mlZeocin, 10%FBS, 1%penicillin/streptomycin-D MEMで、まず4℃にて2時間処理したのち、CO2インキュベータにて37℃の培養を行った。以後は2日ごとに100μg/mlZeocin, 10%FBS, 1%penicillin/streptomycin-D MEM培地にて培地交換を行い、14日後に24個のコロニーを単離した。これらを個別に培養し、クローン12個を得た。
前日に、上記の各細胞クローンをそれぞれ2 wellずつ、6 well plateに約25%コンフリエントになるよう継代した。培地は 3μg/ml blasticidin,100μg/mlZeocin, 10%FBS, 1%penicillin/streptomycin-D MEMであるが、FBSはInvitrogenのTetracycline tested FBSを使用した。当日、細胞は50-60%コンフリエントとなっていた。これに対して、1μg/ml tetracycline入りの培地と無しの培地にて培地交換した。培地交換48時間後、細胞を回収してFCM解析を行った。
細胞は2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco BRL)でディッシュから解離させたのち、10%FBS/D MEMにて回収した。これを5%BSA, 0.05%NaN3/PBS(BSA液)にて洗浄したのち、2.5% normal goat serum/BSA液100μlに懸濁して氷上に30分静置したのち、35-273cp3を5μg/mlになるように加えて、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、抗cp3ウサギポリクローナル抗体(MBL社特注)5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、Alexa488結合抗ウサギIgGヤギ抗体(Molecularprobe社製)5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて二度洗浄したのち、PBS 1mlにて懸濁し、セルストレイナー(Becton Dickinson社製)にて処理したのち、Becton Dickinson社製FACScaliver(FCM)にて細胞集団の蛍光強度を解析した。図21に見られるとおり、テトラサイクリン入り培地で培養された細胞はRNAiが作用し、抗体を作用させない場合と同様FCMシフトが見られなくなり、035-273抗体の認識対象分子がIgSF4であることが確認できた。
単離した各種抗体クローンの各種細胞株に対する反応性を以下の通りFCMで確認した。
(1)肝癌由来細胞株HEPG2(図22)及びHLF(図23)に対するFCM反応性を調べた。
(2)ヒト胎児腎上皮由来細胞株293T(図24)に対するFCM反応性を調べた。
(3)ヒト腎癌由来株ACHN(図25)対するFCM反応性を調べた。
(4)ヒトATL由来株としてKK1を用いたFCM解析を行った(図26)。
(6)IgSF4の非発現性ATL細胞株と発現性ATL細胞株の比較として、IgSF4のプロモーターがメチル化されているヒトATL由来細胞株ED、Su9T、SO4と、メチル化されていないヒトATL由来細胞株KK1、KOB及びST1に関してFCMで比較した(図28)。
(7)ATLはHTLV感染が原因で発症する特殊な白血病と考えられている。そこで、非HTLV感染T細胞株とHTLV感染T細胞株の比較として、ヒト非ATL由来細胞株MOLT4(ヒトT細胞性白血病由来株)及びJurkatと、ヒトT細胞指向性ウイルス感染(HTLV感染株)T細胞リンパ腫由来のHUT102、MT-2に関してFCMで比較した(図29)。
まず、付着性細胞株については6穴プレート(Falcon 3516)において、ATL由来細胞株などの浮遊細胞株は浮遊培養フラスコ(70ml(スラントネック))において、培地(RPMI-1640:Sigma-Aldrich 社製、10%ウシ胎児血清、1%ペニシリンーストレプトマイシン溶液)を用い、CO2インキュベータ内、37℃で培養したものを使用した。
各細胞よりFastTrack 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用してmRNAを抽出した。その後得られたmRNA3μgを1%アガロースゲルでMOPS緩衝溶液中で電気泳動した後、ナイロンメンブレン(BIODYNE Pall BioSupport, East Hills, NY)に転写したした。その後IgSF4の411位から1371位の961bpのp32標識のプローブを用いてNothern blotを行なった。プローブのラベルはPrime-lt II Random Primer Labeling Kit (Stratagene, La Jolla, CA)を使用した。
(6)及び(7)の実験結果(図28、図29)とNorthern Blotの結果(図30)を合わせて考えると、細胞表面上にIgSF4分子が発現している、ATL由来細胞株(KK1、KOB、ST1)及びHTLV感染細胞(HUT102、MT-2)を認識する抗体が取得できていることが分かる(プロモーターのメチル化によってIgSF4発現が見られない細胞、及びHTLV非感染細胞はこの抗体で認識されない)。
抗体依存性細胞性細胞傷害(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity、以下ADCCと略す)は、ウイルス感染細胞など人体にとって有害な細胞を殺傷、攻撃する免疫反応であり、膜表面に広く抗体が結合した細胞を標的と見なし、ナチュラルキラー細胞や単球を主とする「エフェクター細胞」が攻撃する機構である。ADCCによる細胞傷害性は、細胞膜表面抗原に特異的に結合する抗体、およびエフェクター細胞の組み合わせに依存して起きる。
腫瘍表面抗原に特異的に結合する抗体のうちのいくつかは抗腫瘍効果、がん治療効果が示され、抗体医薬として販売されているが、これら抗体の主要な作用機序はADCCであるという報告がなされている。そこで、本発明者らが単離に成功したがん抗原特異的抗体に抗腫瘍効果があるか、即ちがん治療用抗体として有望であるかを評価するための方法として、ADCCの検出を試みた。以下に示す実験では標的細胞にIgSF4を認識するヒトIgG型抗体クローンを反応させてエフェクター細胞に提示するという方法を用いた。ADCCの検出は、エフェクター細胞により攻撃された標的がん細胞から培地中へ漏出する乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を、試薬の発色で検出する原理の細胞傷害性検出キットを用い、傷害の度合いを算出した。
i)A431細胞株は2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco BRL)でディッシュから解離させたのち、10%FBS/D MEMにて回収した。それを2.5%BSA, 0.05%NaN3/PBS(BSA液)にて洗浄したのち、2.5% normal goat serum/BSA液100μlに懸濁して氷上に30分静置したのち、106個/wellになるように分注した。
調製したIgG型抗体035-029を、5μg/mlになるように加えて、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、Alexa488結合抗ヒトIgGヤギ抗体(Molecularprobe社製)5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて二度洗浄したのち、BSA液500μlにて懸濁し、固定液(ホルムアル デヒド)50μlを添加し、10分静置した。その後PBS 150μl添加し、セルストレイナー(Becton Dickinson社製)にて処理したのち、Becton Dickinson社製FACScaliver(FCM)にて細胞集団の蛍光強度を解析した(図31)。
ADCC活性測定実験に用いるIgG型抗体(クローン番号035-029、YA14(抗インフルエンザウイルス抗体)、HR1-007(抗ハブ毒抗体))をコードする遺伝子断片を導入したチャイニーズハムスター細胞株CHO-K1を、無血清培地(CHO-S-SFM II:Invitrogen 社製、1% (v/v) Penicillin - Streptomycin Solution:Sigma-Aldrich 社製、700 μg/ml G418:Sigma-Aldrich 社製)大量培養フラスコ(Becton Dickinson 社製 CELLine 1000 Flask)で2週間培養した培養上清を回収し、Protein G 結合アフィニティカラムへ反応させた。PBSで洗浄後、グリシン塩酸緩衝液(pH 2.7)でカラムから溶出させ、トリス塩酸緩衝液(pH8.9)で中和した。精製された抗体サンプルは透析濃縮用チューブ(Millipore 社製、Amicon Ultra-15)を用いて PBS にて置換、濃縮したものを実験に用いた。
用いる標的細胞として、直径150mmの培養ディッシュ上で液体培地 1(Minimum Essntial Medium Alpha Medium:Invitrogen 社製、10%(v/v)ウシ胎児血清:Equitic-Bio 社製、1%(v/v)Penicillin - Streptomycin Solution:Sigma-Aldrich 社製)にて肺がん由来培養細胞VMRC-LCD(Japanese Collection of Research Bioresourcesより分与された)を成育させた。液体培地を除去し、細胞をPBS 10 mlで2回洗浄し溶液を除去した後、4%(w/v)コラゲナーゼType IV(Invitrogen 社製)を5 ml加え37℃で10分保温させることにより細胞を培養ディッシュから剥離させた。さらに5 mlの液体培地2(RPMI-1640、10% (v/v) ウシ胎児血清、1% (v/v) Penicillin - Streptomycin Solution:Sigma-Aldrich 社製)(RPMI-1640:Sigma-Aldrich 社製、10%ウシ胎児血清、1%ペニシリンーストレプトマイシン溶液)を加えてコラゲナーゼ反応を停止させ、浮遊した細胞6.7 x 106を回収した。遠心分離(200 x g、4℃、3 分)を行い上清を除いたあと、細胞密度が3 x 105cells/mlになるように細胞傷害性試験培地(Cytotoxic Medium、以下、CTMと略す。RPMI-1640 培地、1% (v/v)ウシ胎児血清、1% (v/v) Penicillin - Streptomycin Solution、1% (v/v) 1M HEPES buffer (pH7.0):Invitrogen 社製)にて懸濁し実験に用いた。
ボランティアから採血したヘパリン添加末梢血30 mlをPBSで80 mlに希釈し、遠心チューブ4本に10 mlのリンパ球単離試薬Ficoll Paque Plus(Amersham Bioscience 社製)を分注しておいたものに静かに重層し、遠心分離(400 x g、20℃、40分)した。単核球画分(リンパ球と単球を含む)を回収して冷PBSにて80 mlに希釈し、遠心分離(200 x g、4℃、15分)により沈殿させた。沈殿物を細胞密度が7.5 x 106 cells/mlになるようにCTMにて懸濁した。
U底96穴マルチプレート(Becton Dickinson 社製)に1ウェルあたり66μlの標的細胞(2 x 104 cells)を入れ、IgG型抗体(3 μg/ml)66 μlを加えたのち、66μlの末梢血単核球懸濁液(7.5 x 105 cells)を加えた。E/T ratio(エフェクター細胞と標的細胞の比率)は20とした。細胞同士の会合を促すため遠心分離(60 x g、4℃、5分)を行い細胞を底部へ沈めたのち、37℃、5% CO2の条件に設定した培養装置で240分保温してADCC反応を誘導した。各抗体サンプルはCTM溶液として調製した。また、それぞれのサンプルについて陰性コントロールとしてCTMを用い、乳酸デヒドロゲナーゼの最大遊離量コントロールとして、標的細胞に100μlの2% Triton X-100 - CTM溶液を加えたものを用いた(Triton X-100によりあらかじめ細胞を破壊)。また、それぞれの実験群につき3つのウェルを使用した。
ADCC反応後、細胞傷害性検出キット(Roche Diagnostics 社製)の方法に従って以下のように操作を行った。遠心分離(350 x g、4℃、10分)を行い、上清100μlを回収し、平底96穴マルチプレート(TPP 社製)に移した。各サンプルにつき細胞傷害性検出キットの反応液100μlを加えたのち、室温で静置することにより色素の発色を誘導した。発色の程度は培養上清中に遊離した乳酸デヒドロゲナーゼの濃度に比例し、標的細胞のダメージの指標となる。発色開始から30分後、分光光度計により吸光度(OD490 - OD620(バックグラウンド吸光度))を測定し、各実験群につき3つのウェルの吸光度を平均し細胞傷害性指数(Cytotoxic Index)を算出した。あらかじめ培地のみの吸光度を引き算し、以下の計算式のように行った。
以上の結果から、IgSF4を介して癌細胞を特異的に認識し、そしてADCC活性による傷害効果を発揮する抗体の取得に成功したことが確認された。従ってこれらの抗体は、癌細胞を標的とした抗体医薬として有効であるといえる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (9)
- IgSF4に対する特異的結合性を有し、IgSF4を介してADCC活性を発揮することを特徴とする単離された抗体であって、
以下のa〜vからなる群より選択される組合せの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を備える、単離された抗体:
(a)配列番号:2のCDR1、配列番号:3のCDR2、及び配列番号:4のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:6のCDR1、配列番号:7のCDR2、及び配列番号:8のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(b)配列番号:10のCDR1、配列番号:11のCDR2、及び配列番号:12のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:14のCDR1、配列番号:15のCDR2、及び配列番号:16のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(c)配列番号:18のCDR1、配列番号:19のCDR2、及び配列番号:20のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:22のCDR1、配列番号:23のCDR2、及び配列番号:24のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(d)配列番号:26のCDR1、配列番号:27のCDR2、及び配列番号:28のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:30のCDR1、配列番号:31のCDR2、及び配列番号:32のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(e)配列番号:34のCDR1、配列番号:35のCDR2、及び配列番号:36のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:38のCDR1、配列番号:39のCDR2、及び配列番号:40のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(f)配列番号:42のCDR1、配列番号:43のCDR2、及び配列番号:44のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:46のCDR1、配列番号:47のCDR2、及び配列番号:48のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(g)配列番号:50のCDR1、配列番号:51のCDR2、及び配列番号:52のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:54のCDR1、配列番号:55のCDR2、及び配列番号:56のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(h)配列番号:58のCDR1、配列番号:59のCDR2、及び配列番号:60のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:62のCDR1、配列番号:63のCDR2、及び配列番号:64のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(i)配列番号:1のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号:5のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(j)配列番号:9のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号:13のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(k)配列番号:17のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号:21のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(l)配列番号:25のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号:29のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(m)配列番号:33のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号:37のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(n)配列番号:41のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号:45のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(o)配列番号:49のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号:53のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(p)配列番号:57のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号:61のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(q)配列番号:222のCDR1、配列番号:223のCDR2、及び配列番号:224のCDR3からなるCD Rを有する重鎖可変領域と、
配列番号:226のCDR1、配列番号:227のCDR2、及び配列番号:228のCDR3からなるCD Rを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(r)配列番号:230のCDR1、配列番号:231のCDR2、及び配列番号:232のCDR3からなるCD Rを有する重鎖可変領域と、
配列番号:234のCDR1、配列番号:235のCDR2、及び配列番号:236のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(s)配列番号:238のCDR1、配列番号:239のCDR2、及び配列番号:240のCDR3からなるCDRを有する重鎖可変領域と、
配列番号:242のCDR1、配列番号:243のCDR2、及び配列番号:244のCDR3からなるCDRを有する軽鎖可変領域との組合せ、
(t)配列番号:221のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号:225のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(u)配列番号:229のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号:233のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ、
(v)配列番号:237のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号:241のアミノ酸配列の軽鎖可変領域との組合せ。 - ヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項1に記載の単離された抗体。
- IgG、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、又はdsFv抗体である、請求項1又は2に記載の単離された抗体。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の抗体を有効成分として含む癌治療剤。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の抗体を含んでなる、肝癌検査用、成人T細胞白血病検査用、肝癌研究用、又は成人T細胞白血病研究用試薬。
- 肝癌診断用の情報を取得する方法であって、
(1)生体から分離された被検細胞を用意するステップ、及び
(2)前記被検細胞を対象としてIgSF4を検出するステップ、
を含む方法。 - 肝癌細胞の悪性度を判定するためにIgSF4を検出する方法であって、
(1)生体から分離された被検肝細胞を用意するステップ、及び
(2)前記被検肝細胞を対象としてIgSF4を検出するステップ、
を含む方法。 - 肝癌細胞に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング法であって、
(1)IgSF4と試験化合物とを接触させるステップ、
(2)試験化合物のIgSF4に対する結合性を評価するステップ、
を含むスクリーニング法。 - 肝癌の治療に有効なIgSF4結合性化合物のスクリーニング法であって、
(1)IgSF4遺伝子を発現する細胞を用意するステップ、
(2)前記細胞に試験化合物を接触させるステップ、
(3)癌細胞の死滅又は減少を評価するステップ、
を含むスクリーニング法。
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