CN104797600A - 能够特异性识别转铁蛋白受体的抗体 - Google Patents

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Abstract

根据本发明，提供重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VH CDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、7、且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体。

Description

能够特异性识别转铁蛋白受体的抗体
技术领域
本发明涉及与人TfR抗原特异性反应的抗TfR抗体。进而，本发明涉及包含抗TfR抗体的医药组合物，特别涉及与恶性肿瘤的治疗相关的医药组合物。
背景技术
癌症占据日本死亡原因的第一位，伴随着高龄化，患者数逐年增加，强烈希望开发有效性和安全性高的药剂和治疗方法。现有的化学疗法、放射线疗法等存在着在杀死癌细胞的同时，对正常细胞也带来损伤、引起很强的副作用的问题。为了解决该问题，积极地研究着以对癌细胞特异性表达的分子作为靶标设计药剂而进行治疗的分子靶标治疗。在该分子靶标癌治疗药中，抗体药由于具有半衰期长、副作用少等的优点而备受瞩目。作为开发的成功例，可以列举以CD20为靶标的嵌合抗体Rituxan(利妥昔单抗)(非专利文献1)、以Her2/neu作为靶标的人化抗体赫赛汀(非专利文献2)、以血管内皮增殖因子(VEGF)作为靶标的人化抗体安维汀等。这些抗体以癌作为对象疾病使用，其治疗效果得到认可。
抗体作为治疗药的使用分为非标记和标记抗体。非标记抗体的作用机理被认为是：(1)与免疫系统细胞或分子相关的抗体依赖性细胞毒活性(ADCC)(非专利文献3)以及补体依赖性细胞毒活性(CDC)(非专利文献4)、(2)通过靶标分子对细胞内生存、增殖相关的信号的障碍、(3)细胞凋亡的诱导、(4)细胞因子的分泌调节等。通过各个机理的组合，使肿瘤细胞死亡或使增殖停止，从而发挥治疗效果。就标记抗体而言，使抗体与放射线物质或毒素、酶、药剂等细胞毒性物质连接，利用抗体的特异性而仅对癌组织传送这些物质，谋求治疗效果的提高和副作用的降低。
转铁蛋白受体(TfR)作为用于将与转铁蛋白(Tf)结合的铁摄入细胞内的细胞膜结构，最初在网织红细胞上被鉴定(非专利文献5)。后来知道其在胎盘滋养膜细胞(非专利文献10至12)、活化的淋巴细胞(非专利文献12)、进而各种肿瘤细胞等中表达。例如，有报告在乳腺癌(非专利文献6)、前列腺癌(非专利文献7)、肺癌(非专利文献8)，胰腺癌(非专利文献9)、大肠癌(非专利文献30、31)、胃癌(非专利文献31)、膀胱癌(非专利文献32，33)、肝癌(非专利文献34)、宫颈癌(非专利文献35)、脑肿瘤(非专利文献36)、慢性淋巴性白血病(非专利文献37，38)、非霍奇金淋巴瘤(非专利文献38，39)、成人T细胞白血病(非专利文献40)中，转铁蛋白受体高表达。另外，由于TfR在各种癌细胞表面高表达，而在正常细胞中的表达低，因此过去一直以来就被认为是癌治疗的分子靶标(非专利文献13至16、专利文献1、2)。然而，至今为止所开发的抗人TfR抗体全部是源自动物的抗体，而且没有显著的肿瘤增殖抑制效果。一般而言，如果对人投与人以外的动物的抗体，例如小鼠抗体，则因被识别为异物而在人体内诱导出针对小鼠抗体的人抗体(Human Anti Mouse Antibody：人抗鼠抗体，以下，记作HAMA)。已知HAMA与所投与的小鼠抗体反应，从而引发副作用(非专利文献17至20)，或者加快所投与的小鼠抗体从体内消失(非专利文献18、21及22)，削减小鼠抗体的治疗效果(非专利文献23及24)。在利用小鼠抗人TfR抗体实际进行的临床Ⅰ期试验中，观察到HAMA的产生，而没有看到显著的治疗效果(非专利文献25)。
为了避免这样的问题，开发出了嵌合抗体(专利文献3及4)。嵌合抗体包含源自2个或其以上的种属的抗体的一部分(小鼠抗体的可变区和人抗体的恒定区等)。这样的嵌合抗体的优点是保持小鼠抗体的特征，但由于具有人Fc，所以能够刺激人补体或细胞毒性。但是，这样的嵌合抗体依然为会引起“人抗嵌合抗体”即HACA(Human Anti-Chimera Antibody)应答(非专利文献26)。此外，还开发出了仅取代的抗体的一部分为互补决定区(即“CDR”)的重组抗体(专利文献5及6)。使用CDR移植技术，产生了由小鼠CDR、人可变部框架和恒定区构成的抗体，即“人化抗体”(非专利文献27)。然而，即使是这样的人化抗体，对人也有免疫原性，引起HAHA(Human anti-HumanAntibody)反应(非专利文献28、29)。因此，在临床应用中，希望有更加安全有效的不具有免疫原性的抗体治疗药物。
此外，为了克服治疗抗体的免疫原性，还开发出了完全的人抗体的制作方法。例如，通过用所期望的抗原来免疫具有人抗体基因的全部组成成分的转基因动物，能够取得所期望的的人抗体(专利文献7－12)。另外，还已知有使用人抗体库，通过淘选取得人抗体的技术。例如，能够将人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)，利用噬菌体展示法使其在噬菌体的表面表达，选择与抗原结合的噬菌体。对所选择的噬菌体的基因进行解析，就能够确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA序列。通过该scFv的DNA序列能够制作适当的表达载体，取得完全的人抗体(专利文献13－18)。根据这样的人抗体scFv的噬菌体展示法取得人抗TfR噬菌体抗体(专利文献20)。然而，在抗体药物开发中，取得识别存在于细胞膜表面的“native form(天然类型)”靶标癌抗原的抗体非常重要，根据淘选方法或者筛选的不同，所取得的抗体的药理效果也不同。本发明的发明人目前为止制作了包括1000亿个独立的克隆的巨大的人抗体库，使用数十种癌细胞，以独自的技术确立了对存在于癌细胞膜表面的蛋白质(细胞表面抗原)的抗体的网罗式获取法(专利文献19)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第5,667,781号
专利文献2：美国专利第7,976,841号
专利文献3：欧州专利120694号
专利文献4：欧州专利125023号
专利文献5：英国专利GB2188638A
专利文献6：美国专利第5,585,089号
专利文献7：WO93/12227
专利文献8：WO1992/03918
专利文献9：WO1994/02602,
专利文献10：WO1994/25585，
专利文献11：WO1996/34096,
专利文献12：WO1996/33735
专利文献13：WO1992/01047
专利文献14：WO1992/20791,
专利文献15：WO1993/06213
专利文献16：WO1993/11236
专利文献17：WO1993/19172
专利文献18：WO1995/01438
专利文献19：日本专利4870348
专利文献20：WO2011/073943
非专利文献
非专利文献1：Mass R,et al.,Proc Am Soci Clin Oncol 19,75a,2000
非专利文献2：Berinstein NL,et al.,Annals of Oncology 1998,9:995-1001.
非专利文献3：Bruggemann M.,et al.,J.Exp.Med.,166,1351-1361.
非专利文献4：Loos M.(1982).Prog.Allergy,30,135-192.MolImmunol.1982 May；19(5):651-7.
非专利文献5：J Clin Invest 1963；42,314-326
非专利文献6：Int J Cancer 1981；27:329-334,
非专利文献7：J Urol 1990；143:381-385,
非专利文献8：Cancer Gene Ther 2000；7:59-65；
非专利文献9：Eur J Cancer 2004；40(9):1418-1422
非专利文献10：J Clin Invest 1980；65:1182-1191.
非专利文献11：Placenta 1986；7:391-403
非专利文献12：J Clin Invest(1980)66,1135-1143.10
非专利文献13：Proc.Natl Acad Sci USA 1982；79:1175-1179,
非专利文献14：Cancer Res 1986；46:1759-1763,
非专利文献15：Cancer Res 1990；50:6295-6301,
非专利文献16：Blood 2004；103:1838-1845
非专利文献17：J.Clin.Oncol.,2,881(1984)
非专利文献18：Blood,65,1349(1985)
非专利文献19：J.Natl.Cancer Inst.,80,932(1988)
非专利文献20：Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,82,1242(1985)
非专利文献21：J.Nucl.Med.,26,1011(1985)
非专利文献22：J.Natl.Cancer Inst.,80,937(1988)
非专利文献23：J.Immunol.,135,1530(1985)
非专利文献24：Cancer Res.,46,6489(1986)
非专利文献25：Clini.Cancer.Res.1995；1:1259-1265
非专利文献26：J.Exp.Med.,170,2153-2157,1989
非专利文献27：Nature,332,323-327,1988
非专利文献28：Cancer Res.2001；61:6851-6859,
非专利文献29：J Pharm Biomed Anal.2006；41:1347-1353
非专利文献30：Int J Oncol.199813(4):871-5
非专利文献31：Tohoku J.exp.Med.1987；153:239-243
非专利文献32：Urol.Res.1987；15:341-344
非专利文献33：Br.J.Urol.1990；65:339-344
非专利文献34：Histopathology 1988；12:53-63
非专利文献35：J.Clin.Pathol.1984；37:131-135
非专利文献36：A Pathol.Anat.Histopathol.1990；416:491-496
非专利文献37：Leukemia 1993；7:2019-2025
非专利文献38：Hematol.Pathol.1990；4:37-41
非专利文献39：Lancet 1983；1:498-501
非专利文献40：Blood 2004；103:1838-1845
发明内容
发明所要解决的课题
本发明将提供一种以TfR作为靶标的具有很强的肿瘤增殖抑制效果的完全的人抗体作为所要解决的课题。另外，将提供这些抗体的制造方法和使用抗体的癌症等疾病的治疗药物作为所要解决的课题。
用于解决课题的方法
如上所述，虽然以TfR作为靶标的抗体已经作为抗肿瘤剂进行了开发，但由于是源自动物的抗体，所以因HAMA的产生、药效的不足等而没有实现开发成功。因此，本发明的发明人深入研究了专利文献19中记载的独自的抗体制作方法，通过人抗体库噬菌体展示(Display)取得了与位于癌细胞膜上的TfR反应的噬菌体抗体(scFv抗体)。将这些scFv抗体进行IgG化，制作得到完全的人IgG抗体。
此外，以抗体的1)生产率的提高、2)保存稳定性的提高以及3)抗肿瘤效果的提高作为目的，对于所得到的完全的人抗TfR抗体的可变区的CDR改变至少一个氨基酸，为了临床应用而尝试了将抗TfR抗体进行优化。其结果，得知所得到的突变抗体与亲株同样地与人TfR反应，具有更强的抗肿瘤效果。特别是由上述得到的本发明的抗体比专利文献20和WO2012/153707中所记载的人抗TfR抗体在肿瘤抑制效果上显著优异。由上，利用这些抗体在各种TfR高表达得癌治疗中显示了有用性，从而完成了本发明。
即，根据本发明，提供选自下述(1)至(34)中的与人TfR特异性反应的抗体。
(1)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、7，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(2)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、8，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(3)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、9，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(4)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、10，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(5)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、11，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(6)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、12，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(7)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、13，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(8)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、14，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(9)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、15，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(10)重链具有序列号16，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(11)重链具有序列号17，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(12)重链具有序列号18，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(13)重链具有序列号19，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(14)重链具有序列号20，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(15)重链具有序列号21，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(16)重链具有序列号22，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(17)重链具有序列号23，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(18)重链具有序列号24，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(19)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号25的抗体；
(20)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号26的抗体；
(21)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号28的抗体；
(22)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号29的抗体；
(23)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号31的抗体；
(24)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号32的抗体；
(25)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号34的抗体；
(26)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号36的抗体；
(27)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号37的抗体；
(28)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号38的抗体；
(29)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号40的抗体；
(30)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区が序列号41的抗体；
(31)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号42的抗体；
(32)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、52、3，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(33)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、53、3，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(34)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、54、3，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
优选本发明的抗体为人抗体或人化抗体。
优选本发明的抗体为选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(Diabody)、二硫键稳定V区(dsFv)和包含CDR的肽中的抗体片段。
根据本发明，提供编码上述的本发明的抗体的DNA。
根据本发明，提供含有上述的本发明的DNA的重组载体。
根据本发明，提供将上述的本发明的重组载体导入宿主细胞得到的转化株。
根据本发明，提供本发明的抗体的制造方法，其包括在培养基中培养上述本发明的转化株，使本发明的抗体在培养物中生成蓄积，从培养物采集抗体的步骤。
根据本发明，提供具有上述的本发明的抗体的医药组合物。
根据本发明，提供细胞毒性物质与抗体结合的上述医药组合物。
优选细胞毒性物质为药剂、毒素或放射性物质。
优选本发明的医药组合物作为抗癌剂使用。
优选癌为实体癌或血液癌。
优选实体癌为肺癌、大肠癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、宫颈癌、子宫癌、卵巣癌、乳腺癌、头颈部癌、皮肤癌。
优选血液癌为白血病、淋巴瘤、骨髓瘤。
更优选血液癌为成人T细胞白血病(ATL)。
根据本发明，还提供抑制或治疗癌的方法，其包括向对象者投与上述的本发明的抗体的步骤。
根据本发明，还提供用于制造医药组合物或抗癌剂的、上述本发明的抗体的使用。
发明的效果
本发明的抗体是特异性识别人TfR、抑制表达TfR的癌细胞的生存和增殖的完全的人抗体。人抗体在投与给人时，避免了抗体的抗原性，不产生HAHA，因此能够发挥副作用更少的很高的抗肿瘤作用。即，本发明的抗人TfR抗体作为抗癌剂有用。
附图说明
图1表示各个抗TfR006抗体的改变抗体和白血病细胞株K562的流式细胞术结果
图2表示各个抗TfR006抗体的改变抗体的K562细胞的增殖抑制效果。
图3表示TfR006抗体的VH氨基酸序列(序列号43)、IGHV3-30氨基酸序列(序列号44)与人生殖系列基因的亚组III的共有氨基酸序列(序列号45)的比对。
图4表示ATL模型中的抗TfR006抗体的改变抗体的肿瘤增殖抑制效果。
图5表示ATL模型中的抗TfR006抗体的改变抗体的肿瘤增殖抑制效果。
图6表示白血病模型中的抗TfR006抗体的改变抗体的肿瘤增殖抑制效果。
图7表示白血病模型中的抗TfR006抗体的改变抗体的肿瘤增殖抑制效果。
图8表示白血病模型中的抗TfR006抗体的改变抗体的肿瘤增殖抑制效果。
图9表示实体癌模型中的抗TfR006抗体的改变抗体的肿瘤增殖抑制效果。
图10表示抗TfR006抗体的改变抗体和现有抗体的抗原抗体ELISA效果。
图11表示抗TfR006抗体的改变抗体和现有抗体的体内(in vivo)药效比较结果。
具体实施方式
接着，对于本发明进一步详细地说明。
定义和一般的技术
本说明书中，只要没有另外定义，关于本发明使用的科学技术用语包含本领域技术人员通常理解的意思。通常本说明书中记载的关于细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学以及杂交使用的命名法及其技术是本技术领域中所公知的，通常所使用的。
本发明的方法和技术通常只要不另外表示，则根据本技术领域所公知的现有的方法，在本说明书整体中以引用论述的各种一般的参照文献和更具体的参照文献所记载的方式实施。
TfR
人转铁蛋白受体(TfR)是由人三号染色体所编码的760氨基酸构成的一次跨膜蛋白质(序列号51)。该蛋白质也作为CD71抗原已知，参与细胞对铁的摄入，据认为与细胞的增殖相关。本发明的TfR在结构上没有特别限定，包括单体、多聚体、在细胞膜表达的完整类型(intactform)、在细胞外区域所构成的可溶类型、剪切类型(truncted form)，另外，也包括由基因的突变、缺损等产生的突变类型(mutation form)、通过磷酸化等而受到翻译后修饰的类型等，所有都是指人TfR。
进行反应和反应性
本说明书中，“进行反应”和“反应性”只要没有特别表示，就是指相同意思。即，抗体识别抗原。该抗原既可以是在细胞膜表达的完整TfR，也可以剪切类型或可溶类型。另外，既可以是保持有立体结构的TfR，也可以是变性的TfR。作为研究反应性的方法，可以列举流式细胞术(FACS)、酶联免疫吸附检测法(ELISA)、蛋白质印迹(western-blot)、荧光微量测定技术(FMAT)表面等离子共振(BIAcore)、免疫染色、免疫沉降等。
作为用于流式细胞术的抗体，既可以是通过FITC等的荧光物质、生物素等所标记的抗体，也可以没有标记的抗体。根据使用的抗体的标记的有无、其种类，使用荧光标记抗生物素蛋白、荧光标记抗人免疫球蛋白抗体等。反应性能够通过将足够量的抗TfR抗体(通常最终浓度为0.01～10μg/mL)加入检测体中进行，进行与阴性对照抗体、阳性对照抗体的反应性的比较来评价。
抗体
本说明书中，根据需要按照习惯使用以下的简写(括号内)。
重链(H链)、轻链(L链)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、互补决定区(CDR)、第一互补决定区(CDR1)、第二互补决定区(CDR2)、第三互补决定区(CDR3)、重链的第一互补决定区(VHCDR1)、重链的第二互补决定区(VH CDR2)、重链的第三互补决定区(VH CDR3)、轻链的第一互补决定区(VL CDR1)、轻链的第二互补决定区(VL CDR2)、轻链的第三互补决定区(VL CDR3)。
本说明书中，“抗体”这一用语与免疫球蛋白的意思相同，应当按照本技术领域通常已知的来理解。具体而言，抗体这一用语不受制作抗体的任意的特定方法的限定。例如，抗体这一用语中包含有重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体，但不限于此。
本说明书中，“人抗体”这一用语是指可变区和恒定区的序列为人序列的任意的抗体。该用语包含具有源自人基因的序列、但例如以进行认为降低免疫原性、增加亲和性、除去有可能引起不希望的折叠的半胱氨酸等方式而变化的抗体。该用语还包含能够实施不是人细胞所特有的糖基化的、在非人细胞中通过重组制作的这样的抗体。这些抗体能够以各种方式制备。
本说明书中，“人化抗体”这一用语是指非人来源的抗体，非人种的抗体序列中特征性的氨基酸残基被取代为在人抗体的对应位置所识别的残基。该“人化”工序的结果据认为使所得到的抗体在人中的免疫原性降低。可以理解使用本技术领域中公知的技术能够将非人来源的抗体人化。例如，可以参照Winter等，Immunol.Today14：43～46(1993)。能够通过重组DNA技术将作为对象的抗体的CH1、CH2、CH3、铰链域和/或框架域取代为对应的人序列，以工程学的方法制作。例如，能够参照WO92/02190以及美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,792号、第5,714,350号和第5,777,085号。本说明书中，“人化抗体”这一用语所意味的范围内包含嵌合人抗体和CDR移植抗体。
本发明的抗体的可变区中，框架域(FR)的序列只要实质上不影响对于所对应抗原的特异的结合性，就没有特别限定。优选使用人抗体的FR区，但也能够使用人以外的动物种类(例如小鼠或大鼠)的FR区。
本说明书中，“噬菌体抗体”这一用语是指由噬菌体产生的scFv抗体。即，为包含VH和VL氨基酸序列的抗体片段。该片段除了作为接头(Linker)的氨基酸以外，也可以包含作为标签的氨基酸序列。
在本发明的抗体的一个方式中，除了可变区以外，还包含恒定区(例如IgG型抗体)。恒定区的序列没有特别限定。例如，能够使用公知的人抗体的恒定区。作为人抗体的重链恒定区(CH)，只要属于人免疫球蛋白(以下，记作hIgG)，则所有的都可以，但优选hIgG类的恒定区，进而能够使用属于hIgG类的hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4这些亚类的任意一种。另外，作为轻链恒定区(CL)，只要属于hIg，则所有的都可以，能够使用κ类或λ类的恒定区。另外，也能够使用人以外的动物种类(例如小鼠或大鼠)的恒定区。
本说明书中，“改变体”或“改变抗体”是指在亲抗体的可变区(CDR序列和/或FR序列)的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入1或多个氨基酸的抗体。“亲抗体”是指VH具有序列号43所示的氨基酸序列、VL具有序列号46所示的氨基酸序列的TfR006抗体。氨基酸序列中，缺失、添加、取代和/或插入了1或多个(例如、1至8个、优选1至5个、更优选1至3个、特别优选1或2个)的氨基酸。作为用于制备具有对于TfR的结合活性和/或抗肿瘤活性的抗体的氨基酸序列的、本领域技术人员所熟知的方法，已知有在蛋白质中导入突变的方法。例如，只要为本领域技术人员，就能够通过使用部位特异性的突变诱导法(Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y,anDNAkagawa,M.(1995)An oligodeoxyribonucleotide-directed dualamber method for site-directed mutagenesis.Gene 152,271-275、Zoller,MJ,and Smith,M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNAfragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol.100,468-500、Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW,Kramer,B,Pflugfelder,M,and Fritz,HJ(1984)The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedmutation construction.Nucleic Acids Res.12,9441-9456、Kramer W,andFritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutations viagapped duplex DNA Methods.Enzymol.154,350-367、Kunkel,TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypicselection.Proc Natl Acad Sci U S A.82,488-492)等，在具有对TfR的结合活性和/或抗肿瘤活性的抗体的氨基酸序列中导入适当突变，由此制备与具有对TfR的结合活性和/或抗肿瘤活性的抗体在功能上等同的突变体。
本说明书中，“活性与亲抗体等同”是指对人TfR的结合活性和/或抗肿瘤活性等同。“等同”并不一定为相同程度的活性，既可以是活性被增强，还可以是只要具有活性而活性被减少。作为活性减少的抗体，例如，能够列举与原始抗体比较具有30％以上的活性的抗体，优选具有50％以上的活性的抗体，更优选具有80％以上的活性的抗体，更加优选具有90％以上的活性的抗体，特别优选具有95％以上的活性的抗体。
作为结合活性，是指识别抗原的意思。该抗原既可以是在细胞膜表达的完整TfR，也可以剪切类型或可溶类型。另外，既可以为保持立体结构的TfR，也可以是变性的TfR。例如，作为研究结合活性的方法，可以列举流式细胞术(FACS)、酶联免疫吸附检测法(ELISA)、蛋白质印迹、荧光微量测定技术(FMAT)、表面等离子共振(BIAcore)等。
作为抗肿瘤活性，是指妨碍肿瘤细胞的增殖或生存的活性。该肿瘤细胞的增殖或生存的妨碍既可以在体外(in vitro)也可以在体内(invivo)。例如，在体外(in vitro)使肿瘤细胞的数量减少的活性、阻碍肿瘤细胞的数量增加的活性、引起肿瘤细胞的细胞死亡的活性、抗体依赖性细胞毒性(ADCC：Antibody-dependent cellular cytotoxicity)、补体依赖性细胞毒性(CDC：Complement-dependent cytotoxicity)等。可以列举在体内(in vivo)使肿瘤重量或体积减少的活性、抑制肿瘤重量或体积的增加的活性、促进由其他药剂引起的肿瘤重量或体积的减少的活性、抑制因肿瘤细胞造成的个体死亡的活性等。
作为体内(in vivo)的动物模型，可以列举在裸小鼠等免疫不全小鼠中移植源自人癌组织的培养细胞株得到的异种移植模型、将培养小鼠癌细胞株移植到具有正常的免疫体系的野生型小鼠的同系移植模型等。
异种移植模型能够通过在裸小鼠等免疫不全小鼠的皮下、皮内、腹腔内、静脉内等各种部位移植人癌细胞株进行制作。
上述的抗体只要具有对TfR的同等的结合活性或者具有同等的抗肿瘤活性，就可以在可变区(CDR序列和/或FR序列)的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入1个或多个氨基酸。作为用于制备氨基酸序列中缺失、添加、取代和/或插入1或多个(例如、1至8个、优选1至5个、更优选1至3个、特别优选1或2个)氨基酸、具有对TfR的结合活性和/或抗肿瘤活性的抗体的氨基酸序列的、本领域技术人员所熟知的方法，已知有在蛋白质中导入突变的方法。例如，只要为本领域技术人员，就能够通过使用部位特异性的突变诱导法(Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y,anDNAkagawa,M.(1995)An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method forsite-directed mutagenesis.Gene 152,271-275、Zoller,MJ,and Smith,M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments clonedinto M13 vectors.Methods Enzymol.100,468-500、Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW,Kramer,B,Pflugfelder,M,and Fritz,HJ(1984)The gappedduplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction.Nucleic Acids Res.12,9441-9456、Kramer W,and Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplexDNA Methods.Enzymol.154,350-367、Kunkel,TA(1985)Rapid andefficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc NatlAcad Sci U S A.82,488-492)等，在具有对TfR的结合活性和/或抗肿瘤活性的抗体的氨基酸序列中导入适当突变，由此制备与具有对TfR的结合活性和/或抗肿瘤活性的抗体在功能上等同的突变体。
这样，在可变区中1个或多个氨基酸突变的、具有对TfR的结合活性和/或抗肿瘤活性的抗体也包含在本发明的抗体中。
本发明的抗体不受其来源限定，可以为人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体等源自任何动物的抗体。另外，也可以是嵌合化抗体、人化抗体等。作为本发明中抗体的优选方式之一，为人抗体。
本发明的抗体根据后述产生抗体的细胞、宿主或者纯化方法，其氨基酸序列、分子量、等电点或糖链的有无或形态等会有所不同。所得到的抗体只要具有与本发明的抗体等同的活性，就包含在本发明中。例如，本发明所记载的氨基酸序列在翻译后受到修饰的情况也包含在本发明中。此外，对于已知的翻译后修饰以外的部位的翻译后修饰，只要具有与本发明的抗体等同的活性，就包含在本发明中。另外，在使本发明的抗体在原核细胞、例如大肠杆菌中表达时，在本来的抗体的氨基酸序列的N末端添加甲硫氨酸残基。本发明的抗体也包含这样的抗体。对于已知的翻译后修饰以外的部位的翻译后修饰，只要具有与本发明的抗体等同的活性，也包含在本发明中。
抗体的制作
(1)通过噬菌体展示库与抗原进行反应的scFv
本发明的抗体的取得能够按照本技术领域已知的几种方法制备。例如，使用噬菌体展示技术，能够提供包含对TfR具有各种各样亲和性的抗体的全部组成成分的库。接着，能够筛选这些库，鉴定并分离针对TfR的抗体。优选噬菌体库为使用由从人B细胞分离出的mRNA所制备的人VL和VHcDNA而生成的scFv噬菌体展示库。制备并筛选这样的库的方法在本技术领域中是已知的。从以人TfR作为抗原筛选得到的显示反应性的噬菌体克隆中，回收遗传物质。如果解析所选择的噬菌体的基因，就能够确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的VH和VL的DNA序列。如果使用该scFv的序列将scFv进行IgG化，就能够取得人抗体。
(2)scFv的IgG化(人抗体的制作)
制作H链或L链的表达载体，使其在宿主细胞中表达，回收并纯化分泌上清，由此取得人抗体。另外，通过在同一载体中表达VH和VL(串联型)也能够取得人抗体。这些方法为公知的，能够参考WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、WO97/10354等。
具体而言，通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的其他DNA分子连结，能够取得完全长度重链基因。人重链恒定区基因的序列在本技术领域中是已知的(例如Kabat，E.A.等，(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242)，包含这些区域的DNA片段能够通过标准的PCR扩增得到。重链恒定区可以为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD的恒定区，但最优选为IgG1或IgG2的恒定区。IgG1恒定区序列可以为Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)或Gm(17)等已知在不同个人之间产生的任意的各种等位基因或同种异型。这些同种异型相当于在IgG1恒定区中的天然存在的氨基酸取代。
通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的其他DNA分子连结，能够取得完全长度L链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本技术领域是已知的(例如Kabat，E.A.等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Departmentof Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)，包含这些区域的DNA片段能够通过标准的PCR扩增得到。轻链恒定区可以为κ或λ的恒定区。κ恒定区可以为Inv(1)、Inv(2)或Inv(3)等已知在不同个人之间产生的任意的各种等位基因。λ恒定区可以源自3个λ基因中的任意一个。
通过将如上所述得到的编码H链或L链的DNA插入表达载体中，制作表达载体，使其在宿主细胞中表达，回收并纯化分泌上清，由此取得人抗体。表达载体中可以列举：质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒等植物病毒、粘粒、YAC、来自EBV的附加体等。表达载体和表达调节序列以适合于使用的表达用宿主细胞的方式选择。抗体轻链基因和抗体重链基因既能够插入各自的载体中，还能够将两种基因插入相同的表达载体中。将抗体基因通过标准的方法(例如，抗体基因片段上的互补的限制性酶切位点和载体的连结、或在不存在限制性酶切位点时进行平端连结)插入表达载体中。
恰当的载体是如上述记载的以能够容易插入任意的VH或VL序列并使其表达的方式以工程学方法制作的具有适当的限制性酶切位点的、编码功能完整的人CH或CL免疫球蛋白序列的载体。在这样的载体中，通常，在所插入的J区域中的剪接供与部位与在人C结构域之前的剪接接受部位之间、或者在人CH外显子内存在的剪接区域中，会发生剪接。多腺苷酸化和转录终结在处于编码区域下游的天然的染色体部位发生。重组表达载体还能够编码促进源自宿主细胞的抗体链的分泌的信号肽。抗体链基因能够以信号肽在框内与免疫球蛋白链的氨基末端连结的方式在载体中克隆化。信号肽既可以为免疫球蛋白信号肽，也可以为异种性信号肽(即源自非免疫球蛋白的信号肽)。
本发明的抗体的表达载体在抗体基因和调控序列以外，还可以具有调控宿主细胞中的载体复制的序列(例如复制起点)、选择标记基因等的其他序列。选择标记基因促进导入了载体的宿主细胞的选择。例如，通常，选择标记基因在导入了载体的宿主细胞后，赋予对于G418、潮霉素或甲氨蝶呤等药物的抗性。在优选的选择标记基因中，有：二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(dhfr-宿主细胞中与甲氨蝶呤选择/扩增一起使用)、新霉素磷酸转移酶基因(G418选择用)以及谷氨酸合成酶基因。
利用由以上的方法制作的抗体基因表达载体对宿主细胞进行转化。作为宿主细胞，细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等，只要是能够产生本发明的抗体，则可以为任何一种细胞，但优选动物细胞。作为动物细胞，可以列举：中国仓鼠卵巣细胞CHO/dhfr(－)细胞CHO/DG44细胞、源自猴的细胞COS细胞(A.Wright&S.L.Morrison,J.Immunol.160,3393-3402(1998))、SP2/O细胞(小鼠骨髓瘤)(K.Motmans et al.,Eur.J.Cancer Prev.5,512-5199(1996),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.50,1495-1502(1990))等。另外，转化适合使用脂质体法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6007(1989),P.L.Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413(1987))、电穿孔法、磷酸钙法(F.L.Graham&A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran法等。
培养转化体后，从转化体的细胞内或培养液分离人抗体。在抗体的分离、纯化中适合组合利用离心分离、硫酸铵分级、盐析、超滤、亲和色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱等方法。
抗体片段
基于本发明的抗体，或基于编码本发明的抗体的基因的序列信息，能够制作抗体片段。作为抗体片段，可以列举Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体。
Fab是通过将IgG在半胱氨酸存在下进行木瓜蛋白酶消化得到的、由L链和H链可变区、以及包括CH1结构域及铰链部的一部分的H链片段构成的分子量约5万的片段。本发明中，能够通过将上述抗体进行木瓜蛋白酶消化而得到。另外，也能够将编码上述抗体的H链的一部分和L链的DNA重组入适当的载体中，利用使用该载体转化得到的转化体来制备Fab。
Fab'是通过将后述的F(ab')2的H链间的二硫键切断而得到的分子量约5万的片段。本发明中，通过将上述抗体进行胃蛋白酶消化，使用还原剂切断二硫键而得到。另外，与Fab同样，能够使用编码Fab'的DNA用基因工程的方法制备。
F(ab')2通过将IgG进行胃蛋白酶消化而得到的、由L链和H链可变区、以及包含CH1结构域和铰链部的一部分的H链片段构成的片段(Fab')被二硫键结合得到的分子量约10万的片段。在本发明中，通过将上述抗体进行胃蛋白酶消化而得到。另外，与Fab同样，也能够使用编码F(ab')2的DNA用基因工程的方法制备。
scFv是将包含H链可变区和L链可变区的Fv通过将一个链的C末端和另一个的N末端用适当的连接肽连结而单链化得到的抗体片段。作为连接肽，能够使用例如柔软性高的(GGGGS)3等。例如，能够使用编码上述抗体的H链可变区和L链可变区的DNA和编码连接肽的DNA，构建编码scFv抗体的DNA，将其组合入适当的载体，利用使用该载体转化得到的转化体制备scFv。
dsFv是在H链可变区和L链可变区的适当的位置导入Cys残基，通过二硫键使H链可变区和L链可变区稳定化的Fv片段。各链中的Cys残基的导入位置能够根据由分子建模预测的立体结构确定。本发明中，例如能够从上述抗体的H链可变区和L链可变区的氨基酸序列预测立体结构，构建分别编码基于这样的预测导入突变的H链可变区和L链可变区的DNA，将其重组入适当的载体，然后利用使用该载体进行转化得到的转化体制备dsFv。
此外，也能够使用适当的连接体(linker)将scFv抗体、dcFv抗体等连结，使链抗生物素蛋白融合而将抗体片段进行多聚体化。
医药组合物
根据本发明，提供含有本发明的抗体的医药组合物。作为本发明一个实施方式，为癌的治疗，但不限于此。因TfR的高表达引起的癌以外的疾病也在本发明的范围以内。作为更优选的实施方式，癌为实体癌(例如、肺癌、大肠癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、宫颈癌、子宫癌、卵巣癌、乳腺癌、头颈部癌、皮肤癌等)、或血液癌(例如、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等)。本发明的另外的优选的实施方式中，癌为成人T细胞白血病(ATL)。
作为本发明的医药组合物的一个方式，本发明的抗体可以作为有效成分利用。其利用抗体的细胞增殖抑制活性、细胞死亡诱导活性、ADCC活性、CDC活性等，发挥抗肿瘤效果。抗体既可以具有仅一种以上的活性，也可以同时具有多种活性。即，裸(naked)抗体为医药组合物的有效成分。
在另一个方式中，本发明的抗体也能够作为癌治疗药用于特异性地以癌组织为靶标的导弹疗法。即，通过投与结合有对癌细胞造成伤害的物质的抗体，特异性地向癌部位转移，实现治疗效果和减轻副作用的治疗方法。
伤害癌细胞的物质可以列举药剂、毒素或放射线物质等细胞毒性物质。细胞毒性物质与抗体的结合能够使用本领域技术人员所公知的方法进行(Clin Cancer Res.2004 Jul 1；10(13):4538-49)。
与抗体结合的药剂能够使用对癌细胞造成伤害的公知的物质。作为例子，能够列举例如：倍癌霉素(Duocarmycin)、倍癌霉素的类似物及诱导剂、以CC-1065、CBI为主成分的倍癌霉素类似物、以MCBI为主成分的倍癌霉素类似物、以CCBI为主成分的倍癌霉素类似物、多柔比星、多柔比星缀合物、吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、多拉司他汀、多拉司他汀-10、考布他汀、卡奇霉素(calicheamicin)、美登素、美登素类似物、DM1，DM2，DM3，DM4、DMI、阿里他汀E、阿里他汀EB(AEB)、阿里他汀EFP(AEFP)、单甲基阿里他汀E(MMAE)、单甲基阿里他汀F(MMAF)、5-苯甲酰基戊酸AE酯(AEVB)、Tubulysin、双萨拉唑、埃博霉素、紫杉醇、多西他赛、SN-38、拓扑替康、根霉素、棘霉素、秋水仙碱、长春碱、长春地辛、雌莫司汀、西马多丁、eleutherobin、甲氨蝶呤、甲基叶酸、二氯甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、胞嘧啶阿拉伯糖苷、美法仑、艾司唑仑、洛诺西丁(リューロシダイン)、放线菌素、柔红霉素、柔红霉素缀合物、丝裂霉素C、丝裂霉素A、洋红霉素、氨基蝶呤、泰莱霉素、鬼臼毒素、鬼臼毒素衍生物、依托泊甙、依托泊甙磷酸盐、长春新碱、紫杉酚、多西紫杉醇维甲酸、丁酸、N8-乙酰基亚精胺以及喜树碱等，不仅限定于此。
抗体与药剂的结合中，既可以经由它们自身具有的连结基团等直接结合，另外也可以经由连接体或其他物质间接地结合。
药剂直接结合时的连结基团，可以列举例如经由利用SH基的二硫键或马来酰亚胺的结合。例如，将抗体的Fc区的分子内二硫键和药剂的二硫键还原，将两者以二硫键结合。另外，还有经由马来酰亚胺的方法。另外作为其他方法，还有在抗体内用基因工程的方法导入半胱氨酸的方法。
抗体和药剂也可以经由其他物质(连接体)间接地结合。希望连接体中具有1种或2种以上的与抗体或药剂或两者反应的官能团。作为官能团的例子，能够列举氨基、羧基、巯基、马来酰亚胺基、吡啶基等。
作为连接体的例子，可以列举：N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺己酸酯)(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺十一烷酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺己酸N－羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺苯基)-丁酸酯(SMPB)、以及N-(对马来酰亚胺苯基)异氰酸酯(PMPI)、6-马来酰亚胺己酸酯(MC)、马来酰亚胺丙酸酯(MP)、对氨基苄基氧基羰基(PAB)、N-琥珀酰亚胺基4(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)以及N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)等，但不限定于这些。另外，该连接体例如也可以为缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)之类的连接肽，上述列举的连接体还可以分别适当组合使用。
关于药剂和抗体的结合方法，例如能够按照Cancer Research；68(22)9280(2008)、Nature Biotechnology；26(8)925(2008)、Bio ConjugateChemistry；19、1673(2008)、Cancer Research；68(15)6300(2008)、或日本特表2008-516896号公报等中记载的方法进行。
作为毒素，能够列举将毒素以化学方法或基因工程学方法与抗体结合得到的所谓的免疫毒素。作为毒素，能够列举例如：白喉毒素A链、假单胞菌内毒素、赖氨酸链；无糖链赖氨酸A链白树毒素(Gelonin)皂草素(Saporin)等。
利用的放射性物质能够使用本领域技术人员所公知的物质。能够列举例如：钇90(90Y)、铼186(186Re)、铼188(188Re)、铜67(67Cu)、铁59(59Fe)、锶89(89Sr)、金198(198Au)、汞203(203Hg)、铅212(212Pb)、镝165(165Dy)、钌103(103Ru)、铋212(212Bi)、铋213(213Bi)、钬166(166Ho)、钐153(153Sm)、镥177(177Lu)等。优选为90Y、153Sm、177Lu。
抗体与放射性物质的结合能够通过本领域技术人员公知的方法进行(Bioconjug Chem.1994 Mar-Apr；5(2):101-4.)。
使用结合有包含放射性同位素的化合物的抗体的癌治疗能够通过本领域技术人员公知的方法进行(Bioconjug Chem.1998 Nov-Dec；9(6):773-82.)。具体而言，最初将结合有包含少量的放射性同位素的化合物的抗体向患者投与，进行全身的闪烁扫描。在确认到正常组织的细胞与抗体的结合少、癌细胞与抗体的结合多的情况的基础上，大量投与结合有包含放射性同位素的化合物的抗体。
利用包含本发明的抗人TfR抗体的医药组合物得到的制剂也包括在本发明的范围内。这样的制剂优选在含有抗体的医药组合物以外，还包含生理学上能够接受的稀释剂或载体，也可以是与其他抗体或抗癌剂这样的其他药剂的混合物。适当的载体包括：生理食盐水、磷酸缓冲生理食盐水、磷酸缓冲生理食盐水葡萄糖液以及缓冲生理食盐水，但不限定于这些。或者，抗体也可以冻结干燥，在需要的时候通过添加如上所述的缓冲水溶液进行再构成来使用。作为给药形态，能够列举：通过片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等的口服给药、或通过注射剂(皮下注射、静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射等)、经皮、经粘膜、经鼻、经肺、栓剂等的非口服给药。既可以单独投与由本发明的医药组合物得到的制剂，也可以与其他药剂并用。
本发明的医药组合物的给药量根据症状、年龄、体重等而不同，但通常在口服给药时，作为抗体的量，相对于成人，1天约为0.01mg～1000mg，能够将其1次或分成数次给药。另外，在非口服给药时，能够1次将约0.01mg～1000mg通过皮下注射、肌肉注射或静脉注射进行给药。
通过以下的实施例更加详细地说明本发明，但本发明并不受实施例的限定。
实施例
实施例1：使用癌细胞株的噬菌体抗体筛选
(1)与癌细胞结合的噬菌体抗体的筛选(肝癌细胞株HepG2)
用15cm培养皿培养HepG2细胞，利用2mg/mL胶原酶I/细胞解离缓冲液(Gibco BRL)将其从培养皿剥离。回收细胞，用冷却的PBS进行清洗后，混合1×1013cfu的人抗体噬菌体库，添加反应液(1％BSA、0.1％NaN3、MEM)使得最终体积为1.6mL，以4℃缓慢旋转4小时使其反应。反应结束后，将反应液分成两份，分别将其用事先准备的0.6mL的有机溶液(dibutyl phtalate cycloheximide(二丁基邻苯二甲酸环己酰亚胺)9：1)进行分层，通过微量离心机进行2分钟离心(3000rpm)。弃掉上清，用0.7mL的1％BSA/MEM悬浮沉降在管底的细胞，再用0.7mL的有机溶剂进行分层。同样地通过离心弃掉上清，将细胞用0.3mL的PBS悬浮，用液氮冻结(专利文献19、WO2008/007648)。
将冻结的细胞在37℃解冻，使其感染20mL的大肠杆菌DH12S(OD0.5)1小时。将受噬菌体感染的大肠杆菌加入600mL的2×YTGA培养基(2×YT、200μg/mL ampicisulfate、1％葡萄糖)，在30℃培养过夜。然后取10mL，加入200mL 2×YTA培养基(2×YT、200μg/mLampicisulfate)，在37℃培养1.5小时。加入1×1011辅助噬菌体KO7，再在37℃培养1小时。添加800mL的2×YTGAK培养基(2×YT、200μg/mL ampicisulfate、0.05％葡萄糖、50μg/mL卡那霉素)，在30℃培养过夜。通过10分钟的离心(8000rpm)，回收上清。在回收的上清中加入200mL的PEG液(20％聚乙二醇6000、2.5M NaCl)充分搅拌后，通过10分钟的离心(8000rpm)使噬菌体沉淀。将其悬浮于10mL的PBS，将其作为1st(第一次)筛选的噬菌体。
接着，进行2nd(第二次)筛选。混合2×107培养细胞和1×10101st筛选的噬菌体，加入反应液(1％BSA、0.1％NaN3、MEM)使得最终体积为0.8mL。然后，进行与上述1st筛选相同的方法，取得2nd筛选的噬菌体。
3rd(第三次)筛选使用1×109的2nd筛选的噬菌体，与上述同样地进行。
(2)噬菌体抗体的解析
回收3rd筛选的噬菌体，通过现有方法解析DNA序列，排除保持缺损区域的不完全的抗体和序列重复的抗体，取得具有独立的抗体序列的噬菌体抗体(参照日本专利第4870348号)。
通过同样的方法，使用下述的表1所示的21种癌细胞，进行与癌抗原反应的噬菌体抗体的筛选。其结果，如表1所示，取得1863个具有独立序列的噬菌体抗体。
[表1]
癌细胞 取得的噬菌体数量
CO-2 102
MKN45 90
OCTH-16 82
HepG2 410
NCI-H441 80
K562 33
U937 107
HL-60 107
MV4-11 46
KF28 62
NCI-N87 50
RERF-LC-AI 73
SW480 46
MCF7 73
LNCap.FGC 60
MDA-MB-231 78
U-87MG 62
T98G 71
DU-145 96
MMAc 76
G-361 59
实施例2：与可溶性人TfR反应的噬菌体的筛选
(1)可溶性TfR抗原产生细胞的制作
使用癌细胞株MIAPaCa2、SKOV-3，通过PCR法制作TfR的cDNA。通过常规方法制备TfR细胞外结构域的cDNA，将其插入pCMV-Script(Clontech公司制)，由此制作可溶性TfR抗原表达载体。将该表达载体导入细胞株293T中，制作了产生可溶性TfR抗原的表达细胞。
(2)通过ELISA的阳性噬菌体的筛选
回收上述可溶性TfR产生细胞的上清，通过纯化取得可溶性TfR抗原。使用该可溶性TfR抗原，通过ELISA研究抗原抗体的反应性。即，用PBS将可溶性TfR抗原调整为10μg/mL，以50μL/孔添加在Immuno Module/Strip Plates(NUNK)中，在37℃静置2小时。然后，弃掉可溶性TfR抗原，以200μL/孔添加封闭液(5％脱脂乳/0.05％NaN3/PBS)，在37℃进行2小时封闭。除去封闭溶液，利用PBS进行清洗，添加上述(表1)噬菌体的培养上清100μL/孔，在37℃使其反应1小时反。用PBS清洗5次后，以100μL/孔添加用PBS/0.05％Tween20稀释后的1μg/mL Rabbit anti-cp3，在37℃使其反应1小时。用PBS清洗5次后，以100μL/孔再添加用PBS/0.05％Tween20稀释2000倍后的anti-Rabbit IgG(H+L)-HRP，在37℃使其反应1小时。用PBS清洗5次后，以100μL/孔添加OPD in 0.1M柠檬酸磷酸缓冲液(pH5.1)+0.01％H2O2，在室温使其反应5分钟。以100μL/孔加入2NH2SO2，停止显色反应。然后，用SPECTRAmax340PC(Molecular Devices)测定492nm的吸光度。其结果，1863株的噬菌体之中，与可溶性TfR抗原显示显著的阳性反应的噬菌体为20株。对该20株噬菌体的DNA序列进行解析，确认到各个CDR序列均为新序列。其中，TfR006抗体的CDR序列如下所示。
TfR006
VH CDR1：序列号1、VH CDR2：序列号2、VH CDR3：序列号3
VL CDR1：序列号4、VL CDR2：序列号5、VL CDR3：序列号6
序列号1：SYGMH
序列号2：VISFDGSSKYYADSVKG
序列号3：DSNFWSGYYSPVDV
序列号4：TRSSGSIASNSVQ
序列号5：YEDTQRPS
序列号6：QSYDSAYHWV
实施例3：TfR006抗体的VH改变
(1)TfR006抗体的VH CDR3序列中的一个氨基酸取代
将TfR006抗体的VH(序列号43)CDR3(序列号3)的Kabat编号96、97、98、100分别取代成其他氨基酸。改变抗体TfR402抗体的VH以将Kabat编号96的氨基酸从S变成G(序列号7)的方式突变，TfR403抗体的VH以将Kabat编号97的氨基酸从N变成A(序列号8)的方式突变，TfR404抗体的VH以将Kabat编号98的氨基酸从F变成L(序列号9)的方式突变，TfR406抗体的VH以将Kabat编号100的氨基酸从S变成G(序列号10)的方式突变。取代后的序列表示在表2中。另外，所有的改变体的Kabat编号1的Q被取代成没有形成N末端焦谷氨酸的D。
[表2]
表2：改变抗体CDR3序列
...100.....102
Kabat编号 567890abcdef12
TfR006 HV CDR3 DSNFWSGYYSPVDV 序列号3
TfR402 HV CDR3 DGNFWSGYYSPVDV 序列号7
TfR403 HV CDR3 DSAFWSGYYSPVDV 序列号8
TfR404 HV CDR3 DSNLWSGYYSPVDV 序列号9
TfR406 HV CDR3 DSNFWGGYYSPVDV 序列号10
(2)TfR006抗体的VH CDR3序列中的3个氨基酸取代
制作将TfR006抗体VH CDR3序列的3个氨基酸取代后的改变抗体。取代该CDR3的Kabat编号95到100的6个氨基酸中的3个氨基酸。TfR407抗体的VH突变为Kabat编号N97A(将第97号氨基酸从N取代成A)、F98L、S100G(序列号11)、TfR408抗体HV突变为Kabat编号S96G、F98L、S100G(序列号12)，TfR409抗体HV突变为Kabat编号S09G、N97A、S100G(序列号13)，TfR410抗体突变为Kabat编号S96G、N97A、F98L(序列号14)(表3)。另外，所有的改变体的Kabat编号1的Q被取代成没有形成N末端焦谷氨酸的D。
[表3]
表3：改变抗体CDR3序列
...100.....102
Kabat编号 567890abcdef12
TfR006 HV CDR3 DSNFWSGYYSPVDV 序列号3
TfR407 HV CDR3 DSALWGGYYSPVDV 序列号11
TfR408 HV CDR3 DGNLWGGYYSPVDV 序列号12
TfR409 HV CDR3 DGAFWGGYYSPVDV 序列号13
TfR410 HV CDR3 DGALWSGYYSPVDV 序列号14
(3)TfR006抗体的VH CDR3序列中的4个氨基酸取代
制作将TfR006抗体的VH CDR3序列中的4个氨基酸取代后的改变抗体TfR411抗体。该CDR3的Kabat编号95到100的6个氨基酸中，突变为Kabat编号S96G、N97A、F98L、S100G(序列号15)(表4)。另外，该改变体的Kabat编号1的Q被取代成没有形成N末端焦谷氨酸的D。
[表4]
表4：改变抗体CDR3序列
...100.....102
Kabat编号 567890abcdef12
TfR006 HV CDR3 DSNFWSGYYSPVDV 序列号3
TfR411 HV CDR3 DGALWGGYYSPVDV 序列号15
(4)TfR006抗体的VH CDR2序列中的氨基酸取代
制作将TfR006抗体VH CDR2序列的氨基酸取代后的改变抗体。改变如下述的表所示。
[表5]
表5：改变抗体CDR2序列
50.................65
Kabat编号 012a3456789012345
TfR006 HV CDR2 VISFDGSSKYYADSVKG 序列号2
TfR434 HV CDR2 VISYDGSSKYYADSVKG 序列号52
TfR435 HV CDR2 VISFDGSNKYYADSVKG 序列号53
TfR436 HV CDR2 VISYDGSNKYYADSVKG 序列号54
(5)其他的TfR006抗体VH改变
用IMGT调查与TfR006抗体的VH氨基酸序列最接近的生殖系列的基因，结果判明为IGHV3-0。图3是TfR006抗体的VH氨基酸序列(序列号43)、IGHV3-0氨基酸序列(序列号44)与人生殖系列基因的亚组III的共有氨基酸序列(序列号45)的比对。从TfR412VH(序列号16)到TfR420HV(序列号24)制作具有各个不同氨基酸组合的TfR006VH突变体。
序列号16：TfR412 VH
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFKSYGMQWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSSRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVS
序列号17：TfR413 VH
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFKSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
序列号18：TfR414 VH
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFKSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
序列号19：TfR415 VH
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFKSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGGSRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
序列号20：TfR416 VH
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFKSYGMQWVRQAPGKGLEWVAVISFDGGSRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
序列号21：TfR417 VH
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVAVISFDGGSRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
序列号22：TfR418 VH
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMQWVRQAPGKGLEWVAVISFDGGSRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
序列号23：TfR419 VH
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVSVISFDGGNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
序列号24：TfR420 VH
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVSIVSFDGGNRYYADSIKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPIDVWGQGTLVTVSS
序列号43：TfR006 VH
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFPFKSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRGEDTAVYYCARDSNFWSGYYSPVDVWGQGTTVTVSS
序列号44：IGHV3-30
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
序列号45：Human VH3 consensus
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISGDGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
实施例4：TfR006抗体的VL改变
(1)TfR006抗体的VL改变
用IMGT检索被推定为使用TfR006 VL(序列号46)的生殖系列的基因，结果判明为IGLV6-7(登录号：Z73673、序列号47)(表6)。VL基因部分的氨基酸取代有5处，基于此制作了TfR006抗体的VL改变体TfR421、TfR422(TfR421：序列号25、TfR422：序列号26)。另外，该改变体的Kabat编号1的Q被取代成没有形成N末端焦谷氨酸的D。
[表6]
表6：TfR006生殖系列的基因
序列号25：TfR421 VL
DFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNHWVFGGGTKLAVL
序列号26：TfR422 VL
DFMLTQPQSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNQWVFGGGTKLAVL
序列号46：TfR006 VL
序列号47：IGLV6-57
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSN
IMGT的亚组6的生殖系列基因为1个，因此无法制作共有序列。因此用亚组6和亚组1、2制作共有序列(序列号27)。基于此制作了TfR006抗体的改变体TfR423VL(序列号28)和TfR424VL(序列号29)。
序列号27：VL1、2、6共有序列
QSxLTQPPSVSGSPGQSVTISCTGSSSNIGSxNyVSWYQQxPGtAPKLMIYENNKRPSGVPDRFSGSKxxSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSWDsSlSx
序列号28：TfR423 VL
DSALTQPPSVSGSPGQSVTISCTGSSSNIIASNSVQWYQQLPGtAPKTVIYEDTQRPSGVPDRFSGSKDSSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSYDSAYHWVFGGGTKLAVL
序列号29：TfR424 VL
DSALTQPPSVSGSPGQSVTISCTGSSSNIIASNSVQWYQQLPGtAPKTVIYENTQRPSGVPDRFSGSKDSSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYDSAYHWVFGGGTKLAVL
与TfR006VL序列最接近的人抗体VL为SUT(登录号：P06317，序列号30)，且VL的氨基酸序列全部15个不同。基于该信息，利用与人化技术同样的改变方法得到TfR425VL(序列号31)和TfR426VL(序列号32)的序列。
序列号30：SUT
DFMLTQPHSVSESPGKTVIISCTRSDGTIAGYYVQWYQQRPGRAPTTVIFEDTQRPSGVPDRFSGSIDRSSNSASLTISGLQTEDEADYYCQSYDRDHWVFGGGTKLTVLG
序列号31：TfR425 VL
DFMLTQPHSVSESPGKTVIISCTRSDGTIAGYYVQWYQQRPGRAPTTVIFEDTQRPSGVPDRFSGSIDRSSNSASLTISGLQTEDEADYYCQSYDSRDHWVFGGGTKLTVL
序列号32：TfR426 VL
DFMLTQPQSVSESPGKTVIISCTRSTGTIASNSVQWYQQRPGRAPTTVIFDETQRPSGVPDRFSGSIDRSSNSASLTISGLQTEDEADYYCQSYDSRDQWVFGGGTKLTVL
(2)TfR006抗体L链的改变
将TfR006抗体的Lambda链的CDR嫁接到Kappa链的亚组I的共有序列(序列号33)，得到TfR427抗体的VL氨基酸序列(序列号34)。进而，用IMTG检索将该氨基酸变换为碱基序列时最接近的生殖系列的基因，结果得知为IGKV1-5。在该IGKV1-5(登录号：Z00001、序列号35)的框中嫁接TfR006的Lambda链的CDR，得到TfR428抗体的VL(序列号36)。进而分别取代TfR428抗体的VL CDR3的D92N、H95Q，得到TfR429抗体(序列号37)和TfR430抗体(序列号38)的VL序列。
序列号33：Human KVI共有序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSLPWTFGQGTKVEIK
序列号34：TfR427 VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQIASNSVQWYQQKPGKAPKTVIYEDTQLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSYDSAYHWVFGQGTKVEIK
序列号35：IGKV1-5
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYS
序列号36：TfR428 VL
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序列号37：TfR429 VL
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序列号38：TfR430 VL
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与TfR417抗体的VL氨基酸序列接近的人抗体κ链为WEA(登录号：P01610、序列号39)，在其框中嫁接TfR006的Lambda链的CDR。这样得到TfR431抗体(序列号40)的VL序列。进而在TfR431抗体的CDR3中分别取代D92N、H95A，得到TfR432、TfR433抗体的VL序列。
序列号39：WEA
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序列号40：TfR431 VL
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序列号41：TfR432 VL
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序列号42：TfR433 VL
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实施例5：各改变抗体的制作
(1)表达各TfR006改变抗体的质粒(plasmid)的制作
将上述得到的各个TfR006改变VH、VL分别与人G1的恒定区(序列号48)以及对应的L链恒定区(λ：序列号49、κ：序列号50)连结。由GenScript公司全合成5'侧添加了NheI、3'侧添加了EcoRI的H链、L链基因。合成的重链、轻链的基因分别被重组入各个表达载体中。即，将H链、L链各自的人工合成基因用NheI和EcoRI切断，重组入表达载体pCAGGS的NheI和EcoRI部位，分别得到了突变抗体H链表达载体和L链表达载体。
(2)TfR006改变抗体的瞬时表达
TfR006改变抗体的瞬时表达中使用FreeStyle(Life Technologies)。作为基因导入用悬浮细胞的293-F(Life Technologies)在前一天传代。在转染当日，每一个抗体准备调整为1×106细胞/mL的细胞浓度的400mL的细胞悬浊液。制备在其中将各个抗体的重链表达载体100μg、轻链表达载体100μg合计200μg的质粒悬浮在OptiPro SFM中得到的溶液(I)。接着，将200μL的MAX reagent加入到8mL的OptiPRO SFM中(溶液II)。混合溶液(I)和(II)，以室温静置10分钟到20分钟。将该合计16mL的反应液加入到悬浮有293-F细胞的400mL的293表达培养基中，在37℃以8％CO2用细胞培养振荡机的TAITEC BioShakerBR-43FL培养6天到7天。6天到7天后，回收包含TFR006重组抗体的培养上清，将其作为材料，进行纯化。
(3)TfR006IgG抗体的纯化
瞬时表达的培养上清所含的各抗体蛋白质通过使用AKTAprime的Ab-Capcher ExTra(Protenova)亲和色谱柱纯化。得到的峰值级分(Peakfraction)利用作为溶剂用Dulbecco的PBS平衡化的Sephacryl S-300色谱柱进行凝胶过滤，进而进行纯化。纯化的抗体蛋白质的定量使用吸光系数计算。
(4)通过酶免疫测定法(ELISA)的抗体的定量
利用吸光度对抗体生产细胞的培养基上清所含的抗体、纯化的抗体的浓度进行了定量，并且还利用酶免疫测定法(ELISA)进行了定量。作为固相抗体在平皿中以100μl/孔(5μg/mL的浓度)加入山羊抗人IgG(H+L)(对于小鼠、兔、牛、小鼠IgG吸收完毕)(Cosmobio：AmericanQualex International，Inc.；AQI，Cat.No.A-110UD)，在4℃静置一昼夜。接着，以200μL/孔加入Block Ace在室温封闭1小时后，将试样的抗体进行梯度稀释，加入各孔中，孵育1小时使其反应。用PBST(0.05％Tween20、PBS)清洗5次后，以100μL/孔的比例加入将山羊抗人IgG(H+L)(对于小鼠、兔、牛、小鼠IgG吸收完毕)-HRP(Cosmobio：AQI，Cat.A-110PD)用PBST稀释10000倍后的检测抗体溶液。孵育1小时后，用PBST清洗5次，然后以100μL/孔的比例加入底物缓冲液TMB。在室温暗处孵育15分钟后，以100μL/孔的比例加入反应停止液，使反应停止，然后测定450nm的吸光度。使用纯化人IgG作为标准品制作标准曲线，使用该标准曲线算出人抗体的浓度。
实施例6：TfR006改变抗体的反应性
使用TfR表达细胞K562(ATCC CCL-243：CML)，研究各改变抗体的抗原反应性。通过离心回收K562细胞，用PBS清洗1次。然后，用FACS Buffer(含有1％BSA，2mM EDTA，0.1％NaN3的PBS)悬浮细胞，使其达到1×106/mL。将该细胞悬浊液100μL分注入96孔V底板(Costar 3897)，进而将各个抗体用FACS Buffer调制成0.2μg～2/mL，将各个抗体溶液100μL添加到细胞中，在4℃孵育1小时。将细胞利用FACS Buffer清洗2次后，添加用FACS Buffer稀释到750倍的Alexa488-anti-human IgG(invitrogen)溶液100μL，搅拌后进一步在4℃孵育1小时。用FACS Buffer通过离心清洗2次，安装于FACSCalibur(BD)的HTS，测定各孔的FL1荧光强度。如图1所示，各改变抗体(a:1ng/mL；b：10ng/mL；c：100ng/mL；d:1μg/mL)相对于K562细胞显示出与亲抗体TfR006同等的反应性。
实施例7：TfR改变抗体的体外(in vitro)癌细胞增殖抑制效果
用培养液将TfR表达细胞株K562(ATCC CCL-243)以及ATL细胞株MT-2细胞调制成2500/mL密度，在96孔平底板(NUNC 167008)中各分注100μL/孔。制作各个TfR006改变抗体4.6ng～10μg/mL的抗体稀释系列，将其100μL添加到细胞中，以37℃、5％CO2、95％空气培养96小时。培养结束后，在平板中添加Cell Counting Kit(DOJINDO)20μl，以37℃、5％CO2、95％空气培养3小时。在吸光度(Absorbance)450nm进行测定。用下述的计算式算出由各浓度的抗体添加得到的增殖率。使用Master Plex 2010软件(Hitachi solutions,Ltd.)，求出显示增殖率50％的抗体浓度(IC50)(表7)。如图2所示，TfR006改变抗体与亲抗体大致相同程度地抑制癌细胞的增殖。
增殖率＝抗体添加孔值－空白(仅为培养液)/对照值(无抗体孔)－空白(仅为培养液)×100％
[表7]
表7：显示增殖率50％的抗体浓度(IC50)
实施例8：ATL细胞株异种移植模型中的TfR改变抗体的抗肿瘤效果
用添加有10％FBS的RPMI1640培养液(SIGMA)培养ATL细胞株SU9T1细胞。移植时，通过离心回收细胞，将细胞以达到1×108/mL的方式悬浮于RPMI1640。混合该细胞悬浊液和等量的Matrigel(Becton,Dickinson(BD公司))，移植到SCID小鼠(雌性、6周龄、九动株式会社)的右腹侧部皮下。移植后，每周二次用游标卡尺测定肿瘤直径，在肿瘤平均体积达到150mm3前后的时刻，通过相对于肿瘤体积随机地分配，将小鼠分配成每1组5只。将TfR006、TfR402、TfR403、TfR404、TfR406抗体在各个组中以5mg/kg进行尾静脉投与，将TfRTfR435、TfR436抗体在各个组中以10mg/kg、3mg/kg进行尾静脉投与。阴性对照组中，以0.2mL/20g小鼠通过尾静脉投与PBS。每周进行投与2次(每3天或4天)，合计进行5次。投与后也与分配前同样地，每周2次用游标卡尺进行肿瘤直径的测定，求出各组的肿瘤体积。抗肿瘤效果的判定通过对于最终测定日的肿瘤体积，以PBS组作为对照的参数Dunnet多重比较检验进行判定。
肿瘤体积用下式算出。
肿瘤体积＝(短径)2×长径×0.5
另外，随机分配以及多重比较检验使用生物实验数据统计解析软件EXSUS(株式会社CAC)进行。
各组的肿瘤体积的平均值的经时的变化表示在图4和图5中。如图4和图5所示，肿瘤的增殖被投与的各个TfR抗体所抑制。特别是如图4所示，改变抗体TfR402比亲抗体TfR006显示更强的肿瘤增殖抑制效果。TfR435、TfR436抗体以10mg/kg的用量，不仅抑制了肿瘤的增殖，还发挥了显著的肿瘤缩小效果(图5)。
实施例9：白血病异种移植模型中的TfR改变抗体的抗肿瘤效果
用添加有10％FBS的RPMI1640培养液培养白血病细胞株细胞K562(ATCC CCL-243)。移植时，通过离心回收细胞，将细胞以达到5×107/mL的方式悬浮于RPMI1640。在SCID小鼠(雌性、7周龄、日本Clea)的右腹侧部皮下以成为5×106个/小鼠的方式以100μL/只移植上述癌细胞悬浊液。移植后，利用游标卡尺测定肿瘤直径，通过下述的式求出体积。在肿瘤平均体积达到150mm3以上的时刻，通过分组软件(EXSASversion7.6 CAC)进行小鼠的分组(n＝5)。在各个抗体投与组中，对小鼠通过尾静脉投与5mg/kg的TfR006抗体、TfR402抗体、TfR404抗体、TfR406抗体、TfR435抗体、TfR436抗体。另外，在低用量投与组中，对小鼠投与1mg/kg的TfR402、TfR434抗体、TfR435抗体、TfR436抗体。在阴性对照组中以0.2mL/20g小鼠通过尾静脉投与PBS。投与每周2次(每3天或4天)，合计进行5次。投与后每周2次利用游标卡尺进行肿瘤直径的测定，求出各组的肿瘤体积。抗肿瘤效果的判定通过肿瘤体积判定。
肿瘤体积通过下式算出。
肿瘤体积＝(短径)2×长径×0.5
将抗体5mg/kg的投与各组的肿瘤体积平均值的经时的变化表示在图6和图7中。如图6和图7所示，肿瘤的增殖被投与的各个TfR抗体所抑制。特别是如图6所示，改变抗体TfR402、TfR404、TfR406抗体均显示出比亲抗体TfR006更强的肿瘤增殖抑制效果。特别需要关注的是，TfR435、TfR436抗体即使为1mg/kg的低用量，也显著抑制了肿瘤的增殖(图8)。
实施例10：实体癌异种移植模型中的TfR改变抗体的抗肿瘤效果
用添加有10％FBS的DMEM培养液(SIGMA)培养膀胱癌细胞株BFTC-905(DSMZ；ACC361)。移植时，通过离心回收细胞，将细胞以达到5×107/mL的方式悬浮于RPMI1640。在SCID小鼠(雌性、7周龄、日本Clea)的右腹侧部皮下以成为5×106个/小鼠的方式以100μL/只移植上述癌细胞悬浊液。移植后，利用游标卡尺测定肿瘤直径，通过下述的式求出体积。在肿瘤平均体积达到200mm3左右的时刻，利用分组软件(EXSASversion7.6 CAC)进行小鼠的分组(n＝5)。在各个抗体投与组中，对小鼠通过尾静脉投与10mg/kg的TfR435抗体、TfR436抗体。在阴性对照组中，以0.2mL/20g小鼠通过尾静脉投与PBS。每周进行投与2次(每3天或4天)，合计进行5次。投与后每周2次利用游标卡尺进行肿瘤直径的测定，求出各组的肿瘤体积。抗肿瘤效果的判定通过肿瘤体积判定。
肿瘤体积通过下式算出。
肿瘤体积＝(短径)2×长径×0.5
将投与各组的肿瘤体积平均值的经时的变化表示在图9中。如图9所示，肿瘤的增殖被TfR435抗体、TfR436抗体的投与所抑制。
实施例11：抗体3TF12、3GH7(WO2011/073943)的IgG抗体表达质粒的制作
WO2011/073943中记载了对于人TfR的scFv单体、二聚体抗体。为了讲本发明的抗体与WO2011/073943中记载的抗体进行比较，制作了WO2011/073943中记载的3TF12、3GH7scFv抗体的IgG1抗体。3TF12的scFv氨基酸序列及碱基序列分别用序列号55号和56号表示，3GH7的scFv氨基酸序列及碱基序列分别用序列号57号和58号表示。
关于IgG1抗体的制作，与本发明的抗体的制作同样地，采用如下方法：将重链基因和轻链基因重组入各个表达载体中，将重链表达载体和轻链表达载体这2种质粒在基因导入时进行共转染，生产抗体。
关于重链，将可变区的碱基序列插入已经重组入人G1基因的盒式载体。可变区分别为3TF12scFv的重链可变区(氨基酸序列号59、碱基序列号60)和3GH7scFv重链可变区(氨基酸序列号61、碱基序列号62)。
关于轻链，将在可变区连接了恒定区的整体的轻链基因重组入表达载体中。轻链的可变区为3TF12 scFv的轻链可变区(氨基酸序列号63、碱基序列号64)和3GH7scFv轻链可变区(氨基酸序列号65、碱基序列号66)。
在各个可变区的碱基序列上连接作为Lambda恒定区之一的IGLC3*01(GenBank登录号：J00254)。加入了数据库上的登录号J00254中确认到缺失的N端的2个氨基酸GQ(碱基序列中，为GGTCAG)(氨基酸序列号67、碱基序列号68)。
此外，各个基因在不变更初始的氨基酸序列的条件下，进行碱基序列的优化，由GenScript公司合成。合成的3TF12的重链可变区的氨基酸序列表示为序列号69，优化的碱基序列表示为序列号70，轻链的氨基酸序列表示为序列号71，优化的碱基序列表示为序列号72。合成的3GH7的重链的可变区的氨基酸序列表示为序列号73，优化的碱基序列表示为序列号74，轻链的氨基酸序列表示为序列号75，优化的碱基序列表示为序列号76。使用的人IGHG1的氨基酸序列由Uniprot(P01857)公开，氨基酸序列表示为序列号77，碱基序列表示为序列号78。此外，在对基因进行全合成时，为了方便构建，在合成基因的5'侧添加限制性内切酶NheI的识别部位，在3'侧添加限制性内切酶EcoR1的识别部位。通过用这些限制性内切酶处理合成基因，进行抗体基因从亚克隆载体向表达载体的重组。
实施例12：抗体3TF12、3GH7(WO2011/073943)的IgG抗体的瞬时表达
在转染前一天，在三角烧瓶中将Expi293F细胞(Life Technologies)以每1 mL为1.4×106细胞的方式用85mL的PowerCHO-2CD培养基(LONZA)进行调整，在37℃、8％CO2的条件下，设定为每分钟转速(rpm)135，进行振荡培养。
抗体基因向Expi293F细胞的导入使用2种质粒，即，重链表达载体和轻链表达载体进行。
向Expi293F细胞的转染如下进行，即，在管1中在5mL的Opti-MEM(Life Technologies)中加入50μg的重链表达载体和50μg的轻链表达载体，充分混合。接着在管2中加入5mL的Opti-MEM和0.27mL的ExpiFectamine293reagent，充分混合。在管1混合液中加入管2混合液，进行搅拌，在室温静置20分钟到30分钟。将该混合液加入到自前一天预先进行了振荡培养的Expi293F细胞中(转染)。在转染16小时至18小时后，加入0.5mL的ExpiFectamine293 TransfectionEnhancer1和5mL的ExpiFectamine293 Transfection Enhancer2。然后，以37℃、8％CO2、135rpm次转速培养6天。在转染7天后回收培养上清。通过离心除去细胞后，通过0.2μm的过滤器，将其用于抗体的纯化。
实施例13：抗体3TF12、3GH7(WO2011/073943)的IgG抗体的纯化
抗体的纯化首先使用阴离子交换担载体进行，接着使用Protein A担载体进行。使用AKTAprime plus纯化瞬时表达Expi293F细胞的培养上清。以流速每分钟5mL上样于CaptoQ(GE healthcare)柱(柱容量10mL)。包含抗体的取得级分为通过液(通过级分)，但除了蛋白质以外，核酸(基因组或RNA)与阴离子交换担体结合而能够除去，因此，就能够有效地利用接下来的Protein A的结合容量。以流速每分钟5mL上样于Protein A担载体(Ab-Capcher ExTra：Protenova公司；10mL)，然后，清洗缓冲液以与上样相同的流速用D-PBS进行。洗脱的级分容量设定成每个试管为4mL进行分取。洗脱使用0.1M甘氨酸盐酸缓冲液、pH2.7，以流速每分钟3mL进行。在分取洗脱液的试管中预先加入120μL的1M Tris盐酸缓冲液(pH8.5)，与洗脱同时使pH从酸性快速恢复到pH6.5的中性附近。蛋白质量用280nM的吸光度检测，分取峰值级分。该峰值级分，使用分子量3万截止的Ultra cell超滤盘的Millipore搅拌式单元，一边将缓冲液交换为D-PBS一边进行洗脱液的浓缩。
实施例14：与3TF12、3GH7 IgG抗体的亲和性比较
将实施例2中制作的可溶性TfR抗原以2μg/mL的浓度悬浮于PBS(2.68 mM KCl，1.47 mM KH2PO4，136.89 mM NaCl，8.04 mMNa2HPO4)，在96孔板(Nunc Immuno Module MaxiSorp(ThermoScientific，cat.468667))中以100μL/孔进行分注，在4℃静置过夜。
第二天，弃去孔内的溶液，将Block Ace(DS Pharma Biomedical株式会社、cat.UK-B40)的原液以200μL/孔进行分注，在室温用多孔板振荡器(IKA、cat.MTS 2/4 degital)振荡1小时进行封闭。然后弃掉溶液，进行多孔板的清洗(使用Plate washer(Biotech、cat.MW-96AR)，BufferA(PBS+0.05％Tween20)250μL×5次清洗)。接着，制备将纯化抗体TFR436、3TF12和3GH7改变浓度用BufferA稀释后的溶液，以100μL/孔进行分注，在室温用多孔板振荡器振荡1小时。
弃掉溶液，进行多孔板的清洗后，制备将HRP标记抗人IgG抗体(Peroxidase-conjugated AffiniPure F(ab’)2 Fragment Goat Anti-HumanIgG FcγFragment Specific(Jackson Immuno Research，cat.109-036-098))用BufferA稀释50,000倍的溶液，以100μL/孔进行分注，在室温用多孔板振荡器振荡1小时。
进行多孔板的清洗后，以100μL/孔加入TMB显色液(SCYTEC，cat.TM4999)，在暗处静置8分钟进行显色。以100μL/孔加入停止液(SCYTEC，cat.TSB999)后，用多孔板读取器(CORONA、cat.MTP450)测定450nm的吸光度(A450)。
将所得到的结果表示在图10中。如图10所示，TFR436抗体显示出显著高于3TF12和3GH7的反应性。提示了相比于3TF12和3GH7抗体，TFR436抗体与TFR抗原的亲和性更强。
实施例15：与3TF12、3GH7 IgG抗体的体内(in vivo)药效比较
用添加有10％FBS的RPMI1640培养液培养白血病细胞株细胞K562(ATCC CCL-243)。移植时通过离心回收细胞，将细胞以成为5×107/mL的方式悬浮于RPMI1640。在SCID小鼠(雌性、7周龄、日本Clea)的右腹侧部皮下以5×106个/小鼠的方式以100μL/只移植上述癌细胞悬浊液。移植后，利用游标卡尺测定肿瘤直径，通过下述的式求出体积。在肿瘤平均体积达到150mm3以上的时刻，利用分组软件(EXSASversion7.6 CAC)，进行小鼠的分组(n＝5)。在各个抗体投与组中，对小鼠通过尾静脉投与1mg/kg的TfR435抗体、TfR436抗体、3TF12抗体、3GH7T抗体。在阴性对照组中以0.2mL/20g小鼠通过尾静脉投与PBS。每周进行投与2次(每3天或4天)，合计进行5次。投与后每周2次利用游标卡尺进行肿瘤直径的测定，求出各组的肿瘤体积。抗肿瘤效果的判定通过肿瘤体积判定。
肿瘤体积用下式算出。
肿瘤体积＝(短径)2×长径×0.5
将投与各组的肿瘤体积平均值的经时的变化表示在图11中。如图11所示，在1mg/kg的投与时，TfR435、TfR436抗体显著抑制了肿瘤的增殖，但3TF12、3GH7抗体没有显著地抑制肿瘤的增殖。

Claims (15)

1.一种与人TfR特异性反应的抗体，其选自下述(1)至(34)：
(1)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、7，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(2)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、8，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(3)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、9，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(4)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、10，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(5)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、11，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(6)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、12，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(7)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、13，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(8)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、14，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(9)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、15，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(10)重链具有序列号16，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(11)重链具有序列号17，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(12)重链具有序列号18，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(13)重链具有序列号19，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(14)重链具有序列号20，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(15)重链具有序列号21，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(16)重链具有序列号22，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(17)重链具有序列号23，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(18)重链具有序列号24，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(19)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号25的抗体；
(20)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号26的抗体；
(21)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号28的抗体；
(22)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号29的抗体；
(23)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号31的抗体；
(24)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号32的抗体；
(25)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号34的抗体；
(26)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号36的抗体；
(27)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号37的抗体；
(28)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号38的抗体；
(29)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号40的抗体；
(30)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号41的抗体；
(31)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，且轻链可变区为序列号42的抗体；
(32)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、52、3，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(33)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、53、3，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体；
(34)重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、54、3，且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于：
抗体为人抗体或人化抗体。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其特征在于：
抗体为选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(Diabody)、二硫键稳定V区(dsFv)和包含CDR的肽中的抗体片段。
4.编码权利要求1～3中任一项所述的抗体的DNA。
5.含有权利要求4所述的DNA的重组载体。
6.将权利要求5所述的重组载体导入宿主细胞得到的转化株。
7.一种抗体的制造方法，其用于制造权利要求1～3中任一项所述的抗体，该制造方法的特征在于，包括：
在培养基中培养权利要求6所述的转化株，在培养物中生成并蓄积权利要求1～3中任一项所述的抗体，从培养物采集抗体的步骤。
8.具有权利要求1～3中任一项所述的抗体的医药组合物。
9.如权利要求9所述的医药组合物，其特征在于：
其为细胞毒性物质与抗体结合的医药组合物。
10.如权利要求9所述的医药组合物，其特征在于：
细胞毒性物质为药剂、毒素或放射性物质。
11.如权利要求8～10中任一项所述的医药组合物，其特征在于：
其作为抗癌剂使用。
12.如权利要求11所述的医药组合物，其特征在于：
癌为实体癌或血液癌。
13.如权利要求11所述的医药组合物，其特征在于：
实体癌为肺癌、大肠癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、宫颈癌、子宫癌、卵巣癌、乳腺癌、头颈部癌、皮肤癌。
14.如权利要求11所述的医药组合物，其特征在于：
血液癌为白血病、淋巴瘤、骨髓瘤。
15.如权利要求11所述的医药组合物，其特征在于：
血液癌为成人T细胞白血病(ATL)。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113164594A (zh) * 2018-11-20 2021-07-23 株式会社英仙蛋白质科学 向细胞内摄入铁的抑制剂
CN114364699A (zh) * 2019-09-04 2022-04-15 株式会社英仙蛋白质科学 红细胞增多症治疗药
CN114786718A (zh) * 2019-11-27 2022-07-22 株式会社英仙蛋白质科学 癌性腹膜炎的治疗药

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3292149T3 (pl) 2015-05-04 2022-03-21 Cytomx Therapeutics, Inc. Aktywowalne przeciwciała anty-cd71 i sposoby ich stosowania
JP6858185B2 (ja) * 2015-07-22 2021-04-14 イナサリス 増殖性および炎症性疾患の処置における抗ＴｆＲ抗体およびその使用
CN114502781A (zh) * 2019-09-20 2022-05-13 纳维再生科技股份有限公司 个人化癌症免疫治疗
EP4227686A1 (en) 2020-10-08 2023-08-16 National University Corporation Tokai National Higher Education and Research System Method for determining sensitivity or medicinal effect of anti-transferrin receptor antibody
CN117836003A (zh) 2021-08-26 2024-04-05 株式会社英仙蛋白质科学 Ros（活性氧类）产生增强剂
TW202328187A (zh) 2021-09-01 2023-07-16 美商百健Ｍａ公司 抗運鐵蛋白受體抗體及其用途
WO2023204181A1 (ja) * 2022-04-19 2023-10-26 学校法人東海大学 Ｎｋ細胞腫瘍の治療剤

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5589211A (en) 1985-06-24 1996-12-31 Cox; James P. Methods for processing poultry shell eggs
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
ATE154245T1 (de) 1990-03-27 1997-06-15 Salk Inst For Biological Studi Verfahren zur zellwachstumshinderung und dazu nützliche verbindungen
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU665025B2 (en) 1991-09-23 1995-12-14 Cambridge Antibody Technology Limited Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ATE275198T1 (de) 1991-12-02 2004-09-15 Medical Res Council Herstellung von antikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken.
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
DE69331089T2 (de) 1992-02-18 2002-07-18 Otsuka Kagaku Kk Beta-Laktam und Cepham Verbindungen und Ihre Herstellung
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
EP0656941B1 (en) 1992-03-24 2005-06-01 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
AU690171B2 (en) 1993-12-03 1998-04-23 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
ES2233974T3 (es) 1995-09-11 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anticuerpo contra la cadena alfa del receptor de la interleucina 5 humana.
JP4870348B2 (ja) * 2003-12-04 2012-02-08 株式会社ペルセウスプロテオミクス 細胞表面抗原に対する抗体取得とその抗原同定
WO2005111082A1 (en) 2004-04-30 2005-11-24 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Anti-tfr antibody.
CA2580141C (en) 2004-09-23 2013-12-10 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
AU2006216291B2 (en) 2005-02-27 2011-01-27 Institute For Antibodies Co., Ltd. Anti-IgSF4 antibody and utilization of the same
EP2975057A1 (en) 2006-07-10 2016-01-20 Fujita Health University Novel anti-cd73 antibody
CN101245107B (zh) 2007-02-14 2010-10-13 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 抗人转铁蛋白受体人源抗体及其应用
US7973019B1 (en) 2007-10-03 2011-07-05 Alcon Research, Ltd. Transferrin/transferrin receptor-mediated siRNA delivery
FR2953841B1 (fr) 2009-12-16 2011-12-30 Centre Nat Rech Scient Anticorps diriges contre le recepteur de la transferrine et leurs utilisations pour l'immunotherapie des tumeurs qui dependent du fer
CN103534272B (zh) 2011-05-09 2016-05-11 株式会社英仙蛋白质科学 能够特异性识别转铁蛋白受体的抗体
JP5990523B2 (ja) * 2011-08-26 2016-09-14 学校法人藤田学園 抗ヒトトランスフェリン受容体抗体を含む画像用腫瘍診断剤
JP5939855B2 (ja) * 2012-03-23 2016-06-22 国立大学法人 宮崎大学 トランスフェリン受容体抗体

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113164594A (zh) * 2018-11-20 2021-07-23 株式会社英仙蛋白质科学 向细胞内摄入铁的抑制剂
CN114364699A (zh) * 2019-09-04 2022-04-15 株式会社英仙蛋白质科学 红细胞增多症治疗药
CN114364699B (zh) * 2019-09-04 2024-03-29 株式会社英仙蛋白质科学 红细胞增多症治疗药
CN114786718A (zh) * 2019-11-27 2022-07-22 株式会社英仙蛋白质科学 癌性腹膜炎的治疗药

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