JP7410051B2 - 細胞内への鉄の取り込み阻害剤 - Google Patents
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Description
(1) ヒトトランスフェリンレセプターの629番目~633番目のアミノ酸を認識する抗体を含む、細胞内への鉄の取り込み阻害剤。
(2) ヒトトランスフェリンとヒトトランスフェリンレセプターとの結合を阻害することにより、細胞内への鉄の取り込みを阻害する、(1)に記載の阻害剤。
(3) 前記抗体が、重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体である、(1)または(2)に記載の阻害剤。
(4) 前記抗体が、重鎖が配列番号7を有し、軽鎖が配列番号8を有する抗体である、(1)から(3)の何れか一に記載の阻害剤。
(5) 抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である、(1)から(4)の何れか一に記載の阻害剤。
(6) 抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(Diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)およびCDRを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、(1)から(5)の何れか一に記載の阻害剤。
(7) 細胞内への鉄の過剰取り込みを伴う疾患又は症状の処置のために使用される、(1)から(6)の何れか一に記載の阻害剤。
(8) ヒトトランスフェリンレセプターの629番目~633番目のアミノ酸を認識する抗体を含む、ヒトトランスフェリンとヒトトランスフェリンレセプターとの結合阻害剤。
(9) 前記抗体が、重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体である、(8)に記載の阻害剤。
(10) 前記抗体が、重鎖が配列番号7を有し、軽鎖が配列番号8を有する抗体である、(8)又は(9)に記載の阻害剤。
(11) 抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である、(8)から(10)の何れか一に記載の阻害剤。
(12) 抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(Diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)およびCDRを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、(8)から(11)の何れか一に記載の阻害剤。
(13) 細胞内への鉄の過剰取り込みを伴う疾患又は症状の処置のために使用される、(8)から(12)の何れか一に記載の阻害剤。
(B) ヒトトランスフェリンレセプターの629番目~633番目のアミノ酸を認識する抗体を対象者に投与することを含む、ヒトトランスフェリンとヒトトランスフェリンレセプターとの結合を阻害する方法が提供される。
(C) ヒトトランスフェリンレセプターの629番目~633番目のアミノ酸を認識する抗体を対象者に投与することを含む、細胞内への鉄の過剰取り込みを伴う疾患又は症状を処置する方法。
(D) 細胞内への鉄の取り込みの阻害において使用するための、ヒトトランスフェリンレセプターの629番目~633番目のアミノ酸を認識する抗体。
(E) ヒトトランスフェリンとヒトトランスフェリンレセプターとの結合の阻害において使用するための、ヒトトランスフェリンレセプターの629番目~633番目のアミノ酸を認識する抗体。
(F) 細胞内への鉄の過剰取り込みを伴う疾患又は症状の処置において使用するための、ヒトトランスフェリンレセプターの629番目~633番目のアミノ酸を認識する抗体。
(G) 細胞内への鉄の取り込み阻害剤の製造のための、ヒトトランスフェリンレセプターの629番目~633番目のアミノ酸を認識する抗体の使用。
(H) ヒトトランスフェリンとヒトトランスフェリンレセプターとの結合阻害剤の製造のための、ヒトトランスフェリンレセプターの629番目~633番目のアミノ酸を認識する抗体の使用。
(I) 細胞内への鉄の過剰取り込みを伴う疾患又は症状の処置剤の製造のための、ヒトトランスフェリンレセプターの629番目~633番目のアミノ酸を認識する抗体の使用。
定義および一般的技術
本明細書において別段定義しない限り、本発明に関して使用した科学技術用語は、当業者に通常理解されている意味を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して使用した命名法およびその技術は、当技術分野で周知のものであり、通常使用されている。
ヒトトランスフェリン受容体(TfR)はヒト三番染色体にコードされる760アミノ酸から構成される一回膜貫通型タンパクである(配列番号9)。このタンパクはCD71抗原としても知られ、細胞の鉄の取り込みに関与し、細胞の増殖に関与すると考えられている。本発明のTfRは、構造上特別に限定せず、単量体、多量体、細胞膜に発現しているintact form、細胞外領域に構成された可溶化form、truncted form、また、遺伝子の変異や、欠損などによりmutation form、リン酸化などにより翻訳後修飾を受けたformなども含め、すべてヒトTfRを意味する。
本明細書において、「反応する」と「反応性」は特別に示さない限り、同じのことを意味する。すなわち、抗体が抗原を認識すること。この抗原は、細胞膜に発現するintact TfRでもよいし、truncted formや、可溶化formでも良い。また、立体構造を保ったTfRでもよいし、変性したTfRでもよい。反応性を検討する手段として、フローサイトメーター(FACS)、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、western-blot、蛍光微量測定技術(FMAT)表面プラズモン共鳴(BIAcore)、免疫染色、免疫沈降などが挙げられる。
本明細書では必要に応じて、慣習に従い以下の略号(括弧内)を使用する。
重鎖(H鎖)、軽鎖(L鎖)、重鎖可変領域(VH)、軽鎖可変領域(VL)、相補性決定領域(CDR)、第1相補性決定領域(CDR1)、第2相補性決定領域(CDR2)、第3相補性決定領域(CDR3)重鎖の第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖の第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖の第3相補性決定領域(VH CDR3)軽鎖の第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖の第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖の第3相補性決定領域(VL CDR3)。
本発明において、「親抗体」とは、VHは配列番号7、VLは配列番号8で示されたアミノ酸配列を有するTfR436抗体である。アミノ酸配列において、1または数個(例えば、1から8個、好ましくは1から5個、より好ましくは1から3個、特に好ましくは1または2個)のアミノ酸が欠失、付加、置換及び/または挿入されている。TfRに対する結合活性を有する抗体のアミノ酸配列を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, anDNAkagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V,Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492)などを用いて、TfRに対する結合活性を有する抗体のアミノ酸配列に適宜変異を導入することにより、TfRに対する結合活性を有する抗体と機能的に同等な改変抗体を調製することができる。このように、抗体の可変領域又は定常領域において、1または数個のアミノ酸が変異しており、TfRに対する結合活性を有する抗体を使用することもできる。
(1)ファージディスプレイライブラリーにより抗原と反応するscFv
抗体の取得は、当技術分野で知られているいくつかの方法に従って調製することができる。例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、TfRに対する親和性が様々である抗体のレパートリーを含むライブラリーを提供することができる。次いで、これらのライブラリーをスクリーニングして、TfRに対する抗体を同定し単離することができる。好ましくは、ファージライブラリーは、ヒトB細胞から単離されたmRNAから調製されたヒトVLおよびVHcDNAを使用して生成されるscFvファージディスプレイライブラリーである。そのようなライブラリーを調製しスクリーニングする方法は当技術分野で知られている。ヒトTfRを抗原としてスクリーニングした反応性を示すファージクローンから遺伝物質を回収する。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするVH及びVLのDNA配列を決定することができる。このscFvの配列を用いて、scFvをIgG化すれば、ヒト抗体を取得することができる。
H鎖またL鎖の発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製によりヒト抗体を取得する。また、VH及びVLを同一ベクターに発現すること(タンデム型)によりヒト抗体の取得もできる。これらの方法は周知であり、WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、W093/19172、WO95/01438、WO95/15388、WO97/10354などを参考にすることができる。
抗体を基にして又は抗体をコードする遺伝子の配列情報を基にして抗体断片を作製することができる。抗体断片としてはFab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体が挙げられる。
本発明の阻害剤を含む医薬組成物及び製剤も本発明の範囲内に含まれる。
本発明の阻害剤は、細胞内への鉄の過剰取り込みを伴う疾患又は症状の処置のために使用することができる。
細胞内への鉄の取り込み過剰を伴う疾患又は症状としては、鉄過剰症等を挙げることができる。
VH CDR1:SYGMH(配列番号1)
VH CDR2:VISYDGSNKYYADSVKG(配列番号2)
VH CDR3:DSNFWSGYYSPVDV(配列番号3)
VL CDR1:TRSSGSIASNSVQ(配列番号4)
VL CDR2:YEDTQRPS(配列番号5)
VL CDR3:QSYDSAYHWV(配列番号6)
TfR436 VH(配列番号7)
DVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFPFKSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRGEDTAVYYCARDSNFWSGYYSPVDVWGQGTTVTVSS
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNSVQWYQQRPGSAPITVIYEDTQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLQTEDEADYYCQSYDSAYHWVFGGGTKLAVL
TfR436抗体はマウスTfRと交差反応しないが、ハムスターTfRと交差反応性を示した。TfRにおけるTransferrin(TF)結合部位(569~760番目のアミノ酸)のアミノ酸配列のアライメントを行った。ヒトTfR配列において、ハムスターと同じ、マウスと異なるアミノ酸をピックアップした。ピックアップされたアミノ酸を図1に示されたようにpoint mutationを行い、可溶性TfR mutant fragmentを作製した。
ヒトTfR細胞外domain(89~760番目のアミノ酸)、あるいは図1に示されたそれぞれTfR mutant fragment(MF1~MF7)とAAARGGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH(配列番号10)をコードする塩基配列を全合成した。発現vector pCAGGS(非特許文献2.:Niwa et al. 1991)にネオマイシン耐性遺伝子とDHFR遺伝子を組み込んだベクターのマルチクローニングサイトにそれぞれ合成した遺伝子を挿入し、pCAGGS-Neo-DHFR-sTFR-myc-his発現plasmidを作製した。Expifectamine(Invitrogen)を用いてExpi293細胞(Invitrogen)に上記plasmidをトランスフェクションし、37℃、8%CO2、135rpmで5日間培養した。その後遠心により培養上清を回収し、AKTA prime(GE Healthcare)にHisTrapHP(GE Healthcare)カラムを接続し、結合バッファーに20mM Imidazole/DPBS、溶出バッファーに500mM Imidazole/DPBSを用いてsTfRあるいはMF1~MF7を精製した。溶出したタンパク質はZeba spin column (Thermo scientific)を用いて30mM HEPES、5%trehalose、pH7.2にバッファー交換した。
上記精製したsTfRあるいはMF1~MF7をPBST(Phosphate Buffered Saline with Tween20,TaKaRa) にて希釈し、600ng/mLから3倍希釈で7段階に調製した。その後Ni-NTA HisSorb Strips 96-well plate(QIAGEN)に希釈液を100μL/wellに分注し、シェーカーに乗せ、室温で反応させた。1時間後PBST Bufferで5回洗浄し、TfR436抗体(1ug/mL)を100μL/wellに分注し、シェーカーに乗せ、室温で1時間反応させた。その後、PBS-T Bufferで5回洗浄し、50,000倍希釈した二次抗体F(ab’)2 Fragment Anti-Human IgG Fcγ(Jackson Immuno Research)100μL/wellに分注し室温で1時間反応させた。PBST Bufferで5回洗浄後TMB Soluble Reagent(High Sensitivity)(Scy Tek)を100μL/wellに分注し、室温、暗所で3分間反応させた後、TMB Stop Buffer(Scy Tek)を100μL/well添加し、1分間シェーカーで振とうさせ、プレートリーダーで450n(ref.620nm)の吸光度を測定した。
(1)比較用抗体A24の作製
特許文献US2008/0193453にヒトTfRに対するA24抗体が記載されている。TfR436抗体とこの抗体を比較するため、寄託されたHybridomaを入手し、抗体を生産した。具体的には、Hybridoma をRPMI1640 (GIBCO)、FBS10%の培地に細胞濃度が1~2x105/mLになるようにまきこみ、37℃の5%CO2インキュベーターで培養した。拡大培養後、遠心により細胞を回収し、PBSで2回洗浄後無血清培地cosmedium005 (コスモバイオ)、0.5% Nutridoma-CS (Roche)にてさらに550mLになるまで拡大培養した。細胞がコンフルエントになってから5日後に遠心により培養上清を回収した。
実施例1に記載されたsTfRをPBSTにて5.0μg/mLになるように調整し、MaxiSorp 96-well plate(Nunc)に希釈液を100μL/wellに分注して4℃で一晩静置し固相化した。翌日に固相液を捨て、100%ブロックエース(DS Pharma Biomedical)200μL/wellで室温静置しブロッキングした。1時間後PBST Bufferで5回洗浄後、HRP標識したTf(2ug/mL)50μL/wellを分注し、更にTfR436抗体、A24抗体(10μg/mLから2倍希釈系列)またはholo-Tf(Sigma)300μg/mLから2倍希釈系列)を50μL/wellで添加した。室温で1時間反応させた後、PBST Bufferで5回洗浄し、TMB Soluble Reagent(High Sensitivity)を100μL/wellに分注し、室温暗所で反応させた。25分間後、TMB Stop Bufferを100μL/well添加し、1分間シェーカーで震とうさせた、プレートリーダーで450nm (ref.620nm)の吸光度を測定した。
上記の実験結果に示すように、TfR436抗体はTfRアミノ酸629番目~633番目を認識し、完全にTf-TfRの結合を阻害する。この阻害により、細胞内への鉄の取り込みが完全に阻害される。つまり、TfR436抗体は細胞内への鉄の取り込み阻害剤である。鉄は細胞の生存や増殖に不可欠な物質であり、細胞内鉄欠乏になると細胞増殖停止や細胞死が起こる。TfR436抗体が細胞の増殖を抑制するかどうか、またこの増殖抑制は鉄欠乏原因であることについてnon-trasferrin bound iron uptakeの鉄ドナーとして知られているクエン酸鉄アンモニウムを用いて検討した。具体的には、K562細胞を細胞数が5000個/mlとなるよう培養用メディウム(RPMI1640、10%FBS、1%P/S)に懸濁し、96ウエルプレートに100μl/wellずつ播種した。TfR436抗体を100μg/mlから5倍連続希釈した溶液を作製し、K562細胞に50μLずつ添加した(最終濃度:25~0.3μg/ml)。更に、120μMのクエン酸鉄アンモニウム(和光純薬)50μLを添加した(最終濃度:30μM)。37℃の5%CO2インキュベータ内に96時間で培養後、各ウエルをよく攪拌し、150μlの細胞培養液をV底96-wellプレート(Corning)に移し、その25μlをFACS Calibur(BD)に吸引させ、イベント数を測定した。得られたイベント数の4倍をウエルあたりの細胞数とし、抗体及びクエン酸鉄アンモニウム無添加のウエルにおける細胞数平均値を100%として、各処理における増殖率を算出した。
K562細胞株を用いて、TfR436抗体の添加による細胞内鉄量変化を確認した。具体的には、K562細胞を0.5x105cells/mLになるように播種したT150フラスコ(IMDM+10%-FBS;60mL)に対して、TfR436抗体を終濃度5μg/mLになるように添加した。比較対照として、TfR006抗体(特許5980202号に記載)、A24抗体、ヒトモノクローナルIgG1抗体(Nega mAb)、及びDPBS緩衝液(未処理)を用意し、TfR436抗体と同様に添加した。37℃、5%-CO2インキュベーターにて96時間培養した後、各サンプルの細胞数をカウントし、1.0x107cellsを回収した。細胞はDPBSにて3回洗浄した後、細胞ペレットに250μLのLysisM Reagent(Roche; cat.# 04 719 956 001)と2.5μLの6N-HClを添加・混和し、室温にて1時間静置した。遠心後、回収した上清を鉄定量に用いた。鉄定量は、メタロアッセイ鉄測定LS(フェロジン法)(Metallogenics; cat.#FE31M)に従い実施した。結果を図5に示した。
Claims (13)
- 配列番号9のアミノ酸配列からなるヒトトランスフェリンレセプターの629番目~633番目のアミノ酸を認識する抗体を含む、細胞内への鉄の取り込み阻害剤。
- ヒトトランスフェリンとヒトトランスフェリンレセプターとの結合を阻害することにより、細胞内への鉄の取り込みを阻害する、請求項1に記載の阻害剤。
- 前記抗体が、重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体である、請求項1または2に記載の阻害剤。
- 前記抗体が、重鎖が配列番号7を有し、軽鎖が配列番号8を有する抗体である、請求項1から3の何れか一項に記載の阻害剤。
- 抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項1から4の何れか一項に記載の阻害剤。
- 抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(Diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)およびCDRを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、請求項1から5の何れか一項に記載の阻害剤。
- 細胞内への鉄の過剰取り込みを伴う疾患又は症状の処置のために使用される、請求項1から6の何れか一項に記載の阻害剤。
- 配列番号9のアミノ酸配列からなるヒトトランスフェリンレセプターの629番目~633番目のアミノ酸を認識する抗体を含む、ヒトトランスフェリンとヒトトランスフェリンレセプターとの結合阻害剤。
- 前記抗体が、重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体である、請求項8に記載の阻害剤。
- 前記抗体が、重鎖が配列番号7を有し、軽鎖が配列番号8を有する抗体である、請求項8又は9に記載の阻害剤。
- 抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項8から10の何れか一項に記載の阻害剤。
- 抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(Diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)およびCDRを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、請求項8から11の何れか一項に記載の阻害剤。
- 細胞内への鉄の過剰取り込みを伴う疾患又は症状の処置のために使用される、請求項8から12の何れか一項に記載の阻害剤。
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