CN113164594A - 向细胞内摄入铁的抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明的课题在于提供一种以TfR为目标的、向细胞内摄入铁的抑制剂以及人Tf与人TfR的结合抑制剂。根据本发明，能够通过一种向细胞内摄入铁的抑制剂，其含有识别人转铁蛋白受体的第629个～第633个氨基酸的抗体。

Description

向细胞内摄入铁的抑制剂

技术领域

本发明涉及向细胞内摄入铁的抑制剂、以及人转铁蛋白与人转铁蛋白受体的结合抑制剂。

背景技术

转铁蛋白受体(TfR)是作为将与转铁蛋白(Tf)结合的铁摄入到细胞内的细胞膜构造而最初在网织红细胞上被确认的(非专利文献1)。TfR已知在胎盘的营养膜细胞、被活化的淋巴细胞以及肿瘤细胞等中被表达。

在专利文献1中记载了通过人抗体文库噬菌体展示获取与存在于癌细胞膜上的TfR反应的噬菌体抗体(scFv抗体)，将这些scFv抗体IgG化后，制作完全的人IgG抗体。在专利文献1中，还记载了对于所得到的完整的人抗TfR抗体的可变区的CDR改变其中的至少一个氨基酸，由此制作适于临床应用的抗TfR抗体。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际专利公开WO2014/073641号公报

非专利文献

非专利文献1：J Clin Invest 1963；42,314-326

非专利文献2：Gene.1991Dec 15；108(2):193-9.

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的课题在于解决提供一种以TfR为目标的、向细胞内摄入铁的抑制剂以及人Tf与人TfR的结合抑制剂。

用于解决课题的技术方案

本发明的发明人为了解决上述课题进行了深入探讨，结果发现，识别人TfR中规定位置的氨基酸序列的抗体能够抑制人Tf与人TfR的结合，进而能够抑制铁向细胞内的摄入，从而完成了本发明。

即，根据本发明，提供以下的发明。

(1)一种向细胞内摄入铁的抑制剂，其含有识别人转铁蛋白受体的第629个～第633个氨基酸的抗体。

(2)如(1)所述的抑制剂，其中，通过抑制人转铁蛋白与人转铁蛋白受体的结合，来抑制铁向细胞内的摄入。

(3)如(1)或(2)所述的抑制剂，其中，上述抗体为重链第一互补性决定区(VHCDR1)、重链第二互补性决定区(VH CDR2)、重链第三互补性决定区(VH CDR3)分别为序列编号1、2、3并且轻链第一互补性决定区(VL CDR1)、轻链第二互补性决定区(VL CDR2)、轻链第三互补性决定区(VL CDR3)分别为序列编号4、5、6的抗体。

(4)如(1)～(3)中任一项所述的抑制剂，其中，上述抗体为重链具有序列编号7、轻链具有序列编号8的抗体。

(5)如(1)～(4)中任一项所述的抑制剂，其中，抗体为人抗体或人源化抗体。

(6)如(1)～(5)中任一项所述的抑制剂，其中，抗体为选自Fab、Fab′、F(ab′)₂、单链抗体(scFv)、二聚体化V区域(Diabody)、二硫化物稳定化V区域(dsFv)和含有CDR的肽中的抗体片段。

(7)如(1)～(6)中任一项所述的抑制剂，其用于伴有铁向细胞内的过剩摄入的疾病或症状的处置。

(8)一种人转铁蛋白与人转铁蛋白受体的结合抑制剂，其含有识别人转铁蛋白受体的第629个～第633个氨基酸的抗体。

(9)如(8)所述的抑制剂，其中，上述抗体为重链第一互补性决定区(VH CDR1)、重链第二互补性决定区(VH CDR2)、重链第三互补性决定区(VH CDR3)分别为序列编号1、2、3并且轻链第一互补性决定区(VL CDR1)、轻链第二互补性决定区(VL CDR2)、轻链第三互补性决定区(VL CDR3)分别为序列编号4、5、6的抗体。

(10)如(8)或(9)所述的抑制剂，其中，上述抗体为重链具有序列编号7、轻链具有序列编号8的抗体。

(11)如(8)～(10)中任一项所述的抑制剂，其中，抗体为人抗体或人源化抗体。

(12)如(8)～(11)中任一项所述的抑制剂，其中，抗体为选自Fab、Fab′、F(ab′)₂、单链抗体(scFv)、二聚体化V区域(Diabody)、二硫化物稳定化V区域(dsFv)和含有CDR的肽中的抗体片段。

(13)如(8)～(12)中任一项所述的抑制剂，其用于伴有铁向细胞内的过剩摄入的疾病或症状的处置。

(A)提供一种抑制向细胞内摄入铁的方法，其包括对对象者投予识别人转铁蛋白受体的第629个～第633个氨基酸的抗体的步骤。

(B)提供一种抑制人转铁蛋白与人转铁蛋白受体的结合的方法，其包括对对象者投予识别人转铁蛋白受体的第629个～第633个氨基酸的抗体的步骤。

(C)提供一种处置伴有铁向细胞内的过剩摄入的疾病或症状的方法，其包括对对象者投予识别人转铁蛋白受体的第629个～第633个氨基酸的抗体的步骤。

(D)一种用于抑制向细胞内摄入铁的、识别人转铁蛋白受体的第629个～第633个氨基酸的抗体。

(E)一种用于抑制人转铁蛋白与人转铁蛋白受体的结合的、识别人转铁蛋白受体的第629个～第633个氨基酸的抗体。

(F)一种用于伴有铁向细胞内的过剩摄入的疾病或症状的处置的、识别人转铁蛋白受体的第629个～第633个氨基酸的抗体。

(G)一种识别人转铁蛋白受体的第629个～第633个氨基酸的抗体在向细胞内摄入铁的抑制剂的制造中的使用。

(H)一种识别人转铁蛋白受体的第629个～第633个氨基酸的抗体在人转铁蛋白与人转铁蛋白受体的结合抑制剂的制造中的使用。

(I)一种识别人转铁蛋白受体的第629个～第633个氨基酸的抗体在伴有铁向细胞内的过剩摄入的疾病或症状的处置剂的使用。

发明效果

根据本发明，能够提供向细胞内摄入铁的抑制剂以及人Tf与人TfR的结合抑制剂。本发明的抑制剂在伴有铁向细胞内的过剩摄入的疾病或症状的处置中有用。本发明的抑制剂能够用于抑制成红血细胞等的铁需求性高的细胞的增殖。

附图说明

图1中表示各个TfR突变片段中的发生了点突变的部位。

图2中表示TfR436与可溶性野生型TfR(sTfR)和TfR突变片段的反应性。

图3中表示TfR436的Tf－TfR结合抑制活性。

图4中表示柠檬酸铁铵对于TfR436抗体的抑制细胞增殖效果的效果。

图5中表示通过添加TfR436抗体导致的K562细胞株内铁量的变化。

具体实施方式

下面，对于本发明进行更详细的说明。

定义和常规的技术

本说明书中没有特别定义时，关于本发明使用的科学技术术语包括本领域技术人员通常所理解的意义。一般来说，本说明书中的关于细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学以及杂交所使用的命名法及其技术是在本技术领域中所公知的，被普遍使用的。

本发明的方法和技术在没有特别明示时，是在本技术领域中公知的现有方法，因此，能够如在本说明书整体所引用和讨论的各种常规参考文献和更具体的参考文献中记载的那样实施。

TfR

人转铁蛋白受体(TfR)是由人三号染色体上所编码的760个氨基酸构成的单次跨膜蛋白(序列编号9)。该蛋白也作为CD71抗原被熟知，被认为参与细胞的铁的摄入，并参与细胞增殖。本发明的TfR在构造上没有特别限定，包括单体、多聚体、在细胞膜上表达的完整形式(intact form)、在细胞外区域构成的可溶化形式、缩短形式(truncted form)、或者因基因变异或缺损等导致的突变形式(mutation form)、由于磷酸化等在翻译后受到修饰的形式等，意指所有的人TfR。

发生反应和反应性

本说明书中，“发生反应”和“反应性”在没有特别明示时，具有相同含意。即，抗体识别抗原。该抗原既可以是在细胞膜上表达的完整TfR，也可以是缩短形式、可溶化形式。另外，既可以是保持了立体结构的TfR，也可以是突变后的TfR。作为探讨反应性的手段，可以列举流式细胞仪(FACS)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、蛋白质印迹法(western－blot)、荧光痕量测量技术(FMAT)、表面等离子体共振(BIAcore)、免疫染色、免疫沉降等。

作为流式细胞仪中使用抗体，可以是利用FITC等的荧光物质、生物素等标识的抗体，也可以是未被标识的抗体。依照所使用的抗体的标识的有无、其种类，使用荧光标识亲和素、荧光标识抗人免疫球蛋白抗体等。反应性能够通过对检测体添加充分量的抗TfR抗体(通常最终浓度为0.01～10μg/mL)来进行，通过与阴性对照抗体、阳性对照抗体的反应性进行比较来评价。

抗体

在本说明书中根据需要，依照习惯使用以下的简称(括号内)。

重链(H链)、轻链(L链)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、互补性决定区(CDR)、第一互补性决定区(CDR1)、第二互补性决定区(CDR2)、第三互补性决定区(CDR3)、重链的第一互补性决定区(VH CDR1)、重链的第二互补性决定区(VH CDR2)、重链的第三互补性决定区(VH CDR3)、轻链的第一互补性决定区(VL CDR1)、轻链的第二互补性决定区(VL CDR2)、轻链的第三互补性决定区(VL CDR3)。

本说明书中，“抗体”这一术语与免疫球蛋白意义相同，应被理解为与本技术领域中通常知晓的含意。具体来说，抗体这一术语并不被制作抗体的任意特定的方法所限定。例如，抗体这一术语包括但不限于重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。

本说明书中，术语“人抗体”是指可变区和恒定区的序列为人的序列的任意抗体。该术语具有人基因来源的序列，但也包括例如进行了被认为会导致免疫原性的降低、亲和性的增大、引起不希望的折叠的可能性的半胱氨酸的去除等而发生了变化的抗体。该术语还能够包括实施了在人细胞中并非特有的糖基化、通过在非人细胞中的重组而制作的抗体。这些抗体能够以各种形式制备。

本说明书中，“人源化抗体”这一术语是指非人来源的抗体，非人种的抗体序列中特征性的氨基酸残基被取代被认为是对应于人抗体的位置的残基。该“人源化”的工序被认为能够降低作为其结果得到的抗体在人中的免疫原性。应该被理解为使用在本技术领域在公知的技术，能够将非人来源的抗体人源化。例如，能够参照Winter等，Immunol.Today14：43～46(1993)。对象的抗体能够通过将CH1、CH2、CH3、铰链区和/或框架区取代为对应的人序列的重组DNA技术来工业化制造。例如，能够参照WO92/02190、以及美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,792号、第5,714,350号和第5,777,085号。本说明书中，“人源化抗体”这一术语在其含义的范围内也包括嵌合人抗体和CDR移植抗体。

在抗体的可变区中的框架区(FR)的序列只要对于所对应的抗原的结合特异性没有实质影响，就没有特别限定。优选使用人抗体的FR区，但也能够使用人以外的动物种(例如小鼠、大鼠)的FR区。

在抗体的一个实施方式中，在可变区之外还包含恒定区(例如IgG型抗体)。恒定区的序列没有特别限定。例如，能够使用公知的人抗体的恒定区。作为人抗体的重链恒定区(CH)，可以是属于人免疫球蛋白(以下，记为hIgG)中的任意种，优选为hIgG类，更优选属于hIgG组的hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4这样亚类中的任意种均可使用。另外，作为轻链恒定区(CL)，可以是属于hIg中的任意种，也能够使用κ类或者λ类的恒定区。另外，也能够使用人以外的动物种(例如小鼠、大鼠)的恒定区。

本说明书中，“突变体”、“突变抗体”是指亲抗体的可变区(CDR序列和/或FR序列)的氨基酸序列中的1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的情况。

在本发明中，“亲抗体”是指VH具有序列编号7所示的氨基酸序列、VL具有序列编号8所示的氨基酸序列的TfR436抗体。在氨基酸序列中，缺失、添加、取代和/或插入1个或数个(例如，1～8个、优选1～5个、更优选1～3个、特别优选1或2个)氨基酸。作为用于制备对于TfR具有结合活性的抗体的氨基酸序列的本领域技术人员公知的方法，已知有向蛋白质导入突变的方法。例如，只要是本领域技术人员，就能够使用位点特异的突变诱导法(Hashimoto－Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y,anDNAkagawa,M.(1995)Anoligodeoxyribonucleotide－directed dual amber method for site－directedmutagenesis.Gene 152,271－275，Zoller,MJ,and Smith,M.(1983)Oligonucleotide－directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.MethodsEnzymol.100,468－500，Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW,Kramer,B,Pflugfelder,M,andFritz,HJ(1984)The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide－directedmutation construction.Nucleic Acids Res.12,9441－9456，Kramer W,and Fritz HJ(1987)Oligonucleotide－directed construction of mutations via gapped duplexDNA Methods.Enzymol.154,350－367，Kunkel,TA(1985)Rapid and efficient site－specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U SA.82,488－492)等，向对于TfR具有结合活性的抗体的氨基酸序列中导入适当突变，由此能够制备与对于TfR具有结合活性的抗体具有同等功能的突变抗体。这样，也能够使用在抗体的可变区或恒定区中1或数个氨基酸发生了突变且对于TfR具有结合活性的抗体。

在本说明书中，“活性与亲抗体为同等”是指，对于人TfR的结合活性为同等。“同等”不是必须为相同程度的活性，既可以活性得到增强，另外，在具有活性的限度内也可以活性降低。作为活性降低的抗体，例如，可以列举与原本抗体相比具有30％以上的活性、优选具有50％以上的活性、更优选具有80％以上的活性、更加优选具有90％以上的活性、特别优选具有95％以上的活性的抗体。

作为结合活性，是指能够识别抗原。该抗原既可以是在细胞膜上表达的完整TfR，也可以是缩短形式、可溶化形式。另外，还可以是保持了立体结构的TfR，也可以是突变后的TfR。例如，作为探讨结合活性的手段，可以列举流式细胞仪(FACS)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、蛋白质印迹法、荧光痕量测量技术(FMAT)、表面等离子体共振(BIAcore)等。

抗体的Tf－TfR结合抑制活性能够依照后述的“实施例2(2)Tf－TfR结合抑制中TfR436抗体和其它公司抗体的比较”中记载的方法来测定。将TfR溶液分注到培养板(96－孔板等)后静置，经过固相化，进行封闭。之后，分注HRP标记的Tf溶液，进一步添加抗体，在室温进行反应。之后，清洗培养板，添加显色试剂(TMB等)进行反应，使用酶标仪测定吸光度。通过上述操作，能够评价该抗体的Tf－TfR结合抑制活性。

抗体的抑制铁向细胞内的摄入的活性能够依照后述的“实施例3：柠檬酸铁铵对于TfR436抗体的抑制细胞增殖效果的效果”所记载的方法进行测定。即，将细胞悬浊于培养用培养基，接种至培养板(96孔板等)。制作将抗体连续稀释至适当浓度的溶液，对上述细胞添加。进一步添加柠檬酸铁铵。将细胞培养规定的时间后，充分搅拌各孔，将细胞培养液转移至另外的板(例如，V底96－孔板等)上。将其中的一部分提供给FACS Calibur(BD)，测定事件数(event numbers)。将得到的事件数的4倍作为每孔的细胞数，将未添加抗体和柠檬酸铁铵的孔中的细胞数均值作为100％，算出各处理中的增殖率。在抗体浓度依存性地抑制细胞增殖且该增殖停止能够通过添加柠檬酸铁铵而得到恢复的情况下，可以证明该抗体抑制了铁向细胞内的摄入。

抗体的来源没有限定，可以是人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体等任意动物来源的抗体。另外，也可以是嵌合化抗体、人源化抗体等。本发明中的抗体的优选方式之一为人抗体。

抗体根据后述的产生抗体的细胞、宿主或者纯化方法的不同，在氨基酸序列、分子量、等电点或有无糖链和形态等方面不同。例如，在本发明中记载的氨基酸序列在翻译后接受修饰的情况也被包含在本发明中。而且，对于已知的翻译后修饰以外的部位的翻译后修饰也包含在本发明中。另外，在原核细胞、例如大肠菌表达抗体的情况下，在原本的抗体的氨基酸序列的N末端上会添加甲硫氨酸残基。在本发明中，也可以使用这样的抗体。对于已知的翻译后修饰以外的部位进行的翻译后修饰也包含在本发明中。

抗体的制作

(1)利用噬菌体展示文库的与抗原发生反应的scFv

抗体的获得能够依照本技术领域中公知的几种方法进行制备。例如，使用噬菌体展示技术，能够提供包含对于TfR具有亲和性的各种抗体的全部组成成分(repertory)的文库。之后，对这些文库进行筛选，能够鉴定并分离对于TfR的抗体。优选，噬菌体文库是使用由从人B细胞分离的mRNA制备的人VL和VHcDNA生成的scFv噬菌体展示文库。制备并进行筛选的方法在本技术领域中是已知的。从以人TfR作为抗原而筛选的显示反应性的噬菌体克隆体回收遗传物质。对所选择的噬菌体的基因进行解析，就能够确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的VH和VL的DNA序列。使用该scFv的序列，将scFv IgG化，能够获得人抗体。

(2)scFv的IgG化(人抗体的制作)

通过制作H链或L链的表达载体(vector)，在宿主细胞中使其表达，将分泌的上清液回收、纯化，从而得到人抗体。另外，也能够通过将VH和VL以同一载体进行表达(Tandem型)来得到人抗体。这些方法是公知的，能够参照WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、W093/19172、WO95/01438、WO95/15388、WO97/10354等进行。

具体来说，通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的其它DNA分子连结，能够取得完全长度重链基因。人重链恒定区基因的序列在本技术领域中是已知的(例如，Kabat,E.A.等，(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91－3242)，包含这些区域的DNA片段能够通过标准的PCR扩增得到。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD的恒定区，最优选为IgG1或IgG2的恒定区。IgG1恒定区序列可以是Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)或Gm(17)等已知在不同的个人之间产生的任意的各种等位基因(allele)或同种异型(allotype)。这些同种异型相当于IgG1恒定区中天然存在的氨基酸取代。

通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的其它DNA分子连结，能够得到完全长度L链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本技术领域公知的(例如，Kabat,E.A.等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91－3242)，包含这些区域的DNA片段能够通过标准的PCR扩增得到。轻链恒定区可以是κ或λ的恒定区。κ恒定区可以是Inv(1)、Inv(2)或Inv(3)等已知在不同的人之间产生的任意的各种等位基因。λ恒定区可以来自3个λ基因中的任一个。

通过将如上所述得到的编码H链或L链的DNA插入表达载体中，制作表达载体，使宿主细胞表达，将分泌的上清液回收、纯化，得到人抗体。表达载体可以列举质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、花椰菜花叶病毒和烟草花叶病毒等的植物病毒、粘粒、YAC、EBV来源附加体(episomes)等。表达载体和表达调节序列以与所使用的表达用宿主细胞相适合的方式选择。抗体轻链基因和抗体重链基因能够插入不同的载体中，另外也能够将两者的基因插入相同表达载体中。将抗体基因通过标准的方法(例如，将抗体基因片段上互补的限制部位与载体连结或在不存在限制部位时使用平滑末端连结)插入表达载体中。

合适的载体是容易插入并表达上述所述的任意的VH或VL序列的、具有通过工业方式制作的适当的限制部位且能够编码功能完全的人CH或CL免疫球蛋白序列的载体。这样的载体中，通常，在被插入的J区域中的剪接提供部位与在人C区域之前的剪接接受部位之间、以及在存在于人CH外显子内的剪接区域也会发生剪接。多腺嘌呤基化和转录结束在位于编码区域的下游的天然的染色体部位发生。重组表达载体还能够编码宿主细胞来源的促进抗体链的分泌的信号肽。抗体链基因能够以与信号肽在框内(inframe)与免疫球蛋白链的氨基末端连结的方式克隆到载体中。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽，或者也可以是不同种的信号肽(即非免疫球蛋白蛋白质来源的信号肽)。

抗体的表达载体中，除抗体基因和控制序列外，还可以具有控制载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)或选择标记基因等的其它序列。选择标记基因能够促进导入有载体的宿主细胞的选择。例如，通常，标记基因对导入有载体的素质细胞赋予对G418、潮霉素和氨甲蝶呤等药物的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr－宿主细胞中与氨甲蝶呤选择/扩增同时使用)、新霉素磷酸转移酶基因(用于G418选择)和谷氨酸合酶基因。

利用通过上述方法制得的抗体基因表达载体对宿主细胞进行转化。作为宿主细胞，可以是细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等能够产生抗体的任何细胞，优选动物细胞。作为动物细胞，可以列举中国仓鼠卵巣细胞CHO/dhfr(－)细胞CHO/DG44细胞、猴来源细胞COS细胞(A.Wright&S.L.Morrison,J.Immunol.160,3393－3402(1998))、SP2/O细胞(小鼠骨髓瘤)(K.Motmans et al.,Eur.J.Cancer Prev.5,512－5199(1996),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.50,1495－1502(1990))等。另外，转化优选使用Lipofectin转化法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6007(1989),P.L.Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413(1987)、电穿孔法、磷酸钙法(F.L.Graham&A.J.van der Eb,Virology 52,456－467(1973))、DEAE－Dextran法等。

将转化体培养后，从转化体的细胞内或培养液分离人抗体。抗体的分离、纯化中，能够适当组合利用离心分离、硫酸铵分级分离、盐析、超滤、亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法等的方法。

抗体片段

能够基于抗体或基于编码抗体的基因的序列信息制作抗体片段。作为抗体片段可以列举Fab、Fab′、F(ab′)₂、scFv、dsFv抗体。

Fab是通过将IgG在半胱氨酸的存在下利用木瓜蛋白酶消化得到的，是由L链和H链可变区、以及CH1区域和铰链部的一部分所构成的H链片段构成的分子量大约5万的片段。本发明中，能够通过将上述抗体利用木瓜蛋白酶进行消化来得到。另外，也能够通过将编码上述抗体的H链的一部分和L链的DNA重组入适当的载体中，由使用该载体转化得到的转化体来制备Fab。

Fab'是将后述的F(ab′)₂的H链间的二硫键切断而得到的分子量为大约5万的片段。在本发明中，将上述抗体利用胃蛋白酶消化，使用还原剂将二硫键切断来得到。另外，与Fab同样，也能够使用编码Fab'的DNA通过基因工程的方式制备。

F(ab′)₂是通过将IgG利用胃蛋白酶消化而得到的，由L链与H链可变区、以及CH1区域和铰链部的一部分所构成的H链片段构成的片段(Fab')通过二硫键结合的分子量为大约10万的片段。本发明中，通过将上述抗体利用胃蛋白酶进行消化来得到。另外，与Fab同样，也能够使用编码F(ab′)₂的DNA通过基因工程的方式制备。

scFv是将由H链可变区和L链可变区构成的Fv利用适当的连接肽将一方的链的C末端与另一方的N末端连结并单链化的抗体片段。作为连接肽，例如能够使用柔软性高的(GGGGS)₃等。例如，能够使用编码上述抗体的H链可变区和L链可变区的DNA与编码连接肽的DNA构建编码scFv抗体的DNA，将其重组入适当的载体，由使用该载体转化得到的转化体来制备scFv。

dsFv是在H链可变区和L链可变区的适当的位置导入Cys残基，并且将H链可变区与L链可变区通过二硫键稳定化的Fv片段。各链中的Cys残基的导入位置能够基于利用分子模拟所预测的立体结构来确定。在本发明中，例如，能够从上述抗体的H链可变区和L链可变区的氨基酸序列预测立体结构，基于该预测，构建分别编码导入了突变的H链可变区和L链可变区的DNA，将其重组入适当的载体，由使用该载体转化得到的转化体来制备dsFv。

另外，也能够使用适当的接头将scFv抗体、dcFv抗体等连结，或者使链霉亲和素融合等来将抗体片段多聚体化。

医药组合物和制剂

含有本发明的抑制剂的医药组合物和制剂也被包含于本发明的范围内。

本发明的抑制剂能够用于伴有铁向细胞内的过剩摄入的疾病或症状的处置。

作为伴随向细胞内过剩地摄入铁的疾病或症状，能够列举铁过剩症等。

医药组合物和制剂优选除抗体外还含有生理学上可接受的稀释剂或载体(carrier)，也可以是与其它试剂的混合物。适当的载体包括生理食盐水、磷酸缓冲生理食盐水、磷酸缓冲生理食盐水葡萄糖液和缓冲生理食盐水，但不限于这些。或者，抗体也可以通过冻结干燥(冻干)，在需要时添加如上所述的缓冲水溶液而重构后使用。作为给药方式，可以列举锭剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等口服给药、或注射剂(皮下注射、静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射等)、经皮、经粘膜、经鼻、经肺、栓剂等非口服给药。本发明的医药组合物的制剂既可以单独给药，也可以与其它药剂并用。

本发明的抑制剂的给药量根据症状、年龄、体重等而不同，通常，在口服给药中，作为抗体的量，对于成人，1天为大约0.01mg～1000mg，能够将其1次给药，或分成多次给药。另外，在非口服给药中，能够将1次大约0.01mg～1000mg的量通过皮下注射、肌肉注射或静脉注射来给药。

通过以下的实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不受实施例限定。

实施例

在以下的实施例中，使用了在国际公开WO2014/073641号公报的第0090和0091段中记载的TfR436抗体。

将TfR436抗体的CDR序列示于下方。

VH CDR1：SYGMH(序列编号1)

VH CDR2：VISYDGSNKYYADSVKG(序列编号2)

VH CDR3：DSNFWSGYYSPVDV(序列编号3)

VL CDR1：TRSSGSIASNSVQ(序列编号4)

VL CDR2：YEDTQRPS(序列编号5)

VL CDR3：QSYDSAYHWV(序列编号6)

将TfR436抗体的VH序列和VL序列示于下方。

TfR436 VH(序列编号7)

DVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFPFKSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRGEDTAVYYCARDSNFWSGYYSPVDVWGQGTTVTVSS

TfR436 VL(序列编号8)

NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNSVQWYQQRPGSAPITVIYEDTQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLQTEDEADYYCQSYDSAYHWVFGGGTKLAVL

实施例1：TfR436抗体的结合部位的鉴定

TfR436抗体与小鼠TfR不发生交叉免疫反应，但与仓鼠TfR显示了交叉免疫反应性。进行了TfR中的Transferrin(转铁蛋白，TF)结合部位(第569～760个氨基酸)的氨基酸序列的比对。在人TfR序列中，选取了与仓鼠相同而与小鼠不同的氨基酸。将所选取的氨基酸如图1所示那样进行点突变，制作了可溶性TfR突变片段。

(1)可溶性野生型TfR(sTfR)和TfR突变片段(MF1～MF7)的制作

合成编码人TfR细胞外区域(第89～760个的氨基酸)、或者图1所示的各个TfR突变片段(MF1～MF7)、和AAARGGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH(序列编号10)的碱基序列。在表达载体pCAGGS(非专利文献2：Niwa et al.1991)中组入新霉素耐性基因和DHFR基因的载体的多克隆位点分别插入合成的基因，制作了pCAGGS－Neo－DHFR－sTFR－myc－his表达质粒。使用Expifectamine(Invitrogen)，对Expi293细胞(Invitrogen)转化上述质粒，在37℃、8％CO₂以135rpm培养5天。此后通过离心回收培养上清液，将AKTA prime(GE Healthcare)与HisTrapHP(GE Healthcare)柱连接，使用20mM咪唑/DPBS作为结合缓冲液，使用500mM咪唑/DPBS作为洗脱缓冲液，纯化sTfR或MF1～MF7。洗脱的蛋白质使用Zeba离心柱(Zeba spincolumn，Thermo science)在30mM HEPES、5％海藻糖、pH 7.2中缓冲液交换。

(2)TfR436抗体的结合部位的鉴定

将上述纯化的sTfR或MF1～MF7用PBST(含Tween20的磷酸盐缓冲盐水，TaKaRa)稀释，并从600ng/mL以3倍稀释制备为7阶的稀释液。然后，将稀释液以100μL/孔的量分注到Ni-NTA HisSorb Strips 96－孔板(QIAGEN)中，置于振荡器上，在室温下反应。1小时后，用PBST缓冲液清洗5次，以100μL/孔的量分注TfR436抗体(1ug/mL)，置于振荡器上，在室温下反应1小时。然后，用PBST缓冲液清洗5次，以100μL/孔的量分注50,000倍稀释后的二次抗体F(ab')₂片段抗人IgG Fcγ(Jackson Immuno Research)，在室温下反应1小时。用PBST缓冲液清洗5次后，以100μL/孔的量分注TMB可溶性试剂(高灵敏度)(Scy Tek)，在室温下在暗处反应3分钟，然后将TMB终止缓冲液(Scy Tek)以100μL/孔的量添加到孔中，用振荡器振荡1分钟，用酶标仪测定450n(对照620nm)的吸光度。

结果如图2所示，TfR436抗体可见降低了与TfR突变片段MF5的反应性，未见到与其它的突变片段的反应性的降低。也就是说，将TfR的第629个、第630个、第633个氨基酸取代为其它的氨基酸时，TfR436抗体无法识别TfR。这暗示第629个～第633个氨基酸是TfR436抗体的识别位点。

实施例2：Tf－TfR结合抑制中的TfR436抗体和比较用抗体的比较

(1)比较用抗体A24在制作

在专利文献US2008/0193453中记载了对于人TfR的A24抗体。为了比较TfR436抗体与该抗体，获得了保藏的杂交瘤，生产了抗体。具体来说，将杂交瘤在RPMI1640(GIBCO)、FBS10％的培养基中以使细胞浓度成为1～2×10⁵/mL的方式接种，在37℃的5％CO₂恒温箱中培养。扩大培养后，通过离心回收细胞，利用PBS清洗2次后，在无血清培养基cosmedium005(Cosmo bio)、0.5％Nutridoma－CS(Roche)中扩大培养至550mL。细胞变成融合后，在5天后通过离心回收了培养上清液。

将回收的上清液适用于Protein A载体(Ab－Capcher ExTra：Protenova)，将与Protein A结合的抗体利用0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH 2.7)洗脱，迅速用1M Tris盐酸缓冲液(pH 8.5)进行中和。之后使用Ultracel超滤盘(Merck Millipore)在PBS中进行缓冲液交换。

(2)Tf－TfR结合抑制中的TfR436抗体和其它公司抗体的比较

将实施例1中记载的sTfR在PBST中调整为5.0μg/mL，在MaxiSorp 96－孔板(Nunc)中以100μL/孔的量分注稀释液，在4℃静置一晩进行固相化。次日弃掉固相液，以200μL/孔的量加入100％Block Ace(DS Pharma Biomedical)，在室温静置进行封闭。1小时后利用PBST缓冲液清洗5次后，以50μL/孔的量分注HRP标记的Tf(2ug/mL)，之后进一步以50μL/孔的量添加TfR436抗体、A24抗体(从10μg/mL稀释2倍的系列)或holo－Tf((Sigma)从300μg/mL稀释2倍的系列)。在室温反应1小时后，利用PBST缓冲液清洗5次，以100μL/孔的量分注TMB可溶性试剂(高灵敏度)，在室温下在暗处进行反应。25分钟后，以100μL/孔的量添加TMB终止缓冲液，用振荡器震动1分钟，用酶标仪测定450nm(对照620nm)的吸光度。

结果如图3所示，TfR436抗体以极低的用量(100ng/mL)完全地抑制了Tf－TfR的结合。另一方面，A24抗体即使以10μg/mL的用量也未能完全抑制Tf－TfR的结合，仅仅抑制了50％的Tf－TfR的结合。暗示在Tf－TfR的结合抑制中TfR436抗体更为优异。

实施例3：柠檬酸铁铵对于TfR436抗体的抑制细胞增殖效果的效果

如上述实验结果所示，TfR436抗体识别TfR的第629个～第633个氨基酸，完全地抑制Tf－TfR的结合。通过该抑制，完全抑制铁向细胞内的摄入。也就是说，TfR436抗体是向细胞内摄入铁的抑制剂。铁是在细胞的生存、增殖中不可欠缺的物质，细胞内铁变得缺乏时，会发生细胞增殖停止、细胞死亡。关于TfR436抗体是否抑制细胞的增殖、以及该增殖抑制是否是由于缺铁的原因，使用了使用作为非铁传递蛋白结合铁摄取(non-trasferrin boundiron uptake)的铁供体被已知的柠檬酸铁铵进行了探讨。具体来说，将K562细胞以细胞数成为5000个/ml的方式悬浊于培养用培养基(RPMI1640，10％FBS，1％P/S)中，在96孔板中以100μl/孔的量接种于各孔。将TfR436抗体从100μg/ml进行5倍连续稀释制作溶液，向K562细胞中各添加50μL(最终浓度：25～0.3μg/ml)。并且，添加120μM的柠檬酸铁铵(和光纯药)50μL(最终浓度：30μM)。在37℃的5％CO₂恒温箱内培养96小时后，充分搅拌各孔，将150μl的细胞培养液转移至V底96－孔板(Corning)，将其中的25μl提供给FACS Calibur(BD)，测定事件数。将得到的事件数的4倍作为每孔的细胞数，将未添加抗体和柠檬酸铁铵的孔中的细胞数均值作为100％，算出各个处理中的增殖率。

结果如图4所示，TfR436抗体是浓度依存性地抑制了K562的增殖。该停止增殖通过添加柠檬酸铁铵而恢复。根据该结果，暗示TfR436抗体抑制了铁向细胞内的摄入。

实施例4：添加TfR436抗体导致的细胞株内铁量的变化

使用K562细胞株，确认了添加TfR436抗体导致的细胞内铁量的变化。具体来说，对于将K562细胞以浓度成为0.5×10⁵cells/mL的方式接种的T150烧瓶(IMDM+10％－FBS；60mL)，添加TfR436抗体并使最终浓度成为5μg/mL。作为比较对照，准备了TfR006抗体(记载于日本专利5980202号)、A24抗体、人单克隆IgG1抗体(Nega mAb)和DPBS缓冲液(未处理)，与TfR436抗体同样地添加。在37℃、5％－CO₂恒温箱中培养96小时后，对各样品中的细胞数进行计数，回收1.0×10⁷个细胞。利用DPBS对细胞清洗3次后，向细胞团中添加、混合250μL的LysisM试剂(Roche；cat.#04 719 956 001)和2.5μL的6N－HCl，在室温静置1小时。离心后，将回收的上清液用于铁的定量。铁的定量依照Metallo Assay铁测定LS(Ferrozine法)(Metallogenics；cat.#FE31M)实施。将结果示于图5。

结果如图5所示，未处理、添加了Nega mAb、TfR006、TfR436和A24的K562细胞内的铁量分别为1.15、1.20、0.27、0.25和0.81nmol。由此，暗示了通过添加抗TfR抗体，抑制向细胞内摄入转铁蛋白铁，使铁量减少。另外，可知，与A24抗体相比，TfR006抗体与TfR436抗体的抑制铁摄入效果更高。而且，该实验结果显示TfR436抗体与TfR006抗体相比，抑制铁摄入效果更高。

序列表

<110> 株式会社英仙蛋白质科学

<120> 向细胞内摄入铁的抑制剂

<130> 191983A

<160> 10

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人

400> 3

Asp Ser Asn Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Ser Pro Val Asp Val

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人

<400> 4

Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Ser Val Gln

1 5 10

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人

<400> 5

Tyr Glu Asp Thr Gln Arg Pro Ser

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人

<400> 6

Gln Ser Tyr Asp Ser Ala Tyr His Trp Val

1 5 10

<210> 7

<211> 123

<212> PRT

<213> 人

<400> 7

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Lys Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Asn Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Ser Pro Val Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 人

<400> 8

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn

20 25 30

Ser Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Ile Thr Val

35 40 45

Ile Tyr Glu Asp Thr Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly

65 70 75 80

Leu Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser

85 90 95

Ala Tyr His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ala Val Leu

100 105 110

<210> 9

<211> 760

<212> PRT

<213> 人

<400> 9

Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu

1 5 10 15

Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp

20 25 30

Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala

35 40 45

Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly

50 55 60

Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly

65 70 75 80

Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr

85 90 95

Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro

100 105 110

Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys

115 120 125

Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile

130 135 140

Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln

145 150 155 160

Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe

165 170 175

Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val

180 185 190

Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg

195 200 205

Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys

210 215 220

Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys

225 230 235 240

Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile

245 250 255

Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu

260 265 270

Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe

275 280 285

Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly

290 295 300

Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln

305 310 315 320

Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr

325 330 335

Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp

340 345 350

Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser

355 360 365

Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile

370 375 380

Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp

385 390 395 400

His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala

405 410 415

Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met

420 425 430

Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile

435 440 445

Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr

450 455 460

Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr

465 470 475 480

Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val

485 490 495

Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn

500 505 510

Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp

515 520 525

Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe

530 535 540

Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp

545 550 555 560

Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu

565 570 575

Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu

580 585 590

Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn

595 600 605

Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp

610 615 620

Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln

625 630 635 640

Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu

645 650 655

Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys

660 665 670

Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro

675 680 685

Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser

690 695 700

Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys

705 710 715 720

Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala

725 730 735

Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp

740 745 750

Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe

755 760

<210> 10

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组标签

<400> 10

Ala Ala Ala Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp

1 5 10 15

Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His

20 25

25

Claims (13)

1.一种向细胞内摄入铁的抑制剂，其特征在于：

含有识别人转铁蛋白受体的第629个～第633个氨基酸的抗体。

2.如权利要求1所述的抑制剂，其特征在于：

通过抑制人转铁蛋白与人转铁蛋白受体的结合，来抑制铁向细胞内的摄入。

3.如权利要求1或2所述的抑制剂，其特征在于：

所述抗体为重链第一互补性决定区(VH CDR1)、重链第二互补性决定区(VH CDR2)、重链第三互补性决定区(VH CDR3)分别为序列编号1、2、3并且轻链第一互补性决定区(VLCDR1)、轻链第二互补性决定区(VL CDR2)、轻链第三互补性决定区(VL CDR3)分别为序列编号4、5、6的抗体。

4.如权利要求1～3中任一项所述的抑制剂，其特征在于：

所述抗体为重链具有序列编号7、轻链具有序列编号8的抗体。

5.如权利要求1～4中任一项所述的抑制剂，其特征在于：

抗体为人抗体或人源化抗体。

6.如权利要求1～5中任一项所述的抑制剂，其特征在于：

抗体为选自Fab、Fab′、F(ab′)₂、单链抗体(scFv)、二聚体化V区域(Diabody)、二硫化物稳定化V区域(dsFv)和含有CDR的肽中的抗体片段。

7.如权利要求1～6中任一项所述的抑制剂，其特征在于：

用于伴有铁向细胞内的过剩摄入的疾病或症状的处置。

8.一种人转铁蛋白与人转铁蛋白受体的结合抑制剂，其特征在于：

含有识别人转铁蛋白受体的第629个～第633个氨基酸的抗体。

9.如权利要求8所述的结合抑制剂，其特征在于：

所述抗体为重链第一互补性决定区(VH CDR1)、重链第二互补性决定区(VH CDR2)、重链第三互补性决定区(VH CDR3)分别为序列编号1、2、3并且轻链第一互补性决定区(VLCDR1)、轻链第二互补性决定区(VL CDR2)、轻链第三互补性决定区(VL CDR3)分别为序列编号4、5、6的抗体。

10.如权利要求8或9所述的结合抑制剂，其特征在于：

所述抗体为重链具有序列编号7、轻链具有序列编号8的抗体。

11.如权利要求8～10中任一项所述的结合抑制剂，其特征在于：

抗体为人抗体或人源化抗体。

12.如权利要求8～11中任一项所述的结合抑制剂，其特征在于：

抗体为选自Fab、Fab′、F(ab′)₂、单链抗体(scFv)、二聚体化V区域(Diabody)、二硫化物稳定化V区域(dsFv)和含有CDR的肽中的抗体片段。

13.如权利要求8～12中任一项所述的结合抑制剂，其特征在于：

用于伴有铁向细胞内的过剩摄入的疾病或症状的处置。

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