KR20210093974A

KR20210093974A - 세포내 철 흡수 억제제

Info

Publication number: KR20210093974A
Application number: KR1020217018673A
Authority: KR
Inventors: 장 릴린; 노무라 후미코; 카스미 게이코; 코다카 로미; 오히라 유타
Original assignee: 가부시키가이샤 페르세우스 프로테오믹스
Priority date: 2018-11-20
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2021-07-28
Also published as: AU2019384781A1; US20220332838A1; WO2020105621A1; BR112021009768A2; CN113164594A; SG11202105163UA; CA3120548A1; EP3884959A4; JPWO2020105621A1; JP7410051B2; EP3884959A1; ZA202103554B; MX2021005913A

Abstract

본 발명의 과제는 TfR을 표적으로 하는 세포 내 철 흡수 억제제 및 인간 Tf와 인간 TfR의 결합 억제제를 제공하는 것이다. 본 발명에 따르면, 인간 트랜스페린 수용체의 제629번 내지 제633번 아미노산을 인식하는 항체를 포함하는 세포 내 철 흡수 억제제가 제공된다.

Description

세포내 철 흡수 억제제

본 발명은 세포 내 철 흡수 억제제, 및 인간 트랜스페린과 인간 트랜스페린 수용체의 결합 억제제에 관한 것이다.

트랜스페린 수용체(transferrin receptor, TfR)는 트랜스페린(transferrin, Tf)과 결합한 철을 세포 내로 받아들이기 위한 세포막 구조로서, 최초 망상 적혈구 (reticulocyte) 상에 있는 것으로 동정되었다(비특허문헌 1). TfR은 태반의 영양막 세포(trophoblast cell), 활성화된 림프구 및 종양 세포 등에서 발현하는 것으로 알려져 있다.

특허문헌 1에는 인간 항체 라이브러리 파지 디스플레이에 의해 암세포에 존재하는 TfR과 반응하는 파지 항체(scFv 항체)를 수득하고, 이들 scFv 항체를 IgG로 전환하여 완전한 인간 IgG 항체를 제조하는 것이 기재되어 있다. 또한, 특허문헌 1에는 수득된 완전한 인간 항 TfR 항체의 가변영역(variable region) CDR에 있어서 적어도 하나의 아미노산을 변경하여 임상적으로 응용하기에 적합한 항 TfR 항체를 제조하는 것이 기재되어 있다.

국제공개 WO 2014/073641호 공보

비특허문헌 1: J Clin Invest 1963; 42, 314-326 비특허문헌 2: Gene. 1991 Dec 15; 108(2): 193-9.

본 발명은 TfR을 표적으로 하는 세포 내 철 흡수 억제제, 및 인간 Tf와 인간 TfR의 결합 억제제를 제공하는 것을 해결하려는 과제로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 검토한 결과, 인간 TfR에 있어서 소정 위치에 있는 아미노산 서열을 인식하는 항체가 인간 Tf와 인간 TfR의 결합을 저해할 수 있고, 나아가 세포 내 철의 흡수를 저해할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명에 따르면 다음과 같은 발명이 제공된다.

(1) 인간 트랜스페린 수용체의 제629번 내지 제633번 아미노산을 인식하는 항체를 포함하는 세포내 철 흡수 억제제.

(2) 인간 트랜스페린과 인간 트랜스페린 수용체와의 결합을 저해함으로써 세포 내 철의 흡수를 저해하는, 상기 항목 (1)에 기재된 억제제.

(3) 항체는 중쇄 제1상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3상보성 결정영역(VH CDR3)이 각각 서열번호 1, 2, 3이고, 및 경쇄 제1상보성 결정영역(VL CDR1), 경쇄 제2상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3상보성 결정영역(VL CDR3)이 각각 서열번호 4, 5, 6인 항체인, 상기 항목 (1) 또는 항목 (2)에 기재된 억제제.

(4) 항체는 중쇄가 서열번호 7을 가지고, 경쇄가 서열번호 8을 가지는 항체인, 상기 항목 (1) 내지 항목 (3)의 어느 하나에 기재된 억제제.

(5) 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체인, 상기 항목 (1) 내지 항목 (4)의 어느 하나에 기재된 억제제.

(6) 항체는 Fab, Fab', F(ab')₂, 일본쇄(single-chain) 항체(scFv), 이량체화(dimerized) V 영역(Diabody), 이황화 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체 단편인, 상기 항목 (1) 내지 항목 (5)의 어느 하나에 기재된 억제제.

(7) 세포 내 철의 과잉 흡수를 수반하는 질환 또는 증상의 처치를 위해 사용되는, 상기 항목 (1) 내지 항목 (6)의 어느 하나에 기재된 억제제.

(8) 인간 트랜스페린 수용체의 제629번 내지 제633번 아미노산을 인식하는 항체를 포함하는 인간 트랜스페린과 인간 트랜스페린 수용체와의 결합 억제제.

(9) 항체는 중쇄 제1상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3상보성 결정영역(VH CDR3)이 각각 서열번호 1, 2, 3이고, 및 경쇄 제1상보성 결정영역(VL CDR1), 경쇄 제2상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3상보성 결정영역(VL CDR)이 각각 서열번호 4, 5, 6인, 상기 항목 (8)에 기재된 억제제.

(10) 항체는 중쇄가 서열번호 7을 가지고, 경쇄가 서열번호 8을 가지는 항체인, 상기 항목 (9) 또는 항목(9)에 기재된 억제제.

(11) 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체인, 상기 항목 (8) 내지 (10)의 어느 하나에 기재된 억제제.

(12) 항체는 Fab, Fab', F(ab')₂, 일본쇄(single-chain) 항체(scFv), 이량체화(dimerized) V 영역(Diabody), 이황화 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체 단편인, 상기 항목 (8) 내지 (11)의 어느 하나에 기재된 억제제.

(13) 세포 내 철의 과잉 흡수를 수반하는 질환 또는 증상의 처치를 위해 사용되는, 상기 항목 (8) 내지 항목(12)의 어느 하나에 기재된 억제제.

(A) 인간 트랜스페린 수용체의 제629번 내지 제633번 아미노산을 인식하는 항체를 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 철의 흡수를 저해하는 방법이 제공된다.

(B) 인간 트랜스페린 수용체의 제629번 내지 제633번 아미노산을 인식하는 항체를 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 트랜스페린과 인간 트랜스페린 수용체와의 결합을 저해하는 방법이 제공된다.

(C) 인간 트랜스페린 수용체의 제629번 내지 제633번 아미노산을 인식하는 항체를 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 세포내 철의 과잉 흡수를 수반하는 질환 또는 증상을 처치하는 방법이 제공된다.

(D) 세포내 철의 흡수를 저해하는데 사용하기 위한, 인간 트랜스페린 수용체의 제629번 내지 제633번 아미노산을 인식하는 항체가 제공된다.

(E) 인간 트랜스페린과 인간 트랜스페린 수용체와의 결합을 저해하는데 사용하기 위한, 인간 트랜스페린 수용체의 제629번 내지 제633번 아미노산을 인식하는 항체가 제공된다.

(F) 세포내 철의 과잉 흡수를 수반하는 질환 또는 증상의 처치에 사용하기 위한, 인간 트랜스페린 수용체의 제629번 내지 제633번 아미노산을 인식하는 항체가 제공된다.

(G) 세포내에의 철의 흡수 억제제의 제조를 위한, 인간 트랜스페린 수용체의 제629번 내지 제633번의 아미노산을 인식하는 항체의 용도가 제공된다.

(H) 인간 트랜스페린과 인간 트랜스페린 수용체와의 결합 억제제 제조를 위한, 인간 트랜스페린 수용체의 제629번 내지 제633번 아미노산을 인식하는 항체의 용도가 제공된다.

(I) 세포내 철의 과잉 흡수를 수반하는 질환 또는 증상의 처치제 제조를 위한, 인간 트랜스페린 수용체의 제629번 내지 제633번 아미노산을 인식하는 항체의 용도가 제공된다.

본 발명에 의하면, 세포 내 철의 흡수 억제제 및 인간 Tf와 인간 TfR의 결합 억제제가 제공된다. 본 발명의 억제제는 세포 내 철의 과잉 흡수를 수반하는 질환 또는 증상 처치에 유용하다. 본 발명의 억제제는 적혈구 등의 철 요구성이 높은 세포의 증식억제를 위해 사용할 수 있다.

도 1은 각각의 TfR 변이 단편(mutant fragment)의 점변이(point mutation)를 행하는 부위를 나타낸다.
도 2는 TfR 436과 가용성 야생형(wild type) TfR(sTfR) 및 TfR 변이 단편의 반응성을 나타낸다.
도 3은 TfR 436의 Tf-TfR 결합저해 활성을 나타낸다.
도 4는 TfR 436 항체의 세포증식 억제효과에 대한 구연산 철암모늄의 효과를 나타낸다.
도 5는 TfR 436 항체의 첨가에 의한 K562 세포주 내의 철의 양 변화를 나타낸다.

이하에서는, 본 발명에 대해 구체적으로 설명한다.

정의 및 일반기술

본 명세서에서 특별히 정의하지 않는 한, 본 발명에 대하여 사용된 과학기술용어는 당업자에게 통상 이해되고 있는 의미를 포함하는 것으로 한다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직배양, 분자생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 단백질 및 핵산화학, 및 혼성화에 대해 사용한 명명법 및 그 기술은 당해 기술분야에서 알려진 것으로 통상 사용된다.

본 발명의 제반 방법 및 기술은 일반적으로, 특정하지 않는 한, 당해 기술분야에서 주지되는 종래의 방법에 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐서 인용되어 설명한 여러가지 일반적 참조문헌과 보다 구체적인 참조문헌에 기재된대로 실행된다.

TfR

인간 트랜스페린 수용체(TfR)는 인간 3번 염색체에 암호화되는 760개의 아미노산으로 구성되는 일회막 관통형 단백질(single-pass transmembrane protein)이다(서열번호 9). 이 단백질은 CD71 항원으로도 알려져 세포의 철 흡수에 관여하고, 세포의 증식에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서의 TfR은 구조가 특별히 한정되지 않고, 단량체, 다량체, 세포막에서 발현된 천연형태(intact form), 세포 외 영역으로 구성된 가용화 형태(soluble form), 띠 형태(truncted form), 또한 유전자 변이나 결손 등의 변이형태(mutation form), 인산화 등의 번역 후 수식형태 등을 포함하여 모두 인간 TfR을 의미한다.

반응 및 반응성

본 명세서에서 '반응하다(react)'와 '반응성(reactivity)'은 특별히 한정하지 않는 한 동일한 것을 의미한다. 즉, 이들 용어는 항체가 항원을 인식하는 것을 의미한다. 이 항원은 세포막에서 발현되는 천연형 TfR이라도 좋고, 띠형이나 가용형이라도 좋다. 또한, 입체구조를 유지한 TfR도 좋고, 변성된 TfR도 무방하다. 반응성을 검토하는 수단으로는 플로우사이토미터(FACS), 효소결합면역흡착검정법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western-blot), 형광미량측정기술(FMAT), 표면 플라즈몬 공명(BIAcore), 면역염색, 면역침강 등이 있다.

플로우사이토미터에 사용하는 항체는 FITC 등의 형광물질, 비오틴 등에 의하여 표지된 항체라도, 표지되지 아니한 항체라도 좋다. 사용한 항체의 표지 유무 및 그 종류에 따라, 형광표지 아비딘, 형광표지 항인간 면역글로블린 항체 등을 사용한다. 반응성은 충분한 량의 항TfR 항체(통상 최종농도가 0.01~10μg/mL)를 검체에 가하고, 음성대조 항체, 양성대조 항체의 반응성과 비교함으로써 평가할 수 있다.

항체

본 명세서에서는 필요에 따라, 이하의 약호(괄호 안)를 사용한다:

중쇄(H쇄), 경쇄(L쇄), 중쇄가변영역(VH), 경쇄가변영역(VL), 상보성 결정영역(CDR), 제1상보성 결정영역(CDR1), 제2상보성 결정영역(CDR2), 제3상보성 결정영역(CDR3), 중쇄의 제1상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄의 제2상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄의 제3상보성 결정영역(VH CDR3), 경쇄의 제1상보성 결정영역(VL CDR1), 중쇄의 제2상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄의 제3상보성 결정영역(VL CDR3).

본 명세서에서 '항체(antibody)'라는 용어는 면역글로블린과 같은 뜻으로, 본 기술분야에서 통상 알려진 대로 이해되어야 한다. 구체적으로, 항체라는 용어는 항체를 만드는 임의의 특정방법에 의하여 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 항체라는 용어에는 그것에만 국한되지 않느나, 재조합 항체, 모노클로널 항체 및 폴리클로널 항체가 있다.

본 명세서에서 '인간 항체(human antibody)'라는 용어는 가변영역 및 불변영역의 서열이 사람 서열인 임의의 항체를 의미한다. 그 용어는 인간 유전자에서 유래하는 서열을 가지는데, 예를 들어 생각할 수 있는 면역원성의 저하, 친화성의 증대, 바람직하지 않은 접힘(folding)을 일으킬 가능성이 있는 시스테인을 제거하도록 변화시키는 항체를 포함한다. 그 용어는 인간 세포에 특유하지 않은 글리코실화를 시행할 수 있는 비인간 세포 내에서 재조합으로 만들어진 이러한 항체를 포함한다. 이들 항체는 여러 형태로 제조할 수 있다.

본 명세서에서 '인간화 항체(humanized antibody)'라는 용어는 비인간 유래 항체를 의미하며, 비인간 항체(non-human antibody) 서열에서 특징적인 아미노산 잔기가 인간 항체가 대응하는 위치로 인정되는 잔기로 치환된다. 이러한 '인간화(humanization)' 공정은 그 결과 얻어진 항체의 인체 면역원성을 저하시킬 것으로 여겨진다. 본 기술분야에서 알려진 기술을 사용하여 비인간 유래의 항체를 인간화할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 윈터(Winter) 등의 Immunol. Today 14:43~46(1993)을 참조하기 바란다. 대상으로 하는 항체는 CH1, CH2, CH3, 힌지 도메인 및/또는 프레임워크 도메인을 대응하는 사람 서열으로 치환하는 치환 DNA 기술에 의해 공학적으로 작제할 수 있다. 예를 들어, WO92/02190 및 미국특허 제5,530,101호, 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,792호, 제5,714,350호 및 제5,777,085호를 참조할 수 있다. 본 명세서에서 '인간화 항체(humanized antibody)'라는 용어는 그 의미의 범위 내에서 키메라 인간 항체 및 CDR 이식 항체를 포함한다.

항체의 가변영역에서 프레임워크 영역(FR)의 서열은 대응하는 항원에 대한 특이적 결합성에 실질적인 영향이 없는 한 특별히 한정되지 않는다. 인간 항체의 FR영역을 이용하는 것이 바람직하지만, 사람 이외의 동물종(예를 들어, 마우스나 랫트)의 FR영역을 이용할 수도 있다.

항체의 한 형태에 따르면, 가변영역(variable region)과 더불어 불변영역(constant region)을 포함한다(예를 들어, IgG형 항체). 불변영역의 서열은 특별히 한정되지 않는데, 예를 들면 공지의 인간항체의 불변영역을 사용할 수 있다. 인간 항체의 중쇄 불변영역(CH)으로는 인간 면역글로블린(이하에서는, 'hIgG'로 표기함)에 속하면 어떠한 것이든 좋으나 hIgG 등급이 적합하며, 나아가 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4와 같은 서브 클래스 모두 이용할 수 있다. 또한, 경쇄 불변영역(CL)은 hIg에 속하면 어떠한 것이든 가능하며 κ 클래스 또는 λ 클래스를 사용할 수 있다. 또한, 인간 이외의 동물종(예를 들어, 마우스나 레트)의 불변영역을 이용할 수도 있다.

본 명세서에서 '개변체(modified form)'나 '개변항체(modified antibody)'란 친항체(parent antibody)의 가변영역(CDR 서열 및/또는 FR 서열)의 아미노산 서열에 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있는 것이다.

본 발명에서 '친항체(parent antibody)'란, VH는 서열번호 7, VL은 서열번호 8로 나타내는 아미노산 서열을 가지는 TfR436 항체이다. 아미노산 서열에서 1개 또는 복수개(예를 들어, 1 내지 8개, 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 바람직하게는 1 내지 3개, 가장 바람직하게는 1 또는 2개)의 아미노산이 결실, 부가, 치환 및/또는 삽입된다. TfR에 대한 결합활성을 갖는 항체의 아미노산 서열을 제조하기 위한 당업자에게 잘 알려진 방법으로는, 단백질에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들어, 당업자라면 부위특이적 변이유발법(참조: Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y,, Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA, 82, 488-492) 등을 이용하여, TfR에 대한 결합활성을 갖는 항체의 아미노산 서열에 적절히 변이를 도입함으로써 TfR에 대한 결합활성을 갖는 항체와 기능적으로 동등한 개변항체를 제조할 수 있다. 이와 같이 항체의 가변영역 또는 불변영역에서 1개 또는 여러 개의 아미노산 변이를 포함하는 TfR에 대한 결합활성을 갖는 항체를 사용할 수도 있다.

본 명세서에서, '친항체와 동등한 활성(an activity equivalent to the activity of the parent antibody)'은 인간 TfR에 대한 결합활성이 동등함을 의미한다. '동등(equivalent)'이란 반드시 동일한 정도의 활성일 필요는 없고, 활성이 증강되도 되고, 또한 활성이 있는 한 활성이 감소되도 무방하다. 활성이 감소하고 있는 항체로는, 원래 항체에 비해 30% 이상의 활성, 바람직하게는 50% 이상의 활성, 더욱 바람직하게는 80% 이상의 활성, 좀 더 바람직하게는 90% 이상의 활성, 특히 바람직하게는 95% 이상의 활성을 가지는 항체를 예로 들 수 있다.

본 명세서에서, '결합 활성(binding activity)'이란 용어는 항원을 인식하는 정도를 의미한다. 이 항원은 세포막에서 발현되는 천연형(intact) TfR이라도 좋고, 띠형(truncted form)이나 가용화형(soluble form)이라도 좋다. 또한, 입체구조를 유지한 TfR도 좋고, 변성된 TfR도 무방하다. 결합활성을 측정하는 방법의 예로서는, 플로우사이토미터(FACS: flow cytometry), 효소결합면역흡착검정법(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴 블롯(Western-blot), 형광미량측정기술(FMAT: microfluorescence measuring technique), 표면 플라스몬공명(sursace plasmon resonance, BI Acore) 등을 들 수 있다.

항체의 Tf-TfR 결합 저해활성은 후술하는 '실시예 2(2); TfR436 항체 및 타사 항체의 Tf-TfR 결합저해 비교'에 기술된 방법에 따라 측정할 수 있다. TfR 용액을 기판(96-웰 plate 등)에 분주하여 정치하고 고상화하여 블로킹한다. 이어서 HRP 표지한 Tf 용액을 분주하고, 항체를 첨가하여 실온에서 반응시킨다. 그런 다음, 기판을 세척하고 발색시약(TMB 등)을 첨가하여 반응시켜 플레이트 판독기로 흡광도를 측정한다. 상기 조작에 의하여 당해 항체가 Tf-TfR 결합저해 활성을 평가할 수 있다.

항체 세포 내 철의 흡수 저해 활성은 후술하는 '실시예 3: TfR436 항체의 세포증식 억제효과에 대한 구연산 철암모늄의 효과'에 기술된 방법에 따라 측정할 수 있다. 즉, 세포를 배양용 배지에 현탁하여 기판(96웰 플레이트 등)에 파종한다. 항체를 적당한 농도로 연속 희석한 용액을 작제하여 상기 세포에 첨가한다. 여기에 구연산 철암모늄을 첨가한다. 소정 시간 세포를 배양한 후 각 웰을 잘 휘저어 세포 배양액을 다른 플레이트(예를 들어, V 바닥 96-웰 플레이트 등)로 옮긴다. 그 중 일부를 FACS Calibur(BD)에 흡인시켜 이벤트수(number of events)를 측정한다. 얻은 이벤트수의 4배를 웰당 세포수로 하여 항체 및 구연산 철암모늄 무첨가 웰에서의 세포수 평균치를 100%로 하여 각 처리에서의 증식률을 산출한다. 항체가 농도의존적으로 세포의 증식을 억제하고, 이 증식정지가 구연산 철암모늄의 첨가에 의해 회복되는 경우에는 당해 항체가 세포 내로 철의 흡수를 저해한다는 것이 실증된다.

항체는 그 기원을 한정하지 않으며, 인간 항체, 마우스 항체, 랫트 항체 등 어떠한 동물 유래의 항체라도 무방하다. 또한, 키메라 항체, 인간화 항체 등도 좋다. 본 발명에서의 항체의 바람직한 양태의 하나는 인간 항체이다.

항체는 후술하는 항체를 생산하는 세포나 숙주나 정제방법에 따라 아미노산서열, 분자량, 등전점 또는 당쇄의 유무나 형태 등이 다를 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 기재되어 있는 아미노산 서열에 번역 후 수식을 받는 경우도 본 발명에 포함된다. 또한, 기존의 번역 후 수식 이외의 부위에 대한 번역 후 수식도, 본 발명에 포함된다. 또한, 항체를 원핵세포, 예컨대 대장균에서 발현시킨 경우 원래 항체의 아미노산 서열 N 말단에 메티오닌 잔기가 부가된다. 본 발명에서는 이러한 항체를 사용해도 좋다. 기존의 번역 후 수식 이외의 부위에 대한 번역 후 수식도 본 발명에 포함된다.

항체의 작제

(1) 파지 디스플레이 라이브러리에 의해 항원과 반응하는 scFv

항체는 당해 기술분야에서 알려진 몇 가지 방법에 따라 수득할 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 기술(phage display technique)을 사용하여 TfR에 대한 친화성이 다양한 항체의 레퍼토리를 포함하는 라이브러리를 제공할 수 있다. 그런 다음, 이러한 라이브러리를 스크리닝 하고, TfR에 대한 항체를 동정하고 단리할 수 있다. 바람직한 것은 인간 B세포에서 분리된 mRNA에서 만들어진 인간 VL 및 VH cDNA를 사용하여 생성되는 scFv 파지 디스플레이 라이브러리이다. 그러한 라이브러리를 만들어 스크리닝 하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다. 인간 TfR을 항원으로서 스크리닝한 반응성을 나타내는 파지 클론으로부터 유전물질을 회수한다. 선택된 파지의 유전자를 분석하면, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변영역을 암호화하는 VH 및 VL의 DNA 서열을 결정할 수 있다. 이 scFv의 서열을 이용해 scFv를 IgG화하면 인간 항체를 수득할 수 있다.

(2) scFv의 IgG화 (인간 항체의 작제)

H사슬 또는 L사슬의 발현벡터를 만들어 숙주세포에서 발현시킨다. 분비된 상등액을 회수하고 정제하여 인간항체를 취득한다. 또한, VH 및 VL을 동일 벡터에서 발현시킴으로써(탠덤형, tandem type) 인간 항체를 취득할 수도 있다. 이러한 방법은 널리 알려져 있으며, WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/1236, W093/19172, WO95/01438, WO95/15388, WO97/10354 등을 참고하여 실행될 수 있다.

구체적으로, VH를 암호화하는 DNA를 중쇄 불변영역(CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 다른 DNA 분자와 연결함으로써 완전장 중쇄 유전자를 취득할 수 있다. 인간 중쇄 불변영역 유전자의 서열은 당해 기술분야에서 알려져 있으며(예를 들어, Kabat, E. A. 등, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변영역이 좋으나, 가장 바람직한 것은 IgG1 또는 IgG2의 불변영역이다. IgG1 불변영역 서열은 Gm(1), Gm(2), Gm(3)이나 Gm(17) 등 서로 다른 개인 간에 생기는 것으로 알려진 임의의 다양한 대립유전자(allele) 또는 알로타입(allotype)을 포함할 수 있다. 이들 알로타입은 IgG1 불변영역 중 천연에 존재하는 아미노산 치환에 상당한다.

VL을 암호화하는 DNA를 경쇄 불변영역 CL을 암호화하는 다른 DNA 분자와 연결함으로써 완전장 L사슬 유전자(및 Fab 경쇄 유전자)를 취득할 수 있다. 인간 경쇄 불변영역 유전자의 서열은 당해 기술분야에서 알려져 있으며(예를 들어, Kabat, E.A. 등, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human의 단편을 통해 증폭할 수 있는 DNA-Services, NI5판, NI. 경쇄 불변영역은 κ 또는 λ의 불변영역으로 좋다. 불변영역은 Inv(1), Inv(2), Inv(3) 등 서로 다른 개인간에 생기는 것으로 알려진 임의의 다양한 대립 유전자이다. λ 불변영역은 3가지 λ 유전자 중 어느 것에서 유래하는 것이라도 좋다.

상기와 같이 얻은 H사슬 또는 L사슬을 암호화하는 DNA를 발현벡터 내에 삽입함으로써 발현벡터를 만들어 숙주세포에서 발현시키고 분비한 상등액의 회수·정제에 의해 인간 항체를 취득한다. 발현벡터로는 플라스미드, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 수반 바이러스(AAV), 컬리플라워 모자이크 바이러스나 담배 모자이크 바이러스 등의 식물 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래 에피좀 등을 들 수 있다. 발현벡터 및 발현조절 서열은 사용하는 발현용 숙주세포와 적합하도록 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터 내에 삽입할 수 있으며, 양쪽 유전자를 같은 발현벡터 내에 삽입할 수도 있다. 항체 유전자를 표준적인 방법(예를 들어, 항체 유전자 단편상의 상보적인 제한부위와 벡터의 연결, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활말단 연결)에 의해 발현벡터 내에 삽입한다.

적합한 벡터는 상술한 바와 같이 임의의 VH 또는 VL 서열을 쉽게 삽입하여 발현시킬 수 있도록 공학적으로 작제된 적당한 제한부위를 갖는 기능적으로 완전한 사람 CH 또는 CL 면역글로블린 서열을 암호화하는 것이다. 그러한 벡터에서는 일반적으로 삽입된 J 영역 중의 스플라이스 공여 부위(splice donor site)와 인간 C 도메인에 선행하는 스플라이스 수용 부위(splice acceptor site) 사이에서, 또는 인간 CH 엑손 내에 존재하는 스플라이스 영역에서도 스플라이싱이 일어난다. 폴리아데닐화 및 전사종결은 코드영역 하류 천연 염색체 부위에서 일어난다. 재조합 발현벡터는 또한 숙주세포에서 유래된 항체 사슬 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 암호화할 수도 있다. 항체사슬 유전자는 신호 펩티드가 인프레임(in-frame)으로 면역글로블린 사슬의 아미노 말단과 연결되도록 벡터 내에 클론화할 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로블린 신호 펩티드도 좋고, 혹은 이종성 신호 펩티드(즉, 비면역글로블린 단백질 유래 신호 펩티드)도 좋다.

항체의 발현벡터는 항체 유전자 및 제어서열 외에 숙주세포 내에서의 벡터의 복제를 제어하는 서열(예를 들어, 복제기점(replication origin))이나 선택 마커유전자(selective marker gene) 등의 서열을 가져도 된다. 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주세포의 선택을 촉진한다. 예를 들어, 보통 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주세포 상에 G418, 하이그로마이신이나 메트렉세이트 등의 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선택 마커 유전자에는 탈수소엽산 환원효소(DHFR) 유전자(dhfr-숙주세포에서 메트렉세이트 선택/증폭과 함께 사용함), 네오마이신 포스포전달효소 유전자(G418 선택용) 및 글루탐산 합성효소 유전자가 있다.

이상의 방법으로 작제된 항체 유전자 발현벡터에 의해 숙주세포를 형질전환한다. 숙주세포로는 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등 항체를 생산시킬 수만 있다면, 어떤 세포라도 좋지만 동물세포가 바람직하다. 동물세포로는 차이니즈 햄스터 난소세포 CHO/dhfr(-) 및 CHO/DG44, 원숭이 유래세포 COS 세포(A. Wright & S. L. Morrison, J. Immunol. 160, 3393-3402(1998)), SP2/O 세포(마우스 미엘로마)(K. Motmans, Eur. J. Cancer Prev. 5, 512-5199(1996), R. P. Junghans et al., Cancer Res. 50, 1495-1502(1990)) 등을 예로 들 수 있다. 또한, 형질전환에는 리포펙틴법(lipofectin method, R. W. Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 6007(1989), P. L. Felgner et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413(1987)), 전기천공법(electroporation method), 인산칼슘법(calcium phosphate method, F. L. Graham & A. J. van der Eb, Virology 52,456-467 (1973)), DEAE-덱스트란법(DEAE-Dextran method) 등의 방법을 이용하는 것이 바람직하다.

형질전환체를 배양한 후 형질전환체의 세포 내 또는 배양액에서 인간 항체를 분리한다. 항체의 분리, 정제에는 원심분리(centrifugation), 유안분획(ammonium sulfate fractionation), 염석(salting-out), 한외여과(ultrafiltration), 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 겔여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography) 등의 방법을 적절히 조합하여 이용할 수 있다.

항체단편

항체에 기반하거나 항체를 암호화하는 유전자의 서열정보를 기초로 하여 항체단편을 만들 수 있다. 항체 단편으로는 Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, dsFv 항체를 예로 들 수 있다.

Fab은 IgG를 시스테인 존재 하에서 파파인(papain) 소화함으로써 얻을 수 있는 L사슬과 H사슬 가변영역 및 CH1 도메인 및 힌지부의 일부로 이루어진 H사슬 단편으로 구성된 분자량 약 5만의 단편이다. 본 발명에서는 상기 항체를 파파인 소화함으로써 얻을 수 있다. 또한, 상기 항체의 H사슬 일부 및 L사슬을 암호화하는 DNA를 적당한 벡터에 삽입하여 당해 벡터를 사용하여 형질전환한 형질전환체에서 Fab를 제조할 수도 있다.

Fab'은 후술하는 F(ab')₂의 H사슬간 이황화 결합을 절단함으로써 얻어지는 분자량이 약 5만인 단편이다. 본 발명에서는 상기 항체를 펩신 소화하고 환원제를 사용하여 이황화 결합을 절단함으로써 얻는다. 또한, Fab과 마찬가지로 F(ab')₂를암호화하는 DNA를 이용하여 유전공학적으로 제조할 수도 있다.

F(ab')₂는 IgG를 펩신 소화함으로써 얻을 수 있는 L사슬과 H사슬 가변영역 및 CH1 도메인 및 힌지부 일부로 구성된 H사슬 단편과 함께 구성된 단편(Fab')이 이황화 결합으로 결합한 분자량 약 10만의 단편이다. 본 발명에서는 상기 항체를 펩신 소화함으로써 얻을 수 있다. 또한, Fab과 마찬가지로 F(ab')₂를 암호화하는 DNA를 이용하여 유전공학적으로 제조할 수도 있다.

scFv는 H사슬 가변영역과 L사슬 가변영역으로 구성된 Fv를, 한쪽 사슬의 C 말단과 다른 쪽 N 말단을 적당한 펩티드 링커로 연결하여 단일 사슬화한 항체 단편이다. 펩티드 링커로서는 예를 들어 유연성이 높은 (GGGGS)₃ 등을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 H사슬 가변영역 및 L사슬 가변영역을 암호화하는 DNA와 펩티드 링커를 암호화하는 DNA를 사용하여 scFv 항체를 암호화하는 DNA를 구축하고, 이를 적당한 벡터에 삽입하여 당해 벡터를 사용하여 형질전환한 형질전환체에서 scFv를 제조할 수 있다.

dsFv는 H사슬 가변영역 및 L사슬 가변영역의 적절한 위치에 Cys 잔기를 도입하여 H사슬 가변영역과 L사슬 가변영역을 이황화 결합으로 안정화시킨 Fv 단편이다. 각 사슬에서의 Cys 잔기 도입 위치는 분자 모델링에 의해 예측되는 입체구조에 근거해 결정할 수 있다. 본 발명에서는 예를 들어 상기 항체의 H사슬 가변영역 및 L사슬 가변영역의 아미노산 서열로부터 입체구조를 예측하고, 이러한 예측에 따라 변이를 도입한 H사슬 가변영역 및 L사슬 가변영역을 각각 암호화하는 DNA를 구축한 다음, 이를 적당한 벡터에 삽입하고 당해 벡터를 사용하여 형질전환한 형질전환체에서 dsFv를 제조할 수 있다.

또한, 적당한 링커를 이용하여 scFv항체, dcFv항체 등을 연결하거나 스트렙토아비딘을 융합시킴으로써, 항체 단편을 다량체화(multmerization)할 수도 있다.

의약 조성물 및 제제

본 발명의 억제제를 포함하는 의약 조성물 및 제제도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명의 억제제는 세포 내 철의 과잉 흡수를 수반하는 질환 또는 증상의 처치를 위해 사용할 수 있다.

세포 내 철의 흡수과잉을 수반하는 질환 또는 증상으로는, 예를 들어 철과잉증(iron overload) 등을 들 수 있다.

의약 조성물 및 제제는 바람직하게는 항체에 더해 생리학적으로 허용될 수 있는 희석제 또는 담체를 포함하고 있으며, 다른 약제와의 혼합물이라도 좋다. 적절한 담체로는 생리적 식염수, 인산완충 생리식염수, 인산완충 생리식염수 글루코스액 및 완충 생리식염수가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 혹은, 항체는 동결건조하여 필요할 때 위와 같은 완충수용액을 첨가하여 재구성하여 사용해도 된다. 투여 형태로는 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 시럽제 등으로 경구투여 또는 주사제(피하주사, 정맥주사, 근육주사, 복강내주사 등), 경피, 경점막, 경비, 경폐, 좌약 등으로 비경구 투여를 들 수 있다. 본 발명의 의약 조성물에 의한 제제 단독 투여하여도 되고, 다른 약제와 병용해도 된다.

본 발명에서 억제제의 투여량은 증상, 나이, 체중 등에 따라 다르지만, 일반적으로 경구투여에서는 항체의 양으로 성인에게 1일 약 0.01mg 내지 1,000mg이며, 이들을 1회 또는 여러 차례로 나누어 투여할 수 있다. 또한, 비경구 투여에서는 1회 약 0.01mg 내지 1,000mg을 피하주사, 근육주사 또는 정맥주사로 투여할 수 있다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

이하의 실시예에서는 국제공개 WO2014/073641호 공보의 단락 [0090] 및 [0091]에 기재되어 있는 TfR436 항체를 사용하였다.

TfR436 항체의 CDR서열을 다음과 같이 나타낸다.

VH CDR1 : SYGMH (서열번호 1)

VH CDR2: VISYD GSNKYADS VKG (서열번호 2)

VH CDR3: DSNFWSGYYS PVDV(서열번호 3)

VL CDR1 : TRSSGSIASNSVQ (서열번호 4)

VL CDR2: YEDTQRPS (서열번호 5)

VL CDR3: QSYD SAYH WV (서열번호 6)

TfR436 항체의 VH서열 및 VL서열을 이하에 나타내었다.

TfR436 VH(서열번호 7)

ＤＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＰＦＫＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＧＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＳＮＦＷＳＧＹＹＳＰＶＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

TfR436 VL(서열번호 8)

ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＳＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＡＰＩＴＶＩＹＥＤＴＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＱＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＡＹＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＡＶＬ

TfR436 항체의 결합부위 동정

TfR436 항체는 쥐 TfR과 교차 반응하지 않지만 햄스터 TfR와 교차 반응성을 나타내었다. TfR에서의 트랜스페린(TF) 결합부위(569번째~760번째 아미노산)의 아미노산 서열을 정렬하였다. 인간 TfR 서열에서 햄스터와 같고, 마우스와는 다른 아미노산을 선택하였다. 선택된 아미노산을 도 1에 나타낸 바와 같이 점 돌연변이(point mutation)시키고, 가용성 TfR 변이 단편을 작제하였다.

(1) 가용성 야생형 TfR(sTfR) 및 TfR 변이 단편(MF1~MF7)의 작제

　 인간 TfR 세포외 영역(89번째~760번째 아미노산), 또는 도 1에 나타난 각각 TfR 변이 단편(MF1~MF7)과 AAARGG PEQKLISEED LISAVDHHHHHH(서열번호 10)를 암호화하는 염기서열을 전체 합성하였다. 발현 벡터 pCAGGS(비특허문헌 2: Niwa et al. 1991)에 네오마이신 내성 유전자와 DHFR 유전자를 내장한 벡터의 멀티클로닝 사이트에 각각 합성한 유전자를 삽입하고, pCAGGS-Neo-DHFR-sTFR-myc-his 발현 플라스미드를 작제하였다. Expifectamine(Invitrogen)을 이용하여 Expi293 세포(Invitrogen)에 상기 플라스미드를 트랜스펙션하고, 37℃, 8% CO₂, 135rpm의 조건에서 5일간 배양하였다. 그런 다음, 원심분리하여 배양 상등액을 회수한 다음, AKTA prime(GE Healthcare)에 HisTrapHP(GE Healthcare) 컬럼을 접속하고, 결합용 완충용액으로 20mM Imidazole/DPBS, 용출용 완충용액으로는 500mM 이미다졸/DPBS를 이용하여 sTfR 혹은 MF1~MF7을 정제하였다. 용출된 단백질은 Zeba spin column(Thermo Scientific)을 이용하여, 30mM HEPES, 5% 트레할로스(trehalose), pH 7.2로 완충용액 교환하였다.

(2) TfR436 항체의 결합부위 동정

　 상기에서 정제한 sTfR 혹은 MF1~MF7을 PBST(Phosphate Buffered Saline with Tween 20, TaKaRa)로 희석하고, 600ng/mL으로부터 3배 희석을 7단계로 실시하였다. 그런 다음, Ni-NTA HisSorb Strips 96-웰 plate(QIAGEN)에 희석액을 100μL/웰로 분주하여 진탕기에 옮기고 실온에서 반응시켰다. 1시간 후 PBST 완충용액으로 5회 세정하고, TfR436 항체(1ug/mL)를 100μL/웰에 분주하여 진탕기에 옮기고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, PBST 완충용액으로 5회 세정하고 50,000배 희석한 2차 항체 F(ab')₂ Fragment Anti-Human IgG Fcγ(Jackson Immuno Research) 100μL/웰로 분주하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBST 완충용액으로 5회 세척한 다음, TMB Soluble Reagent (High Sensitivity) (Scy Tek)를 100μL/웰로 분주하고, 실온, 암소에서 3분간 반응시켰다. 그런 다음, TMB 정지용 완충용액(Scy Buffer(Scy Tek)을 100μL/웰로 첨가하고 1분간 진탕기에서 진탕한 다음, 플레이트 판독기로 450nm(ref: 620nm)에서의 흡광도를 측정하였다.

　 결과는 도 2에서 나타내듯이, TfR 436 항체는 TfR 변이 단편 MF5와의 반응성 저하가 나타났지만, 기타 변이 단편와의 반응성 저하는 나타나지 않았다. 즉, TfR의 629번째, 630번째, 633번째 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하면 TfR436 항체가 TfR로 인식하지 못하게 된다. 아미노산 제629번 내지 제633번는 TfR436 항체의 인식 에피토프(epitope)임이 시사되었다.

Tf-TfR 결합 저해에 있어서 TfR436 항체 및 비교용 항체 비교

(1) 비교용 항체 A24의 작제

　 특허문헌 US2008/0193453에 인간 TfR에 대한 A24항체가 기재되어 있다. TfR436 항체와 이 항체를 비교하기 위하여 기탁받은 하이브리도마를 입수하여 항체를 생산하였다. 구체적으로, 하이브리도마를 RPMI1640(GIBCO), FBS 10%의 배지에 세포농도가 1~2 x 10⁵/mL가 되도록 하여, 37℃의 5% CO₂인큐베이터에서 배양하였다. 확대 배양(cell expansion) 후 원심분리하여 세포를 회수하여 PBS에서 2회 세정하고, 무혈청 배지 cosmedium 005(코스모바이오), 0.5% Nutridoma-CS(Roche)에서 다시 550mL가 될 때까지 확대 배양하였다. 세포가 콘플루엔트(confluent)가 되고 5일 후, 원심분리하여 배양 상등액을 회수하였다.

　 회수된 상등액을 단백질 A 담체(Ab-Capcher ExTra: 프로테노바사)에 적용하고, 단백질 A와 결합하고 있는 항체를 0.1M 글리신염산 완충액(pH 2.7)으로 용출하여 신속하게 1M Tris 염산 완충액(pH 8.5)으로 중화하였다. 그런 다음, 울트라 셀 한외 여과 디스크(Merck Millipore)를 이용하여 완충용액을 PBS로 교환하였다.

(2) TfR436 항체 및 타사 항체의 Tf-TfR 결합저해 비교

실시예 1에 기재된 sTfR을 PBST에서 5.0μg/mL가 되도록 조정한 다음, MaxiSorp 96-웰 플레이트(Nunc)에 희석액을 100μL/웰로 분주하여 4℃에서 하룻밤 정치하여 고상화하였다. 다음날 고상액(solid phase liquid)을 버리고, 100% 블록 에이스(Block Ace, DS Pharma Biomedical) 200μL/웰로 실온 정지시켜 블로킹하였다. 1시간 후 PBST 완충용액으로 5회 세정한 다음, HRP 표지한 Tf(2ug/mL) 50μL/웰을 분주하고, 추가로 TfR436 항체, A24 항체(10μg/mL에서 2배 희석) 또는 holo-Tf(Sigma) 300μg/mL에서 2배 희석)로 첨가한 것)을 50μL/mL로 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, PBST 완충용액으로 5회 세척하고 TMB Soluble Reagent(High Sensitivity)를 100μL/웰로 분주하여 실온 암소에서 반응시켰다. 25분 후, TMB 정지용 완충용액을 100μL/웰의 양으로 첨가하고, 1분간 진탕기에서 진동시킨 다음, 플레이트 판독기로 450nm(ref: 620nm)의 흡광도를 측정하였다.

　 결과는 도 3에 나타내었듯이, TfR 436 항체는 훨씬 낮은 용량으로(100ng/mL) 완전히 Tf-TfR의 결합을 저해하였다. 반면, A24 항체는 10μg/mL의 용량으로도 완전히 Tf-TfR의 결합을 저해할 수 없고, Tf-TfR의 결합을 50% 밖에 저해할 수 없었다. 이로써, Tf-TfR의 결합 저해에서 TfR436 항체가 우수하다는 것이 시사되었다.

TfR436 항체의 세포증식 억제효과에 대한 구연산 철암모늄 효과

　 위 실험 결과에서 알 수 있듯이, TfR436 항체는 TfR 아미노산 제629번 내지 제633번를 인식하고 완전히 Tf-TfR의 결합을 저해한다. 이러한 저해로 인해 세포 내로의 철 흡수가 완전히 저해된다. 즉, TfR436 항체는 세포내로의 철을 흡수하는 억제제이다. 철은 세포의 생존과 증식에 필수적인 물질로 세포 내 철 결핍이 되면 세포증식 정지나 세포사가 일어난다. TfR436 항체가 세포의 증식을 억제하는지와 또한 이 증식 억제가 철 결핍 원인임을, 비-트랜스페린 결합 철 흡수(non-trasferrin bound iron uptake)의 철 공여체로 알려진 구연산 철암모늄을 이용하여 검토하였다. 구체적으로, K562 세포를 세포수가 5,000개/ml가 되도록 배양용 배지(RPMI1640, 10% FBS, 1% P/S)에 현탁하고, 96웰 플레이트에 100μl/웰씩 파종하였다. TfR436 항체를 100μg/ml에서 5배 연속 희석한 용액을 만들어 K562 세포에 50μL씩 첨가하였다(최종농도: 25~0.3μg/ml). 또한, 120μM의 구연산 철암모늄(화광순약) 50μL를 첨가하였다(최종농도: 30μM). 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터 내에 96시간 배양한 다음, 각 웰을 잘 교반시켜 150μl의 세포 배양액을 V 바닥 96-웰 플레이트(Corning)에 옮기고, 그 25μl를 FACS Calibur(BD)로 흡인시켜 이벤트수를 측정하였다. 얻은 이벤트수의 4배를 웰당 세포수로 하고 항체 및 구연산 철암모늄 무첨가 웰에서의 세포수 평균치를 100%로 하여, 각 처리구에서의 증식률을 산출하였다.

　결과는 도 4에 나타낸 것처럼 TfR 436 항체는 농도 의존적으로 K562의 증식을 억제하였다. 이 증식정지는 구연산 철암모늄의 첨가에 의해 회복되었다. 이 결과로 TfR436 항체가 세포 내 철의 흡수를 저해하는 것이 확인되었다.

TfR436 항체 첨가에 따른 세포내 철량의 변화

K562 세포주를 이용하여 TfR436 항체의 첨가에 의한 세포내 철량의 변화를 확인하였다. 구체적으로, K562세포를 0.5x10⁵세포/mL가 되도록 파종한 T150 플라스크(IMDM+10%-FBS; 60mL)에 대해 TfR436 항체를 최종농도 5μg/mL가 되도록 첨가하였다. 비교대조로 TfR006 항체(특허 5980202호에 기재), A24 항체, 인간 모노클로널 IgG1 항체(Nega mAb) 및 DPBS 완충액(미처리)을 준비하고, TfR436 항체와 동일하게 첨가하였다. 37℃, 5%-CO₂ 인큐베이터에서 96시간 배양한 다음, 각 시료의 세포수를 계수하여 1.0x10⁷ 세포를 회수하였다. 세포를 DPBS로 3회 세척하고, 세포 덩어리에 250μL의 Lysis M Reagent(Roche; cat. # 04 719 956 001)와 2.5μL의 6N-HCl을 첨가하고 혼합하여 실온에서 1시간 동안 정치시켰다. 원심분리 후 회수한 상등액을 철의 정량에 이용하였다. 철의 정량은 메탈로어세이 철 정량법(metalloassay iron measurement) LS(ferrozine method)(Metallogenics; cat. #FE31M)에 따라 실시하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

　 결과는 도 5에서 보듯이, 미처리, Nega mAb, TfR006, TfR436 및 A24를 첨가한 K562 세포 내 철의 량은 각각 1.15, 1.20, 0.27, 0.25 및 0.81nmol이었는데, 이는 항TfR 항체 첨가에 의해 세포 내로의 트랜스페린 철 흡수가 억제되어 철량이 감소하는 것을 시사하였다. 또한, A24 항체에 비해 TfR006 항체와 TfR436 항체는 철 흡수 억제효과가 높은 것으로 나타났다. 아울러, 이러한 실험결과는 TfR006 항체보다 TfR436 항체로 철 흡수 억제효과가 높다는 것을 나타내었다.

SEQUENCE LISTING <110> Perseus Proteomics Inc. <120> Agent for inhibition of incorporation of iron in cells <130> 191983A <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> human <400> 1 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> human <400> 2 Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> human 400> 3 Asp Ser Asn Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Ser Pro Val Asp Val 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> human <400> 4 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Ser Val Gln 1 5 10 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> human <400> 5 Tyr Glu Asp Thr Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> human <400> 6 Gln Ser Tyr Asp Ser Ala Tyr His Trp Val 1 5 10 <210> 7 <211> 123 <212> PRT <213> human <400> 7 Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Lys Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Asn Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Ser Pro Val Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 111 <212> PRT <213> human <400> 8 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn 20 25 30 Ser Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Ile Thr Val 35 40 45 Ile Tyr Glu Asp Thr Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser 85 90 95 Ala Tyr His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ala Val Leu 100 105 110 <210> 9 <211> 760 <212> PRT <213> human <400> 9 Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu 1 5 10 15 Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp 20 25 30 Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala 35 40 45 Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly 50 55 60 Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly 65 70 75 80 Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr 85 90 95 Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro 100 105 110 Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile 130 135 140 Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln 145 150 155 160 Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe 165 170 175 Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val 180 185 190 Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg 195 200 205 Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys 210 215 220 Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys 225 230 235 240 Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile 245 250 255 Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu 260 265 270 Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe 275 280 285 Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly 290 295 300 Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln 305 310 315 320 Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr 325 330 335 Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp 340 345 350 Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser 355 360 365 Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile 370 375 380 Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp 385 390 395 400 His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala 405 410 415 Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met 420 425 430 Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile 435 440 445 Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr 450 455 460 Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr 465 470 475 480 Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val 485 490 495 Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn 500 505 510 Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp 515 520 525 Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe 530 535 540 Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp 545 550 555 560 Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu 565 570 575 Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu 580 585 590 Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn 595 600 605 Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp 610 615 620 Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln 625 630 635 640 Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu 645 650 655 Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys 660 665 670 Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro 675 680 685 Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser 690 695 700 Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys 705 710 715 720 Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala 725 730 735 Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp 740 745 750 Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe 755 760 <210> 10 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Recombinant tag <400> 10 Ala Ala Ala Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 1 5 10 15 Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His 20 25 25

Claims

인간 트랜스페린 수용체의 제629번 내지 제633번 아미노산을 인식하는 항체를 포함하는 세포내 철 흡수 억제제.
제1항에 있어서,
인간 트랜스페린과 인간 트랜스페린 수용체와의 결합을 저해함으로써 세포 내 철의 흡수를 저해하는 것을 특징으로 하는
억제제.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 항체는 중쇄 제1상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3상보성 결정영역(VH CDR3)이 각각 서열번호 1, 2, 3이고, 및 경쇄 제1상보성 결정영역(VL CDR1), 경쇄 제2상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3상보성 결정영역(VL CDR3)이 각각 서열번호 4, 5, 6인 항체인 것을 특징으로 하는
억제제.
제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 중쇄가 서열번호 7을 가지고, 경쇄가 서열번호 8을 가지는 항체인 것을 특징으로 하는
억제제.
제1항 내지 제4항의 어느 한 항에 있어서,
항체는 인간 항체 또는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는
억제제.
제1항 내지 제5항의 어느 한 항에 있어서,
항체는 Fab, Fab', F(ab')₂, 일본쇄(single-chain) 항체(scFv), 이량체화(dimerized) V 영역(Diabody), 이황화 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체 단편인 것을 특징으로 하는
억제제.
제1항 내지 제6항의 어느 한 항에 있어서,
세포 내 철의 과잉 흡수를 수반하는 질환 또는 증상의 처치를 위해 사용되는 것을 특징으로 하는
억제제.
인간 트랜스페린 수용체의 제629번 내지 제633번 아미노산을 인식하는 항체를 포함하는 인간 트랜스페린과 인간 트랜스페린 수용체와의 결합 억제제.
제8항에 있어서,
상기 항체는 중쇄 제1상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3상보성 결정영역(VH CDR3)이 각각 서열번호 1, 2, 3이고, 및 경쇄 제1상보성 결정영역(VL CDR1), 경쇄 제2상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3상보성 결정영역(VL CDR)이 각각 서열번호 4, 5, 6인 것을 특징으로 하는
억제제.
제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 항체는 중쇄가 서열번호 7을 가지고, 경쇄가 서열번호 8을 가지는 항체인 것을 특징으로 하는
억제제.
제8항 내지 제10항의 어느 한 항에 있어서,
항체는 인간 항체 또는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는
억제제.
제8항 내지 제11항의 어느 한 항에 있어서,
항체는 Fab, Fab', F(ab')₂, 일본쇄(single-chain) 항체(scFv), 이량체화(dimerized) V 영역(Diabody), 이황화 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체 단편인 것을 특징으로 하는
억제제.
제8항 내지 제12항의 어느 한 항에 있어서,
세포 내 철의 과잉 흡수를 수반하는 질환 또는 증상의 처치를 위해 사용되는 것을 특징으로 하는
억제제.