CN114364699B

CN114364699B - 红细胞增多症治疗药

Info

Publication number: CN114364699B
Application number: CN202080062640.9A
Authority: CN
Inventors: 张黎临; 野村富美子; 小松则夫; 荒木真理人
Original assignee: Saitama Medical University; Perseus Proteomics Inc
Current assignee: Saitama Medical University; Perseus Proteomics Inc
Priority date: 2019-09-04
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2024-03-29
Anticipated expiration: 2040-09-04
Also published as: JPWO2021045184A1; WO2021045184A1; EP4026560A4; US20230220098A1; CN114364699A; EP4026560A1

Abstract

本发明所要解决的技术问题在于提供一种红细胞增多症治疗药。利用本发明，能够提供一种含有识别人转铁蛋白受体的第629位～第633位的氨基酸的抗体的红细胞增多症治疗药。

Description

红细胞增多症治疗药

技术领域

本发明涉及一种含有抗转铁蛋白受体抗体的红细胞增多症治疗药。

背景技术

转铁蛋白受体(Transferrin receptor；TfR)是在细胞表面表达的TypeII膜蛋白。TfR通过与配体转铁蛋白结合，将铁运入细胞内，维持细胞的生存和分裂。TfR在大多数正常细胞中低表达，但报告了例如在皮肤表皮基底细胞、小肠上皮细胞等一些细胞中表达(非专利文献1～3)。在有核红细胞和胎盘滋养细胞中，由于摄入铁的需求性高，因此TfR高表达(非专利文献4和5)。

真性红细胞增多症(Polycythemia Vera：PV)是以红细胞的过量增加为特征的慢性骨髄增殖肿瘤。作为PV的临床表现，可以列举血液中的红细胞增加所导致的血液粘稠度增高、血液的流速下降等。在PV中，例如会出现脏器供血不良、低氧所导致的头痛、眩晕、倦怠、血小板功能异常所导致的出血等。另外，在PV中，因嗜碱性粒细胞的增加而放出组胺，从而导致皮肤掻痒，特别是在入浴后产生重度的皮肤掻痒感。作为PV的并发症，进一步可以列举不对称的手和足的肿胀、表现为疼痛和灼热感的肢端红痛症、血栓症、栓塞症等。部分患者转变为急性髄性白血病(AML)或骨髄纤维化(非专利文献6)。

PV的预后比其他的恶性肿瘤良好，治疗的生存期约为14年(非专利文献7)。目前，没有治愈PV的药，PV的治疗目的主要在于：减少红细胞数，将红细胞压积值控制在45％以下，防止血栓症。作为对PV的现有的治疗方法，有放血、细胞减少疗法。然而，这些治疗方法有铁缺乏症、骨髄抑制等副作用，降低患者的QOL。由于对现有的治疗方法的满意度低，因此期望副作用更少、提高患者的QOL的治疗方法。

现有技术文献

专利文献

非专利文献1：P.Ponka，C.N.Lok，The transferrin receptor：role in healthand disease，Int.J.Biochem.Cell Biol.31(1999)1111-1137.

非专利文献2：D.R.Richardson，P.Ponka，The molecular mechanisms of themetabolism and transport of iron in normal and neoplastic cells，Biochim.Biophys.Acta 1331(1997)1-40.

非专利文献3：Daniels TR.Delgado T，Rodriguez JA，Helguera G，PenichetML.The transferrin receptor part I：Biology and targeting with cytotoxicantibodies for the treatment of cancer.Clinical Immunology(2006)121，144-158

非专利文献4：J.E.Levy，O.Jin，Y.Fujiwara，F.Kuo，N.C.Andrews，Transferrinreceptor is necessary for development of erythrocytes and the nervous system，Nat.Genet.21(1999)396-399.

非专利文献5：Khatun R，Wu Y，Kanenishi K，Ueno M，Tanaka S，Hata T，SakamotoH.，Immunohistochemical study of transferrin receptor expression in theplacenta of pre-eclamptic pregnancy.，Placenta.2003；24(8-9)：870-6.

非专利文献6：Butcher C，D’Andrea RJ.Molecular aspects of polycythemiavera(review)..Int J Mol Med.2000Sep；6(3)：243-52.

非专利文献7：Tefferi A，Rumi E，Finazzi G，Gisslinger H，Vannucchi AM，Rodeghiero F，Randi ML，Vaidya R，Cazzola M，Rambaldi A，Gisslinger B，Pieri L，Ruggeri M，Bertozzi I，Sulai NH，Casetti I，Carobbio A，Jeryczynski G，Larson DR，Mullauer L，Pardanani A，Thiele J，Passamonti F，Barbui T.Survival and prognosisamong 1545patients with contemporary polycythemia vera：an internationalstudy..Leukemia.2013Sep；27(9)：1874-81

发明内容

发明所要解决的技术问题

本发明所要解决的技术问题在于提供一种红细胞增多症治疗药。

用于解决技术问题的技术方案

为了解决上述技术问题，本发明的发明人进行了研究，结果发现使用识别人TfR的规定位置的氨基酸序列的抗体能够治疗红细胞增多症，从而完成了本发明。

即，利用本发明，提供以下的发明。

(1)一种红细胞增多症治疗药，其含有识别人转铁蛋白受体的第629位～第633位的氨基酸的抗体。

(2)如(1)所述的红细胞增多症治疗药，其中，红细胞增多症为真性红细胞增多症。

(3)如(1)或(2)所述的红细胞增多症治疗药，其与其他的红细胞增多症治疗方法联合使用。

(4)如(1)～(3)中任一项所述的红细胞增多症治疗药，其中，上述抗体是重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VH CDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，并且轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体。

(5)如(1)～(4)中任一项所述的红细胞增多症治疗药，其中，上述抗体是重链具有序列号7并且轻链具有序列号8的抗体。

(6)如(1)～(5)中任一项所述的红细胞增多症治疗药，其中，抗体为人抗体或人源化抗体。

(7)如(1)～(6)中任一项所述的红细胞增多症治疗药，其中，抗体为选自Fab、Fab'、F(ab')₂、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(Diabody)、二硫化物稳定化V区(dsFv)和包含CDR的肽中的抗体片段。

(8)如(1)～(7)中任一项所述的红细胞增多症治疗药，其与羟基脲联合使用。

(A)提供一种治疗红细胞增多症的方法，其包括向对象者投予识别人转铁蛋白受体的第629位～第633位的氨基酸的抗体的步骤。

(B)一种用于治疗红细胞增多症的识别人转铁蛋白受体的第629位～第633位的氨基酸的抗体。

(C)识别人转铁蛋白受体的第629位～第633位的氨基酸的抗体在制造红细胞增多症治疗药中的应用。

发明效果

本发明的红细胞增多症治疗药在红细胞增多症的治疗中是有用的。

附图说明

图1表示各TfR突变片段(TfR mutant fragment)进行点突变(point mutation)的部位。

图2表示TfR436与可溶性野生型TfR(wild type TfR(sTfR))以及TfR突变片段(TfR mutant fragment)的反应性。

图3表示TfR436的Tf-TfR结合抑制活性。

图4表示TfR436对有核红细胞增殖的抑制。

具体实施方式

接着，对本发明进行更详细地说明。

定义和一般技术

在本说明书中，只要没有特别定义，关于本发明所使用的科学技术用语包含本领域技术人员通常理解的意义。一般而言，本说明书所记载的关于细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学以及杂交所使用的命名方法及其技术都是该技术领域所公知且常用的。

一般而言，只要没有特别表示，基于该技术领域所公知的现有方法，如本说明书全部引用并论述的各种一般的参考文献和更具体的参考文献所记载的那样，实施本发明的方法和技术。

TfR

人转铁蛋白受体(TfR)是由人三号染色体所编码的760个氨基酸构成的一次跨膜蛋白(序列号9)。该蛋白也已知作为CD71抗原，据认为参与细胞对铁的摄入，并参与细胞的增殖。本发明的TfR在结构上没有特别限定，包括单体、多聚体、细胞膜上表达的完整形态(intact form)、细胞外区域构成的可溶化形态、截短形态(truncted form)，还包括因基因的突变、缺损等而产生的突变形态(mutation form)、通过磷酸化等而受到翻译后修饰的形态等，全部是指人TfR。

进行反应和反应性

在本说明书中，只要没有特别表示，“进行反应”和“反应性”是指相同的意义。即，抗体识别抗原。该抗原可以为在细胞膜上表达的完整TfR，也可以为截短形态(trunctedform)、可溶化形态。另外，既可以为保持了立体结构的TfR，也可以为变性了的TfR。作为研究反应性的方法，可以列举流式细胞仪(FACS)、酶联免疫吸附检测法(ELISA)、蛋白质印迹(western-blot)、荧光微量测定技术(FMAT)表面等离子体共振(BIAcore)、免疫染色、免疫沉降等。

作为用于流式细胞仪的抗体，可以为FITC等荧光物质、生物素等所标记的抗体，也可以为没有标记的抗体。根据所使用的抗体有无标记、其种类，使用荧光标记抗生物素蛋白、荧光标记抗人免疫球蛋白抗体等。反应性能够通过将充分量的抗TfR抗体(通常最终浓度为0.01～10μg/mL)加入被检测体中进行，通过进行与阴性对照抗体、阳性对照抗体的反应性的比较而评价。

抗体

在本说明书中，根据需要，按照习惯使用以下的缩略符号(括号内)。

重链(H链)、轻链(L链)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、互补决定区(CDR)、第一互补决定区(CDR1)、第二互补决定区(CDR2)、第三互补决定区(CDR3)、重链的第一互补决定区(VH CDR1)、重链的第二互补决定区(VH CDR2)、重链的第三互补决定区(VH CDR3)、轻链的第一互补决定区(VL CDR1)、轻链的第二互补决定区(VL CDR2)、轻链的第三互补决定区(VL CDR3)。

在本说明书中，术语“抗体”与免疫球蛋白的意义相同，应当如该技术领域通常已知的那样进行理解。具体而言，抗体这样的术语不受制作抗体的任意的特定的方法限定。例如，抗体这样的术语包含重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体，但并不只限于此。

在本说明书中，术语“人抗体”是指可变区和恒定区的序列为人序列的任意的抗体。该术语包含具有来自人基因的序列、且例如以进行认为降低免疫原性、增大亲和性、除去具有引起不希望的折叠的可能性的半胱氨酸等方式发生了变化的抗体。该术语还包含能够实施不是人细胞所特有的糖基化的、在非人细胞中通过重组而制作的这样的抗体。这些抗体能够以各种方式制备。

在本说明书中，术语“人源化抗体”是指来自非人的抗体，非人种的抗体序列的特征氨基酸残基替换为在人抗体所对应的位置可识别的残基。被认为该“人源化”工序降低了所得到的抗体在人体中的免疫原性。能够理解的是，使用该技术领域所公知的技术能够使来自非人的抗体人源化。例如可以参照Winter等、Immunol.Today14：43～46(1993)。利用与CH1、CH2、CH3、铰链区和/或骨架区所对应的人序列进行替换的重组DNA技术，能够以工程学的方式制作作为对象的抗体。例如可以参照WO92/02190以及美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,792号、第5,714,350号和第5,777,085号。在本说明书中，术语“人源化抗体”在其含义的范围内包含嵌合型人抗体和CDR移植抗体。

在抗体的可变区内，骨架区(FR)的序列只要对与所对应的抗原的特异结合性没有实质的影响，就没有特别限定。优选使用人抗体的FR区，但也可以利用人以外的动物种(例如小鼠、大鼠)的FR区。

在抗体的一个方式中，除了可变区以外，还包含恒定区(例如IgG型抗体)。恒定区的序列没有特别限定。例如可以利用公知的人抗体的恒定区。作为人抗体的重链恒定区(CH)，只要属于人免疫球蛋白(以下标记为hIgG)，则可以是任何的重链恒定区，优选hIgG类的重链恒定区，进而属于hIgG类的hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4这样的亚型的重链恒定区都可以使用。另外，作为轻链恒定区(CL)，只要属于hIg，可以是任何的轻链恒定区，可以使用κ类或λ类。另外，也可以利用人以外的动物种(例如小鼠、大鼠)的恒定区。

在本说明书中，“改型体”或“改型抗体”是通过亲本抗体的可变区(CDR序列和/或FR序列)的氨基酸序列置换、缺失、添加和/或插入1个或多个氨基酸而得到的。

在本发明中，“亲本抗体”是VH具有序列号7所示的氨基酸序列并且VL具有序列号8所示的氨基酸序列的TfR436抗体。在氨基酸序列中，缺失、添加、置换和/或插入了1个或数个(例如1至8个、优选1至5个、更优选1至3个、特别优选1个或2个)氨基酸。作为用于制备对TfR具有结合活性的抗体的氨基酸序列的本领域技术人员公知的方法，已知有向蛋白质中导入突变的方法。例如，只要是本领域技术人员，就能够通过利用定点诱变法(Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y,anDNAkagawa,M.(1995)An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis.Gene 152,271-275、Zoller,MJ,and Smith,M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNAfragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol.100,468-500、Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW,Kramer,B,Pflugfelder,M,and Fritz,HJ(1984)The gapped duplexDNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction.Nucleic AcidsRes.12,9441-9456、Kramer W,and Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directedconstruction of mutations via gapped duplex DNA Methods.Enzymol.154,350-367、Kunkel,TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis withoutphenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A.82,488-492)等，向对TfR具有结合活性的抗体的氨基酸序列中适当导入突变，制备功能上与对TfR具有结合活性的抗体同等的改型抗体。这样，也能够使用在抗体的可变区或恒定区内1个或数个氨基酸突变且对TfR具有结合活性的抗体。

在本说明书中，“活性与亲本抗体同等”是指与人TfR的结合活性同等。“同等”不一定是同等程度的活性，活性可以增强，或者只要具有活性，活性也可以减少。作为活性减少了的抗体，例如可以列举与原有的抗体相比，具有30％以上的活性、优选50％以上的活性、更优选80％以上的活性、进一步优选90％以上的活性、特别优选95％以上的活性的抗体。

作为结合活性，是指识别抗原。该抗原可以为在细胞膜上表达的完整TfR(intactTfR)，也可以为截短形态(truncted form)、可溶化形态。另外，可以为保持立体结构的TfR，也可以为变性后的TfR。例如，作为研究结合活性的方法，可以列举流式细胞仪(FACS)、酶联免疫吸附检测法(ELISA)、蛋白质印迹(western-blot)、荧光微量测定技术(FMAT)表面等离子体共振(BIAcore)等。

抗体的Tf-TfR结合抑制活性可以基于后述的“实施例2(2)TfR436抗体与其他公司抗体的Tf-TfR结合抑制的比较”所记载的方法进行测定。将TfR溶液分别注入基板(96孔板等)并静置，进行固相化并封闭。接着，分别注入HRP标记后的Tf溶液，再添加抗体，在室温下进行反应。之后，清洗基板，添加显色试剂(TMB等)进行反应，利用酶标仪测定吸光度。通过上述操作，能够评价该抗体的Tf-TfR结合抑制活性。

关于抗体，其来源没有限定，可以为人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体等来自任意动物的抗体。或者，也可以为嵌合体化抗体、人源化抗体等。作为本发明的抗体的优选方式之一，为人抗体。

关于抗体，可以因后述的产生抗体的细胞、宿主或精制方法，其氨基酸序列、分子量、等电点或有无糖链、形态等而不同。例如，本发明中所记载的氨基酸序列在翻译后受到修饰的情况也包含在本发明中。进一步而言，对已知的翻译后修饰以外的部位的翻译后修饰也包含在本发明中。另外，利用原核细胞、例如大肠杆菌表达抗体时，向原来的抗体的氨基酸序列的N末端添加蛋氨酸残基。在本发明中，可以使用这样的抗体。对已知的翻译后修饰以外的部位的翻译后修饰也包含在本发明内。

抗体的制作

(1)利用噬菌体展示文库与抗原反应的scFv

关于抗体的获得，可以按照该技术领域所公知的任意方法进行制备。例如，使用噬菌体展示技术，能够提供包含对TfR的亲合性各种各样的抗体谱的文库。接着，对这些文库进行筛选，能够鉴定并分离针对TfR的抗体。优选噬菌体文库为使用由从人B细胞分离的mRNA制备的人VL和VHcDNA所生成的scFv噬菌体展示文库。制备并筛选这样的文库的方法在该技术领域是公知的。从将人TfR作为抗原而筛选得到的显示反应性的噬菌体克隆中回收遗传物质。如果分析所选择的噬菌体的基因，则能够确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的VH和VL的DNA序列。如果使用该scFv的序列并将scFv进行IgG化，则能够获得人抗体。

(2)scFv的IgG化(人抗体的制作)

制作H链或L链的表达载体，在宿主细胞内表达，回收并精制所分泌的上清，由此能够获得人抗体。另外，通过在同一载体中表达VH和VL(串连型)，也能够获得人抗体。这些方法是公知的，可以参考WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、W093/19172、WO95/01438、WO95/15388、WO97/10354等。

具体而言，通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的其他DNA分子连结，能够获得完整长度的重链基因。人重链恒定区基因的序列在该技术领域是公知的(例如Kabat，E.A.等，(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)，包含这些区域的DNA片段可以通过标准的PCR扩增而得到。重链恒定区可以为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD的恒定区，最优选为IgG1或IgG2的恒定区。IgG1恒定区序列可以为Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)、Gm(17)等已知在不同个体间所产生的任意的各种等位基因或同种异型。这些同种异型相当于IgG1恒定区中天然存在的氨基酸置换。

通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的其他的DNA分子连结，能够获得完整长度的L链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在该技术领域是公知的(例如Kabat，E.A.等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)，包含这些区域的DNA片段可以通过标准的PCR扩增而得到。轻链恒定区可以为κ或λ的恒定区。κ恒定区可以为Inv(1)、Inv(2)、Inv(3)等已知在不同个体间所产生的任意的各种等位基因。λ恒定区可以来自3个λ基因中的任一个。

通过将如上所述得到的编码H链或L链的DNA插入表达载体中，制作表达载体，在宿主细胞中表达，回收并精制所分泌的上清，从而获得人抗体。关于表达载体，可以列举质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒等植物病毒、黏粒、YAC、来自EBV的附加体等。选择表达载体和表达调节序列，使其适合所使用的表达用宿主细胞。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入各自的载体中，还可以将两者的基因插入相同的表达载体中。利用标准的方法(例如抗体基因片段上的互补性限制部位与载体连结，或者在不存在限制部位时以平滑末端连结)将抗体基因插入表达载体中。

合适的载体如上述所记载，是以能够容易地插入并表达任意的VH或VL序列的方式、利用工程学方法制作的具有适当的限制部位的编码功能完全的人CH或CL免疫球蛋白序列的载体。在这样的载体中，通常在所插入的J区中的剪接供体部位与先于人C区的剪接受体部位之间、或者存在于人CH外显子内的剪接区内也发生剪接。多聚腺苷酸化和转录终结在存在于编码区下流的天然的染色体部位发生。重组表达载体还能够编码来自宿主细胞的促进抗体链分泌的信号肽。抗体链基因能够以信号肽在读码框内与免疫球蛋白链的氨基末端连结的方式克隆在载体中。信号肽可以为免疫球蛋白信号肽，或者也可以为异种性信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。

抗体的表达载体除了抗体基因和控制序列以外，还可以具有控制载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)、选择标记基因等其他的序列。选择标记基因促进对导入了载体的宿主细胞的选择。例如，通常，选择标记基因对导入了载体的宿主细胞赋予对G418、潮霉素、甲氨蝶呤等药物的耐受性。优选的选择标记基因有脱氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞内甲氨蝶呤选择/扩增同时使用)、新霉素磷酸转移酶基因(G418选择用)和谷氨酸合成酶基因。

利用由以上方法制作的抗体基因表达载体转化宿主细胞。作为宿主细胞，可以为细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等能够产生抗体的细胞，优选动物细胞。作为动物细胞，可以列举中国仓鼠卵巢细胞CHO/dhfr(-)细胞CHO/DG44细胞、来自猴的细胞COS细胞(A.Wright&S.L.Morrison,J.Immunol.160,3393-3402(1998))、SP2/O细胞(小鼠骨髓瘤)(K.Motmans et al.,Eur.J.Cancer Prev.5,512-5199(1996),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.50,1495-1502(1990))等。另外，在转化时适合利用脂质体法(R.W.Malone etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6007(1989),P.L.Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413(1987)、电穿孔法、磷酸钙法(F.L.Graham&A.J.van derEb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran法等。

培养转化体后，从转化体的细胞内或培养液中分离人抗体。抗体的分离和精制可以适当组合利用离心分离、硫酸铵分级分离、盐析、超滤、亲和色谱、离子交换色谱、凝胶渗透色谱等方法。

抗体片段

基于抗体或者基于编码抗体的基因的序列信息，能够制作抗体片段。作为抗体片段，可以列举Fab、Fab'、F(ab')₂、scFv、dsFv抗体。

Fab是通过在半胱氨酸存在下木瓜蛋白酶消化IgG而得到的由L链和H链可变区以及包含CH1区和铰链部的一部分的H链片段构成的分子量约5万的片段。在本发明中，通过进行木瓜蛋白酶消化，能够得到上述抗体。另外，也可以将编码上述抗体的H链的一部分和L链的DNA导入适当的载体中，利用以该载体转化得到的转化体制备Fab。

Fab'是通过切断后述的F(ab')₂的H链间的二硫键而得到的分子量约为5万的片段。在本发明中，通过进行胃蛋白酶消化并使用还原剂切断二硫键，能够得到上述抗体。另外，与Fab同样，也能够使用编码Fab'的DNA以基因工程学的方式进行制备。

F(ab')₂是通过胃蛋白酶消化IgG而得到的由L链和H链可变区以及包含CH1区和铰链部的一部分的H链片段构成的片段(Fab')以二硫键结合而成的分子量约10万的片段。在本发明中，通过进行胃蛋白酶消化，能够得到上述抗体。另外，与Fab同样，也能够使用编码F(ab')₂的DNA以基因工程学的方式进行制备。

scFv是利用适当的肽接头将一条链的C末端和另一条链的N末端连结而使包含H链可变区和L链可变区的Fv单链化而得到的抗体片段。作为肽接头，例如可以使用柔软性高的(GGGGS)₃等。例如，可以使用编码上述抗体的H链可变区和L链可变区的DNA和编码肽接头的DNA构建编码scFv抗体的DNA，将其导入适当的载体中，利用以该载体转化得到的转化体制备scFv。

dsFv是向H链可变区和L链可变区的适当位置导入Cys残基并利用二硫键使H链可变区和L链可变区稳定化而得到的Fv片段。各链中的Cys残基的导入位置可以基于利用分子模型预测的立体结构进行确定。在本发明中，例如可以根据上述抗体的H链可变区和L链可变区的氨基酸序列预测立体结构，基于这样的预测构建分别编码导入了突变的H链可变区和L链可变区的DNA，将其导入适当的载体中，然后利用以该载体转化得到的转化体制备dsFv。

另外，使用适当的接头将scFv抗体、dcFv抗体等连结，或者使抗生蛋白链菌素融合，也能够使抗体片段多量体化。

医药组合物和制剂

含有本发明的红细胞增多症治疗药的医药组合物和制剂也包含在本发明的范围内。

本发明的红细胞增多症治疗药能够用于红细胞增多症的处置。

红细胞增多症是血细胞量绝对或相对增加的状态，由于血细胞的大部分是红细胞，因此红细胞增多症的概念几乎与红细胞增加症相同。红细胞增多症有真性红细胞增多症、相对红细胞增多症和二次性红细胞增多症。

真性红细胞增多症(Polycythemia vera)是骨髄增殖性肿瘤之一，是因造血干细胞的后天基因异常所导致的增殖而引起血液中的红细胞数和循环血液量绝对增加的疾病。在真性红细胞增多症中，通常白血球和血小板也增加，从而全血细胞增加。

关于相对红细胞增多症，红细胞的总量没有增加，通常是因占血液成分的一半以上的液体成分的血浆减少而使每单位体积血液的红细胞量相对增加的状态。

二次性红细胞增多症也称为继发性红细胞增多症，是作为造血因子的促红细胞生成素的量因某种原因而增加，从而使红细胞造血做出反应并引起红细胞量增加的状态。

作为本发明的红细胞增多症，优选真性红细胞增多症。

本发明的红细胞增多症治疗药也可以与其他的红细胞增多症治疗方法联合使用。

作为其他的红细胞增多症治疗方法，可以列举放血、化疗法(抗癌剂等)和抗血小板药等。

放血是抽取血液并舍弃的治疗。

作为化疗法药物，可以列举羟基脲(Hydroxycarbamide，商品名：HYDREA)、雷莫司汀(商品名：CYMERIN)、白消安(商品名：MABLlN POWDER)、鲁索替尼(Ruxolitinib，商品名：Jakafi)等。

作为抗血小板药，可以列举低容量阿斯匹林等。

优选本发明的红细胞增多症治疗药与羟基脲联合使用。

含有本发明的红细胞增多症治疗药的医药组合物和制剂优选除了抗体以外还含有生理学上可接受的稀释剂或载体，也可以为与其他的药剂的混合物。合适的载体中含有生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、磷酸缓冲生理盐水葡萄糖液和缓冲生理盐水，但并不限定于这些。或者，抗体也可以被冷冻干燥(冻干)、并在需要时通过添加如上所述的缓冲水溶液进行重组后使用。作为给药形态，可以列举利用片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等的口服给药、或利用注射剂(皮下注射、静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射等)经皮、经粘膜、经鼻、经肺、栓剂等的非口服给药。可以利用本发明的医药组合物的制剂单独给药，也可以与其他的药剂联合使用。

本发明的红细胞增多症治疗药的给药量因症状、年龄、体重等而不同，通常在口服给药中，作为抗体的量，对于成人为1日约0.01mg～1000mg，可以1次或分数次给药这些量。另外，在非口服给药中，可以通过皮下注射、肌肉注射或静脉注射1次给药约0.01mg～1000mg。

利用以下的实施例对本发明更详细地进行说明，但本发明并不受实施例的限定。

实施例

在以下的实施例中，使用了国际公开WO2014/073641号公报的0090和0091段所记载的TfR436抗体。

将TfR436抗体的CDR序列显示如下。

VH CDR1：SYGMH(序列号1)

VH CDR2：VISYDGSNKYYADSVKG(序列号2)

VH CDR3：DSNFWSGYYSPVDV(序列号3)

VL CDR1：TRSSGSIASNSVQ(序列号4)

VL CDR2：YEDTQRPS(序列号5)

VL CDR3：QSYDSAYHWV(序列号6)

将TfR436抗体的VH序列和VL序列显示如下。

TfR436 VH(序列号7)

DVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFPFKSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRGEDTAVYYCARDSNFWSGYYSPVDVWGQGTTVTVSS

TfR436 VL(序列号8)

NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNSVQWYQQRPGSAPITVIYEDTQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLQTEDEADYYCQSYDSAYHWVFGGGTKLAVL

实施例1：TfR436抗体的结合部位的鉴定

TfR436抗体与小鼠TfR没有交叉反应，但与仓鼠TfR显示交叉反应性。对TfR中的转铁蛋白(Transferrin，TF)结合部位(第569～760位的氨基酸)的氨基酸序列进行比对。选出在人TfR序列中与仓鼠相同而与小鼠不同的氨基酸。如图1所示那样对所选出的氨基酸进行点突变(point mutation)，制作可溶性TfR突变片段(TfR mutant fragment)。(1)可溶性野生型TfR(wild type TfR，sTfR)和TfR突变片段(TfR mutant fragment)(MF1～MF7)的制作

全合成编码人TfR细胞外区域(第89～760位的氨基酸)或图1所示的各TfR突变片段(MF1～MF7)和AAARGGPEQKLISEE DLNSAVDHHHHHH(序列号10)的碱基序列。向表达载体pCAGGS(非专利文献2.：Niwa et al.1991)导入新霉素耐受性基因和DHFR基因，向所得到的载体的多克隆位点插入分别合成的基因，制作pCAGGS-Neo-DHFR-sTFR-myc-his表达质粒。使用Expifectamine(Invitrogen)向Expi293细胞(Invitrogen)转染上述质粒，以37℃、8％CO₂、135rpm培养5天。之后，通过离心回收培养上清液，将HisTrapHP(GE Healthcare)柱与AKTA prime(GE Healthcare)连接，结合缓冲液使用20mM咪唑/DPBS，洗脱缓冲液使用500mM咪唑/DPBS，对sTfR或MF1～MF7进行精制。洗脱得到的蛋白质利用Zeba spin column(Thermo scientific)以30mM HEPES、5％海藻糖、pH7.2进行缓冲液交换。

(2)TfR436抗体的结合部位的鉴定

利用PBST(含吐温20的磷酸盐缓冲液，TaKaRa)稀释上述所精制的sTfR或MF1～MF7，从600ng/mL稀释3倍，以7个阶段进行制备。之后，以100μL/孔将稀释液分别注入Ni-NTAHisSorb Strips 96孔板(QIAGEN)，置于振动器上，室温下进行反应。1小时后用PBSTBuffer清洗5次，以100μL/孔分别注入TfR436抗体(1ug/mL)，置于振动器上，室温下反应1小时。之后，用PBS-T Buffer清洗5次，以100μL/孔分别注入50,000倍稀释后的二次抗体F(ab’)₂Fragment Anti-Human IgG Fcγ(Jackson Immuno Research)，室温下反应1小时。用PBST Buffer清洗5次后，以100μL/孔分别注入TMB Soluble Reagent(HighSensitivity)(Scy Tek)，室温下在暗处反应3分钟后，以100μL/孔添加TMB Stop Buffer(Scy Tek)，在振动器上振荡1分钟，利用酶标仪测定450n(ref.620nm)的吸光度。

结果如图2所示，关于TfR436抗体，看到了与TfR突变片段MF5的反应性下降，但没有看到与其他的突变片段的反应性下降。即，将TfR的第629位、第630位、第633位的氨基酸置换成其他的氨基酸时，TfR436抗体与TfR无法识别。提示了氨基酸第629位～第633位为TfR436抗体的识别表位。

实施例2：TfR436抗体和比较用抗体的Tf-TfR结合抑制的比较

(1)比较用抗体A24的制作

在专利文献US2008/0193453记载了针对TfR的A24抗体。为了将TfR436抗体与该抗体进行比较，获得所保藏的杂交瘤(Hybridoma)，生产抗体。具体而言，将杂交瘤加入RPMI1640(GIBCO)、FBS 10％的培养基中，使得细胞浓度成为1～2×10⁵/mL，在37℃的5％CO₂培养箱内进行培养。扩大培养后，通过离心回收细胞，用PBS清洗2次后，在无血清培养基cosmedium005(Cosmobio)、0.5％Nutridoma-CS(Roche)中进一步扩大培养至550mL。细胞开始汇合5天后，通过离心回收培养上清液。

将所回收的上清液加载于蛋白A载体(Ab-Capcher ExTra：Protenova公司)，利用0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH 2.7)洗脱与蛋白A结合的抗体，用1M Tris盐酸缓冲液(pH 8.5)快速中和。之后，使用Ultracel超滤盘(Merck Millipore)与PBS进行缓冲液交换。

(2)TfR436抗体与其他公司抗体的Tf-TfR结合抑制的比较

利用PBST将实施例1所记载的sTfR调整成5.0μg/mL，以100μL/孔将稀释液分别注入MaxiSorp 96孔板(Nunc)，以4℃静置一晩进行固相化。第二日舍弃固相液，以100％BLOCKACE(DS Pharma Biomedical)200μL/孔在室温下静置，进行封闭。1小时后，用PBST Buffer清洗5次后，分别注入HRP标记后的Tf(2ug/mL)50μL/孔，再以50μL/孔添加TfR436抗体、A24抗体(由10μg/mL稀释2倍系列)或holo-Tf(Sigma)(由300μg/mL稀释2倍系列)。室温下反应1小时后，用PBST Buffer清洗5次，以100μL/孔分别注入TMB可溶性底物(HighSensitivity)，室温下在暗处进行反应。25分钟后，以100μL/孔添加TMB反应终止缓冲液，在振动器上振荡1分钟，利用酶标仪测定450nm(ref.620nm)的吸光度。

结果如图3所示，TfR436抗体以非常低的用量(100ng/mL)完全抑制了Tf-TfR的结合。另一方面，A24抗体即使以10μg/mL的用量也无法完全抑制Tf-TfR的结合，只能够抑制50％Tf-TfR的结合。教导了TfR436抗体在Tf-TfR的结合抑制中TfR436抗体优异。

实施例3：来自PV患者的造血干细胞的EPO非依赖性有核红细胞分化抑制效果

来自PV患者的造血干细胞的特征在于：在不存在促红细胞生成素(EPO)的情况下也能够形成BFU-E、CFU-E。研究TfR436对这些细胞集落形成的抑制活性。

(1)PBMC分离

对于放血后的PV患者的末梢血，向3根50mL离心管中分别注入末梢血20mL，添加等量的PBS(Gibco)并混合。向新的4根50mL离心管中分别注入LymphoSep、淋巴细胞分离液(Lymphocyte Separation Media，MP Biomedicals^TM)15mL，缓慢添加用PBS稀释后的末梢血各30mL，以1,500rpm、30分钟、在室温下进行离心。离心后，除去上清液的血浆，用移液管采取PBMC层，悬浮在PBS+2％FBS(Gibco)20mL中。再以1350rpm、10分钟、在室温下进行离心，除去上清液，悬浮在IMDM(Nacalai tesque)+2％FBS1～5mL中。使用0.2％台盼蓝对细胞数进行计数，利用IMDM+2％FBS调制至2×10⁶/mL。

(2)细胞集落分析(Colony assay)

作为TfR436和阴性对照，分别使用IMDM+2％FBS稀释人IgG1抗体至抗体浓度10～1000mg/mL而制备。向7根14mL圆瓶管中分别注入MethoCult^TMH4534 Classic WithoutEPO(STEMCELL TECHNOLOGIES)3mL后，添加上述所制备的PBMC 300μL。再添加抗体稀释液或IMDM2％+FBS 3.3μL(对照)并完全混合。之后，在2块35mm培养皿中各接种1mL。将其在37℃、5％CO₂培养箱内培养14天。利用显微镜观察培养后的35mm培养皿，对所形成的BFU-E或CFU-E的细胞集落数进行计数，算出相对于不添加抗体培养的细胞集落数的形成率。其结果，通过添加100ng/mL以上的TfR436，几乎完全抑制了有核红细胞菌落形成(表1)。

[表1]

表1：TfR436对来自PV患者的造血干细胞有核红细胞集落形成的抑制

实施例4：正常有核红细胞的增殖抑制效果

以37℃溶解冷冻的CD34阳性细胞(POIETICS)后，悬浮在IMDM(GIBCO)+30％FBS(Sigma-Aldrich)、100U/ml DNase(QIAGEN)中，按照制造商的指示复苏细胞。之后，在SF-03培养基(Eidia株式会社)中添加了2-ME(50μmol/L)(GIBCO)、hIL-3(100U/ml)(Miltenybiotec)、hEPO(4U/ml)(Roche)、hSCF(50ng/ml)(Peprotech)的培养液中将细胞调制为5×10⁴/ml，以1ml/孔分别注入24孔板，在37℃、5％CO₂培养箱内进行培养。7天后，将细胞放入96孔板，添加0.15ng/mL～10μg/mL的抗体进行培养。抗体无添加孔为对照。96小时后，用移液器仔细搅拌各孔，将细胞液150μl移至V底板，将其20μl吸引至FACS Calibur，测定细胞数。将所得到的细胞数的10倍作为每孔的细胞数，并将对照平均值作为100％，算出各浓度的增殖率。其结果，TfR436抑制了有核红细胞的增殖(图4)。GI₅₀为125ng/mL。

实施例5：来自HYDREA(注册商标)给药患者的造血干细胞的有核红细胞集落形成的抑制

作为来自PV患者的造血干细胞，使用来自HYDREA(注册商标)给药患者的造血干细胞，按照与实施例3相同的方法，研究TfR436对有核红细胞集落形成的抑制活性。其中，HYDREA(注册商标)作为羟基脲(Hydroxycarbamide，也称为hydroxyurea)，1日分1～3次向患者口服给药500mg～2000mg。其结果，通过添加100ng/mL以上的TfR436，抑制了有核红细胞集落形成(表2)。

[表2]

表2：TfR436对来自HYDREA(注册商标)给药患者的造血干细胞的有核红细胞集落形成的抑制

实施例6：TfR436和羟基脲的联合使用效果

利用RPMI-1640(Sigma-Aldrich)+10％FBS(Sigma-Aldrich)+1％PenStrep(gibco)培养基培养HEL细胞，并利用该培养基调整至20000cells/mL。称量羟基脲(和光纯药)后，利用注射用蒸馏水(大塚制药)溶解至100mM浓度。以100μL/孔将细胞调整液接种于96孔板(Thermo SCIENTIFIC)，将利用上述培养基调整至最终浓度的4倍浓度的TfR436(150、300、600、1200ng/mL)和羟基脲(125、250、500、1000μM)50μL添加在单独或联合使用的孔中。然后，向药剂单独的孔中添加培养基50μL，向细胞增殖对照的孔中添加培养基100μL。将其在37℃、5％培养箱内培养72小时。

一边用移液管从培养后的板中吸移各孔的培养细胞，一边分别注入V底板(Costar)100μL，再添加用FACS Buffer(自制，添加1％BSA、2mM EDTA、0.1％NaN₃的PBS)稀释至20倍的PI(BD)溶液10μL。将其置于FACS Calibur(BD)的HTS，吸引各孔的细胞20μL，测定FL2的荧光和细胞数。根据所得到的结果，算出活细胞(PI阴性)和死细胞(PI阳性)数，算出活性(Viability)(PI阴性细胞/总细胞数×100)％，接着算出细胞死亡率(100-Viability)％。另外，将细胞增殖对照的活细胞数作为100％，算出此时的各孔的增殖率。将计算结果示于表3和4。关于细胞死亡率和增殖率，将各药剂单独的结果相加得到的数值作为累加效应，将获得其以上的细胞增殖抑制和细胞死亡率的情况作为协同效应。如表3所示，关于半数以上的联合使用，确认了协同的细胞增殖抑制效果。另外，关于细胞死亡率，在除TfR436和羟基脲各自最低浓度以外的全部的联合使用中，确认了协同的细胞死增强效果(表4)。

[表3]

表3 PPMX-T003和羟基脲的联合使用效果

细胞增殖抑制率

[表4]

表4 PPMX-T003和羟基脲的联合使用效果

细胞死亡率

表中的(A)表示单剂的增殖抑制或细胞死亡的比率，(B)表示超过累加效应(单剂的抑制率合计)的组合(协同效应)，(C)表示协同效应超过100％的组合。

序列表

<110> 株式会社英仙蛋白质科学

<120> 红细胞增多症治疗药

<130> F20672A-WO

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人

400> 3

Asp Ser Asn Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Ser Pro Val Asp Val

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人

<400> 4

Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Ser Val Gln

1 5 10

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人

<400> 5

Tyr Glu Asp Thr Gln Arg Pro Ser

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人

<400> 6

Gln Ser Tyr Asp Ser Ala Tyr His Trp Val

1 5 10

<210> 7

<211> 123

<212> PRT

<213> 人

<400> 7

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Lys Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Asn Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Ser Pro Val Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 人

<400> 8

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn

20 25 30

Ser Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Ile Thr Val

35 40 45

Ile Tyr Glu Asp Thr Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly

65 70 75 80

Leu Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser

85 90 95

Ala Tyr His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ala Val Leu

100 105 110

<210> 9

<211> 760

<212> PRT

<213> 人

<400> 9

Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu

1 5 10 15

Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp

20 25 30

Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala

35 40 45

Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly

50 55 60

Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly

65 70 75 80

Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr

85 90 95

Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro

100 105 110

Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys

115 120 125

Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile

130 135 140

Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln

145 150 155 160

Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe

165 170 175

Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val

180 185 190

Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg

195 200 205

Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys

210 215 220

Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys

225 230 235 240

Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile

245 250 255

Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu

260 265 270

Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe

275 280 285

Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly

290 295 300

Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln

305 310 315 320

Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr

325 330 335

Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp

340 345 350

Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser

355 360 365

Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile

370 375 380

Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp

385 390 395 400

His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala

405 410 415

Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met

420 425 430

Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile

435 440 445

Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr

450 455 460

Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr

465 470 475 480

Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val

485 490 495

Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn

500 505 510

Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp

515 520 525

Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe

530 535 540

Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp

545 550 555 560

Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu

565 570 575

Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu

580 585 590

Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn

595 600 605

Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp

610 615 620

Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln

625 630 635 640

Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu

645 650 655

Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys

660 665 670

Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro

675 680 685

Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser

690 695 700

Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys

705 710 715 720

Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala

725 730 735

Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp

740 745 750

Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe

755 760

<210> 10

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组标签

<400> 10

Ala Ala Ala Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp

1 5 10 15

Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His

20 25

Claims

1.识别人转铁蛋白受体的第629位～第633位的氨基酸的抗体在制造红细胞增多症治疗药中的应用，其中，所述抗体是重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VHCDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3，并且轻链第一互补决定区(VLCDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)、轻链第三互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：

红细胞增多症为真性红细胞增多症。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述红细胞增多症治疗药与其他的红细胞增多症治疗方法联合使用。

4.如权利要求1～3中任一项所述的应用，其特征在于：所述抗体是重链具有序列号7且轻链具有序列号8的抗体。

5.如权利要求1～4中任一项所述的应用，其特征在于：抗体为人抗体或人源化抗体。

6.如权利要求1～5中任一项所述的应用，其特征在于：

抗体为选自Fab、Fab'、F(ab')₂、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(Diabody)、二硫化物稳定化V区(dsFv)和包含CDR的肽中的抗体片段。

7.如权利要求1～6中任一项所述的应用，其特征在于：所述红细胞增多症治疗药与羟基脲联合使用。