CN115811987A - 抗神经酰胺抗体 - Google Patents

抗神经酰胺抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN115811987A
CN115811987A CN202180034154.0A CN202180034154A CN115811987A CN 115811987 A CN115811987 A CN 115811987A CN 202180034154 A CN202180034154 A CN 202180034154A CN 115811987 A CN115811987 A CN 115811987A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
antigen
binding fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180034154.0A
Other languages
English (en)
Inventor
R·科莱斯尼克
A·廷克伦贝格
J·K-M·王
Y·吴
Y·王
R·利维
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cerlatec Holdings Ltd
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Original Assignee
Cerlatec Holdings Ltd
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cerlatec Holdings Ltd, Memorial Sloan Kettering Cancer Center filed Critical Cerlatec Holdings Ltd
Publication of CN115811987A publication Critical patent/CN115811987A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本公开文本提供了抗神经酰胺抗体及其抗原结合片段的组合物。本公开文本进一步提供了预防或抑制有需要的受试者的细胞死亡的方法，所述方法包括向受试者施用所述抗神经酰胺抗体或抗原结合片段。所述有需要的受试者能够患有自身免疫病、GI综合征或GvHD。

Description

抗神经酰胺抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年3月18日提交的美国临时申请号62/991,232的优先权，将其内容通过引用以其整体并入本文。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供并且通过引用特此并入本说明书中。序列表的计算机可读格式拷贝：文件名：CERA-012_01WO_ST25.txt，记录日期：2021年3月17日，文件大小68.1千字节。
技术领域
本公开文本总体上涉及抗神经酰胺抗体及其使用方法。具体而言，本公开文本涉及抑制细胞死亡的人源化抗神经酰胺抗体。此类抗体可用于治疗和预防胃肠综合征、移植物抗宿主病和自身免疫病。
背景技术
急性辐射综合征(Acute Radiation Syndrome，ARS)(有时称为辐射中毒或辐射病)是一种由在很短的时间内身体的很大一部分被高剂量的贯穿辐射(例如，高能X射线、伽马射线和中子)辐照引起的急性病。由于由辐射诱导的细胞死亡引起的胃肠道和骨髓的具破坏性且不可修复的变化，出现这种综合征极不可能存活。
辐射是治疗癌症最有效的工具之一。不幸的是，放疗的不良副作用在于骨髓、毛囊、表皮和胃肠道的健康细胞对辐射诱导的细胞死亡极为敏感。其他类型的癌症策略(如骨髓移植)在宿主体内引发有破坏性的免疫应答，导致移植物排斥或移植物抗宿主病(GvHD)。
因此，迫切需要替代策略来减少与辐射GI综合征和GvHD相关的细胞死亡的发生。
发明内容
本公开文本提供了抗神经酰胺抗体及其抗原结合片段的组合物。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体及其抗原结合片段是人源化的。在其他实施方案中，所述抗神经酰胺抗体及其抗原结合片段是scFv。在一些实施方案中，本公开文本进一步提供了预防或抑制有需要的受试者的细胞死亡的方法，所述方法包括向所述受试者施用所述抗神经酰胺抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述受试者患有自身免疫病、GI综合征或GvHD。
在一些实施方案中，本公开文本提供了一种抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述VH包含重链互补决定区(CDR)1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)和重链CDR3(HCDR3)，所述VL包含轻链互补决定区(CDR)1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)，其中：(a)所述HCDR1包含选自SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列；(b)所述HCDR2包含选自SEQ ID NO:3、4、5和6的氨基酸序列；(c)所述HCDR3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(d)所述LCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(e)所述LCDR2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；并且(f)所述LCDR3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，所述HCDR1包含SEQ ID NO:2，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，所述HCDR1包含SEQ ID NO:2，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，所述HCDR1包含SEQ ID NO:2，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，所述HCDR1包含SEQ ID NO:2，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:6。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:17至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
在一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:17至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:23组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:17至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:18至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:18至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:23组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:18至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:19至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:19至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:23组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:19至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:20至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:20 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:20组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:21至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:21 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:21组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
在一些实施方案中，本公开文本提供了一种抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与选自SEQ ID NO:17、18、19、20和21的序列至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列；并且其中所述VL包含与选自SEQ ID NO:22、23和24的序列至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:17至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ IDNO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:17至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ IDNO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:23组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:17至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ IDNO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:18至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ IDNO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:18至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ IDNO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:23组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:18至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ IDNO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:19至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ IDNO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:19至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ IDNO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:23组成。
在一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:19至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:24 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:20至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:20 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ IDNO:20组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:21至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含与SEQ ID NO:21 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH氨基酸序列由SEQ IDNO:21组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是人源化的。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是全人的。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体在所述抗体的Fc结构域中包含一个或多个点突变。
在一些实施方案中，所述抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，所述scFv包含与选自SEQ ID NO:48-61的序列至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scFv包含与选自SEQ ID NO:48-61的序列100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scFv由选自SEQ ID NO:48-61的序列组成。
在一些实施方案中，所述scFv的轻链可变区在所述scFv的重链可变区的羧基末端。在一些实施方案中，所述scFv的轻链可变区在所述scFv的重链可变区的氨基末端。
在一些实施方案中，所述scFv包含接头多肽。在一些实施方案中，所述接头多肽在所述scFv的轻链可变区与重链可变区之间。在一些实施方案中，所述接头多肽包含Gly4Ser接头。在一些实施方案中，所述接头多肽包含式(Gly4Ser)n，其中n＝1-5。
在一些实施方案中，本公开文本提供了一种抗神经酰胺单链可变片段(scFv)，所述抗神经酰胺scFv包含与选自SEQ ID NO:48-61的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scFv包含与选自SEQ IDNO:48-61的序列100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scFv由选自SEQ ID NO:48-61的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本公开文本提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本文所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开文本提供了一种抗神经酰胺单链可变片段(scFv)，所述抗神经酰胺scFv包含与SEQ ID NO:48或51至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NO:48或51100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scFv由SEQ ID NO:48或51的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本公开文本提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本文所述的抗神经酰胺单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种表达载体，所述表达载体包含所述多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开文本提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本文所述的多核苷酸或表达载体。
在一些实施方案中，本公开文本提供了一种制造本文所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段或者本文所述的抗神经酰胺单链可变片段(scFv)的方法，所述方法包括将根据实施方案98所述的表达载体引入宿主细胞中。
在一些实施方案中，本公开文本提供了一种抑制有需要的受试者的细胞凋亡的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段或者本文所述的抗神经酰胺单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，所述细胞凋亡与选自移植物抗宿主病、辐射病、GI综合征和自身免疫病的疾病相关。在一些实施方案中，所述疾病是辐射病或GI综合征，并且在所述受试者暴露于辐射前施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述疾病是移植物抗宿主病，并且在所述受试者接受移植前施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述移植是骨髓移植。
在一些实施方案中，将所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段静脉内、肌内、腹膜内、脑脊髓内(intracerobrospinally)、皮下、滑膜内、鞘内、口服、局部或经由吸入施用。
在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于减轻患有GI综合征的受试者的细胞凋亡的方法，所述方法包括在所述受试者暴露于贯穿辐射后，向所述受试者施用有效量的根据实施方案1-89中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段或者根据实施方案94-96中任一项所述的抗神经酰胺scFv。在一些实施方案中，在所述受试者暴露于贯穿辐射后立即施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，在所述受试者暴露于贯穿辐射后24小时内施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于抑制患有GvHD的受试者的细胞凋亡的方法，所述方法包括在所述受试者接受移植前或在所述受试者接受移植后在GvHD发病前，向所述受试者施用有效量的根据实施方案1-89中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段或者根据实施方案94-96中任一项所述的抗神经酰胺scFv。在一些实施方案中，所述移植是骨髓移植。
附图说明
附图说明了本公开文本的一个或多个实施方案，并且与书面描述一起用于解释本公开文本的示例性实施方案的原理。
图1示出了在6B5 scFv的浓度渐增的情况下T细胞中CD28诱导的富神经酰胺平台(ceramide-rich platform，CRP)形成的剂量-反应曲线。
图2A示出了在人源化6B5 scFv的浓度渐增的情况下辐射诱导的T细胞的细胞凋亡的剂量-反应曲线。
图2B示出了在VH4-VL1、VH5-VL1和亲本鼠6B5 scFv的浓度渐增的情况下辐射诱导的T细胞的细胞凋亡的剂量-反应曲线。
图2C示出了在VH4-VL1、VH5-VL1和亲本鼠6B5 scFv的浓度渐增的情况下辐射诱导的T细胞的细胞凋亡的剂量-反应曲线。
图2D示出了在VH4-VL1和VH5-VL1的浓度渐增的情况下辐射诱导的T细胞的细胞凋亡的剂量-反应曲线。
图2E示出了在VH4-VL1和VH5-VL1的浓度给定的情况下辐射诱导的凋亡T细胞的百分比。
图3A示出了在暴露于15戈瑞单位(Gy)的LD90剂量的小鼠中每个绒毛的凋亡内皮细胞的数量随时间的变化。与符号相邻的数字表示每个时间点测量的动物的数量。Gy，吸收辐射的戈瑞单位。
图3B示出了在暴露于15戈瑞单位(Gy)的LD90剂量并且在辐照后24小时不做处理或用VH2-VL1(SEQ ID NO:51)处理的小鼠中每个绒毛的凋亡内皮细胞的数量随时间的变化。与符号相邻的数字表示每个时间点测量的动物的数量。Gy，吸收辐射的戈瑞单位。
图4A示出了人源化VH区的氨基酸序列比对。CDR加下划线。不同于亲本鼠CDR序列的CDR氨基酸以粗体示出。不同于人种系框架序列的框架区氨基酸以粗体示出。
图4B示出了人源化VL区的氨基酸序列比对。CDR加下划线。
具体实施方式
在下面的所附说明书中阐述了本公开文本的细节。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本公开文本的实践或测试，但现在描述说明性方法和材料。根据说明书和权利要求，本公开文本的其他特征、目标和优点将变得清楚。在说明书和所附权利要求中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式也包括复数。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本公开文本所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。将在本说明书中引用的所有专利和出版物都通过引用以其整体并入本文。
定义
术语“抗体”是指能够通过位于免疫球蛋白(Ig)分子的可变区中的至少一个表位识别位点与特异性靶标(如碳水化合物、多核苷酸、脂质或多肽)结合的Ig分子。如本文所用，所述术语涵盖完整的多克隆抗体或单克隆抗体及其抗原结合片段。例如，天然免疫球蛋白分子由两个重链多肽和两个轻链多肽构成。每个重链多肽通过在重链多肽与轻链多肽之间的链间二硫键与轻链多肽缔合，以形成两个异二聚体蛋白或多肽(即，由两条异源多肽链构成的蛋白质)。然后这两个异二聚体蛋白通过在重链多肽之间的另外的链间二硫键缔合，以形成免疫球蛋白蛋白质或多肽。
如本文所用的术语“抗原结合片段”是指含有免疫球蛋白重链和/或轻链的至少一个互补决定区(CDR)的多肽片段，所述至少一个CDR与目的抗原的至少一个表位结合。在这方面，本文描述的抗体的抗原结合片段可以包含来自特异性结合神经酰胺的抗体的可变重链(VH)序列和可变轻链(VL)序列的1、2、3、4、5个或所有6个CDR。抗原结合片段包括包含全长抗体的一部分(通常是其抗原结合区或可变区)的蛋白质，如Fab、F(ab')2、Fab'、Fv片段、微型抗体、双抗体、单结构域抗体(dAb)、单链可变片段(scFv)、由抗体片段形成的多特异性抗体以及包含具有所需特异性的抗原结合位点或片段的任何其他经修饰的构型的免疫球蛋白分子。在本公开文本的某些实施方案中，使用抗原结合片段而不是完整抗体来增加组织穿透性或肿瘤穿透性。在其他实施方案中，对抗原结合片段进行进一步修饰以增加血清半衰期。
术语“F(ab)”是指由酶木瓜蛋白酶对IgG分子进行蛋白水解切割而产生的两个蛋白质片段。每个F(ab)包含VH链和VL链的共价异二聚体，并且包括完整的抗原结合位点。每个F(ab)是单价抗原结合片段。术语“Fab'”是指源自F(ab')2的片段，并且可以含有Fc的一小部分。每个Fab'片段是单价抗原结合片段。
术语“F(ab')2”是指通过酶胃蛋白酶的蛋白水解切割而产生的IgG的蛋白质片段。每个F(ab')2片段包含两个F(ab')片段，因此是二价抗原结合片段。
“Fv片段”是指非共价VH::VL异二聚体，其包括保留天然抗体分子的大部分抗原识别和结合能力的抗原结合位点，但是缺少Fab内所含的CH1结构域和CL结构域。Inbar等人(1972)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 69:2659-2662；Hochman等人(1976)Biochem15:2706-2710；以及Ehrlich等人(1980)Biochem 19:4091-4096。在一些实施方案中，可以通过IgM的优先蛋白水解切割，以及在极少情况下通过IgG或IgA免疫球蛋白分子的优先蛋白水解切割而产生Fv片段。然而，Fv片段更通常是使用本领域已知的重组技术来衍生的。
本文还包括包含连接到CH3结构域的scFv的微型抗体(S.Hu等人,Cancer Res.,56,3055-3061,1996)。参见例如，Ward,E.S.等人,Nature 341,544-546(1989)；Bird等人,Science,242,423-426,1988；Huston等人,PNAS USA,85,5879-5883,1988；PCT/US92/09965；WO94/13804；P.Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448,1993；Y.Reiter等人,Nature Biotech,14,1239-1245,1996；S.Hu等人,Cancer Res.,56,3055-3061,1996。
术语“双抗体”是指双特异性抗体，其中VH结构域和VL结构域使用接头在单条多肽链中表达，所述接头太短以致不允许在同一条链上的这两个结构域之间配对，从而迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如，Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-48(1993)以及Poljak等人,Structure2:1121-23(1994))。
术语“纳米抗体”或“单结构域抗体”是指由单个单体可变抗体结构域组成的抗原结合片段。纳米克隆(Nanoclone)方法是基于对B细胞的自动高通量选择来产生针对所需靶标的纳米抗体的方法。(参见WO 2006/079372)
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本同质的抗体的群体(即，除了可能少量存在的可能自然发生的突变之外，构成所述群体的单独抗体是相同的)获得的抗体。
在一些实施方案中，如本文所用的术语“嵌合抗体”是指单克隆抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的对应序列相同或同源，而所述一条或多条链的剩余部分与源自另一种物种或属于另一种抗体类别或子类的抗体中的对应序列相同或同源；以及此类抗体的片段，只要它们展现出所需的生物活性即可。
术语“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白，所述可变区用十至约25个氨基酸的短接头肽连接。Huston等人(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85(16):5879-5883。接头可以连接VH的N末端与VL的C末端，或反之。已经描述了许多方法来辨识用于将来自抗体V区的天然聚集但化学分离的轻多肽链和重多肽链转化为scFv分子的化学结构，所述scFv分子会折叠成基本上类似于抗原结合位点结构的三维结构。参见例如，Huston等人的美国专利号5,091,513和5,132,405；以及Ladner等人的美国专利号4,946,778。
术语“抗原”是指如下分子或分子的一部分，其能够被抗体或其抗原结合片段结合并且另外能够被用于动物中以产生能够与该抗原的表位结合的抗体。抗原可以具有一个或多个表位。本文的实施方案考虑使用神经酰胺或与半抗原缀合的神经酰胺作为抗原。
术语“表位”是指抗体所结合的抗原区域。表位决定簇可以包括分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。
在本文中，术语“特异性结合”是指抗体或其抗原结合片段以至少105M-1的结合亲和力(Ka)结合靶抗原而不显著结合混合物中存在的其他组分或抗原的能力。在本文中提及抗神经酰胺抗体是指与神经酰胺特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
结合亲和力(Ka)是指以1/M或M-1为单位表示的特定相互作用的平衡缔合。抗体或其抗原结合片段可以被分类为“高亲和力”抗体或其抗原结合片段以及“低亲和力”抗体或其抗原结合片段。“高亲和力”抗体或其抗原结合片段是指具有至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1或至少1013M-1的Ka的那些抗体或其抗原结合片段。“低亲和力”抗体或其抗原结合片段是指具有高达107M-1、高达106M-1、高达105M-1的Ka的那些抗体或其抗原结合片段。可替代地，亲和力可以被定义为以M为单位(例如，10-5M至10-13，或约500nM、约300nM、约250nM、约200nM、约150nM、约100nM、约50nM、约25nM、约10nM或约5nM)的特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)。根据本公开文本的结合结构域多肽和单链多肽的亲和力可以使用常规技术容易地确定(参见例如，Scatchard等人(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660；以及美国专利号5,283,173、5,468,614或等同专利)。
“保守取代”在本领域中被认为是一种氨基酸对另一种具有类似特性的氨基酸的取代。示例性保守取代是本领域熟知的(参见例如，PCT申请公开号WO 97/09433,第10页,1997年3月13日公开；Lehninger,Biochemistry,第二版；Worth Publishers,Inc.NY:NY(1975),第71-77页；Lewin,Genes IV,Oxford University Press,NY and Cell Press,Cambridge,MA(1990),第8页)。
如本文所用，术语“衍生物”涉及通过化学手段或生物手段(用或不用酶)，例如通过糖基化、烷基化、酰化、酯形成或酰胺形成对肽的一个或多个氨基酸残基进行修饰。
如本文所用，衍生出另一种多肽或多核苷酸的多肽或多核苷酸被称为“亲本”或“参考”多肽或多核苷酸。例如，人源化抗体可以源自亲本鼠抗体。
如本文所用的术语“变体(variant)”或“变体(variants)”是指具有不同于参考多核苷酸或多肽的序列的序列但保留亲本多核苷酸或多肽的本质特性的多核苷酸或多肽。通常，变体多核苷酸或多肽序列与亲本多核苷酸或多肽总体上密切类似，并且在许多区域中与其相同。例如，与亲本多核苷酸或多肽相比，变体多核苷酸或多肽可以展现出至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性。
如本文所用，术语“序列同一性”是指两个或更多个多核苷酸序列之间或者两个或更多个多肽序列之间的关系。当一个序列中的位置被比较序列的对应位置的相同核酸碱基或氨基酸残基占据时，称所述序列在该位置处是“相同的”。通过确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量以得到相同位置的数量来计算序列同一性百分比。然后将相同位置的数量除以比较窗口中的位置总数并乘以100以得到序列同一性的百分比。通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定序列同一性的百分比。多核苷酸序列的比较窗口的长度可以是例如至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个或更多个核酸。多肽序列的比较窗口的长度可以是例如至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300个或更多个氨基酸。为了最佳比对序列以进行比较，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列部分可以包含添加或称为空位的缺失，而参考序列保持不变。最佳比对是如下比对，即使具有空位，其也在参考序列与比较序列之间产生最大可能数量的“相同”位置。两个序列之间的“序列同一性”百分比可以使用程序“BLAST 2Sequences”的可自2004年9月1日起从国家生物技术信息中心获得的版本来确定，所述程序并入了程序BLASTN(用于核苷酸序列比较)和BLASTP(用于多肽序列比较)，这些程序基于Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(12):5873-5877,1993)的算法。当利用“BLAST 2 Sequences”时，对于字长(3)、开放空位罚分(11)、延伸空位罚分(1)、空位下降(dropoff)(50)、期望值(10)和任何其他所需参数(包括但不限于矩阵选项)可以使用作为自2004年9月1日起的默认参数的参数。如果两个核苷酸或氨基酸序列相对于彼此具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，则认为这两个序列具有“基本上类似的序列同一性”或“基本序列同一性”。
术语“基本上相同”是指含有足够数量的与第二多肽序列相同的氨基酸的多肽序列，使得第一多肽序列和第二多肽序列具有类似的活性。基本上相同的多肽在氨基酸序列方面至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％相同。
“Fc区”或“Fc结构域”是指对应于或源自抗体部分的多肽序列，所述部分能够与细胞上的Fc受体和/或补体的C1q组分结合，从而介导抗体的效应子功能。Fc代表“结晶片段”，即会容易形成蛋白质晶体的抗体片段。最初通过蛋白水解消化描述的不同蛋白质片段可以限定免疫球蛋白的总体一般结构。如文献中最初所定义，Fc区是包含两个多肽的同二聚体蛋白，所述多肽通过二硫键缔合，并且各自包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。然而，最近，所述术语已经应用于由CH3、CH2和铰链的至少一部分组成的单链单体组分，其足以与这样的第二链形成二硫化物连接的二聚体。因此，并且根据上下文，术语“Fc区”或“Fc结构域”的使用在本文中将指代二聚体形式或缔合以形成二聚体蛋白的单独单体。关于免疫球蛋白结构和功能的综述，参见Putnam,The Plasma Proteins,第V卷(Academic Press,Inc.,1987),第49-140页；以及Padlan,Mol.Immunol.31:169-217,1994。如本文所用，术语Fc结构域包括天然存在的序列的变体。
术语“免疫球蛋白恒定区”或“恒定区”是指对应于或源自免疫球蛋白的一个或多个恒定结构域(例如，CH1、CH2、CH3)的部分或全部的肽或多肽序列。在某些实施方案中，恒定区不包含CH1结构域。在某些实施方案中，构成恒定区的恒定结构域是人的。
术语“轻链可变区”(也称为“轻链可变结构域”或“VL”)和“重链可变区”(也称为“重链可变结构域”或“VH”)分别是指来自抗体轻链和抗体重链的可变结合区。可变结合区由离散的、明确定义的亚区构成，所述亚区被称为“互补决定区”(CDR)和“框架区”(FR)。
术语“免疫球蛋白轻链恒定区”(也称为“轻链恒定区”或“CL”)是来自抗体轻链的恒定区。
术语“免疫球蛋白重链恒定区”(也称为“重链恒定区”或“CH”)是指来自抗体重链的恒定区。根据抗体同种型，CH可进一步分为CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域(IgA、IgD、IgG)，或CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域(IgE、IgM)。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指免疫球蛋白(抗体)分子。每个可变结构域有三个CDR：轻链可变结构域中的CDR1、CDR2和CDR3，以及重链可变结构域中的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，“铰链”或“铰链区”是指源自免疫球蛋白铰链区并且位于本文所述的多肽中的抗原结合结构域(例如，神经酰胺结合结构域)与免疫球蛋白恒定区之间的多肽。“野生型免疫球蛋白铰链区”是指在抗体重链中发现的插入CH1结构域与CH2结构域(对于IgG、IgA和IgD)之间并且连接它们或者插入CH1结构域与CH3结构域(对于IgE和IgM)之间并且连接它们的天然存在的上部铰链氨基酸序列和中部铰链氨基酸序列。在某些实施方案中，野生型免疫球蛋白铰链区序列是人的，并且可以包含人IgG铰链区(例如，IgG1铰链区、IgG2铰链区、IgG3铰链区或IgG4铰链区)。
“经改变的免疫球蛋白铰链区”或“变体免疫球蛋白铰链区”是指与对应的亲本野生型免疫球蛋白铰链区相比具有一个或多个突变、取代、插入或缺失的铰链区多肽。通常，如美国专利申请公开号2013/0129723和2013/0095097中所披露，作为野生型免疫球蛋白铰链区片段的经改变的免疫球蛋白铰链区包含IgG核心铰链区(例如，包含序列C-X-X-C的多肽，其中X是任何氨基酸)。
如本文所用，术语“人源化”是指源自非人物种的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段保留原始非人抗体的抗原结合特性。在一些实施方案中，抗体的结合片段(例如，轻链可变区和重链可变区、Fab、scFv)是人源化的。非人抗原结合片段可以使用称为CDR移植(Jones等人,Nature 321:522(1986))的技术及其变体人源化，所述变体包括“重塑(reshaping)”(Verhoeyen等人,1988 Science 239:1534-1536；Riechmann等人,1988Nature 332:323-337；Tempest等人,Bio/Technol 1991 9:266-271)、“超嵌合(hyperchimerization)”(Queen等人,1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033；Co等人,1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873；Co等人,1992 J Immunol 148:1149-1154)以及“镶饰(veneering)”(Mark等人,“Derivation of therapeutically activehumanized and veneered anti-CD18 antibodies.”在:Metcalf BW,Dalton BJ编辑Cellular adhesion:molecular definition to therapeutic potential.New York:Plenum Press,1994:291-312)。如果源自非人来源，则抗体的其他区域(如铰链区结构域和恒定区结构域)也可以是人源化的。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指当使用本领域熟知的途径施用时，通常不产生过敏反应或其他严重不良反应的分子实体和组合物。由联邦政府或州政府的管理机构所核准的或者列于美国药典或其他公认药典中的用于在动物中使用、更特别地用于在人中使用的分子实体和组合物被认为是“药学上可接受的”。
如本文所提到的术语“多核苷酸”意指单链核酸聚合物或双链核酸聚合物。在某些实施方案中，构成多核苷酸的核苷酸可以是RNA或DNA或经修饰形式的任一类型的核苷酸(如经修饰的信使RNA)。所述修饰可以包括但不限于碱基修饰(如溴尿苷)、核糖修饰(如阿糖胞苷和2',3'-二脱氧核糖)以及核苷酸间连键修饰(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯(phosphoroamidate))。术语“多核苷酸”特别包括单链形式和双链形式的DNA。
如本文所用，“多肽”或“蛋白质”是指单一、线性且连续排列的共价连接的氨基酸。多肽可以形成一个或多个链内二硫键。术语多肽和蛋白质还涵盖两条多肽链以非线性方式(如经由链间二硫键)连接在一起的实施方案。在本文中，蛋白质或多肽可以是抗体或抗体的抗原结合片段。
如本文所用，术语“转化”、“转染”和“转导”是指将多聚核苷酸转移到细胞中。如本文所用，术语“遗传转化”是指将DNA(尤其是重组DNA)转移并且掺入到细胞中。所转移的核酸可以经由表达载体引入细胞中。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“改善”是指治疗性治疗或预防性(prophylactic/preventative)治疗。如果接受治疗的个体的疾病的至少一种症状改善，或者治疗可以延迟个体的进行性疾病的恶化或预防另外的相关疾病的发病，则治疗是治疗性的。
如本文所用，术语“LD90”是指“致死剂量90％”或“半数致死剂量”，并且是杀死90％的测试群体所需的物质的量。
如在本说明书和所附权利要求中所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。
如在本说明书中所用，除非另外指示，否则术语“和/或”在本公开文本中用于“和”或“或”。
贯穿本说明书，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”或变体(如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”)将被理解为意味着包括所陈述的要素或整数或者要素或整数的组，但是不排除任何其他要素或整数或者要素或整数的组。
抗神经酰胺抗体
本公开文本提供了与神经酰胺特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是人源化的。在其他实施方案中，所述抗神经酰胺抗体是人源化6B5 scFv抗体。
如本文所用的术语“神经酰胺”是指由鞘氨醇和脂肪酸构成的脂质第二信使分子。神经酰胺通过重组质膜和形成侧向有序液体微结构域(lateral liquid-orderedmicrodomain)(一种类型的称为“富神经酰胺平台”的“筏(raft)”)调节细胞内的应激信号传导。这些CRP充当聚集激活的受体分子(例如，TNF受体超家族的成员，包括Fas)的信号传导平台，从而提供最终导致信号传导放大和信号转导的前馈机制。CRP形成对于Fas介导的细胞死亡尤为重要，并且在靶细胞的质膜上的富神经酰胺区对于对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导的细胞死亡的敏感性至关重要。示例性神经酰胺是葡糖神经酰胺、半乳糖神经酰胺和神经节苷脂(寡糖连接的神经酰胺)。
在一些实施方案中，本公开文本提供了抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段与神经酰胺特异性结合并且包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述VH包含重链互补决定区(CDR)1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)和重链CDR3(HCDR3)，所述VL包含轻链互补决定区(CDR)1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)，其中所述HCDR1包含选自SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列；所述HCDR2包含选自SEQID NO:3、4、5和6的氨基酸序列；所述HCDR3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；所述LCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
示例性抗神经酰胺抗体的CDR在表1中示出。
表1：示例性抗神经酰胺抗体序列
Figure BDA0003934065150000111
Figure BDA0003934065150000121
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是scFv，所述scFv包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述VH包含重链互补决定区(CDR)1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)和重链CDR3(HCDR3)，所述VL包含轻链互补决定区(CDR)1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)，其中所述HCDR1包含选自SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列；所述HCDR2包含选自SEQ ID NO:3、4、5和6的氨基酸序列；所述HCDR3包含SEQID NO:7的氨基酸序列；所述LCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列；并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中(a)所述HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(b)所述HCDR2包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；(c)所述HCDR3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(d)所述LCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(e)所述LCDR2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；并且(f)所述LCDR3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中(a)所述HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(b)所述HCDR2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(c)所述HCDR3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(d)所述LCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(e)所述LCDR2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；并且(f)所述LCDR3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中(a)所述HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(b)所述HCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(c)所述HCDR3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(d)所述LCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(e)所述LCDR2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；并且(f)所述LCDR3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中(a)所述HCDR1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(b)所述HCDR2包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(c)所述HCDR3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(d)所述LCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(e)所述LCDR2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；并且(f)所述LCDR3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中(a)所述HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(b)所述HCDR2包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(c)所述HCDR3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(d)所述LCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(e)所述LCDR2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；并且(f)所述LCDR3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中(a)所述HCDR1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(b)所述HCDR2包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；(c)所述HCDR3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(d)所述LCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(e)所述LCDR2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；并且(f)所述LCDR3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中(a)所述HCDR1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(b)所述HCDR2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(c)所述HCDR3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(d)所述LCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(e)所述LCDR2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；并且(f)所述LCDR3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中(a)所述HCDR1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(b)所述HCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(c)所述HCDR3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(d)所述LCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(e)所述LCDR2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；并且(f)所述LCDR3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中(a)所述HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(b)所述HCDR2包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(c)所述HCDR3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(d)所述LCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(e)所述LCDR2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；并且(f)所述LCDR3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中(a)所述HCDR1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(b)所述HCDR2包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；(c)所述HCDR3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(d)所述LCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(e)所述LCDR2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；并且(f)所述LCDR3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中(a)所述HCDR1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(b)所述HCDR2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(c)所述HCDR3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(d)所述LCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(e)所述LCDR2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；并且(f)所述LCDR3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中(a)所述HCDR1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(b)所述HCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(c)所述HCDR3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(d)所述LCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(e)所述LCDR2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；并且(f)所述LCDR3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含VH链和VL链，其中所述VH链包含如下氨基酸序列或由其组成，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:17-21的氨基酸序列至少约85％％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含VH链和VL链，其中所述VL链包含如下氨基酸序列或由其组成，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:22-24的氨基酸序列至少约85％％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含VH链和VL链，其中所述VH链包含如下氨基酸序列或由其组成，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:17-21的氨基酸序列至少约85％％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同，并且所述VL链包含如下氨基酸序列或由其组成，所述氨基酸序列与选自SEQ IDNO:22-24的氨基酸序列至少约85％％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是scFv，所述scFv包含VH链和VL链，其中所述VH链包含如下氨基酸序列或由其组成，所述氨基酸序列与选自SEQID NO:17-21的氨基酸序列至少约85％％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同，并且所述VL链包含如下氨基酸序列或由其组成，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:22-24的氨基酸序列至少约85％％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同。
表2.示例性VH和VL氨基酸序列
Figure BDA0003934065150000141
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原片段包含SEQ ID NO:17的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:22的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原片段包含SEQ ID NO:17的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:23的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原片段包含SEQ ID NO:17的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:24的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原片段包含SEQ ID NO:18的VH氨基酸序列和SEQ IDNO:22的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原片段包含SEQ ID NO:18的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:23的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原片段包含SEQ ID NO:18的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:24的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原片段包含SEQ ID NO:19的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:22的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原片段包含SEQ ID NO:19的VH氨基酸序列和SEQID NO:23的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原片段包含SEQ ID NO:19的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:24的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原片段包含SEQ ID NO:20的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:22的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原片段包含SEQ ID NO:20的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:23的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原片段包含SEQ ID NO:20的VH氨基酸序列和SEQID NO:24的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原片段包含SEQ ID NO:21的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:22的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原片段包含SEQ ID NO:21的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:23的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原片段包含SEQ ID NO:21的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:24的VL氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:17至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VH氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:22至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含VH链和VL链，其中所述VH链氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:17至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VH氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:23至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含由17组成的VH氨基酸序列和由23组成的VL氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:17至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VH氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:24至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含VH链和VL链，其中所述VH链氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:18至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VH氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:22至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含VH链和VL链，其中所述VH链氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:18至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VH氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:23至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含VH链和VL链，其中所述VH链氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:23组成。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:18至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VH氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:24至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含VH链和VL链，其中所述VH链氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:19至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VH氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:22至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含VH链和VL链，其中所述VH链氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:19至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VH氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:23至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含VH链和VL链，其中所述VH链氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:23组成。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:19至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VH氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:24至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含VH链和VL链，其中所述VH链氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:20至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VH氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:22至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含VH链和VL链，其中所述VH链氨基酸序列由SEQ ID NO:20组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:21至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VH氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:22至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含VH链和VL链，其中所述VH链氨基酸序列由SEQ ID NO:21组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗原结合片段是scFv，所述scFv包含与SEQID NO:18至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VH氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:22至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％相同的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺scFv包含VH链和VL链，其中所述VH链氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQID NO:22组成。
在一些实施方案中，所述其抗神经酰胺抗原结合片段是scFv。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺scFv包含与选自SEQ ID NO:48-61的氨基酸序列至少约80％、至少约82％、至少约85％、至少约87％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺scFv由选自SEQ ID NO:48-61的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺scFv包含SEQ ID NO:48或51的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺scFv包含以下结构：VH-接头-VL或VL-接头-VH。如本文所用，术语“接头”通常是指连接多肽的两个子结构域的短多肽序列。接头的非限制性例子包括包含甘氨酸-丝氨酸重复的柔性接头，以及源自(a)跨膜蛋白(例如，I型跨膜蛋白)的结构域间区域；(b)II型C-凝集素的茎区；或(c)免疫球蛋白铰链的接头。在一些实施方案中，接头提供与这两个子结合结构域的相互作用相容的间隔子功能，使得所得多肽保留对与包含相同的轻链和重链可变区的抗体相同的靶分子的特异性结合亲和力。在某些实施方案中，接头由五至约35个氨基酸(例如，约15至约25个氨基酸)构成。示例性接头在表3中示出。
表3.示例性接头
Figure BDA0003934065150000171
Figure BDA0003934065150000181
在一些实施方案中，产生具有N末端信号序列的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，以促进scFv蛋白的分泌。在一些实施方案中，所述信号序列包含SEQ ID NO:75。本领域技术人员将理解这些信号序列不是成熟的分泌蛋白的一部分。因此，在一些实施方案中，SEQ ID NO:75的信号序列被从成熟的抗神经酰胺抗体或抗原结合片段蛋白中切割掉。
在一些实施方案中，产生具有C末端标签序列的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，以使制造期间的纯化更容易。在一些实施方案中，所述C末端标签包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列。在一些实施方案中，产生没有C末端标签序列的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。因此，在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列不包含SEQ ID NO:76的C末端标签。
所述抗神经酰胺scFv的示例性氨基酸序列在下表4中提供。通过加下划线的文本指示所述scFv的CDR。通过斜体文本指示接头序列。通过粗体文本指示信号序列。通过粗斜体文本指示C末端标签序列。
表4.示例性抗神经酰胺scFv的氨基酸序列
Figure BDA0003934065150000182
Figure BDA0003934065150000191
Figure BDA0003934065150000201
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体是包含全长抗体轻链和全长抗体重链的全长抗体。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体是IgG同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体的Fc结构域包含野生型IgG氨基酸序列。此类序列是本领域已知的，参见例如Shields等人,J Biol Chem,(2001)276:9；6591-6604。在一些实施方案中，所述Fc结构域的CH2或CH3结构域包含改变所述抗体的功能和/或稳定性的一个或多个氨基酸突变。例如，在一些实施方案中，本文所述的抗神经酰胺抗体的Fc结构域缺乏或具有极少的效应子功能，同时保留结合一些Fc受体(如新生儿Fc受体(FcRn))的能力并且保留相对较长的体内半衰期。在一些实施方案中，所描述的抗神经酰胺抗体不导致或大幅减少诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、补体激活和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。此类突变是本领域熟知的，参见例如Shields等人,J Biol Chem,(2001)276:9；6591-6604；Arduin等人,Mol Immunol(2015)63:2；456-463；Vafa等人,Methods(2014)65:1；114-126。
在一些实施方案中，所描述的抗神经酰胺抗体是IgG1同种型抗体，其中IgG1恒定区在一个或多个以下位置处具有突变：228(S228)、234(L234)、235(L235)、237(G237)、297(N297)、318(E318)、320(K320)、322(K322)或其任何组合(根据EU编号)。在一些实施方案中，IgG1 Fc结构域具有L234A和L235A突变。在一些实施方案中，所述IgG1 Fc结构域具有S228P突变。
如本文所用，除非另外规定，否则氨基酸残基在免疫球蛋白分子中的位置是根据EU命名法(Ward等人,1995 Therap.Immunol.2:77-94)编号的。抗体内氨基酸位置的其他编号系统是本领域已知的。例如，IMGT系统(Brochet等人,Nucl.Acids Res.(2008)36,W503-508)和Kabat编号系统(Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Bethesda,MD:Public Health Service,National Institutes of Health(1991))。在一种编号系统与另一种编号系统之间进行转换的方法和信息是本领域已知的。参见例如，可在imgt.org获得的IMGT科学图表-C编号之间的对应关系(IMGT Scientific Chart–Correspondence between C numberings)。
在某些实施方案中，可以使用关于选择具有所需特异性的抗体的标准分子生物学技术制备所述抗神经酰胺抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中，使用重组DNA技术产生所述抗神经酰胺抗体及其抗原结合片段。重组蛋白的表达和纯化的程序在本领域中是成熟的。
多核苷酸以及蛋白质表达方法
本公开文本还包括编码本公开文本的抗神经酰胺抗体及其抗原结合片段的多核苷酸(例如，DNA或RNA)。在一些实施方案中，所述多核苷酸编码与表1、2、3和4中列出的多肽基本上相同的多肽。在一些实施方案中，所述多核苷酸编码与表1、2、3和4中列出的多肽至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％相同的多肽。本公开文本的多核苷酸还包括互补核酸。在一些情况下，当比对时，序列将完全互补(没有错配)。在其他情况下，在序列中可以有高达约20％的错配。可以使用密码子优化、简并序列、沉默突变以及优化在特定宿主中的表达的其他DNA技术开发本文提供的多核苷酸序列，并且本公开文本涵盖此类序列修饰。
在一些实施方案中，本公开文本提供了编码抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸与选自SEQ ID NO:65-73的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开文本提供了编码抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:65-73的核酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，将本公开文本的多核苷酸插入核酸载体中。所述核酸载体可以是病毒载体或非病毒载体(例如质粒)。载体包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、转座子、人工染色体(如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1源性人工染色体(PAC))、噬菌体(如λ噬菌体或M13噬菌体)和动物病毒。在一些实施方案中，所述载体是选自以下的质粒：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(Pharmacia)。在一些实施方案中，所述载体是选自基于如下病毒的病毒载体的病毒载体：痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见例如，Li等人,Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994；Borras等人,Gene Ther 6:515 524,1999；Li和Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等人,HGene Ther 5:1088 1097,1999；WO 94/12649；WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(参见例如，美国专利号7,078,387；Ali等人,HumGene Ther 9:81 86,1998，Flannery等人，，PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等人,Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997；Jomary等人,Gene Ther 4:683 690,1997；Rolling等人,Hum Gene Ther 10:641 648,1999；Ali等人,Hum Mol Genet 5:591594,1996；Srivastava WO 93/09239；Samulski等人,J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等人，，Virol.(1988)166:154-165；以及Flotte等人,PNAS(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人类免疫缺陷病毒(参见例如，Miyoshi等人,PNAS 94:1031923,1997；Takahashi等人,J Virol 73:7812 7816,1999)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒载体、脾坏死病毒载体以及源自诸如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒(Harvey SarcomaVirus)、禽白血病病毒、慢病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳瘤病毒的逆转录病毒的载体)；等。载体的例子是用于在哺乳动物细胞中表达的pClneo载体(Promega)；用于慢病毒介导的基因转染并且在哺乳动物细胞中表达的pLenti4/V5-DESTTM、pLenti6/V5-DESTTM和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)。
在一些实施方案中，将所述多核苷酸插入核酸载体中，并且可操作地连接到一个或多个控制转录的调控序列，如启动子、增强子、终止子、诱导子或阻遏子。示例性启动子包括合适的真核启动子(在真核细胞中起作用的启动子)的非限制性例子包括来自巨细胞病毒(CMV)立即早期蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、病毒性猿猴病毒40(SV40)(例如，早期和晚期SV40)的启动子、脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、来自逆转录病毒的长末端重复(LTR)启动子(例如，莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子)、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来自痘苗病毒的H5、P7.5和P11启动子、延伸因子1-α(EF1α)启动子、早期生长应答因子1(EGR1)启动子、铁蛋白H(FerH)启动子、铁蛋白L(FerL)启动子、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)启动子、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)启动子、热休克蛋白90kDaβ成员1(HSP90B1)启动子、热休克蛋白70kDa(HSP70)启动子、β-驱动蛋白(β-KIN)启动子、人ROSA 26基因座启动子(Irions等人,Nature Biotechnology 25,1477-1482(2007))、泛素C(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增生性肉瘤病毒增强子负调控区缺失的dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子以及小鼠金属硫蛋白-l启动子。
在一些实施方案中，将所述载体引入宿主细胞用于表达所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。因此，可以根据常规技术在基因工程化宿主细胞中产生用于在本公开文本内使用的蛋白质。合适的宿主细胞是可以用外源DNA转化或转染并且在培养基中生长的那些细胞类型，并且包括细菌、真菌细胞和培养的高等真核细胞(包括培养的多细胞生物的细胞)、特别是培养的哺乳动物细胞。Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,2001)以及Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology(第4版,John Wiley&Sons,1999)披露了操纵克隆的DNA分子并且将外源DNA引入多种宿主细胞中的技术。
使通过本公开文本的多核苷酸编码的基因产物在任何方便的表达系统(包括例如细菌、酵母、昆虫、两栖动物和哺乳动物系统)中表达。合适的哺乳动物宿主细胞的例子包括非洲绿猴肾细胞(Vero；ATCC CRL 1587)、人胚肾细胞(293-HEK；ATCC CRL 1573)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21、BHK-570；ATCC CRL 8544、ATCC CRL 10314)、犬肾细胞(MDCK；ATCC CCL 34)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1；ATCC CCL61；CHO DG44；CHO DXB11(Hyclone，犹他州洛根市)；还参见例如，Chasin等人,Som.Cell.Molec.Genet.12:555,1986))、大鼠垂体细胞(GH1；ATCC CCL82)、HeLa S3细胞(ATCC CCL2.2)、大鼠肝癌细胞(H-4-II-E；ATCC CRL 1548)、经SV40转化的猴肾细胞(COS-1；ATCC CRL 1650)以及鼠胚细胞(NIH-3T3；ATCC CRL 1658)。另外的合适的细胞系是本领域已知的，并且可从公共贮藏所(如美国典型培养物保藏中心，弗吉尼亚州马纳萨斯)获得。可以使用任何方便的方法引入DNA构建体，所述方法包括例如接合、细菌转化、钙沉淀DNA、电穿孔、融合、转染、病毒载体感染、基因枪法等。
例如，为了重组表达如本文所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，表达载体通常将包括编码一个或多个表1、2、3和4中提供的氨基酸序列的可操作地连接到启动子的核酸区段。通过常规技术将所述表达载体引入宿主细胞中，然后通过常规技术培养所述宿主细胞以产生一种或多种所编码的多肽，从而产生对应的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
为了将重组蛋白引导到宿主细胞的分泌途径中，在所述表达载体中提供分泌信号序列(也称为前导序列)。所述分泌信号序列可以是所述重组蛋白的天然形式的信号序列，或者可以源自另一种分泌蛋白或者从头合成。所述分泌信号序列可操作地连接到编码多肽的DNA序列，即，这两个序列在正确的阅读框中连接并且定位，以将新合成的多肽引导到所述宿主细胞的分泌途径中。分泌信号序列通常位于编码目的多肽的DNA序列的5’，尽管某些信号序列可以位于目的DNA序列的其他位置(参见例如，美国专利号5,037,743和5,143,830)。在一些实施方案中，所述分泌信号序列是SEQ ID NO:75。
培养的哺乳动物细胞是用于产生本公开文本的重组多肽和蛋白质(例如，抗神经酰胺抗体及其抗原结合片段)的合适的宿主。将外源DNA引入哺乳动物宿主细胞中的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler等人,Cell 14:725,1978；Corsaro和Pearson,Somatic CellGenetics 7:603,1981；Graham和Van der Eb,Virology 52:456,1973)、电穿孔(Neumann等人,EMBO J.1:841-845,1982)、DEAE-右旋糖酐介导的转染(Ausubel等人,同上)和脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等人,Focus 15:73,1993；Ciccarone等人,Focus 15:80,1993)。例如美国专利号4,713,339；4,784,950；4,579,821；以及4,656,134披露了在培养的哺乳动物细胞中产生重组多肽。
根据常规程序在含有所选宿主细胞的生长所需的营养物和其他组分的培养基中培养经转化的或经转染的宿主细胞以产生本公开文本的多肽和蛋白质(例如，神经酰胺结合多肽)。多种合适的培养基(包括限定培养基和复合培养基)是本领域已知的，并且通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。根据需要，培养基还可以含有诸如生长因子或血清的此类组分。生长培养基通常将例如通过药物选择或必需营养物的缺乏来选择含有外源添加的DNA的细胞，所述必需营养物通过表达载体上携带的或共转染到宿主细胞中的选择性标记物来补充。
可以通过常规蛋白质纯化方法(通常通过色谱技术的组合)纯化本公开文本的抗神经酰胺抗体及其抗原结合片段。一般参见Affinity Chromatography:Principles&Methods(Pharmacia LKB Biotechnology,Uppsala,Sweden,1988)；Scopes,ProteinPurification:Principles and Practice(Springer-Verlag,New York 1994)。可以通过亲和色谱在固定化的蛋白A或蛋白G上纯化包含免疫球蛋白Fc区的蛋白质。另外的纯化步骤(如凝胶过滤)可以用于获得所需的纯度水平或提供脱盐、缓冲液交换等。
人源化抗体的产生方法
本公开文本公开了人源化抗神经酰胺抗体及其抗原结合片段。人源化抗体具有与为构建人源化抗体提供起始材料的小鼠或其他非人抗体相同或类似的结合特异性和亲和力。用于人源化的优选抗体是通过引用以其整体并入本文的US 2017-03334133中描述的鼠6B5抗体。所述鼠6B5抗体的VH和VL序列在下表5中提供。通过加下划线的文本指示CDR。通过斜体文本指示接头序列。通过粗体文本指示信号序列。通过粗斜体文本指示C末端标签序列。
表5.来自抗神经酰胺抗体的鼠6B5 VH和VL序列
Figure BDA0003934065150000231
如果人可变结构域框架采用与CDR所起源的鼠可变框架相同或类似的构象，则将小鼠CDR取代至人可变结构域框架中最有可能导致保留其正确的空间定向。这通过从人抗体获得人可变结构域来实现，所述人抗体的框架序列展现出与衍生出CDR的鼠可变框架结构域的高度序列同一性。所述重链和轻链可变框架区可以源自相同或不同的人抗体序列。所述人可变框架区序列可以是天然存在的人抗体的序列，或者可以是几种人抗体的共有序列。参见Kettleborough等人,Protein Engineering 4:773(1991)；Kolbinger等人,Protein Engineering 6:971(1993)以及Carter等人,WO 92/22653。
已经鉴定出鼠供体免疫球蛋白的CDR和适当的人受体框架区，下一步是确定应当对来自这些组分的哪些残基(如果有的话)进行修饰以优化所得人源化抗体的特性。一般而言，应当尽量减少用鼠残基取代人氨基酸残基，因为引入鼠残基会增加抗体在人体中引起人抗小鼠抗体(HAMA)应答的风险。可以进行本领域公认的确定免疫应答的方法来监测特定患者或临床试验期间的HAMA应答。
在一些实施方案中，用于修饰的氨基酸残基的选择部分地通过计算机建模来确定。本文描述了用于产生免疫球蛋白分子的三维图像的计算机硬件和软件。一般而言，从免疫球蛋白链或其结构域的已解析结构开始产生分子模型。将待建模的链与三维结构已解析的链或结构域进行氨基酸序列相似性比较，并且选择显示出最大序列相似性的链或结构域作为构建分子模型的起点。选择具有至少50％的序列同一性的链或结构域进行建模，并且优选地选择具有至少60％、70％、80％、90％或更高的序列同一性的链或结构域进行建模。对已解析的起始结构进行修饰，以允许被建模的免疫球蛋白链或结构域中的实际氨基酸与起始结构中的氨基酸之间存在差异。然后将经修饰的结构组装成复合免疫球蛋白。最后，通过能量最小化并验证所有原子彼此之间在适当的距离内以及键的长度和角度在化学上可接受的限值内来完善模型。
用于修饰的氨基酸残基的选择还可以部分地通过检查在特定位置处的氨基酸的特征或者凭经验观察特定氨基酸的取代或诱变的影响来确定。
在例如Presta等人,J.Immunol.,151:2623-2632(1993)；Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,89:4285-4289(1992)；Couto等人,Cancer Res.,55:5973s-77s(1995)；O'Conner等人,Protein Eng.,11:321-328(1998)；以及Lo的AntibodyEngineering-Methods and Protocols,第248卷(2004)中描述了可以用于人源化本公开文本的免疫球蛋白的另外的示例性人源化技术。
通常，人源化抗体中的CDR区与鼠供体抗体的对应CDR区相同。例如，在一些实施方案中，所述人源化抗体及其片段的CDR氨基酸序列与鼠6B5抗体的CDR氨基酸序列(例如，SEQID NO:11-16)相同。
在一些实施方案中，可能需要修饰一个或多个CDR区以更改所述抗体的抗原结合特异性和/或降低所述抗体的免疫原性。在一些实施方案中，改变CDR的一个或多个残基以更改结合，从而获得更有利的结合缔合速率、更有利的结合解离速率或两者，使得获得理想的结合常数。使用此策略，可以获得具有例如1010M-1或更高的高结合亲和力的抗体。如本文所述的亲和力成熟技术可以用于改变一个或多个亲本CDR区，然后筛选所得结合分子的所需结合变化。所述方法还可以用于将亲本CDR改变为更不具免疫原性，使得最小化或避免潜在的人抗小鼠抗体(HAMA)应答。因此，随着一个或多个CDR的改变，可以对结合亲和力以及免疫原性的变化进行监测和评分，使得获得经优化以具有结合与低免疫原性的最佳组合的抗体(参见例如，美国专利号6,656,467和美国专利公开案US20020164326A1)。此外，有时可以对CDR残基进行一个或多个保守氨基酸取代，而不明显影响所得人源化免疫球蛋白的结合亲和力。保守取代是诸如以下的预期组合：gly，ala；val，ile，leu；asp，glu；asn，gin；ser，thr；lys，arg；以及phe，tyr。
在一些实施方案中，所述人源化抗神经酰胺抗体及其抗原结合片段相对于鼠6B5抗体的对应CDR序列(例如，相对于SEQ ID NO:11-16中的一个或多个)包含一个或多个突变。相对于鼠6B5 CDR的CDR氨基酸序列的示例性突变在图4A中以粗体文本示出。
人源化免疫球蛋白的框架区通常与衍生出它们的人抗体的框架区基本上相同，更通常地与其相同。在一些实施方案中，本公开文本的人源化抗体包括选自人抗体基因(例如，种系抗体基因区段)的可变区框架序列，所述人抗体基因包括一种或多种与被人源化的对应非人抗体(例如，鼠)的标准CDR结构类型相同或类似的标准CDR结构类型。参见，美国专利号6,881,557以及Tan等人,Journal of Immunol 169:1119-1125(2002)(出于所有目的通过引用以其整体而并入)。
当然，框架区中的许多氨基酸对抗体的特异性或亲和力几乎没有或没有直接贡献。因此，可以容忍框架残基的许多单独保守取代，而所得人源化免疫球蛋白的特异性或亲和力没有明显变化。可以分析框架残基以确定哪些残基(如果有的话)应当被取代，以优化所得人源化抗体的特性。例如，计算机建模可以用于鉴定具有较大概率直接或间接影响抗原结合的残基。
因此，在一个实施方案中，所述人源化抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的可变框架区与人可变框架区序列或此类序列的共有序列具有至少85％的序列同一性。在一些实施方案中，所述人源化抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的可变框架区与人可变框架区序列或此类序列的共有序列具有至少90％、优选95％、更优选96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述人源化抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段对抗原展现出至少107M-1、108M-1、109M-1或1010M-1的特异性结合亲和力。通常，人源化抗体对抗原的结合亲和力上限在亲本免疫球蛋白的结合亲和力上限的三、四或五倍内。通常，结合亲和力的下限也在亲本免疫球蛋白的结合亲和力下限的三、四或五倍内。可替代地，可以将结合亲和力与没有取代的人源化抗体(例如，具有供体CDR和受体FR但没有FR取代的抗体)的结合亲和力进行比较。在此类情况下，经优化的抗体(具有取代)的结合优选地比未经取代的抗体的结合至少大二至三倍或者大三至四倍。为了进行比较，可以例如通过BIACORE(即，使用未经标记的试剂进行表面等离子体共振)或竞争性结合测定来确定各种抗体的活性。
治疗方法
本申请公开了抑制有需要的受试者的细胞死亡的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开文本的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是与神经酰胺特异性结合的人源化scFv。
在一些实施方案中，所述细胞死亡与选自移植物抗宿主病、辐射病、GI综合征和自身免疫病的疾病相关。在一些其他实施方案中，所述疾病是辐射病或GI综合征，并且在所述受试者暴露于辐射前施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
辐射靶向胃肠微血管和肠干细胞隔室两者。微血管内皮功能障碍(在辐射后四小时被检测为细胞凋亡)代表导致GI综合征的主要损伤。内皮功能障碍将对循环隐窝基底柱状细胞(CBC)的损伤从亚致死转变为致死的，导致再生隐窝的损失并且促进GI毒性。免疫组化研究以及用[3H]TdR和BrdUrd进行的标记研究揭示到隐窝干细胞死亡不会在辐射暴露后急性地发生。而是，最早可检测到的反应是通过晚期S期检查点和有丝分裂阻滞的短暂剂量依赖性进展延迟，明显由辐射诱导的DNA双链断裂(DSB)发信号。在辐照后的第一个24小时内，在生长受阻滞的细胞中发生快速凋亡性死亡，其在12Gy下等于总死亡的33％。在哺乳动物细胞中，DNA dsb激活DNA损伤识别和修复途径以及细胞周期检查点活性的协同调节。肠干细胞有丝分裂阻滞似乎代表了此途径中受调节的事件。有丝分裂形式的死亡发生在第二个24小时内，占总体死亡的66％。尽管由于隐窝转运和分化的细胞从隐窝持续正常迁移到绒毛的上皮层并且从绒毛顶端损失，隐窝的大小逐渐减小，但在此阶段，显然每肠周的隐窝数量没有显著变化。在12-18小时有丝分裂活性的恢复与隐窝干细胞克隆原(clonogen)的快速耗尽和每周隐窝数量的减少相关。干细胞克隆原损失导致隐窝-绒毛系统近乎完全崩溃、粘膜剥蚀以及死于GI综合征。
神经酰胺介导的筏聚集参与辐射诱导的细胞凋亡和克隆源性细胞死亡。长期以来一直被接受的是胃肠(GI)粘膜的克隆源性隔室是辐射诱导GI损伤的特异性的直接靶标。
本公开文本涉及用于减轻有需要的受试者的在GI综合征期间的细胞死亡的方法。所述方法包括施用有效量的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述方法包括在所述受试者暴露于贯穿辐射后立即向所述受试者施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在其他实施方案中，所述方法包括在所述受试者暴露于贯穿辐射后一小时内向所述受试者施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述方法包括在所述受试者暴露于贯穿辐射后2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或18小时内向所述受试者施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述方法包括在所述受试者暴露于贯穿辐射后24小时内向所述受试者施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在其他实施方案中，所述方法包括在所述受试者暴露于贯穿辐射后30、36、42、48、54、60、66或72小时内向所述受试者施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在其他实施方案中，所述方法包括在所述受试者暴露于贯穿辐射前48、36、24、18、12、10、8、6、4、2或1小时内或者45、30或15分钟内向所述受试者施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述疾病是移植物抗宿主病，并且在所述受试者接受移植前施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述移植是骨髓移植。在其他实施方案中，在所述受试者接受移植后但在移植物抗宿主病发病前施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，在移植物抗宿主病发病后向有需要的受试者以有效减轻在移植物抗宿主病期间的细胞凋亡的量施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
本公开文本还涵盖用于制造用以治疗特征在于神经酰胺的表达的障碍(例如，GI综合征或GvHD)的药物的抗神经酰胺抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述蛋白质或多肽包含抗神经酰胺结合结构域，并且抑制富神经酰胺平台的形成。在一些实施方案中，本公开文本涉及用于治疗受试者的障碍的方法，其中所述障碍的特征在于富神经酰胺平台的表达，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开文本的蛋白质或多肽，所述蛋白质或多肽包含特异性结合人神经酰胺表位的神经酰胺结合结构域(例如，神经酰胺结合多肽)。
在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗患有GI综合征或GvHD的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包含本文阐述的氨基酸序列(例如，选自SEQ ID NO:48-61的氨基酸序列)的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗患有GI综合征或GvHD的患者的方法，所述方法包括施用SEQ ID NO:48或51的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体及其抗原结合片段预防辐射诱导的细胞死亡或者与GvHD或自身免疫病相关的细胞死亡。可以通过多种本领域已知的手段测量细胞死亡，所述手段包括评估染色细胞中标记物表达的变化的流式细胞术、免疫荧光和免疫组化、评估活力的细胞计数、评估基因表达的变化的qPCR等。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体及其抗原结合片段通过抑制富神经酰胺平台的形成来预防细胞死亡。例如，在一些实施方案中，所述抗神经酰胺scFv抑制经辐照的Jurkat T细胞中的富神经酰胺平台形成(参见，实施例3和图1)。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段将富神经酰胺平台的形成减少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体及其抗原结合片段抑制细胞死亡。例如，在一些实施方案中，所述抗神经酰胺scFv抑制经辐照的Jurkat T细胞中的细胞死亡(参见，实施例4和图2A-2D)。在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段将细胞死亡或细胞凋亡减少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。
在一些实施方案中，对于本文所述的治疗方法和用途，以和与寻求治疗的疾病或障碍的处理相关的常规方法一致的方式递送所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。根据本文的本公开文本，在足以预防或治疗所述疾病或障碍的时间和条件下，向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的所述蛋白质或多肽。
在预防性应用中，向易患特定障碍或原本有患特定障碍的风险的患者以足以消除或降低所述障碍的风险或者延迟所述障碍的发病的量施用包含所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的药物组合物或药物。在治疗性应用中，向疑似患有或已经患有这种障碍的患者以足以治愈或至少部分地阻止所述障碍及其并发症的症状的量施用包含本公开文本的蛋白质的组合物或药物。足以实现这一点的量被称为治疗有效剂量或治疗有效量。在预防性和治疗性两种方案中，通常以几个剂量施用药剂，直到已经获得足够的反应(例如，对不适当的血管生成活性的抑制)。通常，对所述反应进行监测，并且如果所需反应开始消退，则给予重复剂量。
为了施用，可以将所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段配制为药物组合物。药物组合物可以包含：(i)神经酰胺结合多肽；以及(ii)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。可以根据已知的制备药学上有用的组合物的方法配制包含神经酰胺结合多肽的药物组合物，由此将所述治疗分子与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合在混合物中。如果受体患者可以耐受载体的施用，则称所述载体是“药学上可接受的载体”。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上可接受的载体的一个例子。其他合适的载体、稀释剂或赋形剂是本领域技术人员熟知的。(参见例如，Gennaro(编辑),Remington's Pharmaceutical Sciences(MackPublishing Company,第19版1995)。)配制品可以进一步包括一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、防止蛋白质在小瓶表面上损失的白蛋白等。
可以将包含本文所述的多肽或蛋白质的药物组合物配制成选自以下的剂型：口服单位剂型、静脉内单位剂型、鼻内单位剂型、栓剂单位剂型、皮内单位剂型、肌内单位剂型、腹膜内单位剂型、皮下单位剂型、硬膜外单位剂型、舌下单位剂型和脑内单位剂型。所述口服单位剂型可以选自：片剂、丸剂、微丸、胶囊剂、散剂、锭剂、颗粒剂、溶液、混悬剂、乳剂、糖浆剂、酏剂、持续释放配制品、气雾剂和喷雾剂。
可以向受试者以治疗有效量施用包含所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的药物组合物。根据本公开文本的方法，可以通过多种施用方式向受试者施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，所述施用方式包括例如通过肌内、皮下、静脉内、心房内、关节内、肠胃外、鼻内、肺内、透皮、胸膜内、鞘内和口服施用途径。出于预防和治疗目的，可以以单次推注递送、经由在延长的时间段内的连续递送(例如，连续透皮递送)或以重复的施用方案(例如，以每小时、每日、每周或每月为基础)向受试者施用激动剂(例如，神经酰胺结合多肽)。
本公开文本的组合物的有效剂量根据许多不同的因素而变化，所述因素包括施用手段、靶部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、所施用的其他药物、治疗是预防性的还是治疗性的以及组合物本身的比活性及其在个体中引起所需反应的能力。通常，患者是人，但是在一些疾病中，患者可以是非人哺乳动物。通常，调整剂量方案以提供最佳治疗反应，即以优化安全性和功效。
在此背景下，有效剂量的确定通常基于动物模型研究，之后是人临床试验，并且通过确定显著降低模式受试者中主题障碍的发生或严重程度的有效剂量和施用方案来指导。因此，如本文所用，“治疗有效量”是指化合物的量是达到所需生物或治疗效果的量，即预防、减少或改善所枚举的被治疗或预防的疾病的一种或多种症状的量。例如，抗体或其抗原结合片段的治疗有效量将取决于待治疗的病症、病症的严重程度和病程、施用抗体是用于预防还是治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对抗体的反应、所使用的抗体或其抗原结合片段的类型以及主治医师的判断。一次性或经一系列的治疗向患者适当地施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，并且可以在从诊断起的任何时间向患者进行施用。所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段可以作为唯一治疗施用，或者与其他可用于治疗所讨论的病症的药物或疗法联合施用。
在一些实施方案中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的治疗有效量在约1ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天之间。在一些实施方案中，所施用抗体的范围是从约1ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天、1ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天、1ng/kg体重/天至约10ng/kg体重/天、10ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天、10ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天、100ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天、100ng/kg体重/天至约10pg/kg体重/天、1μg/kg体重/天至约10pg/kg体重/天、1μg/kg体重/天至约100pg/kg体重/天、10pg/kg体重/天至约100pg/kg体重/天、10pg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、100μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、1mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天以及10mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天。在此范围内的剂量可以通过单次或多次施用达到，包括例如每天施用多次或者每日、每周、每两周或每月施用一次。可以根据情况或指示以单个剂量通过推注或通过连续输注或者以多个剂量通过推注或通过连续输注施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。多个剂量的施用可以例如每天多次、每日一次、每2、3、4、5、6或7天、每周、每2、3、4、5或6周或每月一次。然而，其他剂量方案可以是有用的。通过常规技术容易地监测此疗法的进展。
对于向人类成年患者施用，可以按0.0006mg至1000mg/剂的范围内的剂量施用治疗有效量，所述剂量包括但不限于0.0006mg/剂、0.001mg/剂、0.003mg/剂、0.006mg/剂、0.01mg/剂、0.03mg/剂、0.06mg/剂、0.1mg/剂、0.3mg/剂、0.6mg/剂、1mg/剂、3mg/剂、6mg/剂、10mg/剂、30mg/剂、60mg/剂、100mg/剂、300mg/剂、600mg/剂和1000mg/剂，并且可以在疗程中施用多个通常连续的每日剂量。可以在一天的不同时间施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原片段。在一个实施方案中，可以在晚上施用最佳治疗剂量。在另一个实施方案中，可以在早晨施用最佳治疗剂量。正如所预期的，剂量将取决于患者的病症、体型、年龄和状况。
包含所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的药物组合物的剂量可以由主治临床医师改变，以在靶部位处维持所需的浓度。例如，如果选择静脉内递送方式，则在靶组织的血流中的药剂局部浓度可以在约0.01-50nM之间，有时在约1.0nM与10、15或25nM之间，这取决于受试者的状态和计划测量的反应。可以基于递送方式(例如，经表皮递送与递送至粘膜表面)选择更高或更低的浓度。还应当基于所施用配制品的释放速率调整剂量，所施用配制品例如鼻喷雾剂与散剂、持续释放口服或注射颗粒、透皮配制品等。为了达到相同的血清浓度水平，例如，释放速率为5nM(在标准条件下)的缓释颗粒将以约两倍于释放速率为10nM的颗粒的剂量施用。
包含所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的药物组合物可以作为试剂盒提供，所述试剂盒包含含有如本文所述的药物组合物的容器。可以例如以单个剂量或多个剂量的可注射溶液的形式或者以注射前将被重构的无菌粉末提供药物组合物。可替代地，这种试剂盒可以包括用于施用药物组合物的干粉分散器、液体气溶胶发生器或喷雾器。这种试剂盒可以进一步包含关于所述药物组合物的适应证和用法的书面信息。
实施例
通过以下实施例进一步说明本公开文本，所述实施例不应当被解释为限制。将贯穿本申请引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请以及附图和表格的内容都通过引用并入本文。
实施例1：6B5抗体人源化和产生
本研究的目标是最大化人源化神经酰胺抗体中人序列的量，同时保留6B5小鼠抗体的原始特异性。
抗体人源化设计：使用计算机模拟分析进行亲本6B5小鼠抗体的人源化设计。简言之，使用同源模建生成亲本6B5抗体的3D结构，并且基于3D模型产生亲本抗体的轮廓。基于在整个框架中的总体序列同一性、匹配界面位置、类似分类的CDR标准位置以及N-糖基化位点的存在选择两个人重链(HC)受体框架和两个人轻链(LC)受体框架。然后通过产生融合了亲本抗体序列的选择部分与人框架序列的多个杂合序列设计人源化抗体。使用亲本6B5抗体的3D结构，通过眼睛和计算机建模有方法地分析这些人源化序列，以分离最有可能保留抗原结合的序列。基于这两个不同的人HC受体框架设计三条人源化HC，并且基于这两个不同的人LC受体框架设计三条人源化LC。框架组合在下表6中示出。
表6.人源化6B5抗体的受体框架
链名称 人受体框架
VH1+VL1 HC框架1/LC框架1
VH1+VL2 HC框架1/LC框架1
VH1+VL3 HC框架1/LC框架2
VH2+VL1 HC框架1/LC框架1
VH2+VL2 HC框架1/LC框架1
VH2+VL3 HC框架1/LC框架2
VH3+VL1 HC框架2/LC框架1
VH3+VL2 HC框架2/LC框架1
VH3+VL3 HC框架2/LC框架2
人源化VH1和VL1利用各自的第一个框架，并且含有最多的人序列与最少的亲本抗体框架序列。VH2和VL2使用与VH1和VL1相同的框架，但是含有另外的亲本序列。VH3和VL3利用各自的第二个框架，并且与人源化VH2和VL2类似，也含有与人框架融合的另外的亲本序列。
将上述人源化重链和轻链组合以产生全人源化抗体。测试人源化重链和轻链的组合的表达水平和抗原结合亲和力，以鉴定表现与亲本6B5小鼠抗体类似的抗体。
工程化抗体人性得分的计算：开发了计算工程化人源化抗体的人性得分的工具(Gao等人,BMC Biotechnology 2013,13:55)。通过分析可变区的一级序列，T20得分表示抗体人性的程度。鼠6B5和人源化6B5重链和轻链的T20得分在下表7和8中示出。
表7.人源化6B5 VH链的人性得分
VH 仅框架的人性 框架+CDR的人性
鼠6B5 VH 69 62
人源化VH1 90 82
人源化VH2 87 78
人源化VH3 85 75
表8.人源化6B5 VL链的人性得分
VL 仅框架的人性 框架+CDR的人性
鼠6B5 VL 79 76
人源化VL1 96 89
人源化VL2 93 86
人源化VL3 95 87
对于全长HC，79或以上的得分指示人样重链，并且对于全长κLC，86或以上的得分指示人样轻链。如表7和8所示，全长VH1、VL1、VL2和VL3的人性得分表明这些链是人样的。
来自小鼠6B5抗体的在人源化期间基本保持不变的CDR区的低人性显著影响全长抗体的T20得分。因此，还计算了人源化抗体的仅框架的区域(即，没有鼠CDR序列)的T20得分。对于HC框架，84或以上的得分指示人样重链，并且对于κLC框架，90或以上的得分指示人样轻链。如表7和8所示，6B5重链和轻链(仅框架)的人性得分表明VH区和VL区是人样的。
人源化scFv的构建与小规模生产：将上述人源化VH链和VL链重新格式化为在C末端具有八His标签(SEQ ID NO:76)的scFv。平行表达鼠亲本6B5 scFv以进行比较。为了产生抗体，将所指示的scFv的质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌(E.coli)中，然后使用His标签亲和纯化柱从裂解的细胞中纯化scFv。
实施例2：人源化抗神经酰胺scFv的产生和分析
抗体构建体的表达：将抗神经酰胺VH2和VL1的核苷酸序列克隆到高表达哺乳动物载体(Lake Pharma)中，并且验证克隆的构建体的核酸序列。然后将每个构建体按比例放大到适当的量用于转染，并且通过凝胶电泳评估质粒DNA的质量。
将CHO细胞接种在摇瓶中，并且使用无血清的化学限定培养基扩增。在转染的当天，将扩增的细胞接种到具有新鲜培养基的新烧瓶中，并且将每个抗体表达构建体使用本领域已知的标准程序瞬时转染到CHO细胞中。将细胞以分批补料培养(C4611和C4612，Medna)维持，直到产生结束。收获来自瞬时转染的条件培养基，并且将其通过离心和过滤澄清。然后如下所述通过蛋白L或IMAC纯化来纯化抗体。
蛋白L亲和纯化：将上清液加载到用结合缓冲液预平衡的蛋白L柱上。使洗涤缓冲液穿过柱，直到OD280值(NanoDrop，ThermoScientific)为零。用低pH缓冲液洗脱靶蛋白，收集级分，并且记录每一种级分的OD280值。将含有靶蛋白的级分合并并且通过0.2μm膜过滤。根据OD280值和所计算的消光系数计算蛋白质浓度。
带His标签的蛋白质的IMAC纯化：将上清液加载到用结合缓冲液预平衡的固定化金属(镍)亲和色谱(IMAC)柱上。使含有40mM咪唑的洗涤缓冲液穿过柱，直到OD280值(NanoDrop，ThermoScientific)接近零。用咪唑浓度逐渐增加至0.5M的线性梯度洗脱靶蛋白。按级分收集洗脱物，并且记录每一种级分的OD280值。对每一种级分进行CE-SDS(LabChip GXII，Perkin Elmer)，并且进行分析。将含有靶蛋白的级分合并并且透析到客户指定的缓冲液中。通过0.2μm膜过滤蛋白质，并且根据OD280值(NanoDrop，ThermoScientific)和所计算的消光系数计算蛋白质浓度。
抗体分析：使用HiLoad 26/600 Superdex 200柱(GE Healthcare LifeSciences)进行尺寸排阻色谱(SEC)。通过CE-SDS(LabChip GXII，Perkin Elmer)分析收集的级分。将含有靶蛋白的级分合并并且通过SE-UPLC进行分析。使用每种纯化方法对抗体构建体2766的分析报告的汇总在表9中示出。
表9. 2766 6B5抗体的纯化
抗体 纯化方法 浓度(mg/mL) 总产量(mg)
2766 IMAC 0.77 32.34
2766 蛋白L 0.60 35.52
实施例3：人源化6B5 scFv在体外抑制富神经酰胺平台的形成
然后测试实施例1和2中产生的人源化抗神经酰胺scFv抑制富神经酰胺平台形成的能力。
对于细胞培养和刺激，将Jurkat T淋巴细胞(克隆E6-1，TIB-152，ATCC)维持在37℃下具有5％ CO2的加湿培养箱中的补充有10％热灭活FBS的RPMI 1640培养基中。将细胞洗涤并且重悬于补充有1％ FBS或脱脂化的FBS的RPMI 1640培养基中。简言之，在血细胞计数器上对细胞计数，并且将1x106个细胞/0.5ml在37℃下铺板于24孔板中。在2h后，用0.6μg/ml人抗CD28抗体(AF-342-PB，R&D systems)刺激细胞。另外，将Jurkat T淋巴细胞用50ng/mL至800ng/mL人源化6B5 scFv预处理1小时，之后用抗CD28抗体(0.6μg/mL，目录号AF-342-PB，R&D Systems)刺激45秒。然后立刻将细胞用4％多聚甲醛在4℃下固定10min。
如先前所述(J.A.Rotolo等人,2005；Stancevic等人,2013)检测富神经酰胺平台(CRP)。通过用2％正常驴血清(D9663，Sigma)将细胞在冰上孵育2h阻断非特异性位点。在PBS洗涤后，针对表面神经酰胺使用小鼠抗神经酰胺1°Ab MID 15B4 IgM(1:50，AlexisBiochemicals)将细胞在4℃下染色过夜。使用无关的小鼠IgM作为同种型对照。然后将细胞用PBST洗涤3次并且用Cy3缀合的抗小鼠IgM 2°Ab(1:400，Jackson ImmunoResearch)在4℃下染色1h。将细胞用PBST洗涤3次并且使用含有DAPI的Vectashield荧光封固剂(VectorLaboratories)封固在载玻片上。在Leica SP5倒置显微镜上在室温下对平台成像，所述显微镜具有HyD混合探测器光子计数器以及HCX PL APO CS 63.0x 1.40油物镜(数码变焦为7，用于体积分析)和HCX PL APO CS 40.0×1.25油物镜(数码变焦为1，用于关联(incidence)分析)。使用Leica LAS AF软件获取Z堆栈(Z-stack)。
使用Imaris软件(Bitplane AG，瑞士苏黎世)进行3维CRP体积分析。简言之，在经优化的条件下，每个样品获取10-12个单独的Z堆栈，并且将数据传输给Imaris软件。对对照样品和经处理的样品进行灰度(intensity)归一化。简言之，从未经处理的对照样品获得z柱(z-column)的灰度平均阈值。基于灰度平均阈值，使用Imaris中的“表面(Surfaces)”功能为未经处理的对照细胞、经CD28处理的细胞和经scFv处理的细胞创建表面。灰度平均阈值只允许一定范围的灰度值被认为是表面体积定量的正值，而超出此范围的任何值都被认为是负值。通过Imaris的表面体积功能生成每个表面的体积。对每个样品集的单独体积进行汇总并且计算平均值以供最终分析。为了计算IC50值，将每种抗体的抑制作用标准化为0-100％ CRP抑制的范围，其中0％表示未经处理的对照(仅CD28抗体)并且100％表示达到最佳抑制作用的抗体处理。使用Graph Pad Prism 8绘制数据，并且使用非线性回归分析拟合曲线。
如图1所示，用不同浓度的6B5 scFv预孵育抑制CD28激活的T细胞中的CRP形成。VH2-VL1在预防CRP形成方面最有效，其IC50值为6.1ng/mL。所测试的各种人源化6B5 scFv的IC50值在下表10中示出。
表10.人源化6B5 scFv对CRP形成的抑制
人源化6B5 scFv SEQ ID NO IC<sub>50</sub>(ng/mL)
VH1-VL1 54 180.8
VH1-VL3 56 85.7
VH2-VL1 51 6.1
VH2-VL2 57 12.1
VH3-VL1 59 12.7
VH3-VL2 60 8.4
实施例4：人源化6B5 scFv在体外抑制辐射诱导的细胞凋亡
然后测试实施例1和2中产生的人源化抗神经酰胺scFv抑制辐射诱导的细胞死亡的能力。
如(Haimovitz-Friedman等人,1994；J.A.Rotolo等人,2005)所述进行细胞凋亡测定。将Jurkat T淋巴细胞重悬于补充有1％ FBS的RPMI 1640中并且用100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、600ng/mL或800ng/mL人源化6B5 scFv在37℃下预处理1小时，之后暴露于10Gy(约1.5Gy/分钟)的辐射。将经辐照的Jurkat T细胞在37℃下孵育16小时，然后在4％多聚甲醛中固定。然后将细胞用PBS洗涤，用24μg/ml荧光团三盐酸双苯甲亚胺(Hoechst 33258；Sigma-Aldrich)染色，并且在室温下放置在载玻片上用于在使用40×DPlanApo40UV0.850160/0.11-0.23物镜的Olympus IMT-2显微镜上计数。使用荧光显微镜，基于凋亡细胞核的形态学特征(包括染色质凝聚、分裂和沿核周缘的致密化以及凋亡小体的出现)对细胞凋亡进行定量。每个样品至少计数100个细胞。通过将值相对于仅辐射的对照归一化来确定细胞凋亡抑制百分比(图2A)。在GraphPad Prism v7软件上使用非线性回归计算IC50值。
如图2A所示，用不同浓度的6B5 scFv预孵育抑制经辐照的Jurkat T细胞的细胞凋亡。VH2-VL1在抑制辐射诱导的细胞凋亡方面最有效，其IC50值为130.3ng/mL。所测试的各种人源化6B5 scFv的IC50值在下表11中示出。
表11.人源化6B5 scFv对T细胞的细胞凋亡的抑制
6B5 scFv SEQ ID NO IC<sub>50</sub>(ng/mL)
VH1-VL1 54 3707
VH1-VL3 56 509.9
VH2-VL1 51 130.3
VH2-VL2 57 332.7
VH3-VL1 59 339.8
VH3-VL2 60 197.6
鼠6B5抗体 62 274.8
Genscript 299.2
使用类似的实验设置测试另外两种人源化6B5 scFv(VH4-VL1(SEQ ID NO:52)和VH5-VL1(SEQ ID NO:53))抑制辐射诱导的T细胞的细胞凋亡的能力(图2B-2E)。在图2B中，将VH4-VL1、VH5-VL1和亲本鼠6B5 scFv各自以25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、600ng/mL或800ng/mL与Jurkat T细胞一起孵育1小时，并且将每种scFv抑制辐射诱导的细胞凋亡的能力相对于在800ng/mL下亲本鼠6B5 scFv的保护作用归一化。在图2C中，将VH4-VL1、VH5-VL1和亲本鼠6B5 scFv各自以25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL或800ng/mL与Jurkat T细胞一起孵育1小时，并且将每种scFv抑制辐射诱导的细胞凋亡的能力相对于在800ng/mL下VH5-VL1的保护作用归一化。在图2D中，将VH4-VL1和VH5-VL1以25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、600ng/mL或800ng/mL与Jurkat T细胞一起孵育1小时，并且将每种构建体抑制辐射诱导的细胞凋亡的能力相对于在800ng/mL下VH4-VL1的保护作用归一化。基于这些实验组的IC50值在下表12中提供。
表12.人源化6B5 scFv对T细胞的细胞凋亡的抑制
6B5 scFv SEQ ID NO IC<sub>50</sub>(ng/mL) 对应的附图
亲本鼠6B5 scFv 62 19.4 图2C
VH4-VL1 52 15.1 图2C
VH5-VL1 53 30.0 图2C
VH4-VL1 52 18.9 图2D
VH5-VL1 53 80.7 图2D
图2E示出了VH4-VL1和VH5-VL1在给定的浓度(400ng/mL和800ng/mL)下的保护作用，如通过在这些条件下的辐射诱导的凋亡T细胞的百分比所评价。总之，这些结果证明人源化6B5 scFv可以有效地保护T细胞免于辐射诱导的细胞凋亡。
实施例5：用人源化6B5 scFv处理在体内预防辐射诱导的细胞死亡
在体内测试抗神经酰胺VH2-VL1(SEQ ID NO:51)对暴露于致死剂量的辐射的小鼠的治疗。将15戈瑞单位(Gy)的LD90剂量使用铯辐照器递送给C57BL/6小鼠，并且在辐照后24小时，将小鼠不做处理或用6B5 VH2-VL1(150μg/25g)静脉内处理。在辐照后的不同时间点处死小鼠，并且从屈氏韧带分离出连续的近端空肠段，将其在4％多聚甲醛中固定，并且在石蜡中包埋。将组织切片为5μm，并且使用采用MECA-32抗体(泛内皮细胞标记物)的致死的末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定来鉴定凋亡内皮细胞。对双染色的凋亡内皮细胞进行定量。
用15Gy的LD90剂量辐照小鼠导致小肠内皮细胞死亡，其在辐照后24小时达到峰值(图3A)。与未经处理的小鼠相比，辐照后24小时用6B5 VH2-VL1处理显著减少了内皮细胞的细胞凋亡(图3B)。总之，这些数据表明抑制神经酰胺预防GI综合征小鼠模型的胃肠道内皮细胞死亡。人源化抗神经酰胺scFv可以有益于治疗与增加的细胞死亡相关的疾病(包括GI综合征、GvHD和自身免疫病)。
其他编号的实施方案
本公开文本的其他实施方案提供于以下编号的实施方案中：
实施方案1.一种抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述VH包含重链互补决定区(CDR)1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)和重链CDR3(HCDR3)，所述VL包含轻链互补决定区(CDR)1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)，其中：(a)所述HCDR1包含选自SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列；(b)所述HCDR2包含选自SEQ ID NO:3、4、5和6的氨基酸序列；(c)所述HCDR3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(d)所述LCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(e)所述LCDR2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；并且(f)所述LCDR3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
实施方案2.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:1，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:3。
实施方案3.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:1，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:4。
实施方案4.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:1，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:5。
实施方案5.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:1，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:6。
实施方案6.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:2，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:3。
实施方案7.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:2，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:4。
实施方案8.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:2，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:5。
实施方案9.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:2，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:6。
实施方案10.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:17至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
实施方案11.根据实施方案10所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22100％相同的氨基酸序列。
实施方案12.根据实施方案10所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
实施方案13.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:17至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
实施方案14.根据实施方案13所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23100％相同的氨基酸序列。
实施方案15.根据实施方案13所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:23组成。
实施方案16.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:17至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
实施方案17.根据实施方案16所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24100％相同的氨基酸序列。
实施方案18.根据实施方案16所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
实施方案19.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:18至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
实施方案20.根据实施方案19所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22100％相同的氨基酸序列。
实施方案21.根据实施方案19所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
实施方案22.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:18至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
实施方案23.根据实施方案22所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23100％相同的氨基酸序列。
实施方案24.根据实施方案22所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:23组成。
实施方案25.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:18至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
实施方案26.根据实施方案25所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24100％相同的氨基酸序列。
实施方案27.根据实施方案25所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
实施方案28.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:19至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
实施方案29.根据实施方案28所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22100％相同的氨基酸序列。
实施方案30.根据实施方案28所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
实施方案31.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:19至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
实施方案32.根据实施方案31所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23100％相同的氨基酸序列。
实施方案33.根据实施方案31所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:23组成。
实施方案34.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:19至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
实施方案35.根据实施方案34所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24100％相同的氨基酸序列。
实施方案36.根据实施方案34所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
实施方案37.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:20至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
实施方案38.根据实施方案37所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:20 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22100％相同的氨基酸序列。
实施方案39.根据实施方案37所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:20组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
实施方案40.根据实施方案1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:21至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
实施方案41.根据实施方案40所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:21 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22100％相同的氨基酸序列。
实施方案42.根据实施方案40所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:21组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
实施方案43.一种抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与选自SEQ ID NO:17、18、19、20和21的序列至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列；并且其中所述VL包含与选自SEQ ID NO:22、23和24的序列至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
实施方案44.根据实施方案43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:17至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:22至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
实施方案45.根据实施方案43或44所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22100％相同的氨基酸序列。
实施方案46.根据实施方案43-45中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
实施方案47.根据实施方案43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:17至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:23至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
实施方案48.根据实施方案43或47所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23100％相同的氨基酸序列。
实施方案49.根据实施方案43、47或48中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ IDNO:23组成。
实施方案50.根据实施方案43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:17至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:24至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
实施方案51.根据实施方案43或50所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24100％相同的氨基酸序列。
实施方案52.根据实施方案43、50或51中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ IDNO:24组成。
实施方案53.根据实施方案43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:18至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:22至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
实施方案54.根据实施方案43或53所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22100％相同的氨基酸序列。
实施方案55.根据实施方案43、53或54中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ IDNO:22组成。
实施方案56.根据实施方案43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:18至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:23至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
实施方案57.根据实施方案43或56所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23100％相同的氨基酸序列。
实施方案58.根据实施方案43、56或57中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ IDNO:23组成。
实施方案59.根据实施方案43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:18至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:24至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
实施方案60.根据实施方案43或59所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24100％相同的氨基酸序列。
实施方案61.根据实施方案43、59或60中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ IDNO:24组成。
实施方案62.根据实施方案43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:19至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:22至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
实施方案63.根据实施方案43或62所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22100％相同的氨基酸序列。
实施方案64.根据实施方案43、62或63中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ IDNO:22组成。
实施方案65.根据实施方案43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:19至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:23至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
实施方案66.根据实施方案43或65所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23100％相同的氨基酸序列。
实施方案67.根据实施方案43、65或66中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ IDNO:23组成。
实施方案68.根据实施方案43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:19至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:24至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
实施方案69.根据实施方案43或68所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24100％相同的氨基酸序列。
实施方案70.根据实施方案43、68或69中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ IDNO:24组成。
实施方案71.根据实施方案43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:20至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:22至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
实施方案72.根据实施方案43或71所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:20 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22100％相同的氨基酸序列。
实施方案73.根据实施方案43、71或72中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:20组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ IDNO:22组成。
实施方案74.根据实施方案43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:21至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:22至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
实施方案75.根据实施方案43或74所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:21 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22100％相同的氨基酸序列。
实施方案76.根据实施方案43、74或75中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:21组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ IDNO:22组成。
实施方案77.根据实施方案1-76中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人源化的。
实施方案78.根据实施方案1-76中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是全人的。
实施方案79.根据实施方案1-78中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述抗神经酰胺抗体在所述抗体的Fc结构域中包含一个或多个点突变。
实施方案80.根据实施方案1-79中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。
实施方案81.根据实施方案80所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv包含与选自SEQ ID NO:48-61的序列至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
实施方案82.根据实施方案80所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv包含与选自SEQ ID NO:48-61的序列100％相同的氨基酸序列。
实施方案83.根据实施方案80所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv由选自SEQ ID NO:48-61的序列组成。
实施方案84.根据实施方案80所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv的轻链可变区在所述scFv的重链可变区的羧基末端。
实施方案85.根据实施方案80所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv的轻链可变区在所述scFv的重链可变区的氨基末端。
实施方案86.根据实施方案80-85中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv包含接头多肽。
实施方案87.根据实施方案86所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述接头多肽在所述scFv的轻链可变区与重链可变区之间。
实施方案88.根据实施方案86或87所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述接头多肽包含Gly4Ser接头。
实施方案89.根据实施方案86-88中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述接头多肽包含式(Gly4Ser)n，其中n＝1-5。
实施方案90.一种抗神经酰胺单链可变片段(scFv)，所述抗神经酰胺scFv包含与选自SEQ ID NO:48-61的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
实施方案91.根据实施方案90所述的抗神经酰胺scFv，其中所述scFv包含与选自SEQ ID NO:48-61的序列100％相同的氨基酸序列。
实施方案92.根据实施方案90所述的抗神经酰胺scFv，所述抗神经酰胺scFv由选自SEQ ID NO:48-61的氨基酸序列组成。
实施方案93.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据实施方案1-92中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
实施方案94.一种抗神经酰胺单链可变片段(scFv)，所述抗神经酰胺scFv包含与SEQ ID NO:48或51至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
实施方案95.根据实施方案94所述的抗神经酰胺scFv，其中所述scFv包含与SEQID NO:48或51 100％相同的氨基酸序列。
实施方案96.根据实施方案94所述的抗神经酰胺scFv，所述抗神经酰胺scFv由SEQID NO:48或51的氨基酸序列组成。
实施方案97.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据实施方案94-96中任一项所述的抗神经酰胺单链可变片段(scFv)。
实施方案98.一种表达载体，所述表达载体包含根据实施方案93或97中任一项所述的多核苷酸。
实施方案99.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方案93或97中任一项所述的多核苷酸或者根据实施方案97所述的表达载体。
实施方案100.一种制造根据实施方案1-89中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段或者根据实施方案94-96中任一项所述的抗神经酰胺单链可变片段(scFv)的方法，所述方法包括将根据实施方案98所述的表达载体引入宿主细胞中。
实施方案101.一种抑制有需要的受试者的细胞凋亡的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施方案1-88中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段或者根据实施方案94-96中任一项所述的抗神经酰胺scFv。
实施方案102.根据实施方案101所述的方法，其中所述细胞凋亡与选自移植物抗宿主病、辐射病、GI综合征和自身免疫病的疾病相关。
实施方案103.根据实施方案102所述的方法，其中所述疾病是辐射病或GI综合征，并且在所述受试者暴露于辐射前施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
实施方案104.根据实施方案102所述的方法，其中所述疾病是移植物抗宿主病，并且在所述受试者接受移植前施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
实施方案105.根据实施方案104所述的方法，其中所述移植是骨髓移植。
实施方案106.根据实施方案101所述的方法，其中将所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段静脉内、肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、滑膜内、鞘内、口服、局部或经由吸入施用。
实施方案107.一种用于减轻患有GI综合征的受试者的细胞凋亡的方法，所述方法包括在所述受试者暴露于贯穿辐射后，向所述受试者施用有效量的根据实施方案1-89中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段或者根据实施方案94-96中任一项所述的抗神经酰胺scFv。
实施方案108.根据实施方案107所述的方法，其中在所述受试者暴露于贯穿辐射后立即施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
实施方案109.根据实施方案107所述的方法，其中在所述受试者暴露于贯穿辐射后24小时内施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
实施方案110.一种用于抑制患有GvHD的受试者的细胞凋亡的方法，所述方法包括在所述受试者接受移植前或在所述受试者接受移植后在GvHD发病前，向所述受试者施用有效量的根据实施方案1-89中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段或者根据实施方案94-96中任一项所述的抗神经酰胺scFv。
实施方案111.根据实施方案110所述的方法，其中所述移植是骨髓移植。
实施方案112.一种抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述VH包含重链互补决定区(CDR)1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)和重链CDR3(HCDR3)，所述VL包含轻链互补决定区(CDR)1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)，其中：(a)所述HCDR1包含选自GYTFTDHTIH(SEQ ID NO:1)和GYTFTDHTMH(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列；(b)所述HCDR2包含选自YNYPRDGSTKYNEKFQG(SEQ ID NO:3)、YNYPREGSTKYNEKFQG(SEQ ID NO:4)、YNYPRDVSTKYNEKFQG(SEQ ID NO:5)和YNYPRDGSTKYAEKFQG(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列；(c)所述HCDR3包含GFITTVVPSAY(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列；(d)所述LCDR1包含RASKSISKYLA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)所述LCDR2包含SGSTLQS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；并且(f)所述LCDR3包含QQHNEYPWT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。
实施方案113.根据实施方案112所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含GYTFTDHTIH(SEQ ID NO:1)，并且所述HCDR2包含YNYPRDGSTKYNEKFQG(SEQID NO:3)。
实施方案114.根据实施方案112所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含GYTFTDHTIH(SEQ ID NO:1)，并且所述HCDR2包含YNYPREGSTKYNEKFQG(SEQID NO:4)。
实施方案115.根据实施方案112所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含GYTFTDHTIH(SEQ ID NO:1)，并且所述HCDR2包含YNYPRDVSTKYNEKFQG(SEQID NO:5)。
实施方案116.根据实施方案112所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含GYTFTDHTIH(SEQ ID NO:1)，并且所述HCDR2包含YNYPRDGSTKYAEKFQG(SEQID NO:6)。
实施方案117.根据实施方案112所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含GYTFTDHTMH(SEQ ID NO:2)，并且所述HCDR2包含YNYPRDGSTKYNEKFQG(SEQID NO:3)。
实施方案118.根据实施方案112所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含GYTFTDHTMH(SEQ ID NO:2)，并且所述HCDR2包含YNYPREGSTKYNEKFQG(SEQID NO:4)。
实施方案119.根据实施方案112所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含GYTFTDHTMH(SEQ ID NO:2)，并且所述HCDR2包含YNYPRDVSTKYNEKFQG(SEQID NO:5)。
实施方案120.根据实施方案112所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含GYTFTDHTMH(SEQ ID NO:2)，并且所述HCDR2包含YNYPRDGSTKYAEKFQG(SEQID NO:6)。
通过引用并入
将本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利公开案和专利申请都出于所有目的通过引用以其整体而并入。然而，提及本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开案和专利申请并非并且不应当被视为承认或以任何形式暗示它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家公知常识的一部分。
本公开文本的序列表：
Figure BDA0003934065150000411
Figure BDA0003934065150000421
Figure BDA0003934065150000431
Figure BDA0003934065150000441
Figure BDA0003934065150000451
Figure BDA0003934065150000461
Figure BDA0003934065150000471
序列表
<110> 纪念斯隆凯特琳癌症中心
瑟拉美蒂克控股有限公司
<120> 抗神经酰胺抗体
<130> CERA-012/01WO
<150> US 62/991,232
<151> 2020-03-18
<160> 76
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR1-IH
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Thr Ile His
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR1-IH-MH
<400> 2
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Thr Met His
1 5 10
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR2-DG
<400> 3
Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR2-DG-EG
<400> 4
Tyr Asn Tyr Pro Arg Glu Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR2-DG-DV
<400> 5
Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Val Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR2-NE-AE
<400> 6
Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR3
<400> 7
Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR1
<400> 8
Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR2
<400> 9
Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 10
Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠 (Mus musculus)
<400> 11
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Thr Ile His
1 5 10
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠 (Mus musculus)
<400> 12
Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠 (Mus musculus)
<400> 13
Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠 (Mus musculus)
<400> 14
Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠 (Mus musculus)
<400> 15
Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠 (Mus musculus)
<400> 16
Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化VH1
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化VH2
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 19
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化 VH3
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Ile His Trp Met Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化VH4
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Glu Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化VH5
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Val Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化VL1
<400> 22
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化VL2
<400> 23
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化VL3
<400> 24
Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> STD1接头
<400> 25
Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Asn Ser
20
<210> 26
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> STD2接头
<400> 26
Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Asn Ser
35
<210> 27
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H1接头
<400> 27
Asn Ser
1
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H2接头
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser
1 5
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H3接头
<400> 29
Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser
1 5 10
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4接头
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser
1 5 10
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H5接头
<400> 31
Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser
1 5 10 15
<210> 32
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H6接头
<400> 32
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Asn Ser
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H7接头
<400> 33
Gly Cys Pro Pro Cys Pro Asn Ser
1 5
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly4Ser接头
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)3接头
<400> 35
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H105接头
<400> 36
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 37
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)4接头
<400> 37
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 38
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H75接头 (NKG2A四重突变体)
<400> 38
Gln Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Gly Thr Gln Met Ala Gly
1 5 10 15
His Ser Pro Asn Ser
20
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H83接头 (NKG2A源性)
<400> 39
Ser Ser Leu Asn Thr Gly Thr Gln Met Ala Gly His Ser Pro Asn Ser
1 5 10 15
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H106接头 (NKG2A源性)
<400> 40
Gln Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Gly Thr Gln Met Ala Gly
1 5 10 15
His Ser
<210> 41
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H81接头 (NKG2D源性)
<400> 41
Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Ser Pro Asn Ser
1 5 10
<210> 42
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H91接头 (NKG2D源性)
<400> 42
Asn Ser Leu Ala Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr
1 5 10 15
Ser Pro Asn Ser
20
<210> 43
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H94接头
<400> 43
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Pro Asn Ser
<210> 44
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H111接头
<400> 44
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Pro Gly Ser
<210> 45
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H113接头
<400> 45
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Pro Ala Ser
<210> 46
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H114接头
<400> 46
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Pro Ser
<210> 47
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H115接头
<400> 47
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Pro Ser Ser
<210> 48
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2-VL1 (前导序列) scFv
<400> 48
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp His Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu
195 200 205
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu
210 215 220
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr
245 250 255
Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser His His His His His His His His
275 280
<210> 49
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH4-VL1 scFv
<400> 49
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp His Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Glu Gly Ser Thr Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu
195 200 205
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu
210 215 220
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr
245 250 255
Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser His His His His His His His His
275 280
<210> 50
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH5-VL1 scFv
<400> 50
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp His Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Val Ser Thr Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu
195 200 205
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu
210 215 220
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr
245 250 255
Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser His His His His His His His His
275 280
<210> 51
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2-VL1 scFv - 无信号序列
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
His His His His His His His His
260
<210> 52
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH4-VL1 scFv - 无信号序列
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Glu Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
His His His His His His His His
260
<210> 53
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH5-VL1 scFv - 无信号序列
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Val Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
His His His His His His His His
260
<210> 54
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1-VL1 scFv
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
His His His His His His His His
260
<210> 55
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1-VL2 scFv
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Asn Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
His His His His His His His His
260
<210> 56
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1-VL3 scFv
<400> 56
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
His His His His His His His His
260
<210> 57
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2-VL2 scFv
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Asn Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
His His His His His His His His
260
<210> 58
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2-VL3 scFv
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
His His His His His His His His
260
<210> 59
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH3-VL1 scFv
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Ile His Trp Met Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
His His His His His His His His
260
<210> 60
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH3-VL2 scFv
<400> 60
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Ile His Trp Met Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Asn Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
His His His His His His His His
260
<210> 61
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH3-VL3 scFv
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Ile His Trp Met Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
His His His His His His His His
260
<210> 62
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠6B5 scFv
<400> 62
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu
20 25 30
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Asp His Thr Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys
65 70 75 80
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
85 90 95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Val Tyr Phe Cys Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser
115 120 125
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Ile
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly Glu Thr Ile Thr
165 170 175
Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr
180 185 190
Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser
195 200 205
Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
225 230 235 240
Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser His His His His His His
260 265 270
<210> 63
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠6B5 VH亲本
<400> 63
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 64
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠6B5 VL亲本
<400> 64
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 65
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH3-VL3 scFv核酸序列
<400> 65
atgaagtacc ttcttcccac cgccgcggct gggttgttgt tacttgcagc acaaccggcg 60
atggctcaag tccagttagt tcagtcgggg gccgaagtaa agaagccagg tgctactgtg 120
aaaatttcgt gcaaagtgag cggatacaca ttcacggacc acacgattca ctggatgcag 180
caagctccgg gcaagggtct tgagtggatg ggctacaact atccgcgtga cggatcaaca 240
aaatacaatg aaaaatttca agggcgtgtt acaattaccg cggataaatc cacgagtact 300
gcctacatgg agttgtcctc acttcgttca gaggacacag cagtgtacta ttgtgctaaa 360
gggttcatca cgaccgtggt cccctctgct tattggggcc aaggaacact tgtgactgtg 420
tcttctgggg gcggggggag cggaggcgga ggtagcggtg gcgggggtag tgacgttcaa 480
ctgactcaat cgccttcatc cgttagcgcc agcgtaggcg accgtgtgac catcacgtgc 540
cgcgcgtcca aaagtatcag caagtacctg gcctggtacc aacaaaaacc cggaaaggca 600
ccgaagttgt tgatttattc cggttcaaca ttacaaagcg gcgttccgag tcgtttcagt 660
ggtagcggtt ccggcacaga ttttaccttg accatttcct ccctgcagcc agaagacttt 720
gctacttatt actgtcaaca gcacaatgag tacccgtgga cgtttgggcc tggaactaag 780
gttgagatta agcgtgctgc tgccgggggc ggtggttccg gaggaggagg aagtcaccac 840
caccatcacc atcatcatgg t 861
<210> 66
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH3-VL2 scFv核酸序列
<400> 66
atgaaatatc tgctgccaac tgcggcagca ggtctgttgc ttctggccgc tcaaccggcc 60
atggctcaag tccagttagt tcagagtggg gcagaggtta aaaaaccggg agctacagta 120
aagatcagct gtaaagtatc aggttataca tttactgacc atactatcca ctggatgcaa 180
caggcgccag ggaaaggttt ggagtggatg ggatataatt atccacgcga cgggtcaact 240
aagtacaacg agaagtttca aggccgtgta acgattaccg cggacaaaag cacgagtaca 300
gcgtacatgg aattatcatc tttgcgctcg gaggacacag cggtctatta ctgtgccaag 360
ggtttcatca ctactgtggt accaagtgcg tattggggtc aaggaaccct tgttacggtg 420
tcatcagggg gtggcggaag tggcggtggt ggatcgggcg gaggtggaag cgatgttcag 480
atcacacagt cgccctcgtt cctgagtgca agtgtcggtg atcgtgtgac tattacgtgt 540
cgtgcatcga aatcaatctc aaagtatctg gcttggtacc agcaaaaacc tggaaaggct 600
aacaaattgt tgatctattc cgggagcacc cttcaaagcg gtgtcccctc tcgtttctcc 660
ggatccgggt cagggaccga ctttactctg actatttcca gtcttcagcc ggaagatttt 720
gcgacttact attgccagca gcataatgag tacccatgga cttttggcgg tggcacaaag 780
gtcgagatta agcgtgcagc tgccggtggt ggaggttcgg gtgggggcgg ttctcatcat 840
caccatcatc accatcatgg t 861
<210> 67
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH3-VL1 scFv核酸序列
<400> 67
atgaaatatt tgcttccgac tgccgccgca ggtctgttac ttttagcagc gcagcccgct 60
atggcacagg tccagttagt tcaatcagga gcggaggtga agaagccggg agccacggtt 120
aaaatctcat gcaaggtgtc cggctataca tttaccgacc acacgattca ctggatgcag 180
caagctcccg ggaaggggct tgaatggatg gggtacaatt atccacgcga tggttccacc 240
aagtataacg aaaaatttca aggtcgtgtc accattaccg ctgacaaaag cacgtctaca 300
gcgtacatgg agctgagtag cttgcgctca gaggacacag ccgtatacta ttgcgcaaaa 360
ggtttcatca cgaccgtagt cccctctgcg tattggggac aggggaccct ggtcacggtc 420
tcctccgggg gcggaggatc gggaggcggg gggtctggag gtggtggatc tgacatccag 480
cttacccaat cgcctagctt cttgagtgct agtgtaggcg accgtgttac tatcacttgt 540
cgcgcttcta agagcattag caaatactta gcctggtacc aacaaaagcc gggaaaggca 600
cccaagctgt taatttatag tgggtctacc cttcagtccg gcgtaccctc acgcttttcc 660
ggcagtggct cgggtaccga atttaccctt acgatttctt cgcttcaacc cgaagatttt 720
gcaacgtact actgtcagca gcacaacgag tatccctgga cattcggcgg agggacaaaa 780
gtagaaatca agcgtgcagc cgcaggtggc ggcgggtctg gcggcggagg gagtcaccat 840
caccatcatc atcatcatgg a 861
<210> 68
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2-VL3 scFv核酸序列
<400> 68
atgaaatatt tgttacctac cgctgcggca ggacttctgc ttttggccgc tcagcccgca 60
atggctcaag tgcaattggt tcagtcaggg gccgaagtaa aaaagccagg cgcgagcgta 120
aaagtgagtt gcaaggtctc cggttacacg tttaccgatc acacgattca ctggatgcgt 180
caagctccag gccagggtct tgaatggatg ggttacaact atcctcgcga tggttcgacc 240
aagtataacg agaagtttca gggccgtgtc acaatgaccg ccgacaaatc aacgagcact 300
gtctacatgg agctgtcatc cctgcgcagc gaggatacag ctgtgtacta ctgtgccaag 360
ggcttcatta ctaccgtcgt ccccagcgcg tactggggtc aaggtacact ggtaacagtt 420
tcatccggag gagggggaag cggcggcggt ggatctggcg gcggtgggtc agacgttcaa 480
cttacccagt cgccttcttc cgtgagtgcc tctgtcgggg atcgtgttac catcacttgc 540
cgcgcatcta agtcaatttc taaatatttg gcctggtatc agcagaaacc cggtaaagcg 600
cccaaattgt tgatctattc cggcagtacc ttgcaatccg gggtgccttc gcgcttctcg 660
gggagtggaa gcggcacgga tttcacttta acgatctcga gtttgcagcc ggaagatttt 720
gcgacttact attgtcagca gcataacgaa tatccatgga cctttggccc tggtacgaaa 780
gtagaaatca aacgtgcagc agccggtggg ggtggctccg gtggcggtgg gtcgcatcac 840
caccaccatc atcatcacgg t 861
<210> 69
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2-VL2 scFv核酸序列
<400> 69
atgaagtacc tgttgcccac agccgctgct gggttactgc ttcttgctgc ccagcccgca 60
atggcgcaag tgcaattagt ccagtctgga gcagaggtta aaaagccggg agcttcagtg 120
aaggtctcct gtaaggtaag tggttataca ttcaccgatc acacaatcca ttggatgcgc 180
caggccccag gtcagggtct tgaatggatg ggctataact acccgcgtga tggctcaact 240
aagtataacg agaagtttca ggggcgcgtt acaatgactg cggataaaag cacgtcgacg 300
gtgtacatgg aattgtcaag ccttcgttcc gaagataccg cagtttacta ttgtgctaag 360
ggctttatca ctaccgtggt acccagtgcg tactgggggc agggaaccct ggtaaccgtg 420
tcatcgggcg gaggcggaag cgggggaggt ggcagtggag gtggcgggtc tgacgttcaa 480
atcacccagt caccgtcatt tctttccgcg tctgtgggtg accgcgtaac aattacttgc 540
cgtgcttcga aaagcatttc gaaatacctt gcctggtacc aacagaaacc ggggaaagca 600
aacaaacttt taatctacag cgggagcacg cttcaatccg gcgtcccatc ccgtttttct 660
ggctccggca gcgggaccga cttcacctta actatttctt cccttcaacc ggaggacttt 720
gcgacgtatt actgtcaaca acacaatgag tatccgtgga ctttcggagg cggaactaag 780
gttgaaatca agcgtgctgc tgctggcggg ggaggctcag gcggaggggg atcacatcat 840
catcaccatc atcatcacgg a 861
<210> 70
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2-VL1 scFv核酸序列
<400> 70
atgaaatact tgctgccgac tgccgcagcg ggattattat tacttgcggc tcagccggct 60
atggcgcagg tccagttagt tcagagtggg gcagaagtga agaaacccgg tgcatctgta 120
aaggtctcat gtaaagtatc tggctacacc ttcactgacc acactatcca ctggatgcgt 180
caagcaccag gacaaggttt agagtggatg ggatataact atccgcgtga cgggagtacg 240
aagtataacg aaaaatttca gggccgtgta accatgaccg cggataaatc cacttccact 300
gtctatatgg aattatcgtc gttacgtagc gaggacacgg cggtatatta ttgcgccaaa 360
gggtttatca cgactgttgt gccgtccgct tactgggggc aagggacttt agtgaccgtg 420
tccagcggag gggggggtag cgggggtggc gggagtggtg gtgggggttc ggacattcag 480
cttacccaat cccctagctt tttgtcagcc tccgttggcg atcgtgtaac tattacgtgc 540
cgcgcctcca agtccatttc aaaatattta gcctggtacc aacagaagcc aggaaaagct 600
cctaaattac tgatttactc aggttccaca ttgcagtcgg gcgtaccaag ccgtttttcg 660
ggaagtggta gcgggaccga gtttacattg acgattagta gtcttcaacc ggaggatttt 720
gcaacctact attgtcagca gcacaacgag tacccatgga cctttggagg cggtaccaaa 780
gtggaaatta aacgcgcagc agcaggcggc ggtggttcag ggggaggagg ctcgcatcac 840
caccatcatc atcaccacgg t 861
<210> 71
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1-VL3 scFv核酸序列
<400> 71
atgaaatacc ttttgccgac tgccgccgca ggattattgt tactggcggc tcagccggct 60
atggcccaag tccaattagt tcaatcaggg gcagaagtta agaagcccgg agcaagtgtc 120
aaggtctcat gcaaagcctc cggttacacc tttaccgacc acacgatgca ctgggttcgc 180
caagctcccg gacagggcct ggaatggatg ggttataatt atccgcgtga tggtagcacg 240
aaatacgcgg aaaaattcca aggtcgcgtt acgatgaccg cggacaagtc tactagcacc 300
gtgtacatgg aacttagctc gctgcgttcg gaagatacgg cggtgtacta ctgtgcgaaa 360
ggtttcatca ctacagtagt gccaagtgcg tattggggtc aaggcacgct ggtaacggtt 420
tcaagtggtg gcggcggtag cggcggcggc ggcagcggag gagggggatc ggatgtccaa 480
cttacgcaat ctccgtcctc tgtttccgca agtgtgggcg accgcgtaac catcacttgc 540
cgtgctagta aaagcatttc taagtattta gcgtggtatc aacagaagcc cggaaaggcg 600
ccaaagctgt tgatttattc cgggagtaca ttacaatctg gcgtgccgtc ccgcttctcc 660
ggcagcggta gtggtactga cttcacgctg acaattagtt cacttcagcc agaggatttt 720
gcgacatatt attgccagca gcataacgaa tacccatgga ccttcggtcc tggaaccaag 780
gttgaaatca aacgtgctgc ggccggcggc ggtgggagcg gagggggcgg gtcacatcat 840
catcatcatc accatcatgg t 861
<210> 72
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1-VL2 scFv核酸序列
<400> 72
atgaaatacc ttcttcccac cgcagcagcg ggattgttat tattggctgc acaacctgcg 60
atggctcaag tacagttggt gcagtcaggg gcggaagtca agaaaccagg cgcttcagtg 120
aaagtttcgt gtaaagcatc cggctatact tttaccgacc acaccatgca ctgggttcgc 180
caagctcctg gacagggtct ggaatggatg gggtacaact atccccgcga tggatccaca 240
aagtacgcgg agaagttcca aggacgtgta acaatgacgg ccgataaaag cacttccaca 300
gtctatatgg aactttcgtc tcttcgttct gaggacacag cagtttacta ctgtgctaaa 360
ggatttatca ctaccgtcgt tccgtctgca tattgggggc agggcacgtt agtaacagtc 420
agctccgggg gcgggggctc agggggcggt ggatcagggg gaggcggctc tgacgtgcag 480
atcactcagt cgcctagctt tctttcggct agtgtcgggg atcgcgtcac tatcacatgc 540
cgcgccagca aaagcatctc taaatacctg gcttggtacc aacaaaaacc cggaaaggct 600
aataagttgc tgatctacag tgggagtact ttgcagtcgg gggtgccgag tcgtttttca 660
ggtagcgggt cgggcacgga ctttaccctt acaatttcct ccctgcagcc cgaggacttt 720
gccacatatt attgtcaaca gcacaacgag tacccgtgga cgtttggggg aggtaccaaa 780
gtggaaatca agcgtgcagc ggccggggga ggtggaagcg gcggcggtgg aagtcaccat 840
catcaccacc accatcacgg a 861
<210> 73
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1-VL1 scFv核酸序列
<400> 73
atgaaatacc tgttacctac tgctgccgca ggtttgttgc ttctggcggc tcaaccggcc 60
atggcacagg ttcagctggt gcaatcaggc gccgaagtca aaaaaccggg tgcaagcgtc 120
aaggtgagct gtaaggcaag cggatatact tttacagatc atacaatgca ctgggtacgc 180
caggcaccag gccagggcct tgaatggatg ggatataact acccacgtga tggatctact 240
aaatatgccg agaagttcca gggtcgcgtt accatgactg ctgataaaag tacatcaact 300
gtatacatgg aacttagctc attgcgttcc gaagatactg ccgtgtacta ttgtgcaaag 360
gggtttatca cgacagtcgt tccatcggca tattggggcc agggaacgtt agtaacagtc 420
agcagtgggg gtggggggtc aggcggagga gggtctggtg gggggggttc tgacatccag 480
ttgacacagt ccccatcctt tttgtctgca tcggttgggg accgcgtgac gattacttgt 540
cgcgcgtcca agtctatcag caaatattta gcatggtatc aacaaaaacc tggcaaggct 600
cccaagttac ttatttactc cggtagtact cttcagtcgg gagtgccttc ccgttttagc 660
gggtctggtt caggcacgga gtttaccctt acaattagtt ctctgcagcc cgaggatttt 720
gcaacttact actgccagca acacaatgag tacccctgga cattcggcgg tgggacaaaa 780
gtcgagatta agcgtgccgc tgccggtgga ggagggtcag ggggtggcgg cagtcatcac 840
caccatcacc atcatcatgg a 861
<210> 74
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6B5 scFv核酸序列
<400> 74
atgaagtact tattgcccac tgctgctgct ggattattat tgttggcagc gcaaccggcc 60
atggcgcagg tccaacttca gcagtcagat gccgaacttg taaagccggg tgcaagcgtg 120
aaaatctcat gtaaagtatc tggttatacg tttacagatc acaccatcca ctggatgaag 180
caacgccctg agcagggttt agagtggatt ggctataatt atccgcgcga cggttcgaca 240
aaatacaacg aaaagttcaa gggcaaggca acgcttaccg ccgataagag ttcaagtaca 300
gcatatatgc aactgaacag cttaactagc gaagatagcg cagtttactt ttgcgcgaag 360
ggatttatca ccaccgtggt tccgagtgcc tactggggac agggcacatt ggttacagtc 420
agtgcaggag gaggagggtc cggtggcgga ggatcgggtg ggggtggatc agatgtccaa 480
atcacacaat cgccatccta cttggccgcc tcgcccggag aaaccatcac tattaattgc 540
cgcgcgagca agtctatttc caagtatttg gcatggtacc aagaaaagcc cggtaaaact 600
aacaaacttt tgatctactc tgggtccacg ctgcagtcag gaatcccatc ccgtttctcg 660
ggcagcggat ctgggacaga cttcacgttg acaatttcga gccttgagcc ggaagatttc 720
gcaatgtact actgtcagca acataacgag tacccttgga catttggcgg gggcacaaag 780
cttgaaatta aacgcgctgc tgccggagga ggtggttcgg ggggaggggg ttctcatcat 840
caccaccatc accaccacgg a 861
<210> 75
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 75
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 76
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端标签
<400> 76
Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His
1 5 10 15
His His His His His His
20

Claims (111)

1.一种抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述VH包含重链互补决定区(CDR)1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)和重链CDR3(HCDR3)，所述VL包含轻链互补决定区(CDR)1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)，其中：
(a)所述HCDR1包含选自SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列；
(b)所述HCDR2包含选自SEQ ID NO:3、4、5和6的氨基酸序列；
(c)所述HCDR3包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列；
(d)所述LCDR1包含选自SEQ ID NO:8的氨基酸序列；
(e)所述LCDR2包含选自SEQ ID NO:9的氨基酸序列；并且
(f)所述LCDR3包含选自SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含SEQID NO:1，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:3。
3.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含SEQID NO:1，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:4。
4.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含SEQID NO:1，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:5。
5.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含SEQID NO:1，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:6。
6.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含SEQID NO:2，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:3。
7.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含SEQID NO:2，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:4。
8.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含SEQID NO:2，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:5。
9.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1包含SEQID NO:2，并且所述HCDR2包含SEQ ID NO:6。
10.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:17至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:22至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。
12.根据权利要求10所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
13.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:17至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:23至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
14.根据权利要求13所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23 100％相同的氨基酸序列。
15.根据权利要求13所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:23组成。
16.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:17至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:24至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
17.根据权利要求16所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24 100％相同的氨基酸序列。
18.根据权利要求16所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
19.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:18至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:22至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
20.根据权利要求19所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。
21.根据权利要求19所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
22.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:18至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:23至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
23.根据权利要求22所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23 100％相同的氨基酸序列。
24.根据权利要求22所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:23组成。
25.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:18至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:24至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
26.根据权利要求25所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24 100％相同的氨基酸序列。
27.根据权利要求25所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
28.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:19至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:22至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
29.根据权利要求28所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。
30.根据权利要求28所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
31.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:19至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:23至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
32.根据权利要求31所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23 100％相同的氨基酸序列。
33.根据权利要求31所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:23组成。
34.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:19至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:24至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
35.根据权利要求34所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24 100％相同的氨基酸序列。
36.根据权利要求34所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
37.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:20至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:22至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
38.根据权利要求37所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:20 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。
39.根据权利要求37所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:20组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
40.根据权利要求1所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:21至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:22至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
41.根据权利要求40所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:21 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。
42.根据权利要求40所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:21组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
43.一种抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，
其中所述VH包含与选自SEQ ID NO:17、18、19、20和21的序列至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列；并且
其中所述VL包含与选自SEQ ID NO:22、23和24的序列至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
44.根据权利要求43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:17至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
45.根据权利要求43或44所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。
46.根据权利要求43-45中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
47.根据权利要求43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:17至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
48.根据权利要求43或47所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23 100％相同的氨基酸序列。
49.根据权利要求43、47或48中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:23组成。
50.根据权利要求43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:17至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
51.根据权利要求43或50所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:17 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24 100％相同的氨基酸序列。
52.根据权利要求43、50或51中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
53.根据权利要求43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:18至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
54.根据权利要求43或53所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。
55.根据权利要求43、53或54中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
56.根据权利要求43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:18至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
57.根据权利要求43或56所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23 100％相同的氨基酸序列。
58.根据权利要求43、56或57中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:23组成。
59.根据权利要求43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:18至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
60.根据权利要求43或59所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:18 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24 100％相同的氨基酸序列。
61.根据权利要求43、59或60中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
62.根据权利要求43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:19至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
63.根据权利要求43或62所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。
64.根据权利要求43、62或63中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
65.根据权利要求43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:19至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
66.根据权利要求43或65所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:23 100％相同的氨基酸序列。
67.根据权利要求43、65或66中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:23组成。
68.根据权利要求43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:19至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
69.根据权利要求43或68所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:19 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:24 100％相同的氨基酸序列。
70.根据权利要求43、68或69中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:19组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:24组成。
71.根据权利要求43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:20至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
72.根据权利要求43或71所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:20 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。
73.根据权利要求43、71或72中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:20组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
74.根据权利要求43所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:21至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22至少90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
75.根据权利要求43或74所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:21 100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:22 100％相同的氨基酸序列。
76.根据权利要求43、74或75中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸序列由SEQ ID NO:21组成，并且所述VL氨基酸序列由SEQ ID NO:22组成。
77.根据权利要求1-76中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人源化的。
78.根据权利要求1-76中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是全人的。
79.根据权利要求1-78中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述抗神经酰胺抗体在所述抗体的Fc结构域中包含一个或多个点突变。
80.根据权利要求1-79中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。
81.根据权利要求80所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv包含与选自SEQ ID NO:48-61的序列至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
82.根据权利要求80所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv包含与选自SEQ ID NO:48-61的序列100％相同的氨基酸序列。
83.根据权利要求80所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv由选自SEQ ID NO:48-61的序列组成。
84.根据权利要求80所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv的轻链可变区在所述scFv的重链可变区的羧基末端。
85.根据权利要求80所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv的轻链可变区在所述scFv的重链可变区的氨基末端。
86.根据权利要求80-85中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv包含接头多肽。
87.根据权利要求86所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述接头多肽在所述scFv的轻链可变区与重链可变区之间。
88.根据权利要求86或87所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述接头多肽包含Gly4Ser接头。
89.根据权利要求86-88中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中所述接头多肽包含式(Gly4Ser)n，其中n＝1-5。
90.一种抗神经酰胺单链可变片段(scFv)，所述抗神经酰胺scFv包含与选自SEQ IDNO:48-61的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
91.根据权利要求90所述的抗神经酰胺scFv，其中所述scFv包含与选自SEQ ID NO:48-61的序列100％相同的氨基酸序列。
92.根据权利要求90所述的抗神经酰胺scFv，所述抗神经酰胺scFv由选自SEQ ID NO:48-61的氨基酸序列组成。
93.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1-92中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
94.一种抗神经酰胺单链可变片段(scFv)，所述抗神经酰胺scFv包含与SEQ ID NO:48或51至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列。
95.根据权利要求94所述的抗神经酰胺scFv，其中所述scFv包含与SEQ ID NO:48或51100％相同的氨基酸序列。
96.根据权利要求94所述的抗神经酰胺scFv，所述抗神经酰胺scFv由SEQ ID NO:48或51的氨基酸序列组成。
97.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求94-96中任一项所述的抗神经酰胺单链可变片段(scFv)。
98.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求93或97中任一项所述的多核苷酸。
99.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求93或97中任一项所述的多核苷酸或者根据权利要求97所述的表达载体。
100.一种制造根据权利要求1-89中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段或者根据权利要求94-96中任一项所述的抗神经酰胺单链可变片段(scFv)的方法，所述方法包括将根据权利要求98所述的表达载体引入宿主细胞中。
101.一种抑制有需要的受试者的细胞凋亡的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-88中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段或者根据权利要求94-96中任一项所述的抗神经酰胺scFv。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述细胞凋亡与选自移植物抗宿主病、辐射病、GI综合征和自身免疫病的疾病相关。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述疾病是辐射病或GI综合征，并且在所述受试者暴露于辐射前施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
104.根据权利要求102所述的方法，其中所述疾病是移植物抗宿主病，并且在所述受试者接受移植前施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述移植是骨髓移植。
106.根据权利要求101所述的方法，其中将所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段静脉内、肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、滑膜内、鞘内、口服、局部或经由吸入施用。
107.一种用于减轻患有GI综合征的受试者的细胞凋亡的方法，所述方法包括在所述受试者暴露于贯穿辐射后，向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-89中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段或者根据权利要求94-96中任一项所述的抗神经酰胺scFv。
108.根据权利要求107所述的方法，其中在所述受试者暴露于贯穿辐射后立即施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
109.根据权利要求107所述的方法，其中在所述受试者暴露于贯穿辐射后24小时内施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
110.一种用于抑制患有GvHD的受试者的细胞凋亡的方法，所述方法包括在所述受试者接受移植前或在所述受试者接受移植后在GvHD发病前，向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-89中任一项所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段或者根据权利要求94-96中任一项所述的抗神经酰胺scFv。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述移植是骨髓移植。
CN202180034154.0A 2020-03-18 2021-03-18 抗神经酰胺抗体 Pending CN115811987A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202062991232P 2020-03-18 2020-03-18
US62/991,232 2020-03-18
PCT/US2021/022914 WO2021188770A1 (en) 2020-03-18 2021-03-18 Anti-ceramide antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115811987A true CN115811987A (zh) 2023-03-17

Family

ID=77771401

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180034154.0A Pending CN115811987A (zh) 2020-03-18 2021-03-18 抗神经酰胺抗体

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20230167197A1 (zh)
EP (1) EP4121110A1 (zh)
JP (1) JP2023534779A (zh)
KR (1) KR20230031814A (zh)
CN (1) CN115811987A (zh)
AU (1) AU2021236669A1 (zh)
BR (1) BR112022018682A2 (zh)
CA (1) CA3172201A1 (zh)
IL (1) IL296550A (zh)
MX (1) MX2022011591A (zh)
WO (1) WO2021188770A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112017002433A2 (pt) 2014-08-07 2017-11-28 Ceram Therapeutics anticorpos anticeramida

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110043786A (ko) * 2008-08-20 2011-04-27 센토코 오르토 바이오테크 인코포레이티드 조작된 항-ｉｌ-13 항체, 조성물, 방법 및 용도
BR112017002433A2 (pt) * 2014-08-07 2017-11-28 Ceram Therapeutics anticorpos anticeramida

Also Published As

Publication number Publication date
IL296550A (en) 2022-11-01
US20230167197A1 (en) 2023-06-01
CA3172201A1 (en) 2021-09-23
BR112022018682A2 (pt) 2023-02-14
JP2023534779A (ja) 2023-08-14
MX2022011591A (es) 2023-03-06
AU2021236669A1 (en) 2022-11-10
KR20230031814A (ko) 2023-03-07
EP4121110A1 (en) 2023-01-25
WO2021188770A1 (en) 2021-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI830761B (zh) 針對cldn18.2和cd3之抗體構建體
JP7425604B2 (ja) 抗ｃｔｌａ４－抗ｐｄ－１二機能性抗体、その医薬組成物および使用
JP7011574B2 (ja) Ｆｌｔ３及びｃｄ３に対する抗体構築物
TWI744242B (zh) Egfrviii及cd3抗體構築體
JP2018530996A (ja) Ｃｄ７０及びｃｄ３に対する抗体構築物
JP2018530996A6 (ja) Ｃｄ７０及びｃｄ３に対する抗体構築物
JP2017522892A (ja) Ｃｄｈ１９およびｃｄ３に対する抗体コンストラクト
EP2580241B1 (en) Annexin 1 antibody
JP2018512860A (ja) Ｃｄｈ３及びｃｄ３に対する二重特異性抗体構築物
TW202126691A (zh) Ｃｄ３９的高親和力抗體及其用途
JP2019514871A (ja) 骨髄性白血病の治療方法で使用するための、ｃｄ３３とｃｄ３に結合する二重特異性構築物の投与の方法
IL293138A (en) Antibodies to cd3 and bcma and bispecific binding proteins produced from them
JP2023134497A (ja) Ｍｕｃ１７及びｃｄ３に向けられる二重特異性抗体コンストラクト
KR20200041835A (ko) 재조합 이중특이적 항체
JP2022537650A (ja) 生物製剤の製造における自動化された生物量に基づく灌流制御
US20230167197A1 (en) Anti-ceramide antibodies
EP4292611A1 (en) Anti-cd112r antibody and use thereof
JP2021501583A (ja) 抗体および使用方法
WO2023179443A1 (en) Anti-her2/anti-cd47 molecules and uses thereof
WO2021143858A1 (en) ANTI-NKp30 ANTIBODIES AND METHODS OF USE
US20210395298A1 (en) Downstream processing of bispecific antibody constructs
JP2023527972A (ja) Ｃｄ３３及びｃｄ３に結合する二重特異性コンストラクトの有害作用軽減投与
CN114269788A (zh) 一种能够与人4-1bb结合的分子及其应用
CN116133684A (zh) 抗人nr1抗体衍生物
EA046123B1 (ru) Конструкция на основе биспецифического антитела, направленная на muc17 и cd3

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination