CN117836003A

CN117836003A - Ros（活性氧类）产生增强剂

Info

Publication number: CN117836003A
Application number: CN202280057409.XA
Authority: CN
Inventors: 胜见惠子; 大屋顺平; 石井敬介; 阪本爱弥
Original assignee: Perseus Proteomics Inc
Current assignee: Perseus Proteomics Inc
Priority date: 2021-08-26
Filing date: 2022-08-26
Publication date: 2024-04-05
Also published as: WO2023027164A1

Abstract

本发明的课题在于提供ROS产生增强剂。根据本发明，可以提供一种包含识别转铁蛋白受体的物质的ROS产生增强剂。

Description

ROS(活性氧类)产生增强剂

技术领域

本发明涉及包含识别转铁蛋白受体的物质的ROS产生增强剂、铁蛋白分解促进剂、铁死亡诱导剂和细胞凋亡诱导剂。

背景技术

转铁蛋白受体(Transferrin receptor；TfR)作为用于将与转铁蛋白(Tf)结合的铁摄入细胞内的细胞膜结构，最初在网织红细胞上被鉴定。此后，已知TfR在胎盘的滋养膜细胞、活化的淋巴细胞、以及各种各样的肿瘤细胞等中表达。例如，有报告TfR在乳癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、大肠癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、宫颈癌、脑肿瘤、慢性淋巴性白血病、非霍奇金淋巴瘤、成人T细胞白血病中高表达。另外，TfR在各种癌细胞表面高表达，而在正常细胞中的表达低，因此能够作为癌治疗的分子靶标。例如，专利文献1中，记载了能够特异性识别转铁蛋白受体的抗体和使用了上述抗体的抗癌剂。专利文献2中记载了抑制铁向细胞内摄取的抑制剂，其包含识别人转铁蛋白受体的第629位～第633位氨基酸的抗体。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO2014/073641号公报

专利文献2：国际公开WO2020/105621号公报

发明内容

发明所要解决的课题

如上所述，已知将识别转铁蛋白受体的物质作为抗癌剂的使用和作为铁的摄取抑制剂使用，但是，关于识别转铁蛋白受体的物质对于细胞内的铁蛋白表达和对ROS产生的影响仍不明确，并且，对于识别转铁蛋白受体的物质是否通过增加ROS产生而由铁死亡和细胞凋亡诱导细胞死亡也是不明确的。本发明以提供ROS产生增强剂、铁蛋白分解促进剂、铁死亡诱导剂和细胞凋亡诱导剂作为所要解决的课题。

用于解决课题的方法

本发明的发明人为了解决上述课题而进行了研究，结果发现，转铁蛋白受体结合物质促进铁蛋白的分解而增强ROS产生，由此抑制细胞增殖或者导致细胞死亡，从而完成了本发明。

即，根据本发明，可以提供以下的发明。

(1)一种包含识别转铁蛋白受体的物质的ROS产生增强剂。

(2)一种包含识别转铁蛋白受体的物质的铁蛋白分解促进剂。

(3)一种包含识别转铁蛋白受体的物质的铁死亡诱导剂。

(4)一种包含识别转铁蛋白受体的物质的细胞凋亡诱导剂。

(5)如(1)～(4)中任一项所述的剂，其中，识别转铁蛋白受体的物质为识别转铁蛋白受体的抗体。

(6)如(5)所述的剂，其中，识别转铁蛋白受体的抗体是识别人转铁蛋白受体的抗体。

(7)如(6)所述的剂，其中，识别人转铁蛋白受体的抗体是识别人转铁蛋白受体的第629位～第633位氨基酸的抗体、或抑制其它抗体与人转铁蛋白受体的第629位～第633位氨基酸的结合的抗体。

(8)如(5)～(7)中任一项所述的剂，其中，上述抗体是重链第1互补决定区(VHCDR1)、重链第2互补决定区(VH CDR2)、重链第3互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3并且轻链第1互补决定区(VL CDR1)、轻链第2互补决定区(VL CDR2)、轻链第3互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体。

(9)如(5)～(8)中任一项所述的剂，其中，上述抗体是作为重链可变区具有序列号7、作为轻链可变区具有序列号8的抗体。

(10)如(5)～(7)中任一项所述的剂，其中，上述抗体是如下(a)～(d)的抗体中的任一种：

(a)重链第1互补决定区(VH CDR1)、重链第2互补决定区(VH CDR2)、重链第3互补决定区(VH CDR3)分别为序列号11、12、13并且轻链第1互补决定区(VL CDR1)、轻链第2互补决定区(VL CDR2)、轻链第3互补决定区(VL CDR3)分别为序列号14、15、16的抗体；

(b)重链第1互补决定区(VH CDR1)、重链第2互补决定区(VH CDR2)、重链第3互补决定区(VH CDR3)分别为序列号17、18、19并且轻链第1互补决定区(VL CDR1)、轻链第2互补决定区(VL CDR2)、轻链第3互补决定区(VL CDR3)分别为序列号20、21、22的抗体；

(c)重链第1互补决定区(VH CDR1)、重链第2互补决定区(VH CDR2)、重链第3互补决定区(VH CDR3)分别为序列号23、24、25并且轻链第1互补决定区(VL CDR1)、轻链第2互补决定区(VL CDR2)、轻链第3互补决定区(VL CDR3)分别为序列号26、27、28的抗体；和

(d)重链第1互补决定区(VH CDR1)、重链第2互补决定区(VH CDR2)、重链第3互补决定区(VH CDR3)分别为序列号29、30、31并且轻链第1互补决定区(VL CDR1)、轻链第2互补决定区(VL CDR2)、轻链第3互补决定区(VL CDR3)分别为序列号32、33、34的抗体。

(11)如(10)所述的剂，其中，上述抗体是如下抗体中的任一种：

作为重链可变区具有序列号35、作为轻链可变区具有序列号36的抗体；

作为重链可变区具有序列号37、作为轻链可变区具有序列号38的抗体；

作为重链可变区具有序列号39、作为轻链可变区具有序列号40的抗体；或

作为重链可变区具有序列号41、作为轻链可变区具有序列号42的抗体。

(12)如(5)～(11)中任一项所述的剂，其中，抗体为人抗体或人源化抗体。

(13)如(5)～(12)中任一项所述的剂，其中，抗体为选自Fab、Fab'、F(ab')₂、单链抗体(scFv)、多特异性抗体、二硫键稳定性V区域(dsFv)和包含CDR的肽中的抗体片段。

(A1)一种增强ROS产生的方法，其包括将识别转铁蛋白受体的物质向对象施用的步骤。

(A2)一种促进铁蛋白的分解的方法，其包括将识别转铁蛋白受体的物质向对象施用的步骤。

(A3)一种诱导铁死亡的方法，其包括将识别转铁蛋白受体的物质向对象施用的步骤。

(A4)一种诱导细胞凋亡的方法，其包括将识别转铁蛋白受体的物质向对象施用的步骤。

(B1)用于在增强ROS产生的治疗中使用的、识别转铁蛋白受体的物质。

(B2)用于在促进铁蛋白分解的治疗中使用的、识别转铁蛋白受体的物质。

(B3)用于在诱导铁死亡的治疗中使用的、识别转铁蛋白受体的物质。

(B4)用于在诱导细胞凋亡的治疗中使用的、识别转铁蛋白受体的物质。

(C1)识别转铁蛋白受体的物质用于制造ROS产生增强剂的应用。

(C2)识别转铁蛋白受体的物质用于制造铁蛋白分解促进剂的应用。

(C3)识别转铁蛋白受体的物质用于制造铁死亡诱导剂的应用。

(C4)识别转铁蛋白受体的物质用于制造细胞凋亡诱导剂的应用。

发明的效果

根据本发明，能够提供新型的ROS产生增强剂、铁蛋白分解促进剂、铁死亡诱导剂和细胞凋亡诱导剂。

附图说明

图1表示各个TfR突变片段的进行点突变的位点。

图2表示TfR436与可溶性野生型TfR(sTfR)和TfR突变片段的反应性。

图3表示TfR436的Tf-TfR结合抑制活性。

图4表示由TfR436得到的增殖抑制效果。

图5表示由TfR436得到的铁蛋白分解效果。

图6表示由TfR436得到的ROS产生增加效果。

图7表示由TfR436得到的Caspase(半胱氨酸蛋白酶)3/7活性量增加效果。

图8表示由TfR436得到的细胞周期停止效果。

图9表示利用多个TfR抗体研究铁蛋白表达量变化的结果。

图10表示利用多个TfR抗体研究ROS量变化的结果。

具体实施方式

接着，对本发明更详细地进行说明。

定义和常规技术

本说明书中只要没有特别定义，关于本发明使用的科学技术术语包含本领域技术人员所通常理解的意义。一般而言，本说明书中关于所记载的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学以及杂交所使用的命名法及其技术是本领域所公知的，可以普通使用。

本发明的方法和技术只要没有特别例示，一般可以根据本领域公知的现有方法，在本说明书的全文中引用，如所阐述的各种一般性参照文献或更具体的参照文献中所记载的那样来实施。

铁蛋白分解、ROS产生的增强、和铁死亡诱导

铁死亡是细胞死亡机制之一。据认为以细胞内自由铁(Fe²⁺)为催化剂，细胞膜磷脂质的过氧化反应连锁发生，脂质羟基自由基积蓄，由此导致细胞死亡。作为细胞内的铁死亡的发生机理，设想为自噬的诱发、铁蛋白的分解、Fe²⁺的增加、ROS产生的增加、铁死亡诱导(细胞死亡)这样的机理(Jing Du et al,Free Radical Biology and Medicine131(2019)356-369)。在后述的实施例4中，确认到识别转铁蛋白受体的抗体使细胞中的铁蛋白减少。另外，在实施例5中，确认到识别转铁蛋白受体的抗体使细胞内的ROS产生增加。并且，在实施例3和8中，确认到识别转铁蛋白受体的抗体抑制细胞的增殖和降低细胞的生存率。根据上述的实施例3～5、8的结果，暗示了作为由识别转铁蛋白受体的抗体抑制细胞的增殖的机理之一，发生铁蛋白分解和ROS产生的增加，由此抑制细胞的增殖。

线粒体ROS产生的增强、和细胞凋亡诱导

线粒体内产生的ROS的增强使细胞凋亡信号活化。细胞凋亡存在称为内源性和外源性2个通路，内源性通路中，通过细胞应激、DNA损伤、发生的信号、生存因子的除去而被活化，外源性通路中，通过Fas、TNFR1、TRAIL等配体使细胞表面的细胞死亡受体活化，由此，最终Caspase3和Caspase7被活化，诱导细胞凋亡进行直至细胞死亡。根据实施例6的结果可以考虑在某细胞株中诱导了细胞凋亡。

细胞周期的停止

细胞经历称为M期、G1期、S期、G2期的规律周期，分裂为2个子细胞。将这一系列过程称为细胞周期，在该过程中，铁需求性酶发挥作用，因此，在切断铁供给的状况下，该周期停止，均会导致细胞死亡。可以认为实施例7的结果展示了该过程。

TfR

在人的情况下，转铁蛋白受体(TfR)是由在人的第三染色体上编码的760个氨基酸构成的一次跨膜型蛋白(序列号9)。该蛋白作为CD71抗原已知，参与细胞对铁的摄取，认为与细胞的增殖相关。本发明的TfR在结构上没有特别限定，也包括单体、多聚体、在细胞膜表达的完整型(intact form)、构成细胞外区域的可溶型、截短型(truncted form)、以及由于基因的变异、缺损等得到的突变型(mutation form)、受到磷酸化等翻译后修饰的型等，是指全部的TfR。

序列号9

Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu ProLeu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp Asn Ser His ValGlu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala Asp Asn Asn Thr Lys Ala AsnVal Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val IleVal Phe Phe Leu Ile Gly Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val GluPro Lys Thr Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu ProGly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys

Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile

Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln

Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe

Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val

Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg

Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys

Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys

Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile

Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu

Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe

Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly

Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln

Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr

Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp

Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser

Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile

Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp

His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala

Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met

Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile

Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr

Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr

Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val

Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn

Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp

Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe

Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp

Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu

Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu

Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn

Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp

Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln

Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu

Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys

Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser ProTyrVal Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser Gly Ser His ThrLeu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys Gln Asn Asn Gly Ala Phe AsnGlu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala AlaAsn Ala Leu Ser Gly Asp

Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe

反应和反应性

在本说明书中，“反应”和“反应性”只要没有特别例示，是指相同的意思。即，抗体识别抗原。该抗原可以是在细胞膜表达的完整TfR，也可以是截短型、可溶型。另外，可以是保持立体结构的TfR，也可以是经改性的TfR。作为研究反应性的方法，可以列举流式细胞术(FACS)、酶联免疫吸附检测法(ELISA)、western-blot、荧光微量测定技术(FMAT)表面等离子共振(BIAcore)、免疫染色、免疫沉淀等。

作为流式细胞术所使用的抗体，可以是利用FITC等荧光物质、生物素等进行了标记的抗体，也可以是没有被标记的抗体。根据所使用的抗体的标记的有无、其种类，使用荧光标记亲和素、荧光标记抗人免疫球蛋白抗体等。反应性能够通过对检测体添加充分量的抗TfR抗体(通常最终浓度为0.01～10μg/mL)，与阴性对照抗体、阳性对照抗体的反应性进行比较来评价。

识别转铁蛋白受体的物质

在本发明中，使用识别转铁蛋白受体的物质。作为识别转铁蛋白受体的物质，没有特别限定，例如，能够使用选自核酸(核酸适配体、Decoy核酸等)、核酶、抗体及其片段、肽、环状肽、肽模拟物中的至少1种。例如，Wilner et al.,Molecular Therapy-Nucleic Acids(2012)1,e21；doi:10.1038/mtna.2012.14中，记载了模拟转铁蛋白的适配体。另外，JaeH.Lee et al.,Eur.J.Biochem.268,2004-2012(2001)中，记载了以转铁蛋白受体为靶标的肽。本发明中能够使用这样的核酸、肽等。

抗体

本说明书中，根据需要，遵从习惯使用以下的缩写(括号内)。

重链(H链)、轻链(L链)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、互补决定区(CDR)、第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)、第3互补决定区(CDR3)、重链的第1互补决定区(VH CDR1)、重链的第2互补决定区(VH CDR2)、重链的第3互补决定区(VH CDR3)轻链的第1互补决定区(VL CDR1)、轻链的第2互补决定区(VL CDR2)、轻链的第3互补决定区(VLCDR3)。

在本说明书中，“抗体”这一术语与免疫球蛋白意思相同，能够如本领域通常所知道的那样理解。具体而言，抗体这一术语不受制作抗体的任意特定方法限定。例如，抗体这一术语中有重组抗体、单克隆抗体、多克隆抗体，但不仅限定于这些。

在本说明书中，“人抗体”这一术语是指可变区和恒定区的序列为人序列的任意的抗体。该术语包含虽然具有来自人基因的序列但例如以除去了认为可能降低免疫原性、增加亲和性、引起不期望的折叠的半胱氨酸等的方式发生变化的抗体。该术语还包括能够对人细胞施以非特有的糖基化、在非人细胞中通过重组制得的这样的抗体。这些抗体能够以各种方式制备。

在本说明书中，“人源化抗体”这一术语是指非人由来的抗体，非人种的抗体序列中特征性的氨基酸残基取代为认为是人抗体的对应位置中的残基。该“人源化”的工序认为能够使其结果所得到的抗体在人的免疫原性降低。应当理解为能够使用在本领域中公知的技术将非人由来的抗体人源化。例如，可以参照Winter等，Immunol.Today14：43～46(1993)。作为对象的抗体能够通过取代为对应CH1、CH2、CH3、铰链区和/或框架区的人序列的重组DNA技术以基因工程学的方法制作。例如，能够参照WO92/02190、以及美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,792号、第5,714,350号和第5,777,085号。在本说明书中，“人源化抗体”这一术语在其意思的范围内包括嵌合人抗体和CDR移植抗体。

在抗体的可变区中，框架区(FR)的序列只要对于所对应抗原的特异结合性没有实质影响即可，没有特别限定。优选使用人抗体的FR区域，也能够使用人以外的动物种类(例如，小鼠、大鼠)的FR区域。

在抗体的一个方式中，除了可变区还包括恒定区(例如IgG型抗体)。恒定区的序列没有特别限定。例如，能够使用公知的人抗体的恒定区。作为人抗体的重链恒定区(CH)，只要是属于人免疫球蛋白(以下，记为hIgG)的即可，可以任意，但优选hIgG类，进一步而言，能够使用属于hIgG类的hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4这些亚类中的任一种。另外，作为轻链恒定区(CL)，只要是属于hIg即可，可以任意，能够使用κ类或λ类的轻链。另外，也能够使用人以外的动物种类(例如小鼠、大鼠)的恒定区。

在本说明书中，“变异体”、“变异抗体”是指亲本抗体的可变区(CDR序列和/或FR序列)的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入了1个或多个氨基酸。

在本发明中，“亲本抗体”是指VH具有序列号7、VL具有序列号8所示的氨基酸序列的TfR436抗体。在氨基酸序列中，取代、缺失、添加和/或插入有1或多个(例如，1～8个、优选为1～5个、更优选为1～3个、特别优选为1或2个)的氨基酸。作为用于制备对TfR具有结合活性的抗体的氨基酸序列的本领域技术人员所熟知的方法，已知有对蛋白质导入突变的方法。例如，只要是本领域技术人员，则能够使用定点诱变法(Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y,anDNAkagawa,M.(1995)An oligodeoxyribonucleotide-directed dualamber method for site-directed mutagenesis.Gene 152,271-275、Zoller,MJ,andSmith,M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis ofDNA fragments clonedinto M13 vectors.Methods Enzymol.100,468-500、Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW,Kramer,B,Pflugfelder,M,and Fritz,HJ(1984)The gapped duplex DNA approach tooligonucleotide-directed mutation construction.Nucleic Acids Res.12,9441-9456、Kramer W,and Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction ofmutations via gapped duplex DNA Methods.Enzymol.154,350-367、Kunkel,TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypicselection.Proc Natl Acad Sci U S A.82,488-492)等，向对TfR具有结合活性的抗体的氨基酸序列导入适当突变，由此制备与对TfR具有结合活性抗体同等功能的变异抗体。这样，也能够使用在抗体的可变区或恒定区中使1个或多个氨基酸发生突变且对TfR具有结合活性的抗体。

在本说明书中，“活性与亲本抗体同等程度”是指对TfR的结合活性为同等程度。“同等程度”不需要一定是同程度的活性，活性可以增强，或者，只要具有活性，活性也可以减少。作为活性减少的抗体，例如，可以列举与原始的抗体相比具有30％以上的活性、优选为50％以上的活性、更优选为80％以上的活性、进一步优选为90％以上的活性、特别优选为95％以上的活性的抗体。

作为结合活性，是指识别抗原。该抗原可以是在细胞膜表达的完整TfR，也可以是截短型、可溶型。另外，可以是保持立体结构的TfR，也可以是经改性的TfR。例如，作为研究结合活性的方法，可以列举流式细胞术(FACS)、酶联免疫吸附检测法(ELISA)、western-blot、荧光微量测定技术(FMAT)表面等离子共振(BIAcore)等。

抗体的Tf-TfR结合抑制活性能够根据后述的“实施例2(2)TfR436抗体和其它公司抗体在Tf-TfR结合抑制上的比较”所记载的方法进行测定。将TfR溶液分注到基板(96-孔板等)并静置、固相化，进行封闭。接着，分注HRP标记的Tf溶液，进一步添加抗体，在室温使其反应。此后，清洗基板，添加显色试剂(TMB等)使其反应，用酶标仪测定吸光度。通过上述操作，该抗体能够评价Tf-TfR结合抑制活性。

抗体不限定其由来，可以为人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体等来自任意动物的抗体。另外，也可以是嵌合化抗体、人源化抗体等。作为本发明中抗体的优选方式之一，为人抗体。

抗体根据后述的产生抗体的细胞、宿主或纯化方法，氨基酸序列、分子量、等电点或有无糖链、形态等可以不同。例如，本发明中记载的氨基酸序列在翻译后受到修饰的情况也包含在本发明中。另外，对于已知的翻译后修饰以外的位点的翻译后修饰也包含在本发明中。另外，在原核细胞、例如大肠杆菌中表达抗体时，在原来的抗体的氨基酸序列的N末端添加蛋氨酸残基。在本发明中，可以使用这样的抗体。对于已知的翻译后修饰以外的位点的翻译后修饰也包含在本发明中。

抗体的制作

作为本发明中使用的抗体，可以为单克隆抗体和多克隆抗体的任意抗体。单克隆抗体和多克隆抗体能够通过本领域技术人员公知的方法来制作。

作为抗体，可以列举：动物的血中产生的抗体；通过杂交瘤产生的抗体；和由利用基因工程学的方法用包含抗体基因的表达载体转染的宿主产生的抗体；利用噬菌体展示从克隆文库筛选出最佳的抗体，将该基因用CHO细胞生产的抗体；或者使用产生人抗体的转基因小鼠直接得到的人抗体等。

为了制造多克隆抗体，将抗原对兔等动物进行免疫，得到血清。能够将所得到的血清例如通过硫酸铵沉淀、蛋白A吸附柱、蛋白G吸附柱、DEAE离子交换色谱、亲和柱等进行纯化，由此制备多克隆抗体。

为了制造单克隆抗体，将抗原与所期望的佐剂一起对动物进行免疫。在经免疫的动物的血清中确认到所期望的抗体水平上升之后，从动物收集免疫细胞(脾细胞等)，与哺乳动物的骨髓瘤细胞进行细胞融合。通过细胞融合得到的杂交瘤能够通过在通常的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养液)中培养来进行选择。此后，实施有限稀释法，能够筛选产生目标抗体的杂交瘤。

下面，对通过噬菌体展示法制造抗体进行说明。

(1)利用噬菌体展示文库与抗原发生反应的scFv

使用噬菌体展示技术能够提供包含对TfR具有各种亲和性的抗体的全部组成成分(repertory)的文库。接着，对这些文库进行筛选，能够鉴定并分离针对TfR的抗体。优选噬菌体文库是使用由从人B细胞分离的mRNA制备的人VL和VHcDNA生成的scFv噬菌体展示文库。制备并进行筛选的方法在本技术领域中是已知的。以TfR作为抗原进行筛选，从显示反应性的噬菌体克隆体回收遗传物质。对所选择的噬菌体的基因进行解析，就能够确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的VH和VL的DNA序列。使用该scFv的序列，将scFv IgG化，能够获得人抗体。

(2)scFv的IgG化(人抗体的制作)

制作H链和L链的表达载体，在宿主细胞中使其表达，将分泌的上清液回收、纯化，由此得到人抗体。另外，也能够通过将VH和VL以同一载体进行表达(Tandem型)来得到人抗体。这些方法是公知的，能够参照WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、W093/19172、WO95/01438、WO95/15388、WO97/10354等。

具体来说，通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的其它DNA分子连结，能够取得全长的重链基因。人重链恒定区基因的序列在本技术领域中是已知的(例如，Kabat,E.A.等，(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)，包含这些区域的DNA片段能够通过标准的PCR扩增得到。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD的恒定区，最优选为IgG1或IgG2的恒定区。IgG1恒定区序列可以是Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)或Gm(17)等已知在不同的个人之间产生的任意的各种等位基因(allele)或同种异型(allotype)。这些同种异型相当于IgG1恒定区中天然存在的氨基酸取代。

通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的其它DNA分子连结，能够得到全长L链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本技术领域公知的(例如，Kabat,E.A.等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)，包含这些区域的DNA片段能够通过标准的PCR扩增得到。轻链恒定区可以是κ或λ的恒定区。κ恒定区可以是Inv(1)、Inv(2)或Inv(3)等已知在不同的人之间产生的任意的各种等位基因。λ恒定区可以来自3个λ基因中的任一个。

通过将如上所述得到的编码H链和L链的DNA插入表达载体中，制作表达载体，使宿主细胞表达，将分泌的上清液回收、纯化，得到人抗体。表达载体可以列举质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、花椰菜花叶病毒和烟草花叶病毒等的植物病毒、粘粒、YAC、EBV来源附加体(episomes)等。表达载体和表达调节序列以与所使用的表达用宿主细胞相适合的方式选择。抗体轻链基因和抗体重链基因能够插入不同的载体中，另外也能够将两者的基因插入相同表达载体中。将抗体基因通过标准的方法(例如，将抗体基因片段上互补的限制位点与载体连结或在不存在限制位点时使用平滑末端连结)插入表达载体中。

合适的载体是具有通过工程学方法制作的适当的限制位点且能够编码功能完全的人CH或CL免疫球蛋白序列，从而能够容易地插入并表达上述所记载的任意的VH或VL序列的载体。这样的载体中，通常，在被插入的J区域中的剪接提供部位与在人C区域之前的剪接接受部位之间、以及在存在于人CH外显子内的剪接区域也会发生剪接。多腺嘌呤基化和转录结束在位于编码区域的下游的天然的染色体部位发生。重组表达载体还能够编码宿主细胞来源的促进抗体链分泌的信号肽。抗体链基因能够以与信号肽在框内(inframe)与免疫球蛋白链的氨基末端连结的方式克隆到载体中。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽，或者也可以是不同种的信号肽(即非免疫球蛋白蛋白质来源的信号肽)。

抗体的表达载体中，除抗体基因和控制序列外，还可以具有控制载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)或选择标记基因等其它序列。选择标记基因能够促进导入有载体的宿主细胞的选择。例如，通常，标记基因对导入有载体的宿主细胞赋予对G418、潮霉素、氨甲蝶呤等药物的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞中与氨甲蝶呤选择/扩增同时使用)、新霉素磷酸转移酶基因(用于G418选择)和谷氨酸合酶基因。

利用通过上述方法制得的抗体基因表达载体对宿主细胞进行转化。作为宿主细胞，可以是细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等能够产生抗体的任何细胞，优选动物细胞。作为动物细胞，可以列举中国仓鼠卵巣细胞CHO/dhfr(-)细胞CHO/DG44细胞、猴来源细胞COS细胞(A.Wright&S.L.Morrison,J.Immunol.160,3393-3402(1998))、SP2/O细胞(小鼠骨髓瘤)(K.Motmans et al.,Eur.J.Cancer Prev.5,512-5199(1996),R.P.Junghanset al.,Cancer Res.50,1495-1502(1990))等。另外，转化优选使用Lipofectin转化法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,6007(1989),P.L.Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413(1987)、电穿孔法、磷酸钙法(F.L.Graham&A.J.van derEb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran法等。

将转化体培养后，从转化体的细胞内或培养液分离人抗体。抗体的分离、纯化中，能够适当组合利用离心分离、硫酸铵分级分离、盐析、超滤、亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法等方法。

抗体片段

能够基于抗体或基于编码抗体的基因的序列信息制作抗体片段。作为抗体片段,可以列举Fab、Fab′、F(ab′)₂、scFv、dsFv抗体。

Fab是通过将IgG在半胱氨酸的存在下利用木瓜蛋白酶消化得到的由L链和H链可变区、以及CH1区域和铰链部的一部分所构成的H链片段构成的分子量大约5万的片段。本发明中，能够通过将上述抗体利用木瓜蛋白酶进行消化来得到。另外，也能够通过将编码上述抗体的H链的一部分和L链的DNA重组入适当的载体中，由使用该载体转化得到的转化体来制备Fab。

Fab'是将后述的F(ab′)₂的H链间的二硫键切断而得到的分子量为大约5万的片段。在本发明中，将上述抗体利用胃蛋白酶消化，使用还原剂将二硫键切断而得到。另外，与Fab同样，也能够使用编码Fab'的DNA通过基因工程学的方式制备。

F(ab′)₂是通过将IgG利用胃蛋白酶消化而得到的由L链和H链可变区、以及CH1区域和铰链部的一部分所构成的H链片段构成的片段(Fab′)通过二硫键结合而成的分子量大约10万的片段。本发明中，能够通过将上述抗体利用胃蛋白酶消化来得到。另外，与Fab同样，也可以使用编码F(ab′)₂的DNA通过基因工程学的方式制备。

scFv是将由H链可变区和L链可变区构成的Fv利用适当的连接肽将一方的链的C末端与另一方的N末端连结并单链化的抗体片段。作为连接肽，例如能够使用柔软性高的(GGGGS)₃等。例如，能够使用编码上述抗体的H链可变区和L链可变区的DNA与编码连接肽的DNA构建编码scFv抗体的DNA，将其重组入适当的载体，由使用该载体转化得到的转化体来制备scFv。

dsFv是在H链可变区和L链可变区的适当的位置导入Cys残基，并且将H链可变区与L链可变区通过二硫键稳定化的Fv片段。各链中的Cys残基的导入位置能够基于利用分子模拟所预测的立体结构来确定。在本发明中，例如，能够从上述抗体的H链可变区和L链可变区的氨基酸序列预测立体结构，基于该预测，构建分别编码导入了突变的H链可变区和L链可变区的DNA，将其重组入适当的载体，由使用该载体转化得到的转化体来制备dsFv。

另外，也能够使用适当的接头将scFv抗体、dcFv抗体等连结，或者使链霉亲和素融合等来将抗体片段多聚体化。

多特异性抗体

抗体只要识别TfR即可，可以为同时识别TfR以外的靶标的多特异性抗体。特别是经常使用双特异性抗体。

双特异性抗体表示组合了一个识别TfR的分子和另一个以其它分子为靶标的分子的抗体。例如，可以列举2分子的单克隆抗体通过化学交联得到的双特异性(mab)₂、2分子的Fab片段通过化学交联得到的双特异性F(ab′)₂、四源杂交瘤(quadroma)、bsDb(bispecificdiabody，双特异双体抗体)、scBsDb(single-chain bispecific diabody，单链双特异双体抗体)、scBsTaFv(single-chain bispecific tandem variabledomain，单链双特异双座可变区)、Bite(Bispecific T cell Engager antibody，双特异T细胞定向抗体)、DNL-F(ab)₃(docl-and-lock trivalent Fab，对接锁定三价Fab)等(Shim,H.Bispecific Antibodiesand Antibody-Drug conjugates for Cancer Therapy:TechnologicalConsiderations.Biomolecules 2020,10,360)，形态不限定于此。

医药组合物和制剂

包含本发明的ROS产生增强剂、铁蛋白分解促进剂、铁死亡诱导剂和细胞凋亡诱导剂的医药组合物和制剂也包括在本发明的范围内。

本发明的ROS产生增强剂、铁蛋白分解促进剂、铁死亡诱导剂和细胞凋亡诱导剂能够在需要增强ROS产生、促进铁蛋白分解、诱导铁死亡或诱导细胞凋亡的对象中用于通过ROS产生增强、铁蛋白分解促进、铁死亡诱导或细胞凋亡诱导剂进行治疗。

包含本发明的ROS产生增强剂、铁蛋白分解促进剂、铁死亡诱导剂和细胞凋亡诱导剂的医药组合物和制剂优选除了识别转铁蛋白受体的物质以外还包含生理学上可接受的稀释剂或载体(carrier)。适当的载体包括生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、磷酸缓冲生理盐水葡萄糖液和缓冲生理盐水，但不限于这些。或者，识别转铁蛋白受体的物质也可以通过冻结干燥(冻干)，在需要时添加如上所述的缓冲水溶液而重构后使用。作为给药方式，可以列举片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等口服给药、或注射剂(皮下注射、静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射等)、经皮、经粘膜、经鼻、经肺、栓剂等非口服给药。

本发明的ROS产生增强剂、铁蛋白分解促进剂、铁死亡诱导剂和细胞凋亡诱导剂的给药量根据症状、年龄、体重等而不同，通常，在口服给药中，作为抗体的量，对于成人，1天为大约0.001mg/kg～1000mg/kg，能够将其1次给药或分成多次给药。另外，在非口服给药中，能够将1次大约0.001mg/kg～1000mg/kg的量通过皮下注射、肌肉注射或静脉注射来给药。

通过以下的实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不受实施例限定。

实施例

在以下的实施例中，使用了在国际公开WO2014/073641号公报的第0090和0091段中记载的TfR436抗体。

将TfR436抗体的CDR序列示于下方。

VH CDR1：SYGMH(序列号1)

VH CDR2：VISYDGSNKYYADSVKG(序列号2)

VH CDR3：DSNFWSGYYSPVDV(序列号3)

VL CDR1：TRSSGSIASNSVQ(序列号4)

VL CDR2：YEDTQRPS(序列号5)

VL CDR3：QSYDSAYHWV(序列号6)

将TfR436抗体的VH序列和VL序列示于下方。

TfR436 VH(序列号7)

DVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFPFKSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRGEDTAVYYCARDSNFWSGYYSPVDVWGQGTTVTVSS

TfR436 VL(序列号8)

NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNSVQWYQQRPGSAPITVIYEDTQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLQTEDEADYYCQSYDSAYHWVFGGGTKLAVL

另外，在实施例9和10中，使用国际公开WO2012/153707号公报的第0083段中记载的TfR007抗体、TfR014抗体、TfR017抗体和TfR018抗体。

将TfR007抗体、TfR014抗体、TfR017抗体和TfR018抗体的CDR序列示于下方。

TfR007

VH CDR1：序列号11、VH CDR2：序列号12、VH CDR3：序列号13

VL CDR1：序列号14、VL CDR2：序列号15、VL CDR3：序列号16

TfR014

VH CDR1：序列号17、VH CDR2：序列号18、VH CDR3：序列号19

VL CDR1：序列号20、VL CDR2：序列号21、VL CDR3：序列号22

TfR017

VH CDR1：序列号23、VH CDR2：序列号24、VH CDR3：序列号25

VL CDR1：序列号26、VL CDR2：序列号27、VL CDR3：序列号28

TfR018

VH CDR1：序列号29、VH CDR2：序列号30、VH CDR3：序列号31

VL CDR1：序列号32、VL CDR2：序列号33、VL CDR3：序列号34

序列号11：SYWLS

序列号12：KIDPSDSYTQYSPSFEG

序列号13：HGYDAFHV

序列号14：SGSSSNIGNNAVN

序列号15：YDDLLPS

序列号16：AAWDDSLNGWV

序列号17：ELSMH

序列号18：GFDPEDGETIYAQKFQG

序列号19：DAYYGSGSPRDAFDI

序列号20：GGDNVGGKSLH

序列号21：DDRDRPS

序列号22：QVWDDISRLVI

序列号23：DYAMY

序列号24：GINWNSAIIGYADSVKG

序列号25：EALYYSAFFDS

序列号26：SGSSSNIGNNYVS

序列号27：DNNKRPS

序列号28：GTWDSSLSAWV

序列号29：DYAMH

序列号30：GINWNGGSTDYADSVEG

序列号31：DYADLGSGSDY

序列号32：SGSRSNIGSNYVH

序列号33：RNDQRPS

序列号34：ASWDDKMSGRL

将TfR007抗体的VH序列和VL序列示于下方。

TfR007 VH(序列号35)

EVQLVESGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTSYWLSWVRQLPGKGLEWMGKIDPSDSYTQYSPSFEGQVTISADKSSNTAYLQWSSLKASDTAIYYCARHGYDAFHVWGQGTTVTVSR

TfR007 VL(序列号36)

QSVLTQPPSVSEAPRQRVTISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLISYDDLLPSGVSDRFSGSTSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC

将TfR014抗体的VH序列和VL序列示于下方。

TfR014 VH(序列号37)

QVQLQQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDAYYGSGSPRDAFDIWGQGTTVTVSR

TfR014 VL(序列号38)

SYVLTQPPSVSVAPGETATITCGGDNVGGKSLHWYQVKPGQAPVLVVFDDRDRPSGIPDRFSGANSRDTAALTISRVEAGDEADYYCQVWDDISRLVIFGGGTRLTVLRQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSRQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC

将TfR017抗体的VH序列和VL序列示于下方。

TfR017 VH(序列号39)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMYWVRQAPGKGLEWVSGINWNSAIIGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYFCAKEALYYSAFFDSWGQGTLVTVSR

TfR017 VL(序列号40)

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSRSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVVGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELRANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC

将TfR018抗体的VH序列和VL序列示于下方。

TfR018 VH(序列号41)

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYAMHWVRQSPGKGLEWVSGINWNGGSTDYADSVEGRFTISRDNAANSLFLQMNSLRAEDTAIYYCARDYADLGSGSDYWGQGTLVTVSS

TfR018 VL(序列号42)

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSRSNIGSNYVHWYQQLPGAAPKLLIYRNDQRPSGVPDRFSGSRSDTSAFLAISGLRSEDEADYYCASWDDKMSGRLFGGGTKVTVLSQPKAAPSVTLFPPSSEELRANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC

实施例1：TfR436抗体的结合部位的鉴定

TfR436抗体与小鼠TfR不发生交叉免疫反应，但与仓鼠TfR显示了交叉免疫反应性。进行了TfR中的Transferrin(转铁蛋白，TF)结合部位(第569～760位的氨基酸)的氨基酸序列的比对。在人TfR序列中，选取了与仓鼠相同而与小鼠不同的氨基酸。将所选取的氨基酸如图1所示那样进行点突变，制作了可溶性TfR突变片段。

(1)可溶性野生型TfR(sTfR)和TfR突变片段(MF1～MF7)的制作

合成编码人TfR细胞外区域(第89～760位的氨基酸)、或者图1所示的各个TfR突变片段(MF1～MF7)、和AAARGGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH(序列编号10)的碱基序列。在表达载体pCAGGS(非专利文献2：Niwa et al.1991)中重组入新霉素抗性基因和DHFR基因而得到的载体的多克隆位点分别插入所合成的基因，制作了pCAGGS-Neo-DHFR-sTFR-myc-his表达质粒。使用Expifectamine(Thermo Fisher Scientific)对Expi293细胞(Thermo FisherScientific)转化上述质粒，在37℃、8％CO₂以135rpm培养5天。此后通过离心回收培养上清液，将AKTA prime(Cytiva)与HisTrapHP(Cytiva)柱连接，使用20mM咪唑/DPBS作为结合缓冲液，使用500mM咪唑/DPBS作为洗脱缓冲液，纯化sTfR或MF1～MF7。洗脱的蛋白质使用Zeba离心柱(Zeba spin column，Thermo Fisher Scientific)在30mM HEPES、5％海藻糖、pH7.2中缓冲交换。

(2)TfR436抗体的结合部位的鉴定

将上述纯化的sTfR或MF1～MF7用PBST(含Tween20的磷酸盐缓冲盐水，TaKaRa)稀释，并从600ng/mL以3倍稀释制备为7阶的稀释液。然后，将稀释液以100μL/孔的量分注到Ni-NTA HisSorb Strips96-孔板(QIAGEN)中，置于振荡器上，在室温下反应。1小时后，用PBST缓冲液清洗5次，以100μL/孔的量分注TfR436抗体(1ug/mL)，置于振荡器上，在室温下反应1小时。然后，用PBST缓冲液清洗5次，以100μL/孔的量分注50,000倍稀释后的二次抗体F(ab')₂片段抗人IgG Fcγ(Jackson Immuno Research)，在室温下反应1小时。用PBST缓冲液清洗5次后，以100μL/孔的量分注TMB可溶性试剂(高灵敏度)(Scy Tek)，在室温下在暗处反应3分钟，然后将TMB终止缓冲液(Scy Tek)以100μL/孔的量添加到孔中，用振荡器振荡1分钟，用酶标仪测定450nm(对照620nm)的吸光度。

结果如图2所示，可观察到TfR436抗体与TfR突变片段MF5的反应性降低，与其它的突变片段的反应性未观察到降低。也就是说，将TfR的第629位、第630位、第633位氨基酸取代为其它的氨基酸时，TfR436抗体无法识别TfR。这暗示第629位～第633位氨基酸是TfR436抗体的识别位点。

实施例2：TfR436抗体和比较用抗体在Tf-TfR结合抑制中的比较

(1)比较用抗体A24的制作

在专利文献US2008/0193453中记载了针对人TfR的A24抗体。为了比较TfR436抗体与该抗体，获得了保藏的杂交瘤，生产了抗体。具体来说，将杂交瘤在RPMI1640(GIBCO)、FBS10％的培养基中以使细胞浓度成为1～2×10⁵/mL的方式接种，在37℃的5％CO₂恒温箱中培养。扩大培养后，通过离心回收细胞，利用PBS清洗2次后，在无血清培养基cosmedium005(Cosmo bio)、0.5％Nutridoma-CS(Roche)中扩大培养至550mL。细胞变成融合后，在5天后通过离心回收了培养上清液。

将回收的上清液施用于Protein A载体(Ab-Capcher ExTra：Protenova)，将与Protein A结合的抗体利用0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH2.7)洗脱，迅速用1M Tris盐酸缓冲液(pH 8.5)进行中和。之后使用Ultracel超滤盘(Merck)在PBS中进行缓冲交换。

(2)TfR436抗体和其它公司抗体在Tf-TfR结合抑制中的比较

将实施例1中记载的sTfR在PBST中调整为5.0μg/mL，在MaxiSorp96-孔板(Nunc)中以100μL/孔的量分注稀释液，在4℃静置一晩进行固相化。次日弃掉固相液，以200μL/孔的量加入100％Block Ace(DS Pharma Biomedical)，在室温静置，进行封闭。1小时后利用PBST缓冲液清洗5次后，以50μL/孔的量分注HRP标记的Tf(2ug/mL)，之后进一步以50μL/孔的量添加TfR436抗体、A24抗体(从10μg/mL稀释2倍的系列)或holo-Tf((Merck)从300μg/mL稀释2倍的系列)。在室温反应1小时后，利用PBST缓冲液清洗5次，以100μL/孔的量分注TMB可溶性试剂(高灵敏度)，在室温下在暗处进行反应。25分钟后，以100μL/孔的量添加TMB终止缓冲液，用振荡器震动1分钟，用酶标仪测定450nm(对照620nm)的吸光度。

结果如图3所示，TfR436抗体以极低的用量(100ng/mL)完全地抑制了Tf-TfR的结合。另一方面，A24抗体即使以10μg/mL的用量也未能完全抑制Tf-TfR的结合，仅仅抑制了50％的Tf-TfR的结合。暗示在Tf-TfR的结合抑制中TfR436抗体更为优异。

实施例3：由TfR436抗体引起的增殖抑制效果

检验由TfR436抗体暴露引起的增殖抑制效果。具体而言，将MV4；11、Kasumi-1和HNT-34以成为1000个/50μL的方式悬于各种最佳的细胞培养用培养基，在96孔板中接种。对TfR436抗体和阴性对照单克隆抗体，使用同样的培养基，分别从最终浓度5μg/mL(33.3nM)以公比3.16倍的方式9段稀释。将这些抗体添加培养基和抗体无添加培养基向各细胞株各添加50μL。在37℃的5％CO₂孵育箱内培养96小时后，在各孔中添加20μL的CellTiter96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega#G3580)并混合，在37℃的5％CO₂孵育箱内静置4小时后，检测505nm的吸光度。将仅添加培养基的孔作为空白对照，将不添加抗体的孔的平均值设为增殖率100％，算出各抗体浓度下的增殖率。

将结果示于图4。TfR436抗体与阴性对照单克隆抗体(Nega Ab)相比，确认到抑制了各细胞株的增殖。

实施例4：由TfR436抗体引起的铁蛋白量变化

通过免疫蛋白印迹检验由TfR436抗体暴露引起的铁蛋白量变化。具体而言，将MV4；11、Kasumi-1和HNT-34以成为1.0×10⁵细胞/mL的方式悬浮于各种最佳的细胞培养用培养基，在T75烧瓶或T150烧瓶中接种。将添加了TfR436抗体或阴性对照单克隆抗体的烧瓶和不添加抗体的烧瓶在37℃的5％CO₂孵育箱内培养。其中，TfR436抗体的最终浓度根据由实施例3的TfR436各抗体浓度下的增殖率算出的各细胞株的GI50值配制，阴性对照单克隆抗体的最终浓度以成为与TfR436抗体同浓度的方式配制。在添加抗体4、24、48、96小时后回收细胞，用PBS清洗之后，将各细胞株1.0×10⁶cells悬浮于100μL Complete Lysis-MEDTA-free(Roche#4719964001)，在冰上静置30分钟。离心后，回收上清，用Pierce BCAProtein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific#23225)进行蛋白质定量。在回收的上清中添加五分之一量的5×样品缓冲液(含有2-巯基乙醇)并混合后，在100℃处理3分钟，由此配制样品。在5-20％梯度聚丙烯酰胺凝胶中将所配制的样品分别上样7.5μL(5μg)，进行电泳。此后，使用含有20％甲醇的转印用缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液)，施加80V·60分钟电压，将蛋白质转印到PVDF膜(Cytiva#RPN303F)。转印后的PVDF膜使用在100mL的精制水中溶解有4g的Block Ace粉末(DS PHARMA BIOMEDICAL#UK-B500)的封闭缓冲液进行封闭之后，用封闭缓冲液稀释以下所示的一次抗体，在4℃孵育过夜。

一次抗体(克隆名)(购入源、制品号、稀释倍率)

(1)Ferritin Heavy chain(B-12)(Santa Cruz Biotechnology、#sc-376594、1000倍)

(2)Anti-Actin，clone C4(Merck、#MAB1501、5000倍)

孵育后，对膜用0.05％-PBST在室温下清洗5分钟×3次，用封闭缓冲液将二次抗体ECL Anti-Mouse IgG HRP-Linked Whole Antibody(Cyriva、#NA931)分别稀释为(1)2500倍/(2)5000倍，在室温下孵育60分钟。

孵育后，对膜用0.05％-PBST在室温下清洗5分钟×3次，使用ECL Prime WesternBlottinng Detection Reagents(Cytiva#RPN2232)，用Lumino Image Analyzer LAS-3000(FUJIFILM)曝光，进行检测。

将结果示于图5。TfR436抗体与不添加抗体(Untreated：未处理)和阴性对照单克隆抗体(Nega mAb)进行比较，确认到各细胞株中铁蛋白的量减少。

实施例5：ROS的测定

线粒体内ROS使用MitoSOX(Thermo Fisher Scientific)进行测定。细胞以1×10⁵细胞/mL接种于6孔板或60mm培养皿。以K562、MV4；11、U266B1的最终浓度成为5μg/mL、CCRF-CEM的最终浓度成为0.05μg/mL的方式添加TfR436抗体，或不添加，进行培养。培养规定时间之后，回收细胞，用HBSS清洗2次之后进行细胞计数。将细胞以1×10⁵细胞/孔接种于V底96孔板，用MitoSOX5μM在37℃染色10分钟。用HBSS清洗2次之后将细胞转移到荧光测定用板，用Tecan公司的infinite200Pro以Ex505nm、Em590nm进行测定。从测定值减去溶剂的荧光值，将非添加设为100％，算出TfR436抗体添加的ROS产生率。

将结果示于图6。确认到TfR436抗体在K562、MV4；11、CCRF-CEM中使ROS产生增加。

实施例6：Caspase3/7活性量的测定

对于TfR436抗体暴露下的Caspase3/7活性量进行检验。将K562、MV4；11、CCRF-CEM、U266B1以成为10000个/50μL的方式悬于各种最佳的细胞培养用培养基，在96孔板中接种。对TfR436抗体和阴性对照单克隆抗体，使用同样的培养基，分别从最终浓度5μg/mL(33.3nM)以公比3.16倍的方式6或7段稀释。将这些抗体添加培养基和抗体无添加培养基对各细胞株各添加50μL。在37℃的5％CO₂孵育箱内分别培养72小时(K562、MV4；11)或96小时(CCRF-CEM、U266B1)后，在各孔中添加100μL的Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7Assay(Promega#G7790)并混合，在室温静置1～2小时后，以激发波长465nm和荧光波长535nm检测显示Caspase3/7活性量的荧光产物量。

将结果示于图7。确认到TfR436抗体在K562、MV4；11、CCRF-CEM中使Caspase3/7活性量增加。

实施例7：由TfR436抗体引起的细胞周期的停止

验证TfR436抗体对于细胞周期的影响。将HEL细胞配制为2×10⁶细胞/mL，在6孔板中以1mL/孔接种。以最终浓度成为0.5、1.0或2.0μg/mL的方式配制TfR436抗体添加培养基，以成为20μg/mL的方式配制阴性对照抗体添加培养基，在各孔中添加这些抗体添加培养基或抗体非添加培养基1mL。在37℃的5％CO₂孵育箱内培养48小时之后，用胰蛋白酶剥离细胞并回收。对回收的细胞用PBS清洗，添加1mL70％EtOH，固定细胞。在-20℃将细胞保存24小时后，除去EtOH，用PBS清洗细胞，进行细胞计数。细胞周期的测定中，添加0.5mL Fx CyclePI/RNase Staining Solution(Thermo Fisher Scientific#F10797)，在暗处静置30分钟之后，使用BD FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)进行测定。用FlowJo解析50,000个细胞。从解析的细胞群算出各细胞周期所占的比例。

将结果示于图8。确认了TfR436抗体在HEL细胞株中使S期的细胞比例增加。

实施例8：由TfR436抗体引起的细胞死亡

检验由TfR436抗体暴露引起的细胞生存率的变化。具体而言，将MV4；11、Kasumi-1和HNT-34以成为1.0×10⁵细胞/mL的方式悬于各种最佳的细胞培养用培养基，在T75烧瓶中接种。将TfR436抗体或阴性对照单克隆抗体(Nega mAb)以最终浓度5μg/mL的方式在烧瓶中添加，在37℃的5％CO₂孵育箱内培养。在添加抗体48、96小时后回收细胞，用PBS清洗之后，将细胞重悬于1mL的PBS。将细胞悬液与台盼蓝染色液以1∶1混合，用血细胞计数器测定活细胞数和死细胞数。其中，细胞悬液根据细胞数用PBS稀释，以调整为用血细胞计数器的测定中不产生障碍。算出活细胞占总的细胞数的比例，作为细胞的生存率。

将结果示于表1。确认了TfR436抗体在MV4；11、Kasumi-1、和HNT-34中使生存率减少。

[表1]

表1：

实施例9：由多个TfR436抗体引起的铁蛋白量变化

将由多个TfR抗体(TfR007、TfR014、TfR017、TfR018)暴露引起的铁蛋白量变化与TfR436抗体进行比较。具体而言，将K562以成为1.0×10⁵细胞/mL的方式悬浮于细胞培养用培养基，在T75烧瓶中接种。将各TfR抗体和抗体无添加的烧瓶在37℃的5％CO₂孵育箱内培养。其中，以使各TfR抗体的最终浓度成为5μg/mL的方式配制。在添加抗体72小时后回收细胞，用PBS清洗后，将细胞株以1.0×10⁶cells悬浮于Complete Lysis-M EDTA-free50μL，在冰上静置30分钟。离心后，回收上清，用Pierce BCA Protein Assay Kit进行蛋白质定量。在回收的上清中添加五分之一量的5×样品缓冲液(含有2-巯基乙醇)并混合后，在100℃处理3分钟，由此配制样品。在5-20％梯度聚丙烯酰胺凝胶中将所配制的样品分别上样12μL(10μg)，进行电泳。此后，使用含有20％甲醇的转印用缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液)，施加80V·60分钟电压，将蛋白质转印到PVDF膜(Millipore#IPFL85R)。转印后的PVDF膜使用TBS封闭缓冲液(LI-COR#927-60001)进行封闭后，用封闭缓冲液稀释以下所示的一次抗体，在4℃孵育过夜。

一次抗体(克隆名)(购入源、制品号、稀释倍率)

(1)Ferritin Heavy chain(B-12)(Santa Cruz Biotechnology、#sc-376594、1000倍)

(2)Anti-Actin，clone C4(Merck Millipore、#MAB1501、5000倍)

孵育后，对膜用0.05％-PBST在室温下清洗5分钟×4次，用封闭缓冲液将二次抗体IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG(LI-COR、#925-32210)稀释为20,000倍，在室温下孵育60分钟。

孵育后，对膜用0.05％-PBST在室温下清洗5分钟×4次，使用Odyssey Fc ImagingSystem(LI-COR)进行检测。

将结果示于图9。确认了多个TfR抗体(TfR007、TfR014、TfR017、TfR018)与TfR436抗体同样，在K562中使铁蛋白的量减少。

实施例10：由多个TfR436抗体引起的ROS量变化

将由多个TfR抗体(TfR007、TfR014、TfR017、TfR018)暴露引起的线粒体内的ROS量变化与TfR436抗体进行比较。具体而言，将MV4；11以1×10⁵细胞/mL在T25烧瓶中接种。各TfR抗体和抗体无添加的烧瓶在37℃的5％CO₂孵育箱内培养。其中，以使各TfR抗体的最终浓度成为5μg/mL的方式配制。在添加抗体72小时后回收细胞，用HBSS清洗2次后进行细胞计数。将细胞以4×10⁵细胞/孔接种于V底96孔板，用MitoSOX5μM在37℃染色10分钟。用HBSS清洗2次之后将细胞转移到荧光测定用板，用MOLECULAR DEVICES公司的SpectraMAX iD3以Ex515nm、Em600nm进行测定。从测定值减去溶剂的荧光值，将非添加设为100％，算出TfR436抗体添加的ROS产生率。

将结果示于图10。确认了多个TfR抗体(TfR007、TfR014、TfR017、TfR018)与TfR436抗体同样在MV4；11中使线粒体内ROS产生增加。

Claims

1.一种ROS产生增强剂，其特征在于：

包含识别转铁蛋白受体的物质。

2.一种铁蛋白分解促进剂，其特征在于：

包含识别转铁蛋白受体的物质。

3.一种铁死亡诱导剂，其特征在于：

包含识别转铁蛋白受体的物质。

4.一种细胞凋亡诱导剂，其特征在于：

包含识别转铁蛋白受体的物质。

5.如权利要求1～4中任一项所述的剂，其特征在于：

识别转铁蛋白受体的物质是识别转铁蛋白受体的抗体。

6.如权利要求5所述的剂，其特征在于：

识别转铁蛋白受体的抗体是识别人转铁蛋白受体的抗体。

7.如权利要求6所述的剂，其特征在于：

识别人转铁蛋白受体的抗体是识别人转铁蛋白受体的第629位～第633位氨基酸的抗体、或抑制其它抗体与人转铁蛋白受体的第629位～第633位氨基酸的结合的抗体。

8.如权利要求5～7中任一项所述的剂，其特征在于：

所述抗体是重链第1互补决定区(VH CDR1)、重链第2互补决定区(VH CDR2)、重链第3互补决定区(VH CDR3)分别为序列号1、2、3并且轻链第1互补决定区(VL CDR1)、轻链第2互补决定区(VL CDR2)、轻链第3互补决定区(VL CDR3)分别为序列号4、5、6的抗体。

9.如权利要求5～8中任一项所述的剂，其特征在于：

所述抗体是作为重链可变区具有序列号7、作为轻链可变区具有序列号8的抗体。

10.如权利要求5～7中任一项所述的剂，其特征在于，所述抗体是如下(a)～(d)的抗体中的任一种：

11.如权利要求10所述的剂，其特征在于，所述抗体是如下抗体中的任一种：

12.如权利要求5～11中任一项所述的剂，其特征在于：

抗体为人抗体或人源化抗体。

13.如权利要求5～12中任一项所述的剂，其特征在于：

抗体为选自Fab、Fab'、F(ab')₂、单链抗体(scFv)、多特异性抗体、二硫键稳定性V区域(dsFv)和包含CDR的肽中的抗体片段。