KR20240049363A - Ros(활성 산소종) 생산 증강제 - Google Patents

Abstract

본 발명의 과제는 ROS 생산 증강제를 제공하는 것이다. 본 발명에 따르면, 트랜스페린 수용체를 포함하는 ROS 생산 증강제가 제공된다.

Description

ROS(활성 산소종) 생산 증강제

본 발명은 트랜스페린 수용체(transferrin receptor: TfR)를 인식하는 물질을 포함하는 ROS 생산 증강제, 페리틴(ferritin) 분해 촉진제, 페로톱시스(ferroptosis) 유도제 및 아폽토시스(apoptosis) 유도제에 관한 것이다.

트랜스페린 수용체는 트랜스페린(transferrin: Tf)과 결합한 철을 세포 내로 흡수하기 위한 세포막 구조로서, 처음에 망상 적혈구 상에 있는 것으로 동정되었다. 그 후, TfR은 태반의 영양막 세포나, 활성화 림프구, 더욱 다양한 종양 세포 등에 발현하고 있는 것이 알려져 있다. 예를 들어, 유방암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 대장암, 위암, 방광암, 간암, 자궁 경부암, 뇌종양, 만성 림프성 백혈병 및 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma), 성인 T세포 백혈병에서 TfR의 고발현이 보고되었다. 또한, TfR은 다양한 암세포 표면에 고발현되고 정상세포에서의 발현이 낮아 암 치료의 분자 표적으로 인식되고 있다. 예를 들어, 특허문헌 1에는 트랜스페린 수용체를 특이적으로 인식할 수 있는 항체 및 상기 항체를 이용한 항암제가 기재되어 있다. 특허문헌 2에는, 인간 트랜스페린 수용체의 629번째 내지 633번째 아미노산을 인식하는 항체를 포함하는, 세포 내에의 철의 흡수 억제제가 기재되어 있다.

1: 국제공개 WO 2014/073641호 공보 2: 국제공개 WO 2020/105621호 공보

상술한 바와 같이, 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 항암제로서 사용하는 것이나 철의 흡수 저해제로서 사용하는 것은 알려져 있었지만, 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질이 세포 내에 있어서의 페리틴 발현 및 ROS 생산에 미치는 영향에 대해서는 불분명하고, 또한 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질이 ROS 생산의 증대를 통해 페로톱시스 및 아폽토시스에 의한 세포사를 유도하는지에 대해서도 불분명하였다. 본 발명은 ROS 생산 증강제, 페리틴 분해 촉진제, 페로톱시스 유도제 및 아폽토시스 유도제를 제공하는 것을 해결해야 하는 과제로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 검토한 결과, 트랜스페린 수용체 결합물질이 페리틴의 분해를 촉진하여 ROS 생산을 증강함으로써 세포증식을 억제 혹은 세포사로 이끄는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명에 의하면, 이하의 발명이 제공된다:

(1) 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 포함하는 ROS 생산 증강제.

(2) 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 포함하는 페리틴 분해 촉진제.

(3) 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 포함하는 페로톱시스 유도제.

(4) 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 포함하는 아폽토시스 유도제.

(5) 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질이 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체인, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 제제.

(6) 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체가 인간 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체인, (5)에 기재된 제제.

(7) 인간 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체가 인간 트랜스페린 수용체의 629번째 내지 633번째 아미노산을 인식하는 항체 또는 인간 트랜스페린 수용체의 629번째 내지 633번째 아미노산에 대한 다른 항체의 결합을 저해하는 항체인, (6)에 기재된 제제.

(8) 상기 항체가 중쇄 제1 상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2 상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3 상보성 결정영역(VH CDR3)이 각각 서열번호 1, 2, 3이고, 및 경쇄 제1 상보성 결정영역(VL CDR1), 경쇄 제2 상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3 상보성 결정영역(VL CDR3)이 각각 서열번호 4, 5 및 6인 항체인, (5) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 제제.

(9) 상기 항체가 중쇄 가변영역으로서 서열번호 7을 가지고, 경쇄 가변영역으로서 서열번호 8을 가지는 항체인, (5) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 제제.

(10) 상기 항체가,

(a) 중쇄 제1 상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2 상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3 상보성 결정영역(VH CDR3)이 각각 서열번호 11, 12, 13이고, 및 경쇄 제1 상보성 결정영역(VL CDR1), 경쇄 제2 상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3 상보성 결정영역(VL CDR3)이 각각 서열번호 14, 15 및 16인 항체;

(b) 중쇄 제1 상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2 상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3 상보성 결정영역(VH CDR3)이 각각 서열번호 17, 18, 19이고, 및 경쇄 제1 상보성 결정영역(VL CDR1), 경쇄 제2 상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3 상보성 결정영역(VL CDR3)이 각각 서열번호 20, 21, 22 인 항체;

(c) 중쇄 제1 상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2 상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3 상보성 결정영역(VH CDR3)이 각각 서열번호 23, 24, 25이고, 및 경쇄 제1 상보성 결정영역(VL CDR1), 경쇄 제2 상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3 상보성 결정영역(VL CDR3)이 각각 서열번호 26, 27 및 28인 항체; 및

(d) 중쇄 제1 상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2 상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3 상보성 결정영역(VH CDR3)이 각각 서열번호 29, 30, 31이고, 및 경쇄 제1 상보성 결정영역(VL CDR1), 경쇄 제2 상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3 상보성 결정영역(VL CDR3)이 각각 서열번호 32, 33, 34인 항체;

중 어느 하나인, (5) 내지 (7)중 어느 하나에 기재된 제제.

(11) 상기 항체가,

중쇄 가변영역으로서 서열번호 35를 가지고, 경쇄 가변영역으로서 서열번호 36을 가지는 항체;

중쇄 가변영역으로서 서열번호 37을 가지고, 경쇄 가변영역으로서 서열번호 38을 가지는 항체;

중쇄 가변영역으로서 서열번호 39를 가지고, 경쇄 가변영역으로서 서열번호 40을 가지는 항체; 또는

중쇄 가변영역으로서 서열번호 41을 가지고, 경쇄 가변영역으로서 서열번호 42를 가지는 항체;

중 어느 하나인, (10)에 기재된 제제.

(12) 항체가 인간 항체 또는 인간화 항체인, (5) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 제제.

(13) 항체가 Fab, Fab', F(ab')₂, 단일 가닥 항체(scFv), 다중 특이성 항체, 디설파이드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로 구성된 군에서 선택되는 항체 단편인, (5) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 제제.

(A1) 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, ROS의 생산을 증강하는 방법.

(A2) 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 페리틴의 분해를 촉진하는 방법.

(A3) 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 페로톱시스를 유도하는 방법.

(A4) 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 아폽토시스를 유도하는 방법.

(B1) ROS의 생산을 증강하는 치료에 사용하기 위한, 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질.

(B2) 페리틴의 분해를 촉진하는 치료에 사용하기 위한, 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질.

(B3) 페로톱시스를 유도하는 치료에 사용하기 위한, 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질.

(B4) 아폽토시스를 유도하는 치료에 사용하기 위한, 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질.

(C1) ROS 생산 증강제의 제조를 위한 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질의 용도.

(C2) 페리틴 분해 촉진제의 제조를 위한, 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질의 용도.

(C3) 페로톱시스 유도제의 제조를 위한, 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질의 용도.

(C4) 아폽토시스 유도제의 제조를 위한, 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질의 용도.

본 발명에 의하면, 신규한 ROS 생산 증강제, 페리틴 분해 촉진제, 페로톱시스 유도제 및 아폽토시스 유도제가 제공된다.

도 1은 각각의 TfR 변이 단편(mutant fragment)의 점 돌연변이(point mutation) 부위를 나타낸다.
도 2는 TfR436과 가용성 야생형(wild type) TfR(sTfR) 및 TfR 변이 단편(mutant fragment)의 반응성을 나타낸다.
도 3은 TfR436의 Tf-TfR 결합저해 활성을 나타낸다.
도 4는 TfR436에 의한 증식억제 효과를 나타낸다.
도 5는 TfR436에 의한 페리틴 분해 효과를 나타낸다.
도 6은 TfR436에 의한 ROS 생산증대 효과를 나타낸다.
도 7은 TfR436에 의한 카스파제(caspase) 3/7 활성량 증가 효과를 나타낸다.
도 8은 TfR436에 의한 세포주기 정지 효과를 나타낸다.
도 9는 여러 TfR 항체에 의한 페리틴 발현량의 변화를 조사한 결과를 나타낸다.
도 10은 복수의 TfR 항체에 의한 ROS량의 변화를 조사한 결과를 나타낸다.

이하에서는, 본 발명에 대해 보다 구체적으로 설명한다.

정의 및 일반기술

본 명세서에서 특별히 정의하지 않는 한, 본 발명에 대하여 사용된 과학기술용어는 당업자에게 통상 이해되고 있는 의미를 포함하는 것으로 한다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직배양, 분자생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 단백질 및 핵산화학, 및 혼성화에 대해 사용한 명명법 및 그 기술은 당해 기술분야에서 알려진 것으로 통상 사용된다.

본 발명의 제반 방법 및 기술은 일반적으로, 특정하지 않는 한, 당해 기술분야에서 주지되는 종래의 방법에 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐서 인용되어 설명한 여러가지 일반적 참조문헌과 보다 구체적인 참조문헌에 기재된대로 실행된다.

페리틴 분해, ROS 생산증강 및 페로톱시스 유도

　

페로톱시스(ferroptosis)란 세포사 기구의 하나로서, 세포내 자유철(free iron, Fe²⁺)을 촉매로 하여 세포막 인지질의 과산화 반응이 연쇄해서 지질 히드록시 라디칼(hydroxy radical)을 축적시켜 세포가 죽음에 이른다고 여겨지고 있다. 세포 내에서의 페로톱시스의 발생 기전으로는 오토파지(autophagy)의 유발, 페리틴의 분해, Fe²⁺의 증가, ROS 생산의 증가, 페로톱시스 유도(세포사)라는 기전이 상정되고 있다(참조: Jing Du et al, Free Radical Biology and Medicine 131(2019) 356-369). 후술하는 실시예 4에서는 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체가 세포에서의 페리틴을 감소시키는 것이 확인되었다. 또한, 실시예 5에서는 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체가 세포 내에서의 ROS 생산을 증대시키는 것이 확인되었다. 그리고, 실시예 3 및 8에서는 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체가 세포의 증식을 억제함으로써 세포의 생존율을 감소시키는 것이 확인되었다. 상기 실시예 3 내지 5 및 8의 결과로부터, 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체에 의해 세포의 증식이 억제되는 기전의 하나로서, 페리틴 분해 및 ROS 생산의 증대가 야기되고, 그에 따라 세포의 증식이 억제되는 것이 시사되고 있다.

미토콘드리아 ROS 생산 증강 및 아폽토시스 유도

　

미토콘드리아 내에서 생성되는 ROS의 증강은 아폽토시스 시그널을 활성화한다. 아폽토시스에는 내인성과 외인성으로 불리는 두 가지 경로가 있는데, 내인성 경로(endogenous pathway)에서는 세포 스트레스, DNA 손상, 발생 신호, 생존 인자 제거에 의해 활성화되고, 외인성 경로(exogenous pathway)에서는 Fas, TNFR1, TRAIL 등의 리간드에 의해 세포 표면의 세포사 수용체가 활성화됨으로써, 최종적으로 카스파제 3 및 카스파제 7이 활성화되어 아폽토시스가 진행되어 세포사로 유도된다. 실시예 6의 결과는 일부 세포주에서 아폽토시스를 유도하고 있다고 판단되고 있다.

세포주기의 정지

　

세포는 M기, G1기, S기, G2기로 불리는 규칙적인 주기를 거쳐 두 개의 딸세포(daughter cell)로 분열한다. 일련의 과정을 세포주기(cell cycle)라고 부르는데, 그 과정에서 여러 가지 철 요구성 효소가 작용하기 때문에, 철 공급이 끊긴 상황에서는 이 주기가 정지되어 결국 세포사에 이르게 된다. 후술하는 실시예 7의 결과는 그 과정을 나타내고 있다.

TfR

인간 트랜스페린 수용체(TfR)는 인간 3번 염색체에 암호화되는 760개의 아미노산으로 구성되는 일회막 관통형 단백질(single-pass transmembrane protein)이다(서열번호 9). 이 단백질은 CD71 항원으로도 알려져 세포의 철 흡수에 관여하고, 세포의 증식에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서의 TfR은 구조가 특별히 한정되지 않고, 단량체, 다량체, 세포막에서 발현된 천연형태(intact form), 세포 외 영역으로 구성된 가용화 형태(soluble form), 띠 형태(truncted form), 또한, 유전자 변이나 결손 등의 변이형태(mutation form), 인산화 등의 번역 후 수식(post-translational modification) 형태 등을 포함하여 모두 인간 TfR을 의미한다.

서열번호 9

Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu

Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp

Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala

Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly

Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly

Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr

Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro

Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys

Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile

Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln

Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe

Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val

Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg

Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys

Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys

Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile

Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu

Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe

Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly

Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln

Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr

Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp

Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser

Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile

Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp

His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala

Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met

Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile

Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr

Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr

Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val

Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn

Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp

Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe

Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp

Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu

Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu

Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn

Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp

Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln

Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu

Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys

Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro

Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser

Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys

Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala

Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp

Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe

반응 및 반응성

본 명세서에서 '반응하다(react)'와 '반응성(reactivity)'은 특별히 한정하지 않는 한 동일한 것을 의미한다. 즉, 이들 용어는 항체가 항원을 인식하는 것을 의미한다. 이 항원은 세포막에서 발현되는 천연형 TfR이라도 좋고, 띠형이나 가용형이라도 무방하다. 또한, 입체구조를 유지한 TfR도 좋고, 변성된 TfR도 무방하다. 반응성을 검토하는 수단으로는 플로우사이토미터(FACS: flow cytometry), 효소결합면역흡착검정법(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴 블롯(Western-blot), 형광미량측정기술(FMAT: microfluorescence measuring technique), 표면 플라스몬공명(surface plasmon resonance, BI Acore), 면역염색(immunostaining), 면역침강(immunoprecipitation) 등이 있다.

플로우사이토미터에 사용하는 항체는 FITC 등의 형광물질, 비오틴 등에 의하여 표지된 항체라도, 표지되지 아니한 항체라도 좋다. 사용한 항체의 표지 유무 및 그 종류에 따라, 형광표지 아비딘, 형광표지 항인간 면역글로블린 항체 등을 사용한다. 반응성은 충분한 량의 항TfR 항체(통상 최종농도가 0.01~10μg/mL)를 검체에 가하고, 음성대조 항체, 양성대조 항체의 반응성과 비교함으로써 평가할 수 있다.

트랜스페린 수용체를 인식하는 물질

　

본 발명에서는 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 사용한다. 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 핵산(핵산 압타머(nucleic acid aptamer), 데코이 핵산(decoy nucleic acid) 등), 리보자임, 항체 및 그 단편, 펩티드, 고리형 펩티드, 펩티드 모방체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 사용할 수 있다. 예를 들면, Wilner et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012) 1, e21; doi:10.1038/mtna. 2012.14에는 트랜스페린을 모방한 압타머가 기재되어 있다. 또한, Jae H. Lee et al., Eur. J. Biochem. 268, 2004-2012(2001)에는 트랜스페린 수용체를 표적으로 한 펩티드가 기재되어 있다. 본 발명에서는 이러한 핵산이나 펩티드 등을 사용할 수 있다.

항체

본 명세서에서는 필요에 따라, 이하의 약호(괄호 안)를 사용한다:

중쇄(H쇄), 경쇄(L쇄), 중쇄 가변영역(VH), 경쇄 가변영역(VL), 상보성 결정영역(CDR), 제1 상보성 결정영역(CDR1), 제2 상보성 결정영역(CDR2), 제3 상보성 결정영역(CDR3), 중쇄 제1 상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2 상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3 상보성 결정영역(VH CDR3), 경쇄 제1 상보성 결정영역(VL CDR1), 중쇄 제2 상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3 상보성 결정영역(VL CDR3).

본 명세서에서 '항체(antibody)'라는 용어는 면역글로블린과 같은 뜻으로, 본 기술분야에서 통상 알려진 대로 이해되어야 한다. 구체적으로, 항체라는 용어는 항체를 만드는 임의의 특정방법에 의하여 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 항체라는 용어에는 그것에만 국한되지 않으나, 재조합 항체, 모노클로널 항체 및 폴리클로널 항체가 있다.

본 명세서에서 '인간 항체(human antibody)'라는 용어는 가변영역 및 불변영역의 서열이 사람 서열인 임의의 항체를 의미한다. 그 용어는 인간 유전자에서 유래하는 서열을 가지는데, 예를 들어 생각할 수 있는 면역원성의 저하, 친화성의 증대, 바람직하지 않은 접힘(folding)을 일으킬 가능성이 있는 시스테인을 제거하도록 변화시키는 항체를 포함한다. 그 용어는 인간 세포에 특유하지 않은 글리코실화를 시행할 수 있는 비인간 세포 내에서 재조합으로 만들어진 이러한 항체를 포함한다. 이들 항체는 여러 형태로 제조할 수 있다.

본 명세서에서 '인간화 항체(humanized antibody)'라는 용어는 비인간 유래 항체를 의미하며, 비인간 항체(non-human antibody) 서열에서 특징적인 아미노산 잔기가 인간 항체가 대응하는 위치로 인정되는 잔기로 치환된다. 이러한 '인간화(humanization)' 공정은 그 결과 얻어진 항체의 인체 면역원성을 저하시킬 것으로 예견된다. 본 기술분야에서 알려진 기술을 사용하여 비인간 유래의 항체를 인간화할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 윈터(Winter) 등의 Immunol. Today 14:43~46(1993)을 참조하기 바란다. 대상으로 하는 항체는 CH1, CH2, CH3, 힌지 도메인 및/또는 프레임워크 도메인을 대응하는 사람 서열으로 치환하는 치환 DNA 기술에 의해 공학적으로 작제할 수 있다. 예를 들어, WO92/02190 및 미합중국특허 제5,530,101호, 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,792호, 제5,714,350호 및 제5,777,085호를 참조할 수 있다. 본 명세서에서 '인간화 항체(humanized antibody)'라는 용어는 그 의미의 범위 내에서 키메라 인간 항체 및 CDR 이식 항체를 포함한다.

항체의 가변영역에서 프레임워크 영역(FR)의 서열은 대응하는 항원에 대한 특이적 결합성에 실질적인 영향이 없는 한 특별히 한정되지 않는다. 인간 항체의 FR영역을 이용하는 것이 바람직하지만, 사람 이외의 동물종(예를 들어, 마우스나 랫트)의 FR영역을 이용할 수도 있다.

항체의 한 형태에 따르면, 가변영역(variable region)과 더불어 불변영역(constant region)을 포함한다(예를 들어, IgG형 항체). 불변영역의 서열은 특별히 한정되지 않는데, 예를 들면 공지의 인간항체의 불변영역을 사용할 수 있다. 인간 항체의 중쇄 불변영역(CH)으로는 인간 면역글로블린(이하에서는, 'hIgG'로 표기함)에 속하면 어떠한 것이든 좋으나 hIgG 등급이 적합하며, 나아가 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4와 같은 서브 클래스 모두 이용할 수 있다. 또한, 경쇄 불변영역(CL)은 hIg에 속하면 어떠한 것이든 가능하며, κ 클래스 또는 λ 클래스를 사용할 수 있다. 또한, 인간 이외의 동물종(예를 들어, 마우스나 렛트)의 불변영역을 이용할 수도 있다.

본 명세서에서 '개변체(modified form)'나 '개변항체(modified antibody)'란 친항체(parent antibody)의 가변영역(CDR 서열 및/또는 FR 서열)의 아미노산 서열에 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있는 것이다.

본 발명에서 '친항체(parent antibody)'란, VH는 서열번호 7, VL은 서열번호 8로 나타내는 아미노산 서열을 가지는 TfR436 항체이다. 아미노산 서열에서 1개 또는 복수개(예를 들어, 1 내지 8개, 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 바람직하게는 1 내지 3개, 가장 바람직하게는 1 또는 2개)의 아미노산이 결실, 부가, 치환 및/또는 삽입된다. TfR에 대한 결합활성을 가지는 항체의 아미노산 서열을 제조하기 위한 당업자에게 잘 알려진 방법으로는, 단백질에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들어, 당업자라면 부위특이적 변이유발법(site-directed mutagenesis, 참조: Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y,, Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA, 82, 488-492) 등을 이용하여, TfR에 대한 결합활성을 가지는 항체의 아미노산 서열에 적절히 변이를 도입함으로써 TfR에 대한 결합활성을 가지는 항체와 기능적으로 동등한 개변항체를 제조할 수 있다. 이와 같이 항체의 가변영역 또는 불변영역에서 1개 또는 여러 개의 아미노산 변이를 포함하는 TfR에 대한 결합활성을 가지는 항체를 사용할 수도 있다.

본 명세서에서, '친항체와 동등한 활성(an activity equivalent to the activity of the parent antibody)'은 인간 TfR에 대한 결합활성이 동등함을 의미한다. '동등(equivalent)'이란 반드시 동일한 정도의 활성일 필요는 없고, 활성이 증강되도 되고, 또한, 활성이 있는 한 활성이 감소되도 무방하다. 활성이 감소하고 있는 항체로는, 원래 항체에 비해 30% 이상의 활성, 바람직하게는 50% 이상의 활성, 더욱 바람직하게는 80% 이상의 활성, 좀 더 바람직하게는 90% 이상의 활성, 특히 바람직하게는 95% 이상의 활성을 가지는 항체를 예로 들 수 있다.

본 명세서에서, '결합 활성(binding activity)'이란 용어는 항원을 인식하는 정도를 의미한다. 이 항원은 세포막에서 발현되는 천연형(intact) TfR이라도 좋고, 띠형(truncted form)이나 가용화형(soluble form)이라도 무방하다. 또한, 입체구조를 유지한 TfR도 좋고, 변성된 TfR도 무방하다. 결합활성을 측정하는 방법의 예로서는, 플로우사이토미터(FACS: flow cytometry), 효소결합면역흡착검정법(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴 블롯(Western-blot), 형광미량측정기술(FMAT: microfluorescence measuring technique), 표면 플라스몬공명(surface plasmon resonance, BI Acore) 등을 들 수 있다.

항체의 Tf-TfR 결합저해 활성은 후술하는 '실시예 2(2); Tf-TfR 결합저해에 있어서 TfR436 항체 및 타사 항체의 비교'에 기술된 방법에 따라 측정할 수 있다. TfR 용액을 기판(96-웰 플레이트 등)에 분주하여 정치하고 고상화하여 정지시킨다. 이어, HRP 표지한 Tf 용액을 분주하고, 항체를 첨가하여 실온에서 반응시킨다. 그런 다음, 기판을 세척하고 발색시약(TMB 등)을 첨가하여 반응시켜 플레이트 판독기로 흡광도를 측정한다. 상기 조작에 의하여 당해 항체가 Tf-TfR 결합저해 활성을 평가할 수 있다.

항체는 그 기원을 한정하지 않으며, 인간 항체, 마우스 항체, 랫트 항체 등 어떠한 동물 유래의 항체라도 무방하다. 또한, 키메라 항체, 인간화 항체 등도 좋다. 본 발명에서의 항체의 바람직한 태양의 하나는 인간 항체이다.

항체는 후술하는 항체를 생산하는 세포나 숙주나 정제방법에 따라, 아미노산서열, 분자량, 등전점 또는 당쇄의 유무나 형태 등이 다를 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 기재되어 있는 아미노산 서열에 번역 후 수식을 받는 경우도 본 발명에 포함된다. 또한, 기존의 번역 후 수식 이외의 부위에 대한 번역 후 수식도, 본 발명에 포함된다. 또한, 항체를 원핵세포, 예컨대 대장균에서 발현시킨 경우 원래 항체의 아미노산 서열 N 말단에 메티오닌 잔기가 부가된다. 본 발명에서는 이러한 항체를 사용해도 좋다. 기존의 번역 후 수식 이외의 부위에 대한 번역 후 수식도 본 발명에 포함된다.

항체의 작제

본 발명에서 사용하는 항체로는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체 중 어느 것이라도 좋다. 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체는 당업자에게 공지의 방법에 의해 제작될 수 있다.

항체로는 동물의 혈중에 생성되는 것, 하이브리도마에 의해 생성되는 것, 및 유전공학적 방법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환한 숙주에 의해 생성되는 것, 파지 디스플레이에 의해 클론 라이브러리로부터 최적의 항체가 스크리닝되어 그 유전자를 CHO 세포로 생산한 것, 혹은 인간 항체를 생산하는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 직접 인간 항체를 얻을 수 있는 것 등을 들 수 있다.

폴리클로날 항체를 제조하기 위해서는, 항원을 토끼 등의 동물에 면역하여 혈청을 얻는다. 얻어진 혈청을 예를 들어 황안 침전(ammonium sulfate precipitation), 프로테인 A 컬럼(protein A column), 프로테인 G 컬럼(protein G column), DEAE 이온교환 크로마토그래피(DEAE-ion exchange chromatography), 친화성 컬럼(affinity column) 등에 의해 정제함으로써, 폴리클로날 항체를 제조할 수 있다.

모노클로날 항체를 제조하기 위해서는, 항원을 원하는 바에 따라 어쥬번트와 함께 동물에 면역한다. 면역된 동물의 혈청 중 원하는 항체 수준이 상승하는 것을 확인한 다음, 동물에게서 면역세포(비장세포 등)를 채취하여 포유동물인 미엘로마 세포와 세포융합시킨다. 세포융합에 의해 얻어진 하이브리도마는 통상의 선택배지, 예를 들면 HAT 배지(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배지)에 배양함으로써 선택할 수 있다. 이후 한계희석법을 이용하여 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별할 수 있다.

이하에서는, 파지 디스플레이법에 의한 항체의 제조에 대해 설명한다.

(1) 파지 디스플레이 라이브러리에 의해 항원과 반응하는 scFv

파지 디스플레이 기술(phage display technique)을 사용하여 TfR에 대한 친화성이 다양한 항체의 레퍼토리를 포함하는 라이브러리를 제공할 수 있다. 그런 다음, 이러한 라이브러리를 스크리닝하고, TfR에 대한 항체를 동정하고 단리할 수 있다. 바람직한 것은 인간 B세포에서 분리된 mRNA에서 만들어진 인간 VL 및 VH cDNA를 사용하여 생성되는 scFv 파지 디스플레이 라이브러리이다. 이러한 라이브러리를 만들어 스크리닝하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다. 인간 TfR을 항원으로서 스크리닝한 반응성을 나타내는 파지 클론으로부터 유전물질을 회수한다. 선택된 파지의 유전자를 분석하면, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변영역을 암호화하는 VH 및 VL의 DNA 서열을 결정할 수 있다. 이 scFv의 서열을 이용하여 scFv를 IgG화하면 인간 항체를 수득할 수 있다.

(2) scFv의 IgG화 (인간 항체의 작제)

H 사슬 또는 L 사슬의 발현벡터를 만들어 숙주세포에서 발현시킨다. 분비된 상등액을 회수하고 정제하여 인간항체를 취득한다. 또한, VH 및 VL을 동일 벡터에서 발현시킴으로써(탠덤형, tandem type), 인간 항체를 취득할 수도 있다. 이러한 방법은 널리 알려져 있으며, WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/1236, W093/19172, WO95/01438, WO95/15388, WO97/10354 등을 참고하여 실행될 수 있다.

구체적으로, VH를 암호화하는 DNA를 중쇄 불변영역(CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 다른 DNA 분자와 연결함으로써 완전장 중쇄 유전자를 취득할 수 있다. 인간 중쇄 불변영역 유전자의 서열은 당해 기술분야에서 알려져 있으며(예를 들어, Kabat, E. A. 등, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변영역이 좋으나, 가장 바람직한 것은 IgG1 또는 IgG2의 불변영역이다. IgG1 불변영역 서열은 Gm(1), Gm(2), Gm(3)이나 Gm(17) 등 서로 다른 개인 간에 생기는 것으로 알려진 임의의 다양한 대립유전자(allele) 또는 알로타입(allotype)을 포함할 수 있다. 이들 알로타입은 IgG1 불변영역 중 천연에 존재하는 아미노산 치환에 상당한다.

VL을 암호화하는 DNA를 경쇄 불변영역 CL을 암호화하는 다른 DNA 분자와 연결함으로써 완전장 L 사슬 유전자(및 Fab 경쇄 유전자)를 취득할 수 있다. 인간 경쇄 불변영역 유전자의 서열은 당해 기술분야에서 알려져 있으며(예를 들어, Kabat, E.A. 등, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준적인 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다, 경쇄 불변영역은 κ 또는 λ의 불변영역으로 좋다. κ 불변영역은 Inv(1), Inv(2), Inv(3) 등 서로 다른 개인간에 생기는 것으로 알려진 임의의 다양한 대립 유전자이다. λ 불변영역은 3가지 λ 유전자 중 어느 것에서 유래하는 것이라도 좋다.

상기와 같이 얻은 H 사슬 또는 L 사슬을 암호화하는 DNA를 발현벡터 내에 삽입함으로써 발현벡터를 만들어 숙주세포에서 발현시키고 분비한 상등액의 회수·정제에 의해 인간 항체를 취득한다. 발현벡터로는 플라스미드, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 수반 바이러스(AAV), 컬리플라워 모자이크 바이러스나 담배 모자이크 바이러스 등의 식물 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래 에피좀(episome) 등을 들 수 있다. 발현벡터 및 발현조절 서열은 사용하는 발현용 숙주세포와 적합하도록 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터 내에 삽입할 수 있으며, 양쪽 유전자를 같은 발현벡터 내에 삽입할 수도 있다. 항체 유전자를 표준적인 방법(예를 들어, 항체 유전자 단편상의 상보적인 제한부위와 벡터의 연결, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활말단 연결)에 의해 발현벡터 내에 삽입한다.

적합한 벡터는 상술한 바와 같이 임의의 VH 또는 VL 서열을 쉽게 삽입하여 발현시킬 수 있도록 공학적으로 작제된 적당한 제한부위를 가지는 기능적으로 완전한 사람 CH 또는 CL 면역글로블린 서열을 암호화하는 것이다. 이러한 벡터에서는 일반적으로 삽입된 J 영역 중의 스플라이스 공여 부위(splice donor site)와 인간 C 도메인에 선행하는 스플라이스 수용 부위(splice acceptor site) 사이에서, 또는 인간 CH 엑손 내에 존재하는 스플라이스 영역에서도 스플라이싱이 일어난다. 폴리아데닐화 및 전사종결은 코드영역 하류 천연 염색체 부위에서 일어난다. 재조합 발현벡터는 또한, 숙주세포에서 유래된 항체 사슬 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 암호화할 수도 있다. 항체사슬 유전자는 신호 펩티드가 인프레임(in-frame)으로 면역글로블린 사슬의 아미노 말단과 연결되도록 벡터 내에 클론화할 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로블린 신호 펩티드도 좋고, 혹은 이종성 신호 펩티드(즉, 비면역글로블린 단백질 유래 신호 펩티드)도 무방하다.

항체의 발현벡터는 항체 유전자 및 제어서열 외에 숙주세포 내에서의 벡터의 복제를 제어하는 서열(예를 들어, 복제기점(replication origin))이나 선택 마커유전자(selective marker gene) 등의 서열을 가져도 된다. 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주세포의 선택을 촉진한다. 예를 들어, 보통 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주세포 상에 G418, 하이그로마이신이나 메토트렉세이트 등의 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선택 마커 유전자에는 탈수소엽산 환원효소(DHFR) 유전자(dhfr-숙주세포에서 메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 사용함), 네오마이신 포스포전달효소 유전자(G418 선택용) 및 글루탐산 합성효소 유전자가 있다.

이상의 방법으로 작제된 항체 유전자 발현벡터에 의해 숙주세포를 형질전환한다. 숙주세포로는 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등 항체를 생산시킬 수만 있다면, 어떤 세포라도 좋지만 동물세포가 바람직하다. 동물세포로는 차이니즈 햄스터 난소세포 CHO/dhfr(-) 및 CHO/DG44, 원숭이 유래세포 COS 세포(참조: A. Wright & S. L. Morrison, J. Immunol. 160, 3393-3402(1998)), SP2/O 세포(마우스 미엘로마)(참조: K. Motmans, Eur. J. Cancer Prev. 5, 512-5199(1996), R. P. Junghans et al., Cancer Res. 50, 1495-1502(1990)) 등을 예로 들 수 있다. 또한, 형질전환에는 리포펙틴법(lipofectin method, 참조: R. W. Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 6007(1989), P. L. Felgner et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413(1987)), 전기천공법(electroporation method), 인산칼슘법(calcium phosphate method)(참조: F. L. Graham & A. J. van der Eb, Virology 52,456-467 (1973)), DEAE-덱스트란법(DEAE-Dextran method) 등의 방법을 이용하는 것이 바람직하다.

형질전환체를 배양한 후 형질전환체의 세포 내 또는 배양액에서 인간 항체를 분리한다. 항체의 분리, 정제에는 원심분리(centrifugation), 유안분획(ammonium sulfate fractionation), 염석(salting-out), 한외여과(ultrafiltration), 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 겔여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography) 등의 방법을 적절히 조합하여 이용할 수 있다.

항체단편

　

항체에 기반하거나 항체를 암호화하는 유전자의 서열정보를 기초로 하여 항체단편을 만들 수 있다. 항체 단편으로는 Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, dsFv 항체를 예로 들 수 있다.

Fab은 IgG를 시스테인 존재 하에서 파파인(papain) 소화함으로써 얻을 수 있는 L 사슬과 H 사슬 가변영역 및 CH1 도메인 및 힌지부의 일부로 이루어진 H 사슬 단편으로 구성된 분자량 약 5만의 단편이다. 본 발명에서는 상기 항체를 파파인 소화함으로써 얻을 수 있다. 또한, 상기 항체의 H 사슬 일부 및 L 사슬을 암호화하는 DNA를 적당한 벡터에 삽입하고, 당해 벡터를 사용하여 형질전환한 형질전환체에서 Fab를 제조할 수도 있다.

Fab'은 후술하는 F(ab')₂의 H 사슬간 이황화 결합을 절단함으로써 얻어지는 분자량이 약 5만인 단편이다. 본 발명에서는 상기 항체를 펩신 소화하고, 환원제를 사용하여 이황화 결합을 절단함으로써 얻는다. 또한, Fab과 마찬가지로, F(ab')₂ 를 암호화하는 DNA를 이용하여 유전공학적으로 제조할 수도 있다.

F(ab')₂는 IgG를 펩신 소화함으로써 얻을 수 있는 L 사슬과 H 사슬 가변영역 및 CH1 도메인 및 힌지부 일부로 구성된 H 사슬 단편과 함께 구성된 단편(Fab')이 이황화 결합으로 결합한 분자량 약 10만의 단편이다. 본 발명에서는 상기 항체를 펩신 소화함으로써 얻을 수 있다. 또한, Fab과 마찬가지로 F(ab')₂를 암호화하는 DNA를 이용하여 유전공학적으로 제조할 수도 있다.

scFv는 H 사슬 가변영역과 L 사슬 가변영역으로 구성된 Fv를, 한쪽 사슬의 C 말단과 다른 쪽 N 말단을 적당한 펩티드 링커로 연결하여 단일 사슬화한 항체 단편이다. 펩티드 링커로서는 예를 들어 유연성이 높은 (GGGGS)₃ 등을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 H 사슬 가변영역 및 L 사슬 가변영역을 암호화하는 DNA와 펩티드 링커를 암호화하는 DNA를 사용하여 scFv 항체를 암호화하는 DNA를 구축하고, 이를 적당한 벡터에 삽입하여 당해 벡터를 사용하여 형질전환한 형질전환체에서 scFv를 제조할 수 있다.

dsFv는 H 사슬 가변영역 및 L 사슬 가변영역의 적절한 위치에 Cys 잔기를 도입하여 H 사슬 가변영역과 L 사슬 가변영역을 이황화 결합으로 안정화시킨 Fv 단편이다. 각 사슬에서의 Cys 잔기 도입 위치는 분자 모델링에 의해 예측되는 입체구조에 근거해 결정할 수 있다. 본 발명에서는 예를 들어 상기 항체의 H 사슬 가변영역 및 L 사슬 가변영역의 아미노산 서열로부터 입체구조를 예측하고, 이러한 예측에 따라 변이를 도입한 H 사슬 가변영역 및 L 사슬 가변영역을 각각 암호화하는 DNA를 구축한 다음, 이를 적당한 벡터에 삽입하고 당해 벡터를 사용하여 형질전환한 형질전환체에서 dsFv를 제조할 수 있다.

또한, 적당한 링커를 이용하여 scFv 항체, dcFv 항체 등을 연결하거나 스트렙토아비딘을 융합시킴으로써, 항체 단편을 다량체화(multmerization)할 수도 있다.

다중특이성 항체

　

항체는 한쪽이 TfR을 인식한다면, 동시에 그 이외의 표적도 인식하는 다중특이성 항체라도 좋다. 특히 이중특이성 항체는 자주 이용된다.

이중특이성 항체는 한쪽이 TfR을 인식하는 분자로 다른 쪽이 다른 분자를 표적으로 하는 분자가 조합된 항체를 나타낸다. 예를 들어, 2분자의 모노클로날 항체를 화학적으로 가교함으로써 얻어지는 이중특이성(mab)₂, 2분자의 Fab 단편을 화학적으로 가교함으로써 얻어지는 이중특이성 F(ab')₂, quadroma, bsDb(bispecific diabody), scBsDb(single-chain bispecific diabody), scBsTaFv(single-chain bispecific tandem variable domain), Bite(bispecific T cell Engager antibody), DNL-F(ab)₃(docl-and-lock trivalent Fab) 등을 열거할 수 있으나(참조: Eng, H. Bispecific Antibodies and Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy: Technological Considerations. Biomolecules 2020, 10, 360), 형태는 이에 한정되지 않는다.

의약 조성물 및 제제

본 발명의 ROS 생산 증강제, 페리틴 분해 촉진제, 페로톱시스 유도제 및 아폽토시스 유도제를 포함하는 의약 조성물 및 제제도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명의 ROS 생산 증강제, 페리틴 분해 촉진제, 페로톱시스 유도제 및 아폽토시스 유도제는 ROS 생산증강, 페리틴 분해촉진, 페로톱시스 유도 또는 아폽토시스 유도를 필요로 하는 대상에서 ROS 생산증강, 페리틴 분해촉진, 페로톱시스 유도제에 의한 치료를 위해 사용할 수 있다.

본 발명의 ROS 생산 증강제, 페리틴 분해 촉진제, 페로톱시스 유도제 및 아폽토시스 유도제를 포함하는 의약 조성물 및 제제는, 바람직하게는 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질에 더해 생리학적으로 허용될 수 있는 희석제 또는 담체를 포함한다. 적절한 담체로는 생리적 식염수, 인산완충 생리식염수, 인산완충 생리식염수 글루코스액 및 완충 생리식염수가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 혹은, 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질은 동결건조(freeze-drying)) 또는 동결하고, 필요할 때 상기와 같은 완충 수용액을 첨가함으로써 재구성하여 사용해도 된다. 투여 형태로는 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 시럽제 등에 의한 경구 투여 또는 주사제(피하주사, 정맥주사, 근육주사, 복강내 주사 등), 경피(經皮)·경점막(經粘膜)·경비(經鼻)·경폐(經肺)·좌약(坐藥) 등에 의한 비경구 투여를 예로 들 수 있다.

본 발명의 ROS 생산 증강제, 페리틴 분해 촉진제, 페로톱시스 유도제 및 아폽토시스 유도제는 증상, 나이, 체중 등에 따라 다르나, 일반적으로 경구투여에서는 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질의 양으로 성인에게 1일 약 0.001mg/kg 내지 1,000mg/kg이며, 이들을 1회 또는 여러 차례로 나누어 투여할 수 있다. 또한, 비경구 투여에서는 1회 약 0.001mg/kg 내지 1,000mg/kg을 피하주사, 근육주사 또는 정맥주사로 투여할 수 있다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

이하의 실시예에서는 국제공개 WO2014/073641호 공보의 단락 [0090] 및 [0091]에 기재되어 있는 TfR436 항체를 사용하였다.

TfR436 항체의 CDR서열은 다음과 같다:

VH CDR1: SYGMH (서열번호 1)

VH CDR2: VISYDGSNKYADSVKG (서열번호 2)

VH CDR3: DSNFWSGYYSPVDV(서열번호 3)

VL CDR1: TRSSGSIASNSVQ (서열번호 4)

VL CDR2: YEDTQRPS (서열번호 5)

VL CDR3: QSYDSAYHWV (서열번호 6)

TfR436 항체의 VH서열 및 VL서열은 다음과 같다:

TfR436 VH(서열번호 7)

ＤＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＰＦＫＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤNＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＧＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＳＮＦＷＳＧＹＹＳＰＶＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

TfR436 VL(서열번호 8)

ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＳＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＡＰＩＴＶＩＹＥＤＴＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＱＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＡＹＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＡＶＬ

또한, 실시예 9 및 10에서는 국제공개 WO 2012/153707호 공보의 단락 [0083]에 기재되어 있는 TfR007 항체, TfR014 항체, TfR017 항체 및 TfR018 항체를 사용하였다.

TfR007 항체, TfR014 항체, TfR017 항체 및 TfR018 항체의 CDR 서열은 다음과 같다:

TfR007

VH CDR1: 서열번호 11, VH CDR2: 서열번호 12, VH CDR3: 서열번호 13

VL CDR1: 서열번호 14, VL CDR2: 서열번호 15, VL CDR3: 서열번호 16

TfR0014

VH CDR1: 서열번호 17, VH CDR2: 서열번호 18, VH CDR3: 서열번호 19

VL CDR1: 서열번호 20, VL CDR2: 서열번호 21, VL CDR3: 서열번호 22

TfR017

VH CDR1: 서열번호 23, VH CDR2: 서열번호 24, VH CDR3: 서열번호 25

VL CDR1: 서열번호 26, VL CDR2: 서열번호 27, VL CDR3: 서열번호 28

TfR018

VH CDR1: 서열번호 29, VH CDR2: 서열번호 30, VH CDR3: 서열번호 31

VL CDR1: 서열번호 32, VL CDR2: 서열번호 33, VL CDR3: 서열번호 34

서열번호 11: SYWLS

서열번호 12: KIDPSDSYTQYSPSFEG

서열번호 13: HGYDAFHV

서열번호 14: SGSSNIGNNAVN

서열번호 15: YDDLLPS

서열번호 16: AAWDDSLNGWV

서열번호 17: ELSMH

서열번호 18: GFDPEDGETIYAQKFQG

서열번호 19: DAYGSPRDAFDI

서열번호 20: GGDNVGGKSLH

서열번호 21: DDRDRPS

서열번호 22: QVWDDISRLVI

서열번호 23: DYAMY

서열번호 24: GINWNSAIIGYADSVKG

서열번호 25: EALYYSAFFDS

서열번호 26: SGSSNIGNNYVS

서열번호 27: DNNKRPS

서열번호 28: GTWDSSLSAWV

서열번호 29: DYAMH

서열번호 30: GINWNGGSTDYADSVEG

서열번호 31: DYADLGSGSDY

서열번호 32: SGSRSNIGSNYVH

서열번호 33: RNDQRPS

서열번호 34: ASWDDKMSGRL

TfR007 항체의 VH 서열 및 VL 서열은 다음과 같다:

TfR007 VH(서열번호 35)

EVQLVESGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTSYWLSWVRQLPGKGLEWMGKIDPSDSYTQYSPSFEGQVTISADKSSNTAYLQWSSLKASDTAIYYCARHGYDAFHVWGQGTTVTVSR

TfR007 VL(서열번호 36)

QSVLTQPPSVSEAPRQRVTISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLISYDDLLPSGVSDRFSGSTSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC

TfR014 항체의 VH 서열 및 VL 서열은 다음과 같다:

TfR014 VH(서열번호 37) QVQLQQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDAYYGSGSPRDAFDIWGQGTTVTVSR

TfR014 VL(서열번호 38)

SYVLTQPPSVSVAPGETATITCGGDNVGGKSLHWYQVKPGQAPVLVVFDDRDRPSGIPDRFSGANSRDTAALTISRVEAGDEADYYCQVWDDISRLVIFGGGTRLTVLRQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSRQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC

TfR017 항체의 VH 서열 및 VL 서열은 다음과 같다:

TfR017 VH(서열번호 39)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMYWVRQAPGKGLEWVSGINWNSAIIGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYFCAKEALYYSAFFDSWGQGTLVTVSR

TfR017 VL(서열번호 40)

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSRSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVVGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELRANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC

TfR018 항체의 VH 서열 및 VL 서열은 다음과 같다:

TfR018 VH(서열번호 41)

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYAMHWVRQSPGKGLEWVSGINWNGGSTDYADSVEGRFTISRDNAANSLFLQMNSLRAEDTAIYYCARDYADLGSGSDYWGQGTLVTVSS

TfR018 VL(서열번호 42)

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSRSNIGSNYVHWYQQLPGAAPKLLIYRNDQRPSGVPDRFSGSRSDTSAFLAISGLRSEDEADYYCASWDDKMSGRLFGGGTKVTVLSQPKAAPSVTLFPPSSEELRANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC

TfR436 항체의 결합부위 동정

TfR436 항체는 마우스 TfR과 교차 반응하지 않지만, 햄스터 TfR와 교차 반응성을 나타내었다. TfR에서의 트랜스페린(TF) 결합부위(569번째 내지 760번째 아미노산)의 아미노산 서열을 정렬하였다. 인간 TfR 서열에서 햄스터와 같고, 마우스와는 다른 아미노산을 선택하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 선택된 아미노산을 점 돌연변이(point mutation)시키고, 가용성 TfR 변이 단편을 작제하였다.

(1) 가용성 야생형 TfR(sTfR) 및 TfR 변이 단편(MF1~MF7)의 작제

　 인간 TfR 세포외 영역(89번째 내지 760번째 아미노산), 또는 도 1에 나타낸 각각 TfR 변이 단편(MF1~MF7)과 AAARGGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH(서열번호 10)를 암호화하는 염기서열을 전체 합성하였다. 발현벡터 pCAGGS(비특허문헌 2: Niwa et al. 1991)에 네오마이신 내성 유전자와 DHFR 유전자를 함유하는 벡터의 멀티클로닝 사이트에 각각 합성한 유전자를 삽입하고, pCAGGS-Neo-DHFR-sTFR-myc-his 발현 플라스미드를 작제하였다. Expifectamine(Thermo Fischer Scientific)을 이용하여 Expi293 세포(Thermo Fischer Scientific)에 상기 플라스미드를 트랜스펙션하고, 37℃, 8% CO₂, 135rpm의 조건에서 5일간 배양하였다. 그런 다음, 원심분리하여 배양 상등액을 회수한 다음, AKTA prime(Cytiva)에 HisTrapHP(Cytiva) 컬럼을 접속하고, 결합용 완충용액으로 20mM Imidazole/DPBS, 용출용 완충용액으로는 500mM 이미다졸/DPBS를 이용하여 sTfR 혹은 MF1~MF7을 정제하였다. 용출된 단백질은 Zeba spin column(Thermo Fischer Scientific)을 이용하여, 30mM HEPES, 5% 트레할로스(trehalose), pH 7.2로 완충용액 교환하였다.

(2) TfR436 항체의 결합부위 동정

　 상기에서 정제한 sTfR 혹은 MF1~MF7을 PBST(Phosphate Buffered Saline with Tween 20, TaKaRa)로 희석하고, 600ng/mL으로부터 3배 희석을 7단계로 실시하였다. 그런 다음, Ni-NTA HisSorb Strips 96-웰 플레이트(QIAGEN)에 희석액을 100μL/웰로 분주하여 진탕기에 옮기고 실온에서 반응시켰다. 1시간 후 PBST 완충용액으로 5회 세정하고, TfR436 항체(1ug/mL)를 100μL/웰에 분주하여 진탕기에 옮기고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, PBST 완충용액으로 5회 세정하고 50,000배 희석한 2차 항체 F(ab')₂ Fragment Anti-Human IgG Fcγ(Jackson Immuno Research) 100μL/웰로 분주하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBST 완충용액으로 5회 세척한 다음, TMB Soluble Reagent (High Sensitivity) (Scy Tek)를 100μL/웰로 분주하고, 실온, 암소에서 3분간 반응시켰다. 그런 다음, TMB 정지용 완충용액(Stop Buffer(Scy Tek))을 100μL/웰로 첨가하고 1분간 진탕기에서 진탕한 다음, 플레이트 판독기로 450nm(ref: 620nm)에서의 흡광도를 측정하였다.

　 그 결과를 도 2에서 나타내었다. TfR 436 항체는 TfR 변이 단편 MF5와의 반응성 저하가 나타났지만, 기타 변이 단편와의 반응성 저하는 나타나지 않았다. 즉, TfR의 629번째, 630번째, 633번째 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하면, TfR436 항체가 TfR로 인식하지 못하게 된다. 아미노산 제629번 내지 제633번는 TfR436 항체의 인식 에피토프(epitope)임이 시사되었다.

Tf-TfR 결합저해에 있어서 TfR436 항체 및 비교용 항체의 비교

(1) 비교용 항체 A24의 작제

　 특허문헌 US2008/0193453에 인간 TfR에 대한 A24항체가 기재되어 있다. TfR436 항체와 이 항체를 비교하기 위하여 기탁받은 하이브리도마를 입수하여 항체를 생산하였다. 구체적으로, 하이브리도마를 RPMI1640(GIBCO), FBS 10%의 배지에 세포농도가 1~2 x 10⁵/mL가 되도록 하여, 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 확대 배양(cell expansion) 후 원심분리하여 세포를 회수하여 PBS에서 2회 세정하고, 무혈청 배지 cosmedium 005(코스모바이오), 0.5% Nutridoma-CS(Roche)에서 다시 550mL가 될 때까지 확대 배양하였다. 세포가 콘플루엔트(confluent)가 되고 5일 후, 원심분리하여 배양 상등액을 회수하였다.

　 회수된 상등액을 프로테인 A 담체(Ab-Capcher ExTra: 프로테노바사)에 적용하고, 프로테인 A와 결합하고 있는 항체를 0.1M 글리신 염산 완충용액(pH 2.7)으로 용출하고, 신속하게 1M Tris 염산 완충액(pH 8.5)으로 중화하였다. 그런 다음, 울트라 셀 한외 여과 디스크(Merck)를 이용하여 완충용액을 PBS로 교환하였다.

(2) Tf-TfR 결합저해에 있어서 TfR436 항체 및 타사 항체의 비교

실시예 1에 기재된 sTfR을 PBST에서 5.0μg/mL가 되도록 조정한 다음, MaxiSorp 96-웰 플레이트(Nunc)에 희석액을 100μL/웰로 분주하여 4℃에서 하룻밤 정치하여 고상화하였다. 다음날 고상액(solid phase liquid)을 버리고, 100% 블록 에이스(Block Ace, DS Pharma Biomedical) 200μL/웰로 실온에서 정지시켰다. 1시간 후 PBST 완충용액으로 5회 세정한 다음, HRP 표지한 Tf(2ug/mL) 50μL/웰을 분주하고, 추가로 TfR436 항체, A24 항체(10μg/mL에서 2배 희석) 또는 holo-Tf(Sigma) 300μg/mL에서 2배 희석)로 첨가한 것)을 50μL/mL로 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, PBST 완충용액으로 5회 세척하고 TMB Soluble Reagent(High Sensitivity)를 100μL/웰로 분주하여 실온 암소에서 반응시켰다. 25분 후, TMB 정지용 완충용액을 100μL/웰의 양으로 첨가하고, 1분간 진탕기에서 진동시킨 다음, 플레이트 판독기로 450nm(ref: 620nm)의 흡광도를 측정하였다.

　 그 결과를 도 3에 나타내었다. TfR436 항체는 훨씬 낮은 용량으로(100ng/mL) 완전히 Tf-TfR의 결합을 저해하였다. 반면, A24 항체는 10μg/mL의 용량으로도 완전히 Tf-TfR의 결합을 저해할 수 없고, Tf-TfR의 결합을 50% 밖에 저해할 수 없었다. 이로써, Tf-TfR의 결합저해에서 TfR436 항체가 우수하다는 것이 시사되었다.

TfR436 항체에 의한 증식억제 효과

　 TfR436 항체 폭로(exposure)에 의한 증식억제 효과를 검증하였다. 구체적으로, MV4;11, Kasumi-1 및 HNT-34를 1000개/50μL가 되도록 각종 최적의 세포배양용 배지에 현탁하여 96웰 플레이트에 파종하였다. TfR436 항체 및 음성 대조군 모노클로날 항체를 동일한 배지를 이용하여 최종 농도 5μg/mL(33.3nM)에서 공비(common ratio) 3.16배가 되도록 각각 9단계로 희석하였다. 이들 항체 첨가 배지와 항체 무첨가 배지를 각 세포주에 50μL씩 첨가하였다. 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 96시간 배양 후 각 웰에 20μL의 Cell Titer 96 AQeous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega #G3580)을 첨가·혼화하여 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 4시간 동안 정치 후 505nm의 흡광도를 검출하였다. 배지만 첨가한 웰을 대조군으로 하여, 항체 무첨가 웰에서의 평균값을 증식률 100%로 하여 각 항체 농도에서의 증식률을 산출하였다.

　 그 결과를 도 4에 나타내었다. TfR436 항체는 음성 대조군 모노클로날 항체(Nega Ab)와 비교해 각 세포주의 증식을 억제하는 것으로 확인되었다.

TfR436 항체에 의한 페리틴 양의 변화

TfR436 항체 폭로에 따른 페리틴 양의 변화를 웨스턴 블로팅법으로 검증하였다. 구체적으로, MV4;11, Kasumi-1 및 HNT-34를 1.0 x 10⁵ cell/mL가 되도록 각종 최적의 세포배양용 배지에 현탁하고, T75 플라스크 또는 T150 플라스크에 파종하였다. TfR436 항체 또는 음성 대조군 모노클로날 항체를 첨가한 플라스크와 항체 무첨가 플라스크를 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 배양하였다. 또한, TfR436 항체의 최종 농도는 실시예 3의 TfR436 각 항체 농도에서의 증식률에서 산출한 각 세포주의 GI50 값에 맞춰 조제하고, 음성 대조군 모노클로날 항체의 최종 농도는 TfR436 항체와 동일 농도가 되도록 조제하였다. 항체 첨가 4, 24, 48, 96시간 후 세포를 회수하여 PBS로 세척한 후, 각 세포주 1.0 x 10^{6 cell} 당 Complete Lysis-MEDTA-free(Roche #4719964001) 100μL로 현탁하고, 빙상에서 30분간 정치시켰다. 원심분리 후 상등액을 회수하고 Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific #23225)를 이용하여 단백질을 정량하였다. 회수한 상등액에 5분의 1량의 5×Sample Buffer(2-머캡토에탄올 함유)를 첨가·혼화한 후, 100℃에서 3분간 처리하여 시료를 조제하였다. 5~20% 구배의 폴리아크릴아마이드 겔에 조제한 시료를 7.5μL(5μg)씩 적용하고 전기영동하였다. 이후 20% 메탄올을 함유한 전사용 완충액(트리스-글리신 완충액)을 이용하여 80V 60분간 전압을 걸어 단백질을 PVDF막(Cytiva #RPN303F)에 전사하였다. 전사한 PVDF막은 4g의 블록 에이스 분말(DS파마 바이오 메디컬 #UK-B500)을 100mL 정제수에 용해된 정지용 완충용액을 이용하여 정지시킨 후, 아래에 제시한 1차 항체를 정지용 완충용액에 희석하여 4℃에서 하룻밤 배양하였다.

1차 항체(클론명)(입수처, 제품 번호, 희석 배율)

(1) Ferritin Heavy chain (B-12) (Santa Cruz Biotechnology, #sc-376594, 1,000배)

(2) Anti-Actin, clone C4(Merck, #MAB1501, 5,000배)

　 배양 후, 멤브레인을 0.05%-PBST로 실온에서 5분간×3회 세척하여 2차 항체 ECL Anti-Mouse IgG HRP-Linked Whole Antibody(Cyriva, #NA931)를 정지용 완충용액으로 각각 (1) 2,500배/(2) 5,000배로 희석하여 실온에서 60분간 배양하였다.

　 배양 후, 멤브레인을 0.05%-PBST에 의해 실온에서 5분간×3회 세정하고, ECL Prime Western Blottinng Detection Reagents(Cytiva #RPN2232)를 이용하여, 루미노·이미지 어닐라이저 LAS-3000(FUJIFILM)에 의해 노광하고, 검출하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다. TfR436 항체는 항체 무첨가(untreated) 및 음성 대조군 모노클로날 항체(Nega mAb)와 비교하여, 각 세포주에서 페리틴의 양을 감소시키는 것을 확인하였다.

ROS 측정

　 미토콘드리아 내 ROS는 MitoSOX(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 측정하였다. 세포는 1 x 10⁵ cell/mL로 6웰 플레이트 또는 60mm 디쉬에 집어 넣었다. 최종 농도가 K562, MV4;11, U266B1은 5μg/mL, CCRF-CEM은 0.05μg/mL가 되도록 TfR436 항체를 첨가 또는 비첨가로 배양하였다. 소정 시간 배양한 후 세포를 회수하여 HBSS에서 2회 세정하고, 세포수를 계수하였다. 세포를 1 x 10⁵ cell/well로 V 바닥 96웰 플레이트에 파종하고, MitoSOX 5μM로 37℃에서 10분간 염색하였다. HBSS로 2회 세척한 후, 세포를 형광측정용 플레이트로 옮겨, Tecan사의 infinite 200 Pro에서 Ex505nm, Em590nm로 측정하였다. 측정값에서 용매의 형광값을 추출하고, 비첨가를 100%로 하여 TfR436 항체 첨가의 ROS 생산율을 산출하였다.

　 그 결과를 도 6에 나타내었다. TfR436 항체는 K562, MV4;11, CCRF-CEM에서 ROS 생산을 증대시키는 것으로 확인되었다.

Caspase3/7 활성량 측정

　 TfR436 항체 폭로에 의한 Caspase 3/7 활성량에 대해 검증하였다. K562, MV4;11, CCRF-CEM, U266B1을 10,000개/50μL가 되도록 각종 최적의 세포배양용 배지에 현탁하여 96웰 플레이트에 파종하였다. TfR436 항체 및 음성 대조군 모노클로날 항체를 동일한 배지를 이용하여 최종 농도 5μg/mL(33.3nM)에서 공비 3.16배가 되도록 각각 6 또는 7단계로 희석하였다. 이들 항체 첨가 배지와 항체 무첨가 배지를 각 세포주에 50μL씩 첨가하였다. 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 72시간(K562, MV4;11) 또는 96시간(CCRF-CEM, U266B1) 각각 배양 후 각 웰에 100μL의 Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay(Promega #G7790)를 첨가·혼화하고 실온에서 1~2시간 동안 정치한 다음, 여기파장 465nm 및 형광파장 535nm에서 Caspase 3/7 활성량을 나타내는 형광산 물량을 검출하였다.

그 결과를 도 7에 나타내었다. TfR436 항체는 K562, MV4;11, CCRF-CEM에서 Caspase 3/7 활성량을 증가시키는 것으로 확인되었다.

TfR436 항체에 의한 세포주기의 정지

TfR436 항체가 세포주기에 미치는 영향을 검증하였다. HEL 세포를 2x10⁶ cell/mL로 조제하여 6웰 플레이트에 1mL/well 파종하였다. 최종 농도가 0.5, 1.0 또는 2.0 μg/mL가 되도록 TfR436 항체 첨가 배지를, 20μg/mL가 되도록 음성 대조군 항체 첨가 배지를 각각 조제하고, 이들 항체 첨가 배지 또는 항체 비첨가 배지 1 mL를 각 웰에 첨가하였다. 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 48시간 배양한 후, 트립신으로 세포를 박리해 회수하였다. 회수한 세포를 PBS로 세척하고 70% EtOH를 1mL 첨가해 세포를 고정하였다. -20℃에서 24시간 세포를 보관 후 EtOH를 폐기하고, PBS로 세포를 세척하고 셀 계수하였다. 세포주기 측정은 Fx Cycle PI/RNase Staining Solution(Thermo Fisher Scientific #F10797)을 0.5mL 첨가하여 30분간 암소에 정치한 후, BD FACS Calibur 플로우사이토미터(BD Biosciences)를 이용하여 측정하였다. 세포 50,000개에 대해 FlowJo로 해석하였다. 해석한 세포군으로부터, 각 세포주기가 차지하는 비율을 산출하였다.

　 그 결과를 도 8에 나타내었다. TfR436 항체는 HEL 세포주에서 S기의 세포 비율을 증가시키는 것이 확인되었다.

TfR436 항체에 의한 세포사

TfR436 항체 노출에 따른 세포 생존율 변화를 검증하였다. 구체적으로, MV4;11, Kasumi-1 및 HNT-34를 1.0 x 10⁵ cell/mL가 되도록 각종 최적의 세포배양용 배지에 현탁하여 T75 플라스크에 파종하였다. TfR436 항체 또는 음성 대조군 모노클로날 항체(Nega mAb)를 최종 농도 5μg/mL가 되도록 플라스크에 첨가하고, 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 배양하였다. 항체 첨가 48, 96시간 후 세포를 회수하고 PBS로 세척한 다음, 세포를 1mL PBS로 재현탁하였다. 세포 현탁액과 트리판 블루(trypan blue) 염색액을 1:1로 혼화하고, 혈구 계수기를 이용하여 생세포수와 사세포수를 측정하였다. 또한, 세포 현탁액은 세포수에 따라 PBS로 희석하여 혈구 계수기에서의 측정에 지장이 없도록 조정하였다. 전체 세포수 대비 생세포가 차지하는 비율을 세포 생존율로 산출하였다.

　 그 결과를 표 1에 나타내었다. TfR436 항체는 MV4;11, Kasumi-1 및 HNT-34에서 생존율을 감소시키는 것으로 확인되었다.

세포주	항체첨가시간 (h)	생존률 (%)
		Nega mAb	TfR436
MV4;11	48	91.1	64.3
	96	93.8	34.8
Kasumi-1	48	93.6	87.5
	96	92.5	65.4
HNT-34	48	100.0	91.0
	96	97.1	84.4

복수의 TfR 항체에 의한 페리틴 량의 변화

　 복수의 TfR 항체(TfR007, TfR014, TfR017, TfR018) 폭로에 의한 페리틴 량의 변화를 TfR436 항체와 비교하였다. 구체적으로, K562를 1.0 x 10⁵ cell/mL가 되도록 세포배양용 배지에 현탁하고, T75 플라스크에 파종하였다. 각 TfR 항체와 항체 무첨가 플라스크를 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 배양하였다. 또한, 각 TfR 항체의 최종 농도는 5μg/mL가 되도록 조제하였다. 항체 첨가 72시간 후 세포를 회수하여 PBS로 세척한 다음, 세포주 1.0 x 10⁶ cell 당 Complete Lysis-MEDTA-free 50 μL로 현탁하여 빙상에서 30분간 정치하였다. 원심분리 후 상등액을 회수하고 Pierce BCA Protein Assay Kit를 이용하여 단백질을 정량하였다. 회수한 상등액에 5분의 1량의 5×Sample Buffer(2-머캡토에탄올 함유)를 첨가·혼화 후 100℃에서 3분간 처리하여 시료를 조제하였다. 5~20% 구배 폴리아크릴아마이드 겔에 조제한 시료를 12μL(10μg)씩 적용하고 전기영동하였다. 이후 20% 메탄올을 함유한 전사용 완충액(트리스-글리신 완충액)을 이용하여 80V, 60분간 전압을 걸어 단백질을 PVDF막(Millipore #IPFL85R)으로 전사하였다. 전사한 PVDF 막은 TBS 정지용 완충용액(LI-COR #927-60001)를 이용하여 정지시킨 후, 아래에 제시한 1차 항체를 정지용 완충용액으로 희석하여 4℃에서 하룻밤 배양하였다.

1차 항체(클론명)(입수처, 제품 번호, 희석 배율)

(1) Ferritin Heavy chain (B-12) (Santa Cruz Biotechnology, #sc-376594, 1,000배)

(2) Anti-Actin, clone C4(Merck Millipore, #MAB1501, 5,000배)

　 배양 후, 멤브레인을 0.05%-TST로 실온에서 5분간×4회 세척하고, 2차 항체 IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG(LI-COR, #925-32210)를 정지용 완충용액으로 20,000배 희석하여 실온에서 60분간 배양하였다.

　 배양 후, 멤브레인을 0.05%-TST로 실온에서 5분간×4회 세척하여 Odyssey Fc 이미징 시스템(LI-COR)을 이용하여 검출하였다.

　 그 결과를 도 9에 나타내었다. 여러 TfR 항체(TfR007, TfR014, TfR017, TfR018)는 TfR 436 항체와 동일하게 K562에서 페리틴의 양을 감소시키는 것이 확인되었다.

복수의 TfR 항체에 의한 ROS 량의 변화

　 복수의 TfR 항체(TfR007, TfR014, TfR017, TfR018) 폭로에 의한 미토콘드리아 내 ROS량의 변화를 TfR436 항체와 비교하였다. 구체적으로, MV4;11을 1x10⁵ cell/mL로 T25 플라스크에 넣었다. 각 TfR 항체와 항체 무첨가 플라스크를 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 배양하였다. 또한, 각 TfR 항체의 최종 농도는 5μg/mL가 되도록 조제하였다. 항체 첨가 72시간 후 세포를 회수하고 HBSS에서 2회 세척한 다음, 세포수를 계수하였다. 세포를 4x10⁵ cell/well로 V 바닥 96웰 플레이트에 파종하고, MitoSOX 5μM, 37℃에서 10분간 염색하였다. HBSS에서 2회 세척 후 세포를 형광 측정용 플레이트로 옮겨, MOLECULAR DEVICES사의 Spectra MAX iD3에서 Ex515nm, Em600nm로 측정하였다. 측정값에서 용매의 형광값을 추출하고, 비첨가를 100%로 하여 TfR436 항체 첨가의 ROS 생산율을 산출하였다.

　 그 결과를 도 10에 나타내었다. 복수의 TfR 항체(TfR007, TfR014, TfR017, TfR018)는 TfR436 항체와 동일하게, MV4;11에서 미토콘드리아 내 ROS 생산을 증대시키는 것으로 확인되었다.

Claims (13)

1. 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 포함하는 ROS 생산 증강제.
   
2. 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 포함하는 페리틴 분해 촉진제.
   
3. 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 포함하는 페로톱시스 유도제.
   
4. 트랜스페린 수용체를 인식하는 물질을 포함하는 아폽토시스 유도제.
   
5. 제1항 내지 제4항의 어느 한 항에 있어서,
   트랜스페린 수용체를 인식하는 물질이 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는
   제제.
   
6. 제5항에 있어서,
   트랜스페린 수용체를 인식하는 항체가 인간 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는
   제제.
   
7. 제6항에 있어서,
   인간 트랜스페린 수용체를 인식하는 항체가 인간 트랜스페린 수용체의 629번째 내지 633번째 아미노산을 인식하는 항체 또는 인간 트랜스페린 수용체의 629번째 내지 633번째 아미노산에 대한 다른 항체의 결합을 저해하는 항체인 것을 특징으로 하는
   제제.
   
8. 제5항 내지 제7항의 어느 한 항에 있어서,
   상기 항체가 중쇄 제1 상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2 상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3 상보성 결정영역(VH CDR3)이 각각 서열번호 1, 2, 3이고, 및 경쇄 제1 상보성 결정영역(VL CDR1), 경쇄 제2 상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3 상보성 결정영역(VL CDR3)이 각각 서열번호 4, 5 및 6인 항체인 것을 특징으로 하는
   제제.
   
9. 제5항 내지 제8항의 어느 한 항에 있어서,
   상기 항체가 중쇄 가변영역으로서 서열번호 7을 가지고, 경쇄 가변영역으로서 서열번호 8을 가지는 것을 특징으로 하는
   제제.
   
10. 제5항 내지 제7항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가,
    (a) 중쇄 제1 상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2 상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3 상보성 결정영역(VH CDR3)이 각각 서열번호 11, 12, 13이고, 및 경쇄 제1 상보성 결정영역(VL CDR1), 경쇄 제2 상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3 상보성 결정영역(VL CDR3)이 각각 서열번호 14, 15 및 16인 항체;
    (b) 중쇄 제1 상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2 상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3 상보성 결정영역(VH CDR3)이 각각 서열번호 17, 18, 19이고, 및 경쇄 제1 상보성 결정영역(VL CDR1), 경쇄 제2 상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3 상보성 결정영역(VL CDR3)이 각각 서열번호 20, 21, 22 인 항체;
    (c) 중쇄 제1 상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2 상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3 상보성 결정영역(VH CDR3)이 각각 서열번호 23, 24, 25이고, 및 경쇄 제1 상보성 결정영역(VL CDR1), 경쇄 제2 상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3 상보성 결정영역(VL CDR3)이 각각 서열번호 26, 27 및 28인 항체; 및
    (d) 중쇄 제1 상보성 결정영역(VH CDR1), 중쇄 제2 상보성 결정영역(VH CDR2), 중쇄 제3 상보성 결정영역(VH CDR3)이 각각 서열번호 29, 30, 31이고, 및 경쇄 제1 상보성 결정영역(VL CDR1), 경쇄 제2 상보성 결정영역(VL CDR2), 경쇄 제3 상보성 결정영역(VL CDR3)이 각각 서열번호 32, 33, 34인 항체;
    중 어느 하나인 것을 특징으로 하는
    제제.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 항체가,
    중쇄 가변영역으로서 서열번호 35를 가지고, 경쇄 가변영역으로서 서열번호 36을 가지는 항체;
    중쇄 가변영역으로서 서열번호 37을 가지고, 경쇄 가변영역으로서 서열번호 38을 가지는 항체;
    중쇄 가변영역으로서 서열번호 39를 가지고, 경쇄 가변영역으로서 서열번호 40을 가지는 항체; 또는
    중쇄 가변영역으로서 서열번호 41을 가지고, 경쇄 가변영역으로서 서열번호 42를 가지는 항체;
    중 어느 하나인 것을 특징으로 하는
    제제.
    
12. 제5항 내지 제11항의 어느 한 항에 있어서,
    항체가 인간 항체 또는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는
    제제.
    
13. 제5항 내지 제12항의 어느 한 항에 있어서,
    항체가 Fab, Fab', F(ab')₂, 단일 가닥 항체(scFv), 다중 특이성 항체, 디설파이드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로 구성된 군에서 선택되는 항체 단편인 것을 특징으로 하는
    제제.