CN103534272B - 能够特异性识别转铁蛋白受体的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种特异性识别人TfR，抑制TfR高表达的癌细胞的生存和增殖，且对人没有免疫原性的完全人抗人TfR抗体。根据本发明，提供一种与人TfR进行特异性反应的抗体，作为重链第一互补决定区（VH？CDR1）、重链第二互补决定区（VH？CDR2）、重链第三互补决定区（VH？CDR3）分别包含序列号1～3、7～9、13～15、19～21、25～27、31～33、37～39、43～45、49～51、55～57、61～63、67～69、73～75、79～81、85～87、91～93、97～99、103～105、109～111、115～117中的任意的氨基酸序列。

Description

能够特异性识别转铁蛋白受体的抗体
技术领域
本发明涉及与人TfR抗原进行特异性反应的抗TfR抗体。本发明还涉及包含抗TfR抗体的医药组合物、特别是与恶性肿瘤的治疗相关的医药组合物。
背景技术
癌症占日本死亡原因的第一位，随着着高龄化，患者的数量年年增加，强烈希望开发有效性和安全性高的药剂和治疗方法。目前的化学疗法、放射线疗法等，在杀死癌细胞的同时会对正常细胞造成损害，引起强烈的副作用。为了解决上述问题，将癌细胞中特异性表达的分子作为标的设计药剂来进行治疗的分子标的治疗的研究开始盛行。由于这种分子标的癌治疗药具有抗体药的半衰期长、副作用少等优点，因此受到很大的关注。作为开发的成功例，可以举出以CD20为标的的嵌合抗体利妥昔单抗（非专利文献1）、以Her2/neu为标的的人化抗体曲妥珠单抗（非专利文献2）、以血管内皮生长因子（VEGF）为标的的人化抗体贝伐单抗等。这些抗体以癌作为对象病患被使用，认可了其治疗效果。
作为治疗药的抗体的使用，分为非标记和标记抗体。非标记抗体的作用机理认为是：（1）涉及免疫系统细胞、分子的抗体依赖性细胞损伤活性（ADCC）（非专利文献3）或补体依赖性细胞损伤活性（CDC）（非专利文献4）、（2）标的分子引起的与细胞内生存或增殖相关的信号的阻碍、（3）细胞凋亡的诱导、（4）细胞因子的分泌调节等。通过各种机理的组合，使得肿瘤细胞死亡、停止增殖，从而发挥治疗效果。对于标记抗体而言，将抗体与放射线物质、毒素、酶或药剂等细胞损伤物质连接，利用抗体的特异性将这些物质送达至癌组织，从而实现治疗效果的提高和副作用的降低。
转铁蛋白受体（TfR）作为与转铁蛋白（Tf）结合的铁进入细胞内用的细胞膜结构，最初发现存在于网织红细胞上（非专利文献5）。后来知道在胎盘的滋养膜细胞（非专利文献10到12）、活化的淋巴细胞（非专利文献12）、各种肿瘤细胞等中表达。例如，报告了在乳腺癌（非专利文献6）、前列腺癌（非专利文献7）、肺癌（非专利文献8）、胰腺癌（非专利文献9）、大肠癌（非专利文献30、31）、胃癌（非专利文献31）、膀胱癌（非专利文献32、33）、肝癌（非专利文献34）、宫颈癌（非专利文献35）、脑肿瘤（非专利文献36）、慢性淋巴性白血病（非专利文献37、38）、非霍奇金淋巴瘤（非专利文献38、39）、成人T细胞白血病（非专利文献40）中，转铁蛋白受体高表达。此外，由于TfR在各种癌细胞表面高表达，而在正常细胞中的表达低，因此，很久以前就被认作是癌治疗的分子标的（非专利文献13到16、专利文献1、2）。但是，迄今为止所开发的抗人TfR抗体都是来自动物的抗体。通常，已知如果将人以外的动物的抗体，例如小鼠的抗体投给人，则会被识别为异物，因此在人体内诱导出针对小鼠抗体的人抗体（HumanAntiMouseAntibody：以下，记为HAMA）。已知HAMA与投与的小鼠抗体反应，引起副作用（非专利文献17到20），加速所投与的小鼠抗体从体内消失（非专利文献18、21和22），从而减弱小鼠抗体的治疗效果（非专利文献23和24）。用实际上存在的小鼠抗人TfR抗体进行临床一期试验，观察到HAMA的产生，未能发现显著的治疗效果（非专利文献25）。
为了回避这样的问题，开发了嵌合抗体（专利文献3和4）。嵌合抗体包括来自2个或其以上的种的抗体的一部分（小鼠抗体的可变区和人抗体的恒定区等）。这样的嵌合抗体的优点在于保持了小鼠抗体的特征，并且因具有人Fc而能够刺激人补体或细胞损伤活性。但是，这样的嵌合抗体依然会引起“人抗嵌合抗体”即HACA（HumanAnti-ChimeraAntibody）应答（非专利文献26）。进而，开发了只有取代的抗体的一部分为互补决定域（即“CDR”）的重组抗体（专利文献5和6）。使用CDR移植技术，产生由小鼠CDR、人可变区骨架和恒定区构成的抗体，即“人化抗体”（非专利文献27）。但是，这样的人化抗体对人也具有免疫原性，会引起HAHA（Humananti-HumanAntibody）反应（非专利文献28、29）。因此，在临床应用中，期待更加安全有效的没有免疫原性的抗体治疗药。
但是，在抗体新药研发中，虽然获取识别存在于细胞膜表面的“完整状态的”标的癌抗原的抗体是必不可少的，但是由于标的癌抗原为膜蛋白，所以即使对于针对已知的癌抗原的抗体而言，其取得也是很困难的。为了消除这些问题点，本发明的发明人迄今为止制作了由1000亿个独立的克隆构成的巨大的人抗体文库，利用该数据库确立了针对癌细胞和组织的细胞膜表面存在的蛋白质（细胞表面抗原）的抗体的网罗式获取法（专利文献7～9）。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第5667781号
专利文献2：美国专利第7976841号
专利文献3：欧洲专利120694号
专利文献4：欧洲专利125023号
专利文献5：英国专利GB21886638A
专利文献6：美国专利第5585089号
专利文献7：国际公开第01/062907号小册子
专利文献8：国际公开第2001/096401号小册子
专利文献9：日本特开2005-185281号公报
非专利文献
非专利文献1：MassR,etal.,ProcAmSociClinOncol19,75a,2000
非专利文献2：BerinsteinNL,etal.,AnnalsofOncology1998,9:1995-1001.
非专利文献3：BruggemannM.,etal.,J.Exp.Med.,166,1351-1361.
非专利文献4：LoosM.（1982）.Prog.Allergy,30,135-192.MolImmunol.1982May;19(5):651-7.
非专利文献5：JClinInvest1963;42,314-326
非专利文献6：IntJCancer1981;27:329-334,
非专利文献7：JUrol1990;143:381-385,
非专利文献8：CancerGeneTher2000;7:59-65;
非专利文献9：EurJCancer2004;40（9）:1418-1422
非专利文献10：JClinInvest1980;65:1182-1191.
非专利文献11：Placenta1986;7:391-403
非专利文献12：JClinInvest(1980)66,1135-1143.10
非专利文献13：Proc.NatlAcadSciUSA1982;79:1175-1179,
非专利文献14：CancerRes1986;46:1759-1763
非专利文献15：CancerRes1990;50:6295-6301
非专利文献16：Blood2004;103:1838-1845
非专利文献17：J.Clin.Oncol.,2,881（1984）
非专利文献18：Blood,65,1349（1985）
非专利文献19：J.Natl.CancerInst.,80,932（1988）
非专利文献20：Proc.Natl.Acad.Scl.,U.S.A.,82,1242（1985）
非专利文献21：J.Nucl.Med.,26,1011（1985）
非专利文献22：J.Natl.CancerInst.,80,937（1988）
非专利文献23：J.Immunol.,135,1530（1985）
非专利文献24：CancerRes.,46,6489（1986）
非专利文献25：Clini.Cancer.Res.1995;1:1259-1265
非专利文献26：J.Exp.Med.,170,2153-2157,1989
非专利文献27：Nature,332,323-327,1988
非专利文献28：CancerRes.2001;61:6851-6859
非专利文献29：JPharmBiomedAnal.2006;41:1347-1353
非专利文献30：IntJOncol.199813（4）:871-5
非专利文献31：TohokuJ.exp.Med.1987;153:239-243
非专利文献32：Urol.Res.1987;15:341-344
非专利文献33：Br.J.Urol.1990;65:339-344
非专利文献34：Histopathology1988;12:53-63
非专利文献35：J.Clin.Pathol.1984;37:131-135
非专利文献36：APathol.Anat.Histopathol.1990;416:491-496
非专利文献37：Leukemia1993;7:2019-2025
非专利文献38：Hematol.Pathol.1990;4:37-41
非专利文献39：Lancet1983;1:498-501
非专利文献40：Blood2004;103:1838-1845
发明内容
发明要解决的课题
本发明要解决的课题在于提供一种完全的人抗人TfR抗体，该抗体特异性识别人TfR，阻碍TfR高表达的癌细胞的生存和增殖，并且对人没有免疫原性。本发明的目的还在于提供这些抗体的制造方法和使用这些抗体的癌等疾病的治疗药。
用于解决课题的方法
如上所述，虽然开发了以TfR为标的的抗体作为抗肿瘤剂，但是由于是来自动物的抗体，所以HAMA的产生和药效不足等，导致开发不成功。为此，本发明的发明人对独自的抗体制作方法进行了潜心研究，发现：通过人抗体文库噬菌体展示，获取了与癌细胞膜上的TfR反应的噬菌体抗体（scFv抗体）。通过对这些抗体基因序列进行分析，发现抗体的CDR具有新型的氨基酸序列。进而，将这些scFv抗体IgG化，制作了完全的人IgG抗体。使用这些IgG抗体在体外（invitro）、体内（invivo）研究了抗肿瘤效果。其结果可知，抗体具有很强的抗肿瘤效果。由此，利用这些抗体在多种TfR高表达的癌治疗中显示有用性，从而完成了本发明。
即，根据本发明，提供一种与人TfR进行特异性反应的抗体，作为重链第一互补决定区（VHCDR1）、重链第二互补决定区（VHCDR2）、重链第三互补决定区（VHCDR3）分别包含序列号1～3、7～9、13～15、19～21、25～27、31～33、37～39、43～45、49～51、55～57、61～63、67～69、73～75、79～81、85～87、91～93、97～99、103～105、109～111、115～117中的任意的氨基酸序列。
根据本发明，提供一种与人TfR进行特异性反应的抗体，作为重链第一互补决定区（VHCDR1）、重链第二互补决定区（VHCDR2）、重链第三互补决定区（VHCDR3）分别包含序列号1～3、7～9、13～15、19～21、25～27、31～33、37～39、43～45、49～51、55～57、61～63、67～69、73～75、79～81、85～87、91～93、97～99、103～105、109～111、115～117中的任意的氨基酸序列，作为轻链第一互补决定区（VLCDR1）、轻链第二互补决定区（VLCDR2）、轻链第三互补决定区（VLCDR3）分别包含序列号4～6、10～12、16～18、22～24、28～30、34～36、40～42、46～48、52～54、58～60、64～66、70～72、76～78、82～84、88～90、94～96、100～102、106～108、112～114、118～120中的任意的氨基酸序列。
根据本发明，提供一种与人TfR进行特异性反应的抗体，其选自下述（1）到（20）的抗体。
（1）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号1的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号2的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号3的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号4的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号5的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号6的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（2）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号7的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号8的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号9的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号10的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号11的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号12的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（3）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号13的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号14的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号15的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号16的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号17的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号18的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（4）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号19的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号20的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号21的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号22的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号23的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号24的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（5）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号25的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号26的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号27的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号28的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号29的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号30的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（6）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号31的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号32的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号33的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号34的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号35的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号36的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（7）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号37的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号38的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号39的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号40的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号41的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号42的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（8）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号43的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号44的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号45的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号46的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号47的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号48的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（9）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号49的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号50的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号51的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号52的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号53的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号54的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（10）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号55的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号56的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号57的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号58的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号59的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号60的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（11）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号61的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号62的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号63的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号64的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号65的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号66的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（12）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号67的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号68的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号69的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号70的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号71的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号72的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（13）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号73的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号74的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号75的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号76的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号77的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号78的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（14）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号79的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号80的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号81的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号82的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号83的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号84的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（15）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号85的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号86的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号87的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号88的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号89的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号90的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（16）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号91的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号92的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号93的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号94的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号95的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号96的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（17）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号97的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号98的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号99的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号100的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号101的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号102的轻链第三互补决定区（VLCDR3）构成的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（18）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号103的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号104的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号105的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号106的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号107的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号108的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（19）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号109的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号110的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号111的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号112的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号113的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号114的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR；
（20）具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号115的重链第一互补决定区（VHCDR1）、序列号116的重链第二互补决定区（VHCDR2）、序列号117的重链第三互补决定区（VHCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR，轻链可变区具有包含序列号118的轻链第一互补决定区（VLCDR1）、序列号119的轻链第二互补决定区（VLCDR2）、序列号120的轻链第三互补决定区（VLCDR3）的CDR、或者与其实质上相同的CDR。
根据本发明，还提供一种与人TfR进行特异性反应的抗体，在序列号1～3、7～9、13～15、19～21、25～27、31～33、37～39、43～45、49～51、55～57、61～63、67～69、73～75、79～81、85～87、91～93、97～99、103～105、109～111、115～117、4～6、10～12、16～18、22～24、28～30、34～36、40～42、46～48、52～54、58～60、64～66、70～72、76～78、82～84、88～90、94～96、100～102、106～108、112～114、118～120中的任意的氨基酸序列中，缺失、添加、取代和／或插入了1个或者数个氨基酸，活性与权利要求1～3中任一项所述的抗体等同。
优选，本发明的抗体为人抗体或者人化抗体。
优选，本发明的抗体为选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体（scFv）、二聚体化V区（Diabody）、二硫化物稳定化V区（dsFv）和包含CDR的肽的抗体片段。
根据本发明，提供一种编码上述本发明的抗体的DNA。
根据本发明，提供一种含有上述本发明的DNA的重组载体。
根据本发明，提供一种将上述本发明的重组载体导入宿主细胞得到的转化株。
根据本发明，提供一种本发明的抗体的制造方法，包括将上述本发明的转化株在培养基中培养，在培养物中产生蓄积本发明的抗体，从培养物中收集抗体的工序。
根据本发明，提供一种具有上述本发明的抗体的医药组合物。
根据本发明，提供一种在抗体上结合有细胞损伤性物质的上述医药组合物。
优选，细胞损伤性物质为药剂、毒素或者放射性物质。
优选，本发明的医药组合物作为抗癌剂使用。
优选，癌为实体癌或者血液癌。
优选，实体癌为肺癌、大肠癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、皮肤癌。
优选，血液癌为白血病、淋巴瘤、骨髓瘤。
更优选，血液癌为成人T细胞白血病（ATL）。
根据本发明，还提供一种抑制或者治疗癌的方法，包括向对象者投与上述本发明的抗体的步骤。
根据本发明，还提供上述本发明的抗体在医药组合物或者抗癌剂的制造中的使用。
发明的效果
本发明的抗体是特异性识别人TfR，阻碍表达TfR的癌细胞的生存或增殖的完全的人抗体。人抗体在投与人时，回避了抗体的抗原性，不会产生HAHA，因此，更能够发挥副作用小的高抗肿瘤作用。即，本发明的抗人TfR抗体作为抗癌剂是有用的。
附图说明
图1为用免疫沉降和蛋白质印迹法确认抗TfR噬菌体抗体的TfR结合性的结果。
图2表示人抗体基因。人抗体基因轻链λ的J链（junction）基因和C链（constant）基因为5个J、C依次并列存在，J4-CL4和J5-CL5为假基因，没有功能。
图3表示TfRIgG抗体和癌细胞株的流式细胞分析结果。
图4表示各个癌模型中TfRIgG抗体的抗肿瘤效果。
图5表示ATL模型中TfR006IgG抗体的抗肿瘤效果。
图6表示来自临床的肺癌组织样品与TfR006噬菌体抗体的反应性。
具体实施方式
接着，对本发明进行更详细说明。
定义和一般技术
本说明书中，除了另外定义，涉及本发明使用的科学技术用语包含本领域的技术人员通常理解的意义。通常，本说明书中记载的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学以及杂交相关使用的命名法及其技术，为本技术领域公知的技术而通常使用。
本发明的方法和技术通常在没有其他表示时，为该技术领域公知的现有方法，按照本说明书整体中引用的各种一般性参考文献和更具体的参考文献所记载的实施。
TfR
人转铁蛋白受体（TfR）为人第三号染色体编码的760个氨基酸构成的一次跨膜蛋白（序列号125）。该蛋白质作为CD71抗原已知，涉及细胞对铁的获取，涉及细胞的增殖。本发明的TfR在结构上没有特别限定，包括单体、多聚体、细胞膜上表达的intactform、细胞外区域构成的可溶化form、trunctedform、基因的突变、缺失等引起的mutationform、磷酸化等引起的接受了翻译后修饰的form等，全部表示人TfR。
进行反应和反应性
本说明书中，“进行反应”和“反应性”没有特别限定，指相同的意思。即，抗体识别抗原。该抗原可以为在细胞膜上表达的intactTfR，也可以为trunctedform或可溶化form。此外，也可以为保持立体结构的TfR、改性TfR。作为研究反应性的方法，可以举出流式细胞分析方法（FACS）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、western-blot、荧光微量测定技术（FMAT）表面等离子共振（BIAcore）、免疫染色、免疫沉降等。
流式细胞分析中使用的抗体，可以为用FITC等荧光物质、生物素等标记的抗体，也可以为未标记的抗体。根据使用的抗体有无标记、其种类不同，使用荧光标记抗生物素蛋白、荧光标记抗人免疫球蛋白抗体等。反应性通过下述方法进行评价：在检体中加入充分量的抗TfR抗体（通常最终浓度为0.01～10μg/mL），进行阴性对照抗体、阳性对照抗体的反应性比较。
抗体
本说明书中，根据需要，按照习惯使用以下的简记（括号内）。
重链（H链）、轻链（L链）、重链可变区（VH）、轻链可变区（VL）、互补决定区（CDR）、第一互补决定区（CDR1）、第二互补决定区（CDR2）、第三互补决定区（CDR3）、重链的第一互补决定区（VHCDR1）、重链的第二互补决定区（VHCDR2）、重链的第三互补决定区（VHCDR3）、轻链的第一互补决定区（VLCDR1）、轻链的第二互补决定区（VLCDR2）、轻链的第三互补决定区（VLCDR3）。
本说明书中，“抗体”与免疫球蛋白同义，能够按照在本技术领域中通常已知的那样理解。具体来说，抗体这个用语不受制作抗体的任意特定方法的限定。例如，抗体可以为重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。
本说明书中，“人抗体”是指可变区和恒定区的序列为人序列的任意的抗体。该用语包含具有来自人基因的序列，但是例如考虑到免疫原性的降低、亲和性的增大，进行可能引起不希望的折叠的半胱氨酸的去除等变化的抗体。该用语还包含能够实施人细胞非特有的糖基化、通过在非人细胞中重组而制作的那样的抗体。这些抗体能够以各种方式制备。
本说明书中，“人化抗体”的用语是指来自非人的抗体，非人种的抗体序列中特征性的氨基酸残基取代与人抗体对应位置确认的残基。该“人化”工序，其结果得到的抗体会降低人的免疫原性。可以理解为使用在本技术领域中公知的技术能够将来自非人的抗体人化。例如可以参考Winter等，Immunol.Today14:43-46（1993）。作为对象的抗体，能够通过与对应于CH1、CH2、CH3、铰链区、和／或框架区的人序列取代的重组DNA技术工程制作。例如，参照WO92/02190、以及美国专利第5530101号、第5585089号、第5693761号、第5693792号、第5714350号、和第5777085号。本说明书中，“人化抗体”在其意义范围内，包括嵌合抗体和CDR移植抗体。
本发明的抗体可变区中，框架区（FR）的序列，只要是相对于对应的抗原的特异性结合性没有实质性影响，就没有特别限定。优选使用人抗体的FR区域，但是，也能够使用人以外的动物种（例如小鼠或大鼠）的FR区域。
本说明书中，“噬菌体抗体”的用语是指通过噬菌体产生的scFv抗体。即，包括VH和VL氨基酸序列的抗体片段。该片段除了作为Linker的氨基酸以外，还包括作为标签的氨基酸序列。
本发明的抗体的一个实施方式，包括可变区和恒定区（例如IgG型抗体）。恒定区的序列没有特别限定。例如，能够使用公知的人抗体的恒定区。作为人抗体的重链恒定区（CH），只要属于人免疫球蛋白（以下，记为hlg）就可以，适宜为hIgG类型，业能够使用属于hIgG类型的hIgG1、hIgG2、GhIgG3、hIgG4这样的亚型的任意种类。此外，作为轻链恒定区（CL），只要为属于hIg的即可，能够使用κ簇或λ簇的物质。此外，也能够使用人以外的动物种（例如小鼠或大鼠）的恒定区。
本发明的抗体中使用的FR或恒定区的氨基酸序列，可以原样使用作为来源的原始的FR或者恒定区的氨基酸序列原型，也可以使用缺失、添加、取代和／或插入1或者数个（例如，1到8个、优选1到5个、更优选1到3个、特别优选1或2个）的氨基酸的不同氨基酸序列。
本发明中，“活性与权利要求所述的抗体等同”是指对人TfR的结合活性和／或抗肿瘤活性等同。作为结合活性，是指识别抗原。该抗原可以是细胞膜中表达的intactTfR，也可以是trunctedform、可溶化form。另外，可以是保持立体结构的TfR，也可以是改性的TfR。例如，作为研究结合活性的方法，可以举出流式细胞分析方法（FACS）、酶结合免疫吸附测定法（ELISA）、western-blot、荧光微量测定技术（FMAT）表面等离子共振（BLAcore）等。作为抗肿瘤活性，意味着阻碍肿瘤细胞的增殖或生存的活性。该肿瘤细胞的增殖或生存为invitro或invivo。例如，invitro中，可以举出使肿瘤细胞的数量减少的活性、阻碍肿瘤细胞的数量增加的活性、引起肿瘤细胞的细胞死亡的活性、抗体依赖性细胞损伤活性（ADCC：Antibody-dependentcellularcytotoxicity）、补体依赖性细胞损伤活性（CDC：Complement-dependentcytotoxicity）等。Invivo中，可以举出使肿瘤重量或者体积减少的活性、抑制肿瘤重量或者体积增加的活性、促进由其他药剂引起的肿瘤重量或者体积的减少的活性、抑制肿瘤细胞引起的个体死亡的活性等。
作为Invivo的动物模型，可以举出在裸鼠等免疫缺陷小鼠中移植来自人癌组织的培养细胞株的异种移植模型、将培养小鼠癌细胞株移植到具有正常的免疫系统的野生型小鼠中的同系移植模型等。
异种移植模型能够通过将人癌细胞株移植到裸鼠等免疫缺陷小鼠的皮下、皮内、腹腔内、静脉内等各种部位而制作。
本发明中，“等同”是指不是必须是同程度的活性，活性可以增强，或者，只要具有活性，活性减少也可以。作为活性减少的抗体，例如，可以举出具有与原先的抗体比较30%以上的活性、优选50%以上的活性、更优选80%以上的活性、更优选90%以上的活性、特别优选95%以上的活性的抗体。
上述抗体，只要具有对TfR等同的结合活性，或者，只要具有等同的抗肿瘤活性，则也可以在可变区（CDR序列和／或FR序列）的氨基酸序列中取代、缺失、添加和／或插入1或者数个氨基酸。在氨基酸序列中，缺失、添加、取代和／或插入1或者数个（例如，1到8个、优选1到5个、更优选1到3个、特别优选1或2个）的氨基酸，制备具有对TfR的结合活性和／或抗肿瘤活性的抗体的氨基酸序列的本领域技术人员熟知的方法，已知有向蛋白质导入突变的方法。例如，如果为本领域的技术人员，则能够使用部位特异性突变诱导法（Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y,anDNAkagawa,M.(1995)Anoligodeoxyribonucleotide-directeddualambermethodforsite-directedmutagenesis.Gene152,271-275、Zoller,MJ,andSmith,M.(1983)Oligonucleotide-directedmutagenesisofDNAfragmentsclonedintoM13vectors.MethodsEnzymol.100,468-500、Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW,Kramer,B,Pflugfelder,M,andFritz,HJ(1984)ThegappedduplexDNAapproachtooligonucleotide-directedmutationconstruction.NucleicAcidsRes.12,9441-9456、KramerW,andFritzHJ(1987)Oligonucleotide-directedconstructionofmutationsviagappedduplexＤＮＡMethods.Enzymol.154,350-367、Kunkel,TA(1985)Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypicselection.ProcNatlAcadSciUSA.82,488-492）等，在具有对TfR结合活性和／或抗肿瘤活性的抗体的氨基酸序列中导入适宜突变，由此能够制备与具有对TfR结合活性和／或抗肿瘤活性的抗体功能等同的突变体。
这样，在可变区，1或者多个氨基酸突变，具有对TfR结合活性和／或抗肿瘤活性的抗体也包含在本发明的抗体中。
本说明书中“与其实质上相同的CDR”的用语是指构成如上所述1或者多个氨基酸缺失、添加、取代和／或插入，具有对TfR的结合活性和／或抗肿瘤活性的抗体的CDR。
本发明的抗体不受其来源的限定，可以为人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体等来自任意动物的抗体。或者，也可以为嵌合体化抗体、人化抗体等。本发明的抗体的优选实施方式为人抗体。
本发明的抗体根据后述的产生抗体的细胞或宿主或者通过精制方法不同，氨基酸序列、分子量、等电点或糖链的有无或形态等可以不同。所得到的抗体只要是具有与本发明的抗体等同的活性，就包含在本发明中。例如，本发明记载的氨基酸序列接受翻译后修饰的情况也包含在本发明中。还有，对已知的翻译后修饰以外的部分进行的翻译后修饰，只要是具有与本发明的抗体等同的活性，则也包含在本发明中。此外，本发明的抗体在原核细胞例如大肠杆菌中表达的情况下，在本来的抗体的氨基酸序列的N末端添加甲硫氨酸残基。本发明的抗体也包含这样的抗体。对已知的翻译后修饰以外的部位进行翻译后修饰，只要是具有与本发明的抗体等同的活性，则也包含在本发明中。
抗体的制作
（1）通过噬菌体展示文库得到与抗原的反应的scFv
本发明的抗体的获取能够按照本技术领域已知的任意方法进行制备。例如，使用噬菌体展示技术，能够提供包含对TfR的亲和性各异的抗体的储藏库的文库。接着，筛选这些文库，能够鉴定并分离针对TfR的抗体。优选噬菌体文库为下述文库，即，使用将从人B细胞分离的mRNA制备的人VL和VHcDNA产生的scFv噬菌体展示文库。制备这样的文库并进行筛选的方法是本技术领域已知的。人TfR作为抗原，从显示筛选反应性的噬菌体克隆回收遗传物质。分析选择的噬菌体的基因，就能够决定编码与抗原结合的人抗体的可变区的VH和VL的DNA序列。使用该scFv序列，将scFv进行IgG化，就能够得到人抗体。
（2）scFv的IgG化（人抗体的制作）
制作H链和L链的表达载体，使其在宿主细胞中表达，回收分泌的上清并进行精制，由此得到人抗体。也可以通过在同一载体上表达VH和VL（串联型）而获取人抗体。这些方法是公知的，能够参考WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、WO97/10354等。
具体来说，将编码VH的DNA与编码重链恒定区（CH1、CH2和CH3）的其他的DNA分子连结，由此能够取得完全长重链基因。人重链恒定区基因的序列为本技术领域已知的（例如，Kabat，E.A.（1991）SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices、NIHPublicationNo.91-3242），包含这些区域的DNA片段通过标准的PCR扩增能够得到。重链恒定区为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD的恒定区即可，最优选为IgG1或IgG2的恒定区。IgG1的恒定区序列可以为Gm（1）、Gm（2）、Gm（3）、Gm（17）等已知在不同个体间产生的任意的各种等位基因或异型。这些异型相当于IgG1恒定区中天然存在的氨基酸取代。
将编码VL的DNA与编码轻链恒定区的其他的DNA分子连结，由此能够取得完全长轻链基因（以及Fab轻链基因）。人轻链恒定区基因的序列为本技术领域已知的（例如，Kabat，E.A.（1991）SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices、NIHPublicationNo.91-3242），包含这些区域的DNA片段通过标准的PCR扩增能够得到。轻链恒定区可以为κ或者λ的恒定区。κ恒定区可以为Inv（1）、Inv（2）或Inv（3）等已知在不同个体间产生的任意的各种等位基因。λ恒定区可以为来自3个λ基因的任一个。
将上述那样得到的编码H链或L链的DNA插入表达载体中，由此制作表达载体，使其在宿主细胞中表达，回收并精制分泌上清，由此能够得到人抗体。表达载体可以举出质粒、逆转录酶病毒、腺病毒、腺相关病毒（AAV）、花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒等植物病毒、粘粒、YAC、来自EBV的附加体等。表达载体和表达调节序列，以与使用的表达用宿主细胞适合的方式选择。抗体轻链基因和抗体重链基因能够各自插入载体中，也能够二者的基因插入相同的表达载体中。抗体基因通过标准的方法（例如，抗体基因片段上的互补的限制性内切酶部位和载体的连接、或者限制性内切酶部位不存在的情况下平滑末端连接）插入表达载体中。
适宜的载体，如上所述，是以能够容易插入、表达任意的VH或VL序列的方式而工程学制作的具有适当的限制性内切酶部位的功能完全的编码人CH或CL免疫球蛋白序列的载体。这样的载体，通常，在插入的J区域中的剪接供给部位和人C区域中先行的剪接接受部位之间，或者存在于人CH外显子内的剪接区域中引发剪接。多腺苷酸化和转录结束在编码区域下游的天然染色体部位发生。重组表达载体也能够编码促进来自宿主细胞的抗体链的分泌的信号肽。抗体链基因能够以使信号肽在框架内与免疫球蛋白链的氨基末端连结的方式在载体中被克隆。信号肽可以为免疫球蛋白信号肽，或者也可以为异种性信号肽（即，来自非免疫球蛋白的信号肽）。
本发明的抗体的表达载体，除了抗体基因和控制序列，还可以具有控制载体在宿主细胞中的复制的序列（例如，复制起点）、选择标记基因等序列。选择标记基因促进导入载体的宿主细胞的选择。例如，通常，选择标记基因赋予导入载体的宿主细胞对G418、潮霉素、甲氨蝶呤等药物的抗性。优选的选择标记基因例如有二氢叶酸还原酶（DHFR）基因（dhfr-宿主细胞中甲氨蝶呤选择/扩增同时使用）、新霉素磷酸转移酶基因（G418选择用）和谷氨酸合成酶基因。
用以上方法制作的抗体基因表达载体对宿主细胞进行转化。作为宿主细胞，可以为细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等、只要能够产生本发明的抗体的细胞即可，优选为动物细胞。作为动物细胞，可以举出中国仓鼠卵巢细胞CHO/dhfr（-）细胞CHO/DG44细胞、来自猴的细胞COS细胞（A.Wright&S.L.Morrison,J.Immunol.160,3393-3402（1998））、SP2/O（小鼠骨髓瘤）（K.Motmansetal.,Eur.J.CancerPrev.5,512-5199(1996),R.P.Junghansetal.,CancerRes.50,1495-1502(1990)）等。此外，转化能够适宜地使用脂质体（R.W.Maloneetal.,Proc.Natl.Acad.Sci,USA86,6007(1989)，P.L.Felgneretal.,Proc.Natl.Acad.Sci,USA84,7413(1987)）、电穿孔法、磷酸钙法（F.L.Graham&A.J.vanderEb,Virology52,456-467(1973)）、DEAE-Dextran法等。
培养转化体之后，从转化体的细胞内或培养液分离人抗体。抗体的分离、精制能够适宜地组合利用离心分离、硫酸铵分级分离、盐析、超滤、亲和色谱法、离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法等方法。
抗体片段
基于本发明的抗体或者基于编码本发明的抗体的基因的序列信息，能够制作抗体片段。作为抗体片段，可以举出Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、dsFv抗体。
Fab为在半胱氨酸存在下由木瓜蛋白酶消化IgG得到的由L链与H链片段构成的分子量约5万的片段，其中，该H链片段由H链可变区以及CH1区域和铰链部的一部分构成。本发明中，能够通过木瓜蛋白酶消化上述抗体而得到。将编码上述抗体的H链的一部分和L链的DNA重组到适当的载体中，使用该载体转化而得到转化体，使用该转化体也能够制备Fab。
Fab’为通过切断后述的F(ab’)2的H链间的二硫键而得到的分子量约5万的片段。本发明中，能够通过用胃蛋白酶消化上述抗体，使用还原剂切断二硫键而得到。此外，与Fab同样，也能够使用编码Fab’的DNA以基因工程的方法制备。
F(ab’)2为通过胃蛋白酶消化IgG得到的由L链和H链片段构成的片段（Fab’）通过二硫键结合的分子量约10万的片段，其中，该H链片段由H链可变区、CH1区域和铰链的一部分构成。本发明中，能够通过胃蛋白酶消化上述抗体而得到。此外，与Fab同样，也能够使用编码F(ab’)2的DNA以基因工程的方法制备。
scFv为将由H链可变区和L链可变区构成的Fv用肽接头连接一个链的C末端和另一个链的N末端的单链化的抗体片段。作为肽接头，例如能够使用柔软性高的（GGGGS）3等。例如，使用编码上述抗体的H链可变区和L链可变区的DNA和编码肽接头的DNA，构建编码scFv抗体的DNA，将其重组入适当的载体中，使用该载体转化得到转化体，由该转化体能够制备scFv。
dsFv是在H链可变区和L链可变区的适当位置导入Cys残基，通过二硫键将H链可变区和L链可变区结合，由此稳定化的Fv片段。各链中的Cys残基的导入位置根据由分子模拟预测的立体结构来决定。本发明中，例如，预测由上述抗体的H链可变区和L链可变区的氨基酸序列构成的立体结构，构建基于这样的预测而导入突变的分别编码H链可变区和L链可变区的DNA，将其重组入适当的载体中，使用该载体转化得到转化体，由该转化体能够制备dsFv。
此外，通过使用适当的接头连结scFv抗体、dcFv抗体等，或者融合链霉亲和素，能够将抗体片段多量化。
医药组合物
根据本发明，提供包含本发明的抗体的医药组合物。本发明的一个实施方式为癌的治疗，但不限于此。由TfR高表达引起的癌以外的疾病也包括在本发明的范围内。作为更优选的实施方式，癌为实体癌（例如，肺癌、大肠癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、皮肤癌等）、或血液癌（例如，白血病、淋巴肿、骨髓瘤等）。本发明的其他的优选实施方式中，癌为成人T细胞白血病（ATL）。
作为本发明的医药组合物的一种实施方式，将本发明的抗体作为有效成分利用。这是利用抗体的细胞增殖抑制活性、细胞死亡诱导活性、ADCC活性、CDC活性等，发挥抗肿瘤效果。抗体可以仅具有一个上述的活性，也可以同时具有多种活性。即，裸抗体为医药组合物的有效成分。
在另一各实施方式中，本发明的抗体作为癌治疗药，能够用于对癌组织特异性打靶的癌细胞定向破坏疗法（missiletherapy）。即，通过投与结合有对癌细胞损伤的物质的抗体，使其向癌部位特异性移动，达到治疗效果和降低副作用的治疗方法。
损伤癌细胞的物质可以举出药剂、毒素或放射性物质等细胞损伤性物质。细胞损伤性物质与抗体的结合能够用本领域技术人员公知的方法进行（ClinCancerRes.2004Jul1;10（13）:4538-49）。
与抗体结合的药剂能够使用对癌细胞造成损伤的公知的物质。作为例子，例如，可以举出Duocarmycin、Duocarmycin的类似物和诱导剂、CC-1065、CBI为主要成分的Duocarmycin模拟剂、MCBI为主要成分的Duocarmycin类似物、CCBI为主要成分的Duocarmycin类似物、多柔比星、多柔比星结合物、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、多拉斯他汀、多拉斯他汀-10、考布他汀、卡奇霉素（calicheamicin）、美坦辛、美坦辛类似物、DM1、DM2、DM3、DM4、DMI、澳瑞他汀E（auristatinE）、澳瑞他汀EB（AEB）、澳瑞他汀EFP（AEFP）、单甲基澳瑞他汀（MMAE）、单甲基澳瑞他汀F（MMAF）、5-苯甲酰戊酸AE酯（AEVB）、tubulysin、双萨拉唑（Disorazole）、埃博霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、SN-38、托泊替康、根霉素、棘霉素、秋水仙碱、长春碱、长春地辛、雌莫司汀、西马多丁、艾榴塞洛素、甲氨蝶呤、甲基叶酸、二氯甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-巯嘌呤、阿糖胞苷、米尔法兰、洛诺生、洛诺西丁、放线菌素、道诺霉素、道诺霉素结合物、丝裂霉素C、丝裂霉素A、洋红霉素、氨基蝶呤、他利霉素、鬼臼毒素、鬼臼毒素衍生物、依托泊苷、依托泊苷磷酸盐、长春新碱、紫杉醇、紫衫酯维甲酸、酪酸、N8-乙酰亚精胺、喜树碱等，但不限于这些。
抗体和药剂的结合可以通过其自身具有的连接基等直接结合，也可以通过接头或其他物质间接结合。
作为与药剂直接结合时的连接基，例如可以例举通过使用SH基的二硫键或马来酰亚胺的结合。例如，还原抗体的Fc区域的分子内二硫键与药剂的二硫键，将二者通过二硫键结合。此外，还有通过马来酰亚胺的方法。此外，作为别的方法，还有以基因工程学的方法在抗体内导入半胱氨酸的方法。
抗体和药剂通过其他物质（接头）间接结合也可以。接头优选具有1种或者2种以上的与抗体或药剂或两者反应的官能团。作为官能团的例子，可以举出氨基、羧基、巯基、马来酰亚胺基、吡啶基等。
作为接头的例子，可以举出N-琥珀酰亚胺4-（马来酰亚胺甲基）环己烷羧酸酯（SMCC）、N-琥珀酰亚胺-4-（N-马来酰亚胺甲基）-环己烷-1-羧基-（6-酰胺己酸酯）（LC-SMCC）、κ-马来酰亚胺十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯（KMUA）、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺酯（GMBS）、ε-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（EMCS）、间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS）、N-（α-马来酰亚胺乙酰氧基）-琥珀酰亚胺酯（AMAS）、琥珀酰亚胺基-6-（β-马来酰亚胺丙酰胺）己酸酯（SMPH）、N-琥珀酰亚胺基-4-（对马来酰亚胺苯基）-丁酯（SMPB）、和N-（对马来酰亚胺苯基）异氰酸酯（PMPI）、6-马来酰亚胺己酰基（MC）、马来酰亚胺丙酰基（MP）、对氨基苯氧基羧基（PAB）、N-琥珀酰亚胺基4-（2-吡啶基硫代）戊酸酯（SPP）和N-琥珀酰亚胺（4-碘-乙酰基）氨基安息香酸酯（SIAB）等，但不限于这些。此外，该接头，例如，也可以为缬氨酸-瓜氨酸（Val-Cit）、丙氨酸-苯丙氨酸（ala-phe）这样的肽接头，也可以分别组合上述举出的接头使用。
关于药剂和抗体的结合方法，例如，可以基于CancerResearch;68(22)9280(2008),NatureBiotechnology;26(8)925(2008)、BioConjugateChemistry;19、1673（2008）、CancerResearch；68（15）6300（2008）或者特表2008-516896号公报等记载的方法进行。
作为毒素，能够举出以化学或者基因工程学方法与抗体结合的所谓的免疫毒素。作为毒素，例如可以举出白喉杆菌毒素A链、假单胞杆菌毒素、蓖麻蛋白链、无糖链蓖麻蛋白A链GeloninSaporin等。
利用的放射性物质能够使用本领域技术人员公知的物质。例如，钇90（90Y）、铼186（186Re）、铼188（188Re）、铜67（67Cu）、铁59（59Fe）、锶89（89Sr）、金198（198Au）、汞203（203Hg）、铅212（212Pb）、镝165（165Dy）、钌103（103Ru）、铋212（212Bi）、铋213（213Bi）、钬166（166Ho）、钐153（153Sm）、镥177（177Lu）等。优选90Y、153Sm、177Lu。
抗体和放射性物质的结合能够通过本领域技术人员公知的方法进行（BioconjugChem.1994Mar-Apr;5（2）：101-4.）
使用与含有放射性同位素的化合物结合的抗体的癌治疗能够通过本领域技术人员公知的方法进行（BioconjugChem.1998Nov-Dec;9(6):773-82）。具体来说，最初向患者少量投与结合有含有放射性同位素的化合物的抗体，进行全身的闪烁照相术。确认与正常组织的细胞的抗体的结合少，与癌细胞的抗体的结合多，再大量投与结合有含有放射性同位素的化合物的抗体。
包含本发明的抗人TfR抗体的医药组合物的制剂也在本发明的范围内。这样的制剂，优选，除了包含抗体的医药组合物，还包含生理学上可接受的稀释剂或载体，也可以为与其他的抗体或抗癌剂这样的其他的药剂的混合物。适宜的载体可以包括生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、磷酸缓冲生理盐水葡萄糖液、和缓冲生理盐水，但是不限于此。或者，也可以将抗体冷冻干燥（freezedry），需要时如上所述添加缓冲水溶液而再构成使用。作为给药形态，可以举出片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等口服给药、或者注射剂（皮下注释、静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射等）、经皮、经粘膜、经鼻、经肺、栓剂等非经口给药。本发明的医药组合物的制剂可以单独给药也可以与其他药剂并用。
本发明的医药组合物的给药量，根据症状、年龄、体重等而不同，但是通常，口服给药时，作为抗体的量，相对于成人1日约0.01mg～1000mg，1次或者分数次给药。非口服给药时，1次约0.01mg～1000mg通过皮下注射、肌肉注射或者静脉注射给药。
通过以下的实施例更详细的说明本发明，但是本发明不受实施例的限定。
实施例
实施例1：使用癌细胞株的噬菌体抗体筛选
（1）与癌细胞结合的噬菌体抗体的筛选（肝癌细胞株HepG2）
在15cm的培养皿中培养HepG2细胞，通过2mg/mLcollagenasel/cellsissociationBuffer（GibcoBRL）从培养皿剥离。回收细胞，用冷却的PBS清洗后，与1×1013cfu的人抗体噬菌体文库（参照日本特开2005-185281号公报、WO2008/007648号公报、WO2006/090750号公报），添加反应液（1%BSA、0.1%NaN3、MEM）使得最终容积为1.6mL，在4℃下缓慢旋转4小时进行反应。反应结束后，将反应液分为两份，分别添加0.6mL的有机溶剂（dibutylphthalatecycloheximide9:1），通过微离心机进行2分钟离心（3000rpm）。除去上清液，用0.7mL的1%的BSA/MEM悬浮沉淀在管底的细胞，再添加0.7mL的有机溶剂。同样通过离心除去上清液，在0.3mL的PBS中悬浮细胞，用液氮冷冻。
在37℃下解冻被冷冻的细胞，用1小时感染20mL的大肠杆菌DH12S（OD0.5）。将噬菌体感染的大肠杆菌放入600mL的2×YTGA培养基（2×XYT、200μg/mLampicisulfate、1%Glucose）中，在30℃培养一晚。其后，取出10mL，放入200mL的2×YTA培养基（2×YT、200μg/mLampicisulfate）中，在37℃培养1.5小时。放入1×1011辅助噬菌体KO7，再在37℃下培养1小时。添加800mL的2×YTGAK培养基（2×YT、200μg/mLampicisulfate、0.05%Glucose、50μg/mLkanamycin），在30℃培养一晚。进行10分钟离心（8000rpm），由此回收上清液。在回收的上清液中加入200mL的PEG液（20%polyetyleneglycol6000、2.5MNaCl），充分搅拌，之后，进行10分钟离心（8000rpm），由此沉淀噬菌体。将其在10mL的PBS中悬浮，将其作为第一轮筛选的噬菌体。
接着，进行第二轮筛选。混合2×107培养细胞和1×1010第一轮筛选的噬菌体，添加反应液（1%BSA、0.1%NaN3、MEM），使得最终容积为0.8mL。其后，进行与上述第一轮筛选同样的方法，取得第二轮筛选的噬菌体。
第三轮筛选使用1×109第二轮筛选的噬菌体，与上述同样进行。
（2）噬菌体抗体的分析
回收第三轮筛选得到的噬菌体，通过已知方法分析DNA序列，排出保持有缺陷区域的不完全抗体或序列重复的抗体，取得具有独立的抗体序列的噬菌体抗体（参考专利第4870348）。
通过同样的方法，使用下述表1所示的21种癌细胞，进行了与癌抗原反应的噬菌体抗体的筛选。其结果，如表1所示，获取了具有独立序列的噬菌体抗体1863个。
[表1]
癌细胞 获取的噬菌体数目
CO-2 102
MKN45 90
OCTH-16 82
HepG2 410
NCI-H441 80
K562 33
U937 107
HL-60 107
MV4-11 46
KF28 62
NCI-N87 50
RERF-LC-AI 73
SW480 46
MCF7 73
LNCap.FGC 60
MDA-MB-231 78
U-87MG 62
T98G 71
DU-145 96
MMAc 76
G-361 59
实施例2：与可溶性人TfR反应的噬菌体的筛选
（1）可溶性TfR抗原产生细胞的制作
使用癌细胞株MIAPaCa2、SKOV-3，通过PCR法制作了TfR的cDNA。通过常规方法调整TfR细胞外区域的cDNA，插入pCMV-Script（Clonetech公司制作），由此制作了可溶性TfR抗原表达载体。将该表达载体导入细胞株293T，制作了产生可溶性TfR抗原的表达细胞。
（2）通过ELISA进行阳性噬菌体筛选
回收上述可溶性TfR产生细胞的上清液，通过精制获得了可溶性TfR抗原。使用该可溶性TfR抗原，通过ELISA研究抗原抗体的反应性。即，用PBS将可溶性TfR抗原调整为10μg/mL，在ImmunoModule/StripPlates（NUNK）中添加50μL/well，在37℃静置2小时。其后，去除可溶性TfR抗原，以200μL/well添加封闭液（5%脱脂牛奶/0.05%NaN3/PBS），在37℃进行2小时封闭。除去封闭液，以PBS清洗，添加100μL/well的上述（表1）噬菌体的培养上清液，在37℃反应1小时。用PBS清洗5次，之后，添加100μL/well用PBS/0.05%Tween20稀释的1μg/mLRabbitanti-cp3，在37℃反应1小时。用PBS清洗5次，之后，再添加100μL/well的用PBS/0.05%Tween20稀释2000倍的anti-RabbitIgG（H+L）-HRP，在37℃反应1小时。用PBS清洗5次，之后，添加100μL/well的OPDin0.1M柠檬酸磷酸缓冲液（pH5.1）+0.01%H2O2，在室温下反应5分钟。加入100μL/well的2NH2SO2，停止显色反应。其后，以SPECTRAma×340PC（MolecularDevices）测定492nm的吸光度。其结果，1863株的噬菌体中，显示与可溶性TfR抗原显著的阳性反应的有20株。分析该20株噬菌体的DNA序列，确认了各自的CDR序列均为新型。CDR序列如下。
（1）TfR001抗体
VHCDR1：序列号1、VHCDR2：序列号2、VHCDR3：序列号3
VLCDR1：序列号4、VLCDR2：序列号5、VLCDR3：序列号6
（2）TfR002抗体
VHCDR1：序列号7、VHCDR2：序列号8、VHCDR3：序列号9
VLCDR1：序列号10、VLCDR2：序列号11、VLCDR3：序列号12
（3）TfR003抗体
VHCDR1：序列号13、VHCDR2：序列号14、VHCDR3：序列号15
VLCDR1：序列号16、VLCDR2：序列号17、VLCDR3：序列号18
（4）TfR004抗体
VHCDR1：序列号19、VHCDR2：序列号20、VHCDR3：序列号21
VLCDR1：序列号22、VLCDR2：序列号23、VLCDR3：序列号24
（5）TfR005抗体
VHCDR1：序列号25、VHCDR2：序列号26、VHCDR3：序列号27
VLCDR1：序列号28、VLCDR2：序列号29、VLCDR3：序列号30
（6）TfR006抗体
VHCDR1：序列号31、VHCDR2：序列号32、VHCDR3：序列号33
VLCDR1：序列号34、VLCDR2：序列号35、VLCDR3：序列号36
（7）TfR007抗体
VHCDR1：序列号37、VHCDR2：序列号38、VHCDR3：序列号39
VLCDR1：序列号40、VLCDR2：序列号41、VLCDR3：序列号42
（8）TfR008抗体
VHCDR1：序列号43、VHCDR2：序列号44、VHCDR3：序列号45
VLCDR1：序列号46、VLCDR2：序列号47、VLCDR3：序列号48
（9）TfR009抗体
VHCDR1：序列号49、VHCDR2：序列号50、VHCDR3：序列号51
VLCDR1：序列号52、VLCDR2：序列号53、VLCDR3：序列号54
（10）TfR010抗体
VHCDR1：序列号55、VHCDR2：序列号56、VHCDR3：序列号57
VLCDR1：序列号58、VLCDR2：序列号59、VLCDR3：序列号60
（11）TfR011抗体
VHCDR1：序列号61、VHCDR2：序列号62、VHCDR3：序列号63
VLCDR1：序列号64、VLCDR2：序列号65、VLCDR3：序列号66
（12）TfR012抗体
VHCDR1：序列号67、VHCDR2：序列号68、VHCDR3：序列号69
VLCDR1：序列号70、VLCDR2：序列号71、VLCDR3：序列号72
（13）TfR013抗体
VHCDR1：序列号73、VHCDR2：序列号74、VHCDR3：序列号75
VLCDR1：序列号76、VLCDR2：序列号77、VLCDR3：序列号78
（14）TfR014抗体
VHCDR1：序列号79、VHCDR2：序列号80、VHCDR3：序列号81
VLCDR1：序列号82、VLCDR2：序列号83、VLCDR3：序列号84
（15）TfR015抗体
VHCDR1：序列号85、VHCDR2：序列号86、VHCDR3：序列号87
VLCDR1：序列号88、VLCDR2：序列号89、VLCDR3：序列号90
（16）TfR016抗体
VHCDR1：序列号91、VHCDR2：序列号92、VHCDR3：序列号93
VLCDR1：序列号94、VLCDR2：序列号95、VLCDR3：序列号96
（17）TfR017抗体
VHCDR1：序列号97、VHCDR2：序列号98、VHCDR3：序列号99
VLCDR1：序列号100、VLCDR2：序列号101、VLCDR3：序列号102
（18）TfR018抗体
VHCDR1：序列号103、VHCDR2：序列号104、VHCDR3：序列号105
VLCDR1：序列号106、VLCDR2：序列号107、VLCDR3：序列号108
（19）TfR019抗体
VHCDR1：序列号109、VHCDR2：序列号110、VHCDR3：序列号111
VLCDR1：序列号112、VLCDR2：序列号113、VLCDR3：序列号114
（20）TfR020抗体
VHCDR1：序列号115、VHCDR2：序列号116、VHCDR3：序列号117
VLCDR1：序列号118、VLCDR2：序列号119、VLCDR3：序列号120
序列号1：TSGVGVG
序列号2：LIYWDDDKHYSPSLKS
序列号3：NGDYGIEFDY
序列号4：GGNNIGSKSVH
序列号5：YDSDRPS
序列号6：QVWDSSSDHVV
序列号7：SYSMN
序列号8：SISSSSSYIYYADSVKG
序列号9：ARESVDAFDI
序列号10：QGDSLRSYDAS
序列号11：GLSDRPS
序列号12：ISRDSGGNPH
序列号13：SYAMS
序列号14：AISGSGGSTYYADSVKG
序列号15：GYYGSNYYYGMDV
序列号16：SGSSSNIGSNYVY
序列号17：RNNQRPS
序列号18：AAWDDSLSGPV
序列号19：DFVFS
序列号20：WISAHDGNTNYAQKLQD
序列号21：DTFTNLLGDYSYDAMDV
序列号22：GSSTGAVTSGHYPY
序列号23：DTTEKHS
序列号24：LLSSGDGRAV
序列号25：NYGMS
序列号26：WISAYNGNTNYGEKLQG
序列号27：DDYYGSGVDAFDI
序列号28：GGNKIGSKSVH
序列号29：YDRDRPS
序列号30：QVWDSSSDVV
序列号31：SYGMH
序列号32：VISFDGSSKYYADSVKG
序列号33：DSNFWSGYYSPVDV
序列号34：TRSSGSIASNSVQ
序列号35：YEDTQRPS
序列号36：QSYDSAYHWV
序列号37：SYWLS
序列号38：KIDPSDSYTQYSPSFEG
序列号39：HGYDAFHV
序列号40：SGSSSNIGNNAVN
序列号41：YDDLLPS
序列号42：AAWDDSLNGWV
序列号43：DYAMH
序列号44：GISWNSGSIGYADSVKG
序列号45：DQHREFYYYGMDV
序列号46：SGSSSNIGSNYVY
序列号47：RNNQRPS
序列号48：AAWDDSLSGPV
序列号49：SYWIG
序列号50：IIYPGDSDTRYSPSFQG
序列号51：QGTNWGVGDAFDI
序列号52：GGNNIGSKSVH
序列号53：DDSDRPS
序列号54：QVWDISSDHVV
序列号55：SYAMS
序列号56：AISGSGGSTYYADSVKG
序列号57：DRYYYGSGSYYDAFDI
序列号58：QGDSLRSYYAS
序列号59：GKNNRPS
序列号60：NSRDSSGNHVV
序列号61：SYSMN
序列号62：VISYDGSNKYYADSVKG
序列号63：VDPGDRGWYFDL
序列号64：SGSSSNIGSNTVN
序列号65：SNNQRPS
序列号66：AAWDDSLNGWV
序列号67：SSPYYWG
序列号68：SVYYSGNTYYNPSLTR
序列号69：HSWGINDAFDV
序列号70：SGSSSNIGNNYVS
序列号71：DNNKRPS
序列号72：GTWDSSLSVWV
序列号73：DYAMH
序列号74：GISWNSGSIDYADSVKG
序列号75：ENLAVAGLDY
序列号76：QGDSLRGYYAS
序列号77：DKNTRPS
序列号78：QSRDNSGEMVV
序列号79：ELSMH
序列号80：GFDPEDGETIYAQKFQG
序列号81：DAYYGSGSPRDAFDI
序列号82：GGDNVGGKSLH
序列号83：DDRDRPS
序列号84：QVWDDISRLVI
序列号85：SYYIH
序列号86：IINPRGGGTDFAQKFQG
序列号87：GDCTNGVCYSGGLDV
序列号88：SGSSSNIGNNYVS
序列号89：DNDKRPS
序列号90：GTWDNSLSGV
序列号91：DYAMH
序列号92：GISWNSGSIGYADSVKG
序列号93：DVDLWFGEYYFDY
序列号94：SGSSSNIGNNYVS
序列号95：DNNKRPS
序列号96：GTWDSSLSAPYV
序列号97：DYAMY
序列号98：GINWNSAIIGYADSVKG
序列号99：EALYYSAFFDS
序列号100：SGSSSNIGNNYVS
序列号101：DNNKRPS
序列号102：GTWDSSLSAWV
序列号103：DYAMH
序列号104：GINWNGGSTDYADSVEG
序列号105：DYADLGSGSDY
序列号106：SGSRSNIGSNYVH
序列号107：RNDQRPS
序列号108：ASWDDKMSGRL
序列号109：SYEMN
序列号110：YISSSGSTIYYADSVKG
序列号111：HSNYDILTGYSTDAFDI
序列号112：TGTSSDIGFYDSVS
序列号113：DVSNRPS
序列号114：TSNTKTNTLYV
序列号115：RGNYWWT
序列号116：SVHYSGSTNYNPSLKS
序列号117：DSDYGDYYFDY
序列号118：QGDSLRSYYAS
序列号119：GKNNRPS
序列号120：NSRDSSGNHVV
实施例3：抗TfR噬菌体抗体的TfR反应性确认
（1）免疫沉降
为了确认上述20种噬菌体抗体识别人TfR，进行了免疫沉降和蛋白质印迹法。使20种噬菌体感染大肠杆菌，通过对培养上清液的回收、精制，获得了精制scFv抗体。在玻璃滤器中，相对于CNBr-activatedsepharose4B1mL固定抗体5mg，制作了抗体珠子。接着，回收在10cm3培养皿中培养的SKOV-3细胞，制备了细胞裂解液600μL。将60μL的生物素放入细胞裂解液600μL中，将抗原生物素化。将制作的抗体珠子溶液150μL和生物素化的细胞裂解液放入2mL的管中，在4℃搅拌6小时。对管进行离心（5500g，1分钟，4℃），除去上清液，放入清洗用缓冲液（0.5mMBiotin、0.1%Tween20/PBS）800μL，通过离心对珠子进行清洗。反复进行3次珠子的清洗，之后，加入30μL的洗脱用柠檬酸液（50mM柠檬酸pH2.5），搅拌之后进行离心（5500g，1分钟，4℃），回收上清液，由此洗脱得到了免疫复合体。反复进行3次洗脱操作，回收上清液。通过添加3MTris进行中和，用SDS-PAGE进行电泳。以SDS-PAGE进行电泳，用银染色确认条带。对该样品同时使用链霉亲和素-HRP（Anti-Streptavidin，IgGFraction，ConjugatedtoperoxidaseCORTEXbiochem公司）进行蛋白质印迹法。其结果，如图1所示，确认各个抗体（TfR001、TfR003、TfR005）与分子量约90KD的蛋白质结合（TfR分子量约90KD）。
（2）质量分析
接着，对由免疫沉降法得到的抗原蛋白质进行质量分析。
将对应于检测出的膜蛋白的部分在凝胶内进行胰蛋白酶消化，回收肽。通过常规方法进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，切出考马斯亮兰染色得到的条带。将其浸入200mM碳酸氢铵-50%丙烯腈溶液中，在37℃下振荡45分钟后，废弃溶液，反复进行两次相同的操作，除去考马斯亮兰。将该凝胶减压干燥，每单位面积（mm2）凝胶片加入4μL的溶解在40mM碳酸氢铵（pH8.1）-10%丙烯腈中的胰蛋白酶（20μg/mL），在室温下放置1小时充分浸润。加入先前加入量的2.5倍量的胰蛋白酶容易，在37℃下静置18小时。将其用带有孔隙大小为0.22μm的滤器的管过滤，回收了通过胰蛋白酶切断抗原所产生的肽。
将由凝胶内胰蛋白酶消化得到的试样放入电喷雾电离化方式离子阱四极型质量分析装置连接的HPLC。从HPLC的反向色谱柱，通过含有0.1%TFA的0%到80%的丙烯腈的直线浓度梯度变化，用电喷雾法将以疏水性的不同依次洗脱的各肽离子化，确定了各肽的质量和内部氨基酸序列。将所得到的氨基酸内部序列的排列使用公开的TfR氨基酸序列数据库进行检索。其结果，确认了噬菌体抗体与TfR结合。
实施例4：噬菌体抗体（scFv）的IgG化
（1）表达TfR006IgG抗体的质粒的制作
以TfR006的IgG化为例，对噬菌体抗体的IgG化进行如下说明。其他的抗体使用同样的方法进行IgG化。
TfR006的噬菌体抗体（scFv）的基因以VH-VL的顺序排列，形成VH和VL通过接头（序列号121）连接的scFv的结构。
VH由V、D、J这3个基因构成，VL由V、J这2个基因构成。人的轻链λ的情况下，Jλ（λJunction）基因和Cλ（λconstant）基因并列排列5套，J4-CL4和J5-CL5为假基因（图2）。
推定在TfR006的VH、VL中使用的人生殖系列的基因用IMGT（*）检索的结果示于表2。
（*）IMGT：http://www.imgt.org
[表2]
参考IMGT的检索结果，进行噬菌体抗体的IgG化。TfR006的VH与人G1的恒定区（序列号122）、TfR006的VL与IGLJ3基因并列的IGLC3（序列号123）连接的基因在Genscript公司合成。在进行全长人工合成时，进行密码子使用频度的最适化（按照kim等，Codonoptimizationforhigh-levelexpressionofhumanerythropoietininmammaliancells，Cene，VoL199，1997p293-301方法）、将用于有效翻译的DNA序列（Kozak，AtleastsixnucleotidesprecedingtheAUGinitiatorcodonenhancetranslationinmammaliancells，JMolBiolVol196，p947-950，1987）、以及人抗体重链三种系（subgroup3）的信号肽的共有序列（序列号124）作为分泌用的信号附加在重链和轻链基因的5’侧。此外，为了重组入表达载体中，合成的重链、轻链基因的两端5’侧添加NheI、3’侧添加EcoRI。
抗体基因的表达载体使用pCAGGS（Niwa等，Efficientselectionforhigh-expressiontransfectantswithanoveleukaryoticvector，Gene，Vol108，p193-200），在该载体的HindIII部位插入了基因扩增用的小鼠DHFR基因表达区域。
（2）TfR006IgG抗体的瞬时表达
TfR006IgG抗体的瞬时表达使用Freestyle（LifeTechnologies）。作为基因导入用悬浮细胞的293-F（LifeTechnologies）在前一天进行传代。转染当日，准备调整为1×106细胞/mL的细胞浓度的400mL的细胞悬浮液。制备了100μg的TfR006重链表达载体和100μg的TfR006轻链表达载体合计200μg的质粒悬浮在OptiProSFM中的溶液（I）。接着，将200μL的MAXreagent加入8mL的OptiPROSFM（溶液II）。混合溶液（I）和溶液（II），在室温下静置10分钟到20分钟。将该合计16mL的反应液加入悬浮有293-F细胞的400mL的293表达培养基中，在6天到7天间，在37℃、8%CO2中用细胞培养震荡机TAITECBioshakerBR-43FL中培养。6天到7天后，回收含有TFR006重组抗体的培养上清液，将其精制为材料。
（3）TfR006IgG抗体的稳定性生产株的建立
使用CHOdhfr（-）细胞（G.Urlaub等，IsolationofChinesehamstercellmutantsdeficientindihydrofolatereductaseactivity，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77,p4216-4220,1980），利用两种质粒（在氨苄西林抗性基因内的Pvul处切断质粒，从环状质粒变成线状质粒），即，用于表达TFR006L链的pCAGGS-IGL-CMV-dhfr-A载体和用于表达TFR006H链的pCAGGS-IGH-CMV-dhfr-A载体同时进行转化。电穿孔使用Lonza公司制造的Amaxa。将DNA（L链、H链各质粒0.002mg/试样）加入3×103细胞的0.1mL的Amaxa电穿孔CHO用缓冲液中，施加电脉冲。
将电穿孔处理过的细胞加入含有10%透析过的FBS、不包含HT（H:次黄嘌呤、T：胸腺嘧啶）的Iscove’sModifiedDulbecco培养基（IMDM）中。从基因导入到3日后，更换为不含10%透析FBS、2mML-谷氨酰胺、HT的IMDM培养基，以1mg/mL的G418进行neo+转化细胞的选择，得到TfR006IgG抗体产生阳性细胞株集落。接着，使用以G418选择得到的集落进行基因扩增。在0.25mM、1mM的两轮（2round）的甲氨蝶呤（MTX）中的扩增之后，建立了每1升产生约50mg的TfR006IgG抗体的细胞株。
（4）TfR006IgG抗体的精制
瞬时表达的培养上清液、或者稳定表达株的培养上清液中包含的TfR6IgG抗体蛋白质以使用AKTAprime的Ab-CapcherExTra（protenova）亲和柱进行精制。得到的波峰部分，作为溶剂使用Dulbecco的PBS平衡化的葡聚糖S-300柱进行凝胶过滤，再精制。精制得到的TfR006IgG抗体的吸光系数在EXPASY的ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）使用TfR006的总氨基酸序列计算，求出ε=1.607。
（5）由酶免疫测定法（ELISA）进行TfR006IgG抗体的定量
TfR006IgG抗体生产细胞的培养基上清液中包含的抗体、精制得到的抗体的浓度通过吸光度进行定量，并且还通过酶免疫测定法（ELISA）进行了定量。作为固相抗体，在板中加入山羊抗人IgG（H+L）（完成对小鼠、兔子、牛、小鼠IgG的吸收）（Cosmobio：AmericanQualexInternational，Inc.：AQI，Cat.No.A-110UD）100μL/well（5μg/mL的浓度），在4℃下静置一晚。接着，以200μL/well加入封闭剂，在室温下进行1小时封闭，之后，阶段稀释试样的抗体，加入各孔中孵育1小时，使其反应。以PBST（0.05%Tween20、PBS）清洗5次后，以100μL/well的比例加入用PBST进行10000倍稀释的山羊抗人IgG（H+L）（完成对小鼠、兔子、牛、小鼠IgG的吸收）-HRP（Cosmobio：AQI,Cat.A-110PD）而得到的检测抗体溶液。进行1小时孵育后，用PBST进行5次清洗，以100μL/well的比例加入底物缓冲液TMB。在室温暗室内，进行15分钟孵育，之后以100μL/well的比例加入反应停止液，停止反应，测定450nm的吸光度。使用精制人IgG作为标准品，制作标准曲线，使用该标准曲线计算出人抗体的浓度。
实施例5：IgG化TfR抗体的反应性
使用2株TfR表达细胞，即K562（ATCCCCL-243:CML）、MIAPaCa（ATCCCRL-1420：胰腺癌），研究IgG化的抗TfR抗体的反应性。通过离心回收K562细胞。MIAPaCa-2用2mMEDTA/PBS剥离，通过离心回收。回收的细胞分别用PBS清洗1次，之后，使用FACSBuffer（加入1%BSA、2mMEDTA、0.1%NaN3的PBS）悬浮细胞，使其为1×106mL。将该细胞悬浮液100μL分注入96-wellV底培养皿（Costar3897）中，再通过FACSBuffer将TfR001IgG抗体、TfR005IgG抗体、TfR006IgG抗体调制为1～0.01μg/mL，在细胞中分别添加抗体溶液100μL，在4℃孵育1小时。细胞通过FACSBuffer清洗2次，之后，添加用FACSBuffer稀释到750倍的Alexa-anti-humanIgG（Invitrogen）溶液100μL，搅拌之后，在4℃孵育1小时。用FACSBuffer离心清洗2次，装入FACSCalibur（BD）的HTS，测定各孔的FL1荧光强度。如图3所示，各抗体（a：500ng/mL；b：50ng/mL；c：5ng/mL）与K562和MIAPaCa-2显示很强的反应性。Anti-humanIgG（1μg/mL）和anti-humanTfR（1μg/mLMBLD259-3）分别作为阴性对照（negativecontrol）、阳性对照（positivecontrol）使用。
实施例6：IgG化的TfR抗体的invitro增殖抑制效果
用培养液将TfR表达细胞13株，即Ramos（ATCCCRL-1596）、K-562（ATCCCCL-243）、NCI-H358（ATCCCRL-5807）、A549（ATCCCCL-185）、MIAPaCa-2（ATCCCRL-1420）、PK-45P（东北大学加龄医学研究所TKG0493）、KLM-1（RCB）、A431（ATCCCRL-1555）、DU145（ATCCHTB-81）、HT-29（ATCCHTB-38）、BFTC905（DSMZACC361）、MKN45（JCRBJCRB0254）MT-2调制为2500～10000/mL密度，以100μL/well分注入96孔平底板（NUNC167008）中。在37℃、5%CO2、95%空气中培养24小时，之后，制作20μg/mL～1.52ng/mL的TfR006抗体稀释系列，将其100μL添加到培养中的板中，在37℃、5%CO2、95%空气中再培养96小时。培养结束后，将板以1200rpm进行3分钟离心，静止取出上清液，之后，添加100μLPBS。再次离心，将PBS分取到96孔V底板（Costar3897）中之后，添加0.25%TrypsinEDTA50μL，剥离细胞。用移液管搅拌后将细胞总量移入放入有PBS的V底板中，再用培养液50μL清洗孔，将其总量移入V底板中。将该V底板装入FACSCalibur（BD）的HTS中，搅拌后，各well吸引40μL，对其总量进行细胞数的测定。得到的细胞数×5为每1孔的细胞数。各浓度的抗体添加得到增殖率用下述的计算式计算。使用MasterPlex2010软件（日立solutions）求出表示增殖率50%的抗体浓度（IC50）。其结果，各抗体显示出很强的细胞增殖抑制效果。各个的IC50示于表3。
增殖率＝细胞数（抗体添加）/细胞数（没有抗体）×100%
[表3]
实施例7：移植瘤模型中的抗肿瘤效果
由下述移植了各个TfR阳性表达癌细胞株的移植瘤模型确认人抗TfR抗体的抗肿瘤效果。
[表4]
细胞株 癌种类 培养液
PK-45P 胰腺癌 RPMI1640+10%FBS
HT-29 大肠癌 McCoy’s 5A+10%FBS
K562 白血病 RPMI1640+10%FBS
MIAPaCa-2 胰腺癌 DMEM+10%FBS
DU145 前列腺癌 MEM+10%FBS
RAMOS 淋巴瘤 RPMI1640+10%FBS25 -->
BFTC905 膀胱癌 DMEM+10%FBS
以上细胞由上述表4所示的各个培养液培养，移植时各细胞在RPMI1640中悬浮，SCID小鼠（雌性，7周龄，日本clair）的右腹侧部皮下以100μL/只移植上述各癌细胞悬浮液，成为5×106个/小鼠。移植后，用游标卡尺测定肿瘤直径，通过下式计算体积。肿瘤平均体积达到150mm3以上时，通过分组软件（EXSASversion7.6CAC）进行分类，一种癌细胞荷瘤的小鼠分为两组（n=5）。抗体给药组将PBS稀释的TfR006抗体以尾静脉给药，使得每一只小鼠为15mg/kg。阴性对照组以0.2mL/20g小鼠将PBS通过尾静脉投与。给药每周两次（每3日或4日），合计进行6次。给药后一周两次通过游标卡尺测定肿瘤直径，求出各组的肿瘤体积。抗肿瘤效果的判定通过肿瘤体积测定。
肿瘤体积通过下式计算：
肿瘤体积＝（短径）2×长径×0.5
各组的肿瘤体积的平均值的经时变化如图4所示。在任意的癌细胞株移植瘤模型中，确认了抗体给药组的肿瘤增殖抑制。从该结果可以看出TfR006抗体对各种癌细胞具有很强的增殖抑制效果。
实施例8：ATL模型中的抗TfR抗体的抗肿瘤效果
ATL细胞株MT-2细胞在添加有10%FBS的RPMI1640培养液中培养。移植时通过离心回收细胞，细胞在RPMI1640中悬浮，成为1×108/mL。混合与该细胞悬浮液同量的Matrigel（BectonDickinson），移植到NOG/Jic小鼠（雌性，7周龄，动物实验中央研究所）的右腹侧部皮下。移植后，一周两次通过游标卡尺测定肿瘤直径，在肿瘤平均体积到达150mm3前后的时间点，通过对肿瘤体积随机划分进行分组，每一组5只小鼠，分为4组。对3组分别以15mg/kg组、5mg/kg组、1.5mg/kg组由尾静脉将TfR006抗体给药，剩下的一组作为阴性对照组，以0.2mL/20g小鼠由尾静脉投与PBS。给药每周2次（每3日或者4日），合计进行6次。给药后，与分组前相同，每周2次用游标卡尺测定肿瘤直径，求出各组的肿瘤体积。抗肿瘤效果的判定通过最终测定日的肿瘤体积，以PBS组为对照组的参变量Dunnet多重比较测定进行判定。
肿瘤体积通过下式计算
肿瘤体积＝（短径）2×长径×0.5
此外，随机分组和多重比较测定通过生物实验数据统计分析软件EXSUS（株式会社CAC）进行。
各组的肿瘤体积的平均值的经时变化如图5所示。如图5所示，肿瘤的增殖通过TfR006抗体得到剂量依赖性的控制。
实施例9：使用临床检体的免疫染色
（1）切片制作
将摘出的肺癌组织切成5mm×5mm×10mm的大小，放入在4℃的4%PFA/0.01%戊二醛/0.1M二甲砷酸缓冲液中（PFA为和光纯药，戊二醛为关东化学，二甲砷酸钠为SIGMA），使用电炉（SHARP）用微网固定后，通过相同的固定液在4℃再固定1小时。移动到10%sucrose/PBS中，在4℃下浸渍4小时，然后，取代为15%sucrose/PBS，在4℃下浸渍4小时，之后，取代为20%sucrose/PBS，在4℃下浸渍1晚，通过OTCcompound包埋，在干冰-己烷中急速冻结。将其在恒冷箱（Reichert-Jung2800FRIGCUTE）中切为4μm的厚度，贴付在硅烷涂覆载玻片上，通过冷风干燥机吹干30分钟。
（2）染色
贴付切片的载片在PBS中每隔5分钟浸渍3次，进行亲水化。接着，滴下50μL的0.3%H2O2/0.1%NaN3，在室温下反应10分钟，进行内源性过氧化酶的封闭。其后，用PBS每隔5分钟清洗3次，放入2%BSA2/PBS，在室温下进行10分钟非特异性反应的封闭。滴下余下的液体，滴下噬菌体抗体TfR006（50μL），在室温下反应1小时。用PBS清洗3次后，滴下5μg/mL的抗cp3兔抗体50μL，在室温下进行45分钟的二次抗体反应。用PBS清洗3次，滴下50μL的过氧化酶标记葡聚糖结合抗兔免疫球蛋白-山羊多克隆抗体（DAKO），在室温下进行30分钟三次抗体反应。用PBS清洗3次，之后滴下50μL的DAB·H2O2显色液，显色为褐色后，移动到装满蒸馏水的短管中使反应停止。然后进行10分钟水洗，之后，用苏木精核染后，进行脱水、透明，用Marinol封片，在显微镜下观察。如图6所示，本抗体与肺癌的癌细胞反应，与非癌细胞不反应。

Claims (14)

1.一种与人TfR进行特异性反应的抗体，其特征在于：
其为具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中，重链可变区具有包含序列号31的重链第一互补决定区(VHCDR1)、序列号32的重链第二互补决定区(VHCDR2)、序列号33的重链第三互补决定区(VHCDR3)的CDR，轻链可变区具有包含序列号34的轻链第一互补决定区(VLCDR1)、序列号35的轻链第二互补决定区(VLCDR2)、序列号36的轻链第三互补决定区(VLCDR3)的CDR。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于：
抗体为人抗体或者人化抗体。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其特征在于：
抗体为选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(Diabody)、二硫化物稳定化V区(dsFv)和包含CDR的肽的抗体片段。
4.编码权利要求1～3中任一项所述的抗体的DNA。
5.含有权利要求4所述的DNA的重组载体。
6.将权利要求5所述的重组载体导入宿主细胞得到的转化株。
7.具有权利要求1～3中任一项所述的抗体的医药组合物。
8.如权利要求7所述的医药组合物，其特征在于：
在抗体上结合有细胞损伤性物质。
9.如权利要求8所述的医药组合物，其特征在于：
细胞损伤性物质为药剂、毒素或者放射性物质。
10.如权利要求7～9中任一项所述的医药组合物，其特征在于：
所述医药组合物作为抗癌剂使用。
11.如权利要求10所述的医药组合物，其特征在于：
癌为实体癌或者血液癌。
12.如权利要求10所述的医药组合物，其特征在于：
实体癌为肺癌、大肠癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、皮肤癌。
13.如权利要求10所述的医药组合物，其特征在于：
血液癌为白血病、淋巴瘤、骨髓瘤。
14.如权利要求10所述的医药组合物，其特征在于：
血液癌为成人T细胞白血病(ATL)。
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