CN108530537B

CN108530537B - Pd-1/pd-l1信号通路抑制剂

Info

Publication number: CN108530537B
Application number: CN201810273627.2A
Authority: CN
Inventors: 罗龙龙; 陈国江; 冯健男; 乔春霞; 李新颖; 肖鹤; 吕忠霖; 沈倍奋
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2018-03-29
Publication date: 2019-07-02
Anticipated expiration: 2038-03-29
Also published as: CN108530537A

Abstract

本发明公开了一种PD‑1/PD‑L1信号通路抑制剂，所述抑制剂是针对PD‑1的单克隆抗体，其中重链的可变结构域包含SEQ ID NO:1中给出的CDR‑H1的序列、SEQ ID NO:2中给出的CDR‑H2的序列和SEQ ID NO:3中给出的CDR‑H3的序列，并且轻链的可变结构域包含SEQ ID NO:4中给出的CDR‑L1的序列、SEQ ID NO:5中给出的CDR‑L2的序列和SEQ ID NO:6中给出的CDR‑L3的序列。本发明还扩展至该抑制剂的治疗性用途、组合物和用于检测PD‑1的方法。

Description

PD-1/PD-L1信号通路抑制剂

技术领域

本发明属于分子免疫学领域，涉及一种PD-1/PD-L1信号通路抑制剂，具体涉及一种针对PD-1的单克隆抗体。

背景技术

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。抗体库技术克服体内了免疫耐受和表位优势的限制，是体外获得单克隆抗体的主要技术之一。抗体库技术受库容等因素制约，一般很难直接从抗体库中筛选到高亲和力的抗体；在筛选获得候选抗体后需要进一步进行抗体亲和力体外成熟，抗体库的展示载体有多种，与常用的噬菌体相比，借助哺乳动物细胞展示抗体有诸多优势，如密码子偏好、完整的翻译后修饰、合理的蛋白质折叠以及高水平的表达量等。然后，受限于转染效率等因素，哺乳动物细胞展示抗体库的库容一般较小，不易直接从哺乳动物细胞展示的天然库中筛选高亲和力抗体。

程序性死亡受体-1C Program Death-1,PD-1)是T细胞表面上的一种抑制性共受体，与其配体(Program Death Ligand-1/2,PD-L1/2)结合，能够抑制T细胞的活性。PD-1/PD-L1信号通路在维持和调节自身免疫耐受中发挥着重要的作用。在正常的生理状态下T细胞低表达PD-1，抗原递呈细胞表达PD-L1，当T细胞被激活后T细胞表面PD-1表达上调，并与递呈细胞表达的PD-L1相互作用，激活PD-1/PD-L1负反馈信号，从而抑制T细胞的过度激活，避免机体受自身免疫系统的攻击。研究发现，PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤的免疫逃逸中也发挥着重要的作用；多种肿瘤细胞表面高表达PD-L1，能够与T细胞上的PD-1相互作用，抑制T细胞对其攻击，从而形成了肿瘤细胞的免疫逃逸；阻断PD-1/PD-L1信号通路，能够恢复T细胞对肿瘤的免疫杀伤作用。因此PD-1，PD-L1己成为治疗肿瘤的新靶点，目前国外已上市的抗PD-1抗体药物是百时美施宝贵的Nivolumab、默沙东的Keytruda。但是由于进口大分子药物对于病人来说需要花费高昂的费用，因此，研发新的抗PD-L1单克隆抗体，减少病人负担，降低治疗费用是一个亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种PD-1/PD-L1信号通路抑制剂，所述PD-1/PD-L1信号通路抑制剂是PD-1特异性抗体。在本发明的具体实施方案中，所述PD-1/PD-L1信号通路抑制剂是PD-1特异性单克隆抗体。所述PD-1/PD-L1信号通路抑制剂能够逆转PD-1参与的免疫抑制状态，治疗免疫障碍。基于此，本发明还公开了一种用于免疫障碍的治疗方法。

本发明的PD-1/PD-L1信号通路抑制剂包括：

(1)SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2、SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；和/或

(2)SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2、SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。

作为本发明的一个方面，本发明的CFH抑制剂包括：

(1)重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；和/或

(2)轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

为了方便解释以下抑制剂的功能变体，将上面所述的PD-1/PD-L1信号通路抑制剂称之为亲代抑制剂。

本发明的PD-1/PD-L1信号通路抑制剂可以是完整的免疫球蛋白分子，免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)类(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。

本发明的PD-1/PD-L1信号通路抑制剂还可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab片段，Fab'片段，Fab'-SH片段，F(ab')²片段，Fd片段，Fv片段，双抗体，单链Fv(scFv)仅含有一个轻链可变区的单链多肽，含有轻链可变区的三个CDR的单链多肽，仅含有一个重链可变区的单链多肽，含有一个重链可变区的三个CDR的单链多肽，重链可变区和VHH。

本发明的PD-1/PD-L1信号通路抑制剂还包括前面所述的PD-1/PD-L1信号通路抑制剂的功能变体，所述的功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代抑制剂中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代抑制剂的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述抑制剂的结合特性，即所述抑制剂仍能识别并结合其靶位。

所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然氨基酸。

保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半肤氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。

此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代抑制剂相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合PD-1。此后，当使用术语“抑制剂”时，其也涵盖所述抑制剂的功能变体。

所述功能变体还包含对高变区的修饰，高变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代抑制剂具有至少大约50％至大约99％、优选至少大约60％至大约99％、更优选至少大约70％至大约99％、甚至更优选至少大约80％至大约99％、最优选至少大约90％至大约99％、特别是至少大约95％至大约99％，以及特别是至少大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。

本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代抑制剂或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。

本发明提供了编码前面所述的PD-1/PD-L1信号通路抑制剂的核酸分子。所述的核酸分子可以包含在严格条件下与编码包含重链或轻链序列的抗体的核酸分子杂交的核苷酸序列。

本领域技术人员将意识到这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是这样的核酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的抑制剂(或其片段，或其衍生物)的核酸序列。然后可将该核酸序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的抑制剂的序列中。

本发明还提供了一种包括前面所述的核酸分子的重组载体，除了前面所述的核酸分子之外，重组载体还包括与所述核酸分子序列操作性相连的调控序列。

这些重组载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达核酸分子或者蛋白质。

所述载体包括克隆载体或者表达载体。克隆载体用于扩增核酸分子，表达载体用于表达核酸分子编码的蛋白质。

本发明还提供了一种含有前面所述的核酸分子或前面所述的载体的重组细胞。

重组细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞：真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO,COS,293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明提供了一种包括治疗有效量的前面所述的PD-1/PD-L1信号通路抑制剂的药物组合物。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。

可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。

可以和本发明的药物组合物联合应用的药物包括抗肿瘤药，所述的抗肿瘤药物包括目前经过FDA批准的所有抗肿瘤药。所述的抗肿瘤药包括经FDA批准的药物或未批准的药物。所述的抗肿瘤药包括已知靶向抗肿瘤药与未知靶向抗肿瘤药。所述的抗肿瘤药还包括任意的化疗药或化合物。

靶向抗肿瘤药包括(但不限于)17-AAG、2-deoxyglucose、阿比特龙(Abiraterone)、ABT-263、AC-220、AT-406、AZD4547、AZD5363、AZD7762、BI-2536、Birinapant、BMS-754807、硼替佐米(Bortezomib)、BX-795、卡博替尼(Cabozantinib)、CAL-101、卡非佐米(Carfilzomib)、克唑替尼(crizotinib)、danusertib、达沙替尼(Dasatinib)、Dovitinib、Elesclomol、Embelin、恩替诺特(Entinostat)(MS-275)、Enzastaurin、依维莫司(Everolimus)、Foretinib、氟维司群(Fulvestrant)、Ganetespib、GDC0941、GSK429286A、JQ1、KU-55933、KX2-391、Lenvatinib、Linifanib、Linsitinib、LY2157299、Masitinib、MK-1775、MK-2206、MLN-4924、Neratinib、NU7441、Nutlin-3、NVP-BEZ235、NVP-BKM120、Orantinib、PCI-32765、PD-0325901、PD-0332991、PD-173074、PH-797804、PRT062607、R-406、Refametinib、瑞戈非尼(Regorafenib)、SCH900776、sgi-1776、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、TAE684、替西莫司(Temsirolimus)、TG-101348、Tideglusib、Tipifarnib、Tivantinib、Toremifene、Tozasertib、曲美替尼(Trametinib)、维甲酸(Tretinoin)、Triptolide、伐地考昔(Valdecoxib)、维莫德吉(Vismodegib)、Volasertib、伏立诺他(Vorinostat)、YM-155、CHIR-99021、NVP-BGJ398、LY2090314。

所述的化疗药包括(但不限于)六甲蜜胺、氨鲁米特、阿那罗唑、阿扎胞苷、苯达莫司汀、白消安、卡巴他赛、卡培他滨、卡铂、顺铂、克拉曲滨、氯法拉宾、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、柔红霉素、地西他滨、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊甙、伊西美坦、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、依达比星、异环磷酰胺、伊立替康、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、洛莫司丁、6-巯基嘌呤、美司钠、甲胺喋呤、米托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、奈拉滨、培美曲塞、喷司他汀、普拉曲沙、甲苄肼、雷替曲噻、链脲霉素、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、长春花碱、长春瑞滨、唑来膦酸。

本发明还提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含本文所述至少一个抑制剂以及进一步包含至少一个标记物可检测的部分/物质。可检测的部分/物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。

为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记抑制剂的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、生物测定(例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。

除了通过直接或间接(例如通过接头)缀合而化学产生免疫缀合物之外，所述免疫缀合物可以作为融合蛋白而产生，所述融合蛋白包含本发明的抑制剂及合适的标记。融合蛋白可以通过本领域已知方法产生，例如通过构建核酸分子以及随后表达所述核酸分子而重组产生，所述核酸分子包含符合读框的编码抑制剂的核苷酸序列以及编码合适标记的核苷酸序列。

本发明还提供了一种测定样品中PD-1的检测产品，所述产品包括前面所述的PD-1/PD-L1信号通路抑制剂。

进一步，所述产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述抑制剂的能够检测出CFH的检测产品均包括在本发明的范围之内。

本发明的PD-1/PD-L1信号通路抑制剂，又可以叫做PD-1抗体，可以通过多种技术中的任一种制备。通常，抗体可以通过细胞培养技术产生，包括通过常规技术产生单克隆抗体，或通过将抗体基因，重链和/或轻链转染到合适的细菌或哺乳动物细胞宿主中，以允许抗体的产生，其中所述抗体可以是重组的。术语“转染”的各种形式意在包括通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的各种技术，例如电穿孔，磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是优选在真核细胞中表达抗体，并且最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为这种真核细胞(特别是哺乳动物细胞)更可能比原核细胞组装和分泌正确折叠和免疫活性的抗体。

用于表达重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞，本发明包括与DHFR选择标记一起使用的中国仓鼠卵巢(CHO细胞)，NS0骨髓瘤细胞，COS细胞，HEK 293T细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达的一段时间，或更优选地，将抗体分泌至培养宿主细胞的培养基。可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。

宿主细胞也可用于产生功能性抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。应当理解，上述程序的变化在本发明的范围内。例如，可能期望用编码本发明抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于除去一些或所有编码轻链和重链之一或两者的DNA，其不是结合感兴趣的抗原所必需的。从这种截短的DNA分子表达的分子也包括在本发明的抗体中。此外，可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体(即，结合人PD-1)，并且另一条重链和轻链对于除人PD-1之外的抗原是特异性的。

制备单克隆抗体的方法涉及永生细胞的制备，能够产生具有所需特异性的抗体的细胞系。这样的细胞系可以从获自免疫动物的脾细胞产生。可以用免疫动物生产前面所述的抑制剂或其片段和/或变体。

可以从生长的杂交瘤的上清液中分离单克隆抗体。此外，可以采用各种技术来提高产量，例如将杂交瘤细胞系注射到合适的脊椎动物宿主(例如小鼠)的腹膜腔中。然后可以从腹水液体或血液收获单克隆抗体。污染物可以通过常规技术例如色谱，凝胶过滤，沉淀和提取从抗体中除去。亲和层析是可用于纯化抗体的方法的实例。

本发明提供了一种阻断PD-1与PD-1配体结合的方法，所述方法包括施用前面所述的PD-1/PD-L1信号通路抑制剂，或者施用包括前面所述PD-1/PD-L1信号通路抑制剂的药物组合物，或者施用前面所述的包括编码所述PD-1/PD-L1信号通路抑制剂的核酸分子以及包括所述核酸分子的载体。

本发明提供了一种调节PD-1活性或水平的方法，所述方法包括施用前面所述的PD-1/PD-L1信号通路抑制剂，或者施用包括前面所述PD-1/PD-L1信号通路抑制剂的药物组合物，或者施用前面所述的包括编码所述PD-1/PD-L1信号通路抑制剂的核酸分子以及包括所述核酸分子的载体。

本发明提供了一种解除PD-1对机体免疫抑制的方法，所述方法包括施用前面所述的PD-1/PD-L1信号通路抑制剂，或者施用包括前面所述PD-1/PD-L1信号通路抑制剂的药物组合物，或者施用前面所述的包括编码所述PD-1/PD-L1信号通路抑制剂的核酸分子以及包括所述核酸分子的载体或者细胞。

本发明提供了一种促进T淋巴细胞中IFN-γ表达的方法，所述方法包括施用前面所述的PD-1/PD-L1信号通路抑制剂，或者施用包括前面所述PD-1/PD-L1信号通路抑制剂的药物组合物，或者施用前面所述的包括编码所述PD-1/PD-L1信号通路抑制剂的核酸分子以及包括所述核酸分子的载体。

本发明提供了一种治疗患有免疫障碍受试者的方法。所述方法包括向所述受试者施用所述PD-1/PD-L1信号通路抑制剂，或者施用包括所述PD-1/PD-L1信号通路抑制剂的药物组合物，或者施用包括编码所述PD-1/PD-L1信号通路抑制剂的核酸分子以及包括所述核酸分子的载体或者细胞。

本发明还提供了一种检测或测量样品中的PD-1的方法。该方法包括使样品与所述PD-1/PD-L1信号通路抑制剂接触。

本发明还提供了前面所述的抑制剂在制备测定PD-1产品中的应用。

所述产品包括前面所述的PD-1/PD-L1信号通路抑制剂；所述产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述的PD-1/PD-L1信号通路抑制剂能够检测出PD-1的产品均包括在本发明的范围之内。

本发明还提供了前面所述的PD-1/PD-L1信号通路抑制剂在制备治疗以下药物中的应用。

(1)阻断PD-1与PD-1配体结合的药物；

(2)调节PD-1活性或水平的的药物；

(3)解除PD-1对机体免疫抑制的药物；

(4)促进T淋巴细胞中IFN-γ表达的药物；

(5)治疗免疫障碍的药物。

本发明的免疫障碍的非限定性实例包括但不限于，类风湿性关节炎、多发性硬化、炎性肠病、克罗恩病、全身性红斑狼疮、I型糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、过度增生性免疫障碍、肿瘤和感染性疾病。

可以用于治疗的肿瘤种类没有特别限制，任何实体的、非实体的、恶性的或良性的肿瘤均包括在本发明的范围之内。肿瘤的实例包括但不限于：皮肤癌，白血病，肾上腺皮质癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑癌，乳腺癌，气管及支气管肿瘤，淋巴瘤，神经系统肿瘤，宫颈癌，肠癌，肛门癌，子宫内膜癌、食管癌，鼻咽癌，卵巢癌，肉瘤，眼癌，恶性纤维组织细胞癌，胆囊癌，胃癌，结直肠癌、胃肠道类癌瘤，胃肠道间质瘤，胚细胞瘤，头颈癌，肝癌，下咽癌，黑色素瘤，胰腺癌，肾癌，喉癌，唇癌，口腔癌，口咽癌，肺癌，间皮瘤，骨髓瘤，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜络细胞瘤，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，涎腺癌，皮肤癌，睾丸癌，喉癌，胸腺瘤，甲状腺癌，尿道癌，阴道癌，外阴癌。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。如有冲突，本文件(包括定义)将予以控制。优选的方法和材料如下所述，尽管与本文所述相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试。本文提及的所有出版物，专利申请，专利和其它参考文献通过引用以其全文并入本文。本文公开的材料，方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。

本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一的群体获得的抗体，除少数可能存在的天然发生的突变外，该群体中包含的单个抗体是相同的。修饰语“单克隆”仅表示抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不能解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本文所用的术语“施用”是指接触和/或递送PD-1/PD-L1抑制剂以获得期望的效果。PD-1/PD-L1抑制剂可以以多种方式施用于受试者，包括但不限于口服，眼部，鼻部，静脉内，局部，气溶胶，栓剂等，并且可以组合使用。

本文使用的术语“有效量”是指在所需时间内有效的药物剂量，以实现所需的剂量治疗结果。有效剂量可以由本领域技术人员确定，并且可以根据个体的疾病状态，年龄，性别和体重等因素而变化药物在个体中引起所需反应的能力。本文使用的该术语还指在动物，哺乳动物，哺乳动物，或人类，例如减少和/或抑制雌激素受体的功能。治疗有效量可以一次或多次施用(例如，药剂可作为预防性治疗或在疾病进展的任何阶段治疗性地，在症状之前或之后等)，应用或剂量给予，并且不是预期的限于特定的制剂，组合或施用途径。给药次数和剂量取决于几个因素，例如治疗的目标，受试者等，并且可以由本领域技术人员容易地确定。

本发明的“样品”可以是血液，组织，尿液，血清，血浆，羊水，脑脊液，胎盘细胞或组织，内皮细胞，白细胞或单核细胞的样品。样品可以直接从患者获得或可以预处理，例如通过过滤，蒸馏，提取，浓缩，离心，干扰组分的灭活，添加试剂等，以修饰样品。

可以使用任何细胞类型，组织或体液来获得样品。这样的细胞类型，组织和流体可以包括组织切片，例如活组织检查和尸检样本，为组织学目的取得的冷冻切片，血液(例如全血)，血浆，血清，痰，粪便，眼泪，粘液，唾液，支气管肺泡灌洗液BAL)流体，毛发，皮肤，红细胞，血小板，间质液，眼晶状体液，脑脊髓液，汗液，鼻液，滑液，月经，羊水，精液等。细胞类型和组织也可包括淋巴流体，胃肠液，妇科液，尿，腹膜液，脑脊液，通过阴道冲洗收集的液体或通过阴道冲洗收集的液体。组织或细胞类型可以通过从动物中除去细胞样品来提供，但也可以通过使用先前分离的细胞(例如，由另一个人分离，在另一时间和/或为了另一个目的)来实现。也可以使用存档组织，例如具有治疗或结果历史的那些。蛋白质或核苷酸分离和/或纯化可能不是必需的。

本文所用的“受试者”和“患者”可互换地指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如牛，猪，骆驼，骆驼，马，山羊，兔，绵羊，仓鼠，豚鼠，猫，狗，大鼠和小鼠，非人灵长类动物，猴，例如食蟹猴或恒河猴，黑猩猩等)和人)。在一些实施方案中，受试者可以是人或非人。受试者或患者可以经历其他形式的治疗。

本文所用的“治疗”描述逆转，减轻或抑制该术语适用的疾病或该疾病的一种或多种症状的进展。根据受试者的状况，该术语还指预防疾病，并且包括预防疾病的发作或预防与疾病相关的症状。治疗可以以急性或慢性方式进行。该术语还指在患有疾病之前降低与该疾病相关的疾病或症状的严重性。在疾病之前这种疾病的预防或减轻的严重程度是指将本发明的抗体或药物组合物施用给不是在施用疾病的施用时间的受试者。

附图说明

图1显示pcDNA^TM5/FRT的物理图谱；

图2显示利用琼脂糖电泳检测PCR产物和酶切产物的电泳图，其中：A：Kappa-BGHpoly A片段PCR产物，泳道1代表DL2000，泳道2代表PCR产物，B：Kappa-BGH poly A片段XbaI，BamHI酶切，泳道1代表DL2000，泳道2代表酶切片段，C：PCMV/T7片段PCR产物，泳道1代表DL2000，泳道2代表PCR产物，D：PCMV/T7片段BamHI，NotI酶切，泳道1代表DL2000，泳道2代表酶切片段，E：重链恒定区片段PCR产物，泳道1代表DL2000，泳道2代表PCR产物，F：重链恒定区片段NotI，PmeI酶切，泳道1代表DL2000，泳道2代表酶切产物。

图3显示利用显示利用琼脂糖电泳检测构建载体的酶切产物电泳图，其中泳道1代表DL2000，泳道2代表EcoRI酶切片段，泳道3代表HindIII酶切片段，泳道4代表Bsiwl酶切片段，泳道5代表ClaI酶切片段，泳道6代表NheI酶切片段，泳道7代表XbaI酶切片段，泳道8代表BamHI+NotI酶切片段，泳道9代表NotI+PmeI酶切片段；

图4显示PRT/KIgGl载体的结构示意图；

图5显示利用双夹心ELISA检测抗体表达量的统计图；

图6显示利用间接ELISA检测抗体结合能力的曲线图；

图7显示利用间接ELISA检测抗体结合特异性的统计图；

图8显示利用Biacore检测抗体亲和能力的曲线图；

图9显示利用ELISA检测抗体竞争结合抗原的结合曲线图；

图10显示利用ELISA检测抗体对T细胞IFN-γ表达的影响的统计图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1抗PD-1抗体制备

1、PRT/KIgG1全长抗体表达载体构建

构建全长抗体表达载体需要在pcDNA^TM5/FRT载体骨架(图1)的基础上依次引入轻链可变区克隆位点、CK基因、BGH polyA、PCMV/T7启动子基因序列、抗体重链可变区克隆位点、抗体重链恒定区基因等。

采用overlap PCR、定点克隆等分子生物学手段构建全长抗体表达载体，所用引物如下：

Kappa-BGH poly A基因序列引物

P-Kappa-TY：

5’-CCTCTAGAGAATTCAAGCTTTAGCGTACGGTGGCTGCACCATC-3’

Kappa-BGH3：

5’-GTCGAGGCTGATCAGCGGCTAACACTCTCCCCTGTTG-3’

Kappa-BGH5：

5’-CAACAGGGGAGAGTGTTAGCCGCTGATCAGCCTCGAC-3’

Kappa3：

5’-CCGGATCCACATTCCACAGGGGCCATCC-3’

PCMV/T7基因序列引物

Pcmv/t7-up:5’-GGGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAA-3’

Pcmv/t7-down:5’-GCGGCCGCTTGGGTCTCCCTATAGTGAG-3’

Heavy链恒定区基因引物：

P-Ig G1H-TY：

5’-ATCGGCGGCCGCGAATTCATCGATTAGGCTAGCACCAAGGGCCCATC-3’

Heavy-3：

5’-GTTTAAACTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTA-3’。

借助overlap PCR将轻链可变区克隆位点(酶A、酶B)、Kappa链恒定区、BGH Poly A序列进行拼接，获得大小为650bp目标片段，并构建T载体，酶切测序正确(图2A，B)，通过XbaI，BamHI酶切位点克隆入pcDNA^TM5/FRT载体。在此基础上，通过BamHI，NotI酶切位点，将测序正确的PCMV/T7启动子基因序列(图2C，D)克隆入载体中。

PCR拼接重链可变区克隆位点(酶C，酶D)，IgGl重链恒定区基因序列(CH1，CH2，CH3获得大小约1000bp的目标片段，克隆T载体，测序正确(图2E，F)，并通过NotI，PmeI酶切位点定向克隆入前述载体中。

根据载体构建过程，以及载体自身的酶切位点特征，选择EcoRI，HinIII，BsiwI，C1aI，NheI，Xbai对目标载体进行酶切鉴定(图3)。理论上，该载体中一共含有3个EcoRI酶切位点，EcoRI单酶切将载体切成三条线性片段，结果与预期相符；HinIII，BsiwI，C1aI，NheI，Xbai均为载体中单一酶切位点，将载体切成单一的线性片段，结果与预期相符。进一步分别用酶BamHI+NotI以及NotI+PmeI进行酶切(图3泳道8,9)，分别获得载体大片段与PCMV/T7(约650bp)以及Heavy表达盒(约1000bp)小片段，与预期一致。

上述结果表明，目标载体构建成功，命名为PRT/KIgGl，其结构示意图见图4。理论而言，该载体适用于各种全长抗体的表达。

2、抗PD-1抗体表达量测定

(1)利用基因合成的方法合成抗体重链可变区序列(序列如SEQ ID NO.7所示)、轻链可变区序列(序列如SEQ ID NO.8所示)，并将其利用分子克隆的方法将片段克隆入PRT/KIgGl中。

(2)瞬时转染

将处于对数生长期的293T细胞以5*10⁵个/孔密度接种于6孔板中，12h后弃换新鲜培养基。4μg抗体表达质粒加入250μL MEM培养基中，充分混匀后往里加8μLLipofectamine^TM 2000脂质体，混匀室温放置20min，将混合物加入对应的6孔板中，培养48h后收获上清，同时以PRT/KIgGl-MIL75载体(MIL75的重链可变区序列为：QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS；轻链可变区序列为：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK)作为对照。

(3)双夹心ELISA测定瞬时表达上清中抗体表达量

用包被液稀释GAH-IgG抗体至2μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭lh。1xPBS稀释Herceptin至0.5μg/mL，在此基础上进行2倍稀释获得8个浓度梯度，同时用1xPBS稀释瞬时表达上清至625倍、3125倍、15625倍。将Herceptin与瞬时表达上清按照100μL/每孔加入酶联板中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入羊抗人酶标二抗室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。以标准品浓度LN值为横坐标，相应的OD值为纵坐标，绘制一条标准曲线并添加线性回归曲线及其相关系数R²(R²>0.95)，并用y＝kx+b直线方程计算样品中抗体浓度。

(4)结果

结果如图5所示，利用上述方法能够表达出抗PD-1抗体。

实施例2抗PD-1抗体结合能力测定

1、抗体大量表达与纯化鉴定

将抗体表达质粒按照以上的转染方法大量转染293T细胞并利用Protein A纯化获得抗体的纯化样品。

2、间接ELISA检测抗体抗原结合能力

2.1步骤

包被液稀释PD-1/Fc抗原至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭1h。用1xPBS稀释抗体至3μg/mL，并以100μL每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入羊抗人(Fab')2-HRP二抗室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μLTMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。并以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制抗体-抗原结合曲线。利Graphpad分析软件拟合四参数方程曲线，方程为y＝(A-D)/(1+(X/C)^B)+D，其中B代表斜率，C代表EC50。

2.2结果

结果如图6所示，本发明制备的抗PD-1抗体结合活性与MIL75相近，能够特异性识别固相载体上的PD-1抗原分子，且随着抗体浓度的增加抗原一抗体之间结合具有良好的剂量依赖性。

3、抗体结合抗原特异性检测

3.1步骤

包被液稀释PD-1/Fc，CD28/Fc，CTLA4/Fc，BTLA/Fc，ICOS/Fc抗原至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，以平行孔作为复孔。置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒中37℃封闭1h。用1xPBS稀释抗体至1μg/mL，并以100μL每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入羊抗人(Fab')a-HRP二抗室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应5min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。并以抗体名称为横坐标，OD值为纵坐标绘制柱形图。

3.2结果

结果如图7所示，本发明制备的抗PD-1抗体只特异性识别PD-1分子，而与其他分子不存在交叉识别现象。

4、抗PD-1抗体亲和力测定

4.1步骤

利用Biacore测定抗体的亲和力。

将抗人Fab抗体偶联到CM5芯片上，将抗体样品稀释到1-2μg/ml并以30ml/min流速进样60-150秒。将PD-1/Fc融合蛋白进行梯度稀释至浓度为3.125，6.25，12.5，25，50，100nM并以30μL/min流速进样抗原结合120秒，解离1200S。实验结束后用10mM Glycine-HClpH2.1进行再生60秒。利用Biacore T200分析软件分析结果。

4.2结果

结果如表1所示，本发明制备的抗PD-1抗体与MIL75的亲和力相当，图8是抗体的亲和力动力学曲线(选择3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM五个浓度进行拟合)。

表1抗体亲和力测定结果

	Ka(1/Ms)	Kd(1/s)	KD(M)
				MIL75	5.594E+5	7.900E-5	1.412E-10
本发明制备抗体	7.202E+5	5.715E-4	7.936E-10

实施例3抗PD-1抗体阻断PD-1/PD-L1作用

1、ELISA检测PDL1/Fc-Biotin与PD-1结合活性

1.1步骤

包被液稀释PD-1/Fc抗原至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭1h。用1xPBS稀释PD-L1/Fc-Biotin至48μg/mL，进行3倍稀释共获得12个浓度点。以100μL每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入Peroxidase-Labeled Streptavidin(1:4000)室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。以PD-L1/Fc-Biotin浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制PD-1/PD-L1结合曲线，选取PD-L1结合PD-1最低饱和浓度进行抗体阻断实验。

1.2结果

摸索出PD-L1/Fc-Biotin参与结合固相抗原PD-1分子最低饱和浓度为5μg/mL。

2、抗体阻断PD-1/PD-L1相互作用

2.1步骤

包被液稀释PD-1/Fc抗原至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭lh。用1xPBS稀释PD-L1/Fc-Biotin至5μg/mL，以上述溶液作为稀释液稀释抗体至抗体浓度500μg/mL，并进行5倍稀释共获得12个浓度梯度。100μL每孔加入酶联板中湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入Peroxidase-Labeled Streptavidin(1:4000)室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制结合曲线。

2.2结果

结果如图9所示，结果表明本发明制备的抗体可以有效阻断PD-1/PD-L1相互作用。

实施例4抗PD-1抗体的体外活性检测

外周血单个核细胞活性实验

取1名健康志愿者全血10-15mL，利用人淋巴细胞分离液分离人PBMC细胞，生理盐水洗细胞2遍，10％FBS 1640培养基重悬细胞并计数，以1*10⁵/孔接种于96孔板中，每孔接种50μL。将梯度的CD3抗体以及CD28抗体以25μL/孔加入对应的培养孔中至二者的终浓度均为1μg/mL，0.8μg/mL，0.6μg/mL，0.4μg/mL，0.2μg/mL，0.1μg/mL。同时在培养体系中以25μL/孔加入梯度PD-L1/Fc融合蛋白至终浓度为0μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL。置于37℃细胞培养箱培养72h，收获上清并利用人IFN-γELISA检测试剂盒测定上清中IFN-γ的表达情况。

基于上述方法测定刺激PBMC活化的最适CD3，CD28浓度以及PD-L1抑制浓度。同样的方法分离人PBMC细胞并以同样的细胞密度接种于96孔板中。配置最适抗体刺激浓度以及PD-L1抑制浓度加入相应的孔中。10％FBS 1640培养基稀释抗体至终浓度为0μg/mL、2.5μg/mL、10μg/mL、40μg/mL加入对应的反应体系，37℃细胞培养箱培养72h，收获上清并利用人IFN-γELISA检测试剂盒测定上清中IFN-γ的表达情况。

结果：结果如图10所示，CD3/CD28抗体能够有效激活T细胞，PD-L1的加入则在一定程度抑制T细胞活性，本发明制备的抗体的加入能够有效逆转T细胞被抑制的状态，进而上调IFN-γ的表达，而且抗体的逆转效果具有剂量依赖性。利用未配对t检验对各抗体浓度点IFN-γ的表达量进行统计学分析，结果显示本发明制备的抗体与MIL75各浓度点IFN-γ的表达水平无统计学差异。表明本发明制备的抗体与阳性抗体MIL75具有一致的体外生物学活性。

虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> PD-1/PD-L1信号通路抑制剂

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Trp Tyr Asp Gly Ser Glu

1 5

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asp Ser Asp Tyr

1

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asn Ser Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Gln Asn Ser Asn Trp Pro Arg Thr

1 5

<210> 7

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asn Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Glu Leu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asp Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.一种分离的PD-1/PD-L1抑制剂，其特征在于，所述PD-1/PD-L1抑制剂包括：

（1）SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2、SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；和

（2）SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2、SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3；

所述PD-1/PD-L1抑制剂是完整的免疫球蛋白分子、或免疫球蛋白分子的抗原结合部分。

2.根据权利要求1所述的PD-1/PD-L1抑制剂，其特征在于，所述PD-1/PD-L1抑制剂包括：

（1）重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；和

（2）轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的PD-1/PD-L1抑制剂，其特征在于，所述抗原结合部分包括Fab片段，Fab'片段，Fab'-SH片段，F（ab'）2片段，Fv片段。

4.编码权利要求1-3中任一项所述的PD-1/PD-L1抑制剂的核酸分子。

5.一种包括权利要求4所述的核酸分子的重组载体。

6.一种包括权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组载体的重组细胞。

7.一种包括治疗有效量的权利要求1-3中任一项所述的PD-1/PD-L1抑制剂的药物组合物。

8.一种包括权利要求1-3中任一项所述的PD-1/PD-L1抑制剂的检测产品。

9.一种包括权利要求1-3中任一项所述的PD-1/PD-L1抑制剂的免疫缀合物。

10.权利要求1-3中任一项所述的PD-1/PD-L1抑制剂在制备检测PD-1产品中的应用。

11.权利要求1-3中任一项所述的PD-1/PD-L1抑制剂在制备治疗免疫障碍的药物中的应用。