JP5980202B2

JP5980202B2 - トランスフェリン受容体を特異的に認識できる抗体

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Publication number: JP5980202B2
Application number: JP2013514005A
Authority: JP
Inventors: 良和黒澤; 和広森下; 黎臨張; 仁黒澤; 克之見供; 須藤　幸夫; 幸夫須藤; 富美子野村; 由範鵜飼
Original assignee: University of Miyazaki; Perseus Proteomics Inc
Current assignee: University of Miyazaki; Perseus Proteomics Inc
Priority date: 2011-05-09
Filing date: 2012-05-07
Publication date: 2016-08-31
Anticipated expiration: 2032-05-07
Also published as: CA2835603A1; US9598496B2; CN103534272A; EP2708560A4; CN103534272B; WO2012153707A1; JPWO2012153707A1; EP2708560A1; US20140114054A1; HK1193833A1

Description

本発明はヒトＴｆＲ抗原に特異的に反応する抗ＴｆＲ抗体に関する。さらに本発明は、抗ＴｆＲ抗体を含む医薬組成物、特に悪性腫瘍の治療に関わる医薬組成物に関する。

がんは、日本における死亡原因の第一位を占め、高齢化に伴って患者数は年々増加してきており、有効性及び安全性の高い薬剤や治療法の開発が強く望まれている。従来の化学療法や、放射線療法など、がん細胞を殺すと同時に、正常細胞にもダメージを与え、強い副作用を引き起こしている問題点がある。これを解決するために、がん細胞に特異的に発現する分子を標的として薬剤を設計し、治療を行う分子標的治療が盛んに研究されている。この分子標的がん治療薬の中、抗体薬は半減期が長く、副作用が少ないなどメリットがあるため大変注目を浴びる。開発の成功例として、ＣＤ２０を標的としたキメラ抗体リツキサン（非特許文献１）や、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを標的としたヒト化抗体ハーセプチン（非特許文献２）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的としたヒト化抗体アバスチンなど挙げられる。これらの抗体ががんを対象疾患として使用されており、その治療効果が認められている。

治療薬としての抗体の使用は、非標識と標識抗体に分けられる。非標識抗体の作用メカニズムは、（１）免疫系細胞や分子を関与する抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）（非特許文献３）また補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）（非特許文献４）、（２）標的分子により細胞内生存や増殖と関わるシグナルの阻害、（３）アポトーシスの誘導、（４）サイトカインの分泌調節などと考えられる。それぞれのメカニズムの組み合わせにより腫瘍細胞を死亡させたり増殖を停止させたりして、治療効果を発揮する。標識抗体は、抗体に放射線物質や、毒素、酵素、また薬剤など細胞傷害物質とリンカーさせ、抗体の特異性を利用し、がん組織だけにこれらの物質を送達し、治療効果の向上と副作用の低減を図る。

トランスフェリンレセプター(ＴｆＲ)は,トランスフェリン(Ｔｆ)と結合した鉄を細胞内に取り込むための細胞膜構造として、最初網状赤血球上にあると同定された（非特許文献５）。以後、胎盤の栄養膜細胞(非特許文献１０から１２)や、活性化されたリンパ球（非特許文献１２）、更にさまざまな腫瘍細胞などに発現していることが分かった。たとえば、乳がん（非特許文献６）、前立腺がん（非特許文献７）、肺がん（非特許文献８），膵臓がん（非特許文献９）大腸がん（非特許文献３０、３１）胃がん（非特許文献３１）、膀胱癌（非特許文献３２，３３）、肝癌（非特許文献３４）、子宮頸がん（非特許文献３５）、脳腫瘍（非特許文献３６）、慢性リンパ性白血病（非特許文献３７，３８）、非ホジキンリンパ腫（非特許文献３８，３９）、成人T 細胞白血病（非特許文献４０）においてトランスフェリンレセプターの高い発現を報告されていた。また、ＴｆＲは様々な癌細胞表面に高発現し、正常細胞における発現が低いため、古くからがん治療の分子標的と認識された（非特許文献１３から１６、特許文献１、２）。しかしながら、今まで開発された抗ヒトＴｆＲ抗体はすべて動物由来の抗体であった。一般にヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体をヒトに投与すると、異物として認識されることにより、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体（ＨｕｍａｎＡｎｔｉＭｏｕｓｅＡｎｔｉｂｏｄｙ：以下、ＨＡＭＡと表記する）が誘導されることが知られている。ＨＡＭＡは投与されたマウス抗体と反応し、副作用を引き起こしたり（非特許文献１７から２０）、投与されたマウス抗体の体内からの消失を速めたりをし（非特許文献１８、２１及び２２）、マウス抗体の治療効果を減じてしまうことが知られている（非特許文献２３及び２４）。実際にあるマウス抗ヒトＴｆＲ抗体によりフェーズ１臨床試験を行われ、ＨＡＭＡの産生が観察され、顕著な治療効果を見られなかった（非特許文献２５）。

このような問題を回避するためにキメラ抗体が開発された（特許文献３及び４）。キメラ抗体は、２つまたはそれ以上の種由来の抗体の一部（マウス抗体の可変領域及びヒト抗体の定常領域など）を含む。このようなキメラ抗体の利点はマウス抗体の特徴は保持するが、ヒトＦｃを持つためヒト補体または細胞傷害活性を刺激することができる。しかし、このようなキメラ抗体も依然として「ヒト抗キメラ抗体」すなわちＨＡＣＡ（ＨｕｍａｎＡｎｔｉ− ＣｈｉｍｅｒａＡｎｔｉｂｏｄｙ）応答を惹起する（非特許文献２６）。さらに、置換された抗体の一部のみが相補性決定領域（すなわち「ＣＤＲ」）である組換え抗体が開発された（特許文献５及び６）。ＣＤＲ移植技術を使用してマウスＣＤＲ、ヒト可変部フレームワーク及び定常領域からなる抗体、すなわち「ヒト化抗体」が産生されている（非特許文献２７）。しかしながら、このようなヒト化抗体でも人に対して免疫原性があり、ＨＡＨＡ（Ｈｕｍａｎａｎｔｉ−ＨｕｍａｎＡｎｔｉｂｏｄｙ）反応を引き起こす（非特許文献２８、２９）。従って、臨床応用において、より安全有効な免疫原性を持たない抗体治療薬を望まれている。

ところで、抗体創薬においては、細胞膜表面に存在する「インタクトな状態の」標的癌抗原を認識する抗体を取得することが不可欠といえるが、標的癌抗原が膜タンパク質であるという理由から、既知の癌抗原に対する抗体であってもその取得には困難が伴っていた。このような問題点を解消すべく、本発明者らはこれまでに1000億個もの独立したクローンからなる巨大なヒト抗体ライブラリーを作製し、それを利用した癌細胞及び組織の細胞膜表面に存在するタンパク質（細胞表面抗原）に対する抗体の網羅的取得法を確立した。（特許文献７〜９）。

米国特許第５，６６７，７８１号米国特許第７，９７６，８４１号欧州特許１２０６９４号欧州特許１２５０２３号英国特許ＧＢ２１８８６３８Ａ米国特許第５,５８５,０８９号国際公開第０１／０６２９０７号パンフレット国際公開第２００１／０９６４０１号パンフレット特開２００５−１８５２８１号公報

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本発明は、ヒトＴｆＲを特異的に認識し、ＴｆＲ高発現しているがん細胞の生存や増殖を阻害する、かつヒトに対し免疫原性ない完全なヒト抗ヒトＴｆＲ抗体を提供することを解決すべき課題とした。また、これらの抗体の製造方法および抗体を用いるがんなどの疾患の治療薬を提供することを目的とする。

上述のように、ＴｆＲを標的とした抗体は抗腫瘍剤として開発されたが、動物由来の抗体であるため、ＨＡＭＡの産生や、薬効の不足などにより開発成功に至らなかった。そこで、本発明者らは、独自の抗体作成方法を鋭意に研究し、ヒト抗体ライブラリーファージＤｉｓｐｌａｙにより癌細胞膜上にあるＴｆＲと反応するファージ抗体（ｓｃＦｖ抗体）を取得した。これらの抗体遺伝子配列の解析により、抗体のＣＤＲが新規なアミノ酸配列を有することを見出した。更にこれらのｓｃＦｖ抗体をＩｇＧ化し、完全なヒトＩｇＧ抗体を作製した。これらのＩｇＧ抗体を用いてｉｎｖｉｔｒｏ, ｉｎｖｉｖｏで抗腫瘍効果を検討した。その結果、抗体が強い抗腫瘍効果を持つことを分かった。以上のことより、これらの抗体を利用しいろいろなＴｆＲ高発現しているがん治療に有用性を示し、本発明を完成させた。

即ち、本発明によれば、重鎖第１相補性決定領域（ＶＨＣＤＲ１）、重鎖第２相補性決定領域（ＶＨＣＤＲ２）、重鎖第３相補性決定領域（ＶＨＣＤＲ３）としてそれぞれ配列番号１〜３、７〜９、１３〜１５、１９〜２１、２５〜２７、３１〜３３、３７〜３９、４３〜４５、４９〜５１、５５〜５７、６１〜６３、６７〜６９、７３〜７５、７９〜８１、８５〜８７、９１〜９３、９７〜９９、１０３〜１０５、１０９〜１１１、１１５〜１１７の何れかのアミノ酸配列を含む、ヒトＴｆＲと特異的に反応する抗体が提供される。

本発明によればさらに、重鎖第１相補性決定領域（ＶＨＣＤＲ１）、重鎖第２相補性決定領域（ＶＨＣＤＲ２）、重鎖第３相補性決定領域（ＶＨＣＤＲ３）としてそれぞれ配列番号１〜３、７〜９、１３〜１５、１９〜２１、２５〜２７、３１〜３３、３７〜３９、４３〜４５、４９〜５１、５５〜５７、６１〜６３、６７〜６９、７３〜７５、７９〜８１、８５〜８７、９１〜９３、９７〜９９、１０３〜１０５、１０９〜１１１、１１５〜１１７の何れかのアミノ酸配列を含み、軽鎖第１相補性決定領域（ＶＬＣＤＲ１）、軽鎖第２相補性決定領域（ＶＬＣＤＲ２）、軽鎖第３相補性決定領域（ＶＬＣＤＲ３）としてそれぞれ配列番号４〜６、１０〜１２、１６〜１８、２２〜２４、２８〜３０、３４〜３６、４０〜４２、４６〜４８、５２〜５４、５８〜６０、６４〜６６、７０〜７２、７６〜７８、８２〜８４、８８〜９０、９４〜９６、１００〜１０２、１０６〜１０８、１１２〜１１４、１１８〜１２０の何れかのアミノ酸配列を含む、ヒトＴｆＲと特異的に反応する抗体が提供される。

本発明によればさらに、下記（１）から（２０）から選択される、ヒトＴｆＲと特異的に反応する抗体が提供される。
（１）配列番号１の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号２の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号３の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号５の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号６の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（２）配列番号７の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号８の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号９の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号１０の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号１１の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号１２の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（３）配列番号１３の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号１４の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号１５の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号１６の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号１７の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号１８の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（４）配列番号１９の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号２０の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号２１の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号２２の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号２３の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号２４の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（５）配列番号２５の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号２６の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号２７の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号２８の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号２９の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号３０の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（６）配列番号３１の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号３２の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号３３の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号３４の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号３５の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号３６の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（７）配列番号３７の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号３８の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号３９の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号４０の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号４１の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号４２の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（８）配列番号４３の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号４４の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号４５の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号４６の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号４７の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号４８の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（９）配列番号４９の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号５０の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号５１の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号５２の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号５３の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号５４の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（１０）配列番号５５の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号５６の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号５７の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号５８の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号５９の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号６０の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（１１）配列番号６１の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号６２の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号６３の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号６４の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号６５の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号６６の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（１２）配列番号６７の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号６８の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号６９の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号７０の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号７１の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号７２の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（１３）配列番号７３の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号７４の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号７５の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号７６の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号７７の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号７８の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（１４）配列番号７９の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号８０の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号８１の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号８２の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号８３の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号８４の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（１５）配列番号８５の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号８６の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号８７の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号８８の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号８９の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号９０の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（１６）配列番号９１の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号９２の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号９３の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号９４の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号９５の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号９６の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（１７）配列番号９７の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号９８の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号９９の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号１００の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号１０１の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号１０２の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（１８）配列番号１０３の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号１０４の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号１０５の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号１０６の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号１０７の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号１０８の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（１９）配列番号１０９の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号１１０の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号１１１の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号１１２の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号１１３の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号１１４の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；
（２０）配列番号１１５の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号１１６の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号１１７の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号１１８の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号１１９の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号１２０の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR、又はそれと実質的に同一のCDRを有する軽鎖可変領域とを有する抗体；

本発明によればさらに、配列番号１〜３、７〜９、１３〜１５、１９〜２１、２５〜２７、３１〜３３、３７〜３９、４３〜４５、４９〜５１、５５〜５７、６１〜６３、６７〜６９、７３〜７５、７９〜８１、８５〜８７、９１〜９３、９７〜９９、１０３〜１０５、１０９〜１１１、１１５〜１１７、４〜６、１０〜１２、１６〜１８、２２〜２４、２８〜３０、３４〜３６、４０〜４２、４６〜４８、５２〜５４、５８〜６０、６４〜６６、７０〜７２、７６〜７８、８２〜８４、８８〜９０、９４〜９６、１００〜１０２、１０６〜１０８、１１２〜１１４、１１８〜１２０の何れかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入されていて、活性が請求項１から３の何れかに記載の抗体と同等である、ヒトＴｆＲと特異的に反応する抗体が提供される。

好ましくは、本発明の抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。
好ましくは、本発明の抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ab')₂、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化V領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である。

本発明によれば、上記した本発明の抗体をコードするＤＮＡが提供される。
本発明によれば、上記した本発明のＤＮＡを含有する組換えベクターが提供される。
本発明によれば、上記した本発明の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株が提供される。
本発明によれば、上記した本発明の形質転換株を培地に培養し、培養物中に本発明の抗体を生成蓄積させ、培養物から抗体を採取することを含む、本発明の抗体の製造方法が提供される。

本発明によれば、上記した本発明の抗体を有する医薬組成物が提供される。
本発明によれば、抗体に細胞傷害性物質が結合している上記医薬組成物が提供される。
好ましくは、細胞傷害性物質が薬剤、毒素、又は放射性物質である。
好ましくは、本発明の医薬組成物は抗がん剤として使用される。

好ましくは、がんが、固形がんまた血液がんである。
好ましくは、固形がんが肺がん、大腸がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がんである。
好ましくは、血液がんが白血病、リンパ腫、骨髄腫である。
更に好ましくは、血液がんが成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）である。

本発明によればさらに、上記した本発明の抗体を対象者に投与することを含む、がんを抑制又は治療する方法が提供される。
本発明によればさらに、医薬組成物又は抗がん剤の製造のための、上記した本発明の抗体の使用が提供される。

本発明の抗体は、ヒトＴｆＲと特異的に認識し、ＴｆＲ発現しているがん細胞の生存や増殖を阻害する完全なヒト抗体である。ヒト抗体はヒトに投与する際、抗体の抗原性が回避され、ＨＡＨＡが産生されないので、より副作用が少ない高い抗腫瘍作用を発揮できる。即ち、本発明の抗ヒトＴｆＲ抗体は、抗がん剤として有用である。

図１は、抗ＴｆＲファージ抗体のＴｆＲ結合性を、免疫沈降とウエスタンブロットで確認した結果を示す。図２は、ヒト抗体遺伝子を示す。ヒト抗体遺伝子軽鎖λのJ鎖（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）遺伝子とC鎖（ｃｏｎｓｔａｎｔ）遺伝子は5つがＪ、Cの順で並列に存在しており、Ｊ4-CL4とＪ5-CL5は偽遺伝子で機能していない。図３は、ＴｆＲＩｇＧ抗体とがん細胞株とのフローサイトメトリ結果を示す。図４は、それぞれのがんモデルにおけるＴｆＲＩｇＧ抗体の抗腫瘍効果を示す。図５は、ＡＴＬモデルにおけるＴｆＲ００６ＩｇＧ抗体の抗腫瘍効果を示す。図６は、臨床由来肺癌組織サンプルとＴｆＲ００６ファージ抗体の反応性を示す。

次に、本発明について更に詳細に説明する。
定義および一般的技術
本明細書において別段定義しない限り、本発明に関して使用した科学技術用語は、当業者に通常理解されている意味を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して使用した命名法およびその技術は、当技術分野で周知のものであり、通常使用されている。

本発明の方法および技術は一般に、別段示さない限り、当技術分野で周知である従来の方法に従って、本明細書全体にわたって引用し論じた種々の一般的参照文献およびより具体的な参照文献に記載されているように実施する。

ＴｆＲ
ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）は人三番染色体にコードされる７６０アミノ酸から構成される一回膜貫通型タンパクである(配列番号１２５)。このタンパクはＣＤ７１抗原としても知られ、細胞の鉄の取り込みに関与し、細胞の増殖に関与すると考えられている。本発明のＴｆＲは、構造上特別に限定せず、単量体、多量体、細胞膜に発現しているｉｎｔａｃｔｆｏｒｍ、細胞外領域に構成された可溶化ｆｏｒｍ、ｔｒｕｎｃｔｅｄｆｏｒｍ、また、遺伝子の変異や、欠損などによりｍｕｔａｔｉｏｎｆｏｒｍ、リン酸化などにより翻訳後修飾を受けたｆｏｒｍなども含め、すべてヒトＴｆＲを意味する。

反応する及び反応性
本明細書において、「反応する」と「反応性」は特別に示さない限り、同じのことを意味する。すなわち、抗体が抗原を認識すること。この抗原は、細胞膜に発現するｉｎｔａｃｔＴｆＲでもよいし、ｔｒｕｎｃｔｅｄｆｏｒｍや、可溶化ｆｏｒｍでも良い。また、立体構造を保ったＴｆＲでもよいし、変性したＴｆＲでもよい。反応性を検討する手段として、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ、蛍光微量測定技術（ＦＭＡＴ）表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）、免疫染色、免疫沈降などが挙げられる。

フローサイトメーターに用いる抗体としては、ＦＩＴＣなどの蛍光物質、ビオチンなどにより標識された抗体であっても、標識をされていない抗体であってもよい。用いた抗体の標識の有無、その種類により、蛍光標識アビジン、蛍光標識抗ヒト免疫グロブリン抗体などを使用する。反応性は、十分量の抗ＴｆＲ抗体（通常最終濃度が０．０１〜１０μｇ／ｍＬ）を検体に加えて行い、陰性対照抗体、陽性対照抗体の反応性との比較を行うことにより評価することができる。

抗体
本明細書では必要に応じて、慣習に従い以下の略号（括弧内）を使用する。
重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）、第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）重鎖の第１相補性決定領域（ＶＨＣＤＲ１）、重鎖の第２相補性決定領域（ＶＨＣＤＲ２）、重鎖の第３相補性決定領域（ＶＨＣＤＲ３）軽鎖の第１相補性決定領域（ＶＬＣＤＲ１）、軽鎖の第２相補性決定領域（ＶＬＣＤＲ２）、軽鎖の第３相補性決定領域（ＶＬＣＤＲ３）。

本明細書において、「抗体」という用語は、イムノグロブリンと同義であり、当技術分野で通常知られている通りに理解されるべきである。具体的には、抗体という用語は、抗体を作製する任意の特定の方法により限定されるものではない。例えば、抗体という用語には、それだけに限らないが、組換え抗体、モノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体がある。

本明細書において、「ヒト抗体」という用語は、可変領域および定常領域の配列がヒト配列である任意の抗体を意味する。その用語は、ヒト遺伝子に由来する配列を有するが、例えば、考えられる免疫原性の低下、親和性の増大、望ましくない折りたたみを引き起こす可能性があるシステインの除去などを行うように変化させている抗体を包含する。その用語はまた、ヒト細胞に特有でないグリコシル化を施すことができる、非ヒト細胞中で組換えにより作製されたそのような抗体をも包含する。これらの抗体は、様々な形で調製することができる。

本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト由来の抗体を指し、非ヒト種の抗体配列に特徴的なアミノ酸残基が、ヒト抗体の対応する位置で認められる残基と置換されている。この「ヒト化」の工程が、その結果得られる抗体のヒトでの免疫原性を低下させると考えられる。当技術分野で周知の技術を使用して、非ヒト由来の抗体をヒト化できることが理解されるであろう。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１４：４３〜４６（１９９３）を参照されたい。対象とする抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを対応するヒト配列と置換する組換えＤＮＡ技術によって工学的に作製することができる。例えば、ＷＯ９２／０２１９０、ならびに米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７９２号、第５，７１４，３５０号、および第５，７７７，０８５号を参照できる。本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、その意味の範囲内で、キメラヒト抗体およびＣＤＲ移植抗体を含む。

本発明の抗体の可変領域においてフレームワーク領域（ＦＲ）の配列は、対応する抗原に対する特異的結合性に実質的な影響のない限り、特に限定されない。ヒト抗体のＦＲ領域を用いることが好ましいが、ヒト以外の動物種（例えばマウスやラット）のＦＲ領域を用いることもできる。

本明細書において、「ファージ抗体」という用語は、ファージにより産生されたｓｃＦｖ抗体を意味する。つまり、ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体断片である。この断片は、Ｌｉｎｋｅｒとしてのアミノ酸以外、タグとしてのアミノ酸配列を含むことでもよい。

本発明の抗体の一態様において、可変領域に加えて定常領域を含む（例えばIgG型抗体）。定常領域の配列は特に限定されない。例えば、公知のヒト抗体の定常領域を用いることができる。ヒト抗体の重鎖定常領域（ＣＨ）としては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、軽鎖定常領域（ＣＬ）としては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。また、ヒト以外の動物種（例えばマウスやラット）の定常領域を用いることもできる。

本発明の抗体に用いられるＦＲまたは定常領域のアミノ酸配列は、由来となる元のＦＲまたは定常領域のアミノ酸配列をそのまま用いてもよいし、１または数個（例えば、１から８個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から３個、特に好ましくは１または２個）のアミノ酸を欠失、付加、置換及び／または挿入して異なるアミノ酸配列にして用いてもよい。

本発明において、「活性が請求項に記載の抗体と同等である」とは、ヒトＴｆＲへの結合活性および／または抗腫瘍活性が同等であることを意味する。結合活性としては、抗原を認識することを意味する。この抗原は、細胞膜に発現するｉｎｔａｃｔＴｆＲでもよいし、ｔｒｕｎｃｔｅｄｆｏｒｍや、可溶化ｆｏｒｍでも良い。また、立体構造を保ったＴｆＲでもよいし、変性したＴｆＲでもよい。たとえば、結合活性を検討する手段として、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ、蛍光微量測定技術（ＦＭＡＴ）表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）などが挙げられる。抗腫瘍活性としては、腫瘍細胞の増殖また生存を阻害する活性を意味する。この腫瘍細胞の増殖また生存の阻害は、ｉｎｖｉｔｒｏで、また、ｉｎｖｉｖｏでもよい。例えば、ｉｎｖｉｔｒｏで腫瘍細胞の数が減少させる活性、腫瘍細胞の数の増加を阻害する活性、腫瘍細胞の細胞死を引き起こす活性、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙーｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）など。ｉｎｖｉｖｏでは腫瘍重量または体積を減少させる活性、腫瘍重量または体積の増加を抑制させる活性、他薬剤による腫瘍重量または体積の減少を促進させる活性、腫瘍細胞による個体死亡を抑制する活性等が挙げられる。

Ｉｎｖｉｖｏの動物モデルとしては、ヌードマウス等の免疫不全マウスにヒト癌組織由来の培養細胞株を移植した異種移植モデル、培養マウス癌細胞株を正常な免疫系を有する野生型マウスへ移植した同系移植モデルなどがあげられる。

異種移植モデルはヌードマウス等の免疫不全マウスの皮下、皮内、腹腔内、静脈内等様々な部位にヒト癌細胞株を移植することにより作製することができる。

本発明において、「同等」とは、必ずしも同程度の活性である必要はなく、活性が増強されていてもよいし、又、活性を有する限り活性が減少していてもよい。活性が減少している抗体としては、例えば、元の抗体と比較して３０％以上の活性、好ましくは５０％以上の活性、より好ましくは８０％以上の活性、さらに好ましくは９０％以上の活性、特に好ましくは９５％以上の活性を有する抗体を挙げることができる。

上述の抗体は、ＴｆＲに対する同等な結合活性を有する、あるいは、同等な抗腫瘍活性を有する限り、可変領域（ＣＤＲ配列および／またはＦＲ配列）のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。アミノ酸配列において、１または数個（例えば、１から８個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から３個、特に好ましくは１または２個）のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入されており、ＴｆＲに対する結合活性、および／または抗腫瘍活性を有する抗体のアミノ酸配列を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, anＤＮＡkagawa, M. (１995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene １5２, ２7１-２75、Zoller, MJ, and Smith, M.(１98３) Oligonucleotide-directed mutagenesis of ＤＮＡ fragments cloned into M１３ vectors.Methods Enzymol. １00, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V,Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(１984) The gapped duplex ＤＮＡ approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. １２,944１-9456、Kramer W, and Fritz HJ(１987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex ＤＮＡ Methods. Enzymol. １54, ３50-３67、Kunkel,TA(１985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 8２, 488-49２）などを用いて、ＴｆＲに対する結合活性および／または抗腫瘍活性を有する抗体のアミノ酸配列に適宜変異を導入することにより、ＴｆＲに対する結合活性および／または抗腫瘍活性を有する抗体と機能的に同等な変異体を調製することができる。

このように、可変領域において、１または数個のアミノ酸が変異しており、ＴｆＲに対する結合活性および／また抗腫瘍活性を有する抗体もまた本発明の抗体に含まれる。
本明細書において「それと実質的に同一のCDR」という用語は、上記のように１または数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入されており、ＴｆＲに対する結合活性、および／または抗腫瘍活性を有する抗体を構成するCDRを意味する。

本発明の抗体は、その由来で限定されず、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体など、如何なる動物由来の抗体でもよい。又、キメラ化抗体、ヒト化抗体などでもよい。本発明における抗体の好ましい様態の一つとして、ヒト抗体である。

本発明の抗体は、後述する抗体を産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。得られた抗体が、本発明の抗体と同等の活性を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明で記載されているアミノ酸配列に翻訳後に修飾を受ける場合も本発明に含まれる。更に、既知の翻訳後修飾以外の部位に対する翻訳後修飾も、本発明の抗体と同等の活性を有している限り、本発明に含まれる。また、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明の抗体はこのような抗体も包含する。既知の翻訳後修飾以外の部位に対する翻訳後修飾も、本発明の抗体と同等の活性を有している限り、本発明に含まれる。

抗体の作製
（１）ファージディスプレイライブラリーにより抗原と反応するｓｃＦｖ
本発明の抗体の取得は、当技術分野で知られているいくつかの方法に従って調製することができる。例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、ＴｆＲに対する親和性が様々である抗体のレパートリーを含むライブラリーを提供することができる。次いで、これらのライブラリーをスクリーニングして、ＴｆＲに対する抗体を同定し単離することができる。好ましくは、ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを使用して生成されるｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。そのようなライブラリーを調製しスクリーニングする方法は当技術分野で知られている。ヒトＴｆＲを抗原としてスクリーニングした反応性を示すファージクローンから遺伝物質を回収する。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＶＨ及びＶＬのＤＮＡ配列を決定することができる。このｓｃＦｖの配列を用いて、ｓｃＦｖをＩｇＧ化すれば、ヒト抗体を取得することができる。

（２）ｓｃＦｖのＩｇＧ化（ヒト抗体の作製）
Ｈ鎖またＬ鎖の発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製によりヒト抗体を取得する。また、ＶＨ及びＶＬを同一ベクターに発現すること（タンデム型）によりヒト抗体の取得もできる。これらの方法は周知であり、ＷＯ９２/０１０４７、ＷＯ９２/２０７９１、ＷＯ９３/０６２１３、ＷＯ９３/１１２３６、Ｗ０９３/１９１７２、ＷＯ９５/０１４３８、ＷＯ９５/１５３８８、ＷＯ９７/１０３５４などを参考にすることができる。

具体的には、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする他のＤＮＡ分子と連結することによって、完全長重鎖遺伝子を取得することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１−３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの定常領域でよいが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２の定常領域である。ＩｇＧ１定常領域配列は、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）やＧｍ（１７）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子またはアロタイプでよい。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域中の天然に存在するアミノ酸置換に相当する。

ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子と連結することによって、完全長Ｌ鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）を取得することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１−３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλの定常領域でよい。κ定常領域は、Ｉｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）やＩｎｖ（３）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子でよい。λ定常領域は、３つのλ遺伝子のいずれかに由来するものでよい。

上記のように得られたＨ鎖またＬ鎖コードするＤＮＡを発現ベクター中に挿入することにより、発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製によりヒト抗体を取得する。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルスやタバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用する発現用宿主細胞と適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入することができるし、また両方の遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入することもできる。抗体遺伝子を、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補的な制限部位とベクターの連結、または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）によって発現ベクター中に挿入する。

好都合なベクターは、上記に記載のように任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に挿入し発現させることができるように工学的に作製された適当な制限部位を有する機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬイムノグロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターでは、通常、挿入されたＪ領域中のスプライス供与部位とヒトＣドメインに先行するスプライス受容部位の間で、またヒトＣＨエキソン内に存在するスプライス領域でもスプライシングが起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流にある天然の染色体部位で起こる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞由来の抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることもできる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがインフレームでイムノグロブリン鎖のアミノ末端と連結するようにベクター中にクローン化することができる。シグナルペプチドは、イムノグロブリンシグナルペプチドでもよく、あるいは異種性シグナルペプチド（すなわち非イムノグロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でもよい。

本発明の抗体の発現ベクターは、抗体遺伝子および制御配列に加えて、宿主細胞中でのベクターの複製を制御する配列（例えば複製起点）や選択マーカー遺伝子などのさらなる配列を有してよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンやメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、デヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞でメトトレキセート選択／増幅とともに使用する）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇ４１８選択用）、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子がある。

以上の方法で作製された抗体遺伝子発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、本発明の抗体を産生させる可能であればいかなる細胞でもよいが、動物細胞が好ましい。動物細胞として、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ/ｄｈｆｒ (−)細胞ＣＨＯ/ＤＧ４４細胞、サル由来細胞ＣＯＳ細胞(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immunol.１60, ３３９３-３４０２ (１９９８))、ＳＰ２／Ｏ細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.５,５１２-５１９9(１９９６),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.５０,１４９５-１５０２ (１９９０)) など挙げられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８６,６００７ (１９８９), P.L.Felgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８４,７４１３ (１９８７)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology ５２,４５６-４６７(１９７３))、ＤＥＡＥ-Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。

形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト抗体を分離する。抗体の分離・精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて利用することができる。

抗体断片
本発明の抗体を基にして又は本発明の抗体をコードする遺伝子の配列情報を基にして抗体断片を作製することができる。抗体断片としてはＦａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')₂、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ抗体が挙げられる。

Ｆａｂは、ＩｇＧをシステイン存在下パパイン消化することにより得られる、Ｌ鎖とＨ鎖可変領域、並びにＣＨ１ドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される分子量約５万の断片である。本発明では、上記抗体をパパイン消化することにより得ることができる。また、上記抗体のＨ鎖の一部及びＬ鎖をコードするＤＮＡを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりＦａｂを調製することもできる。

Ｆａｂ'は、後述のF(ａｂ')₂のＨ鎖間のジスルフィド結合を切断することにより得られる分子量が約５万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化し、還元剤を用いてジスルフィド結合を切断することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆａｂ'をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。

Ｆ(ａｂ')₂は、ＩｇＧをペプシン消化することにより得られる、Ｌ鎖とＨ鎖可変領域、並びにＣＨ１ドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される断片（Ｆａｂ'）がジスルフィド結合で結合した分子量約１０万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆ(ａｂ')₂をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。

ｓｃＦｖは、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とからなるＦｖを、片方の鎖のＣ末端と他方のＮ末端とを適当なペプチドリンカーで連結し一本鎖化した抗体断片である。ペプチドリンカーとしては例えば柔軟性の高い（ＧＧＧＧＳ）₃などを用いることができる。例えば、上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡとペプチドリンカーをコードするＤＮＡを用いてｓｃＦｖ抗体をコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｓｃＦｖを調製することができる。

ｄｓＦｖは、Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の適切な位置にＣｙｓ残基を導入し、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とをジスルフィド結合により安定化させたＦｖ断片である。各鎖におけるＣｙｓ残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。本発明では例えば上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域のアミノ酸配列から立体構造を予測し、かかる予測に基づき変異を導入したＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をそれぞれコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、そして当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｄｓＦｖを調製することができる。

尚、適当なリンカーを用いてｓｃＦｖ抗体、ｄｃＦｖ抗体などを連結させたり、ストレプトアビジンを融合させたりして抗体断片を多量体化することもできる。

医薬組成物
本発明によれば、本発明の抗体を含有する医薬組成物が提供される。本発明一つの実施形態としてはがんの治療であるが、これに限らない。ＴｆＲの高発現によるがん以外の疾患でも本発明の範囲以内である。更に好ましい実施形態としてがんは、固形癌（例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がんなど）、または血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫など）である。本発明の他の好ましい実施形態では、がんは成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）である。

本発明の医薬組成物の一態様として、本発明の抗体が有効成分として利用される。これは、抗体の細胞増殖抑制活性、細胞死誘導活性、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性などを利用し、抗腫瘍効果を発揮する。抗体が、以上の活性を一つだけを持つことでもよいし、また複数の活性を同時に持つことでもよい。つまり、ｎａｋｅｄ抗体が医薬組成物の有効成分である。

もう一つの態様では、本発明の抗体はがん治療薬としてがん組織に特異的にターゲティングさせるミサイル療法に用いることができる。すなわち、がん細胞に傷害をもたらす物質を結合させた抗体を投与することにより、がん部特異的に移行させ、治療効果および副作用の軽減を意図した治療方法である。

がん細胞に傷害する物質は、薬剤、毒素又は放射線物質などの細胞障害性物質を挙げられる。細胞障害性物質と抗体の結合は、当業者に公知の方法で行うことができる（ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ. ２００４Ｊｕｌ１;１０(１３):４５３８-４９。
抗体に結合させる薬剤は、がん細胞に傷害をもたらす公知の物質を用いることができる。例としては例えばデュオカルマイシン、デュオカルマイシンのアナログ及び誘導剤、ＣＣ−１０６５、ＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＭＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＣＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ドキソルビシン、ドキソルビシンコンジュゲート、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン、ドレスタチン−１０、コンブレタスタチン、カリケアマイシン(calicheamicin)、メイタンシン、メイタンシンアナログ、ＤＭ１，ＤＭ２，ＤＭ３，ＤＭ４、ＤＭＩ、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、５−ベンゾイルバレリン酸ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）、チューブリシン、ジソラゾール、エポシロン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＳＮ−３８、トポテカン、リゾキシン、エキノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エストラムスチン、セマドチン、エリューテロビン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、リューロシン、リューロシダイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシンコンジュゲート、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン誘導体、エトポシド、エトポシドリン酸塩、ビンクリスチン、タキソール、タキソテールレチノイン酸、酪酸、Ｎ⁸−アセチルスペルミジン並びにカンプトセシン等をあげることができるが、これだけに限定されるわけではない。

抗体と薬剤の結合には、それら自身が有する連結基などを介して直接結合されてもよいし、また、リンカーや他の物質を介して間接的に結合されてもよい。

薬剤が直接結合される場合の連結基は、例えばＳＨ基を用いたジスルフィド結合やマレイミドを介する結合が挙げられる。例えば、抗体のＦｃ領域の分子内ジスルフィド結合と、薬剤のジスルフィド結合を還元して、両者をジスルフィド結合にて結合する。また、マレイミドを介する方法もある。また別の方法として、抗体内にシステインを遺伝子工学的に導入する方法もある。

抗体と薬剤を、他の物質（リンカー）を介して間接的に結合することも可能である。リンカーには、抗体または薬剤または両方と反応する官能基を１または２種類以上有することが望ましい。官能基の例としてはアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、マレイミド基、ピリジニル基等をあげることができる。

リンカーの例としては、Ｎ−スクシンイミジル４−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−(Ｎ−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−１−カルボキシ−(６−アミドカプロエート) （ＬＣ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−(α−マレイミドアセトキシ)−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−(β−マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−(ｐ−マレイミドフェニル)−ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ−(ｐ−マレイミドフェニル)イソシアネート（ＰＭＰＩ）、６-マレイミドカプロイル(ＭＣ)、マレイミドプロパノイル(ＭＰ)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(ＰＡＢ)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(ＳＰＰ) 及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(ＳＩＡＢ)等があげられるが、これらに限定されるものではない。また、このリンカーは例えば、バリン-シトルリン（Ｖａｌ-Ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン(ａｌａ−ｐｈｅ)のようなペプチドリンカーであってもよいし、上記にあげたリンカーをそれぞれ適時組み合わせて使用しても良い。

薬剤と抗体との結合方法に関しては、例えば、Cancer Research ;68 (22) 9280（2008）、Nature Biotechnology;26(8) 925（2008）、Bio Conjugate Chemistry;19、1673 (2008)、Cancer Research ;68 (15) 6300（2008）、又は特表2008-516896号公報などに記載の方法に準じて行うことができる。

毒素としては、抗体に毒素を化学的または遺伝子工学的に結合した、いわゆるイムノトキシンをあげることができる。毒素として、たとえば、ジフテリアトキシンＡ鎖、シュードモナスエンドトキシン、リシン鎖；無糖鎖リシンＡ鎖ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）等をあげることができる。

利用する放射性物質は、当業者に公知の物質を用いることができるが。例えばイットリウム９０（⁹⁰Ｙ）、レニウム１８６（¹⁸⁶Ｒｅ）、レニウム１８８（¹⁸⁸Ｒｅ）、銅６７（⁶⁷Ｃｕ）、鉄５９（⁵⁹Ｆｅ）、ストロンチウム８９（⁸⁹Ｓｒ）、金１９８（¹⁹⁸Ａｕ）、水銀２０３（²⁰³Ｈｇ）、鉛２１２（²¹²Ｐｂ）、ジスプロシウム１６５（¹⁶⁵Ｄｙ）、ルテニウム１０３（¹⁰³Ｒｕ）、ビスマス２１２（²¹²Ｂｉ）、ビスマス２１３（²¹³Ｂｉ）、ホルミウム１６６（¹⁶⁶Ｈｏ）、サマリウム１５３（¹⁵³Ｓｍ）、ルテチウム１７７（¹⁷⁷Ｌｕ）などを挙げることができる。好ましくは、⁹⁰Ｙ ¹⁵³Ｓｍ、¹⁷⁷Ｌｕである。
抗体と放射性物質の結合は、当業者公知の方法により行うことができる（Bioconjug Chem. １994 Mar-Apr;5(２):１0１-4.）。

放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を用いたがん治療は、当業者公知の方法により行うことができる（Bioconjug Chem. １998 Nov-Dec;9(6):77３-8２.）。具体的には、最初に少量の放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を患者に投与し、全身のシンチグラムを行う。正常組織の細胞と抗体の結合が少なく、癌細胞と抗体の結合が多いことを確認した上で、放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を大量に投与する。

本発明の抗ヒトＴｆＲ抗体を含有する医薬組成物による製剤も本発明の範囲内に含まれる。このような製剤は、好ましくは、抗体を含有する医薬組成物に加え、生理学的に許容され得る希釈剤又はキャリアを含んでおり、他の抗体又は抗がん剤のような他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。或いは、抗体は凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用してもよい。投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、又は、注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺、坐薬等による非経口投与を挙げることができる。本発明の医薬組成物による製剤単独の投与でもよいし、他の薬剤と併用でもよい。

本発明の医薬組成物の投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、抗体の量として、成人に対して、１日約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇであり、これらを１回、又は数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、１回約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇを皮下注射、筋肉注射又は静脈注射によって投与することができる。

以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例１：癌細胞株を使用したファージ抗体スクリーニング
（１）癌細胞に結合するファージ抗体のスクリーニング（肝癌細胞株ＨｅｐＧ２）
ＨｅｐＧ２細胞を１５ｃｍデイッシュで培養し、２ｍｇ/ｍＬｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩ/ ｃｅｌｌｓｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）によりデイッシュから剥離した。細胞を回収し、冷却したＰＢＳで洗浄した後、１×１０¹³ｃｆｕのヒト抗体ファージライブラリー（特開２００５−１８５２８１号公報、ＷＯ２００８／００７６４８号公報、ＷＯ２００６／０９０７５０号公報を参照）を混ぜ、最終容積１．６ｍＬになるように反応液（１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、ＭＥＭ）を添加し、４℃にて４時間ゆっくり回転させて反応させた。反応終了後、反応液を二つに分け、それぞれに０．６ｍＬの有機溶液(ｄｉｂｕｔｙｌｐｈｔａｌａｔｅｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ９：１)を添加し、マイクロ遠心機により２分間遠心（３０００ｒｐｍ）した。上清を捨て、チューブの底に沈降した細胞を０．７ｍＬの１％ＢＳＡ/ＭＥＭで懸濁し、更に０．７ｍＬの有機溶媒を添加した。同じように遠心により上清を捨て、細胞を０．３ｍＬのＰＢＳで懸濁し、液体窒素で凍結した。

凍結した細胞を３７℃で解凍し、２０ｍＬの大腸菌ＤＨ１２Ｓ（ＯＤ０．５）に１時間で感染させた。ファージに感染した大腸菌を６００ｍＬの２×ＹＴＧＡ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬａｍｐｉｃｉｓｕｌｆａｔｅ、１％Ｇｌｕｃｏｓｅ）に入れ、３０℃で一晩培養した。その後１０ｍＬを取り、２００ｍＬ２×ＹＴＡ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬａｍｐｉｃｉｓｕｌｆａｔｅ）に入れ、３７℃で１．５時間培養した。１×１０¹¹ヘルパーファージＫＯ７を入れ、更に３７℃で１時間培養した。８００ｍＬの２×ＹＴＧＡＫ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬａｍｐｉｃｉｓｕｌｆａｔｅ、０．０５％Ｇｌｕｃｏｓｅ、５０μｇ/ｍＬｋａｎａｍｙｃｉｎ）を添加し、３０℃で一晩培養した。１０分間の遠心（８０００ｒｐｍ）により上清を回収した。回収した上清に２００ｍＬのＰＥＧ液（２０％ｐｏｌｙｅｔｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ６０００、２．５ＭＮａＣｌ）を入れよく攪拌した後、１０分間の遠心（８０００ｒｐｍ）によりファージを沈殿させた。これを１０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、これが１ｓｔスクリーニングのファージとした。

次は、２ｎｄスクリーニングを行った。２×１０⁷培養細胞と１×１０¹⁰１ｓｔスクリーニングのファージを混合し、最終容積０．８ｍＬになるように反応液を（１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、ＭＥＭ）入れた。その後は上記１ｓｔスクリーニングと同様の手法を行い、２ｎｄスクリーニングのファージを取得した。

３ｒｄスクリーニングは１×１０⁹の２ｎｄスクリーニングのファージを使用し、上記と同じように行った。

（２）ファージ抗体の解析
３ｒｄスクリーニングしたファージを回収し、既存法によりＤＮＡ配列を解析し、欠損領域を保持する不完全な抗体や配列が重複する抗体を排除し、独立した抗体配列を持つファージ抗体を取得した（特許第４８７０３４８を参照）。

同様の手法により、下記の表１に示す２１種類のがん細胞を用いて、がん抗原に反応するファージ抗体のスクリーニングを行った。その結果、表１に示したように、独立配列を有するファージ抗体１８６３個を取得した。

実施例２：可溶性ヒトＴｆＲと反応するファージのスクリーニング
（１）可溶性ＴｆＲ抗原産生細胞の作製
癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ２, ＳＫＯＶ−３を用いて、ＴｆＲのｃＤＮＡをＰＣＲ法により作製した。常法によりＴｆＲ細胞外ドメインのｃＤＮＡを調整し、ｐＣＭＶ-Ｓｃｒｉｐｔ（クロンテク社製）に挿入することにより、可溶性ＴｆＲ抗原発現ベクターを作製した。この発現ベクターを細胞株２９３Ｔへ導入し、可溶性ＴｆＲ抗原を産生する発現細胞を作製した。

（２）ＥＬＩＳＡによる陽性ファージのスクリーニング
上記可溶性ＴｆＲ産生細胞の上清を回収し、精製により可溶性ＴｆＲ抗原を取得した。この可溶性ＴｆＲ抗原を用いてＥＬＩＳＡによる抗原抗体の反応性を検討した。すなわち、可溶性ＴｆＲ抗原をＰＢＳで１0μg/ｍＬになるように調整し、ＩｍｍｕｎｏＭｏｄｕｌｅ／ＳｔｒｉｐＰｌａｔｅｓ（ＮＵＮＫ）に50μＬ/ｗｅｌｌに添加し、３７℃で２時間静置した。その後、可溶性ＴｆＲ抗原を捨て、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ液（５％スキムミルク / ０．０５％ＮａＮ３/ ＰＢＳ)２００μＬ/ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２時間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除き、ＰＢＳにより洗浄し、上記（表１）ファージの培養上清を１00μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＰＢＳ/０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈した１μｇ/ｍＬＲａｂｂｉｔａｎｔｉ−ｃｐ３を１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、更にＰＢＳ/０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で２０００倍希釈したａｎｔｉ−ＲａｂｂｉｔＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰを１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＯＰＤｉｎ０．１Ｍクエン酸リン酸バーファー（ｐＨ５．１）＋０．０１％Ｈ₂Ｏ₂ を１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し室温で５分間反応させた。２ＮＨ₂ＳＯ₂を１００μＬ/ｗｅｌｌ加え、発色反応を停止した。その後、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ３４０ＰＣ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）にて４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果、１８６３株のファージの中、可溶性ＴｆＲ抗原と顕著な陽性反応を示すものは２０株であった。この２０株ファージのＤＮＡ配列を解析し、それぞれのＣＤＲ配列が新規であることが確認された。ＣＤＲ配列は下記の通りである。

(１)ＴｆＲ００１抗体
VH CDR1：配列番号１、VH CDR2：配列番号２、VH CDR3：配列番号３
VL CDR1：配列番号４、VL CDR2：配列番号５、VL CDR3：配列番号６
(２)ＴｆＲ００２抗体
VH CDR1：配列番号７、VH CDR2：配列番号８、VH CDR3：配列番号９
VL CDR1：配列番号１０、VL CDR2：配列番号１１、VL CDR3：配列番号１２
(３)ＴｆＲ００３抗体
VH CDR1：配列番号１３、VH CDR2：配列番号１４、VH CDR3：配列番号１５
VL CDR1：配列番号１６、VL CDR2：配列番号１７、VL CDR3：配列番号１８
(４)ＴｆＲ００４
VH CDR1：配列番号１９、VH CDR2：配列番号２０、VH CDR3：配列番号２１
VL CDR1：配列番号２２、VL CDR2：配列番号２３、VL CDR3：配列番号２４
(５)ＴｆＲ００５
VH CDR1：配列番号２５、VH CDR2：配列番号２６、VH CDR3：配列番号２７
VL CDR1：配列番号２８、VL CDR2：配列番号２９、VL CDR3：配列番号３０
(６)ＴｆＲ００６
VH CDR1：配列番号３１、VH CDR2：配列番号３２、VH CDR3：配列番号３３
VL CDR1：配列番号３４、VL CDR2：配列番号３５、VL CDR3：配列番号３６
(7)ＴｆＲ００７
VH CDR1：配列番号３７、VH CDR2：配列番号３８、VH CDR3：配列番号３９
VL CDR1：配列番号４０、VL CDR2：配列番号４１、VL CDR3：配列番号４２
(８)ＴｆＲ００８
VH CDR1：配列番号４３、VH CDR2：配列番号４４、VH CDR3：配列番号４５
VL CDR1：配列番号４６、VL CDR2：配列番号４７、VL CDR3：配列番号４８
(９)ＴｆＲ００９
VH CDR1：配列番号４９、VH CDR2：配列番号５０、VH CDR3：配列番号５１
VL CDR1：配列番号５２、VL CDR2：配列番号５３、VL CDR3：配列番号５４
(１０)ＴｆＲ０１０
VH CDR1：配列番号５５、VH CDR2：配列番号５６、VH CDR3：配列番号５７
VL CDR1：配列番号５８、VL CDR2：配列番号５９、VL CDR3：配列番号６０
(１１)ＴｆＲ０１１
VH CDR1：配列番号６１、VH CDR2：配列番号６２、VH CDR3：配列番号６３
VL CDR1：配列番号６４、VL CDR2：配列番号６５、VL CDR3：配列番号６６
(１２)ＴｆＲ０１２
VH CDR1：配列番号６７、VH CDR2：配列番号６８、VH CDR3：配列番号６９
VL CDR1：配列番号７０、VL CDR2：配列番号７１、VL CDR3：配列番号７２
(１３)ＴｆＲ０１３
VH CDR1：配列番号７３、VH CDR2：配列番号７４、VH CDR3：配列番号７５
VL CDR1：配列番号７６、VL CDR2：配列番号７７、VL CDR3：配列番号７８
(１４)ＴｆＲ０１４
VH CDR1：配列番号７９、VH CDR2：配列番号８０、VH CDR3：配列番号８１
VL CDR1：配列番号８２、VL CDR2：配列番号８３、VL CDR3：配列番号８４
(１５)ＴｆＲ０１５
VH CDR1：配列番号８５、VH CDR2：配列番号８６、VH CDR3：配列番号８７
VL CDR1：配列番号８８、VL CDR2：配列番号８９、VL CDR3：配列番号９０
(１６)ＴｆＲ０１６
VH CDR1：配列番号９１、VH CDR2：配列番号９２、VH CDR3：配列番号９３
VL CDR1：配列番号９４、VL CDR2：配列番号９５、VL CDR3：配列番号９６
(１７)ＴｆＲ０１７
VH CDR1：配列番号９７、VH CDR2：配列番号９８、VH CDR3：配列番号９９
VL CDR1：配列番号１００、VL CDR2：配列番号１０１、VL CDR3：配列番号１０２
(１８)ＴｆＲ０１８
VH CDR1：配列番号１０３、VH CDR2：配列番号１０４、VH CDR3：配列番号１０５
VL CDR1：配列番号１０６、VL CDR2：配列番号１０７、VL CDR3：配列番号１０８
(１９)ＴｆＲ０１９
VH CDR1：配列番号１０９、VH CDR2：配列番号１１０、VH CDR3：配列番号１１１
VL CDR1：配列番号１１２、VL CDR2：配列番号１１３、VL CDR3：配列番号１１４
(２０)ＴｆＲ０２０
VH CDR1：配列番号１１５、VH CDR2：配列番号１１６、VH CDR3：配列番号１１７
VL CDR1：配列番号１１８、VL CDR2：配列番号１１９、VL CDR3：配列番号１２０

配列番号１：TSGVGVG
配列番号２：LIYWDDDKHYSPSLKS
配列番号３：NGDYGIEFDY
配列番号４：GGNNIGSKSVH
配列番号５：YDSDRPS
配列番号６：QVWDSSSDHVV
配列番号７：SYSMN
配列番号８：SISSSSSYIYYADSVKG
配列番号９：ARESVDAFDI
配列番号１０：QGDSLRSYDAS
配列番号１１：GLSDRPS
配列番号１２：ISRDSGGNPH
配列番号１３：SYAMS
配列番号１４：AISGSGGSTYYADSVKG
配列番号１５：GYYGSNYYYGMDV
配列番号１６：SGSSSNIGSNYVY
配列番号１７：RNNQRPS
配列番号１８：AAWDDSLSGPV
配列番号１９：DFVFS
配列番号２０：WISAHDGNTNYAQKLQD
配列番号２１：DTFTNLLGDYSYDAMDV
配列番号２２：GSSTGAVTSGHYPY
配列番号２３：DTTEKHS
配列番号２４：LLSSGDGRAV
配列番号２５：NYGMS
配列番号２６：WISAYNGNTNYGEKLQG
配列番号２７：DDYYGSGVDAFDI
配列番号２８：GGNKIGSKSVH
配列番号２９：YDRDRPS
配列番号３０：QVWDSSSDVV
配列番号３１：SYGMH
配列番号３２：VISFDGSSKYYADSVKG
配列番号３３：DSNFWSGYYSPVDV
配列番号３４：TRSSGSIASNSVQ
配列番号３５：YEDTQRPS
配列番号３６：QSYDSAYHWV
配列番号３７：SYWLS
配列番号３８：KIDPSDSYTQYSPSFEG
配列番号３９：HGYDAFHV
配列番号４０：SGSSSNIGNNAVN
配列番号４１：YDDLLPS
配列番号４２：AAWDDSLNGWV
配列番号４３：DYAMH
配列番号４４：GISWNSGSIGYADSVKG
配列番号４５：DQHREFYYYGMDV
配列番号４６：SGSSSNIGSNYVY
配列番号４７：RNNQRPS
配列番号４８：AAWDDSLSGPV
配列番号４９：SYWIG
配列番号５０：IIYPGDSDTRYSPSFQG
配列番号５１：QGTNWGVGDAFDI
配列番号５２：GGNNIGSKSVH
配列番号５３：DDSDRPS
配列番号５４：QVWDISSDHVV
配列番号５５：SYAMS
配列番号５６：AISGSGGSTYYADSVKG
配列番号５７：DRYYYGSGSYYDAFDI
配列番号５８：QGDSLRSYYAS
配列番号５９：GKNNRPS
配列番号６０：NSRDSSGNHVV
配列番号６１：SYSMN
配列番号６２：VISYDGSNKYYADSVKG
配列番号６３：VDPGDRGWYFDL
配列番号６４：SGSSSNIGSNTVN
配列番号６５：SNNQRPS
配列番号６６：AAWDDSLNGWV
配列番号６７：SSPYYWG
配列番号６８：SVYYSGNTYYNPSLTR
配列番号６９：HSWGINDAFDV
配列番号７０：SGSSSNIGNNYVS
配列番号７１：DNNKRPS
配列番号７２：GTWDSSLSVWV
配列番号７３：DYAMH
配列番号７４：GISWNSGSIDYADSVKG
配列番号７５：ENLAVAGLDY
配列番号７６：QGDSLRGYYAS
配列番号７７：DKNTRPS
配列番号７８：QSRDNSGEMVV
配列番号７９：ELSMH
配列番号８０：GFDPEDGETIYAQKFQG
配列番号８１：DAYYGSGSPRDAFDI
配列番号８２：GGDNVGGKSLH
配列番号８３：DDRDRPS
配列番号８４：QVWDDISRLVI
配列番号８５：SYYIH
配列番号８６：IINPRGGGTDFAQKFQG
配列番号８７：GDCTNGVCYSGGLDV
配列番号８８：SGSSSNIGNNYVS
配列番号８９：DNDKRPS
配列番号９０：GTWDNSLSGV
配列番号９１：DYAMH
配列番号９２：GISWNSGSIGYADSVKG
配列番号９３：DVDLWFGEYYFDY
配列番号９４：SGSSSNIGNNYVS
配列番号９５：DNNKRPS
配列番号９６：GTWDSSLSAPYV
配列番号９７：DYAMY
配列番号９８：GINWNSAIIGYADSVKG
配列番号９９：EALYYSAFFDS
配列番号１００：SGSSSNIGNNYVS
配列番号１０１：DNNKRPS
配列番号１０２：GTWDSSLSAWV
配列番号１０３：DYAMH
配列番号１０４：GINWNGGSTDYADSVEG
配列番号１０５：DYADLGSGSDY
配列番号１０６：SGSRSNIGSNYVH
配列番号１０７：RNDQRPS
配列番号１０８：ASWDDKMSGRL
配列番号１０９：SYEMN
配列番号１１０：YISSSGSTIYYADSVKG
配列番号１１１：HSNYDILTGYSTDAFDI
配列番号１１２：TGTSSDIGFYDSVS
配列番号１１３：DVSNRPS
配列番号１１４：TSNTKTNTLYV
配列番号１１５：RGNYWWT
配列番号１１６：SVHYSGSTNYNPSLKS
配列番号１１７：DSDYGDYYFDY
配列番号１１８：QGDSLRSYYAS
配列番号１１９：GKNNRPS
配列番号１２０：NSRDSSGNHVV

実施例３：抗ＴｆＲファージ抗体のＴｆＲ反応性確認
（１）免疫沈降
更に上記２０種類のファージ抗体がヒトＴｆＲを認識することを確認するために、免疫沈降及びウエスタンブロットを行った。２０種類のファージを大腸菌に感染させ、培養上清の回収・精製により精製ｓｃＦｖ抗体を取得した。ＧｌａｓｓＦｉｌｔｅｒにＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ１ｍＬに対し抗体５ｍｇを固相し、抗体ビーズを作製した。次に、１０ｃｍ³ｄｉｓｈで培養したＳＫＯＶ−３細胞を回収し、細胞ｌｙｓａｔｅ６００μＬを調製した。６０μＬのｂｉｏｔｉｎを細胞ｌｙｓａｔｅ６００μＬに入れ、抗原をビオチン化した。作製した抗体ビーズ溶液１５０μＬとビオチン化した細胞ｌｙｓａｔｅを２ｍＬチューブに入れ、4℃６時間撹拌した。チューブを遠心（５５００ｇ,１分, ４℃）し、上清を除き、洗浄用バーファー(０．５ｍＭＢｉｏｔｉｎ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ)８００μＬを入れ、遠心によりビーズを洗浄した。ビーズの洗浄を３回繰り返した後、溶出用クエン酸液（５０ｍＭクエン酸ｐＨ２．５）を３０μＬ加え、撹拌したのち、遠心（５５００ｇ,１分, ４℃）し、上清を回収することにより免疫複合体を溶出した。溶出作業を３回繰り返し、上清を回収した。３ＭＴｒｉｓの添加により中和し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで電気泳動を行った。SDS-PAGEにて泳動し、銀染色にてバンドの確認を行った。このサンプルについて同時にストレプトアビジン−HRP（Anti-Streptavidin, IgG Fraction, Conjugated to Peroxidase CORTEX biochem 社）を使用したウエスタンブロットも行った。その結果、図１に示したように、それぞれの抗体（ＴｆＲ００１、ＴｆＲ００３，ＴｆＲ００５）が分子量約９０ＫＤの蛋白質と結合していることが確認された（ＴｆＲの分子量は約９０ＫＤ）。

（２）質量分析
続いて、免疫沈降法により得られた抗原タンパクの質量分析を行った。
検出された膜蛋白に対応する部分をゲル内でトリプシン消化し、ペプチドを回収した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を常法に従い行い、クマシーブリリアントブルーで染色することで得られたバンドを切り出した。これを２00mM重炭酸アンモニウム-50%アセトニトリル溶液に浸し、３7℃で45分間振盪後、溶液を廃棄して、同じ操作を２回繰り返すことでクマシーブリリアントブルーを除いた。このゲルを減圧乾燥し、それに40mM重炭酸アンモニウム(pH8.１)-１0%アセトニトリルに溶かしたトリプシン（２0μg/ｍＬ）をゲルスライスの単位面積（mm２）あたり4μＬ加えて、室温で１時間置いて充分に浸潤させた。これに先に加えた量の２.5倍量のトリプシン溶液を加えて、３7℃で１8時間静置した。これをポアサイズが0.２２μmのフィルター付きチューブで濾過して、トリプシンにより抗原が切断されて生じたペプチドを回収した。

ゲル内トリプシン消化により得られた試料を、エレクトロスプレーイオン化方式イオントラップ四重極型質量分析装置につないだHPLCにかけた。HPLCの逆相クロマトグラフィーカラムから、0.１%TFAを含む0%から80%のアセトニトリルの直線濃度勾配変化により、疎水性の違いで順次溶出される各ペプチドをエレクトロスプレー法でイオン化し、各ペプチドの質量及び内部アミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸内部配列のセットを、公開されているＴｆＲアミノ酸配列データベースを用いて検索した。その結果ファージ抗体がＴｆＲに結合することが確認された。

実施例４：ファージ抗体（ｓｃＦｖ）のIgG化
（１）ＴｆＲ００６ＩｇＧ抗体を発現するｐｌａｓｍｉｄの作製
ファージ抗体のIgG化はＴｆＲ００６のＩｇＧ化を例として下記のように説明する。他の抗体について同様な手法でＩｇＧ化した。

ＴｆＲ００６のファージ抗体（ｓｃＦｖ）の遺伝子はＶＨ-ＶＬの順で並んでおり、ＶＨとＶＬはリンカー（配列番号１２１）で接続したｓｃＦｖの構造をしている。

ＶＨはＶ、Ｄ、Ｊの３遺伝子から、ＶＬはＶＪの２遺伝子から構成されている。ヒトの軽鎖λの場合、Ｊλ（λ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）遺伝子とCλ（λ ｃｏｎｓｔａｎｔ）遺伝子は並列に5セットが並んでおり、Ｊ4-CL4とＪ5-CL5は偽遺伝子である（図２）。

ＴｆＲ００６のＶＨ,ＶＬで使用していると推定されるヒト生殖系列の遺伝子をＩＭＧＴ (*)で検索した結果を表２で示す。
(*) ＩＭＧＴ : http://www.imgt.org

ＩＭＧＴの検索結果を参考にして、ファージ抗体のＩｇＧ化をおこなった。ＴｆＲ００６のＶＨをヒトG１の定常領域（配列番号１２２）と、ＴｆＲ００６のＶＬはＩＧＬＪ３遺伝子と並列に並んでいるＩＧＬＣ３（配列番号１２３）と接続した遺伝子をGenScript社で全合成した。全長人工合成に際してコドン使用頻度の最適化（Kimら、Codon optimization for high-level expression of human erythropoietin in mammalian cells、Gene、Vol １99、１997、p２9３-３0１の方法に従った）をおこない、効率的な翻訳のためのＤＮＡ配列（Kozak、At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells、J Mol BioｌＶol １96、p947-950、１987）、およびヒト抗体重鎖サブグループ３のシグナルペプチドのコンセンサス配列（配列番号１２４）を分泌用のシグナルとして重鎖、および軽鎖遺伝子の5'側に付加した。また、合成する重鎖、軽鎖遺伝子の両端には5'側にNheIを、３'側にEcoRIを発現ベクターに組み込むために付加した。

抗体遺伝子の発現ベクターはpCAGGS（Niwaら、Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector、Gene、Vol １08、p１9３-２00）を使用し、このベクターのHindIII部位に遺伝子増幅用にマウスDHFR遺伝子発現領域を挿入した。

（２）ＴｆＲ００６ＩｇＧ抗体の一過性発現
ＴｆＲ００６ＩｇＧ抗体の一過性発現にはＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（ライフテクノロジーズ）を用いた。遺伝子導入用浮遊細胞である２９３-Ｆ（ライフテクノロジーズ）は前日に継代した。トランスフェクション当日１ｘ１０⁶細胞／ｍＬの細胞濃度に調整した４００ｍＬの細胞懸濁液を準備した。これにＴｆＲ００６重鎖発現ベクターを１００ μｇ、ＴｆＲ００６軽鎖発現ベクターを１００μｇ合計２００μｇのプラスミドをＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭに懸濁した溶液（Ｉ）を調整した。次に２００μＬのＭＡＸｒｅａｇｅｎｔを８ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯＳＦＭに加えた（溶液ＩＩ）。溶液（Ｉ）と（ＩＩ）を混合して室温で１０分から２０分静置した。この合計１６ｍＬの反応液を２９３-F細胞を懸濁した４００ｍＬの２９３発現培地に加え、６日から７日間３７°C、８％ＣＯ₂で細胞培養震盪機のＴＡＩＴＥＣＢｉｏＳｈａｋｅｒＢＲ-４３ＦＬで培養した。６日から７日間後、ＴＦＲ００６組換え抗体を含む培養上清を回収し、これを材料に精製をおこなった。

（３）ＴｆＲ００６ＩｇＧ抗体の安定性生産株の樹立
ＣＨＯｄｈｆｒ（-）細胞(G. Urlaubら、Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, p4２１6-4２２0, １980)を用いて、２種類のプラスミド（アンピシリン耐性遺伝子内のＰｖｕＩでプラスミドを切断して環状プラスミドから線状プラスミドにした）すなわち、ＴＦＲ００６Ｌ鎖を発現するためのｐＣＡＧＧＳ-ＩＧL-ＣＭＶ-ｄｈｆｒ-Ａベクター、および、ＴＦＲ００６Ｈ鎖を発現するためのｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨ-ＣＭＶ-ｄｈｆｒ-Ａベクターにより同時形質転換した。エレクトロポレーションはロンザ社製のＡｍａｘａでおこなった。ＤＮＡ（Ｌ鎖、Ｈ鎖各プラスミドにつき０．００２ｍｇ／試料）を３ｘ１０³細胞の０．１ｍＬのＡｍａｘａエレクトロポレーションＣＨＯ用緩衝液に加えて電気パルスを与えた。

エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％の透析済みＦＢＳを含有し、ＨＴ（Ｈ：ヒポキサンチン；Ｔ：チミジン）を含まないＩｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）に加えた。遺伝子導入から３日後、１０％透析ＦＢＳ、２ｍＭＬ-グルタミン、ＨＴを含まないＩＭＤＭに培地を交換して１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８でｎｅｏ＋形質転換細胞の選択をおこない、ＴｆＲ００６ＩｇＧ抗体産生陽性細胞株クローンを得た。次に、Ｇ４１８で選択されたクローンを用いて遺伝子増幅をおこなった。０．２５ｍＭ、１ｍＭの２ラウンドのメソトレキセート（ＭＴＸ）中での増幅の後、１リットルあたり約５０ｍｇのＴｆＲ００６ＩｇＧ抗体を産生する細胞株を樹立した。

（４）ＴｆＲ００６ＩｇＧ抗体の精製
一過性で発現した培養上清、あるいは安定発現株の培養上清に含まれるＴｆＲ００６ＩｇＧ抗体タンパク質は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅを用いたＡｂ-ＣａｐｃｈｅｒＥｘＴｒａ（プロテノバ）アフィニティーカラムで精製した。得られたピークフラクションは、溶媒としてダルベッコのＰＢＳで平衡化したセファクリルＳ-３００カラムによるゲルろ過をして、さらに精製した。精製したＴｆＲ００６ＩｇＧ抗体タンパク質の定量は、吸光係数を用いて算出した。ＴｆＲ００６ＩｇＧ抗体の吸光係数はＥＸＰＡＳＹのＰｒｏｔＰａｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）にＴｆＲ００６の全アミノ酸配列を用いて計算してε＝１．６０７を求めた。

（５）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるＴｆＲ００６ＩｇＧ抗体の定量
ＴｆＲ００６ＩｇＧ抗体生産細胞の培地上清に含まれる抗体や、精製した抗体の濃度は、吸光度による定量とともに、酵素免疫測定法（ELISA）による定量もおこなった。固相抗体としてプレートにヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）（コスモバイオ：ＡｍｅｒｉｃａｎＱｕａｌｅｘＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．；ＡＱＩ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ-１１０ＵＤ）を１００μｌ／ｗｅｌｌ（５μｇ／ｍＬの濃度）で加えて４℃で一昼夜静置した。次にブロックエースを２００μＬ／ｗｅｌｌで加えて室温で１時間ブロックした後、試料の抗体を段階希釈し、各ｗｅｌｌに加えて１時間インキュベーションして反応させた。ＰＢＳＴ(０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ)で５回洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）-ＨＲＰ（コスモバイオ：ＡＱＩ，Ｃａｔ．Ａ-１１０ＰＤ）をＰＢＳＴで１００００倍希釈した検出抗体溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌの割合で加えた。１時間インキュベーション後、ＰＢＳＴで5回洗浄してから基質緩衝液TMBを１００μL/ｗｅｌｌの割合で加えた。室温暗所で１5分間インキュベーションした後、反応停止液を１００μL/ｗｅｌｌの割合で加えて反応を停止してから、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準品として精製ヒトＩｇＧを用いて検量線を作成し、これを用いてヒト抗体の濃度を算出した。

実施例５：ＩｇＧ化したＴｆＲ抗体の反応性
ＴｆＲ発現細胞２株、Ｋ５６２（ＡＴＣＣＣＣＬ−２４３：ＣＭＬ）、ＭＩＡＰａＣａ−２（ＡＴＣＣＣＲＬ−１４２０：膵癌）を用いて、ＩｇＧ化した抗ＴｆＲ抗体の反応性を検討した。K５６２細胞を遠心により回収した。ＭＩＡＰａＣａ−２は２ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢＳで剥離し、遠心により回収した。回収した細胞をそれぞれＰＢＳで１回洗浄し、その後、ＦＡＣＳＢｕｆｆｅｒ（１％ＢＳＡ，２ｍＭＥＤＴＡ，０．１％ＮａＮ３入りＰＢＳ）で細胞を１×１０⁶／ｍＬなるように懸濁しに。この細胞懸濁液１００μＬを９６- ｗｅｌｌＶ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ３８９７）に分注し、さらにＴｆＲ００１ＩｇＧ抗体、ＴｆＲ００５ＩｇＧ抗体、ＴｆＲ００６ＩｇＧ抗体をＦＡＣＳＢｕｆｆｅｒで１〜０．０１μｇ／ｍＬに調製し、それぞれの抗体溶液１００μＬを細胞に添加した、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣS Ｂｕｆｆｅｒにより２回洗浄した後、ＦＡＣＳＢｕｆｆｅｒで７５０倍に希釈したＡｌｅｘａ−ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＩｇＧ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）溶液１００μＬを添加し、攪拌した後更に４℃で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳＢｕｆｆｅｒで遠心により２回洗浄し、ＦＡＣS Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）のＨＴＳにセットして各ｗｅｌｌのＦＬ１蛍光強度を測定した。図３に示すように、各抗体（a:５００ｎｇ/ｍＬ；ｂ：５０ｎｇ/ｍＬ；ｃ：５ｎｇ/ｍＬ）がＫ５６２及びＭＩＡＰａＣａ−２と強い反応性を示した。Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＩｇＧ（1μg/ｍＬ）及びａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＴｆＲ（1μg/ｍＬＭＢＬＤ２５９−３）はそれぞれｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ、ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌとして使用した。

実施例６：ＩｇＧ化したＴｆＲ抗体のｉｎｖｉｔｒｏ増殖抑制効果
ＴｆＲ発現細胞１３株、Ｒａｍｏｓ（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５９６）、Ｋ―５６２（ＡＴＣＣＣＣＬ−２４３）、ＮＣＩ−Ｈ３５８（ＡＴＣＣＣＲＬ−５８０７）、Ａ５４９（ＡＴＣＣＣＣＬ−１８５）、ＭＩＡＰａＣａ−２（ＡＴＣＣＣＲＬ−１４２０）、ＰＫ−４５Ｐ（東北大学加齢医学研究所ＴＫＧ０４９３）、ＫＬＭ−１（ＲＣＢ）、Ａ４３１（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５５５）、ＤＵ１４５（ＡＴＣＣＨＴＢ−８１）、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣＨＴＢ−３８）、ＢＦＴＣ９０５（ＤＳＭＺＡＣＣ３６１）、ＭＫＮ４５（ＪＣＲＢＪＣＲＢ０２５４）ＭＴ−２を２５００〜１００００／ｍＬ密度になるよう培養液で調製し、９６ｗｅｌｌ平底プレート（ＮＵＮＣ１６７００８）に１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ₂、９５％空気で２４時間培養した後、２０μｇ／ｍＬ〜１．５２ｎｇ／ｍＬのＴｆＲ００６抗体希釈系列を作製し、その１００μＬを、培養中のプレートに添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ₂、９５％空気で９６時間培養した。培養終了後、プレートを１２００ｒｐｍ３分間遠心し、静かに上清を抜き取った後、ＰＢＳ１００μＬを添加した。再び遠心し、ＰＢＳを９６ｗｅｌｌＶ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ３８９７）に分取した後、０．２５％ＴｒｙｐｓｉｎＥＤＴＡ５０μＬを添加し、細胞を剥離した。ピペッティングで攪拌してから細胞全量をＰＢＳ入りのＶ底プレートに移し、さらに培養液５０μＬでｗｅｌｌを洗い、その全量をＶ底プレートに移した。このＶ底プレートをＦＡＣS Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）のＨＴＳにセットし、攪拌後、各ｗｅｌｌあたり４０μＬを吸引させて、その全量について細胞数の測定を行った。得られた細胞数×５を、１ｗｅｌｌあたりの細胞数とした。各濃度の抗体添加による増殖率を下記の計算式で算出した。ＭａｓｔｅｒＰｌｅｘ２０１０ソフトウエア（日立ソリューションズ）を使用して、増殖率５０％を示す抗体濃度（ＩＣ５０）を求めた。その結果、各抗体が強い細胞増殖抑制効果を示した。それぞれのＩＣ５０を表３に示す。
増殖率＝細胞数（抗体添加）/細胞数（抗体なし）Ｘ１００％

実施例７：ゼノグラフトモデルにおける抗腫瘍効果
ヒト抗ＴｆＲ抗体の抗腫瘍効果を、下記それぞれのＴｆＲ陽性発現癌細胞株を移植したゼノグラフトで確認した。

以上の細胞は上記表４に示したそれぞれの培養液で培養した。移植時それぞれの細胞をＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、ＳＣＩＤマウス（メス、７週齢、日本クレア)の右腹側部皮下に５×１０⁶個／マウスとなるように上記それぞれの癌細胞懸濁液１００μＬ／匹で移植した。移植後、ノギスによる腫瘍径を測定し、下記の式により体積を求めた。腫瘍平均体積が１５０ｍｍ³以上に至る時点で、群分けソフト（ＥＸＳＡＳｖｅｒｓｉｏｎ７．６シーエーシ）により一種類の癌細胞担癌につきマウスを二群（ｎ=５）になるように群分けを行った。抗体投与群にＰＢＳで希釈したＴｆＲ００６抗体をマウス一匹あたり１５ｍｇ/ｋｇになるように尾静脈より投与した。陰性コントロール群に０．２ｍＬ/２０ｇマウスでＰＢＳを尾静脈より投与した。投与は、週２回（３日または４日毎）、合計６回行った。投与後週２回ノギスによる腫瘍径の測定を行い、各群の腫瘍体積を求めた。抗腫瘍効果の判定は腫瘍体積により判定した。
腫瘍体積は下式にて算出した。
腫瘍体積＝（短径）²× 長径 × ０．５

各群の腫瘍体積の平均値の経時的変化を図４に示す。いずれの癌細胞株ゼノグラフトモデルにおいて、抗体の投与群は腫瘍増殖の抑制が認められた。この結果から、ＴｆＲ００６抗体はさまざまな癌細胞に対し強い増殖抑制効果を有することが示唆された。

実施例８：ＡＴＬモデルにおける抗ＴｆＲ抗体の抗腫瘍効果
ＡＴＬ細胞株ＭＴ−２細胞を１０％ＦＢＳ添加したＲＰＭＩ１６４０培養液で培養した。移植時遠心により細胞を回収し、細胞を１×１０⁸/ｍＬになるようにＲＰＭＩ１６４０に懸濁した。この細胞懸濁液と同量のＭａｔｒｉｇｅｌ（ベクトンディッキンソン）を混ぜ、ＮＯＧ/Ｊｉｃマウス（メス、７週齢、動物実験中央研究所)の右腹側部皮下に移植した。移植後、週二回ノギスにより腫瘍径を測定し、腫瘍平均体積が１５０ｍｍ３前後に到達した時点で、腫瘍体積に対する無作為化割付により、マウスを１群あたり５匹、４群になるよう割付けを行った。３群にはＴｆＲ００６抗体を１５ｍｇ/ｋｇ群、５ｍｇ/ｋｇ群、１．５ｍｇ/ｋｇ群でそれぞれ尾静脈投与し、残りの１群には陰性コントロールとして、０．２ｍＬ/２０ｇマウスでＰＢＳを尾静脈より投与した。投与は、週２回（３日または４日毎）、合計６回行った。投与後も割付け前と同様に、週２回ノギスによる腫瘍径の測定を行い、各群の腫瘍体積を求めた。抗腫瘍効果の判定は最終測定日の腫瘍体積について、ＰＢＳ群をコントロールとしたパラメトリックＤｕｎｎｅｔ多重比較検定により判定した。
腫瘍体積は下式にて算出した。
腫瘍体積＝（短径）²× 長径 × ０．５
また、無作為化割付および、多重比較検定は生物実験データ統計解析ソフトＥＸＳＵＳ（株式会社シーエーシー）を用いて行った。
各群の腫瘍体積の平均値の経時的変化を図５に示す。図５に示したように、腫瘍の増殖は、ＴｆＲ００６抗体により用量依存的に抑制された。

実施例９：臨床検体を用いた免疫染色
（１）切片作製
摘出された肺癌組織は５ｍｍ×５ｍｍ×１０ｍｍほどの大きさにし、４℃の４％ＰＦＡ/０．０１％グルタールアルデヒド/０．１Ｍカコジル酸バッファーに入れ（ＰＦＡは和光純薬、グルタールアルデヒドは関東化学、カコジル酸ナトリウムはＳＩＧＭＡ）、電子レンジ（ＳＨＡＲＰ）を用いてマイクロウェーブ固定した後に、同固定液にて４℃で１時間再固定した。それから１０％ｓｕｃｒｏｓｅ/ＰＢＳに移し４℃にて４時間浸漬後、１５％ｓｕｃｒｏｓｅ/ＰＢＳに置換して４℃にて４時間浸漬したのち、２０％ｓｕｃｒｏｓｅ/ＰＢＳに置換して４℃にて一晩浸漬させ、ＯＴＣｃｏｍｐｏｕｎｄにて包埋、ドライアイス・ヘキサン中で急速に凍結した。これを、クリオスタット（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ２８００ＦＲＩＧＣＵＴＥ）にて４μmの厚さに薄切し，シランコートスライドガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）に貼り付け、冷風ドライヤーにて３０分風乾した。

（２）染色
切片を貼付したスライドガラスは、ＰＢＳの中で５分間ずつ３回浸漬し親水化を行った。次に５０μＬの０．３％Ｈ₂Ｏ₂/０．１％ＮａＮ₃を滴下し、室温にて１０分間反応させ内因性ペルオキシダーゼのブロッキングをおこなった。その後、ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄し、２％ＢＳＡ2/ＰＢＳに入れ、室温で10分間非特異反応のブロッキングをした。余分な液を落としファージ抗体ＴｆＲ００６（５０μＬ）を滴下し，室温にて1時間反応させた。ＰＢＳで3回洗浄後、５μg/ｍＬの抗ｃｐ3ウサギ抗体50μＬを滴下し、室温にて４５分間二次抗体反応をさせた。ＰＢＳで3回洗浄後、パーオキシダーゼ標識デキストラン結合抗ウサギイムノグロブリン・ヤギポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ）50μＬを滴下して、室温にて３０分間三次抗体反応を行った。ＰＢＳで3回洗浄後、50μＬのＤＡＢ・Ｈ₂Ｏ₂発色液を滴下し、褐色に発色後、蒸留水を満たしたバットに移して反応を停止させた。その後１０分間水洗したのち、ヘマトキシリンによる核染後，脱水・透徹し、マリノールにて封入し、顕微鏡の下で観察した。図６に示したように、本抗体が肺癌の癌細胞に反応するが、非癌細胞に反応しない。

Claims

配列番号３１の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、配列番号３２の重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、配列番号３３の重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDRを有する重鎖可変領域と、配列番号３４の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、配列番号３５の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、配列番号３６の軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDR有する軽鎖可変領域とを有する抗体である、ヒトＴｆＲと特異的に反応する抗体。
重鎖の定常領域が、配列番号１２２のアミノ酸配列であり、軽鎖の定常領域が、配列番号１２３のアミノ酸配列である、請求項１に記載の抗体。
抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')₂、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化V領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、請求項１から３の何れか１項に記載の抗体。
請求項１から４の何れか１項に記載の抗体をコードするＤＮＡ。
請求項５に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
請求項６に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
請求項７に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１から４の何れか１項に記載の抗体を生成蓄積させ、培養物から抗体を採取することを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
請求項１から４の何れか１項に記載の抗体を有する医薬組成物。
抗体に細胞傷害性物質が結合している、請求項９に記載の医薬組成物。
細胞傷害性物質が薬剤、毒素、又は放射性物質である、請求項１０に記載の医薬組成物。
抗がん剤として使用される、請求項９から１１の何れか１項に記載の医薬組成物。
がんが、固形がんまたは血液がんである、請求項１２に記載の医薬組成物。
固形がんが肺がん、大腸がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がんである、請求項１３に記載の医薬組成物。
血液がんが白血病、リンパ腫、骨髄腫である、請求項１３に記載の医薬組成物。
血液がんが成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）である請求項１３に記載の医薬組成物。