JP2008508904A - トランスフェリンレセプター抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
診断におけるその知られた使用のほかに、抗体は治療剤として有用であることがわかっている。例えば免疫療法、すなわち治療目的のための抗体の使用は癌を治療するために近年使用されている。受動免疫療法では癌の治療においてモノクローナル抗体を使用する。例えば非特許文献1を参照できる。これ等の抗体は腫瘍細胞の増殖または生存の直接の抑制および身体の免疫系の自然の細胞殺傷活性をリクルートするその能力の両方により、固有の治療上の生物学的活性を有することができる。これ等の因子は単独または放射線照射または化学療法剤と組み合わせて投与することができる。非ホジキンリンパ腫および乳癌の治療についてそれぞれ認可されているリツキシマブおよびトラスツズマブはそのような治療剤の2つの例である。或いは、抗体は、抗体が毒性の因子に連結され、そして、腫瘍に特異的に結合することによりその因子を腫瘍に指向させる、抗体コンジュゲートを生成するために使用できる。ゲムツズマブオゾガマイシンは白血病の治療のために使用される認可された抗体コンジュゲートの一例である。癌細胞に結合し、診断および治療のための潜在的用途を有するモノクローナル抗体が公開物に開示されている。例えば特に一部の分子量の標的タンパク質を開示している以下の特許出願、すなわち、特許文献1(200kD c−erbB−2(Her2)および大きさ40〜200KDの他の未知の抗原)および特許文献2(50kDおよび55kDの癌胎児タンパク質)を参照できる。臨床試験における、および/または、固形腫瘍の治療に関して認可された抗体の例はトラスツヅマブ(抗原:180kD、HER2/neu)、エドレコロマブ(抗原:40〜50kD、Ep−CAM)、抗ヒト乳脂肪小球(HMFG1)(抗原>200kD、HMWムチン)、セツキシマブ(抗原:150kDおよび170kD、EGFレセプター)、アレムツズマブ(抗原:21〜28kD、CD52)およびリツキシマブ(抗原:35kD、CD20)を包含する。
本発明の実施では、特段の記載が無い限り、当該分野で知られた分子生物学(組み換え手法を包含する)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の手法を使用する。このような手法は文献、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook et al.,1989)Cold Spring Harbor Press;Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984);Methods in Molecular Biology,Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press;Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press;Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993−8)J.Wiley and Sons;Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.);Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,1994);Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991);Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999);Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997);Antibodies(P.Finch,1997);Antibodies:a practical approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988−1989);Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000);Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999);The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995);およびCancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita et al.,eds.,J.B.Lippincott Company,1993)に詳細に説明されている。
「トランスフェリンレセプター」とは、本発明の抗体が対する相手となる約90kD〜100kDの分子量を有するポリペプチド抗原を指す。トランスフェリンレセプターは抗トランスフェリンレセプター抗体により決具される細胞表面タンパク質であり、そして結腸および十二指腸を包含する数種の正常組織および数種の型の癌に存在する。この抗原は1つより多い異なるエピトープを有する場合がある。抗体LUCA31が結合するヒトトランスフェリンレセプターの新しいエピトープは本明細書においてはLUCA31エピトープと称し、本発明において特に有利なものである。現時点では、トランスフェリンレセプターおよびLUCA31エピトープは該当正常組織対応物と比較して特定の癌細胞において過剰発現される場合があると考えられている。特定の実施形態においては、一般的にトランスフェリンレセプターの特性に言及する場合は特定して言及するものとする。
モノクローナル抗体の生成方法は当該分野で知られている。使用してよい1つの方法はKohler and Milstein,Nature 256:495−497(1975)の方法またはその変法であってよい。典型的には、モノクローナル抗体は非ヒトの種、例えばマウスにおいて形成する。一般的にマウスまたはラットが免疫化のために使用されるが、他の動物も使用してよい。抗体はヒトトランスフェリンレセプターを含有する細胞、細胞抽出液またはタンパク質調製物の免疫原性の量でマウスを免疫化することにより製造する。免疫原は例えば一次細胞、培養細胞系統、癌性細胞、核酸または組織であることができる。1つの実施形態において、培養されたヒト腫瘍細胞系統を使用する。別の実施形態においてはヒト膀胱または膵臓の先祖細胞を使用する。免疫化のために使用される細胞、例えばヒト胎児腎臓、膀胱細胞またはヒト膵臓先祖細胞は免疫原として使用する前の一定時間(少なくとも24時間)培養してよい。細胞(例えばヒト胎児腎臓、膀胱細胞またはヒト膵臓先祖細胞)はそれ自体として、または非変性アジュバント、例えばRibiと組み合わせて免疫原として使用してよい。一般的に細胞は免疫原として使用する際には未損傷のまま、好ましくは生存状態で保持する。未損傷の細胞は破壊された細胞よりも良好に、抗原が免疫化動物により検出されるようにする。変性または過酷処理用のアジュバント、例えばフロイントのアジュバントを使用することはヒト胎児腎臓または他の細胞を破壊する場合があり、従って推奨できない。免疫原は複数回、周期的間隔において、例えば週2回、週1回投与してよく、または、動物における(例えば組織組み換え体における)生存性を維持するような態様で投与してよい。実施例2は抗トランスフェリンレセプター抗体を形成するために使用される方法を説明しており、そして、トランスフェリンレセプターに結合する他のモノクローナル抗体を形成するために使用してよい。
数種の方法を用いてトランスフェリンレセプターに結合するポリペプチドおよびモノクローナル抗体をスクリーニングしてよい。「結合」とは、生物学的または免疫学的に該当する結合、すなわち免疫グロブリン分子がコードされている対象となる、または、ポリペプチドが指向されている対象となる独特の抗原に対して特異的な結合を指すものとする。非特異的標的に対して極めて高濃度で免疫グロブリンが使用される場合に起こりえる非特異的な結合を指すものではない。1つの実施形態において、モノクローナル抗体は標準的なスクリーニング手法を用いてトランスフェリンレセプターに対する結合に関してスクリーニングされる。この態様においては、抗トランスフェリンレセプターモノクローナル抗体が得られた。ブダペスト条約に従って、抗トランスフェリンレセプターモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマはPTA−6055のPatent Deposit Designationと共に2004年7月8日にAmerican Type Culture Collection(ATCC)10801 University Blvd.,Manassas VA 20110−2209に寄託されている。
数種の方法を用いて抗トランスフェリンレセプター抗体を特徴付けすることができる。1つの方法はそれが結合するエピトープを発見することである。エピトープマッピングは種々の入手元、例えばPepscan Systems(Edelhertweg 15,8219 PH Lelystad,The Netherlands)から販売されている。エピトープマッピングは抗トランスフェリンレセプター抗体が結合する配列を決定するために使用できる。エピトープは線状のエピトープである、すなわちアミノ酸の単一のストレッチ内に含有されることができ、或いは、単一のストレッチに含有されなくてもよいアミノ酸の三次元相互作用により形成されるコンホーメーションエピトープであることができる。種々の長さ(例えば少なくとも4〜6アミノ酸長)のペプチドを単離または合成(例えば組み換えによる)し、そして抗トランスフェリンレセプター抗体との結合試験に使用することができる。抗トランスフェリンレセプター抗体が結合するエピトープは細胞外配列より誘導したオーバーラッピングペプチドを用い、そして抗トランスフェリンレセプター抗体による結合を測定することにより、系統的スクリーニングにおいて決定することができる。
本明細書に記載した方法により生成されたトランスフェリンレセプターに対するモノクローナル抗体を用いて診断目的のために種々の組織、例えば卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、膵臓、皮膚、甲状腺、脳、心臓、肝臓、胃、神経、血管、骨および上部消化管における癌性細胞の存在または非存在を発見してよい。本明細書に開示した方法により生成されたトランスフェリンレセプターに対するモノクローナル抗体はまた固形腫瘍から放出された後に血中を循環している癌性の細胞の存在または非存在、またはその量を調べるために使用してよい。このような循環している抗原は未損傷のトランスフェリンレセプター抗原、または本発明に記載した方法で検出されるべき能力を温存しているそのフラグメントであってよい。このような検出は当該分野で一般的に使用されている標準的な方法を用いてFACS分析により行ってよい。
本発明は、また抗トランスフェリンレセプター抗体、抗トランスフェリンレセプター抗体から誘導したポリペプチド、抗トランスフェリンレセプター抗体をコードするポリヌクレオチド、および本明細書に記載した他の物質を含む薬学的組成物を包含する組成物も包含する。本明細書においては、組成物はさらに、トランスフェリンレセプター、トランスフェリンレセプターアゴニスト、アンタゴニスト、モジュレーターに結合する抗体、ポリペプチドおよび/またはタンパク質の1つ以上、および/または、トランスフェリンレセプターに結合する抗体、ポリペプチドおよびタンパク質の1つ以上をコードする配列を含むポリヌクレオチドの1つ以上を含む。
トランスフェリンレセプターに対するモノクローナル抗体は、癌または他の疾患を有する個体において治療目的のために使用してよい。抗トランスフェリンレセプター抗体を用いた治療では上記した通りインビトロおよびインビボの両方で複合体を形成することができる。1つの実施形態において、モノクローナル抗体抗トランスフェリンレセプターを癌性の細胞に結合させ、その増殖を低減することができる。抗体は生理学的(例えばインビボ)条件において結合を促進する濃度において投与するものとする。別の実施形態においては、トランスフェリンレセプターに対するモノクローナル抗体を結腸、肺、乳房、前立腺、卵巣、膵臓、腎臓および他の型の癌、例えば肉腫のような種々の組織の癌性の細胞に指向させた免疫療法のために使用できる。別の実施態様においては、モノクローナル抗体抗トランスフェリンレセプター単独を癌細胞に結合させて、その細胞分裂を低減することができる。別の実施形態においてはモノクローナル抗体抗トランスフェリンレセプターを癌性の細胞に結合させて、転移の発生を遅滞させることができる。さらに別の実施形態においては、癌を有する個体に抗トランスフェリンレセプター抗体を用いた待機的治療を行う。癌個体の待機的治療では、疾患の有害な症状または癌の進行に直接影響しない疾患に対して行われる別の治療に起因する医原性の症状を治療または縮小させる。これには疼痛の軽減、栄養補給、性的問題、心理学的苦痛、抑鬱、疲労、精神障害、嘔気、嘔吐等の治療が包含される。
組織または細胞培養物から単離した全細胞を特定の細胞型を代表する表面抗原に対して特異的であるモノクローナル抗体を生成するための免疫原として使用した。本発明の実施のために適するそのような方法は米国特許6,541,225に記載されている。一般的に特定の細胞型の細胞表面抗原に指向したモノクローナル抗体を生成するためには、その型の生存未損傷細胞で、好ましくは自身の表面が血清非含有である細胞で、非形質転換B細胞を免疫化することが望ましい。抗原トランスフェリンレセプター、例えば、LUCA31に対するモノクローナル抗体を生成するために適する細胞系統は、BT−474(ATCC#HTB−20)、MDA−MB−175VII(ATCC#HB−25)、MDA−MB−361(ATCC#HB−27)、SKBR3(ATCC#HTB−30)、SKMES−1(ATCC#HTB−58)、ES−2(ATCC#CRL−1978)、SKOV3(ATCC#HTB−77)、HPAFII(ATCC#CRL−1997)、Hs700T(ATCC#HTB−147)、Colo205(ATCC#CCL−222)、HT29(ATCC#HTB−38)、SW480(ATCC#CCL−228)、SW948(ATCC#CCL−237)、A498(ATCC#HTB−44)およびCaki−2(ATCC#HTB−47)を包含する。
非変性アジュバント(Ribi、R730、Corixa,Hamilton MT)をリン酸塩緩衝食塩水中2mlとなるように再水和させた。次にこの再水和アジュバント100μlを次に免疫化に使用する実施例1の細胞ペレットの一部と穏やかに混合した。マウス当たり約106個のヒト胎児腎細胞をBalb/cマウスに脚部手掌を介して概ね週1または2回注射した。厳密な免疫化の日程は、以下の通りとした。第0日、免疫化+Ribi。第3日、免疫化+Ribi。第7日、免疫化+Ribi。第24日、免疫化−Ribi。第29日、免疫化−Ribi。第32日、免疫化−Ribi。第36日、免疫化−Ribi。第44日、免疫化−Ribi。第51日、免疫化−Ribi。第69日、力価試験用採血。第71日、免疫化+Ribi。第74日、免疫化+Ribi。第81日、免疫化+Ribi。第91日、灌流ブースト(Ribi非存在)。第104日、融合用の結節回収。
SKMES−1、786−OおよびColo205細胞系統などを包含するヒト癌細胞を10.0mMのEDTAの存在下に組織培養フラスコから脱着させ、5分間1400rpmで遠心分離し、1%BSAおよび2mM EDTAを含有するPBS(FACS希釈液)中に再懸濁した。細胞を計数し、107個/mlに調節した。約0.1mlの細胞を37℃で30分間100μlのFACS希釈液と共にインキュベートした。ヒト癌細胞系統に結合するモノクローナル抗体をタンパク質Gアフィニティークロマトグラフィーを用いて組織培養上澄みから精製した。抗体精製過程には以下の物質、すなわち、ハイブリドーマ組織培養上澄み、Immunopure(G)IgG結合緩衝液(Pierce #21011 Rockford,IL)、Immunopure IgG溶出緩衝液(Pierce #21009)、濃塩酸(pH調節用)、Corning 1リットルPES(ポリエーテルスルホン)、0.22μmフィルター(Corning #431098、Corning,NY)、Amersham Pharmacia AKTA Explorer System(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)、タンパク質Gセファロース4 Fast Flow(Amersham Biosciences #17−0618−03)、3Mチオシアン酸カリウム/50mM Tris pH7.8およびPBS(リン酸塩緩衝食塩水)、3M Tris pH9.0からなるストリッピング緩衝液を使用した。
材料および方法のセクションで列挙した変性オリゴを用いたRT−PCRによれば、重鎖に対してMVHfwd9と共にMVHrev1およびrev2を用いて個別のバンドが得られた。軽鎖に対しては、MVHfwd2およびfwd5にMVLrevを組み合わせて生成物を得た。使用したPCRプログラムはTopoクローニングにおいて使用するための72℃における10分間インキュベートとした。PCR産物は製造元のプロトコルに従ってpCR2.1 Topo TAクローニングベクターにライゲーションした。各ライゲーションの20コロニーをミニプレップで釣菌し、正しいサイズのインサートを有するものをM13およびM13revを用いた配列決定のためのマイクロ化学法に付した。
MVLrevおよびMVLfwd2を用いて生成したLUCA31のLCは不完全なV領域を有していた。MVLfwd5を用いて生成したLCは完全であった。クローン5.19をクローニングの次の工程における鋳型として使用するために選択した。PCRプライマーはVL領域の5’末端にHindIII部位および至適Kozakおよび3’末端にBbsI部位を取り込むように設計した。
MVHrev1およびrev2は相互に僅かにずれが合ったことから、LUCA31.HC PCR産物はその3’末端においてのみ異なっていた。コンセンサス配列を生成し、2つの希少なコドンを含有させるがこれ等の部位においてDNA配列は明確である。クローン9R1.1をクローニングの次の工程における鋳型として使用するために選択した。PCRプライマーはVH領域の5’末端にHindIII部位および至適Kozakおよび3’末端にNheI部位を取り込むように設計した。
pDEF14オールインワン発現ベクターは19.7kbのpDEF14 NotI−XbaIベクターフラグメントを3.4kbのBglII−XbaI pDEF2B/Luca31.LC軽鎖フラグメントおよび6.5kb NotI−BamHI pICFSP/Luca31.G1にライゲーションしてpDEF14/Luca31.1を生成することにより生成した。
コンティグ「コンセンサスアライメントTopo LC5」の総括図
腎細胞癌の細胞SW480(ATCC#CCL−228)を175cm2の培養皿上でコンフルエントとなるまで増殖させた。コンフルエントの単層をHank’s Balanced Salt Solution(重炭酸ナトリウムまたはフェノールレッド非含有のHBSS+、10mM HEPESで緩衝、pH7.4;Sigma Chemicals)で3回洗浄し、室温で30分間スルホ−NHS−LC−ビオチン(Pierce Endogen)200μgでビオチニル化した。次に細胞を0.1M Tris含有のHBSS+、pH7.4(Sigma Chemicals)で洗浄し、室温で15分間0.1M Tris含有HBSS+、pH7.4中でインキュベートした。最後に細胞をHBSS+で3回洗浄し、そして溶解緩衝液(2% Triton X−100、2mM PMSF、0.1%アジ化ナトリウムおよび溶解緩衝液5ml当たり1錠のEDTA非含有完全ミニプロテアーゼカクテル(Roche Molecular Biochemicals)を含有するHBSS+)中氷上で5分間インキュベートすることにより溶解した。
癌患者より得た凍結組織試料をOCT化合物に包埋し、ドライアイスを用いてイソペンタン中急速凍結した。低温切片はLeica 3050 CMミクロトームを用いて厚み8〜10μmとなるように切り出し、SuperFrost Plusスライド(VWR#48311−703)上に解凍搭載した。切片は75%アセトン/25%エタノールを用いて10℃で固定し、室温で2〜4時間風乾した。固定したセクションは使用時まで−80℃で保存した。
モノクローナル抗体LUCA31を使用して組織の種々の型に由来する種々の細胞系統に対する反応性を試験した。結果は弱い陽性染色に対しては「+」、中等度の陽性染色に対しては「++」、強度の陽性染色に対しては「+++」そして陰性染色に対しては「−」と評点した。
腫瘍細胞系統分布の分析。LUCA31エピトープ発現を結腸直腸癌、非小細胞胚癌および膵臓癌を代表する32のヒト腫瘍細胞系統のパネルを用いて評価した。標的細胞へのLUCA31の結合は内標準の抗体(抗EGFレセプター)に相対比較しながら測定し、データは平均蛍光強度の関数としてプロットした。LUCA31染色の分布は図2に示す通りである。エピトープ発現実験の結果によれば、LUCA31は細胞パネルにわたって広範な染色強度を示していた。
LUCA31抗体の生物学的活性を調べるために、本発明者等はトリチウム化チミジン取り込みを測定する本明細書に記載した細胞増殖試験においてこれを試験した。試験はFACSアレイにおいて呈示された32細胞系統と同様のもの、および、本抗体により認識されることを本発明者等が以前に示している別の5細胞系統に対して実施した。本発明者等は標準(10%)および低値(0.5%)の血清条件の両方を使用しながら活性について抗体を試験した。両方の血清条件を用いて活性を試験するという決定は低減された血清の条件を用いた場合に活性となるのみであるマウスEGFレセプター抗体225(セツキシマブのネズミ前駆体)を用いた実験に基づいたものであった。
LUCA31は正常(脳、結腸、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、小腸、脾臓)および腫瘍(乳房、結腸、肺、膵臓)の組織のパネルを用いて材料および方法で記載した通り評価した。染色はまず染色陽性としてRavenにより発見された組織を用いて至適化した。至適化の後、組織の免疫反応性をパーオキシダーゼコンジュゲート二次抗体を用いて評価し、強度を評点した。0.1ug/mlでLUCA31を用いた場合に得られたIHCデータの総括を表5に示す。LUCA31については正常組織における最強の染色は結腸および小腸において観察され、他の組織では限定的な染色が観察された。
LUCA31が反応性となる抗原を発見するために、免疫沈降(Ippt)実験を実施した。Ipptのためには、SW480細胞の175cm2フラスコ30本を溶解緩衝液30mlで溶解した。溶解緩衝液の組成は2% Triton X−100、プロテアーゼ阻害剤カクテル(溶解緩衝液5ml当たり1錠のRoche Molecular Biochemicals製の完全ミニEDTA非含有プロテアーゼカクテル)、0.1%アジ化ナトリウムおよび2mM PMSFを添加したHank’s Balanced Salt Solution(HBSS+)とした。細胞溶解物は4℃で30分間24000xgで清澄化した後に、1mlのタンパク質G(Amersham Pharmacia)からなるカラムを通過させた。予備清浄化したSW480溶解物を次に、4℃で2時間、タンパク質G吸収トランスフェリンレセプター(5μlのタンパク質Gと共に室温で30分間トランスフェリンレセプター10μgを予備インキュベートした)と共にインキュベートした。ビーズ(予備清浄化タンパク質Gビーズおよびタンパク質G吸収トランスフェリンレセプタービーズの両方)を次に3回溶解緩衝液で洗浄し、その後、30μlのSDS試料緩衝液(3%SDS、20%グリセロール、10mM DTT、2%ブロモフェノールブルー、0.1M Tris,pH8.0)で溶離した。25マイクロリットルの溶離液を次にSDS−PAGEで分割し、クーマシー染色により可視化した。5マイクロリットルの溶離液をSDS−PAGEで分割し、さらにウェスタンブロット用のニトロセルロースに転移させた。
LUCA31が結合する抗原は実施例11に記載する通り単離し、Kane et al.J Bio Chem.2002 June 21;277(25):22115−8,Epub May 06の方法に従ってTandem質量スペクトルに付した。タンパク質をSDS−PAGEで分離し、ゲルをコロイド状クーマシーブルー試薬(Invitrogen)で染色した。目的のタンパク質はトリプシンでゲル中消化した。トリプシン処理ペプチドはWu et al.,Nature 405:477−482(2000)に記載の通りイオントラップ質量スペクトル分析器(Thermo−Finnigan LCDQ DECA XP)上でマイクロキャピラリー液体クロマトグラフィーMS/MSにより配列決定した。この結果、トランスフェリンレセプターのフラグメントと合致する質量を有する1つのポリペプチドが得られた。
a.抗体競合分析。本発明者等はHCT15細胞への結合に関してLUCA31と競合する既知トランスフェリンレセプター抗体能力を評価した。この実験の結果を図4、AおよびBに示す。本発明者等はHCT15細胞に結合するビオチニル化LUCA31の能力は抗体42/6により完全に抑制され、そして、OVCA26、LUCA29およびKID21により部分的に抑制されたことを発見した。OVCA18抗体は細胞へのLUCA31の結合を増大させ、そして他のトランスフェリンレセプター抗体はLUCA31の結合に影響するようには観察されなかった。図4Bはネガティブの抗体1B7.11はLUCA31の結合に対する作用を有さず、そして、非ビオチニル化LUCA31はビオチニル化抗体の結合を完全にブロックすることを示している。これ等の観察結果に基づいて本発明者等はLUCA31はOVCA18抗体により安定化または誘導されるエピトープを認識し、そして、このエピトープはトランスフェリンの結合部位に機能的に連結されることを提案する。この観察結果を特に興味深いものとしていることは、OVCA18は細胞増殖も促進し(データ示さず)、そしてトランスフェリンの細胞への結合も促進する(以下の図6参照)という点である。総括すれば、これ等のデータは、LUCA31はトランスフェリンレセプターに結合しているという考えと合致しているが、トランスフェリンレセプター抗体のサブセットと結合部位を共有している関連因子に抗体が結合していたかもしれないという可能性を排除するものではない。
b.CHO細胞におけるトランスフェリンレセプターの発現。LUCA31のエピトープをさらに明確化するために、本発明者等は材料および方法において記載した通り完全長ヒトトランスフェリンレセプターをクローニングし、CHO細胞において発現させた。図5に示す通り、CHO細胞のLUCA31染色のFACS分析は二次抗体単独で観察された染色の水準と同等であった。これとは対照的に、トランスフェリンレセプターコンストラクトでトランスフェクトしたCHO細胞は二次抗体試薬と相対比較してLUCA31による実質的染色を示した。これ等のデータは抗体競合試験の結果と合わせると、LUCA31がトランスフェリンレセプターに直接結合することを示している。
c.推定作用機序。本発明者等の現時点でのデータはLUCA31はトランスフェリンレセプターに直接結合するが、トランスフェリンレセプターに特異的に結合するモノクローナル抗体(mAb)により共通して認識されないエピトープと相互作用するかもしれないという考えと合致している。トランスフェリンレセプター抗体は以前よりトランスフェリンレセプターのエンドサイトーシスの混乱を介して鉄の輸送を制限することにより、または、レセプターへのトランスフェリンの結合をブロックすることにより細胞の増殖をブロックすることが解っている。レセプターへの結合に関してLUCA31とトランスフェリンが競合するかどうかを調べるために、本発明者等はLUCA31とトランスフェリンの相互作用を細胞結合試験において調べた。トランスフェリンの漸増濃度は細胞へのLUCA31の結合に明確に影響しなかったが、基準物質のトランスフェリンレセプター抗体42/6の結合は低減した(図6A)。興味深いことに、LUCA31の添加により細胞へのトランスフェリンの結合は増大したが、基準物質の抗体42/6はトランスフェリンの結合を抑制した(図6B)。これ等の結果は、42/6とは異なり、LUCA31はトランスフェリンの結合と重複しない部位に結合することを示している。これは42/6が細胞へのLUCA31の結合を抑制するという観察結果を考慮すると興味深いことである。本発明者等はさらに、細胞へのLUCA31の結合に対するその作用を鑑みて、これ等の試験におけるOVCA18抗体の作用を検討した。LUCA31と同様、OVCA18抗体もまた細胞へのトランスフェリンの結合を増大させたが、その程度はより低値であった。
標的発現および分布。本発明者等のデータはLUCA31がトランスフェリンレセプター上に存在するエピトープに結合するという考えと合致していたため、本発明者等はトランスフェリンレセプターと比較しながらLUCA31エピトープの組織分布および発現を評価することが重要であると考えた。以前の試験によればLUCA31は肝臓、膵臓または脳の切片は染色せず、そしてこれらの組織は通常はトランスフェリンレセプターmAbにより認識されることが示されている。これから派生して、本発明者等はこれらの組織の各々の3試料を使用しながら、そして比較コントロール組織としての結腸も含めて、3種の既知のトランスフェリンレセプター抗体(H68.4、BERT9およびDF1513)およびLUCA31の染色パターンを分析した。この実験の総括を表6に示す。
赤血球、血小板および白血球のLUCA31染色の分析を実施することにより血液コンパートメント中の抗原発現を評価した。これらの細胞集団の何れにおいても染色は観察されなかった。これもまた単球およびリンパ球集団におけるトランスフェリンレセプター発現に関する公開された報告とは矛盾している。しかしながら、トランスフェリンレセプター発現は非増殖リンパ球と相対比較して刺激されたリンパ球において誘導されるため(Neckers & Cossman,Transferrin receptor induction in mitogen−stimulated human T lymphocytes is required for DNA synthesis and cell division and is regulated by interleukin 2(有糸分裂誘発物質刺激ヒトTリンパ球におけるトランスフェリンレセプター誘導はDNA合成および細胞分裂に必要であり、そしてインターロイキン2により調節される)、Proc Natl Acad Sci USA 80,3494−3498(1983))、本発明者等はLUCA31を用いながらPHAにより刺激されたTリンパ球の染色を調べることにより本発明者等の分析をさらに進めた(表8)。比較コントロールとして、本発明者等はトランスフェリンレセプター抗体LUCA29およびBERT9並びにリンパ球染色に関する標準物質としてアルファ2およびベータ1インテグリン抗体を使用した。組織試料の本発明者等の分析とは異なり、本試験においてはLUCA31と他のトランスフェリンmAbとの間の差は観察されなかった。
−特段の記載が無い限り、全集団は記載された染色水準を有していた。
−「sub」という略記はある特定のサブ集団が活性を示し、残余が陰性であったことを示す。
−「B」細胞は本表ではCD3陰性リンパ球を表す。
−「T」細胞は本表ではCD3陽性リンパ球を表す。
本分子の活性をさらに十分特徴付けするため、本発明者等は異種移植片腫瘍モデル(ヒト異種移植片細胞パネル)において有効化されている細胞のパネルを試験し、そして、抗体が単独で、そして化学療法剤と組み合わせて高度に活性であることを明らかにした。本発明者等はLUCA31がトランスフェリンレセプターと相互作用することを示しているため、本発明者等は十分試験されたIgAトランスフェリンレセプター抗体42/6(Trowbridge & Lopez,1982)と相対比較した場合のその活性を基準とした。表10に示す通り、LUCA31は本発明者等が優先した異種移植片パネルにおける細胞系統全てにおいて活性であり、抗トランスフェリンレセプター抗体42/6と良好な同等性を示していた。
LUCA31の作用機序をさらに明確化するために、本発明者等は細胞周期を経るHCT15細胞の過程に対しどのように抗体が影響するのかを調べた。図9に示す通り、24時間LUCA31をHCT15細胞に投与したところ、2N含有(G1)細胞の比率が低下し、S期停止と合致するDNA含量を有する細胞の集団が増大した。さらに又LUCA31を投与したHCT15細胞は細胞死と合致するDNA含量<2Nの細胞集団の増大を示した。この作用は投与コントロール抗体や未投与の細胞では観察されなかった。これ等のデータはLUCA31がHCT15細胞のサブ集団において細胞増殖停止ではなく細胞死を誘導し、そして、LUCA31曝露に対してこれらの細胞が最も感受性である根拠を与えることを示唆している。
別の腫瘍型における本分子の潜在的活性を調べるために、前立腺(DU145、LNCap)および乳房(MCF7、MDA−MB−231、MDA−MB−435、ADR−Res)から誘導した固形腫瘍細胞系統においてLUCA31を試験した(図10)。LUCA31エピトープの発現は細胞系統の各々において同様であったが、LUCA31はMCF7細胞において最も活性であるように観察された。これらの結果は結腸、肺および膵臓の癌を用いて得られたデータに匹敵するものであった。
単層として増殖させた場合のインビトロの細胞数を低減させる抗体の能力は被験またはコントロールの精製抗体の種々の量の存在下または非存在下において増殖させた細胞単層を用いて評価することができ、そして細胞数の変化はMTTを用いて評価できる。MTTはミトコンドリア酵素の活性を測定する染料であり、そして相対的生細胞数と相関している。96穴プレートに10%ウシ胎児血清を添加したF12/DMEM(1:1)増殖培地中に目的の細胞をプレーティングして増殖させた。以下の細胞系統を96穴のディッシュの3連のウェル中に以下の密度、すなわち786−O、Colo205、MDA−MB−175VIIおよびSKMES−1をそれぞれ1800、1500、2500および1500個/ウェルでプレーティングした。プレーティング直後にLUCA31を添加した。細胞は5日間5%CO2/空気において湿潤インキュベーター中で37℃でインキュベートした。試験終了時にMTTをPBSに溶解(5mg/ml)し、1:10希釈度でウェルに直接添加した。プレートは4時間インキュベーターに戻した。インキュベーションの後、培地を除去し、100μlのDMSOを添加してMTT沈殿物を溶解した。プレートはOD540nmで読み取った。
Ma−ZAP(Advanced Targeting Systems,San Diego,CA)はタンパク質合成を抑制する毒素であるサポリンにコンジュゲートした抗マウスIgGである。この毒素は細胞膜を通過できない。内在化できる細胞表面抗原にモノクローナル抗体を結合すれば、毒素コンジュゲートは結合モノクローナルに結合することができ、これにより内在化して最終的には細胞を殺傷できる。毒性活性の提示のための内在化に依存して、Mab−ZAPはある表面抗原が細胞毒性作用を発現するために内在化に依存したいずれかの毒素のための適当な標的として機能するかどうかを評価するために使用できる。すなわち、Mab−ZAPはマイタンシノイドおよびカリケマイシンのようなこのような内在化依存性毒素のためのモデルとして機能する。
LUCA31によるリンパ球および骨髄先祖細胞の染色がこれらの細胞における抗増殖活性を予測するものであるかどうかを調べるために、本発明者等はヒト末梢血液白血球およびCD34選択骨髄先祖細胞を用いたトリチウム化チミジン系細胞増殖試験を開発した。これらの細胞集団の両方につき、本発明者等はLUCA31エピトープ染色を測定するために用いたものと同じサイトカインカクテルを使用した。ヒト白血球に対するLUCA31の作用を試験するために、本発明者等はPHA/IL−2単独で、または種々の量のコントロールIgG1抗体またはLUCA31の存在下に単離PBMCを刺激した。この実験の結果によれば(図14)、LUCA31は増殖中の白血球集団においてトリチウム化チミジンの取り込みを強力に抑制し、細胞増殖の約90%抑制をもたらした。
腫瘍誘導細胞系統による本発明者等のインビトロの試験の結果は本発明者等がLUCA31が異種移植片モデルに翻訳した細胞系統のパネル内で広範な活性を有している。LUCA31は結腸癌細胞系統HCT15の増殖のブロッキングにおいて特に活性であった。これ等の結果に基づいて、本発明者等は樹立されたHCT15腫瘍異種移植片モデル単独およびゲンシタビンとの組み合わせにおいてLUCA31の作用を試験することとした。この試験においてはマウス15匹の群に4週間抗体500ugを週二回投与した。ゲンシタビンはほぼMTDである120mg/kgでq3dx2の日程で投与した。投与は腫瘍容量が平均70mm3となった時点で開始した。試験の結果は図16に示す。図16Aにおいては中央値の腫瘍容量を示し、そして図16Bにおいてはエラーバーと共に平均の腫瘍容量を示す。この実験においては、LUCA31抗体は生理食塩水コントロールと相対比較して14日より長い腫瘍増殖の遅滞をもたらした。ゲンシタビンは20日の腫瘍増殖遅滞をもたらし、LUCA31とゲンシタビンの組み合わせはゲンシタビン単独と比較して18日の腫瘍増殖遅滞をもたらした。
(LUCA31 V領域のクローニングおよび発現ベクターの構築)
導入:LUCA31のRNAはマウス抗体を発現するハイブリドーマ細胞系統から抽出し、重鎖および軽鎖の可変領域をcDNAからRT−PCRにより引出した。V領域をCHEF1哺乳類発現ベクター内に挿入した。
RNA抽出:
QIAGEN RNeasy Mini Kit(Cat No 74106)を用いて凍結ハイブリドーマ細胞ペレットからRNAを抽出した。
Rocheの「RT−PCR用1stStrand cDNA合成キット(AMV)」(Cat No 1 483 188)を用いてcDNAを形成した。PCR反応のネガティブを得るために反応はRTの存在下および非存在下において実施した。
PCRはcDNA鋳型上において、Padmaの「ShortPCR」プログラムおよびClontechのAdvantage PCRキットを用いながら実施した。
5μl 10X緩衝液
2μl各プライマー
1μl dNTPミックス
1μl Advantageポリメラーゼ
dH2O全量50μl相当量。
使用した制限酵素類およびリガーゼはRoche、NEBまたはPromegaより購入した。ライゲーションはStratageneから入手した化学的にコンピテントなXL10−Gold細胞内に形質転換し、LBM/Carbアガロースプレート上にプレーティングした。コロニーはミニプレップ用の100または50μg/mlのいずれかのカルベニシリンを用いてLBM内に釣菌した。
LUCA31および市販のトランスフェリンレセプター抗体は凍結組織切片を用いながら試験した。組織切片を−20℃で100%アセトン中に10分間固定し、次に洗浄緩衝液に入れ、そして第1ブロッキング溶液工程に付した。洗浄緩衝液=1X TBSに0.05%Tween20添加/希釈液=洗浄緩衝液中20%ヒト血清、2%BSA。
1)H2O2ブロック:DAKOパーオキシダーゼブロッキング試薬、cat#003715、15分間
2)タンパク質ブロック:洗浄緩衝液中20%ヒト血清、2%BSA
3)アビジン/ビオチンブロック:ベクターcat#sp−2001、15分間アビジン(A)濯処理X2洗浄/15分
4)ビオチン(B)ブロットオフおよび一次抗体添加
5)1°抗体:(表参照)1時間
6)洗浄X3、1°後
7)3°(表参照)30分/洗浄X3
8)DAB:DAKO DAB+、Cat#K3468、提供緩衝液ml当たりDAB 1滴(パッケージの説明書)。発色時に水で反応停止。
10)キシレンで脱水しマウント用培地とともにカバーガラス適用。
細胞使用準備:#細胞を細胞系統に応じてプレーティングする(1000〜6000/ウェル);細胞を200ul RPMI1640+10%ウシ胎児血清(FBS)中ウェルに添加する
一夜37℃でインキュベートする。
ウェルから培地を吸引し、150ulの完全培地、次に50ulの4x抗体希釈物(10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml、0.6ug/ml)またはネガティブを添加する。抗体希釈は3連で行う。
一夜37℃でインキュベートする。
注記−パルシングの前に、半付着細胞(例えばColo25)と共にプレートを遠心分離する。
1uCiの3Hチミジンでパルシングする(20ulの完全増殖培地中)。
6時間〜一夜インキュベートする。
0.5%SDS(D−PBS中に調製)20ulをウェルに添加し、SDS終濃度を0.05%とする。
約60分間−80℃の冷凍庫で細胞を冷凍する。
採取し、細胞内DNA中のトリチウム化チミジンの取り込みを計数する。
ヒトトランスフェリンレセプターを以下のプライマー:
5’−GAA TTC TGC AGG GGA TCC GCC ACC ATG ATG GAT CAA GCT AGA TCA GCA TTC TC−3’
5’−CTC GAG CGG CCG CCA CTG TTA AAA CTC ATT GTC AAT GTC CC−3’
を用いてヒトcDNAからPCR増幅し、そして完全長トランスフェリンレセプター遺伝子を修飾pDEF2ベクターにクローニングすることにより発現ベクターTFRC−pDEF99TORAを生成した。TFRC−pDEF99TORA発現コンストラクトをMirus TransITトランスフェクション試薬を用いながら、そして、Pvu I消化線状プラスミドを用いたエレクトロポレーションによりCHO細胞にトランスフェクトした。細胞は限界希釈により選択した。米国特許5,888,809に開示されている該当する方法を参考として本明細書に援用する。
FACS緩衝液(D;PBS+.1%BSA)
BSA(内毒素非含有)
−マウスIgG FITCコンジュゲート(Sigma#F−2883_FACS緩衝液中1:200希釈)
1%ホルムアルデヒド(D−PBS中)
FACS試験管(Falcon#2052)
96穴ポリスチレン丸底細胞培養プレート(Corning/Costar#3799)
プロトコル
−200_l D−PBS中に細胞を再懸濁する。
−穏やかに回転混合する。
−50_lの適切な試薬(抗体、アイソタイプコントロール、培地・・)を各ウェルに添加し、穏やかに回転混合する。
−30分間氷上でインキュベートする。
−遠心分離(1100RPM/5分)し、培地を除去する(振り払い)。
−穏やかに回転混合する。
−200_l D−PBS中で1回洗浄する(遠心分離、振り払い、穏やかに回転混合)。
−200_l_−マウスIgG FITCコンジュゲート(FACS緩衝液中1:200希釈)中に再懸濁し、
穏やかに回転混合する。
−暗所(ホイル)氷上で30分間インキュベートする。
−遠心分離(1100RPM/5分)し、培地を除去する(振り払い)。
−穏やかに回転混合する。
−200_l D−PBS中で1回洗浄する(遠心分離、振り払い、穏やかに回転混合)。
−200_l 1%ホルムアルデヒド(D−PBS中)中に再懸濁し、FACS試験管に移す。
−FACS上でFL1蛍光強度を読み取る。
Claims (35)
- 実質的に精製された抗体であって、該抗体は、ヒトトランスフェリンレセプター上のLUCA31エピトープに特異的に結合し、かつ該抗体は、
a.癌細胞上のトランスフェリンレセプターに結合する能力;
b.インビトロまたはインビボにて生存細胞の表面上に露出しているトランスフェリンレセプターの部分に結合する能力;
c.トランスフェリンレセプターを発現する癌細胞に治療剤または検出可能なマーカーを送達する能力;および、
d.トランスフェリンレセプターを発現する癌細胞中に治療剤または検出可能なマーカーを送達する能力、
のうちの少なくとも1つ以上を有する、抗体。 - 請求項1に記載の精製された抗体であって、前記癌細胞は、副腎腫瘍、エイズ関連癌、胞状軟部肉腫、星状細胞腫、膀胱癌(扁平上皮癌および移行上皮癌)、骨癌(アダマンチノーム、動脈瘤性骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫)、脳および脊髄の癌、転移性脳腫瘍、乳癌、頸動脈小体腫瘍、子宮頸癌、軟骨肉腫、脊索腫、色素嫌性腎細胞癌、明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣細胞腫、ユーイング腫、骨外性粘液様軟骨肉腫、線維形成性骨形成不全症、線維性骨形成異常、胆嚢および胆管の癌、妊娠性栄養膜疾患、生殖細胞腫瘍、頭部および頚部の癌、ランゲルハンス島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌(腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞癌)、白血病、脂肪腫/良性脂肪性腫瘍、脂肪肉腫/悪性脂肪性腫瘍、肝臓癌(胚芽細胞腫、肝細胞癌)、リンパ腫、肺癌、髄芽細胞腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腫瘍、多発性骨髄腫、脊髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、乳頭状甲状腺癌腫、副甲状腺腫瘍、小児癌、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺癌、ブドウ膜または眼内の黒色腫、希少な血液学的障害、腎転移癌、横紋筋様腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、軟組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移癌および子宮癌(子宮頸癌、子宮内膜癌および平滑筋腫)に由来する癌細胞からなる群より選択される、抗体。
- 請求項1に記載の抗体をコードする、単離された核酸配列。
- 前記核酸は、プロモーターに作動可能に連結している、請求項3に記載の核酸。
- 前記プロモーターおよび前記核酸は、発現ベクター内に含有されている請求項4に記載の核酸。
- 前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項3に記載の核酸。
- 請求項3の核酸を含有するベクターでトランスフェクト、形質転換または感染されている細胞系統。
- ヒトトランスフェリンレセプター上のLUCA31エピトープに特異的に結合する実質的に精製された抗体を生産する方法であって、該方法は、
a.請求項3の核酸で形質転換された細胞系統を、前記抗体が発現される条件下にて増殖させる工程;および、
b.発現された抗体を採取する工程;
を包含する、方法。 - 前記細胞系統は、ハイブリドーマである、請求項8に記載の方法。
- 前記ハイブリドーマは、ATCC No.PTA−6055またはその子孫である、請求項9に記載の方法。
- 前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項8に記載の方法。
- 前記抗体は、ハイブリドーマATCC No.PTA−6055またはその子孫により発現される、請求項10に記載の方法。
- 前記抗体は、前記ハイブリドーマATCC No.PTA−6055またはその子孫により発現される抗体の抗原結合フラグメントを含む、請求項10に記載の方法。
- 請求項1に記載の抗体の治療有効量を、薬学的に受容可能なキャリアと共に含む、薬学的組成物。
- 治療有効量の抗体を、薬学的に受容可能なキャリアと共に含む、薬学的組成物であって、
該抗体は、ヒトトランスフェリンレセプター上のLUCA31エピトープに特異的に結合し、そして、該抗体は、
a.癌細胞上のトランスフェリンレセプターに結合する能力;
b.インビトロまたはインビボにて生存細胞の表面上に露出しているトランスフェリンレセプターの部分に結合する能力;
c.トランスフェリンレセプターを発現する癌細胞に治療剤または検出可能なマーカーを送達する能力;および、
d.トランスフェリンレセプターを発現する癌細胞中に治療剤または検出可能なマーカーを送達する能力、
のうちの少なくとも1つ以上を有する、組成物。 - さらなる治療部分を含む、請求項15に記載の薬学的組成物。
- ATCC No.PTA−6055またはその子孫からなる、単離された細胞系統。
- 癌細胞に化学療法剤を送達するための方法であって、該方法は、
LUCA31エピトープに結合可能な抗体を該化学療法剤と共に含む組成物を、投与する工程;
を包含し、
該癌細胞は、副腎腫瘍、エイズ関連癌、胞状軟部肉腫、星状細胞腫、膀胱癌(扁平上皮癌および移行上皮癌)、骨癌(アダマンチノーム、動脈瘤性骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫)、脳および脊髄の癌、転移性脳腫瘍、乳癌、頸動脈小体腫瘍、子宮頸癌、軟骨肉腫、脊索腫、色素嫌性腎細胞癌、明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣細胞腫、ユーイング腫、骨外性粘液様軟骨肉腫、線維形成性骨形成不全症、線維性骨形成異常、胆嚢および胆管の癌、妊娠性栄養膜疾患、生殖細胞腫瘍、頭部および頚部の癌、ランゲルハンス島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌(腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞癌)、白血病、脂肪腫/良性脂肪性腫瘍、脂肪肉腫/悪性脂肪性腫瘍、肝臓癌(胚芽細胞腫、肝細胞癌)、リンパ腫、肺癌、髄芽細胞腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腫瘍、多発性骨髄腫、脊髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、乳頭状甲状腺癌腫、副甲状腺腫瘍、小児癌、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺癌、ブドウ膜または眼内の黒色腫、希少な血液学的障害、腎転移癌、横紋筋様腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、軟組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移癌および子宮癌(子宮頸癌、子宮内膜癌および平滑筋腫)に由来する癌細胞からなる群より選択される、方法。 - 前記化学療法剤は、個体に投与される、請求項18に記載の方法。
- 前記抗体は、ハイブリドーマATCC No.PTA−6055またはその子孫により発現された抗体である、請求項18に記載の方法。
- 個体における癌細胞の増殖を抑制する方法であって、該方法は、
LUCA31エピトープに結合可能な抗トランスフェリンレセプター抗体を化学療法剤と共に含む組成物の有効量を、該個体に投与する工程;
を包含し、
該癌細胞は、副腎腫瘍、エイズ関連癌、胞状軟部肉腫、星状細胞腫、膀胱癌(扁平上皮癌および移行上皮癌)、骨癌(アダマンチノーム、動脈瘤性骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫)、脳および脊髄の癌、転移性脳腫瘍、乳癌、頸動脈小体腫瘍、子宮頸癌、軟骨肉腫、脊索腫、色素嫌性腎細胞癌、明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣細胞腫、ユーイング腫、骨外性粘液様軟骨肉腫、線維形成性骨形成不全症、線維性骨形成異常、胆嚢および胆管の癌、妊娠性栄養膜疾患、生殖細胞腫瘍、頭部および頚部の癌、ランゲルハンス島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌(腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞癌)、白血病、脂肪腫/良性脂肪性腫瘍、脂肪肉腫/悪性脂肪性腫瘍、肝臓癌(胚芽細胞腫、肝細胞癌)、リンパ腫、肺癌、髄芽細胞腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腫瘍、多発性骨髄腫、脊髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、乳頭状甲状腺癌腫、副甲状腺腫瘍、小児癌、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺癌、ブドウ膜または眼内の黒色腫、希少な血液学的障害、腎転移癌、横紋筋様腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、軟組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移癌および子宮癌(子宮頸癌、子宮内膜癌および平滑筋腫)に由来する癌細胞からなる群より選択される、方法。 - 前記化学療法剤は、前記癌細胞に送達される、請求項21に記載の方法。
- 前記抗体は、ハイブリドーマATCC No.PTA−6055またはその子孫により発現される、請求項21に記載の方法。
- 個体における癌細胞の存在または非存在を検出するための方法であって、該方法は、
該個体由来の細胞を、ヒトトランスフェリンレセプター上のLUCA31エピトープに結合可能な抗体に接触させる工程;および
該細胞由来のトランスフェリンレセプターと該抗体との複合体を、該複合体が存在する場合に検出する工程;
を包含し、
該癌細胞は、副腎腫瘍、エイズ関連癌、胞状軟部肉腫、星状細胞腫、膀胱癌(扁平上皮癌および移行上皮癌)、骨癌(アダマンチノーム、動脈瘤性骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫)、脳および脊髄の癌、転移性脳腫瘍、乳癌、頸動脈小体腫瘍、子宮頸癌、軟骨肉腫、脊索腫、色素嫌性腎細胞癌、明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣細胞腫、ユーイング腫、骨外性粘液様軟骨肉腫、線維形成性骨形成不全症、線維性骨形成異常、胆嚢および胆管の癌、妊娠性栄養膜疾患、生殖細胞腫瘍、頭部および頚部の癌、ランゲルハンス島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌(腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞癌)、白血病、脂肪腫/良性脂肪性腫瘍、脂肪肉腫/悪性脂肪性腫瘍、肝臓癌(胚芽細胞腫、肝細胞癌)、リンパ腫、肺癌、髄芽細胞腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腫瘍、多発性骨髄腫、脊髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、乳頭状甲状腺癌腫、副甲状腺腫瘍、小児癌、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺癌、ブドウ膜または眼内の黒色腫、希少な血液学的障害、腎転移癌、横紋筋様腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、軟組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移癌および子宮癌(子宮頸癌、子宮内膜癌および平滑筋腫)に由来する癌細胞からなる群より選択される、方法。 - トランスフェリンレセプターとLUCA31エピトープに結合可能なトランスフェリンレセプター結合パートナーとの間の相互作用のうちの少なくとも1つをブロックする因子であって、該相互作用は、
a.癌細胞上のトランスフェリンレセプターに結合する能力;
b.インビトロまたはインビボにて生存細胞の表面上に露出しているトランスフェリンレセプターの部分に結合する能力;
c.トランスフェリンレセプターを発現する癌細胞に治療剤または検出可能なマーカーを送達する能力;および、
d.トランスフェリンレセプターを発現する癌細胞中に治療剤または検出可能なマーカーを送達する能力、
である、因子。 - 請求項23に記載の因子の治療有効量を、薬学的に受容可能なキャリアと共に含む、薬学的組成物。
- トランスフェリンレセプターモジュレーターであって、該モジュレーターは、以下の特徴:
a.ヒトトランスフェリンレセプターとネイティブのトランスフェリンレセプターリガンドとの間の相互作用を妨害またはブロックする能力;
b.ヒトトランスフェリンレセプターと抗トランスフェリンレセプター抗体との間の相互作用を妨害またはブロックする能力;
c.ヒトトランスフェリンレセプターに結合する能力;
d.ヒトトランスフェリンレセプターに対するネイティブのリガンドに結合する能力;
e.抗トランスフェリンレセプター抗体に結合する能力;
f.LUCA31エピトープまたは抗LUCA31抗体に結合可能な抗体の惹起において使用され得る抗原性部位を含有する;
g.LUCA31エピトープまたは抗LUCA31抗体に結合可能な抗体のスクリーニングにおいて使用され得る抗原性部位を含有する;
h.LUCA31エピトープとネイティブLUCA31リガンドとの間、または、LUCA31エピトープとLUCA31との間の相互作用を妨害またはブロックすることが可能な抗体の惹起において使用され得る抗原性部位を含有する;
i.LUCA31エピトープとLUCA31の間の相互作用を妨害またはブロックすることが可能な抗体のスクリーニングにおいて使用され得る抗原性部位を含有する;
のうちの少なくとも1つを有する、モジュレーター。 - 個体における癌細胞の増殖を抑制する方法であって、該方法は、
ヒトトランスフェリンレセプターのLUCA31レセプターに結合可能な抗体を含む組成物の有効量を該個体に投与する工程;
を包含し、
該癌細胞は、副腎腫瘍、エイズ関連癌、胞状軟部肉腫、星状細胞腫、膀胱癌(扁平上皮癌および移行上皮癌)、骨癌(アダマンチノーム、動脈瘤性骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫)、脳および脊髄の癌、転移性脳腫瘍、乳癌、頸動脈小体腫瘍、子宮頸癌、軟骨肉腫、脊索腫、色素嫌性腎細胞癌、明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣細胞腫、ユーイング腫、骨外性粘液様軟骨肉腫、線維形成性骨形成不全症、線維性骨形成異常、胆嚢および胆管の癌、妊娠性栄養膜疾患、生殖細胞腫瘍、頭部および頚部の癌、ランゲルハンス島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌(腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞癌)、白血病、脂肪腫/良性脂肪性腫瘍、脂肪肉腫/悪性脂肪性腫瘍、肝臓癌(胚芽細胞腫、肝細胞癌)、リンパ腫、肺癌、髄芽細胞腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腫瘍、多発性骨髄腫、脊髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、乳頭状甲状腺癌腫、副甲状腺腫瘍、小児癌、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺癌、ブドウ膜または眼内の黒色腫、希少な血液学的障害、腎転移癌、横紋筋様腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、軟組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移癌および子宮癌(子宮頸癌、子宮内膜癌および平滑筋腫)に由来する癌細胞からなる群より選択される、方法。 - 前記抗体は、ハイブリドーマATCC No.PTA−6055またはその子孫により発現される、請求項28に記載の方法。
- 前記抗体は、ハイブリドーマATCC No.PTA−6055またはその子孫により発現される抗体の抗原結合フラグメントを含む、請求項28に記載の方法。
- 前記抗体は、ハイブリドーマATCC No.PTA−6055またはその子孫により発現される抗体の少なくとも1つの相補性決定領域を含む、請求項28に記載の方法。
- ハイブリドーマATCC No.PTA−6055またはその子孫により発現される、抗体。
- ハイブリドーマATCC No.PTA−6055またはその子孫により発現される抗体の抗原結合フラグメントを含む、抗体。
- ハイブリドーマATCC No.PTA−6055またはその子孫により発現される抗体の少なくとも1つの相補性決定領域を含む、抗体。
- 請求項32〜34のうちのいずれかに記載の抗体をコードする、DNA。
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