KR20070042959A - 트랜스페린 리셉터 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 질환 및 암 관련 항원, 트랜스페린 리셉터의 특성화를 더욱 제공한다. 본 발명은 트랜스페린 리셉터에 결합하는 항체의 신규 패밀리, 트랜스페린 리셉터를 발현하는 다양한 사람 암과 질환의 진단 및 치료 방법을 또한 제공한다.
암, 트랜스페린, 리셉터, 단일클론, 항체, 면역, 하이브리도마, LUCA1 에피토프.

Description

트랜스페린 리셉터 항체{TRANSFERRIN RECEPTOR ANTIBODIES}
본 발명은 생물학과 면역요법의 분야이다. 보다 구체적으로는, 발명은 질환 및 암-관련 항원 트랜스페린 리셉터, 및 트랜스페린 리셉터에 결합하는 다클론성 및 단일클론 항체 및 다른 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 항-트랜스페린 리셉터 항체를 포함하여, 트랜스페린 리셉터에 결합하는, 길항제, 조정자 및 펩티드를 사용하여, 트랜스페린 리셉터와 관련된 다양한 사람 질환과 암의 진단 및/또는 치료를 더욱 제공한다.
진단법에서의 그들의 공지된 사용에 더하여, 항체는 치료제로서 유용한 것으로 나타났다. 예를 들어, 면역요법, 또는 치료 목적을 위한 항체의 사용은 최근 몇년간 암을 치료하는데 사용되었다. 수동 면역요법은, 암 치료에서 단일클론 항체의 사용을 수반한다. 예를 들어, Cancer: Principles and Practice of Oncology, 6th Edition (2001) Chapt. 20 pp. 495-508을 참조하라. 이들 항체는 종양 세포 성장 또는 생존의 직접적인 저해에 의해 그리고 몸의 면역 시스템의 천연 세포 사멸 활성을 보강하는 그들의 능력에 의해, 본래부터의 치료 생물학적 활성을 가질 수 있다. 이들 작용제는 단독으로 또는 방사선 또는 화학치료제와 결합하여 투여될 수 있다. 비-Hodgkin의 임파종과 유방암 각각의 치료에 승인된 리툭시맙과 트라스투주마브는 그러한 치료의 두가지 예이다. 대안으로서, 항체는 항체가 독성작용제에 연결되고 종양에 특이적으로 결합시킴으로써 그 작용제를 종양에 지시하는 항체 컨쥬게이트를 만드는데 사용될 수 있다. 겜투주마브 오조가마이신(Gemtuzumab ozogamicin)는 백혈병의 치료에 사용된 승인된 항체 컨쥬게이트의 예이다. 암 세포에 결합되고 진단 및 치료법에 잠재력인 사용을 갖는 단일클론 항체가 공보에 개시되었다. 예를 들어, 그 중에서도 특히, 표적 단백질의 일부 분자량을 개시하는 하기의 특허 출원을 참조하라: 미국 특허 No. 6,054,561 (200 kD c-erbB-2 (Her2), 및 다른 공지되지 않은 항원 크기 40-200 KD) 및 미국 특허 No. 5,656,444 (50 kD 및 55 kD 종양태아 단백질). 임상적인 실험에서와/또는 고형 종양의 치료에 승인된 항체의 예는 : 트라스투주마브 (항원: 180 kD, HER2/neu), 에드레콜로마브 (항원: 40-50 kD, Ep-CAM), 항-사람 유지방 글로불 (HMFG1) (항원 >200 kD, HMW Mucin), 세툭시마브 (항원: 150 kD 및 170 kD, EGF 리셉터), 알렘투주마브 (항원: 21-28 kD, CD52), 및 리툭시맙 (항원: 35 kD, CD20)을 포함한다.
유방암을 치료하는데 사용되는 트라스투주마브 (Her-2 리셉터) 및 몇가지 암의 치료를 위한 임상적인 실험에서의 세툭시마브 (EGF 리셉터)의 항원 표적은 피부, 결장, 폐, 난소, 간, 및 췌장을 포함하는 많은 정상 사람 성인 조직에서 일부 검출가능한 수준으로 존재한다. 이들 치료를 사용하는데 있어서 안전의 허용범위는 발현의 수준 또는 이들 부위에서 항체의 활성의 접근에서의 차이에 의해 가능하게 제공된다.
면역요법의 또다른 타입은 활성 면역요법, 또는 특정 암(들)에 존재하는 항원 또는 개인에서 면역 반응을 일으키는, 즉, 개인이 그들 고유의 암에 대해서 항체를 활발히 제조하도록 유도하는 항원의 발현을 지시하는 DNA 구성체의 백신접종이다. 활성 면역법은 수동 면역요법 또는 항체독소로서 종종 사용되지 않았다.
질환 진행의 몇가지 모델(암을 포함)이 제안되었다. 이론들은 단일 감염/변형사건에 의한 원인으로부터, 궁극적으로 충분히 병원균 또는 악성의 능력을 갖는 것으로 인도되는 "질환-유사" 또는 '암-유사' 조직 타입으로 점점 발달에까지 범위가 이른다. 일부는 암에 대해서, 예를 들어, 단일 돌연변이 사건이 악성종양을 유발하는데 충분하다고 주장하는 반면, 다른 이들은 이어지는 변경이 또한 필요하다고 주장한다. 일부 다른 이들은 증가하는 돌연변이 로드 및 종양 등급이 세포 수준에서 돌연변이-선택 사건의 연속체를 통한 종양형성의 진행은 물론 개시의 둘다에 필요하다고 제안하였다. 어떤 암 표적은 오직 종양 조직에서만형성된 반면, 다른 것들은 정상 조직에 존재하고 종양 조직에서 상향 조절 및/또는 과-발현된다. 그러한 상황에서, 일부 연구원들은 과도-발현이 악성종양의 획득에 연결된다고 제안하였고, 다른이들은 과도-발현이 단지 증가하는 질환 상태에 대한 진로를 따르는 경향의 마커라고 시사한다.
이상적인 진단 및/또는 치료 항체는 많은 암에 존재하는 항원에 대해 특이적일 것이지만, 오로지 낮은 수준으로 어떠한 정상 조직에 부재 또는 존재한다. 암(들)과 특이적으로 관련되는 신규 항원의 발견, 특성화, 및 분리는 많은 방식으로 유용할 것이다. 먼저, 항원은 단일클론 항체를 항원에 대하여 만드는데 사용될 수 있었다. 항체는 이상적으로 암 세포에 대해서 생물학적 활성을 가질 것이고 외래 항원에 대한 면역 시스템의 반응을 보충할 수 있다. 항체가 치료제로서 단독으로 또는 현재의 치료와 조합하여 투여되거나 또는 독성 작용제에 연결된 면역컨쥬게이트를 제조하는데 사용될 수 있다. 생물학적 활성이 낮거나 없는 것을 빼고 동일한 특이성을 갖는 항체가 단독으로 투여될 때, 항체가 방사성 동위원소, 독소, 또는 화학치료제 또는 화학치료제를 함유하는 리포솜과의 면역컨쥬게이트를 제조하는데 사용될 수 있고, 컨쥬게이트 형태는 독소를 항원-함유 세포로 지시하는 항체에 의하여, 생물학적으로 활성이라는 점에서 유용할 수 있다.
이상적인 진단 및/또는 치료 항체에 바람직한 한가지 양태는 다양한 암과 관련되는 항원의 발견과 특성화이다. 비-암세포에서 제한된 발현을 갖는 많은 타입의 암 (예를 들어, "전(pan)-암" 항원)에서 발현되는 항원은 거의 없다. 그러한 항원의 분리와 정제는 항원을 표적화하는 항체 (예를 들어, 진단 또는 치료)를 만드는데 유용할 것이다. "전-암" 항원에 결합하는 항체는 오직 하나의 특이적 타입의 암과 관련된 항원에 대한 항체와 대조적으로, 표적 다른 조직에서 발견된 다양한 암을 표적화할 수 있다. 항원은 또한 약물 발견 (예를 들어, 작은 분자) 및 더 나아가 세포 조절, 성장, 및 분화의 특성화에 유용할 것이다.
트랜스페린 리셉터는 사람 종양에서 널리 발현되었고(Gatter et al., 사람 조직에서 트랜스페린 리셉터 : 그들의 분포 및 가능한 임상적인 적절성, J Clin Pathol 36, 539-545 (1983)) 세포 증식 및 생존에서 중요한 역할을 한다. 트랜스페린 리셉터에 결합하는 항체는 이전에 동물 종양 모델에서 효능있는 것으로 나타 났다. CCRF-CEM 세포를 사용하는 백혈병 이종이식 모델에서(White et al., Combinations of anti- transferrin receptormonoclonal antibodies inhibithuman tumor cell growth in vitro and in vivo :evidence for synergistic antiproliferative effects, Cancer Res 50, 6295-6301(1990)) 그리고 M21 사람 흑색종 이종이식에서 (Trowbridge & Domingo, Anti- transferrin receptormonoclonal antibody and toxin-antibody conjugates affect growth of human tumor cells, Nature 294, 171-173(1981)), 트랜스페린 리셉터 항체는 또한 종양 진행을 억제하였다.
뮤린 IgA 항체 42/6를 가지고한 단계 I 임상적인 실험을 포함하여(Brooks et al., PhaseIa trialof murine immunoglobulin A antitransferrin receptor antibody 42/6, Clin Cancer Res 1, 1259-1265(1995), 네이키드 항체, 독소 컨쥬게이트 항체 및 트랜스페린-독소 컨쥬게이트를 사용한 1980년대 이후로 트랜스페린 리셉터가 암 표적으로서 연구되었다(예를 들어, 하기 참조, Griffin et al., Combinedantitumor therapy with the chemotherapeutic drugdoxorubicin and an ahti-trafzsferrin receptor inimuiiotoxiii : In vitro and in vivo studies, J Immunol I 1 , 12-18 (1992) ; Qian et al., Targeted drug delivery via the transferrin receptor-mediated endocytosis pathway, Pharmacological Reviews 54, 561-587 (2002); Trowbridge & Collin et al.,Structure-function analysis of thehatmarztransfer;in receptor: Effectsof anti- receptor monoclonal antibodies on tumor growth, Curr Stud Hematol Blood Transf 58, 139-147 (1991))). 트랜스페린 리셉터의 발현은 세포 증식과 상호관련이 있고 이것이 트랜스페린 리셉터 항체와 포지티브로 염색하는 높은 비율의 종양 및 정상 조직의 제한된 염색을 설명한다고 제안되었다 (Gatter, 1983). 일반적으로 트랜스페린 리셉터 항체가 세포 안으로의 철의 흡수를 줄임으로써 세포 증식을 저해한다는 것이 받아들여진다 (Kemp, Iron deprivation andcancer : a viewbeginning with studiesof monoclonal antibodies against the transferrin receptor, Histol Histopathol 12, 291-296, (1997)). 이것은 트랜스페린 리셉터과 철-하전된 트랜스페린과의 상호작용을 차단함으로써 또는 트랜스페린 리셉터 주기 세포 표면 제시의 역학을 바꿈으로써 달성될 수 있다. 종양 세포에서 철 흡수를 차단하는 효과는 주로 S-상태에서 이어서 G1 상태 세포의 축적에서, 초기에 세포 주기 저지로서 나타난다 (White, 1990). 철 회수의 궁극적 종말점은 백혈구정체로부터 세포 사멸의 유도에 이르기까지 변하는 것으로 보인다.
뮤린 트랜스페린 리셉터를 인식하는 래트 유도된 항체는 합성 마우스 백혈병 모델에서 테스트되었다 (Savage, et al.,. Effects of monoclonal antibodiesthat block transferrin receptorfunction on the in vivo growth of a syngeneic murine leukemia, Cancer Res 47, 747-753 (1987)). 이 분자는 대조군에 비해 생존을 상당히 개선시켰고 주에 걸친 치료 기간에서 항체에 의해 인식된 총체 독성의 증거 또는 정상 조직에 대한 손상의 증거는 없었다. 추가적으로, 적혈구 또는 백혈구 세포 수에서의 변화는 없었다. 그러나, 골수 원종 세포의 분석은 CFU-e /106 세포에서의 2배 감소와 CFU-c에서는 덜 현저한 감소를 보여주었다. 트랜스페린 리셉터를 차단하는 효과(들)에 추가의 통찰력은 마우스 항체 42/6를 사용하여 수행된 단계 I 임상적인 실험의 결과를 평가함으로써 제공될 수 있다. 이 연구에서, 짧은 처리 과정과 마우스 항체의 불량한 약동학에도 불구하고, 혼합된 종양 반응의 증거가 있었다 (Brooks, 1995). 42/6으로 처리된 환자의 평가는 항체로 처리한 후에, 감소된 골수 BFU-e의 증거를 보였지만 결과는 통계적으로 유의하지 않았다. 트랜스페린 리셉터가 분화하는 골수 원종 세포에서 발현되는 것으로 나타났기 때문에(Helm et al., Characterizationand phenotypic analysis of differentiating CD34+human bone marrow cells in liquid culture, Eur J Haematol 59, 318-326 (1997)) 항-트랜스페린 리셉터 항체를 편입하는 치료제는 골수 독성에 대한 잠재력보다 중대한 잠재적인 치료 효과를 갖는다는 것이 바람직하다.
요구되는 것은 그러한 질환 및/또는 암을, 세포 표면 표적을 특이적으로 인식하는, 항체 및 다른 작용제로 진단하고 치료하는데 사용될 수 있는, 병든 및/또는 암 세포의 표면에서의 신규 표적이다. 본원에서 개시된 발견에 근거하여, 트랜스페린 리셉터의 질환-촉진 활성을 감소하거나 강화함으로써 조절할 수 있는, 세포의 표면에서 표적을 특이적으로 인식하는, 신규 항체 및 다른 작용제에 대한 더 나아간 요구가 존재한다. 그것의 질환-관련 활성을 저해할 수 있는 사람 트랜스페린 리셉터의 길항제를 확인하는 것이 본 발명의 목적이다. 트랜스페린 리셉터의 분석에 사용하기 위해, 그리고 면역원으로서 사용하기 위한 또는 항-사람 트랜스페린 리셉터 항체를 선택하기 위한 신규 화합물을 제공하는 것이 또다른 목적이다.
아래에서 좀더 자세하게 설명될 바와 같이, 본 발명자들은 사람 트랜스페린 리셉터의 신규 에피토프를 발견하고, 본원에서 제공된 신규 길항제, 조정자 및 항체의 항원 표적으로서 확인하였다 .
발명의 개요
본 발명은 다양한 사람 암에서 발현되는 트랜스페린 리셉터에 결합하는, 트랜스페린 리셉터 길항제, 조정자 및 단일클론 항체를 제공한다. 한가지 양태에서, 본 발명은 트랜스페린 리셉터에 결합하는 단일클론 항체의 패밀리이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 Patent Deposit Designation of PTA-6055과 함께 American Type Culture Collection에 2004년 6월 8일날 기탁된 숙주 세포주 CA130.3.13C9.1A7 에 의해 제조되는 단일클론 항체 항-트랜스페린 리셉터이다.
한층더 또다른 양태에서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는, 병든 및/또는 암 세포와 반응하는 단일클론 항체 항-트랜스페린 리셉터를 생성하는 방법이다:
(a) 숙주 포유동물을 면역원으로 면역화시키는 단계;
(b) 포유동물로부터 림프구를 얻는 단계 ;
(c) 림프구(b)를 골수종 세포주와 융합하여 하이브리도마를 생산하는 단계;
(d) (c)의 하이브리도마를 배양하여 단일클론 항체를 제조하는 단계; 및
(e) 항체를 선별하여 오로지 병든 및/또는 암 세포 또는 세포주에 결합하지만 비-암 또는 정상 세포 또는 세포주에는 결합하지 않는, 또는 더 낮은 수준에서 또는 다른 형태로 정상 세포에 결합하는 그러한 항체를 선택하는 단계.
또다른 양태에서, 본 발명은 항체의 생산을 허용하는 조건하에서, 그러한 항체 또는 그것의 자손을 인코딩하는 숙주 세포를 배양하고, 항-트랜스페린 리셉터 항체를 정제하는 것을 포함하는, 항-트랜스페린 리셉터 항체를 생성하는 방법이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 적절한 세포에서 항체를 인코딩하는 한가지 이상의 폴리뉴클레오티드를 발현하고(이것은 단일 경쇄 또는 중쇄로서 각각 발현될 수 있거나, 또는 경쇄와 중쇄 둘다 하나의 벡터로부터 발현된다), 일반적으로 이어서 관심의 항체 또는 폴리펩티드를 회수 및/또는 분리함으로써, 본원에서 기술된 항체 (또는 폴리펩티드)중 어떤 것을 생성하는 방법을 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 트랜스페린 리셉터에 대한 항-트랜스페린 리셉터 항체의 우선적인 결합을 경쟁적으로 저해하는, 항-트랜스페린 리셉터 항체 또는 폴리펩티드(이것은 항체이거나 아닐 수 있다)이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 LUCA31 항체와 동일한 에피토프(들) 트랜스페린 리셉터에 우선적으로 결합하는, 항체 또는 폴리펩티드이다(이것은 항체이거나 아닐 수 있다).
또다른 양태에서, 본 발명은 항-트랜스페린 리셉터 항체의 트랜스페린 리셉터에 대한 우선적인 결합을 경쟁적으로 저해하는, 트랜스페린 리셉터 조정자 (이것은 폴리펩티드이거나 아닐 수 있다)이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 다른 항-트랜스페린 리셉터 항체와 동일한 또는 다른 에피토프(들) 트랜스페린 리셉터에 우선적으로 결합하는, 작은 분자 또는 화학 화합물이 될 수 있다.
한층더 또다른 양태에서, 본 발명은 트랜스페린 리셉터의 에피토프에 대해 특이적인 항체에 의해 결합된 트랜스페린 리셉터를 포함하는 조성물이다. 하나의 구체예에서 항체는 항-트랜스페린 리셉터이다. 다른 구체예에서, 두개 이상의 항-트랜스페린 리셉터 항체가 투여되고, 그러한 항체는 트랜스페린 리셉터의 두개 이상의 다른 에피토프에 대해 맵핑한다. 일부 구체예에서, 항-트랜스페린 리셉터 항체는 치료제 또는 검출가능한 라벨에 연결된다.
또다른 양태에서, 본 발명은 LUCA31 항체의 단편 또는 영역을 포함하는 항체이다. 하나의 구체예에서 단편은 항체의 경쇄이다. 또다른 구체예에서, 단편은 항체의 중쇄이다. 한층더 또다른 구체예에서, 단편은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 하나 이상의 가변 영역을 함유한다. 한층더 또다른 구체예에서, 단편은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 하기중 하나를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다: a) 경쇄 또는 중쇄로부터 하나 이상의 CDR (또는 그것의 단편); b) 경쇄로부터 3 CDR ; c) 중쇄로부터 3 CDR ; d) 경쇄로부터 3 CDR 및 중쇄로부터 3 CDR ; e) 경쇄 가변 영역; f) 항-트랜스페린 리셉터 항체의 중쇄 가변 영역. 바람직한 구체예에서, 이들 폴리펩티드는 LUCA31 항체의 서열로부터 선택된다.
또다른 양태에서, 본 발명은 사람화 항체이다. 일부 구체예에서, 사람화 항체는 비-사람 항-트랜스페린 리셉터 항체의 하나 이상의 CDR를 포함한다. 일부 구체예에서, 사람화 항체는 다른 LUCA31과 동일하거나 또는 다른 에피토프(들)에 결합한다. 일반적으로, 본 발명의 사람화 항체는 CDR(들) 본래의 비-사람 항-트랜스페린 리셉터 항체로부터 동일하고/또는 유도된 하나 이상의 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그것의 단편) CDR를 포함한다. 일부 구체예에서, 사람 항체는 다른 항-트랜스페린 리셉터 항체와 동일한 또는 다른 에피토프(들)에 결합한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 비-사람 항-트랜스페린 리셉터 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로부터 유도된 가변 영역과, 사람 항체의 중쇄와 경쇄의 일정한 영역으로부터 유도된 일정한 영역을 포함하는 키메릭 항체이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 ATCC No. PTA-6055의 기탁 번호를 갖는 숙주 세포, 또는 그것의 자손에 의해 제조되는 항체 LUCA31를 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명은 위에서 명시한 항체 중 어떤 것의 본래부터의 결합 또는 생물학적 활성을 갖는 항체 폴리펩티드를 포함한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 본원에서 기술된 어떠한 다른 폴리펩티드는 물론이고, 항체 (항체 단편을 포함) 중 어떤 것을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 화학치료제에 연결된 항-트랜스페린 리셉터 항체, 항-트랜스페린 리셉터 항체의 단편을 포함하는 항체, 비-사람 항-트랜스페린 리셉터 항체의 사람화 항체, 비-사람 항-트랜스페린 리셉터 항체의 가변 영역으로부터 유도된 가변 영역 및 사람 항체의 일정한 영역으로부터 유도된 일정한 영역을 포함하는 키메릭 항체, 또는 비-사람 항-트랜스페린 리셉터 항체의 한가지 이상의 성질을 갖는 사람 항체, 또는 화학치료제(방사능 부분과 같은)에 연결된 본원에서 기술된 항-트랜스페린 리셉터 항체 중 어떤 것, 및 제약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물과 같은, 폴리펩티드 중 어떤 것을 포함하는 제약 조성물 (본원에서 기술된 항체 중 어떤 것을 포함한다) 또는 본원에서 기술된 폴리뉴클레오티드이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 병든 또는 암 세포에 존재하는 트랜스페린 리셉터에 결합된 항-트랜스페린 리셉터 항체를 포함하는 조성물이다. 바람직한 구체예에서, 암 세포는 난소, 폐, 전립선, 췌장, 결장, 및 유방암 세포로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 암 세포는 분리된다. 일부 구체예에서, 암 세포는 생물학적 샘플이다. 일반적으로, 생물학적 샘플은 사람과 같은 개인으로부터 난다.
또다른 양태에서, 본 발명은 개인으로부터 세포에서 트랜스페린 리셉터를 검출함으로써 개인에서 질환을, 특히 개인에서 염증 또는 자가면역 반응과 관련된 질환 또는 장애를 진단하는 방법이다. 본 발명의 다른 양태에서, 방법이 개인에서 염증 또는 자가면역 반응을 조정하기 위해 제공된다. 본 발명의 조성물과 방법을 사용하여 치료받을 수 있는, 염증 및 자가면역 장애로부터 기인하는 질환 및 상태는 제한이 아닌 실례로서, 다발성 경화증, 수막염, 뇌염, 뇌중풍, 다른 뇌외상, 궤포지티브 대장염 및 크론병을 포함하는 염증 장 질환, 중증근육무력증, 루푸스, 류마티즘성 관절염, 천식, 급성 소아 개시 당뇨병, AIDS 치매, 죽상경화증, 신장염, 망막염, 아토피 피부염, 건선, 심근 허혈 및 급성 백혈구-매개된 폐 손상을 포함한다. 본 발명의 항체는 그러한 상태를 위한 치료를 필요로하는 개인에게 투여하는데 적용가능성을 발견한다.
본 발명의 항체 및 다른 치료제의 치료 용도를 위한 여전히 다른 지시는 기관 또는 이식편 거부의 위험에 있는 개인에게 투여하는 것을 포함한다. 최근 몇년동안 피부, 신장, 간, 심장, 폐, 췌장 및 골수와 같은 조직 및 기관을 이식하기 위한 수술 기술이 효능에서의 상당한 개선이 있었다. 아마도 주요한 미해결 문제는 이식된 동종이식 또는 기관에 대해 받는 사람에서 면역내성을 유도하기 위한 만족스러운 약제의 부족이다. 동종이계 세포 또는 기관이 숙주에 이식될 때 (즉, 기증자와 피이식자가 동일한 종과 다른 개인이다), 숙주 면역 시스템은 이식조직에서 외래 항원에 대한 면역 반응을 갖추는 것 같고(숙주-대-이식 질환) 이식된 조직의 파괴를 야기한다. 본 발명의 항체는 기관 또는 이식 거부의 위험에 있는 개인에게 투여할 때 적용가능성을 발견한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 개인으로부터 선택된 세포에 트랜스페린 리셉터의 발현이 존재하는지 여부를 결정하는 것을 포함하는, 개인이 암을 갖고 있는지 여부를 진단하는 방법이고, 여기에서 상기 세포에서 트랜스페린 리셉터의 발현은 상기 암의 표시이다. 일부 구체예에서, 트랜스페린 리셉터의 발현은 항-트랜스페린 리셉터 항체를 사용하여 결정된다. 일부 구체예에서, 방법은 세포로부터 트랜스페린 리셉터 발현의 수준을 검출하는 것을 수반한다. 본원에서 사용된 용어 "검출" 은 대조군이 있거나 없이 정성 및/또는 정량 검출 (수준을 측정)하는 것을 포함한다.
한층더 또다른 양태에서, 본 발명은 개인으로부터의 세포에 있는 또는 세포로부터 방출된 트랜스페린 리셉터를 검출함으로써 개인에서 암의 진단 방법이고, 이때 암은 이것으로 제한되지는 않지만 부신 종양, AIDS-관련 암, 폐포 연한 부분 육종, 성상세포 종양, 방광암 (편평 세포 암종 및 이행 세포 암종), 골암 (사기질종, 동맥류뼈낭종, 뼈연골증, 골육종), 뇌암 및 척수 암, 전이 뇌 종양, 유방암, 경동맥소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장 암, 직장결장 암, 피부 포지티브 섬유 조직구종, 결합조직형성 소 원형 세포 종양, 뇌실막세포종, Ewing 종양, 외골격 점액 연골육종, 골성 불완전 섬유 생성증, 뼈의 섬유 형성장애, 담낭 및 담관 암, 임신영양모세포병, 세균세포 종양, 머리와 목 암, 섬 세포 종양, Kaposi 육종, 신장암 (콩팥모세포종, 유듀모양 신장 세포 암종), 백혈병, 지방종/포지티브 지방종성 종양, 지방육종/악성의 지방종성 종양, 간암 (간모세포종, 간세포 암종), 임파종, 폐암, 속질모세포종, 흑색종, 수막종, 다발 내분비 종양형성, 다발 골수종, 골수형성이상 증후군, 신경모세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유듀모양 갑상샘 암종, 부갑상샘 종양, 소아 암, 말초 신경 집 종양, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선 암, 포도막 또는 안내 흑색종, 희귀 혈액 장애, 신장 전이 암, 막대 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연-조직 육종, 편평 세포 암, 위암, 윤활 육종, 고환 암, 가슴샘 암종, 가슴샘종, 갑상샘 전이 암, 및 자궁암 (자궁목의 암종, 자궁내막 암종, 및 형활근종)을 포함하는 군으로부터 선택된다.
또다른 양태에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 트랜스페린 리셉터의 발현을 결정하는 것을 포함하는, 개인에서 암(이것으로 제한되지는 않지만 난소, 폐, 전립선, 췌장, 결장, 또는 유방암과 같은)의 진단을 돕는 방법이다. 일부 구체예에서, 트랜스페린 리셉터의 발현은 항-트랜스페린 리셉터 항체를 사용하여 결정된다. 일부 구체예에서, 방법은 세포로부터 트랜스페린 리셉터 발현의 수준을 검출한다. 암으로부터 방출된 트랜스페린 리셉터는 체액(예를 들어, 혈액, 침 또는 장 점액 분비)에서 검출가능한 상승된 수준의 트랜스페린 리셉터 또는 그것의 일부에 기여할 수 있다.
한층더 또다른 양태에서, 본 발명은 암 세포의 성장을 줄이기에 충분한, 트랜스페린 리셉터에 결합하는 효과적인 양의 항체를 투여함으로써 암을 치료하는 방법이다. 일부 구체예에서, 항체는 항-트랜스페린 리셉터 항체이다. 특정 구체예에서, 암 세포는 이것으로 제한되지는 않지만 부신 종양, AIDS-관련 암, 폐포 연한 부분 육종, 성상세포 종양, 방광암 (편평 세포 암종 및 이행 세포 암종), 골암 (사기질종, 동맥류뼈낭종, 뼈연골증, 골육종), 뇌 및 척수 암, 전이 뇌 종양, 유방암, 경동맥소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장 암, 직장결장 암, 피부 포지티브 섬유 조직구종, 결합조직형성 소 원형 세포 종양, 뇌실막세포종, Ewing 종양, 외골격 점액 연골육종, 골성 불완전 섬유 생성증, 뼈의 섬유 형성장애, 담낭 및 담관 암, 임신영양모세포병, 세균 세포 종양, 머리와 목 암, 섬 세포 종양, Kaposi육종, 신장암 (콩팥모세포종, 유듀모양 신장 세포 암종), 백혈병, 지방종/포지티브 지방종성 종양, 지방육종/악성의 지방종성 종양, 간암 (간모세포종, 간세포 암종), 임파종, 폐암, 속질모세포종, 흑색종, 수막종, 다발 내분비 종양형성, 다발 골수종, 골수형성이상 증후군, 신경모세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유듀모양 갑상샘 암종, 부갑상샘 종양, 소아 암, 말초 신경 집 종양, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선 암, 포도막 또는 안내 흑색종, 희귀 혈액 장애, 신장 전이 암, 막대 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연-조직 육종, 편평 세포 암, 위암, 윤활 육종, 고환 암, 가슴샘 암종, 가슴샘종, 갑상샘 전이 암, 및 자궁암 (자궁목의 암종, 자궁내막 암종, 및 형활근종)을 포함하는 군으로부터 선택된다. 특정 바람직한 구체예에서, 암 세포는 이것으로 제한되지는 않지만 유방암, 결장 암, 전립선 암, 폐암, 육종, 신장 전이 암, 갑상샘 전이 암, 및 투명 세포 암종을 포함하는 고형 종양의 군으로부터 선택된다.
한층더 또다른 양태에서, 본 발명은 트랜스페린 리셉터에 특이적으로 결합하는 효과적인 양의 항체의 패밀리의 한가지 이상을 포함하는, 암을 갖는 개인에서 전이의 발전을 지연시키는 방법이다. 하나의 구체예에서 항체는 항-트랜스페린 리셉터 항체이다. 또다른 양태에서, 본 발명은 화학치료제와 관련된(연결되는 것을 포함) 항-트랜스페린 리셉터 항체를 포함하는 효과적인 양의 조성물을 세포 배양 또는 샘플, 또는 개인에게, 투여하는 것을 포함하는, 시험관내 또는 개인에서 암 세포의 성장 및/또는 증식을 저해하는 방법이다.
한층더 또다른 양태에서, 본 발명은 개인에게 트랜스페린 리셉터에 특이적으로 결합하는 효과적인 양의 항체의 패밀리의 한가지 이상 멤버를 투여함으로써, 개인에 있어서 암 세포에게 치료제를 송달하는 방법이다. 다른 구체예에서, 항-트랜스페린 리셉터 항체가 또다른 치료제와 조합하여 (연결되는 것을 포함) 개인에게 송달된다.
일부 구체예에서, 항-트랜스페린 리셉터 항체는 여기에서 명명된 항체로부터 유도된 사람화 항체(일반적으로, 반드시는 아니지만, 한가지 이상의 항체의 부분적인 또는 손상되지 않은 CDR)를 포함)이다. 일부 구체예에서, 항- 트랜스페린 리셉터 항체는 명명된 항체의 한가지 이상의 성질을 갖는 사람 항체이다. 일부 구체예에서, (독소 또는 방사능 분자와 같은) 화학치료제가 암 세포 안으로 송달된다 (흡수된다). 일부 구체예에서, 작용제는 사포린이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 화학치료제와 연합된(연결된 것을 포함) 항- 트랜스페린 리셉터 항체를 포함하는 효과적인 양의 조성물을 개인에게 투여하는 것을 포함하는, 개인에 있어서 암을 치료하는 방법이다.
본 발명은 트랜스페린 리셉터와 세포질 신호화 파트너와의 연합을 강화하거나 줄임으로써 조절하기 위한 방법을 더욱 제공한다. 세포질 신호화 파트너 와의 트랜스페린 리셉터의 연합은 세포 표면에 제시되는 트랜스페린 리셉터 분자를, 신호화 파트너의 트랜스페린 리셉터에 대한 결합을 조절하는 작용제와 접촉시킴으로써, 영향받을 수 있다. 그것의 결합 및/또는 신호화 파트너와의 트랜스페린 리셉터 연합을 차단하거나 줄이는 작용제가 트랜스페린 리셉터-매개된 염증 또는 면역 반응에 수반되는 생물학적 및 병리학적 프로세스를 조절하는데 사용될 수 있다. 이런 작용을 수반하는 병리학적 프로세스는 종양-관련 세포 성장을 포함한다.
작용제는 트랜스페린 리셉터와 항-트랜스페린 리셉터 항체와 같은 결합 파트너와의 연합을 차단, 감소, 강화 또는 다르게는 조절하는 그들의 능력에 대해 테스트될 수 있다. 특히, 작용제는 트랜스페린 리셉터 상호작용 부위를 포함하는 펩티드를 (전형적으로 그것이 손상되지 않은 살아있는 세포에 존재할때 그것의 선천 입체형태로) 결합 파트너 및 시험 작용제로 배양하고, 시험 작용제가 트랜스페린 리셉터 펩티드에 대한 결합 파트너의 결합을 줄이거나 강화하는지 여부를 결정함으로 써, 그러한 상호작용을 조절하는 능력에 대해 테스트될 수 있다.
작용제, 길항제, 및 트랜스페린 리셉터 작용의 다른 조정자는 본 발명의 범위내에 명백히 포함된다. 이들 작용제, 길항제 및 조정자는 트랜스페린 리셉터에서 항원 결정자 부위중 한가지 이상을 포함하는 또는 그러한 부위의 한가지 이상의 단편, 그러한 부위의 변이체, 또는 그러한 부위의 펩티드유사체를 포함하는 폴리펩티드이다. 이들 작용제, 길항제, 및 트랜스페린 리셉터 조정자 화합물은 선형 또는 고리화 형태로 제공되고, 선택적으로 자연 또는 한가지 이상 아미드 동배체에서 통상적으로 발견되지 않는 한가지 이상 아미노산 잔기를 포함한다. 이들 화합물은 글리코실화될 수 있다. 작용제, 길항제, 및 본 발명의 트랜스페린 리셉터 작용의 다른 조정자는 항체를 참조하여 상술된 구체예와 방법 모두에서 바람직하게 사용된다.
본 발명의 다른 양태는 본원에서 LUCA31 항체에 대한 항원으로서 확인되고 언급되는 트랜스페린 리셉터의 신규 에피토프에 관한 것이다. 이 항원은 다양한 연구, 진단 및 치료 목적을 위한 면역원으로서 사용하기에 적합하다.
특정 구체예에서, 본 발명은 (i) 개인에게서 얻은 혈액 또는 조직 샘플에서 트랜스페린 리셉터의 존재를 분석하는 단계; (ii) 상기 샘플이 정상 (병들지 않은) 혈액 또는 조직 샘플에 비해서 증가된 양의 트랜스페린 리셉터 마커를 갖는지 여부를 검출하는 단계; 및 (iii) 증가된 양의 상기 마커를 포지티브 진단에 서로 관련시키거나 또는 증가된 양의 상기 마커의 부재를 질환에 대한 네거티브 진단에 서로 관련시키는 단계를 포함하는 개인에 있어서 질환의 진단을 돕는 방법이다. 특정 구체예에서, 마커는 항-트랜스페린 리셉터 항체를 사용하여 검출된다. 특정 구체예에서, 방법은 방사선핵종 이미징, 흐름세포측정, 및 면역조직화학으로 구성되는 군으로부터 선택된 기술이다.
도 1은 SW480 세포 용해물에서 LUCA31 단일클론 항체를 사용하는 면역침전 과, 이어서 LUCA31 단일클론 항체를 사용하는 웨스턴 블롯과 ECL+ 검출 시스템을 사용하여 가시화되는 것을 보여준다(Amersham).
도 2는 32 세포주 FACS 배열의 LUCA31 (어둡게 표시됨) 및 EGF (백색) 리셉터 항체 염색을 보여준다.
도 3은 LUCA31이 정제된 트랜스페린 리셉터의 샘플에 결합되지 않는다는 것을 보여준다. 화살표는 겔에서 트랜스페린 리셉터의 위치를 나타낸다.
도 4는 공지된 트랜스페린 리셉터 항체의 존재하에서 HCT15 세포에 대한 LUCA31 결합의 분석을 보여준다.
도 5는 LUCA31를 사용하여 CHO 세포의 FACS 분석을 보여준다. 세포를 pDEF 벡터 단독(왼쪽 패널) 또는 사람 트랜스페린 리셉터를 함유하는 pDEF 벡터(오른쪽 패널)로 트랜스펙션시켰다.
도 6A는 HCT15 세포에의 LUCA31 결합에 대한 트랜스페린의 영향을 보여준다.
도 6B는 HCT15 세포에의 트랜스페린 결합에 대한 LUCA31의 영향을 보여준다.
도 7은 파클리탁셀 단독으로 사용 또는 파클리탁셀 및 5ug/ml LUCA31 항체와의 조합을 사용하여 화학치료법 조합 연구의 결과를 보여준다. 세포 증식을 삼중수소화 티미딘 편입에 의해 측정하였다.
도 8은 HCT15 (A), HCT116 (B) 및 LOVO (C) 세포에서 LUCA31 및 42/6의 활성에 대한 100ug/ml 트랜스페린의 효과를 보여준다.
도 9는 HCT15 세포 주기 진행에 대한 5ug/ml LUCA31의 효과를 보여준다. 처리 및 대조군 세포의 DNA 함량을 프로피듐에 의해 결정하였다. 화살표는 S-상 저지 및 세포사의 히스토그램 지표의 영역을 나타낸다.
도 10은 사람 종양 세포주 패널에서 LUCA31의 활성을 보여준다. 도 10A 은 유방암과 전립선 암으로부터 유도된 세포주에의 LUCA31 결합의 FACS 분석을 보여준다. 데이타가 평균 형광 강도의 함수로서 플롯팅되고 EGFR 염색은 표준으로서 포함된다. 도 10B는 유방암과 전립선 암 세포주에서 LUCA31 의 최대 활성(0.5% 혈청에서 측정됨)을 보여준다. 데이타 값은 lOug/ml과 0.6ug/ml 사이의 항체의 5-점 용량 적정을 사용하여 관찰된 세포 증식의 최대 저해를 나타낸다.
도 11는 사람 혈액 종양 세포주 패널에서 LUCA31의 활성을 보여준다. 도 11A는 혈액 암 세포주로부터 유도된 세포주에의 LUCA31 결합의 FACS 분석을 보여준다. 도 11B는 혈액암 세포주에서 LUCA31의 최대 활성(0.5% 혈청에서 측정됨)을 보여준다.
도 12A는 786-0 세포주의 성장에서 LUCA31의 시험관내 활성을 보여주는 그래프이다. 도 12B는 SKMES-1 세포주에서 LUCA31의 시험관내 활성을 보여주는 그래프이다. 도 2C는 SKBR3 세포주에서 LUCA31의 시험관내 활성을 보여주는 그래프이다. 도 2D는 Colo205 세포주에서 LUCA31의 시험관내 활성을 보여주는 그래프이다.
도 13는 사람 결장 암종 세포주 Colo205의 성장에 대한 LUCA31 및 Mab-ZAP (사포린에 대한 항-IgG 컨쥬게이트)의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 14는 백혈구 증식에 대한 LUCA31의 효과를 보여준다. 정상 사람 백혈구 증식 분석에서 LUCA31과 대조군 IgG1 항체 1B7.11를 비교하였다. PHA를 사용하여 세포를 자극하였고 세포 증식에 대한 효과는 삼중수소화 티미딘 편입에 의해 결정하였다. 항체 농도에 대한 퍼센트 저해의 함수로서 (비-항체 대조군에 비해) 데이타를 플롯팅한다.
도 15는 CD34+ 골수 원종 세포에 대한 LUCA31의 효과를 보여준다. 골수 원종 세포의 2개의 씨딩 밀도를 사용하여 세포 증식 분석에서 LUCA31와 대조군 IgG1 항체1B7.11를 비교하였다.
도 16은 HCT15 종양 성장에 대한 LUCA31이 효과를 보여준다. 도 16A는 중앙 종양 부피 측정을 보여준다. 도 16B는 에러 바와 함께 평균 종양 부피 측정을 보여준다. 각각의 실험 군에 대해서, 첫번째 동물이 1000mm보다 더 큰 종양을 제시할 때까지 데이타를 플롯팅한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 이것으로 제한되지는 않지만 유방암, 결장암, 폐암, 및 전립선 암을 포함하는 다양한 조직 타입의 암 세포에서 발현되는, 사람 트랜스페린 리셉터의 신규 에피토프(본원에서 LUCA31 에피토프라고 부름)를 제공한다. 더 나아가, 본 발명은 이 트랜스페린 리셉터 에피토프에 결합하는 단일클론 항체 및 폴리펩티드와 이들 항체 및 폴리펩티드를 만들고 트랜스페린 리셉터의 발현 및/또는 과도- 발현과 관련된 다양한 질환 사람 암을 진단하고 치료하는데 사용하는 방법을 제공한다.
이전의 트랜스페린 리셉터 항체에 대해 떠올랐던 한가지 이슈는 이들 항체가 결합하는 에피토프의 조직 분포의 비교적 광범위한 프로파일로부터 나온다. 본 발명은 많은 고형 종양 세포주에서 강한 항-증식 활성을 갖는, 본원에서 때때로 LUCA31 항체로 불리는 항체에 관한 것이다. LUCA31 항체는 유일하고 다른 트랜스페린 리셉터 항체보다 좀더 제한된 정상 조직 분포를 보이는 사람 트랜스페린 리셉터에서의 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 통상 트랜스페린 리셉터가 풍부한 조직인 뇌 내피의 염색은(예를 들어, Jefferies et al., Transferrin receptor onendothelium of brain capillaries, Nature 312,162-163 (1984) ; Orte, et al., A comparison of blood-brain barrier and blood-nerve barrierendothelial cell markers, Anat Embryol 199, 509-517 (1999) ; Rothenberger et al., Coincident expression and distribution ofmelanotransferrin and transferrin receptor in human brain capillary endothelium, Brain Res 712, 117-121 (1996) 참조), LUCA3 1와의 매우 제한된 반응성을 보여준다. 섬 세포를 포함하는 췌장은, 트랜스페린 리셉터 항체로 포지티브으로 염색하는 것으로 나타났지만 (Gatter, 1983), 본 발명자들은 LUCA31와의 제한된 췌장 조직 염색을 보았다. 추가적으로, 공개된 데이타는 트랜스페린 리셉터가 Kupfer 세포와 간 내의 간세포 모두에 존재한다는 것을 보여준다(Gatter, 1983), 그러나 LUCA31으로의 분석은 간 조직 염색을 보여주지 않았다. 함께 고려할 때, LUCA31 에피토프의 강한 활성과 유일한 조직 분포 프로파일은 LUCA31 및 관련 항체가 다른 트랜스페린 리셉터 항체와 구별된다는 이론적 근거를 제공하고 유의한 치료와 영리적인 이득을 제공할 수 있다.
I. 일반적인 기술
본 발명의 실행은 달리 지시하지 않으면, 당업계 기술내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술을 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래의 기술을 채택할 것이다. 그러한 기술은 다음과 같은 문헌에서 충분히 설명된다 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 2판 (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular- Biology,Hwnana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987);Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.);Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) ; PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994) ; Current Protocolsin Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997) ; Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practicalapproach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies : a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995) ; 및 Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J. B. Lippincott Company, 1993).
II. 정의
"트랜스페린 리셉터"는 본 발명의 항체가 그것에 대하여 지시되는 대략 90kD 내지 100kD의 분자량을 갖는 폴리펩티드 항원을 말한다. 트랜스페린 리셉터는 항-트랜스페린 리셉터 항체에 의해 결합된 세포 표면 단백질이고 결장 및 십이지장을 포함하는 몇가지 정상 조직과 몇가지 타입의 암종에 존재한다. 이 항원은 한가지 이상의 다른 에피토프를 가질 수 있다. 항체 LUCA31가 결합하는 사람 트랜스페린 리셉터의 신규 에피토프는 본원에서 LUCA31 에피토프라 부르고, 본 발명에서 특별한 관심이 대상이다. 현재 트랜스페린 리셉터, 및 LUCA31 에피토프가, 그들의 정상 조직 대응부와 비교해서, 특정 암 세포에서 과도-발현될 수 있다고 믿어진다. 특정 구체예에서, 트랜스페린 리셉터의 특성에 대한 참조는 일반적으로 특별히 언급할 목적이다.
트랜스페린 리셉터 작용의 작용제, 길항제, 및 다른 조정자는 명백히 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이들 작용제, 길항제 및 조정자는 트랜스페린 리셉터에서 항원 결정자 부위의 한가지 이상을 포함하거나, 또는 그러한 부위, 그러한 부위의 변이체, 또는 그러한 부위의 펩티드유사체의 한가지 이상의 단편을 포함하는 폴 리펩티드이다. 이들 작용제, 길항제, 및 트랜스페린 리셉터 조정자 화합물이 선형 또는 고리화 형태로 제공되고, 선택적으로 자연 또는 한가지 이상의 아미드 동배체에서 통상적으로 발견되지 않는 한가지 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 이들 화합물은 글리코실화될 수 있다.
보다 구체적으로는, 본원에서 사용된 용어 "트랜스페린 리셉터 조정자"는 (1) 사람 트랜스페린 리셉터와 그것의 선천 리간드 또는 항-트랜스페린 리셉터 항체와의 사이에 상호작용을 붕괴 또는 차단할 수 있고 ; (2)사람 트랜스페린 리셉터 및 그것의 선천 리간드 또는 항-트랜스페린 리셉터 항체에 결합할 수 있고; (3) 사람 트랜스페린 리셉터 및 그것의 선천 리간드 또는 항-트랜스페린 리셉터 항체에 결합할 수 있는 항체를 키우는데 사용될 수 있는 항원 부위를 함유하고; (4)사람 트랜스페린 리셉터 및 그것의 선천 리간드 또는 항-트랜스페린 리셉터 항체에 결합할 수 있는 항체의 선별에 사용될 수 있는 항원 부위를 함유하고; (5) 사람 트랜스페린 리셉터와 그것의 선천 리간드 또는 항-트랜스페린 리셉터 항체 사이의 상호작용을 붕괴 또는 차단할 수 있는 항체를 키우는데 사용될 수 있는 항원 부위를 함유하고; (6) 사람 트랜스페린 리셉터와 그것의 선천 리간드 또는 항-트랜스페린 리셉터 항체 사이의 상호작용을 붕괴 또는 차단할 수 있는 항체의 선별에 사용될 수 있는 항원 부위를 함유하는 어떠한 화합물로서 정의된다. 트랜스페린 리셉터 조정자는 그들의 활성이 정상 트랜스페린 리셉터 생물학적 활성을 각각 강화 또는 저해하는지 여부에 따라 "트랜스페린 리셉터 작용제" 또는 "트랜스페린 리셉터 길항제"가 될 수 있다.
트랜스페린 리셉터 작용제, 길항제 및 조정자는 트랜스페린 리셉터 변이체, 트랜스페린 리셉터 펩티드 길항제, 펩티드유사체, 및 작은 분자, 항-트랜스페린 리셉터 항체 및 면역글로불린 변이체, 아미노산 치환, 결손, 및 첨가 변이체, 또는 어떠한 그것의 조합을 포함하는 사람 트랜스페린 리셉터의 아미노산 변이체, 및 키메릭 면역글로불린을 포함한다. 본 발명의 트랜스페린 리셉터 작용제, 길항제 및 조정자는 그것의 선천 리간드 또는 항-트랜스페린 리셉터 항체에 대한 사람 트랜스페린 리셉터의 결합에 수반된 트랜스페린 리셉터 도메인의 본 발명자들의 확인에 근거한다. 따라서, 본 발명은 사람 트랜스페린 리셉터의 한가지 이상의 항-트랜스페린 리셉터 결합 도메인을 복제 또는 흉내내는 분자 구조를 갖는 트랜스페린 리셉터 작용제, 길항제 및 조정자를 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "트랜스페린 리셉터 변이체"는 아미노산 치환, 결손, 및 첨가 변이체, 또는 어떠한 그것의 조합을 포함하는 사람 트랜스페린 리셉터의 어떠한 아미노산 변이체를 나타낸다. 정의는 사람 트랜스페린 리셉터/비-사람 키메라와 같은 키메릭 분자 및 다른 하이브리드 분자를 포함한다. 분자의 변이체 또는 하이브리드 영역(들)을 포함하는 트랜스페린 리셉터 변이체 분자의 어떠한 단편이 또한 정의에 포함된다.
"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 한가지 이상의 항원 인식 부위를 통해 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드, 등과 같은 표적에의 특이적 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어는 손상되지 않은 다클론성 또는 단일클론 항체는 물론이고, 그것의 단편(Fab, Fab',F(ab')2, Fv와 같은), 단일 사슬 (ScFv), 그것의 돌연변이, 자연적으로 일어나는 변이체, 필요한 특이성의 항원 인식 부위와 함께 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 사람화 항체, 키메릭 항체, 및 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 어떠한 다른 변경된 구성을 포함한다.
"단일클론 항체"는 단일클론 항체는 항원의 선택적인 결합에 수반되는 아미노산으로 구성되는 (자연적으로 일어나는 그리고 비- 자연적으로 일어나는) 균질한 항체 집단을 말한다. 단일클론 항체는 매우 특이적이고, 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 용어 "단일클론 항체" 손상되지 않은 단일클론 항체 및 전장 단일클론 항체는 물론이고, 그것의 단편 (Fab, Fab', F(ab')2, Fv와 같은), 단일 사슬 (ScFv), 그것의 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 사람화 단일클론 항체, 키메릭 단일클론 항체, 및 필요한 특이성과 항원에 결합하는 능력의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 어떠한 다른 변경된 구성도 포함한다. 항체의 공급원 또는 그것이 (예를 들어, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 유전자이식 동물, 등에 의해) 만들어지는 방식에 관해 제한하려는 의도는 아니다. 용어는 "항체"의 정의에서 상술한 단편 등은 물론이고 전체 면역글로불린을 포함한다.
"사람화" 항체는 비-사람 종으로부터 면역글로불린으로부터 유도된 항원 결합 부위 및 사람 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 근거한 분자의 남아있는 면역글로불린 구조를 갖는, 일반적으로 재조합 기술을 사용하여 제조된 키메릭 분자 를 말한다. 항원- 결합 부위는 일정한 도메인 위에 융합된 완전한 가변 도메인 또는 가변 도메인에서 적절한 틀구조 영역 위에 이식된 오직 상보성 결정 영역 (CDR)중의 하나를 포함할 수 있다. 항원 결합 부위는 야생형이 되거나 또는 한가지 이상의 아미노산 치환에 의해 변경될 수 있다. 이것은 사람 개인에서 면역원으로서 일정한 영역을 제거하지만, 외래 가변 영역에의 면역 반응의 가능성은 남아있다 (LoBuglio, A. F. et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 4220-4224). 또다른 접근은 사람 형태에 가능한 가깝게 그들을 재성형하도록 하기 위해 사람-유도된 일정한 영역을 제공하는 것은 물론이고, 가변 영역을 변경하는 것에 초점을 맞춘다. 중쇄와 경쇄 모두의 가변 영역은 주어진 종에서 비교적 보존되고 추정상으로 CDR에 대해 스캐폴딩을 제공하는 4개의 틀구조 영역(FRs)의 측면에 위치한, 문제의 항원에 반응하여 변하고 결합 능력을 결정하는, 3 상보성-결정 영역 (CDR)을 함유한다고 알려져있다. 비인간 항체가 특정한 항원에 대해서 제조될 때, 가변 영역은 변경될 사람 항체에 존재하는 FRs에 있는 비인간 항체로부터 유도된 CDR을 이식함으로써 "재성형" 또는 "사람화"될 수 있다. 다양한 항체에 대한 이러한 접근의 응용은 Sato, K., et al., (1993) Cancer Res 53: 851-856. Riechmann, L., et al., (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen, M., et al., (1988) Science 239: 1534-1536; Kettleborough, C. A., et al., (1991) Protein Engineering 4: 773-3783; Maeda, H., et al., (1991) Human Antibodies Hybridoma 2: 124-134; Gorman, S. D., et al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 4181-4185; Tempest, P. R., et al., (1991) Bio/Technology 9: 266-271; Co, M. S., et al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:2869- 2873; Carter, P., etal., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 4285-4289; 및 Co, M. S. etal., (1992) J Immunol 148:1149-1154에 의해 보고되었다. 일부 구체예에서, 사람화 항체는 모든 CDR 서열을 보존한다 (예를 들어, 마우스 항체로부터 모든 6개의 CDR를 함유하는 사람화 마우스 항체). 다른 구체예에서, 사람화 항체는 본래의 항체에 대해서 변경되는 하나 이상의 CDR (1, 2, 3, 4, 5, 6)를 갖고, 이것은 또한 본래의 항체로부터 하나 이상의 CDR로부터 "유도된" 하나 이상의 CDR라고 명명한다.
항체 또는 폴리펩티드에 "특이적으로 결합하는" 또는 "우선적으로 결합하는" (상호교환가능하게 본원에서 사용됨) 에피토프는 당업계에서 잘 이해되는 용어이고 그러한 특이적 또는 우선적인 결합을 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져있다. 분자는 만일 그것이 대안의 세포 또는 물질과 하는 것보다, 더큰 지속기간 및/또는 더 큰 친화력을 가지고 특정한 세포 또는 물질과 좀더 자주, 보다 빠르게 반응 또는 연합한다면, "특이적 결합" 또는 "우선적인 결합"을 나타낸다고 말한다. 항체는 그것이 다른 물질에 결합하는 것보다, 더큰 친화력, 갈망을 가지고, 보다 쉽게, 및/또는 더큰 지속기간을 가지고 결합할때, 표적에 "특이적으로 결합하는" 또는 "우선적으로 결합한다". 예를 들어, 특이적으로 또는 우선적으로 트랜스페린 리셉터 에피토프에 결합하는 항체는 그것이 다른 트랜스페린 리셉터 에피토프 또는 비-트랜스페린 리셉터 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화력, 갈망을 갖고, 보다 쉽게, 및/또는 더 큰 지속기간을 갖고, 이 트랜스페린 리셉터 에피토프에 결합하는 항체이다. 그것은 이러한 정의를 읽음으로써 또한 예를 들어, 특이적으로 또 는 우선적으로 첫번째 표적에 결합하는 항체 (또는 부분 또는 에피토프)는 특이적으로 또는 우선적으로 두번째 표적에 결합하거나 하지 않을 수 있다는 것이 이해된다. 그러한 것으로서, "특이적 결합" 또는 "우선적인 결합"은 배타적인 결합을 반드시 요구하는 것은 아니다(비록 그것이 포함할 수는 있지만). 일반적으로, 반드시는 아니지만, 결합에 대한 참조는 우선적인 결합을 의미한다.
에피토프임과 관련하여 용어 "면역학적으로 활성인" 또는 "면역학적으로 활성으로 남아있는"은 다른 조건하에서, 예를 들어, 에피토프가 감소 및 변성 조건에 처한 후에 항체 (예를 들어, 항-트랜스페린 리셉터 항체)가 에피토프에 결합하는 능력을 말한다.
다른 생물학적 기능은 이것으로 제한되지는 않지만, 트랜스페린 리셉터 (이것으로 제한되지는 않지만 난소, 전립선, 췌장, 폐, 결장, 또는 유방암 세포를 포함하는 암 세포에 있는 트랜스페린 리셉터를 포함)에 결합하는 능력; 시험관내 또는 생체내에서 살아있는 세포의 표면위에 노출되는 트랜스페린 리셉터의 일부분에 결합하는 능력; 화학치료제를 트랜스페린 리셉터를 발현하는 암 세포 (난소, 전립선, 췌장, 폐, 결장, 또는 유방암 세포와 같은)에 송달하는 능력; 치료제 또는 검출가능한 마커를 트랜스페린 리셉터를 발현하는 암 세포 안으로 송달하는 능력을 포함하여 항-트랜스페린 리셉터 항체와 관련된다. 본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드 (항체를 포함)는 이들 특성들중 어떠한 한가지 이상을 가질 수 있다.
"항-트랜스페린 리셉터 등가 항체" 또는 "항-트랜스페린 리셉터 등가 폴리펩 티드"는 예를 들어 결합 특이성과 같이 항-트랜스페린 리셉터 항체와 연합된 한가지 이상의 생물학적 기능을 갖는 항체 또는 폴리펩티드를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "작용제"는 생물학적, 제약, 또는 화학 화합물을 말한다. 비-제한 예는 단순 또는 복합 유기 또는 무기 분자, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 항체, 항체 유도체, 항체 단편, 비타민유도체, 탄수화물, 독소, 또는 화학치료 화합물를 포함한다. 다양한 화합물 예를 들어, 작은 분자 및 올리고머 (예를 들어, 올리고펩티드 및 올리고뉴클레오티드), 및 다양한 코어 구조에 기반한 합성 유기 화합물이 합성될 수 있다. 게다가, 식물 또는 동물 추출물, 등과 같이 다양한 자연 공급원은 선별을 위한 화합물을 제공할 수 있다. 당업자들은 본 발명의 작용제의 구조적 성질에 대한 제한이 없다는 것을 쉽게 인식할 수 있다.
본 발명의 방법에 채택되는 작용제는 무작위로 선택되거나 또는 합리적으로 선택 또는 설계될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 작용제가 트랜스페린 리셉터와 그것의 선천 결합 파트너 또는 공지된 항체와의 연합에 수반된 특이적 서열을 고려하지 않고 무작위로 선택될 때, 작용제는 무작위로 선택된다고 말한다. 무작위로 선택된 작용제의 예는 화학 라이브러리 또는 펩티드 조합의 라이브러리의 사용이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 작용제가 작용제의 작용과 연결하여 표적 부위의 서열 및/또는 그것의 입체형태를 고려하는 무작위가 아닌 기초로 선택될 때, 결합제는 합리적으로 선택 또는 설계된다고 말한다. 항-트랜스페린 리셉터 작용제에 관하여, 항체가 길러지고 따라서 트랜스페린 리셉터/항-트랜스페린 리셉터 상호작용을 차단하는 작용제에 대한 작용의 3개 이상의 부위에 대해, 트랜스페린 리셉터에 3 이상의 에피토프가 존재한다고 현재 믿어진다. 본 발명은 또한 현재 공지되거나 또는 나중에 확인되든지 간에, 비록 다른 리간드와 그들의 활성 트랜스페린 리셉터-상호작용 부위가 또한 본 발명의 범위내에 포함되지만, 트랜스페린 리셉터와 그것의 선천 결합 파트너 사이의 상호작용의 부위에서 작용하는 작용제를 포함한다. 작용제는 리셉터/리간드 및/또는 트랜스페린리셉터/항-트랜스페린 리셉터 항체 복합체의 접촉 부위를 구성하는 펩티드 서열을 이용함으로써 합리적으로 선택 또는 합리적으로 설계될 수 있다. 예를 들어, 합리적으로 선택된 펩티드 작용제는 그것의 선천 환경에서 그것이 살아있는 세포의 표면위에 노출될 때, 아미노산 서열이 트랜스페린 리셉터에 나타나는 에피토프와 동일한 펩티드가 될 수 있다. 그러한 작용제는 원할 때, 항-트랜스페린 리셉터 항체로의 또는 선천 리간드로의 결합에 의해, 항-트랜스페린 리셉터 항체와 트랜스페린 리셉터와의 연합, 또는 트랜스페린 리셉터와 것의 선천 리간드와의 연합을 줄이거나 차단할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표지된"은, 항체에 대하여, 검출가능한 물질과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적인 표지화는 물론이고, 방사능 작용제 또는 형광발색단 (예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 또는 피코에리트린 (PE))과 같이 검출가능한 물질을 항체에 커플링(즉, 물리적인 연결)함으로써 항체의 직접적인 표지화를 포함하려는 의도이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "연합"은, 항체에 대하여, 작용제로의 공 유 및 비-공유 부착 또는 결합(예를 들어, 화학치료제)을 포함한다. 항체는 부착을 통해 통상적인 플랫폼으로의 직접적인 결합 또는 간접적인 결합에 의해 작용제 (예를 들어, 화학치료제)와 연합될 수 있고, 따라서 항체가 결합하는 암 세포로 작용제의 국소화를 지시하도록 하고, 여기서 항체와 작용제는 작용제가 항체가 결합하는 동일한 암 세포에 표적화되도록 하거나 또는 작용제의 효능이 감소되지 않도록 하는 생리학적 조건 하에서 실질적으로 해리하지 않는다.
"생물학적 샘플"은 개인으로부터 얻은 다양한 샘플 타입을 포함하고 진단 또는 모니터링 분석에 사용될 수 있다. 정의는 침, 혈액 및 생물학적 기원의 다른 액상 샘플, 생체검사 표본 또는 조직 배양 또는 그들로부터 유도된 세포, 및 그것의 자손, 예를 들어, 난소, 폐, 전립선, 췌장, 결장, 및 유방 조직으로부터 바람직한 구체예에서 암을 가질 것으로 의심되는 개인으로부터 수집된 조직 샘플로부터 얻은 세포와 같은 고형 조직 샘플을 포함한다. 정의는 또한 시약으로 처리, 가용화, 또는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 특정 성분에 대한 풍부, 또는 절편화 목적을 위해 반-고체 또는 고체 매트릭스에 파묻음(embed)으로써 그들의 획득 후에, 어떠한 방식으로 조작된 샘플을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 임상적인 샘플을 포함하고, 또한 배양, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체, 및 조직 샘플에서 세포를 포함한다 .
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입물의 벡터(들) 편입을 위해 수령자가 될 수 있거나 된 개별적인 세포 또는 세포 배양을 포함한다. 숙주 세포 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 자손은 자연, 우연, 또는 계획적 돌연변이로 인해 본래 의 모 세포와 완전히 동일(형태학 또는 게놈 DNA 보체에서)할 필요는 없을 수 있다. 숙주 세포는 생체내에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)로 트랜스펙션된 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "전이의 발달을 지연시킴"은 전이의 발달을 뒤로 미루고, 저지하고, 늦추고, 지체시키고, 안정화하고/또는 연기하는 것을 의미한다. 이러한 지연은 암의 이력 및/또는 치료되는 개인에 따라 시간의 길이는 변화할 수 있다. 당업자들에게 분명한 바와 같이, 충분한 또는 상당한 지연은 사실상, 개인이 전이를 발달시키지 않는다는 점에서 예방을 포함한다.
"효과적인 양"의 제약 조성물은, 하나의 구체예에서 제한 없이, 종양의 크기가 작아짐(암 환경에서, 예를 들어, 유방암 또는 전립선 암), 암 세포 성장의 방해, 전이의 발전을 지연, 질환으로부터 기인하는 증상을 감소시킴, 질환으로부터 고통받는 사람들의 삶의 질을 증가시킴, 치료하는데 필요한 다른 약제의 용량을 감소시킴, 표적화 및/또는 내재화를 통해서 또다른 약제의 효과를 강화함, 질환의 진행을 지연시킴, 및/또는 개인의 생존을 연장함과 같은 임상적인 결과를 포함하여, 유익한 또는 원하는 결과를 발휘하기에 충분한 양이다. 한가지 이상의 투여로 효과적인 양을 투여할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 효과적인 양의 약물, 화합물, 또는 제약 조성물은 직접적으로 또는 간접적으로, 암 세포의 증식(또는 파괴)을 줄이고 암 세포의 발달, 또는 성장, 전이를 줄이고 및/또는 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 구체예에서, 효과적인 양의 약물, 화합물, 또는 제약 조성물은 또다른 약물, 화합물, 또는 제약 조성물과 연결하여 달성 또는 달성되지 않을 수 있다. 따라서, "효과적인 양"은 한가지 이상의 화학치료제를 투여하는 환경에서 고려될 수 있고, 만일, 한가지 이상의 다른 작용제와 결합하여, 바람직한 결과가 달성되거나 될 수 있다면, 단일 작용제가 효과적인 양으로 주어지는 것이 고려될 수 있다. 개인의 요구가 변하지만, 효과적인 양의 각각의 성분의 최적의 범위의 결정은 당업계의 기술내에 있다. 전형적인 투여량은 0.1- 내지 100mg/kg/체중을 포함한다. 바람직한 투여량은 1-내지 100-mg/kg/체중을 포함한다. 가장 바람직한 투여량은 10- 내지 100-mg/kg/체중을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 분자 또는 작용제, 항체, 조성물 또는 세포, 등은 그 핵산 분자, 작용제, 항체, 조성물, 또는 세포, 등이 실질적으로 그것의 원래의 공급원으로부터 오염물질 핵산 분자, 항체, 작용제, 조성물, 또는 세포로부터 분리될 때, "분리된다"고 말한다.
"개인"은 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 사람이다. 포유동물은 이것으로 제한되지는 않지만, 농장 동물, 스포츠 동물, 애완용, 영장류, 마우스와 래트를 포함한다.
용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 어떠한 길이의 아미노산의 폴리머를 말하며, 상호교환가능하게 본원에서 사용된다. 폴리머는 선형 또는 분지될 수 있고, 그것은 변경된 아미노산을 포함할 수 있고, 그것은 비-아미노산에 의해 저지될 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개재, 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지화 성분과의 컨쥬게이션과 같이 어떠한 다른 조작 또는 변경에 의해 변경된 아미노산 폴리머를 포함한다.
당업계에 공지된 다른 변경은 물론이고, 예를 들어, 아미노산의 한가지 이상의 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산, 등을 포함)를 함유하는 폴리펩티드가 정의내에 또한 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드가 항체에 기반하기 때문에, 폴리펩티드가 단일 사슬 또는 연합된 사슬로서 일어날 수 있다는 것이 이해된다. 본원에서 기술된 트랜스페린 리셉터 펩티드 작용제, 길항제 및 조정자 (항-트랜스페린 리셉터 항체를 포함)의 펩티드유사체가 본 발명의 범위내에 또한 포함된다. 그러한 펩티드유사체는 아미노산의 아미노산 또는 N-알킬화 종의 D 이성체와 같이, 한가지 이상의 아미노산 잔기가 자연에서 통상 발견되지 않는 아미노산 잔기로 치환되는 펩티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 펩티드유사체는 트랜스페린 리셉터 펩티드 작용제, 길항제 또는 조정자에서의 한가지 이상의 아미드 결합(--C(.dbd.O)--NH--)를 아미드 동배체로 치환함으로써 구성된다. 적절한 아미드 동배체는 --CH.sub.2 --NH--, CH. sub.2 --S--,--CH.sub.2 --S (O).sub.n -- (이때 n은 1 또는 2),--CH.sub.2 --CH. sub.2 --, - -CH. dbd.CH-- (E 또는 Z),--C(.dbd.O)--CH.sub.2 --,--CH(CN)--NH--, --C (OH)--CH.sub.2 --, 및--O--C(.dbd.O)--NH--를 포함한다. 아미드 동배체로의 치환에 적절한 후보자인, 트랜스페린 리셉터 펩티드 작용제, 길항제 또는 조정자에서의 아미드 결합은 트랜스페린 리셉터 펩티드 작용제, 길항제 또는 조정자 치료의 의도된 대상의 내생의 에스테라아제 또는 프로테아제에 의해 가수분해가능한 결합을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 순수한"은 50% 이상 순수한 (즉, 오염물질이 없음), 보다 바람직하게는 90%이상 순수한, 보다 바람직하게는 95%이상 순수한, 보다 바람직하게는 98%이상 순수한, 보다 바람직하게는 99%이상 순수한, 또는 그 이상 순수한 재료를 말한다.
"독소"는 세포내에서 역 반응을 초래하는 어떠한 물질을 말한다. 예를 들어, 암 세포에 지시된 독소는 암 세포에 대해 부작용, 때때로 해로운 효과를 갖는다. 독소의 예는 이것으로 제한되지는 않지만, 방사성 동위원소, 칼리케아미신, 및 메이탄시노이드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"은 바람직하게는 임상적인 결과를 포함하여, 유익한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익한 또는 원하는 임상적인 결과는 이것으로 제한되지는 않지만, 다음 중 한가지 이상을 포함한다: 암 또는 다른 병든 세포의 증식을 줄이고(또는 파괴함), 암에서 발견된 암 세포의 전이를 줄임, 종양의 크기를 줄임, 질환으로부터 기인하는 증상을 감소시킴, 질환으로 고통받는 사람들의 삶의 질을 증가시킴, 질환을 치료하는데 요구되는 다른 약제의 용량을 줄임, 질환의 진행을 지연시키고 및/또는 개인의 생존을 연장시킴.
III.항체와 폴리펩티드를 만드는 방법
단일클론 항체를 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 채택될 수 있는 하나의 방법은 Kohler 및 Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)의 방법 또는 그것의 변경이다. 전형적으로, 마우스와 같은 비-사람 종에서 단일클론 항체가 개발된다. 일반적으로, 마우스 또는 래트가 면역법에 사용되지만 다른 동물이 사용될 수 있 다. 사람 트랜스페린 리셉터를 함유하는 면역원 양의 세포, 세포 추출물, 또는 단백질 제제로 마우스를 면역화함으로써 항체가 생산된다. 면역원은 이것으로 제한되지는 않지만, 원시 세포, 배양된 세포주, 암 세포, 핵산, 또는 조직이 될 수 있다. 하나의 구체예에서 배양된 사람 종양 세포주가 사용된다. 또다른 구체예에서, 사람 방광 또는 췌장 원종 세포가 사용된다. 면역화에 사용된 세포, 예를 들어, 사람 태아 신장, 방광세포 또는 사람 췌장 원종 세포는 면역원으로서 그들의 사용에 앞서 시간 기간 동안 (24시간 이상) 배양될 수 있다. 세포 (예를 들어, 사람 태아 신장, 방광세포 또는 사람 췌장 원종 세포)는 그들 스스로 또는 Ribi와 같은 비-변성 보조약과 조합하여 면역원으로 사용될 수 있다. 일반적으로, 세포는 손상되지 않고 유지되어야 하고 바람직하게는 면역원으로서 사용될 때 가변적이다. 손상되지 않은 세포는 면역화 동물에 의해 포획된 세포보다 항원이 더 잘 검출되도록 허용할 수 있다. 변성 또는 까칠까칠한 보조약, 예를 들어, Freud의 보조약의 사용은 사람 태아 신장 또는 다른 세포를 포획할 수 있어서 좌절된다. 면역원은 2주에 한번, 또는 매주와 같은 주기 간격으로 여러번 투여될 수 있고, 또는 동물에서 (예를 들어, 조직 재조합에서) 생존력을 유지하기 위한 그러한 방식으로 투여될 수 있다. 실시예 2는 항-트랜스페린 리셉터 항체를 발생하는데 사용된 방법을 기술하고 트랜스페린 리셉터에 결합하는 다른 단일클론 항체를 발생하는데 사용될 수 있다.
하나의 구체예에서 면역원으로서 트랜스페린 리셉터를 과도-발현하는 숙주 세포를 사용함으로써 트랜스페린 리셉터에 결합하는 단일클론 항체가 얻어진다. 그 러한 세포는 예로서 제한에 의한 것이 아니고, 사람 태아 신장 세포 및 사람 결장 암 세포를 포함한다.
항체 반응을 모니터하기 위해, 작은 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액)은 동물로부터 얻을 수 있고 면역원에 대해 항체 역가를 시험한다. 비장 및/또는 몇개의 큰 림프절을 제거하고 단일 세포로 분리될 수 있다. 만일 원한다면, 비장 세포는 (비-특이적으로 점착성 세포의 제거 후에) 세포 부유액을 항원으로 코팅된 플레이트 또는 웰에 도포함으로써 선별될 수 있다. 항원에 특이적인 막-결합 면역글로불린을 발현하는 B-세포는 플레이트에 결합할 것이고, 부유액의 나머지를 헹구지 않는다. 결과의 B-세포, 또는 모든 해리된 비장 세포는 그후 골수종 세포와 융합될 수 있다 (예를 들어, X63-Ag8.653 및 Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, CA로부터 입수된 것). 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 비장 또는 림프구를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 하이브리도마는 그후 선택적인 배지에서 배양된다(예를 들어, 하이포잔틴, 아미노프테린, 티미딘 배지, 다르게는 "HAT 배지"로 알려짐). 결과의 하이브리도마는 그후 제한 희석에 의해 플레이팅되고, FACS 또는 면역조직화학 (IHC 스크리닝)을 사용하여 면역원에 특이적으로 결합하는 항체의 제조에 대해 분석된다(예를 들어, 사람 태아 신장 세포의 표면, 암 세포주의 표면, Ag-트랜스페린 리셉터, 태아 방광 절편, 등). 선택된 단일클론 항체-분비 하이브리도마는 그후 시험관내 (예를 들어, 조직 배양 병 또는 공동 섬유 리액터에서), 또는 생체내 (예를 들어, 마우스에서 복수로서)에서 배양된다. 실시예 3은 항-트랜스페린 리셉터 항체를 얻고 선별하는데 이 용된 방법에 대한 세부사항을 더욱 제공한다.
세포 융합 기술에 대한 또다른 대안으로서, 본 발명의 단일클론 항체를 제조하기 위해 EBV 불멸화 B 세포가 사용될 수 있다. 하이브리도마가 확장되고 서브클로닝되고, 만일 원한다면, 상청액은 종래의 분석 과정(예를 들어, FACS, IHC, 방사능면역분석, 효소 면역분석, 형광 면역분석, 등)에 의해 항-면역원 활성에 대해서 분석된다.
또다른 대안에 있어서, 단일클론 항체 항-LUCA31 및 어떠한 다른 등가 항체 는 시퀀싱되고 재조합으로 당업계에 공지된 어떠한 수단에 의해 (예를 들어, 사람화, 충분히 사람 항체 제조를 위한 유전자이식 마우스의 사용, 파지 디스플레이 기술, 등) 제조될 수 있다. 하나의 구체예에서 항-트랜스페린 리셉터 단일클론 항체 는 시퀀싱되고 폴리뉴클레오티드 서열은 그후 발현 또는 증식을 위해 벡터 안으로 클로닝된다. 관심의 항체 서열 인코딩은 숙주 세포에서 벡터에서 유지될 수 있고 숙주 세포는 확장되고 나중에 사용을 위해 냉동될 수 있다.
실시예 4는 선천 신호 서열을 포함하여, 항-트랜스페린 리셉터 단일클론 항체 LUCA31의 카파 경쇄의 핵산 및 상응하는 번역된 단백질 서열을 보여준다.
실시예 4는 항-트랜스페린 리셉터 단일클론 항체 LUCA31의 G 1 중쇄의 핵산 및 상응하는 번역된 단백질 서열을 또한 보여준다.
단일클론 항체 LUCA31의 폴리뉴클레오티드 서열 및 어떠한 다른 등가 항체 는 "사람화" 항체를 생성하고, 친화력, 또는 항체의 다른 특성들을 향상시키기 위해 유전자 조작에 사용될 수 있다. 항체를 사람화하는데 있어서의 일반적인 원리 는 항체의 비-사람 잔부를 사람 항체 서열과 바꾸면서, 항체의 항원-결합 부분의 기본 서열을 유지하는 것을 수반한다. 단일클론 항체를 사람화하기 위해 4개의 일반적인 단계가 존재한다. 이들은: (1) 시작 항체 경 및 중 가변 도메인의 뉴클레오티드 및 예측된 아미노산 서열을 결정하는 단계 (2) 사람화 항체를 설계하는 단계, 즉, 사람화 프로세스 동안에 어떤 항체 틀구조 영역을 사용할지를 결정하는 단계 (3) 실제 사람화 방법론/기술 및 (4) 사람화 항체의 트랜스펙션 및 발현이다. 예를 들어, 미국 특허 Nos. 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 및 6,331,415을 참조하라.
설치동물 또는 변경된 설치동물 V 영역 및 사람 일정한 도메인에 융합된 그들의 관련된 상보성 결정 영역 (CDR)을 갖는 키메릭 항체를 포함하여, 비-사람 면역글로불린으로부터 유도된 항원-결합 부위를 포함하는 많은 "사람화" 항체 분자가 기술되었다. 예를 들어, Winter et al. Nature 349:293-299(1991), Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 4220-4224 (1989), Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538 (1987), 및 Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583 (1987)을 참조할 것. 다른 참고문헌은 적절한 사람 항체 일정한 도메인과 융합에 앞서 사람 지지 틀구조 영역(FR) 안으로 이식된 설치동물 CDR을 기술한다. 예를 들어, Riechmann et al. Nuture 332: 323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988), 및 Jones et al. Nuture 321:522-525 (1986)을 참조하라. 또다른 참고문헌은 재조합으로 감춰진 설치동물 틀구조 영역에 의해 지지된 설치동물 CDR을 기술한다. 예를 들어, 유럽 특허 공보 No. 519,596를 참조하라. 이들 " 사람화" 분자는 사람 수령자에서 그들 부분의 치료 적용의 지속기간과 효과를 제한하는, 설치동물 항-사람 항체 분자를 향한 원치않는 면역 반응을 최소화하도록 설계된다. 또한 이용될 수 있는 항체를 사람화하는 다른 방법은 Daugherty et al., Nucl. Acids Res., 19: 2471-2476 (1991) 및 미국 특허 Nos. 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; 및 5,866,692에 의해 개시된다.
본 발명은 또한 LUCA31과 같은 본 발명의 항체의 단일 사슬 가변 영역 단편 ("scFv")을 포함한다. 짧은 연결 펩티드를 사용함으로써 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 연결함으로써 단일 사슬 가변 영역 단편이 만들어진다. Bird et al. (1988) Science 242: 423-426은 하나의 가변 영역의 카르복시 종말과 다른 가변 영역의 아미노 종말 사이에 대략 3.5 nm를 연결하는 연결 펩티드의 예를 기술한다. 다른 서열의 링커가 설계되고 사용되었다, Bird et al. (1988). 링커는 약물의 부착 또는 고체 지지체에 대한 부착과 같은 추가의 기능을 위해서 차례로 변경될 수 있다. 단일 사슬 변이체가 재조합으로 또는 합성에 의해 제조될 수 있다. scFv의 합성 제조를 위해, 자동화 합성장치가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 제조를 위해, scFv를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적절한 플라스미드가 효모와 같은 진핵생물, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포, 또는 E. coli와 같은 원핵생물 중의 하나인 적절한 숙주 세포 안으로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 라이게이션과 같은 일상적인 조작에 의해 관심의 scFv를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 만들어질 수 있다. 당업계에 알려진 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 결과의 scFv를 분리할 수 있다.
본 발명은 그들의 성질에 크게 영향을 주지 않는 기능적으로 등가한 항체 및 폴리펩티드 그리고 활성을 강화 또는 감소시킨 변이체를 포함하여, 트랜스페린 리셉터 작용제, 길항제, 조정자 및 항체로 변경을 포함한다. 폴리펩티드의 변경은 당업계의 일상적인 관행이고 본원에서 상세하게 설명할 필요는 없다. 변경된 폴리펩티드의 예는 작용 활성을 상당히 해롭게 변화시키지 않는 아미노산 잔기의 보존성의 치환, 아미노산의 한가지 이상의 결손 또는 첨가를 갖는 폴리펩티드, 또는 화학 유사체의 사용을 포함한다. 보존적으로 서로 치환될 수 있는 아미노산 잔기는 이것으로 한정되지는 않지만: 글리신/알라닌; 발린/이소류신/류신; 아스파라긴/글루타민; 아스파르트산/글루탐산; 세린/트레오닌; 리신/아르기닌; 및 페닐알라닌/트리오신을 포함한다. 이들 폴리펩티드는 예를 들어, 다른 당으로 글리코실화, 아세틸화, 및 인산화와 같이 다른 후-번역 변경을 갖는 폴리펩티드는 물론이고, 글리코실화 및 비-글리코실화 폴리펩티드를 또한 포함한다. 바람직하게는, 아미노산 치환은 보존성이 될 것이다, 즉, 치환된 아미노산은 본래의 아미노산의 그것과 유사한 화학 성질을 가질 것이다. 그러한 보존성의 치환은 당업계에 잘 알려져있고, 예는 위에서 제공되었다. 아미노산 변경은 한가지 이상의 아미노산을 변화 또는 변경하는 것에서부터 가변 영역과 같은 영역의 완전한 재설계에 이르기까지 변할 수 있다. 가변 영역에서의 변화는 결합 친화력 및/또는 특이성을 바꿀 수 있다. 변경의 다른 방법은 이것으로 제한되지는 않지만, 효소 수단, 산화 치환 및 킬레이트화를 포함하는 당업계에 알려진 커플링 기술을 사용하는 것을 포함한다. 방사능면역분석을 위해 방사능 부분의 부착과 같이, 예를 들어, 면역분석을 위한 라벨의 부착을 위해 변경이 사용될 수 있다. 당업계에 확립된 과정을 사용하여 변경된 폴리펩티드가 만들어지고 당업계에 공지된 표준 분석을 사용하여 선별될 수 있다.
본 발명은 또한 폴리펩티드 및 본 발명의 항체로부터 한가지 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구체예에서 가변 경쇄 영역의 10 이상의 인접 아미노산 및 가변 중쇄 영역의 10 이상의 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 또다른 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 이종기원 면역글로불린 일정한 영역을 함유한다. 또다른 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 본원에서 기술된 바와 같이 ATCC에 기탁된 하이브리도마로부터 제조된 항체의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 함유한다. 본 발명의 목적을 위해, 항체 융합 단백질은 한가지 이상의 항-트랜스페린 리셉터 폴리펩티드 및 그것이 선천 분자에서 부착되지 않는 또다른 아미노산 서열, 예를 들어, 또다른 영역으로부터 이종기원 서열 또는 상동의 서열을 함유한다.
항-트랜스페린 리셉터 폴리펩티드, 및 다른 트랜스페린 리셉터 작용제, 길항제 및 조정자는 당업계에 공지된 방법에 의해 예를 들어, 합성에의해 또는 재조합으로 생성될 수 있다. 트랜스페린 리셉터 펩티드 작용제, 길항제 및 조정자를 제조하는 한가지 방법은 폴리펩티드의 화학 합성과 이어서 선천 입체형태, 즉, 정확한 디술피드 결합 연결을 얻기에 적절한 산화 조건 하에서 처리를 수반한다. 이는 당업자들에게 잘 알려진 방법론을 사용하여 수행될 수 있다(Kelley, R. F. & Winkler, M. E. in Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J. K., ed., Plenum Press, N. Y., vol. 12, pp 1-19 (1990) ; Stewart, J. M. & Young, J. D. Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co. Rockford, Ill. (1984) ; 또한 U. S. Pat. Nos. 4,105,603; 3,972,859; 3,842,067; 및 3,862,925를 참조하라.)
본 발명의 폴리펩티드는 고체 상 펩티드 합성을 사용하여 편리하게 제조될 수 있다(Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1964) ; Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5132 (1985)).
한층더 또다른 대안에 있어서, 충분히 사람 항체는 특이적 사람 면역글로불린 단백질을 발현하도록 엔지니어링된 시중에서 입수가능한 마우스를 사용함으로써 얻어질 수 있다. 보다 바람직하거나(예를 들어, 충분히 사람 항체) 또는 보다 강한 면역 반응을 생성하기 위해 설계되는 유전자이식 동물은 사람화 또는 사람 항체의 발생을 위해 사용될 수 있다. 그러한 기술의 예는 Abgenix, Inc. (Fremont, CA)으로부터 XenomouseTM 및 Medarex, Inc. (Princeton, NJ)로부터의 HuMAb-Mouse® 및 TC MouseTM 이다.
대안에 있어서, 항체는 재조합으로 만들어질 수 있고 당업계에서 공지된 어떠한 방법을 사용하여 발현될 수 있다. 항체는 숙주 동물로부터 만들어진 항체를 먼저 분리시키고, 유전자 서열을 얻고, 유전자 서열을 사용하여 숙주 세포에서 재조합으로 항체를 발현함으로써(예를 들어, CHO 세포) 재조합으로 만들어질 수 있다. 채택될 수 있는 또다른 방법은 식물(예를 들어, 담배) 또는 유전자이식 밀크에서 항체 서열을 발현하는 것이다. 식물 또는 밀크에서 항체를 재조합으로 발현 하기 위한 방법이 개시되었다. 예를 들어, Peeters, et al. (2001) Vaccine 19: 2756; Lonberg, N. 및 D. Huszar (1995) Iht.Rev. Immunol 13:65; 및 Pollock, et al.(1999) J Immunol Methods 231:147을 참조하라. 예를 들어, 사람화, 단일 사슬, 등 항체의 유도체를 만들기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 또다른 대안에서, 항체가 파지 디스플레이 기술에 의해 재조합으로 만들어질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 Nos. 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 6,265,150; 및 Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)를 참조하라.
관심의 항체 또는 단백질은 당업자들에게 잘 알려진 Edman 분해에 의해 시퀀싱을 할 수 있다. 질량 분석법 또는 Edman 분해로부터 생성된 펩티드 정보는 관심의 단백질을 클로닝하는데 사용되는 프로브 또는 프라이머를 설계하기 위해 사용될 수 있다.
관심의 단백질을 클로닝하는 대안의 방법은 관심의 항체 또는 단백질을 발현하는 세포에 대해서, 정제된 트랜스페린 리셉터 또는 그것의 부분을 사용하여 "패닝"하는 것이다. 관심의 항체 또는 단백질을 발현하는 조직 또는 세포로부터 cDNA 라이브러리를 얻고, 두번째 세포 타입에서 cDNA를 과도-발현하고, 트랜스페린 리셉터에 대한 특이적 결합을 위해 두번째 세포 타입의 트랜스펙션된 세포를 스크리닝함으로써 "패닝" 과정을 수행한다. "패닝"에 의해 세포 표면 단백질에 대한 클로닝 포유동물 유전자 코딩에 사용된 방법의 상세한 설명은 당업계에서 찾아볼 수 있다. 예를 들어, Aruffo, A. 및 Seed, B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,8573-8577 (1987) 및 Stephan, J. et al., Endocrinology 140: 5841-5854 (1999)를 참조 하라.
항-트랜스페린 리셉터 항체를 인코딩하는 cDNA, 및 다른 트랜스페린 리셉터 펩티드 작용제, 길항제 및 조정자가 당업계의 표준 방법에 따라 특정한 세포 타입으로부터 mRNA를 역전사 함으로써 얻어질 수 있다. 특히, mRNA는 앞서 Sambrook, et al.에서 설명한 과정에 따라 다양한 용해 효소 또는 화학 용액을 사용하여 분리되거나 또는 제조업체에 의해 제공된 수반된 지시사항에 따라 (예를 들어, Qiagen, Invitrogen, Promega) 시중에서 입수가능한 핵산-결합 수지에 의해 추출될 수 있다. 합성된 cDNA가 그후 발현 벡터 안으로 도입되어 두번째 타입의 세포에서 관심의 항체 또는 단백질을 제조한다. 발현 벡터는 에피솜 또는 염색체 DNA의 내부 부분으로서 숙주 세포에서 복제가능해야 한다고 암시된다. 적절한 발현 벡터는 이것으로 한정되지는 않지만 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 및 코스미드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다.
관심의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 전기천공법, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 채택하는 트랜스펙션; 유전자총 폭격; 리포펙션; 및 감염 (예를 들어, 벡터가 백시나 바이러스와 같이 전염성 작용제이다)을 포함하는 많은 적절한 수단중 어떠한 것에 의해 숙주 세포 안으로 도입될 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 의존할 것이다.
이종기원 DNA를 과도-발현할 수 있는 어떠한 숙주 세포는 관심의 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자를 분리하기 위한 목적으로 사용될 수 있 다. 포유동물 숙주 세포의 비-제한 예는 이것으로 제한되지는 않지만 COS, HeLa, 및 CHO 세포를 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 만일 존재한다면, 숙주 세포에서 관심의 상응하는 내생의 항체 또는 단백질의 그것보다 약 5배 더 높은, 보다 바람직하게는 10배 더 높은, 좀더 바람직하게는 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. 트랜스페린 리셉터에 대한 특이적 결합을 위한 숙주 세포의 스크리닝은 면역분석 또는 FACS에 의해 달성된다. 세포 과도-발현 관심의 항체 또는 단백질이 확인될 수 있다.
모 트랜스페린 리셉터 펩티드 작용제, 길항제 또는 조정자 분자에 비해서 결과의 단백질의 아미노산 서열에서 첨가, 결손, 또는 변화를 인코딩하는 돌연변이 트랜스페린 리셉터 펩티드 작용제, 길항제, 및 조정자를 제조하기 위해 이제 채택될 수 있는 다양한 기술은 또한 이용가능하다.
본 발명은 본 발명의 항체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 과정에 의해 만들어질 수 있다. 폴리펩티드는 항체의 단백질가수분해 또는 다른 분해에 의해, 상술한 바와 같은 재조합 방법(즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드)에 의해 또는 화학 합성에 의해 제조될 수 있다. 항체의 폴리펩티드는 특히 약 50 이하의 아미노산 더 짧은 폴리펩티드가 화학 합성에 의해 편리하게 만들어진다. 화학 합성의 방법은 당업계에 공지되고 시중에서 입수가능하다. 예를 들어, 항-트랜스페린 리셉터 폴리펩티드는 고체 상 방법을 채택하는 자동화 폴리펩티드 합성장치에 의해 제조될 수 있다.
IV. 폴리펩티드 및 단일클론 항체를 스크리닝하는 방법
몇가지 방법이 트랜스페린 리셉터에 결합하는 폴리펩티드 및 단일클론 항체를 선별하는데 사용될 수 있다. "결합"은 생물학적으로 또는 면역학적으로 관련된 결합, 즉, 면역글로불린 분자가 인코딩되고, 또는 폴리펩티드가 지시되는 유일한 항원에 대해 특이적인 결합을 말하는 것으로 이해된다. 면역글로불린이 비-특이적 표적에 대해서 매우 높은 농도에서 사용될 때 일어날 수 있는 비-특이적 결합을 말하지 않는다. 하나의 구체예에서 단일클론 항체는 표준 스크리닝 기술을 사용하여 트랜스페린 리셉터로의 결합에 대해 선별된다. 이런 식으로, 항-트랜스페린 리셉터 단일클론 항체가 얻어졌다. 부다페스트 조약에 따르면, 항-트랜스페린 리셉터 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마가 2004년 7월 8일에 PTA-6055의 Patent Deposit Designation로 American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Blvd., Manassas VA 20110-2209 에 기탁되었다.
트랜스페린 리셉터에 결합하는 단일클론 항체는 암 조직 및 비-암 세포로의 결합에 대해 선별된다. 하나의 구체예에서 트랜스페린 리셉터에 결합하고 또한 사람 암 세포 또는 조직에 교차 반응성이지만, 정상 세포 또는 조직에는 동일한 정도로 그렇지 않은 단일클론 항체가 선택된다. 스크리닝을 위해 채택될 수 있는 하나의 방법은 면역조직화학 (IHC)이다. 표준 면역조직화학 기술이 당업계의 평균 기술자들에게 공지된다. 예를 들어, 동물 세포 배양 방법 (J. P. Mather and D.Barnes, eds., Academic Press, Vol. 57, Ch. 18 및 19, pp. 314-350, 1998)을 참조하라. 생체검사법, 검시해부, 또는 부검으로부터 생물학적 샘플(예를 들어, 조직)을 얻을 수 있다. 오직 암 세포에만 트랜스페린 리셉터가 존재하는지를 확인 하기 위해서, 항-트랜스페린 리셉터 항체를 사용하여 암을 갖는 개인으로부터 조직에서 트랜스페린 리셉터의 존재를 검출할 수 있고, 암으로부터 고통받는 개인으로부터 다른 비-암 조직 또는 암이 없는 개인으로부터의 조직이 대조군으로 사용된다. 조직을 냉동하는 동안에 (예를 들어, 아가로스 겔 또는 OCT) 손상을 방지하는 고체 또는 반-고체 물질에 파묻고 그후 염색을 위해 절편화하였다. 다른 기관으로부터의 다른 등급에서 암을 사용하여 단일클론 항체를 선별할 수 있다. 스크리닝 목적에 사용될 수 있는 조직의 예는 이것으로 한정되지는 않지만 난소, 유방, 폐, 전립선, 결장, 신장, 피부, 갑상샘, 뇌, 심장, 간, 위, 신경, 혈관, 뼈, 상부 소화관, 및 췌장을 포함한다. 스크리닝 목적에 사용될 수 있는 다른 암 타입의 예는 이것으로 한정되지는 않지만 암종, 아데노암종, 육종, 아데노육종, 임파종, 및 백혈병을 포함한다.
한층더 또다른 대안으로서, BT474 (ATCC# HTB- 20), MCF7 (ATCC# HTB-22), MDA-175 (ATCC# HB-25), MDA-361 (ATCC# HB-27), SK-BR-3 (ATCC# HTB-30), A549 (ATCC# CCL-185), CaLu3 (ATCC# HTB-55) SKMES1 (ATCC# HTB-58), ES-2 (ATCC# CRL-1978), SKOV3 (ATCC# HTB-77), AsPC-1 (ATCC# CRL-1682), HPAFII (ATCC# CRL-1997), Hs700T (ATCC# HTB-147), Colo205 (ATCC# CCL-222), HT29 (ATCC# HTB-38), SW480 (ATCC# CCL-228), SW948 (ATCC# CCL-237), 293 (ATCC# CRL-1573), 786-0 (ATCC# CRL-1932), A498 (ATCC# HTB-44), Caki2 (ATCC# HTB-47), Cos7 (ATCC# CRL-1651), RL65 (ATCC# CRL-10345), SVT2 (ATCC# CCL-163.1), 22Rvl (ATCC# CRL 2505), DU145 (ATCC# HTB-81), LNCaP (ATCC# CRL-1740), PC3(ATCC# CRL-1435), Hs746T(ATCC# HTB 135), TDH-1 (Raven biotechnologies, inc.에서 개발된 독점적 전립선 암 세포주) Rav CA130 (Raven biotechnologies, inc.에서 개발된 독점적 폐암 세포주), Rav9979 (Raven biotechnologies, inc.에서 개발된 독점적 폐암 세포주), Rav9926 (Raven biotechnologies, inc.에서 개발한 독점적 췌장암 세포주), 및 NCI-N87 (ATCC# CRL-5822)와 같은 암 세포주 그리고 그들의 각각의 조직으로부터 정상 세포는 암 조직에 대해 특이적인 단일클론 항체를 선별하는데 사용될 수 있다. 이것으로 한정되지는 않지만, 난소, 유방, 폐, 전립선, 결장, 신장, 피부, 갑상샘, 대동맥 평활근, 및 내피 세포를 포함하는, 다른 기관으로부터 정상 조직으로부터 유도된, 1차, 또는 낮은 계대 세포 배양이 네거티브 대조군으로서 사용될 수 있다. 암 또는 비- 암 세포는 유리 슬라이드 또는 커버글래스, 또는 플라스틱 표면위에서 성장되거나, 또는 WO01/43869에서 기술된 바와 같이, CellArrayTM에서 제조되고 조직에 대해 상술한 바와 같이 IHC를 사용하여, 항체의 결합을 선별할 수 있다. 대안으로서, 비-단백질가수분해 수단을 사용하여 성장 표면으로부터 세포를 제거하고 펠릿으로 만들 수 있고, 이것을 그후 상술한 바와 같이 IHC 분석을 위한 조직으로서 파묻고 처리한다. 세포를 면역결핍 동물 안으로 접종시키고, 종양을 성장시키고, 그후 이 종양을 수확하고, 묻고, IHC 분석을 위한 조직 공급원으로서 사용될 수 있다. 또다른 대안에 있어서, 단일 세포는 형광 분자에 연결된 1차 항체, 2차 "리포터" 항체로 배양함으로써 선별되고 그후 형광 활성화 세포-추리기(sorting) (FACS) 머신을 사용하여 분석할 수 있다.
몇가지 다른 검출 시스템은 항체의 조직 절편으로의 결합을 검출하는데 이용될 수 있다. 전형적으로, 면역조직화학은 1차 항체의 조직에 대한 결합을 수반하고 그후 1차 항체로부터의 종에 대해 반응성인 2차 항체가 발생되고 검출가능한 마커 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, HRP, 또는 디아미노벤제딘, DAB)에 컨쥬게이트되었다. 사용될 수 있는 한가지 대안의 방법은 다클론성 거울 이미지 상보적 항체 또는 PolyMICA이다. D. C. Mangham 및 P. G. Isaacson (Histopathology (1999) 35 (2):129-33)에 의해 기술된 PolyMICA (다클론성 거울 이미지 상보적 항체) 기술은 1차 항체(예를 들어, 항-트랜스페린 리셉터 항체)의 정상 및 암 조직에 대한 결합을 시험하는데 사용될 수 있다. 몇가지 종류의 PolyMICATM 검출 키트는 Binding Site Limited (P. O. Box 4073 Birmingham B29 6AT England)로부터 시중에서 입수가능하다. 제품 No. HK004. D는 DAB 크로마겐을 사용하는 PolyMICATM 검출 키트이다. 제품 No. HK004.는 AEC 크로마겐을 사용하는 PolyMICATM 검출 키트이다. 대안으로서, 1차 항체는 검출가능한 마커로 직접적으로 표지될 수 있다.
적절한 항체를 선택하기 위해 IHC 스크리닝에서 첫번째 단계는 마우스 (예를 들어, 항-트랜스페린 리셉터 항체)에서 기른 1차 항체의 한가지 이상의 면역원 (예를 들어, 세포 또는 조직 샘플)에 대한 결합이다. 하나의 구체예에서 조직 샘플은 다른 기관으로부터 냉동된 조직의 절편이다. 세포 또는 조직 샘플은 암 또는 암이 아니다.
냉동된 조직을 제조하고 고정하거나 하지 않고 절편화하고, 당업계 기술에 친숙한 사람들에게 알려진 많은 방법 중 어떤 것에 의해 IHC를 수행할 수 있다. 예를 들어, Stephan et al. Dev. Biol. 212: 264-277 (1999), 및 Stephan et al.Endocrinology 140: 5841-54(1999) 참조.
V. 항- 트랜스페린 리셉터 항체의 특성화 방법
몇가지 방법을 사용하여 항-트랜스페린 리셉터 항체를 특성화할 수 있다.
한가지 방법은 그것이 결합하는 에피토프를 확인하는 것이다. 에피토프 맵핑은 다양한 공급원 예를 들어, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands)으로부터 시중에서 입수가능하다. 에피토프 맵핑은 항-트랜스페린 리셉터 항체가 결합하는 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프, 즉, 아미노산의 단일 스트레치에 함유된, 또는 단일 스트레치에 반드시 함유되지는 않을 수 있는 아미노산의 3-차원 상호작용에 의해 형성된 입체형태의 에피토프가 될 수 있다. 변하는 길이의 펩티드(예를 들어, 4-6 이상의 아미노산 길이)는 분리 또는 합성될 수 있고(예를 들어, 재조합으로) 항-트랜스페린 리셉터 항체와의 결합 분석에 사용될 수 있다. 항-트랜스페린 리셉터 항체가 결합하는 에피토프는 세포외 서열로부터 유도된 오버랩핑 펩티드를 사용하고 항-트랜스페린 리셉터 항체에 의해 결합을 결정함으로써, 조직적인 스크리닝에서 결정될 수 있다.
항-트랜스페린 리셉터 항체를 특성화하는데 사용될 수 있는 한층더 또다른 방법은 동일한 항원에 결합하는 것으로 알져진 다른 항체, 즉, 트랜스페린 리셉터와의 경쟁 분석을 사용하여 항-트랜스페린 리셉터 항체가 다른 항체와 동일한 에피 토프에 결합하는지를 결정하는 것이다. 트랜스페린 리셉터에 대한 시중에서 입수가능한 항체의 예는 이용가능하고 본원에서 교시된 결합 분석을 사용하여 확인될 수 있다. 경쟁 분석은 당업자들에게 잘 알려져있고, 그러한 과정과 예증 데이타는 실시예에서 더욱 자세히 설명된다. 항-트랜스페린 리셉터 항체는 조직, 암의 타입 또는 그들이 결합하는 종양의 타입에 의해 더욱 특성화될 수 있다.
항-트랜스페린 리셉터 항체를 특성화하는 또다른 방법은 그것이 결합하는 항원에 의한 것이다. 다양한 사람 암으로부터 세포 용해물과 함께 웨스턴 블롯에서 항-트랜스페린 리셉터 항체가 사용되었다. 당업자들에게 공지된 바와 같이, 웨스턴 블롯팅은 변성 또는 비-변성 겔에서 세포 용해물 및/또는 세포 부분을 러닝하고, 단백질을 니트로셀룰로스 페이퍼로 이동시키고, 그후 항체 (예를 들어, 항-트랜스페린 리셉터 항체)로 블롯을 프로빙하여 어떤 단백질이 항체에 의해 결합되는지를 보는 것을 수반할 수 있다. 이 과정은 실시예에서 더욱 상술된다. 항-트랜스페린 리셉터 항체가 결합된 밴다를 분리시키고 질량 분광법을 사용하여 더욱 분석한다. 항-트랜스페린 리셉터 항체가 결합하는 항원이 트랜스페린 리셉터라고 밝혀졌다. 트랜스페린 리셉터는 육종과 같은 다른 타입의 암은 물론이고, 이것으로 제한되지는 않지만 결장, 폐, 유방, 전립선, 난소, 췌장, 신장을 포함하는 다른 조직의 다양한 사람 암과 연합된다. 트랜스페린 리셉터의 더나아간 설명은 하기 실시예에 주어진다.
VI. 항- 트랜스페린 리셉터 항체 및 트랜스페린 리셉터조정자를 사용하여 암을 진단하는 방법
본원에 개시된 방법에 의해 만들어진 트랜스페린 리셉터에 대한 단일클론 항체는 아마도 진단의 목적으로, 이것으로 제한되지는 않지만, 난소, 유방, 폐, 전립선, 결장, 신장, 췌장, 피부, 갑상샘, 뇌, 심장, 간, 위, 신경, 혈관, 뼈, 및 상부 소화관을 포함하는 다양한 조직에서 암세포의 존재 또는 부존재를 확인하기 위해 사용된다. 본원에 개시된 방법에 의해 만들어진 트랜스페린 리셉터에 대한 단일클론 항체는 암 세포의 존재 또는 부재, 또는 그것의 수준을 확인하는데 사용될 수 있고, 이것은 그들이 고형 종양으로부터의 방출 후에 혈액에서 순환하고 있다. 그러한 순환하는 항원은 본원에서 교시된 방법에 따라 검출되는 능력을 보유하는, 손상되지 않은 트랜스페린 리셉터 항원, 또는 그것의 단편이 될 수 있다. 그러한 검출은 당업계에서 통상 사용되는 표준 방법을 사용하여 FACS 분석에 의해 달성될 수 있다.
이들 사용은 트랜스페린 리셉터와 특이적으로 트랜스페린 리셉터에 결합하는 항체 사이에 복합체의 형성을 수반할 수 있다. 그러한 항체의 예는 이것으로 한정되지는 않지만 지정 PTA-6055을 갖고 ATCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 그러한 항-트랜스페린 리셉터 단일클론 항체를 포함한다. 그러한 복합체의 형성은 시험관내 또는 생체내가 될 수 있다. 이론에 의해 제한되지 않고, 단일클론 항체 항-트랜스페린 리셉터는 트랜스페린 리셉터의 세포외 도메인을 통해 트랜스페린 리셉터에 결합될 수 있고 그후 흡수될 수 있다.
본 발명의 진단 방법의 바람직한 구체예에서, 항체는 검출가능한 라벨을 갖는다. 사용될 수 있는 라벨의 예는 플루오로이소티오시아네이트 또는 피코에리트 린과 같은 방사능 작용제 또는 형광발색단을 포함한다.
진단 및 치료 목적으로 시중에서 사용된 다른 공지된 항체에 대해서, 본 발명의 표적 항원은 정상 조직에 널리 발현된다. 그것은 또한 일부 종양에서 상향 조절된다. 따라서, 진단 또는 치료제를 위해 사용될 때 본 발명의 항체의 송달의 특정한 투여량과 경로는 치료되는 특정한 개인은 물론이고, 특정한 종양 또는 질환 상태에 맞게 맞춰질 것이다.
진단을 위해 항체를 사용하는 한가지 방법은 항체를 방사능 또는 방사선비투과성제재에 연결시키고, 항체 개인에게 투여하고 x-선 또는 다른 이미징 머신을 사용하여 항원을 발현하는 암 세포의 표면에서 표지된 항체의 국소화를 가시화함으로써 생체내 종양 이미징이다. 항체는 생리학적 조건에서 결합을 촉진하는 농도로 투여된다.
트랜스페린 리셉터의 검출을 위한 시험관내 기술은 당업계에서 일상적이고 효소 연결된 면역흡착제 분석 (ELISA), 면역침전, 면역형광, 효소 면역분석 (EIA), 방사능면역분석 (RIA), 및 웨스턴 블롯 분석을 포함한다.
본 발명의 양태에서, 종양 또는 신생물의 방사성이미징의 방법, 또는 방사능표지된 항체로 치료의 방법의 효과를 측정하는 방법은 본 발명의 실행 후에, 방사능표지된, 종양-특이적 항체를 개인에게 투여하는 단계를 포함한다. 방사능표지된 항체는 바람직하게는 Technetium-99m, Indium-111, Iodine-131, Rhenium-186, Rhenium-188, Samarium-153, Lutetium-177, Copper-64, Scandium-47, Yttrium-90로 구성되는 군으로부터 선택된 방사능표지를 포함하는 단일클론 또는 다클론성 항체 가 될 수 있다. 항체의 면역반응성을 포함하지 않고 생체내에서 깨지지 않는Iodine-131, Rhenium-188, Holmium-166, Samarium-153 및 Scandium-47과 같은 치료 방사선핵종으로 표지된 단일클론 항체가 특히 바람직하다. 당업자는 다른 방사능 동위원소가 알려져있고, 특이적 적용에 적합할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 방사성이미징은 단일 광량자 방출 컴퓨터 단층 촬영술(Single Photon Emission Computer Tomography:SPECT), 양전자 단층 촬영술(Position Emission Tomography: PET), 컴퓨터 X선 단층 촬영(Computer Tomography: CT) 또는 자기 공명 이미징 (MRI)을 사용하여 수행될 수 있다. 방사능면역이미징에 의해 위치된 전이의 위치의 더 큰 해부상 정의를 허용하는 상호관련 이미징이 또한 계획된다.
다른 방법에서, 암 세포를 제거하고 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 면역조직화학을 위해 조직을 제조한다 (예를 들어, 냉동 화합물에 묻기, 고정하거나 하지 않고 냉동 및 절편화; 항원 복구 및 반대염색의 다양한 방법으로 또는 그것없이 고정 및 파라핀 묻기). 단일클론 항체가 또한 다른 발전의 단계에서 암 세포를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 항체는 또한 어느 개인들의 종양이 그들의 표면에서 미리-결정된 수준에서 항원을 발현하고 따라서 상기 항원에 대해 지시된 항체를 사용하여 면역요법을 위한 후보자인지를 결정하는데 사용될 수 있다. 항체는 난소, 전립선 및 췌장의 원발암 및 전이하는 암 그리고 트랜스페린 리셉터를 발현하는 폐의 원발 암 둘다를 인지한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 검출은 정성 및/또는 정량 검출을 포함할 수 있고 암 세포에서 트랜스페린 리셉터의 발현의 증가된 수준에 대해 측정된 수준을 정상 세포와 비교하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 트랜스페린 리셉터에 결합하는 어떠한 항체와 트랜스페린 리셉터 발현의 수준을 결정하는데 사용될 수 있는 어떠한 다른 방법을 사용하여 , 개인에 있어서 암(난소, 폐, 췌장, 전립선, 결장, 또는 유방암과 같은)의 진단을 돕는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "진단을 돕는" 방법은 이들 방법은 암의 분류, 또는 성질에 관해서 임상적인 결정을 하는 것을 돕는다는 것을 의미하고, 최종적인 진단에 대해서 결정적이 되거나 되지 않을 수 있다. 따라서, 암의 진단을 돕는 방법은 개인으로부터 생물학적 샘플에서 트랜스페린 리셉터의 수준을 검출하고 /또는 샘플에서 트랜스페린 리셉터 발현의 수준을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 항원 또는 그것의 일부를 인식하는 항체가 또한 이것으로 제한되지는 않지만, 혈액, 침, 소변, 폐 유체, 또는 복수 유체를 포함하는 체액에서 살아있거나 또는 죽어가는 암 세포로부터 방출 또는 분비된 항원을 검출하기 위한 진단 면역분석을 생성하는데 사용될 수 있다.
관심의 특정한 종양에서 모든 세포가 트랜스페린 리셉터를 발현하지는 않을 것이고, 다른 조직에 있는 암 세포가 트랜스페린 리셉터를 발현할 수 있고, 따라서 개인은 개인에서 면역요법의 유용성을 결정하기 위해, 암 세포에서 트랜스페린 리셉터의 존재 또는 부재가 선별되어야 한다. 본원에서 개시된 방법에 의해 만들어진 항-트랜스페린 리셉터 항체는 암으로 진단받은 개인이 트랜스페린 리셉터에 대하여 지시된 항체를 사용하여 면역요법에 대한 생각된 후보자가 될 수 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서 암 종양 또는 생체검사 샘플은 트랜스페린 리셉터에대해 지시된 항체를 사용하여 트랜스페린 리셉터의 발현에 대 해 테스트될 수 있다. 트랜스페린 리셉터를 발현하는 암 세포를 갖는 개인이 트랜스페린 리셉터에 대해서 지시된 항체를 사용하여 면역요법을 위해 적절한 후보자이다. 항-트랜스페린 리셉터 항체로 염색은 정상 조직과 암 조직을 구별하는데 사용될 수 있다.
진단 목적을 위해 항-트랜스페린 리셉터 항체를 사용하는 방법은 어떤 종양이 주어진 치료에 가장 반응할 것 같은지, 암, 종양 서브타입 또는 전이 질환의 기원, 및 질환 또는 치료에 대한 반응의 진행을 갖는 개인에 대한 예후를 결정하기 위해, 어떠한 형태의 항암 치료, 예를 들어, 화학치료법 또는 방사선 치료법 전과 후에 유용하다.
본 발명의 조성물은 또한 다른 병든 (비-암) 세포에 적용에 있어서 일반적으로 위에서 기술한 방법을 사용하여, 암 이외의 질환 상태의 진단에 적절하다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적절한 질환 상태는 이것으로 제한되지는 않지만, 개인에서 염증 또는 자가면역 반응과 관련된 질환 또는 장애를 포함한다. 상술한 방법 은 개인에서 염증 또는 자가면역 반응을 조절하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물과 방법을 사용하여 진단 및/또는 치료를 받을 수 있는 염증 및 자가면역 장애로부터 기인하는 질환 및 상태는 실례로서 제한은 아니고, 다발성 경화증, 수막염, 뇌염, 뇌중풍, 다른 뇌외상, 궤포지티브 대장염 및 Crohn병을 포함하는 염증 장 질환, 중증근육무력증, 루푸스, 류마티즘성 관절염, 천식, 급성 소아 개시 당뇨병, AIDS 치매, 죽상경화증, 신장염, 망막염, 아토피 피부염, 건선, 심근 허혈 및 급성 백혈구-매개된 폐 손상을 포함한다.
본 발명의 항체 및 다른 치료제의 진단 및/또는 치료 사용을 위한 여전히 다른 지표는 기관 또는 이식 거부의 위험에 있는 개인에게 투여하는 것을 포함한다. 최근 몇년동안 피부, 신장, 간, 심장, 폐, 췌장 및 골수와 같은 조직과 기관을 이식하는 수술 기술의 효능에서의 상당한 개선이 있었다. 아마도 주요 미해결 문제 이식된 동종이식 또는 기관에 대해 수령자에서 면역내성을 유도하기 위한 만족스러운 약제의 결핍이다. 동종이계 세포 또는 기관이 숙주 (즉, 기증자와 피이식자 가 동일한 종과 다른 개인이다) 안으로 이식될 때, 숙주 면역 시스템은 이식된 조직의 파괴를 초래하는, 이식조직 (숙주-대-이식 질환)에서 외래 항원에 대한 면역 반응을 갖출 것같다.
항- 트랜스페린 리셉터 항체에 대한 그들의 사용을 살명하는 본 명세서 어디서나 기술된 사용은 또한 본원에서 기술된 바와 같이 다른 트랜스페린 리셉터 작용제, 길항제 및 조정자의 사용을 포함한다. 그러한 구체예에서, 트랜스페린 리셉터 작용제, 길항제 또는 다른 비-항체 조정자는 기술된 단계에서 트랜스페린 리셉터 항체로 치환되고, 방법을 치환된 트랜스페린 리셉터 조절 조성물에 맞추기 위해 통상의 기술을 가진 개업의의 범위 내에 있는 변경이 만들어진다.
VII. 본 발명의 조성물
본 발명은 또한 항-트랜스페린 리셉터 항체, 항-트랜스페린 리셉터 항체로부터 유도된 폴리펩티드, 항- 트랜스페린 리셉터 항체를 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 본원에서 기술된 바와 같은 다른 작용제를 포함하는 제약 조 성물을 포함하는 조성물을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 조성물은 한가 지 이상의 항체, 트랜스페린 리셉터에 결합하는 폴리펩티드 및/또는 단백질, 트랜스페린 리셉터 작용제, 길항제, 조정자, 및/또는 트랜스페린 리셉터에 결합하는 한가지 이상의 항체, 폴리펩티드 및 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 한가지 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 어떠한 트랜스페린 리셉터 펩티드 작용제, 길항제 또는 조정자의 컨쥬게이트, 및 의도된 작용 또는 특정한 트랜스페린 리셉터 펩티드 작용제, 길항제 또는 조정자의 작용을 지지하는 추가적 화학 구조를 더욱 제공한다. 이들 컨쥬게이트는 본원에서 논의된 진단, 스크리닝 또는 정제 과정에 사용된 어떠한 불용성, 고체 지지체 매트릭스와 같은 거대분자에 공유 결합된, 트랜스페린 리셉터 펩티드 작용제, 길항제 또는 조정자를 포함한다. 적절한 매트릭스 재료는 화학적으로 비활성이고, 높은 다공도를 가지고 펩티드 리간드와의 공유 연결을 형성할 수 있는 많은 수의 작용기를 갖는 어떠한 물질을 포함한다. 매트릭스-리간드 컨쥬게이트의 제조를 위한 매트릭스 재료 및 과정의 예는 Dean et al. (eds) Affinity Chromatography: A Practical Approach, IRL Press (1985) ; Lowe, Work et al. (eds) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 7, Part II, North-Holland (1979)에서 "An Introduction to Affinity Chromatography"; Porath et al., Neurath et al. (eds), The Proteins, 3rd ed., Vol. 1, pp. 95-178 (1975)에서 "Biospecific Affinity Chromatography" ; 및Schott, Affinity Chromatography, Dekker (1984)에서 기술된다.
트랜스페린 리셉터 펩티드 작용제, 길항제 또는 조정자의 컨쥬게이트 및 본 원에서 논의된 진단 과정에 사용된 어떠한 리포터 부분이 또한 본원에 제공된다.
항-트랜스페린 리셉터 항체를 포함하여, 본 발명의 트랜스페린 리셉터 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절제, 폴리펩티드 및 단백질은 하기의 조건 중 어떠한 것(한가지 이상의)에 의해 더욱 확인되고 특성화된다: (a)트랜스페린 리셉터 (이것으로 제한되지는 않지만 난소, 전립선, 췌장, 폐, 결장, 또는 유방암 세포를 포함하여 암 세포에서의 트랜스페린 리셉터를 포함)에 결합하는 능력; (b) 본래의 항체가 우선적으로 결합하는 동일한 트랜스페린 리셉터 에피토프에 우선적으로 결합하는 능력을 포함하여, 공지된 항-트랜스페린 리셉터 항체의 트랜스페린 리셉터에 대한 우선적인 결합을 경쟁적으로 저해하는 능력; (c) 시험관내 또는 생체내에서 살아있는 세포의 표면위에 노출되는 트랜스페린 리셉터의 일부분에 결합하는 능력; (d) 이것으로 제한되지는 않지만 난소, 전립선, 췌장, 폐, 결장, 또는 유방암 세포와 같이 살아있는 암 세포의 표면위에 노출되는 트랜스페린 리셉터의 일부분에 결합하는 능력; (e) 화학치료제 또는 검출가능한 마커를, 트랜스페린 리셉터를 발현하는(이것으로 제한되지는 않지만 난소, 전립선, 췌장, 폐, 결장, 또는 유방암 세포와 같은) 암 세포에 송달하는 능력; (f)치료제를 트랜스페린 리셉터를 발현하는 (이것으로 제한되지는 않지만 난소암 세포와 같은) 암 세포 안으로 송달하는 능력.
일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 기탁 번호 ATCC No. PTA-6055를 갖는 숙주 세포, 또는 그것의 자손에 의해 제조되는 항체이다. 본 발명은 또한 이들 기탁된 하이브리도마 및 등가 항체 또는 폴리펩티드 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, 등), 키메릭 항체, 단일 사슬 (ScFv), 항체 부분, 사람화 항체, 및 항원 (트랜스페린 리셉터), 필요한 특이성의 인식 부위를 포함하는 이들 또는 등가 항체중 어떤것의 어떠한 다른 변경된 구성을 포함하는 그것의 돌연변이 융합 단백질에 의해 제조된 항체의 다양한 제형을 포함한다. 본 발명은 또한 항-트랜스페린 리셉터 패밀리 멤버의 생물학적 특성들중 한가지 이상을 나타내는 사람 항체를 제공한다. 항-트랜스페린 리셉터 패밀리의 등가 항체(사람화 항체 및 사람 항체를 포함), 폴리펩티드 단편, 및 이들 단편중 어떠한것을 포함하는 폴리펩티드가 상술한 5가지 조건중 어떠한 것(한가지 이상의)에 의해 확인되고 특성화된다.
일부 구체예에서, 트랜스페린 리셉터에 결합하는 본 발명의 항체, 폴리펩티드 및 단백질은 본원에서-명시된 항-트랜스페린 리셉터 항체의 트랜스페린 리셉터에 대한 우선적인 결합을 경쟁적으로 저해하는 항체, 폴리펩티드 및 단백질이다. 일부 구체예에서, 항체, 폴리펩티드 및 단백질은 우선적으로 트랜스페린 리셉터에서 항체 LUCA31가 우선적으로 결합하는 것과 동일한 에피토프에 결합한다.
따라서, 본 발명은 다음중 어떠한 것(또는 다음중 어떠한 것을 포함하는 제약 조성물을 포함하는 조성물)을 제공한다: (a) 위에서 확인된 기탁 번호를 갖는 숙주 세포 또는 그것의 자손에 의해 제조된 항체; (b) 그러한 항체의 사람화 형태; (c) 그러한 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역 중 한가지 이상을 포함하는 항체; (d) 그러한 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역과 상동 또는 그것으로부터 유도된 가변 영역, 및 사람 항체의 중쇄 및 경쇄의 일정한 영역과 상동 또는 그것으로부터 유도된 일정한 영역을 포함하는 키메릭 항체 ; (e) 그러한 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 CDR의 하나 이상을 포함하는 항체 (1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 이상) ; (f) 그러한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항체; (g) 그러한 항체와 등가인 사람 항체. 항체의 사람화 형태는 원래의 항체와 동일한 CDR, 또는 위에서 확인된 기탁 번호를 갖는 숙주 세포에 의해 제조된 항체를 가지거나 가지지 않을 수 있다. CDR 영역의 결정은 당업계의 기술로 충분히 할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명은 위에서 확인된 기탁된 하이브리도마 중 하나에 의해 제조된 항체의 실질적으로 1 이상의 CDR, 2이상, 3이상, 4이상, 5이상 CDR(또는, 일부 구체예에서 이들 항체 중 하나의 모든 6 CDR와 실질적으로 상동의, 또는 이들 항체 중 하나로부터 유도된)과 상동인 하나 이상의 CDR를 포함하는 항체, 또는 위에서 확인된 기탁 번호를 갖는 숙주 세포에 의해 제조된 항체를 제공한다. 다른 구체예는 본원에서 확인된 바와 같이 기탁된 하이브리도마로부터 제조된 항체의, 또는 그러한 항체로부터 유도된 2, 3, 4, 5 또는 6 이상의 CDR과 실질적으로 상동인 2, 3, 4, 5, 또는 6 이상의 CDR(들)을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 기탁된 하이브리도마 (더 크거나 더 작을 수 있음)에 의해 제조된 항체와 비교할때 비록 활성의 정도가 변할 수 있지만, 결합 특이성 및/또는 전체적인 활성 (암 세포의 성장 및/또는 증식을 줄이고, 암 세포에서 세포자멸사 세포사를 유도하고, 전이의 발달을 지연시키고, 및/또는 경감하게 치료하기 위해 화학치료제를 암 세포로 또는 암 세포 안으로 송달하는 관점에 있을 수 있는)이 일반적으로 유지된다는 것을 이해한다. 본 발명은 또한 이들 항체중 어떠한 것을 만드는 방법을 제공한다. 항체를 만드는 방법은 당업계에 잘 알려져있고 본원에서 기술된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역 중 한가지 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 CDR 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 3 CDR을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음중 어떤 것을 갖는 항체의 아미노산 서열을 포함한다: 본래의 항체의 서열의 5 이상의 인접 아미노산, 8이상의 인접 아미노산, 약 10 이상의 인접 아미노산, 약 15 이상의 인접 아미노산, 약 20 이상의 인접 아미노산, 약 25 이상의 인접 아미노산, 약 30 이상의 인접 아미노산, 이때 3 이상의 아미노산은 항체의 가변 영역으로부터이다. 하나의 구체예에서 가변 영역은 본래의 항체의 경쇄로부터이다. 또다른 구체예에서, 가변 영역은 항체의 중쇄로부터이다. 또다른 구체예에서, 5(또는 그 이상) 인접 아미노산은 항체의 상보성-결정 영역 (CDR)으로부터이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 발명의 트랜스페린 리셉터, 트랜스페린 리셉터의 부분, 항-트랜스페린 리셉터 항체 또는 다른 트랜스페린 리셉터-결합 폴리펩티드를 발현하는 본 발명의 세포는 그들의 생체내 트랜스페린 리셉터 생물학적 활성을 조절하기 위해 직접적으로 개인에게 투여된다.
VIII. 치료 목적을 위해 트랜스페린 리셉터 조정자 및 항- 트랜스페린 리셉터 항체를 사용하는 방법
트랜스페린 리셉터에 대한 단일클론 항체는 암 또는 다른 질환을 갖는 개인 에서 치료 목적을 위해 사용될 수 있다. 항-트랜스페린 리셉터 항체로 치료법은 위에서 기술한 바와 같이 시험관내와 생체내 둘다에서 복합체의 형성을 수반할 수 있다. 하나의 구체예에서 단일클론 항체 항-트랜스페린 리셉터가 결합하여 암 세포의 증식을 줄일 수 있다. 항체가 결합을 생리학적 (예를 들어, 생체내) 조건에서 촉진하는 농도에서 투여된다는 것을 이해한다. 또다른 구체예에서, 트랜스페린 리셉터에 대한 단일클론 항체는 결장, 폐, 유방, 전립선, 난소, 췌장, 신장과 같은 다른 조직의 암 세포 및 육종과 같은 다른 타입의 암에서 지시된 면역요법에 사용될 수 있다. 또다른 구체예에서, 단일클론 항체 항-트랜스페린 리셉터 단독은 암 세포에서 결합하고 세포 분할을 줄일 수 있다. 또다른 구체예에서, 단일클론 항체 항-트랜스페린 리셉터는 암 세포에 결합하고 전이의 발달을 지연시킬 수 있다. 한층더 또다른 구체예에서, 암을 가진 개인은 항-트랜스페린 리셉터 항체로 경감하는 치료를 받는다. 암 개인의 경감하는 치료는 질환의 부정적인 증상, 또는 암 진행에 직접적으로 영향을 주지 않으면서 질환을 위해 주어진 다른 치료로부터 기인하는 의원 증상을 치료 또는 줄이는 것을 수반한다. 이것은 고통의 완화, 영양상 지지, 성적인 문제, 심리적 고통, 우울증, 피로, 정신의학적 장애, 메스꺼움, 구토, 등의 치료를 포함한다.
그러한 상황에서, ADCC을 강화하는 작용제와 같이, 개인의 고유한 면역 반응을 강화 또는 지시할 수 있는 작용제와 함께, 항-트랜스페린 리셉터 항체가 투여될 수 있다.
한층더 또다른 구체예에서, 항-트랜스페린 리셉터 항체는 방사능 분자, 독소 (예를 들어, 칼리케아미신), 화학치료 분자, 리포솜 또는 화학치료 화합물을 함유하는 다른 소포에 컨쥬게이트되거나 또는 이들과 연합되고 그러한 치료를 필요로하는 개인에게 투여되어 이들 화합물을 항체에 의해 인지된 항원을 함유하는 암 세포로 표적화하고 따라서 암 또는 병든 세포를 제거한다. 어떠한 특정한 이론으로 한정되지 않지만, 항-트랜스페린 리셉터 항체는 그것의 표면에 트랜스페린 리셉터를 갖는 세포에 의해 흡수되고, 따라서 컨쥬게이티드 부분을 세포에 송달하여 치료 효과를 유발한다. 한층더 또다른 구체예에서, 항체는 전이의 발달을 지연시키기 위해 항원을 발현하는 암의 수술 제거의 시기에 보조약 치료법으로서 채택될 수 있다. 항체는 또한 항원을 발현하는 종양을 갖는 개인에 있어서 종양의 크기를 줄이고 따라서 수술을 가능하게 하거나 간소화하고, 수술하는 동안에 조직을 절약하고, 및/또는 결과의 외관손상을 줄이기 위해서, 수술 전에 투여될 수 있다 (신보조약 치료법).
세포 주기 투약은 본 발명의 실행에서 계획된다. 그러한 구체예에서, 화학치료제는 종양 또는 다른 표적 병든 세포의 세포 주기를 미리-결정된 단계에서 동조시키기 위해 사용된다. 이어서, 항-트랜스페린 리셉터 본 발명의 항체 (단독으로 또는 추가적 치료 부분과 함께)의 투여가 이루어진다. 대안의 구체예에서, 항-트랜스페린 리셉터 항체는 두번째 라운드의 처리의 투여 전에 세포 주기를 동조시키고 세포 분할을 줄이기 위해 사용되고; 두번째 라운드는 항-트랜스페린 리셉터 항체 및/또는 추가적 치료 부분의 투여가 될 수 있다.
화학치료제는 암 세포의 생존력에 해로운 어떠한 작용제, 화학치료 화합물을 함유하는 작용제, 및 리포솜 또는 다른 소포를 포함하는, 방사능 분자, 또한 세포독소 또는 세포독성제로 불리는 독소를 포함한다. 적절한 화학치료제의 예는 이것으로 한정되지는 않지만 1- 데하이드로테스토스테론, 5-플루오로우라실 데카르바진, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 악티노마이신 D, 아드리아마이신, 알데스류킨, 알킬화제, 알로푸리놀 나트륨, 알트레타민, 아미포스틴, 아나스트로졸, 안트라마이신 (AMC)), 항-유사분열제, 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 디아미노 디클로로 백금, 안트라사이클린, 항생물질, 대사길항물질, 아스파라기나아제, BCG 살아있는 (방광내), 베타메타손 나트륨 포스페이트 및 베타메타손 아세테이트, 비칼루타미드, 블레오마이신 술페이트, 부술판, 칼슘 류코우오린, 칼리케아미신, 카페시타빈, 카르보플라틴, 로무스틴 (CCNU), 칼무스틴 (BSNU), 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 콜치신, 컨쥬게이티드 에스트로겐, 사이클로포스파미드, 사이클로토스파미드, 시타라빈, 시타라빈, 사이토칼라신 B, 다카르바진, 닥티노마이신 (이전에는 악티노마이신), 다우니루비신 HCl, 다우노룩비신 시트레이트, 데닐류킨 디프티톡스, 덱스라족세인, 디브로모만니톨, 디하이드록시 안트라신 디온, 도세탁셀, 돌라세트론 메실레이트, 독소루비신 HCl, 드로나비놀, E. coli L-아스파라기나아제, 에메틴, 에포에틴알파, Erwinia L- 아스파라기나아제, 에스테르화 에스트로겐, 에스트라디올, 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨, 에티듐 브로마이드, 에티닐 에스트라디올, 에티드로네이트, 에토포시드 시트로로룸 인자, 에토포시드 포스페이트, 필그라스팀, 플록수리딘, 플루코나졸, 플루다라빈 포스페이트, 플루오로우라실, 플루타미드, 폴린산, 겜시타빈 HCl, 글루코코르티코이드, 고세렐린 아세테 이트, 그라미시딘 D, 그라니세트론 HCl, 하이드록시우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 인터페론 알파-2b, 이리노테칸 HCI, 레트로졸, 류코보린 칼슘, 류프롤리드 아세테이트, 레바미솔 HCl, 리도카인, 로무스틴, 메이탄시노이드, 메클로레타민 HCI, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 멜팔란 HCI, 메르캅티퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 메틸테스토스테론, 미트라마이신, 미토마이신 C, 미토테인, 미톡산트론, 닐루타미드, 옥트레오티드 아세테이트, 온단세트론 HCI, 파클리탁셀, 파미드로네이트 디소듐, 펜토스타틴, 필로카르핀 HCI, 플리마이신, 카르무스틴 임플란트와 함께 폴리페프로산 20, 포르피머 나트륨, 프로카인, 프로카르바진 HCI, 프로프라놀롤, 리툭시맙, 사르그라모스팀, 스트렙토조토신, 타목시펜, 탁솔, 테니포시드, 테노포시드, 테스톨락톤, 테트라카인, 티오에파 클로람부실, 티오구아닌, 티오테파, 토포테칸 HCI, 토레미펜 시트레이트, 트라스투주마브, 트레티노인, 발루비신, 빈블라스틴 술페이트, 빈크리스틴 술페이트, 및 비노렐빈 타르트레이트를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 세포독소는 분할 또는 신속하게 분할하는 세포에서 특히 효과적이서, 비-분할하는 세포는 독성 효과가 비교적 없도록 한다.
본 발명의 항체는 그들이 결합하는 병든 또는 암종 세포 내에 흡수될 수 있고 따라서 특히 치료 용도, 예를 들어, 그들의 반대의 활성에 대해 흡수될 필요가 있는 세포 독소 안으로 송달에 유용하다. 그러한 독소의 예는 이것으로 제한되지는 않지만, 사포린, 칼리케아미신, 오리스타틴, 및 메이탄시노이드를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 방사능 분자, 독소, 또는 다른 치료제로, 또는 치료제를 함유하는 리포솜 또는 다른 소포로, 공유로 또는 비-공유로, 직접적으로 또는 간접적으로 연합(컨쥬게이트되거나 또는 연결되는 것을 포함)될 수 있다. 항체는 항체가 그것의 표적 트랜스페린 리셉터에 결합될 수 있는 한, 항체를 따라 어떠한 위치에서 방사능 분자, 독소, 또는 화학치료 분자에 연결될 수 있다.
독소 또는 화학치료제는 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들어, 링커 기를 통해, 또는, 대안으로서, 미국 특허 5,552,391에서 기술된 바와 같은 플랫폼 분자와 같은 적절한 부착 부위와의 연결 분자를 통해), 적절한 단일클론 항체에 커플링될 수 있다(예를 들어, 공유 결합된). 본 발명의 독소와 화학치료제는 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 직접적으로 특정한 표적화 단백질에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 각각이 서로와 반응할 수 있는 치환기를 가질 때, 작용제와 항체 사이의 직접적인 반응은 가능하다. 예를 들어, 하나에서는 아미노 또는 술피드릴 기와 같은 친핵성 기가 무수물 또는 산 할로겐화물와 같은 카르보닐-함유 기와 반응할 수 있거나 또는 나머지에서 양호한 이탈기 (예를 들어, 할로겐화물)를 함유하는 알킬 기와 반응할 수 있다.
항체 또는 폴리펩티드는 또한 마이크로담체를 통해 화학치료제에 연결될 수 있다. 마이크로담체는 물에 불용성이고 크기가 약 150, 120 또는 100 mm미만, 좀더 통상적으로는 약 50-60 ㎛미만, 바람직하게는 약 10, 5, 2.5, 2 또는 1.5 ㎛미만의 크기를 갖는 생물분해성 또는 비-생물분해성 입자를 말한다. 마이크로담체는 약 1㎛미만, 바람직하게는 약 500 nm미만의 크기를 갖는 마이크로담체인 "나노담체"를 포함한다. 그러한 입자는 당업계에 공지되어 있다. 고체 상 마이크로담체 는 당업계에 공지된 다른 생물분해성 재료는 물론이고, 아가로스 또는 가교-결합된 아가로스로부터 형성된 마이크로담체를 포함 또는 배재할 수 있는 생물융화성 자연적으로 일어나는 폴리머, 합성 폴리머 또는 합성 코폴리머로부터의 입자가 될 수 있다. 생물분해성 고체 상태 마이크로담체는 포유동물의 생리학적 상태 하에서 분해가능한(예를 들어, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산) 및 그것의 코폴리머) 또는 침식가능한 (예를 들어, 3,9-디에틸리덴-2,4,8,10- 테트라옥사스피로 [5.5]운데케인 (DETOSU)와 같은 폴리(오쏘 에스테르 또는 세바스 산의 폴리 (무수물)과 같은 폴리 (무수물)) 폴리머로부터 형성될 수 있다. 단, 액상 마이크로담체가 생물분해성이라면, 마이크로담체는 액상 상태(예를 들어, 오일 또는 지질 기반), 항원없는 그러한 리포솜, 이스콤 (콜레스테롤, 및 인지질, 보조약-활성 사포닌의 안정한 복합체인 면역-자극 복합체), 또는 오일-인-워터 또는 워터-인-오일 에멀젼에서 발견된 작은방울 또는 미셀이 될 수 있다. 생물분해성 액상 마이크로담체는 전형적으로 스쿠알렌과 식물성 오일을 포함하여 당업계에 공지된 많은 생물분해성 오일을 편입한다. 마이크로담체는 전형적으로 구형이지만, 구형에서 벗어난 마이크로담체도 또한 허용가능하다(예를 들어, 타원체, 막대 형태 등). 그들의 불용성 성질 (물에 대해)로 인해, 마이크로담체는 물 및 물-기반 (수성) 용액으로부터 여과가능하다.
본 발명의 항체 또는 폴리펩티드 컨쥬게이트는 독성제 또는 화학치료제에 커플링할 수 있는 기와 항체에 커플링할 수 있는 기 둘다를 함유하는 2기능성 링커를 포함할 수 있다. 링커는 결합 능력의 방해를 피하기 위해서 작용제로부터의 항체를 거리를 두는 스페이서로 작용할 수 있다. 링커는 쪼갤 수 있거나 또는 쪼갤 수 없을 수 있다. 링커는 또한 작용제 또는 항체에 대한 치환기의 화학 반응성을 증가시키는 역할을 할 수 있고, 따라서 커플링 효율을 증가시킨다. 화학 반응성의 증가는 작용제 또는 작용제에 있는 작용기의 사용을 용이하게 할 수 있고, 다르게는 가능하지 않을 것이다. 2기능성 링커는 당업계에 공지된 수단에 의해 항체에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 아미드 연결을 통해 항체에서 리신 잔기에 커플링하기 위해 N-하이드록시숙시니미드 에스테르와 같은 활성 에스테르 부분을 함유하는 링커를 사용할 수 있다. 또다른 예에서, 친핵성 아민 또는 히드라진 잔기를 함유하는 링커는 항체 탄수화물 잔기의 당분해 산화에 의해 제조된 알데히드 기에 커플링될 수 있다. 커플링의 이들 직접적인 방법에 더하여, 링커는 아미노덱스트란과 같은 중간체 담체에 의해 항체에 간접적으로 커플링될 수 있다. 이들 구체예에서 변경된 연결은 리신, 탄수화물, 또는 중간체 담체를 통한 것이다. 하나의 구체예에서 링커는 단백질에서 부위-선택적으로 자유 티올 잔기에 커플링된다. 단백질에서 티올 기에 선택적인 커플링에 적절한 부분은 당업계에 잘 알려져있다. 예는 디술피드 화합물, α-할로카르보닐 및 α- 할로카르복실 화합물, 및 말레이미드를 포함한다. 친핵성 아민 작용기가 α-할로 카르보닐 또는 카르복실 기로서 동일한 분자에 존재할 때 고리화가 아민의 분자내 알킬화를 통해 일어날 잠재력이 존재한다. 이런 문제를 막기 위한 방법, 예를 들어 아민 및 α-할로 작용기가 가요성 기, 이를테면 아릴기 또는 트랜스-알켄에 의해 분리되는, 분자의 제조가 당업자들에게 잘 알려져있고, 이것은 원치않는 고리화를 입체화학적으로 불리하게 만든다. 예를 들어, 디술피드 부분을 통한 메이탄시노이드 및 항체의 컨쥬게이트의 제조를 대해서 는 미국 특허 No. 6,441,163를 참조하라.
항체- 약물 컨쥬게이트의 제조를 위해 사용될 수 있는 쪼갤 수 있는 링커 중 하나는 리셉터 매개된 세포이물흡수 동안에 마주친 엔도좀과 리소좀과 같이, 다른 세포내 구획의 산성 환경을 이용하는 시스-아코니트산에 기반한 산-불안정 링커이다. 예를 들어, 거대분자 담체와 다우노루비신의 컨쥬게이트의 제조에 대해서 Shen et al., Biochem . Biophys . Res. Commun.102:1048-1054 (1981) 그리고; 항- 흑색종 항체에 대해 다우노루비신의 컨쥬게이트의 제조에 대해서는 Yang et al., J. Natl. Canc. Inst. 80:1154-1159 (1988); 다우노루비신과 항-T 세포 항체와의 컨쥬게이트를 제조하기 위해 유사한 형태로산- 불안정링커를 사용하기 위해서는 Dillman et al., Cancer Res. 48: 6097-6102 (1988) ; 펩티드 스페이서 팔을 통해 다우노루비신을 항체에 연결에 대해서는 Trouet et al., Proc . Natl . Acad . Sci. 79:626-629 (1982)를 참조하라.
본 발명의 항체 (또는 폴리펩티드)는 당업계에 공지된 어떠한 방법에 의해 방사능 분자에 컨쥬게이트(연결)될 수 있다. 방사능표지화 항체를 위한 방법의 논의를 위해서는 "Cancer Therapy with Monoclonal AntibodiesT", D. M. Goldenberg ed. (CRC Press, Boca Raton, 1995)를 참조하라.
대안으로서, 항체는 두번째 항체에 컨쥬게이트되어 미국 특허 No. 4,676,980에서 Segal에 의해 기술된 바와 같은 항체 헤테로컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 가교-결합된 항체의 형성은 특이적 타입의 세포 예를 들어, 트랜스페린 리셉터를 발현하는 암 또는 병든 세포에 대한 면역 시스템을 표적화할 수 있다.
본 발명은 또한 항-트랜스페린 리셉터 항체 또는 화학치료제에 연결된 트랜스페린 리셉터에 결합하는 다른 구체예를 사용하여, 암(이것으로 제한되지는 않지만, 전립선, 폐, 유방, 난소, 췌장, 또는 결장 암을 포함함)을 갖는 개인에 있어서 전이의 발전을 지연시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 항체는 비-사람 항-트랜스페린 리셉터 항체의 사람화 또는 키메릭 형태이다.
한층더 또다른 구체예에서, 항원을 발현하는 암의 수술 제거의 시점에, 전이의 발전을 지연시키기 위해서, 항체가 보조 치료법으로서 채택될 수 있다. 항원을 발현하는 종양을 갖는 개인에 있어서, 종양의 크기를 감소시키고 따라서 수술을 가능하게 하거나 간단하게 하고, 수술하는 동안 조직을 아끼고, 및/또는 결과의 외관손상을 줄이기 위해서, 화학치료제와 연합된 항체 또는 항체가 수술전에(신보조약 치료법) 또한 투여될 수 있다.
한층더 또다른 구체예에서, 본원에서 기술된 트랜스페린 리셉터 결합 구체예중 어떠한 것은 트랜스페린 리셉터-발현 암 세포에 결합하여 트랜스페린 리셉터를 발현하는 암 세포에 대해서 활성 면역 반응을 유발할 수 있다. 어떤 경우에, 활성 면역 반응은 암 세포의 죽음 (예를 들어, 세포자멸사 세포사를 유발하는 암 세포에 대한 항체 결합)을 유발하거나, 또는 암 세포의 성장을 저해 (예를 들어, 세포 주기 진행을 차단)할 수 있다. 다른 경우에는, 본원에서 기술된 신규 항체 중 어떠한 것은 암 세포에 결합할 수 있고 항체 의존 세포 세포독성 (ADCC)이 항-트랜스페린 리셉터가 결합하는 암 세포를 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에서 기술된 조성물 중 어떠한 것을 투여하는 것을 포함하는 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
어떤 경우에, 항체 결합은 세포와 체액 면역 반응 둘다를 활성화할 수 있고 개인의 면역 시스템을 더욱 활성화하여 암 세포를 더욱 파괴하는, 더 많은 자연 킬러 세포 또는 사이토킨의 증가된 생산 (예를 들어, IL-2, IFN-g, IL-12, TNF-a, TNF-b, 등)을 보충할 수 있다. 한층더 또다른 구체예에서, 항-트랜스페린 리셉터 항체가 암 세포에 결합할 수 있고, 대식세포 또는 다른 식세포 세포는 암세포를 옵소닌화할 수 있다.
항-트랜스페린 리셉터 항체 또는 그것의 단편의 다양한 제형은 투여를 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 항-트랜스페린 리셉터 항체 또는 그것의 단편 은 순수하게 투여될 수 있다. 제약학적으로 활성제에 더하여, 본 발명의 조성물은 당업계에 잘 알려져있고, 제약학적으로 효과적인 물질의 투여를 촉진하고 또는 작용의 부위에 송달하기 위해 제약학적으로 사용될 수 있는 제제안으로 활성 화합물의 프로세싱을 촉진하는 비교적 비활성 물질인, 부형제와 보조제를 포함하는 적절한 제약학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 경도를 주거나, 또는 희석제로서 작용할 수 있다. 적절한 부형제는 이것으로 한정되지는 않지만 안정화제, 습윤제 및 유화제, 몰삼투압농도를 변화시키기 위한 염, 캡슐화제, 완충제, 및 피부 침투 인핸서를 포함한다.
비경구 투여를 위한 적절한 제형은 수용성 형태로 활성 화합물의 수성 용액, 예를 들어, 수용성 염을 포함할 수 있다. 게다가, 오일 주사 부유액에 적절한 활성 화합물의 부유액이 투여될 수 있다. 적절한 친유성 용매 또는 매개체는 지방 오일, 예를 들어, 참깨 오일, 또는 합성 지방 산 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드를 포함한다. 수성 주사 부유액은 부유액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있고, 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 및/또는 덱스트란을 포함한다. 선택적으로, 부유액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다. 리포솜은 또한 세포 안으로 송달을 위한 작용제를 캡슐화하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 전신 투여를 위한 제약 제형이 장, 비경구 또는 국소 투여를 위해 조제될 수 있다. 실제로, 모든 3가지 타입의 제형이 동시에 활성 성분의 전신 투여를 활성화하는데 사용될 수 있다. 비경구 및 경구 약물 송달을 위한 제형은 물론이고 부형제가 Remington , The Science and Practice of Pharmacy 20 th EdMack Publishing (2000)에서 설명된다.
경구 투여에 적절한 제형은 코팅된 정제, 엘릭서, 부유액, 시럽 또는 흡입 및 그것의 제어 방출 형태를 포함하여, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 알약, 정제를 포함한다.
일반적으로, 이들 작용제는 다른 형태의 투여 (예를 들어, 경구, 점막, 등)도 또한 사용될 수 있지만, 주사(예를 들어, 복막내로, 정맥내로, 피하로, 근육내로, 등)에 의한 투여를 위해 조제된다. 따라서, 항-트랜스페린 리셉터 항체는 바람직하게는 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 등과 같은 제약학적으로 허용가능한 매개체와 조합된다.
특정한 투약 요법, 즉, 투여량, 시간 및 반복은 특정한 개인 및 그 개인의 의학적 이력에 의존할 것이다. 일반적으로, 약 100 ug/kg 체중 이상, 보다 바람직하게는 약 250 ug/kg 체중 이상, 좀더 바람직하게는 약 750 ug/kg 체중 이상, 좀더 바람직하게는 약 3 mg/kg 체중 이상, 좀더 바람직하게는 약 5 mg/kg체중 이상, 좀더 바람직하게는 약 10 mg/kg체중 이상의 투여량이 투여된다.
반감기와 같은 실험상 고려는 일반적으로 투약의 결정에 기여할 것이다. 사람화 항체 또는 충분히 사람 항체와 같이 사람 면역 시스템과 호환가능한 항체는 항체의 반감기를 연장하고 숙주의 면역 시스템에 의해 공격받는 항체를 예방하는데 사용될 수 있다. 투여의 빈도는 치료법의 전과정에 걸쳐 결정되고 조절될 수 있으며, 암 세포의 수를 줄이고, 암 세포의 감소를 유지하고, 암 세포의 증식을 줄이거나, 또는 전이의 발전을 지연시키는데 기반한다. 대안으로서, 항-트랜스페린 리셉터 항체의 지속된 연속 방출 제형이 적절할 수 있다. 지속된 방출을 달성하기위해 다양한 제형과 디바이스가 당업계에 공지되어 있다.
하나의 구체예에서 항-트랜스페린 리셉터 항체를 위한 투약은 한가지 이상의 투여(들)을 받는 개인에서 실험상으로 결정될 수 있다. 개인은 항-트랜스페린 리셉터 항체의 점증 투약이 주어진다. 항-트랜스페린 리셉터 항체의 효능을 평가하기 위해, 특이적 암 질환 상태의 마커가 따라올 수 있다. 이들은 촉지 또는 눈으로 관찰을 통한 종양 크기의 직접적인 측정, x-선 또는 다른 이미징 기술에 의해 종양 크기의 간접적인 측정; 허용된 테스트 또는 생존의 연장에 의해 특정될때 종양 샘플의 직접적인 종양 생체검사 및 현미경 검사에 의해 평가된 개선; 간접적인 종양 마커의 측정(예를 들어, 전립선 암에 대해 PSA), 고통 또는 마비의 감소 ; 말 하는 능력, 시력, 호흡 또는 종양과 관련된 다른 무능력의 개선; 증가된 식욕; 또는 삶의 질의 증가를 포함한다. 투여량은 개인, 암의 타입, 암의 단계, 암이 개인에서 다른 위치로 전이하기 시작했는지 여부, 사용되는 과거와 동시발생 치료에 따라 변할 것이라는 것이 당업자들에게 명백할 것이다.
다른 제형은 이것으로 제한되지는 않지만, 리포솜과 같은 담체를 포함하여 당업계에 공지된 적절한 송달 형태를 포함한다. 예를 들어, Mahato et al. (1997)Pharm. Res. 14: 853-859 참조. 리포솜 제제는 이것으로 제한되지는 않지만, 사이토펙틴, 다층 소포 및 단일층 소포를 포함한다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 항체가 존재할 수 있다. 항체는 단일클론 또는 다클론성이 될 수 있다. 그러한 조성물은 암종, 아데노암종, 육종, 또는 아데노육종에 대해 반응성인 1개 이상, 2개 이상, 3 이상, 4이상, 5이상의 다른 항체를 함유할 수 있다. 항-트랜스페린 리셉터 항체는 이것으로 제한되지는 않지만 난소, 유방, 폐, 전립선, 결장, 신장, 피부, 갑상샘, 뼈, 상부 소화관, 및 췌장을 포함하는 기관에서 암종, 아데노암종, 육종, 또는 아데노육종에 대해 반응성인 한가지 이상의 항체와 혼합될 수 있다. 하나의 구체예에서 다른 항-트랜스페린 리셉터 항체의 혼합물이 사용된다. 종종 당업계에서 표시되는 바와 같이, 항체의 혼합물은 특히 더 넓은 범위의 개인의 집단을 치료하는데 유용할 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명을 제한하지는 않지만 예증하기 위해서 제공된다.
하기 실시예에서 언급된 특정 재료와 방법은 본 섹션의 끝에 제시된다.
실시예 1. 면역원으로서 암 세포주의 제조
조직 또는 세포 배양으로부터 분리된 전체 세포는 특정한 세포 타입의 표면 항원 대표에 특이적인 단일클론 항체를 제조하기 위한 면역원으로서 사용되었다. 본 발명의 실행에 적절한 방법이 미국 특허 # 6,541,225에서 기술된다. 일반적으로, 특이적 세포 타입의 세포-표면 항원에 지시된 단일클론 항체를 제조하기 위해, 비-변형된 B-세포를 그 타입의 생존가능 및 손상되지 않은 세포로, 바람직하게는 혈청이 없는 표면을 갖는 세포로 면역화하는 것이 바람직하다. 항원 트랜스페린 리셉터에 대해서 단일클론 항체의 발생에 적합한 세포주는 LUCA31로 제한되지는 않지만, : BT-474 (ATCC# HTB-20), MDA-MB-175VII (ATCC# HB-25), MDA- MB-361 (ATCC # HB-27), SKBR3 (ATCC# HTB-30), SKMES-1 (ATCC# HTB-58), ES-2 (ATCC# CRL-1978), SKOV3 (ATCC# HTB-77), HPAFII(ATCC# CRL-1997), Hs700T (ATCC# HTB-147), Colo205 (ATCC# CCL-222), HT-29 (ATCC# HTB-38), SW480 (ATCC# CCL-228), SW948 (ATCC# CCL-237), A498 (ATCC# HTB-44) 및 Caki-2 (ATCC# HTB-47)을 포함한다.
혈청은 없지만 성장 인자들로 보충된 적절한 영양 배지에서 세포를 성장시켰다. 혈청-보충된 배지에서 번식된 세포를 사용한 면역법은 극도로 불리할 수 있다. 혈청은 정의되지 않은 활성을 갖는 작고 큰 바이오분자의 복합 혼합물을 함유한다. 이들 바이오분자는 세포의 표면에 부착되고 그로인해 특이적 세포 타입의 대표가 아닌 분자와 교차 반응하는 항체의 발생을 초래할 수 있다. 추가적으로, 혈청 바이오분자의 세포 표면으로의 결합은 원하는 세포 표면 항원 표적의 마스킹을 야기할 수 있다. 예를 들어, 하기 : 인슐린(10 ㎍/ml 최종 농도), 상피 성장 인 자 (EGF) (5 ng/ml 최종 농도), 아셀렌 산 (2.5 x 10-8 M 최종 농도), 및 돼지 뇌하수체 추출물 (PPE) (5㎕/ml 최종 농도)의 보충을 갖는 F12/DME (1:1) 영양 배지와 같이 많은 혈청-없는 배지 조제물은 상업적으로 알려져있고 널리 이용가능하다.
세포를 수확하기 위해, 세포 단층을 칼슘- 및 마그네슘-없는 Hanks 식염수 용액으로 한번 헹구고, Hanks 식염수 용액중의 10mM EDTA에서 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 부드러운 피펫팅에 의해 세포를 배양 표면으로부터 떼어냈다. 세포 부유액을 원심분리에 의해 1000xg에서 5분동안 펠릿화하였다. 상청액을 제거하였고 세포를 적절할 때 비- 변성 보조약을 갖는 혈청-없는 배지에 재현탁하였다.
실시예 2. 단일클론 항체의 생성
비-변성 보조약 (Ribi, R730, Corixa, Hamilton MT)은 포스페이트 완충화 식염수에서 2 ml로 재수화하였다. 100μl의 이 재수화된 보조약을 그후 면역화에 사용될 실시예 1로부터 세포 펠릿의 일부와 부드럽게 혼합하였다.
마우스당 대략 106 사람 태아 신장 세포를 풋패드를 통해, 대략 1주일에 한번 또는 두번 Balb/c 마우스에게 주사하였다. 정확한 면역법 스케줄은 다음과 같다: 0일째, 면역법 플러스 Ribi. 3일째, 면역법 플러스 Ribi. 7일째, 면역법 플러스 Ribi. 24일째, 면역법 마이너스 Ribi. 29일째, 면역법 마이너스 Ribi. 32일째, 면역법 마이너스 Ribi. 36일째, 면역법 마이너스 Ribi. 44일째, 면역법 마이너스 Ribi. 51일째, 면역법 마이너스 Ribi. 69일째, 역가 테스트를 위한 출혈. 71일째. 면역법 플러스 Ribi. 74일째, 면역법 플러스 Ribi. 81일째, 면역법 플러스 Ribi. 91일째, 예비융합 부스트(Ribi 없음). 104일째, 융합을 위한 수확 노드.
69일째에, FACS 분석을 사용하여 면역화하기 위해 사용된 세포주에 대해서 항체의 역가를 시험하기 위해, 혈액의 방울을 각각의 면역화 동물의 꼬리로부터 빼냈다. 역가가 1:2000 이상에 도달했을 때, CO2와 이어서 자궁경부 탈구를 사용하여 마우스를 희생시켰다. 하이브리도마 제조를 위해 림프절을 수확하였다.
마우스로부터의 림프구를 35% 폴리에틸렌 글리콜 4000을 사용하여 마우스 골수종 라인 X63-Ag8.653 과 융합시켰다. 융합 후 10일째에, 하이브리도마 상청액 을 형광 활성화 세포 추리기(FACS)에 의해 면역화 세포-특이적 단일클론 항체의 존재에 대해 스크리닝하였다. 각각의 하이브리도마로부터의 조건 배지를 30분동안 사람 태아 신장 세포의 부분표본으로 배양하였다. 배양후에, 세포 샘플을 세척하였고, 0.1 ml 희석제에 재현탁시켰고 1 g/ml의 염소 항-마우스 IgG의 FITC 컨쥬게이티드 F(ab')2 단편으로 30분동안 4℃에서 배양하였다. 세포를 세척하였고, 0.2 ml FACS 희석제에 재현탁시키고 FACScan (tm) 세포 분석기 (Becton Dickinson; San Jose, CA)를 사용하여 분석하였다. 하이브리도마 클론을 FACS에 의해 사람 태아 신장 세포의 표면에 대한 그들의 결합에 기반하여 더 나아간 팽창, 클로닝, 및 특성화에 대해 선택하였다. 항원 지정된 Ag-트랜스페린 리셉터와 그 항원 지정된 Ag-트랜스페린 리셉터에 있는 에피토프를 결합하는, 단일클론 항체 지정된 LUCA31를 만드는 하이브리도마가 선택되었다.
실시예 3. LUCA31 를 포함하여, 항- 트랜스페린 리셉터 항체의 정제
이것으로 제한되지는 않지만 SKMES-1, 786-0, 및 Colo205 세포주와 같은 사람 암 세포를 10.0 mM EDTA의 존재하에서 조직 배양 플라스크로부터 분리시켰고, 1400 rpm에서 5분동안 원심분리하고 1% BSA 및 2mM EDTA (FACS 희석제)를 함유하는 PBS에 재현탁시켰다. 세포수를 세고 107 세포/ml으로 조절시켰다. 약 0.1 ml의 세포를 100 μl FACS 희석제로 30분동안 37℃에서 배양하였다. 사람 암 세포주에 결합하는 단일클론 항체를 단백질-G 친화력 크로마토그래피를 사용하여 조직 배양 상청액으로부터 정제하였다. 다음의 재료가 항체 정제 프로세스에 사용되었다: 하이브리도마 조직 배양 상청액, Immunopure (G) IgG 결합 완충제 (Pierce #21011 Rockford, IL), Immunopure IgG 용출 완충제 (Pierce #21009), 농축 HCl (pH를 조절하기 위함), Corning 1 리터 PES (폴리에테르 술폰), 0.22 ㎛ 필터 (Corning #431098, Corning, NY), Amersham Pharmacia AKTA Explorer 시스템 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), 단백질-G 세파로스 4 Fast Flow (Amersham Biosciences #17-0618-03), 3M 칼륨 티오시아네이트/50mM Tris pH 7.8, 및 PBS (포스페이트 완충화 식염수), 3M Tris pH 9.0로 구성되는 Stripping 완충제.
본원에서 LUCA31라고 부르는 마우스 항-후(hu)트랜스페린 리셉터 항체를 정제하기 위해, 상청액의 부피를 측정하였고 동일한 부피의 결합 완충제를 상청액에 첨가하였다. 혼합물을 실온과 평형유지시켰다. 상청액을 0.22 ㎛ 필터를 통한 통과에 의해 정화하였다. 상청액을 AKTA Explorer 시스템 (Amersham Biosciences)을 사용하여 단백질-G 세파로스 칼럼 위로 로딩하였고 5-10 칼럼 부피의 결합 완충제 로 세척하였다. 단일클론 항체는 용출 완충제로 용출시켰고, 소부분을 수집하였다. 3M Tris, pH 9.0을 빈 튜브 (1/60 부피의 소부분)에 첨가하면서 용출시에 소부분을 중화하였다. 단일클론 항체를 함유하는 피크 소부분을 모았다. 모아진 샘플을 미리-습윤된 슬라이드얼라이저 카세트 (10,000 MW 컷오프; Pierce #66810)안으로 주입하였고 1x PBS에서 4℃에서 투석하였다(변화 당 4 시간 이상의 투석의 3 완충제 변화로). 정제된 단일클론 항체를 무균 여과되었고(0.2 m Acrodisc) 2-8℃에서 저장되었다
UV 흡광도(A280) 및 SDS-폴리아크릴이미드 겔 전기이동 (SDS-PAGE)에 의해 농도를 결정하기 위해 정제된 항체의 샘플을 취했다. SDS-PAGE를 비-환원 및 환원 조건 모두하에서 분자량의 분석, 단일클론 항체의 전형적인 밴딩 패턴의 확인 및 순도의 평가에 대해 수행한다.
하이브리도마 상청액으로부터 LUCA31 단일클론 항체의 정제 후에, 그것을 사람 태아 신장 세포로의 결합에 대해 재-시험하였다. 세포 샘플을 위에서 기술한 바와 같이 제조하였고 다양한 농도에서 정제된 항체로 배양하였다. 배양 후에, the 세포를 세척하였고, 0.1 ml 희석제에 재현탁시키고 1μg의 FITC 컨쥬게이티드 F(ab)'2 단편의 염소 항-마우스 IgG로 30분동안 4℃에서 배양하였다. 세포를 세척하였고, 0.5 ml FACS 희석제에 재현탁시키고 FACScan 세포 소터 (Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 분석하였다. FACScan 히스토그램에서 오른쪽으로의 이동은 정제된 항체가 여전히 사람 태아 신장 세포에 결합되었다는 것을 나타내었다.
다른 실험에서, LUCA31 항체의 트랜스페린 리셉터에 대한 결합을 살아있는 세포 ELISA를 사용하여 시험하였다. 비록 당업계에 통상적으로 공지된 다른 방법을 적용가능하지만 다음의 방법을 사용하였다. 세포(HT-29, SKOV3, SKMES-1, SW480, SKBR-3, 및 HPAFII)는 조직 배양 처리된 96-웰 플레이트 (Falcon)에서 배지를 함유하는 10% 태아 솟과 혈청 (FBS)에서 컨플루언시까지 성장시켰다. 세포를 PBS로 세척하였고 그후 원하는 농도에서 1% BSA 및 0.1% 나트륨 아지드를 함유하는 Hank's Balanced Salt 용액 (HBSS)에서 1시간동안 실온에서 50㎕의 원하는 항체로 배양하였다. 세포를 그후 30분동안 실온에서 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 2차 항체 (HBSS에 희석된 웰당 50㎕)로 배양하기 전에 HBSS의 웰당 100㎕로 3번 세척하였다. 세포를 최종적으로 HBSS로 3번 세척하였고 색상 변화 기질 (TMB 기질, KPL)을 각각의 웰에 웰당 100㎕로 첨가하였다. 색상 변화 반응을 1M 인산의 웰당 100㎕의 첨가로 멈추었다. 플레이트를 그후 O. D. 450nm에서 판독하였다.
실시예 4. LUCA31 의 시퀀싱
재료 및 방법 섹션에서 열거된 변질 올리고와 함께한 RT-PCR는 중쇄에 대한 MVHfwd9와 함께 MVHrevl 및 rev2을 사용하여 뚜렷한 밴드를 산출하였다. 경쇄에 대해서, MVLrev와 MVLfwd2 및 fwd5 둘다와의 조합은 생성물을 산출하였다. 사용된 PCR 프로그램은 Topo 클로닝에서 사용하기 위해 72℃에서 10-분 배양을 포함한다. PCR 생성물은 제조업자의 프로토콜에 따라 pCR2.1 Topo TA 클로닝 벡터에 라이게이션되었다. 각각의 라이게이션의 20 콜로니 미니 프렙(prep)에 대해서 골랐고 정확 한 크기의 삽입을 갖는 것들을 M13 및 M13rev으로 시퀀싱하기 위해 미량화학에 보냈다.
공통 서열을 각각의 PCR 생성물에 대해 유도하였고, BLAST 서치에서 사용하였고, 대표 미니 프렙을 선택하여 클로닝을 진행하였다.
Luca31 경쇄:
MVLrev 및 MVLfwd2로 발생된 Luca31 LC는 불완전 V영역을 가졌다. MVLfwd5로 발생된 LC는 완전하였다. 클론 5.19은 클로닝의 다음 단계에서 주형으로 사용하기 위해 선택되었다. PCR 프라이머는 HindIII 부위와 최적의 Kozak를 5' 말단에, 그리고 Bbsl 부위를 3' 말단의 VL 영역에 편입하도록 설계되었다.
Figure 112007000927728-PCT00001
LC 클론 5.19에서 PCR을 수행하였고 결과의 밴드는 겔 추출하였고, HindII와 Bbsl로 소화시키고, 8.5 kb pDEF2B/Kappa 벡터 단편에 라이게이션하고, 동일한 효소로 소화시켜, pDEF2B/Luca31.LC을 수득하였다. 미니-프렙을 프라이머 96-91와 CM-KR으로 시퀀싱하였고 정확한 클론을 선택하여 맥시 프렙 배양을 씨딩하였다.
pNEF32/Luca31.LC 및 pNEF5/Luca31.LC을 생성하기 위해, 1776 bp NotI - Xbal LC 단편을 pDEF2B/Luca31.LC로부터 11.7 kb pNEF32 또는 19.4 kb pNEF5 NotIXbal 벡터 단편까지 라이게이션함으로써 경쇄 발현 벡터를 생성하였다.
Luca31 중쇄:
MVHrev 1 및 rev2 서로 약간 상쇄되기 때문에, Luca31 HC PCR 생성물은 오로 지 그들의 3' 말단에서만 다르다. 공통 서열을 생성하였고, 2 희귀 코돈을 함유하지만, DNA 서열은 그들 부위에서 선명하다. 클로닝의 다음 단계에서 주형으로서 사용하기 위해 클론 9R1.1을 선택하였다. PCR 프라이머는 HindIII 부위와 최적의 Kozak 서열을 5' 말단에 그리고 Nhel 부위를 VH 영역의 3'말단에 편입되도록 설계하였다.
Figure 112007000927728-PCT00002
HC 클론 9R1.1에서 PCR을 수행하였고 결과의 밴드를 겔 추출하였고, HindIII 및 Nhel로 소화시키고, 그후 9.3 kb pICFSP. IgG1.NH 또는 pICFSP. IgG4.NH HindIII - NheI 벡터 단편에 라이게이션시켜 pICFSP.Luca31.Gl 또는 G4. HC, 각각을 생성하였다.
pDEF32/Luca31.G1.HC, pDEFl4/Luca31.G1.HC, pDEF32/Luca31.G4.HC 및 pDEF14/Luca31.G4.HC.를 생성하기 위해, pICFSP.Luca31.Gl 또는 G4. HC로부터 12 kb pDEF32 또는 19.7 kb pDEF14 Notl - Xbal 벡터 단편까지 3.2 NotI - Xbal HC 단편을 라이게이션 함으로써 중쇄 발현 벡터를 생성하였다
올-인-원 발현 벡터:
pDEF14/Luca31.1.를 생성하기 위해서, 19.7 kb pDEF14 NotI- Xbal 벡터 단편을 3.4kb BglII-Xbal pDEF2B/Luca31.LC 경쇄 단편과 6.5kb NotI- BamHI pICFSP/Luca31.G1에 라이게이션함으로써 pDEF14 올-인-원 발현 벡터를 생성하였다.
다음의 서열을 결정하였다:
Contig "공통 정렬 Topo LC5"의 개략적인 통람
Figure 112007000927728-PCT00003
Figure 112007000927728-PCT00004
Contig "Luca31 VH 공통"의 개략적인 통람
Figure 112007000927728-PCT00005
Figure 112007000927728-PCT00006
실시예 5. 암 세포주 SW480 에서 트랜스페린 리셉터 발현의 웨스턴 블롯 분석
신장 세포 암종 세포 SW480 (ATCC# CCL-228)는 175 cm2 배양 디시에서 컨플루언시까지 성장되었다. 융합성 단층을 Hank's Balanced Salt 용액 (HBSS+ 나트륨 바이카보네이트 또는 페놀 레드를 함유하지 않음; lOmM HEPES, pH 7.4로 완충화; Sigma Chemicals)로 3번 세척하였고 200㎍의 술포-NHS-LC-비오틴 (Pierce Endogen)로 실온에서 30분동안 비오티닐화하였다. 세포를 그후 O.1M Tris, pH 7.4 (Sigma Chemicals)을 함유하는 HBSS+로 세척하였고 0.1M Tris, pH 7.4 을 함유하는 HBSS+로 15분 동안 실온에서 배양하였다. 세포를 최종적으로 HBSS+ 으로 3번 세척하였고 용해 완충제 (HBSS+ with 2% Triton X-100, 2mM PMSF, 0.1 % 나트륨 아지드와 함께, 및 EDTA 없는 완전 미니-프로테아제 칵테일 (Roche 분자 BioChemicals)의 5ml 용해 완충제당 1 정)에서 배양에 의해 5분동안 얼음에서 용해하였다.
세포를 용해 완충제에서 긁어모았고 용해물을 수집하였다. 14,000 x g에서 1시간동안 4℃에서 용해물을 원심분리하였다. 정화된 용해물을 그후 2 시간동안 4℃에서 5㎕의 사람 IgG 컨쥬게이티드(lmg/ml) CNBr 4MB 세파로스 비즈 (Amersham Pharmacia)로 미리-깨끗이 하였다. 사람 IgG 비즈을 원심분리하고 제거하고, 미리-깨끗이된 용해물을 그후 CNBr 4MB 세파로스 비즈 (Img/ml에서 컨쥬게이트된) 컨쥬게이티드 단일클론 항체 LUCA31로 2시간동안 4℃에서 배양하였다. LUCA31 비즈를 원심분리하였고 2-시간 배양후에 제거하였다. 사람 IgG 과 LUCA31 비즈 둘다는 1 ml의 용해 완충제로 개별적으로 3번 세척하였고 그후 1ml HBSS+로 3번 세척하였다. 세척된 비즈를 30㎕의 SDS-PAGE 샘플 완충제를 첨가하고 99℃에서 5분동안 끓임으로써 용리시켰다.
샘플을 그후 4-20% Novex 구배 겔 (Invitrogen) 위에서 용해시키고, 0.2μm 니트로셀룰로스 막 (Invitrogen) 위로 이동시키고 양고추냉이퍼옥시다제 (HRP) 컨쥬게이티드 스트렙타비딘 (Pierce Endogen)에 의해 가시화하고 또는 LUCA31의 5㎍/블롯으로 웨스턴 블롯팅하였다.
HRP 컨쥬게이티드 스트렙타비딘로 검출하기 위해, 니트로셀룰로스를 차단 완 충제 (0.05% Tween-20 (TBST)와 같이 Tris-완충화 식염수에서 5% 비-지방 건조 밀크)로 1시간동안 먼저 차단시켰다. HRP 컨쥬게이티드 스트렙타비딘을 1㎍/ml 에서 TBST 안으로 희석시켰고 30분동안 실온에서 니트로셀룰로스에 노출시켰다. ECL+ (Amersham)으로 가시화하기 전에 니트로셀룰로스를 TBST에서 3번 세척하였다.
LUCA31으로 웨스턴 블롯팅을 하기 위해, 니트로셀룰로스를 차단 완충제에서 유사하게 1시간동안 차단시켰다. 니트로셀룰로스를 그후 차단 완충제에서 희석된 1ml의 5㎍/ml LUCA31 을 함유하는 열 밀봉된 플라스틱 파우치에서 배양하였다. 시간동안 실온에서 10ml의 l㎍/ml HRP 컨쥬게이티드 당나귀 항-마우스 IgG (솟과, 닭, 염소, 기니 피그, Syrian 햄스터, 말, 사람, 토끼, 양 혈청 단백질에 대해서 중쇄 및 경쇄 특이적, 교차 흡착됨; Jackson Immunoresearch Cat. #709-035-149)으로 배양하기 전에 니트로셀룰로스를 TBST로 3번 세척하였다. 니트로셀룰로스를 최종적으로 TBST로 3번 세척하였고 ECL+ (Amersham)에 의해 가시화하였다.
도 1은 LUCA31으로 SW480 세포 용해물의 면역침전과 LUCA31 항체를 사용하는 웨스턴 블을 보여준다. 화살표는 90-100 kDa의 대략 분자량을 갖는 유일한 밴드를 가리킨다.
실시예 6. 면역조직화학 방법
암 환자로부터 냉동된 조직 샘플을 OCT 화합물에 묻고 드라이 아이스와 함께 이소펜테인에서 급속-냉동시켰다. 동결 절편을 Leica 3050 CM 마이크로톰으로 8-10 ㎛의 두께로 커팅하고 SuperFrost 플러스 슬라이드 (VWR #48311-703)위에 해동-마운팅하였다. 절편을 10℃에서 75% 아세톤/25% 에탄올로 고정하였고 2-4 시간 실 온에서 공기건조시켰다. -80℃에서 사용할때까지 고정된 절편을 저장하였다.
면역조직화학을 위해서, 조직 절편을 회수하여 Tris 완충화 0.05% Tween (TB-T)에서 세척하고 차단 완충제 (TB-T,5% 정상 염소 혈청 및 100㎍/ml 아비딘)에서 30분동안 실온에서 차단시켰다. 슬라이드를 그후 항-트랜스페린 리셉터로 배양하였고 대조군 단일클론 항체는 60-90분동안 실온에서 차단 완충제 (1 g/ml)에 희석시켰다. 절편을 그후 차단 완충제로 3번 세척하였다. 결합된 단일클론 항체는 0.1 M 나트륨 아세테이트 완충제 pH 5.05 및 0.003% 과산화수소 (Sigma cat. No. H1009)중의 염소 항-마우스 IgG + IgM (H+L)F(ab')2-퍼옥시다제 및 퍼옥시다제 기질 디아미노벤지딘 (1mg/ml, Sigma cat. No. D 5637)로 검출하였다. 염색된 슬라이드는 헤마톡실린으로 카운터-염색되었고 Nikon 현미경으로 검사하였다.
어떤 경우에, 적절한 항원 복구 방법이 채택된 후에, 파라핀 파묻은 포름알데히드-고정된 조직을 면역조직화학을 위해 사용하였다. 한가지 그러한 항원 복구 방법이 Mangham and Isaacson, Histopathology 35: 129-33 (1999)에 기술된다. 항원 복구 및/또는 검출의 다른 방법이 당업자들에 의해 사용될 수 있다. 유사한 실험으로부터의 결과는 냉동된 조직을 사용하여 수행되거나, 또는 적절한 곳에서, 항원 복구 및 PolyMICA 검출과 함께 고정된 조직이 수행되었다. 다양한 정상 및 암 조직에 대한 항-트랜스페린 리셉터 항체의 결합을 평가하였다. 모든 경우에, 대조군 고정된 조직에 있는 항체 결합은 냉동된 조직의 그것과 상호관련이 있었다. 대조군에서 두개가 매치되지 않았다면, 냉동된 조직으로부터의 결과만이 오직 사용 되었다.
편의를 위해, 다른 공급원으로부터 냉동된 수술 조직을 사용하여 몇가지 실험의 조합된 결과의 요약은 아래 표 1과 표 2에서 보여준다.
[표 1과 2]
Figure 112007000927728-PCT00007
실시예 7. 면역세포화학 결과
단일클론 항체 LUCA31를 사용하여 다른 타입의 조직으로부터 다양한 세포주와의 반응성을 테스트하였다. 결과는 약한 포지티브 염색에 대해서는 '+', 중간정도의 포지티브염색에 대해서는 '++', 강한 포지티브 염색에 대해서는 '+++' 그리고 네거티브 염색에 대해서는 '-'로 점수매겼다.
WO01/43869에서 기술된 바와 같이 CellArrayTM 기술을 사용하여 면역조직화 학 결과를 얻었다. 다른 확립된 세포주로부터의 세포는 프로테아제를 사용하지 않고 성장 표면으로부터 제거하였고, OCT 화합물에 패킹하고 묻었다. 세포를 냉동하고 절편화하고, 그후 표준 IHC 프로토콜을 사용하여 염색하였다.
LUCA31 항체의 다양한 확립된 사람 정상 및 종양 세포주에 대한 결합의 결과 가 편의를 위해 표 3에 편집되어 있다. 표 3에 제시된 실험은 본원에서 기술된 방법을 사용하는 Live-세포 ELISA 및 CellArrayTM 결합 실험을 포함한다.
Figure 112007000927728-PCT00008
Figure 112007000927728-PCT00009
* CC-2251 BioWhittaker
단일클론 항체 LUCA31를 사용하여 신경아교종-유도된 세포주와의 반응성을 테스트하였다. CellArrayTM 기술에 대해 위에서 기술한 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 면역세포화학 결과를 얻었다. 신경아교종-유도된 세포주를 프로테아제를 사용하지 않고, 성장 표면으로부터 제거하였고, 패킹되고 OCT 화합물에 묻었다. 세포를 냉동하고 절편화하고, 그후 표준 IHC 프로토콜을 사용하여 염색하였다. LUCA31은 선별된 25 신경아교종-유도된 세포주 중에 21개에서 포지티브이었다. 염색 강도는 +/-에서 2+ 염색까지의 범위였다.
실시예 8. 추가적 LUCA 세포주 스크리닝
종양 세포주 분포의 분석. 직장결장, 비-작은 세포 폐 및 췌장암을 나타내는 32 사람 종양 세포주의 패널을 사용하여 LUCA31 에피토프 발현을 평가하였다. 내부 항체 표준 (항-EGF 리셉터)에 대해서 LUCA31의 표적 세포에 대한 결합은 결정되었고 평균 형광 강도의 함수로서 데이타를 플로팅하였다. LUCA31 염색의 분포가 도 2에 나와있다. 에피토프 발현 실험의 결과는 세포 패널에 걸쳐서 LUCA31가 넓은 범위의 염색 강도를 가진다는 것을 나타냈다.
실시예 9. 세포 증식 분석
LUCA31 항체의 생물학적 활성을 결정하기 위해, 본 발명자들은 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 그것을 삼중수소화 티미딘 편입을 측정하는 세포 증식 분석으로 테스트하였다. FACS 배열로 나타난 동일한 32 세포주에 대해서 분석을 수행하였고 본 발명자들이 이전에 보여준 추가의 5 세포주는 이 항체에 의해 인식되었다. 본 발명자들은 표준 (10%)과 낮은 (0.5%) 혈청 조건 모두를 사용하여 활성에 대해 항체를 테스트하였다. 두 혈청 조건 모두를 사용하여 활성을 테스트하기 위한 결정은 감소된 혈청 조건을 사용하여, 유일한 활성인 마우스 EGF 리셉터 항체 225 (세툭시마브의 뮤린 전구체)과의 경험에 근거하였다.
항체의 5 농도(10, 5, 2.5, 1.25 및 0.6ug/ml)를 사용하여 각각의 항체를 테스트하였고 결과는 비-항체 대조군과 비교하였다. 각각의 분석을 3중으로 수행하였다. 세포의 1차 스크린의 결과는 표 4에 요약되어있고 LUCA31가 세포주의 이 패널에서 널리 활성이라는 것을 나타낸다. 어둡게 표시됨 세포는 세포 증식의 최대 저해(즉 90=90% 성장 저해)를 나타내는 숫자와 함께 포지티브 스코어를 나타낸다.
40%과 동일하거나 또는 더 큰 세포 증식의 저해가 포지티브로서 스코어링되었다. 이 역치는 항체가 트라스투주마브 및 EGF 리셉터 항체 225(이것 둘다 이 분석에서 세포 증식에서의 40-50% 감소를 일으킨다)와의 경험과 일치하는, 진성 생물학적 활성을 나타낸다. LUCA31 항체는 이 분석에서 특히 활성이었고, 종종 낮은 혈청 조건 하에서 실질적으로 세포 증식을 줄인다. 이 항체의 활성에 대한 혈청 농도의 영향은 ASPC-1 또는 A431 세포 중의 하나를 사용하여 EGFR 항체 225에 대해서 관찰된 것과 유사하다.
Figure 112007000927728-PCT00010
실시예 10. 추가적 IHC 분석
재료 및 방법에서 기술된 바와 같이 정상 (뇌, 결장, 심장, 간, 신장, 폐, 췌장, 소장, 비장) 및 종양 (유방, 결장, 폐, 췌장) 조직의 패널을 사용하여 LUCA31을 평가하였다. 염색 포지티브로서 Raven에 의해 확인된 조직을 사용하여 염색을 먼저 최적화하였다. 최적화에 이어서, 조직을 퍼옥시다제 컨쥬게이티드 2차 항체를 사용하여 면역반응성에 대해 평가하였고 강도에 대해 점수를 매겼다. O.1ug/ml에서 LUCA31을 사용하여 제조된 IHC 데이타의 요약은 표 5에 나타나있다. LUCA31에 대해서 다른 조직에서 관찰된 제한된 염색과 함께, 정상 조직에서의 가장 강한 염색은 결장과 소장에서 보인다.
Figure 112007000927728-PCT00011
실시예 11. 트랜스페린 리셉터항원의 분리 및 특성화
LUCA31이 반응하는 항원을 확인하기 위해서, 면역침전 (Ippt) 실험을 수행하였다. Ippt에 대해서, SW480 세포의 30 175cm2 플라스크를 30ml의 용해 완충제로 용리하였다. 용해 완충제는 2% Triton X-100로 강화된 Hanks 밸런스 염 용액 (HBSS+), 프로테아제 저해제 칵테일 (Roche 분자 Biochemicals로부터 완전한 미니 EDTA 없는 프로테아제 칵테일의 5ml 용해 완충제 당 1 정제),0.1 % 나트륨 아지드, 및 2mM PMSF으로 구성되었다. 1ml 단백질 G (Amersham Pharmacia)로 구성되는 칼럼 위로 지나가기 전에, 세포 용해물을 24,000xg에서 30분동안 4℃에서 정화하였다. 미리-깨끗이된 SW480 용해물을 그후 2시간동안 4℃에서 단백질 G 흡수된 트랜스페린 리셉터로 배양하였다(10 ㎍ 트랜스페린 리셉터는 30분동안 실온에서 5 ㎕ 단백질 G로 미리-배양하였다). 비즈(미리-깨끗한 단백질 G 비즈와 단백질 G 흡수된 트랜스페린 리셉터 비즈 둘다)를 그후 30㎕ SDS 샘플 완충제 (3%SDS, 20% 글리세롤, 1OmM DTT, 2% Bromo페놀 블루, O.1M Tris, pH8.0)로 용출하기 전에, 용해 완충제로 3번 세척하였다. 25 마이크로리터의 용출액을 그후 SDS-PAGE에 의해 분석하였고 Coomassie 염색을 통해 가시화하였다. 5 마이크로리터의 용출액을 SDS-PAGE에 의해 분석하였고 웨스턴 블롯팅을 위해 니트로셀룰로스로 더욱 이동시켰다.
블롯을 그후 LUCA31 로 프로브하였고 웨스턴 블롯팅 키트 (Invitrogen Cat. No. WB7103)을 사용하여 현상하여 항원 인식을 확인하였다. 트랜스페린 리셉터에 대해, 트랜스페린 리셉터 및 마우스 IgG 용출액을 웨스턴 블롯팅에 의해, 트랜스페린 리셉터 용출액 (90-100kDa)에 유일한 단백질을 관찰하였다. Coomassie 염색에 의해, 트랜스페린 리셉터 유일한 단백질이 ~100kD에서 관찰되었다. 깨끗한 외과용 매스 블레이드를 사용하여 NuPAGE 겔로부터 염색된 단백질 밴드를 삭제하고 깨끗한 Eppendorf 튜브에 놓는다. 질량 분석법에 의해 단백질 확인을 위해 사용될 때까지 -20℃에서 삭제된 밴드를 저장한다.
실시예 12. 질량 분석법 (MS/MS)을 사용하여 LUCA31 가 결합하는 항원의 특성화
실시예 11에서 기술된 바와 같이 LUCA31이 결합되는 항원을 분리하였고 Kane et al. J Bio Chem. 2002 June 21;277(25):22115-8, Epub May 06의 방법에 따라 Tandem 질량 분광법을 행했다. 단백질을 SDS- PAGE에 의해 분리하였고, 겔은 콜로이달 Coomassie Blue 시약 (Invitrogen)으로 염색하였다. 관심의 단백질은 트립신으로 겔에서 소화되었다. Wu et al., Nature 405: 477-482 (2000)에서 기술된 바와 같이 이온 트랩 질량 분광계 (Thermo-Finnigan LCDQ DECA XP)에서 마이크로모세관 액상 크로마토그래피 MS/MS에 의해 트립신 펩티드를 시퀀싱하였다. 이것의 결과는 트랜스페린 리셉터의 단편과 일치한 질량을 갖는 이런 산출된 하나의 폴리펩티드를 산출하였다.
LUCA31가 트랜스페린 리셉터에 결합하는지 여부를 확인하기 위해서 본 발명자들은 사람 태반으로부터 유도된 정제된 트랜스페린 리셉터의 제제를 사용하여 실험을 수행하였다. 도 3에서 나타낸 바와 같이, 또다른 항-트랜스페린 리셉터 항체, LUCA29 및 시중에서 입수가능한 트랜스페린 리셉터 항체 BER-T9 모두는 정제된 트랜스페린 리셉터에 결합하지만, LUCA31는 그렇지 않다. 트랜스페린 리셉터의 다른 제제로 이 실험이 반복될 때 유사한 결과를 달성하였다(데이타를 도시하지 않음).
본 발명자들은 이들 데이타가 LUCA31가 트랜스페린 리셉터와 반응하는 단백질에 결합하거나 또는 정제된 재료의 샘플에서 잘 나타나지 않는 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다고 해석하였다. LUCA31 표적의 우리의 이해를 상세히 논술하기 위해 본 발명자들은 다음의 실험을 수행하였다.
a. 항체 경쟁 분석. 본 발명자들은 공지된 트랜스페린 리셉터 항체가 HCT15 세포에의 결합에 대해 LUCA31와 경쟁하는 능력을 평가하였다. 이 실험의 결과는 도 4, A와 B에 도시된다. 본 발명자들은 비오티닐화 LUCA31가 HCT15 세포에 결합하는 능력이 충분히 항체 42/6에 의해 저해되고 부분적으로 OVCA26, LUCA29 및 KID21에 의해 저해된다는 것을 발견하였다. OVCA18 항체는 세포로의 LUCA31의 결합을 증가시켰고 다른 트랜스페린 리셉터 항체는 LUCA31 결합에 영향을 주는 것으로 보이지 않았다. 도 4B은 네거티브 대조군 항체 1B7.11가 LUCA31 결합에 대해 효과가 없고 비- 비오티닐화 LUCA31 충분히 비오티닐화 항체의 결합을 차단한다는 것을 증명한다. 이들 관찰에 근거하여, 본 발명자들은 LUCA31가 OVCA18 항체에 의해 안정화되거나 또는 유도되는 에피토프를 인식할 수 있고 이 에피토프가, 기능적으로, 트랜스페린 결합 부위에 연결될 수 있다는 것을 제시한다. 이런 관찰을 특히 흥미롭게 만드는 것은 OVCA18이 또한 세포 증식 (데이타는 도시하지 않음)을 자극하고 트랜스페린의 세포에 대한 결합을 자극한다는 것이다 (하기 도 6 참조). 함께 고려하면, 이들 데이타는 LUCA31이 트랜스페린 리셉터에 결합하고 있다는 사실과 일치하지만, 항체가, 결합 부위를 트랜스페린 리셉터 항체가 서브셋과 공유하는 관련된 인자에 결합할 수 있다는 가능성을 배제하지는 않는다.
b. CHO 세포에서 트랜스페린 리셉터의 발현.
LUCA31 에피토프를 더욱 정화하기 위해서, 본 발명자들은 재료와 방법에서 기술한 바와 같이, CHO 세포에서 전장 사람 트랜스페린 리셉터를 클로닝하고 발현하였다. 도 5에서 나타낸 바와 같이, CHO 세포의 LUCA31 염색의 FACS 분석은 2차 항체 단독으로 관찰된 염색의 수준과 거의 비슷하였다. 대조적으로, 트랜스페린 리셉터 구성체로 트랜스펙션된 CHO 세포는 두번째 항체 시약에 비해 실질적인 LUCA31으로의 염색을 보여주었다. 이들 데이타는 항체 경쟁 연구 결과에 따라, LUCA31가 직접적으로 트랜스페린 리셉터에 결합한다는 것을 나타낸다.
c. 추정되는 작용의 메카니즘.
본 발명자들의 현재 데이타는 LUCA31 항체가 직접적으로 트랜스페린 리셉터에 결합한다는 생각과 일치하지만, 그것은 특이적으로 트랜스페린 리셉터에 결합하는 단일클론 항체 (mAbs)에 의해 통상적으로 인식되지 않는 에피토프와 상호작용할 수 있다. 트랜스페린 리셉터 항체는 트랜스페린 리셉터 세포이물흡수의 동요를 통해 철 수송을 제한함으로써 또는 리셉터에 대한 트랜스페린의 결합을 차단함으로써이전에 세포 증식을 차단하는 것으로 나타냈다. LUCA31과 트랜스페린이 리셉터로의 결합에 대해 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해서, 본 발명자들은 세포 결합 분석에서 LUCA31와 트랜스페린의 상호작용을 검사하였다. 증가하는 농도의 트랜스페린은 LUCA31의 세포에 대한 결합에 상당히 영향을 주지 않았지만, 벤치마크 트랜스페린 리셉터 항체 42/6의 결합을 감소시켰다(도 6A). 흥미롭게도, LUCA31의 첨가는 트랜스페린의 세포에 대한 결합을 증가시킨 반면, 벤치마크 항체 42/6가 트랜스페린 결합을 저해하였다(도 6B). 이들 결과는 42/6와는 달리, LUCA31는 트랜스페린 결합과 겹치지 않는 부위에 결합한다는 것을 나타낸다. 이것은 42/6가 세포에 대한 LUCA31 결합을 저해한다는 관찰을 고려할 때, 흥미롭다. 본 발명자들은 또한 세포에 대한 LUCA31 결합에 미치는 그것의 영향 때문에, 이들 연구에서 OVCA18 항체의 영향을 조사하였다. LUCA31와 유사하게, OVCA18 항체는 또한 세포에 대한 트랜스페린 결합을 증가시켰지만, 더 적은 정도까지 증가시켰다.
실시예 13. 추가의 조직 결합 연구
표적 발현 및 분포. 본 발명자 데이타가 LUCA31가 트랜스페린 리셉터에 존재하는 에피토프에 결합한다는 생각과 일치하기 때문에, 본 발명자들은 트랜스페린 리셉터과 비교하여, LUCA31 에피토프의 조직 분포과 발현을 평가하는 것이 중요하다고 느꼈다. 이전의 연구는 LUCA31가 간, 췌장 또는 뇌 절편을 염색하지 않았고 이들 조직이 정상으로 트랜스페린 리셉터 mAbs에 의해 인식된다는 것을 나타냈다. 여기에서 연장하여, 본 발명자들은 이들 조직의 각각의 3 샘플을 사용하여, 그리고 결장을 참조 조직으로 포함하여, 3개의 공지된 트랜스페린 리셉터 항체 (H68.4, BERT9 및 DF1513) 및 LUCA31의 염색 패턴을 분석하였다. 본 실험의 요약은 표 6에 나와있다.
Figure 112007000927728-PCT00012
이 실험의 결과는 이전의 연구와 일치하고 LUCA31는 원형 트랜스페린 리셉터 항체의 동일한 조직 염색 패턴을 생성하지 않는다는 것을 보여준다. 이들 결과는 LUCA31 항체가 다른 트랜스페린 리셉터 항체에 의해 인식된 에피토프와는 다른 패턴으로 분포되는 에피토프를 인식한다는 개념을 지지하고 다른 트랜스페린 리셉터 항체보다 좀더 순조로운 치료 인덱스를 제공할 수 있다. 그러나, lOug/ml에서 췌장과 뇌 내피 염색은 LUCA31 에피토프가 이들 조직에 존재하지만, 결장과 일부 종양 샘플보다 덜 풍부할 수 있다는 것을 암시한다.
본 발명자들은 또한 암에서 에피토프 발현의 발생을 더 잘 확립하기 위해서 LUCA31로 추가의 종양 조직의 염색을 조사하였다. 이전에, 이 항체는 사람 결장 암종, 사람 췌장암종 및 사람 폐암종에서 포지티브로 증명되었다. 이 연구에서 본 발명자들은 이 항체의 포지티브 반응성의 발생을 더 잘 확립하기 위해, 추가의 폐, 췌장, 및 결장 암종 샘플을 평가하였다. LUCA31은 4명의 결장 암종 환자 중 4; 2명의 췌장암종 환자 중 2; 그리고 2명의 폐암종 환자 중 2명에서 포지티브였다(표 7). 모든 종양은 1 ug/ml및 10 ug/ml 둘다에서 포지티브였다. 결장과 폐암종은 1 ug/ml에서 강한 강도 염색을 가진 반면, 췌장암종은 항체의 1ug/ml에서 약한 강도 염색과 10 ug/ml에서 중간정도의 강도 염색을 가졌다. 이들 결과는 LUCA31 에피토프가 종양 조직에서 발현되는 것을 나타내는 다른 데이타와 일치한다.
Figure 112007000927728-PCT00013
실시예 14. RBCs , 혈소판 및 백혈구의 FACS 분석
혈액 구획에서 항원 발현을 평가하기 위해 적색 혈액 세포, 혈소판 및 백혈구의 LUCA31 염색의 분석을 수행하였다. 이들 세포 집단 중 어떤 것에서도 염색이 관찰되지 않았다. 이것은 또한 단핵세포와 림프구 집단에서 트랜스페린 리셉터 발현에 대한 공개된 보고와는 모순된다. 그러나, 트랜스페린 리셉터 발현은 비-증식 림프구에 비해서, 자극된 림프구에서 유발되기 때문에(Neckers & Cossman, Transferrin receptor induction in mitogen -stimulated human T lymphocytes isrequired for DNA synthesis and cell division and is regulated by interleukin 2, Proc Natl Acad Sci USA 80,3494-3498 (1983)), 본 발명자들은 LUCA31을 사용하여 PHA로 자극된 T-림프구의 염색을 검사함으로써 본 발명자들의 분석을 확장하였다(표 8). 참조로서, 본 발명자들은 림프구 염색에 대한 표준으로서 알파2 및 베타 1 인테그린 항체는 물론이고, 트랜스페린 리셉터 항체 LUCA29 및 BERT9을 사용하였다. 조직 샘플의 우리의 분석의 결과와는 달리, 본 발명자들은 이 분석에서 LUCA31와 다른 트랜스페린 mAbs 사이의 차이를 관찰하지 않았다.
Figure 112007000927728-PCT00014
비고:
--특별히 언급되지 않으면 전체의 집단은 지시된 염색 수준을 가졌다.
--약어 "서브(하위)"는 뚜렷한 하위집단이 활성을 나타냈고 나머지가 네거티브였다는 것을 나타낸다.
--이 표에서 "B" 세포는 CD3 네거티브 림프구를 나타낸다.
--이 표에서 "T" 세포는 CD3 포지티브 림프구를 나타낸다.
트랜스페린 리셉터가 분화하는 골수 원종 세포에서 발현될 것으로 보여졌기 때문에(Helm et al.,Characterization and phenotypic analysis of differentiating CD34+haaman bone marrow cells in liquid culture, Eur J Haematol 59,318-326(1997)), 본 발명자는 또한 LUCA31 에피토프가 또한 골수 유도된 세포에서 발현되는지 여부를 검사하기 위해 실험을 수행하였다. 이것을 하기 위해, 본 발명자들은 CD34 풍부한 골수 세포를 얻었고 LUCA31 및 다른 특이성을 갖는 또다른 항체, KID20를 사용하여 FACS에 의해 그들을 평가하였다.
이 실험으로부터 데이타는 표 9에 나와있고, 이것은 다른 항체에 의해 사람 골수 원종 염색을 보여준다. 자극되지 않은 그리고 성장 인자 자극된 세포 모두의 항체 염색을 FACS에 의해 결정하였고 결과는 항체 염색된 세포의 퍼센트로서 표시된다. 미처리 세포에서 LUCA31 염색은 트랜스페린 리셉터 항체 BERT9에서 얻은 결과와 매우 유사하였다. 세포가 72 시간동안 GM-CSF, SCF, IL3 및 EPO을 포함하여 성장 인자의 존재하에서 배양될 때, LUCA31 및 BERT9 염색 세포의 비율이 증가하였다. 이들 결과는 본 발명자들이 증식 림프구에서 관찰한 것과 유사하였고 LUCA31 에피토프는 또한 성장 인자 자극된 골수 원종 세포 집단에서 발현된다는 것을 나타낸다.
Figure 112007000927728-PCT00015
실시예 15. 활성 분석
이 분자의 활성을 보다 충분히 특성화하기 위해서, 본 발명자들은 이종이식 종양 모델 (사람 이종이식 세포 패널)에서 확인된 세포의 패널을 연구하였고 항체가 단독으로 그리고 화학치료제와 조합하여, 고도로 활성이라는 것을 증명하였다. 본 발명자들은 LUCA31이 트랜스페린 리셉터와 상호작용한다는 것을 보여주었기 때문에, 본 발명자들은 잘 연구된 IgA 트랜스페린 리셉터 항체 42/6 (Trowbridge & Lopez, 1982)에 대해서, 그것의 활성을 벤치마크하였다. 표 10에서 나타낸 바와 같이, LUCA31은 우리의 우선시킨 이종이식 패널에서 세포주의 모두에서 활성이고 항 -트랜스페린 리셉터 항체 42/6와 필적한다.
Figure 112007000927728-PCT00016
LUCA31 항체를 또한 화학치료제 캄프토테신, 카르보플라틴, 독소루비신, 겜시타빈 및 파클리탁셀와 조합하여 이종이식 세포 패널에서 테스트하였다. 각각의 작용제에 대해서, LUCA31의 첨가가 부가적인 효과를 초래하였고, 항체는 종양세포붕괴제의 작용을 상쇄시키지 않는 것 같다고 암시한다. HCT116 세포에서 LUCA31와 화학치료와의 조합을 위한 대표 데이타가 도 7에 나와있다. LUCA31 화학치료법 조합 연구로부터의 결과는 본 발명자가 Her2 표적화 항체 트라스투주마브와 화학치료법 짝을 연구할 때 얻은 결과와 필적한다.
LUCA31의 활성은 낮은 혈청 조건에서 최대이며, 이는 태아 솟과 혈청(FBS)에서 이용가능한 성분은 이 항체가 세포 증식을 차단하는 능력을 약하게 한다고 암시한다. 42/6 항체가 고형 종양 세포주의 증식을 차단하는 능력은 또한 낮은 혈청 조건에서 최대로 나타났고 이것은 항체와 트랜스페린 사이의 경쟁 때문이다(Taetle, R., and Honeysett, J. M. (1987). 사람 고형 종양 세포의 시험관내 성장에 대한 단일클론항-트랜스페린 리셉터 항체의 영향. Cancer Res 47, 2040-2044). 물론 LUCA31가 트랜스페린 리셉터로의 결합에 대해 트랜스페린와 경쟁하는 것으로 보이지 않지만, 10% FBS에서 LUCA31의 감소된 활성이 세포 배양 배지에서 증가된 트랜스페린의 결과인지 여부를 결정하기 위해 본 발명자들은 실험을 수행하였다.
이 문제를 역설하기 위해 본 발명자들은 철 하전된 트랜스페린을 낮은 혈청 배지에 첨가하였고 이종이식 종양 세포주 패널을 사용하여 LUCA31와 42/6 둘다의 활성을 조사하였다. 본 발명자들은 할로-트랜스페린이 세포 배양 배지에 첨가될 때 LUCA31와 42/6의 둘다의 활성이 감소된다는 것을 발견하였다. 도 8은 0과 100ug/ml 트랜스페린에서 LUCA31; HCT15, HCT116 및 LOVO에 가장 민감한 3 세포주에 대한 데이타를 보여준다. HCT15 세포에서, LUCA31은 첨가된 트랜스페린의 존재하에서 양호한 활성을 보유한다.
이것은 또한 이 항체가 10% 혈청에서 활성을 유지하는 능력과 일치한다. 모두 고려할때, 이들 데이타는 LUCA31가 세포 증식을 차단하는 능력이 트랜스페린에 의해 약화될 수 있다는 것을 암시하고 세포 배양 조건을 함유하는 10% 혈청에서 이 항체의 제한된 활성은 트랜스페린의 증가된 농도 때문이라는 생각을 지지한다. 높은 혈청에서 항체 42/6의 감소된 활성에 대한 증거에도 불구하고, 이것과 다른 트랜스페린 리셉터 항체는 동물 암 모델에서 활성인 것으로 나타났고, 이는 분자가 생체내에서 작동하는 능력이 혈청 트랜스페린 수준에 의해 무효가 되지 않는다는 것을 암시한다.
실시예 16. 세포 주기 분석
LUCA31의 작용의 메카니즘을 더욱 정의하기 위해, 본 발명자들은 세포 주기를 통해 항체가 HCT15 세포의 진행에 어떻게 영향을 주었는지를 조사하였다. 도 9에서 나타낸 바와 같이, 24시간동안 LUCA31로 HCT15 세포의 처리는 2N 함량(G1) 세포의 비율의 감소를 야기하였고 S-상 저지와 일치하는, DNA 함량을 갖는 세포의 집단을 증가시켰다. 추가적으로, LUCA31로 처리된 HCT15 세포는 또한 세포사와 일치하는, DNA 함량< 2N 을 갖는 세포의 증가된 비율을 보여주었다. 이런 영향은 대조군 항체 처리된 또는 미처리된 세포에서 명백하지 않았다. 이들 데이타는 LUCA31가 HCT15 세포의 하위집단에서 백혈구정체라기 보다는 오히려 세포사를 유발할 수 있다는 것을 암시하고 왜 이들 세포가 LUCA31 노출에 가장 민감한지에 대한 이론적 근거를 제공할 수 있다.
실시예 17. 종양 세포주에 대한 LUCA31 의 영향
추가적 종양 타입에서 이 분자의 잠재적 활성을 탐구하기 위해서, LUCA31를 전립선 (DU145, LNCap) 및 유방 (MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-435, ADR-Res) 으로부터 유도된 고형 종양 세포주에서 테스트하였다 (도 10). LUCA31 에피토프의 발현은 세포주의 각각에서 유사하였지만, LUCA31은 MCF7 세포에서 가장 활성인 것처럼 보였다. 이들 결과는 결장, 폐 및 췌장암을 사용하여 생성된 데이타와 필적한다.
고형 종양 세포주에 더하여, 본 발명자들은 또한 임파종, 백혈병 및 다발 골수종으로부터 유도된 세포를 사용하여 LUCA31 활성에 대해 조사하였다. 본 발명자들은 벤치마크 트랜스페린 리셉터 항체 (42-6)을 사용하여 공개된 연구의 대부분이 혈액암세포주로 수행되었기 때문에 이것이 중요하다고 느꼈다(예를 들어, Savage, 1987; Trowbridge & Lopez, Monoclonal antibody to transferrin receptor blocks trarasferrin binding and inhibits human tumor cell growth in vitro, Proc Natl Acad Sci USA 79, 1175- 1179 (1982) ; White, 1990를 참조하라). 이들 실험으로부터의 결과는 도 11에 나와있고, LUCA31 에피토프가 CCRF-CEM 세포주에서 가장 고도로 발현되었지만, 연구된 다른 세포주에서도 또한 발견되었다는 것을 증명한다(도 11A). LUCA31은 이들 세포주의 각각에서 활성이었고, 어떤 경우에는 세포 증식을 대조군 값의 10%로 줄였다(도 11B). 이 활성은 벤치마크 항체 42-6 (데이타는 도시되지 않음)보다 뛰어났고 감소된 혈청에서 최대였다.
실시예 18. 암 세포주 786-0, SKMES -1, MDA -MB-175VII 및 Colo205 에 대한 LUCA31의 영향
시험관내에서 단층으로서 성장될 때 세포 수를 줄이는 항체의 능력은 변하는 양의 시험 또는 대조군 정제된 항체의 존재 또는 부재 하에서 성장된 세포 단층을 사용하여 평가될 수 있고 세포 수의 변화는 MTT를 사용하여 평가된다. MTT는 사립체 효소의 활성을 측정하고 상대적인 생존가능 세포 수와 상호관련이 있는 염료이다. 관심의 세포를 96 웰 플레이트에서 10% 태아 솟과 혈청으로 보충된 F12/DMEM (1:1) 성장 배지에 플레이팅하고 성장시켰다. 다음의 세포주를 96 웰 디시의 3중 웰에서 다음의 밀도에서 플레이팅하였다: 1800, 1500, 2500 및 1500 세포/웰에서 각각 786-0, Colo205, MDA-MB-175VII, 및 SKMES-1. 플레이팅 직후, LUCA31를 첨가하였다. 세포를 5일동안 5% C02/공기에서 습윤 배양기에서 37℃에서 배양하였다. 분석의 끝에, MTT를 PBS (5mg/ml)에 용해하고 1:10 희석으로 직접 웰에 첨가하였다. 플레이트를 4시간동안 배양기에 다시 놓았다. 배양후에, 배지를 제거하였고 MTT 침전물을 용해하기 위해 100μl DMSO를 첨가하였다. 플레이트를 O. D. 540nm 에서 판독하였다.
20 ㎍/ml에서 LUCA31은 신장 세포 아데노암종 786-0 54% (3 실험의 평균), 직장결장 아데노암종 Colo205 37% (4 실험의 평균), 유방관 암종 MDA-MB-175VII 35% (2 실험의 평균) 및 폐 편평 암종 SKMES-1 45% (3 실험의 평균)의 성장을 저해하였다.
LUCA31의 영향의 대표적 그래프화한 결과가 도 12에 나와있다. 도 12A는 LUCA31의 786-0 세포에 대한 영향의 대표적 그래프화한 결과를 보여준다. 도 12B는 LUCA31의 Colo205 세포에 대한 영향의 대표적 그래프화한 결과를 보여준다. 도 12C는 LUCA31의 SKMES-1 세포에 대한 영향의 대표적 그래프화한 결과를 보여준다.
실시예 19. LUCA31 및 독소- 컨쥬게이티드 항-마우스 IgG 의 내재화
Mab-ZAP (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA)은 단백질 합성을 저해하는 독소인, 사포린에 컨쥬게이티드 항-마우스 IgG이다. 이 독소는 세포 막을 침투하지 못한다. 만일 단일클론 항체가 흡수가능한 세포-표면 항원에 결합되면, 독소-컨쥬게이트가 결합된 단일클론에 결합할 수 있고, 그로인해, 흡수되고 결국 세포를 죽일 수 있다. 독성활성의 증명을 위한 내재화에 의존하여, Mab-ZAP 는 주어진 표면 항원이 세포 독성 효과를 발현하는 내재화에 의존하는 어떠한 독소에 대해서 적절한 표적으로서 역할을 할지 여부를 평가하는 역할을 할 수 있다. 그러한 것으로서, Mab-ZAP는 메이탄시노이드 및 칼리케아미신과 같은 그러한 내재화-의존 독소에 대한 모델로서 역할을 한다.
종양 세포에 의해 LUCA31 및 사포린 컨쥬게이티드 항-마우스 IgG 의 내재화와, 사포린의 내재화 종양 세포를 죽이는 효과를 시험하기 위해, 사람 결장 종양 세포, Colo205를 10 mM EDTA를 갖는 스톡 플라스크로부터 제거하였고 원심분리하였다. 세포를 적절한 배지에서 50,000/ ml로 재현탁하였고 96 웰 플레이트에서 웰당 100μl 플레이팅하였다. 항체 LUCA31를 1Ox 응축물로서 적절한 웰에 즉시 첨가하여, 10 ug/ml의 최종 농도를 만들었다. 15 분 후에 실온에서 Mab-ZAP (Cat. # IT-04, Advanced Targeting Systems, San Diego CA)를 적절한 웰에 10x 응축물로서 첨가하였고, 0.001 nM 내지 10 nM의 최종 농도를 만들었다. 4 일 성장 후에, MTT를 4시간동안 37℃에서 첨가하였다 (웰에서 스톡 5 mg/ml PBS, 1:10 희석). 그후 배지를 모든 웰로부터 제거하였고 100μl/웰 DMSO를 첨가하였다. 플레이트를 그후 부드럽게 소용돌이쳐서 블루 MTT 침전물을 용해하고 O. D. 540 nm에서 플레이트를 판독하였다.
LUCA31의 부재하에서 염색과 비교할 때, LUCA31의 존재하에서 Colo205 세포에서 MTT 염색의 감소가 있었다. 이것은 LUCA31 및 Mab-ZAP의 존재하에서 Colo205 세포의 성장이 저해되었고 이들 결과는 LUCA31의 표시이고 독소-컨쥬게이티드 항-마우스 IgG가 Colo205 세포에서 내재화되었다는 것을 나타낸다.
본 실시예의 방법에 따르는 내재화 실험의 결과는 도 13에 나와있다.
실시예 20. 림프구와 골수 세포로의 활성.
LUCA31에 의한 림프구와 골수 원종 세포의 염색이 이들 세포에서 항증식 활성의 지표인지 아닌지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 사람 말초 혈액 백혈구를 사용하여 삼중수소화 티미딘-기반 세포 증식 분석을 개발하였고 CD34는 골수 원종 세포를 선택하였다. 이들 세포 집단 모두에 대해서 본 발명자들은 LUCA31 에피토프 염색을 결정하기 위해 채택된 동일한 사이토킨 칵테일을 사용하였다.
사람 백혈구에 대한 LUCA31의 영향을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 PHA/IL-2 단독으로, 또는 변하는 양의 대조군 IgG1 항체 또는 LUCA31 중의 하나의 존재하에서 분리된 PBMC를 자극하였다. 이 실험의 결과(도 14)는 LUCA31가 증식 백혈구 집단에서 강력하게 삼중수소화 티미딘의 편입을 저해하여 그 결과 세포 증식의 거의 90% 저해했다는 것을 보여준다.
골수 원종 세포에 대한 LUCA31의 영향을 평가하기 위해, 본 발명자들은 유사한 분석을 수행하였고, 이때는 CD34 선택된 사람 골수 유도된 세포를 사용하여 EPO, IL-3, SCF 및 GM- CSF을 포함한 사이토킨/성장 인자 칵테일로 자극하였다. 이 실험에 대해서 본 발명자들은 2개의 다른 세포 씨딩 밀도를 사용하여 LUCA31를 대조군 IgG1 항체1B7.11와 비교하였다. 이 실험의 결과는(도 15) LUCA31가 세포 증식을 대조군 수준의 20%로 줄였다는 것을 보여준다. 비교해볼 때, 대조군 항체는 적당한 효과를 가졌다. 함께 고려할때, 이들 실험은 LUCA31가 말초 혈액과 골수 구획 둘다로부터 유도된 정상 세포는 물론이고, 두 종양 세포의 증식을 강력하게 저해할 수 있다는 것을 나타낸다.
골수 유도된 세포에 대한 LUCA31의 영향은 잠재적인 독성 경향이 있음을 고려하여 주의하는 것이 특히 중요하다. 위에서 논의한 바와 같이, 트랜스페린 리셉터 항체 42-6의 사람 단계 I 실험에서 골수 억제의 일부 증거가 있었다(Brooks et al., 1995). 우리의 데이타는 LUCA31가, 다른 트랜스페린 리셉터 항체과 마찬가지로, 종양 세포 증식을 저해할 수 있지만, 또한 골수 원종 세포 집단의 증식에 영향을 줄 수 있다는 생각과 일치한다. 그러나, LUCA31이 이전에 공지된 트랜스페린 리셉터 항체에 비해서, 상당히 독성을 줄인다고 믿어진다.
실시예 21. 생체내 생물학
종양 유도된 세포주를 가지고 한 본 발명자들의 시험관내 연구의 결과는 LUCA31가 본 발명자들이 이종이식 모델로 번역한 세포주의 패널 내에서 넓은 활성을 가진다는 것을 보여주었다. LUCA31는 결장 암종 세포주 HCT15의 증식을 차단하는데 있어서 특히 활성이었다. 이들 결과에 기반하여 본 발명자들은 확립된 HCT15 종양 이종이식 모델 단독에서, 및 겜시타빈과 조합할때 LUCA31의 영향을 시험하기 위해 선택하였다. 이 연구에서, 15 마우스의 그룹은 500ug의 항체로 4주동안 일주일에 두번 치료하였다. 겜시타빈을 q3d x2 스케줄로 MTD에 가까운, 120mg/kg에서 투여하였다. 종양 부피가 평균하여 70mm3 일때 치료가 개시되었다.
본 연구의 결과는 도 16에 나와있다. 도 16A에서, 중앙 종양 부피가 나와있고 도 16B에는, 에러바와 함께 평균 종양 부피가 제시된다. 본 실험에서, LUCA31 항체가 식염수 대조군과 비교하여, 14일 이상의 종양 성장 지연을 발생시켰다. 겜시타빈은 20-일 종양 성장 지연을 발생시켰고 LUCA31와 겜시타빈의 조합은 겜시타빈 단독에 비해 18일의 종양 성장 지연을 발생시켰다.
본 실험의 결과는 LUCA31 항체가 이 종양 모델에서 활성이고 데이타는 직장결장 종양 모델에서 세툭시마브에 필적한다는 것을 나타낸다. 본 발명자들이 LUCA31에 대해서 이해한 것을 기초로, 특정한 메카니즘으로 한정되지 않고, 이 항체의 종양 세포에 대한 영향이 주로 그것의 트랜스페린 리셉터와의 상호작용을 통해 매개된 진성 활성을 통해 작동된다고 현재 믿어진다. LUCA31가 마우스 IgG 1 분자이고 이 아이소타입의 Fc 도메인은 Fc 리셉터에 대해서 낮은 친화력을 갖기 때문에, 종양 세포의 ADCC 매개된 파괴는 종양 성장 지연에 실질적으로 공헌하지 않을 것같다.
마우스 Fc 리셉터에 대한 증가된 친화력을 갖는 항체는 강화된 면역 이펙터 작용을 통해서는 물론이고 리셉터 가교 결합을 통해, 종양 성장을 제어하는데 보다 효과적일 수 있다. 이 개념을 역설하기 위해, 사람 IgG 1 Fc 도메인을 함유하는 사람 키메릭 LUCA31 분자가 만들어졌다.
실시예에서 참조된 재료와 방법:
Luca31 V 영역 클로닝과 발현 벡터 구성
도입: Luca31 RNA 를 마우스 항체를 발현하는 하이브리도마 세포주로부터 추출하였고 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 cDNA로부터 RT-PCR에 의해 빠졌다. V-영역을 CHEF 1 포유동물 발현 벡터 안으로 삽입하였다.
재료와 방법
RNA 추출:
QIAGEN RNeasy 미니 키트 (Cat No 74106)를 사용하여 RNA를 냉동된 하이브리도마 세포 펠릿으로부터 추출하였다.
cDNA:
Roche의 "RT-PCR (AMV)에 대한 1st Strand cDNA 합성 키트" (Cat No 1 483 188)를 사용하여 cDNA를 발생시켰다. PCR 반응에 대한 네거티브 대조군을 생성하기 위해 RT와 함께 및 없이 반응을 수행하였다.
RT-PCR:
Padma의 "ShortPCR" 프로그램과 Clontech의 Advantage PCR 키트로부터 시약을 사용하여, cDNA 주형에서 PCR을 수행하였다.
2㎕ cDNA 반응
5㎕ 10X 완충제
2㎕ 각각의 프라이머
1㎕ dNTP 믹스
1㎕ Advantage 폴리머라제
50㎕까지 dH20
각각의 프라이머 조합에대해 네거티브 대조군 (RT cDNA 없음)을 수행하였다. 사용된 변질 프라이머는 V 영역의 CH1 도메인을 간단히 하기보다는, 신호 서열에 대한 서열을 함유한다.
Figure 112007000927728-PCT00017
벡터 구성:
사용된 제한 효소와 리가제를 Roche, NEB 또는 Promega으로부터 구매하였다. 라이게이션은 Stratagene로부터 화학적으로 컴피턴트 XL10-Gold 세포로 형질변환되었고 LBM/Carb 아가로스 플레이트 위에 플레이팅하였다. 콜로니를 미니 프렙에 대해서 100 또는 50㎍/ml 카르베니실린이 있는 LBM 안에 따서 넣었다.
QIAGEN 키트로 미니-프렙과 맥시-프렙을 수행하였다. 더 큰 벡터(pDEF14 및 pNEF5)의 맥시 프렙에 있어서, 200 ml 밤새 배양을 성장시켰고 세포를 펠릿화하였다. QIAGEN의 프로토콜을 따랐고, 2 X 100 ml 배양을 준비하는 것처럼 모든 부피의 PI, P2 및 P3을 두배로 하였다. 첫번째 스핀 후에, 모든 상청액을 하나의 칼럼에 도포하였고, 효과적으로 DNA 수율을 농축하였다. CHO 세포에서 트랜스펙션 하기 전에 발현 벡터를 코딩 영역을 통해 시퀀싱하였고 제한 소화에 의해 분석하였다.
LUCA31 염색의 조직 분석
냉동된 조직 절편을 사용하여 LUCA31 및 시중의 트랜스페린 리셉터 항체를 평가하였다. 조직 절편을 100% 아세톤에서 -20℃에서 10 분동안 고정하였고, 그후 첫번째 블로킹 용액 단계 전에 세척 완충제에 넣었다. 세척 완충제= 0.05% Tween 20/ 희석제를 갖는 1X TBS = 세척 완충제중의 20% 사람 혈청, 2% BSA.
염색 프로토콜:
1) H202 블록: DAKO 퍼옥시다제 Blocking 시약, cat#003715, 15 분
2) 단백질 블록: 세척 완충제중의 20% 사람 혈청, 2% BSA
3) 아비딘 /비오틴 블록: 벡터 cat# sp-2001, 아비딘 (A)으로 15 분 헹굼 X2 세척/ 15 분으로
4) 비오틴 (B) 블롯 오프 및 1차 항체 첨가.
5) 1°항체: (표 참조) 1 시간
6) 1°후에 세척 X3
7) 3°(표 참조) 30 분/ 세척 X3
8) DAB: DAKO DAB+, Cat# K3468, 공급된 완충제의 ml당 1 방울 DAB.
(패키지 지시사항) 발달될 때 H20으로 반응을 정지시킴.
9) 카운터염색: Gills 헤마톡실린, 1 빠른 당굼 후에 몇번 헹굼. 수도 H20에서 블루 5 분.
10) 자일렌으로 탈수하고 마운팅 배지와 함께 커버글래스.
Figure 112007000927728-PCT00018
Figure 112007000927728-PCT00019
Figure 112007000927728-PCT00020
항체 바이오분석
96 웰 평평 바닥 조직 배양 플레이트에서 분석을 수행하였다
1일:
세포를 사용하기 위해 제조: 플레이팅된 # 세포는 세포주 (1000-6000/웰)에 의존한다;
세포를 200 ul RPMI1640 +10% 태아 솟과 혈청 (FBS)의 부피로 웰에 첨가한다.
밤새 37℃에서 배양한다
2일:
웰로부터 배지를 흡인하고 150ul 완전한 배지에 다시 첨가하고, 그후 50ul 의 4x 항체 희석(lOug/ml, 5ug/ml, 2.5ug/ml, 1.25 ug/ml. 0.6 ug/ml) 또는 네거티브 대조군을 첨가한다. 항체 희석을 3중으로 수행한다.
밤새 37℃에서 배양한다
3일 37℃에서 48시간동안 연속 배양
5일
주의 - 펄싱 전에, 반-점착성 세포가 있는 플레이트를 스피닝한다 (예를 들어 Colo205)
1 uCi의 3H-티미딘으로 펄스(20 ul 완전 성장 배지에서)
6 시간 내지 밤새 배양한다
6일
20ul의 0.5% SDS (D-PBS에서 만듦)을 웰에 첨가한다 - SDS의 최종 농도는 0.05%이다.
냉동장치에서 -80℃에서 약 60 분동안 세포를 냉동한다
세포 DNA 에서 삼중수소화 티미딘 편입을 수확하고 카운팅한다
CHO 세포에서 사람 트랜스페린 리셉터의 발현과 LUCA31 으로 염색
사람 트랜스페린 리셉터는 다음의 프라이머를 사용하여 사람 cDNA 로부터 증폭된 PCR 였다:
5'- GAA TTC TGC AGG GGA TCC GCC ACC ATG ATG GAT CAA GCT AGA TCA GCA TTC TC -3'
5'- CTC GAG CGG CCG CCA CTG TTA AAA CTC ATT GTC AAT GTC CC -3' 및
전장 트랜스페린 리셉터 유전자를 변경된 pDEF2 벡터로 클로닝하여 발현 벡터 TFRC-pDEF99TORA를 생성하였다. TFRC-pDEF99TORA 발현 구성체가 MirusTransIT 트랜스펙션시약을 사용하고 Pvu I 소화된 선형 플라스미드를 사용하는 전기천공법에 의해 CHO 세포로 트랜스펙션되었다. 제한된 희석에 의해 세포를 선택하였다. 미국 특허 NO. 5,888,809에서 개시된 적용가능한 방법은 본원에서 참고문헌에 의해 포함된다.
LUCA31 염색을 평가하기 위해서, 세포주를 FACS하고 형광 현미경법하였다. 세포의 일정부분을 얼음에서 30분동안 100ng/ml으로 희석된 LUCA31 항체로 배양하였고, 세척하고 그후 1:200 희석의 FITC 컨쥬게이트 항-마우스 항체로 배양하였다. 세척된 세포는 FACS에 의해 평가되거나 또는 형광 현미경을 사용하여 직접적으로 보았다. 트랜스펙션되지 않은 CHO 세포 또는 벡터 단독으로 트랜스펙션된 CHO 세포에서 어떤 염색의 검출도 보이지 않았다. 발현 벡터 단독에 비해, 배경에 걸친 50 배 신호가 FL1 채널을 사용하여 TFRC-pDEF99TORA 벡터로 트랜스펙션된 세포에서 FACS 에 의해 검출되었다.
FACS 분석:
FACS 완충제 (D-PBS+ .1% BSA)
BSA (내독소 없음)
-마우스 IgG FITC 컨쥬게이트 (Sigma#F-2883 - FACS 완충제에서 1:200 희석)
1% 포름알데히드 (D-PBS에서)
FACS 튜브 (Falcon #2052)
96 웰, 폴리스티렌, 둥근 바닥, 세포 배양 플레이트 (Corning/Costar #3799)
프로토콜
- 세포를 200_1 D-PBS 에 재현탁한다
- 부드럽게 와동한다.
- 50_1 적절한 시약 (항체, 아이소타입 대조군, 배지....)을 각각의 웰에 첨가하고 부드럽게 와동한다.
- 아이스에서 배양한다/30 분.
- 원심분리하고 (1100 RPM/ 5 분) 배지를 제거한다 (튕김) .
- 부드럽게 와동한다.
- 200_1 D-PBS 에서 한번 세척한다 (원심분리, 튕김, 부드럽게 와동).
- 200_1_- 마우스 IgG FITC 컨쥬게이트에서 재현탁 (FACS 완충제중에 1:200 희석)하고 부드럽게 와동한다.
- 어둠에서 배양한다 (호일), 얼음 위에서/30 분
- 원심분리 (1100 RPM/ 5 분) 하고 배지를 제거한다(튕김).
- 부드럽게 와동한다.
- 200_1D-PBS 에서 한번 세척한다(원심분리, 튕김, 부드럽게 와동).
- 200_11% 포름알데히드 (D-PBS중)에서 재현탁하고 FACS 튜브로 이동한다.
- FL1 형광 강도를 FACS에서 판독함.
본원에서 기술된 실시예와 구체예는 오직 예증의 목적이고 그것에 비추어 다양한 변경 또는 변화가 당업자들에게 제시될 수 있으며 본 출원의 정신과 범위 내에 포함될 것이라는 것을 이해한다. 본원에서 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별적 공보, 특허 또는 특허 출원이 특이적으로 개별적으로 참조에 의해 그렇게 포함되도록 하는 것처럼 동일한 정도까지 모든 목적을 위해, 그들의 전체로 본원에 참고문헌으로 포함된다.

Claims (35)

  1. 사람 트랜스페린 리셉터에서 특이적으로 LUCA31 에피토프에 결합하고, 다음의 특성들 중 한가지 이상을 갖는 실질적으로 정제된 항체.
    a. 암 세포에서 트랜스페린 리셉터에 결합하는 능력;
    b. 시험관내 또는 생체내에서 살아있는 세포의 표면위에 노출되는 트랜스페린 리셉터의 일부분에 결합하는 능력;
    c. 치료제 또는 검출가능한 마커를 트랜스페린 리셉터를 발현하는 암 세포로 송달하는 능력; 및
    d. 치료제 또는 검출가능한 마커를 트랜스페린 리셉터를 발현하는 암 세포 안으로 송달하는 능력.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 암 세포는 부신 종양, AIDS-관련 암, 폐포 연한 부분 육종, 성상세포 종양, 방광암(편평 세포 암종 및 이행 세포 암종), 골암 (사기질종, 동맥류뼈낭종, 뼈연골증, 골육종), 뇌 및 척수 암, 전이 뇌 종양, 유방암, 경동맥소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장 암, 직장결장 암, 피부 포지티브 섬유 조직구종, 결합조직형성 소 원형 세포 종양, 뇌실막세포종, Ewing종양, 외골격 점액 연골육종, 골성 불완전 섬유 생성증, 뼈의 섬유 형성장애, 담낭 및 담관 암, 임신영양모세포병, 세균 세포 종양, 머리와 목 암, 섬 세포 종양, Kaposi육종, 신장암 (콩팥모세포종, 유듀모양 신장 세포 암종), 백혈병, 지방종/포지티브 지방종성 종양, 지방육종/악성의 지방종성 종양, 간암 (간모세포종, 간세포 암종), 임파종, 폐암, 속질모세포종, 흑색종, 수막종, 다발 내분비 종양형성, 다발 골수종, 골수형성이상 증후군, 신경모세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유듀모양 갑상샘 암종, 부갑상샘 종양, 소아 암, 말초 신경 집 종양, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선 암, 포도막 또는 안내 흑색종, 희귀 혈액 장애, 신장 전이 암, 막대 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연-조직 육종, 편평 세포 암, 위암, 윤활 육종, 고환 암, 가슴샘 암종, 가슴샘종, 갑상샘 전이 암, 및 자궁암 (자궁목의 암종, 자궁내막 암종, 및 형활근종)으로부터의 암 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제된 항체.
  3. 제 1항의 항체를 코딩하는 분리된 핵산 서열.
  4. 제 3항에 있어서, 핵산이 프로모터에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 핵산.
  5. 제 4항에 있어서, 프로모터와 핵산이 발현 벡터에 함유되는 것을 특징으로 하는 핵산.
  6. 제 3항에 있어서, 항체가 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 핵산.
  7. 제 3항의 핵산을 함유하는 벡터로 트랜스펙션, 형질전환, 또는 감염된 세포주.
  8. a. 항체가 발현되는 조건하에서 제 3항의 핵산으로 형질전환된 세포주를 성장시키는 단계; 및
    b. 발현된 항체를 수확하는 단계를 포함하는,
    사람 트랜스페린 리셉터에서 LUCA31 에피토프에 특이적으로 결합하는 실질적으로 정제된 항체의 제조 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 세포주는 하이브리도마인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 하이브리도마가 ATCC No. PTA-6055 또는 그것의 자손인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8항에 있어서, 항체는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 항체가 하이브리도마 ATCC No. PTA-6055 또는 그것의 자손에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 항체는 하이브리도마 ATCC No. PTA-6055 또는 그것의 자 손에 의해 발현된 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제약학적으로 허용가능한 담체와 함께 치료에 효과적인 용량의 제 1항의 항체를 포함하는 제약 조성물.
  15. 제약학적으로 허용가능한 담체와 함께, 사람 트랜스페린 리셉터에서 특이적으로 LUCA31 에피토프에 결합하고, 다음의 특성들중 한가지 이상을 갖는 치료에 효과적인 용량의 실질적으로 정제된 항체를 포함하는 제약 조성물.
    a. 암 세포에서 트랜스페린 리셉터에 결합하는 능력;
    b. 시험관내 또는 생체내에서 살아있는 세포의 표면위에 노출되는 트랜스페린 리셉터의 일부분에 결합하는 능력;
    c. 치료제 또는 검출가능한 마커를 트랜스페린 리셉터를 발현하는 암 세포로 송달하는 능력; 및
    d. 치료제 또는 검출가능한 마커를 트랜스페린 리셉터를 발현하는 암 세포 안으로 송달하는 능력.
  16. 제 15항에 있어서, 조성물은 추가적 치료 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
  17. ATCC No. PTA-6055, 또는 그것의 자손으로 구성되는 분리된 세포주.
  18. 화학치료제와 연합된, LUCA1 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 화학치료제를 암 세포에 송달하는 방법으로서, 암 세포는 부신 종양, AIDS 관련 암, 폐포 연한 부분 육종, 성상세포 종양, 방광암 (편평 세포 암종 및 이행 세포 암종), 골암 (사기질종, 동맥류뼈낭종, 뼈연골증, 골육종), 뇌 및 척수 암, 전이 뇌 종양, 유방암, 경동맥소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장 암, 직장결장 암, 피부 포지티브 섬유 조직구종, 결합조직형성 소 원형 세포 종양, 뇌실막세포종, Ewing종양, 외골격 점액 연골육종, 골성 불완전 섬유 생성증, 뼈의 섬유 형성장애, 담낭 및 담관 암, 임신영양모세포병, 세균 세포 종양, 머리와 목 암, 섬 세포 종양, Kaposi육종, 신장암 (콩팥모세포종, 유듀모양 신장 세포 암종), 백혈병, 지방종/포지티브 지방종성 종양, 지방육종/악성의 지방종성 종양, 간암 (간모세포종, 간세포 암종), 임파종, 폐암, 속질모세포종, 흑색종, 수막종, 다발 내분비 종양형성, 다발 골수종, 골수형성이상 증후군, 신경모세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유듀모양 갑상샘 암종, 부갑상샘 종양, 소아 암, 말초 신경 집 종양, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선 암, 포도막 또는 안내 흑색종, 희귀 혈액 장애, 신장 전이 암, 막대 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연-조직 육종, 편평 세포 암, 위암, 윤활 육종, 고환 암, 가슴샘 암종, 가슴샘종, 갑상샘 전이 암, 및 자궁암 (자궁목의 암종, 자궁내막 암종, 및 형활근종)으로부터의 암세포들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 화학치료제가 개인에게 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18항에 있어서, 항체는 하이브리도마 ATCC No PTA-6055 또는 그것의 자손에 의해 발현된 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 개인에게, 화학치료제와 연합된 LUCA31 에피토프에 결합할 수 있는 항-트랜스페린 리셉터 항체를 포함하는 효과적인 양의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 개인에 있어서 암 세포의 성장을 저해하는 방법으로서, 암 세포는 부신 종양, AIDS-관련 암, 폐포 연한 부분 육종, 성상세포 종양, 방광암(편평 세포 암종 및 이행 세포 암종), 골암 (사기질종, 동맥류뼈낭종, 뼈연골증, 골육종), 뇌 및 척수 암, 전이 뇌 종양, 유방암, 경동맥소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장 암, 직장결장 암, 피부 포지티브 섬유 조직구종, 결합조직형성 소 원형 세포 종양, 뇌실막세포종, Ewing종양, 외골격 점액 연골육종, 골성 불완전 섬유 생성증, 뼈의 섬유 형성장애, 담낭 및 담관 암, 임신영양모세포병, 세균 세포 종양, 머리와 목 암, 섬 세포 종양, Kaposi육종, 신장암 (콩팥모세포종, 유듀모양 신장 세포 암종), 백혈병, 지방종/포지티브 지방종성 종양, 지방육종/악성의 지방종성 종양, 간암 (간모세포종, 간세포 암종), 임파종, 폐암, 속질모세포종, 흑색종, 수막종, 다발 내분비 종양형성, 다발 골수종, 골수형 성이상 증후군, 신경모세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유듀모양 갑상샘 암종, 부갑상샘 종양, 소아 암, 말초 신경 집 종양, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선 암, 포도막 또는 안내 흑색종, 희귀 혈액 장애, 신장 전이 암, 막대 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연-조직 육종, 편평 세포 암, 위암, 윤활 육종, 고환 암, 가슴샘 암종, 가슴샘종, 갑상샘 전이 암, 및 자궁암 (자궁목의 암종, 자궁내막 암종, 및 형활근종)으로부터의 암세포들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 화학치료제가 암 세포 안으로 송달되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21항에 있어서, 항체는 하이브리도마 ATCC No. PTA-6055 또는 그것의 자손에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 개인으로부터의 세포를 사람 트랜스페린 리셉터에서 LUCA31 에피토프에 결합할 수 있는 항체와 접촉시키고, 만일 있다면, 세포와 항체로부터 트랜스페린 리셉터의 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 개인에 있어서 암 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 방법으로서, 암 세포는 부신 종양, AIDS 관련 암, 폐포 연한 부분 육종, 성상세포 종양, 방광암 (편평 세포 암종 및 이행 세포 암종), 골암 (사기질종, 동맥류뼈낭종, 뼈연골증, 골육종), 뇌 및 척수 암, 전이 뇌 종양, 유방암, 경 동맥소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장 암, 직장결장 암, 피부 포지티브 섬유 조직구종, 결합조직형성 소 원형 세포 종양, 뇌실막세포종, Ewing종양, 외골격 점액 연골육종, 골성 불완전 섬유 생성증, 뼈의 섬유 형성장애, 담낭 및 담관 암, 임신영양모세포병, 세균 세포 종양, 머리와 목 암, 섬 세포 종양, Kaposi 육종, 신장암 (콩팥모세포종, 유듀모양 신장 세포 암종), 백혈병, 지방종/포지티브 지방종성 종양, 지방육종/악성의 지방종성 종양, 간암 (간모세포종, 간세포 암종), 임파종, 폐암, 속질모세포종, 흑색종, 수막종, 다발 내분비 종양형성, 다발 골수종, 골수형성이상 증후군, 신경모세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유듀모양 갑상샘 암종, 부갑상샘 종양, 소아 암, 말초 신경 집 종양, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선 암, 포도막 또는 안내 흑색종, 희귀 혈액 장애, 신장 전이 암, 막대 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연-조직 육종, 편평 세포 암, 위암, 윤활 육종, 고환 암, 가슴샘 암종, 가슴샘종, 갑상샘 전이 암, 및 자궁암 (자궁목의 암종, 자궁내막 암종, 및 형활근종)으로부터의 암세포들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. LUCA31 에피토프에 결합할 수 있는 트랜스페린 리셉터와 트랜스페린 리셉터 결합 파트너 사이의 다음의 상호작용 중 한가지 이상을 차단하는 작용제.
    a. 암 세포에서 트랜스페린 리셉터에 결합하는 능력;
    b. 시험관내 또는 생체내에서 살아있는 세포의 표면위에 노출되는 트랜스페린 리셉터의 일부분에 결합하는 능력;
    c. 치료제 또는 검출가능한 마커를 트랜스페린 리셉터를 발현하는 암 세포로 송달하는 능력; 및
    d. 치료제 또는 검출가능한 마커를 트랜스페린 리셉터를 발현하는 암 세포 안으로 송달하는 능력.
  26. 제약학적으로 허용가능한 담체와 함께, 제 23항에 따르는 치료에 효과적인 용량의 작용제를 포함하는 제약 조성물.
  27. 다음의 특성들 중 한가지 이상을 갖는 트랜스페린 리셉터 조정자.
    a. 사람 트랜스페린 리셉터와 선천 트랜스페린 리셉터 리간드 사이의 상호작용을 붕괴 또는 차단하는 능력;
    b. 사람 트랜스페린 리셉터와 항-트랜스페린 리셉터 항체 사이의 상호작용을 붕괴 또는 차단하는 능력;
    c. 사람 트랜스페린 리셉터에 결합하는 능력;
    d. 사람 트랜스페린 리셉터에 대한 선천 리간드에 결합하는 능력
    e. 항-트랜스페린 리셉터 항체에 결합하는 능력;
    f. LUCA31 에피토프 또는 항-LUCA31 항체에 결합할 수 있는 항체를 키우는데 사용될 수 있는 항원 부위를 함유함;
    g. LUCA31 에피토프 또는 항-LUCA31 항체에 결합할 수 있는 항체의 선별에 사용될 수 있는 항원 부위를 함유함;
    h. LUCA31 에피토프와 선천 LUCA31 리간드 사이 또는 LUCA31 에피토프와 LUCA31 사이의 상호작용을 붕괴 또는 차단할 수 있는 항체를 키우는데 사용될 수 있는 항원 부위를 함유하고;
    i. LUCA31 에피토프와 LUCA31 사이의 상호작용을 붕괴 또는 차단할 수 있는 항체의 선별에 사용될 수 있는 항원 부위를 함유함.
  28. 사람 트랜스페린 리셉터의 LUCA31 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 포함하는 효과적인 양의 조성물을 개인에게 투여하는 것을 포함하는, 개인에 있어서 암 세포의 성장을 저해하는 방법으로서, 암 세포는 부신 종양, AIDS-관련 암, 폐포 연한 부분 육종, 성상세포 종양, 방광암 (편평 세포 암종 및 이행 세포 암종), 골암 (사기질종, 동맥류뼈낭종, 뼈연골증, 골육종), 뇌 및 척수 암, 전이 뇌 종양, 유방암, 경동맥소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장 암, 직장결장 암, 피부 포지티브 섬유 조직구종, 결합조직형성 소 원형 세포 종양, 뇌실막세포종, Ewing종양, 외골격 점액 연골육종, 골성 불완전 섬유 생성증, 뼈의 섬유 형성장애, 담낭 및 담관 암, 임신영양모세포병, 세균 세포 종양, 머리와 목 암, 섬 세포 종양, Kaposi육종, 신장암 (콩팥모세포종, 유듀모양 신장 세포 암종), 백혈병, 지방종/포지티브 지방종성 종양, 지방육종/악성의 지방종성 종양, 간암 (간모세포종, 간세포 암종), 임파종, 폐암, 속질모세포종, 흑색종, 수막종, 다발 내분비 종양형성, 다발 골수종, 골수형성이상 증후군, 신경모세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유듀모양 갑상샘 암종, 부갑상샘 종양, 소아 암, 말초 신경 집 종양, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선 암, 포도막 또는 안내 흑색종, 희귀 혈액 장애, 신장 전이 암, 막대 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연-조직 육종, 편평 세포 암, 위암, 윤활 육종, 고환 암, 가슴샘 암종, 가슴샘종, 갑상샘 전이 암, 및 자궁암 (자궁목의 암종, 자궁내막 암종, 및 형활근종)로부터의 암세포들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 항체는 하이브리도마 ATCC No. PTA-6055 또는 그것의 자손에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 28항에 있어서, 항체는 하이브리도마 ATCC No. PTA-6055 또는 그것의 자손에 의해 발현된 항체의 항원결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 28항에 있어서, 항체는 하이브리도마 ATCC No. PTA-6055 또는 그것의 자손에 의해 발현된 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 하이브리도마 ATCC No. PTA-6055 또는 그것의 자손에 의해 발현된 항체.
  33. 하이브리도마 ATCC No. PTA-6055 또는 그것의 자손에 의해 발현된 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 항체.
  34. 하이브리도마 ATCC No. PTA-6055 또는 그것의 자손에 의해 발현된 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 항체.
  35. 청구항 32항 내지 제 34항 중 어느 한 항의 항체를 인코딩하는 DNA.
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