KR100935855B1 - Ｋｉｄ3 및 그것과 결합하는 ｋｉｄ3 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 질환 및 암-관련 에피토프인 KID3의 확인 및 특성화를 제공한다. 또한, 본 발명은 KID3와 결합하는 모노클로날 항체들의 패밀리, KID3를 발현하는 다양한 사람 암 및 질환을 진단하고 치료하는 방법을 제공한다.
KID3, 암, 항체, 항원, 면역요법, 화학요법, 치료

Description

ＫＩＤ3 및 그것과 결합하는 ＫＩＤ3 항체{KID3 AND KID3 ANTIBODIES THAT BIND THERETO}
관련된 출원의 상호참조
본 출원은 2003년 9월 18일자 제출된 미국 임시 출원일련번호 60/504,441의 권리를 주장하며, 이 출원은 본원에 참고자료로서 그 전체가 포함된다.
본 발명은 생물학 및 면역요법 분야에 속한다. 더 구체적으로, 본 발명은 신규한 질환 및 암-관련 에피토프인 KID3, 및 KID3와 결합하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체 및 다른 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 더 나아가, 항-KID3 항체를 포함하는, KID3와 결합하는 길항제, 조절제 및 펩티드를 사용하여, KID3에 관련된 다양한 사람의 질환 및 암을 진단 및/또는 치료하는 것을 제공한다.
항체는 진단제로서의 그들의 공지된 사용에 더하여 치료제로서도 유용한 것으로 나타났다. 예를 들어, 최근 몇 년간 암을 치료하기 위한 면역요법, 또는 치료적 목적을 위한 항체의 사용이 있었다. 암치료에서 수동적 면역요법은 모노클로날 항체의 사용을 포함한다. 예를 들어, Cancer: Principles and Practice of Oncology, 6판 (2001) Chapt. 20 pp. 495-508 참조. 이들 항체는 종양세포의 성장 이나 생존을 직접 억제하는 것과 신체 면역시스템의 자연세포살해 활성을 회복시키는 능력에 의해서 고유한 치료적 생물학적 활성을 가질 수 있다. 이들 제제는 단독으로 투여되거나, 또는 방사성 제제나 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 비-호지킨 림프종 및 유방암의 치료를 위해 각각 승인된 리툭시맵(Rituximab) 및 트라스투주맵(Trastuzumab)이 그러한 치료제들의 두 가지 예이다. 또는 달리, 항체를 사용하여, 항체와 독소제가 연결된 항체 콘쥬게이트를 만들 수 있으며, 이것은 종양과 특이적으로 결합함으로써 독소제를 종양으로 보낼 수 있다. 젬투주맵 오조가마이신(gemtuzumab ozogamicin)이 백혈병의 치료에 사용되는 승인된 항체 콘쥬게이트의 한 예이다. 진단 및 치료에 있어서 잠재적 용도를 갖는, 암세포와 결합하는 모노클로날 항체들이 간행물에 개시되어 있다. 예를 들어, 그 중에서도, 어떤 분자량을 가진 표적 단백질을 개시하고 있는 하기 특허출원들을 참조한다: 미국특허 No. 6,054,561(200kD c-erbB-2(Her2) 및 40-200KD 크기의 다른 미지 항원들) 및 미국특허 No. 5,656,444(50kD 및 55kD의 암태아성 단백질). 임상시험 중인 및/또는 고상 종양의 치료를 위해 승인된 항체들의 예는 다음의 것들을 포함한다: 트라스투주맵(항원:180kD, HER2/neu), 에드레콜로맵(Edrecolomab)(항원:40-50kD, Ep-CAM), 항-사람 유지방구(HMFG1)(항원>200kD, HMW 무친), 세툭시맵(Cetuximab)(항원:150kD 및 170kD, EGF 수용체), 알렘투주맵(Alemtuzumab)(항원:21-28kD, CD52), 및 리툭시맵(항원: 35kD, CD20).
유방암의 치료에 사용되는 트라스투주맵(Her-2 수용체)과 몇몇 암의 치료에 대해 임상시험 중에 있는 세툭시맵(EGF 수용체)의 항원 표적은 피부, 결장, 폐, 난 소, 간 및 췌장을 포함하는 다수의 정상 사람 성인 조직에 어떤 검출가능한 수준으로 존재한다. 이들 치료제의 사용에서 안정성에 대한 최저한도는 아마도 이들 부위에서의 발현 수준의 차이나, 혹은 항체의 접근성 또는 활성의 차이에 의해 제공될 것이다.
또 다른 종류의 면역요법은, 항원의 발현을 지시하고, 그 다음 개체에서 면역반응을 유발하는, 즉 그 자신의 암에 대하여 능동적으로 항체를 생성하도록 개체를 유도하는, 특정한 암(들) 또는 DNA 구성물에 존재하는 항원을 사용한 능동적 면역요법, 또는 백신접종이다. 능동적 면역화는 수동적 면역요법이나 면역독소만큼 자주 사용되지는 않고 있다.
질환(암을 포함한다) 진행의 몇몇 모델이 제안되었다. 이론은 하나의 감염/변형성 사건에 의한 원인에서부터 점점, 궁극적으로는 완전한 병원성 또는 악성 능력을 가져오는 "질환-형" 또는 "암-형" 조직 종류를 평가하는 데까지 이르고 있다. 어떤 이론은 암에 있어서, 예를 들어 하나의 돌연변이 사건이 악성의 원인이 되는데 충분하다고 논하고 있는 반면, 다른 이론은 후속의 변형이 또한 필요하다고 논하고 있다. 어떤 다른 이론은, 세포 수준에서의 연속적 돌연변이-선택 사건에 의한 신생물의 개시 및 진행에는 모두 돌연변이 양 및 종양 등급의 증가가 필수적이라고 제안했다. 일부 암 표적은 종양 조직에서만 발견되는 한편, 다른 것들은 정상 조직에 존재하고 종양 조직에서 상향조절 및/또는 과발현된다. 그러한 상황에서, 일부 연구자들은 과발현이 악성의 획득과 연결된다고 제안하며, 다른 연구자들은 과발현은 단순히 증가한 질환 상태까지의 경로를 따르는 어떤 경향에 대한 마커 라고 제안하고 있다.
이상적인 진단 및/또는 치료 항체는 다수의 암에는 존재하지만 어떤 정상 조직에는 부재하거나 낮은 수준으로만 존재하는 항원에 특이적이어야 한다. 암(들)과 특이적으로 관련되는 신규한 항원의 발견, 특성화 및 분리는 많은 방법에서 유용할 것이다. 먼저, 이 항원을 사용하여 항원에 대한 모노클로날 항체를 만들 수 있다. 항체는 이상적으로는 암세포에 대해 생물학적 활성을 가져야 하며, 외래 항원에 대한 면역시스템의 반응을 회복시킬 수 있어야 한다. 항체는 치료제로서 단독으로 또는 현재의 치료제와 함께 투여될 수 있거나, 또는 독소제와 연결된 면역 콘쥬게이트를 제조하는데 사용될 수 있다. 동일한 특이성을 갖지만, 단독으로 투여되었을 때는 생물학적 활성이 낮거나 아예 없는 항체가, 항체를 사용하여 방사성 동위원소, 독소, 또는 화학요법제나 화학요법제를 함유하는 리포솜과의 면역 콘쥬게이트를 제조할 수 있다는 점에서 또한 유용할 수 있으며, 콘쥬게이트 형태는 독소를 항원-함유 세포로 보내는 이 항체에 의하여 생물학적으로 활성으로 된다.
이상적인 진단 및/또는 치료 항체에 바람직한 한 양태는 다양한 암들에 관련된 항원의 발견 및 특성화이다. 비-암성 세포에서는 발현이 제한되는, 많은 종류의 암에서 발현되는 몇몇 항원(예를 들어, "Pan-Cancer" 항원)이 있다. 그러한 항원의 분리 및 정제는 그 항원을 표적으로 하는 항체(예를 들어, 진단 또는 치료용)를 제조하는데 유용할 것이다. "Pan-Cancer" 항원과 결합하는 항체는, 오직 하나의 특정 종류의 암과 관련된 항원에 대한 항체와 달리, 상이한 조직들에서 발견되는 다양한 암들을 표적으로 할 수 있다. 이 항원은 또한 약물 발견(예를 들어, 소 분자)에도 유용하며, 더 나아가 세포 조절, 성장 및 분화의 특성화에도 유용하다.
당화 및 차별 당화의 조절은 각각 암 진행 및 예후에 연루된다. 세포 표면 탄수화물 결정소는 악성 변형 동안 격한 변화를 겪을 수 있다. 루이스 항원이 다양한 암과 관련된 탄수화물 결정소의 예이다. 루이스 항원과 같은 탄수화물 결정소에 특이적인 모노클로날 항체의 사용은 생체외에서 세포의 전이 잠재성을 조절하는데 효과적인 것으로 나타났다(Liu 등, 2001).
세포 표면 표적을 특이적으로 인식하는 항체 및 다른 제제들을 사용하여 질환 및/또는 암을 진단 및 치료하는데 사용될 수 있는 질환세포 및/또는 암세포 표면의 신규한 표적이 요구된다. 더 나아가, 본원에 개시된 발견에 기초하여, 세포 표면의 표적을 특이적으로 인식하고, KID3의 질환-촉진 활성을, 감소시키거나 증진시킴으로써 조절할 수 있는, 신규한 항체 및 다른 제제에 대한 요구가 존재한다. 본 발명은 KID3의 질환-관련 활성을 억제할 수 있는 사람 KID3에 대한 길항제의 확인을 목적으로 한다. 또 다른 목적은, KID3의 분석에서 사용되고, 면역원으로서 사용되거나 또는 항-사람 KID3 항체를 선택하기 위해 사용되는 신규한 화합물을 제공하는 것이다.
하기 더 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명자들은, 본원에서 제공된 신규한 길항제, 조절제 및 항체의 에피토프 표적으로서 확인된 신규한 에피토프를 발견하였으며, 본원에서는 이것을 KID3라고 한다.
발명의 개요
본 발명은 다양한 사람의 암에서 발현되는 KID3 길항제, 조절제, 및 KID3와 결합하는 모노클로날 항체를 제공한다. 한 양태로서, 본 발명은 KID3와 결합하는 모노클로날 항체들의 패밀리이다.
다른 양태로서, 본 발명은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2002년 12월 18일자 로 기탁되어 PTA-4860의 특허기탁명을 받은 숙주 셀라인(KIDNEY.3.11E8.2A11)에 의해 생성되는 모노클로날 항체 항-KID3이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 질환 및/또는 암성 세포와 반응하는 모노클로날 항체 항-KID3를 생성하는 방법이며, 이 방법은 (a) 면역원으로 숙주 포유동물을 면역화하는 단계, (b) 포유동물로부터 림프구를 얻는 단계, (c) (b)의 림프구를 골수종 셀라인과 융합하여 하이브리도마를 생성하는 단계, (d) (c)의 하이브리도마를 배양하여 모노클로날 항체를 생성하는 단계; 및 (e) 항체를 스크리닝하여 질환 및/또는 암성 세포 또는 셀라인과는 결합하지만, 비-암성 또는 정상 세포 또는 셀라인과는 결합하지 않거나, 또는 정상 세포와는 더 낮은 수준으로 또는 상이한 방식으로 결합하는 항체만을 선택하는 단계를 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명은 그러한 항체 또는 항체의 자손을 암호화하는 숙주세포를 항체의 생성을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계, 및 항-KID3 항체를 정제하는 단계를 포함하는 항-KID3 항체를 생성하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 항체(이것은 하나의 경쇄 또는 중쇄로서 개별적으로 발현될 수 있거나, 경쇄와 중쇄가 모두 한 벡터로부터 발현된다)를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 발현한 후에, 일반적으로 관심의 항체 또는 폴리펩티드를 회수 및/또는 분리하는 것에 의해서 본원에 설명된 항체(또는 폴리펩티드) 중 어느 것을 생성하는 방법을 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 항 KID3 항체와 KID3의 우선적인 결합을 경쟁적으로 억제하는 항-KID3 항체 또는 폴리펩티드(이것은 항체일 수도 아닐 수도 있다)이 다. 어떤 구체예에서, 본 발명은, 다른 항-KID3 항체와 마찬가지로, KID3 상의 동일한 또는 상이한 에피토프(들)과 우선적으로 결합하는 항체 또는 폴리펩티드(이것은 항체일 수도 아닐 수도 있다)이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 KID3의 에피토프에 대해 특이적인 항체에 의해 결합된 KID3를 포함하는 조성물이다. 다른 구체예에서, 2개 이상의 항-KID3 항체가 투여되며, 그러한 항체는 KID3의 2개 이상의 상이한 에피토프들을 맵핑하거나, 또 다르게는 이 항체는 KID3 에피토프 및 상이한 세포 표적과 다가결합할 수 있다. 어떤 구체예에서, 항-KID3 항체는 치료제나 검출가능한 표지에 연결된다.
다른 양태로서, 본 발명은 항-KID3 항체의 단편 또는 영역을 포함하는 항체이다. 한 구체예에서, 단편은 항체의 경쇄이다. 다른 구체예에서, 단편은 항체의 중쇄이다. 다른 구체예에서, 단편은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 가변영역을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 단편은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 a) 항-KID3 항체의 경쇄 또는 중쇄로부터의 하나 이상의 CDR(또는 그의 단편); b) 경쇄로부터의 3개의 CDR; c) 중쇄로부터의 3개의 CDR; d) 경쇄로부터의 3개의 CDR과 중쇄로부터의 3개의 CDR; e) 경쇄 가변영역; f) 중쇄 가변영역 중 어느 것을 포함하는 폴리펩티드(이것은 항체일 수도 아닐 수도 있다)를 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 사람화 항체이다. 어떤 구체예에서, 사람화 항체는 비-사람 항-KID3 항체의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 어떤 구체예에서, 사람 화 항체는, 다른 항-KID3 항체와 마찬가지로, 동일한 또는 상이한 에피토프(들)과 결합한다. 일반적으로, 본 발명의 사람화 항체는, 본래의 비-사람 항-KID3 항체의 CDR(들)과 동일하거나 및/또는 이들 CDR로부터 유래된 하나 이상의 CDR(1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 이들의 단편)을 포함한다. 어떤 구체예에서, 사람 항체는, 다른 항-KID3 항체와 마찬가지로, 동일한 또는 상이한 에피토프(들)과 결합한다. 다른 양태로서, 본 발명은 비-사람 항-KID3 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역으로부터 유래된 가변영역 및 사람 항체의 중쇄 및 경쇄의 불변영역으로부터 유래된 불변영역을 포함하는 키메라 항체이다.
다른 양태로서, 본 발명은 기탁번호 ATCC No. PTA-4860을 갖는 숙주세포, 또는 이들의 자손에 의해 생성되는 항체 mu-항-KID3를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명은 상기 특정된 항체들 중 어느 것의 고유한 결합 또는 생물학적 활성을 갖는 항체 폴리펩티드를 포함한다. 다른 양태로서, 본 발명은 이 항체들(항체 단편을 포함한다) 중 어느 것을 암호화할 뿐만 아니라, 본원에서 설명된 어떤 다른 폴리펩티드들도 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 화학요법제에 연결된 항-KID3 항체, 항-KID3 항체의 단편을 포함하는 항체, 비-사람 항-KID3 항체의 사람화 항체, 비-사람 항-KID3의 가변영역으로부터 유래된 가변영역과 사람 항체의 불변영역으로부터 유래된 불변영역을 포함하는 키메라 항체, 또는 비-사람 항-KID3 항체의 한 가지 이상의 특성을 갖는 사람 항체, 또는 화학요법제(방사성 활성 부분)에 연결된 본원에 설명된 어떤 항-KID3 항체와 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 제약학적 조성물과 같은, 본원에 설명된 폴리펩티드(본원에 설명된 항체들 중 어느 것을 포함한다) 또는 폴리뉴클레오티드 중 어느 것을 포함하는 제약학적 조성물이다.
한 양태로서, 본 발명은 질환 또는 암성 세포에 존재하는 KID3와 결합된 항-KID3 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 암세포는 난소암, 폐암, 전립선암, 췌장암, 결장암, 및 유방암 세포로 구성되는 군으로부터 선택된다. 어떤 구체예에서, 암세포는 분리된다. 어떤 구체예에서, 암세포는 생물학적 샘플 중에 있다. 일반적으로 생물학적 샘플은 사람과 같은 개체로부터 얻는다.
다른 양태로서, 본 발명은 개체로부터의 세포 상에서 KID3를 검출함에 의해서 개체에서 질환을 진단하는 방법이며, 특히 개체에서 염증 또는 자가면역 반응과 관련된 질환 또는 장애를 진단하는 방법이다. 본 발명의 다른 양태로서, 개체에서 염증 또는 자가면역 반응을 조절하는 방법이 제공된다. 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 염증 및 자가면역 장애를 가져오는 질환 및 상태는, 제한은 없지만, 다발성 경화증, 수막염, 뇌염, 뇌졸중, 다른 대뇌 외상, 궤양성 대장염 및 크론병을 포함하는 염증성 장질환, 중증 근무력증, 루푸스, 류마티스성 관절염, 천식, 급성 소아당뇨병, AIDS, 치매, 죽상경화증, 신장염, 망막염, 아토피성 피부염, 건선, 심근허혈 및 급성 백혈구-매개 폐손상을 포함한다.
본 발명의 항체 및 다른 치료제의 치료적 사용에 대한 또 다른 지침은 기관 또는 이식편 거부의 위험이 있는 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 최근 몇 년간에 걸쳐 피부, 신장, 간, 심장, 폐, 췌장 및 골수와 같은 조직 및 기관을 이식하는 수술 기술의 능률에 상당한 개선이 있었다. 아마도 제일 눈에 띄는 문제는 레시피 언트에서 이식된 동종이식편이나 기관에 대한 면역내성을 유도하는 만족스러운 제제의 부족일 것이다. 동종유전자 세포나 기관이 숙주에게 이식될 때(즉, 기증자와 수여자가 같은 종으로부터의 상이한 개체이다), 숙주 면역시스템은 이식조직에 있는 외래 항원에 대해서 면역반응을 개시할 가능성이 있으며(숙주-대-이식편 질환), 이는 이식조직의 파괴를 가져온다.
다른 양태로서, 본 발명은 개체가 암을 가지는지의 여부를 진단하는 방법이며, 이 방법은 개체로부터 선택된 세포에서 KID3의 발현이 있는지의 여부를 측정하는 것을 포함하는데, 이 때 상기 세포에서 KID3의 발현이 상기 암을 표시한다. 어떤 구체예에서, KID3의 발현은 항-KID3 항체를 사용하여 측정된다. 어떤 구체예에서, 이 방법은 세포로부터 KID3의 발현 수준을 검출하는 것을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "검출"은 대조표준에 대한 언급의 유무에 관계없이 정성적 및/또는 정량적 검출(수준을 측정하는 것)을 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 개체의 세포 상에 있는 KID3 또는 세포로부터 방출된 KID3를 검출함에 의해서 개체에서 암을 진단하는 방법이며, 제한은 없지만, 여기서 암은 부신종양, AIDS-관련 암들, 포상연부육종, 성상세포종양, 방광암(편평세포암종 및 이행세포암종), 골암(사기질종, 동맥류성 골낭종, 골연골종, 골육종), 뇌척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥소체종양, 경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장세포암종, 투명세포암종, 결장암, 결직장암, 표피성 양성 섬유성 조직구증, 결합조직형성 소세포종양, 뇌실막세포종, 유잉씨종양, 외골격점액양 연골육종, 골성 불완전섬유생성증, 뼈의 섬유이형성증, 담낭암 및 담관암, 임신성 융모상 피질환, 생식세포종양, 두경부암, 섬세포종양, 카포시육종, 신장암(신모세포종, 유두형 신세포암종), 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암(간모세포종, 간세포암종), 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비종양, 다발성 골수종, 골수이형성증후군, 신경모세포종, 신경내분비종양, 난소암, 췌장암, 유두형 갑상선암종, 부갑상선종양, 소아암, 말초신경초종양, 크롬친화세포종, 뇌하수체종양, 전립선암, 후방포도막흑색종, 희귀혈액질환, 전이성 신장암, 횡문양 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직육종, 편평세포암, 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암종, 흉선종, 전이성 갑상선암, 및 자궁암(자궁경부의 암종, 자궁내막암종, 및 평활근종)을 포함하는 군으로부터 선택된다.
다른 양태로서, 본 발명은 개체에서 암(제한은 없지만, 예를 들어, 난소암, 폐암, 전립선암, 췌장암, 결장암 또는 유방암)의 진단을 보조하는 방법이며, 이 방법은 개체로부터의 생물학적 샘플에서 KID3의 발현을 측정하는 것을 포함한다. 어떤 구체예에서, KID3의 발현은 항-KID3 항체를 사용하여 측정된다. 어떤 구체예에서, 이 방법은 세포로부터 KID3 발현 수준을 검출하는 것이다. 암으로부터 방출된 KID3는 KID3나 그 일부분의 수준 상승에 기여할 수 있고, 이것은 체액(예를 들어, 혈액, 침 또는 장점막성 분비물)에서 검출가능하다.
다른 양태로서, 본 발명은 KID3와 결합하는 항체를 암성 세포의 성장을 감소시키는데 충분한 유효량으로 투여함에 의해서 암을 치료하는 방법이다. 어떤 구체예에서 항체는 항-KID3 항체이다. 어떤 구체예에서, 암성 세포는, 제한은 없지만, 부신종양, AIDS-관련 암들, 포상연부육종, 성상세포종양, 방광암(편평세포암종 및 이행세포암종), 골암(사기질종, 동맥류성 골낭종, 골연골종, 골육종), 뇌척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥소체종양, 경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장세포암종, 투명세포암종, 결장암, 결직장암, 표피성 양성 섬유성 조직구증, 결합조직형성 소세포종양, 뇌실막세포종, 유잉씨종양, 외골격점액양 연골육종, 골성 불완전섬유생성증, 뼈의 섬유이형성증, 담낭암 및 담관암, 임신성 융모상피질환, 생식세포종양, 두경부암, 섬세포종양, 카포시육종, 신장암(신모세포종, 유두형 신세포암종), 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암(간모세포종, 간세포암종), 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비종양, 다발성 골수종, 골수이형성증후군, 신경모세포종, 신경내분비종양, 난소암, 췌장암, 유두형 갑상선암종, 부갑상선종양, 소아암, 말초신경초종양, 크롬친화세포종, 뇌하수체종양, 전립선암, 후방포도막흑색종, 희귀혈액질환, 전이성 신장암, 횡문양 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직육종, 편평세포암, 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암종, 흉선종, 전이성 갑상선암, 및 자궁암(자궁경부의 암종, 자궁내막암종, 및 평활근종)을 포함하는 군으로부터 선택된다. 어떤 바람직한 구체예에서, 암성 세포는, 제한은 없지만, 유방암, 결장암, 전립선암, 폐암, 육종, 전이성 신장암, 전이성 갑상선암, 및 투명세포암종을 포함하는 고상 종양의 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 암을 갖는 개체에서 전이의 발생을 지연시키는 방법이며, 이 방법은 KID3와 특이적으로 결합하는 항체 패밀리의 적어도 하나를 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서 항체는 항-KID3 항체이다. 다 른 양태로서, 본 발명은 생체외 또는 개체에서 암세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 방법이며, 이 방법은 세포 배양물이나 샘플, 또는 개체에 화학요법제와 연합된(연결되는 것을 포함한다) 항-KID3 항체를 포함하는 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 KID3와 특이적으로 결합하는 항체 패밀리의 적어도 한 구성원을 유효량으로 개체에 투여함에 의해서 개체에서 암성 세포로 치료제를 송달하는 방법이다. 다른 구체예에서, 항-KID3 항체는 다른 치료제와 함께(연결되는 것을 포함한다) 개체에 송달된다.
어떤 구체예에서, 항-KID3 항체는 본원에 지정된 항체로부터 유래된 사람화 항체이다(반드시 그런 것은 아니지만 일반적으로 항체의 하나 이상의 부분적 또는 완전한 CDR을 포함한다). 어떤 구체예에서, 항-KID3 항체는 지정된 항체의 한 가지 이상의 특성을 갖는 사람 항체이다. 어떤 구체예에서, 화학요법제(예를 들어, 독소 또는 방사성 활성 분자)가 암세포 내로 송달된다(내재화된다). 어떤 구체예에서, 이 제제는 사포린이다.
다른 양태로서, 본 발명은 개체에서 암을 치료하는 방법이며, 이 방법은 개체에 화학요법제와 연합된(연결되는 것을 포함한다) 항-KID3 항체를 포함하는 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
더 이상으로, 본 발명은 KID3와 세포질 신호 파트너의 연합을, 증진시키거나 감소시킴에 의해서 조절하는 방법을 제공한다. KID3와 세포질 신호 파트너의 연합은 세포 표면에 존재하는 KID3 분자를 신호 파트너와 KID3의 결합을 조절하는 제제 와 접촉시키는 것에 의해서 강한 영향을 받을 수 있다. KID3와 그것의 결합 및/또는 신호 파트너의 연합을 차단하거나 감소시키는 제제를 사용하여 KID3-매개 염증 또는 면역 반응에 수반되는 생물학적, 병리학적 과정을 조절할 수 있다. 이런 작용을 수반하는 병리학적 과정은 종양-관련 세포성장 및 세포자살, 괴사, 종양증 또는 다른 세포사 경로에 의한 세포사의 유발을 포함한다.
KID3와 결합 파트너, 예를 들어 항-KID3 항체의 연합을 차단, 감소, 증진시키거나, 또는 다른 식으로 조절하는 능력에 대해서 제제를 시험할 수 있다. 구체적으로, 제제는 KID3 상호작용 부위(전형적으로 그것이 무손상 생세포 상에 존재할 때의 천연 입체구조로)를 포함하는 펩티드를 결합 파트너 및 시험 제제와 함께 인큐베이션하고, 시험 제제가 결합 파트너와 KID3 펩티드의 결합을 감소시키는지 또는 증진시키는지의 여부를 측정함에 의해서 그러한 상호작용을 조절하는 능력에 대해 시험될 수 있다.
작용제, 길항제, 및 KID3 기능의 다른 조절제가 본 발명의 범위 내에 명백히 포함된다. 이들 작용제, 길항제 및 조절제는 KID3에 있는 항원 결정소 부위 중 하나 이상을 포함하거나, 또는 그러한 부위의 하나 이상의 단편, 그러한 부위의 변이체, 또는 그러한 부위의 펩티드유사체를 포함하는 폴리펩티드이다. 이들 작용성, 길항성, 및 KID3 조절성 화합물은 선형 또는 고리형 형태로 제공되며, 선택적으로 자연에서는 통상적으로 발견되지 않는 적어도 하나의 아미노산 잔기나 혹은 적어도 하나의 아미드 동배체를 포함한다. 이들 화합물은 당화될 수 있다. 본 발명의 작용제, 길항제, 및 KID3 기능의 다른 조절제는 바람직하게는 항체와 관련하여 상기 설명된 모든 구체예 및 방법들에 사용된다.
본 발명의 다른 양태는 본원에서 KID3로서 확인되고 언급된 신규한 에피토프에 관한 것이다. 이 에피토프는 면역원으로 사용하는데 적합하며, 여러 다양한 연구, 진단 및 치료 목적에 적합하다.
어떤 양태로서, 본 발명은 개체에서의 질환의 진단을 보조하는 방법이며, 이 방법은 (i) 개체로부터 얻어진 혈액 또는 조직 샘플에서 KID3의 존재에 대해 분석하는 단계; (ii) 상기 샘플이 정상(비-질환) 혈액 또는 조직 샘플에 비하여 증가된 양의 KID3 마커를 가지는지의 여부를 검출하는 단계; 및 (iii) 상기 마커의 증가된 양을 질환에 대한 양성(포지티브) 진단과 상호관련시키거나, 또는 상기 마커의 증가되지 않은 양을 질환에 대한 음성(네거티브) 진단과 상호관련시키는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 이 마커는 항-KID3 항체를 사용하여 검출된다. 어떤 구체예에서, 이 방법은 방사성핵영상법, 유세포분석법 및 면역조직화학법으로 구성되는 군으로부터 선택된 기술에 의해 행해진다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 면역원으로서 사용되거나 진단제나 치료제로서 직접 사용될 수 있는 신규한 탄수화물 에피토프---KID3---를 제공한다. 더 나아가, 본 발명은 KID3의 발현 및/또는 과발현에 관련된, 사람 암을 포함하는 다양한 질환을 진단 및 치료하기 위한 모노클로날 항체, 폴리펩티드 및 다른 조성물을 제공한다.
1. 일반적 기술
달리 나타내지 않는다면 본 발명의 실시에는 분자생물학(재조합 기술을 포함 한다), 미생물학, 세포생물학, 생화학 및 면역학 분야의 종래 기술들이 사용될 것이며, 이들은 모두 당업계의 기술에 속하는 것이다. 그러한 기술들은 문헌들에 충분히 설명되어 있으며, 예를 들어 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판(Sambrook 등, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait, 편저, 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook(J. E. Cellis, 편저, 1998) Academic Press; Animal Cell Culture(R. I. Freshney, 편저, 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather 및 P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures(A. Doyle, J. B. Griffiths, 및 D. G. Newell, 편저, 1993-8) J. Wiley 및 Sons; Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology(D. M. Weir 및 C. C. Blackwell, 편저); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller 및 M. P. Calos, 편저, 1987); Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel 등, 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction(Mullis 등, 편저, 1994); Current Protocols in Immunology(J. E. Coligan 등, 편저, 1991); Short Protocols in Molecular Biology(Wiley 및 Sons, 1999); Immunobiology(C. A. Janeway 및 P. Travers, 1997); Antibodies. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach(D. Catty. 편저, IRL Press 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach(P. Shepherd, C. Dean 편저, Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual 6. Harlow 및 D. Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies(N. Zanetti 및 J. D. Capra, 편저, Harwood Academic Publishers, 1995); Cancer: Principles and Practice of Oncology(V. T. DeVita 등, 편저, J. B. Lippincott Company, 1993) 등이 있다.
II. 정의
"KID3"는 본 발명의 항체가 나타나는 신규한 탄수화물 에피토프를 말한다. KID3 에피토프는 항-KID3 항체에 의해 결합된 탄수화물 구조이며, 그것이 부착되는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 다른 구조에 대한 제한이나 언급은 없다. KID3는 결장 및 몇몇 종류의 암종에 존재한다. 현재 어떤 암세포에서는 정상 조직 대조물에 비해 KID3가 과발현될 수 있다고 여겨지고 있다.
N-글리카나제를 사용하여 KID3-발현 단백질을 처리한 후 항-KID3 항체 결합의 손실을 측정한 것에 따르면, KID3는 N-결합 탄수화물이다. 직접 결합 및 상호-경쟁 분석에 의한 측정에 따르면, 지금까지의 연구는 KID3가 이전에 보고된 무친이나 루이스 혈액군 암종-관련 탄수화물의 하나가 아니라는 것을 나타낸다. 항-KID3 항체를 사용한 사람 종양 셀라인 막 추출물의 웨스턴블롯 분석은, KID3가 약 25kDa에서 250kDa 이상까지의 분자량 범위의 다양한 막-관련 단백질에 존재한다는 것을 나타냈다. 항-KID3 항체민감성(생체내 및 생체외) 라인 Colo201, Colo205, SU86.86 및 SNU-16에서 측정된 KID3 반응성의 밴딩 패턴은 전체 25kDa에서 >250kDa 범위까지 걸쳐 있으며, 이들 KID3-관련 단백질의 하부집합만을 발현한다고 드러난 대부분의 항-KID3 항체 비민감성 종양 셀라인에 대해서 관찰된 것과는 정성적으로 다른 것이 분명하다. 도시하지 않은 데이타는, KID3를 발현하는 단백질이, 이전에는 E- 캐드헤린(E-cadherin) 결합 및 기능에 없었던 새로운 상호작용 부위를 통해 E-캐드해린 결합을 지원한다는 것을 나타낸다.
용어 "RAAG 12"는 신규한 KID3 에피토프를 말한다. 용어 "RAAG 12", "KID3 에피토프" 및 "KID3"는 본 출원에서 상호교환하여 사용된다.
용어 "에피토프"는 면역반응을 도출할 수 있으며 그러한 반응에 의해 생성된 특이적 항체와 조합될 수 있는 항원의 표면에 있는 분자 영역을 말한다. 용어 "에피토프" 및 "항원 결정소"는 본 출원에서 상호교환하여 사용된다.
작용제, 길항제, 및 KID3 기능의 다른 조절제가 본 발명의 범위 내에 명백히 포함된다. 이들 작용제, 길항제 및 조절제는 KID3에 있는 항원 결정소 부위 중 하나 이상과, 혹은 KID3의 에피토프, 단편 또는 변이체와 상호작용하는 폴리펩티드, 펩티드유사체, 소분자, 또는 다른 화합물 또는 조성물이다. 이들 작용성, 길항성, 및 KID3 조절성 화합물은 선형 또는 고리형 형태로 제공되며, 선택적으로 자연에서는 통상적으로 발견되지 않는 적어도 하나의 아미노산 잔기나 혹은 적어도 하나의 아미드 동배체를 포함한다. 이들 화합물은 당화될 수 있거나, 다른 번역-후 변형을 가질 수 있다.
더 구체적으로, 본원에 사용된 용어 "KID3 작용제", "길항제" 또는 "조절제"는 (1) 사람 KID3와 그것의 천연 리간드나 항-KID3 항체 사이의 상호작용을 파괴하거나 차단할 수 있는 화합물; (2) 사람 KID3 및 그것의 천연 리간드나 항-KID3 항체와 결합할 수 있는 화합물; (3) 사람 KID3 및 그것의 천연 리간드나 항-KID3 항체와 결합할 수 있는 항체를 발생시키는데 사용될 수 있는 항원 결정소를 함유하는 화합물; (4) 사람 KID3 및 그것의 천연 리간드나 항-KID3 항체와 결합할 수 있는 항체의 스크리닝에 사용될 수 있는 항원결정소를 함유하는 화합물; (5) 사람 KID3와 그것의 천연 리간드나 항-KID3 항체 사이의 상호작용을 파괴하거나 차단할 수 있는 항체를 발생시키는데 사용될 수 있는 항원 결정소를 함유하는 화합물; (6) 사람 KID3와 그것의 천연 리간드나 항-KID3 항체 사이의 상호작용을 파괴하거나 차단할 수 있는 항체의 스크리닝에 사용될 수 있는 항원 결정소를 함유하는 화합물로서 정의된다.
KID3 작용제, 길항제 및 조절제는 KID3 변이체, KID3 작용제, 길항제, 펩티드유사체, 및 소분자를 포함한다. KID3 작용제, 길항제 및 조절제는 또한 항-KID3 항체 및 면역글로불린 변이체, 키메라 면역글로불린, 사람화 면역글로불린 및 탄수화물 치환, 결실, 및 부가 변이체, 또는 이들의 어떤 조합을 포함하는 사람 KID3에 대해 반응성인 항-KID3 항체를 포함한다. 본 발명의 KID3 작용제, 길항제 및 조절제는 사람 KID3와 그것의 천연 리간드 또는 항-KID3 항체의 결합에 수반된 항원 결정소에 대한 본 발명자들의 확인을 토대로 한다. 따라서, 본 발명은 항-KID3 항체의 KID3 결합 도메인 중 하나 이상을 복제하거나 의태한 분자 구조를 갖는 KID3 작용제, 길항제 및 조절제를 제공한다.
본원에 사용된 용어 "KID3 변이체"는 당 치환, 결실, 및 부가 변이체, 또는 이들의 어떤 조합을 포함하는, 사람 KID3의 어떤 탄수화물 변이체를 표시하며, 이것은 어떤 KID3 작용제, 길항제, 또는 조절제와 상호작용한다. 또한, 이 정의에는 분자의 변이체 영역(들)을 포함하는 KID3 변이체 분자의 어떤 단편이 포함된다.
용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변영역에 위치한 적어도 하나의 에피토프 인식 부위를 통해 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 같은 표적과의 특이적 결합이 가능한 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용된 이 용어는 완전한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 뿐만 아니라, 이들의 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일사슬(ScFv), 이들의 돌연변이, 자연발생 변이체, 요구되는 특이성을 지닌 에피토프 인식 부위를 갖는 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 사람화 항체, 키메라 항체, 및 요구되는 특이성을 지닌 에피토프 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 어떤 다른 변형된 구조를 포함한다.
"모노클로날 항체"는 동종성 항체 집단을 말하며, 여기서 모노클로날 항체는 에피토프의 선택적 결합에 수반되는 아미노산들(자연발생 및 비-자연발생)로 이루어진다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이며, 단 하나의 에피토프에 대해서만 나타난다. 용어 "모노클로날 항체"는 완전한 모노클로날 항체 및 전-길이 모노클로날 항체 뿐만 아니라, 이들의 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일사슬(ScFv), 이들의 돌연변이, 항체 일부분을 포함하는 융합 단백질, 사람화 모노클로날 항체, 키메라 모노클로날 항체, 및 요구되는 특이성 및 에피토프와 결합하는 능력을 지닌 에피토프 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 어떤 다른 변형된 구조를 포함한다. 항체 공급원이나 항체가 만들어지는 방식(예를 들어, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 트랜스젠 동물 등에 의한)은 제한되지 않는다. 이 용어는 전체 면역글로불린 뿐만 아니라, "항체"의 정의에서 상기 설명된 단편 등도 포함한다.
"사람화 항체"는 비-사람 종의 면역글로불린으로부터 유래된 에피토프 결합 부위와, 사람 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한 분자의 나머지 면역글로불린 구조를 갖는, 일반적으로 재조합 기술을 사용하여 제조된 키메라 분자를 말한다. 항원-결합 부위는 불변 도메인 위에서 융합된 완전한 가변 도메인을 포함하거나, 또는 가변 도메인의 적합한 프레임워크 영역 위에서 접합된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 에피토프 결합 부위는 야생형이거나, 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 이것은 사람 개체에서 면역원인 불변영역을 제거하지만, 외래 가변영역에 대한 면역반응의 가능성은 유지한다(LoBuglio, A. F. 등, (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:4220-4224). 또 다른 접근법은 사람-유래 불변영역을 제공하는 것뿐만 아니라, 가변영역을 변형시켜 이들을 사람 형태에 가능한 가깝도록 다시 만드는 것에도 집중하고 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변영역은, 주어진 종에서 비교적 보존되며, 추정된 바로는 CDR에 스캐폴딩을 제공하는 4개의 프레임워크 영역(FR)이 측면에 위치해 있는, 문제의 에피토프에 반응하여 변하며 결합력을 결정하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다. 특정한 에피토프와 관련하여 비-사람 항체가 제조될 때, 가변영역은 변형될 사람 항체에 존재하는 FR 상에 비-사람 항체로부터 유래된 CDR을 접합시킴으로써 "재형성"되거나 혹은 "사람화"될 수 있다. 다양한 항체에 대한 이 접근법의 적용이 Sato, K. 등 (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. 등 (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen, M., 등 (1988) Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A., 등, (1991) Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. 등 (1991) Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D., 등, (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:4181-4185; Tempest, P.R., 등, (1991) Bio/Technology 9:266-271; Co, M.S., 등 (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Carter, P., 등, (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289; 및 Co, M. S. 등, (1992) J Immunol 148:1149-1154에 의해 보고되었다. 어떤 구체예에서, 사람화 항체는 모든 CDR 서열을 간직한다(예를 들어, 마우스 항체로부터의 6개 CDR을 모두 함유하는 사람화 마우스 항체). 다른 구체예에서, 사람화 항체는 본래 항체와 관련하여 변형된 하나 이상의 CDR(1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개)을 가지는데, 이것 역시 본래 항체로부터의 하나 이상의 CDR"로부터 유래된" 하나 이상의 CDR로 칭해진다.
항체 또는 폴리펩티드와 "특이적으로 결합"하거나 "우선적으로 결합"하는(본원에서 상호교환하여 사용된다) 에피토프는 본 분야에서 잘 이해되고 있는 용어이며, 그러한 특이적 또는 우선적 결합을 측정하는 방법 역시 본 분야에 잘 공지되어 있다. 분자가 다른 세포나 물질보다 특정한 세포나 물질과 더 오랜 기간 동안 및/또는 더 큰 친화성으로 더 자주 더 빨리 반응하거나 연합한다면, 이 분자는 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타낸다고 말한다. 항체가 다른 물질과 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 더 큰 결합력으로, 더 빨리, 및/또는 더 오랜 기간 동안 결합한다면, 이 항체는 표적과 "특이적으로 결합"하거나 "우선적으로 결합"한다고 말한다. 예를 들어, KID3 에피토프와 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는, 그것이 다른 KID3 에피토프 또는 비-KID3 에피토프와 결합하는 것보다, 더 큰 친화성, 더 큰 결합력으로, 및/또는 더 오랜 기간 동안 KID3 에피토프와 결합하는 항체 이다. 또한, 예를 들어, 제1 표적과 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체(또는 부분 또는 에피토프)는 제2 표적과 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다는 것이 본 정의를 읽음으로써 이해된다. 이와 같이, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"이 반드시 배타적인 결합을 필요로 하는 것은 아니다(포함될 수 있기는 하지만). 반드시 그런 것은 아니지만 일반적으로는 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미한다.
에피토프에 대한 언급에서 용어 "면역학적 활성"이나 "면역학적 활성을 유지하는"은 상이한 조건들 하에서, 예를 들어 에피토프가 감소 및 변성 조건에 놓여진 후에 에피토프와 결합하는 항체(예를 들어, 항-KID3 항체)의 능력을 말한다.
상이한 생물학적 기능은 항-KID3 항체와 관련되며, 이들은, 제한은 없지만, KID3(제한은 없지만, 난소암, 전립선암, 췌장암, 폐암, 결장암, 또는 유방암 세포들를 포함하는 암세포에 존재하는 KID3를 포함한다)와 결합하는 능력; 생체외 또는 생체내에서 살아있는 세포의 표면에 노출된 KID3의 일부분과 결합하는 능력; KID3를 발현하는 암성 세포(난소암, 전립선암, 췌장암, 폐암, 결장암, 또는 유방암 세포와 같은)로 화학요법제를 송달하는 능력; KID3를 발현하는 암세포 내로 치료제나 검출가능한 마커를 송달하는 능력; 세포자살, 괴사, 종양증 또는 다른 세포사 경로에 의한 세포사 사건에 영향을 미치는 능력을 포함한다.
"종양증" 또는 "종창성" 사건은 세포자살과 구별될 수 있는 세포사의 형태이다. 종양증은 골세포의 허혈성 세포사를 설명하기 위해 1910년에 처음 사용되었다(Trump 등, 1997). 종창성 세포는 세포 및 소기관 종창, 혈관화, 및 막 투과성 의 증가를 특징으로 한다. 종양증은 보통 손상 후에 빠르게 발생하며, 초기 변화가 세포 모양 및 부피에 변경을 가져온다. 종양증의 기초를 이루는 분자 및 생화학적 메커니즘은 아직 완전하게 해명되지 않았다. 어떤 시스템에서, 종양증은 세포막에 있는 이온 채널의 조절 실패 및 세포 ATP의 수준 감소로 인한 나트륨의 유입과 이로 인한 세포 종창 및 용해의 결과일 수 있다고 여겨진다(Barros 등, 2001). 본원에서 논의된 대로, KID3 또는 KID3 항체 뿐만 아니라, 설명된 나머지 제제들, 길항제, 조절제, 및 폴리펩티드(항체를 포함한다)는 이들 특징이나 생물학적 효과 중에서 어느 하나 이상을 가질 수 있다.
"항-KID3 동등 항체" 또는 "항-KID3 동등 폴리펩티드"는, 예를 들어 결합 특이성과 같은, 항-KID3 항체와 관련된 하나 이상의 생물학적 기능을 갖는 항체 또는 폴리펩티드를 말한다.
본원에 사용된 "제제"는 생물학적, 제약학적, 또는 화학적 화합물을 말한다. 비제한적인 예들은 단순한 또는 복잡한 유기 또는 무기 분자, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 항체, 항체 유도체, 항체 단편, 바이타민 유도체, 탄수화물, 독소, 또는 화학요법 화합물을 포함한다. 소분자 및 올리고머(예를 들어, 올리고펩티드 및 올리고뉴클레오티드), 및 다양한 코어 구조에 기초한 합성 유기 화합물과 같은 다양한 화합물들이 합성될 수 있다. 여기에 더하여, 식물 또는 동물 추출물 등과 같은 다양한 자연의 공급원들이 스크리닝용 화합물을 제공할 수 있다. 당업자라면 본 발명의 제제의 구조적 성질에 관해 어떤 제한도 없다는 것을 쉽게 인정할 수 있을 것이다.
본 발명의 방법에서 사용되는 제제는 무작위적으로 선택되거나 혹은 합리적으로 선택되거나 설계될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 제제는, 이 제제가 KID3와 그것의 천연 결합 파트너 또는 공지된 항체의 연합에 수반된 특정한 서열들을 고려하지 않고 선택될 때 무작위적으로 선택된다고 말한다. 무작위적으로 선택된 제제들의 예는 화학적 라이브러리 또는 펩티드 조합 라이브러리의 사용이다.
본원에서 사용된 바와 같은 제제는, 이 제제가 표적 부위의 서열 및/또는 제제의 작용과 관련된 서열의 입체구조를 고려한 비무작위적 토대 위에서 선택될 때 합리적으로 선택되거나 설계된다고 말한다. 항-KID3 제제는 KID3/항-KID3 상호작용을 차단한다. 또한, 본 발명은 KID3와 그것의 천연 결합 파트너 간의 상호작용 부위에서 작용하는 제제를 포함하며, 현재 알려져 있거나 혹은 후에 확인되는 것과 무관하게, 다른 리간드와 그들의 활성 KID3-상호작용 부위 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 수용체/리간드 및/또는 KID3/항-KID3 항체 복합체의 접촉 부위를 구성하는 펩티드 서열 또는 탄수화물 구조를 이용함으로써 제제를 합리적으로 선택하거나 합리적으로 설계할 수 있다. 예를 들어, 합리적으로 선택된 제제는 천연 환경에서 살아있는 세포의 표면에 노출된 때 KID3와 동일한 3차 구조를 갖는 펩티드 또는 탄수화물일 수 있다. 그러한 제제는, 바람직하게는 항-KID3 항체 또는 천연 리간드와 결합함으로써, 항-KID3 항체와 KID3의 연합, 또는 KID3와 그것의 천연 리간드의 연합을 감소시키거나 차단할 것이다.
항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "표지된"은 방사성 활성제 또는 형광발색단(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아테이트(FITC) 또는 피코에리트린(PE)) 과 같은 검출가능한 물질과 항체를 커플링(즉, 물리적 결합)하는 것에 의한 항체의 직접적 표지화 뿐만 아니라, 검출가능한 물질을 사용하여 반응성에 의해 프로브나 항체를 간적접으로 표지화하는 것을 포함한다.
항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "연합"은 제제(예를 들어, 화학요법제)와의 공유 및 비-공유 부착 또는 결합을 포함한다. 항체는 직접 결합이나 통상적 플랫폼에의 부착에 의한 간접 결합에 의해 제제(예를 들어, 화학요법제)와 연합될 수 있으며, 이로써 항체는 이 항체가 결합하는 암성 세포로 제제를 국부화시키고, 여기서 항체 및 제제는 실질적으로 생리학적 조건 하에서 분리되지 않으며, 이로써 제제는 항체가 결합하는 동일한 암성 세포를 표적으로 하지 못하거나, 혹은 제제의 효능이 감소되지 않게 된다.
"생물학적 샘플"은 진단 분석이나 모니터링 분석에서 사용될 수 있는 개체로부터 얻어진 다양한 샘플 종류를 포함한다. 이 정의는 침, 혈액 및 생물학적 기원의 다른 액체 샘플, 생체검사 견본이나 조직 배양물 같은 고상 조직 샘플 또는 이들로부터 유래된 세포, 및 이들의 자손, 예를 들어 암을 가진다고 의심되는 개체로부터 수집된 조직 샘플, 바람직한 구체예에서는 난소, 폐, 전립선, 췌장, 결장, 및 유방 조직으로부터 얻어진 세포를 포함한다. 또한, 이 정의는, 예를 들어, 시약으로의 처리, 용해, 또는 단백질이나 폴리뉴클레오티드와 같은 어떤 성분들의 부화, 또는 절편화을 위해 반고체 또는 고체 매트릭스에 포매시켜 두는 것에 의해, 샘플을 획득한 후에 어떤 식으로든 조작한 샘플을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 임상 샘플을 포함하며, 또한 배양물 중의 세포, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체, 및 조직 샘플을 포함한다.
"숙주세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입체의 통합을 위한 벡터(들)에 대한 수용체일 수 있거나 수용체인 개체의 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주세포는 한 숙주세포의 자손을 포함하며, 이 자손은 자연적, 우연한, 또는 계획적인 돌연변이로 인해 본래 부모 세포와 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있다(형태적으로 또는 게놈 DNA 보체에서). 숙주세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)로 생체내에서 트랜스펙트된 세포를 포함한다.
본원에 사용된 "돌연변이의 발생을 지연시키는"은 돌연변이의 발생을 유예, 방해, 지체, 저지, 안정화, 및/또는 연기시키는 것을 의미한다. 이런 지연은 치료될 암 및/또는 개체의 이력에 의존하여 시간 기간을 변화시키는 것일 수 있다. 당업자에게 명백한 대로, 충분한 또는 유의한 지연은 사실상 개체가 돌연변이를 발생시킬 수 없다는 점에서 예방을 포함한다.
제약학적 조성물의 "유효량"은, 한 구체예에서, 제한은 없지만, 종양 크기의 축소(암과 관련하여, 예를 들어 유방암 또는 전립선암), 암성 세포의 성장 저지, 돌연변이 발생의 지연, 질환으로 인한 증상의 감소, 질환으로 고통받는 사람들의 삶의 질 증가, 질환을 치료하는데 필요한 다른 의약의 용량 감소, 표적화 및/또는 내재화에 의한 것과 같은 다른 의약의 효과 증대, 질환 진행의 지연, 및/또는 개체의 생존 연장과 같은, 임상적 결과를 포함하는 유리한 또는 바람직한 결과를 행할 수 있는 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 약물, 화합물, 또는 제약학적 조성물의 유효량은, 직간접적으로 암 성 세포의 증식을 감소시키고(또는 암성 세포를 파괴하고), 암성 세포의 전이의 발생, 또는 성장을 감소 및/또는 지연시키는데 충분한 양이다. 어떤 구체예에서, 약물, 화합물, 또는 제약학적 조성물의 유효량은 다른 약물, 화합물, 또는 제약학적 조성물과 함께 달성될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 따라서, 하나 이상의 화학요법제를 투여한다는 문맥에서 "유효량"이 고려될 수 있으며, 만일 하나 이상의 다른 제제와 함께 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성된다면, 단일 제제가 유효량으로 제공되도록 고려될 수 있다. 개체의 요구가 다양하므로, 각 성분의 최적 범위의 결정은 당해 기술의 범위에 있다. 전형적인 용량은 0.1 내지 100mg/kg/체중을 포함한다. 바람직한 용량은 1 내지 100mg/kg/체중을 포함한다. 가장 바람직한 용량은 10 내지 100mg/kg/체중을 포함한다.
본원에 사용된 핵산 분자 또는 제제, 항체, 조성물 또는 세포 등은, 이 핵산 분자, 제제, 항체, 조성물, 또는 세포 등이 본래 공급원으로부터 오염물질인 핵산 분자, 항체, 제제, 조성물, 또는 세포 등과 실질적으로 분리될 때, "분리된다"라고 말한다.
"개체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 사람이다. 포유동물은, 제한은 없지만 사육용 동물, 경주용 동물, 애완동물, 영장류, 마우스 및 래트를 포함한다.
용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환하여 사용되며, 어떤 길이의 아미노산의 폴리머를 말한다. 이 폴리머는 선형이거나 분지형일 수 있으며, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의 해 가로막힐 수 있다. 또한, 이 용어는 자연적으로 또는 개입에 의해, 예를 들어 이황화 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지화 성분과의 콘쥬게이트와 같은 어떤 다른 조직이나 변형에 의해 변형된 아미노산 폴리머를 포함한다. 또한, 이 정의에는, 예를 들어 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함한다) 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형들을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체에 기초하고 있기 때문에, 이 폴리펩티드는 단일 사슬 또는 연합된 사슬로서 발생할 수 있다는 것이 이해된다.
또한, 본 발명의 범위에는 본원에 설명된 KID3 작용제, 길항제 및 조절제(항-KID3 항체를 포함한다)의 펩티드유사체가 포함된다. 그러한 펩티드 유사체는 적어도 1개의 아미노산 잔기가, 아미노산의 D 이성질체 또는 아미노산의 N-알킬화 종들과 같은, 자연에서는 통상적으로 발견되지 않는 아미노산 잔기로 치환된 펩티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 펩티드유사체는 KID3 작용제, 길항제 또는 조절제에 있는 적어도 1개의 아미드 결합(--C(.dbd.O)--NH--)을 아미드 동배체로 교체함에 의해서 구성된다. 적합한 아미드 동배체는 --CH.sub.2--NH--, --CH.sub.2--S--, --CH.sub.2--S(O).sub.n--(여기서 n은 1또는 2이다), --CH.sub.2--CH.sub.2--, --CH.dbd.CH--(E 또는 Z), --C(.dbd.O)--CH.sub.2--, --CH(CN)--NH--, --C(OH)--CH.sub.2--, 및 --O--C(.dbd.O)--NH--를 포함한다. 아미드 동배체로 교체하기 위한 적합한 후보인 KID3 작용제, 길항제 또는 조절제에 있는 아미드 결합은 KID3 작용제, 길항제 또는 조절제 치료가 의도된 피험자의 내인성 에스테라제 또는 프로테아제에 의해 가수분해될 수 있다. 천연 KID3와의 유사성을 더 효과적으로 증가시 키기 위해서 펩티드 유사체는 탄수화물과 유사한 구조적 특징을 가질 수 있다.
본원에 사용된 "실질적으로 순수한"은 적어도 85% 순수한(즉, 오염물질이 없는), 더 바람직하게는 적어도 90% 순수한, 더 바람직하게는 적어도 95% 순수한, 더 바람직하게는 적어도 98% 순수한, 더 바람직하게는 적어도 99% 순수한, 또는 그 이상 순수한 재료를 말한다.
"독소"는 세포 내에서 좋지 않은 반응을 야기하는 어떤 물질을 말한다. 예를 들어, 암성 세포로 보내진 독소는 암성 세포에 대해 좋지 않은, 때로는 해로운 효과를 가질 것이다. 독소의 예들은, 제한은 없지만, 방사성 동위원소, 칼리키마이신(calicheamicin) 및 메이탄시노이드(maytansinoid)를 포함한다.
본원에 사용된 "치료" 또는 "치료하는"은, 바람직하게는 임상적 결과를 포함하여, 유리하거나 바람직한 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해서, 유리한 또는 바람직한 임상적 결과는, 제한은 없지만, 암성 세포 또는 다른 질환세포의 증식 감소(또는 이들 세포의 파괴), 암에서 발견된 암성 세포의 전이 감소, 종양 크기의 축소, 질환으로 인한 증상 감소, 질환으로 고통받는 사람들의 삶의 질 증가, 질환을 치료하는데 필요한 다른 의약의 용량 감소, 질환 진행의 지연, 및/또는 개체의 생존 연장 중 하나 이상을 포함한다.
III. 항체 및 폴리펩티드의 제조 방법
모노클로날 항체의 제조 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 사용할 수 있는 한 방법은 Kohler 및 Milstein(Nature 256:495-497 (1975))의 방법이나 이들방법의 변형이다. 전형적으로, 모노클로날 항체는 마우스와 같은 비-사람 종들에 서 발생된다. 일반적으로, 마우스나 래트가 면역화에 사용되지만 다른 동물도 사용될 수 있다. 사람 KID3를 포함하는 세포, 세포 추출물, 또는 단백질 제제의 면역원적 양으로 마우스를 면역화함으로써 항체가 생성된다. 제한은 없지만, 면역원은 1차 세포, 배양된 셀라인, 암성 세포, 핵산, 또는 조직일 수 있다. 한 구체예에서 사람 태아 신장의 상피세포가 사용된다. 다른 구체예에서 사람 방광 또는 췌장 선조세포가 사용된다. 사람 태아 신장세포를 분리하여 배양하는 방법이 실시예 1에 상세히 설명된다. 면역화에 사용된 세포, 예를 들어 사람 태아 신장, 방광 세포 또는 사람 췌장 선조세포는 이들을 면역원으로 사용하기 전에 장시간(적어도 24시간) 동안 배양될 수 있다. 세포(예를 들어, 사람 태아 신장, 방광 세포 또는 사람 췌장 선조세포)는 단독으로 또는 Ribi와 같은 비-변성 애쥬번트와 함께 면역원으로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 세포는 면역원으로서 사용될 때 완전한 상태를 유지하고 있어야 하며 바람직하게는 생존가능해야 한다. 무손상 세포는 면역화된 동물에 의해 파괴된 세포보다 에피토프가 더 잘 검출될 수 있다. 변성 애쥬번트 또는 거친 애쥬번트, 예를 들어 프로인드 애쥬번트의 사용은 사람 태아 신장세포나 다른 세포들을 파괴할 수 있기 때문에 권하지 않는다. 면역원은 2주, 또는 1주와 같이 시간적 간격을 두고 여러 번 투여될 수 있거나, 동물에서의(예를 들어, 조직 재조합체에서) 생존력이 유지되도록 하는 방식으로 투여될 수 있다. 실시예 2가 항-KID3 항체를 발생시키는데 사용된 방법을 설명하고 있으며, 이것은 KID3와 결합하는 다른 모노클로날 항체를 발생시키는데도 사용될 수 있다.
한 구체예에서, KID3와 결합하는 모노클로날 항체는 면역원으로서 KID3를 과 발현하는 숙주세포를 사용함으로써 얻어진다. 그러한 세포는, 제한은 없지만, 사람 태아 신장세포 및 사람 결장암세포를 포함한다.
항체반응을 모니터하기 위해서, 작은 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액)을 동물로부터 얻고, 이것이 면역원에 대한 항체 역가에 대해 시험될 수 있다. 비장 및/또는 몇몇 큰 림프절을 제거하여 단일 세포로 분리할 수 있다. 바람직한 경우에, 에피토프로 코팅된 플레이트나 웰에 세포 현탁액을 도포함으로써 비장세포가 스크리닝될 수 있다(비-특이적으로 부착한 세포의 제거 후). 에피토프에 특이적인 막-결합 면역글로불린을 발현하는 B-세포가 플레이트와 결합될 것이며, 이것은 현탁액의 나머지 부분과 함께 헹궈져 나가지 않는다. 다음에, 결과의 B-세포 또는 모든 분리된 비장세포는 흑색종 세포(예를 들어, X63-Ag8.653 및 Salk Institute, Cell Distribution Center(캘리포니아 샌디에고)로부터의 것들)와 융합될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하여 비장 또는 림프구와 흑색종 세포를 융합하여 하이브리도마를 형성할 수 있다. 다음에 하이브리도마가 선택성 배지(예를 들어, 하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘 배지, 이것은 "HAT" 배지라고도 알려져 있다)에서 배양될 수 있다. 다음에, 희석을 제한함으로써 결과의 하이브리도마를 플레이팅하고, FACS나 면역조직화학법(IHC 스크리닝)을 사용하여 면역원(예를 들어, 사람 태아 신장세포의 표면, 암 셀라인의 표면, Ag-KID3, 태아 방광 절편 등)과 특이적으로 결합하는 항체의 생성에 대해 분석한다. 다음에, 선택된 모노클로날 항체-분비형 하이브리도마를 생체외(예를 들어, 조직 배양병이나 속이 빈 섬유질 반응용기에서) 또는 생체내(예를 들어, 마우스에서 복수로서)에서 배양한다. 항-KID3 항체 를 얻고 스크리닝하는데 이용되는 방법에 대한 더 상세한 설명이 실시예 3에 제공된다.
세포융합기술에 대한 다른 대안으로서, EBV 불멸화 B-세포를 사용하여 본 발명의 모노클로날 항체를 생성할 수 있다. 바람직한 경우 이 하이브리도마는 확장되고 서브클로닝되며, 상청액이 종래의 분석과정(예를 들어, FACS, IHC, 방사성면역분석법, 효소면역분석법, 형광면역분석법 등)에 의해 항-면역원 활성에 대해 분석된다.
다른 대안으로서, 모노클로날 항체 항-KID3 및 어떤 다른 동등 항체가 서열화되고, 본 분야에 공지된 어떤 수단(예를 들어, 사람화, 트랜스젠 마우스를 사용한 완전 사람 항체의 생성, 파지 디스플레이 기술 등)에 의해 재조합적으로 생성될 수 있다. 한 구체예에서, 항-KID3 모노클로날 항체가 서열화된 다음, 이 폴리뉴클레오티드 서열이 발현 또는 증식용 벡터로 클로닝된다. 관심의 항체를 코드화하는 서열이 숙주세포 내의 벡터에서 유지된 다음, 앞으로의 사용을 위해 확장되어 냉동될 수 있다.
도 7은 천연 신호 서열을 포함하는, 항-KID3 모노클로날 항체 mu-항-KID3의 카파 경쇄의 핵산 서열과 상응하는 번역된 단백질 서열을 나타낸다. 천연 신호 서열은 아미노산 1-20, 뉴클레오티드 잔기 1-60이다. 경쇄 가변영역은 아미노산 21-131, 뉴클레오티드 잔기 61-393이다. 사람 카파 불변영역은 아미노산 132-238, 뉴클레오티드 잔기 394-714이다. 중지 코돈은 뉴클레오티드 잔기 715-171이다.
도 8은 천연 신호 서열을 포함하는, 항-KID3 모노클로날 항체 mu-항-KID3의 G1 중쇄의 핵산 서열과 상응하는 번역된 단백질 서열을 나타낸다. 천연 신호 서열은 아미노산 1-18, 뉴클레오티드 잔기 1-54이다. 중쇄 가변영역은 아미노산 19-138, 뉴클레오티드 잔기 55-414이다. 사람 감마 1 불변영역은 아미노산 139-468, 뉴클레오티드 잔기 415-1404이다. 중지 코돈은 뉴클레오티드 잔기 1405-1407이다.
모노클로날 항체 항-KID3 및 어떤 다른 동등 항체의 폴리뉴클레오티드 서열이 "사람화" 항체를 발생시키거나, 친화성을 개선하거나, 또는 항체의 다른 특징들을 개선하기 위한 유전적 조작에 사용될 수 있다. 항체를 사람화하는데 대한 일반적인 이론은 항체의 에피토프-결합 부분의 기본 서열을 보유하면서 이 항체의 비-사람 나머지 부분과 사람 항체 서열을 바꾸는 것이다. 모노클로날 항체를 사람화하는데는 일반적으로 4단계가 있다. 이들은 (1) 출발 항체 경 및 중 가변 도메인의 뉴클레오티드 및 예상되는 아미노산 서열을 측정하는 단계, (2) 사람화 항체를 설계하는 단계, 즉 사람화 과정 동안 사용하기 위한 항체 프레임워크 영역을 결정하는 단계, (3) 실제 사람화 방법/기술 및 (4) 사람화 항체의 트랜스펙션 및 발현이다. 예를 들어, 미국특허 No. 4,816, 567; 5,807,715; 5,866,692; 및 6,331,415 참조.
설치류 또는 변형 설치류 V 영역 및 사람 불변영역과 융합된 이들의 관련된 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 키메라 항체를 포함하는, 비-사람 면역글로불린으로부터 유래된 에피토프 결합 부위를 포함하는 많은 "사람화" 항체 분자가 설명되었다. 예를 들어, Winter 등, Nature 349:293-299(1991), Lobuglio 등, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224(1989), Shaw 등, Immunol. 138:4534-4538(1987), 및 Brown 등,. Cancer Res. 47:3577-3583(1987) 참조. 다른 참고자료들은 적합한 사람 항체 불변영역과 융합하기 전에 사람 지지 프레임워크 영역(FR)으로 이식된 설치류 CDR을 설명하고 있다. 예를 들어, Riechmann 등, Nature 332:323-327(1988), Verhoeyen 등, Science 239:1534-1536(1988), 및 Jones 등, Nature 321:522-525 (1986) 참조. 다른 참고자료들은 재조합적으로 붙여진 설치류 프레임워크 영역에 의해 지지된 설치류 CDR을 설명하고 있다. 예를 들어, 유럽특허공보 No. 519,596 참조. 이들 "사람화" 분자는 사람 레시피언트에서 이들 부분의 치료적 적용의 지속기간 및 유효성을 제한하는 설치류 항-사람 항체 분자를 향한 원치 않는 면역학적 반응을 최소화하도록 설계된다. 항체를 사람화하는데 이용될 수 있는 다른 방법들이 Daugherty 등, Nucl. Acids Res., 19:2471-2476(1991) 및 미국특허 No. 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; 및 5,866,692에 개시된다.
본 발명은 또한 mu-항-KID3와 같은 본 발명의 항체의 단일 사슬 가변영역 단편("scFv")을 포함한다. 단일 사슬 가변영역 단편은 짧은 연결 펩티드를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변영역을 연결함으로써 제조된다. Bird 등, (1988) Science 242:423-426는 한 가변영역의 카르복시 말단과 나머지 가변영역의 아미노 말단 사이의 약 3.5nm를 연결하고 있는 연결 펩티드의 예를 설명하고 있다. Bird 등에는 다른 서열의 링커들도 설계되고 사용되었다. 다음에 링커는 약물의 부착이나 고체 지지체의 부착과 같은 부가적 기능을 위해서 변형될 수 있다. 단일 사슬 변이체는 재조합적으로 또는 합성적으로 제조될 수 있다. scFv의 합성 제조에서는 자동 서열화기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 제조에서는, scFv를 코드화하는 폴리뉴 클레오티드를 함유하는 적합한 플라스미드가, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포와 같은 진핵세포이거나 또는 E. coli와 같은 원핵세포인 적합한 숙주세포로 도입될 수 있다. 관심의 scFv를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 리게이션과 같은 통상적인 조작에 의해서 제조될 수 있다. 결과의 scFv는 본 기술분야에 공지된 표준 단백질 정제기술을 사용하여 분리될 수 있다.
본 발명은 KID3 작용제, 길항제, 조절제 및 항체에 대한 변형을 포함하는데, 이것은 이들의 특성에 유의한 영향을 미치지 않는 기능적으로 동등한 항체 및 폴리펩티드 및 활성이 증진되거나 감소된 변이체를 포함한다. 폴리펩티드의 변형은 본 기술분야에서는 통상적인 실시형태로서 본원에서 상세히 설명할 필요는 없다. 변형된 폴리펩티드의 예들은 아미노산 잔기의 보존성 치환, 기능적 활성을 유의하게 해롭게 변화시키지 않는 아미노산의 하나 이상의 결실이나 부가, 또는 화학적 유사체의 사용을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 서로에 대해 보존적으로 치환될 수 있는 아미노산 잔기는, 제한은 없지만, 글리신/알라닌; 발린/이소로이신/로이신; 아스파라긴/글루타민; 아스파르트산/글루탐산; 세린/트레오닌; 리신/아르기닌; 및 페닐알라닌/티로신을 포함한다. 이들 폴리펩티드는 또한 당화된 폴리펩티드 및 비당화된 폴리펩티드를 포함할 뿐만 아니라, 예를 들어 상이한 당들을 사용한 당화, 아세틸화, 및 인산화와 같은, 다른 번역-후 변형을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게, 아미노산 치환은 보전성일 수 있는데, 즉 치환된 아미노산이 본래의 아미노산과 유사한 화학적 특성을 소유하는 것이다. 그러한 보존성 치환은 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예들은 상기 제공되었다. 아미노산 변형은 하나 이상의 아미노산을 변화 또는 변형시키는 것에서부터 가변영역과 같은 영역을 완전히 재설계하는 것까지에 미칠 수 있다. 가변영역에서의 변화는 결합 친화성 및/또는 특이성을 변경시킬 수 있다. 다른 변형방법은 본 기술분야에 공지된 커플링 기술을 사용하는 것을 포함하며, 이들은 제한은 없지만 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이트화를 포함한다. 변형은, 예를 들어, 방사성면역분석을 위해 방사성 활성 부분을 부착하는 것과 같은, 면역분석용 표지를 부착하기 위해서 사용될 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 본 기술분야에 확립된 과정을 사용하여 제조되며, 본 기술분야에 공지된 표준분석법을 사용하여 스크리닝될 수 있다.
또, 본 발명은 폴리펩티드로부터의 하나 이상의 단편 또는 영역과 본 발명의 항체를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 한 구체예에서, 가변 경쇄 영역의 적어도 10개 연속 아미노산과 가변 중쇄 영역의 적어도 10개 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 구체예에서 융합 폴리펩티드는 이종성 면역글로불린 불변영역을 함유한다. 다른 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 본원에 설명된 ATCC에 기탁된 하이브리도마로부터 생성된 항체의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 함유한다. 본 발명의 목적을 위해서, 항체 융합 단백질은 하나 이상의 항-KID3 폴리펩티드와, 천연 분자에 부착되지 않는 또 다른 아미노산 서열, 예를 들어 또 다른 영역으로부터의 이종성 서열이나 동종성 서열을 함유한다.
항-KID3 폴리펩티드, 및 다른 KID3 작용제, 길항제 및 조절제는 본 기술분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 합성적으로 또는 재조합적으로 만들어질 수 있다. KID3 펩티드 작용제, 길항제 및 조절제를 생성하는 한 방법은, 폴리펩티드의 화학적 합성과, 이에 이어서 천연 입체구조, 즉 정확한 이황화 결합 연결을 얻는데 적합한 산화 조건 하에서 처리하는 것을 포함한다. 이것은 당업자에게 잘 공지된 방법을 사용하여 달성될 수 있다(Kelley, R. F. & Winkler, M. E. Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J. K. , 편저, Plenum Press, N. Y. , vol. 12, pp 1-19 (1990); Stewart, J. M. & Young, J. D. Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co. Rockford,111. (1984) 참조; 또한, 미국특허 No. 4,105,603 ; 3,972,859; 3,842,067; 및 3,862,925 참조).
본 발명의 폴리펩티드는 고체상 펩티드 합성을 사용하여 편리하게 제조될 수 있다(Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149(1964); Houghten, Proc. Natl. Acal. Sci. USA 82:5132(1985)).
또 다른 대안으로서, 상업적으로 입수할 수 있는 특이적 사람 면역글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 마우스를 사용하여 완전한 사람 항체가 얻어질 수 있다. 더 바람직한(예를 들어, 완전한 사람 항체) 또는 더 강한 면역반응을 야기하도록 설계된 트랜스젠 동물을 사용하여 사람화 항체 또는 사람 항체를 발생시킬 수 있다. 그러한 기술의 예는 Abgenix, Inc.(캘리포니아 프레몬트)의 XenomouseTM 및 Medarex, Inc.(뉴저지 프린스톤)의 HuMAb-Mouse
Figure 112008076584136-pat00001
및 TC MouseTM이다.
대안으로서, 본 기술분야에 공지된 어떤 방법을 사용하여 항체가 재조합적으로 제조되고 발현될 수 있다. 먼저 숙주 동물로부터 제조된 항체를 분리한 다음 유전자 서열을 얻고, 이 유전자 서열을 사용하여 숙주세포(예를 들어, CHO 세포)에 서 항체를 재조합적으로 발현시킴에 의해서 항체가 제조합적으로 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 또 다른 방법은 식물(예를 들어, 담배)이나 트랜스젠 밀크에서 항체 서열을 발현시키는 것이다. 식물이나 밀크에서 항체를 재조합적으로 발현시키는 방법들이 개시되었다. 예를 들어, Peeters 등(2001) Vaccine 19:2756; Lonberg N. 및 D. Huszar(1995) Int.Rev.Immunol 13:65; 및 Pollock 등 (1999) J. lmmunol. Methods 231:147 참조. 예를 들어, 사람화, 단일 사슬 등의 항체 유도체를 제조하는 방법이 본 기술분야에 공지되어 있다. 다른 대안으로서, 파지 디스플레이 기술에 의해 재조합적으로 항체가 제조될 수 있다. 예를 들어, Winter 등, Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994) 및 미국특허 No. 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 6,265,150 참조.
관심의 항체 또는 단백질은 당업자에게 잘 얄려진 에드만 분해법에 의해 서열화될 수 있다. 질량분광법이나 에드만 분해법으로부터 생성된 펩티드 정보를 사용하여 관심의 단백질을 클로닝하는데 사용되는 프로브나 프라이머를 설계할 수 있다.
관심의 단백질을 클로닝하는 다른 방법은, 정제된 KID3나 그의 일부분을 사용하여 관심의 항체나 단백질을 발현하는 세포를 가려내는 것이다. "가려내기" 과정은 관심의 항체나 단백질을 발현하는 조직이나 세포로부터 cDNA 라이브러리를 얻고, 제2 세포 타입에서 cDNA를 과발현시키고, 제 2 세포 타입의 트랜스펙트된 세포를 KID3와의 특이적 결합에 대해 스크리닝하는 것에 의해서 수행된다. "가려내기"에 의해서 세포 표면 단백질을 코딩하는 포유동물 유전자를 클로닝하는데 사용되는 방법에 대한 상세 설명은 본 기술분야에서 찾을 수 있다. 예를 들어, Aruffo, A. 및 Seed, B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8573-8577(1987) 및 Stephan, J. 등, Endocrinology 140:5841-5854(1999) 참조.
항-KID3 항체, 및 다른 KID3 펩티드 작용제, 길항제 및 조절제를 암호화하는 cDNA가 본 기술분야의 표준방법에 따라 특정한 세포 타입으로부터 mRNA를 역번역하는 것에 의해서 얻어질 수 있다. 구체적으로, mRNA가 Sambrook 등(상동)에 제시된 과정에 따라서 다양한 세포용해성 효소나 화학적 용액을 사용하여 분리되고, 제조자(예를 들어, Qiagen, Invitrogen, Promega)에 의해 제공된 첨부된 설명서에 따라서, 상업적으로 입수할 수 있는 핵산 결합 수지에 의해 추출될 수 있다. 다음에, 합성된 cDNA가 발현 벡터로 도입되어 제2 타입의 세포에서 관심의 항체나 단백질을 생성한다. 이것은 발현 벡터가 숙주세포에서 에피솜이나 염색체 DNA의 통합부분으로서 복제가능해야 한다는 것을 의미한다. 적합한 발현 벡터는 제한은 없지만, 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스를 포함하는 바이러스 벡터, 및 코스미드를 포함한다.
관심의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 사용한 트랜스펙션, 마이크로프로젝타일 봄바드먼트, 리포펙션, 및 감염(예를 들어, 벡터가 우두 바이러스 같은 감염성 제제인 경우)을 포함하는 많은 적합한 수단 중 어느 것에 의해 숙주세포에 도입될 수 있다. 도입하는 벡터나 폴리뉴클레오티드의 선택은 주로 숙주세포의 특징에 의존할 것이다.
관심의 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하기 위해서 이종성 DNA를 과발현할 수 있는 어떤 숙주세포가 사용될 수 있다. 포유동물 숙주세포의 비제한적인 예들은, 제한은 없지만, COS, HeLa 및 CHO 세포를 포함한다. 바람직하게, 숙주세포는, 숙주세포에서, 상응하는 내인성 해당 항체 또는 단백질이 존재한다면, 이들보다 약 5배 더 높은 수준으로, 더 바람직하게는 약 10배 더 높은 수준으로, 더욱더 바람직하게는 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. KID3와의 특이적 결합에 대한 숙주세포의 스크리닝은 면역분석법이나 FACS에 의해 행해진다. 관심의 항체 또는 단백질을 과발현하는 세포가 확인될 수 있다.
다양한 기술이 또 이용가능하며, 현재 이들을 사용하여, 모 KID3 펩티드 작용제, 길항제, 또는 조절제 분자와 비교하여, 결과의 단백질의 아미노산 서열에서 부가, 결실, 또는 변화를 암호화하는 돌연변이 KID3 펩티드 작용제, 길항제, 및 조절제를 생성할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 본 기술분야에 공지된 과정에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 항체의 단백질 가수분해나 다른 분해, 상기 설명된 재조합 방법(즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드 또는 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 약 50 아미노산 이하의 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조된다. 화학적 합성법은 본 기술분야에 공지되어 있으며 상업적으로 입수할 수 있다. 예를 들어, 항-KID3 폴리펩티드는 고체상 방법을 사용하는 자동 폴리펩티드 합성기에 의해 생성될 수 있다.
IV. 폴리펩티드 및 모노클로날 항체의 스크리닝 방법
몇몇 방법을 사용하여 KID3와 결합하는 폴리펩티드 및 모노클로날 항체를 스크리닝할 수 있다. "결합"이 생물학적으로 또는 면역학적으로 관련된 결합, 즉 면역글로불린 분자가 암호화되는, 또는 폴리펩티드가 보내지는 유일한 항원 결정소에 대한 특이적인 결합을 말한다는 것이 이해된다. 이것은 면역글로불린이 비-특이적 표적에 대해 매우 고농도로 사용될 때 발생할 수 있는 비-특이적 결합을 말하는 것은 아니다. 한 구체예에서, 표준 스크리닝 기술을 사용하여 KID3와의 결합에 대해 모노클로날 항체가 스크리닝된다. 이런 방식으로 항-KID3 모노클로날 항체가 얻어졌다. 부다페스트 조약에 따라서, 항-KID3 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마가 2002년 12월 18일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)(버지니아 20110-2209 매너사스 유니버시티 빌딩 10801)에 기탁되었고 PTA-4860의 특허기탁명을 받았다.
KID3와 결합하는 모노클로날 항체는 암성 조직 및 비-암성 조직과의 결합에 대해 스크리닝된다. 한 구체예에서, KID3와 결합하고, 또 사람의 암성 세포나 조직과는 교차반응하지만 정상 세포나 조직과는 동일한 정도로 교차반응하지 않는 모노크로날 항체가 선택된다. 스크리닝에 사용될 수 있는 한 방법은 면역조직화학법(IHC)이다. 표준 면역조직화학 기술은 당업자에게 공지된 기술이다. 예를 들어, Animal Cell Culture Methods(J. P. Mather 및 D. Barnes, 편저, Academic Press, Vol. 57, Ch. 18 및 19, pp. 314-350, 1998). 생물학적 샘플(예를 들어, 조직)이 생체검사, 부검, 또는 검시로부터 얻어질 수 있다. KID3가 암성 세포에만 존재하는지 확인하기 위해서, 항-KID3 항체를 사용하여, 암을 가진 개체로부터의 조직 상에서 KID3의 존재를 검출할 수 있으며, 이때 암에 걸린 개체로부터의 다른 비-암성 조직이나 암에 걸리지 않은 개체로부터의 조직이 대조표준으로 사용된다. 냉동시키는 동안 손상되는 것을 방지하는 고체 또는 반-고체 물질(예를 들어, 아가로스겔 또는 OCT)에 이 조직을 포매시킨 다음에 절편으로 만들어 염색할 수 있다. 상이한 기관으로부터의 상이한 등급의 암을 사용하여 모노클로날 항체를 스크리닝할 수 있다. 스크리닝 목적을 위해 사용될 수 있는 조직의 예들은, 제한은 없지만, 난소, 유방, 폐, 전립선, 결장, 신장, 피부, 갑상선, 뇌, 심장, 간, 위, 신경, 혈관, 뼈, 상부소화관 및 췌장을 포함한다. 스크리닝 목적을 위해 사용될 수 있는 상이한 암 종류의 예들은, 제한은 없지만, 암종, 선암종, 육종, 선육종, 림프종, 및 백혈병을 포함한다.
또 다른 대안으로, 이들 각 조직으로부터의 정상 세포와 암성 셀라인, 예를 들어 SK-Ov-3(ATCC #HTB 77), LnCap(ATCC #CRL-1740), A549(ATCC #CCL 185), PANC-1(ATCC #CRL 1469), SK-BR-3(ATCC #HTB 30), SK-MES-1(ATCC #HTB 58), HT-29(HTB-38), SW 480(ATCC #CCL 228), AsPC-1(ATCC #CRL 1682), Capan-1(ATCC #HTB 79), CFPAC-1(ATCC #CRL 1918), HPAF-II(ATCC #CRL-1997), Hs-700T(ATCC #HTB 147), ES-2(ATCC #CRL-1978), PC-3(ATCC #CRL 1435), Du-145(ATCC #HTB-81), Calu3(ATCC #HTB-55), A498(ATCC #CRL-7908), Caki-2(ATCC #HTB-47), 786-O(ATCC #CRL-1932), Hs766T(ATCC #HTB-134), MCF7(ATCC #HTB-22), BT-474(ATCC #HTB-20), Rav CA130 (Raven Biotechnologies, inc.에서 밝혀낸 독점적 폐암 셀라인), Rav9926(Raven에 서 밝혀낸 독점적 췌장암 셀라인), 및 22Rvl(ATCC #CRL-2505)를 사용하여, 암성 조직에 특이적인 모노클로날 항체를 스크리닝할 수 있다. 제한은 없지만, 난소, 유방, 폐, 전립선, 결장, 신장, 피부, 갑상선, 대동맥 평활근, 및 내피세포를 포함하는 상이한 기관들의 정상 조직으로부터 유래된 1차, 또는 로우 패시지 세포 배양물이 음성 대조표준으로 사용될 수 있다. 암성 또는 비-암성 세포는 WO 01/43869에 설명된 대로, 유리 슬라이드나 커버슬립 위에서, 또는 플라스틱 표면 위에서 성장되거나, 또는 CellArrayTM에서 제조된 다음, 상기 설명된 대로 IHC를 사용하여 조직에 대한 항체의 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 또는 달리, 비-단백질가수분해성 수단을 사용하여 성장 표면으로부터 세포를 제거하고, 회전시켜 펠릿으로 만든 다음, 이것을 상기 설명된 대로 IHC 분석용 조직으로서 포매시키고 처리한다. 세포를 면역결핍 동물에 접종하고 종양을 성장시킨 다음, 이 종양을 수집하고 포매시켜 IHC 분석용 조직 공급원으로서 사용할 수 있다. 다른 대안으로서, 1차 항체와 함께 인큐베이션함으로써 단 1개의 세포가 스크리닝되고, 2차 "리포터" 항체가 형광 분자에 연결되고, 다음에 형광활성화세포분별(FACS) 기계를 사용하여 분석될 수 있다.
항체와 조직 절편의 결합을 검출하기 위해서 몇몇 상이한 검출 시스템이 이용될 수 있다. 전형적으로, 면역조직화학법은 1차항체와 조직의 결합을 수반하며, 그 후 1차 항체로부터의 종들에 대해 반응성인 2차 항체가 발생되었고, 검출가능한 마커(예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, HRP, 또는 디아미노벤제딘, DAB)와 콘쥬 게이트되었다. 사용될 수 있는 다른 방법은 폴리클로날 거울 이미지 상보성 항체 또는 polyMICA이다. polyMICA(폴리클로날 거울 이미지 상보성 상체) 기술은, D.C. Mangham 및 P.G. Isaacson(Histopathology (1999) 35(2):129-33)에 의해 설명되었으며, 이것을 사용하여 1차 항체(예를 들어, 항-KID3 항체)와 정상 및 암성 조직의 결합을 시험할 수 있다. Binding Site Limited(영국 비29 6에이티 버밍엄 피. 오. 박스 4073)로부터 몇 가지 종류의 polyMICATM 검출 키트를 상업적으로 입수할 수 있다. 제품 No. HK004.D는 DAB 크로마젠을 사용하는 polyMICA 검출 키트이다. 제품 No. HK004.A는 AEC 크로마젠을 사용하는 polyMICA 검출 키트이다. 또는 달리, 1차 항체가 검출가능한 마커로 직접 표지될 수 있다.
적합한 항체를 선택하기 위한 IHC 스크리닝에서 제1 단계는 마우스에서 발생된 1차 항체(예를 들어, 항-KID3 항체)와 하나 이상의 면역원(예를 들어, 세포 또는 조직 샘플)의 결합이다. 한 구체예에서, 조직 샘플은 상이한 기관들로부터 유래된 냉동 조직의 절편이다. 세포 또는 조직 샘플은 암성이거나 비-암성일 수 있다.
냉동 조직이 제조되고, 고정화시키면서 또는 고정화 없이 절편화될 수 있으며, 당업자에게 공지된 많은 방법 중 어느 것에 의해서 IHC가 수행될 수 있다. 예를 들어, Stephan 등 Dev. Biol. 212:264-277(1999), 및 Stephan 등 Endocrinology 140:5841-54 (1999) 참조.
V. 항-KID3 항체의 특성화 방법
항-KID3 항체를 특성화하기 위해서 몇몇 방법이 사용될 수 있다. 한 방법은 그것이 결합하는 에피토프를 확인하는 것이다. 에피토프 맵핑은 KID3를 구성하는 코어 탄수화물을 합성함으로써 달성될 수 있다. 이들 합성된 탄수화물이 또한 소혈청 알부민(BSA)이나 사람혈청 알부민(HSA)과 같은 캐리어 분자에 부착되어 "신생-단백질"을 구성할 수 있다. 신생-단백질의 합성은 다양한 공급원, 예를 들어 Lundonia Biotech AB(스웨덴 룬트) 및 Dextra Laboratories(영국 리딩)으로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 다음에, 이들 신생-단백질은 다른 항-KID3 항체의 발견에서 스크리닝 표적으로서 사용될 수 있다.
항-KID3 항체를 특성화하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은, 동일한 에피토프, 즉 KID3와 결합한다고 알려진 다른 항체와의 경쟁 분석을 사용하여, 항-KID3 항체가 다른 항체들처럼 동일한 에피토프와 결합하는지를 측정하는 것이다. 상업적으로 입수가능한 KID3에 대한 항체의 예들이 이용될 수 있으며, 본원에서 교시된 결합분석법을 사용하여 확인될 수 있다. 경쟁 분석은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 그러한 과정 및 실례의 데이타는 실시예에서 더 상세히 설명된다. 항-KID3 항체는 그들이 결합하는 조직, 암의 종류 또는 종양의 종류에 의해서 더 특성화될 수 있다.
VI. 항-KID3 항체 및 KID 조절제를 사용한 암의 진단 방법
진단의 목적을 위해서, 본원에 개시된 방법에 의해서 제조된 KID3에 대한 모노클로날 항체를 사용하여, 제한은 없지만, 난소, 유방, 폐, 전립선, 결장, 신장, 췌장, 피부, 갑상선, 뇌, 심장, 간, 위, 신경, 혈관, 뼈, 및 상부소화관을 포함하 는 다양한 조직에서 암성 세포의 존재 또는 부재를 확인할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 방법에 의해서 제조된 KID3에 대한 모노클로날 항체를 사용하여, 암성 세포의 존재나 부재, 또는 고상 종양으로부터 방출된 후 혈액 중에서 순환하고 있는 이들의 항원 결정소의 수준을 확인할 수 있다. 그러한 순환하고 있는 항원 결정소는 완전한 KID3 에피토프, 또는 본원에 교시된 방법에 따라서 검출될 수 있는 능력을 보유한 이들의 단편일 수 있다. 그러한 검출은 본 기술분야에서 통상 사용되는 표준 방법을 사용하는 FACS 분석에 의해 행해질 수 있다.
이들 사용은 KID3와 KID3와 특이적으로 결합하는 항체 간의 복합체의 형성을 수반할 수 있다. 그러한 항체의 예들은 제한은 없지만, 기탁명 PTA-4860으로 ATCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 항-KID3 모노클로날 항체를 포함한다. 그러한 복합체는 생체외에서 혹은 생체내에서 형성될 수 있다. 어떤 이론과 결부되지는 않지만, 모노클로날 항체 항-KID3는 KID3와 결합한 다음 내재화될 수 있다.
본 발명의 진단 방법의 바람직한 구체예에서, 항체는 검출가능한 표지를 지닌다. 사용될 수 있는 표지의 예들은 방사성 활성제나 플루오로이소티오시아네이트 또는 피코에리트린과 같은 형광발색단을 포함한다.
진단 및 치료적 목적을 위해 상업적으로 사용되는 다른 공지된 항체들과 마찬가지로, 본 발명의 표적 에피토프도 정상 조직에서 광범위하게 발현된다. 또한, 어떤 종양에서는 상향조절된다. 따라서, 진단제 또는 치료제로 사용되는 본 발명의 항체에 대한 특정한 용량 및 송달 경로는, 멀지 않아 특정한 종양 또는 질환 상태 뿐만 아니라 치료될 특정한 개체에 맞춰질 것이다.
진단을 위해 항체를 사용하는 한 방법은, 항체와 방사성 활성제 또는 방사성 불투명 제제를 연결하고, 항체를 개체에 투여하고, x-선이나 다른 영상화기를 사용하여 에피토프를 발현하는 암세포 표면에서의 표지된 항체의 국부화를 시각화함으로써 종양을 생체내에서 영상화하는 것이다. 항체는 생리학적 조건에서 결합을 촉진하는 농도로 투여된다.
KID3 검출을 위한 생체외 기술은 본 기술분야에서 통상적인 것으로, 효소결합면역흡수분석법(ELISA), 면역침전법, 면역형광법, 효소면역분석법(EIA), 방사성면역분석법(RIA), 및 웨스턴블롯 분석을 포함한다.
본 발명의 양태로서, 종양이나 신생물을 방사선 영상화하는 방법, 또는 방사성 표지된 항체를 사용한 치료 방법의 유효성을 측정하는 방법은, 본 발명의 실시형태에 따라 방사성 표지된 종양-특이적 항체를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 방사성 표지된 항체는, 바람직하게는 테크네튬-99m, 인듐-111, 요오드-131, 레늄-186, 레늄-188, 사마륨-153, 루테튬-177, 구리-64, 스칸듐-47, 이트륨-90으로 구성되는 군으로부터 선택된 방사성 표지를 포함하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 항체의 면역반응성을 손상시키지 않고 생체내에서 파괴되지 않는 요오드-131, 레늄-188, 홀뮴-166, 사마륨-153 및 스칸듐-47과 같은 치료용 방사성 핵종으로 표지된 모노클로날 항체가 특히 바람직하다. 당업자라면 다른 방사성 활성 동위원소가 공지되어 있고, 특정한 용도에 적합할 수 있다는 것을 알 것이다. 방사선 영상화는 단일양자방출 컴퓨터단층촬영(SPECT), 위치방출 단층촬영(PET), 컴퓨터단층촬영(CT) 또는 자기공명영상화(MRI)를 사용하여 수행될 수 있다. 또, 방 사선 면역영상화에 의해 위치가 알려진 전이 장소에 대한 더 고도의 해부적 한정을 허용하는 상호 영상화가 고려된다.
다른 방법으로, 암성 세포가 제거되고, 본 기술분야에 잘 공지된 방법에 의해서 면역조직화학용 조직이 제조된다(예를 들어, 냉동 화합물에 포매하고, 고정화시키면서 또는 고정화 없이 냉동하여 절편화하는 것; 다양한 에피토프 수선 방법과 함께 또는 그러한 방법 없이 고정화 및 파라핀 포매시키고 반대염색하는 것). 또한, 모노클로날 항체를 사용하여 상이한 발생 단계에 있는 암성 세포를 확인할 수 있다. 또한, 이 항체를 사용하여, 개체의 종양이 정해진 수준으로 종양 표면에서 에피토프를 발현하는지를 측정할 수 있으며, 그에 따라 상기 에피토프에 관한 항체를 사용한 면역요법의 후보인지를 결정할 수 있다. 항체는 난소, 전립선 및 췌장의 원발성 암과 전이성 암을 모두 인식할 수 있으며, KID3를 발현하는 폐의 원발성 암을 인식할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 검출은, 정성적 및/또는 정량적 검출을 포함할 수 있으며, 암성 세포에서 KID3의 발현 수준의 증가를 정상 세포에서 측정된 수준과 비교하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 KID3와 결합하는 어떤 항체를 사용하여 개체에서 암(난소암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 결장암 또는 유방암)의 진단을 보조하는 방법과, KID3 발현 수준을 측정하는데 사용될 수 있는 어떤 다른 방법들을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은, "진단을 보조하는" 방법은 이들 방법이 암의 분류, 또는 암의 성질에 관한 임상적 결정을 내리는데 도움이 된다는 의미이며, 명확한 진단에 관하여서 결정적일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 따라서, 암의 진단을 보조하는 방법 은 개체로부터의 생물학적 샘플에서 KID3의 수준을 검출하고 및/또는 이 샘플에서 KID3 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 에피토프 또는 그 일부분을 인식하는 항체를 사용하여, 제한은 없지만 혈액, 침, 소변, 폐의 수액, 또는 복수를 포함하는 체액 내의 살아있거나 죽은 암세포로부터 방출되거나 분비된 항원 결정소를 검출하기 위한 진단적 면역분석을 행할 수 있다.
관심의 특정 종양에 있는 모든 세포들이 KID3를 발현하는 것은 아니며, 다른 조직에 있는 암성 세포도 KID3를 발현할 수 있으므로, 암성 세포 상의 KID3의 존재나 부재에 대해 개체를 스크리닝하여 개체에서의 면역요법의 유용성을 결정하는 것이 바람직하다. 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 항-KID3 항체를 사용하여, 암으로 진단된 개체가 KID3에 관한 항체를 사용한 면역요법에 대한 후보일 수 있는지를 결정할 수 있다. 한 구체예에서, 암성 종양 또는 생체검사 샘플이 KID3에 관한 항체를 사용하여 KID3의 발현에 대해 시험될 수 있다. KID3를 발현하는 암세포를 가진 개체가 KID3에 관한 항체를 사용한 면역요법의 적합한 후보이다. 또한, 정상 조직과 암성 조직을 구별하기 위해서 항-KID3를 사용한 염색이 사용될 수 있다.
진단적 목적을 위해 항-KID3 항체를 사용하는 방법은, 예를 들어 화학요법이나 방사선요법과 같은 모든 형태의 항암치료의 전후에 유용하며, 이로써 주어진 치료에 가장 잘 반응할 것 같은 종양, 암, 종양 아유형 또는 전이성 질환의 기원을 가진 개체의 예후, 및 질환의 진행이나 치료에 대한 반응을 결정할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은, 다른 질환(비-암성) 세포에의 적용에서 상기 일반적으로 설명된 방법을 사용하여 암 이외의 다른 질환 상태를 진단하는데도 적합 하다. 본 발명의 방법에서 사용하는데 적합한 질환 상태는, 제한은 없지만, 개체에서의 염증 또는 자가면역 반응에 관련된 질환 또는 장애이다. 상기 설명된 방법이 개체에서의 염증 또는 자가면역 반응을 조절하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 진단 및/또는 치료될 수 있는 염증 및 자가면역 장애로 인한 질환 및 상태는, 제한은 없지만, 다발성 경화증, 수막염, 뇌염, 뇌졸중, 다른 대뇌 외상, 궤양성 대장염 및 크론병을 포함하는 염증성 장질환, 중증 근무력증, 루푸스, 류마티스성 관절염, 천식, 급성 소아당뇨병, AIDS, 치매, 죽상경화증, 신장염, 망막염, 아토피성 피부염, 건선, 심근허혈 및 급성 백혈구-매개 폐손상을 포함한다. 본 발명의 항체 및 다른 치료제의 진단적 및/또는 치료적 사용에 대한 또 다른 지침은 기관 또는 이식편 거부의 위험이 있는 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 최근 몇 년간에 걸쳐 피부, 신장, 간, 심장, 폐, 췌장 및 골수와 같은 조직 및 기관을 이식하는 수술 기술의 능률에 상당한 개선이 있었다. 아마도 제일 눈에 띄는 문제는 레시피언트에서 이식된 동종이식편이나 기관에 대한 면역내성을 유도하는 만족스러운 제제의 부족일 것이다. 동종유전자 세포나 기관이 숙주에게 이식될 때(즉, 기증자와 수여자가 같은 종으로부터의 상이한 개체이다), 숙주 면역시스템은 이식조직에 있는 외래 항원에 대해서 면역반응을 개시할 가능성이 있으며(숙주-대-이식편 질환), 이는 이식조직의 파괴를 가져온다.
또한, 항-KID3 항체에 대해서 이들의 사용을 기술하고 있는, 본 출원의 곳곳에서 설명된 사용은 본원에 설명된 다른 KID3 작용제, 길항제 및 조절제의 사용을 포함한다. 그러한 구체예에서, KID3 작용제, 길항제 또는 다른 비-항체 조절제는 설명된 단계에서 KID3 항체를 대신하며, 치환된 KID3 조절성 조성물에 맞게 본 방법을 맞추기 위해서 당업자의 범위 내에서의 변경이 만들어진다.
VII. 본 발명의 조성물
또한, 본 발명은 항-KID3 항체, 항-KID3 항체로부터 유래된 폴리펩티드, 항-KID3 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 설명된 다른 제제들을 포함하는, 제약학적 조성물을 포함하는 조성물을 포함한다. 본원에서 설명된 바와 같은 조성물은 KID3와 결합하는 하나 이상의 항체, 폴리펩티드 및/또는 단백질, KID3 작용제, 길항제, 조절제, 및/또는 KID3와 결합하는 하나 이상의 항체, 폴리펩티드 및 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 더 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 어떤 KID3 작용제, 길항제 또는 조절제와 특정한 KID3 작용제, 길항제 또는 조절제의 의도된 기능이나 기능들을 지원하는 추가의 화학적 구조의 콘쥬게이트를 제공한다. 이들 콘쥬게이트는 본원에서 논의된 진단, 스크리닝 또는 정제 과정에서 사용된 어떤 불용성 고체 지지체 매트릭스와 같은 거대분자와 공유결합된 KID3 작용제, 길항제 또는 조절제를 포함한다. 적합한 매트릭스 재료는 화학적으로 불활성이고, 높은 다공도를 가지며, 펩티드 리간드와 공유결합을 형성할 수 있는 많은 수의 작용기를 갖는 어떤 물질을 포함한다. 매트릭스 재료의 예들과 매트릭스-리간드 콘쥬게이트의 제조 과정은 Dean 등 (편저) Affinity Chro-matography: A Practical Approach, IRL Press (1985); Lowe, "An Introduction to Affinity Chromatography", Work 등(편저) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 7, Part II, North-Holland (1979); Porath 등, "Biospecific Affinity Chromatography", Neurath 등(편저), The Proteins, 3판, Vol. 1, pp. 95-178 (1975); 및 Schott, Affinity Chromatography, Dekker (1984)에서 설명된다.
또한, 본원에서는 KID3 작용제, 길항제 또는 조절제와 본원에서 논의된 진단 과정에서 사용된 어떤 리포터 부분의 콘쥬게이트가 제공된다.
더 나아가, 항-KID3 항체를 포함하는, 본 발명의 KID3 작용제, 길항제 또는 조절제, 폴리펩티드 및 단백질이 다음의 기준들 중 어느 (하나 이상의) 것에 의해 확인되고 특성화된다: (a) KID3(제한은 없지만, 난소암, 전립선암, 췌장암, 폐암, 결장암 또는 유방암 세포를 포함하는 암세포 상의 KID3를 포함한다)와 결합하는 능력; (b) 본래 항체가 우선적으로 결합하는 동일한 KID3 에피토프와 우선적으로 결합하는 능력을 포함하여, 공지된 항-KID3 항체와 KID3의 우선적 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력; (c) 생체외 또는 생체내에서 살아있는 세포의 표면에 노출된 KID3의 일부분과 결합하는 능력; (d) 제한은 없지만, 난소암, 전립선암, 췌장암, 폐암, 결장암, 또는 유방암 세포와 같은, 살아있는 암세포의 표면에 노출된 KID3의 일부분과 결합하는 능력; (e) KID3를 발현하는 암성 세포(제한은 없지만, 난소암, 전립선암, 췌장암, 폐암, 결장암, 또는 유방암 세포)로 화학요법제나 검출가능한 마커를 송달하는 능력; (f) KID3를 발현하는 암성 세포(제한은 없지만, 난소암세포) 내로 치료제를 송달하는 능력.
어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 기탁번호 ATCC No. PTA-4860을 사용하여 숙주세포에 의해 생성된 항체, 또는 그의 자손이다. 또한, 본 발명은 이들 기탁된 하이브리도마 및 동등 항체 또는 폴리펩티드 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 단일 사슬(ScFv), 그의 돌연변이, 항체의 일부분을 포함하는 융합 단백질, 사람화 항체, 및 필요한 특이성을 갖는 인식 부위인 에피토프(KID3)를 포함하는 이들 또는 동등 항체 중 어느 것의 어떤 다른 변형된 구조에 의해 생성된 항체의 다양한 조제물을 포함한다. 또한, 본 발명은 항-KID3 패밀리 구성원의 생물학적 특징들 중 하나 이상을 나타내는 사람 항체를 제공한다. 항-KID3 패밀리(사람화 항체 및 사람 항체를 포함한다)의 동등 항체, 폴리펩티드 단편, 및 이들 단편 중 어느 것을 포함하는 폴리펩티드가 상기 설명된 5가지의 기준 중 어느 (하나 이상의) 것에 의해 확인되고 특성화된다.
어떤 구체예에서, KID3와 결합하는 본 발명의 항체, 폴리펩티드 및 단백질은 본원에 명시된 항-KID3 항체와 KID3의 우선적인 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체, 폴리펩티드 및 단백질이다. 어떤 구체예에서, 항체, 폴리펩티드 및 단백질은 항체 mu-항-KID3가 우선적으로 결합함에 따라 동일한 KID3 에피토프와 우선적으로 결합한다.
따라서, 본 발명은 다음 중 어느 것(또는 다음 중 어느 것을 포함하는 제약학적 조성물을 포함하는 조성물)을 제공한다: (a) 상기와 동일한 기탁번호를 가지고 숙주세포에 의해 생성된 항체 또는 그 자손; (b) 그러한 항체의 사람화된 형태; (c) 그러한 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 가변영역들 중 하나 이상을 포함하는 항체; (d) 그러한 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역과 동종성이거나 이들 가변영역으로부터 유래된 가변영역, 및 사람 항체의 중쇄 및 경쇄의 불변영역과 동종성이거나 이들 영역으로부터 유래된 불변영역을 포함하는 키메라 항체; (e) 그러한 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 CDR(적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개) 중 하나 이상을 포함하는 항체; (f) 그러한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항체; (g) 그러한 항체와 동등한 사람 항체. 항체의 사람화된 형태는 본래 항체, 또는 상기와 동일한 기탁번호를 가지고 숙주세포에 의해서 생성된 항체와 동일한 CDR을 가질 수도 있고 갖지 않을 수도 있다. CDR 영역의 결정은 당업자에게 잘 알려져 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 상기와 동일한 기탁된 하이브리도마 중 하나에 의해 생성된 항체, 또는 상기와 동일한 기탁번호를 가지고 숙주세포에 의해서 생성된 항체의 적어도 1개의 CDR, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 CDR과 실질적으로 동종성인 적어도 1개의 CDR을 포함하는 항체를 제공한다(또는 어떤 구체예에서는, 이들 항체 중 하나의, 또는 이들 항체 중 하나에서 유래된 6개 CDR 전부와 실질적으로 동종성이다). 다른 구체예는 본원에서 확인된 기탁된 하이브리도마로부터 생성된 항체의, 또는 그러한 항체로부터 유래된 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 CDR과 실질적으로 동종성인 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개 CDR(들)을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해서, 결합 특이성 및/또는 전체적 활성(이것은 화학요법제를 암성 세포로 또는 암성 세포 내로 송달하여, 암세포의 성장 및/또는 증식을 감소시키고, 암세포에서 세포자살성 세포사를 유발하고, 전이의 발생을 지연시키고, 및/또는 고식적으로 치료하는 것에 관한 것일 수 있다)이 일반적으로 보유되며, 활성의 정도는 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 항체에 비해서 변할 수 있다는 것이 이해된다(더 크거나 더 적을 수 있다). 또한, 본 발명은 이들 항체 중 어느 것을 제조하는 방법을 제공한다. 항체를 제조하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있으며 본원에서 설명된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 어떤 구체예에서, 폴리펩티드는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 가변영역 중 하나 이상을 포함한다. 어떤 구체예에서, 폴리펩티드는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 CDR 중 하나 이상을 포함한다. 어떤 구체예에서, 폴리펩티드는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 3개의 CDR을 포함한다. 어떤 구체예에서, 폴리펩티드는 본래 항체 서열의 적어도 5개 연속 아미노산; 적어도 8개 연속 아미노산, 적어도 약 10개 연속 아미노산, 적어도 약 15개 연속 아미노산, 적어도 약 20개 연속 아미노산, 적어도 약 25개 연속 아미노산, 적어도 약 30개 연속 아미노산 중 어느 것을 갖는 항체 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 아미노산 중 적어도 3개는 항체의 가변영역에서 유래한다. 한 구체예에서, 가변영역은 본래 항체의 경쇄로부터 유래한다. 다른 구체예에서, 가변영역은 항체의 중쇄로부터 유래한다. 다른 구체예에서, 5개 (또는 그 이상) 연속 아미노산은 항체의 상보성-결정 영역(CDR)로부터 유래한다.
본 발명의 어떤 구체예에서, KID3, KID3의 일부분, 항-KID3 항체 또는 본 발명의 다른 KID3-결합 폴리펩티드를 발현하는 본 발명의 세포가 생체내에서 KID3 생물학적 활성을 조절하기 위해 개체에 직접 투여된다.
치료적 목적을 위해 KID3 조절제 및 항-KID3 항체를 사용하는 방법
KID3에 대한 모노클로날 항체는 암 또는 다른 질환을 갖는 개체에서 치료적 목적을 위해 사용될 수 있다. 항-KID3 항체를 사용한 치료는 상기 설명된 바와 같이 생체외 및 생체내에서의 복합체의 형성을 수반할 수 있다. 한 구체예에서, 항-KID3 모노클로날 항체는 암성 세포와 결합하여 암성 세포의 증식을 감소시킬 수 있다. 항체가 생리학적(예를 들어, 생체내) 조건에서 결합을 촉진하는 농도로 투여된다는 것이 이해된다. 다른 구체예에서, KID3에 대한 모노클로날 항체는 결장암, 폐암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 신장암 및 육종과 같은 다른 종류의 암과 같은 상이한 조직들의 암성 세포에서의 면역요법을 위해 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, KID3에 대한 모노클로날 항체는 단독으로 암세포와 결합하여 세포분할을 감소시킬 수 있다. 다른 구체예에서, KID3에 대한 모노클로날 항체는 암성 세포와 결합하여 전이의 발생을 지연시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, 암을 가진 개체에게 항-KID3 항체를 사용한 고식적 치료가 제공된다. 암 개체의 증상을 경감시키는 치료는 질환의 부정적 증상, 또는 암 진행에는 직접 영향을 미치지 않는 질환에 대해 주어진 다른 치료로 인한 의원성 증상을 치료하거나 줄이는 것을 포함한다. 이것은 통증 진정, 영양적 지원, 성적 문제, 심리적 고통, 우울증, 피로, 정신적 장애, 메스꺼움, 구토 등을 위한 치료를 포함한다.
그러한 상황에서, 항-KID3 항체는, ADCC를 강화시키는 제제와 같은, 개체 자신의 면역반응을 증진시키거나 감독하는 제제와 함께 투여될 수 있다. 또한, ADCC를 강화하거나 감소시키기 위해 항-KID3 항체의 당화 패턴이 변형될 수 있다. 항체의 차별적 당화는 ADCC 반응을 증가시킨다고 알려졌다(미국특허 6,602,684). 또, 항체에서의 푸코실화(fucosylation) 감소가 ADCC 반응 증가와 관련된다(Yamane-Ohnuki 등, 2004). ADCC를 감소시키는 변형은 또한 본 기술분야에 통상적으로 공지되어 있으며, 본원에서는 어떤 구체예에서 이용가능하다.
또 다른 구체예에서, 항-KID3 항체는 방사성 활성 분자, 독소(예를 들어, 칼리키마이신), 화학요법분자, 리포솜 또는 화학요법 화합물을 함유하는 다른 소포와 콘쥬게이트되거나 연합되고, 항체에 의해 인식된 에피토프를 함유하는 암세포에 이들 화합물을 표적화하는 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로써, 암성 세포나 질환세포를 제거한다. 어떤 특정한 이론에 한정되는 것은 아니지만, 항-KID3 항체는 KID3를 지니는 세포에 의해 세포 표면에서 내재화되고, 이로써 콘쥬게이트 부분을 세포로 송달하여 치료 효과를 유도한다. 또 다른 구체예에서, 항체는 에피토프를 발현하는 암의 외과적 제거시에 보조치료제로서 사용됨으로써 전이의 발생을 지연시킬 수 있다. 또한, 항체는 에피토프를 발현하는 종양을 가진 개체에게 수술 전에 투여됨으로써 종양의 크기를 줄일 수 있으며, 이로써 수술을 가능하게 하거나 간단하게 하고, 수술 중에 조직을 보존하고, 및/또는 결과의 외관 손상을 감소시킨다.
본 발명의 실시형태에서는 세포 사이클 용량법이 고려된다. 그러한 구체예에서는, 화학요법제를 사용하여 정해진 단계에서 종양 또는 다른 표적 질환세포의 세포 사이클을 동기화한다. 이어서, 본 발명의 항-KID3 항체의 투여(단독으로 또는 추가의 치료제 부분과 함께)를 행한다. 다른 구체예에서, 항-KID3 항체를 사용하여 세포 사이클을 동기화하고, 제2 치료 라운드의 투여 전에 세포분할을 감소시 키는데, 여기서 제2 라운드는 항-KID3 항체 및/또는 추가의 치료제 부분의 투여일 수 있다.
화학요법제는 방사성 분자, 암성 세포의 생존력에 해로운 어떤 제제를 포함하는 세포독소나 세포독소제라고도 하는 독소, 화학요법 화합물을 함유하는 제제, 및 화학요법 화합물을 함유하는 리포솜 또는 다른 소포를 포함한다. 적합한 화학요법제의 예들은, 제한은 없지만, 1-디히드로테스토스테론, 5-플루오로우라실 디카르바진, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 악티노마이신 D, 아드리아마이신, 알데스로이킨, 알킬화제, 알로푸리놀 나트륨, 알트레타민, 아미포스틴, 아나스트로졸, 안트라마이신(AMC), 항-유사분열제, 시스-디클로로디아민 플래티늄(II)(DDP) 시스플라틴, 디아미노 디클로로 플래티늄, 안트라시클린, 항생제, 항대사제, 아스파라기나제, 생 BCG(방광내), 베타메타손 나트륨 포스페이트 및 베타메타손 아세테이트, 바이칼루타미드, 블레오마이신 술페이트, 부술판, 칼슘 류코우로린, 칼리키마이신, 카페시타빈, 카르보플라틴, 로무스틴(CCNU), 카르무스틴(BSNU), 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 콜치신, 콘쥬게이트 에스트로겐, 시클로포스파미드, 시클로토스파미드, 시타라빈, 시타라빈, 시토칼라신 B, 시톡산, 다카르바진, 닥티노마이신, 닥티노마이신(이전에는 악티노마이신), 다우니루비신 HCL, 다우노루비신 시트레이트, 데니로이킨 디프티톡스, 덱스라족산, 디브로모만니톨, 디히드록시 안트라신 디온, 도세탁셀, 돌라세트론 메실레이트, 독소루비신 HCL, 드로나비놀, E. coli L-아스파라기나제, 에메틴, 에포에틴 알파, 어위니아 L-아스파라기나제, 에스테르화 에스트로겐, 에스트라디올, 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨, 에티듐 브로마이드, 에티닐 에스트라디올, 에티드로네이트, 에토포시드 시트로로륨 팩터, 에토포시드 포스페이트, 필그라스팀, 플록수리딘, 플루코나졸, 플루다라빈 포스페이트, 플루오로우라실, 플루타미드, 폴린산, 젬시타빈 HCL, 글루코코르티코이드, 고세렐린 아세테이트, 그라마이시딘 D, 그라니세트론 HCL, 히드록시우레아, 이다루비신 HCL, 이포스파미드, 인터페론 알파-2b, 이리노테칸 HCL, 레트로졸, 류코보린 칼슘, 류프롤리드 아세테이트, 레바미졸 HCL, 리도카인, 로뮤스틴, 메이탄시노이드, 메클로레타민 HCL, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 멜파란 HCL, 메르캅티퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 메틸테스토스테론, 미트라마이신, 미토마이신 C, 미토탄, 미토크산트론, 닐루타미드, 옥트레오타이드 아세테이트, 온단세트론 HCL, 파클리탁셀, 파미드로네이트 2나트륨, 펜토스타틴, 필로카르핀 HCL, 플리마이신, 카르무스틴 이식편을 가진 폴리페프로산 20, 포르피머 나트륨, 프로카인, 프로카르바진 HCL, 프로프라놀올, 리툭시맵, 사르그라모스팀, 스트렙토조토신, 타목시펜, 탁솔, 테니포시드, 테노포시드, 테스토락톤, 테트라카인, 티오에파 클로람부실, 티오구아닌, 티오테파, 토코테판 HCL, 토포테칸 HCL, 토레미펜 시트레이트, 트라스투주맵, 트레티오닌, 발루비신, 빈블라스틴 술페이트, 빈크리스틴 술페이트, 및 비노렐빈 타르트레이트를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 세포독소는 분할중인 세포 또는 빠르게 분할중인 세포에 특히 효과적이며, 비-분할 세포는 독소 효과로부터 비교적 자유롭다.
본 발명의 항체는 그들이 결합하는 질환세포나 암종 세포 내로 내재화될 수 있으며, 따라서 치료적 용도에, 예를 들어 불리한 활성을 위해서는 내재화될 필요 가 있는 독소를 세포 내로 송달하는데 특히 유용하다. 그러한 독소의 예들은, 제한은 없지만, 사포린, 칼리키마이신, 아우리스타틴 및 메이탄시노이드를 포함한다.
본 발명의 항체, 폴리펩티드, 또는 다른 치료제나 진단제들은, 공유 또는 비-공유적으로, 직접적으로 또는 간접적으로, 방사성 활성 분자, 독소, 또는 다른 치료제와 연합(콘쥬게이트되거나 또는 연결되는 것을 포함한다)되거나, 또는 치료제를 함유하는 리포솜 또는 다른 소포와 연합될 수 있다. 항체는 항체가 그것의 표적 KID3를 결합시킬 수 있는 한, 항체에 있는 어떤 위치에서도 방사성 활성 분자, 독소, 또는 화학요법 분자에 연결될 수 있다.
독소나 화학요법제는 적합한 모노클로날 항체에 직간접적으로(예를 들어, 링커기에 의해서, 또 다르게는 미국특허 5,552,391에 설명된 플랫폼 분자와 같은 적합한 부착 부위를 갖는 연결 분자에 의해서) 커플링(예를 들어, 공유결합)될 수 있다. 본 발명의 독소 및 화학요법제는 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 특정한 표적 단백질에 직접 커플링될 수 있다. 예를 들어, 제제와 항체 사이의 직접적 반응은, 그 각각이 나머지 하나와 반응할 수 있는 치환기를 지닐 때 가능하다. 예를 들어, 하나에 있는 아미노기나 술프히드릴기와 같은 친핵성기는, 나머지 하나에 있는 무수물 또는 산 할로겐화물과 같은 카르보닐-함유기와, 또는 좋은 이탈기(예를 들어, 할로겐화물)를 함유하는 알킬기와 반응할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드 또는 다른 치료제나 진단제는 마이크로캐리어에 의해 화학요법제에 연결될 수 있다. 마이크로캐리어는, 물에서 불용성이며, 약 150, 120 또는 100㎛ 미만의 크기, 더 통상적으로는 약 50-60㎛ 미만, 바 람직하게는 약 10, 5, 2.5, 2 또는 1.5㎛ 미만의 크기를 갖는 생분해성 또는 비-생분해성 입자를 말한다. 마이크로캐리어는 약 1㎛ 미만, 바람직하게는 약 50nm 미만의 크기를 갖는 마이크로캐리어인 "나노캐리어"를 포함한다. 그러한 입자는 본 기술분야에 공지되어 있다. 고체상 마이크로캐리어는 본 기술분야에 공지된 다른 생분해성 재료들 뿐만 아니라, 생체적합성 천연발생 폴리머, 합성 폴리머 또는 합성 코폴리머로부터 형성된 입자일 수 있으며, 여기서는 아가로스 또는 교차결합 아가로스로부터 형성된 마이크로캐리어가 포함되거나 배제될 수 있다. 생분해성 고체상 마이크로캐리어는 포유동물의 생리학적 조건하에서, 분해성(예를 들어, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산) 및 이들의 코폴리머) 또는 침식성(예를 들어, 3,9-디에틸리덴-2,4,8,10-테트라옥사스피로[5.5]운데칸(DETOSU) 같은 폴리(오르토 에스테르) 또는 세박산의 폴리(무수물)과 같은 폴리(무수물))인 폴리머로부터 형성될 수 있다. 또한, 마이크로캐리어는 액체상(예를 들어, 오일 또는 지질 기제)일 수 있는데, 예를 들어, 리포솜, 항원 결정소를 갖지 않는 이스콤(면역자극 복합체, 이것은 콜레스테롤과 인지질, 애쥬번트-활성 사포닌의 안정한 복합체이다), 또는 수중유 또는 유중수 에멀젼에서 발견되는 작은방울이나 미셀 등이며, 액체상 마이크로캐리어도 생분해성이다. 전형적으로, 생분해성 액체상 마이크로캐리어는 스쿠알렌 및 식물유를 포함하는 본 기술분야에 공지된 수 많은 생분해성 오일과 통합된다. 마이크로캐리어는 전형적으로 구형 모양이지만, 구형 모양에서 벗어난 마이크로캐리어도 허용된다(예를 들어, 타원형, 막대 모양 등). 그들의 불용성(물에 관해서)으로 인해 마이크로캐리어는 물 및 물-기제(수성) 용액으로부터 여과될 수 있다.
본 발명의 항체, 폴리펩티드 또는 다른 치료제나 진단제를 포함하는 본 발명의 콘쥬게이트는 독소나 화학요법제와 커플링할 수 있는 기와 항체와 커플링할 수 있는 기를 모두 함유하는 2-작용기 링커를 포함할 수 있다. 링커는 결합력의 간섭을 피하기 위해서 항체와 제제 사이에 간격을 두는 스페이스로서 기능할 수 있다. 링커는 절단될 수도 있고 절단되지 않을 수도 있다. 또한, 링커는 제제나 항체에 있는 치환기의 화학 반응성을 증가시키도록 작용함으로써 커플링 효능을 증가시킬 수 있다. 화학 반응성의 증가는 또한, 다른 식으로는 불가능한 제제, 또는 제제에 있는 작용기의 사용을 용이하게 할 수 있다. 2-작용기 링커는 본 기술분야에 공지된 수단에 의해서 항체에 커플링될 수 있다. 예를 들어, N-히드록시숙신이미드 에스테르와 같은, 활성 에스테르 부분을 함유하는 링커는 아미드 결합에 의해 항체에 있는 리신 잔기에 커플링하는데 사용될 수 있다. 다른 예로서, 친핵성 아민 또는 히드라진 잔기를 함유하는 링커는 항체 탄수화물 잔기의 해당 산화에 의해 생성된 알데히드기에 커플링될 수 있다. 이들 직접적 커플링 방법에 더하여, 링커는 아미노덱스트란과 같은 중간체 캐리어에 의해 항체에 간접적으로 커플링될 수 있다. 이들 구체예에서, 변형된 결합은 리신, 탄수화물, 또는 중간체 캐리어 중 어느 하나를 경유한다. 한 구체예에서, 링커는 단백질의 유리 티올 잔기에 위치-선택적으로 커플링된다. 단백질 상의 티올기와의 선택적 커플링에 적합한 부분은 본 기술분야에 잘 공지되어 있다. 예들은 이황화 화합물, α-할로카르복실 화합물, 및 말레이미드를 포함한다. 친핵성 아민 작용기가 α-할로카르보닐 또는 카르복실기로서 동일한 분자에 존재할 때, 아민의 분자내 알킬화에 의해 일어날 수 있는 고리화 에 대한 가능성이 존재한다. 이 문제를 방지하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 바람직하지 않은 고리화를 입체화학적으로 어렵게 만드는 아릴기나 트랜스-알켄과 같은 유연하지 않은 기들에 의해 아민과 α-할로 작용기가 분리된 분자를 제조하는 것이다. 예를 들어, 디술피드 부분에 의한 메이탄시노이드와 항체의 콘쥬게이트 제조에 대한 미국특허 No. 6,441,163 참조.
항체-약물 콘쥬게이트의 제조에 사용될 수 있는 절단가능한 링커 중 하나는, 수용체 매개 세포내이입 동안 마주치는 엔도솜 및 리포솜과 같은 상이한 세포내 구획의 산성 환경에서 유리한 시스-아코니틴산에 기초한 산-불안정성 링커이다. 예를 들어, 다우노루비신과 거대분자 캐리어의 콘쥬게이트의 제조에 대한 Shen 등의 Biochem. Biophys. Res. Commun. 102:1048-1054 (1981); 다우노루비신과 항-흑색종 항체의 콘쥬게이트 제조에 대한 Yang 등의 J.Natl.Canc.Inst. 80:1154-1159(1988); 다우노루비신과 항-T 세포 항체의 콘쥬게이트를 제조하는 유사한 방식에서 산-불안정성 링커를 사용하는데 대한 Dillman 등의 Cancer Res. 48:6097-6102(1988); 펩티드 스페이스 팔에 의한 다우노루비신과 항체를 연결하는데 대한 Trouet 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. 79:626-629(1982) 참조.
본 발명의 항체(또는 폴리펩티드) 또는 다른 치료제나 진단제는 본 기술분야에 공지된 어떤 방법에 의해서 방사성 활성 분자와 콘쥬게이트될 수 있다. 방사성 표지 항체를 위한 방법에 대한 논의에 대해서는, "Cancer Therapy with Monoclonal AntibodiesT", D. M. Goldenberg 편저(CRC Press, Boca Raton, 1995)를 참조한다.
또는 달리, 항체는 2차 항체와 콘쥬게이트되어 항체 이종콘쥬게이트를 형성 할 수 있으며, 이것에 대해서는 미국특허 No. 4,676,980에서 Segal에 의해 설명된 바 있다. 교차결합 항체의 형성은 면역시스템을 특정한 종류의 세포, 예를 들어 KID3를 발현하는 암세포나 질환세포에 대해 표적화할 수 있다.
또한, 본 발명은 항-KID3 항체를 사용하여, 또는 다른 구체예에서는 화학요법제와 연결된 KID3와 결합하는 항체를 사용하여, 암(제한은 없지만, 전립선암, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 또는 결장암을 포함한다)을 가진 개체에서 전이의 발생을 지연시키는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 항체는 비-사람 항-KID3 항체의 사람화 형태 또는 키메라 형태이다.
또 다른 구체예에서, 항체는 에피토프를 발현하는 암의 외과적 제거시에 보조치료제로서 사용됨으로써 전이의 발생을 지연시킬 수 있다. 또한, 항체는 에피토프를 발현하는 종양을 가진 개체에게 수술 전에 투여됨으로써 종양의 크기를 줄일 수 있으며, 이로써 수술을 가능하게 하거나 간단하게 하고, 수술중에 조직을 보존하고, 및/또는 결과의 외관 손상을 감소시킨다.
또 다른 구체예에서, 본원에 설명된 KID3 결합 구체예들 중 어느 것은 KID3-발현 암성 세포와 결합하여 KID3를 발현하는 암성 세포에서 세포사 사건을 유발할 수 있다. 어떤 경우, 세포사 사건은 세포자살 경로, 또는 괴사 경로, 또는 종창성 경로를 통한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본원에 설명된 KID3 결합 구체예들 중 어느 것은 KID3-발현 암성 세포와 결합하여 KID3를 발현하는 암성 세포에 대한 활성면역반응을 유발할 수 있다. 어떤 경우, 활성면역반응은 암성 세포를 죽이거나(예를 들어, 항체 와 암세포의 결합이 세포자살성 세포사를 유발한다), 또는 암성 세포의 성장을 억제할 수 있다(예를 들어, 세포 사이클 진행을 차단한다). 다른 경우, 본원에 설명된 신규한 항체들 중 어느 것이 암성 세포와 결합하고, 항체 의존성 세포 세포독소(ADCC)가 항-KID3 항체가 결합한 암성 세포를 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 설명된 조성물 중 어느 것을 투여하는 것을 포함하는 면역반응을 자극하는 방법을 제공한다.
어떤 경우에, 항체 결합은 또한 세포성 및 체액성 면역반응을 모두 활성화시켜, 더 천연의 킬러세포를 모으거나, 또는 개체의 면역시스템을 더 활성화시켜 암성 세포를 파괴하는 시토카인(예를 들어, KL-2, IFN-감마, IL-12, TNF-알파, TNF-베타 등)의 생성을 증가시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항-KID3 항체는 암성 세포와 결합할 수 있으며, 마크로파지나 다른 포식세포가 암성 세포를 먹어서 없앨 수 있다.
항-KID3 항체 또는 이들의 단편의 다양한 조제물이 투여에 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 항-KID3 항체 또는 이들의 단편은 순수한 상태로 투여될 수 있다. 제약학적 활성제에 더하여, 본 발명의 조성물은, 비교적 불활성 물질이며, 제약학적으로 효과적인 물질의 투여를 용이하게 하거나, 작용 부위로의 송달을 위해 제약학적으로 사용될 수 있는 제조물로 활성 화합물을 가공하는 것을 용이하게 하는, 본 기술분야에 잘 공지된 부형제 및 보조제를 포함하는, 제약학적으로 허용되는 적합한 담체를 함유할 수 있다. 예를 들어, 부형제는 형태나 경도를 제공하거나, 희석제로 작용할 수 있다. 적합한 부형제는, 제한은 없지만, 안정화제, 습윤 제 및 유화제, 삼투성을 변화시키는 염, 캡슐화제, 완충액, 및 피부침투증진제를 포함한다.
비경구 투여에 적합한 조제물은 수용성 형태, 예를 들어 수용성염 형태의 활성 화합물 수용액을 포함한다. 여기에 더하여, 유성 주사 현탁액으로 적합한 활성 화합물의 현탁액이 투여될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방오일, 예를 들어 참깨유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트나 트리글리세리드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있으며, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함한다. 선택적으로, 현탁액은 안정제를 또한 함유할 수 있다. 또한, 세포 내로의 송달을 위해 리포솜을 사용하여 제제를 캡슐화할 수 있다.
본 발명에 따른 전신 투여를 위한 제약학적 조제물은 장내, 비경구 또는 국소 투여에 맞게 제조될 수 있다. 게다가, 활성 성분의 전신 투여를 달성하기 위해서 이 3가지 형태의 조제물이 전부 동시에 사용될 수 있다. 비경구 및 비-비경구 약물 송달을 위한 부형제 및 제제들은, Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20판. Mack Publishing (2000)에 제시된다.
경구 투여에 적합한 조제물은 하드 또는 소프트 젤라틴 캡슐, 알약, 코팅 정제를 포함하는 정제, 엘리시르, 현탁액, 시럽 또는 흡입제 및 이들의 제어방출형태를 포함한다.
일반적으로, 이들 제제는 주사(예를 들어, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 주사 등)에 의한 투여에 알맞게 조제되지만, 다른 투여 형태(예를 들어, 경구, 점막 등)도 사용될 수 있다. 따라서, 항-KID3 항체는 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액 등과 같은 제약학적으로 허용되는 비히클과 조합되는 것이 바람직하다.
특정한 투약 섭생법, 즉 용량, 시기조절 및 반복은 특정 개체 및 그 개체의 의학적 병력에 의존할 것이다. 일반적으로, 적어도 약 100ug/kg 체중, 더 바람직하게는 적어도 약 250ug/kg 체중, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 750ug/kg 체중, 더욱더 바람직하게는 약 3mg/kg 체중, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 5mg/kg 체중, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 10mg/kg 체중의 용량이 투여된다.
일반적으로 반감기와 같은 경험적인 고려사항은 용량의 결정에 기여할 것이다. 사람화 항체 또는 완전 사람 항체와 같은, 사람 면역시스템과 양립할 수 있는 항체를 사용하여, 항체의 반감기를 연장하고 항체가 숙주의 면역시스템에 의해 공격받는 것을 방지할 수 있다. 투여 빈도는 치료 진행과정에 따라 결정되고 조정될 수 있으며, 암성 세포수의 감소, 감소된 암성 세포의 유지, 암성 세포증식의 감소, 또는 전이 발생의 지연에 기초한다. 또는 달리, 항-KID3 항체의 지속적 연속방출 조제물이 적합할 수 있다. 지속방출을 달성하기 위한 다양한 조제물 및 장치가 본 기술분야에 공지되어 있다.
한 구체예에서, 항-KID3 항체의 용량은 1회 이상의 투여(들)를 제공받은 개체에서 경험적으로 결정될 수 있다. 항-KID3 항체의 용량은 증가되면서 개체에게 제공된다. 항-KID3 항체의 효능을 평가하기 위해 특정한 암 질환 상태에 대한 마커가 추적될 수 있다. 이들은 촉진이나 시각적 관찰에 의한 종양 크기의 직접 측정, x-선이나 다른 영상화 기술에 의한 종양 크기의 간접 측정, 직접적 종양 생체 검사 및 종양 샘플의 현미경 시험에 의해 평가되는 개선사항; 간접적 종양 마커(예를 들어, 전립선암에서 PSA)의 측정, 통증이나 마비의 감소, 언어능력, 시력, 호흡 또는 종양과 관련된 다른 장애의 개선, 식욕 증가, 또는 승인된 시험에 의해 측정되는 삶의 질의 증가나 생존 연장을 포함한다. 용량은 개체, 암의 종류, 암의 단계, 암이 개체에서 다른 장소로 전이하기 시작했는지의 여부, 그리고 과거의 치료 및 사용중인 동시 치료에 의존하여 변할 것이라는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
다른 조제물은, 제한은 없지만, 리포솜과 같은 담체를 포함하는 본 기술분야에 공지된 적합한 송달 형태를 포함한다. 예를 들어, Mahato 등(1997) Pharm.Res. 14:853-859. 리포솜 제조물은, 제한은 없지만, 시토펙틴, 다층 소포, 및 단층 소포를 포함한다.
어떤 구체예에서는 하나 이상의 항체가 존재할 수 있다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 그러한 조성물은 암종, 선암종, 육종, 또는 선육종에 대해 반응성인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개의 상이한 항체를 함유할 수 있다. 항-KID3 항체는, 제한은 없지만 난소, 유방, 폐, 전립선, 결장, 신장, 피부, 갑상선, 뼈, 상부소화관, 및 췌장을 포함하는 기관에 있는 암종, 선암종, 육종, 또는 선육종에 대해 반응성인 하나 이상의 항체와 혼합될 수 있다. 한 구체예에서, 상이한 항-KID3 항체들의 혼합물이 사용된다. 본 기술분야에서 주로 나타나는 바에 따르면, 항체 혼합물이 광범위한 개체 집단을 치료하는데 특히 유용할 수 있다.
예시를 위해서 다음의 실시예들을 제공하며, 이들은 본 발명을 제한하지 않 는다.
실시예 1
면역원으로서 사람 신장세포의 제조
Advanced Biosciences Research at Alameda County(캘리포니아)로부터 10에서 18주 사이의 재태기의 사람 태아 신장을 얻었다. 신장을 입수한 후 젖은 얼음 위의 조직배양배지 중에 넣어서 실험실까지 배로 운반했다. 도착 후 즉시 신장을 세척배지(페니실린/스트렙토마이신 및 젠타마이신을 함유하는 차가운 PBS)로 옮겼다. 집게로 외부막을 제거한 다음, 70% 에탄올로 신장을 간단히 세척하고 세척배지로 2회 헹구었다. 신장을 100mm짜리 건조된 배양접시에서 수술가위를 사용하여 1mm 입방체로 잘게 썰었다. 본원에서는 I/3F라고 하는 규정된 무혈청 배지 10ml 중에서 이 조직 조각을 플레이팅했다.
이 실시예에 사용된 배지는 다음의 성분들을 함유하며, pH는 7.2, 삼투농도는 295mM이다:
염화칼슘(CaCl2) 0.18g/L,
염화칼륨(KCl) 0.298g/L,
질산칼륨(KNO3) 0.000012629g/L,
황산마그네슘(MgS04)(무수물) 0.068g/L,
염화마그네슘-6H20 0.037g/L,
염화나트륨(NaCl) 6.2g/L,
중탄산나트륨(NaHCO3) 1.2g/L,
인산나트륨(NaH2P04-H20) 0.043g/L,
제2인산나트륨(Na2HP04) 0.088g/L,
아셀렌산소다(NaSe03-5H20) 0.000012629g/L,
메타바나듐산암모늄 0.000000351 g/L,
몰리브덴산-4H20(암모늄) 0.00000372g/L,
황산동-5H20 0.00000075g/L,
황산철-7H20 0.0002502g/L,
황산망간 4.53E-08g/L,
황산아연-7H20 0.0002589g/L,
프럭토스 2g/L,
Hepes 3.57g/L,
푸트레신-2HCl 0.0000483g/L,
티옥트산 0.0000618g/L,
피루브산 나트륨 0.11003g/L,
리놀산 0.00002523g/L,
L-알라닌 0.020173g/L,
L-아스파라긴(자유염기) 0.0175g/L,
L-아스파라긴-H20 0.0045g/L,
L-아르기닌-HCl 0.12201g/L,
L-아스파르트산 0.024993g/L,
L-시스틴-2HCl 0.06398g/L,
L-시스테인-HCl-H2O 0.005268g/L,
L-글루탐산 0.056913g/L,
L-글루타민 0.6g/L,
글리신 0.023253g/L,
L-히스티딘-HCl-H20 0.035691g/L,
L-이소로이신 0.074682g/L,
L-로이신 0.077436g/L,
L-리신-HCl 0.113162g/L,
L-메티오닌 0.022344g/L,
L-페닐알라닌 0.047688g/L,
L-프롤린 0.038359g/L,
L-세린 0.032553g/L,
L-트레오닌 0.070073g/L,
L-트리토판 0.011812g/L,
L-티로신(2나트륨염) 0.0751688g/L,
L-발린 0.069316g/L,
비오틴 0.000011299g/L,
D-판토텐산 칼슘 0.0028714g/L,
염화콜린 0.006988g/L,
엽산 0.0031972g/L,
I-이노시톨 0.010446g/L,
니아신아미드 0.00281098g/L,
피리독살-HCl 0.0028g/L,
피리독신-HCl 0.00001851g/L,
리보플라빈 0.00029128g/L,
티아민-HCl 0.0029011g/L,
바이타민 B12 0.0000499g/L
본 발명의 실시시에는 통상 사용되는 다양한 세포배양배지가 사용될 수 있으며, 현재 바람직한 구체예는 무혈청 프럭토스-기제 세포배양배지를 사용한다. 그러한 배지는 명세서 전체가 본원에 참고자료로 포함되는 미국출원 No. 60/504,674에서 찾을 수 있다.
조직 조각을 15ml 원심분리관으로 옮겨 1000xg으로 5분간 원심분리했다. 인슐린(10ug/ml), 트랜스페린(10ug/ml), 상피성장인자(20ng/ml), 소마토트로핀(0.005 IU/ml), 돼지 뇌하수체 추출물(0.2%), 닭 혈청(0.1%), 젠타마이신(100ug/ml), 페니 실린/스트렙토마이신(1x), 및 콜라게나제/디스파제(0.1%)를 함유하는 I/3F 배지에 조직 조각을 다시 현탁하고 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션했다. 다음 날, 소화된 조직 조각을 1000xg으로 5분간 원심분리하고 I/3F 배지로 2회 세척했다.
이 펠릿을 인슐린(10ug/ml), 트랜스페린(10ug/ml), 상피성장인자(20ng/ml), 소마토트로핀(0.005IU/ml), 돼지 뇌하수체 추출물(0.2%) 및 닭 혈청(0.1%)을 함유하는 I/3F 배지 10ml에 다시 현탁하고 피브로넥틴이 미리 코팅되어 있는 10cm 플레이트에서 배양했다.
이들 배양 조건하에서 사람 태아 신장세포가 기질-코팅 플레이트에 부착되어 단층으로 성장된다. 배양배지는 매주 2번씩 바꾼다.
세포를 수집하기 위해, 37℃에서 15분간 Hank 식염수 용액 중에서 10mM EDTA 중에서 인큐베이션된 칼슘- 및 마그네슘-무함유 Hank 식염수 용액으로 세포 단층을 한번 헹궜다. 부드럽게 피펫팅하여 배양 표면에서 세포를 떼어냈다. 세포 현탁액을 1000xg로 5분간 원심분리하여 펠릿으로 만들었다. 상청액을 제거하고, 적합한 비-변성 애쥬번트를 갖는 무혈청 배지(I/3F 배지)에 세포를 다시 현탁했다.
실시예 2
모노클로날 항체의 발생
인산염 완충 식염수 중에서 비-변성 애쥬번트(Ribi, R730, Corixa, 매사츄세츠 해밀톤)을 4ml까지 재수화시켰다. 다음에, 이 재수화된 애쥬번트 100㎕를 Hank 균형 염용액 400㎕로 희석하고, 이것을 면역화에 사용되는 실시예 1의 세포 펠릿의 일부와 부드럽게 혼합했다. 남아 있는 세포 펠릿 부분을, 애쥬번트가 없는 상기한 바와 같은 용액 중에서 면역화를 위해 Hank 균형 염용액 중에서 제조했다.
마우스 당 대략 106의 사람 태아 신장세포를 발바닥을 통해 Balb/c 마우스에 주입했고, 이것을 대략 1주에 1회 내지는 2회 행한다. 정확한 면역화 일정은 다음과 같다: 0일째, 면역화 더하기 Ribi. 3일째, 면역화 더하기 Ribi. 7일째, 면역화 더하기 Ribi. 38일째, 면역화 빼기 Ribi. 42일째, 면역화 빼기 Ribi. 45일째, 면역화 빼기. 49일째, 면역화 빼기 Ribi. 56일째, 면역화 빼기 Ribi. 63일째, 면역화 빼기 Ribi. 82일째 역가 시험을 위한 방혈. 84일째, 면역화 더하기 Ribi. 87일째, 면역화 더하기 Ribi. 94일째, 면역화 더하기 Ribi. 10일째, 관류 2차 접종(Ribi 없이). 104일째, 융합용 결절들을 수집.
82일째에 각 면역화된 동물의 꼬리에서 혈액 한 방울을 채혈하고, FACS 분석을 사용하여 사람 신장세포에 대한 항체 역가를 시험했다. 역가가 적어도 1:2000에 도달했을 때, 마우스를 CO2 챔버에서 죽인 다음 목을 탈구시켰다. 하이브리도마 제조용으로 림프절을 수집했다.
35% 폴리에틸렌 글리콜 4000을 사용하여 최고 역가를 가진 마우스로부터의 림프구를 마우스 흑색종 라인 X63-Ag8.653과 융합했다. 융합 후 10일째에 하이브리도마 상청액을 형광활성화세포분별법(FACS)에 의해서 사람 태아 신장세포-특이적 모노클로날 항체의 존재에 대해 스크리닝했다. 각 하이브리도마로부터의 콘디셔닝 배지를 사람 태아 신장세포의 분획과 함께 30분간 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 세포 샘플을 세척하고 0.1ml 희석액에 다시 현탁한 다음, 염소 항-마우스 IgG 의 FITC 콘쥬게이트 F(ab')2 단편 1㎍/ml와 함께 4℃에서 30분간 인큐베이션했다. 세포를 세척하고 0.5ml FACS 희석액에 다시 현탁한 다음, FACScan 세포분석기(Becton Dickinson; 캘리포니아 샌어제이)를 사용하여 분석했다. 하이브리도마 클론을 선택하여, 더 확장시키고, 클로닝하고, FACS에 의해 평가되는, 암 셀라인 중 하나 이상의 표면과의 결합에 기초하여 특성화했다. KID3로 명명된 에피토프와 결합하는 mu-KID3로 명명된 모노클로날 항체를 만드는 하이브리도마가 선택되었다.
실시예 3
mu-항-KID3를 포함하는 항-KID3 항체의 정제
10.0mM EDTA의 존재하에 조직배양 플라스크로부터 사람 태아 신장세포를 떼어내고, 1400rpm으로 5분간 원심분리하고, 1% BSA 및 2mM EDTA(FACS 희석액)을 함유하는 PBS에 다시 현탁했다. 세포를 계수하여 107 세포/ml로 조정했다. 세포 약 0.1ml를 100㎕ FACS 희석액 중에서 100㎕ 하이브리도마 상청액과 함께 37℃에서 30분간 인큐베이션했다. 단백질-G 친화성 크로마토그래피를 사용하여 사람 태아 신장세포와 결합하는 모노클로날 항체를 조직배양 상청액으로부터 정제했다. 다음의 재료들을 항체 정제 과정에 사용했다: 하이브리도마 조직배양 상청액, Immunopure (G) IgG 결합 완충액(Pierce #21011, 일리노이 록포드), Immunopure IgG 용출 완충액(Pierce #21009), 진한 HCl(pH 조절용), Corning 1L PES(폴리에테르 술폰), 0.22㎛ 필터(Corning #431098, 뉴저지 커밍), Amersham Pharmacia GradiFrac 시스템(Amersham Pharmacia, 뉴저지 피스카타웨이), 단백질-G 세파로스 4 패스트 플로 우(Amersham Pharmacia #17-0618-02), 3M KSCN/50mM 트리스 pH 7.8인 스트리핑 완충액, 및 PBS(인산염 완충 식염수) 3M 트리스 pH 9.0.
본원에서 mu-항-KID3라고 한 마우스 항-huKID3 항체를 정제하기 위해서, 상청액의 부피를 측정하고, 동일한 부피의 결합 완충액을 상청액에 첨가했다. 이 혼합물을 실온에서 평형이 되도록 했다. 상청액을 0.22㎛ 필터를 통과시켜 깨끗하게 만들었다. GradiFrac 시스템(Pharmacia Biotech)을 사용하여 단백질-G 칼럼에 상청액을 로딩했다. 5-10 칼럼 부피의 결합 완충액으로 칼럼을 세척했다. 용출 완충액을 사용하여 모노클로날 항체를 용출시켜 2ml 부분씩 수집했다. 이 부분들에 대한 OD280 판독을 얻었고, 모노클로날 항체를 함유하는 부분들을 모았다. 3M 트리스를 1/20 부피 첨가하여 용출된 모노클로날 항체 부분을 중화했다. 4℃, 1x PBS 중에서 샘플을 투석했다(교환 당 적어도 3시간에 3번 완충액 교환). 정제된 모노클로날 항체를 멸균여과(0.2uM)하고 2-8℃에서 저장했다.
하이브리도마 상청액으로부터 mu-항-KID3 모노클로날 항체를 정제한 후, 사람 태아 신장세포와의 결합에 대해 그것을 다시 시험했다. 상기 설명된 대로 세포 샘플을 제조하고, 다양한 농도의 정제된 항체와 함께 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 세포를 세척하고 0.1ml 희석액에 다시 현탁한 다음, 4℃에서 30분간 염소 항-마우스 IgG의 FITC 콘쥬게이트 F(ab')2 단편 1㎍과 함께 인큐베이션했다. 세포를 세척하고, 0.5ml FACS 희석액에 다시 현탁한 다음, FACScan 세포분별기(Becton Dickinson; 캘리포니아 샌어제이)를 사용하여 분석했다. FACScan 히스토그램 상에 서 오른쪽으로의 이동은 정제된 항체가 사람 태아 신장세포에 여전히 결합되어 있다는 것을 나타낸다.
다른 실험에서, 생-세포 ELISA를 사용하여 mu-항-KID3와 KID3의 결합을 시험했다. 다음의 방법을 사용했지만, 본 기술분야에 통상 통지된 다른 방법이 이용될 수도 있다. 세포(SKOV3, SKBR3, SKMES, SW480, HT-29, 및 HPAF-II--모두 ATCC(메릴랜드 베데스다)를 조직배양 처리된 96-웰 조직배양 플레이트(Falcon)에서 10% 태아소혈청(FBS) 함유 배지 중에서 컨플루언시까지 성장시켰다. 세포를 세척하여 배양배지를 제거하고, 실온에서 1시간 동안 1% BSA 및 0.1% 나트륨 아지드를 함유하는 Hank 균형 염용액(HBSS) 중에서 원하는 농도로 원하는 항체 50㎕와 함께 인큐베이션했다. 다음에, 세포를 웰 당 HBSS 100㎕로 3회 세척한 후, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 콘쥬게이트된 2차 항체(HBSS로 희석된 웰 당 50㎕)와 함께 실온에서 30분간 인큐베이션했다. 마지막으로, 세포를 HBSS로 3회 세척하고, 색변화 기질(TMB 기질, KPL)을 웰 당 100㎕로 플레이트에 첨가했다. 웰 당 1M 인산 100㎕를 첨가하여 색변화 반응을 중단시켰다. 전개된 플레이트를 O.D.450nm에서 판독했다.
항체 mu-항-KID3를 생성하는 하이브리도마는 ATCC 지정명칭 PTA-4860을 가진다.
실시예 4
면역조직화학법
암환자로부터의 냉동된 조직 샘플을 OCT 화합물 중에 포매한 다음 드라이아이스를 넣은 이소펜탄 중에서 급속냉동시켰다. Leica 3050 CM 마이크로톰을 사용 하여 5㎛ 두께로 동결절편을 잘라내고, 벡타바운드-코팅 슬라이드 위에 해동-장착했다. -20℃에서 에탄올을 사용하여 절편을 고정시키고 실온에서 하룻밤 동안 공기건조시켰다. 고정된 절편을 사용할 때까지 -80℃에 저장했다. 면역조직화학법을 위해 조직 절편을 재생시키는데, 먼저 실온에서 30분간 차단 완충액(PBS, 5% 정상 염소 혈청, 0.1% Tween 20)에서 인큐베이션하고, 다음에 mu-항-KID3와 차단 완충액(1㎍/ml)로 희석된 대조표준 모노클로날 항체와 함께 120분간 인큐베이션했다. 다음에 절편을 차단 완충액으로 3회 세척했다. 결합된 모노클로날 항체를 0.1M 아세트산 나트륨 완충액 pH 5.05 및 0.003% 과산화수소(Sigma cat. No. H1009) 중에서 염소 항-마우스 IgG + IgM (H+L) F(ab')2-퍼옥시다제 콘쥬게이트 및 퍼옥시다제 기질 디아미노벤지딘(1mg/ml, Sigma cat. No. D 5637)을 사용하여 검출했다. 염색된 슬라이드를 헤마톡실린으로 반대염색하고 Nikon 현미경 아래서 시험했다.
어떤 경우, 면역조직화학법에 파라핀 포매된 포름알데히드-고정 조직을 사용한 다음, 적합한 항원 결정소 재생법을 사용했다. 한 그러한 항원 결정소 재생법이 Mangham 및 Isaacson, Histopathology 35:129-33 (1999)에 설명된다. 항원 결정소 재생 및/또는 검출에 대한 다른 방법들도 당업자에 의해 사용될 수 있다. 항원 복원 및 polyMICA 검출을 갖는, 냉동 조직, 또는 적합한 경우에는 고정 조직을 사용하여 수행된 유사한 실험으로부터의 결과가 수행되었다. 항-KID3 항체와 다양한 정상 및 암 조직의 결합을 평가했다. 모든 경우 대조표준 고정 조직에서의 항체 결합을 냉동 조직의 항체 결합과 상관시켰다. 대조표준에서 이 두 가지가 일치하지 않을 경우 냉동 조직으로부터의 결과만을 사용했다.
편의를 위해서, 상이한 공급원으로부터의 냉동 수술 조직을 사용한 몇몇 실험에 대한 결과를 조합한 것의 요약을 하기 표 1에 나타낸다. mu-항-KID3와 결합하는 종양의 수/시험된 총 수를 기재하고, 양성 결합의 퍼센트를 괄호 안에 나타낸다.
Figure 112008076584136-pat00002
KID3 발현을 더 특성화하기 위해 IHC 및 항-KID3 항체를 사용하여 추가의 조직 샘플을 스크리닝했다. 요약하면, 사람의 결장, 위 및 췌장 선암종 임상 샘플의 90% 이상이 항-KID3 항체와 결합했으며, 이는 KID3의 발현을 나타내는 것이다. 평가된 샘플의 64% 이상이 종양 상피에서 전체적으로 균일하게(종양 상피에서 75% 이상 염색에 한정된다) KID3를 발현했다. 전형적으로 상응하는 KID3-양성 선암종이 발생하는 조직들인 다수의 조직에서, 정상 비-각화 상피는 KID3를 다양하게(균일성 대해서 10% 미만) 발현했다. 심혈관, 내분비, 혈림프, 신경근육, 및 중추신경 시스템으로부터의 대부분의 정상 사람 조직은 KID3를 발현하지 않는다. 종양에서의 KID3 발현의 패턴은 상응하는 정상 상피에서와 다르다. 정상 상피에서 KID3 발현의 대부분은 세포질에서 발생하며, 한편 결장 및 위와 같은 정상 분극성 상피에서의 막 KID3 발현은 첨막에 지배적으로 국한된다. 반대로, 위 및 결장 선암종과 같은 종양은 다른 막 도메인에서 KID3를 발현하려는 경향을 가지며, 잘 분화된 종양의 기저막에서부터 잘 분화되지 않은 종양의 전체 막 표면을 가로지른 발현까지 진행한다.
실시예 5
면역조직화학 결과
모노클로날 항체 mu-항-KID3를 사용하여 상이한 종류의 조직으로부터의 다양한 셀라인에 대한 반응성을 시험했다. 약한 양성 염색은 "+"로, 중간 양성 염색은 "++"로, 강한 양성 염색을 "+++"로, 음성 염색은 "-"로 결과를 기록했다.
면역조직화학 결과는 WO 01/43869에 설명된 CellArrayTM 기술을 사용하여 얻었다. 상이한 확립된 셀라인으로부터의 세포를 프로테아제를 사용하지 않고 성장 표면으로부터 제거하고 OCT 화합물에 채워넣어 포매시켰다. 세포를 냉동하고 절편으로 만든 다음, 표준 IHC 프로토콜을 사용하여 염색했다.
mu-항-KID3 항체와 다양한 확립된 사람 정상 셀라인 및 종양 셀라인의 결합에 대한 결과를 편의를 위해 표 2에 편집했다. 표 2에 나타낸 실험은 FACS, 생-세포 ELISA, 및 본원에 설명된 방법을 사용한 CellArrayTM 결합 실험을 포함한다.
Figure 112008076584136-pat00003
Figure 112008076584136-pat00004
Figure 112008076584136-pat00005
실시예 6
mu-항-KID3와 종양 조직 및 정상 조직의 결합
외과적 절제에 의해 얻어진 정상 조직 및 종양 조직(사람)을 실시예 4에서와 같이 냉동하여 장착했다. Leica 3050 CM 마이크로톰을 사용하여 5㎛ 두께로 동결절편을 잘라내고, 벡타바운드-코팅 슬라이드 위에 해동-장착했다. -20℃에서 에탄올을 사용하여 절편을 고정시키고 실온에서 하룻밤 동안 공기건조시켰다. 이 슬라이드를 Nikon 현미경 아래서 시험했다. mu-항-KID3와 조직의 결합을 polyMICATM 검출 키트를 사용하여 측정했다. 1차 항체 mu-항-KID3는 1ug/ml의 최종 농도로 사용했다.
약한 양성 염색은 "1+"로, 중간 양성 염색은 "2+"로, 강한 양성 염색을 "3+"로, 음성 염색은 "-"로 결과를 기록했다. 병소 염색은 "Foc"로 나타낸다. mu-항-KID3를 가진 정상 조직의 염색 결과를 표 3에 나타낸다. 표 4는 mu-항-KID3 항체와 종양 조직 샘플의 결합을 나타낸다.
Figure 112008076584136-pat00006
Figure 112008076584136-pat00007
Figure 112008076584136-pat00008
Figure 112008076584136-pat00009
Figure 112008076584136-pat00010
실시예 7
KID3를 함유하는 단백질의 분리
mu-항-KID3가 반응성인 에피토프를 확인하기 위해서 면역침전(Ippt) 실험을 수행했다. Ippt를 위해 30개의 175cm2 플라스크의 Colo205 세포를 세포용해 완충액을 총 30ml 사용하여 용해했다(플라스크 당 1ml). 트리톤 X-100으로 강화된 Hank 균형 염용액(HBSS+), 프로테아제 억제제 칵테일(5ml 세포용해 완충액 당 1정의 완전 mini EDTA 프리 프로테아제 칵테일(Roche Molecular Biochemicals)), 0.1% 나트륨 아지드, 및 2mM PMSF로 세포용해 완충액을 구성했다. 세포용해액을 24,000xg로 30분간 4℃에서 원심분리한 후, 1ml 단백질 G(Amersham Pharmacia)로 구성된 칼럼 위를 통과시켰다. 다음에 사전-투명해진 Colo205 세포용해액을 단백질 G 흡수 mu-항-KID3(10㎍의 mu-항-KID3를 5㎕의 단백질 G와 함께 실온에서 30분간 미리 인큐베이션했다)와 함께 4℃에서 20시간 동안 인큐베이션했다. 다음에, 이 비드들(사전-투명해진 단백질 G 비드와 단백질 G 흡수 mu-항-KID3 비드 모두)을 세포용해 완충액으로 3회 세척한 후 30㎕ SDS 샘플 완충액(3% SDS, 20% 글리세폴, 10mM DTT, 2% 브로모페놀 블루, 0.1M 트리스, pH 8.0)으로 용출시켰다. 다음에, 용출액 25㎕를 SDS-PAGE로 분해시키고 코마씨 염색을 통해 시각화했다. 또한, 용출액 5㎕를 SDS-PAGE로 분해시키고 니트로셀룰로스로 옮겨서 웨스턴블롯팅했다.
다음에, 블롯을 mu-항-KID3로 프로브한 다음, 웨스턴블롯팅 키트(Invitrogen Cat. No. WB7103)를 사용하여 전개시켜 에피토프 인식을 확인했다. 마우스 IgG에 대한 mu-항-KID3 및 mu-항-KID3 용출액을 사용한 웨스턴블롯팅에 의해, 90kDa에서 250kDa 범위의 mu-항-KID3 용출액에 대해서만 유일한 고도로 당화된 단백질이 관찰되었다. 코마씨 염색에 의해, 약 100kDa 내지 약 200kDa의, mu-항-KID3에 유일한,매우 희미하기는 하지만 고도로 당화된 단백질에 대한 전형적인 얼룩들이 많이 관찰되었다.
SDS-PAGE 겔로부터의 염색된 단백질 밴드를 깨끗한 한쪽 날 메스를 사용하여 절제한 다음 깨끗한 에펜드로프 튜브에 두었다. 절제된 밴드를 -20℃에 저장하고 질량분광법에 의한 단백질 확인에 사용했다.
실시예 8
이단계 질량분광법(MS/MS)를 사용한 mu-항-KID3가 결합하는 에피토프의 특성화
mu-항-KID3가 결합하는 에피토프를 실시예 7에 설명된 대로 분리하고, Kane 등(2002)의 방법에 따라서 이단계 질량분광법을 행했다. 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, 이 겔을 콜로이드상 코마씨 블루 시약(Invitrogen)으로 염색했다. 관심의 단백질을 트립신을 갖는 겔에서 소화시켰다. 이 트립신에 의해 생긴 단백질을, Wu 등(2000)에 설명된 대로, 이온트랩 질량분광기에 장착된 미세모세관 액체 크로마토그래피 MS/MS(Thermo-Finnigan LCDQ DECA XP)에 의해서 서열화했다.
또는 달리, 본 발명의 실시에서는 MALDI 질량분광법과 같은, 다른 통상적으로 공지된 질량분광법을 사용할 수도 있다.
질량분광법 실험으로부터의 결과는 mu-항-KID3 특이적 밴드가 다양한 단백질로 구성된다는 것을 나타냈다.
실시예 9
KID3를 확인하기 위한 다른 특성화 실험
KID3를 갖는 단백질의 탄수화물 특성을 시험하기 위해서, mu-항-KID3에 대해 반응성인 2개의 크기-구별된 단백질 제조물(한 제조물은 85-100kDa 범위의 단백질을 함유했고, 나머지 제조물은 100kDa 이상의 단백질을 함유했다)을 N-글리카나제, O-글리카나제, 시알리아다제, 및 푸코시다제(Prozyme, 캘리포니아)를 사용하여 탈당화를 행했다. 제조자의 프로토콜에 따른 방법을 사용했지만, 본 분야에 통상적으로 알려진 다른 방법도 이용할 수 있다. N-글리카나제로 처리된 85kDa-100kDa 단백질 제조물은 mu-항-KID3를 사용하여 웨스턴블롯 상에서 분해되었을 때 mu-항-KID3 반응성을 나타내지 않았다. N-글리카나제로 처리된 > 100kDa 단백질 제조물은 mu-항-KID3를 사용하여 웨스턴블롯 상에서 분해되었을 때 mu-항-KID3 반응성에서 약 60%의 감소를 나타냈다. N-글리카나제 처리된 > 100kDa 단백질 제조물을 추가로 더 처리한 것은 mu-항-KID3를 사용하여 웨스턴블롯 상에서 분해되었을 때 mu-항-KID3 반응성을 나타내지 않았다. 이들 결과는 KID3가 N-결합 탄수화물일 가능성을 나타내며, 이것은 푸코스를 함유할 수도 있고 함유하지 않을 수도 있다.
KID3를 함유하는 정제된 단백질을 마이크로타이터 웰(NUNC Maxisorb, NUNC)에 고정시키고 1% BSA를 함유하는 HBSS를 사용하여 차단했다. 차단된 플레이트에 비-시알릴화 및 시알릴화 형태의 루이스 항원 LeA, LeB, LeX, 및 LeY(Calbiochem, 캘리포니아 샌디에고)에 대해 발생된 항체를 도입했다. 이들 항체는 20㎍/ml, 50㎍/웰로 사용했고 실온에서 1시간 동안 KID3를 함유하는 단백질과 결합하도록 두었고 차단 완충액으로 희석했다. 1시간의 인큐베이션 시간 후 플레이트를 HBSS로 세척하고, HBSS 중에서 1:1000으로 사용된 HRP 콘쥬게이트 2차 항체(Jackson Immuno- Research Laboratories, Inc., 펜실베니아)를 이 조건에서 반만 플레이트에 도입했다. 나머지 반은 50㎕/웰의 부피로 20㎍/ml로 HRP 콘쥬게이트 스트렙토아비딘(2㎍/ml로)과 비오틴화된 mu-항-KID3의 혼합물에 도입했다. 비오틴화된 mu-항-KID3를 HBSS로 희석하고, 2차 항체와 mu-항-KID3를 모두 실온에서 30분간 플레이트 상에서 상호작용하도록 두었다. 30분의 인큐베이션 시간의 종료 후 플레이트를 HBSS로 세척하고, 100㎕/ml 기질 용액(TMB 기질, KPL, 오하이오 클리블랜드)을 각 웰에 첨가했다. 색변화를 관찰하고, 1M 인산 100㎕를 사용하여 실온에서 5분 후에 중단시켰다. 플레이트를 O.D.450nm에서 판독했다. 이 실험으로부터 얻어진 데이타는 KID3를 발현하는 단백질이 루이스 항원 LeA에 대해 발생된 항체에 의해 인식된다는 것을 나타낸다. 그러나, LeA에 대한 항체는 mu-항-KID3와 동일한 결합 부위에 대해 경쟁할 수 없었다. 이것은 KID3가 LeA와 동시에 발견될 수 있지만 실제로는 루이스 항원 독립적 에피토프라는 것을 나타낸다.
실시예 10
결장암 셀라인에 대한 mu-항-KID3의 효과
다양한 양의 시험 또는 대조표준 정제 항체의 존재 또는 부재하에 성장된 세포 단층을 사용하여, 단층으로 성장했을 때 생체외에서 세포수를 줄이는 항체의 능력을 평가할 수 있으며, 세포수의 변화는 MTT를 사용하여 평가했다. MTT는 미토콘드리아 효소의 활성을 측정하고 이것을 상대적으로 생존할 수 있는 세포수와 상호관련시키는 염료이다. 관심의 세포를 96웰 플레이트에서 10% 태아소혈청으로 보충된 F12/DMEM(1:1) 성장배지 중에서 플레이팅하여 성장시켰다. 다음의 셀라인을 96웰 디시에서 3개 웰씩 다음의 밀도로 플레이팅했다: Colo205 및 Calu3을 각각 1500 및 1800세포/웰로 플레이트. 플레이팅한 후 바로 mu-항-KID3를 첨가했다. 세포를 가습 인큐베이터에서 5% CO2/공기로 5일간 37℃에서 인큐베이션했다. 분석 종료시에 MTT를 PBS(5mg/ml)에서 용해하고 1:10으로 희석하여 웰에 직접 가했다. 플레이트를 다시 인큐베이터에 4시간 동안 두었다. 인큐베이션 후 배지를 제거하고, 100㎕ DMSO를 가하여 MTT 침전물을 용해시켰다. 플레이트를 플레이트 리더에서 540에서 판독했다.
mu-항-KID3는 종창성 세포사의 유발을 통해 용량 의존적 방식으로 결장암세포 Colo205의 성장을 억제했다. 그러나 mu-항-KID3는 10㎍/ml의 최종 농도에서 폐암세포 Calu3(이것에는 mu-항-KID3가 결합하지 않는다)이나 HT29(KID3를 낮은 수준 발현하는 다른 결장암 라인)의 성장을 억제하지 않았다. 이 실시예의 방법에 따라서 항-KID3 항체의 능력을 측정한 몇몇 생체외 실험의 결과를 도 4에 나타낸다.
도 5는 화학요법제 이리노테칸 및 5FU와 조합된 항-KID3 항체의 생체외 활성을 나타낸다.
실시예 11
mu-항-KID3 및 독소-콘쥬게이트 항-마우스 IgG의 내재화
Mab-ZAP(Advanced Targeting Systems, 캘리포니아 샌디에고)는 단백질 합성을 억제하는 독소인 사포린과 콘쥬게이트된 항-마우스 IgG이다. 이 독소는 세포막에 불침투성이다. 만일 모노클로날 항체가 내재화될 수 있는 세포-표면 항원 결정소와 결합된다면, 이 독소-콘쥬게이트는 결합된 모노클로날 항체와 결합하여 내재화될 수 있으며, 결국 세포를 죽일 수 있을 것이다. 독소 활성의 증명을 위한 내재화에 의존하여, Mab-ZAP는 주어진 표면 에피토프가 내재화에 의존하여 세포 독소 효과를 발현하는 어떤 독소에 대한 적합한 표적으로서 작용할 것인지의 여부를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이와 같이, Mab-ZAP는 메이탄시노이드 및 칼리키마이신과 같은 그러한 내재화-의존성 독소에 대한 모델로서 사용된다.
종양세포에 의한 mu-항-KID3 및 사포린 콘쥬게이트 항-마우스 IgG의 내재화 및 사포린의 내재화 후 종양세포를 죽이는 효과를 시험하기 위해서, 사람 결장종양세포 Colo205를 10mM EDTA를 사용하여 스톡 플라스크에서 제거하여 원심분리했다. 세포를 적합한 배지 중에 50,000/ml로 다시 현탁하고 96웰 플레이트에서 웰 당 100㎕씩 플레이팅했다. 항체 mu-항-KID3를 10x 농축물로서 적합한 웰에 즉시 첨가하여 10ug/ml의 최종 농도를 만들었다. 실온에서 15분 후에, Mab-ZAP(Cat. #IT-04, Advanced Targeting Systems, 캘리포니아 샌디에고)를 10x 농축물로서 적합한 웰에 첨가하여 0.001nM 내지 10nM의 최종 농도를 만들었다. 4일간 성장시킨 후 37℃에서 4시간 동안 MTT를 첨가했다(스톡 5mg/ml PBS, 웰에서 1:10 희석). 다음에, 모든 웰에서 배지를 제거하고 100㎕/웰로 DMSO를 첨가했다. 플레이트를 부드럽게 돌려서 청색 MTT 침전물을 용해시키고, 플레이트 리더에서 540nm에서 플레이트를 판독했다.
Mab-ZAP가 0.01nM 이상 첨가되었을 때, mu-항-KID3 부재하에서의 염색과 비교하여, bmu-항-KID3의 존재하에서는 Colo205에서 MTT 염색이 감소했는데, 이는 사람 결장종양세포 Colo205의 성장이 mu-항-KID3 및 Mab-ZAP의 존재하에서 억제되고, mu-항-KID3 및 독소-콘쥬게이트 항-마우스 IgG가 Colo205 내로 내재화되었음을 나타낸다. Mab-ZAP가 10nM로 사용되었을 때 MTT 염색은 약 90% 감소되었으며, 이것은 mu-항-KID3 및 Mab-ZAP의 결합에 의해 Colo205 성장이 약 90% 억제된 것에 해당한다. 이 실시예의 방법에 따른 내재화 실험의 결과를 도 6에 나타낸다.
실시예 12
누드 마우스에서 사람 결장종양(Colo205 및 HT29) 세포에 대한 항-KID3 항체의 효과
사람 결장종양세포를 누드(nu/nu) 마우스의 신장낭 아래에 이식했다. 이 처리된 동물들에서, Colo205 종양세포는 왼쪽 신장에 이식되었고 HT29 종양세포는 오른쪽 신장에 이식되었다. 각 신장에 1개씩 이식했다(콜라겐 겔 중에 500k 세포). 이 이식편을 2일간 성장시켰다. 항-KID3 모노클로날 항체, 클론 mu-항-KID3를 3일째 되는 날 100mg/kg 부하 용량으로 복강내 주사했고, 3번의 후속 용량을 2일 마다 주사했다. 대조표준 마우스에는 식염수만 주사했다. 최종 주사 후 3일째 되는 날 동물을 안락사시키고, 이식편을 가진 신장을 시험했다. 다음에, 이식편과 이식편의 주변 영역을 고정하고 파라핀 블록에 포매시키고, 전체 이식편 영역 전부를 절편으로 만들었다.
유사한 프로토콜을 따르는 다른 실험에서, Colo205 종양(신장낭 아래 콜라겐 겔 중에 500k 세포)를 2일간 자리잡게 한 후, 3일째에 100mg/kg 부하 용량을, 그리고 2일 마다 3-50mg/kg 용량을 주었다. 이들 실험에서는 신장을 최종 용량 후 4일째에 수집했다.
신장낭 모델에 이식된 Colo205 사람 결장종양세포를 갖는 동물 중 일부의 신장을 도 1에 나타낸다. 도 1의 상부 패널은 대조표준(미치료) 동물의 것이고, 하부 패널은 KID3-치료된 동물의 것이다.
도 2는 신장낭 모델에서 항-KID3 항체에 대한 Colo205 결장종양세포의 반응률을 평가한 몇몇 신장낭 실험의 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 이 도면에서는, (CR)은 완전한 반응을 나타내며, 이것은 어떤 절편에서도 종양세포가 보이지 않았다는 것을 의미하고, PR은 부분적 반응을 나타내며, 이것은 결과의 종양 크기가 대조표준의 50% 미만이라는 것을 의미하고, NR은 반응 없음을 나타내며, 이것은 결과의 종양 크기가 대조표준의 50-100%라는 것을 의미한다. 도 1에 나타낸 결과는 부분적 반응자로서 기록되며, Colo205로서 표지된다.
실시예 13
사람 결장종양의 피하 모델에서 KID3 항체의 항종양 효과
이 연구는 결장암의 피하 모델에서 항-KID3 항체에 대한 용량-반응성 항-종양 데이타를 시험하기 위해 설계되었다. 세포독성 화학요법제인 플루오로우라실을 양성 대조표준으로 사용했다.
배양된 Colo205 사람 결장암종세포를 트립신화하고 매지로 세척한 후 회전시켜 배지 ml 당 1억개 세포로(0.05ml 부티 당 5백만개 세포) 배지에 다시 현탁한 다음, 0.1ml의 최종 주사 부피에 대해 동일한 부피의 Matrigel
Figure 112008076584136-pat00011
에서 혼합했다. 이 연구 동안 72마리의 NCR.nu/nu 동종접합 마우스에게 복강내 투약했다. 치료 그룹은 다음과 같다: (1) 0.2ml 식염수 대조표준 매주 2회씩 10회 치료, (2) 50mg/kg 항-KID3 항체 매주 2회씩 10회 치료, (3) 50mg/kg 플루오로우라실(5FU) 매주 1회씩 4회 치료, (4) 35mg/kg 플루오로우라실(5FU) 매주 1회씩 4회 치료, (5) 50mg/kg 항-KID3 항체 매주 2회씩 10회 치료, 더하여 50mg/kg 플루오로우라실(5FU) 매주 1회씩 4회 치료, (6) 50mg/kg 항-KID3 항체 매주 2회씩 10회 치료, 더하여 35mg/kg 플루오로우라실(5FU) 매주 1회씩 4회 치료.
시간에 따른 종양 성장을 평가하여 항-종양 활성을 측정했다. 종양은 치료 개시 전에 촉진될 수 있었다. 항체 치료에 반응한 동물을 치료 중단 후에 계속 사육하여 시간 대 종양 재성장을 측정했다.
이 실험의 결과를 도 3에 나타낸다. 종양세포의 성장을 억제하는데 있어서 모든 치료 그룹이 식염수보다 더욱 효과적이었음을 볼 수 있다.
본원에 설명된 실시예 및 구체예들은 단지 예시의 목적이며, 이들에 비추어 다양한 변형 및 변화가 당업자에게 제안되고, 이 출원의 정신 및 범위 내에 포함될 수 있다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은, 각각의 간행물, 특허 또는 특허출원이 참고자료로 포함되도록 명확하게 개별적으로 표시된 것과 마찬가지로, 동일한 범위의 모든 목적을 위해서 그들 전체가 참고자료로서 본원에 포함된다.
도 1은 신장낭 모델에 이식된 Colo205 사람 결장종양세포를 갖는 동물들 중 일부의 신장을 나타낸다. 도 1에서 상부 패널은 대조표준(미치료) 동물의 것이고, 하부 패널은 치료된 동물의 것이다.
도 2는 신장낭 이종이식편 모델에서 항-KID3 항체의 전신 투여에 따른 Colo- 205 및 HT-29 결장종양세포의 반응률을 나타내는 그래프이다.
도 3은 피하 모델에서 사람 결장종양 셀라인 Colo205에 대한 항-KID3 항체의 효능을 나타낸다.
도 4는 단층으로 성장된 사람 결장암종 셀라인의 항-KID3 항체에 의한 생체외 억제를 예시하는 몇몇 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 화학요법제 이리노테칸(Irinotecan) 및 5FU와 조합된 항-KID3 항체의 생체외 활성을 나타낸다.
도 6은 사람 결장암종 셀라인 Colo205의 성장에 대한 mu-항-KID3 및 Mab-ZAP (사포린과의 항-IgG 콘쥬게이트)의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 천연 신호 서열을 포함하는, 항-KID3 모노클로날 항체 mu-항-KID3의 카파(kappa) 경쇄의 핵산 서열을 나타낸다. 상응하는 단백질 번역이 상기 DNA 서열에는 포함된다.
도 8은 천연 신호 서열을 포함하는, 항-KID3 모노클로날 항체 mu-항-KID3의 G1 중쇄의 핵산 서열을 나타낸다. 상응하는 단백질 번역이 상기 DNA 서열에 포함된다.

Claims (21)

  1. ATCC 기탁번호 PTA-4860을 가지는 하이브리도마에 의해 생산되는 정제된 항-KID3 항체로서,
    KID3는, 결장, 위 및 췌장 암종 세포에 존재하고 분자량 범위가 25 kDa 이상인 막관련 단백질에, N-결합된 탄수화물 에피토프이고, 무친이나 루이스 혈액군 암종-관련 탄수화물이 아닌 것을 특징으로 하는 항체.
  2. 제 1항에 따른 항-KID3 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 사람 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변영역을 포함하고, 상기 항-KID3 항체의 결합 특이성을 가지거나 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 키메라 항체.
  3. 제 1항에 따른 항-KID3 항체의 경쇄로부터의 각각의 3개의 CDR과 제 1항의 항-KID3 항체의 중쇄로부터의 각각의 3개의 CDR을 포함하고, 상기 항-KID3 항체의 결합 특이성을 가지거나 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  4. 제 3항에 있어서, 분리된 항체는 사람화 항체인 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  5. 제 1항에 따른 항-KID3 항체의 단편에 있어서, 상기 단편은 상기 항-KID3 항체의 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역을 포함하고, 상기 항-KID3 항체의 결합 특이성을 가지거나 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 단편.
  6. 제 5항에 있어서, 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv인 것을 특징으로 하는 단편.
  7. 제 1항에 따른 항-KID3 항체의 단편에 있어서, 상기 단편은 상기 항-KID3 항체의 결합 특이성을 가지거나 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 단편.
  8. 제 7항에 있어서, 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv인 것을 특징으로 하는 단편.
  9. 제 1항에 따른 항-KID3 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변영역을 포함하고, 상기 항-KID3 항체의 결합 특이성을 가지거나 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 단일사슬 Fv.
  10. 제 1항에 따른 항-KID3 항체의 중쇄.
  11. 제 1항에 따른 항-KID3 항체의 중쇄의 3개의 CDR을 포함하는 중쇄.
  12. 제 1항에 따른 항-KID3 항체의 경쇄.
  13. 제 1항에 따른 항-KID3 항체의 경쇄의 3개의 CDR을 포함하는 경쇄.
  14. 제 1항 내지 제 4항의 항체 중 어느 한 항에 따른 항체, 제 5항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 단편, 제 10항 또는 제 11항에 따른 중쇄, 또는 제 12항 또는 제 13항에 따른 경쇄 중 어느 하나를 코딩하는 분리된 핵산 서열.
  15. 제 14항에 있어서, 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 핵산.
  16. 제 15항에 있어서, 프로모터 및 핵산은 발현 벡터에 함유되는 것을 특징으로 하는 핵산.
  17. 제 14항에 따른 핵산을 함유하는 벡터로 트랜스펙트, 형질전환, 또는 감염된 셀라인.
  18. a. 제 1항 내지 제 4항의 항체 중 어느 한 항에 따른 정제된 항체, 제 5항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 단편, 제 10항 또는 제 11항에 따른 중쇄, 또는 제 12항 또는 제 13항에 따른 경쇄 중 어느 하나를 발현하는 핵산으로 형질전환된 셀라인을 성장시키는 단계; 및
    b. 발현된 항체, 단편, 중쇄 또는 경쇄를 수집하는 단계
    를 포함하는, 제 1항 내지 제 4항의 항체 중 어느 한 항에 따른 정제된 항체, 제 5항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 단편, 제 10항 또는 제 11항에 따른 중쇄, 또는 제 12항 또는 제 13항에 따른 경쇄 중 어느 하나의 제조방법.
  19. 제약학적으로 허용되는 담체와 함께, 제 1항 내지 제 4항의 항체 중 어느 한 항에 따른 정제된 항체, 또는 제 5항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 단편의 치료적 유효량을 포함하는 암 치료용 제약학적 조성물.
  20. 제 19항에 있어서, 조성물은 추가의 치료적 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  21. ATCC 기탁번호 PTA-4860, 또는 그것의 자손으로 구성된 분리된 셀라인.
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