WO2022196697A1 - 抗ｈｅｒ２抗体及びこれを含有する医薬組成物 - Google Patents

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antibody
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breast cancer
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達郎 入村
陽彦 藤平
伝田 香里 永井
光江 齊藤
義哉 堀本
律子 佐々木
美樹 野地
和宏 鈴木
淳一 赤塚
健一郎 小野
志陽 西田
勝久 松浦
達也 清水
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学校法人順天堂
株式会社医学生物学研究所
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes

Definitions

  • the present invention relates to anti-HER2 antibodies and pharmaceutical compositions containing the same.
  • trastuzumab and pertuzumab which are anti-HER2 antibodies, have been approved for production and used as molecular-targeted antibody drugs for breast cancer.
  • HER2 is a receptor tyrosine kinase that acts on cell proliferation signal transduction similar to epidermal growth factor receptor (EGFR), and is sometimes overexpressed in breast cancer, gastric cancer, etc., and is a cancer cell growth factor. It's becoming Therefore, anti-HER2 antibodies are used as therapeutic agents for HER2-positive breast cancer.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • Non-Patent Documents 1 and 2 antibody drugs containing anti-HER2 antibodies have been reported to have side effects such as cardiac disorders such as heart failure, cardiomyopathy, and arrhythmia in several percent of patients. These side effects are called cardiotoxicity, and are known to occur when anti-HER2 antibodies such as trastuzumab bind to HER2 that is also expressed in normal myocardial cells. (Non-Patent Document 3).
  • An object of the present invention is to provide a new anti-HER2 antibody with reduced side effects on the heart and a pharmaceutical composition containing the same.
  • the present inventor focused on the difference in sugar chains possessed by HER2 and considered whether it would be possible to distinguish between HER2 present in breast cancer cells and HER2 present in cardiomyocytes.
  • the inventors found an anti-HER2 antibody that binds to HER2 but does not bind to HER2 with different sugar chains present in myocardial cells and suppresses the proliferation of breast cancer cells, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides the following inventions [1] to [19].
  • [7] (a) 1 to several CDR1, CDR2 and CDR3 of the immunoglobulin VH chain in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 3 and 4, or in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 3 and 4 and the CDR1, CDR2 and CDR3 of the immunoglobulin VL chain are the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 6, 7 and 8, respectively, or a SEQ ID NO:
  • the anti-HER2 according to any one of [1] to [6], which is a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequences shown in 6, 7 and 8. Antibodies or functional fragments thereof.
  • a pharmaceutical composition comprising a component selected from the anti-HER2 antibody of any one of [1] to [8], a functional fragment thereof, and the antibody-drug conjugate of [9].
  • the pharmaceutical composition of [10] which is a pharmaceutical composition for treating breast cancer.
  • an antibody that does not bind to AOL-non-binding HER2 or AAL-non-binding HER2 and binds to AOL-binding HER2 or AAL-binding HER2, or AOL-binding rather than AOL-non-binding HER2 or AAL-non-binding HER2 A method for producing an anti-HER2 antibody that does not have cardiotoxicity, comprising the step of selecting an antibody highly reactive to HER2-binding or AAL-binding HER2.
  • an antibody that does not bind to AOL-non-binding HER2 or AAL-non-binding HER2 and binds to AOL-binding HER2 or AAL-binding HER2, or AOL-binding rather than AOL-non-binding HER2 or AAL-non-binding HER2 A method for producing an anti-HER2 antibody that reacts with breast cancer cells but does not bind to myocardial cells, comprising the step of selecting an antibody that is highly reactive to HER2-binding or AAL-binding HER2.
  • a method for producing an anti-HER2 antibody that reacts with breast cancer cells and does not bind to cardiomyocytes comprising: [15] an antibody that does not bind to AOL-non-binding HER2 or AAL-non-binding HER2 and binds to AOL-binding HER2 or AAL-binding HER2, or AOL-binding rather than AOL-non-binding HER2 or AAL-non-binding HER2 selecting an antibody highly reactive to HER2-binding or AAL-binding HER2; and A method for producing a pharmaceutical composition for treating cancer, comprising the step of adding said selected antibody to a solution.
  • breast cancer can be safely treated without causing cardiotoxicity.
  • Cardiac toxicity in breast cancer treatment with anti-HER2 antibody is a major cause of discontinuation of treatment. will improve.
  • Anti-HER2 antibody therapy requires continuous monitoring of cardiac function, but the economic effect of avoiding this is also significant.
  • a method for clarifying the difference in sugar chain profile added to HER2 expressed in breast cancer cells and HER2 expressed in cardiomyocytes is shown.
  • a combination of immunoprecipitation and lectin array analysis was used.
  • Lectin array analysis shows that the binding of lectins having specificity to fucose residues is high in breast cancer cell-derived HER2, and that there is no change in the presence or absence of N-glycan in breast cancer cell-derived HER2. This result suggested that it is for O-linked sugar chains.
  • FIG. 2 shows the results of comparing the binding properties of AOL and AAL after electrophoretic fractionation of HER2 immunoprecipitated from the membrane fraction of HER2-high expression breast cancer cells and HER2 immunoprecipitated from the membrane fraction of iPS cell-derived cardiomyocytes. It was found that these lectins have lower binding properties to myocardial cell-derived HER2 than to breast cancer cell-derived HER2.
  • a protocol for obtaining a monoclonal antibody specific for HER2 expressed in breast cancer cells is shown. It shows that breast cancer cell-derived HER2 was purified by immunoprecipitation, further fractionated into AOL-binding and non-binding HER2, and used for screening.
  • HER2-highly expressing breast cancer cells (HCC1419 cells) were used as immunogens to immunize mice, antibody genes were obtained from B cells, and a phage library was constructed as scFv. This library was panned three times with HER2 purified by the method shown in the left panel, and then panned once against HCC1419 cells. In addition, phage clones obtained that bound to non-AOL-binding HER2 were excluded. Multiple clones obtained were recombined into mouse IgG. A comparison of the binding of phage library-derived monoclonal antibodies recombined to mouse IgG to HER2 is shown. Clone D showed high binding to AOL-binding HER2.
  • FIG. 3 shows a comparison of the binding properties of anti-HER2 antibody clone D recombinant to mouse IgG and trastuzumab to HER2-positive breast cancer cells.
  • FIG. 3 shows a comparison of the binding properties of anti-HER2 antibody clone D recombinant to mouse IgG and trastuzumab to iPS cell-derived cardiomyocytes.
  • B7 cardiomyocytes derived from 201B7 iPS cells but with a different differentiation induction method
  • JB7 cardiomyocytes differentiated from iPS cells established from peripheral blood of healthy individuals
  • NP3, NP5 by Trastuzumab Cardiomyocytes differentiated from iPS cells established from the peripheral blood of a patient who underwent treatment but did not show cardiotoxicity
  • SP6, SP10 iPS established from the peripheral blood of a patient who underwent treatment with trastuzumab and showed cardiotoxicity Cardiomyocytes differentiated from cells.
  • Figure 2 shows a comparison of human breast cancer cell killing activity by Trastuzumab, an anti-HER2 antibody (clone D), and an antibody drug conjugate (ADC) with normal human IgG.
  • Figure 2 shows a comparison of human breast cancer cell-killing activity by drug directly conjugated Trastuzumab, anti-HER2 antibody (clone D), antibody drug conjugate (ADC) with normal human IgG.
  • the anti-HER2 antibody of the present invention is an anti-HER2 antibody that binds to HER2 expressed in breast cancer cells but does not bind to HER2 expressed in myocardial cells.
  • the monoclonal antibody that binds to HER2 expressed in breast cancer cells but does not bind to HER2 expressed in myocardial cells, HER2 expressed in breast cancer cells is AOL (Aspergillus oryzae lectin) and AAL lectin. (Aleuria aurantia lectin), but not myocardial cell-derived HER2, was obtained by screening.
  • HER2 expressed in breast cancer cells Distinguishing between HER2 expressed in breast cancer cells and HER2 expressed in cardiomyocytes from the characteristics of the antibody is due to the difference in sugar chains (constitutional changes in the polypeptide due to the addition of breast cancer-specific sugar chains). or recognize the specific sugar chain moieties added).
  • the HER2 portion recognized by the anti-HER2 antibody of the present invention is a portion of a complex of a HER2 polypeptide and a sugar chain that is present in HER2 expressed in breast cancer cells but absent in HER2 expressed in cardiomyocytes, or It is a portion of the HER2 polypeptide whose structure is changed by adding a sugar chain that is present in HER2 expressed in breast cancer cells but not present in HER2 expressed in cardiomyocytes to the HER2 polypeptide to form a complex.
  • the sugar chain is an O-linked sugar chain, has a fucose residue, and has AOL or AAL binding properties.
  • an anti-HER2 antibody of the present invention is an anti-HER2 antibody that binds to AOL-binding HER2 or AAL-binding HER2 and does not bind to AOL-binding HER2 or AAL-binding HER2.
  • the anti-HER2 antibody of the present invention is an antibody that recognizes domain IV
  • it may be an antibody that recognizes the amino acid sequence of domain IV or an amino acid sequence in which one or several amino acids in domain IV are deleted, substituted, or added.
  • the amino acid sequence in which 1 or several amino acids are deleted, substituted or added is preferably an amino acid sequence in which 1 to 4 amino acids are deleted, substituted or added, and 1 to 3 amino acids are A deleted, substituted or added amino acid sequence is more preferred.
  • the identity between the amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added and the amino acid sequence of domain IV is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, and even more preferably 90% or more.
  • the anti-HER2 antibody of the present invention is an antibody that recognizes domain II.
  • anti-HER2 antibody of the present invention include (a) the immunoglobulin VH chain CDR1, CDR2 and CDR3 having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 3 and 4, respectively, or A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, or added in the indicated amino acid sequence, and CDR1, CDR2 and CDR3 of the immunoglobulin VL chain are SEQ ID NOs: 6, 7 and 8, respectively or the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 6, 7 and 8 with one to several amino acids deleted, substituted, or added. is preferred.
  • amino acid sequence in which 1 or several amino acids are deleted, substituted or added is preferably an amino acid sequence in which 1 to 4 amino acids are deleted, substituted or added, and 1 to 3 amino acids are A deleted, substituted or added amino acid sequence is more preferred.
  • the identity between the amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added and the original amino acid sequence is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • the anti-HER2 antibody of the present invention are (b) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or deletion, substitution, or addition of one to several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. and an immunoglobulin VH chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence in which 1 to several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5
  • the amino acid sequence in which 1 or several amino acids are deleted, substituted or added is preferably an amino acid sequence in which 1 to 4 amino acids are deleted, substituted or added, and 1 to 3 amino acids are A deleted, substituted or added amino acid sequence is more preferred.
  • the identity between the amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added and the original amino acid sequence is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • Anti-HER2 antibodies of the present invention may be screened and selected from anti-HER2 antibodies that bind to breast cancer cells but do not bind to myocardial cells, or antibodies that are more reactive to breast cancer cells than to myocardial cells. However, through lectin array analysis, we identified a lectin that binds to breast cancer cells but not to cardiomyocytes.
  • Antibodies highly reactive to the attached HER2 protein more typically antibodies that bind AOL-binding HER2 or AAL-binding HER2 and do not bind AOL-non-binding HER2 or AAL-non-binding HER2, or non-AOL-binding Antibodies that are more reactive to AOL-binding HER2 or AAL-binding HER2 than to AOL-binding HER2 or AAL-non-binding HER2 may be screened and selected.
  • the antibody having higher reactivity to AOL-binding HER2 or AAL-binding HER2 than AOL-non-binding HER2 or AAL-non-binding HER2 is an antibody having reactivity to AOL-binding HER2 or AAL-binding HER2 by ELISA. is generally 1.5-fold or more, preferably 2-fold or more, more preferably 3-fold or more, in reactivity to AOL-non-binding HER2 or AAL-non-binding HER2. Furthermore, using the screened and selected antibody, HER2 protein having a sugar chain specific to breast cancer can be purified from cells such as breast cancer cells, and in the same manner, another new antibody can be obtained. .
  • lectins or antibodies for purifying HER2 proteins to which specific sugar chains have been added may be used singly or in combination.
  • determination and selection of whether or not each cell or HER2 protein binds or has higher reactivity to HER2 protein with a sugar chain specific to breast cancer than to HER2 protein is performed by ELISA method and flow cytometry.
  • FACS surface plasmon resonance
  • SPR surface plasmon resonance
  • isostatic techniques are used to determine, screen and select. These screening and selection processes may be performed in the panning process of the phage play method as described below.
  • Production of an anti-HER2 antibody that reacts with breast cancer cells but does not bind to cardiomyocytes also referred to as "an anti-HER2 antibody that binds to breast cancer cells but does not bind to cardiomyocytes”
  • It can also be regarded as a method or a method for producing an anti-HER2 antibody that does not have cardiotoxicity.
  • a HER2 protein to which a sugar chain specific to breast cancer has been added can be purified by utilizing its binding property (has binding affinity) to a HER2 antibody or lectins such as AOL and AAL.
  • breast cancer cells preferably HCC1419 cells
  • a surfactant or the like according to a standard method to prepare a sample containing HER2 protein (sample derived from membrane fraction).
  • a general commercially available HER2 antibody that does not recognize the difference in glycosylation of HER2 is immobilized on a solid phase immobilization carrier (beads or columns), brought into contact with a sample containing HER2 protein derived from breast cancer cells, and subjected to immunoprecipitation or affinity.
  • a non-lectin-fractionated HER2 protein sample (unfractionated HER2) is obtained from a sample containing HER2 protein by using a column or the like. Furthermore, the sample containing HER2 protein in the non-lectin fraction is brought into contact with a solid-phase carrier (beads or columns) on which lectins such as AOL or AAL are immobilized, and solid-phase HER2 proteins that bind to the labeled lectin are isolated.
  • the HER2 protein purified with such an AOL-immobilized solid-phase carrier that is, purified by using the binding property to AOL, is converted into AOL-binding HER2 (similarly, by using the binding property to AAL).
  • the purified HER2 protein is sometimes referred to as AAL-binding HER2.
  • the HER2 protein contained in the fraction that was not captured by the immobilized carrier (beads or column) to which AOL was bound and was not purified as AOL-binding HER2 from the sample containing HER2 protein in the non-lectin fraction. is sometimes referred to as AOL-non-binding HER2 (similarly, using the binding property to AAL, the HER2 protein that was not purified is referred to as AAL-non-binding HER2).
  • other chromatography columns, filters, ultrafiltration, salting-out, and dialysis may be used in these purification processes, and these may be appropriately combined for purification.
  • Cardiomyocyte-derived HER2 protein was obtained by preparing a membrane fraction sample similarly containing HER2 protein from cardiomyocytes, and using a solid-phase carrier ( beads or column), and immunoprecipitation, affinity column, etc., other chromatography columns, filters, ultrafiltration, salting-out, dialysis, etc. can be used in appropriate combination for purification.
  • a solid-phase carrier beads or column
  • immunoprecipitation, affinity column, etc. other chromatography columns, filters, ultrafiltration, salting-out, dialysis, etc.
  • Breast cancer cells in the present invention are not particularly limited, but cells obtained from tissue determined to be breast cancer or, preferably, HER2-positive breast cancer cells, such as breast cancer cell lines SK-BR-3, AU565, and HCC1419, are particularly preferred. are HER2-high expressing breast cancer cells, eg, HCC1419. (Hereinafter, in this patent, HER2-positive breast cancer cells and HER2-highly expressing breast cancer cells are collectively referred to as HER2-type breast cancer cells.)
  • the cardiomyocytes in the present invention are not particularly limited, but are cells derived from the myocardial tissue of healthy subjects. , immortalized cardiomyocytes, or iPS-derived cardiomyocytes.
  • iPS-derived cardiomyocytes examples include iPS-CM, B7: cardiomyocytes derived from iPS cells 201B7 but with a different differentiation induction method, and JB7: cardiomyocytes differentiated from iPS cells established from the peripheral blood of healthy individuals.
  • NP3, NP5 Cardiomyocytes differentiated from iPS cells established from the peripheral blood of patients who were treated with Trastuzumab but did not show cardiotoxicity
  • SP6, SP10 Patients who were treated with Trastuzumab and showed cardiotoxicity Cardiomyocytes induced to differentiate from iPS cells established from peripheral blood can be used.
  • T0445-C-ACADEMIC immortalized human cardiomyocytes.
  • the antibody of the present invention preferably has the sequence of each CDR of (a) or the sequence of the immunoglobulin VH region and VL region of (b), and the amino acid sequences of regions other than these regions are not particularly limited.
  • the antibodies of the present invention may be mammalian antibodies other than human antibodies, or may be humanized antibodies. More specifically, it is a chimeric antibody consisting of mammals other than humans (non-human animals), for example, mouse or rat antibody heavy and light chain variable regions and human antibody heavy and light chain constant regions.
  • Such antibodies can be obtained by ligating DNA encoding the variable region of a mouse or rat antibody with DNA encoding the constant region of a human antibody, inserting this into an expression vector, and introducing it into a host for production.
  • Humanized antibodies also called reshaped human antibodies, are obtained by grafting the CDRs of mammals other than humans, such as mouse and rat antibodies, to the CDRs of human antibodies, and general genetic recombination techniques are also used.
  • a DNA sequence designed to link the CDRs of a mouse or rat antibody and the framework region (FR) of a human antibody was prepared to have overlapping portions at the ends of several DNA sequences. It is synthesized from oligonucleotides by the PCR method. The resulting DNA is ligated with DNA encoding a human antibody constant region, then incorporated into an expression vector, introduced into a host for production (European Patent Application Publication No.
  • EP239400 International Patent Application Publication No. See WO96/02576).
  • Human antibody FRs linked via CDRs are selected such that the CDRs form good antigen-binding sites. If necessary, the amino acids of the FRs of the variable region of the antibody may be substituted so that the CDRs of the reshaped human antibody form appropriate antigen-binding sites (Sato, K. et al., Cancer Res, 1993, 53 , 851-856.).
  • a method for obtaining human antibodies is also known.
  • non-human animals are immunized with desired antigens or cells expressing desired antigens, preferably AOL-binding HER2 or breast cancer cells, by direct intraperitoneal injection or the like to prepare non-human animal hybridomas, and and humanized antibodies may be generated from the antibody genes thereof, or human lymphocytes may be generated in vitro with the desired antigen or cells expressing the desired antigen, preferably breast cancer cells or AOL-binding HER2
  • Desired human antibodies having antigen-binding activity can also be obtained by sensitizing and fusing the sensitized lymphocytes with human myeloma cells such as U266 (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • desired human antibodies can be obtained by immunizing transgenic animals having an entire repertoire of human antibody genes with desired antigens (WO93/12227, WO92/03918, WO94/02602, WO94/25585, See WO96/34096, WO96/33735).
  • desired antigens WO93/12227, WO92/03918, WO94/02602, WO94/25585, See WO96/34096, WO96/33735.
  • techniques for obtaining human antibodies or non-human animal antibody libraries by panning using human antibody libraries or non-human animal antibody libraries are also known.
  • the variable region of a human antibody or a non-human animal antibody preferably, the antibody gene of a non-human animal immunized with breast cancer cells or AOL-binding HER2
  • scFv single chain antibody
  • Phages that bind to the desired antigen or cells that express the desired antigen can be selected for expression on the surface of the phage.
  • desired antigens or cells expressing desired antigens, preferably breast cancer cells or antibodies-phages that bind to AOL-binding HER2 are simply screened and selected based on their binding and affinity. Instead, cardiomyocytes, cardiomyocyte-derived HER2 proteins, or non-AOL-binding HER2 were mixed with the washing solution for panning, and antibody-phages that bind to cardiomyocytes, HER2 proteins such as cardiomyocytes, or non-AOL-binding HER2 were actively detected.
  • an antibody that binds to breast cancer cells or AOL-binding HER2 but does not bind to HER2 protein of cardiomyocytes, cardiomyocytes, etc. or non-AOL-binding HER2 is obtained. It is possible. Genetic analysis of the selected phage allows determination of the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen. Once the DNA sequence of the scFv that binds to the antigen has been identified, a suitable expression vector can be constructed using the sequence to obtain human antibodies or non-human animal antibodies.
  • a step of directly immunizing a non-human animal a step of preparing a highly diverse antibody gene library from the cells of the non-human animal, a step of preparing an antibody phage display library from the antibody gene library, the antibody phage display Antibodies can be produced by screening antibodies that bind to breast cancer cells or AOL-binding HER2 using a library.
  • the phage display method enables negative selection in the screening process, and may suppress the bias during cell fusion in the hybridoma method.Furthermore, since the antibody gene can be directly obtained, it is possible to humanize it and improve binding characteristics. Therefore, it is more useful for antibody engineering such as antibody modification.
  • the antibody class is not particularly limited, and includes antibodies having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE. Considering ease of purification, etc., IgG is preferable.
  • Functional fragments include low-molecular-weight antibodies such as antibody fragments and modified antibodies.
  • antibody fragments include Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Diabody and the like.
  • the present invention provides antibody drug conjugates (ADCs) in which a drug is attached to an anti-HER2 antibody or functional fragment thereof.
  • Antibody drug conjugates (ADCs) combine drugs (such as radioisotopes, chemotherapeutic agents, and/or toxins) that have cytotoxic or cytostatic effects and/or effects that cause destruction of cells with antigens. Combining the properties of both antibodies and cytotoxic drugs by targeting to the expressing tumor cells (Teicher, BA (2009) Current Cancer Drug Targets 9:982-1004), thereby maximizing efficacy , enhances therapeutic index by minimizing off-target toxicity (Carter, PJ and Senter PD (2008) The Cancer Jour. 14(3):154-169; Chari, R.; V. (2008) Acc.Chem.Res.41:98-107).
  • the drug portion (D) of the antibody drug conjugate (ADC) of the present invention includes those containing anticancer activity. Some embodiments include antibodies conjugated, ie, covalently bound, to drug moieties. In some embodiments, the antibody is covalently attached to the drug moiety through a linker.
  • the antibody-drug conjugates (ADCs) of the present invention selectively deliver effective doses of drugs to tumor tissue, thereby achieving increased selectivity, ie, reduced doses that result in efficacy, while at the same time achieving a therapeutic index of (“therapeutic window”) can be increased.
  • the drug portion (D) of the antibody drug conjugate (ADC) includes any compound, moiety or group that has a cytotoxic or cytostatic effect and/or an effect that causes cell destruction.
  • Drug moieties include radioisotopes, chemotherapeutic agents, and toxins, such as small molecule toxins of bacterial, fungal, plant or animal origin, or enzymatically active toxins.
  • Cytotoxic and cytostatic effects and/or effects that cause cell destruction include tubulin binding, DNA binding or intercalation, and inhibition of RNA polymerase, protein synthesis, and/or topoisomerase. It is not limited to these.
  • Exemplary drug moieties include, but are not limited to, maytansinoids, dolastatins, calicheamicins, pyrrolobenzodiazepines (PBDs), nemorubicin and its derivatives, PNU-159682, anthracyclines, duocarmycins, vinca alkaloids, taxanes, trichothecenes, Included are CC1065, camptothecin, elinafide, and their stereoisomers, isosteres, analogs, and derivatives that have cytotoxic activity.
  • examples of drugs with cytotoxic activity include, but are not limited to, auristatins (e.g., auristatin e, auristatin f, MMAE and MMAF), auromycin, maytansinoids , ricin, ricin A chain, combretastatin, duocarmycin, dolastatin, doxorubicin, daunorubicin, taxol, cisplatin, cc1065, ethidium bromide, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicine, dihydroxyanthracinedione , actinomycin, diphtheria toxin, pseudomonas exotoxin (PE) A, PE40, abrin, abrin A chain, modecin A chain, ⁇ -sarcin, gelonin, mitogellin, restrictocin, phenomycin
  • auristatins e.g.
  • the anti-HER2 antibody or functional fragment thereof of the present invention binds to HER2 expressed in breast cancer cells but does not bind to HER2 expressed in cardiomyocytes. It is useful as a pharmaceutical composition for treating cancer, preferably as a pharmaceutical composition for treating breast cancer, which does not cause cardiotoxicity.
  • a pharmaceutical composition containing the antibody-drug conjugate is also useful as a pharmaceutical composition for treating cancer, preferably a pharmaceutical composition for treating breast cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain the above-described antibody, functional fragment thereof, or antibody-drug conjugate (these are also referred to as "the antibody of the present invention, etc.”), and may be mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. , dissolution, emulsification, encapsulation, freeze-drying, and the like.
  • the manufacturing process includes adding the antibody of the present invention, etc. to a solution.
  • Suitable preparations for oral administration include liquid preparations in which an effective amount of the antibody of the present invention is dissolved in a diluent such as water or physiological saline, capsules, granules, and powders containing an effective amount in the form of solids or granules.
  • a diluent such as water or physiological saline
  • capsules, granules, and powders containing an effective amount in the form of solids or granules Alternatively, tablets, suspensions in which an effective amount is suspended in a suitable dispersion medium, emulsions in which a solution in which an effective amount is dissolved are dispersed and emulsified in a suitable dispersion medium, and the like.
  • the antibody of the present invention, etc. together with pharmaceutically acceptable solvents, excipients, binders, stabilizers, dispersants, etc., can be used as injectable solutions, suspensions, emulsions, creams, It can be formulated into dosage forms such as ointments, inhalants, and suppositories.
  • the antibodies, etc. of the present invention can be dissolved in aqueous solutions, preferably in physiologically compatible buffers such as Hank's solution, Ringer's solution, or physiological saline buffer.
  • the medicaments of the present invention can take such forms as suspensions, solutions, or emulsions in oily or aqueous vehicles.
  • the antibody of the present invention may be produced in the form of powder and an aqueous solution or suspension prepared using sterilized water or the like before use.
  • the antibody or the like of the invention can be powdered and made into a powder mixture with a suitable base such as lactose or starch.
  • Suppository formulations can be prepared by mixing the antibody of the present invention, etc. with a conventional suppository base such as cocoa butter.
  • the medicament of the present invention can be formulated as a sustained release formulation, such as by encapsulating it in a polymer matrix.
  • Example 1 (Identification of lectin) Differentiation induction from 3 types of HER2 type breast cancer cell lines (SK-BR-3, AU565, HCC1419), commercially available immortalized human cardiomyocytes (Applied Biological Materials, T0445-C-ACADEMIC), iPS cells (201B7 strain) Hydrophobic fractions of depleted cardiomyocytes were prepared by CelLytic MEM Protein Extraction Kit (Sigma, CE0050). 125 ⁇ L slurry of Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (Veritas, DB65604; hereinafter referred to as Dyna-SA) was added to 500 ⁇ g of the prepared hydrophobic fraction, shaken at 4° C.
  • Dyna-SA Dynabeads MyOne Streptavidin
  • the hydrophobic fraction after shaking with Dyna-SA and the Dynabeads-Anti-ErbB2 antibody complex after washing with TBSTx were mixed and allowed to react overnight (about 16 hours) at 4° C. (immunoprecipitation).
  • the Dyna-SA-Anti-ErbB2 antibody complex after immunoprecipitation was washed 5 times with 500 ⁇ L of TBSTx, then 250 ⁇ L of 0.2% (w/v) SDS-containing TBS (elution buffer) was added and incubated at 95°C. Immunoprecipitated HER2 was eluted from the Dyna-SA-Anti-ErbB2 antibody complex by incubating for 10 minutes.
  • Example 2 Preparation of scFv antibody phage library
  • scFv and antibody phage display libraries were prepared according to the method described in WO2008/007648. (Hereinafter, unless otherwise specified, the terms are used with the same meanings as in WO2008/007648.)
  • the use of laboratory animals was conducted with the review and approval of the Animal Care and Use Committee of the Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.
  • HER2-high expression breast cancer cells HCC1419 (ATCC: CRL-2326) were expanded using a medium containing RPMI-1640 (Gibco: 11875135) supplemented with 10% FBS (MBL: 268-1). The expanded cultured cells were recovered by centrifugation, washed with phosphate-buffered saline (PBS) containing 25 mM EDTA, and dissolved and suspended to 2.5 ⁇ 10 6 cells. Mice were subcutaneously immunized four times at weekly intervals with this cell solution. Lymph nodes were collected from the immunized mice, and a scFv antibody phage library was prepared by the following procedure.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • RNA was extracted from the immunized mouse lymph node
  • cDNA was synthesized by reverse transcription reaction and PCR was performed using this as a template to obtain cDNA encoding VH chain (VH cDNA) and cDNA encoding VLCL chain (VLCL cDNA).
  • VH cDNA cDNA encoding VH chain
  • VLCL cDNA cDNA encoding VLCL chain
  • a peptide linker for example, highly flexible (GGGGS)3 or the like can be used.
  • assembly PCR (Gibson; et al. (2009).''Enzymatic assembly of DNA molecules up to The scFv gene (5'-[VH cDNA]-[linker DNA]-[VLCL cDNA]) is prepared by randomly ligating by several hundred kilobases').
  • the scFv gene was incorporated into a phagemid vector to prepare an scFv gene library. After transforming the scFv gene library into Escherichia coli, it was superinfected with helper phage to prepare a library of phages displaying various scFvs on their surface (scFv antibody phage library). By the above procedure, two types of scFv antibody phage libraries were prepared separately from the lymph nodes of two immunized mice and mixed.
  • Example 3 (Screening and selection of AOL-binding HER2 antibodies using phage display method) The panning steps of the phage display method are shown in FIGS. In particular, antibody selection was performed according to the methods described in WO2007/042309 and WO2006/122797, etc., unless otherwise stated. Specifically, first, in order to prepare AOL-binding HER2, 100 ⁇ L of the HER2 solution prepared in Example 2, 100 ⁇ L slurry of Dyna-SA, and 10 ⁇ g of biotinylated AOL (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., A2659) were mixed. °C overnight (about 16 hours) with shaking (lectin sedimentation).
  • biotinylated AOL Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., A2659
  • the supernatant after lectin precipitation was collected as AOL-unbound HER2, and the Dyna-SA-AOL complex was washed 5 times with 1 mL of TBSTx and then washed with 100 ⁇ L of 0.2% (w/v) SDS in TBS ( Elution buffer) was added and incubated at 95° C. for 10 minutes to elute the lectin-precipitated HER2 from the Dyna-SA-AOL antibody complex.
  • Add 100 ⁇ L slurry of Dyna-SA to the elution buffer after elution, shake at 4° C. for 1 hour or more to absorb biotinylated AOL that may have been eluted during HER2 elution, and collect the supernatant.
  • AOL-binding HER2 As an antigen, for example, reacting with 100 ⁇ L of magnetic beads (Dynabeads M-270Amine magnetic beads, manufactured by Invitrogen) at room temperature for 1 hour, immobilization, and 1 mL of phosphate buffer solution. Wash 5 times with (PBS). Magnetic beads on which AOL-binding HER2 was immobilized were added to the scFv antibody phage library prepared as described above to allow the scFv antibody phage to bind to the antigen.
  • scFv antibody phage-bound AOL-binding HER2-immobilized magnetic beads were collected and washed several times with PBS. Elute with triethylamine pH 11.5. Escherichia coli was infected with the scFv antibody phage collected as described above and cultured overnight at 37°C. Phage rescue operation from phage-infected E. coli followed a general method (Molecular cloning third. Ed. Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001). The selection rounds described above were repeated three times.
  • the following round of selection was performed once for the purpose of removing non-specific antibody phages that react with undesired AOL non-binding HER2.
  • 21 ⁇ g of AOL-unbinding HER was added to the recovered phages and allowed to react at 4° C. for 1 hour.
  • 5 ⁇ 10 6 HCC1419 cells are added to 500 ⁇ L of PBS to obtain a cell suspension.
  • the reacted phage and cell suspension are mixed, reacted at 4° C. for 1 hour, and then centrifuged at 250 G for 2 minutes to collect the cells.
  • the collected cells are washed with PBS and centrifuged twice, after which phages are eluted from the cells.
  • the recovered phages were infected with E. coli and incubated overnight at 37°C.
  • Example 4 (IgG antibody production) Cloning was performed by preparing a colony plate of the selected E. coli. According to the method described in WO2008/007648, scFv-cp3 fusion proteins of each clone were prepared and reactivity to AOL-binding HER2 and AOL-non-binding HER2 was evaluated by ELISA. Furthermore, each Escherichia coli was cultured, and plasmids were collected (QIAprep Spin MiniPrep kit: manufactured by QIAGEN) and used for nucleotide sequence analysis.
  • clones B, C, D, F 4 clones (clones B, C, D, F) were selected as candidates for antibodies with high AOL-binding HER2 specificity. It was decided to IgG from the scFv-cp3 fusion type.
  • the VH and VLCL fragments of clones B, C, D and F were amplified by PCR using the scFv expression vector as a template while adding a signal sequence and a restriction enzyme recognition sequence.
  • Each of these gene fragments was treated with two types of restriction enzymes, and an H chain vector (pXC18.4: Lonza) and an L chain vector (pXC17.4: Lonza) in which the mouse IgG1CH1, 2, and 3 genes were incorporated in advance. ) into each fragment.
  • the above H chain vector and L chain vector were digested with two types of restriction enzymes, and the H chain vector and L chain vector were ligated to prepare an IgG antibody expression vector. This was introduced into CHO cells, and stable expression cells were obtained by drug selection. The culture supernatant was collected and purified with an affinity column using Protein A (rProtein A Sepharose Fast Flow: Cytiva).
  • the purified protein was confirmed to be a single band by SDS-PAGE, and the protein concentration was determined using NanoDrop (ND-1000: Thermo Scientific).
  • the purified IgG (clones B, C, D and F) obtained above were used in the following experiments.
  • Example 5 (Confirmation of reactivity of IgG antibody (ELISA method)) The activity of the prepared purified IgG was evaluated by ELISA. The reaction pattern and results are shown in FIG.
  • the procedure of the ELISA method can take the following methods. As an antigen, unfractionated HER2, AOL-binding HER2, or AOL-unbinding HER2 was reacted with 100 ⁇ L of magnetic beads (Dynabeads M-270Amine magnetic beads, manufactured by Invitrogen) at room temperature for 1 hour to immobilize, Wash 5 times with 1 mL of phosphate buffered saline (PBS).
  • the prepared IgG antibody was diluted with 100 ⁇ L/well of PBS to a final concentration of 0.5 ⁇ g/mL, and reacted with each antigen-immobilized magnetic bead at room temperature for 1 hour. Collect the used magnetic beads. After washing the beads twice with 100 ⁇ L/well of PBS, a detection antibody obtained by diluting HRP-labeled anti-mouse antibody (MBL: 330) 100 ⁇ L/well with PBS 1,000 times was added to each antigen-immobilized magnetic bead. React for 1 hour at room temperature. Each antigen-immobilized magnetic bead is collected, washed twice with 100 ⁇ L/well of PBS, and 100 ⁇ L/well of substrate solution is added.
  • a substrate solution can be prepared as follows. That is, H 2 O 2 was added to 12 mL of 0.1 M citric acid-disodium hydrogen phosphate (pH 5.1) to a final concentration of 0.01%, and 1 OPD tablet (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. Add. 100 ⁇ L/well of 2N sulfuric acid is added to stop the reaction, and absorbance at 492 nm (sub-wavelength 650 nm) is measured using a plate reader (SUNRISE-BASIC TECAN: TECAN).
  • Example 6 (Amino acid sequence and CDR (complementarity determining region) identification of antibody clone D) Based on the results of nucleotide sequence analysis using the scFv-cp3 fusion protein described in Example 3, the amino acid sequences of the H chain and L chain of antibody clone D and their CDRs (complementarity determining regions) were determined by the method of Kabat et al. (Kabat et al., ''Sequences of Proteins of Immunological Interest'', NIH Publication, 91-3242 (1991).). Table 1 shows the amino acid sequences of the H and L chain CDRs of antibody clone D. In addition, the full-length amino acid sequence of VH of the variable region is shown in SEQ ID NO: 1, and the full-length amino acid sequence of VL of the variable region is shown in SEQ ID NO:5.
  • Example 7 (Confirmation of binding characteristics to cells by FACS) The binding properties of the obtained anti-HER2 antibody (clone D) to several types of HER2-type breast cancer cells and iPS-derived cardiomyocytes were verified by flow cytometry (FACS). All cells were detached from the culture dish with trypsin (0.5 g/L trypsin/0.53 mmol/L EDTA solution, Nacalai Tesque, 32778-34), and the number of cells was counted (Bio-Rad, TC20 total automated cell counter), 2 ⁇ 10 5 cells were used for FACS analysis.
  • trypsin 0.5 g/L trypsin/0.53 mmol/L EDTA solution, Nacalai Tesque, 32778-34
  • the cells were washed twice with 200 ⁇ L of FACS buffer, and Alexa Fluor 488-labeled donkey anti-human IgG antibody (Jackson ImmunoResearch, 709- 545-149) solution was added to the cells in 100 ⁇ L aliquots and incubated on ice for approximately 30 minutes. After that, the cells were washed twice with 200 ⁇ L of FACS buffer, and 100 ⁇ L each of DAPI (Roche, 10236276001) solution suspended in FACS buffer to a final concentration of 1 ⁇ g/mL was added to the cells. No. 355T) and injected into 200 ⁇ L of FACS buffer, and the cell suspension was measured with a flow cytometer (BD FACS Celesta).
  • Alexa Fluor 488-labeled donkey anti-human IgG antibody Jackson ImmunoResearch, 709- 545-149
  • Example 8 Human breast cancer cell-killing activity 1 by antibody drug conjugate (ADC)
  • ADC antibody drug conjugate
  • Trastuzumab, anti-HER2 antibody (clone D), normal human IgG (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 143-09501) were added in 2 ⁇ L each at final concentrations of 100 nM, 20 nM, 4 nM, 800 pM, 160 pM, 32 pM, and 6.4 pM.
  • 2 ⁇ L of culture medium without antibody was added to each well and incubated at room temperature for 5 minutes or longer.
  • Fab fragment of an anti-human IgG Fc specific antibody conjugated to monomethyl auristatin F (MMAF) with cleaveable linker (Moradec, AH-202-AF) was added to 3 wells at a final concentration of 20 nM at 7°C. (5% CO 2 ) for 3 days (approximately 72 hours).
  • Cell viability after culture was measured with the CellTiter96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTT) (Promega, G4100) according to the manufacturer's protocol.
  • MTT Non-Radioactive Cell Proliferation Assay
  • Example 9 Human breast cancer cell-killing activity 2 by antibody drug conjugate (ADC)
  • ADC antibody drug conjugate
  • trastuzumab directly conjugated with MMAE, anti-HER2 antibody (clone D human IgG1 chimera), human chimeric IgG1 antibody at final concentrations of 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1.25 nM, 625 pM, 312.5 pM, 156.25 pM
  • 50 ⁇ L of antibody-free culture medium was added to each well and cultured at 37° C. (5% CO 2 ) for 3 days (about 72 hours).
  • the growth inhibitory effect on HER2-type breast cancer cells or HER2-negative breast cancer cells as shown in FIG.
  • HER2-positive breast cancer cells AU565) shows a growth inhibitory effect on breast cancer cells (HER2-positive breast cancer cells AU565), but on HER2-negative breast cancer cells (HER2-negative breast cancer cells-1; BT-20, HER2-negative breast cancer cells-2; MDA-MB-231) showed no antiproliferative effect.

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Abstract

心毒性のない乳癌治療用抗体医薬を提供する。　本発明は、乳癌細胞に発現するＨＥＲ２に結合し、心筋細胞に発現するＨＥＲ２に結合しない抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片、及びこれを含有する医薬組成物に関する。

Description

抗ＨＥＲ２抗体及びこれを含有する医薬組成物
　本発明は、抗ＨＥＲ２抗体及びこれを含有する医薬組成物に関する。
　乳癌に対する分子標的抗体医薬として抗ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）及びペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）が製造承認され、使用されている。
　ＨＥＲ２は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に類似する細胞増殖のシグナル伝達に作用する受容体型チロシンキナーゼであり、乳癌や胃癌などにおいて、過剰発現している場合があり、癌細胞の増殖因子となっている。従って、抗ＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２陽性乳癌の治療薬として使用されている。
　しかしながら、抗ＨＥＲ２抗体を含有する抗体医薬には、数％の患者において、心不全、心筋症、不整脈などの心障害が現れるという副作用が報告されている（非特許文献１、２）。これらの副作用は心毒性と言われ、トラスツズマブなどの抗ＨＥＲ２抗体が、正常な心筋細胞にも発現するＨＥＲ２に結合することにより生じることが知られている。（非特許文献３）。
Ｃａｎｃｅｒｓ（ＢａｓｅＩ）２０２０　Ｍａｒ．１２（３）；６３６ Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．Ｊｐｎ　Ｅｄ．２０１０；５：６－１２ 医学のあゆみ　ｖｏｌ．２５０　Ｎｏ．３　２０７－２１３
　本発明の課題は、心臓に対する副作用を低減した新たな抗ＨＥＲ２抗体及びこれを含有する医薬組成物を提供することにある。
　そこで本発明者は、ＨＥＲ２が有する糖鎖の違いに着目して、乳癌細胞に存在するＨＥＲ２と心筋細胞に存在するＨＥＲ２とを区別できないかと考え検討した結果、乳癌細胞に存在する糖鎖の異なるＨＥＲ２には結合するが、心筋細胞に存在する糖鎖の異なるＨＥＲ２には結合せず、乳癌細胞の増殖を抑制する抗ＨＥＲ２抗体を見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、次の発明［１］～［１９］を提供するものである。
［１］乳癌細胞に発現するＨＥＲ２に結合し、心筋細胞に発現するＨＥＲ２に結合しない抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片。
［２］乳癌細胞に発現するＨＥＲ２と心筋細胞に発現するＨＥＲ２が、糖鎖が相違するＨＥＲ２である［１］記載の抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片。
［３］乳癌細胞に発現するＨＥＲ２がＯ－結合型糖鎖を有するＨＥＲ２である［１］又は［２］記載の抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片。
［４］乳癌細胞に発現するＨＥＲ２が、フコース残基を含む糖鎖を有するＨＥＲ２である請求項［１］～［３］のいずれかに記載の抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片。
［５］乳癌細胞に発現するＨＥＲ２がＡＯＬ結合性ＨＥＲ２又はＡＡＬ結合性ＨＥＲ２である［１］～［４］のいずれかに記載の抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片。
［６］ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２又はＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に結合し、ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２又はＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２に結合しない抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片。
［７］（ａ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２、３及び４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２、３及び４に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６、７及び８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６、７及び８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである［１］～［６］のいずれかに記載の抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片。
［８］（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する［１］～［７］のいずれかに記載の抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片。
［９］［１］～［８］のいずれかに記載の抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片が、細胞傷害活性を有する薬剤にコンジュゲートされている、抗体薬物コンジュゲート。
［１０］［１］～［８］のいずれかに記載の抗ＨＥＲ２抗体、その機能的断片及び［９］記載の抗体薬物コンジュゲートから選ばれる成分を含有する医薬組成物。
［１１］乳癌治療用医薬組成物である［１０］記載の医薬組成物。
［１２］ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２に結合せず、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に結合する抗体、又は、ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２よりもＡＯＬ結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に対する反応性が高い抗体を選択する工程を含む、心毒性を有さない抗ＨＥＲ２抗体の製造方法。
［１３］ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２に結合せず、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に結合する抗体、又は、ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２よりもＡＯＬ結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に対する反応性が高い抗体を選択する工程を含む、乳癌細胞に反応し、心筋細胞に結合しない抗ＨＥＲ２抗体の製造方法。
［１４］１）乳癌細胞、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２又はＡＡＬ結合性ＨＥＲ２を非ヒト動物に免疫する工程、
　２）前記非ヒト動物の細胞から抗体遺伝子ライブラリーを作製する工程、
　３）前記遺伝子ライブラリーから抗体ファージディスプレイライブラリーを作製する工程
　４）前記抗体ファージディスプレイライブラリーを用い、乳癌細胞、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２又はＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に結合する抗体をスクリーニング・選択する工程を含む、乳癌細胞に反応し、心筋細胞に結合しない抗ＨＥＲ２抗体の製造方法。
［１５］ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２に結合せず、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に結合する抗体、又は、ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２よりもＡＯＬ結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に対する反応性が高い抗体を選択する工程、及び、
　該選択した抗体を溶液に添加する工程を含む、癌治療用医薬組成物の製造方法。
［１６］乳癌細胞、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２又はＡＡＬ結合性ＨＥＲ２を非ヒト動物に免疫する工程、
　非ヒト動物から乳癌細胞、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２又はＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に結合する抗体を単離する工程、及び、
　該単離した抗体を溶液に添加する工程を含む、癌治療用組成物の製造方法。
［１７］乳癌治療用医薬組成物製造のための、［１］～［８］のいずれかに記載の抗ＨＥＲ２抗体、その機能的断片及び［９］記載の抗体薬物コンジュゲートから選ばれる成分の使用。
［１８］乳癌を治療するための、［１］～［８］のいずれかに記載の抗ＨＥＲ２抗体、その機能的断片及び［９］記載の抗体薬物コンジュゲートから選ばれる成分。
［１９］［１］～［８］のいずれかに記載の抗ＨＥＲ２抗体、その機能的断片及び［９］記載の抗体薬物コンジュゲートから選ばれる成分を投与することを特徴とする乳癌の治療方法。
　本発明の抗ＨＥＲ２抗体を用いれば、心毒性を引き起こすことなく、安全に乳癌を治療することができる。抗ＨＥＲ２抗体による乳癌治療における心毒性の発生は、治療継続を中止する大きな原因であるから、心毒性の発生がなければ、抗ＨＥＲ２抗体の治療が継続できることになり、結果的に乳癌の治療効果が向上することになる。抗ＨＥＲ２抗体治療においては心機能を継続的にモニターする必要があるが、これを回避することによる経済的効果も著しい。
乳癌細胞に発現するＨＥＲ２と心筋細胞に発現するＨＥＲ２に付加する糖鎖プロファイルの違いを明らかにする方法を示す。免疫沈降法とレクチンアレイ解析を組み合わせて用いた。 レクチンアレイ解析により、フコース残基に特異性を持つレクチンの結合が乳癌細胞由来のＨＥＲ２で高く、乳癌細胞由来のＨＥＲ２ではＮ－ｇｌｙｃａｎ有無で変化がないことを示す。この結果から、Ｏ－結合型糖鎖に対するものであることが示唆された。 ＨＥＲ２高発現型乳癌細胞の膜画分から免疫沈降したＨＥＲ２とｉＰＳ細胞由来心筋細胞の膜画分から免疫沈降したＨＥＲ２を電気泳動で分画後ＡＯＬ及びＡＡＬの結合性を比較した結果を示す。乳癌細胞由来ＨＥＲ２に比して、心筋細胞由来ＨＥＲ２に対してはこれらのレクチンの結合性が低いことがわかった。 乳癌細胞に発現するＨＥＲ２に特異的なモノクローナル抗体取得のプロトコールを示す。乳癌細胞由来ＨＥＲ２を免疫沈降法により精製し、さらにこれをＡＯＬ結合性と非結合性のＨＥＲ２に分画しスクリーニングに用いたことを示す。 ＨＥＲ２高発現乳癌細胞（ＨＣＣ１４１９細胞）を免疫原として用いてマウスを免疫し、Ｂ細胞から抗体遺伝子を得て、ｓｃＦｖとしてファージライブラリーを作製したことを示す。このライブラリーを左パネルに示す方法で精製したＨＥＲ２にて３回パニングを行ったのち、ＨＣＣ１４１９細胞に対して１回パニングを行った。さらに、得られたファージクローンからＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２に結合するものを除いた。得られた複数のクローンをマウスＩｇＧに組換えた。 マウスＩｇＧに組換えたファージライブラリー由来モノクローナル抗体のＨＥＲ２への結合性の比較を示す。クローンＤ（Ｃｌｏｎｅ Ｄ）はＡＯＬ結合性ＨＥＲ２に高い結合性を示した。トラスツズマブはこの方法によっては結合性を検出できないことが判明した。 マウスＩｇＧに組み替えた抗ＨＥＲ２抗体クローンＤとトラスツズマブのＨＥＲ２陽性乳癌細胞への結合性比較を示す。 マウスＩｇＧに組み替えた抗ＨＥＲ２抗体クローンＤとトラスツズマブのｉＰＳ細胞由来心筋細胞への結合性比較を示す。＊ｉＰＳ－ＣＭ，Ｂ７：由来となるｉＰＳ細胞は２０１Ｂ７であるが分化誘導方法が異なる心筋細胞、ＪＢ７：健常人の末梢血から樹立したｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞、ＮＰ３，ＮＰ５：Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂによる治療を受けたが心毒性を示さなかった患者の末梢血から樹立したｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞、ＳＰ６，ＳＰ１０：Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂによる治療を受けて心毒性を示した患者の末梢血から樹立したｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞。 Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、抗ＨＥＲ２抗体（クローンＤ）、正常ヒトＩｇＧによる抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）によるヒト乳がん細胞殺傷活性の比較を示す。 薬物を直接コンジュゲートしたTｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、抗ＨＥＲ２抗体（クローンＤ）、正常ヒトＩｇＧによる抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）によるヒト乳がん細胞殺傷活性の比較を示す。
　本発明の抗ＨＥＲ２抗体は、乳癌細胞に発現するＨＥＲ２に結合し、心筋細胞に発現するＨＥＲ２に結合しない抗ＨＥＲ２抗体である。
　ここで、乳癌細胞に発現するＨＥＲ２に結合し、心筋細胞に発現するＨＥＲ２に結合しないモノクローナル抗体は、乳癌細胞に発現するＨＥＲ２はＡＯＬ（アスペルギルス・オリゼ由来のレクチン（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　Ｌｅｃｔｉｎ））及びＡＡＬレクチン（ヒイロチャワンタケ由来のレクチン（Ａｌｅｕｒｉａ　ａｕｒａｎｔｉａ　Ｌｅｃｔｉｎ））が結合する糖鎖を持つが、心筋細胞由来のＨＥＲ２は持たないことに基づき、スクリーニングによって得たものである。抗体の特性から見てこれが乳癌細胞に発現するＨＥＲ２と心筋細胞に発現するＨＥＲ２とを見分けるのは、糖鎖の違いを見分けている（乳癌に特異的な糖鎖の付加によるポリペプチドの構造変化又は付加された特異的糖鎖部分を認識する）からであると考えられる。
　本発明の抗ＨＥＲ２抗体が認識するＨＥＲ２部分は、乳癌細胞に発現するＨＥＲ２に存在し、心筋細胞に発現するＨＥＲ２に存在しない糖鎖を含む、ＨＥＲ２ポリペプチドと糖鎖の複合体の部分、又は乳癌細胞に発現するＨＥＲ２に存在し、心筋細胞に発現するＨＥＲ２に存在しない糖鎖が、ＨＥＲ２ポリペプチドに付加し複合体になったことにより、構造が変化したＨＥＲ２ポリペプチドの部分である。
　当該糖鎖は、Ｏ－結合型糖鎖であり、フコース残基を有し、ＡＯＬ又はＡＡＬ結合性を有するという特徴を備える。
　当該糖鎖を含むＨＥＲ２ポリペプチドの部分、又は糖鎖付加したことによるポリペプチド構造が変化した、ＨＥＲ２ポリペプチド部分に、特に限定されないが、トラスツズマブのようなドメインＩＶでもよいし、ペルツズマブのようなドメインＩＩでもよい。
　従って、本発明の抗ＨＥＲ２抗体は、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２又はＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に結合し、ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２又はＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２に結合しない抗ＨＥＲ２抗体である。
　本発明の抗ＨＥＲ２抗体が、ドメインＩＶを認識する抗体である場合、ドメインＩＶのアミノ酸配列又はドメインＩＶにおける１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を認識する抗体であればよい。ここで、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、１～４個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましく、１～３個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列がより好ましい。１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とドメインＩＶのアミノ酸配列の同一性は、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましい。
　ここで、本発明の抗ＨＥＲ２抗体がドメインＩＩを認識する抗体である場合も、同様である。
　本発明の抗ＨＥＲ２抗体の具体例としては、（ａ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２、３及び４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２、３及び４に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６、７及び８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６、７及び８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗ＨＥＲ２抗体であるのが好ましい。
　ここで、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、１～４個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましく、１～３個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列がより好ましい。１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列と元のアミノ酸配列の同一性は、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましい。
　本発明の抗ＨＥＲ２抗体のさらに好ましい具体例としては、（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する抗ＨＥＲ２抗体が挙げられる。
　ここで、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、１～４個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましく、１～３個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列がより好ましい。１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列と元のアミノ酸配列の同一性は、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましい。
　本発明の抗ＨＥＲ２抗体は、抗ＨＥＲ２抗体の中から、乳癌細胞に結合し、心筋細胞に結合しない抗体、又は心筋細胞よりも、乳癌細胞に対する反応性が高い抗体をスクリーニング・選択してもよいが、レクチンアレイ解析により乳癌細胞に結合し、心筋細胞に結合しないレクチンを同定し、そのレクチンを用い、乳癌細胞等の細胞から乳癌に特異的な糖鎖が付加されたＨＥＲ２タンパク質を結合性に基づき、精製し、その乳癌特異的な糖鎖付加ＨＥＲ２タンパク質と選択的に結合し、心筋細胞等のＨＥＲ２に結合しない抗体、又は心筋細胞等のＨＥＲ２タンパク質よりも、乳癌に特異的な糖鎖が付加されたＨＥＲ２タンパク質に対する反応性が高い抗体、より典型的にはＡＯＬ結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に結合し、ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２に結合しない抗体、又はＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２よりもＡＯＬ結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に反応性が高い抗体をスクリーニング・選択してもよい。
　ここで、ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２よりもＡＯＬ結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に対する反応性が高い抗体とは、ＥＬＩＳＡ法で、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に対する反応性がＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２に対する反応性が、通常、１．５倍以上高い、好ましくは２倍以上高い、さらに好ましくは、３倍以上高いものが挙げられる。
　さらには、当該スクリーニング・選択した抗体を用い、乳癌細胞等の細胞から乳癌に特異的な糖鎖が付加されたＨＥＲ２タンパク質を精製し、同様にして、新たな別の抗体を取得することもできる。これら特異的な糖鎖が付加されたＨＥＲ２タンパク質を精製ためのレクチンもしくは抗体は単独で用いても良いが、複数組み合わせても良い。乳癌に特異的な糖鎖の付加がされているか判定するためのレクチン、又は、乳癌細胞に結合し、心筋細胞に結合するレクチンとして、具体的には、Ｏ－結合型糖鎖に結合するもの、フコース残基に結合するものが挙げられるが、好ましくはＡＯＬ及びＡＡＬ、特に好ましくはＡＯＬである。
　この選択過程における、それぞれの細胞又はＨＥＲ２タンパク質に結合する、しない又はＨＥＲ２タンパク質よりも、乳癌に特異的な糖鎖が付加ＨＥＲ２タンパク質に対する反応性が高いことの判定・選択はＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術等定法の技術を用いて判定し、スクリーニング・選択する。
　これらのスクリーニング・選択過程は、後述のようにファージプレイ法のパニングの工程において、行われてもよい。
　なお、以上のようなスクリーニング・選択工程を含んだ、乳癌細胞に反応し、心筋細胞に結合しない抗ＨＥＲ２抗体（「乳癌細胞に結合し、心筋細胞に結合しない抗ＨＥＲ２抗体」ともいう）の製造方法又は、心毒性を有さない抗ＨＥＲ２抗体の製造方法としてとらえることもできる。
　乳癌に特異的な糖鎖が付加されたＨＥＲ２タンパク質は、ＨＥＲ２抗体やＡＯＬ及びＡＡＬなどのレクチンへの結合性（結合親和性を有する）を利用し精製することができる。
　具体的には、乳癌細胞、望ましくはＨＣＣ１４１９細胞を定法により界面活性剤等で処理し、ＨＥＲ２タンパク質を含んだ試料（膜画分由来の試料）を調製する。次に、ＨＥＲ２の糖鎖付加の違いを認識しない一般の市販ＨＥＲ２抗体を固相化担体（ビーズやカラム）に固定化し、乳癌細胞由来のＨＥＲ２タンパク質が存在する試料を接触させ、免疫沈降やアフィニティーカラム等の要領で、ＨＥＲ２タンパク質を含んだ試料から非レクチン分画のＨＥＲ２タンパク質試料（未分画ＨＥＲ２）を得る。さらに、非レクチン分画のＨＥＲ２タンパク質を含む試料を、ＡＯＬ又はＡＡＬなどのレクチンが固定化された固相化担体（ビーズやカラム）に接触させ、免疫沈降やアフィニティーカラム等の要領で、固相化したレクチンに結合性のあるＨＥＲ２タンパク質を分離する。本発明において、このようなＡＯＬ固定化された固相化担体で精製、すなわち、ＡＯＬへの結合性を利用して精製されたＨＥＲ２タンパク質をＡＯＬ結合性ＨＥＲ２（同様にＡＡＬへの結合性を利用し、精製されたＨＥＲ２タンパク質をＡＡＬ結合性ＨＥＲ２）と表記することもある。他方、前記非レクチン分画のＨＥＲ２タンパク質を含んだ試料からＡＯＬを結合させた固相化担体（ビーズやカラム）に捕捉されず、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２として精製されなかった分画に含まれるＨＥＲ２タンパク質をＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２（同様にＡＡＬへの結合性を利用し、精製されなかったＨＥＲ２タンパク質をＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２）と表記することもある。
　なお、これらの精製過程では必要に応じ、その他のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析を用い、これらを適宜組み合わせ精製することができる。
　また、心筋細胞由来のＨＥＲ２タンパク質は、心筋細胞から同様にＨＥＲ２タンパク質を含んだ膜画分の試料を用意し、ＨＥＲ２の糖鎖付加の違いを認識しない一般の市販ＨＥＲ２抗体を固相化担体（ビーズやカラム）に固定化し、免疫沈降やアフィニティーカラム等により、その他のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析を用い、これらを適宜組み合わせ精製することができる。
　本発明における乳癌細胞は特に限定されないが、乳癌と判定された組織から得られる細胞又は、好ましくは、ＨＥＲ２陽性乳癌細胞、例えば、乳癌細胞株ＳＫ－ＢＲ－３、ＡＵ５６５、ＨＣＣ１４１９であり、特に好ましくはＨＥＲ２高発現乳癌細胞、例えば、ＨＣＣ１４１９である。（以下、本特許において、ＨＥＲ２陽性乳癌細胞及びＨＥＲ２高発現乳癌細胞を合わせて、ＨＥＲ２タイプの乳癌細胞ともいう。）本発明における心筋細胞は、特に限定されないが、健常人の心筋組織由来の細胞、不死化心筋細胞、又はｉＰＳ由来心筋細胞である。ｉＰＳ由来心筋細胞として、例えば、ｉＰＳ－ＣＭ、Ｂ７：由来となるｉＰＳ細胞は２０１Ｂ７であるが分化誘導方法が異なる心筋細胞、ＪＢ７：健常人の末梢血から樹立したｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞、ＮＰ３、ＮＰ５：Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂによる治療を受けたが心毒性を示さなかった患者の末梢血から樹立したｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞、ＳＰ６、ＳＰ１０：Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂによる治療を受けて心毒性を示した患者の末梢血から樹立したｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞を用いることができる。不死化ヒト心筋細胞としては、Ｔ０４４５－Ｃ－ＡＣＡＤＥＭＩＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社）を用いることができる。
　本発明の抗体は、前記（ａ）の各ＣＤＲの配列、又は（ｂ）の免疫グロブリンＶＨ領域及びＶＬ領域の配列を有するものが好ましく、これらの領域以外の領域のアミノ酸配列は特に制限されない。従って、本発明の抗体は、ヒト抗体以外の哺乳動物抗体でもよく、ヒト化抗体でもよい。より具体的には、ヒト以外の哺乳動物（非ヒト動物）、例えば、マウスやラット抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなるキメラ抗体であっても良く、この様な抗体はマウスやラット抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウスやラット抗体のＣＤＲをヒト抗体のＣＤＲへ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体例として、マウスやラット抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のＦＲのアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１－８５６．）。
　また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、所望の抗原又は所望の抗原を発現する細胞、望ましくは、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２又は乳癌細胞を非ヒト動物に直接腹腔内注射等により免疫し、非ヒト動物のハイブリドーマを作製し、非ヒト動物の抗体を得て、その抗体遺伝子からヒト化抗体を作製してもよいし、ヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏで所望の抗原又は所望の抗原、望ましくは、乳癌細胞又はＡＯＬ結合性ＨＥＲ２を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１－５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリー又は非ヒト動物の抗体ライブラリーを用いて、パニングによりヒト抗体又は非ヒト動物の抗体ライブラリーを取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体又は非ヒト動物の抗体（望ましくは、乳癌細胞又はＡＯＬ結合性ＨＥＲ２で免疫・感作した非ヒト動物の抗体遺伝子）の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、所望の抗原又は所望の抗原を発現する細胞、望ましくは、乳癌細胞又はＡＯＬ結合性ＨＥＲ２に結合するファージを選択することができる。また、このファージのパニングの過程において、所望の抗原又は所望の抗原を発現する細胞、望ましくは、乳癌細胞又はＡＯＬ結合性ＨＥＲ２に結合する抗体－ファージを結合・親和性に基づきスクリーニング・選択するのみでなく、パニングの洗浄液に心筋細胞または心筋細胞由来のＨＥＲ２タンパク質又は非ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２を混合し、心筋細胞、心筋細胞等のＨＥＲ２タンパク質又は非ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２に結合する抗体―ファージを積極的に吸収・除外（ネガティブセレクション）し、結果として、乳癌細胞又はＡＯＬ結合性ＨＥＲ２に結合する抗体であって、心筋細胞、心筋細胞等のＨＥＲ２タンパク質又は非ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２に結合しない抗体を取得することが可能である。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体又は非ヒト動物の抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。さらに、非ヒト動物の抗体をヒト化することは、前記の通り、公知の方法で可能である。
　本発明の抗体を取得・製造するために、特に、好ましい抗体の取得・製造方法として、糖鎖付加構造のわずかな差を認識する抗体の取得が必要になると見込まれるため、抗原を発現する細胞を直接非ヒト動物に免疫する工程、当該非ヒト動物の細胞から多様性の大きい抗体遺伝子ライブラリーを作製する工程、当該抗体遺伝子ライブラリーから抗体ファージディスプレイライブラリーを作製する工程、当該抗体ファージディスプレイライブラリーを用い、乳癌細胞又はＡＯＬ結合性ＨＥＲ２に結合する抗体をスクリーニングする工程を経て、抗体を製造することが挙げられる。ファージディスプレイ法により、スクリーニング過程でのネガティブセレクションも可能であり、ハイブリドーマ法における細胞融合操作時のバイアスを抑制できる可能性もあり、さらには、抗体遺伝子を直接取得できるので、ヒト化や結合特性向上のため抗体改変など抗体エンジニアリング等に、より有益となる。
　抗体のクラスは特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。精製の容易性等を考慮すると好ましくはＩｇＧである。
　機能的断片としては、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物が挙げられる。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙなどを挙げることができる。
　本発明は、抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片に薬物が結合した抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。
　抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞傷害性又は細胞分裂停止性の効果、且つ／または細胞の破壊を引き起こす効果を有する薬物（放射性同位体、化学療法剤、および／又は毒素等）を、抗原発現腫瘍細胞に標的化することにより、抗体と細胞傷害性薬物両方の特性を組み合わせ（Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｂ．Ａ．（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｔａｒｇｅｔｓ　９：９８２－１００４）、それにより、有効性を最大化し、標的外への毒性を最小化することで治療指数を増強する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ　Ｓｅｎｔｅｒ　Ｐ．Ｄ．（２００８）Ｔｈｅ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｊｏｕｒ．１４（３）：１５４－１６９；Ｃｈａｒｉ，Ｒ．Ｖ．（２００８）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：９８－１０７）。
　本発明の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬物部分（Ｄ）は、抗がん活性を含むものを含む。いくつかの実施態様では、薬物部分に対し、コンジュゲート、即ち共有結合的に結合した抗体を含む。いくつかの実施態様では、抗体は、リンカーを通して薬物部分に共有結合的に結合する。本発明の抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、有効用量の薬物を腫瘍組織へと選択的に送達し、それにより、選択性の増大、即ち効力をもたらす用量の低減を達成すると同時に、治療指数（「治療濃度域」）を増大することができる。
　抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬物部分（Ｄ）は、細胞傷害性又は細胞分裂停止性の効果、且つ／または細胞の破壊を引き起こす効果を有する任意の化合物、部分又は基を含む。薬物部分は、放射性同位体、化学療法剤、および毒素、例えば細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素が含まれる。
　細胞傷害性及び細胞分裂停止性の効果、且つ／または細胞の破壊を引き起こす効果には、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はインタカレーション、及びＲＮＡポリメラーゼ、タンパク質合成、及び／又はトポイソメラーゼの阻害を含むがこれらに限定されない。例示的薬物部分には、限定されないが、メイタンシノイド、ドラスタチン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ネモルビシン及びその誘導体、ＰＮＵ－１５９６８２、アントラサイクリン、ズオカルマイシン、ビンカアルカロイド、タキサン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カンプトテシン、エリナフィド（ｅｌｉｎａｆｉｄｅ）、及び細胞傷害活性を有するそれらの立体異性体、同配体、アナログ、及び誘導体が含まれる。
　さらに、細胞傷害活性（細胞殺傷活性ともいう）を有する薬物の例として限定はされないが、オーリスタチン（例えば、オーリスタチンｅ、オーリスタチンｆ、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）、オーロマイシン（ａｕｒｏｍｙｃｉｎ）、メイタンシノイド、リシン、リシンＡ鎖、コンブレタスタチン、デュオカルマイシン、ドラスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン、カリケアマイシン、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害薬、およびグルココルチコイドおよび他の化学療法剤、並びに放射性同位元素、例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２または２１３、Ｐ３２およびＬｕ１７７を含むＬｕの放射性同位体が挙げられる。抗体はまた、プロドラッグをその活性型に変換する能力を有する抗癌プロドラッグ活性酵素にコンジュゲートされてもよい。
　抗体に薬物及び／又はプロドラッグをコンジュゲートするためのリンカーおよび方法は、当業界で公知であり、例えば、Ｓａｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，（２００３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９－２１５；Ｔｒａｉｌ　ｅｔ　ａｌ．，（２００３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８－３３７；Ｐａｙｎｅ，（２００３）Ｃａｎｃｅｒ　ＣＥＬＬ　３：２０７－２１２；Ａｌｌｅｎ，（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ　２：７５０－７６３；Ｐａｓｔａｎ　ａｎｄ　Ｋｒｅｉｔｍａｎ，（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ　３：（１）０８９－１０９１；Ｓｅｎｔｅｒ　ａｎｄ　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７－２６４　Ｄｅｎａｒｄｏ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９８）Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４（１０）：２４８３－９０を参照の上、実施できる。
　本発明の抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片は、乳癌細胞に発現するＨＥＲ２に結合し、心筋細胞に発現するＨＥＲ２に結合しない抗体であるから、これを含有する医薬組成物は、心筋細胞に作用せず、心毒性を引き起こすことがない癌治療用医薬組成物、好ましくは乳癌治療用医薬組成物として有用である。また、前記抗体薬物コンジュゲートを含有する医薬組成物もまた癌治療用医薬組成物、好ましくは乳癌治療用医薬組成物として有用である。
　本発明の医薬組成物は、前記の抗体、その機能的断片又は抗体薬物コンジュゲート（これらを「本発明抗体等」ともいう）を含有すればよいが、薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化して製造することができる。典型的には、その製造工程に、本発明抗体等を溶液に添加するなどがあげられる。
　経口投与用の好適な製剤は、本発明抗体等を、水、生理食塩水のような希釈剤に有効量溶解させた液剤、有効量を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量を懸濁させた懸濁液剤、有効量を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
　非経口投与用には、本発明抗体等を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、坐剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、本発明の抗体等を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、本発明の医薬は、油性又は水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、又は乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、本発明抗体を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液又は懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、本発明抗体等を粉末化し、ラクトース又はデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、本発明抗体等をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の医薬は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
　次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されない。
［実施例１］
（レクチンの同定）
　３種類のＨＥＲ２タイプの乳癌細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３、ＡＵ５６５、ＨＣＣ１４１９）、市販の不死化ヒト心筋細胞（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社、Ｔ０４４５－Ｃ－ＡＣＡＤＥＭＩＣ）、ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株）から分化誘導した心筋細胞の疎水性画分をＣｅｌＬｙｔｉｃ　ＭＥＭ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ，ＣＥ００５０）により調製した。調製した疎水性画分５００μｇあたり１２５μＬスラリー分のＤｙｎａｂｅａｄｓ　ＭｙＯｎｅ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｔ１（Ｖｅｒｉｔａｓ，ＤＢ６５６０４；以下Ｄｙｎａ－ＳＡと記載）を加え、４℃で１時間以上振とうし、その上清を回収した。並行して、１２５μＬスラリーのＤｙｎａ－ＳＡにビオチン化Ｒａｂｂｉｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ－ＥｒｂＢ２　ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ，ＡＦ１１２９）を１０μｇ加え、４℃で１時間以上振とうし、その後、５００μＬの１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含むＴＢＳ（以下ＴＢＳＴｘと記載）で３回ｂｅａｄｓを洗浄した。Ｒａｂｂｉｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ－ＥｒｂＢ２　ａｎｔｉｂｏｄｙのビオチン化は、Ｂｉｏｔｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２（Ｄｏｊｉｎｄｏ，ＬＫ０３）を用い、製造業者のプロトコールに従って行った。Ｄｙｎａ－ＳＡと振とうした後の疎水性画分とＴＢＳＴｘで洗浄後のＤｙｎａｂｅａｄｓ－Ａｎｔｉ－ＥｒｂＢ２抗体複合体を混合させ、４℃で一晩（約１６時間）反応させた（免疫沈降）。免疫沈降後のＤｙｎａ－ＳＡ－Ａｎｔｉ－ＥｒｂＢ２抗体複合体を５００μＬのＴＢＳＴｘで５回洗浄後、２５０μＬの０．２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含むＴＢＳ（溶出バッファー）を加え、９５℃で１０分間インキュベートすることで、免疫沈降したＨＥＲ２をＤｙｎａ－ＳＡ－Ａｎｔｉ－ＥｒｂＢ２抗体複合体から溶出させた。溶出後の溶出バッファーに１２５μＬスラリー分のＤｙｎａ－ＳＡを加え、４℃で１時間以上振とうし、ＨＥＲ２溶出の際に溶出された可能性のあるビオチン化Ｒａｂｂｉｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ－ＥｒｂＢ２抗体を吸収させ、その上清を回収し、それをＨＥＲ２溶液として用いた。各種細胞株より取得したＨＥＲ２溶液に含まれるＨＥＲ２のタンパク質量を調べるため、ウエスタンブロッティングによる解析を行い、検出されたＨＥＲ２タンパク質のバンド強度を定量し、その結果からＨＥＲ２のタンパク質量が同じになるような各ＨＥＲ２溶液の容量を算出した。算出した容量の各ＨＥＲ２溶液を用いて、レクチンアレイ解析を行った。Ｎ－結合型糖鎖の有無が、各ＨＥＲ２溶液中のＨＥＲ２とレクチンアレイ上のレクチンとの反応に影響するかを調べるため、上記のレクチンアレイ解析と同量のＨＥＲ２溶液に２ｕｎｉｔのＰＮＧａｓｅ　Ｆ（Ｒｏｃｈｅ，１１３６５１６９００１）を加え、３７℃にて一晩（約１６時間）反応させた後、レクチンアレイ解析を行った。レクチンアレイ解析の結果、ＵＥＡ－Ｉ、ＡＯＬ、ＡＡＬというレクチンに対し、心筋細胞由来のＨＥＲ２よりもＨＥＲ２タイプの乳癌細胞由来のＨＥＲ２の方が強く結合することが明らかとなった（図２）。その傾向はＰＮＧａｓｅ　Ｆ処理後により顕著になったことから（図２）、上記の３レクチンはＨＥＲ２上のＯ－結合型糖鎖を認識して結合していると推測される。また、特にＡＯＬとＡＡＬに関しては、ウエスタンブロッティング及びレクチンブロッティングにより、生化学的な実験検証においても、心筋細胞由来のＨＥＲ２よりもＨＥＲ２タイプ乳癌細胞由来のＨＥＲ２に強く結合することが明らかとなった（図３）。
［実施例２］
（ｓｃＦｖ抗体ファージライブラリーの作製）
　以降の実施例における各種遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）、ｓｃＦｖ、抗体ファージディスプレイライブラリーの作製はＷＯ２００８／００７６４８に記載の方法に準じて行った。（以下、特にこだわりのない限り、ＷＯ２００８／００７６４８と同様の用語の意味で用いる。）
　また、実験動物の使用については、株式会社医学生物学研究所動物実験委員会での審査・承認を得て、行った。
　ＨＥＲ２高発現型乳癌細胞ＨＣＣ１４１９（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－２３２６）はＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ：１１８７５１３５）に１０％　ＦＢＳ（ＭＢＬ：２６８－１）を添加した培地を用いて拡大培養した。その拡大培養した細胞を、遠心で回収し、２５ｍＭ　ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄、２．５×１０6細胞となるように溶解懸濁した。この細胞溶液を、マウスの皮下に週１回間隔で４回免疫した。免疫したマウスよりリンパ節を回収し、ｓｃＦｖ抗体ファージライブラリーを以下の手順で作製した。
　免疫したマウスリンパ節より、ＲＮＡを抽出した後、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、これをテンプレートとしてＰＣＲを行ない、ＶＨ鎖をコードするｃＤＮＡ（ＶＨ　ｃＤＮＡ）およびＶＬＣＬ鎖をコードするｃＤＮＡ（ＶＬＣＬ　ｃＤＮＡ）を調製した。
　ペプチドリンカーとしては例えば柔軟性の高い（ＧＧＧＧＳ）３などを用いることができる。例えば、上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡとペプチドリンカーをコードするＤＮＡを用いて、アセンブリＰＣＲ（Ｇｉｂｓｏｎ；ｅｔ　ａｌ．（２００９）．‘‘Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｕｐ　ｔｏ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｈｕｎｄｒｅｄ　ｋｉｌｏｂａｓｅｓ’'）によりランダムに連結し、ｓｃＦｖ遺伝子（５'－［ＶＨ　ｃＤＮＡ］－［リンカーＤＮＡ］－［ＶＬＣＬ　ｃＤＮＡ］）を調製する。ｓｃＦｖ遺伝子をファージミドベクターに組み込み、ｓｃＦｖ遺伝子ライブラリーを調製した。
　ｓｃＦｖ遺伝子ライブラリーを大腸菌に形質転換後、ヘルパーファージを重感染させることにより、様々なｓｃＦｖを表面に提示したファージのライブラリー（ｓｃＦｖ抗体ファージライブラリー）を作製した。
　以上の手順により、免疫したマウス２匹のリンパ節から別々に２種類のｓｃＦｖ抗体ファージライブラリーを作製し、混合した。
［実施例３］
（ファージディスプレイ法を用いたＡＯＬ結合性ＨＥＲ２抗体のスクリーニング・選択）
　ファージディスプレイ法のパニング工程を図４及び５に示す。特に、以下に記載がない限り、ＷＯ２００７／０４２３０９及びＷＯ２００６／１２２７９７等に記載された方法に従って抗体選択を行った。
　具体的には、まずＡＯＬ結合性ＨＥＲ２を調製するために、実施例２で作製したＨＥＲ２溶液１００μＬ、１００μＬスラリーのＤｙｎａ－ＳＡ、１０μｇのビオチン化ＡＯＬ（東京化成工業、Ａ２６５９）を混合し、４℃一晩（約１６時間）振とうした（レクチン沈降）。レクチン沈降後の上清をＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２として回収し、Ｄｙｎａ－ＳＡ－ＡＯＬ複合体は１ｍＬのＴＢＳＴｘで５回洗浄後、１００μＬの０．２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含むＴＢＳ（溶出バッファー）を加え、９５℃で１０分間インキュベートすることで、レクチン沈降したＨＥＲ２をＤｙｎａ－ＳＡ－ＡＯＬ抗体複合体から溶出させた。溶出後の溶出バッファーに１００μＬスラリー分のＤｙｎａ－ＳＡを加え、４℃で１時間以上振とうし、ＨＥＲ２溶出の際に溶出された可能性のあるビオチン化ＡＯＬを吸収させ、その上清を回収し、それをＡＯＬ結合性ＨＥＲ２溶液として用いた。次に、そのＡＯＬ結合性ＨＥＲ２を抗原とし、例えば、磁性体ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２７０Ａｍｉｎｅ　磁性体ビーズ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１００μＬに室温にて１時間反応して固相化し、１ｍＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で５回洗浄する。以上のように作製したｓｃＦｖ抗体ファージライブラリーに、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２を固相化した磁性体ビーズを加えて抗原にｓｃＦｖ抗体ファージを結合させた。
　次に、ｓｃＦｖ抗体ファージが結合したＡＯＬ結合性ＨＥＲ２固相化磁性体ビーズを回収し、数回ＰＢＳで洗浄を行った後、ｓｃＦｖ抗体ファージをＡＯＬ結合性ＨＥＲ２固相化した磁性体ビーズから１００ｍＭトリエチルアミンｐＨ１１．５で溶出する。以上のようにして回収したｓｃＦｖ抗体ファージを大腸菌に感染させ、３７℃で一晩培養した。
　尚、ファージ感染大腸菌からのファージレスキュー操作は一般的な方法に従った（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｔｈｉｒｄ．Ｅｄ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）。
　以上、記載した選択ラウンドを３回繰り返した。
　加えて、目的外のＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２に反応する非特異抗体ファージを除去する目的で、以下の選択ラウンドを１回行った。
　ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２１μｇを上記選択ラウンド後、回収ファージに加え４℃で１時間反応した。ＨＣＣ１４１９細胞を５×１０6個を、ＰＢＳ５００μＬを加え細胞浮遊液とする。その後、反応済みファージと細胞浮遊液を混合し、４℃で１時間反応したのち、２５０Ｇ　２分の遠心分離を行って細胞を回収する。回収した細胞をＰＢＳで洗浄、遠心を２回行ったのち、ファージを細胞から溶出する。以上の選択ラウンドの後、回収したファージは、大腸菌に感染させ、３７℃で一晩培養した。
［実施例４］
（ＩｇＧ抗体作製）
　選択した大腸菌のコロニープレートを作製してクローニングを行った。
　ＷＯ２００８／００７６４８に記載の方法に準じて、各クローンのｓｃＦｖ－ｃｐ３融合タンパクを作製してＡＯＬ結合性ＨＥＲ２およびＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２に対する反応性をＥＬＩＳＡにて評価した。
　さらに、それぞれの大腸菌を培養し、プラスミドを回収（ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　ＭｉｎｉＰｒｅｐ　ｋｉｔ：ＱＩＡＧＥＮ社製）して塩基配列解析に使用した。
　ｓｃＦｖ－ｃｐ３融合タンパクを用いたＥＬＩＳＡ評価および塩基配列解析による重複遺伝子配列クローンを選別した結果、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２特異度の高い抗体の候補として、４クローン（クローンＢ，Ｃ，Ｄ，Ｆ）をｓｃＦｖ－ｃｐ３融合型からＩｇＧ化することを決定した。
　クローンＢ，Ｃ，Ｄ，ＦのそれぞれのＶＨ及びＶＬＣＬ断片として、ｓｃＦｖ発現ベクターをテンプレートに、ＰＣＲによりそれぞれシグナル配列および制限酵素認識配列を付加しながら増幅した。
　これらの遺伝子断片をそれぞれ２種類の制限酵素で処理し、予めマウスＩｇＧ１ＣＨ１，２，３遺伝子を組み込んだＨ鎖用ベクター（ｐＸＣ１８．４：Ｌｏｎｚａ社）及びＬ鎖用ベクター（ｐＸＣ１７．４：Ｌｏｎｚａ社）へ各断片を組み込んだ。
　以上のＨ鎖ベクターとＬ鎖ベクターを２種類の制限酵素で消化し、Ｈ鎖ベクターとＬ鎖ベクターを連結し、ＩｇＧ抗体発現ベクターを作製した。これをＣＨＯ細胞へ導入し、薬剤選択により安定発現細胞を得た。培養上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ（ｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ：Ｃｙｔｉｖａ社）を用いたアフィニティーカラムで精製を行った。精製後のタンパク質はＳＤＳ－ＰＡＧＥによって単一バンドであることを確認し、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＮＤ－１０００：Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてタンパク濃度を決定した。以上で得られた精製ＩｇＧ（クローンＢ，Ｃ，Ｄ，Ｆ）を以下の実験に用いた。
［実施例５］
（ＩｇＧ抗体の反応性の確認（ＥＬＩＳＡ法））
　調製した精製ＩｇＧの活性をＥＬＩＳＡで評価した。反応様式および結果を図５に示す。
　ＥＬＩＳＡ法の手順は、以下の方法をとることができる。抗原として、未分画ＨＥＲ２、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２又はＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２をそれぞれ磁性体ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２７０Ａｍｉｎｅ　磁性体ビーズ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１００μＬに室温にて１時間反応して固相化し、１ｍＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で５回洗浄する。
　調製したＩｇＧ抗体を終濃度０．５μｇ／ｍＬになるよう１００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳで希釈し、上記各々の抗原固相済み磁性体ビーズと室温にて１時間反応させたのち、各々の抗原固相済み磁性体ビーズを回収する。ＰＢＳ１００μＬ／ｗｅｌｌでビーズを２回洗浄した後、続けてＨＲＰ標識抗マウス抗体（ＭＢＬ：３３０）を１００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳで１，０００倍希釈した検出抗体を各々の抗原固相済み磁性体ビーズと室温にて１時間反応する。各々の抗原固相済み磁性体ビーズを回収し、ＰＢＳ１００μＬ／ｗｅｌｌで各々の抗原固相済み磁性体ビーズを２回洗浄し、基質溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ加える。基質溶液は以下のように作製することができる。即ち、１２ｍＬの０．１Ｍクエン酸－リン酸水素２ナトリウム（ｐＨ５．１）に終濃度が０．０１％になるようにＨ2Ｏ2を加え、さらにＯＰＤ錠（和光純薬）を１錠加える。
　２Ｎ硫酸を１００μＬ／ｗｅｌｌ加えて反応を停止し、プレートリーダー（ＳＵＮＲＩＳＥ－ＢＡＳＩＣ　ＴＥＣＡＮ：ＴＥＣＡＮ社）にてそれぞれ４９２ｎｍの吸光度（副波長６５０ｎｍ）を測定する。
　ＥＬＩＳＡ法を用いたＩｇＧ抗体反応性の確認の結果、クローンＤのみが、ＩｇＧ型でもＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２よりもＡＯＬ結合性ＨＥＲ２に対する反応性が高い抗体であることが判明した。（図６）
［実施例６］
（抗体クローンＤのアミノ酸配列・ＣＤＲ（相補性決定領域）同定）
　実施例３で記載したｓｃＦｖ－ｃｐ３融合タンパクを用いた塩基配列解析の結果をもとに、抗体クローンＤのＨ鎖、Ｌ鎖のアミノ酸配列及びそのＣＤＲ（相補性決定領域）をＫａｂａｔらの方法（Ｋａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ．，‘‘Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ’'，ＮＩＨ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，９１－３２４２（１９９１）．）で同定した。
　表１に、抗体クローンＤのＨ鎖およびＬ鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。また、可変領域のＶＨの全長アミノ酸配列を配列番号１、可変領域のＶＬの全長アミノ酸配列を配列番号５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例７］
（ＦＡＣＳによる細胞への結合特性確認）
　取得した抗ＨＥＲ２抗体（クローンＤ）の数種類のＨＥＲ２タイプの乳癌細胞及びｉＰＳ由来心筋細胞に対する結合性をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって検証した。
　いずれの細胞も、トリプシン（０．５ｇ／Ｌ　トリプシン／０．５３ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ溶液、ナカライテスク、３２７７８－３４）で細胞を培養ディッシュから剥離し、細胞数をカウントし（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＴＣ２０全自動セルカウンター）、２×１０5個の細胞をＦＡＣＳ解析に用いた。細胞を２００μＬの０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡと０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）で２回洗浄後、終濃度１０μｇ／ｍＬになるように１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含むＰＢＳ（１％　ＢＳＡ－ＰＢＳ）中に懸濁したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、抗ＨＥＲ２抗体（クローンＤ）、正常ヒトＩｇＧの溶液を各々１００μＬずつ細胞に添加し、氷上で約３０分間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄後、終濃度２．５μｇ／ｍＬになるように１％　ＢＳＡ－ＰＢＳ中に懸濁したＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８標識ロバ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，７０９－５４５－１４９）溶液を１００μＬずつ細胞に添加し、氷上で約３０分間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄後、終濃度１μｇ／ｍＬになるようにＦＡＣＳバッファー中に懸濁したＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ，１０２３６２７６００１）溶液を１００μＬずつ細胞に添加し、ナイロンメッシュ（Ｎ－Ｎｏ．３５５Ｔ）を通して２００μＬのＦＡＣＳバッファーに注入し、その細胞懸濁液をフローサイトメーター（ＢＤ　ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ）にて測定した。測定結果はＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ）にて解析した。
　解析の結果、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂと抗ＨＥＲ２抗体（クローンＤ）の両方がＨＥＲ２タイプの乳癌細胞には結合することが明らかとなった（図７）。一方で、ｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞に対する結合性は、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂが全ての心筋細胞に結合するのに対し、抗ＨＥＲ２抗体（クローンＤ）は結合しないことが明らかとなった（図８）。つまり、抗ＨＥＲ２抗体（クローンＤ）はＨＥＲ２タイプの乳癌細胞に発現するＨＥＲ２には結合するが、心筋細胞上に発現するＨＥＲ２には結合しないことが明らかとなった。
［実施例８］
（抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）によるヒト乳がん細胞殺傷活性１）
　ＨＥＲ２タイプの乳癌細胞を１×１０5個／ｍＬの濃度に調整し、１００μＬ／ウェルでコラーゲンＩコート９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ、４８６０－０１０）に播種し、３７℃（５％ＣＯ2）で一晩（約１６時間）培養した。Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、抗ＨＥＲ２抗体（クローンＤ）、正常ヒトＩｇＧ（富士フイルム和光純薬、１４３－０９５０１）を、終濃度が１００ｎＭ、２０ｎＭ、４ｎＭ、８００ｐＭ、１６０ｐＭ、３２ｐＭ、６．４ｐＭになるように２μＬずつウェルに添加し、コントロールとしては抗体無しの培養液を２μＬずつウェルに添加し、室温で５分以上インキュベートした。Ｆａｂ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　Ｆｃ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｔｏ　ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ　ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ　Ｆ（ＭＭＡＦ）　ｗｉｔｈ　ｃｌｅａｖａｂｌｅ　ｌｉｎｋｅｒ（Ｍｏｒａｄｅｃ社、ＡＨ－２０２－ＡＦ）を終濃度が２０ｎＭになるように２μＬずつウェルに添加し、３７℃（５％ＣＯ2）で３日（約７２時間）培養した。
　培養後の細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６　Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ（ＭＴＴ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ４１００）で製造業者のプロトコールに従って測定した。この際、コントロールとして抗体無しの培養液を添加したウェルの吸光度を細胞生存率１００％とし、各条件における細胞生存率を算出した。吸光度はＳｙｎｅｒｇｙ　ＬＸ　Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ　Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ社製）にて測定した。
　その結果、図９に示すように、本発明の抗ＨＥＲ２抗体は、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂに匹敵し、乳癌細胞ＳＫ－ＢＲ－３に対する増殖抑制効果を示した。
［実施例９］
（抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）によるヒト乳がん細胞殺傷活性２）
　以下の抗体への薬剤コンジュゲートの方法、細胞の調製法及び抗体とのインキュベーションを除き、［実施例８］に準じ、ＨＥＲ２タイプの乳癌細胞またはＨＥＲ２陰性乳癌細胞への増殖抑制効果を比較した。
（１）抗体への薬剤コンジュゲートの方法
　各抗体にＮＨＳ（スクシンイミジル）エステル法により、薬剤ＭＭＡＥ直接標識を行った。具体的には、クローンＤおよび、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、陰性コントロール：ヒトキメラＩｇＧ１の精製抗体をそれぞれ５０μｇ準備し、緩衝液を０．１Ｍリン酸バッファーｐＨ８．６に置換を行った。ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ－ＰＥＧ４－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ社製：ＢＰ－２５５０３）２５０μｇと２５℃で２時間反応して標識後、ＰＢＳに置換した。
（２）細胞の調製法、抗体とのインキュベーション
　ＨＥＲ２タイプの乳癌細胞またはＨＥＲ２陰性乳癌細胞を１×１０５個／ｍＬの濃度に調整し、５０μＬ／ウェルでコラーゲンＩコート９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ、４８６０－０１０）に播種し、３７℃（５％ＣＯ2）で一晩（約１６時間）培養した。ＭＭＡＥを直接コンジュゲートしたＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、抗ＨＥＲ２抗体（クローンＤヒトＩｇＧ１キメラ）、ヒトキメラＩｇＧ１抗体を、終濃度が２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭ、６２５ｐＭ、３１２．５ｐＭ、１５６．２５ｐＭになるように５０μＬずつウェルに添加し、コントロールとしては抗体無しの培養液を５０μＬずつウェルに添加し、３７℃（５％ＣＯ2）で３日（約７２時間）培養した。
　その結果、ＨＥＲ２タイプの乳癌細胞またはＨＥＲ２陰性乳癌細胞への増殖抑制効果は、図１０に示すように、本発明の抗ＨＥＲ２抗体は、ＭＭＡＥと直接コンジュゲートした時、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂと同様にＨＥＲ２タイプの乳癌細胞(ＨＥＲ２陽性乳癌細胞ＡＵ５６５)に対して増殖抑制効果を示すが、ＨＥＲ２陰性乳癌細胞（ＨＥＲ２陰性乳癌細胞－１；ＢＴ－２０、ＨＥＲ２陰性乳癌細胞－２；ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）に対しては増殖抑制効果を示さなかった。

Claims (19)

  1. 　乳癌細胞に発現するＨＥＲ２に結合し、心筋細胞に発現するＨＥＲ２に結合しない抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片。
  2. 　乳癌細胞に発現するＨＥＲ２と心筋細胞に発現するＨＥＲ２が、糖鎖が相違するＨＥＲ２である請求項１記載の抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片。
  3. 　乳癌細胞に発現するＨＥＲ２がＯ－結合型糖鎖を有するＨＥＲ２である請求項１又は２記載の抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片。
  4. 　乳癌細胞に発現するＨＥＲ２が、フコース残基を含む糖鎖を有するＨＥＲ２である請求項１～３のいずれか１項記載の抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片。
  5. 　乳癌細胞に発現するＨＥＲ２がＡＯＬ結合性ＨＥＲ２又はＡＡＬ結合性ＨＥＲ２である請求項１～４のいずれか１項記載の抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片。
  6. 　ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２又はＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に結合し、ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２又はＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２に結合しない抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片。
  7. 　（ａ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２、３及び４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２、３及び４に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６、７及び８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６、７及び８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項１～６のいずれか１項記載の抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片。
  8. 　（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する請求項１～７のいずれか１項記載の抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項記載の抗ＨＥＲ２抗体又はその機能的断片が、細胞傷害活性を有する薬剤にコンジュゲートされている、抗体薬物コンジュゲート。
  10. 　請求項１～８のいずれか１項記載の抗ＨＥＲ２抗体、その機能的断片及び請求項９記載の抗体薬物コンジュゲートから選ばれる成分を含有する医薬組成物。
  11. 　乳癌治療用医薬組成物である請求項１０記載の医薬組成物。
  12. 　ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２に結合せず、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に結合する抗体、又は、ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２よりもＡＯＬ結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に対する反応性が高い抗体を選択する工程を含む、心毒性を有さない抗ＨＥＲ２抗体の製造方法。
  13. 　ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２に結合せず、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に結合する抗体、又は、ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２よりもＡＯＬ結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に対する反応性が高い抗体を選択する工程を含む、乳癌細胞に反応し、心筋細胞に結合しない抗ＨＥＲ２抗体の製造方法。
  14. 　１）乳癌細胞、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２又はＡＡＬ結合性ＨＥＲ２を非ヒト動物に免疫する工程、
    　２）前記非ヒト動物の細胞から抗体遺伝子ライブラリーを作製する工程、
    　３）前記遺伝子ライブラリーから抗体ファージディスプレイライブラリーを作製する工程、
    　４）前記抗体ファージディスプレイライブラリーを用い、乳癌細胞、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２又はＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に結合する抗体をスクリーニング・選択する工程を含む、乳癌細胞に反応し、心筋細胞に結合しない抗ＨＥＲ２抗体の製造方法。
  15. 　ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２に結合せず、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に結合する抗体、又は、ＡＯＬ非結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ非結合性ＨＥＲ２よりもＡＯＬ結合性ＨＥＲ２若しくはＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に対する反応性が高い抗体を選択する工程、及び、
    　該選択した抗体を溶液に添加する工程を含む、癌治療用医薬組成物の製造方法。
  16. 　乳癌細胞、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２又はＡＡＬ結合性ＨＥＲ２を非ヒト動物に免疫する工程、
    　非ヒト動物から乳癌細胞、ＡＯＬ結合性ＨＥＲ２又はＡＡＬ結合性ＨＥＲ２に結合する抗体を単離する工程、及び、
    　該単離した抗体を溶液に添加する工程を含む、癌治療用組成物の製造方法。
  17. 　乳癌治療用医薬組成物製造のための、請求項１～８のいずれかに記載の抗ＨＥＲ２抗体、その機能的断片及び請求項９記載の抗体薬物コンジュゲートから選ばれる成分の使用。
  18. 　乳癌を治療するための、請求項１～８のいずれかに記載の抗ＨＥＲ２抗体、その機能的断片及び請求項９記載の抗体薬物コンジュゲートから選ばれる成分。
  19. 　請求項１～８のいずれかに記載の抗ＨＥＲ２抗体、その機能的断片及び請求項９記載の抗体薬物コンジュゲートから選ばれる成分を投与することを特徴とする乳癌の治療方法。
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