JPWO2014073641A1 - トランスフェリン受容体を特異的に認識できる抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、7であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(2)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、8であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(3)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、9であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(4)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、10であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(5)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、11であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(6)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、12であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(7)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、13であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(8)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、14であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(9)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、15であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(10)重鎖が配列番号16を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(11)重鎖が配列番号17を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(12)重鎖が配列番号18を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(13)重鎖が配列番号19を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(14)重鎖が配列番号20を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(15)重鎖が配列番号21を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(16)重鎖が配列番号22を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(17)重鎖が配列番号23を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(18)重鎖が配列番号24を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(19)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号25である抗体:
(20)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号26である抗体:
(21)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号28である抗体:
(22)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号29である抗体:
(23)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号31である抗体:
(24)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号32である抗体:
(25)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号34である抗体:
(26)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号36である抗体:
(27)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号37である抗体:
(28)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号38である抗体:
(29)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号40である抗体:
(30)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号41である抗体:
(31)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号42である抗体:
(32)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、52、3であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(33)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、53、3であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(34)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、54、3であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
好ましくは、本発明の抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(Diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)およびCDRを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である。
本発明によれば、上記した本発明のDNAを含有する組換えベクターが提供される。
本発明によれば、上記した本発明の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株が提供される。
本発明によれば、上記した本発明の形質転換株を培地に培養し、培養物中に本発明の抗体を生成蓄積させ、培養物から抗体を採取することを含む、本発明の抗体の製造方法が提供される。
本発明によれば、抗体に細胞傷害性物質が結合している上記医薬組成物が提供される。
好ましくは、細胞傷害性物質が薬剤、毒素、又は放射性物質である。
好ましくは、本発明の医薬組成物は抗がん剤として使用される。
好ましくは、固形がんが肺がん、大腸がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がんである。
好ましくは、血液がんが白血病、リンパ腫、骨髄腫である。
更に好ましくは、血液がんが成人T細胞白血病(ATL)である。
本発明によればさらに、医薬組成物又は抗がん剤の製造のための、上記した本発明の抗体の使用が提供される。
定義および一般的技術
本明細書において別段定義しない限り、本発明に関して使用した科学技術用語は、当業者に通常理解されている意味を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して使用した命名法およびその技術は、当技術分野で周知のものであり、通常使用されている。
ヒトトランスフェリン受容体(TfR)は人三番染色体にコードされる760アミノ酸から構成される一回膜貫通型タンパクである(配列番号51)。このタンパクはCD71抗原としても知られ、細胞の鉄の取り込みに関与し、細胞の増殖に関与すると考えられている。本発明のTfRは、構造上特別に限定せず、単量体、多量体、細胞膜に発現しているintact form、細胞外領域に構成された可溶化form、truncted form、また、遺伝子の変異や、欠損などによりmutation form、リン酸化などにより翻訳後修飾を受けたformなども含め、すべてヒトTfRを意味する。
本明細書において、「反応する」と「反応性」は特別に示さない限り、同じのことを意味する。すなわち、抗体が抗原を認識すること。この抗原は、細胞膜に発現するintact TfRでもよいし、truncted formや、可溶化formでも良い。また、立体構造を保ったTfRでもよいし、変性したTfRでもよい。反応性を検討する手段として、フローサイトメーター(FACS)、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、western−blot、蛍光微量測定技術(FMAT)表面プラズモン共鳴(BIAcore)、免疫染色、免疫沈降などが挙げられる。
本明細書では必要に応じて、慣習に従い以下の略号(括弧内)を使用する。
重鎖(H鎖)、軽鎖(L鎖)、重鎖可変領域(VH)、軽鎖可変領域(VL)、相補性決定領域(CDR)、第1相補性決定領域(CDR1)、第2相補性決定領域(CDR2)、第3相補性決定領域(CDR3)重鎖の第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖の第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖の第3相補性決定領域(VH CDR3)軽鎖の第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖の第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖の第3相補性決定領域(VL CDR3)。
(1)ファージディスプレイライブラリーにより抗原と反応するscFv
本発明の抗体の取得は、当技術分野で知られているいくつかの方法に従って調製することができる。例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、TfRに対する親和性が様々である抗体のレパートリーを含むライブラリーを提供することができる。次いで、これらのライブラリーをスクリーニングして、TfRに対する抗体を同定し単離することができる。好ましくは、ファージライブラリーは、ヒトB細胞から単離されたmRNAから調製されたヒトVLおよびVHcDNAを使用して生成されるscFvファージディスプレイライブラリーである。そのようなライブラリーを調製しスクリーニングする方法は当技術分野で知られている。ヒトTfRを抗原としてスクリーニングした反応性を示すファージクローンから遺伝物質を回収する。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするVH及びVLのDNA配列を決定することができる。このscFvの配列を用いて、scFvをIgG化すれば、ヒト抗体を取得することができる。
H鎖またL鎖の発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製によりヒト抗体を取得する。また、VH及びVLを同一ベクターに発現すること(タンデム型)によりヒト抗体の取得もできる。これらの方法は周知であり、WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、W093/19172、WO95/01438、WO95/15388、WO97/10354などを参考にすることができる。
本発明の抗体を基にして又は本発明の抗体をコードする遺伝子の配列情報を基にして抗体断片を作製することができる。抗体断片としてはFab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体が挙げられる。
本発明によれば、本発明の抗体を含有する医薬組成物が提供される。本発明一つの実施形態としてはがんの治療であるが、これに限らない。TfRの高発現によるがん以外の疾患でも本発明の範囲以内である。更に好ましい実施形態としてがんは、固形癌(例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がんなど)、または血液がん(例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫など)である。本発明の他の好ましい実施形態では、がんは成人T細胞白血病(ATL)である。
抗体に結合させる薬剤は、がん細胞に傷害をもたらす公知の物質を用いることができる。例としては例えばデュオカルマイシン、デュオカルマイシンのアナログ及び誘導剤、CC−1065、CBIを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、MCBIを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、CCBIを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ドキソルビシン、ドキソルビシンコンジュゲート、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン、ドレスタチン−10、コンブレタスタチン、カリケアマイシン(calicheamicin)、メイタンシン、メイタンシンアナログ、DM1,DM2,DM3,DM4、DMI、アウリスタチンE、アウリスタチンEB(AEB)、アウリスタチンEFP(AEFP)、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、5−ベンゾイルバレリン酸AEエステル(AEVB)、チューブリシン、ジソラゾール、エポシロン、パクリタキセル、ドセタキセル、SN−38、トポテカン、リゾキシン、エキノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エストラムスチン、セマドチン、エリューテロビン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、5−フルオロウラシル、6−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、リューロシン、リューロシダイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシンコンジュゲート、マイトマイシンC、マイトマイシンA、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン誘導体、エトポシド、エトポシドリン酸塩、ビンクリスチン、タキソール、タキソテールレチノイン酸、酪酸、N8−アセチルスペルミジン並びにカンプトセシン等をあげることができるが、これだけに限定されるわけではない。
抗体と放射性物質の結合は、当業者公知の方法により行うことができる(Bioconjug Chem. 1994 Mar-Apr;5(2):101-4.)。
(1)癌細胞に結合するファージ抗体のスクリーニング(肝癌細胞株HepG2)
HepG2細胞を15cm デイッシュで培養し、2mg/mLcollagenaseI/ cell dissociation Buffer(Gibco BRL)によりデイッシュから剥離した。細胞を回収し、冷却したPBSで洗浄した後、1×1013cfuのヒト抗体ファージライブラリーを混ぜ、最終容積1.6mLになるように反応液(1%BSA、0.1%NaN3、MEM)を添加し、4℃にて4時間ゆっくり回転させて反応させた。反応終了後、反応液を二つに分け、それぞれに事前に用意した0.6mLの有機溶液(dibutyl phtalate cycloheximide9:1)を重層し、マイクロ遠心機により2分間遠心(3000rpm)した。上清を捨て、チューブの底に沈降した細胞を0.7mLの1%BSA/MEMで懸濁し、更に0.7mLの有機溶媒を重層した。同じように遠心により上清を捨て、細胞を0.3mLのPBSで懸濁し、液体窒素で凍結した(特許文献19、WO2008/007648)。
3rdスクリーニングしたファージを回収し、既存法によりDNA配列を解析し、欠損領域を保持する不完全な抗体や配列が重複する抗体を排除し、独立した抗体配列を持つファージ抗体を取得した(特許第4870348を参照)。
(1)可溶性TfR抗原産生細胞の作製
癌細胞株MIAPaCa2, SKOV−3を用いて、TfRのcDNAをPCR法により作製した。常法によりTfR 細胞外ドメインのcDNAを調整し、pCMV-Script(クロンテク社製)に挿入することにより、可溶性TfR抗原発現ベクターを作製した。この発現ベクターを細胞株293Tへ導入し、可溶性TfR抗原を産生する発現細胞を作製した。
上記可溶性TfR産生細胞の上清を回収し、精製により可溶性TfR抗原を取得した。この可溶性TfR抗原を用いてELISAによる抗原抗体の反応性を検討した。すなわち、可溶性TfR抗原をPBSで10μg/mLになるように調整し、Immuno Module/Strip Plates(NUNK)に50μL/wellに添加し、37℃で2時間静置した。その後、可溶性TfR抗原を捨て、Blocking液(5% スキムミルク / 0.05% NaN3/ PBS)200μL/wellで添加し、37℃で2時間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除き、PBSにより洗浄し、上記(表1)ファージの培養上清を100μL/well添加し、37℃で1時間反応させた。PBSで5回洗浄後、PBS/0.05%Tween20で希釈した1μg/mLRabbit anti−cp3を100μL/well添加し、37℃で1時間反応させた。PBSで5回洗浄後、更にPBS/0.05%Tween20で2000倍希釈したanti−Rabbit IgG(H+L)−HRPを100μL/well添加し、37℃で1時間反応させた。PBSで5回洗浄後、OPD in 0.1Mクエン酸リン酸バーファー(pH5.1)+0.01%H2O2 を100μL/well添加し室温で5分間反応させた。 2NH2SO2を100μL/well加え、発色反応を停止した。その後、SPECTRAmax340PC(Molecular Devices)にて492nmの吸光度を測定した。その結果、1863株のファージの中、可溶性TfR抗原と顕著な陽性反応を示すものは20株であった。この20株ファージのDNA配列を解析し、それぞれのCDR配列が新規であることが確認された。そのうち、TfR006抗体のCDR配列は下記の通りである。
VH CDR1:配列番号1、VH CDR2:配列番号2、VH CDR3:配列番号3
VL CDR1:配列番号4、VL CDR2:配列番号5、VL CDR3:配列番号6
配列番号2:VISFDGSSKYYADSVKG
配列番号3:DSNFWSGYYSPVDV
配列番号4:TRSSGSIASNSVQ
配列番号5:YEDTQRPS
配列番号6:QSYDSAYHWV
(1) TfR006抗体のVH CDR3配列における一つのアミノ酸置換
TfR006抗体のVH(配列番号43)CDR3(配列番号3)のカバット番号96、97、98、100をそれぞれ別のアミノ酸に置換した。改変抗体TfR402抗体のVHはカバット番号96のアミノ酸をSからGへ(配列番号7)、TfR403抗体のVHはカバット番号97のアミノ酸をNからAへ(配列番号8)、TfR404抗体のVHはカバット番号98のアミノ酸をFからLへ(配列番号9)、TfR406抗体のVHはカバット番号100のアミノ酸をSからGへ(配列番号10)になるように変異した。置換後の配列は表2で示している。また、すべての改変体のカバット番号1のQはN末端ピログルタミン酸が形成されないDに置換した。
TfR006抗体VH CDR3配列の3個のアミノ酸を置換した改変抗体を作製した。 該CDR3のカバット番号95から100までの6個のアミノ酸のうち3個のアミノ酸を置換した。TfR407抗体のVHはカバット番号N97A(97番目のアミノ酸をNからAへ置換), F98L , S100G (配列番号11)、TfR408抗体HVはカバット番号S96G、F98L、S100G (配列番号12)、TfR409抗体HVはカバット番号S09G、N97A、S100G (配列番号13)、TfR410抗体ははカバット番号S96G、N97A、F98L(配列番号14)に変異した(表3)。 また、すべての改変体のカバット番号1のQはN末端ピログルタミン酸が形成されないDに置換した。
TfR006抗体のVH CDR3配列における4個のアミノ酸を置換した改変抗体TfR411抗体を作製した。該CDR3のカバット番号95から100までの6個のアミノ酸のうち、カバット番号S96G、N97A、F98L、S100Gに変異した(配列番号15)(表4)。また、この改変体のカバット番号1のQはN末端ピログルタミン酸が形成されないDに置換した。
TfR006抗体VH CDR2配列のアミノ酸を置換した改変抗体も作製した。 改変は下記の表に示したようにした。
TfR006抗体のVHアミノ酸配列に最も近い生殖系列の遺伝子をIMGTで調べたところIGHV3−30であることが判明した。図3はTfR006抗体のVHアミノ酸配列 (配列番号43)、IGHV3−30アミノ酸配列(配列番号44)とヒト生殖系列遺伝子のサブグループIIIのコンセンサス・アミノ酸配列(配列番号45)とのアライメントである。それぞれの異なるアミノ酸の組み合せをもつTfR006VH変異体をTfR412VH(配列番号16)からTfR420HV(配列番号24)まで作製した。
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFKSYGMQWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSSRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVS
配列番号17:TfR413 VH
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFKSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
配列番号18:TfR414 VH
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFKSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFKSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGGSRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
配列番号20:TfR416 VH
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFKSYGMQWVRQAPGKGLEWVAVISFDGGSRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
配列番号21:TfR417 VH
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVAVISFDGGSRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMQWVRQAPGKGLEWVAVISFDGGSRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
配列番号23:TfR419 VH
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVSVISFDGGNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
配列番号24:TfR420 VH
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVSIVSFDGGNRYYADSIKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPIDVWGQGTLVTVSS
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFPFKSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRGEDTAVYYCARDSNFWSGYYSPVDVWGQGTTVTVSS
配列番号44:IGHV3-30
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
配列番号45:Human VH3 consensus
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISGDGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
(1)TfR006抗体のVL改変
TfR006 VL(配列番号46)が使用していると推定される生殖系列の遺伝子をIMGTで検索した結果、IGLV6−57(アクセッション番号: Z73673、配列番号47)であることが判明した(表6)。VL遺伝子部分のアミノ酸置換は5ヶ所あり、これをもとにTfR006抗体のVL改変体TfR421、TfR422をつくった(TfR421:配列番号25、TfR422:配列番号26)。また、この改変体のカバット番号1のQはN末端ピログルタミン酸が形成されないDに置換した。
DFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNHWVFGGGTKLAVL
配列番号26:TfR422 VL
DFMLTQPQSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNQWVFGGGTKLAVL
配列番号47: IGLV6−57
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSN
QSxLTQPPSVSGSPGQSVTISCTGSSSNIGSxNyVSWYQQxPGtAPKLMIYENNKRPSGVPDRFSGSKxxSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSWDsSlSx
配列番号28:TfR423 VL
DSALTQPPSVSGSPGQSVTISCTGSSSNIIASNSVQWYQQLPGtAPKTVIYEDTQRPSGVPDRFSGSKDSSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSYDSAYHWVFGGGTKLAVL
配列番号29:TfR424 VL
DSALTQPPSVSGSPGQSVTISCTGSSSNIIASNSVQWYQQLPGtAPKTVIYENTQRPSGVPDRFSGSKDSSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYDSAYHWVFGGGTKLAVL
DFMLTQPHSVSESPGKTVIISCTRSDGTIAGYYVQWYQQRPGRAPTTVIFEDTQRPSGVPDRFSGSIDRSSNSASLTISGLQTEDEADYYCQSYDRDHWVFGGGTKLTVLG
配列番号31:TfR425 VL
DFMLTQPHSVSESPGKTVIISCTRSDGTIAGYYVQWYQQRPGRAPTTVIFEDTQRPSGVPDRFSGSIDRSSNSASLTISGLQTEDEADYYCQSYDSRDHWVFGGGTKLTVL
配列番号32:TfR426 VL
DFMLTQPQSVSESPGKTVIISCTRSTGTIASNSVQWYQQRPGRAPTTVIFDETQRPSGVPDRFSGSIDRSSNSASLTISGLQTEDEADYYCQSYDSRDQWVFGGGTKLTVL
TfR006抗体のラムダ鎖のCDRをカッパ鎖のサブグループIのコンセンサス配列(配列番号33)にグラフティングし、TfR427抗体のVLアミノ酸配列(配列番号34)を得た。さらに、このアミノ酸を塩基配列に変換したときに最も近い生殖系列の遺伝子をIMTGで検索した結果IGKV1−5であることがわかった。このIGKV1−5(アクセッション番号:Z00001、配列番号35)のフレームにTfR006のラムダ鎖のCDRをグラフティングし、TfR428抗体のVL(配列番号36)を得た。 さらに、それぞれTfR428抗体のVL CDR3のD92N、H95Qを置換し、TfR429抗体(配列番号37)及びTfR430抗体(配列番号38)のVL配列を得た。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSLPWTFGQGTKVEIK
配列番号34:TfR427 VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQIASNSVQWYQQKPGKAPKTVIYEDTQLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSYDSAYHWVFGQGTKVEIK
配列番号35: IGKV1-5
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYS
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQIASNSVQWYQQKPGKAPKTVIYEDTQLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQSYDSAYHWVFGQGTKVEIK
配列番号37:TfR429 VL
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQIASNSVQWYQQKPGKAPKTVIYEDTQLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQSYNSAYHWVFGQGTKVEIK
配列番号38:TfR430 VL
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQIASNSVQWYQQKPGKAPKTVIYEDTQLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQSYNSAYQWVFGQGTKVEIK
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLTWYQQKPGTAPKRLIYGATSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQPEDFATYYCLQYSSFPWTFGQGTKVEVK
配列番号40:TfR431 VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQIASNSVQWYQQKPGTAPKTVIYEDTQLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQPEDFATYYCQSYDSAYHWVFGQGTKVEIK
配列番号41:TfR432 VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQIASNSVQWYQQKPGTAPKTVIYEDTQLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQPEDFATYYCQSYNSAYHWVFGQGTKVEIK
配列番号42:TfR433 VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQIASNSVQWYQQKPGTAPKTVIYEDTQLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQPEDFATYYCQSYNSAYQWVFGQGTKVEIK
(1)各TfR006改変抗体を発現するplasmidの作製
上記得られたそれぞれのTfR006改変VH、VLをそれぞれにヒトG1の定常領域(配列番号48)、また対応するL鎖定常領域(λ:配列番号49、κ:配列番号50)と連結した。5'側にNheI、3'側にEcoRIを付加したH鎖、L鎖遺伝子をGenScript社で全合成した。。合成した重鎖、軽鎖の遺伝子はそれぞれ別々の発現ベクターに組み込んだ。すなわちH鎖、L鎖それぞれの人工合成遺伝子をNheIとEcoRIで切断し、発現ベクターpCAGGSのNheIとEcoRI部位に組み込み、それぞれのは異変抗体H鎖発現ベクター、およびL鎖発現ベクターを得た。
TfR006改変抗体の一過性発現にはFreeStyle (ライフテクノロジーズ)を用いた。遺伝子導入用浮遊細胞である293-F (ライフテクノロジーズ) は前日に継代した。トランスフェクション当日に、一抗体あたり1x106細胞/mLの細胞濃度に調整した400mLの細胞懸濁液を準備した。これにそれぞれの抗体の重鎖発現ベクターを100 μg、軽鎖発現ベクターを100μg合計200μgのプラスミドをOptiPro SFMに懸濁した溶液(I)を調整した。次に200μLのMAX reagentを8mLのOptiPRO SFMに加えた(溶液II)。 溶液(I)と(II)を混合して室温で10分から20分静置した。この合計16mLの反応液を293-F細胞を懸濁した400mLの293発現培地に加え、6日から7日間37°C、8%CO2で細胞培養震盪機のTAITEC BioShaker BR-43FLで培養した。6日から7日間後、TFR006組換え抗体を含む培養上清を回収し、これを材料に精製をおこなった。
一過性で発現した培養上清含まれる各抗体タンパク質は、AKTAprimeを用いたAb-Capcher ExTra(プロテノバ)アフィニティーカラムで精製した。得られたピークフラクションは、溶媒としてダルベッコのPBSで平衡化したセファクリルS-300カラムによるゲルろ過をして、さらに精製した。精製した抗体タンパク質の定量は、吸光係数を用いて算出した。
抗体生産細胞の培地上清に含まれる抗体や、精製した抗体の濃度は、吸光度による定量とともに、酵素免疫測定法(ELISA)による定量もおこなった。固相抗体としてプレートにヤギ抗ヒトIgG(H+L)(マウス、ウサギ、ウシ、マウスIgGに対して吸収済み)(コスモバイオ:American Qualex International,Inc.;AQI,Cat.No.A-110UD)を100μl/well(5μg/mLの濃度)で加えて4℃で一昼夜静置した。次にブロックエースを200μL/wellで加えて室温で1時間ブロックした後、試料の抗体を段階希釈し、各wellに加えて1時間インキュベーションして反応させた。PBST(0.05%Tween20、PBS)で5回洗浄後、ヤギ抗ヒトIgG(H+L)(マウス、ウサギ、ウシ、マウスIgGに対して吸収済み)-HRP(コスモバイオ:AQI,Cat.A-110PD)をPBSTで10000倍希釈した検出抗体溶液を100μL/wellの割合で加えた。1時間インキュベーション後、PBSTで5回洗浄してから基質緩衝液TMBを100μL/wellの割合で加えた。室温暗所で15分間インキュベーションした後、反応停止液を100μL/wellの割合で加えて反応を停止してから、450nmにおける吸光度を測定した。標準品として精製ヒトIgGを用いて検量線を作成し、これを用いてヒト抗体の濃度を算出した。
TfR発現細胞K562(ATCC CCL−243:CML)を用いて、各改変抗体の抗原反応性を検討した。K562細胞を遠心により回収し、PBSで1回洗浄した。その後、FACS Buffer(1%BSA,2mM EDTA,0.1%NaN3 入りPBS)で細胞を1×106/mLなるように懸濁しに。 この細胞懸濁液100μLを96- well V底プレート(Costar 3897)に分注し、さらにそれぞれの抗体をFACS Bufferで0.2μg〜2/mLに調製し、それぞれの抗体溶液100μLを細胞に添加した、4℃で1時間インキュベートした。細胞をFACS Bufferにより2回洗浄した後、FACS Buffer で750倍に希釈したAlexa488−anti−human IgG (invitrogen )溶液100μLを添加し、攪拌した後更に4℃で1時間インキュベートした。FACS Buffer で遠心により2回洗浄し、FACS Calibur(BD)のHTSにセットして各wellのFL1蛍光強度を測定した。図1に示すように、各改変抗体(a:1ng/mL;b:10ng/mL;c:100ng/mL; d: 1μg/mL)が、K562細胞に対し、親抗体TfR006と同等な反応性を示した。
TfR発現細胞株K562(ATCC CCL−243)またATL細胞株MT−2細胞を2500/mL密度になるよう培養液で調製し、96well平底プレート(NUNC 167008)に100μL/wellずつ分注した。それぞれのTfR006改変抗体4.6ng〜10μg/mLの抗体希釈系列を作製し、その100μLを細胞に添加し、37℃、5%CO2、95%空気で96時間培養した。培養終了後、プレートにCell Counting Kit (DOJINDO)20μlを添加し、37℃、5%CO2、95%空気で3時間培養した。Absorbance 450nm で測定した。各濃度の抗体添加による増殖率を下記の計算式で算出した。Master Plex 2010ソフトウエア(日立ソリューションズ)を使用して、増殖率50%を示す抗体濃度(IC50)を求めた(表7)。図2で示したように、TfR006改変抗体は、ほぼ親抗体と同程度にがん細胞の増殖を抑制した。
増殖率=抗体添加well値−Blank(培養液のみ)/Control値(抗体なしwell)−Blank(培養液のみ)X100%
ATL細胞株SU9T1細胞を10%FBS添加したRPMI1640培養液(SIGMA)で培養した。移植時遠心により細胞を回収し、細胞を1×108/mLになるようにRPMI1640に懸濁した。この細胞懸濁液と同量のMatrigel(ベクトンディッキンソン)を混ぜ、SCIDマウス(メス、6週齢、九動株式会社)の右腹側部皮下に移植した。移植後、週二回ノギスにより腫瘍径を測定し、腫瘍平均体積が150mm3前後に到達した時点で、腫瘍体積に対する無作為化割付により、マウスを1群あたり5匹になるよう割付けを行った。TfR006、TfR402、TfR403、TfR404、TfR406抗体それぞれの群に5mg/kg、TfRTfR435、TfR436抗体をそれぞれの群に10mg/kg、3mg/kgで尾静脈投与した。陰性コントロール群には0.2mL/20gマウスでPBSを尾静脈より投与した。投与は、週2回(3日または4日毎)、合計5回行った。投与後も割付け前と同様に、週2回ノギスによる腫瘍径の測定を行い、各群の腫瘍体積を求めた。抗腫瘍効果の判定は最終測定日の腫瘍体積について、PBS群をコントロールとしたパラメトリックDunnet多重比較検定により判定した。
腫瘍体積は下式にて算出した。
腫瘍体積=(短径)2 × 長径 × 0.5
また、無作為化割付および、多重比較検定は生物実験データ統計解析ソフトEXSUS(株式会社シーエーシー)を用いて行った。
白血病細胞株細胞K562(ATCC CCL−243)を10%FBS添加したRPMI1640培養液で培養した。移植時遠心により細胞を回収し、細胞を5×107/mLになるようにRPMI1640に懸濁した。SCIDマウス(メス、7週齢、日本クレア)の右腹側部皮下に5×106個/マウスとなるように上記がん細胞懸濁液100μL/匹で移植した。移植後、ノギスによる腫瘍径を測定し、下記の式により体積を求めた。腫瘍平均体積が150mm3以上に至る時点で、群分けソフト(EXSASversion7.6 シーエーシ)によりマウスの群分けを行った (n=5)。それぞれの抗体投与群において、マウスに5mg/kgのTfR006抗体、TfR402抗体、TfR404抗体、TfR406抗体、TfR435抗体、TfR436抗体を尾静脈より投与した。また、低用量投与群において、マウスに1mg/kgのTfR402、TfR434抗体、TfR435抗体、TfR436抗体を投与した。陰性コントロール群に0.2mL/20gマウスでPBSを尾静脈より投与した。投与は、週2回(3日または4日毎)、合計5回行った。投与後週2回ノギスによる腫瘍径の測定を行い、各群の腫瘍体積を求めた。抗腫瘍効果の判定は腫瘍体積により判定した。
腫瘍体積は下式にて算出した。
腫瘍体積=(短径)2 × 長径 × 0.5
膀胱癌細胞株BFTC-905(DSMZ;ACC361)を10%FBS添加したDMEM培養液(SIGMA)で培養した。移植時遠心により細胞を回収し、細胞を5×107/mLになるようにRPMI1640に懸濁した。SCIDマウス(メス、7週齢、日本クレア)の右腹側部皮下に5×106個/マウスとなるように上記がん細胞懸濁液100μL/匹で移植した。移植後、ノギスによる腫瘍径を測定し、下記の式により体積を求めた。腫瘍平均体積が200mm3前後に至る時点で、群分けソフト(EXSASversion7.6 シーエーシ)によりマウスの群分けを行った (n=5)。それぞれの抗体投与群において、マウスに10mg/kgのTfR435抗体、TfR436抗体を尾静脈より投与した。陰性コントロール群に0.2mL/20gマウスでPBSを尾静脈より投与した。投与は、週2回(3日または4日毎)、合計5回行った。投与後週2回ノギスによる腫瘍径の測定を行い、各群の腫瘍体積を求めた。抗腫瘍効果の判定は腫瘍体積により判定した。
腫瘍体積は下式にて算出した。
腫瘍体積=(短径)2 × 長径 × 0.5
WO2011/073943には、ヒトTfRに対するscFv単量体、二量体抗体が記載されている。本発明の抗体とWO2011/073943に記載の抗体とを比較するため、WO2011/073943に記載の3TF12、3GH7scFv抗体のIgG1抗体を作製した。3TF12のscFvアミノ酸配列及び塩基配列はそれぞれ配列番号55番と56番で示し、3GH7のscFvアミノ酸配列及び塩基配列はそれぞれ配列番号57番と58番で示す。
トランスフェクション前日に、Expi293F細胞(ライフテクノロジーズ)を1 mLあたり1.4 x 106細胞になるように85mLのPowerCHO−2CD培地(LONZA)でを三角フラスコに調整し、37℃、8%CO2の条件で、毎分回転数(rpm)135に設定して震盪培養した。
抗体の精製は、はじめに陰イオン交換担体を、次にプロテインA担体を用いておこなった。一過性発現Expi293F細胞の培養上清をAKTAprime plusを用いて精製した。流速毎分あたり5mLでCaptoQ(GEヘルスケア)カラム(カラム容量10mL)にアプライした。抗体を含む取得画分はフロースルー(通過画分)であるが、タンパク質のほか核酸(ゲノムやRNA)が陰イオン交換担体に結合して除去できるので、次のプロテインAの結合容量を有効に利用することが可能になる。プロテインA担体(Ab−Capcher ExTra:プロテノバ社;10mL)に流速毎分あたり5mLでアプライし、その後、洗浄緩衝液はアプライと同一の流速でD−PBSでおこなった。溶出のフラクション容量は試験管あたり4mLに設定して分取した。溶出は0.1Mグリシン塩酸緩衝液, pH2.7を用い、流速毎分3mLでおこなった。溶出液を分取する試験管には予め120μL の1M Tris塩酸緩衝液(pH8.5)を入れておき、溶出と同時にpHを酸性からpH6.5の中性付近に速やかに戻した。タンパク質量は280nMの吸光度で検出し、ピークフラクションを分取した。このピークフラクションは、分子量3万カットのウルトラセル限外ろ過ディスクを使用したミリポア撹拌式セルで、緩衝液をD−PBSに交換しながら溶出液の濃縮をおこなった。
実施例2で作製した可溶性TfR抗原を、2μg/mLの濃度でPBS(2.68 mM KCl,1.47 mM KH2PO4,136.89 mM NaCl,8.04 mM Na2HPO4)に懸濁させ、96ウェルプレート(Nunc イムノモジュール マキシソープ(Thermo Scientific,cat.468667))に100μL/ウェルで分注し、4℃で一晩静置した。
白血病細胞株細胞K562(ATCC CCL−243)を10%FBS添加したRPMI1640培養液で培養した。移植時遠心により細胞を回収し、細胞を5×107/mLになるようにRPMI1640に懸濁した。SCIDマウス(メス、7週齢、日本クレア)の右腹側部皮下に5×106個/マウスとなるように上記がん細胞懸濁液100μL/匹で移植した。移植後、ノギスによる腫瘍径を測定し、下記の式により体積を求めた。腫瘍平均体積が150mm3以上に至る時点で、群分けソフト(EXSASversion7.6 シーエーシ)によりマウスの群分けを行った (n=5)。それぞれの抗体投与群において、マウスに1mg/kgのTfR435抗体、TfR436抗体、3TF12抗体、、3GH7T抗体を尾静脈より投与した。陰性コントロール群に0.2mL/20gマウスでPBSを尾静脈より投与した。投与は、週2回(3日または4日毎)、合計5回行った。投与後週2回ノギスによる腫瘍径の測定を行い、各群の腫瘍体積を求めた。抗腫瘍効果の判定は腫瘍体積により判定した。
腫瘍体積は下式にて算出した。
腫瘍体積=(短径)2 × 長径 × 0.5
Claims (15)
- 下記(1)から(34)から選択される、ヒトTfRと特異的に反応する抗体:
(1)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、7であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(2)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、8であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(3)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、9であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(4)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、10であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(5)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、11であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(6)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、12であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(7)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、13であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(8)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、14であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(9)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、15であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(10)重鎖が配列番号16を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(11)重鎖が配列番号17を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(12)重鎖が配列番号18を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(13)重鎖が配列番号19を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(14)重鎖が配列番号20を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(15)重鎖が配列番号21を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(16)重鎖が配列番号22を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(17)重鎖が配列番号23を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(18)重鎖が配列番号24を有し、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(19)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号25である抗体:
(20)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号26である抗体:
(21)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号28である抗体:
(22)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号29である抗体:
(23)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号31である抗体:
(24)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号32である抗体:
(25)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号34である抗体:
(26)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号36である抗体:
(27)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号37である抗体:
(28)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号38である抗体:
(29)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号40である抗体:
(30)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号41である抗体:
(31)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、2、3であり、及び軽鎖可変領域が配列番号42である抗体:
(32)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、52、3であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(33)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、53、3であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体:
(34)重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)がそれぞれ配列番号1、54、3であり、及び軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)がそれぞれ配列番号4、5、6である抗体: - 抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(Diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)およびCDRを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、請求項1又は2に記載の抗体。
- 請求項1から3のいずれか1項に記載の抗体をコードするDNA。
- 請求項4に記載のDNAを含有する組換えベクター。
- 請求項5に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
- 請求項6に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項1から3のいずれか1項に記載の抗体を生成蓄積させ、培養物から抗体を採取することを含む、請求項1から3のいずれか1項に記載の抗体の製造方法。
- 請求項1から3の何れか1項に記載の抗体を有する医薬組成物。
- 抗体に細胞傷害性物質が結合している、請求項9に記載の医薬組成物。
- 細胞傷害性物質が薬剤、毒素、又は放射性物質である、請求項9に記載の医薬組成物。
- 抗がん剤として使用される、請求項8から10の何れか1項に記載の医薬組成物。
- がんが、固形がんまた血液がんである、請求項11に記載の医薬組成物。
- 固形がんが肺がん、大腸がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がんである、請求項11に記載の医薬組成物。
- 血液がんが白血病、リンパ腫、骨髄腫である、請求項11に記載の医薬組成物。
- 血液がんが成人T細胞白血病(ATL)である請求項11に記載の医薬組成物。
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