CN104918956A - 与egfr结合的抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了涉及或源自抗EGFR抗体的组合物及方法。更具体地来说，本公开提供了与EGFR结合的人抗体、能够结合EGFR的所述抗体片段及衍生物、包含所述片段的EGFR结合性多肽。进一步而言，本公开提供了编码所述抗体的核酸、抗体的片段、衍生物及多肽、含有所述多肽的细胞、制备所抗体、抗体片段、衍生物及多肽的方法，以及使用所述抗体、所述抗体片段及其衍生物和多肽的方法，包括治疗或诊断患有EGFR相关疾病或症状(包括多种炎性疾症和各种癌症)的对象。

Description

与EGFR结合的抗原结合蛋白
技术领域
本公开提供了涉及或源自抗EGFR抗体的组合物及方法。更具体地来说，本公开提供了与EGFR结合的人抗体、能够结合EGFR的所述抗体片段及衍生物、包含所述片段的EGFR结合性多肽。进一步而言，本公开提供了抗体的片段、衍生物及多肽以及使用所述抗体、所述抗体片段及其衍生物和多肽的方法，包括治疗或诊断患有EGFR相关疾病或症状的对象。
背景技术
癌症仍是对人类健康最致命的威胁之一。在美国，每年有将近130万新患者患癌症，癌症是第二大死亡原因，排在心脏病之后，每4例死亡就有1例是癌症。而且，据预测，在5年内，癌症就会超过心血管疾病，成为第一大死因。固体瘤要为这些死亡中的大多数负责。虽然某些癌症的医疗处理已经得到了显著进步，但在过去的20年里，所有癌症的总5年存活率仅提高了约10％。癌症，即恶性肿瘤，以不受控制的方式转移和生长，使得及时检测和治疗极为困难。此外癌症可能在身体任何组织中通过一个或多个正常组织细胞的恶性转化而产生，而每一种特定组织起源的癌症都各不相同。
目前的癌症治疗方法相对地无选择性。手术移除患病组织；放射疗法收缩实体肿瘤；以及，化学疗法迅速杀死分裂细胞。尤其是化疗，会引起众多副作用，在某些情况下，副作用严重到限制了能够给药的剂量，因此妨碍了潜在有效药物的使用。此外，癌症往往会对化学治疗药物产生抗性。
因此，迫切需要对特异性更高且更有效的癌症疗法。
EGFR被克隆为55kD的免疫球蛋白家族的I型膜蛋白(The EMBO Journal(1992),vol.11,issue 11,p.3887-3895,JP5336973,JP7291996)。人EGFR cDNA由如EMBL/GenBank Acc.No.NM005018所示的碱基序列构成，鼠EGFR cDNA由如Acc.No.X67914所示的碱基序列组成；当胸腺细胞从CD4-CD8-细胞分化为CD4+CD8+细胞时，观察到这些序列的表达(InternationalImmunology(1996),vol.18,issue 5,p.773-780.,J.Experimental Med.(2000),vol.191,issue 5,p.891-898.)。据悉，在被抗原受体激活的骨髓细胞(包括T细胞或B淋巴细胞)或激活的巨噬细胞中，均观察到EGFR在外周的表达(International Immunology(1996),vol.18,issue 5,p.765-772.)。
发明内容
本公开提供一种与EGFR表位结合且结合亲和性至少为10-6M的IgG类全人抗体，其重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ IDNO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ IDNO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.81、SEQ IDNO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.103、SEQID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.113、SEQ IDNO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127，及其组合；其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合。优选地，该全人抗体具有重链和轻链，其中该抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列：SEQID NO.1/SEQ ID NO.2(本文称为A3)、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4(本文称为A5)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文称为A6)、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(本文称为A10)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(本文称为A11)、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12(本文称为B1)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文称为B4)、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16(本文称为B5)、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(本文称为B6)、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20(本文称为B7or H3)、SEQ IDNO.21/SEQ ID NO.22(本文称为D2)、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24(本文称为D4or H9)、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26(本文称为D6)、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28(本文称为D10)、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30(本文称为E1)、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32(本文称为EG-A4)、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34(本文称为EG-B7)、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36(本文称为EG-C9)、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38(本文称为EG-D5)、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40(本文称为EG-E9)、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42(本文称为EG-E11)、SEQ ID NO.43/SEQID NO.44(本文称为EB8)、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46(本文称为EC6)、SEQ ID NO.47/SEQID NO.48(本文称为EC10)、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50(本文称为ED10)、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52(本文称为EE12)、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54(本文称为RE-A1)、SEQ IDNO.55/SEQ ID NO.56(本文称为RE-F3)、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58(本文称为RE-F4)、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60(本文称为G3)、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62(本文称为A6-A1)、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64(本文称为A6-A3)、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66(本文称为A6-A4)、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68(本文称为A6-A5)、SEQ ID NO.69/SEQ ID NO.70(本文称为A6-A6)、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72(本文称为A6-A7)、SEQ ID NO.73/SEQID NO.74(本文称为A6-A8)、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76(本文称为D2GA1)、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78(本文称为D2GA2)、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80(本文称为D2GA4)、SEQID NO.81/SEQ ID NO.82(本文称为D2GA5)、SEQ ID NO.83/SEQ ID NO.84(本文称为A6-A11)、SEQ ID NO.85/SEQ ID NO.86(本文称为A6-A12)、SEQ ID NO.87/SEQ ID NO.88(本文称为A6-A13)、SEQ ID NO.89/SEQ ID NO.90(本文称为A6-A14)、SEQ ID NO.91/SEQID NO.92(本文称为A6-A15)、SEQ ID NO.93/SEQ ID NO.94(本文称为A6-A17)、SEQ ID NO.95/SEQ ID NO.96(本文称为A6-A18)、SEQ ID NO.97/SEQ ID NO.98(本文称为A6-A20)、SEQ ID NO.99/SEQ ID NO.100(本文称为A6-A21)、SEQ ID NO.101/SEQ ID NO.102(本文称为A6-A22)、SEQ ID NO.103/SEQ ID NO.104(本文称为A6-A23)、SEQ ID NO.105/SEQ ID NO.106(本文称为A6-A24)、SEQ ID NO.107/SEQ ID NO.108(本文称为D2GA6)、SEQ ID NO.109/SEQ ID NO.110(本文称为D2GA9)、SEQ ID NO.111/SEQ ID NO.112(本文称为D2GA10)、SEQ ID NO.113/SEQ ID NO.114(本文称为D2GA11)、SEQ ID NO.115/SEQ ID NO.116(本文称为D2GB2)、SEQ ID NO.117/SEQ ID NO.118(本文称为D2GB6)、SEQ ID NO.1119/SEQ ID NO.120(本文称为D2GB7)、SEQ ID NO.121/SEQ ID NO.122(本文称为D2GB8)、SEQ ID NO.123/SEQ ID NO.124(本文称为D2GC1)、SEQ ID NO.125/SEQ ID NO.126(本文称为D2GC4)、SEQ ID NO.127/SEQ ID NO.128(本文称为D2GG1)，及其组合。
本公开提供一个Fab全人抗体片段，其具有来自重链的可变域和来自轻链的可变域，其中，重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91、SEQID NO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127，及其组合；且其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ IDNO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ IDNO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.96、SEQ IDNO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合；优选地，该全人抗体Fab片段具有重链可变域和轻链可变域，其中该抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列及其组合：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ IDNO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ IDNO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69/SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77/SEQ IDNO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.81/SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83/SEQID NO.84、SEQ ID NO.85/SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.87/SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89/SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91/SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93/SEQ ID NO.94、SEQ IDNO.95/SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.97/SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.99/SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.101/SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.103/SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.105/SEQ IDNO.106、SEQ ID NO.107/SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.109/SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111/SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113/SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115/SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.117/SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.1119/SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.121/SEQID NO.122、SEQ ID NO.123/SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.125/SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.127/SEQ ID NO.128，及其组合。
本公开提供一个单链人抗体，其具有来自重链的可变域、来自轻链的可变域、连接重链和轻链可变域的连接肽，其中，重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQID NO.59、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQID NO.101、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ IDNO.111、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127，及其组合；其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ IDNO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ IDNO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.94、SEQ IDNO.96、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合。优选地，该全人单链抗体具有重链可变域和轻链可变域，其中该抗单链全人抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69/SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.81/SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83/SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85/SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.87/SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89/SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91/SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93/SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95/SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.97/SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.99/SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.101/SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.103/SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.105/SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107/SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.109/SEQID NO.110、SEQ ID NO.111/SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113/SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115/SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.117/SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.1119/SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.121/SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.123/SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.125/SEQ IDNO.126、SEQ ID NO.127/SEQ ID NO.128，及其组合。
本公开进一步提供一种治疗广谱哺乳动物癌症的方法，包括以抗EGFR多肽的有效剂量给药，其中所述抗EGFR多肽选自：一种与EGFR表位结合且结合亲和度为至少10-6M的IgG类全人抗体、具有重链可变域和轻链可变域的Fab全人抗体片段、具有来自重链的可变域和来自轻链的可变域以及连接所述轻链和重链可变域的连接肽的单链人抗体，及其组合；
其中，所述全人抗体的重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ IDNO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ IDNO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ IDNO.59、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ IDNO.101、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127，及其组合；且其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.94、SEQID NO.96、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ IDNO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合；
其中，所述全人抗体Fab片段的重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ IDNO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ IDNO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ IDNO.89、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127，及其组合；且其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ IDNO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ IDNO.72、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ IDNO.94、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合；
其中，所述单链人抗体的重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ IDNO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ IDNO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ IDNO.59、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ IDNO.101、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127，及其组合；且其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.94、SEQID NO.96、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ IDNO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合。
优选地，所述全人抗体具有重链和轻链，其中所述抗体的重链/轻链可变域序列选自以下序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文称为A3)、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4(本文称为A2)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文称为A6)、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(本文称为A10)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(本文称为A11)、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12(本文称为B1)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文称为B4)、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16(本文称为B5)、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(本文称为B6)、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20(本文称为B7or H3)、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22(本文称为D2)、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24(本文称为D4or H9)、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26(本文称为D6)、SEQ ID NO.27/SEQID NO.28(本文称为D10)、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30(本文称为E-1)、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32(本文称为EG-A4)、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34(本文称为EG-B7)、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36(本文称为EG-C9)、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38(本文称为EG-D5)、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40(本文称为EG-E9)、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42(本文称为EG-E11)、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44(本文称为EB8)、SEQ ID NO.45/SEQ IDNO.46(本文称为EC6)、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48(本文称为EC10)、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50(本文称为ED10)、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52(本文称为EE12)、SEQID NO.53/SEQ ID NO.54(本文称为RE-A1)、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56(本文称为RE-F3)、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58(本文称为RE-F4)、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60(本文称为G3)、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62(本文称为A6-A1)、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64(本文称为A6-A3)、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66(本文称为A6-A4)、SEQ ID NO.67/SEQID NO.68(本文称为A6-A5)、SEQ ID NO.69/SEQ ID NO.70(本文称为A6-A6)、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72(本文称为A6-A7)、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74(本文称为A6-A8)、SEQID NO.75/SEQ ID NO.76(本文称为D2GA1)、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78(本文称为D2GA2)、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80(本文称为D2GA4)、SEQ ID NO.81/SEQ ID NO.82(本文称为D2GA5)、SEQ ID NO.83/SEQ ID NO.84(本文称为A6-A11)、SEQ ID NO.85/SEQID NO.86(本文称为A6-A12)、SEQ ID NO.87/SEQ ID NO.88(本文称为A6-A13)、SEQ IDNO.89/SEQ ID NO.90(本文称为A6-A14)、SEQ ID NO.91/SEQ ID NO.92(本文称为A6-A15)、SEQ ID NO.93/SEQ ID NO.94(本文称为A6-A17)、SEQ ID NO.95/SEQ ID NO.96(本文称为A6-A18)、SEQ ID NO.97/SEQ ID NO.98(本文称为A6-A20)、SEQ ID NO.99/SEQID NO.100(本文称为A6-A21)、SEQ ID NO.101/SEQ ID NO.102(本文称为A6-A22)、SEQID NO.103/SEQ ID NO.104(本文称为A6-A23)、SEQ ID NO.105/SEQ ID NO.106(本文称为A6-A24)、SEQ ID NO.107/SEQ ID NO.108(本文称为D2GA6)、SEQ ID NO.109/SEQ ID NO.110(本文称为D2GA9)、SEQ ID NO.111/SEQ ID NO.112(本文称为D2GA10)、SEQ ID NO.113/SEQ ID NO.114(本文称为D2GA11)、SEQ ID NO.115/SEQ ID NO.116(本文称为D2GB2)、SEQ ID NO.117/SEQ ID NO.118(本文称为D2GB6)、SEQ ID NO.1119/SEQ ID NO.120(本文称为D2GB7)、SEQ ID NO.121/SEQ ID NO.122(本文称为D2GB8)、SEQ ID NO.123/SEQ ID NO.124(本文称为D2GC1)、SEQ ID NO.125/SEQ ID NO.126(本文称为D2GC4)、SEQ ID NO.127/SEQ ID NO.128(本文称为D2GG1)，及其组合；优选地，所述全人抗体Fab片段具有重链可变域和轻链可变域，其中所述抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文称为A3)、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4(本文称为A2)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文称为A6)、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(本文称为A10)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(本文称为A11)、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12(本文称为B1)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文称为B4)、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16(本文称为B5)、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(本文称为B6)、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20(本文称为B7or H3)、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22(本文称为D2)、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24(本文称为D4or H9)、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26(本文称为D6)、SEQ ID NO.27/SEQID NO.28(本文称为D10)、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30(本文称为E-1)、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32(本文称为EG-A4)、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34(本文称为EG-B7)、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36(本文称为EG-C9)、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38(本文称为EG-D5)、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40(本文称为EG-E9)、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42(本文称为EG-E11)、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44(本文称为EB8)、SEQ ID NO.45/SEQ IDNO.46(本文称为EC6)、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48(本文称为EC10)、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50(本文称为ED10)、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52(本文称为EE12)、SEQID NO.53/SEQ ID NO.54(本文称为RE-A1)、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56(本文称为RE-F3)、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58(本文称为RE-F4)、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60(本文称为G3)、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62(本文称为A6-A1)、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64(本文称为A6-A3)、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66(本文称为A6-A4)、SEQ ID NO.67/SEQID NO.68(本文称为A6-A5)、SEQ ID NO.69/SEQ ID NO.70(本文称为A6-A6)、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72(本文称为A6-A7)、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74(本文称为A6-A8)、SEQID NO.75/SEQ ID NO.76(本文称为D2GA1)、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78(本文称为D2GA2)、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80(本文称为D2GA4)、SEQ ID NO.81/SEQ ID NO.82(本文称为D2GA5)、SEQ ID NO.83/SEQ ID NO.84(本文称为A6-A11)、SEQ ID NO.85/SEQID NO.86(本文称为A6-A12)、SEQ ID NO.87/SEQ ID NO.88(本文称为A6-A13)、SEQ IDNO.89/SEQ ID NO.90(本文称为A6-A14)、SEQ ID NO.91/SEQ ID NO.92(本文称为A6-A15)、SEQ ID NO.93/SEQ ID NO.94(本文称为A6-A17)、SEQ ID NO.95/SEQ ID NO.96(本文称为A6-A18)、SEQ ID NO.97/SEQ ID NO.98(本文称为A6-A20)、SEQ ID NO.99/SEQID NO.100(本文称为A6-A21)、SEQ ID NO.101/SEQ ID NO.102(本文称为A6-A22)、SEQID NO.103/SEQ ID NO.104(本文称为A6-A23)、SEQ ID NO.105/SEQ ID NO.106(本文称为A6-A24)、SEQ ID NO.107/SEQ ID NO.108(本文称为D2GA6)、SEQ ID NO.109/SEQ ID NO.110(本文称为D2GA9)、SEQ ID NO.111/SEQ ID NO.112(本文称为D2GA10)、SEQ ID NO.113/SEQ ID NO.114(本文称为D2GA11)、SEQ ID NO.115/SEQ ID NO.116(本文称为D2GB2)、SEQ ID NO.117/SEQ ID NO.118(本文称为D2GB6)、SEQ ID NO.1119/SEQ ID NO.120(本文称为D2GB7)、SEQ ID NO.121/SEQ ID NO.122(本文称为D2GB8)、SEQ ID NO.123/SEQ ID NO.124(本文称为D2GC1)、SEQ ID NO.125/SEQ ID NO.126(本文称为D2GC4)、SEQ ID NO.127/SEQ ID NO.128(本文称为D2GG1)，及其组合；优选地，所述全人单链抗体具有重链可变域和轻链可变域，其中所述单链全人抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ IDNO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ IDNO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ IDNO.63/SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQID NO.69/SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.81/SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83/SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85/SEQ IDNO.86、SEQ ID NO.87/SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89/SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91/SEQID NO.92、SEQ ID NO.93/SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95/SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.97/SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.99/SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.101/SEQ ID NO.102、SEQID NO.103/SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.105/SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107/SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.109/SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111/SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113/SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115/SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.117/SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.1119/SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.121/SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.123/SEQID NO.124、SEQ ID NO.125/SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.127/SEQ ID NO.128，及其组合。优选地，所述以此治疗的哺乳动物癌症选自：卵巢癌、结肠癌、乳腺癌或肝癌细胞系、骨髓瘤、原始神经母细胞性的CNS瘤、单核细胞性白血病、B细胞性白血病、T细胞性白血病、B细胞性淋巴癌、T细胞性淋巴癌、肥大细胞性肿瘤及其组合。
附图说明
图1展示了与A431细胞结合的各种抗EGFR抗体的FACS测量。右上图为A6，一种优选的抗EGFR抗体。
图2展示了与A431表皮样癌细胞结合的A6和D2，其EC50各为1.29nM和0.28nM。
图3展示了A6和D2对EGF与A431细胞表面上表达的EGFR结合的阻断，IC50各为2.06nM和1.35nM。
图4a展示了10ng/ml EGF下的EGF介导A431细胞增殖。新公开的抗EGFR抗体A6与西妥昔单抗(一种市售抗EGFR抗体)比较。A6在该体外模型中表现出的效力与西妥昔单抗相仿。
图4b展示了10ng/ml EGF的EGF刺激或10％FBS的血清-刺激下的MCF7乳腺癌细胞增殖。新公开的抗EGFR抗体A6与西妥昔单抗(一种市售抗EGFR抗体)比较。A6在该体外模型中表现出的效力与西妥昔单抗相仿。
图5展示了EGF刺激下A431表皮样癌细胞中的EGF受体自磷酸化。将各种抗EGFR抗体在10μg/ml浓度下进行比较，其全部表现出优于西妥昔单抗(一种市售抗EGFR抗体)的拮抗效力。
图6a展示了抗EGFR抗体对EGFR介导的细胞信号传导的抑制。具体而言，展示了对ERK1/2磷酸化激活的拮抗。
图6b展示了抗EGFR抗体对EGFR介导的细胞信号传导的抑制。具体而言，展示了对A431细胞中AKT磷酸化激活的拮抗。
图6c展示了抗EGFR抗体对EGFR介导的细胞信号传导的抑制。具体而言，展示了对MCF7细胞中ERK1/2磷酸化激活的拮抗。
图7展示了本公开中的抗EGFR抗体A6和标样在pH 6.8的PBS缓冲液中的重叠ANSEC色谱图(280nm紫外线示踪)：STD/标样测试(黑色虚线)，EGFR-A6色谱(黑色实线)。
图8展示了本公开中的抗EGFR抗体D2和标样在pH 6.8的PBS缓冲液中的重叠ANSEC色谱图(280nm紫外线示踪)：STD/标样测试(黑色虚线)，EGFR-D2色谱(黑色实线)。
图9展示了本公开中的抗EGFR抗体EGC9和标样在pH 6.8的PBS缓冲液中的重叠ANSEC色谱图(280nm紫外线示踪)：STD/标样测试(黑色虚线)，EGFR-EGC9色谱(黑色实线)。
图10展示了本公开中的抗EGFR抗体EC10和标样在pH 6.8的PBS缓冲液中的重叠ANSEC色谱图(280nm紫外线示踪)：STD/标样测试(黑色虚线)，EGFR-EC10色谱(黑色实线)。
图11展示了本公开中的抗EGFR抗体D6和标样在pH 6.8的PBS缓冲液中的重叠ANSEC色谱图(280nm紫外线示踪)：STD/标样测试(黑色虚线)，EGFR-D6色谱(黑色实线)。
图12展示了本公开中的抗EGFR抗体B4和标样在pH 6.8的PBS缓冲液中的重叠ANSEC色谱图(280nm紫外线示踪)：STD/标样测试(黑色虚线)，EGFR-B4色谱(黑色实线)。
图13展示了本公开中的抗EGFR抗体A5和标样在pH 6.8的PBS缓冲液中的重叠ANSEC色谱图(280nm紫外线示踪)：STD/标样测试(黑色虚线)，EGFR-A5色谱(黑色实线)。
图14显示，A6(正方形)和D2(三角形)抗体均降低了异种肿瘤细胞的体内生长。
图15展示了A6抗体的各种变体对EGF处理诱导EGFR自磷酸化激活的抑制作用的IC50测定。
图16A和16B展示了抗EGFR抗体的抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)潜力作为抗体浓度对数的函数的测定。该基于荧光素的启动子实验显示，随着抗体浓度的增加，相对光强度单位(RLU)也提高，表明正相关性的存在(图16A)。抗EGFRmAb A6激活ADCC的EC50为60pM(图16B)。抗EGFRmAb D2激活ADCC的EC50为200pM。
图17展示了D2抗体的各种变体对EGF处理诱导EGFR自磷酸化激活的抑制作用的IC50测定。
具体实施方式
本公开提供一个与EGFR表位结合且结合亲和性为10-6M或以下的IgG类全人抗体，其重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ IDNO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ IDNO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.81、SEQ IDNO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.103、SEQID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.113、SEQ IDNO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127，及其组合；其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ IDNO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ IDNO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合；优选地，该全人抗体具有重链和轻链，其中该抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列及其组合：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文称为A3)、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4(本文称为A2)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文称为A6)、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(本文称为A10)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(本文称为A11)、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12(本文称为B1)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文称为B4)、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16(本文称为B5)、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(本文称为B6)、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20(本文称为B7or H3)、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22(本文称为D2)、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24(本文称为D4or H9)、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26(本文称为D6)、SEQ ID NO.27/SEQID NO.28(本文称为D10)、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30(本文称为E-1)、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32(本文称为EG-A4)、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34(本文称为EG-B7)、SEQID NO.35/SEQ ID NO.36(本文称为EG-C9)、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38(本文称为EG-D5)、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40(本文称为EG-E9)、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42(本文称为EG-E11)、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44(本文称为EB8)、SEQ ID NO.45/SEQ IDNO.46(本文称为EC6)、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48(本文称为EC10)、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50(本文称为ED10)、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52(本文称为EE12)、SEQ IDNO.53/SEQ ID NO.54(本文称为RE-A1)、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56(本文称为RE-F3)、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58(本文称为RE-F4)、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60(本文称为G3)、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62(本文称为A6-A1)、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64(本文称为A6-A3)、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66(本文称为A6-A4)、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68(本文称为A6-A5)、SEQ ID NO.69/SEQ ID NO.70(本文称为A6-A6)、SEQ ID NO.71/SEQID NO.72(本文称为A6-A7)、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74(本文称为A6-A8)、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76(本文称为D2GA1)、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78(本文称为D2GA2)、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80(本文称为D2GA4)、SEQ ID NO.81/SEQ ID NO.82(本文称为D2GA5)、SEQ ID NO.83/SEQ ID NO.84(本文称为A6-A11)、SEQ ID NO.85/SEQ ID NO.86(本文称为A6-A12)、SEQ ID NO.87/SEQ ID NO.88(本文称为A6-A13)、SEQ ID NO.89/SEQID NO.90(本文称为A6-A14)、SEQ ID NO.91/SEQ ID NO.92(本文称为A6-A15)、SEQ IDNO.93/SEQ ID NO.94(本文称为A6-A17)、SEQ ID NO.95/SEQ ID NO.96(本文称为A6-A18)、SEQ ID NO.97/SEQ ID NO.98(本文称为A6-A20)、SEQ ID NO.99/SEQ ID NO.100(本文称为A6-A21)、SEQ ID NO.101/SEQ ID NO.102(本文称为A6-A22)、SEQ ID NO.103/SEQ ID NO.104(本文称为A6-A23)、SEQ ID NO.105/SEQ ID NO.106(本文称为A6-A24)、SEQ ID NO.107/SEQ ID NO.108(本文称为D2GA6)、SEQ ID NO.109/SEQ ID NO.110(本文称为D2GA9)、SEQ ID NO.111/SEQ ID NO.112(本文称为D2GA10)、SEQ ID NO.113/SEQ ID NO.114(本文称为D2GA11)、SEQ ID NO.115/SEQ ID NO.116(本文称为D2GB2)、SEQ ID NO.117/SEQ ID NO.118(本文称为D2GB6)、SEQ ID NO.1119/SEQ ID NO.120(本文称为D2GB7)、SEQ ID NO.121/SEQ ID NO.122(本文称为D2GB8)、SEQ ID NO.123/SEQ ID NO.124(本文称为D2GC1)、SEQ ID NO.125/SEQ ID NO.126(本文称为D2GC4)、SEQ ID NO.127/SEQ ID NO.128(本文称为D2GG1)，及其组合。
本公开提供一个Fab全人抗体片段，其具有来自重链的可变域和来自轻链的可变域，其中，重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ IDNO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ IDNO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ IDNO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91、SEQ IDNO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127，及其组合；且其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ IDNO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ IDNO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.96、SEQ IDNO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合；优选地，该全人抗体Fab片段具有重链可变域和轻链可变域，其中该抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ IDNO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ IDNO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69/SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ IDNO.73/SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78、SEQID NO.79/SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.81/SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83/SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85/SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.87/SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89/SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91/SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93/SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95/SEQ IDNO.96、SEQ ID NO.97/SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.99/SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.101/SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.103/SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.105/SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107/SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.109/SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111/SEQ IDNO.112、SEQ ID NO.113/SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115/SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.117/SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.1119/SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.121/SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.123/SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.125/SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.127/SEQ IDNO.128，及其组合。
本公开提供一个单链人抗体，其具有来自重链的可变域、来自轻链的可变域、连接重链和轻链可变域的连接肽，其中，重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQID NO.59、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQID NO.101、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ IDNO.111、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127，及其组合；其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ IDNO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ IDNO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.94、SEQ IDNO.96、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合；优选地，该全人单链抗体具有重链可变域和轻链可变域，其中该抗单链全人抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ IDNO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ IDNO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65/SEQID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69/SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76、SEQ IDNO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.81/SEQ ID NO.82、SEQID NO.83/SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85/SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.87/SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89/SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91/SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93/SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95/SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.97/SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.99/SEQ IDNO.100、SEQ ID NO.101/SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.103/SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.105/SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107/SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.109/SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111/SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113/SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115/SEQ IDNO.116、SEQ ID NO.117/SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.1119/SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.121/SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.123/SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.125/SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.127/SEQ ID NO.128，及其组合。
本公开进一步提供一种治疗广谱哺乳动物癌症的方法，包括以抗EGFR多肽的有效剂量给药，其中所述抗EGFR多肽选自：一种与EGFR表位结合且结合亲和度为至少10-6M的IgG类全人抗体；具有重链可变域和轻链可变域的全人抗体Fab片段；具有来自重链的可变域、来自轻链的可变域、连接所述轻链和重链可变域的连接肽的单链人抗体；及其组合；
其中，所述全人抗体的重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ IDNO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ IDNO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ IDNO.59、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ IDNO.101、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127，及其组合；且其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.94、SEQID NO.96、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ IDNO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合；
其中，所述全人抗体Fab片段的重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ IDNO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ IDNO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ IDNO.89、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127，及其组合；且其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ IDNO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ IDNO.72、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ IDNO.94、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合；
其中，所述单链人抗体的重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ IDNO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ IDNO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ IDNO.59、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ IDNO.101、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127，及其组合；且其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.94、SEQID NO.96、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ IDNO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合；
优选地，所述全人抗体具有重链和轻链，其中所述抗体的重链/轻链可变域序列选自以下序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ IDNO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ IDNO.64、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69/SEQID NO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80、SEQ IDNO.81/SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83/SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85/SEQ ID NO.86、SEQID NO.87/SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89/SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91/SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93/SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95/SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.97/SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.99/SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.101/SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.103/SEQID NO.104、SEQ ID NO.105/SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107/SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.109/SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111/SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113/SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115/SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.117/SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.1119/SEQID NO.120、SEQ ID NO.121/SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.123/SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.125/SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.127/SEQ ID NO.128，及其组合；优选地，所述全人抗体Fab片段具有重链可变域和轻链可变域，其中所述抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ IDNO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.
35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ IDNO.64、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69/SEQID NO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80、SEQ IDNO.81/SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83/SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85/SEQ ID NO.86、SEQID NO.87/SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89/SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91/SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93/SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95/SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.97/SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.99/SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.101/SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.103/SEQID NO.104、SEQ ID NO.105/SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107/SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.109/SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111/SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113/SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115/SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.117/SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.1119/SEQID NO.120、SEQ ID NO.121/SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.123/SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.125/SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.127/SEQ ID NO.128，及其组合；优选地，所述全人单链抗体具有重链可变域和轻链可变域，其中所述单链全人抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ IDNO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ IDNO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQID NO.64、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69/SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQ IDNO.75/SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80、SEQID NO.81/SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83/SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85/SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.87/SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89/SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91/SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93/SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95/SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.97/SEQ IDNO.98、SEQ ID NO.99/SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.101/SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.103/SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.105/SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107/SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.109/SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111/SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113/SEQ IDNO.114、SEQ ID NO.115/SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.117/SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.1119/SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.121/SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.123/SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.125/SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.127/SEQ ID NO.128，及其组合；
优选地，所述以此治疗的广谱哺乳动物癌症选自：卵巢癌、结肠癌、丗脞痰憺聁痰繪肂粟、骨髓瘤、原始神经母细胞性的CNS瘤、单核细胞性白血病、B细胞性白血病、T细胞性白血病、B细胞性淋巴癌、T细胞性淋巴癌、肥大细胞性肿瘤及其组合。
本申请的多肽可使用任何标准方法制得。在一个实施例中，所述多肽是以DNA重组的方法，通过将编码该多肽的核酸序列(例如，cDNA)插入重组表达载体，并在促进表达的条件下表达该DNA序列来制得的。
编码本文公开的各种多肽的核酸可以化学合成制得。可以选择密码子使用来提高细胞中的表达。所述密码子使用取决于所选择的的细胞类型。E.coli和其他细菌，以及哺乳类细胞、植物细胞、酵母菌细胞和昆虫细胞，都已经发展了专门的密码子使用模式。例如，参见：Mayfieldet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003100(2):438-42；Sinclair et al.Protein Expr.Purif.2002(1):96-105；Connell N D.Curr.Opin.Biotechnol.200112(5):446-9；Makrides et al.Microbiol.Rev.199660(3):512-38；和Sharp et al.Yeast.19917(7):657-78)。
用于核酸操作的常见技术描述例如可参见：Sambrook et al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2ed.,1989；或F.Ausubel et al.,CurrentProtocols in Molecular Biology(Green Publishing and Wiley-Interscience:New York,1987)及其定期更新，在此以引用方式并入本文。编码该多肽的DNA可操作地连接在源于哺乳类、病毒或昆虫基因的适当转录或翻译调节因子上。所述调节因子包括转录启动子、可选的用于控制转录的操纵子序列、编码适当mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。
重组DNA还可以包括可能对纯化蛋白有用的任何蛋白标记序列种类。蛋白标记的例子包括但不限于聚组氨酸标记、FLAG标记、myc标记、HA标记或GST标记。适用于细菌、真菌、酵母菌和哺乳类细胞宿主的克隆和表达载体可以参见：Cloning Vectors:A Laboratory Manual,(Elsevier,N.Y.,1985)。
采取适用于宿主细胞的方法将该表达结构引入宿主细胞。已知有各种用于将核酸引入宿主细胞的方法，包括但不限于：电穿孔；以氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖(DEAE-dextran)或其他物质进行的转染；微弹轰击法(microprojectile bombardment)；脂质转染；以及，感染(其中载体充当感染原)。适当的宿主细胞包括原核细胞、酵母菌、哺乳类细胞或细菌细胞。
适当的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，E.coli或Bacillus spp。酵母菌，优选为Saccharomyces菌种(例如S.cerevisiae)，也可以用于多肽制备。各种哺乳类或昆虫细胞培养体系也可用于表达重组蛋白。用于在昆虫细胞中制备外源蛋白的Baculovirus体系可参见综述：Luckow and Summers,(Bio/Technology,6:47,1988)。适当的哺乳类宿主细胞系的例子包括内皮细胞、COS-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚肾细胞、HeLa、293和BHK细胞系。通过培养适当的宿主/载体体系来表达重组蛋白，以制备纯化多肽。在许多应用中，本文公开的众多多肽的小尺寸使得在E.coli中表达成为优选表达方法。然后，从培养基或细胞提取物中纯化该蛋白。
本文所公开的蛋白还可以使用细胞翻译体系来制备。为此，必须对编码该多肽的核酸进行修饰，以允许体外转录以产生mRNA并允许该mRNA在所用的特定无细胞体系(真核(例如哺乳类或酵母菌)无细胞翻译体系或原核(例如细菌)无细胞翻译体系)中进行无细胞翻译。本公开中的所述多肽可以通过蛋白化学领域众所周知的蛋白分离/纯化方法进行纯化。非限制性的例子包括：提取、重结晶、盐析(例如，硫酸铵或硫酸钠)、离心、渗析、超滤、吸附层析、离子交换层析、疏水层析、正相层析、反相层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析、亲和层析、电泳、逆流分布或其任意组合。纯化后，多肽可以交换入不同缓冲液，和/或以本领域所知各种方法中的任一种(包括但不限于过滤和渗析)浓缩。
纯化多肽优选为具有至少85％纯度，更优选的纯度为至少95％，最优选纯度为至少98％。无论该纯度的确切数值是多少，该多肽的纯度足以用作医药产品。
多肽的翻译后修饰
在一些实施例中，本发明的结合性多肽还可以包括翻译后修饰。示范性翻译后蛋白修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、在一些实施例中，本发明的结合性多肽还可以包括翻译后修饰。示范性翻译后蛋白修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化、泛素化、糖基化、羰基化、类泛素化、生物素酰化或添加多肽侧链或疏水基。由此一来，修饰后的可溶性多肽可能含有非氨基酸成分，例如脂类、多糖或单糖、磷酸。糖基化的一种优选形式为唾液酸化，其将一个或多个唾液酸部分链接至所属多肽。唾液酸部分提高蛋白的可溶性及血清半排出期，同时还降低其可能的免疫原性。例如，参见Raju et al.Biochemistry.200131；40(30):8868-76。可以测试所述非氨基酸成分对多肽功能性的影响以了解其对EGFR或EGF功能的拮抗作用(例如其对肿瘤生长的抑制作用)。
在一个特定实施例中，所述所述可溶性多肽的修饰形式包括将所述可溶性多肽链接至非蛋白质高分子。在一个特定实施例中，所述高分子为聚乙二醇(PEG)、聚丙醇或聚氧化烯烃，如美国专利4640835；4496689；4301144；4670417；4791192或4179337所述。修饰多肽的例子包括聚乙二醇化的A6。
PEG是可溶于水的聚合物，其市面有售，或可以根据本领域所熟知的方法(Sandler and Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York,Vol.3,pages 138-161)通过乙二醇的开环聚合反应制备而成。术语“PEG”用于广泛涵盖任何聚乙二醇分子，无论其大小或PEG末端的修饰为何，且可以用以下公式代表：X--O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH(1)，其中n＝20-2300且X为H或末端修饰(例如C1-4烷基)。在一个实施例中，本发明的PEG的一个末端以羟基或甲氧基结尾，即X为H或CH3(“甲氧基PEG”)。PEG还可以进一步包括：结合反应所必需的化学基团；源于该分子的化学合成的化学基团；或作为该分子的部分的最佳距离的间隔子的化学基团。此外，所述PEG可以由一个或多个连接在一起的PEG侧链组成。具有多个PEG链的PEGs称为多臂或分支PEGs。分支PEGs可以通过例如向各种多元醇(包括甘油、季戊四醇、山梨醇)添加聚氧化乙烯来制备。例如，可以从季戊四醇和环氧乙烷制备4臂分支PEG。分支PEG参见例如EP-A0473084和美国专利5932462所述。PEGs的一种形式包括两个通过赖氨酸的主要氨基链接的PEG侧链(PEG2)(Monfardini et al.,Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。
可以选择各种分子量形式的PEG(例如，约1000道尔顿(Da)-100000Da(n＝20～2300))来连接至EGFR结合性多肽。PEG中得重复单元数“n”是根据以道尔顿为单位的分子量的近似值。优选地，一个激活的连接子上的PEG的总分子量适合于医药用途。因此，在一个实施例中，所述PEG分子的分子量不超过100000Da。例如，若3个PEG分子连接在链接子上，而每个PEG分子具有相同的分子量(12000Da，每个n约为270)，那么连接子上的PEG总分子量为月36000Da(总n为约820)。连接在连接子上的PEG分子量也可以不同，例如，在连接子上的3个PEG分子中，其中可以有2个各5000Da(每个n为约110)和1个12000Da(n为约270)的PEG分子。
本发明的一个具体实施例中，EGFR结合性多肽共价连接在通式
--CO--(CH2)x--(OCH2CH2)m—OR的一个聚(乙二醇)基团上，其中所述聚(乙二醇)基团的—CO(即羰基)与所述结合性多肽的一个氨基形成酰胺键；R为低烷基；x为2或3；m为约450-约950；且n和m的选择使得所述结合物减去结合性多肽的分子量为约10-40kDa。在一个实施例中，结合性多肽的赖氨酸的6-氨基为可用(自由)氨基。
上述结合物可以更具体地由通式(II)表示：P--NHCO--(CH2)x--(OCH2CH2)m--OR(II)，其中P为如本文所述的结合性多肽的基团(即无与通式(II)所示羰基形成酰胺的一个或多个氨基)；且其中R为低级烷基；x为2或3；m为约450至约950，且其选择在于使得缀合物分子量减去结合性多肽分子量的差值为约10-40Da。本文中所称的“m“的指定范围具有定向含义。在任何情况下，”m“的确切范围由PEG基团的分子量决定。
在一个特定实施例中，使用PEG的碳酸酯来形成该聚乙二醇化结合性多肽缀合物。可以用N,N'-二琥珀酰亚胺碳酸酯(N,N'-disuccinimidylcarbonate，DSC)与PEG反应以形成活性混合PEG-琥珀酰亚胺碳酸酯，随后可用该产物与连接肽的亲核基团或结合多肽的氨基反应(参见美国专利5281698和5932462)。在一种相似反应类型中，可以用1,1'-(二苯并三唑)碳酸酯(1,1'-(dibenzotriazolyl)carbonate)和二-(2-吡啶)碳酸酯(di-(2-pyridyl)carbonate)分别与PEG反应以形成PEG-苯并三唑和PEG-吡啶混合碳酸酯(美国专利5382657)。
在一些实施例中，该聚乙二醇化结合性多肽包括共价连接在N端氨基酸的α-氨基上的PEG分子。位点特异性的N端还原胺化反应如Pepinsky et al.,(2001)JPET,297,1059和美国专利5824784所述。PEG-醛在采用其他可用亲核氨基的蛋白的还原胺化反应中的用途，如美国专利4002531、Wieder et al.,(1979)J.Biol.Chem.254,12579和Chamow et al.,(1994)Bioconjugate Chem.5,133所述。
在另一个实施例中，聚乙二醇化的结合性多肽包括一个或多个PEG分子，所述PEG分子与连接子共价连接，而连接子则与该结合性多肽N端氨基酸残基的α氨基相连接。所述途径公布于美国专利公开2002/0044921和WO094/01451中。
在一个实施例中，结合性多肽的C端聚二乙醇化。在一个特定实施例中，通过引入C端叠氮蛋氨酸，随后通过斯陶丁格(Staudinger)反应连接甲基-PEG-三芳基磷化合物，来在蛋白质C端实现聚二乙醇化。Cazalis et al.,Bioconjug.Chem.2004；15(5):1005-1009中叙述了该C端链接方法。
缀合反应中，结合性多肽与激活PEG的比值可以约为1：0.5至1：50，约1:1至1:30，或约1:5至1:15。本发明中，可使用各种水性缓冲液来催化PEG至结合性多肽的共价加成。在一个实施例中，所用缓冲液的pH为约7.0至9.0。在又一个实施例中，pH在略微碱性的范围内，例如从约7.5至8.5。可以使用pKa接近中性pH的缓冲液，例如磷酸缓冲液。
可以使用本领域的常规分离和纯化技术来纯化聚乙二醇化结合性多肽，例如尺寸排阻(例如凝胶过滤)和离子交换层析法。也可以使用SDS-PAGE来分离产物。可以被分离出来的产物包括单体、二聚、三聚、多聚和未聚乙二醇化结合性多肽，以及自由PEG。单PEG缀合物的百分比控制，可以通过在洗脱峰附近汇聚更广馏分来增加该组合物中的单PEG百分比。单PEG缀合物百分比在约90％，代表着产量和活性的良好平衡。可能期望的组合物中例如至少93％或至少96％的缀合物为单PEG种类。在本发明的另一个实施例中，该单PEG缀合物百分比为90％-96％。
在一个实施例中，本发明的该聚乙二醇化结合性多肽包括1个、2个或更多的PEG部分。在一个实施例中，该PEG部分连接在该蛋白表面的氨基酸残基上和/或远离该蛋白接触目标配体的表面。在一个实施例中，该聚乙二醇化结合性多肽中的PEG合并或总分子量为约3000-60000Da，可选为约10000-36000Da。在一个实施例中，聚二乙醇化结合性多肽中的PEG基本为线形直链PEG。
本发明的一个实施例中，该聚乙二醇化结合性多肽并非使用羟胺法(例如450mM羟胺(pH6.5)在室温下反应8-16小时)从聚乙二醇化氨基酸残基水解而来，因此是稳定的。在一个实施例中，该组合物中超过80％为稳定的单PEG结合性多肽，更优选为至少90％，且最优选为至少95％。
在又一个实施例中，本发明中的该聚乙二醇化结合性多肽优选为，相对于未修饰蛋白保持至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的生物活性。在一个实施例中，生物活性指的是其与EGFR结合的能力，以KD、kon或koff来评估。在一个特定实施例中，该聚乙二醇化结合性多肽蛋白相对于未聚乙二醇化的结合性多肽，表现出增强的VEGFR结合能力。
相对于未修饰结合性多肽的清除率，PEG修饰的多肽的血清清除率可以降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％。该PEG修饰的多肽的半排出期(t1/2)也可能相对于未修饰蛋白得到改善。相对于未修饰结合性多肽的半排出期，该PEG修饰的多肽的半排出期可以被改善至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％或500％，或甚至1000％。在一些实施例中，该蛋白半排出期是体外测定的，例如在盐水缓冲溶液或血清中。在其他实施例中，该蛋白半排出期是体内半排出期，例如该蛋白在血清或其他动物体液中的半排出期。
治疗剂型和给药模式
本公开中的特点之一在于，提供了用于治疗对抑制EGF生物活性有应答的病症或预防其前置症状。优选的实施例中，所述病症的特征在于肿瘤生长。给要得技术的剂量取决于特定多肽类型及治疗中的特定症状，但能够被本领域技术人员容易地确定。一般来说，监管机构要求用作药物的蛋白试剂的制型能够使得致热源达到可接受的低水平。由此一来，药物制型通常会与其他制型非常不同，因为其几乎没有致热源，或至少仅含有由适当监管机构(例如，FDA)所确定的可接受致热源水平。
本公开的治疗组合物可以与药学可接受稀释剂、载体或赋形剂以单位剂型一同给药。给药的非限定性示例可以是非肠道的(例如静脉注射，皮下注射)、口服或外用的。此外，可以使用任何基因治疗技术(使用编码本发明多肽的核酸)，例如裸DNA递送、重组基因和载体、基于细胞的递送，包括间接体内操作患者细胞等。
该组合物可以用丸剂、片剂、胶囊、液体或持续释放片剂的形式用于口服给药；或以液体形式用于静脉注射、皮下注射或非肠道给药；以凝胶剂、洗剂、软膏剂、乳膏剂或聚合物形式进行外用给药。
本领域中熟知的制型方法可以参见例如"Remington:The Science and Practice of Pharmacy"(20th ed.,ed.A.R.Gennaro A R.,2000,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.)。外用给药的制型可以例如包括赋形剂、无菌水、盐水、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物原料油或氢化萘。可以使用可生物相容、可生物降解的丙交酯聚合物，丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物来控制化合物的释放。可以使用纳米颗粒剂型(如可生物降解的纳米粒子、固体脂质纳米粒、脂质体)来控制化合物的体内分布。其他潜在的有用非肠道递送体系包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。该化合物的制型浓度根据若干因素而改变，包括药物给药剂量和给药途径。
治疗有效剂量指的是对给药对象产生疗效的剂量。确切剂量取决于需治疗的病症，且可以由本领域技术人员使用已知技术来确定查明。一般来说，该多肽的给药为每天约0.01μg/kg至约50mg/kg，优选为每日0.01mg/kg至约30mg/kg，最优选为每日0.1mg/kg至约20mg/kg。该多肽可以每天给药(例如每日一次、两次、三次或四次)或优选为较低频率给药(例如，每周、每两周、每三周、每月或每季度)。此外，本领域已知，可能需要根据年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用和疾病严重程度来调节。
用法示例
此述的EGFR结合性蛋白及其相关变体可用于多种治疗和诊断应用中，包括通过竞争或阻断与EGFR的结合来抑制VEGF的生物活性。
基于其作为VEGF生物活性抑制剂的效力，本公开的多肽能够有效对抗多种与炎性疾病和肿瘤生长相关的病症，包括但不限于：自身免疫性疾病(例如，类风湿关节炎，炎性肠病或银屑病)；心脏疾病(例如，动脉粥样硬化或血管再狭窄)；视网膜病(例如，一般增生性视网膜病变，糖尿病性视网膜病变，年龄相关性黄斑变性或新血管性青光眼)，肾病(例如，糖尿病性肾病，恶性肾硬化，血栓性微血管病综合征；移植排斥；炎性肾病；肾小球肾炎；系膜增殖性肾小球肾炎；溶血性尿毒综合症；及高血压性肾硬化)；成血管细胞瘤；血管瘤；甲状腺增生；组织移植；慢性炎症；梅格斯综合征(Meigs's syndrome)；心包积液；胸腔积液；自身免疫性疾病；糖尿病；子宫内膜异位症；慢性哮喘；不良纤维化(尤其是肝纤维化)和癌症，以及癌症并发症，例如胸膜积液和腹水。优选地，本公开的EGFR结合性多肽可用于治疗或预防过度增生性疾病或癌症以及癌转移扩散。癌症的非限制性例子包括膀胱癌、血液癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、软骨癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴结癌、神经组织癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、骨骼肌癌、皮肤癌、脊髓癌、脾癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、气管癌、泌尿生殖道癌、输尿管癌、尿道癌、子宫癌或阴道癌。其他可治疗的病症可参见美国专利6524583，在此以引用方式全文并入。其他描述EGFR结合性多肽的参考文献包括：McLeod et al.,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.2002；43(2):474-82；Watanabe et al.,Exp.Dermatol.2004；13(11):671-81；Yoshiji et al.,Gut.200352(9):1347-54；Verheul et al.,Oncologist.2000；5Suppl 1:45-50；and Boldicke et al.,Stem Cells.200119(1):24-36。
如本文所述，癌症包括但不限于：实体瘤、血液瘤(如白血病)和肿瘤转移；良性肿瘤，如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和化脓性肉芽肿；炎性病症，如免疫和非免疫炎症；慢性关节风湿病和牛皮癣；眼部血管疾病，例如糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变、黄斑变性、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织增生、虹膜红变；奥斯勒-韦伯综合征(Osler-Webber Syndrome)；心肌血管生成；斑块新生血管；毛细血管扩张；血友病患者的关节；血管纤维瘤；和伤口肉芽和伤口愈合；毛细血管扩张牛皮癣硬皮病、化脓性肉芽肿、冠状动脉侧枝、缺血性肢体血管生成、角膜病变、虹膜红变、关节炎、糖尿病新生血管、骨折、血管、血细胞生成。
EGFR结合多肽可单独给药或与一种或多种附加疗法共同给予，例如化疗、放疗、免疫疗法、手术治疗或其任意组合。如上所述，在其他治疗策略中，也可以使用长期疗法或辅助疗法。所述方法的某些实施例中，可以共同(同时)或不同时期(前后相继)地用一种或多种多肽治疗剂给药。此外，多肽治疗剂可以与另一种类的癌症治疗化合物共同给药。
在某些实施例中，本发明所述抗EGFR抗体剂可单独使用。可选地，所述药剂可以与针对增殖性紊乱(如肿瘤)的治疗或预防的其他常规抗癌治疗途径组合使用。例如，所述方法可用于癌症预防药，癌症术后复发和转移预防，以及作为其他常规癌症疗法的佐药。本公开认为，常规癌症疗法(例如化疗、放疗、光疗、免疫疗法和手术)的效力可以通过使用所述多肽治疗剂来增强。
据发现，多种常规化合物都具有抗肿瘤活性。这些化合物被用作化疗中的治疗剂，以收缩实体瘤，预防转移瘤和预防进一步生长，或降低白血病或骨髓恶性瘤中的恶性细胞数量。虽然化疗对治疗多种恶性瘤有效，但许多抗肿瘤化合物会导致有害副作用。据发现，当结合两种或以上不同治疗时，治疗可能协同作用，允许降低每种治疗的剂量，由此降低每种化合物在较高剂量下产生的有害副作用。在其他实施例中，难于以一种疗法治疗的恶性瘤可能会响应两种或以上不同疗法的组合疗法。
当本发明的多肽治疗剂附随或前后相继地与其他常规抗肿瘤剂组合给药时，所述治疗剂可能提高抗肿瘤剂的疗效，或克服所述抗肿瘤剂的细胞抗性。这能够减少抗肿瘤剂的剂量，由此降低有害副作用，或恢复抗肿瘤药在抵抗细胞中的效力。
可用于组合抗肿瘤疗法的要学化合物包括但不限于：氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、天冬酰胺酶、卡介苗、比卡鲁胺、博来霉素、布舍瑞林、白消安、喜树碱、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、秋水仙碱、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、己二烯雌酚、己烯雌酚、多西他赛、多柔比星、表柔比星、雌二醇、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟达拉滨、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、染料木黄酮、戈舍瑞林、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素、伊立替康、依立替康、来曲唑、亚叶酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、氮芥、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、诺考达唑、奥曲肽、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸、喷司他丁、普卡霉素、卟吩姆、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、苏拉明、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾酮、硫鸟嘌呤、塞替派、二氯二茂钛、拓扑替康、曲妥珠单抗、维甲酸、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
某些化疗抗肿瘤化合物可以通过其进入例如下列基团的作用机理进行分类：代谢拮抗剂/抗癌剂，例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包括天然产物如长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)、微管干扰物如紫杉烷(紫杉醇、多西他赛)、新长春碱、长春碱、诺考达唑、埃博霉素和诺维本、epidipodophyllotoxins(依托泊苷、替尼泊苷)、DNA损伤剂(放线菌素、安吖啶、蒽环类药物、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环磷酰胺、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六甲密胺奥利沙伯、异环磷酰胺、美法仑、merchlorehtamine、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼、泰素、泰索帝、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP16))；抗生素如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、蒽环类、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶，其系统性地代谢L-天冬酰胺并消除无法自身合成天冬酰胺的细胞)；抗血小板药物；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂如氮芥类(氮芥、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲密胺和噻替派)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)及类似物、链佐星)、trazenes-达卡巴嗪(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂代谢拮抗剂，例如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位络合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特；激素、激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香化酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝剂(肝素、合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(例如组织纤维溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；抗迁移剂；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢霉素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(TNP-470、染料木黄酮)和生长因子抑制剂(例如、VEGF抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻断剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、eniposide、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康)、皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松、和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导物和半胱天冬酶活化剂；和染色质干扰物。
根据组合疗法的性质，可以在施加其他疗法的同时和/或之后以该多肽治疗剂给药。该多肽治疗剂的给药可以是单剂或多剂。在一些实施例中，该多肽治疗剂的给药开始于常规疗法之前的至少数天；而在其他实施例中，给药开始于紧接着该传统疗法之前或在施予传统疗法的同时。
此述的EGFR结合蛋白还可以加上可检测标记，并与表达EGFR的细胞接触，以用于成像应用或诊断应用。对于诊断目的，本发明的多肽优选为固定在固体支架中。优选的固体支架包括柱(例如亲和柱，如琼脂糖基的亲和柱)、微芯片或珠。
在一个诊断应用的实施例中，从疑患癌症的病人取得生物样本，例如血清或组织活体切片，与本发明的可检测标记多肽接触，以检测EGFR水平。然后，将该EGFR水平与正常样本与该标记多肽接触而测得的EGFR水平比较。EGFR水平的增量为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，可看作是以癌症为特征的病症的诊断指标。
在一些实施例中，本发明的EGFR结合多肽进一步附着了能够被检测的标记(例如，该标记可以是放射同位素、荧光化合物、酶或辅酶因子)。活性部分可以是放射性试剂，例如放射性重金属如铁螯合物，钆或锰的放射性螯合物，氧、氮、铁、碳或钆的正电子发射体，43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、68Ga、123I、125I、131I、132I或99Tc。可以使用连接有该部分的结合剂来作为成像剂，并以哺乳类(例如人类)诊断目的的有效剂量来给药，然后检测该成像剂的定位和累积。可以用放射性闪烁摄影术、核磁共振成像、计算机断层扫描或正电子成像术来检测该成像剂的定位和累积。可以使用指向EGFR的EGFR结合多肽的免疫闪烁成像，来检测和/或诊断癌症和脉管系统。例如，任何针对EGFR的结合性多肽，以99锝、111铟或125碘标记后均可以有效地用于所述成像。对于本领域技术人员来说，显而易见，给药的放射性同位素量取决于该放射性同位素。本领域技术人员可以容易地根据用作活性部分的指定放射性核素的比活性和能量来计算成像剂的给药量。典型地，本领域技术人员在给药中使用每剂0.1-100毫居成像剂，优选为1-10毫居，更常用的是2-5毫居。因此，本发明中可用作成像剂的组合物包含缀合的放射性部分和靶向部分，其含0.1-100毫居，在一些实施例中优选为1-10毫居，在一些实施例中优选为2-5毫居，在一些实施例中更优选为1-5毫居。
该EGFR结合多肽还可用于想表达EGFR的细胞或组织递送额外的治疗试剂(包括但不限于药物化合物、化疗化合物和放疗化合物)。在一个实施例中，该EGFR结合性多肽与化疗试剂熔合，以将该化疗试剂靶向递送至表达EGFR的肿瘤细胞或组织。
该EGFR结合多肽可用于各种应用中，包括研究、诊断和治疗应用。例如，其可用于分离和/或纯化受体或其部分，以及用于研究受体结构(例如构象)和功能。
在一些方面中，可以使用所述多种结合性多肽来检测或测量EGFR表达，例如在内皮细胞(例如静脉内皮细胞)或被EGFR基因转染的细胞上的表达。因此，其还可以用于例如细胞分选和成像(例如流式细胞仪和荧光激活细胞分选)，以用于诊断或研究目的。
在一些实施例中，所述结合性多肽或其片段用于诊断目的时可以标记或不标记。典型第，诊断性分析需要检测结合性多肽与EGFR之间结合而形成的复合物。所述结合性多肽或其片段可以被直接标记，类似于抗体。可以使用各种标记，包括但不限于，放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、辅酶因子、酶抑制剂和配体(例如生物素、半抗原)。本领域技术人员熟知多种适当的免疫分析法(例如参见美国专利3817827、3850752、3901654、4098876)。未标记的结合性多肽可用于分析中，例如凝集试验。未标记的结合性多肽还可以与另一种(一种或多种)可用于检测该结合性多肽的适当试剂(例如能与该结合性多肽反应的已标记抗体或其他适当试剂(如标记的蛋白A))组合使用。
在一个实施例中，本发明的结合性多肽可用于酶免疫分析，其中所述多肽与酶缀合。当含有EGFR蛋白的生物样本与所述结合性多肽EGFR接触时，结合性多肽和EGFR蛋白之间发生结合。在一个实施例中，含有表达EGFR蛋白的细胞(例如内皮细胞)的样本与所述抗体接触，而在结合性多肽和载有能被该结合性多肽识别的EGFR蛋白的细胞之间发生结合。已结合细胞可以从未结合试剂中分离，且可以测定特异结合至细胞上的结合性多肽-酶嵌合体的存在，例如通过令该样本与能够在该酶作用下产生颜色或其他可检测变化的酶底物相接触。在又一个实施例中，可以不标记所述结合性多肽，而添加第二种已标记多肽(例如一种抗体)来识别所述结合性多肽。
在一些方面中，还可以制备用于检测生物样本中的EGFR蛋白的存在的试剂盒。所述试剂盒可包括与EGFR蛋白或所述受体的部分相结合的EGFR结合性多肽，以及一种或多种适用于检测结合性多肽与受体蛋白或其部分之间的复合物的存在的辅助试剂。本发明的多肽组合物可提供为单独或与其他表位特异性的额外抗体组合的冻干形式，所述标记或未标记的结合性多肽和/或抗体可以与辅料(例如，缓冲液，例如Tris、磷酸和碳酸盐缓冲液；稳定剂；赋形剂；杀菌剂和/或惰性蛋白例如牛血清白蛋白)一起包含在试剂盒中。例如，该结合性多肽和/或抗体可以与辅料共同提供为冻干形式，或辅料可以单独提供，由使用者来组合。一般来说，所述辅料的含量低于多肽或抗体浓度的约5％重量，且通常总量至少为多肽或抗体浓度的约0.001％重量。当使用了第二种能够与该结合性蛋白结合的抗体时，所述抗体在该试剂盒中可以例如提供在单独的试管或容器中。该第二抗体(若存在)一般已标记，且可以制型为与上述抗体制型的类似形式。
相似地，本公开还提供了一种用于检测和/或定量EGFR表达的方法，其中，一种含有细胞或其碎片(例如，膜碎片)的组合物在适合结合的条件下与能结合EGFR的结合性多肽或其部分相接触，并监控其结合。若检测到结合性多肽，则表明该结合性多肽和EGFR或其部分之间形成了复合物，因此表明了受体的存在。多肽与细胞的结合可以用标准方法来测定，例如实施例中所述的方法。所述方法可用于检测个体中的EGFR在细胞上的表达。可选地，可以评估内皮细胞表面上的EGFR的数量表达，例如通过流体细胞仪，且染色强度可以与疾病易感性、进程或风险相关。
本公开还提供了一种检测哺乳类对某些病症的易感性的方法。举例而言，该方法可用于检测哺乳类对于进程基于细胞上的EGFR量和/或哺乳类体内的EGFR-阳性细胞的数量的病症的易感性。在一个实施例中，本发明涉及一种检测哺乳类对肿瘤的易感性的方法。在此实施例中，将需测试的样本与能结合EGFR的结合性多肽或其部分相接触，其中该样本包括在正常个体中表达EGFR的细胞。对该结合和/或结合量进行检测，以表明该个体对肿瘤的易感性，其中较高的受体水平与较高的个体对肿瘤易感性相关。
除非文中他处另有指明，否则下列术语应当理解为具有如下含义：
术语“EGFR抑制剂”和“EGFR拮抗剂”可交换使用，两者均指能可检测地抑制EGFR的至少一种功能的分子。相反地，“EGFR激动剂”是指能可检测地增强EGFR地至少一种功能的分子。由EGFR抑制剂引起的抑制无需是完全抑制，只要其能被化验检测到即可。可以使用EGFR功能的任何化验，本文提供了一些示例。能够被EGFR抑制剂所抑制或被EGFR激动剂所增加的EGFR功能的例子包括：癌细胞生长或凋亡(程序性细胞死亡)等等。EGFR抑制剂和EGFR激动剂类型的例子包括但不限于：EGFR结合多肽(例如抗原结合蛋白(如：EGFR抑制抗原结合蛋白))、抗体、抗体片段和抗体衍生物。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”均指包括2个或以上相互以肽键连接的氨基酸残基的分子。这些术语涵盖，例如，天然和人工蛋白、蛋白片段、蛋白序列的多肽类似物(例如突变蛋白、变体蛋白或融合蛋白)，以及翻译后修饰蛋白，或共价或非共价修饰蛋白。肽、多肽或蛋白可以是单体或聚合体。
多肽(例如，抗体)的“变体”包括：相对于其他多肽序列而插入、删除和/或取代了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。已公开的变体包括，例如，融合蛋白。
多肽的“衍生物”是经过化学修饰的多肽(例如，抗体)，如通过连接另一个化学部分(例如，聚乙二醇，或白蛋白，如人血清白蛋白)、磷酸化和糖基化。除非另有说明，否则术语“抗体”除了指含有两条全长的重链和两条全长的轻链的抗体之外，还包括其衍生物、变体、片段及突变蛋白，其示例如下所述。
“抗原结合蛋白”是包括以下部分的蛋白：与抗原结合的部分；以及可选地，允许抗原结合部分采取促进抗原结合蛋白与蛋白的结合的构型的支架或骨架部分。抗原结合蛋白的例子包括抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。该抗原结合蛋白可以包括，例如，具有接枝的CDRs或CDRs衍生物的替代蛋白支架或人工支架。所述支架包括但不限于，包含引入了突变(例如用于稳定该抗原结合蛋白的三维结构的突变)的抗体衍生支架，以及包括例如生物可相容聚合物的全合成支架。例如参见：Korndorfer et al.,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,Volume 53,Issue 1:121-129；Roque et al.,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。此外，可以使用多肽抗体模拟物("PAMs")，以及基于以纤维蛋白连接素成分为支架的抗体模拟物的支架。
抗原结合蛋白可以具有，例如，天然存在的免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是四聚物分子。在天然存在的球蛋白中，每个四聚物由2对相同的多肽链组成，每对中有一条“轻”(约25kDa)链和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括约100-110或以上氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每条链的羰基末端部分具有恒定区，主要负责效应子功能。人轻链归类为κ(kappa)或λ(lambda)轻链；重链归类为μ(mu)、Δ(delta)、γ(gamma)、α(alpha)或ε(epsilon)，分别令抗体的种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。优选地，本申请公开的该抗EGFR抗体的特征在于其重链和轻链氨基酸序列中的可变域序列(VH和VL)。优选抗体为VK-B8(кIgG抗体)。在轻链和重链中，可变域和恒定域由约12个或以上氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括一个再含约10个或以上氨基酸的“D”区。一般请参见Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))。每对轻/重链的可变域组成了抗体结合位点，因此一个完整的免疫球蛋白具有2个结合位点。天然存在的免疫球蛋白链具有的相同通用结构为相对保守骨架区(FR)连接3个高变区(也称为互补决定区或CDRs)。从N-端到C-端，轻链和重链均包含以下域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个域中的氨基酸分配与Kabat et al.在Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.,US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIHPublication no.91-3242,1991中所述一致。其他的免疫球蛋白链氨基酸编号系统包括IMGT.RTM.(国际免疫遗传学信息系统(International ImMunoGeneTics information system；Lefranc et al.,Dev.Comp.Immunol.29:185-203；2005)和AHo(Honegger and Pluckthun,J.Mol.Biol.309(3):657-670；2001)。
“抗体”指的是完整免疫球蛋白或其能与完整抗体为特异结合而竞争的抗原结合部分，除非另有说明。抗原结合部分可以由重组DNA技术或完整抗体的酶切或化学裂解法制备。抗原结合部分包括但不限于：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、域抗体(dAbs)，以及互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、二聚体、三聚体、四聚体和至少包含足以令特定抗原与多肽结合的免疫球蛋白部分的多肽。
Fab片段是具有VL、VH、CL和CH1域的单价片段；F(ab')2片段是具有2个Fab片段的二价片段，其Fab片段在铰链区处由二硫键连接；Fd片段具有VH和C H1域；Fv片段具有抗体单臂的VL和VH域；dAb片段具有VH域、VL域或具有VH域或VL域的抗原结合片段(美国专利6846634、6696245，在此以引用的方式全文并入)。
单链抗体(scFv)是一种抗体，其中VL和VH域由连接子(例如，氨基酸残基合成序列)连接以形成连续蛋白链，且该连接子的长度足以允许该蛋白链自身折叠并形成单价抗原结合位点(Bird et al.,1988,Science 242:423-26and Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-83)。
二聚体是含有两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包括由连接子连接的VL和VH域，且该连接子长度短，不允许同一条链上的两个域之间配对，由此每个域能够与另一条多肽链上的互补域配对(Holliger et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-48,and Poljak et al.,1994,Structure 2:1121-23)。若二聚体的2条多肽链相同，则其配对所得的二聚体将具有2个相同的抗原决定位点。具有不同序列的多肽链可用于形成具有2个不同抗原结合位点的二聚体。类似地，三聚体和四聚体分别是含有3个或4个多肽链并分别形成3个或4个抗原结合位点(可以相同或不同)的抗体。
可以识别特定抗体的互补决定区(CDRs)和骨架区(FR)(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5.sup.th Ed.，US Dept.of Health and Human Services，PHS，NIH，NIH Publication no.91-3242，1991)。其他的免疫球蛋白链氨基酸编号系统包括
IMGT.RTM(IinternationalImMunoGeneTics information system；Lefranc et al.，Dev.Comp.Immunol.29：185-203；2005)和AHo(Honegger and Pluckthun，J.Mol.Biol.309(3)：657-670；2001)。一个分子中可以共价或非共价地包含一个或多个CDRs，来使其成为抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以并入作为较大多肽链的一部分的CDR(s)，可以将该CDR(s)共价连接另一个多肽链，或可以非共价地连接该CDR(s)。所述CDRs允许该抗原结合蛋白与所需的特定抗原进行特异结合。
抗原结合蛋白可以具有一个或多个结合位点。若有超过一个结合位点，这些结合位点可以相同或不同。例如，天然存在的人免疫球蛋白典型地具有2个相同结合位点，而“双特异”或“双官能团”抗体则具有2个不同结合位点。
术语“人抗体”包括具有源于人免疫球蛋白序列的每个可变域和恒定域的所有抗体。在一个实施例中，全人抗体，其所有可变域和恒定域均源自人免疫球蛋白(全人抗体)。
人源化抗体的序列不同于源自非人物种的抗体序列，其差别在于一个或多个氨基酸的取代、删除和/或添加，由此令该人源化抗体在对人类对象给药时，引起免疫反应的可能性低于非人物种抗体，和/或引起的免疫反应严重性降低。在一个实施例中，非人物种抗体的重链和/或轻链的骨架和恒定区中的某些氨基酸突变，以产生人源化抗体。在又一个实施例中，人抗体的恒定区融合至非人物种的可变域。在又一个实施例中，非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基改变，以降低该非人抗体向人类对象给药时的可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基要么对于该抗体与其抗原的免疫特异结合来说并不重要，或该氨基酸序列的改变是保守变化，由此该人源化抗体与抗原的结合并不显著差于该非人抗体与抗原的结合。如何制备人源化抗体的示例可以参见美国专利6054297；5886152和5877293。
术语“嵌合抗体”指的是含有来自一个抗体的一个或多个区和来自一个或多个其他抗体的一个或多个区的抗体。
此外，骨架区可以来自相同的抗EGFR抗体之一，一个或多个不同抗体(例如人抗体)，或来自人源化抗体。在一个嵌合抗体的实施例中，其重链和/或轻链的局部等同于、同源于或来源于：特定物种的抗体，或类属于特定抗体类型或亚类的抗体；且所述链的剩余部分等同于、同源于或来源于：另一个特定物种的抗体，或类属于另一个特定抗体类型或亚类的抗体。还包括所述抗体具有所需生物活性的片段(美国专利4816567)。
“中和抗体”或“抑制抗体”是当过量抗EGFR抗体令激活量降低至少约20％(使用如本文实施例中所述的化验)时，对EGFR的蛋白水解激活进行抑制的抗体。在各实施例中，抗原结合蛋白将EGFR的激活量降低至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％和99.9％。
本领域技术人员根据本说明书的教导并使用本领域熟知的技术，能够容易地制备抗体片段或类似物。片段或类似物的氨基末端和羰基末端优选为靠近功能域的边界。可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或私人序列数据库，来识别结构域和功能域。可以使用计算机化的比较方法来识别存在于已知结构和/或功能的其他蛋白中的序列基序或预期蛋白构造域。
“CDR接枝抗体”是含有来自特定物种或种型抗体的一个或多个CDRs和来自相同或不同物种或种型的另一抗体的骨架的抗体。
“多特异抗体”是识别一种或多种抗原上的多个表位的抗体。此类型抗体的一个子类为“双特异抗体”，其识别相同或不同抗体上的两个不同表位。
若抗原结合蛋白在结合抗原(例如人EGFR)时的解离常数为1nM或以下，则称其与抗原“特异结合”。
“抗原结合域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”是指抗原结合蛋白上含有与抗原相互作用的氨基酸残基(或其他化学部分)并有利于该抗原结合蛋白对该抗原的特异性和亲和性的部分。对于与其抗原特异结合的抗体而言，这包括其至少一个CDR域的至少一部分。
“表位”是分子上连接抗原结合蛋白(例如，抗体)的部分。表位可以包括该分子的非邻近部分(例如，在多肽中，在多肽一级序列中并不相邻但在该多肽的三级和四级结构中相互足够靠近以被抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。
两个多核苷酸或两个多肽序列的“相同百分比”是用GAP电脑程序(GCG Wisconsin Package,version 10.3(Accelrys,San Diego,Calif.)中的一部分)以其默认参数来比较序列而确定的。
“宿主细胞”是可用于表达核酸的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如E.coli；或真核细胞，例如真核单细胞(如酵母菌或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(如人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、小鼠细胞、大鼠细胞或昆虫细胞)或杂种细胞。宿主细胞的例子包括猴肾细胞COS-7系(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al.,1981,Cell 23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物|(例如Veggie CHO)和在无血清培养基上生长的相关细胞系(Rasmussen et al.,1998,Cytotechnology 28:31)，或CHO的DX-B11品系(缺少DHFR)(Urlaub et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-20)、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系、源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL 70)(McMahan et al.,1991,EMBO J.10:2821)、人胚肾细胞(例如293、293EBNA或MSR 293)、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其他转化灵长类细胞系、正常二倍体细胞、源于初生组织和初生外植体的体外培养所得的细胞系、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。典型地，宿主细胞是能够以编码多肽且能够在该宿主细胞中表达的核酸转化或转染得到的培养细胞。术语“重组宿主细胞”可用于表示已经用需表达的核酸来转化或转染的宿主细胞。宿主细胞还可以是指包含该核酸，但在调控序列被引入该宿主细胞并与该核酸可操作连接以前，并不以所需表达水平来表达该核酸的细胞。应当理解，术语“宿主细胞”并不单指特定的对象细胞，而是也指所述细胞的后代或潜在后代。因为由于例如突变或环境影响的存在，后代中可能发生某些修饰，使得这些后代事实上与其亲代细胞并不等同，但其仍应属于本文中的“宿主细胞”术语所涵盖的范围。
抗原结合蛋白
抗原结合蛋白(例如抗体、抗体片段、抗体衍生物、抗体突变蛋白和抗体变体)是与EGFR(优选为人EGFR)结合的多肽。抗原结合蛋白包括抑制EGFR生物活性的抗原结合蛋白。含有一个或多个抗原结合蛋白的寡聚物可以用作EGFR的拮抗剂。寡聚物可以是共价连接或非共价连接的二聚体、三聚体或更高寡聚物的形式。也可以使用包括2个或更多抗原结合蛋白的寡聚物，其例子之一为同源二聚体。其他寡聚物包括
一个实施例指向一种含有2个融合蛋白的二聚体，所述融合蛋白是通过将一种抗EGFR抗体的EGFR结合片段与一个抗体的Fc区域相融合来获得的。该二聚体可以例如如下所述地制备：将编码该融合蛋白的基因融合插入适当的表达载体中，在以该重组表达载体转化的宿主细胞中表达该基因融合，并允许所表达的融合蛋白大致如抗体分子般组装，由此在Fc部分之间形成链间二硫键，以获得该二聚体。
术语“Fc多肽”包括源于抗体Fc区域的多肽的原生和突变形式。还包括含有促进二聚化的铰链区的所述多肽的截短形式。含有Fc部分的融合蛋白(及由此形成的寡聚物)提供的有益效果在于，易于通过蛋白质A或蛋白质G柱来以亲和层析法进行纯化。
另一种用于制备寡聚抗原结合蛋白的方法包括使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链域是促进其所在的蛋白质的寡聚化的多肽。亮氨酸拉链最初是在若干DNA结合蛋白中识别出来的(Landschulzet al.,1988,Science 240:1759)，此后在各种不同蛋白中也发现过。在已知的亮氨酸拉链中，有天然存在的多肽及其衍生物，能够二聚化或三聚化。适用于制备可溶寡聚蛋白的亮氨酸拉链域的例子如WO 94/10308所述，以及如Hoppe et al.,1994,FEBS Letters 344:191中所述的源自肺表面活化蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链。Fanslow et al.,1994,Semin.Immunol.6:267-78描述了一种修饰亮氨酸拉链，其允许与其融合的外源蛋白稳定地三聚化。在一种途径中，在适当的宿主细胞中表达含有与亮氨酸拉链融合的抗EGFR抗体片段或衍生物的重组融合蛋白，并从培养基上清液中回收可溶寡聚抗EGFR抗体片段或衍生物。
本公开提供一种EGFR抗原结合蛋白(例如，抗EGFR抗体)，其具有一种或多种下列特征：与人EGFR和鼠EGFR结合，抑制人EGFR激活，抑制鼠EGFR激活，与EGFR的配体结合域或其附近区域结合。
本发明的抗原结合蛋白的抗体结合片段可以用常规技术制备。所述片段的例子包括但不限于Fab和F(ab')2片段。
本公开提供与EGFR结合的单克隆抗体。单克隆抗体可以使用本领域已知的任何方法来制备，例如从完成免疫接种程序的转基因动物中收获脾细胞并使其无限增殖化。所述脾细胞可以使用本领域任何技术来达成无限增殖化，例如将其与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤。用于制备融合蛋白的杂交瘤技术的骨髓瘤细胞优选为不产生抗体、融合效率高，且缺乏某些酶从而无法在某些仅支持所需融合细胞(杂交瘤)生长的选择性培养基中生长的细胞。适用于小鼠融合的细胞系的例子包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0Bul；用于大鼠融合的细胞系的例子包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和48210。可用于细胞融合的其他细胞系有U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
针对EGFR的抗原结合蛋白可用于例如检测EGFR多肽的存在的体外或体内化验。所述抗原结合蛋白还可用在以亲和层析法对EGFR蛋白进行的纯化中。能够额外阻止配体结合介导EGFR激活的抗原结合蛋白，可以用于抑制来源于所述结合的生物活性。阻断性抗原结合蛋白可用于本申请所公开的方法中。具有EGFR拮抗剂功能的所述抗原结合蛋白可用于治疗任何EGFR引起的病症，包括但不限于各种癌症。
抗原结合蛋白可用于体外过程或体内给药以抑制EGFR诱导的生物活性。由此可以治疗由EGFR激活所导致或加重(直接或间接)的病症，所述病症的例子如本文所述。在一个实施例中，本发明提供了一种治疗方法，包括以降低EGFR诱导的生物活性的有效剂量，用EGFR阻断性抗原结合蛋白对哺乳动物进行体内给药。
抗原结合蛋白包括抑制EGFR生物活性(例如血管生成)的全人单克隆抗体。
抗原结合蛋白可以由多种常规技术中的任一种来制备。例如，可以使用任何本领域已知技术，从天然表达所述蛋白的细胞中纯化而得(例如，从产生一种抗体的杂交瘤中纯化该抗体)，或在重组表达体系中制备。例如，参见：Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimensionin Biological Analyses,Kennet et al.(eds.),Plenum Press,New York(1980)；and Antibodies:ALaboratory Manual,Harlow and Land(eds.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,(1988)。
本领域已知的任何表达体系均可用于制备本发明的重组多肽。一般来说，以含有编码一种所需多肽的DNA的重组表达载体来转化宿主细胞。可以使用的宿主细胞包括原核细胞、酵母菌或更高等的真核细胞。原核细胞包括革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，例如E.coli或bacilli。更高等的真核生物包括昆虫细胞扩已建立的源于哺乳类的细胞系。使用的哺乳类宿主细胞系的例子包括猴肾细胞(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al.,1981,Cell 23:175),L cells,293cells、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、BHK(ATCCCRL 10)细胞系、源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL 70)(McMahanet al.,1991,EMBO J.10:2821)。适用于细菌、真菌、酵母菌和哺乳类细胞宿主的克隆和表达载体如Pouwels et al.(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)所述。
转化后的细胞可以在促进多肽表达的条件下培养，且以常规蛋白纯化程序来回收多肽。一种所述纯化过程包括使用亲和层析法，例如，通过能与EGFR的全部或部分(例如胞外域)结合的基质。本申请的思路中使用的多肽包括基本不含内源性污染杂质的基本同质的重组哺乳类抗EGFR抗体多肽。
可以使用多种已知技术中的任一种来制备抗原结合蛋白并筛选所需性质。某些技术涉及分离编码有感兴趣的抗原结合蛋白(例如，抗EGFR抗体)的多肽链(或其部分)的核酸，并通过重组DNA技术操作该核酸。例如，该核酸可以融合到另一感兴趣的核酸，或通过添加、删除或取代一个或多个氨基酸残基来改变(例如，通过诱变或其他常规技术)。
单链抗体可通过氨基酸桥接(短连接肽)来连接重链和轻链可变域(Fv区)片段，以形成单一多肽链。所述单链Fvs(scFvs)通过在编码两个可变域多肽(VL和VH)的DNAs之间融合编码连接肽的DNA来制备。所得多肽可以自身折叠来形成抗原结合单体，或能够形成多聚体(例如二聚体、三聚体或四聚体)，取决于两个可变域之间的柔性连接子的长度(Kortt et al.,1997,Prot.Eng.10:423；Kortt et al.,2001,Biomol.Eng.18:95-108)。通过连接不同的含VL和VH的多肽，可以形成与不同表位结合的多价scFvs(Kriangkum et al.,2001,Biomol.Eng.18:31-40)。为制备单链抗体而开发的技术包括如美国专利4946778；Bird,1988,Science242:423；Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879；Ward et al.,1989,Nature 334:544,de Graaf et al.,2002,Methods Mol.Biol.178:379-87所述的技术。
用于从感兴趣的抗体获得不同子类或种型的抗体的方法是已知的，即子类转换(subclassswitching)。因此，例如可以从IgM抗体得到IgG抗体，反之亦然。此类技术允许制备既具有特定抗体(亲代抗体)的抗原结合性质，也具有不同于亲代抗体种型或子类的抗体的相关生物性质的新抗体。可以使用重组DNA技术。所述过程中可以使用编码特定抗体多肽的克隆DNA，例如编码所需种型抗体的恒定域的DNA(Lantto et al.,2002,Methods Mol.Biol.178:303-16)。此外，若需要的是IgG4，还可能希望在铰链区中引入点突变(CPSCP->CPPCP)(Bloom et al.,1997,Protein Science 6:407)，以减缓重链间形成二硫键从而可能导致IgG4抗体异质性的趋势。
在一些特定实施例中，本发明的抗原结合蛋白对EGFR的结合亲和性(Ka)为至少106nM。在另外一些实施例中，抗原结合蛋白的Ka为至少107、至少108、至少109、或至少1010nM。在另一个实施例中，该抗原结合蛋白的Ka与本申请实施例中所述的抗体实质相同。
在又一个实施例中，本公开提供了一种与EGFR的解离常数低的抗原结合蛋白。在一个实施例中，该抗原结合蛋白的Koff为1X 10-4至1X 10-1M或更低。在又一个实施例中，该Koff为5X 10-5至5X 10-1M或更低。在又一个实施例中，Koff与本申请实施例中所述的抗体实质相同。在又一个实施例中，抗原结合蛋白与EGFR结合的Ka与本申请实施例中所述的抗体实质相同。
本公开的另一个方面中，提供EGFR膜结合蛋白。在一个实施例中，该抗原结合蛋白的IC50为1000nM或以下。在又一个实施例中，该IC50为100nM或以下；在又一个实施例中，该IC50为10nM或以下。在又一个实施例中，该IC50与本申请实施例中所述的抗体实质相同。在又一个实施例中，该抗原结合蛋白抑制EGFR活性的IC50与本申请实施例中所述的抗体实质相同。
本公开的另一个方面中，提供与细胞表面表达的人EGFR结合的抗原结合蛋白，且当发生该结合时，抑制EGFR在该细胞中的信号活动。可以使用任何用于测定或估计细胞表面和/或细胞内部的EGFR量的方法。在其他实施例中，该抗原结合蛋白绑定至EGFR表达细胞，使得低于约75％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、1％或0.1％的细胞表面EGFR被内吞。
本公开的另一个方面中，提供一种抗原结合蛋白，其体外或体内(例如，对人类对象给药时)的半排出期为至少1天。在一个实施例中，该抗原结合蛋白的半排出期为至少3天。在又一个实施例中，该抗原结合蛋白的半排出期为4天或以上。在又一个实施例中，该抗原结合蛋白的半排出期为8天或以上。在又一个实施例中，该抗原结合蛋白衍生化或改性，从而使其半排出期与未衍生化或未改性的抗原结合蛋白相比更为长久。在又一个实施例中，该抗原结合蛋白包括一个或多个点突变，以增加血清半排出期，例如WO00/09560所述，在此以引用方式并入。
本公开还提供了多特异性抗原结合蛋白，例如双特异抗原结合蛋白(例如通过两个不同的抗原结合位点或区域，与EGFR的两个不同表位结合或与EGFR的表位和另一分子的表位结合的抗原结合蛋白)。此外，本申请公开的双特异抗原结合蛋白可以包括：来自此述的一种抗体的EGFR结合位点，以及来自此述的另一种抗体的另一EGFR结合区，其中涵盖本文引用其他出版物所描述的抗体。可选地，一种双特异性抗原结合蛋白可以包括一个来自此述的一种抗体的抗原结合位点，以及来自本领域所知的另一种EGFR抗体或以已知方法或此述方法制备的抗体的又一抗原结合位点。
本领域中已知多种制备双特异性抗体的方法。所述方法包括使用杂交-杂交瘤(hybrid-hybridomas)，如Milstein et al.,1983,Nature 305:537所述，以及抗体片段的化学连接(Brennan et al.,1985,Science 229:81；Glennie et al.,1987,J.Immunol.139:2367；美国专利6,010,902)。此外，双特异性抗体可以通过重组途径来制备，例如使用亮氨酸拉链部分(即，来自优选地形成异源二聚体的Fos和Jun蛋白；Kostelny et al.,1992,J.Immunol.148:1547)或其他锁匙互动域结构，如美国专利5582996所述。额外的可用技术包括如美国专利5959083和5807706中所述的技术。
在又一个方面中，抗原结合蛋白包括抗体的衍生物。该衍生化抗体可以包括能够赋予该抗体所需性质的任何分子或物质，例如在一种特定用途中增加其半排出期。所述衍生化抗体可以包括例如可检测的(或标签)部分(例如：放射性、比色的、抗原性或酶活性分子)、可检测珠(例如磁性或电子致密性的(如金珠))、结合另一分子(例如生物素或链霉亲和素)的分子、治疗性或诊断性部分(例如，放射性、细胞毒性或药学活性部分)或能够增加该抗体对一种特定用途(例如向对象如人类对象给药，或其他体内或体外用途)的适用度的分子。可用于衍生抗体的分子的例子包括白蛋白(例如人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。连接白蛋白且聚乙二醇化的抗体衍生物可以使用本领域所熟知的技术来制备。在一个实施例中，该抗体与甲状腺素运载蛋白(TTR)或TTR变体缀合或以其他方式结合。该TTR或TTR变体可以用选自以下种类的化学物质进行化学改性：葡聚糖、聚(N-乙烯基吡咯烷)、聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇及聚乙烯醇。
实施例1
使用蛋白A对全长IgGs进行纯化，并以SDS-PAGE检测其纯度。以结合特异度(与表达可溶性EGFR和EGFR的细胞系)、结合亲和性(Biacore)、对EGF与可溶性EGFR结合的抑制、EGFR表达细胞系中EGF-刺激的EGFR磷酸化和细胞增殖，来对纯化抗体进行表征。将抗EGFR抗体转化为IgGs并表达于293细胞中。以蛋白A进行纯化所得的表达水平在0.86-5.5μg/ml范围内。该抗体具有完整的重链和轻链。其中5种(A5、A6、B1、B4和B5)与细胞系中表达的可溶性EGFR和EGFR强烈结合。一种抗体(D6)与表达可溶性EGFR和EGFR的细胞系均中度结合。ELISA分析显示，这六种结合性蛋白还阻断了配体EGF与可溶性EGFR的结合。
三种结合性蛋白(A5，A6和B5)在EGFR阳性细胞(A431)的EGF刺激的受体磷酸化实验中表现出～10％的抑制性。三种结合性蛋白(B1、B4和D6)在肿瘤细胞增殖实验中表现出抑制性。
实施例2
本实施例说明了抗EGFR抗体的生成。采用中国仓鼠卵巢亚克隆S(CHO-S)细胞(LifeTechnologies)，以含抗人EGFR IgG1重链和轻链结构基因的表达载体进行瞬时转染，从而制备抗EGFR抗体。
将细胞系保持在摇瓶中，并每3-4天使用CHO-S-SFMII培养基(Life Technologies)例行传代。使用了两种质粒来产生瞬时池：一个携带重链，另一个携带轻链。使用25kd线性乙烯亚胺(PEI,Polysciences)共转染所述载体进入宿主细胞系。
简单而言，将PEI稀释在OptiPro SFM(Life Technologies)中，然后添加到已用等体积OptiPro SFM稀释的质粒DNA。将PEI/DNA混合物培养5-10分钟，然后添加到CHO-S细胞悬浮液中。将培养物在37℃下培养预定时长，然后以等体积扩展培养基进行扩展。数日后，收获培养物上清液并浓缩，以用于纯化。
实施例3
本实施例展示了本公开中的数种抗体(包括A6)初步筛选步骤之一的细胞结合体外数据。本例展示了抗EGFR抗体与A431细胞表面上表达的EGF受体的结合能力(抗体的拮抗性质所必不可少的能力)，并与商购西妥昔单抗(cetuximab())进行比较。在此，将100000A431细胞等份加入含100μl FACS Buffer(PBS+2％FBS)的试管中。将细胞离心沉淀，并在含5μg/ml指定抗体的100μl FACS Buffer中重悬浮为一式三份。培养半小时后，细胞以FACSBuffer洗涤一次，重悬浮在100μl PE连接的羊抗人IgG(γ-链特异性)二抗(Southern BiotechCat#2040-09)中。细胞再次培养半小时，以FACS Buffer洗涤一次，重悬浮在300μl FACS Buffer中，并使用FACSAria流式细胞仪(BD)测定FL2-H通道中的荧光强度中位值。所述FL2-H通道中的荧光强度中位值直接正比于与细胞表面EGFR结合的抗体。
实验结果：图1显示，与背景染色(对照，无Ab)相比，抗EGFR抗体在A431细胞上的细胞结合性强。特定荧光强度的事件数目如柱形图所示。所有抗体均具有与西妥昔单抗相仿的极强细胞结合性。图中所示的是三个重复样本之一的数据，能够代表多次实验结果。
实施例4
本实施例展示了A6和D2的细胞结合EC50测量的体外数据。本例展示了所述抗体的细胞最大结合度和达到50％结合饱和度的浓度(EC50)方面的结合特性。本例中，抗EGFR抗体A6和D2与商购医疗抗EGFR抗体，西妥昔单抗(cetuximab)进行比较。本例中，实验步骤如下：取50000A431细胞，等份加入96孔尖底板的孔的100ul FACS Buffer(PBS+2％FBS)中。以FACS Buffer制作A6、D2和西妥昔单抗的12点3倍稀释曲线，起点为50μg/ml(3.33x10-7M)。将细胞离心沉淀，以FACS Buffer洗涤一次，并在25μl抗体溶液中重悬浮为一式三份。细胞培养半小时后，以FACS Buffer洗涤一次，重悬浮在50μl PE连接的羊抗人IgG(γ-链特异性)二抗(Southern Biotech Cat#2040-09)中。细胞再次培养半小时，以FACS Buffer洗涤一次，重悬浮在25μl FACS Buffer中，并使用Intellicyt HTFC流式细胞仪测定FL2-H通道中的荧光强度中位值。
实验结果：如图2所示，A6、D2和西妥昔单抗在A431细胞中的细胞结合性EC50分别测定为1.3nM、0.28nM、0.48nM。用Graph Pad Prizm以非线性回归拟合来分析数据并作图。图中所述数据点为阳性标记细胞的荧光强度中位值(MFI)+/-标准误差。
实施例5
本实施例展示了抗EGFR抗体A6和D2等等对EGF与A431细胞表面的EGF受体结合进行阻断的体外数据。抗EGFR抗体直接与西妥昔单抗进行比较。抗体对EGF与EGFR结合的阻断能力可以显示该抗体抑制癌细胞中EGFR功能的潜力。为此，取25000A431细胞，在抗EGFR抗体的PBS-BSA 1％系列稀释液中4℃培养30分钟。然后，向每孔中加入1μl人EGF生物素化Fluorokine检测剂(Biotinylated Fluorokine，R&D Systems catalog#NFEG0)。4℃下培养45分钟后，按照厂商说明进行EGF检测，并按比例缩小以适用于微滴定板。最后，将细胞重悬浮在25μl FACS Buffer中，并使用Intellicyt HTFC流式细胞仪测定FL1-H通道中的荧光强度中位值。所述FL1-H信号强度中位值直接正比于EGF与细胞表面的结合度。信号减弱表明EGF结合被阻断。用Graph Pad Prizm以非线性回归拟合来分析数据并作图。图中所述数据点为荧光强度中位值(MFI)+/-标准误差。
实验结果：如图3所示，抗EGFR抗体的存在，阻断了EGF与表达EGFR的A431细胞表面的结合。A6和D2的IC50值分别为2.06nM和1.35nM，与西妥昔单抗(IC50＝2.03nM)相仿或更优。
实施例6
本实施例展示了抗EGFR抗体对EGF-或血清刺激的细胞增殖的抑制作用，并与FDA认可的抗EGFR西妥昔单抗相比。不受控制的细胞增殖是癌症的标志之一，且对于医疗化合物而言，以抗EGFR抗体对EGFR阳性癌细胞增殖进行抑制的能力是必不可少的。在此实施例中，将5000A431表皮样癌细胞(图4a)或MCF7乳腺癌细胞(图4b)加入96孔白色不透明细胞培养板的含10％FBS的100μl DMEM培养基(A431细胞)或无酚红DMEM培养基(MCF7)中，一式三份。24小时后，移除培养基，以PBS洗涤细胞一次，随后令细胞在无FBS的100μl培养基(饥饿培养基)中饥饿18小时。图4a中，将抗体在50μl饥饿培养基中稀释至2倍所需处理浓度(20ng/μl或10ng/μl)，并在移除饥饿培养基后添加到细胞中。培养1小时后，加入50ul 20ng/ml EGF(EGF终浓度为10ng/ml)。随后，细胞培养48小时，然后使用Promega Cell Titer Glo发光检测试剂盒来评估增殖。发光产出量直接与细胞数量成正比。图4b中，将抗体在50μl饥饿培养基中稀释至2倍所需处理浓度(20ng/μl)，并在移除饥饿培养基后添加到细胞中。培养1小时后，加入含20ng/ml EGF或20％FBS的50ul饥饿培养基(EGF终浓度为10ng/ml；EBS终浓度为10％)。随后，细胞培养48小时，然后使用PromegaCell Titer Glo发光检测试剂盒来评估增殖。发光产出量直接与细胞数量成正比。
实验结果：本公开中的抗EGFR抗体A6抑制了EGF刺激下的A431增殖(图4a)和EGF-刺激或血清刺激下的MCF7增殖(图4b)，且在所有处理条件下，增殖抑制与等剂量的西妥昔单抗效果相似。数据显示为三联样本的光强度单位平均值+/-标准误差。
实施例7
本实施例展示了A431细胞的EGF受体在EGF刺激下的自体磷酸化体外数据。该示例展示了抗体阻断对癌细胞中EGFR的激活由此阻断其功能的能力。实验步骤：将500000A431细胞加入6孔细胞培养板的2.5ml含10％FBS的DMEM培养基中。24小时后，移除培养基，以PBS洗涤细胞一次，随后令细胞在1ml培养基(DMEM+2％FBS)中饥饿18小时。将抗体以1ml无血清培养基稀释为20μg/ml(2倍终浓度)，并在移除饥饿培养基后添加到细胞中。培养半小时后，加入终浓度为100ng/ml的EGF。随后，细胞培养60分钟，以PBS洗涤，并以1倍细胞裂解液(Cell Signaling)裂解。使用夹心酶联免疫分析检测EGFR的磷酸化，如下所述：在半面积96孔微滴定板上涂布抗EGFR抗体(1:100稀释于PBS中；Cell Signaling cat#2232)，4℃过夜。以PBST洗涤4次后，用100μl PBST+1％BSA在37℃下封闭孔2小时。再次洗涤培养板，然后向孔中加入50μl裂解物，在37℃下再培养2小时。再次洗涤后，加入连接生物素的抗磷酸酪氨酸抗体(mAB 9E10，1:100稀释于封闭液中，每孔50μl)。培养板在37℃下培养1小时，再次洗涤，然后与抗生物素HRP标记的抗体(Upstate)在37℃下共培养30分钟。最后洗涤一次，然后与50μl TMB底物一起在37℃下培养10分钟。使用2N H2SO4终止反应。读取OD 450nm，并计算抑制百分比＝1—(抗体处理样本OD 450/未处理对照OD 450)。
实验结果：使用100ng/ml EGF处理A431细胞，以刺激EGFR自磷酸化激活。抗EGFR抗体对细胞的预处理，对EGFR的该激活起到了不定量的阻断作用。对所有克隆的检测均显示出，其对EGFR自磷酸化的抑制作用高于西妥昔单抗()(图5)，表明这些克隆可以用于对癌症适应症中的EGFR进行治疗性干预。所示数据代表多次试验，并表示为EGFR自磷酸化抑制百分比，计算为三联样本的1-(抗体处理样本OD 450/未处理对照OD 450)+/-标准误差。
实施例8
本实施例展示了使用抗体来阻断EGFR功能时对细胞信号传导的抑制作用的体外数据。具体而言，阻断配体EGF对EGFR的激活，从而对可能激活如ERK(胞外信号调节激酶；MAPK)和AKT(亦称为蛋白激酶B)等负责细胞生长和生存信号的分子的激酶级联反应进行阻断。图6a和6c分别展示了抗EGFR抗体对A431和MCF7细胞中的Erk1/2激活的抑制(对磷酸化激活进行抑制)。图6b展示了抗EGFR抗体对A431细胞中的AKT激活的抑制。在此实施例中，在存在或不存在10μg/ml抗EGFR抗体的情况下对血清饥饿细胞进行2小时预处理，然后以10ng/ml EGF刺激1小时(MCF7细胞以100ng/ml TGFα进行共刺激)。然后，洗涤细胞，并按照厂商说明以P-ERK1/2或P-AKT抗体染色(Cell Signaling catalog#5682or#4071)。流式细胞仪检测到的抗体染色程度与信号传导分子的磷酸化成正比，由此与其激活程度成正比。图6a展示了表明ERK1/2激活水平的荧光强度中位值。图6b和6c展示了与对照相比的磷酸化抑制百分比。在此实施例中，将抗EGFR抗体与西妥昔单抗对EGF刺激下的细胞信号传导的抑制能力进行比较。
实验结果：图6a展示了用或不用针对EGFR的抗体进行处理和用或不用EGF进行处理的A431细胞中的ERK1/2的磷酸化水平。在此情况下，所有的抗体均显示出对ERK激活的抑制，指标为与以EGF处理但不以抗体处理的对照相比的降低的MFI。抗体A6所表现出的对ERK激活的抑制等同于西妥昔单抗。图中数据显示为荧光强度中位值，对多次试验具有代表性。
图6b展示了以抗EGFR抗体处理并以EGF刺激的A431细胞中的AKT磷酸化(激活)所受的抑制。抑制百分比计算为1-(抗体处理样本MFI/非特异性IgG处理对照MFI)。数据显示，EGFR抗体能够阻断AKT的激活，但不如西妥昔单抗有力。图中所示数据代表了多次试验。
图6c展示了以抗EGFR抗体处理并以EGF刺激的MCF7细胞中的ERK1/2磷酸化(激活)所受的抑制。抑制百分比计算为1-(抗体处理样本MFI/非特异性IgG处理对照MFI)。数据显示，EGFR抗体能够极为有效地抑制MCF7乳腺癌细胞中的ERK激活。示例抗体A6表现出对ERK激活的及其有效的抑制作用，其抑制百分比超过60％，优于西妥昔单抗。图中所示数据代表了多次试验。
实施例9
本实施例提供了EGFR单克隆抗体的ANSEC(Water’s Breeze-HPLC)分析。该分析在pH6.8、流速0.5mL/min的PBS缓冲液中进行，使用BioSep-SEC-s3000,300x 7.8mm柱(Phenomenex)。每个EGFR单克隆抗体样本均与相同测试条件下的BIO-RAD凝胶过滤蛋白标样(STD；Cat#,151-1901-甲状腺球蛋白＝670KDa；γ球蛋白＝158KDa；卵清蛋白＝44KDa；肌红蛋白＝17KDa；维生素B12＝1.35KDa)进行比较。
图7展示了本公开中的抗EGFR抗体A6和标样在pH6.8的PBS缓冲液中的重叠ANSEC色谱图(280nm的紫外线踪迹)：STD/标样测试(黑色虚线)，EGFR-A6频谱(黑色实线)。图8展示了本公开中的抗EGFR抗体D2和标样在pH6.8的PBS缓冲液中的重叠ANSEC色谱图(280nm的紫外线踪迹)：STD/标样测试(黑色虚线)，EGFR-D2频谱(黑色实线)。图9展示了本公开中的抗EGFR抗体EGC9和标样在pH6.8的PBS缓冲液中的重叠ANSEC色谱图(280nm的紫外线踪迹)：STD/标样测试(黑色虚线)，EGFR-EGC9频谱(黑色实线)。图10展示了本公开中的抗EGFR抗体EC10和标样在pH6.8的PBS缓冲液中的重叠ANSEC色谱图(280nm的紫外线踪迹)：STD/标样测试(黑色虚线)，EGFR-EC10频谱(黑色实线)。图11展示了本公开中的抗EGFR抗体D6和标样在pH6.8的PBS缓冲液中的重叠ANSEC色谱图(280nm的紫外线踪迹)：STD/标样测试(黑色虚线)，EGFR-D6频谱(黑色实线)。图12展示了本公开中的抗EGFR抗体B4和标样在pH6.8的PBS缓冲液中的重叠ANSEC色谱图(280nm的紫外线踪迹)：STD/标样测试(黑色虚线)，EGFR-B4频谱(黑色实线)。图13展示了本公开中的抗EGFR抗体A5和标样在pH6.8的PBS缓冲液中的重叠ANSEC色谱图(280nm的紫外线踪迹)：STD/标样测试(黑色虚线)，EGFR-A5频谱(黑色实线)。
实施例10
本实施例展示了抗EGFR抗体对体内肿瘤生长的影响。使用无胸腺鼠科模型来评估抗EGFR抗体调节肿瘤生长的能力。简单而言，取数组每组5只的小鼠，侧腹皮下注射5x106A431人表皮样癌细胞。一旦肿瘤达到约100mm3体积，则用200ml的i)PBS；ii)抗体A6(0.2mg)；iii)抗体D2(0.2mg)；或iv)抗体A6(0.1mg)和D2(0.1mg)总共提供0.2mg蛋白的组合，以10mg/kg对小鼠进行腹腔内给药。
如图14所示，A6(正方形)和D2(三角形)抗体均降低了体内的异种肿瘤细胞生长。
实施例11
本实施例展示了对A549非小细胞肺癌细胞中的EGF受体在EGF刺激下的自体磷酸化的抑制的体外数据。本示例展示了抗体阻断EGFR在癌细胞中激活从而阻断其功能的能力。简单而言，简单而言，取10000A549细胞涂布在96孔细胞培养板上含10％FBS的100μlF12-K培养基中。24小时后，除去培养基，并用PBS洗涤细胞1次，然后在100μl饥饿培养基(无血清F12-K)中饥饿18小时。以无血清培养基制备2倍终浓度的抗体系列稀释液，加入已除去饥饿培养基的细胞中。培养15分钟后，添加EGF以得到25ng/ml终浓度。细胞培养5分钟，以PBS+原钒酸钠洗涤，然后进行裂解。使用来自R&D Systems(#DYC1095B)的DuoSet ICHuman Phospho-EGFR ELISA试剂盒检测EGFR的磷酸化。
抗EGFR抗体对A549细胞的预处理不同程度地阻断了EGF对EGFR的磷酸化和激活。A)克隆A6和亲和力成熟变体的该作用IC50显示为0.5-2.1nM；B)克隆D2和亲和力成熟且种系改变的变体的该作用IC50显示为0.15-1.5nM(图15-17)。图中所示数据代表多次试验。使用非线性回归(GraphPad Prism)计算IC50值。
图15中的IC50数据如下表1所示：
表1
抗体 A6 A6-A1 A6-A3 A6-A4 A6-A5 A6-A7 A6-A8
IC50(M) 1.1e-9 5.1e-10 1.1e-9 1.05e-9 1.1e-9 5.6e-10 6.0e-10
图17中的IC50数据如下表2所示：
表2
抗体 D2 D2G-A1 D2G-A2 D2G-A4 D2G-A5 D2G-A6 D2G-B8 D2G-C1 D2G-C4 D2G-G1
IC50(M) 1.3e-9 1.6e-10 1.8e-10 1.7e-10 2.3e-10 2.2e-10 8.6e-10 2.0e-10 2.8e-10 8.9e-10
实施例12
本实施例使用了基于细胞的报告基因试验进行ADCC分析。抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)是抗体的一种作用机制，其中病毒感染或其他病态的细胞被靶定为细胞调节免疫系统成分(例如自然杀伤细胞)的消灭目标。ADCC是使用基于抗体的药物杀灭目标癌细胞的合适机制。抗体与细胞表面的目标抗原相结合。当结合目标的抗体的Fc效应部分也与效应细胞(主要是自然杀伤细胞)表面的FcγRIIIa受体结合时，两种细胞类型之间发生多重交联，引发通路激活，最终导致细胞杀灭。为了评估抗EGFR mABs对ADDC的诱导潜力，使用了基于细胞的报告基因实验(ADCC Reporter Bioassay,Catalog#G7010,Promega)。简单而言，将1250A431细胞接种在含100ul补充了10％FBS的DMEM的白色384孔细胞培养板的内壁320孔中。允许细胞贴壁过夜，并于次晨除去培养基，替换为每孔7ul ADCC Assay Buffer(RPMI+4％低IgG牛胎血清(Low IgG Fetal Bovine Serum))。以ADCC Assay Buffer制备mAB的3倍终浓度9点稀释曲线。向孔中加入7ul抗体稀释液，一式三份跨行分布，以避免空间影响。根据厂商说明解冻ADCC效应细胞，并向每孔加7ul。将培养板在培养箱(37℃,5％CO2)中培养6小时，并将其移到实验台上以达到室温。向每孔加入21ul生物荧光素酶检验试剂(Bio-Glo Luciferase Assay Reagent)，并培养30分钟。然后，使用荧光检测分析仪分析培养板。用RLU对抗体浓度作图，以确定其效果的EC50。抗EGFR mAb A6对ADCC激活的EC50为60pM(图16A)。抗EGFR mAb D2对ADCC激活的EC50为200pM(图16B)。
序列表

Claims (8)

1.一种与EGFR表位结合且结合亲和性至少为10-6M的IgG类全人抗体，该抗体的重链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ IDNO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ IDNO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.81、SEQ IDNO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.103、SEQID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.113、SEQ IDNO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127，及其组合；所述抗体的轻链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ IDNO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ IDNO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合。
2.根据权利要求1所述的全人抗体，其特征在于，所述抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ IDNO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ IDNO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQID NO.64、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69/SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQ IDNO.75/SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80、SEQID NO.81/SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83/SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85/SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.87/SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89/SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91/SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93/SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95/SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.97/SEQ IDNO.98、SEQ ID NO.99/SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.101/SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.103/SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.105/SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合。
3.一种Fab全人抗体片段，其具有来自重链的重链可变域和来自轻链的轻链可变域，其中，重链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ IDNO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ IDNO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ IDNO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91、SEQ IDNO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127，及其组合；且其轻链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ IDNO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ IDNO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.96、SEQ IDNO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合。
4.根据权利要求3所述的全人抗体Fab片段，其特征在于，所述抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ IDNO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ IDNO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ IDNO.63/SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQID NO.69/SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.81/SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83/SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85/SEQ IDNO.86、SEQ ID NO.87/SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89/SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91/SEQID NO.92、SEQ ID NO.93/SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95/SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.97/SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.99/SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.101/SEQ ID NO.102、SEQID NO.103/SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.105/SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107/SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.109/SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111/SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113/SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115/SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.117/SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.1119/SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.121/SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.123/SEQID NO.124、SEQ ID NO.125/SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.127/SEQ ID NO.128，及其组合。
5.一种单链人抗体，其具有来自重链的重链可变域、来自轻链的轻链可变域、连接重链和轻链可变域的连接肽，其中，所述重链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95％相同：SEQID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ IDNO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ IDNO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ IDNO.89、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127，及其组合；所述轻链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ IDNO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ IDNO.72、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ IDNO.94、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合。
6.根据权利要求5所述的全人单链抗体，其特征在于，所述单链全人抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ IDNO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ IDNO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQID NO.63/SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69/SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ IDNO.80、SEQ ID NO.81/SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83/SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85/SEQID NO.86、SEQ ID NO.87/SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89/SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91/SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93/SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95/SEQ ID NO.96、SEQ IDNO.97/SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.99/SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.101/SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.103/SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.105/SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107/SEQ IDNO.108、SEQ ID NO.109/SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111/SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113/SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115/SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.117/SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.1119/SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.121/SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.123/SEQID NO.124、SEQ ID NO.125/SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.127/SEQ ID NO.128，及其组合。
7.根据权利要求5所述的全人单链抗体，其特征在于，所述全人单链抗体具有重链可变域区和轻链可变域区，且所述单链全人抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ IDNO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ IDNO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64、SEQID NO.65/SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67/SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69/SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71/SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73/SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75/SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77/SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79/SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.81/SEQ IDNO.82、SEQ ID NO.83/SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85/SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.87/SEQID NO.88、SEQ ID NO.89/SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91/SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93/SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95/SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.97/SEQ ID NO.98、SEQ IDNO.99/SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.101/SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.103/SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.105/SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107/SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.109/SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111/SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113/SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115/SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.117/SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.1119/SEQID NO.120、SEQ ID NO.121/SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.123/SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.125/SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.127/SEQ ID NO.128，及其组合。
8.一种用于治疗广谱哺乳动物癌症的方法，包括以抗EGFR多肽的有效剂量给药，其中所述抗EGFR多肽选自：与EGFR表位结合且结合亲和度为至少10-6M的IgG类全人抗体、具有重链可变域和轻链可变域的Fab全人抗体片段、具有重链可变域、轻链可变域以及连接所述轻链和重链可变域的连接肽的单链人抗体，及其组合；
其中，所述全人抗体的重链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ IDNO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ IDNO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ IDNO.59、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ IDNO.101、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127，及其组合；且所述全人抗体的轻链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ IDNO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ IDNO.72、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ IDNO.94、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合；
其中，所述Fab全人抗体片段的重链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95％相同：SEQID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ IDNO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ IDNO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ IDNO.89、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127，及其组合；且所述Fab全人抗体片段的轻链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.90、SEQID NO.92、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124、SEQ ID NO.126、SEQ ID NO.128，及其组合；以及
其中，所述单链人抗体的重链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.9,SEQ ID NO.11,SEQ ID NO.13,SEQ ID NO.15,SEQ ID NO.17,SEQ ID NO.19,SEQ ID NO.21,SEQ ID NO.23,SEQ ID NO.25,SEQ ID NO.27,SEQ ID NO.29,SEQ ID NO.31,SEQ ID NO.33,SEQ ID NO.35,SEQ ID NO.37,SEQ ID NO.39,SEQ ID NO.41,SEQ ID NO.43,SEQ ID NO.45,SEQ ID NO.47,SEQ ID NO.49,SEQ ID NO.51,SEQ ID NO.53,SEQ ID NO.55,SEQ ID NO.57,SEQ ID NO.59,SEQ ID NO.61,SEQ ID NO.63,SEQ ID NO.65,SEQ ID NO.67,SEQ ID NO.69,SEQ ID NO.71,SEQ ID NO.73,SEQ ID NO.75,SEQ ID NO.77,SEQ ID NO.59,SEQ ID NO.81,SEQ ID NO.83,SEQ ID NO.85,SEQ ID NO.87,SEQ ID NO.89,SEQ ID NO.91,SEQ ID NO.93,SEQ ID NO.95,SEQ ID NO.97,SEQ ID NO.99,SEQ ID NO.101,SEQ ID NO.103,SEQ ID NO.105,SEQ ID NO.107,SEQ IDNO.109,SEQ ID NO.111,SEQ ID NO.113,SEQ ID NO.115,SEQ ID NO.117,SEQ ID NO.119.
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