JPWO2015034052A1 - ヒトインテグリンa6b4と特異的に反応する抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
(1) インテグリンA6B4に対する抗体であって、ヒトインテグリンA6B4複合体を特異的に認識し、細胞間接着を阻害する抗体。
(2) インテグリンA6B4に対する抗体であって、ヒトインテグリンA6B4複合体を特異的に認識し、標的抗原を発現するがん細胞の抗がん剤への感受性を上昇させる抗体。
(3) 実質的に細胞の増殖に影響を及ぼさない(1)又は(2)に記載の抗体
(a) インテグリンA6B4を介した細胞間接着を阻害する能力;
(b) がん細胞の抗がん剤への感受性を上昇させる能力;
(c) 実質的に細胞の増殖に影響を及ぼさない特性;
のうち少なくとも2つ以上を有する抗体。
(5) 抗がん剤が下記(i)から(v)から選択される(2)又は(4)に記載の抗体
(i)イホスファミド、塩酸ニムスチン、塩酸プロカルバジン、シクロホスファミド、ダカルバジンおよびチオテバから選択されるアルキル化剤;
(ii)シタラビン、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、カルモフール、テガフールおよびフルオロウラシルから選択される代謝拮抗剤;
(iii)エトポシド、イリノテカン、ドセタキシル、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビンブラスチンから選択される植物アルカロイド;
(iv)アクチノマイシンD、イダルビシン、ドキソルビシン、ヒドラルビシン、ミトキサントロンおよびマイトマイシンCから選択される抗がん性抗生物質;
(v)カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチンおよびオキサリプラチンから選択される白金系製剤:
(6) ヒト抗体あるいはヒト化抗体である(1)から(5)の何れかに記載の抗体。
(8) 重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)としてそれぞれ配列番号1〜3、7〜9、13〜15、19〜21、25〜27の何れかのアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)としてそれぞれ配列番号4〜6、10〜12、16〜18、22〜24、28〜30の何れかのアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含む、(1)から(7)の何れかに記載の抗体。
(i)配列番号1のアミノ酸配列からなる重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、配列番号2のアミノ酸配列からなる重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、配列番号3のアミノ酸配列からなる重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)、配列番号4のアミノ酸配列からなる軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、配列番号5のアミノ酸配列からなる軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、配列番号6のアミノ酸配列からなる軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)を含む抗体;
(ii)配列番号7のアミノ酸配列からなる重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、配列番号8のアミノ酸配列からなる重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、配列番号9のアミノ酸配列からなる重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)、配列番号10のアミノ酸配列からなる軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、配列番号11のアミノ酸配列からなる軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、配列番号12のアミノ酸配列からなる軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)を含む抗体;
(iii)配列番号13のアミノ酸配列からなる重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、配列番号14のアミノ酸配列からなる重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、配列番号15のアミノ酸配列からなる重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)、配列番号16のアミノ酸配列からなる軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、配列番号17のアミノ酸配列からなる軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、配列番号18のアミノ酸配列からなる軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)を含む抗体;
(iv)配列番号19のアミノ酸配列からなる重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、配列番号20のアミノ酸配列からなる重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、配列番号21のアミノ酸配列からなる重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)、配列番号22のアミノ酸配列からなる軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、配列番号23のアミノ酸配列からなる軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、配列番号24のアミノ酸配列からなる軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)を含む抗体;
(v)配列番号25のアミノ酸配列からなる重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、配列番号26のアミノ酸配列からなる重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、配列番号27のアミノ酸配列からなる重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)、配列番号28のアミノ酸配列からなる軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、配列番号29のアミノ酸配列からなる軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、配列番号30のアミノ酸配列からなる軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)を含む抗体;
(11) 抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(Diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)およびCDRを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、(1)から(10)のいずれかに記載の抗体。
(12) (7)から(10)のいずれかに記載の抗体をコードするDNA。
(13) (12)に記載のDNAを含有する組換えベクター。
(14) (12)に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
(15) (14)に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に(1)から(11)の何れかに記載の抗体を生成蓄積させ、培養物から抗体を採取することを含む、(1)から(11)の何れかに記載の抗体の製造方法。
(17) 他の抗がん剤と併用された際、がん細胞の前記抗がん剤に対する感受性を向上させるのに用いられる、(1)から(11)のいずれかに記載の抗体を含有するがん細胞の細胞接着阻害剤。
(18) (1)から(11)の何れかに記載の抗体と医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
(19) (1)から(11)の何れかに記載の抗体を含有する医薬組成物であって、
がん細胞の薬剤感受性を上昇させ、がん細胞の増殖阻害および/またはがん細胞を死滅させるために、それを必要とする患者に、
(a)(1)から(11)のいずれかに記載の抗体、および
(b)イホスファミド、塩酸ニムスチン、塩酸プロカルバジン、シクロホスファミド、ダカルバジンおよびチオテバから選択されるアルキル化剤;シタラビン、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、カルモフール、テガフールおよびフルオロウラシルから選択される代謝拮抗剤;エトポシド、イリノテカン、ドセタキシル、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビンブラスチンから選択される植物アルカロイド;アクチノマイシンD、イダルビシン、ドキソルビシン、ヒドラルビシン、ミトキサントロンおよびマイトマイシンCから選択される抗がん性抗生物質;カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチンおよびオキサリプラチンから選択される白金系製剤から選択される抗がん剤を、前記抗体が、がん細胞に結合するための条件下および十分な量で提供し、それによりがん細胞の増殖阻害および/またはがん細胞の死滅を引き起こす、前記医薬組成物。
(21) がんが、固形がんまた血液がんである、(19)又は(20)に記載の医薬組成物。
(22) 固形がんが肺がん、大腸がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、又は皮膚がんである、(21)に記載の医薬組成物。
(23) 血液がんが白血病、リンパ腫、又は骨髄腫である、(21)に記載の医薬組成物。
本発明によればさらに、上記した本発明の抗体を対象者に投与することを含む、抗がん剤の効果を高める方法が提供される。
本発明によればさらに、上記した本発明の抗体を対象者に投与することを含む、がん細胞の細胞接着を阻害する方法が提供される。
本発明によればさらに、がん細胞の細胞接着阻害剤又は医薬組成物の製造のための、上記した本発明の抗体の使用が提供される。
本発明者らは難治性白血病の病態解析を行っており、網羅的遺伝子発現解析からα6-integrin(ITGA6)並びにβ4(ITGB4)の高発現を同定した。更にこのITGA6/B4はEVI1高発現白血病のみならず、治療後の白血病再発患者群においても高発現があることがわかり(図5)、難治性白血病全般に見られる現象であることから、特に白血病治療において有効な効果が期待できる。本発明の抗体によれば、ITGA6B4を介した骨髄ニッチへの接着を阻害することにより既存の抗がん剤に対して抵抗性を示していたがんの薬剤感受性を増大させることができ、その結果、抗がん剤の効果を復活若しくは増大させ、効果的な治療を行うことが可能になる。本発明の抗体は、特に患者のがん細胞に対する特異性及び親和性が高いもので上記抗がん剤の感受性を高める効果を保持する抗体を選抜しているため、がん細胞について良好な治療結果が得られる。本発明の抗体は、ITGA6B4複合体に対する抗体であり、特に上記した「追い出し治療」を行うことが可能であり、がん細胞の既存の抗がん剤の感受性を飛躍的に高めることができるという特徴を有する。特許文献1においてはインテグリンA6又はインテグリンB4の単独についての効果が記載されているが、本発明の抗体はインテグリンA6B4複合体に対する抗体である。本発明の抗体はインテグリンA6B4を認識し、本発明において提唱する「追い出し治療」に適正化された抗体であることから、白血病再発患者に対しても顕著な治療効果が期待できる。
イテングリンα6とインテグリンβ4からなる複合体で細胞外マトリックスとの相互作用、細胞間接着、細胞の組織への生着、シグナリング等多くの現象に関与している事が知られている。イテングリンα6はβ4以外にもβ1と複合体を形成し、VLA6という複合体を取ることも知られている。なお本抗原はCD49fとして知られ、血小板や巨核球に存在し、 T細胞のサブポピュレーションに弱く発現すると考えられている。一方で本研究対象の複合体は主に正常細胞では気管支上皮とがん細胞では大腸がんを始め多くのがんで発現すると考えられている。
本明細書において、「反応する」と「反応性」は特別に示さない限り、同じのことを意味する。すなわち、抗体が抗原を認識することを意味する。この抗原は、細胞膜に発現するintact ITGA6B4でもよいし、truncted formや、可溶化formでも良い。また、立体構造を保ったITGA6B4でもよいし、変性したITGA6B4でもよい。反応性を検討する手段として、フローサイトメーター(FACS)、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、western−blot、蛍光微量測定技術(FMAT)表面プラズモン共鳴(BIAcore)、免疫染色、免疫沈降などが挙げられる。
本明細書では必要に応じて、慣習に従い以下の略号(括弧内)を使用する。
重鎖(H鎖)、軽鎖(L鎖)、重鎖可変領域(VH)、軽鎖可変領域(VL)、相補性決定領域(CDR)
このように、可変領域において、1または数個のアミノ酸が変異しており、ヒトインテグリンA6B4と特異的に反応する抗体もまた本発明の抗体に含まれる。
(1)ファージディスプレイライブラリーにより抗原と反応するscFv
本発明の抗体の取得は、当技術分野で知られているいくつかの方法に従って調製することができる。例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、ITGA6B4に対する親和性が様々である抗体のレパートリーを含むライブラリーを提供することができる。次いで、これらのライブラリーをスクリーニングして、ITGA6B4に対する抗体を同定し単離することができる。好ましくは、ファージライブラリーは、ヒトB細胞から単離されたmRNAから調製されたヒトVLおよびVHcDNAを使用して生成されるscFvファージディスプレイライブラリーである。そのようなライブラリーを調製しスクリーニングする方法は当技術分野で知られている。ヒトITGA6B4を抗原としてスクリーニングした反応性を示すファージクローンから遺伝物質を回収する。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするVH及びVLのDNA配列を決定することができる。このscFvの配列を用いて、scFvをIgG化すれば、ヒト抗体を取得することができる。
H鎖またL鎖の発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製によりヒト抗体を取得する。また、VH及びVLを同一ベクターに発現すること(タンデム型)によりヒト抗体の取得もできる。これらの方法は周知であり、WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、W093/19172、WO95/01438、WO95/15388、WO97/10354などを参考にすることができる。
本発明の抗体を基にして又は本発明の抗体をコードする遺伝子の配列情報を基にして、抗体結合フラグメントを作製することができる。抗体結合フラグメントとしては、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(Diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)、又は抗体由来の相補性決定領域(CDR)を含むペプチドを挙げることができる。
本発明によれば、本発明の抗体を含有するがん細胞の細胞接着阻害剤、並びに本発明の抗体を含有する医薬組成物が提供される。本発明一つの実施形態としては難治性白血病であるが、これに限らない。ITGA6B4複合体の高発現による難治性白血病以外の疾患についても、本発明の抗体を用いて治療することができる。好ましくは難治性白血病であるが、固形がん(例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がんなど)、または血液がん(例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫など)なども治療対象に含まれる。
細胞に結合した本発明の抗体の検出は、フローサイトメトリー法や、ELISA法等 およびその組み合わせによって行うことが可能である。本発明の抗体が結合した細胞を検出又は定量する装置としては、フローサイトメーター(FACS:Fluorescence Activagted Cell Sorter)が好ましい。血中循環がん細胞(CTC:CirculatingTumorCells)の測定の可能な他の測定器を用いる方法も考えられる。最も好ましくは、本発明の抗体が結合した細胞をフローサイトメーターにより測定することができる。この場合、本発明の抗体は、蛍光色素により標識されていることが好ましい。血液検体より得られた、血球細胞に本発明の抗体の蛍光標識物を接触させた後、フローサイトメーターにより解析することができる。
(1)がん細胞に結合するファージ抗体のスクリーニング(AML株USCD-AML1)
USCD-AML1細胞(Oval et al., Blood 76: 1369-1374 (1990);Taetle et al.,Cancer Res. 53: 3386-3393 (1993);Hu et al., Leukemia 10: 1025-1040 (1996))を任意の方法で培養した。細胞を回収し、冷却したPBSで洗浄した後、1×1013cfuのヒト抗体ファージライブラリー(特開2005−185281号公報、WO2008/007648号公報、WO2006/090750号公報を参照)を混ぜ、最終容積1.6mLになるように反応液(1%BSA、0.1%NaN3、MEM)を添加し、4℃にて4時間ゆっくり回転させて反応させた。反応終了後、反応液を二つに分け、それぞれ事前に用意した0.6mLの有機溶液(dibutyl phtalate cycloheximide9:1)に重層し、マイクロ遠心機により2分間遠心(3000rpm)した。上清を捨て、チューブの底に沈降した細胞を0.7mLの1%BSA/MEMで懸濁し、更に0.7mLの有機溶媒に重層した。同じように遠心により上清を捨て、細胞を0.3mLのPBSで懸濁し、液体窒素で凍結した。
3rdスクリーニングしたファージを回収し、既存法によりDNA配列を解析し、欠損領域を保持する不完全な抗体や配列が重複する抗体を排除し、独立した抗体配列を持つファージ抗体を取得した(特許第4870348を参照)。
精製可溶性ヒトITGA6B4抗原(Recombinant Human Integrin alpha 6 (X1) beta 4 R&D社)を用いてELISAによる抗原抗体の反応性を検討した。すなわち、可溶性ITGA6B4抗原をPBSで10μg/mLになるように調整し、Immuno Module/Strip Plates(NUNK)に50μL/wellに添加し、37℃で2時間静置した。その後、可溶性ITGA6B4抗原を捨て、Blocking液(5% スキムミルク / 0.05% NaN3/ PBS)200μL/wellで添加し、37℃で2時間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除き、PBSにより洗浄し、上記2ndスクリーニングのファージの培養上清を100μL/well添加し、37℃で1時間反応させた。PBSで5回洗浄後、PBS/0.05%Tween20で希釈した1μg/mLRabbit anti−cp3を100μL/well添加し、37℃で1時間反応させた。PBSで5回洗浄後、更にPBS/0.05%Tween20で2000倍希釈したanti−Rabbit IgG(H+L)−HRPを100μL/well添加し、37℃で1時間反応させた。PBSで5回洗浄後、OPD in 0.1Mクエン酸リン酸バーファー(pH5.1)+0.01%H2O2 を100μL/well添加し室温で5分間反応させた。2NH2SO2を100μL/well加え、発色反応を停止した。その後、SPECTRAmax340PC(Molecular Devices)にて492nmの吸光度を測定した。その結果、可溶性ITGA6B4抗原と顕著な陽性反応を示すファージクローンのDNA配列を解析し、それぞれのCDR配列を確認し、独立配列を有するものを分類した。その結果、特に反応性の強い5抗体を選別し、PPMXITG−001〜005とした。
(1)ITGA6B4IgG抗体を発現するplasmidの作製
ファージ抗体のIgG化はITGA6B4のIgG化を例として下記のように説明する。
ITGA6B4のファージ抗体(scFv)の遺伝子はVH-VLの順で並んでおり、VHとVLはリンカー以下の配列で接続したscFvの構造をしている。
<リンカー配列>
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(配列番号31)
同様な方法で、他の抗体の発現ベクターを作製した。
IgG抗体の一過性発現にはFreeStyle (ライフテクノロジーズ)を用いた。遺伝子導入用浮遊細胞である293-F (ライフテクノロジーズ) は前日に継代した。トランスフェクション当日、一種類の抗体発現には、1x106細胞/mLの細胞濃度に調整した400mLの細胞懸濁液を準備した。これに抗体重鎖発現ベクターを100 μg、軽鎖発現ベクターを100μg合計200μgのプラスミドをOptiPro SFMに懸濁した溶液(I)を調整した。次に200μLのMAX reagentを8mLのOptiPRO SFMに加えた(溶液II)。 溶液(I)と(II)を混合して室温で10分から20分静置した。この合計16mLの反応液を293-F細胞を懸濁した400mLの293発現培地に加え、6日から7日間37°C、8%CO2で細胞培養震盪機のTAITEC BioShaker BR-43FLで培養した。6日から7日間後、それぞれの組換え抗体を含む培養上清を回収し、これを材料に精製をおこなった。
上記で発現した培養上清に含まれるIgG抗体タンパク質は、AKTAprimeを用いたAb-Capcher ExTra(プロテノバ)アフィニティーカラムで精製した。得られたピークフラクションは、溶媒としてダルベッコのPBSで平衡化したセファクリルS-300カラムによるゲルろ過をして、さらに精製した。精製したIgG抗体タンパク質の定量は、吸光係数を用いて算出した。IgG抗体の吸光係数はEXPASYのProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)に各抗体の全アミノ酸配列を用いて計算して求めた。
上記で発現させ、精製済みの抗ITGA6B4IgG抗体生産細胞の培地上清に含まれる抗体や、精製した抗体の濃度は、吸光度による定量とともに、酵素免疫測定法(ELISA)による定量も行った。固相抗体としてプレートにヤギ抗ヒトIgG(H+L)(マウス、ウサギ、ウシ、マウスIgGに対して吸収済み)(コスモバイオ:American Qualex International,Inc.;AQI,Cat.No.A-110UD)を100μl/well(5μg/mLの濃度)で加えて4℃で一昼夜静置した。次にブロックエースを200μL/wellで加えて室温で1時間ブロックした後、試料の抗体を段階希釈し、各wellに加えて1時間インキュベーションして反応させた。PBST(0.05%Tween20、PBS)で5回洗浄後、ヤギ抗ヒトIgG(H+L)(マウス、ウサギ、ウシ、マウスIgGに対して吸収済み)-HRP(コスモバイオ:AQI,Cat.A-110PD)をPBSTで10000倍希釈した検出抗体溶液を100μL/wellの割合で加えた。1時間インキュベーション後、PBSTで5回洗浄してから基質緩衝液TMBを100μL/wellの割合で加えた。室温暗所で15分間インキュベーションした後、反応停止液を100μL/wellの割合で加えて反応を停止してから、450nmにおける吸光度を測定した。標準品として精製ヒトIgGを用いて検量線を作成し、これを用いてヒト抗体の濃度を算出した。
ITGA6B4発現細胞株、AML株USCD-AML1を用いて、IgG化した抗ITGA6B4抗体の反応性を検討した。USCD-AML1細胞を遠心により回収した。回収した細胞をPBSで1回洗浄し、その後、FACS Buffer(1%BSA,2mM EDTA,0.1%NaN3 入りPBS)で細胞を1×106/mLなるように懸濁し、この細胞懸濁液100μLを96- well V底プレート(Costar 3897)に分注した。それぞれの抗ITGA6B4IgG抗体をFACS Bufferで0.02〜2μg/mLに調製し、調製した抗体溶液100μLを細胞に添加し、4℃で1時間インキュベートした。細胞をFACS Bufferにより回洗浄した後、FACS Buffer で750倍に希釈したAlexa−anti−human IgG (invitrogen )溶液100μLを添加し、更に4℃で1時間インキュベートした。FACS Buffer で遠心により2回洗浄した後、FACS Calibur(BD)のHTSにセットして各wellのFL1蛍光強度を測定した。その結果各抗体(a:10ng/mL;b:100ng/mL;c:1μg/mL)がUSCD-AML1と強い反応性を示した。また、精製ITGA6B4抗原への反応性の消失が無いかも検討する為、実施例2と同様の手順でELISAを行い、その反応性を確認した。その一例を図4に示す。図4に示される様に、明らかな陽性反応が得られた。なお、ネガティブコントロール抗体として、同様の手順で作製された抗ハブ毒ヒトIgG抗体と、検出用抗体のみ(PBSと表記)を用いた。なお抗ITGA6B4抗体で示される抗体は代表例としてPPMXITG−001である。
(1)免疫沈降用固相化抗体の調製
まず、上記作製された抗ITGA6B4体溶液をカップリング緩衝溶液(0.1M NaHCO3-NaOH pH9)にて透析した。すなわち、抗体溶液を透析膜(Snake Skin Pleated Dialysis Tubing 10,000 MWCO)に封入し、これをカップリング緩衝溶液(0.1M NaHCO3-NaOH pH9)1.5Lに沈め、4℃でスターラーにて2〜3時間撹拌したのち、緩衝溶液を交換して更に2〜3時間透析した。その後もう一度緩衝溶液を交換して一昼夜透析した。
抗体の固相化は以下のようにして行った。即ち、5mgの抗体溶液10mlに対して活性化ゲル1mlを加え、室温にて2時間反応させた。反応終了後、ゲルをカラムに移し、カップリング緩衝溶液1mlにて10回洗浄し、未反応抗体の有無をO.D.測定により確認した。固相化ゲルは、0.2M Glycine-NaOH pH8溶液5mlにて2回置換し、さらに同液5mlを添加して室温にて2時間静置したのち、液を自然滴下し、これに0.2M Glycine-HCl pH3 5mlを添加して置換、さらに同液5ml添加し5分間静置したのち自然滴下した。最後にカラムをPBS 20mlにて置換したのち自然滴下し、1%NP40、プロテアーゼインヒビター、0.05%NaN3/PBSを添加してゲルを回収した。
培養肝がん細胞株のビオチン標識は以下のようにして行った。即ち、107〜108程度の細胞数まで培養した培養細胞PC14をPBSにて2回洗浄したのち、cell dissociation buffer(GIBCO社製)にて5mg/ml濃度に調整したcollagenaseI(GIBCO社製)を加えて、CO2インキュベーターにて37℃で反応させ、細胞を遊離させたのち、培地にて回収し、これをPBS(-)にて2回洗浄したのち、血球計算盤にて細胞数を算出し、約5x107/mlになるようPBS(-)にて懸濁した。これにPBSにて1mg/mlになるように調整したEZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit(PIERCE社)を等量加え、室温にて30分静置したのち、PBSにて2回洗浄した。
まず、固相化された抗体(以降、抗体ビーズと表記)約60μl分(溶液として約150μl)を2mlチューブに入れ、そこに4mM biotinを1/10 volume(15μl程)添加した。これに、培養皿0.5枚分のlysate (600μl)と60μlのbiotin液を混合したものを加え、4℃にて撹拌させながら数時間反応させた後、チューブを遠心(5500g,1分, 4℃)し、上清を除いた。これに洗浄用biotin/lysis-T buffer(0.5mM biotin, 0.1%Tween20/PBS)を800μl加え、転倒混和を2、3回行ったのち、チューブを遠心(5500g, 1分, 4℃)し、上清を除いた。この洗浄操作を再度行った後、抗体ビーズに溶出用クエン酸液(50mMクエン酸pH2.5)を30μl加え、撹拌したのち、チューブを遠心(5500g, 1min, 4℃)し、上清を回収した。残った抗体ビーズに再度溶出用クエン酸溶液を30μl加え、撹拌し、チューブを遠心(5500g, 1min, 4℃)し、上清を回収した。この溶出操作をさらに3回繰り返してサンプル溶液を回収し、それに3M Trisを加えて中和した。このサンプルをSDS-PAGEにて泳動し、銀染色にてバンドの確認を行った。このサンプルについては、同時にストレプトアビジン−HRP(Anti-Streptavidin, IgG Fraction, Conjugated to Peroxidase CORTEX biochem 社)を使用したウエスタンブロットを行いビオチン化された膜蛋白のバンドを検出した。その結果、図1に示される様に2本のバンドが検出された。図1に示される抗ITGA6B4抗体1,2,3抗体はそれぞれPPMXITG−001、004、005である。
(1)ゲル内トリプシン消化
上記実施例5にて検出された膜蛋白に対応する部分をゲル内でトリプシン消化し、ペプチドを回収した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を常法に従い行い、クマシーブリリアントブルーで染色することで得られたバンドを切り出した。これを200mM重炭酸アンモニウム-50%アセトニトリル溶液に浸し、37℃で45分間振盪後、溶液を廃棄して、同じ操作を2回繰り返すことでクマシーブリリアントブルーを除いた。このゲルを減圧乾燥し、それに40mM重炭酸アンモニウム(pH8.1)-10%アセトニトリルに溶かしたトリプシン(20μg/ml)をゲルスライスの単位面積(mm2)あたり4μl加えて、室温で1時間置いて充分に浸潤させた。これに先に加えた量の2.5倍量のトリプシン溶液を加えて、37℃で18時間静置した。これをポアサイズが0.22μmのフィルター付きチューブで濾過して、トリプシンにより抗原が切断されて生じたペプチドを回収した。
ゲル内トリプシン消化により得られた試料を、エレクトロスプレーイオン化方式イオントラップ四重極型質量分析装置につないだHPLCにかけた。HPLCの逆相クロマトグラフィーカラムから、0.1%TFAを含む0%から80%のアセトニトリルの直線濃度勾配変化により、疎水性の違いで順次溶出される各ペプチドをエレクトロスプレー法でイオン化し、各ペプチドの質量を分析した。
本発明の抗ITGA6/B4抗体による難治性白血病細胞株に対する接着性の阻害能を解析した。解析対象の細胞株として難治性白血病のマーカー分子の一つであるEVI1を高発現している細胞株を3株選定した。(UCSD/AML1、Kasumi-3、MOLM1、HNT34)。
基底膜マトリクスであるマトリゲル(BD Bioscience)をプレートにコートし、骨髄ニッチ類似の易接着性の環境下を作成した。この条件で抗体処理による接着性を比較し、その結果、抗ITGA6/B4抗体(PPMXITG−001,004,005)の添加により、各抗体とも接着性が低下することが明らかとなった(図6)。
本発明の抗ITGA6/B4抗体は抗がん剤の効果を増強することが期待された。そこで難治性白血病細胞株であるUCSD/AML1、Kasumi3、MOLM1、HNT34を用い、白血病の治療に一般的に使われている抗がん剤であるAraC(シタラビン)、DXR(ドキソルビシン)、VP16(エトポシド)との併用による影響を検討した。
白血病細胞株に対し、抗がん剤単剤及び抗体との併用条件において、生存率を比較した。その結果、抗体(PPMXITG−001、004、005)添加によるIC50の明らかな低減が確認された(図8−1及び8−2)。なお、図8−1はDXR(ドキソルビシン)とAML1細胞で行った併用効果測定試験の1例である。
このことより、抗ITGA6/B4抗体には、抗がん剤の効果を増強する働きがあると考えられ、より少量の抗がん剤で高い効果を上げられる事が示唆された。さらには抗がん剤の有効投与量を抑えることで副作用を低減させることも期待できた。
(1)アルキル化剤
イホスファミド、塩酸ニムスチン、塩酸プロカルバジン、シクロホスファミド、ダカルバジン、チオテバなど
(2)代謝拮抗剤
シタラビン、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、カルモフール、テガフール、フルオロウラシルなど
(3)植物アルカロイド
エトポシド、イリノテカン、ドセタキシル、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチンなど
(4)抗がん性抗生物質
アクチノマイシンD、イダルビシン、ドキソルビシン、ヒドラルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシンCなど
(5)白金系製剤
カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチンなど
明細書内記載の製品名と略号の対応
AraC(シタラビン):血液がんを中心に使われる。急性骨髄性白血病では第一選択。
DXR(ドキソルビシン):リンパ腫に対して主に使われる。
VP16(エトポシド):悪性リンパ腫、急性白血病に対して使われる。
Kasumi3:広島大学において樹立されたt(3;7)の核型を持つ細胞株。日本人由来。
MOLM1: 林原研究所において樹立されたt(9;22), inv(3)の核型を持つ細胞株。日本人由来。
HNT34: 武蔵野病院において樹立されたt(3;3)の核型を持つ細胞株。日本人由来。
AML細胞株UCSD/AML1、 Kasumi3、MOLM1そしてHNT34の4株に対して細胞接着阻害実験を行った。基底膜マトリクスであるマトリゲル(BD Bioscience)をプレートにコートし、骨髄ニッチ類似の易接着性の環境下を作成し、抗体処理による接着性を比較した。
具体的には、細胞10000個/100μLに対して、実施例2で選抜され実施例3、及び4で作製され、評価された抗ITGA6B4IgG抗体を使用し最終濃度が0〜10μg/mLとなるように加え、4℃にて30分間インキュベートした後、RPMI1640/10%FCSで洗浄した。次いで、100μLのRPMI1640/10%FCSで懸濁し、マトリゲル(登録商標)がコートされてなる96穴プレートのウェルに加え、37℃にて2時間インキュベートした後、PBSにて3回洗浄を行なった。RPMI1640/10%FCSを90μL、Cell counting kit 8(同仁科学研究所製)を10μLずつ加え、37℃にて30分間インキュベートした後、分光光度計を用いて波長450nmにて測定した。なお、コントロールとしては、未処理の細胞株を用いた。
ヒトの健常者並びに白血病患者におけるITGA6/B4のmRNAの発現パターンを、特許文献1に記載の方法に準じて解析した。難治性発決病の患者並びにボランティアより提供された血液において、造血幹細胞及び白血病幹細胞分画におけるITGA4/B1(VLA4)ならびにITGA6/B4の発現確認を実施した。その結果、図9に示されるデータが得られた。健常人由来 HSCは正常検体からのCD34+分画(Hematopoietic Stem Cell: HSC)、白血病患者由来 HSCは白血病患者検体からのCD34+分画、そして白血病患者由来 LSCは白血病患者検体からのCD34+CD38-分画(白血病幹細胞分画Leukemia Stem Cell: LSC)である。これにより、白血病患者においては、白血病幹細胞におけるITGA6とB4の発現が特に高く、治療標的として有用なことが改めて確認された。
本発明の抗体が、intactにがん細胞膜上に発現するITGA6B4複合体に反応していることを確認するため、ITGA6及びITGB4遺伝子のshRNA導入した細胞による、抗体の反応性評価を行った。具体的にはUCSD/AML1細胞株に対して、ITGA6及びITGB4遺伝子のmRNAを切断する活性を有するショートヘアピンRNA(shRNA)であるshITGA6及びshITGB4をトランスフェクションして各々の遺伝子の発現抑制を行った細胞株を用いて、FACSによる抗体の反応性の変化を評価した。shRNAを用いた遺伝子発現抑制細胞株作製の具体的手順並びにFACSによる抗体の反応性試験は、特許文献1及び非特許文献1に記載の方法に準じて行った。
その結果、図10に示される以下のデータが取得された。図に示される、未処理と示されるグラフはshRNA処理が行われていないもの、コントロールと示されているグラフはディテクション抗体<anti-human IgG-Alexa647(Invitrogen)>のみで処理したグラフそしてshITGA6並びにshITGB4と示されるグラフはそれぞれの遺伝子に対しshRNAで発現抑制をしかけたサンプルのグラフを示す。
(1)shITGA6による遺伝子発現抑制の結果(UCSD/AML1;shITGA6)
ITGA6を発現抑制した結果、抗ITGB4ポジティブコントロールの反応性は変化せず(D.BL-ITGB4)、本発明の抗ITGA6B4抗体の反応性はほぼ消失した(A.PPMXIYG-001, B.PPMXITG-004, C.PPMXITG-005)。
(2)shITGB4による遺伝子発現抑制の結果(UCSD/AML1:shITGB4)
ITGB4を発現抑制した結果、抗ITGA6ポジティブコントロールの反応性は変化せず(D.BLITGA6)、本発明の抗ITGA6B4抗体の反応性はほぼ消失した(A.PPMXITG-001, B.PPMXITG-004, C.PPMXITG-005)。
本実施例において、解析対象細胞であるAML1のITGA6及びB4の発現抑制は50〜60%程度の効率で行われた。発現抑制導入が成功した細胞はGFPによってgatingする事によって発現抑制された細胞のみを対象に解析可能である。これらを踏まえ、上記(1)、(2)に示される様に、本発明抗体はITGA6、ITGB4いずれの発現抑制試験においても反応性を消失しており、実施例2、4そして5の結果と合わせて、ITGA6B4の複合体のみを認識し、ITGA6、ITGB4の単独認識は行っていないことが示された。
免疫不全マウス(NOGマウス)を用い、難治性白血病細胞UCSD/AML1,およびHNT34細胞株の静脈移植モデルを作製し、薬剤投与(AraC)、抗体投与、またその併用による骨髄浸潤抑制効果を検証した。マウス静脈に白血病細胞株を注入した後にPPMXITG-005を投与、その後実験体より臓器を取り出してヒト細胞の浸潤度を解析した。具体的には取り出した臓器をセルストレーナー(BD 352340)ですりつぶし、分離した細胞を取得した後に溶血試薬(BD 555899)により赤血球を溶血させる。1x106細胞を100μLのMACS Buffer (2mM EDTA, 5% BSAを含むPBS (-))に懸濁し、ヒト細胞を同定する為にhuman CD45抗体(PEラベル BioLegend 304008)で反応させた。その後MACS Bufferで洗浄3回を行い、 フローサイトメーター (BD FACS Calibur)にて評価した。
その結果、白血病細胞の骨髄への浸潤を指標として、開発抗体の併用または単剤による薬効を評価したところ、抗体の併用または単剤により、有意に骨髄への白血病細胞の浸潤が抑えられた。このことは、本抗体による骨髄ニッチへの生着阻害は細胞接着依存性の化学療法耐性獲得を阻害する上で有用であると考えられる(図11)。
ITGA6B4発現細胞AML1およびSW480、を1000cell/well密度になるよう培養液で調製し、96well平底プレート(NUNC 167008)に100μL/wellずつ分注した。37℃、5%CO2、95%空気で24時間培養した後、10μg/mLのITGA6B4抗体を作製し、その100μLを、培養中のプレートに添加し、さらに37℃、5%CO2、 95%空気で96時間培養した。培養終了後、Cell counting kit-8(DOJIN CK04)を10μL添加しさらに呈色を観察しながら数時間37℃、5%CO2、 95%空気反応させる。その後プレートリーダーを用い、450 nmの吸光度を測定する
増殖率=抗体添加したウェルの吸光度 / 抗体添加なしウェルの吸光度 X100%
これらの解析結果から、各ITGA6B4抗体の細胞への増殖抑制効果は観察されなかった(図12)。このことは抗体単独の作用では細胞に対して増殖を抑制するような薬効がないことを意味し、本発明の副作用の軽減に関して有効に働く事が示唆される。
in vivoにおける抗体・薬剤併用の効果を確認する為に静脈移植モデル実験を実施した。重度免疫不全マウス(NOGマウス: IL2RγKOマウス)に、白血病細胞株2種類(UCSD/AML1, HNT34)をそれぞれ静脈移植し、実験条件として無処理のコントロール、抗がん剤、抗体のそれぞれ単剤投与、抗体と抗がん剤併用、の4条件を検討した。投与条件は抗体を週1回3mg/kg、抗がん剤を週1回150mg/kgとし、各条件に付きn=5の生存率から薬効の検証を行った。その結果コントロールと抗体単剤投与群が同様の生存率に対し、薬剤単剤では生存率が上昇し、さらに抗体と併用した群においては抗がん剤単独に比べ有意に生存の延長が認められた(図13)。
Claims (23)
- インテグリンA6B4に対する抗体であって、ヒトインテグリンA6B4複合体を特異的に認識し、細胞間接着を阻害する抗体。
- インテグリンA6B4に対する抗体であって、ヒトインテグリンA6B4複合体を特異的に認識し、標的抗原を発現するがん細胞の抗がん剤への感受性を上昇させる抗体。
- 実質的に細胞の増殖に影響を及ぼさない請求項1又は2に記載の抗体
- インテグリンA6B4に対する抗体であって、前記抗体はヒトインテグリンA6B4複合体を特異的に認識し、かつ前記抗体は、
(a) インテグリンA6B4を介した細胞間接着を阻害する能力;
(b) がん細胞の抗がん剤への感受性を上昇させる能力;
(c) 実質的に細胞の増殖に影響を及ぼさない特性;
のうち少なくとも2つ以上を有する抗体。 - 抗がん剤が下記(i)から(v)から選択される請求項2又は4に記載の抗体
(i)イホスファミド、塩酸ニムスチン、塩酸プロカルバジン、シクロホスファミド、ダカルバジンおよびチオテバから選択されるアルキル化剤;
(ii)シタラビン、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、カルモフール、テガフールおよびフルオロウラシルから選択される代謝拮抗剤;
(iii)エトポシド、イリノテカン、ドセタキシル、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビンブラスチンから選択される植物アルカロイド;
(iv)アクチノマイシンD、イダルビシン、ドキソルビシン、ヒドラルビシン、ミトキサントロンおよびマイトマイシンCから選択される抗がん性抗生物質;
(v)カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチンおよびオキサリプラチンから選択される白金系製剤: - ヒト抗体あるいはヒト化抗体である請求項1から5の何れか一項に記載の抗体。
- 重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)としてそれぞれ配列番号1〜3、7〜9、13〜15、19〜21、25〜27の何れかのアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含む、請求項1から6の何れか一項に記載の抗体。
- 重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)としてそれぞれ配列番号1〜3、7〜9、13〜15、19〜21、25〜27の何れかのアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)としてそれぞれ配列番号4〜6、10〜12、16〜18、22〜24、28〜30の何れかのアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含む、請求項1から7の何れか一項に記載の抗体。
- 下記(i)から(v)から選択される請求項1から8の何れか一項に記載の抗体
(i)配列番号1のアミノ酸配列からなる重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、配列番号2のアミノ酸配列からなる重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、配列番号3のアミノ酸配列からなる重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)、配列番号4のアミノ酸配列からなる軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、配列番号5のアミノ酸配列からなる軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、配列番号6のアミノ酸配列からなる軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)を含む抗体;
(ii)配列番号7のアミノ酸配列からなる重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、配列番号8のアミノ酸配列からなる重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、配列番号9のアミノ酸配列からなる重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)、配列番号10のアミノ酸配列からなる軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、配列番号11のアミノ酸配列からなる軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、配列番号12のアミノ酸配列からなる軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)を含む抗体;
(iii)配列番号13のアミノ酸配列からなる重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、配列番号14のアミノ酸配列からなる重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、配列番号15のアミノ酸配列からなる重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)、配列番号16のアミノ酸配列からなる軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、配列番号17のアミノ酸配列からなる軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、配列番号18のアミノ酸配列からなる軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)を含む抗体;
(iv)配列番号19のアミノ酸配列からなる重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、配列番号20のアミノ酸配列からなる重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、配列番号21のアミノ酸配列からなる重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)、配列番号22のアミノ酸配列からなる軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、配列番号23のアミノ酸配列からなる軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、配列番号24のアミノ酸配列からなる軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)を含む抗体;
(v)配列番号25のアミノ酸配列からなる重鎖第1相補性決定領域(VH CDR1)、配列番号26のアミノ酸配列からなる重鎖第2相補性決定領域(VH CDR2)、配列番号27のアミノ酸配列からなる重鎖第3相補性決定領域(VH CDR3)、配列番号28のアミノ酸配列からなる軽鎖第1相補性決定領域(VL CDR1)、配列番号29のアミノ酸配列からなる軽鎖第2相補性決定領域(VL CDR2)、配列番号30のアミノ酸配列からなる軽鎖第3相補性決定領域(VL CDR3)を含む抗体; - 配列番号1〜3、7〜9、13〜15、19〜21、25〜27、4〜6、10〜12、16〜18、22〜24、28〜30の何れかのアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び/または挿入されていて、ヒトITGA6B4と特異的に反応する活性を有する、請求項7又は8に記載の抗体。
- 抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(Diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)およびCDRを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項7から10のいずれか一項に記載の抗体をコードするDNA。
- 請求項12に記載のDNAを含有する組換えベクター。
- 請求項12に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
- 請求項14に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項1から11の何れか一項に記載の抗体を生成蓄積させ、培養物から抗体を採取することを含む、請求項1から11の何れか1項に記載の抗体の製造方法。
- 請求項1から11の何れか1項に記載の抗体を含有する、がん細胞の細胞接着阻害剤。
- 他の抗がん剤と併用された際、がん細胞の前記抗がん剤に対する感受性を向上させるのに用いられる、請求項1から11のいずれか1項に記載の抗体を含有するがん細胞の細胞接着阻害剤。
- 請求項1から11の何れか1項に記載の抗体と医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
- 請求項1から11の何れか1項に記載の抗体を含有する医薬組成物であって、
がん細胞の薬剤感受性を上昇させ、がん細胞の増殖阻害および/またはがん細胞を死滅させるために、それを必要とする患者に、
(a)請求項1から11のいずれか1項に記載の抗体、および
(b)イホスファミド、塩酸ニムスチン、塩酸プロカルバジン、シクロホスファミド、ダカルバジンおよびチオテバから選択されるアルキル化剤;シタラビン、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、カルモフール、テガフールおよびフルオロウラシルから選択される代謝拮抗剤;エトポシド、イリノテカン、ドセタキシル、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビンブラスチンから選択される植物アルカロイド;アクチノマイシンD、イダルビシン、ドキソルビシン、ヒドラルビシン、ミトキサントロンおよびマイトマイシンCから選択される抗がん性抗生物質;カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチンおよびオキサリプラチンから選択される白金系製剤から選択される抗がん剤を、前記抗体が、がん細胞に結合するための条件下および十分な量で提供し、それによりがん細胞の増殖阻害および/またはがん細胞の死滅を引き起こす、前記医薬組成物。 - がん細胞が、骨髄ニッチに生着したがん細胞である、請求項19に記載の医薬組成物
- がんが、固形がんまた血液がんである、請求項19又は20に記載の医薬組成物。
- 固形がんが肺がん、大腸がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、又は皮膚がんである、請求項21に記載の医薬組成物。
- 血液がんが白血病、リンパ腫、又は骨髄腫である、請求項21に記載の医薬組成物。
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