JPH07503609A - リセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバーの多量体型 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトや他の哺乳動物、鳥、魚、昆虫なとのような複雑な真核生物の成長やホメオ スタシス（恒常性）の転写的制御は、ステロイドホルモンや甲状腺ホルモンなど の多種多様の制御物質により調節されている。これらのホルモンは系統学的に多 様な生物の成長と分化に対して強い作用を示す。ホルモンの作用は、リセブター と呼ばれる特異的で高親和性の結合蛋白との相互作用により仲介される。

各ステロイドホルモンに特異的なりセブター蛋白（例えばエストロゲン（エスト ロゲンリセプター）、プロゲステロン（プロゲステロンリセブター）、糖質コル チコイド（糖質コルチコイドリセブター）、アンドロゲン（アンドロゲンリセブ ター）、アルドステロン（アルドステロンリセブター）、ビタミンＤ（ビタミン Ｄリセプター））、レチノイドに特異的なりセブター蛋白（例えばレチノイン酸 すセプター）、または甲状腺ホルモンに特異的なりセブター蛋白（例えば甲状腺 ホルモンリセプター）か知られている。リセブター蛋白は、複雑な真核生物の細 胞集団中で組織特異的に分布していることが見いだされている。

分子クローニング研究により、ステロイド、レチノイドおよび甲状腺ホルモンの りセブターはすべて構造的に関連しており、制御蛋白のスーパーファミリーを構 成していることを証明することか可能になった。これらの制御蛋白は、ホルモン 刺激に対してシス作用性成分（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ）に直 接結合して、特異的遺伝子発現を調節することができる。

このリセブター蛋白のスーパーファミリーの性状解析における重要な進歩は、ホ ルモンリセブターに特徴的な構造を存する多くの遺伝子産物が同定され続けてい ることである。

ステロイドホルモンまたは甲状腺ホルモン、これらの保護された型、またはこれ らの代謝物は細胞内に入って、対応する特異的リセブター蛋白に結合し、蛋白の アロステリックな（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ）変化を引き起こすことが知られてい る。この変化の結果、リセブターやホルモン（またはこれらの代謝物）の複合体 は、クロマチン（ｃｈｒｏｍａｔ　ｉｎ）上のある特定の部位に高親和性に結合 することができる。

ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモンの主要な作用の多くは、特定のタイプ の細胞の遺伝子のサブセットの転写を増加させることであることも知られている 。

リセブターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバーに応答するいく つかの転写調節単位か同定されている。これらには、糖質コルチコイド、アルド ステロンおよびアンドロゲンホルモンに応答する、マウス乳癌ウィルス５′長末 端繰り返し配列（ｍｏｕｓ６　ｍａｍａｒｙ　ｔｕｍｏｒ　ｖｉｒｕｓ　５’− １ｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ　（ＭＴＶ　ＬＴＲ））；糖質コル チコイド、エストロゲンおよび甲状腺ホルモンに応答する、哺乳動物の成長ホル モン遺伝子の転写的調節単位；エストロゲンに応答する、哺乳動物のプロラクチ ン遺伝子およびプロゲステロンリセブター遺伝子の転写的調節単位；プロゲステ ロンに応答する、鳥類オバルブミン遺伝子の転写的調節単位：糖質コルチコイド に応答する、哺乳動物のメタロチオネイン遺伝子の転写的調節単位；アンドロゲ ン、エストロゲン、甲状腺ホルモンおよび糖質コルチコイドに応答する、哺乳動 物肝α２Ｕ−グロブリン遺伝子の転写的調節単位がある。

ホルモンリセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリ一種々のメンバーの さらなる理解と広範囲の利用に対する大きな障害は、ホルモンリセブターのステ ロイド／甲状腺スーパーファミリーの種々のメンバーの相互作用の可能性に対す る理解が欠如していることと、種々の生理的プロセスを転写的に制御する、ホル モンリセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバーの能力に対 する、そのような相互作用の意味に対する理解が欠如していることである。

本発明において、我々はりセブターのステロイド／甲状腺スーパーファミリー２ つまたはそれ以上のメンバーか組合さって、２つ以上のりセブターの複合体より なる多量体を形成することができることを発見した。従って第１のりセブターが 第２のりセブターに組合わさって、第１のりセプターの同族のリガンドの存在下 で発現調節されて維持される遺伝子の転写をトランス活性化（ｔｒａｎｓ−ａｃ ｔｉｖａｔｅ）する第１のリセブターの能力を調節することができる。

図面の簡単な説明 図１は、細菌で発現させたＣ０ＵＰ−ＴＦとＲＸＲ，およびＣ０ＵＰ−ＴＦとＲ ＸＲの両方のＤＮＡ結合ドメインにより認識される配列を存する３２Ｐ標識オリ ゴヌクレオチドを用いるゲル移動度シフト測定法（ｇｅｌ　ｍｏｂｉｌｉｔｙｓ ｈｉｆｔ　ａｓｓａｙ）を示す。

図２は、ＲＸＲ応答成分を介するＲＸＲ仲介トランス活性化に対する、Ｃ０ＵＰ −ＴＦとＥＡＲ−２の作用を要約している。

図３は、ＲＡＲとＲＸＲの間のへテロダイマー形成の証拠を示す。具体的には、 図３ＡはＲＸＲとリセブターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーの種々の 他のメンバー（これらの断片を含む）の間の免疫沈降反応の結果を示す。

図３Ｂは、インビトロで合成したＲＡＲおよび／またはＲＸＲと、標識した応答 成分（ＣＲＢＰ−ＩＩ−ＲＸＲＥ）を用いるゲル移動度シフト測定法を示す。

図３０は、標識した応答成分と過剰の標識していない競合応答成分を用いるゲル 移動度シフト競合を示す。

図３Ｄは、インビトロで合成したＥＡＲおよび／またはＲＸＲと、標識した応答 成分（βＲＡＲＥ）を用いるゲル移動度シフト測定法を示す。

図３Ｅは、標識した応答成分（βＲＡＲＥ）と、リセプターを過剰に発現させた ＣＯ８細胞から調製した全細胞抽出物を用いるゲル移動度シフト測定法を示す。

図４は、ＲＸＲ−ＴＲ間、およびＲＸＲ−ＶＤＲ間のへテロダイマー形成の証拠 を示す。具体的には、図４ＡはＲＸＲとＴＲまたはＶＤＲの間の免疫沈降反応の 結果を示す。

図４Ｂは、インビトロで合成したＲＸＲ，ＴＲ１ＶＤＲ，およびＧＲ（図に示す ）そして、種々の応答成分をコードする標識したオリゴヌクレオチドを用いるゲ ル移動度シフト測定法を示す。

発明の詳細な説明 本発明において、リセブターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーの少なく とも２つの異なるメンバーの少なくともダイマー化ドメインよりなる、リセブタ ーのステロイド／甲状腺スーパーファミリーに属する多量体リセブターが与えら れる。

本発明においてリセブターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーの１つのメ ンバーの「ダイマー化ドメイン」という用語は、多量体リセブターの形成に関与 すると考えられているリセプターの部分を意味する。典型的にはこのドメインは 、リセブターのカルボキシ末端（すなわち、リセブターのＤＮＡ結合ドメインに 対して３°であるリセブターの部分）よりなる。

本発明において、リセブターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーの少なく とも２つの異なるメンバーよりなるリセプターの組合せも与えられ、ここでリセ ブターは多量体の形で会合しており、この組合せには、メンバーの１つはＲＡＲ α、ＲＡＲβまたはＲＡＲγより選択され、他のメンバーはＴＲαまたはＴＲβ より選択される２つからなる組合せは含まれない。

本発明の組合せは広義に「多量体」と呼ぶことができ、リセブターのステロイド ／甲状腺スーパーファミリー（これらのダイマー化ドメインよりなるこれらの断 片を含む）のメンバーが会合できる種々のオリゴマー型のすべてを包含する。

すなわちステロイドリセブターの「組合せ」すなわちステロイドリセブターの［ 多量体」型は、単一のりセプタ−（これらのダイマー化ドメインよりなるこれら の断片を含む）のホモダイマー性組合せ、２つの異なるリセブタ−（これらのダ イマー化ドメインよりなるこれらの断片を含む）のへテロダイマー性組合せ、単 一のりセブタ−（これらのダイマー化ドメインよりなるこれらの断片を含む）の ホモトリマー性組合せ、２つまたは３つの異なるリセブター（これらのダイマー 化ドメインよりなるこれらの断片を含む）のヘテロトリマー性組合せ、単一のり セブター（これらのダイマー化ドメインよりなるこれらの断片を含む）のホモテ トラマー性組合せ、２つまたはそれ以上の異なるリセプタ−（これらのダイマー 化ドメインよりなるこれらの断片を含む）のへテロテトラマー性組合せなどを含 む。

本発明において、ｒリセブターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメン バー」という用語は、リガント依存性転写因子として作用するホルモン結合性蛋 白の種々のアイソフオーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）のすべて（特異的リガンドがいま だに同定されてないリセブターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメン バー（以後「オーファンリセブター」と呼ぶ）を含む）を意味する。そのような 蛋白のそれぞれは、漂的遺伝子中の特異的ＤＮＡ配列に結合する本質的能力を存 する。結合の後、遺伝子の転写活性は同族ホルモン（リガンド）の存在または欠 如により調節される。このリセブターのスーパーファミリーのすべてのメンバー のＤＮＡ結合ドメインは関連しており、６６−６８個のアミノ酸残基よりなり、 ９個のソステインを含む約２０個の不変のアミノ酸残基を存する。このスーパー ファミリーのメンバーは、これらの診断用のアミノ酸残基を含む蛋白として同定 。

することができ、これらはヒト糖質コルチコイドリセブター・（アミノ酸４２１ −４８６）、エストロゲンリセプタ−（アミノ酸１８５−２５ＯＬ無機コルチコ イドリセブタ−（アミノ酸６０３−６６８）、ヒトレチノイン酸すセブタ−（ア ミノ＠８８−１５３）なとの公知のステロイドリセブターのＤＮＡ結合ドメイン の一部である。このスーパーファミリーメンバーのＤＮＡ結合ドメインの高度に 保存されたアミノ酸は以下の通りである：Ｃｙｓ　−Ｘ　−Ｘ　−Ｃｙｓ　−Ｘ 　−Ｘ　−Ａｓｐ＊　−Ｘ　−人工ａ会　−Ｘ　−Ｇｌｙ＊　−Ｘ　−Ｔｙｒ＊ 　−Ｘ　−Ｘ　−Ｘ　−Ｘ　−Ｃｙｓ　−Ｘ　−Ｘ　−Ｃｙｓ　−Ｌｙｓ＊　− Ｘ　−Ｐｈａ　−Ｐｈａ　−Ｘ　−ｋｒｑ＊　−Ｘ　−Ｘ　−Ｘ　−Ｘ　−ｘ− ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−（ｘ−ｘ−）Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ　−Ｘ　−Ｘ　−Ｘ　−（Ｘ　− Ｘ　−Ｘ　−）　Ｃｙｓ　−Ｘ　−Ｘ　−Ｘ　−Ｌｙｓ　−Ｘ　−Ｘ　−Ａｒｇ 　−Ｘ　−Ｘ　−ＣＹＳ　−Ｘ　−Ｘ　−ＣＹＳ　−Ａｒｇ會　−Ｘ　−Ｘ　− Ｌｙｓ會　−Ｃｙｓ　−Ｘ　−Ｘ　−Ｘ　−Ｇｌｙ”　−Ｍａｔ（配列番号１） ここでＸはＤＮＡ結合ドメイン中の非保存アミノ酸であり：星印で示すアミノ酸 残基は、はとんど普遍的に保存される残基であるか、いくつかの同定されたホル モンクセブタ−中で変種が見いだされている：および括弧内の残基は任意の残基 である（すなわちＤＮＡ結合ドメインは長さが最低６６個のアミノ酸であるが、 数個の残基を追加的に含む）。

リセブターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバー（これらの種々 のアイソフオームを含む）の例としては、糖質コルチコイドリセブター、無機コ ルチコイドリセブター、プロゲステロンリセブター、アンドロゲンリセプター、 ビタミンＤ３リセブターなどのステロイドリセブター；およびＲＡＲの種々のア イソフオーム（例えばＲＡＲα、ＲＡＲβ、またはＲＡＲγ）、ＲＸＲの種々の アイソフオーム（例えばＲＸＲα、ＲＸＲβ、またはＲＸＲγ）などのレチノイ ドリセブター；ＴＲα、ＴＲβなどの甲状腺リセプター；および前記に定義した ようにその構造と性質からスーパーファミリーのメンバーと考えられる他の遺伝 子産物（およびこれらの種々のアイソフオームを含む）を含む。オーファンリセ ブターの例としては、ＨＮＦ４［例えばスラブツク（Ｓ　１　ａ　ｄ　ｅ　ｋ） ら、Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　４：２３５３−２３６５（１９ ９０）を参照］、リセプターのＣ０ＵＰフアミリー［例えばミャジマ（Ｍｉｙａ ｊｉｍａ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１６：１１０ ５７−１１０７４　（１９８８）　、およびワンプ（Ｗａｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒ ｅ　３４０：１６３−１６６　（１９８９）を参照］、例えばムロシック（Ｍｌ ｏｄｚｉｋ）ら、Ｃｅ１ｌ　６０：２１１−２２４　（１９９０）およびラジア ス（Ｌａｄｉａｓ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２５１：５６１−５６５　（１９９１ ）の記載するＣ０ＵＰ様リセプターやＣ０ＵＰ同族体、種々のベルオキシソーム 増殖物質活性化すセブター（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ −ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）（ＰＰＡＲｓ　；例えばイッセマン とグリーン（ｌｓｓｅｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎ）、Ｎａｔｕｒｅ　３４７ ：６４５−６５０（１９９０）を参照）の種々のアイソフオーム、ウルトラスパ イラクル（ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ）リセブター［例えば、才口（Ｏｒｏ） ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４７：２９８−３０１　（１９９０）を参照コなどがある 。本発明の実施において利用するのに好適なスーパーファミリーのメンバーは、 以下に詳細に記載するように、　［直接繰り返し配列」ホルモン応答成分を認識 するものである。

多量体の形成は、第１のりセプターのリガンドの存在下で発現が調節されて維持 される遺伝子の転写をトランス活性化する、第１のりセブターの能力を調節する ことができる。転写の活性化に対する実際の効果（すなわち転写活性の増強また は抑制）は、多量体の一部であるリセブターに依存して、および多量体と相互作 用する応答成分に依存して変化する。例えばＲＸＲとＲＡＲのへテロダイマーの 形成は、ＲＸＲ仲介プロセスをトランス活性化するＲＸＲの能力を阻害し、同じ へテロダイマーは、ＲＡＲ仲介プロセスをトランス活性化するＲＡＲの能力に関 するトランス活性化能を増強させる。

本発明の別の実施態様において、ある発現系において、遺伝子の発現はホルモン 応答成分の調節下で維持される、リセブターのステロイド／甲状腺スーパーファ ミリーの第１のメンバーによる遺伝子の転写活性化を調節する方法が与えられ、 該方法は、第１のメンバーと多量体複合体を形成するのに有効な量で、リセブタ ーのステロイド／甲状腺スーパーファミリーの第２のメンバーの少なくともダイ マー化ドメインに、数基を暴露させることよりなる。

リセブターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーの第２のメンバーの少なく ともダイマー化ドメインに数基を暴露させることは、数基に第２のメンバー（ま たはそのダイマー化ドメイン）を直接与えるか、または第２のメンバー（または そのダイマー化ドメイン）の発現を誘導する化合物および／または条件に数基を 暴露することにより達成される。得られる多量体は、リセブターのステロイド／ 甲状腺スーパーファミリーの第１のメンバーによる遺伝子のトランス活性化を調 節するのに有効である。

本発明において［調節する」という用語は、複合体ではない状態のりセプターの 能力に比較して、標的遺伝子の転写を誘導するりセブターの能力を増強または抑 制する特定の多量体の能力を意味する。リセブターの転写活性に対する実際の効 果は、多量体の一部である特定のりセブターに依存して、および多量体と相互作 用する応答成分に依存して変化する。例えばＲＸＲとＴＲのへテロダイマーの形 成は、ＲＸＲ仲介プロセスをトランス活性化するＲＸＲの能力を阻害し、一方同 じへテロダイマーは、ＴＲ仲介プロセスをトランス活性化するＴＲの能力に関す るトランス活性化能を増強させる。

本発明の１つの実施態様において、リセブターのステロイド／甲状腺スーパーフ ァミリーの第１のメンバーはＲＸＲのアイソフオームであり、第２のメンバーは Ｃ０ＵＰ−ＴＦ、ＥＡＲ−２、ＰＰＡＲｌＶＤＲＳＴＲＳＲＡＲｌまたはそれら のアイソフオームより選択される。当業者は、前記の１つまたはそれ以上の第２ のメンバーの発現を誘導する化合物および／または条件を容易に同定することか できる。

この実施態様において第１のメンバーは、肝臓、牌１腎臓および／または小腸中 で発現される遺伝子によりコードされる。コードされる成分は脂質代謝および／ またはコレステロールのホメオスタシス（ｈｏｍｅｏｓ　ｔａｓ　ｉｓ）に関与 している。

本発明の別の実施態様において、リセブターのステロイド／甲状腺スーパーファ ミリーの第１のメンバーはＲＡＲのアイソフオームであり、第２のメンバーはＲ ＸＲのアイソフオームである。当業者は、前記の第２のメン／＜−（ＲＸＲ）の １つまたはそれ以上のアイソフオームの発現を誘導することができる化合物およ び／または条件を容易に同定することができる。

本発明のさらに別の実施態様において、リセブターのステロイド／甲状腺スーパ ーファミリーの第１のメンバーはＴＲのアイソフオームであり、第２のメンバー はＲＸＲのアイソフオームである。当業者は、前記の第２のメンバー（ＲＸＲ） の１つまたはそれ以上のアイソフオームの発現を誘導することができる化合物お よび／または条件を容易に同定することができる。

本発明のさらに別の実施態様において、リセブターのステロイド／甲状腺スーパ ーファミリーの第１のメンバーはＶＤＲのアイソフオームであり、第２のメンバ ーはＲＸＲのアイソフオームである。当業者は、前記の第２のメンバー（ＲＸＲ ）の１つまたはそれ以上のアイソフオームの発現を誘導することができる化合物 および／または条件を容易に同定することができる。

本発明の実施において利用されるホルモン応答成分は、天然に存在する応答成分 、または２つまたはそれ以上の「半部位Ｊ　（”ｈａｌｆ−ｓｉｔｅｓ″）より なる合成応答成分を含み、ここで各半部位は配列−ＲＧＢＮＮＭ− ここで、ＲはＡまたはＧから選択され、ＢはＧ、ＣまたはＴから選択され、各Ｎ はＡ、Ｔ、ＣまたはＧから１１に選択され、ＭはＡまたはＣから選択されるが、 ただし上記−ＲＧＢＮＮＭ−配列の少なくとも４つのヌクレオチドは、配列−Ａ ＧＧＴＣＡ−の対応する位置のヌクレオチドと同じであり、ここで、半部位のそ れぞれの間のヌクレオチドのスペースは０から１５個のヌクレオチド（Ｎ）の範 囲内にある。

半部位の１つか−ＡＧＧＴＣＡ−の好適な配列からヌクレオチド２個だけ異なる 時、応答成分の他の半部位は好適な配列と同じであるか、またはヌクレオチドが １個だけしか異ならないことか好ましい。一対の半部位の３°半部位（または下 流の半部位）は好適な配列とはせいぜいヌクレオチド１個しか異ならないことが 好ましい。

半部位は直接の繰り返し配列（パリンドローム作成体ではなく）で組合わされる ため、得られる合成応答成分はｒＤＲ−ＸＩと呼ばれる（ここで「ＤＲ」は半部 位間の会合の直接重複配列（ｄｉｒｅｃｔ　ｒｅｐｅａｔ）性を意味し、「Ｘ」 は各半部位間のスペーサーヌクレオチドの数を示す）。

本発明の実施に作用な応答成分の例は、例えば−ＡＧＧＴＣＡ−１−ＧＧＴＴＣ Ａ−１−ＧＣ；ＧＴＴＡ−１−ＧＧＧＴＧＡ−１−ＡＧＧＴＧＡ−１−ＧＧＧＴ ＣＡ−などから選択される配列を存する半部位の種々の組合せから得られる。

非ゼロスペーサーに使用されるヌクレオチドは、ＣＳＴ、　Ｇまたは八から独立 に選択される。

３つのヌクレオチドスペーサーの例には、−ＡＧＧ−１−ＡＴＧ−１−ＡＣＧ− １−ＣＧＡ−なとがある。４つのヌクレオチドスペーサーの例には、−ＣＡＧＧ −１−ＧＧＣ；Ｇ−１−ＴＴＴＣ−などがある。５つのヌクレオチドスペーサー の例には、−ＣＣＡＧＧ−１−ＡＣＡＧＧ−１−ＣＣＧＡＡ−１−ＣＴＧＡＣ− １−ＴＴＧＡＣ−などかある。

本発明の応答成分には、以下のＤＲ−３成分：５’　−ＡＧＧＴＣＡ−ＡＧＧ− ＡＧＧＴＣＡ−３’　（配列番号２）、５’　−ＧＧＧＴＧＡ−ＡＴＧ−ＡＧＧ ＡＣＡ−３’　（配列番号３）、５°　ＧＧＧＴＧＡ　ＡＣＧ　ＧＧＧＧＣＡ− ３’　（配列番号４）、５°　−ＧＧＴＴＣＡ−ＣＧＡ−ＧＧＴＴＣＡ−３°　 （配列番号５）、以下のＤＲ−４成分： ５°　−ＡＧＧＴＣＡ−ＣＡＧＧ−ＡＧＧＴＣＡ−３’　（配列番号６）、５° −ＡＧＧＴＧＡ−ＣＡＧＧ−ＡＧＧＴＣＡ−３’　（配列番号７）、５’　−Ａ ＧＧＴＧＡ−ＣＡＧＧ−ＡＧＧＡＣＡ−３’　（配列番号８）、５’　−ＧＧＧ ＴＴＡ−ＧＧＧＧ−ＡＧＧＡＣＡ−３’　（配列番号９）、５’　−ＧＣ；ＧＴ ＣＡ−ＴＴＴＣ−ＡＧＧＴＣＣ−３’　（配列番号１０）、以下のＤＲ−５配列 成分： ５°−ＡＧＧＴＣＡ−ＣＣＡＧＧ−ＡＧＧＴＣＡ−３°　（配列番号１１）、５ ’　−ＡＧＧＴＧＡ−ＡＣＡＧＧ−ＡＧＧＴＣＡ−３’　（配列番号１２）、５ °　−ＧＧＴＴＣＡ−ＣＣＧＡＡ−ＡＧＴＴＣＡ−３°　（配列番号１３）、５ °−ＧＧＴＴＣＡ−ＣＣＧＡＡ−ＡＧＴＴＣＡ−３°　（配列番号１４）、５’ 　−ＡＧＧＴＣＡ−ＣＴＧＡＣ−ＡＧＧＧＣＡ−３’　（配列番号１５）、５’ 　−ＧＧＧＴＣＡ−ＴＴＣＡＧ−ＡＧＴＴＣＡ−３°　（配列番号１６）、５° −ＡＡＧＣＴＴＡＡＧ−ＧＧＴＴＣＡ−ＣＣＧＡＡ−ＡＧＴＴＣＡ−ＣＴＣＡＧ ＣＴＴ−３’　（配列番号１７）、５°−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧ−ＧＧＴＴＣＡ− ＣＣＧＡＡ−ＡＧＴＴＣＡ−ＣＴＣＧＣＡＴＡＧＣＴＴ−３’　（配列番号１８ ）、５’　−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧ−ＧＧＴＴＣＡ−ＣＣＣ；ＡＡ−ＡＧＴＴＣＡ −ＣＴＣＧＣＡＴＡＴＡＴＴＡＧＣＴＴ−３’　（配列番号１９）などがある。

本発明の実施での利用に好適な応答成分には：５’　−ＡＧＧＴＣＡ−ＡＧＧ− ＡＧＧＴＣＡ−３’　（配列番号２）、５′−ＡＧＧＴＣＡ−ＣＡＧＧ−ＡＧＧ ＴＣＡ−３’　（配列番号６）、５’　−ＡＧＧＴＧＡ−ＣＡＧＧ−ＡＣ；ＧＴ ＣＡ−３°　（配列番号７）、５′　−ＡＧＧＴＣＡ−ＣＣＡＧＧ−ＡＧＧＴＣ Ａ−３’　（配列番号１１）、５°−ＡＧＧＴＧＡ−ＡＣＡＧＧ−ＡＧＧＴＣＡ −３″　（配列番号１２）などがある。これらは天然には観察されていない合成 配列であるため特に好適であり、従って広範囲のレポーター系に適している（す なわち、配列の供給源に基づき任意の種に利用てきるため、これらの応答成分の 利用は限定されない）。

以下の非限定例で本発明をさらに詳細に記載する。

寒黒聾 同時トランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）測定法に使用され るリセブター発現プラスミツドは、マンゲルスドルフ（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ ）ら［Ｃｅ１ｌ　６６：５５５−５６１　（１９９１）を参照］、およびウメソ ノ（Ｕｍｅｓｏｎｏ）ら［Ｃｅ１ｌ　６５：１−２０　（１９９１）を参照］に より記載されている。

Ｒ３−Ｃ０ＵＰ−ＴＦ発現プラスミツドは、ＥＡＲ−３（すなわちＣ０ＵＰ）コ ード領域を含有するＡｓｐ７１８−ＢａｍＨＩ断片［ミャジｖ（Ｍｉｙａｊｉｍ ａ）　ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１６：１１０５７ −１１０７４　（１９８８）］を、Ａｓｐ７１８−ＢａｍＨＩで切断したＩ）Ｒ ３発現ベクター中に挿入することにより作成した。

ＲＳ−ＥＡＲ−２発現プラスミツドを作成するために、ＥＡＲ−２コード領域を 含有するＥｃｏ４７１ｆｌ−Ｂｇｌｌｌ断片（ミャジｖ　（Ｍｉｙａ　ｊ　ｉｍ ａ）ら、前述）をフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）で平滑末端にし、同じくフレノウで 末端を充填しておいたＡｓｐ７１８−ＢａｍＨＩで切断したｐＲ３中に挿入した 。

使用したすべての組換えレポーター作成体は、基礎レポーター作成体Δ５ｖ−Ｃ ＡＴ　（ウメソノ（Ｕｍｅｓｏｎｏ）ら、前述）の上流の単一のＨｉｎｄｌｌｆ 部位に、記載したオリゴヌクレオチドの１つまたは２つのコピーを挿入して含有 する。Ｕ挿入されたオリゴヌクレオチドの本体および配向は配列決定により確認 した。

同時トランスフェクション測定法 ＣＶ−１、Ｈｅ　］　ａ、およびＦ９奇形癌腫細胞培養、トランスフェクション およびＣＡＴ測定法は、前述した（マンゲルスドルフ（Ｍａｎｇｅ　ｌ　５ｄｏ ｒｆ）ら、前述：ウメソノ（Ｕｍｅｓｏｎｏ）ら、前述）ように行った。発現プ ラスミツドＲ５−Ｃ０ＵＰ−ＴＦおよびＲＳ−ＥＡＲ−２（図２を参照）を含む 同時トランスフェクション実験では、これらの蛋白はβ−ガラクトシダーゼ発現 ベクターの発現を強く抑制することが証明されていたため、ＣＡＴ測定法で使用 するため細胞抽出物を総蛋白量に対して標準化した。

ＲＸＲとＣ０ＵＰ−ＴＦの細菌による発現ｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクター［スミス とジョンソン（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｇｅｎｅ　６７：３ｌ −４０（１９８８）］を用いてグルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼとの融合 蛋白として、ｈＲＸＲαを細菌中で発現した。融合蛋白の精製とトロンビンによ るＲＸＲからのグルタチオン−８−トランスフェラーゼ蛋白の切断は、マンゲル スドルフ（Ｍａｎｇｅ　１５ｄｏｒｆ）らの方法（前述）により実施した。

細菌でのＣ０ＵＰ−ＴＦの発現のために、ＥＡＲ−３（ミャジマ（ＭｉｙａＪｉ ｍａ）ら、前述）の全コード領域を含有する１、８ｋｂのＮｃｏｌ　−ＢａｍＨ Ｉ断片を、ＰＥＴ−８Ｃ発現ベクター［スッジェル（Ｓｔｕｄｉｅｒ）ら、Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８５：６Ｏ−８９（１９９０）］ 中に挿入した。Ｐ　ｅ　ｔ　−８Ｃ−Ｃ０ＵＰ−ＴＦ発現作成体を含有するＢＬ ２１（ＤＥ３）ｐ　１ｙｓＳ細胞［スッジェル（Ｓｔｕｄｉｅｒ）ら、前述）を 、０゜６ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で３時間誘導し、次 に溶解緩衝液［５０ｍＭのトリス（ｐＨ８，０）、２５０ｍＭのＫＣＩ、１ｍＭ のＤＴＴ、ＩｍＭのＰＭＳＦ、１％のトリトンＸ−１００］中で、細胞を凍結− 溶解により溶解した。

溶解物をＴｉ６０ローター（ベックマン）中で４５．００Ｏｒｐｍで１時間遠心 分離して清澄化した。Ｃ０ＵＰ−ＴＦを含有する粗細菌性溶解物を、ＫＣＩの欠 如している溶解緩衝液中で最終濃度が１００ｍＭのＫＣＩになるまで希釈し、ヘ パリン−アガロースカラムにのせた。カラムを緩衝液Ａ［２０ｍＭのトリス（１ ）Ｈ８，０）、２０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＳＦ］で 洗浄し、次にＣ０ＵＰ−ＴＦを８００ｍＭのＫＣＩを含有する緩衝液Ａで溶出し た。

溶出した蛋白をｌＯＵｍＭのＫＣＩで透析し、モノＱカラム（ファルマシア（Ｐ ｈａｒｍａｃ　１ａ））にのせ、緩衝液Ａ中の直線塩勾配（１００ｍＭ−８００ ｍＭ）で溶出した。Ｃ，０ＵＰ−ＴＦ結合活性を含有する画分（３００−３５０ ｍＭのＫＣｌで溶出する）をプールし、ゲル移動度シフト測定法で使用するため に分注した。Ｃ０ＵＰ−ＴＦ特異的抗血清を用いたウェスタンプロット解析によ り、部分的に精製したＣ０ＵＰ−ＴＦは５ＤＳ−ＰＡＧＥで〜４５キロダルトン 蛋白として移動することを確認した。

ＤＮＡ結合測定法 ゲル移動度シフト測定系（２０μｌ）は、ＩＯｍＭ（７）トリス（ｐＨ８，０） 、４０ｍＭ（７）ＫＣＩ、０．１％（７）ＮＰ−４０，６％のグリセロール、ｌ １１ｇ０）ポリ（ｄ　Ｉ−ｄＣ）、そして図の凡例に示した特異的リセブターを 含有していた。氷の上で１０分間インキュベートした後、ｌｎＨの３２Ｐ標識オ リゴヌクレオチドを加え、さらに１０分間インキュベートを続けた。ＤＮＡ蛋白 複合体を０．５ＸＴＢＥ　（ＩＸＴＢＥ＝９０ｍＭのトリス、９０ｍＭのホウ酸 、２ｍＭ＠ＥＤＴＡ）中の４％ポリアクリルアミドゲル上で分解した。ゲルを乾 燥し、−７０″Ｃでオートラジオグラフィーを行った。以下のオリゴヌクレオチ ドとその相補体（ｃｏｍｐ　］　ｅｍｅｎ　ｔ）を３２Ｐで標識し、プローブと して使用した：ＤＲ−０　：ＡＧＣＴＴＣ−ＡＧＧＴＣＡ−ＡＧＣ；ＴＣＡ−Ｇ ＡＧＡＧＣＴ　（配列番号２０）； ＤＲ−１：ＡＧＣＴＴＣ−ＡＧＧＴＣＡ−Ｇ−ＡＧＧＴＣＡ−ＧＡＧＡＧＣＴ（ 配列番号２１）； ＤＲ−２：ＡＧＣＴＴＣ−ＡＧＧＴＣＡ−ＧＣ；−ＡＧＧＴＣＡ−ＧＡＧＣＴ（ 配列番号２２）： ＤＲ−３：ＡＧＣＴＴＣ−ＡＧＧＴＣＡ−ＡＧＧ−ＡＧＣ；ＴＣＡ−ＧＡＧＡＧ ＣＴ（配列番号２３）： ＤＲ−４：ＡＧＣＴＴＣ−ＡＧＧＴＣＡ−ＣＡＧＧ−ＡＧＧＴＣＡ−ＧＡＧＡＧ ＣＴ　（配列番号２４）； ＤＲ−５：ＡＧＣＴＴＣ−ＡＧＧＴＣＡ−ＣＣＡＧＣ；−ＡＧＣＴＣＡ−ＧＡＧ ＡＧＣＴ　（配列番号２５）； βＲＡＲＥ：ＡＧＣＴＴＡＡＧ−ＧＧＴＴＣＡ−ＣＣＧＡＡ−ＡＧＴＴＣＡ−Ｃ ＴＣＧＣＡＴＡＧＣＴＧＣＴ　（配列番号２６）；Ｃ０ＵＰ−ＴＦ　ＲＥ：ＡＧ ＣＴＴＧ−ＧＴＧＴＣＡ−Ａ−ＡＧＧＴＣＡ−ＡＡＣＴＴＡＧＣＴ　（配列番号 ２７）；工旦Δ−Ｃ−ＡＧＧＴＣＡ−Ｃ−へＧＴＴＣＡ−ＡＧＣＴ　（配列番号 ２８）；ＲＸＲ抗血清 リビエラ（Ｒｉｖｉｅｒ）らの方法［５ｃｉｅｎｃｅ　２２４　：８８９−８９ １（１９８４）］に従い、ｈＲＸＲαのアミノ酸２１４−２２９に対応するペプ チドを合成した。ボーガン（Ｖａｕｇｈａｎ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ ｚｙｍｏｌｏｇｙ　１６８：５８８−６１７　（１９８９）に記載されているよ うにビスジアゾ化ベンザジン（ｂｅｎｚａｄｉｎｅ）を用いて、ヒトα−グロブ リンに結合させるためにカルボキシ末端にグリシンとチロシンを加えた。最初の 注入ではフロイントの完全アジュバントを、Ｉｍｇ結合結合体／ｍ台有する等量 の生理食塩水と混合した。追加免疫のためにフロイントの不完全アジュバントを 、０．５ｍｇ結合体／ｍｌを含有する等量の生理食塩水と混合した。各免疫でウ サギに複数の皮肉部位に全部で１ｍｌのエマルジョンを加えた。３週置きにウサ ギに注射し、各追加免疫の７日後、耳静脈から出血させた。抗血清を集め、ｈＲ ＸＲαでトランスフェクションしたＣＯ８細胞抽出物のウェスタンプロット解析 に基づき、リセブター抗体を評価した。ここで使用した抗血清は６回目の追加免 疫の後に集めた。

実施例１ ＣＯＵＰ−ＴＦとＲＸＲはインビトロでヘテロダイマーを形成する細菌で発現さ せたＣ０ＵＰ−ＴＦとＲＸＲ−グルタチオン−５−）ランスフェラーゼ融合蛋白 （ＲＸＲ−ＧＳＴ）をａ合し、得られる複合体を３２Ｐ標識ＤＲ−１オリゴヌク レオチド（すなわち配列番号２１）をプローブとしてゲル移動度シフト測定法に より解析した。Ｃ０ＵＰ−ＴＦとＲＸＲ複合体の間で観察された移動度の差異を 最大にするために、大きいＲＸＲ融合蛋白を用いた。ＲＸＲ−ＧＳＴは、他のＤ Ｒに比較してＤＲ−１に対して顕著な選択性を示すなと、試験したすべての応答 成分との結合特異性の面で非融合蛋白と同じ挙動を示した。

図１に記載したように部分的に精製したＣ０ＵＰ−ＴＦ　（５００ｎｇ）と増加 する濃度の部分的に精製したＲＸＲ（ｌｘ−５０ｎｇ）の存在下で、３２Ｐ標識 ＤＲ−１オリゴヌクレオチド（配列番号２１）を用いてゲル移動度シフト測定法 を実施した。測定系には０，３μｍまたは１μｍのＲＸＲ特異的抗血清を含めた （それぞれレーンＩＩと１２に示しである）。ＲＸＲ特異的複合体とＣ０ＵＰ− ＴＦ特異的複合体の位置は図１に実線［−」で示しである。ＧＯＵＰ−ＴＦ−Ｒ ＸＲへテロダイマー複合体の位置は図に矢印で示してあり、スーパーシフトした 複合体は図に矢印の先端で示しである。遊離のプローブはゲルから流されており 、図には示されていない。

図１　（レーン２）に示しであるように、少量のＲＸＲ−ＧＳＴはＤＲ−１に弱 く結合したのみであるが、高濃度ではホモダイマー複合体が見られた（レーン８ ）。しかし一定量のＣ０ＵＰ−ＴＦに増加する濃度のＲＸＲ−ＧＳＴを加えると 、Ｃ０ＵＰ−ＴＦとＲＸＲ−ＧＳＴのみの場合の移動度の中間の移動度を存する 複合体か出現し、同時にＣ０ＵＰ−ＴＦ特異的複合体か消失した（レーン３．６ および９）。精製したＧＳＴのみを加えてもＣ０ＵＰ−ＴＦ複合体の移動度に影 響を与えなかった。使用した条件下ではいずれかのホモダイマーの形成よりも、 Ｃ０ＵＰ−ＴＦ−ＲＸＲヘテロダイマーの形成は勝っていた。　Ｃ０ＵＰ−ＴＦ とＲＸＲ−ＧＳＴの両方を含む測定系にＲＸＲ特異的抗血清を加えると、Ｃ０Ｕ Ｐ−ＴＦ−ＲＸＲ複合体の「スーパーシフト」が起きた（レーンｌ）。ＲＸＲ特 異的抗血清は、細菌で発現させたＣ０ＵＰ−ＴＦと交差反応をしなかった。ゲル 移動度シフト測定法に増加する量の抗血清を加えると、最終的にＣ０ＵＰ−ＴＦ −ＲＸＲ相互作用の破壊とＣ０ＵＰ−ＴＦ特異的複合体の再出現が見られた（レ ーン＋２）。この複合体からのＣ０ＵＰ−ＴＦの放出は、ＲＸＲホモダイマーを 安定化している多量の抗体の起きやすい結果である。

放射能標識オバルブミンＣ０ＵＰ−ＴＦ　ＲＥをプローブとして用いて、Ｃ０Ｕ Ｐ−ＴＦ−ＲＸＲヘテロダイマー複合体の形成を示す、同様のスーパーシフトデ ータも得られた。これらの結果はまとめると、インビトロでＣ０ＵＰ−ＴＦとＲ ＸＲは高度に安定はへテロダイマー複合体を形成することができるという強力な 証拠を示している。

ＲＸＲはＣ０ＵＰ−ＴＦ認識成分を介して転写を刺激することができるという観 察は、Ｃ０ＵＰ−ＴＦはＣＲＢＰＩ［部位を介して補完的に活性化することを示 唆している。上記のインビトロ結合データは、この仮説を強く支持する。しかし 同時トランスフェクション解析では、Ｒ９、ＣＶ−１、またはＨｅ１ａ細胞（図 ２Ａ、レーン９と１０）中で試験する時、レポータープラスミツドのＣ０ＵＰＲ Ｅ２−Δ５Ｖ−ＣＡＴまた＋ＩＣＲＢＰｒｌ−４ＳＶ−ＣＡＴから、Ｃ０ＵＰ− ＴＦが仲介する存意な発現活性化を得ることは不可能であった。密接に関連した レポーター（ＥＡＲ−２と呼ぶ（ミヤジ７　（Ｍｉ　ｙａ　ｊ　ｉｍａ）ら、前 述））もまた、ＣＲＢＰ１１レポーターを介する転写の活性化をしない（図２Ａ 、レーン１１と１２）、Ｃ０ＵＰ−ＴＦとＥＡＲ−２はオーファンリセブタ−（ ｏｒｐｈａｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるため、Ｃ０ＵＰ−ＴＦとＣＲＢＰ［［応 答成分を介する効率的なトランス活性化が外因性リガンドの添加を必要とするこ とはあり得る。

別のアプローチとして、Ｃ０ＵＰ−ＴＦはＲＸＲの仲介するＣＲＢＰＩ［−ＲＸ ＲＥからの誘導を変化させることができるかを調べた。すなわちＣＲＢＰ［［遺 伝子のインタクトのプロモーター領域を含有するＣＲＢＰ［１−ＣＡＴレポータ ーを、ＲＸＲ発現プラスミツドのみ、またはＣ０ＵＰ−ＴＦまたはＥＡＲ−２に 対する発現プラスミツドとともに、Ｒ９細胞中に同時トランスフェクションした 。Ｒ９細胞は２重測定で、３μｇのレポーターｐｃＲＢＰｌ［−ＣＡＴおよび１ ８ｇのＲ３−ｈＲＸＲα、および０，５μｇの対照のＲ３−ＬＵＣ（レーンｌと ２）、Ｒ３−ｈＲＡＲａ　（レ−：／３と４）、Ｒ３−Ｃ０ＵＰ−ＴＦ　（Ｉｚ −ン５と６）、またはＲ３−ＥＡＲ−２（レーン７と８）で同時トランスフェク ションした。各１０ｃｍのプレートのトランスフェクションにも、担体としての ５μｇのＲＡＳ−β−ガラクトシダーゼと５．５μｇのｐＵＣ１９を含有させた 。ＲＳ−ｈＲＸＲαの欠如する条件下でレポーターｐＣＲＢＰ［Ｉ−ＣＡＴと０ ．　５μｇのＲ５−Ｃ０ＵＰ−ＴＦ　（レーン９と１０）または０．５μｇのＲ ３−ＥＡＲ−２（レーンｔｉと１２）で行った同時トランスフェクションは、図 ２に示しである。細胞をエタノール（−）または１０ｇＭのＲＡ　（＋）で３０ 時間処理し、次に細胞抽出物のＣＡＴ活性を測定した。２重測定のＣＡＴの１つ のセットを図に示しである。

予想されたように、ＣＲＢＰＩ［−ＣＡＴレポーターとＲＸＲ発現プラスミツド て同時トランスフェクションした細胞にレチノイン酸を加えると、ＣＡＴ活性が 劇的に（約９０倍）誘導された（図２Ａ、レーン１と２を比較）。しかしＣＲＢ Ｐｌ＋プロモーターによるＲＸＲ仲介活性化は、ＲＸＲ発現プラスミツドの同時 トランスフェクションにより弱められた（レーン３と４）。篤いたことにＣ０Ｕ Ｐ−ＴＦまたはＥＡＲ−２をコードする発現プラスミツドを同時トランスフェク ション測定法に含めると、ＣＲＢＰＩＩプロモーターによるＲＸＲ仲介トランス 活性化が完全になくなった（レーン５−８）。すなわちＣ０ＵＰ−ＴＦとＥＡＲ −２のいずれも、インタクトのＣＲＢＰ［ｌプロモーターを介するＲＸＲ仲介ト ランス活性化の強力な抑制物質として機能することができる。

この抑制はＣＲＢＰ［［成分に仲介されることを証明するために、ＣＲＢＰ［［ −Δ５Ｖ−ＣＡＴレポーターを用いてＣＶ−１細胞中で平行実験を行った。０． ５ａｇＲ３−ＬＵＣ［対照として：図では（Ｃ）と記載しである］、または０． ２μｇと０５μｇのＲ３−Ｃ０ＵＰ−ＴＦまたはＲ３−ＥＡＲ−２の存在下で、 ＣＶ−１細胞を２重測定でレポーターＣＲＢＰＩ［−Δ５Ｖ−ＣＡＴとＲ３−ｈ ＲＸＲα（１８ｇ）と同時トランスフェクションした。細胞をエタノール（−） または１０８ＭのＲＡ　（＋）で処理し、次に細胞抽出物のＣＡＴ活性を測定し た。

ＣＡＴ活性は図２Ｂに最大変換率で示してあり、ここではＲＳ−ｈＲＸＲαのみ の存在下てＣＲＢＰＩＩ−Δ５Ｖ−ＣＡＴから得られたＲＡ誘導活性を任意に１ ００９６とした。

Ｃ０ＵＰ−ＴＦとＥＡＲ−２の両方がＲＸＲ仲介活性化のインヒビターとして機 能させて、同様の結果か得られた（図２Ｂ）。図２０に示すように、Ｃ０ＵＰ− ＴＦまたはＥＡＲ−２のいずれかが存在すると、βＲＡＲＥによるＲＡＲ仲介ト ランス活性化の全体的レベルは有意に低下したが、ＲＡの非存在下ではＣＡＴ活 性のわずかな（２倍から３倍）上昇か再現性よく見られた。ＣＶ−１細胞を２重 測定でレポーターβＲＡＲＥ−Δ３Ｖ−ＣＡＴ　（ウメソノ（Ｕｍｅｓｏｎｏ） ら、前述）とＲ３−ＲＡＲα（１８ｇ）、および０．５μｇのＲＳ−ＬＵＣ［対 照として：図では（Ｃ）と記載しである］、Ｒ３−Ｃ０ＵＰ−ＴＦまたはＲ３− ＥＡＲ−２と同時トランスフェクションした。細胞をエタノール（−）または１ ０８ＭのＲＡ　（＋）で処理し、次に細胞抽出物のＣＡＴ活性を測定した。ＣＡ Ｔ活性は図２Ｃ１ｍｆｉ大変換率で示してあり、ここてはＲ３−ｈＲＡＲａのみ の存在下でβＲＡＲＥ−Δ５Ｖ−ＣＡＴから得られたＲＡ誘導性活性を任意に１ ００％とした。

これらの結果は、レポーター活性のＣ０ＵＰ−ＴＦ／ＥＡＲ−２仲介抑制はＲＸ Ｒとその応答成分に特異的であることを示している。

実施例３ 細菌で発現したＲＸＲとインビトロで合成した３５Ｓメチオニン標識ＲＡＲを用 いて免疫沈降実験を行った。ＲＡＲ，ＬＢＤ、またはＧＲＲＮＡを調製し、次に 販売会社（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））の指示に従い、ウサギの赤血球溶解物 中で翻訳した。マンゲルスドルフ（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ）ら（前述）の記載 する方法に従いｐＧＥＸ−２μ発現ベクター（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ））を用いて、ＲＸＲをグルタチオン−Ｓ−＋−ランスフェラーゼの融合蛋白 として細菌中で発現させた。免疫沈降反応物（２０μｌ）は、２０ｍＭのトリス 、ｐＨ８，０中に５μＩの［３５Ｓ　］メチオニン標識リセブター蛋白と１５０ ｎＨの精製したＧＳＴ−ＲＸＲまたはＧＳＴのみを含有していた。５μｍのポリ クローナルＲＸＲ抗血清の添加の前に、蛋白を氷の上で２０分間インキュベート した。

蛋白Ａ−セファロース（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ　１ａ））を添加して抗 原抗体複合体を集め、４００μｌのＲＩＰＡ緩衝液［１０ｍＭのトリス（ｐＨ８ ゜０）、１５０ｍＭのＮａＣＬ　１％のトリトンＸ−１００，１％のデオキシコ ール酸ナトリウム］て免疫複合体を３回洗浄した。免疫沈降した複合体を１０％ のゲルのポリアクリルアミドゲル電気泳動で分解し、次にこれを３０％メタノー ル、１０９６酢酸で固定し、乾燥し、オートラジオグラフィーを行った。ゲル遅 延（ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）測定系（２０μｌ）は、１０ｍＭのトリス（ｐＨ ８゜０）、４０ｍＭのＫＣＩ、０．　１％のＮＰ−４０，６％のグリセロール、 ０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＤＴＴ、０．２μｇのポリ（ｄｉ−ｄＣ） およびインビトロで合成した２、５μｌのＲＡＲとＲＸＲ蛋白を含有していた。

ＲＡＲまたはＲＸＲを省略した時は、反応物には等量のプログラムしていない赤 血球溶解物を補足した。氷上で１０分間インキュベートした後、１ｎＧの３２Ｐ 標識オリゴヌクレオチドを加え、さらに１０分間インキュベートを続けた。ＤＮ Ａ蛋白複合体を、０．５ＸＴＢＥ　（ＩＸＴＢＥ＝９０ｍＭのトリス、９０ｍＭ のホウ酸、２ｍＭのＥＤＴＡ）中の４％のポリアクリルアミドゲル上で分解した 。ゲルを乾燥し、−７０°Ｃでオートラジオグラフィーを行った。Ｒ３−ｈＲＡ Ｒα、Ｒ３−ｈＲＸＲα、または両方の発現プラスミツドでトランスフェクショ ンしたＣｏｓ細胞から調製した全細胞抽出物を用いて、ウメソノ（Ｕｍｅｓｏｎ ｏ）らの方法（前述）により、Ｃｏｓ細胞で発現したりセブターを用いるゲル移 動度シフト測定法を行った。

図３Ａに示すようにＲＸＲとＲＡＲのブレインキュベートの後、抗ＲＸＲ抗血清 で沈降させると、放射能標識ＲＡＲの効率的な同時トランスフェクションが起き た（図３Ａ、レーン２）。これに対して反応物からＲＸＲを省略した時はＲＡＲ は検出されなかった（図３Ａ、レーンｌ）。

ＲＡＲを放射能標識ＧＲで置換した同様の実験ではＲＸＲ−ＧＲ相互作用は現れ ず、これらの条件下でのＲＡＲ−ＲＸＲ相互作用の特異性を示していた（図３Ａ 、レーン５と６）。ＲＡＲ−ＲＸＲ相互作用の仲介におけるＲＡＲのカルボキシ 末端の重要性を示すトランスフェクションデータに一致して、ＲＡＲのＣ−末端 のみからなる、端を切りとったＲＡＲ蛋白も、効率的にＲＸＲと同時トランスフ ェクションした（図３Ａ、レーン３と４）。すなわちＲＡＲとＲＸＲは溶液中で 極めて安定なヘテロダイマーを形成する。リガンド結合およびダイマー化ドメイ ンを含有するＲＡＲのカルボキシ末端はこの相互作用に充分である。

溶液中のＲＡＲ−ＲＸＲヘテロダイマーの安定性は、これらの２つの蛋白は相互 作用し、ＤＮＡに会合した時折たな性質を示すかも知れないことを示唆している 。この可能性を試験するために、インビトロで合成したＲＡＲとＲＸＲ，そして ＣＲＢＰＩＩ−ＲＸＲＥをコードする放射能標識オリゴヌクレオチド（すなわち 配列番号２８）を用いて、まずゲル移動度シフト実験を行った。図３Ｂに示すよ うに、インビトロで合成したＲＡＲは非常に弱い親和力でＣＲＢＰＩＩ−ＲＸＲ Ｅに結合した（レーン３）。しかしインビトロで合成したＲＸＲを添加すること により、ＣＲＢＰＩＩ−ＲＸＲＥに結合するＲＡＲの親和性は劇的に上昇した（ 図３８ル−ン４）。インビトロで合成したＲＸＲのみでは結合活性は検出できな かった（図３Ｂ、レーン２）。ＲＡＲまたはＲＸＲに対して調製したポリクロー ナル抗血清を反応混合物に加えると、蛋白−ＤＮＡ複合体が破壊され、移動度が 低下した新規の複合体が出現しく図３Ｂ、レーン５と６）、これは複合体中にＲ ＡＲとＲＸＲの両方が存在していることを示している。すなわちＲＡＲ−ＲＸＲ ヘテロダイマーは、強い親和力でＣＲＢＰＩ［−ＲＸＲＥと相互作用することが できる。

上記の相互作用解析の結果は、使用した条件下でＲＡＲ−ＲＸＲヘテロダイマー は転写的にはＣＲＢＰ［［−ＲＸＲＥに対して不活性であることを示している。

次に非標識オリゴヌクレオチドを競合物質として用いてＲＡＲ−ＲＸＲのＤＮＡ との相互作用の特異性を調べた。ＣＲＢＰＩＩ−ＲＸＲＥを含有するオリゴヌク レオチド（配列番号２８）は、１０倍モル過剰でＲＡＲ−ＲＸＲへテロダイマー 結合に対して効率的に競合しく図３Ｃ，レーン２）、関連のない糖質コルチコイ ド応答成分（ＧＲＥ：シュール（Ｓｃｈｕｌｅ）ら、Ｃｅ１ｌ　６２：１２１７ −１２２６　（１９９０）’）を含有するオリゴヌクレオチドは、放射能標識Ｃ ＲＢｐＨ−ＲＸＲＥに対して４０倍モル過剰で使用した時、競合しなかった（図 ３０、レーン７）。興味深いことにＲＡＲβプロモーターのＲＡＲＥを含有する オリゴヌクレオチド（βＲＡＲＥ　、配列番号２６）もまた、ＣＲＢＰ［［に対 するＲＡＲ−ＲＸＲの結合に対して効率的に競合した（図３Ｃ，レーン４と５） 。

ＲＡＲ−ＲＸＲヘテロダイマーとβＲＡＲＥ　（すなわち配列番号２６）とのこ の相互作用をさらに調べるために、βＲＡＲＥを含有するオリゴヌクレオチドを 標識し、ゲル移動度シフト測定法でプローブとして用いた。ＣＲＢＰＩＩ−ＲＸ ＲＥの場合のように、βＲＡＲＥとの高親和性のＤＮＡ−蛋白相互作用には、イ ンビトロで合成したＲＡＲとＲＸＲが必要であった（図３Ｄ、レーン２−４）。

ＲＡＲのみ、ＲＸＲのみ、またはＲＡＲとＲＸＲの両方でトランスフェクション してあったＣｏｓ細胞から調製した全細胞抽出物を用いて、βＲＡＲＥ上の高親 和性のＤＮＡ−蛋白複合体の形成にはＲＡＲ，！−ＲＸＲの両方が必要であると いう同様の結果が得られた（図３Ｅ）。まとめるとこれらの結果は、ＲＸＲは強 いレチノイン酸応答成分への結合親和性を劇的に上昇させ、ＲＡＲ−ＲＸＲ複合 体はインビボで存在する可能性があることを示している。

同様に免疫沈降実験では、インビトロで合成した甲状腺リセブターーベータ（Ｔ Ｒβ）およびビタミンＤリセブター（ＶＤＲ）は、細菌で発現したＲＸＲと同時 沈降することが見いだされた（図４Ａ、レーン１−６）。これらのリセブターの ＲＸＲとの相互作用は、ＤＮＡ結合のレベルでも存在していた：インビトロで合 成したＲＸＲは、ＭＬＶ−ＬＴＲ（ウメソノ（Ｕｍｅｓｏｎｏ）ら、前述）やオ ステオボンチンＶＤＲＥ　（ウメソノ（Ｕｍｅｓｏｎｏ）ら、前述）へのＴＲβ やＶＤＨの結合を劇的に上昇させることか見いだされた（図４Ｂ、レーン１−８ ）。

これらのデータはまとめると、ＲＡＲ，ＴＲおよびＶＤＲを介して与えられるホ ルモン応答の調節における、リセブターのステロイド／甲状腺スーパーファミリ ーのメンバー（例えばＲＸＲ）の中心的な役割を強く示唆している。

本発明を好適な実施態様に関連して詳細に記載したが、これらの修飾や変更は本 発明に記載され請求の範囲で請求されている精神と範囲に包含されることを理解 すべきである。

配列リスト （１）一般的情報 １）出願人：エバンス、ロナルド（Ｅｖａｎｓ、Ｒｏｎａｌｄ　Ｍ、）クリ−バ ー、スチーブン（Ｋｌ　ｉｅｗｅｒ、５ｔｅｖｅｎ　Ａ、）ウメソノ、カズヒ： ｌ　（Ｕｍｅｓｏｎｏ　Ｋａｚｕｈｉｋｏ）２）発明の名称：リセブターのステ ロイド／甲状腺スーパーファミリーの多量体型 ３）配列の数：２８ ４）住所： ａ）受信人：ブレティー、シュレーダー、ブルーゲマン　アンド　クラーク（Ｐ ｒｅｔｔｙ、ＳｃｈｒｏｅｄｅｒｌＢｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ　＆　Ｃ１ａｒｋ） ｂ）通り＝４４４　サウスフラワーストリート、スィート２０００　（Ｓｏｕｔ ｈ　Ｆｌｏｗｅｒ　５ｔｒｅｅｔ、５ｕｉｔｅ　２０００）Ｃ）市：ロサンゼル ス ｄ）州：カリホルニア ｅ）国：アメリカ合衆国 ｆ）郵便番号：９００７１ ５）コンピューターで読める型： ａ）媒体：フロッピーディスク ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブルＣ）オペレーティングシステム： ＰＣ−ＤＯ８／ＭＳ−ＤｏＳｄ）ソフトウェア：Ｐａｔｅｎｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓ ｅ＃１．０、バージョン＃１．２５６）出願データ： ａ）出願番号：米国０７／８０３，１６３ｂ）出願日：１９９１年１２月６日 Ｃ）分類： ８）弁護士／弁理士情報： ａ）名称ニレイタ−、ステフェン（Ｒｅｉｔｅｒ、５ｔｅｐｈｅｎ　Ｅ、）ｂ） 登録番号：３１．１９２ Ｃ）参考／書類番号：Ｐ３１　９１３６９）！信情報： ａ）を話：　（６１９）５３５−９００１ｂ）ファックス：　（６１９）５３５ −８９４９（２）配列番号ｌの情報： ｌ）配列の特徴： ａ）長さニア１アミノ酸 ｂ）型・アミノ酸 ｃ）Ｍ：未知 ｄ）形Ｌ！！：未知 ２）分子の型：ペプチド ＩＩ）配列：配列番号ｌ： Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＧＬｙ　１（ｅｅ６５７゜ （２）配列番号２の情報： ｌ）配列の特徴・ ａ）長さ＝１５塩基対 ｂ）型：核酸 Ｃ）鎖、１本鎖 ｄ）形態：線状 ＋＋）配列、配列番号２： ＡＧＧＴＣＭＧＧＡ　ＧＧＴＣＡ （２）配列番号３の情報： ｌ）配列の特徴： ａ）長さ＝１５塩基対 ｂ）型：核酸 Ｃ）鎖：１本鎖 ｄ）形態二線状 １１）配列：配列番号３： ＧＧＧＴＧＭＴＧＡ　ＧＧＡＣＡ （２）配列番号４の情報： ｌ）配列の特徴： ａ）長さ：１５塩基対 ｂ）型：核酸 Ｃ）鎖、１本鎖 ｄ）形態・線状 １１）配列・配列番号４： ＧＧＧＴＧＡＡＣＧＧ　ＧＧＧＣＡ （２）配列番号５の情報： ｌ）配列の特徴： ａ）長さ、１５塩基対 ｂ）型：核酸 Ｃ）鎖：１本鎖 ｄ）形態二線状 １１）配列：配列番号５： ＧＧＴＴＣＡＣＧＡＧ　ＧＴＴＣＡ （２）配列番号６の情報： ｌ）配列の特徴： ａ）長さ＝１６塩基対 ｂ）型：核酸 １１）配列：配列番号１３： ＧＧＴｒＣＡＣＣＧＡ　ＡＡＧＴｒＣＡ（２）配列番号Ｉ４の情報。

ｌ）配列の特＠： ａ）長さ＝１７塩基対 ｂ）梨：核酸 Ｃ）鎖：ｌ＊鎖 ｄ）形態：線状 １１）配列：配列番号１４： ＧＧＴｒＣＡＣＣＧＡ　ＭＧ’１ＴＣＡ（２）配列番号１５の情報： ｌ）配列の特徴： ａ）長さ：１７塩基対 ｂ）型：核酸 Ｃ）鎖＝１本鎖 ｄ）形態：線状 １１）配列：配列番号１５： ＡＧＧＴＣＡＣＴＧＡ　ＣＡＧＧＧＣＡ（２）配列番号１６の情報： １）配列の特徴： ａ）長さ：１７塩基対 ｂ）型−核酸 Ｃ）鎖＝１本鎖 ｄ）形態二線状 ＩＩ）配列：配列番号１６： ＧＧＧＴＣＡＴＴＣＡ　ＧＡＧＩＴＣＡ（２）配列番号Ｉ７の情報＝ １）配列の特徴： ａ）長さ：３４塩基対 ｂ）型：核酸 ｃ）Ｍ：１本鎖 ｄ）形態二線状 １１）配列：配列番号１７゜ ＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧ　ＧＴｒＣＡＣＣＧＡＡ　ＡＧＴｒＣＡＣＴＣＡ　ＧＣＴ ｒ（２）配列番号１８の情報： ｌ）配列の特徴： ａ）長さ：３８塩基対 ｂ）型：核酸 Ｃ）鎖：１本鎖 ｄ）形態、線状 ＩＩ）配列：配列番号１８＋ ＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧ　ＧＴＴＣＡＣＣＧＭ　ＡＧＴＴＣＡＣＴＣＧ　ＣＡＴＡ ＧＣＴＴ（２）配列番号Ｉ９の情報。

ｌ）配列の特徴： ａ）長さ＝４３塩基対 ｂ）型：核酸 Ｃ）鎖＝１本鎖 ｄ）形態二線状 １１）配列：配列番号１９： ＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧ　ＧＴＴＣＡＣＣＧＡＡ　ＡＧＴＴＣＡＣＴＣＧ　ＣＡＴ ＡＴＡＴ’ｒＡＧ　ＣＴｒ（２）配列番号２０のＩＷ報： ｌ）配列の特＠： ａ）長さ：２５塩基対 ｂ）型：核酸 Ｃ）鎖：１本鎖 ｄ）形態二線状 １１）配列：配列番号２０゜ ＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴ　ＣＡＡＧＧＴＣＡＧＡ　ＧＡＧＣＴａ）長さ＝４０塩基 対 ｂ）型：核酸 Ｃ）鎖＝１本鎖 ｄ）形態：線状 ＩＩ）配列：配列番号２８： ＡＧＣＴＧＴＣＡＣＡ　ＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴ　ＣＡＣＡＧＧＴＣＡＣＡＧＴＴ ＣＡＡＧＣＴＲＸＲα レーン　１２３４　５６　７８９ ＦＩＧ、　３Ａ レーン　１２３４５６７ ＦＩＧ、　３Ｂ ｍ− レーン　１２３４５６７ ＦＩＧ、　３Ｇ ＲＡＲ−−＋　＋　＋　＋　＋ ＲＸＲ−＋　−＋　＋　＋　＋ レーン　１２３４５６７ ＦＩＧ、　３Ｄ ＲＸＲ−−＋十＋十十十＋ ６ａｍ レーン　１　２３４５６７８９ ＦＩＧ、　３Ｅ ＦＩＧ、　４Ｂ 、　Ｎｓ　ＰＣＴ／ｕｓ　９２／１０５０Ｂフロントページの続き （５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｒ１：０１） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ ＣＩ２Ｒ１：９１） （７２）発明者　クリーワー、スチーブン、エイ。

アメリカ合衆国９２１２２　カリフォルニア州サン　ディエゴ、ナンバー　５８ ．ポーテデ　パルマス　４２５０ Ｉ （７２）発明者　ウメソノ、カズヒコ アメリカ合衆国９２０３７　カリフォルニア州う　ジョラ、スウィート　シー、 プロスペクト　ストリート　１２９５

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. （１）リセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーの少なくとも２つの 異なるメンバーよりなるリセブターの組合せであって、リセプターは多量体の形 で会合しており、この組合せには、メンバーの１つはＲＡＲα、ＲＡＲβまたは ＲＡＲγより選択され、他のメンバーはＴＲαまたはＴＲβより選択される２つ からなる組合せは含まれない、上記組合せ。
2. （２）組合せはヘテロダイマーの型である、請求項１に記載のリセブターの組合 せ。
3. （３）組合せはヘテロトリマーの型である、請求項１に記載のリセプターの組合 せ。
4. （４）組合せはヘテロテトラマーの型である、請求項１に記載のリセプターの組 合せ。
5. （５）メンバーの１つは、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、またはＲＸＲγより選択される 、請求項１に記載のリセプターの組合せ。
6. （６）メンバーの別の１つは、ＣＯＵＰ−ＴＦ、ＰＰＡＲまたはＥＡＲ−２より 選択される、請求項５に記載のリセプターの組合せ。
7. （７）メンバーの別の１つはＶＤＲである、請求項５に記載のリセプターの組合 せ。
8. （８）メンバーの別の１つはＴＲαまたはＴＲβである、請求項５に記載のリセ プターの組合せ。
9. （９）メンバーの１つはＲＡＲα、ＲＡＲβ、またはＲＡＲγである、請求項５ に記載のリセプターの組合せ。
10. （１０）メンバーの１つはＲＸＲαであり、メンバーの他の１つはＲＸＲβまた はＲＸＲγである、請求項１に記載のリセプターの組合せ。
11. （１１）メンバーの１つはＲＡＲαであり、メンバーの他の１つはＲＡＲβまた はＲＡＲγである、請求項１に記載のリセプターの組合せ。
12. （１２）リセブターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーの少なくとも２つ の異なるメンバーの少なくともダイマー化ドメインよりなる多量体。
13. （１３）ある発現系において、該遺伝子の発現はホルモン応答成分の調節下で維 持される、リセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーの第１のメンバ ーによる遺伝子の転写活性化を調節する方法であって、第１のメンバーと多量体 複合体を形成するのに有効な量で、リセプターのステロイド／甲状腺スーパーフ ァミリーの第２のメンバーの少なくともダイマー化ドメインの発現を誘導する化 合物および／または条件に該系を暴露させることよりなる上記方法。
14. （１４）ホルモン応答成分は配列： ５′−ＮＮＮＮＮＮ−（ＮＸ−ＮＮＮＮＮＮ）Ｙ−３′（式中、各Ｎは独立にＡ 、Ｔ、Ｃ、またはＧより選択されるが、ただしヌクレオチドの各−ＮＮＮＮＮＮ −基の少なくとも３つのヌクレオチドは、配列−ＡＧＧＴＣＡ−の同等の部分の ヌクレオチドと同じであり、Ｘはゼロまたは１から１５までの整数であり、Ｙは 少なくとも１の整数でる） を有する、請求項１３に記載の方法。
15. （１５）第１のメンバーはＲＸＲであり、第２のメンバーはＣＯＵＰ−ＴＦ、Ｐ ＰＡＲ、ＥＡＲ−２、ＶＤＲ、ＴＲ、またはＲＡＲより選択される、請求項１３ に記載の方法。
16. （１６）遺伝子は少なくとも肝臓または小腸内で発現される、請求項１５に記載 の方法。
17. （１７）遺伝子は脂質代謝に関与する生成物をコードする、請求項１６に記載の 方法。
18. （１８）遺伝子はコレステロールのホメオスタシスに関与する生成物をコードす る、請求項１６に記載の方法。
19. （１９）第１のメンバーはＲＡＲであり、第２のメンバーはＲＸＲである、請求 項１３に記載の方法。
20. （２０）第１のメンバーはＴＲであり、第２のメンバーはＲＸＲである、請求項 １３に記載の方法。
21. （２１）第１のメンバーはＶＤＲであり、第２のメンバーはＲＸＲである、請求 項１３に記載の方法。