JP3006716B2 - レチノイン酸レセプターの構成および方法 - Google Patents

レチノイン酸レセプターの構成および方法

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Description

【発明の詳細な説明】 謝辞 本発明は国立衛生研究所の研究助成金のもとで政府の
援助によってなされたものである（助成金番号GM2644
4）。
発明の分野 本発明は、一般的には、リガンド反応性調節タンパク
質およびそれらをコードする遺伝子に関するものであ
る。より詳細には、本発明はレチノイド関連調節タンパ
ク質およびそれらをコードする遺伝子、組み換えDNAな
どの遺伝子工学技術によって上記およびその他の調節タ
ンパク質および遺伝子を修飾したもの、および修飾され
ていないものと修飾されたものの双方を含むレチノイド
関連調節タンパク質および遺伝子の使用に関するもので
ある。
さらに、本発明は、リガンド反応性タンパク質に対す
る機能的リガンドを同定するための新しい方法に関する
ものである。本方法は、新しく発見された受容体タンパ
ク質に対する機能的リガンドを同定する場合に特に有用
である。ビタミンＡ関連モルフォゲン、レチノイン酸
が、新しく発見されたレチノイン酸受容体タンパク質に
対する機能的リガンドであることを示すことによって本
方法は一部例示される。
発明の背景 真核生物における中心的な問題は、ホルモンや成長因
子などの外来性誘導因子に反応して特異的な遺伝子制御
を媒介する分子および機構の説明を行うことであり続け
ている。各機構の特異性に関してはまた学ばねばならな
いことが多く残されてはいるものの、ホルモンなどの外
来性因子は細胞内受容体およびホルモン反応性エレメン
トすなわちHREとして知られる個々のDNAを含む細胞内要
素と協調して働くことによって遺伝子の転写を調節する
ことが知られている。
さらに具体的には、グルココルチコイドおよびチロイ
ドホルモンのようなホルモンは促進された拡散によって
細胞に入ることが知られている。ホルモンが次に特異的
な受容体タンパク質に結合し、それによってホルモン／
受容体複合体を作ることも知られている。ホルモンの受
容体への結合により、受容体タンパク質のアロステリッ
ク変化が開始されると考えられている。この変化の結果
として、ホルモン／受容体複合体がクロマチンのDNA上
の特異的部位に高親和性で結合できると考えられてい
る。
ホルモン反応性エレメントすなわちHREを含むこのよ
うな部位は、本分野では様々な名前で呼ばれているが、
近くの標的遺伝子のプロモーターの発現（RNAの転写）
を調節している。
ホルモンなどの外来性誘導因子による遺伝子制御の特
異性をさらに理解するための主要な障害は、タンパク質
の適切な解析を行うために十分な量および純度の受容体
タンパク質が入手できないことであった。この欠乏のた
めに、多様な体液や組織中の外来性誘導因子（例えばホ
ルモン）の存在を決定するための診断用アッセイにおけ
る受容体の使用、およびキメラ受容体タンパク質アナロ
グを操作するための“プロトタイプ”としての受容体の
使用が妨げられて来た。
受容体タンパク質が入手困難であることを克服する努
力がなされ、本出願の譲受人であるソーク生物学研究所
（the Salk Institute for Biological Studies）が受
託された、共に審査中の出願U.S.S.N.108,471号によ
り、グルココルチコイド−、チロイド−、ミネラロコル
チコイド−、および新しいステロイド関連受容体を含む
多様な受容体タンパク質のクローン化された遺伝子が開
示されている。U.S.S.N108,471号はさらに、これらの分
子の詳細な生化学的解析を行い、別々のDNA結合領域お
よびリガンド結合領域を受容体タンパク質が含むことを
示した。（U.S.S.N108,471号の一部は出版されている；
グルココルチコイド受容体のクローニングとこの分子の
各領域に分ける解析に関する部分については、ホレンバ
ーグ（Hollenberg）他、（1985）、およびギゲレ（Gigu
ere）他、（1986）；受容体に関するその他の研究に関
しては、ホレンバーグ（Hollenberg）他、（1987）、グ
リーン（Green）他、（1986）、グリーンとシャンボン
（Chambon）、（1987）、クマー（Kumar）他、（198
7）、ミースフェルド（Miesfeld）他、（1987）、およ
びエバンス（1988）を参照のこと）。
受容体の生化学的解析に関してはさらに、ヒトグルコ
コルチコイド受容体遺伝子の配列解析により、トリ赤芽
球症ウイルス（AEV）のガン遺伝子であるｖ−erb−Ａの
産物と相同性があることが示された（ワインバーガー
（Weinberger）他、（1985）参照）。このグループおよ
び別のグループは続いて、ｖ−erb−Ａの細胞内相同体
がβチロイドホルモン受容体であることを示した（ワイ
ンバーガー（Weinberger）他、（1986）、およびサップ
（Sap）他、（1986）参照）。
ステロイドホルモン受容体とチロイドホルモン受容体
のDNA結合領域が非常によく保存されていることから、
関連しているリガンド誘導性転写制御因子に関してこの
領域が特徴的なのだろうかという疑問が出された。ま
た、これらの領域をコードするDNA配列を、関連してい
るが新しいリガンド反応性受容体に関してゲノムを検索
するハイブリダイゼーション用プローブとして使用可能
だろうかという問題も出された。この手法により、ソー
ク研究所の我々のグループは、幾つかの新しい遺伝子産
物を同定した。U.S.S.N108,471号に示されているよう
に、一つはヒトアルドステロン受容体（hMR,ATCC第6720
1号）（U.S.S.N.108,471号のこの部分の出版物として
は、アリザ（Arriza）他、（1987）参照）；二番目は、
ラット中枢神経系で高レベルで発現されている新しいチ
ロイドホルモン受容体である（rTRα,ATCC等67281号）
（U.S.S.N.108,471号のこの部分の出版物としては、ト
ンプソン（Thompson）他、（1987）参照）。
本開示は、ステロイドおよびチロイドホルモン受容体
のDNA結合領域およびリガンド結合領域と相同性のある
新しいレチノイド受容体タンパク質をコードする、クロ
ーニングされた全長のcDNAの分離と解析を示している。
さらに、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、
チロイド、エストロゲン関連、およびレチノイン酸受容
体の間の機能領域を交換（“swapping"）することによ
って作成されたキメラ受容体の構築と解析についても述
べている。これらのキメラ受容体は、キメラ中に取り込
まれた“親の"DNA結合領域およびリガンド結合領域の
“起源”に基づいたハイブリッド機能特性を有する。例
えば、キメラ受容体のDNA結合領域がレチノイン酸受容
体のDNA結合領域であれば（すなわち野生型レチノイン
酸受容体から得られたものであるか、レチノイン酸DNA
結合領域の機能的要素を含む変異体である場合）、キメ
ラはレチノイン酸受容体のDNA結合特性を有することに
なる。リガンド結合領域に関しても同様である。キメラ
受容体中のリガンド結合領域がチロイドホルモンに結合
する場合には、キメラはチロイドホルモン受容体の持つ
リガンド結合特性を有することになる。
本開示はまた、リガンド反応性受容体タンパク質に対
する機能的リガンドを同定するための新しい方法を示す
ものである。本方法は、（１）レチノイド、レチノイン
酸およびその代謝前駆体、レチノールが新しく発見され
た受容体タンパク質に対する機能的リガンドであるこ
と、（２）DNA結合領域およびリガンド結合領域がキメ
ラ受容体の機能特性を決定すること、を示すことにより
例示される。
図面の簡単な説明 以下に図面の簡単な説明を示す。より詳細な説明は、
“図面の詳細な説明”と題した部分で述べる。
第１図（ＡおよびＢ）はphRARαのDNAヌクレオチド配
列および一次タンパク質配列を示す図である。第1A図は
phRARαの成分構造を制限酵素切断部位と並べて示した
線状図である。第1B−１図、第1B−２図、第1B−３図は
phRARαの全長のヌクレオチド配列およびその一次アミ
ノ酸配列を示している。
第２図（ＡおよびＢ）は図とブロットから成ってい
る。第2A図はキメラ受容体hRGRの構造の模式図である。
第2B図はレチノイン酸によるCAT活性の誘導を示すブロ
ックである。
第３図（ＡおよびＢ）は二つのグラフから構成されて
いる。第3A図はレチノイドに対する使用量依存性を示す
グラフである。第3B図はトランスフェクトされたCOS−
１細胞の細胞質抽出液に対するレチノイン酸結合を示す
棒グラフである。
第４図（ＡおよびＢ）はヒトゲノムDNAのサザンブロ
ック分析を示している。第4A図は厳しい条件下でハイブ
リダイズさせた、消化されたヒト胎盤DNAを示してい
る；第4B図は同じDNAを厳しくない条件下でハイブリダ
イズさせたものを示している。
第５図はラットおよびヒト組織中のレチノイン酸受容
体mRNAのノザンブロット分析を示している。
第６図は、hGR、hRR、およびhT3Rβの比較を示す模式
図である。
第７図は一般化したステロイド／チロイド／レチノイ
ン酸受容体遺伝子の模式図である。
第８図はステロイドホルモン受容体スーパーファミリ
ーに含まれるもののアミノ酸比較を示す模式図である。
第９図はキメラチロイド／グルココルチコイド受容体
の構造および活性を示す模式図である。
定義 本明細書および請求の範囲において、ここで用いるた
めに以下のように特に定義される技術用語が参照され
る。
ここで用いる場合、一般的な語“レチノイド”はレチ
ノイン酸、ビタミンＡ（レチノール）および、多様な系
で発生と分化に重要な影響を及ぼすことのできる一連の
天然および合成誘導体を含む化合物群を意味する。
ここで用いる場合、生物種は以下のように同定され
る:h,ヒト;r,ラット;m,マウス;c,ニワトリ；およびd,ド
ロソフィラ（ショウジョウバエ）。
ここで用いる場合、“ステロイドホルモン受容体スー
パーファミリー”とは、グルココルチコイド、ミネラロ
コルチコイド、プロゲステロン、エステロゲン、エステ
ロゲン関連、ビタミンD3、チロイド、Ｖ−erb−Ａ、レ
チノイン酸、およびE75（ショウジョウバエ）受容体か
らなる関連した受容体群を意味するものである。エバン
ス（1988）、およびそこで引用されている参考文献参
照。
ここで用いる場合、RRおよびRARはともにレチノイン
酸受容体を意味する。かしら文字、hRRおよびhRARは、
ヒトレチノイン酸受容体を意味する。phRARαと呼ばれ
るDNAはヒトレチノイン酸受容体αをコードする。hRAR
αはATCC第40392号として寄託されているphRAR1によっ
てコードされている。hRARβと呼ばれるDNAはヒトレチ
ノイン酸受容体βをコードする。ブランド（Brand）他
（1988）参照。ここで用いる場合、GRはグルココルチコ
イド受容体を意味する。hGRと呼ばれるDNAはヒトグルコ
コルチコイド受容体GRをコードする。hGRはATCC第67200
号として寄託されているpRShGRによってコードされてい
る。
ここで用いる場合、MRはミネラロコルチコイド受容体
を意味する。hMRと呼ばれるDNAはヒトミネラロコルチコ
イド受容体MRをコードする。hMRはATCC第67201号として
寄託されているpRShMRによってコードされている。
ここで用いる場合、TRはチロイド受容体を意味する。
TRαおよびTRβはチロイド受容体のα型およびβ型を意
味する。ｃ−erb−A,herb−A8.7、peA101、rbeA12、お
よびhFA8と呼ばれるDNAはすべてチロイド受容体をコー
ドするものである。プラスミドpherb−A8.7はhTRαをコ
ードする；これは特許目的のために寄託され、ATCC第40
374号として登録されている。プラスミドpeA101はhTRβ
をコードしている；これは特許目的のために寄託され、
ATCC第67244号として登録されている。プラスミドrbeA1
2はrTRαをコードする；これは特許目的のために寄託さ
れ、ATCC第67281号として登録されている。プラスミドp
hFA8はクローンの“リガンド結合”領域に欠失をもつ、
hTRαの部分的クローン（すなわち、受容体タンパク質
のカルボキシ末端をコードするDNA）をコードしてい
る。プラスミドphFA8はATCC第40372号として登録されて
いる。
ここで用いる場合、ERRはエストロゲン関連受容体を
意味する。hERR1およびhERR2の頭文字は、ヒトエストロ
ゲン関連受容体１および２であることを意味する。これ
らの受容体はチロイド受容体よりもステロイド受容体に
より近いが、既知のステロイドホルモンのどの主要なク
ラスにも結合しない（ギゲレ（Giguere）他、1988）。h
ERR1はプラスミドpE4およびpHKAにコードされており、
これはそれぞれATCC等67309号および第67310号として寄
託されている。（pE4もpHKAも完全なクローンではない;
hERR1は両方のクローン由来の断片を結合して構築され
た）。hERR2はプラスミドphH3にコードされており、ATC
C第40373号として寄託されている。
ここで用いる場合、VDRはビタミンD3受容体を意味す
る。
ここで用いる場合、MTVは乳癌ウイルスを意味する;MM
TVはマウス乳癌ウイルスを意味する。
ここで用いる場合、RSVはラウス肉腫ウイルスを意味
する;SVはサルウイルスを意味する。
ここで用いる場合、CATはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼを意味する。
ここで用いる場合、ルシフェラーゼはホタルのルシフ
ェラーゼを意味する。I.R.デ・ウェット（de Wet）、K.
V.ウッド（Wood）、M.デルカ（DeLuca）、D.R.ヘリンス
キ（Helinski）、およびS.スブラマニ（Subramani）、M
ol.Cell.Biol.7:725−737（1987）参照。
ここで用いる場合、COSはＴ抗原（Tag）を発現してい
るサル腎臓細胞を意味する。グルツマン（Gluzman）、C
ell,23:175（1981）参照）。COS細胞は受容体欠損細胞
であり、本発明の機能的リガンド同定アッセイに有用な
ものである。
ここで用いる場合、CV−１は“CV−1"と呼ばれる細胞
系由来のマウス腎臓細胞を意味する。CV−１はCOSの親
系である。SV40 T抗原（Tag）を発現するように形質転
換されているCOS細胞とは異なり、CV−１細胞はＴ抗原
を発現しない。CV−１細胞は、本発明の機能的リガンド
同定アッセイにも有用な受容体欠損細胞である。
ここで用いる場合、“ホルモン反応性要素”または
“HRE"、“転写調節ユニット”、“ホルモン反応性プロ
モーター／エンハンサー要素”、“エンハンサー様DNA
配列”、および“転写刺激を媒介するDNA配列”などの
一般的な技術用語は、すべて同一物を意味しており、す
なわち、転写のホルモン（またはリガンド）による活性
化にて必要なcisに働く配列（約20塩基対）である。こ
れらの要素をホルモン非反応性遺伝子に接続することに
より、その遺伝子がホルモン反応性となる。これらの配
列はホルモン反応性要素またはHREとして最もよく呼ば
れており、位置および向きに関係無く機能する。他のエ
ンハンサーとは異なり、HREの活性はリガンドの存在の
有無に依存する。（エバンス（1988）およびそこで引用
されている参考文献参照。）本明細書および請求の範囲
においては、“ホルモン反応性要素”という語を、これ
らの配列を記述するために本分野で用いられるすべての
語によって示唆される機能的特性を意味し、具体化する
ために一般的な意味で用いられる。
ここで用いる場合、合成HREとは、自動ヌクレオチド
合成機を用いてin vitroで合成されたHREを意味する。H
REはわずか約20bpなので、この方法で容易に合成するこ
とができる。操作された、あるいは合成の野生型HREが
ホルモン非反応性プロモーターに連結されると、これら
のプロモーターはホルモン反応性となる。エバンス（19
88）およびそこで引用されている文献参照。
ここで用いる場合、頭文字GREはグルココルチコイド
受容体反応性要素を、TREはチロイド受容体反応性要素
を意味する。GREはGRとの相互作用によるグルココルチ
コイド反応性を与えるホルモン反応性要素である。ペイ
バー（Payvar）他、Cell,35:381（1983）、およびシー
デライト（Schiedereit）他、Nature,304:749（1983）
参照。GREは、DNA結合領域がGREと機能的に結合できる
（すなわち、活性化できる）ものであるいかなる野生型
またはキメラ受容体とも使用可能である。例えば、GR、
MR、およびPR受容体は全てGREを活性化することがで
き、GR、MR、またはPR型のDNA結合領域を有するいかな
る野生型またはキメラ受容体ともGREを使用することが
できる。TREは、TRとの相互作用によるチロイドホルモ
ン反応性を与えることを除いては、GREと同様である。T
REは、DNA結合領域が機能的にTREと結合できる（すなわ
ち活性化できる）ようないかなる野生型またはキメラ受
容体とも使用可能である。TRおよびRR受容体はTREを活
性化することができ、したがって、TRまたはRR型のDNA
結合領域を有するいかなる受容体ともTREを使用可能で
ある。
ここで用いる場合、リガンドとはホルモンまたは成長
物質などの誘導因子を意味する。細胞内で、リガンドは
受容体タンパク質に結合し、それによってリガンド／受
容体複合体を形成し、それが適当なホルモン反応性要素
に結合することができる。単一のリガンドが複数の受容
体を持つこともある。T3RαおよびT3RβはいずれもT3な
どのチロイドホルモンと結合する。
ここで用いる場合、“リガンド反応性プロモーターお
よび有効なレポーター遺伝子に機能的に連結している有
効なホルモン反応性要素”という語句中の“有効な”と
いう語は、それぞれのDNA配列（“ホルモン反応性要
素”、“リガンド反応性プロモーター”および“レポー
ター遺伝子”という語で表される）が作用可能である、
すなわち、ホルモン反応性要素が受容体タンパク質（野
生型またはキメラ）のDNA結合領域と結合可能であるこ
と、リガンド反応性プロモーターがレポーター遺伝子の
転写調節を行えること（HRE/受容体タンパク質／リガン
ド複合体による適当な活性化による）、およびレポータ
ー遺伝子が宿主細胞で発現され得ることを意味する。
“機能的に連結する”という語句は、DNA断片が連結さ
れた場合に適当な活性化によってレポーター遺伝子（例
えばCATまたはルシフェラーゼ）が発現されることを意
味する。この発現は、“リガンド反応性プロモーター”
（ホルモン反応性要素の下流であり、適当なリガンド／
受容体タンパク質複合体にHREが結合すると“活性化”
され、その結果レポーター遺伝子の転写を“調節”す
る）が“オンの状態となる”、あるいは、ホルモン反応
性要素にリガンド／受容体タンパク質複合体が結合した
結果として活性化されたものである。
ここで用いる場合、受容体の“DNA結合領域”という
語句は、クロマチンDNA上のHRE部位に結合する受容体タ
ンパク質（グルココルチコイド受容体、チロイド受容
体、ミネラロコルチコイド受容体、エステロゲン関連受
容体、およびレチノイン酸受容体）のその部分を呼ぶも
のである。これらのDNA結合領域に対する結合は、ステ
ロイドホルモンスーパーファミリーに関して同定され、
解析された。第８図、およびギゲレ他（1986）；ホレン
バーグ（Hollenberg）他、（1987）；グリーンとシャン
ボン（1987）；およびミースフィールド（Miesaあiel
d）他（1987）、エバンス（1988）参照。
多様なステロイドホルモンスーパーファミリー受容体
に関するDNA結合領域に対する結合を第８図に示す；結
合は以下に示すものである： −hGR（pRShGR）： ヌクレオチド1393〜1590 アミノ酸421〜486 （ATCC＃67200参照） −hTRb （peA101）：ヌクレオチド604〜807 アミノ酸102〜169 （ATCC＃67244参照） −hTRa（pherb−A8.7）：ヌクレオチド168〜372 アミノ酸50〜117 （ATCC＃40374参照） アミノ酸291〜358 （ATCC＃67281参照） −ERR1（pE4 ＆ pHKA）：アミノ酸176〜241 （ATCC＃67309＆＃67310参照） −ERR2（phH3）: アミノ酸103〜168 （ATCC＃40373参照） −hMR （pRShMR）: ヌクレオチド2029〜2226 アミノ酸603〜668 （ATCC＃67201参照） −hRARa（phRAR1）：ヌクレオチド364〜561 アミノ酸88〜153 （ATCC＃40392参照） 受容体のステロイドホルモンスーパーファミリーのDN
A結合領域は66から68アミノ酸のアミノ断片からなる。
この断片は９個のシステイン残基を含み、そのうちの一
つが断片の最初のアミノ酸である。この最初のCys残基
からCys−X2−Cys−X13-15−Cys−X2−Cys（ここでＸは
いかなるアミノ酸残基でもよい）と記述されるモチーフ
が開始される。DNA結合領域は常にアミノ酸Gly−Metで
終わる。
クローニング法の簡便のために、DNA結合領域の前お
よび／または後の１〜６アミノ酸をDNA結合領域ととも
に転換することも可能である。
ここで用いる場合、受容体の“リガンド結合領域”と
いう語句は成長因子またはホルモンなどのリガンドに結
合する、受容体タンパク質の部分に関するものである。
ステロイド受容体スーパーファミリーに対するリガンド
結合領域のこれらの結合が同定され、解析された。第８
図およびエバンス（1988）参照。
多様な受容体のリガンド結合領域が第８図に示されて
いる；該領域の幾つかを以下に示す： −hGR（pRShGR）： アミノ酸528〜777 （ATCC＃67200参照） −hTRb （peA101）：アミノ酸232〜456 （ATCC＃67244参照） −hTRa（pherb−A8.7）：アミノ酸183〜410 （ATCC＃40374参照） −rTR（rbeA12）： アミノ酸421〜639 （ATCC＃67281参照） −ERR1（pE4 ＆ pHKA）：アミノ酸295〜521 （ATCC＃67309参照） −ERR2（phH3）: アミノ酸212〜433 （ATCC＃40373参照） −hMR （pRShMR）: アミノ酸734〜984 （ATCC＃67201参照） −hRARa（phRAR1）：アミノ酸198〜462 （ATCC＃40392参照） 受容体間の機能的領域の交換を可能にするために、受
容体cDNAクローンに共通の制限エンドヌクレアーゼ部位
を導入しなければならない。第８図に示した多様な受容
体のいずれにおいても、DAN結合領域の直前に第一の共
通部位を導入し、直後に第二の共通部位を導入すること
が可能である。（例えば、第８図に示した受容体のステ
ロイドホルモンスーパーファミリーのいずれにおいて
も、DNA結合領域の直前に単独のNot I部位を導入し、直
後に単独のXho I部位を導入することが出来る。これに
より受容体は３つの機能的領域または“カセット”に分
割される；（１）Ｎ末端カセット、（２）DNA結合領域
カセット、（３）リガンド結合領域カセット。どの受容
体由来の３つの領域またはカセットは別の受容体由来の
カセットと組み合わせて多様なキメラ受容体を作成する
ことができる。
ここで用いる場合、キメラ受容体を同定するために用
いた命名法は以下のようである：可変性機能領域（Ｎ末
端、DNA結合領域、およびリガンド結合領域）は、それ
らの元となった“親”受容体によって同定される。例え
ば、GR由来の領域は“G"領域である:TR領域は“T"領域
である（そうでなければさらに“Ta"または“Tb"領域と
して特定される）;MR領域は“M"領域である;RAR領域は
“R"領域である（もしくは、さらに“Ra"または“Rb"と
して特定される）；また、ERR領域は“E"領域である
（もしくは、さらに“E1"または“E2"領域として特定さ
れる）。この表記法によれば、特定しない限り、“T"は
一般的にT3RαまたはT3Rβ受容体のどちらかを意味す
る；“E"はhERR1またはhERR2のどちらかを意味する；ま
た、“R"はRARαまたはRARβ受容体のどちらかを意味す
る。野生型受容体はいかなる交換領域も含まないので、
この表記系にしたがうと、Ｇ−Ｇ−Ｇ（またはGGG）、T
a−Ta−Ta（またはTaTaTa）、Tb−Tb−Tb（またはTbTbT
b）、Ｍ−Ｍ−Ｍ（またはMMM）、Ra−Ra−Ra（またはRa
RaRa）、Rb−Rb−Rb（またはRbRbRb）、E1−E1−E1また
はE2−E2−E2として同定され、ここで最初に示される領
域はＮ末端領域、中央の領域はDNA結合領域、および最
後の領域はリガンド結合領域である。いかなるキメラ受
容体も少なくとも二つの野生型または親受容体由来の機
能領域を持つことになる。例えば、キメラ受容体GGRaは
グルココルチコイド受容体由来のＮ末端およびDNA結合
領域を持ち、グルココルチコイド受容体由来のDNA結合
領域、およびαレチノイン酸受容体由来のリガンド結合
領域を有する;GTaRbはグルココルチコイド受容体由来の
Ｎ末端、チロイド受容体α由来のDNA結合領域、およ
び、レチノイン酸受容体β由来のリガンド結合領域を有
する。
ここで用いる場合、hGRNX、hTRβNX、およびhRR
NXは、受容体のDNA結合領域の境界に隣接してNot IとXh
o Iの単一の切断部位を含むように操作したhGR、hTR
β、およびhRR受容体を意味する。これらの変異受容体
は、hGR,hMR,hERR1,hERR2,hTRα,hTRβ,rTRα,rRARα,r
RARβ由来のアミノ末端、DAN結合領域、およびリガンド
結合領域のすべての可能な組み合わせから成るハイブリ
ッド受容体の構築を例示するものである。
ここで用いる場合、サザンブロット分析は、変性させ
たDNAをアガロースゲルから、相補的な核酸とハイブリ
ダイズさせることができるニトロセルロースフィルター
に転移させる方法を意味する。
ここで用いる場合、ノザンブロット分析とは、RNAを
アガロースゲルから、相補的なDNAにハイブリダイズさ
せることができるニトロセルロースフィルターに転移さ
せる方法を意味する。
ここで用いる場合、本発明の“変異体"DNAとは、“野
生型”あるいは操作していない配列とは異なるように遺
伝学的に操作したDNAを意味する。このような遺伝子操
作には、野生型配列への新しいヌクレオチドの挿入、野
生型配列からのヌクレオチドの削除、野生型配列中のヌ
クレオチドの置換、または受容体間の機能的領域の“交
換（swapping）”が含まれる。機能的領域をある受容体
から別の受容体のものに交換することによって操作され
た受容体もキメラ受容体あるいはハイブリッド受応体と
呼ばれる。キメラ受容体はさらに、新しいヌクレオチ
ド、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの置換などを含
む。
本明細書および請求の範囲における“実質的な配列相
同性”という語の使用は、ここで開示され、請求される
実際の配列を比較してわずかな、重大でない配列の変化
しか起こっていないDNA、RNA、またはアミノ酸配列が、
添付された請求の範囲に含まれることを意図しているこ
とを示す。この語句の中で、“わずかな、重大でない”
配列変化とは、相同な配列がここで開示し、請求する核
酸およびアミノ酸構造と実質的に同様に機能して実質的
に同じ構造を産生することを意味する。
ここで用いる場合、“組み換え的に産生される”とい
う語句は、単に天然物から生成されたのではなく、遺伝
子組み換え技術を用いて作成されたことを意味する。
ここに現れる多様なアミノ酸配列を構成するアミノ酸
は、以下に示す３文字または１文字略号によって同定さ
れる。 アミノ酸 ３文字略号 １文字略号 Ｌ−アラニン Ala Ａ Ｌ−アラギニン Arg Ｒ Ｌ−アスパラギン Asn Ｎ Ｌ−アスパラギン酸 Asp Ｄ Ｌ−システイン Cys Ｃ Ｌ−グルタミン Gln Ｑ Ｌ−グルタミン酸 Glu Ｅ Ｌ−ヒスチジン His Ｈ Ｌ−イソロイシン Ile Ｉ Ｌ−ロイシン Leu Ｌ Ｌ−リジン Lys Ｋ Ｌ−メチオニン Met Ｍ Ｌ−フェニルアラニン Phe Ｆ Ｌ−プロリン Pro Ｐ Ｌ−セリン Ser Ｓ Ｌ−スレオニン Thr Ｔ Ｌ−トリプトファン Trp Ｗ Ｌ−チロシン Tyr Ｙ Ｌ−バリン Val Ｖ ここに現れる多様な核酸配列を構成するヌクレオチド
は、本分野で通常用いられている１文字略号（A,G,T,C,
またはＵ）を有する。
ここで用いる場合、bpとは塩基対を、kbはキロ塩基対
を意味する。
本明細書および請求の範囲において、ギリシャ文字ア
ルファ（α）、ベータ（β）などは、しばしばａ、ｂな
どと示される。
寄託 プラスミドpRShGR（hGR）,pRShMR（hMR）,peA101（hT
3β）およびGMCATは、すべて大腸菌HB101株に入ってお
り、また、rebA12（rTRα）,pE4およびphKA（ともにhER
R1をコードする）、phH3（hERR2）,pherb−A8.7（hTR
α）,phFA8（hTRαの部分的クローン）、およびプラス
ミドphRAR1は、米国メリーランド州ロックビルのアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に、
特許技術目的の微生物寄託の国際認識に関するブタペス
ト条約および本条約の下に公布されている条例に基づい
て寄託されている。諸条約および条例、もしくは米国お
よび本出願または本出願の優先権を請求する出願が提供
されるか、このような出願が認められるいかなる特許も
認められるそのほかの国や国際組織の特許法および条例
にしたがって、プラスミド試料は法的に受け取る資格が
ある産業所有権局などの者が入手することができる。
ATCC寄託番号および寄託年月日を以下に示す： pRShGR（hGR） 67200 1986.9.9 pRShMR（hMR） 67201 1986.9.9 pE4（hERR1＊） 67309 1987.1.30 phHKA（hERR1＊） 67310 1987.1.30 phH3（hERR2） 40373 1987.9.29 GMCAT（レポーター） 67282 1986.12.18 pherb−A8.7（hTRa） 40374 1987.9.27 phFA8（hTRa＊） 40372 1987.9.27 peA101（hTRb） 67244 1986.10.22 prbeA12（rTRa） 67281 1986.12.18 phRARa（hRARa） 40392 1987.11.20 （＊は部分的クローンを意味する） （pE4 ＆ phHKAはともに完全なhERR1をコードする） 発明の概要 本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質： （ａ）次のアミノ酸配列： からなるタンパク質； （ｂ） アミノ酸配列（ａ）において１個またはそれ以
上のアミノ酸 が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつレチノイン酸受容体タンパク質としての特徴を
示すリガンド結合特性および転写活性化特性を有するタ
ンパク質； をコードする核酸を提供する。好ましくは、本発明の核
酸は、次のアミノ酸配列： と実質的なアミノ酸相同性を有するタンパク質の一次配
列をコードする。
本発明はまた、次のDNA配列： と実質的な配列相同性を有する核酸を提供する。
本発明はまた、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク
質： （ａ）次のアミノ酸配列： からなるタンパク質； （ｂ） アミノ酸配列（ａ）において１個またはそれ以
上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
配列からなり、かつレチノイン酸受容体蛋白質としての
特徴を示すリガンド結合活性およびトランス活性化特性
を有するタンパク質、 を提供する。
一つの局面においては、本発明は、ここではヒトレチ
ノイン酸受容体タンパク質と呼ぶレチノイド受容体タン
パク質に特徴的なリガンド結合能およびDNA結合能（ま
たは転写活性化能）を有するタンパク質の一次配列をコ
ードするトリプレットの配列、断片のプラス鎖またはセ
ンス鎖が含んでいるような二本鎖DNAを含むものであ
る。本発明のこの局面によれば、二本鎖DNA断片は、レ
チノイン酸受容体タンパク質を発現できるものである。
別の局面においては、本発明は、レチノイン酸受容体
タンパク質をコードする二本鎖DNAのセンス鎖である一
本鎖DNA、およびこの二本鎖DNAの転写によって産生され
るRNAを含むものである。
別の局面においては、本発明は、本発明のレチノイン
酸受容体タンパク質（RARα）をコードするDANを含むプ
ラスミドphRAR1を含む。このプラスミドはアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに特許目的のために
寄託されている；これはATCC No.40392として登録され
ている。
さらに別の局面においては、本発明はレチノイン酸受
容体タンパク質をコードするDNAでトランスフォームし
た細胞、望ましくは哺乳動物細胞を含む。本発明の本局
面によれば、トランスフォームするDNAは細胞内で発現
されることが可能であり、それによってこのDANにコー
ドされているレチノイン酸受容体の細胞内の量を増加さ
せる。
本発明はさらに、レチノイン酸受容体をコードするDN
Aの発現によって産生またはこのようなレチノイン酸受
容体をコードするDNAから転写されたmRNAの翻訳によっ
て産生された新しいレチノイン酸受容体を含む。本発明
の本局面によれば、レチノイン酸受容体は、“修飾され
ていない”レチノイン酸受容体をコードするDNAおよびm
RNAのタンパク質産物であるか、受容体DNA配列中に導入
された変異の結果として、対応する天然の“野生型”レ
チノイン酸受容体タンパク質とひとつ以上のアミノ酸配
列中の違いを有するものである、修飾された、あるいは
遺伝子操作されたレチノイン酸受容体タンパク質産物で
ある。これらのレチノイン酸受容体は、“修飾されてい
ない”か“操作されている”かにかかわらず、対応する
天然レチノイン酸受容体の少なくとも約５％のレチノイ
ン酸結合活性および／または少なくとも約５％のDNA結
合または転写活性化活性を有することが望ましい。
本発明はさらに、別の型の機能的領域を持つひとつの
受容体の機能的領域を交換することによって作成された
キメラ受容体を含む。このように産生されたキメラDNA
はそれらのそれぞれDNA結合領域およびリガンド結合領
域の“元”に基づく機能的特性を有するキメラ受容体タ
ンパク質をコードする。本発明のキメラ受容体は、キメ
ラ受容体をコードする二本鎖DNA、および二本鎖DNAのセ
ンス鎖である一本鎖DNA、および二本鎖DNAの転写によっ
て産生されたmRNAを含む。本発明はまた、本発明のキメ
ラ受容体をコードするDNAで形質転換された細胞、真核
細胞および原核細胞を含む、を含むものである。
本発明のキメラ受容体の局面によれば、キメラDNA融
合を行うために、３つの機能的領域に受容体DNAを分け
るために、DNA結合領域の中または近傍の各受容体cDNA
の相同な位置に二つの制限エンドヌクレアーゼ部位を導
入する。（例えば、単一のNot I部位をDNA結合領域の直
前に導入し、単一のXho I部位をDNA結合領域の直後に導
入することができる。これにより受容体は３つの機能的
領域すなわち“カセット”に分けられる；（１）Ｎ末端
カセット、（２）DNA結合領域カセット、および（３）
リガンド結合領域カセットである。どの受容体由来の３
つの領域またはカセットでも別の受容体由来のカセット
と結合させて多様なキメラ受容体を作成することが可能
である。本発明のこの局面は、明細書の“発明の詳細な
説明”と題した部分で例示される。） 本明細書および請求の範囲においては、キメラ受容体
（キメラまたはハイブリッドとも呼ばれる）は、多様な
領域の由来を示す文字によって命名される。hGR由来の
領域は“G"領域と呼ばれ、hTR由来の領域は“T"領域と
呼ばれ、hERR由来の領域は“E"、hRR由来の領域は“R"
領域と呼ばれる。例えば、キメラ受容体“RGR"はhRRの
アミノ末端およびカルボキシル末端を持ち、hGRのDNA結
合領域を有する；キメラ受容体“TGG"はhTR由来のアミ
ノ末端、hGR由来のDNA結合領域およびカルボキシル末端
を有する。（第７図に示した図においては、受容体のア
ミノ末端は領域A/Bとして示され、カルボキシル末端は
領域Ｅとして示されている。） 本明細書および請求の範囲で用いた命名法によれば、
特に述べない限り、“T"は一般にT3RαまたはT3Rβ受容
体のいずれかを意味する；“E"はhERR1またはhERR2を意
味する；また、“R"はRARαまたはRARβ受容体のいずれ
かを意味する。
本発明のキメラ受容体は、（１）hGR,hMR,hERR1,hERR
2,rTRα,hT3α,hT3β,hRARα，およびhRARβからなる野
生型受容体群から選択されたＮ末端領域、（２）hGR,hM
R,hERR1,hERR2,rTRα,hT3α,hT3β,hRARα，およびhRAR
βからなる野生型受容体群から選択されたDNA結合領
域、（３）hGR,hMR,hERR1,hERR2,rTRα,hT3α,hT3β,hR
ARα，およびhRARβからなる野生型受容体群から選択さ
れたリガンド結合領域を有するキメラを含み、それにお
いて、どのキメラ受容体を少なくとも２つの異なる“野
生型受容体”源に由来するＮ末端領域、DNA結合領域、
およびリガンド結合領域を有する。
本発明の望ましいキメラ受容体DNAとしては、GRR,GR
G,GGR,RGG,RGR,RRG,GTT,GTG,GGT,TGG,TGT,TTG,TTR,TRT,
TRR,RTT,RTR,RRT,GTT,GTG,GGT,TGG,TGT,およびTTG受容
体DNAが含まれ、およびこのようなキメラ受容体をコー
ドするDNAから転写されたmRNAの翻訳による本発明のキ
メラDNAの発現によって産生されるキメラハイブリッド
受容体タンパク質が含まれる。これらのキメラ受容体
は、与えられた細胞内で外因性のバックグラウンド結合
または転写活性化活性を越える活性を有すること、ま
た、対応する天然の受容体のDNA結合領域のDNA結合活性
または転写活性化活性の少なくとも約５％を持つことお
よび／まはは対応する天然のリガンド結合領域の約５％
のリガンド結合活性を有することが望ましい。
本発明はまた、受容体タンパク質に対する機能的リガ
ンドを同定するための方法を含む。本方法によれば、受
容体タンパク質をコードし、少なくとも機能するリガン
ド結合領域およびDNA結合領域を有するDNA配列（ここで
は試料配列と呼ぶ）を同定することができる。（本分野
の技術に熟達したものには理解されるように、機能的で
あるためにはリガンド結合領域のDNA配列のすべてが必
要なわけではない。働き得る配列、すなわち、その領域
がリガンドに結合する場合になければならない配列はそ
の領域の欠失解析によって同定される。）試料DNA配列
が単離されると、別の受容体タンパク質、例えば、グル
ココルチコイド受容体タンパク質、チロイド受容体タン
パク質、ミネラロコルチコイド受容体タンパク質、また
はレチノイン酸受容体タンパク質などをコードするDNA
配列由来のDNA結合領域と試料DNA配列中のDNA結合領域
とを置換することによってキメラ遺伝子を作成すること
ができる。次に、適当な受容体欠損宿主細胞を、（１）
発現プラスミドに載っていることが望ましい、キメラ受
容体遺伝子、および（２）CAT遺伝子やホタルのルシフ
ェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子であって、これ
もプラスミドに載っていることが望ましく、U.S.S.N.18
0,471においてレポータープラスミドと呼ばれているも
のである。どの場合においても、レポーター遺伝子は機
能的に働き得るホルモン反応性要素（HRE）（野生型ま
たは操作したもの）に連結しており、それにおいてはホ
ルモン反応性要素はキメラ受容体遺伝子の作成に使用す
るDNA結合領域によって活性化され得るものである。
（例えば、キメラ受容体遺伝子がグルココルチコイド受
容体をコードするDNA由来のDNA結合領域を含む場合、HR
Eは野生型、または合成GRE、すなわちグルココルチコイ
ド受容体タンパク質のDNA結合領域の機能的部分によっ
て活性化されるものである。チロイド受容体DNA結合領
域を用いる場合には、野生型あるいは操作されたHREは
チロイド（またはレチノイン酸）受容体タンパク質など
に反応性であるべきである。）次に、トランスフェクト
された細胞を、キメラ遺伝子によってコードされている
キメラタンパク質のリガンド結合領域と結合できる可能
性のあるリガンド候補群で試してみる。これらのうち、
どのリガンドと機能的にキメラ受容体遺伝子を複合体を
形成するかを決定するために、受容体遺伝子の誘導を、
レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質のレ
ベルを追跡する。（例えば、ルシフェラーゼがレポータ
ー遺伝子である場合には、ルシフェラーゼの産生はレポ
ーター制御による遺伝子転写を示唆する。）最後に、レ
ポーター遺伝子の転写を誘導できるリガンドが見つかっ
た際には、このリガンドが最初の試料DNAによってコー
ドされている受容体タンパク質に結合すると結論づけら
れる。この結論は、レポーター遺伝子の発現を誘導する
リガンドと対応させて、最初の試料DNA配列にコードさ
れている受容体タンパク質の結合能を試験することによ
って、さらに証明することができる。
本分野の技術に熟達したものが理解するように、細胞
が既に、（ａ）（１）第一の受容体配列（すなわち第一
の配列）のDNA結合領域の機能領域が、（２）第二の受
容体配列（すなわち第二の配列）のリガンド結合領域の
機能領域と連結されているものからなるキメラ配列
（Ｃ）、および（ｂ）レポーター核酸配列が機能的に働
き得るホルモン反応性要素と連結しており、それにおい
て第一の受容体配列のDNA結合領域の機能領域がレポー
ター配列に機能的に連結されているホルモン反応性要素
に結合し、活性化できるものを含んでいる場合には、受
容体タンパク質の機能的リガンドを同定するための方
法、少なくとも一つの候補リガンドで細胞を処理し、レ
ポーター配列の発現産物の量における変化によってレポ
ーター配列の誘導を追跡することからなる。
新しい機能的リガンド同定アッセイにより、多数の潜
在的なリガンドまたはいかなる与えられた受容体も、受
容体が野生型であるかキメラであるかどうかにかかわら
ず、スクリーニングすることが可能になる。
機能的リガンド同定法は、ここでは（１）レチノイ
ド、レチノイン酸、およびその代謝前駆体、レチノール
がphRAR1DNAによってコードされる受容体の機能的リガ
ンドであること、および、（２）DNA結合領域およびリ
ガンド結合領域がキメラ受容体の機能特性を決定するこ
と、を示すことにより例示される。
新しい機能アッセイ、および新しいレチノイン酸受容
体、および新しいキメラ受容体について、以下でさらに
詳細に述べる。
発明の詳細な説明 レチノイン酸受容体 ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーを研究
する努力が続けられているなかで、ステロイドホルモン
受容体のDNA結合領域に関する顕著な相同性を持つ新し
いゲノム配列を偶発的に同定することが利用されてきた
（デジーン（Dejean）他、1986参照）。この配列は、ヒ
ト肝臓細胞ガン由来のＢ型肝炎ウイルス（HBV）の内在
化配列にまでわたる。
この遺伝子がこれまでに知られていなかった受容体を
コードするという仮説を追及するために、この配列由来
のオリゴヌクレオチドを標識し、多数のヒトcDNAライブ
ラリーのプローブとして用いた。５つのポジティブなク
ローンが最初に精巣cDNAライブラリーから単離された。
これらのクローンの一つの挿入断片（1hT1R）を用い
て、λgt10腎臓cDNAライブラリーからさらなるcDNAクロ
ーンを単離した。最大のクローン（phRAR1）の制限酵素
地図を第1A図に示す。第1B−１図に示すように、ヌクレ
オチド配列解析により、ヌクレオチド103−105に対応す
る仮定的な開始メチオニンコドンから始まる462アミノ
酸の長いオープン・リーディング・フレームが見いださ
れた。このATG周辺の配列は、翻訳開始部位に関するコ
ザック（Kozak）（1987）によって示されたコンセンサ
ス配列と一致する。ATGの上流は、インフレーム（in−f
rame）のターミネーターであり、開始メチオニンである
ことを支持する。30コドン下流に見られる別のATGはコ
ンセンサスには適合ず、イニシエーターではなさそうで
ある。1489−1491のターミネーターコドンに続いて、ポ
リアデニル化領域の20ヌクレオチド上流にポリアデニル
化シグナルのコンセンサス配列（AATAAA）（プラウドフ
ット（Proudfoot）他、1976参照）を持つ３′−非翻訳
領域が存在する。
相対分子量50,772d（51kd）のポリペプチドが、翻訳
されるオープン・リーディング・フレーム内にコードさ
れている。phRAR1の挿入断片にコードされているタンパ
ク質の大きさは、この断片由来のRNAのin vitro翻訳
（クリーグ（Krieg）他、（1984）参照）によって確認
され、54kdの推定分子量に対応することが見いだされた
（データは示さない）。このタンパク質のアミノ酸配列
を、グルココルチコイドおよびチロイドホルモン受容体
と比較した。もっとも高い相同性は、残基88から始まる
66アミノ酸のシステインが豊富な配列に見いだされた。
われわれのグループはすでに、hGRのこの領域がこの受
容体のDNA結合領域であることを示している。ギグレ（G
iguere）他、（1987）およびホレンバーグ他、（1987）
参照。さらに、ミュータジェネシスおよび発現実験によ
り、グルココルチコイド反応性要素（GRE）を有する遺
伝子の転写活性化の役割を果たしている直接の証拠を示
した。ギグレ他、（1987）およびホレンバーグ他、（19
87）参照。
領域スイッチングと転写活性化 phRAR1の遺伝子産物に対するリガンドが知られていな
いので、リガンドを同定するための迅速で感度のよいア
ッセイを開発することが望まれた。これまでの研究から
ヒトグルココルチコイドおよびエストロゲン受容体のDN
A結合領域は交換可能であり、機能するハイブリッド受
容体が得られることが示されている。このキメラはMMTV
−LTRのグルココルチコイド反応性要素を認識するが、
エストロゲンに依存して転写を刺激する（グリーン他、
（1987）参照）。このことにより、新しいホルモン受容
体のリガンド結合能の同定に一般的な領域交換ストラテ
ジーを利用できるのではないかと我々は考えた。このア
プローチを確かめるために、まずphRAR1のDNA結合領域
をよく研究されているhGR由来のDNA結合領域と置換した
（第2A図）。（このキメラ構造は、適当な宿主細胞内で
発現されると、そのリガンド結合領域が、リガンド／受
容体複合体がGREに結合する前に機能的な外来のリガン
ドと結合するようなハイブリッド受容体タンパク質を産
生し、それによってグルココルチコイド誘導性プロモー
ターを活性化する。） 機能的リガンドの存在をアッセイするために、キメラ
受容体遺伝子を適当なGRE連結レポーター遺伝子ととも
に、適当な宿主細胞にトランスフェクトした。CV−１細
胞をMMTV−CATレポーター遺伝子とともにアッセイに用
いた。（MMTV−CATはレポータープラスミドGM−CAT上に
載っており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに特許目的のために寄託されている；本明細書の
“寄託”の項参照。本分野の技術に熟達したものには理
解されるように、ハイブリッドチロイド受容体タンパク
質、すなわちチロイド受容体タンパク質のDNA結合領域
を有するハイブリッドタンパク質をアッセイするための
適当なレポータープラスミドは、プラスミドGM−CAT上
のGREをチロイドホルモン反応性転写要素と置換するこ
とによって構築することができる。たとえば、成長ホル
モンプロモーターは最近のCAT遺伝子に機能的に連結す
ることができる。成長ホルモンプロモーターはチロイド
反応性転写要素を含んでいるので、このようなプラスミ
ドはハイブリッドチロイド受容体タンパク質のアッセイ
に用いることができる。本明細書中の小見出し“レポー
ターおよび発現プラスミドの構築”の項参照。（ミネラ
ルコルチコイド受容体はGREを活性化できるので、GM−C
ATなどのレポータープラスミドをハイブリッドミネラル
コルチコイド受容体タンパク質のアッセイに使用するこ
とができる。） 機能的リガンド同定アッセイに戻ると、トランスフェ
クトした細胞をつぎに、一群のリガンド候補で体系的に
処理し、CAT活性の変化によって誘導を追跡した。
そのホルモン様活性のため、レチノール（ビタミン
Ａ）およびレチノイン酸を含むレチノイドは、潜在的な
インデューサーとして評価されていた。注目すべきなの
は、チレノイン酸はハイブリッド受容体のCATの劇的な
増加を引き起こした（第2B図）。親のベクターpRShR
RNX、またはここではヒトレチノイン酸受容体（hRAR
α）と呼ぶphRAR1由来の野生型遺伝子産物を用いた場合
にはCAT活性には何も影響がないことを我々をは示し
た。期待されたように、ハイブリッド受容体はグルココ
ルチコイドでは誘導されず、hGRはレチノイン酸によっ
ては誘導されない。
第3A図に示すように、レチノイン酸はハイブリッド受
容体によって誘導されたCAT活性に関して、６×10-10M
のED50値を示し、これは多様な生物学的アッセイにおけ
るレチノイン酸に対して観測されたED50値と一致するも
のである（スポーン（Sporn）とロバーツ（Roberts）19
84参照）。レチノールは100nM以上のED50値で弱いアゴ
ニストとして機能する。レチニル酢酸およびレチニルパ
ルミチン酸は弱いインデューサーとしてさえ機能する。
テストステロン、ジヒドロテストステロン、エストロゲ
ン、デキサメタゾン、コルチゾール、アルドステロン、
プロゲステロン、T3,T4、ビタミンD3、および25−OH−
コレステロールを含む多数の天然および合成リガンドは
CAT活性を誘導することができなかった。
phRAR1遺伝子産物がレチノイン酸受容体であることを
確認するために、発現産物の結合特性を以下のCOS−１
細胞のトランスフェクションによって評価した。第3B図
に示したように、トランスフェクションした細胞は3H−
レチノイン酸に特異的に結合する能力が増大しているこ
とが示された。この増加は、細胞性レチノイド結合タン
パク質の存在および、顕著な非特異的結合の結果と考え
られる内存性のバックグラウンドを超えておこってい
る。活性化の研究と一致して、結合はレチノイン酸によ
って完全に競合されるが、レチノールによっては部分的
にしか競合されない。チロイドホルモン、デキサメタゾ
ン、およびビタミンD3は、レチノイン酸の結合と競合し
なかった。
遺伝子ファミリー 新しいレチノイン酸遺伝子が特異的なものであるかど
うかを決定するために、また潜在的に関連した遺伝子を
同定するために、ヒトDNAをサザンブロット分析で調べ
た。制限酵素で切断したヒトDNAをhRR遺伝子のコード領
域由来の標識したDNA断片とハイブリダイゼーションさ
せた結果、単一のハイブリダイズする遺伝子座位とすべ
ての切断で一致する３本のバンドが見られた（第4A
図）。このハイブリダイゼーションパターンはデジーン
他（1986）がHBV前挿入部位に関して記載した制限酵素
地図とは関連がないものである。しかし、ハイブリダイ
ゼーション条件を緩くすると、各酵素消化産物でさらに
６本のバンドが見いだされた（第4B図）。これらの観察
により、ヒトゲノム中に少なくともさらに１カ所、ある
いはそれ以上レチノイン酸受容体に関連する座位が存在
することが示唆された。現在RARβが発見された。ブラ
ンド（Brand）他、（1988）参照。
hRR遺伝子の発現 レチノイン酸は多数の異なる細胞型に影響を与えるこ
とが知られているので、我々はhRR遺伝子の発現を調べ
た。多様なラットおよびヒト組織から単離された全細胞
質RNAをサイズで分離し、ニトロセルロースフィルター
に転移させた。phRAR1由来の600bp制限断片とのハイブ
リダイゼーションにより、海馬、副腎、小脳、視床下
部、および精巣で最も高レベルに、3,200ヌクレオチド
の主要なRNAが見られた（第５図）。長い感光により、
肝臓などのいくつかの組織では検出されなかったが、ほ
とんどの組織で少量の3.2kb転写産物が見られた。
レチノイン酸受容体データ要約 ここで示したデータは、phRAR1の遺伝子産物を３つの
基準に基づいてヒトレチノイン酸受容体として同定する
ものである。第１に、hRRのステロイドおよびチロイド
ホルモン受容体に対する全体的な構造上の相同性（第６
図）は、hRRがリガンド反応性調節タンパク質であるこ
とを示唆している。第２に、hGRのDNA結合領域とhRRの
予想されるリガンド結合領域からなる、発現されたキメ
ラ受容体は、レチノイン酸の存在する場合にのみ、グル
ココルチコイド誘導体性レポーター遺伝子の転写制御因
子として働く。この誘導は生理学的レベルで起こる。第
３に、トランスフェクトされた細胞中のhRRの候補の発
現が選択的に、これらの細胞がレチノイン酸に結合する
能力を増大させる。
発生とガン化 レチノイドは、広範な系においてい発生と分化に難解
な効果を表わす、レチノイン酸、レチノール（ビタミン
Ａ）および一連の天然ならびに合成誘導体からなる化合
物のグループからなるものである。スポーン（Sporn）
とロバーツ（Roberts），（1983）；マンデル（Mande
l）とコーエン（Cohen），（1985）；ウォルバック（Wo
lback）とホウ（Howe），（1925）；ロタン（Lotan），
（1980）；フックス（Fuchs）とグリーン（Green），
（1980）を参照のこと。初期の研究が上皮の成長および
分化に対するレチノイドの効果に焦点を当てたにもかか
わらず、それらの作用がはじめに考えられていたよりも
さらに広範にわたるものであることが示された。最近の
多くの研究により、神経芽細胞腫（ハウスレー（Hausle
r）ら，（1983）を参照）、黒色腫（ロタンら，（198
3）を参照）および線維芽細胞（シュローダー（Shrode
r）ら，（1982）を参照）を含む種々の培養細胞系列に
対するこれらの分子の効果が示されている。ヒト前骨芽
細胞性白血細胞（HL−60）において、レチノイン酸は、
側内胚葉の分化および後期マウス胚盤胞の特徴を誘導す
る（ストリックランド（Strickland）とマーダビ（Mahd
avi），（1978）；ジェッテン（Jetten）ら，（197
9）；ワング（Wang）ら，（1985）を参照）。レチノイ
ン酸は発生において同様に強力な効果を示すことが明ら
かにされている。例えば、レチノイン酸は、発生途上の
ニワトリの肢芽において前後軸が確立する際に、極性領
域の作用を代用できるのである（ティックル（Tickle）
とアイヒール（Eichele），（1985）を参照）。レチノ
イン酸の投与を調節することにより、新奇なパターンを
もつ肢構造を作ることが可能である。レチノイン酸は、
主にはモルフォゲン（morphogen）であると考えられる
にもかかわらず。ノザンブロット分析によって、成体に
おけるその機能についての再評価が示唆されている。ヒ
トにおいて、レチノールの欠損は種々のガンの驚くべき
増加と関連している（ムーン（Moon）とイトリ（Itr
i），（1984）を参照）。レチノイドは、動物において
腫瘍の成長を阻害し、in vitroでの腫瘍促進因子の作用
を妨害することも示されている。これと関連して、hRR
は、ガン化の負の制御因子であると考えられる。
制御遺伝子のスーパーファミリー ２つの驚くべき結果がここに示した研究から明らかと
なった。まず第一は、レチノイン酸受容体関連遺伝子フ
ァミリーの発見であり、これは、溶接に関連した性質を
もつ複数のタンパク質の存在を予言するものである（例
えば、ブランド（Brand）ら，（1988）により記述され
たRARβ）。生理学的研究から、レチノイン酸はレチノ
ール（ビタミンＡ）と同様に、細胞の分化に強力な効果
を発揮し、これらの効果はしばしば関連しないものであ
ることが示されている。したがって、少なくともひとつ
の関連遺伝子産物が、特異的なレチノール受容体あるい
はレチノイドファミリーのもうひとつのメンバーに対す
る受容体であるということがありそうである。これらの
結果から得られる第二の驚くべき観察は、レチノイド受
容体とチロイドホルモン受容体との密接な類縁関係であ
る。（われわれが以下に示すように、レチノイン酸受容
体はチロイド応答エレメントまたはTREを活性化でき
る；「レチノイン酸とチロイドホルモンは共通の応答エ
レメントを介して遺伝子発現を誘導する」と分類された
明細書の節を参照のこと。）この関係は、チロイドホル
モンとレチノイドの構造的相違性から、ある程度驚きで
ある。チロイドホルモンは２つのチロシン分子の縮合か
ら生ずる一方、レチノイドは、メバロン酸から誘導され
る。化学的に異なる分子が共通の構造をもつ受容体と相
互作用するという観察はもっぱら、それらがその個々の
調節効果を引き出すところの作用様式の共通性を反映し
ているように見える。この類推に基づいて、細胞内受容
体とレチノイドの相互作用が、ホルモン／受容体複合体
による特定の遺伝子群の活性化を引き起こす調節カスケ
ードを誘導するという考えを現在われわれは提出してい
る。動物は、その発生と生理状態を調節するための種々
の方法をとっているが、レチノイン酸受容体がステロイ
ド受容体スーパーファミリーの一部であるという証拠
は、形態形成および恒常性をつかさどる機構がはじめに
考えられていたよりもさらに一般的であることを示唆し
ている。
キメラ受容体の構築と特徴付け キメラ受容体遺伝子の構築は、上述の「定義」、「発
明の要約」および「ドメインの切り替えおよび転写活性
化」に分類される明細書の項目で論議されている。それ
に続く項目において、キメラ受容体の構築と特徴付け
は、GR/TRハイブリッドの構築と特徴付けを示すことに
より説明される。
材料と方法 細胞培養とトランスフェクション CV−１細胞は、キメラRR/TR受容体を持つ発現プラス
ミドおよび、CATレポーター遺伝子を持つレポータープ
ラスミドでトランスフェクトする受容体欠損宿主細胞と
して用いられた。CV−１（アフリカミドリザルの腎臓）
細胞の生育およびトランスフェクションの条件は、リン
酸カルシウム沈澱を細胞の上に４−８時間おき、このと
き、培地を５％のT3フリーのウシ血清（スカンチボディ
ーズ）なし、あるいは10-7MのT3（シグマ）を含んだDME
Mにかえることを除いては、以前に述べられたもの（ギ
ギュアー（Giguere）ら，（1986））と同様だった。T3
の添加36時間後に細胞を集め、ゴーマン（Gorman）ら，
（1982）によって述べられているようにしてCATアッセ
イを行った。代表的なものは５μｇのレポーターと１μ
ｇの発現ベクターをコトランスフェクションし、これと
ともに2.5μｇのRSV−βgalをトランスフェクション効
率の対照として用いるものである。アッセイ化および非
アセチル化型の［14C］クロラムフェニコールを薄層ク
ロマトグラフィーにより分離し、切り出し、５％DMSOを
含むエコノフルアー（デュポン社）中で液体シンチレー
ションカウンターを用いてカウントを測定することによ
り定量した。β−ガラクトシダーゼのアッセイはハーボ
メル（Herbomel）ら，（1984）により記載されたように
して行った。CAT活性は、β−ガラクトシダーゼ活性に
よって割った転換率により表わされる。
レポーターおよび発現プラスミドの構築 ラット成長ホルモン遺伝子の−169から−200に相当す
る合成オリゴヌクレオチドを、−190/−181の位置にHin
d IIIサイトを有するMTV−CATのリンカー精査型変異体
（ビュティ（Buetti）とクーネル（Kuhnel），（198
6））に組み込んだ。発現ベクターは、pheA12（hTRβ、
ワインバーガー（Weinberger）ら、（1986）を参照）お
よびrbeA12（hTRα、トンプソン（Thompson）ら、（198
7）を参照）の全長のcDNAを、pRSベクター（ギギュアー
ら、（1986）および（1987））のKpn IとBamH Iサイト
の間に挿入することによりチロイドホルモン受容体に対
して構築した。
キメラ受容体の構築 hGRNXの構築法は既に記載がある（ギギュアーら、（1
987））。hGRNXを構築するために、pheA12（hTRβ、ワ
インバーガー（Weinberger）ら、（1985）と（1986）を
参照）のcDNA挿入断片をM13mp19のKpn IとBamH Iサイト
の間にサブクローニングし、クンケル（1985）の方法に
より変異を生起させた。Not Iサイトを生ずるために用
いたオリゴヌクレオチドは３つのアミノ酸、すなわちAs
p97をArgへ、Lys98をProへ、Asp99をProへと変化させ
た。Xho Iサイトを生ずるために用いたオリゴヌクレオ
チドは２つのアミノ酸、すなわちThr171をLeuへ、Asp17
2をGlyへと変化させた。次に変異型受容体cDNAを発現ベ
クターpRS（ギギュアーら、（1986）および（1987））
に移した；この複合体は、RShGRNXとRShTRβNXの間のKp
n I−Not I、Kpn I−Xho IおよびNot I−Xho I制限酵素
断片を交換することにより構築された。RShGRNXは、野
生型に対し約75％のDNA結合活性を有し、RShTRβNXは野
生型の約60％のDNA結合活性を有している。
Cis/Trans作用性リガンド同定アッセイ cis/Trans機能リガンド同定のためのコトランスフェ
クションアッセイは、グルココルチコイド、およびチロ
イドならびにレチノイン酸受容体の間でドメインを交換
することにより構築したキメラ受容体を研究するために
用いられた。（当業者には理解されるように、cis/Tran
sコトランスフェクションアッセイは、野生型あるいは
遺伝的に操作された受容体のあるドメインにおける、機
能的な交換によって作製されたキメラ受容体を研究する
ために用いることが可能である。cis/Transアッセイに
おいて、２種のプラスミドを受容体受容細胞系列にトラ
ンスフェクションする事が好ましい。第一のプラスミド
は受容体タンパク質（野生型かあるいはキメラまたは遺
伝的に操作を加えたもの）を発現するために使われる。
第二のプラスミドは、リガンドあるいはホルモン応答性
プロモーターからの転写をモニターするために用いられ
る。チロイドホルモン受容体アッセイの場合、発現プラ
スミドは、チロイドホルモン受容体をコードするcDNAを
発現に向かわせるラウス肉腫ウイルスの長い終末反復配
列（RSV−LTR）からなる。hGRの場合、レポータープラ
スミドは、細菌のクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ（CAT）遺伝子を配合したマウス乳腺腫瘍
ウイルスの長い終末反復配列（MTV−LTR）である。MTR
−CATをチロイドホルモン応答性レポーターに変換する
ために、チロイドホルモン応答性エレメント（TRE）を
含むオリゴヌクレオチドをMTV−LTRの−191の位置に挿
入した。この配列、すなわちラット成長ホルモン（rG
H）遺伝子の−169から−200は、チロイドホルモン受容
体に特異的に結合し異種プロモーターにT3応答性を付与
する（グラス（Glass）ら、（1987））。発現およびレ
ポータープラスミドはCV−１細胞にコトランスフェクシ
ョンし、CAT活性はT3存在、非存在下で測定した。この
アッセイにより、αおよびβチロイドホルモン受容体の
どちらも、T3存在、非存在下でMTR−CATからの転写を活
性化しないことが示された（データは示さない）。しか
し、TREをつけることにより、チロイドホルモン応答性
のMTVプロモーターが作られる。CAT活性の誘導は、機能
的なαあるいはβチロイドホルモン受容体のコトランス
フェクションとT3の添加に依存的である。T3存在下でα
受容体（rTRα）はCAT活性を約15倍まで誘導するが、一
方β受容体（hTRβ）は約５倍まで活性を誘導する。
複合チロイドホルモン／グルココルチコイド受容体
は、チロイドおよびグルココルチコイドホルモン受容体
の機能的性質を比較するために構築された。キメラ複合
受容体の構築を促進するために、Not IとXho Iの制限酵
素に対する唯一の切断点をhGRとhTRβのDNA結合ドメイ
ンに隣接して挿入した。これらの変異型受容体は、hGR
NXとhTRβNXと呼ばれ、これらの受容体に対するアミノ
末端、DNA結合ドメイン、リガンド結合ドメインの全て
の可能な組合せにおける複合体を作るために用いること
ができる。（当業者）には理解されるように、共通点を
有するプラスミド、例えばpRARαNXあるいはpMRNXは、
ステロイドホルモン受容体のスーパーファミリーにおけ
る種々の受容体から、全ての機能ドメインの全ての可能
な組合せにおけるキメラ受容体を作るために用いること
が可能である。受容体と種々の機能ドメインの位置は第
８図に示されている。）複合体およびその親型の受容体
は、T3あるいは合成グルココルチコイドデキサメタゾン
の存在、非存在下で、チロイドホルモンおよびグルココ
ルチコイド応答性プロモーター両者を用いてアッセイが
可能である。
複合チロイド／グルココルチコイド受容体の構造およ
び活性は第９図に示されている。受容体は３つの部分に
分けられ、複合体はドメインの「起点」を表わす文字で
名付けられており、例えば「Ｔ−Ｇ−Ｔ」はhTRβのア
ミノ末端およびカルボキシ末端を持ち（Ｔ−，−Ｔ）、
hGRのDNA結合ドメイン（−Ｇ−）を持っている。推定上
のhTRβのDNA結合ドメイン（TTG,GTT,GTG）との複合体
は、TRE−CATからの転写を活性化するが、一方hGRのDNA
結合ドメイン（GGT,TGG,TGT）との複合体はGRE−CATか
らの転写を活性化した、これはhTRβのこの領域がhGRの
DNA結合ドメインに類似しており、プロモーターの認識
に関与していることを示している。hTRβカルボキシ末
端との複合受容体はT3により活性化されるが、一方hGR
のカルボキシ末端との複合受容体はデキサメタゾンによ
り活性化された。これは、カルボキシ末端がホルモンの
結合および活性化の特異性を負っている受容体の一部で
あるとする認識と一致するものである。これとあわせ
て、これらの複合体の機能的性質は、hTRβのDNAおよび
リガンド結合ドメインの帰属を支持するものである。
レチノイン酸およびチロイドホルモンは共通の応答性エ
レメントを介して遺伝子発現を誘導している 機能的なレチノイン酸応答性エレメント（RARE）の同
定はレチノイン酸受容体が遺伝子発現を活性化し、細胞
の分化を制御する機構をわれわれが理解する上で決定的
なものである。こうした研究のひとつの障害は、その転
写がレチノイン酸受容体−ホルモン複合体に直接依存し
ている遺伝子が全く同定されていないことである。RARE
の局在を探るそのほかの手段は、クローン化したcDNAか
ら生産されるレチノイン酸受容体を用いて既知のホルモ
ン応答性プロモーターの誘導性を体系的に調べていくも
のである。（「Cis/Transアッセイ」という見出しで述
べたように、この系において、HREを含むプロモーター
からの転写活性化は、CV−１といった受容体欠損細胞に
おいてコトランスフェクションした発現プラスミドから
の機能的な受容体の発現に依存性を示す。）レチノイン
酸およびチロイドホルモン受容体のDNA結合ドメインは
高い関連性を持つ（アミノ酸配列において62％の一致、
第６図を参照）ため、レチノイド受容体がTREを介して
遺伝子発現を活性化する可能性が検討された。
TREは、例えばグラスら（1987）を参照すると、チロ
イドホルモン（3,5,3′−トリヨード−Ｌ−チロニン、T
3）調節に必須な、ラット成長ホルモン５′隣接ゲノム
配列におけるcis−作用エレメントであるという議論に
より知られている。
TREがRAREとして効果的に機能できるかを調べるため
に、新奇なT3応答性プロモーターを、マウス乳腺肉腫ウ
イルス長終結反復配列（MTV−LTR）中に存在するグルコ
コルチコイド応答性エレンメントを、天然のTREGHをコ
ードするオリゴヌクレオチドと置換することにより構築
した。次に、このプロモーターレポータープラスミドΔ
MTV−TREGH−CATを作製するために、細菌のクロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子
と融合した。CV−１細胞へ短期間のトランスフェクショ
ンを行った後、このプロモーターの誘導性をCAT活性を
測定することにより決定した。CV−１細胞を、ヒトチロ
イドホルモン受容体β（pRShT3Rβ）を含む発現ベクタ
ーおよびレポータープラスミドΔMTV−TREGH−CATでコ
トランスフェクションした場合、CAT活性の誘導はT3の
存在下で測定する。これとは対照的に、ヒトグルココル
チコイド受容体（pRShGRα）をコードする発現ベクター
と同じレポータープラスミドをコトランスフェクション
すると、合成グルココルチコイドデキサメタゾンに応答
してこのプロモーターからのCAT活性を活性化しなかっ
た。これらの結果は、野生型のMTV−LTRが応答性でない
ことから（データは示さない）、RARαによるCAT活性の
誘導がTREによるものであることを明らかに示してい
る。これらの結果はまた、hRARαがTREを含むプロモー
ターからの遺伝子発現を特異的に誘導できることを示し
ている。
RARとGRのキメラ受容体 上で議論したように、ステロイドホルモン受容体のモ
ジュラー構造は、ある受容体から他の受容体へ機能的ド
メインを交換して機能的なキメラ受容体を作製すること
を可能としている。この戦略は、RARのDNA結合ドメイン
とGRのリガンド結合ドメインを持つhGR/hRARαキメラを
作製するために用いられた。CV−１細胞をhGRGをコード
する発現プラスミドとレポーターΔMTV−TREGH−CATで
コトランスフェクションすると、デキサメタゾンは特異
的にCAT活性を誘導した（データは示さない）。この実
験は、hRARαのDNA結合ドメインが標的遺伝子の活性化
の特異性を決定するという直接的証拠を与えた。
図表の詳細な説明 第１図.phRAR1のDNAおよび主要なアミノ酸配列。Ａ、
phRAR1クローンの模式的な説明と制限酸素地図。点を打
ったボックスは推定される遺伝子の読み枠を示す。Ｂ、
（Ｂ−1,B−2,B−３として示されている）phRAR1の完全
なヌクレオチド配列が長い読み枠の上にアミノ酸配列と
ともに示されている。ヌクレオチド85−87の上流域にあ
るインフレームの終止コドンおよびポリアデニル化シグ
ナルは下線を施してある。
第１図の方法．デジャン（Dejean）ら、（1986）によ
って発表されているゲノムはう列のヌクレオチド408−4
77に相当する63−merのオリゴヌクレオチドは、ヒト精
巣λgt10ライブラリーを検索するためのハイブリダイゼ
ーションプローブとして用いられた。ハイブリダイゼー
ション混合液は、35％ホルムアミド、１×デンハルト、
５×SSPE、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、100
μg ml-1の変性サケ精子DNAおよび106c.p.m ml-1の32p
−標識オリゴヌクレオチドを含んでいた。２重にしたニ
トロセルロースフィルターを42℃で16時間ハイブリダイ
ゼーションし、２×SSC、0.1％SDS（１×SSC＝150mM Na
Cl,15mMクエン酸ナトリウム）で20分間、55℃で３回洗
い、増感紙を用いて−70℃でオートラジオグラフにかけ
た。この検索により得られたクローン1hT1Rは、部分的
に性質を調べた後、ヒト腎臓ωgt10cDNAライブラリーを
検索するためのハイブリダイゼーションプローブとして
用いた（ベル（Bell），（1986）を参照）。この検索の
ために、洗いは68℃で１×SSC、0.1％SDSという条件に
変えた。いくつかのcDNAクローンが単離され、そのうち
最も長いクローンであるphRAR1を多種の制限酵素で切断
し、得られた断片をM13シーケンシングベクターmp18な
らびにmp19に、両向きにサブクローニングし、ジデオキ
シ法（サンガー（Sanger）ら、（1977））で塩基配列を
決定した。DNA配列を編集し、デヴェルクス（Devereu
x）ら、（1984）およびシュターデン（Staden），（198
2）のプログラムによって分析した。
第２図.A、キメラ受容体hRGRの構築。種々の構築のド
メイン構造は、模式的に示されており、番号は各々のド
メインのアミノ酸の位置に対応している。DAN結合ドメ
インは「DNA」で表わされており、リガンド結合ドメイ
ンは各々の誘導物質により表わされている。受容体間の
DNA結合ドメインの交換を可能とするために、部位標的
突然変異導入法により作られたNot IおよびXho I部位が
示されている。Ｂ、レチノイン酸によるCAT活性の誘
導。発現ベクターはレポータープラスミドMTVCATととも
にCV−１細胞にコトランスフェクションし、100nMのデ
キサメタゾン（DEX）あるいはレチノイン酸（RA）の存
在、非存在下で２日間培養した。発現ベクターに挿入さ
れた受容体は:pRShRGRではヒトグルココチコイド受容
体;pRShRRではヒト・レチノイン酸受容体;pRShRRnxでは
Nat IとXho I部位を有する変異型ヒト・レチノイン酸受
容体;pRShRGRでは、DNA結合ドメインがヒト・グルココ
ルチコイド受容体のDNA結合ドメインによって置換され
た、ヒト・レチノイン酸受容体キメラ受容体である。
第２図の方法.A、phRARとhGR（ホレンバーグ（Hollen
berg）ら、（1985）を参照）のcDNA挿入断片の制限酸素
断片を、mp19ベクターのkpn IとBamH I部位にサブクロ
ーニングし、クンケル（1985）の方法にしたがい変異誘
起処理した。hGRおよびhRR内にNot I部位を作製するた
めに用いたオリゴヌクレオチドは各々28と31ヌクレオチ
ドであるが、一方hGRとhRRにXho Iを作るために用いた
オリゴヌクレオチドは24と23ヌクレオチドであった。No
t Iが生起した結果、hGRNXではPro416からArgへの変異
が、またhRRNXではIle84およびTyr85がProへと変異し
た。Xho I部位の導入によりhGRNXアミノ酸配列は変化し
ないが、hRRNXではLys155がLeu残基へ変異した。変異型
受容体は次に、発現ベクターpRS（ギギュアーら，（198
6）を参照）に移され、hGRDNA結合ドメインを含むpRShG
RNXのNot I/Xho I制限酵素断片を、pRShRNXのNot IとXh
o I部位の間に導入してpRShRGRを生ずる。Ｂ、細胞のト
ランスフェクションとCATアッセイ。組換え体DNA構築物
（各々５μｇ）はリン酸カルシュム共沈法（ウィグラー
（Wigler）ら，（1979））によってCV−１細胞に導入さ
れた。次に、細胞は誘導物質の存在、非存在下で、ニュ
ートリドーマ（ベーリンガー・マンハイム社）を補った
無血清培地内で２日間培養した。CV−１細胞は、次にゴ
ーマンら，（1982）によって記載されたようにしてCAT
アッセイのために調製し、25μｇのタンパク抽出物を用
いて３時間行った。レチノールを用いた全ての実験は、
緩光下で行った。
第３図.A、レチノイドの投与量に対する応答。pRShRG
RおよびpMTVCATでトランスフェクションしたCV−１細胞
に、レチノイドの濃度を上昇させるあるいはテストステ
ロン、ジヒドロテストステロン、エストロゲン、コルチ
ゾル、アルドステロン、プロゲステロン、トリヨードチ
ロニン（T3）、チロキシン（T4）、ジヒドロキシ−ビタ
ミンD3（VD3）および25−OH−コレステロールなどの１
μＭにおける単独投与（＊）処理を行った。CAT活性の
レベルは、この実験において観察された最大応答に対す
るパーセントとしてプロットされた。B,トランスフェク
ションしたCOS−１細胞の細胞質抽出物に対するレチノ
イン酸の結合。棒は、1000倍過剰量の種々の競合物質非
存在（黒色の棒）、存在下（白ぬきの棒）で決定され
た、結合した3H−レチノイン酸量を表わしている。値
は、４連の測定を平均したものを示している。競合物質
は、レチノイン酸（RA）、レチノール（Ｒ）、T4、デキ
サメタゾン（DEX）およびビタミンD3（VD3）である。
第３図の方法.A、CV−１細胞のコトランスフェクショ
ンとCATアッセイは第２図で述べたようにして行った。
レチノイン酸は最少限のジメチルスルフォキシドに溶解
し、エタノールで希釈した。他の全ての産物はエタノー
ルで希釈し、対照の培養には培地に0.1％の溶媒（V/V）
を与えた。レチノイド処理の投与量−応答の曲線は三連
で行った。Ｂ、準密集状態のCOS−１細胞を、DEAE−デ
キストラン法（ディーンズ（Deans）ら、（1984）を参
照）によりディッシュ当り10μｇの対照プラスミド（pR
S）あるいはpRShRRでトランスフェクションした。細胞
を５％の活性炭処理した仔ウシ胎児血清を含むDMEM中に
２日間おき、次にTNE（40mMトリス−HCL pH7.4,150mM N
aCl,1mM EDTA）中で集め、低張緩衝液（50mMトリス−HC
l pH7.4,0.1mM EDTA,5mMジチオスレイトール,10mM NaMo
04,10％グリセロール,0.5mMフェニルメチルスルフォニ
ル・フルオライド）中で、ドウンス・ホモジナイゼーシ
ョンを用いて融解し、細胞質画分を得るために100,000
×ｇで30分間遠心した。イキュベーションは、総量200
μ中で、細胞質画分からの150μｇのタンパク質およ
び２×10-8Mの3H−レチノイン酸（NEN,52.5Ci/mmole）
とともに、低張緩衝液中で行った。特異的結合は２×10
-5Mの競合物質を添加することにより測定した。反応は
４℃で16時間行った。結合した3H−レチノイン酸はDE−
81フィルターを用いて定量した。反応液をフィルター上
に１分間おいた後、洗浄緩衝液（50mMトリス−HCl pH7.
4,0.1mM EDTA,0.1％トライトンＸ−100）でリンスし
た。フィルターを乾燥させ、液体シンチレーション分光
法によりカウントを測定した。
第４図．ヒト・ゲノムDNAのサザンブロット分析、
Ａ、ヒト胎盤DNAを表示した制限酵素で切断した。切断
したDNAを0.8％のアガロースゲル（レーン当り10μｇ）
で分離し、ニトロセルロースフィルターに転写した（サ
ザン（Southern），（1975））後、ブロットは、hRRのD
NA結合ドメインを含むphRAR1（約600塩基対）由来のEco
R I×Pvu II断片と、高度に厳しい条件（50％ フォル
ムアミド,5×SSPE,1×デンハルト,0.1％SDS,100μg ml
-1サケ精子DNA）下でハイブリダイゼーションした。こ
のフィルターを0.1×SSC、0.1％SDS中、65℃で洗った。
λHind III DNAマーカー（サイズはKbで表示）はオート
ラジオグラムの左にならべてある。Ｂ、ゆるい条件下で
のＡと同様なプローブを用いたヒト胎盤DNAの分析。同
一の試料を含む平行なブロットは、35％のフォルムアミ
ドを用いた以外は、Ａと同様にしてハイブリダイゼーシ
ョンした。このフィルターは２×SSC、0.1％SDS中、55
℃で洗った。
第５図．ラットおよびヒトの組織におけるレチノイン
酸受容体mRNAの、ノザンブロツト分析。
第５図の方法．全RNAは、グアニジンチオシアネート
を用いて種々の組織から単離され（チャーグゥィン（Ch
irgwin」）ら，（1980））、１％アガロース−フォルム
アルデヒドゲルで分離し、ニトロセルロースに転写した
後、第４図で述べられたプローブを用いて、厳しい条件
下でハイブリダイゼーションした。全てのレーンにおい
て20μｇの全RNAが用いられた。リボソームRNA（28Sと1
8S）の移動度はサイズマーカーに対して示されている。
ニトロセルロースフィルターは増感紙を用い、−70℃で
１週間オートラジオグラフィーを行った。
第６図.hGR,hRRおよびhT3Rβ構造の模式的なアミノ酸
の比較。アミノ酸配列は点線にはさまれる領域における
アミノ酸の一致の割合とともに、模式的に並べられてい
る。
第７図は、一般化したステロイド＼チロイド＼レチノ
イン酸受容体遺伝子を模式的に図示したものであり、遺
伝子の区分を領域Ａ＼B,C,D.Eとして示している。Ａ＼
Ｂの領域の機能は、解明が始まったばかりであり;C領域
は、DNA結合ドメインをコードし;D領域はちょうつがい
の領域であり;E領域はリガンド結合ドメインである。
第８図は、ステロイドホルモン受容体スーパーフアミ
リーのメンバーについてアミノ酸配列を比較した模式図
を示している。一次アミノ酸配列は最もアミノ酸の類似
性が高い領域に基づいて並べられており、hGR（ミラー
（Miller）ら，（1985）を参照）に関連した各々の位置
に対してアミノ酸の同一性をパーセントを表示してい
る。示されているドメインは：「最大活性」に必要とさ
れるNH2−末端のドメイン;66−68アミノ酸のDNA結合ド
メインコア（「DNA」）；および250アミノ酸のリガンド
結合（あるいはホルモン結合ドメイン）（「ホルモ
ン」）である。各々のドメインの境界にあるアミノ酸の
位置が示されている。全ての受容体に対するアミノ酸の
番号は、ｖ−erb−ＡおよびE75（セグレイブス（Segrav
ers）,1988）を除いてヒト型を示している。機能の帰属
は、グルココルチコイドおよびエストロゲン受容体の性
質を調べることにより決定された。名称は以下の通りで
ある:GRはグルココルチコイド受容体;MRはミネラロコル
チコイド受容体;PRはプロゲステロン受容体;ERはエスト
ロゲン受容体;ERR1あるいはERR2はエストロゲン関連体
１または2;VDRビタミンD3受容体；およびT3RβとT3Rα
はチロイドホルモン受容体である。（＋）あるいは
（−）とは、特定の性質がクローン化した受容体DNAの
産物あるい精製された受容体について示されるかを表わ
している。HREはホルモン応答性エレメントである。こ
れは、結合部位が構造的に固定されているか、またはこ
れがその促進性が遺伝子転移を行った研究によって示さ
れるかに関連している。PRについては、DNA結合性は無
傷の精製された受容体についてのみ示されている。「in
vitroホルモン結合性」は、その性質がウサギの網状赤
血球溶解物の系（ホレンバーグら，（1985））で翻訳す
ることにより示されるかどうかを示している。「クロモ
ソーム」は、ヒトのクロモソームの位置を示している。
種は、h,ヒト;r、ラット;m、マウス;c、ニワトリ;d、シ
ョウジョウバエである。
第９図、キメラチロイド／グルココルチコイド受容体
の構造と活性。
第９図の方法。複合型受容体を構築するために、hGR
とhTRβのDNA結合ドメインに隣接して唯一のNot Iおよ
びXho I部位が挿入された。複合体は、受容体cDNAの適
当な部分を交換することにより作製された。「DNA」はD
NA結合ドメインを表わし；「T3/T4」および「コルチゾ
ル」はそれぞれhTRβとhGRのリガンド結合ドメインを示
している。箱の上の数字はアミノ酸残基を表わしてい
る。複合体はドメインの起点に関連した文字によりつけ
られている；例えば、「TGT」はhTRβのアミノおよびカ
ルボキシ末端、ならびにhGRのDNA結合ドメインを持って
いる。全ての受容体に関し、T3および合成グルココルチ
コイド・デキサメタゾン（「dex」）の非存在あるいは
存在下で、TRE−MCATおよびGRE−MCATにおけるアッセイ
を行った。示されている全ての組合せは、バックグラウ
ンド以上に活性化を与えた。
参考文献 本明細書は以下の出版物を引用しており、その各々は
この参考文献によって明確に取り入れられている。
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63.Weinberger,C.,Thompson,C.C.,Ong,E.S.,Lebo,R.,Gr
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（1925）．
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジギュール，ヴィンセント カナダ国オンタリオ州エム９エイ・５シ ー６，エトビコーク，イスリントン・ア ベニュー 1320，アパートメント 606 (72)発明者 オング，エステリタ・セバスチャン アメリカ合衆国カリフォルニア州92117, サンディエゴ，ハノン・コート 6307 (72)発明者 セギュイ，プルディマー・セラーノ アメリカ合衆国カリフォルニア州92104, サンディエゴ，オレゴン・ストリート 4152，アパートメント ４ (72)発明者 ウメソノ，カズヒコ アメリカ合衆国カリフォルニア州92122, サンディエゴ，デコーロ・ストリート 4178 ナンバー 60 (72)発明者 トンプソン，キャサリン・キャロライン アメリカ合衆国カリフォルニア州92037, ラ・ホーラ，ミラマー・ストリート 3903，アパートメント エフ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 5/28 C07K 14/00 - 14/825 C12P 1/00 - 41/00 ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質： （ａ）次のアミノ酸配列： からなるタンパク質； （ｂ） アミノ酸配列（ａ）において１個またはそれ以
    上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
    配列からなり、かつレチノイン酸受容体タンパク質とし
    ての特徴を示すリガンド結合特性および転写活性化特性
    を有するタンパク質； をコードする核酸。
  2. 【請求項２】次のアミノ酸配列： と実質的なアミノ酸相同性を有するタンパク質の一次配
    列をコードする、請求項１記載の核酸。
  3. 【請求項３】次のDNA配列： と実質的な配列相同性を有する核酸。
  4. 【請求項４】ヒトレチノイン酸受容体タンパク質として
    の特徴を示すリガンド結合特性および転写活性化特性を
    有するタンパク質の一次配列をコードする、請求項１記
    載の核酸。
  5. 【請求項５】RARαをコードする、請求項４記載の核
    酸。
  6. 【請求項６】ヒトレチノイン酸受容体αをコードする遺
    伝子を含み、次の制限酵素地図： を有するプラスミド。
  7. 【請求項７】請求項６記載のプラスミドのDNAと実質的
    な配列相同性を有する核酸。
  8. 【請求項８】（ａ） 翻訳開始コドンに対応するトリプ
    レットと一致した読み枠にあり、かつ前記開始コドント
    リプレットの下流にある、翻訳終止コドンに対応する１
    つのトリプレット、および （ｂ） 最長のオープンリーディングフレームとして、
    レチノイン酸受容体タンパク質の一次配列をコードする
    トリプレットの配列 を有する請求項１記載の核酸。
  9. 【請求項９】ヒトレチノイン酸受容体をコードする請求
    項１記載の核酸。
  10. 【請求項１０】RARαをコードする、請求項９記載の核
    酸。
  11. 【請求項１１】請求項１ないし10のいずれかに記載の核
    酸と実質的な配列相同性を有する核酸。
  12. 【請求項１２】請求項１ないし10のいずれかに記載の核
    酸の変異体。
  13. 【請求項１３】請求項１ないし10のいずれかに記載の核
    酸から転写される、実質的に純粋なmRNA。
  14. 【請求項１４】以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質： （ａ）次のアミノ酸配列： からなるタンパク質； （ｂ） アミノ酸配列（ａ）において１個またはそれ以
    上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
    配列からなり、かつレチノイン酸受容体蛋白質としての
    特徴を示すリガンド結合活性およびトランス活性化特性
    を有するタンパク質。
  15. 【請求項１５】請求項１ないし10のいずれかに記載の核
    酸によりコードされる、実質的に純粋なタンパク質。
  16. 【請求項１６】請求項１ないし10のいずれかに記載の核
    酸により形質転換された細胞。
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