KR970009951B1 - 레티노 산 수용체 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

레티노 산 수용체 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDF

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세라노 세귀 프루디마르
우메소노 카주히코
케롤린 톰프슨 카테린
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더 솔크 인스티튜트 포오 바이오로지칼 스터디이즈
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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
레티노 산 수용체 조성물 및 이의 제조 방법
[도면의 간단한 설명]
다음은 도면의 간단한 설명이다. 보다 자세한 설명은 도면의 상세한 설명 부분에 나와 있다. 제1도(a 및 b)는 phRARα의 일차 단백질 서열 및 DNA 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다. 제 1a도는 몇몇 제한 엔도뉴클레아제 절단부위의 선 도표와 일렬로 된 phRARα의 복합체 구조를 보여준다. 제 1b-1도, 제 1b-2도 및 제 1b-3도는 phRARα의 완전한 뉴클레오티드 서열 및 그 일차 아미노산 서열을 보여준다.
제2도(a 및 b)는 도면 및 블로트(blot)로 이루어진다. 제 2a도는 키메릭 수용체 hRGR의 구성을 나타내는 도면이다. 제 2b도는 레티노산에 의한 CAT 활성의 유도를 설명하는 블로트이다.
제3도(a 및 b)는 두 그래프로 이루어진다. 제 3a도는 레티노이드에 대한 투여량-반응을 설명하는 그래프이다. 제3b도는 형질 전환된(transfected) COS-1 세포의 사이토졸 추출물에 대한 레티노산 결합을 설명하는 막대 그래프이다.
제4도(a 및 b)는 인간의 게놈 DNA의 서던(Southern) 블로트 분석을 보여준다. 제 4a도는 엄격한 조건하에 융합되고 소화된 인간의 태반 DNA를 보여주며, 제 4b도는 엄격하지 않은 조건하에 융합된 동일한 DNA를 나타낸다.
제5도는 쥐 및 인간 조직에서의 레티노산 수용체 mRNA의 노던(Northern) 블로트 분석을 보여 준다.
제6도는 hGR, hRR 및 hT3Rβ의 비교를 나타내는 개괄도이다.
제7도는 일반화된 스테로이드/티로이드/레티노산 수용체 유전자의 개괄도이다.
제8도는 스테로이드 호르몬 수용체군(superfamily) 구성원들의 아미노산 비교를 나타내는 개괄도이다.
제9도는 키메릭 티로이드/글루코코르티코이드 수용체들의 구조 및 활성을 나타내는 개괄도이다.
[발명의 상세한 설명]
승인
본 발명은 국제 건강 연구소의 허가 하에 정부 지원으로 이루어진 것이다(허가 번호 GM 26444).
발명의 배경
본 발명은 주로 리간드 반응성 조절 단백질 및 이를 암호화하는 유전자에 관한 것이다. 보다 상세히, 본 발명은 레티노이드 관련 조절 단백질 및 이를 암호화하는 유전자, 재조합체 DNA 및 다른 유전 공학 기술에 의한 것들 및 다른 조절 단백질 및 유전자의 개질에 덧붙여, 개질 및 개질되지 않은 모든 레티노이드 관련 조절 단백질 및 유전자의 사용에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 리간드 반응성 단백질에 대한 기능 리간드를 확인하는 신규 방법에 관한 것이다. 이 방법은 새롭게 발견된 수용체 단백질에 대한 기능 리간드(들)를 확인하는데 특히 유용하다. 이 방법은, 비타민 A 관련 모르포겐(morphogen)인 레티노산이, 새롭게 발견된 레티노이드 수용체 단백질에 대한 기능 리간드라는 사실을 보여주므로써 부분적으로 예시된다.
[발명의 배경]
진핵 생물의 분자 생물학에서의 중심 문제는 호르몬 또는 성장 인자와 같은 외생 유도체에 반응하는 특이 유전자의 조절을 중재하는 메카니즘 및 분자의 설명으로 이어진다. 이런 메카니즘의 특이성에 대하여 알아야 할 것이 여전히 많이 남아 있기는 하나, 호르몬과 같은 외생 유도체가 HRE, 즉 호르몬 반응 요소로서 공지된 여러 DNA 및 세포 내 수용체를 포함하는, 세포 내 성분들과 함께 작용하므로써 유전자 전사를 중재한다는 것은 알려져 있다.
보다 상세히는, 글루코코르티코이드 및 티로이드 호르몬과 유사한 호르몬은 용이해진 확산에 의해 세포로 들어간다는 것이 알려져 있다. 그런 다음, 호르몬이 특이 수용체 단백질에 결합되므로써, 호르몬/수용체 복합체를 생성시킨다는 것 또한 공지되어 있다. 수용체에 대한 호르몬의 결합은 수용체 단백질의 알로스테릭(alosteric) 변형을 개시한다고 보고 있다. 이런 변형의 결과로서, 호르몬/수용체 복합체는 염색질 DNA상의 특정한 특이 부위에 대해 높은 친화력을 가지고 결합될 수 있다고 본다. 호르몬 반응 요소, 즉 HRE를 비롯하여 다양한 명칭으로 당 분야에서 언급되는 이런 부위들은 근처의 목적(target) 유전자 프로모터(promoters)의 발현(RNA의 전사)을 조절한다.
호르몬과 같은 외생 유도 물질에 의한 유전자 조절의 특성을 더 잘 이해하고자 하는데 있어서의 주요 장애로는, 수용체 단백질 등을 적절히 분석하고 특징화시키기에 충분할 만큼의 양과 순도에 있어서의 유용성의 부족이었다. 이와 같은 유용성의 부족은, 다양한 체액 및 조직 내의 외생 유도 물질(예컨대, 호르몬)의 존재를 확인하기 위한 진단 분석시 수용체를 사용하는 경우 뿐만 아니라, 키메릭(chimeric) 수용체 단백질 유사물을 조작하기 위한 원형(prototype)으로서의 사용에도 문제가 되고 있다.
수용체 단백질의 이런 유용성의 부족을 극복하기 위한 노력으로, 본 출원의 양수인인 더 솔크 인스티튜트 포오 바이오로지칼 스터디이즈로 양도되어 온, 동시 계류중인 출원 U.S.S.N. 제108,471호에는, 글루코코프티코이드-, 티로이드-, 미네랄로코르티코이드-, 및 신규 스테로이드 관련 수용체를 비롯한 다양한 수용체 단백질에 대해 클로닝시킨 유전자를 공개하고 있다. U.S.S.N. 제108,471호는 또한 수용체 단백질들이 각각의 DNA- 및 리간드- 결합 영역을 포함한다는 것을 보여주는 이러한 분자들의 자세한 생화학적 특징들을 공개하고 있다[U.S.S.N. 제108,471호의 일부는 글루코코르티코이드 수용체의 클로닝 및 이 분자의 각 영역으로의 특징화에 관련된 부분{홀렌베르그 일동(1985) 및 기구어 일동(1986)을 참조하라}; 및 수용체에 관한 기타 관련된 조작{홀렌베르그 일동., (1987), 그링 일동.,(1986), 그린 및 챔본,(1987), 쿠마르 일동.,(1987), 미에스펠드 일동.,(1987) 및 에반스(1988)}을 공개하고 있다].
또한, 수용체의 생화학적 특성화에 있어서는 인간의 글루코코르티코이드 수용체 유전자의 서열을 분석한 결과, 조류의 에리쓰로 블라스토시스 비루스(AEV)의 V-erb-A 종양 유전자의 생성물과 동종임을 알게 되었다(바인베르거 일동(1985)을 보라), 이 그룹 및 다른 그룹들은, 이어 V-erb-A의 세포유사물이 베타 티로이드 호르몬 수용체라고 설명하고 있다(바인베르거 일동(1986) 및 샙 일동(1986)을 보라).
스테로이드 및 티로이드 호르몬 수용체의 DNA-결합 영역이 매우 보존적이라는 발견은, 이러한 단편이 관련된 리간드 유도성 전사 요인을 진단할 수 있을지 여부에 대한 질문을 야기시켰다. 이는 또한 이런 영역들을 암호화하는 DNA 서열과 관련된, 그러나 신규한 리간드-반응성 수용체에 대한 게놈을 자세히 조사하기 위한 융합 프로브로써 이들이 사용될 수 있는지의 여부에 대한 질문도 야기시켰다. 이런 방법을 이용하여 솔크 연구소에서는 여러 신규 유전자 생성물을 확인했다. U.S.S.N. 제108,471호에서나타난 바와같이, 하나는 인간의 알도스테론 수용체이고(hMR, ATCC 번호 67201)(아리자 일동(1987)의 U.S.S.N. 제108,471호의 부분의 출판 번역문에 대한 것을 본다); 두번째는 쥐의 중앙 신경 시스템에서 높은 수준으로 발현되는 신규 티로이드 호르몬 수용체이다(톰슨 일동의 U.S.S.N. 제108,471호의 이 부분의 출판 번역문에 대한 것을 본다.).
상기 개시는, 스테로이드 및 티로이드 호르몬 수용체의 DNA-결합 및 리간드-결합 영역과 유사한 신규 레티노이드 수용체 단백질을 암호화하는, 클로닝된 완전한 길이의 cDNA의 분리 및 특성화를 기술하고 있다. 또한, 글루코코르티코이드, 미네랄로코르티코이드, 티로이드, 에스트로겐-관련 및 레티노산 수용체들 사이의 기능 영역을 스와핑(swapping)시키므로써 이루어지는 키메릭 수용체의 구성 및 특성화도 기술되어 있다. 이런 키메릭 수용체는 키메라(chimera) 안에 통합되는 모(parental) DNA-결합 및 리간드-결합 영역의 근원(origin)에 근거하여 혼성화 기능 특성을 갖는다. 예컨대, 키메릭 수용체 내 DNA-결합 영역이 레티노산 수용체 DNA-결합 영역이라면, (측, 야생형 레티노산 수용체로부터 얻거나 레티노산 DNA-결합 영역의 기능적 요소를 함유하는 돌연변이체인 경우) 키메라는 레티노산 수용체의 특징적인 DNA-결합 성질을 가질 것이다. 리간드-결합 영역에 대해서도 마찬가지이다. 키메릭 수용체 내 리간드-결합 영역이 티로이드 호르몬에 결합된다면, 티로이드 호르몬 수용체의 특징적인 리간드-결합 성질을 가질 것이다.
이 설명은 또한 리간드 반응성 수용체 단백질에 대한 기능 리간드를 확인하기 위한 신규 방법을 기술하고 있다. 이 방법은 (1) 레티노이드, 레니노 산 및 그 신진 대사 전구체, 그리고 레티놀이, 새롭게 발견된 수용체 단백질에 대한 기능 리간드이고, (2) DNA- 및 리간드-결합 영역이 키메릭 수용체의 기능 특성을 결정한다는 사실을 보여주므로써 설명되고 있다.
정의
본 명세서 및 청구범위에서, 다음과 같이 여기 사용하기 위해 명백하게 정의되는 분야의 구 및 용어들에 대해 언급이 있을 것이다.
여기 사용된 것처럼, 레티노이드란 일반 용어는 레티노산, 비타민 A(레티놀) 및 다양한 시스템에서 진화 및 분화에 심한 영향을 미칠 수 있는 일련의 천연 및 합성 유도체를 포함하는 화합물들의 한 군을 의미한다.
여기 사용된 것처럼, 종들은 다음과 같다. h : 인간, r : 쥐, m : 생쥐, c : 병아리 및 d : 드로조필리아 (Drosophilia).
여기 사용된 것처럼, 수용체의 스테로이드 호르몬 군이란 글루코코르티코이드, 미네랄로코르티코이드, 프로게스테론, 에스트로겐, 에스트로겐-관련, 비타민 D3, 티로이드, V-erb-A, 레티노산 및 E75(드로조필리아) 수용체로 구성된 관련 수용체의 부류를 언급하고 있다. 에반스(1988) 및 여기 인용된 참고물을 보라.
여기 사용된 것처럼, RR 및 RAR 둘다 레티노산 수용체를 의미한다. 약성어, hRR 및 hRAR은 인간의 레티노산 수용체를 의미한다. phRARα로서 언급된 DNA는 인간의 레티노산 수용체 알파에 대해 암호화한다. hRARα는 ATCC 번호 40392로서 기탁된 phRAR1에 의해 암호화된다. hRARβ로서 언급된 DNA는 인간의 레티노산 수용체 베타를 암호화한다. 브랜드 일동(1988)을 보라.
여기 언급된 것처럼, GR은 글루코코르티코이드 수용체를 의미한다. hGR로서 언급된 DNA는 인간의 글루코코르티코이드 수용체 GR에 대해 암호화한다. hGR은 ATCC 번호 67200으로서 기탁된 pRShGR에 의해 암호화된다.
여기사용된 것처럼, MR은 미네랄로코르티코이드 수용체를 의미한다. hMR로서 언급된 DNA는 인간의 미네랄로코르티코이드 수용체 MR에 대해 암호화한다. hMR은 ATCC 번호 67201로서 기탁된 pRShMR에 의해 암호화된다.
여기 사용된 것처럼, TR은 티로이드 수용체를 의미한다. TR 알파 및 TR 베타는 티로이드 수용체의 알파 및 베타 형태를 언급한다. DNA 들은 티로이드 수용체에 대한 모든 코드 c-erb-A, herb-A8.7. peA101, rbeA12 및 hFA 8로서 언급된다. 플라스미드 hperb-A8.7은 hTRα을 암호화하는데 이는 특허 목적을 위해 기탁되며 ATCC 번호 40374에 따른다. 플라스미드 peA101은 hTRβ를 암호화 하는데, 이는 특허 목적을 위해 기탁되며 ATCC 번호 67244를 따른다. 플라스미드 rbeA12는 rTRα를 암호화 하는 데 이는 특허 목적을 위해 기탁되며 ATCC 번호 67281을 따른다. 플라스미드 phFA8은 클론(즉, 수용체 단백질의 카르복시 말단 끝을 암호화 하는 DNA)의 리간드-결합 지역에서 결실을 갖는 hTRα의 부분적 클론을 암호화한다. 플라스미드 phFA8은 ATCC 번호 40372에 따른다.
여기 사용된 것처럼, ERR은 에스트로겐-관련 수용체를 의미한다. 약성어, hERR1 및 hERR2는 인간의 에스트로겐-관련 수용체 1 및 2를 언급한다. 이런 수용체들은 티로이드 수용체 보다 스테로이드 수용체에 더 관련되지만, 공지된 스테로이드 호르몬의 임의 주요 부류들에 결합하지 않는다(기구어 일동, 1988). hERR1은 각각 ATCC 번호 67309 및 67310에 따라 기탁된 플라스미드 pE4 및 pHK4에 의해 암호화된다(pE4 또는 pHK4 둘다 완전한 클론은 아니다. hERR1은 두 클론으로부터 단편들을 결합시켜 구성된다). hERR2는 ATCC 번호 40373에 따라 기탁된 플라스미드 phH3에 의해 암호화된다.
여기 사용된 것처럼, VDR은 비타민 D3수용체를 의미한다.
여기 사용된 것처럼, MTV는 유암 비루스를 의미하며, MMTV는 쥐의 유암 비루스를 의미한다.
여기 사용된 것처럼, RSV 라우스 사르코마(Roue sarcoma) 비루스를 의미하며, SV는 원숭이 비루스를 의미한다.
여기 사용된 것처럼, CAT는 클로로암페니콜 아세틸트랜스퍼라제를 의미한다.
여기 사용된 것처럼, 루시퍼라제는 개똥벌레 루시퍼라제를 의미한다. de Wet, I.R., 우드, K.V., 데루카, M., 헬린스키, D.R., 및 수브라마니, S., Mol, Cell, Biol. 7 : 725-735(1987)을 보라.
여기 사용된 것처럼, COS는 T항원(Tag)을 발현시키는 원숭이 신장세포를 의미한다. 글루쯔멘, 세포, 23 : 175(1981)을 보라. COS 세포는 본 발명의 기능 리간드 확인 분석에 유용한 수용체 결핍 세포이다.
여기 사용된 것처럼, CV-1은 CV-1으로서 언급된 세포주로부터의 쥐 신장 세포를 의미한다. CV-1은 COS의 모세포이다. SV4OT 항원(Tag)을 발현시키기 위해 형질전환된 COS 세포와는 달리, CV-1 세포는 T항원을 발현시키지 못한다. CV-1 세포는 본 발명의 기능 리간드 확인 분석에서 또한 유용한 수용체 결핍 세포이다.
여기 사용된 것처럼, 당분야의 일반 용어, 호르몬 반응 요소 즉, HRE, 전사 조절 단위, 호르몬 반응성 프로모터/향상물질 요소, 향상물질 유사 DNA 서열 및 전사 자극을 중재하는 DNA 서열 모두는 같은 것, 즉, 전사의 호르몬(또는 리간드)활성에 필요한 짧은 시스-작용 서열(약 20bp 크기)을 의미한다. 다른 호르몬-비반응성 유전자에 이런 요소들이 붙어 유전자가 호르몬 반응성이 되게 한다. 호르몬 반응 요소 또는 HRE로서 빈번히 언급되는 이런 서열들은 위치 및 배향에 무관한 형태로 기능한다. 다른 향상 물질과는 달리 HRE의 활성은 리간드의 존재 또는 부재에 따라 좌우된다(여기 인용된 참고물 및 에반스(1988)를 보라). 본 명세서 및 청구범위에서, 호르몬 반응 효소란 용어는 일반적인 의미로 이런 서열을 기술하기 위해, 당분야에서 사용된 모든 용어에 의해 함축된 기능적 특성을 의미하고 구체화하기 위해 사용된다.
여기 사용된 것처럼, 합성 HRE는 자동화된 뉴클레오티드 합성 기계를 사용하여 시험관 내에서 합성되는 HRE를 말한다. HRE는 불과 약 20bp의 크기이기 때문에, 이들은 이와 같은 방식으로 쉽게 합성된다. 야생형 또는 조작되거나 합성된 HRE가 호르몬비반응성 프로모터에 연결되면, 그 프로모터들은 호르몬 반응성이 된다. 여기 인용된 참고물 및 에반스(1988)를 본다.
여기 사용된 것처럼, 약성어 GRE는 클루코코르티코이드 반응 요소를 의미하고 TRE는 티로이드 수용체 반응 요소를 의미한다. CRE는 CR과의 상호 작용을 통해 클루코코르티코이드 반응성을 수여하는 호르몬 반응 요소들이다. 페이바르 일동의 세포, 35 : 381(1983) 및 쉬데라이트 일동의 내이쳐(Nature), 304 : 749(1983)를 보라. GRE는 그 DNA-결합 영역이 GRE와 기능적으로 결합될 수 있는(즉, 활성화될 수 있는), 임의의 야생형 또는 키메릭 수용체와 함께 사용될 수 있다. 예컨대, GR, MR 및 PR 수용체가 모두 GRE를 활성화시킬 수 있기 때문에, GRE는 GR, MR 또는 PR-형 DNA-결합 영역을 갖는 임의 야생형 또는 키메릭 수용체와 함께 사용될 수 있다. TRE는 TR과의 상호 작용을 통해 티로이드 호르몬 반응성을 수여하는 것을 제외하고는 CRE와 유사하다. TRE는 그 DNA-결합 영역이 TRE와 기능적으로 결합할 수 있는(즉, 활성화할 수 있는) 임의의 야생형 또는 키메릭 수용체와 사용될 수 있다. TR 및 RR 수용체 둘다 TRE를 활성화시킬 수 있으므로, TRE는 TR 또는 RR-형 DNA-결합 영역을 갖는 임의 수용체와 함께 사용될 수 있다.
여기 사용된 것처럼, 리간드는 호르몬 또는 성장 인자와 같은 유도 물질을 의미한다. 세포 내에서 리간드는 수용체 단백질에 결합하므로써 리간드/수용체 복합체를 생성시키고, 그 다음에 적합한 호르몬 반응 요소에 결합할 수 있다. 하나의 리간드는 여러개의 수용체를 가질 수 있다. 예컨대. T3Rα 및 T3Rβ 둘다 T3과 같은 티로이드 호르몬에 결합한다.
여기서 사용된 것처럼, 리간드-반응성 프로모터에 기능적으로 연결된 조작적 호르몬 반응 요소 및 조작적 리포터(report) 유전자란 구에서, 조작적이란 단어는 각 DNA 서열들(호르몬 반응 요소, 리간드-반응성 프로모터 및 리포터 유전자라는 용어에 의해 표현됨)이 조작 가능하다는 사실, 즉, 호르몬 반응 요소가 수용체 단백질(야생형 또는 키메릭)의 DNA-결합 영역에 결합할 수 있고, 리간드-반응성 프로모터가 리포터 유전자의 전사를 조절할 수 있으며(HRE/수용체 단백질/리간드 복합체에 의한 적절한 활성화에 따라), 리포터 유전자가 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다는 사실을 의미한다.
기능적으로 연결된이란 구는, DNA 단편들이 결합될 때, 적절한 활성화에 따라 리포터 유전자(예컨대, CAT 또는 루시페라제)가 발현될 것이라는 사실을 의미한다. 이러한 발현은, 리간드 반응성 프로모터{호르몬 반응 요소로부터 다운스트림(downstream)이고, HRE가 적절한 리간드/수용체 단백질 복합체에 결합되는 경우 활성화되며, 그 후 결국 리포터 유전자의 전사를 조절하는 것}가 작동하거나, 또는 리간드/수용체 단백질 복합체가 호르몬 반응성 요소에 결합하므로써 활성화되었다는 사실의 결과로서 일어나는 것이다.
여기 사용된 것처럼, 수용체의 DNA-결합 영역은 크로마틴 DNA 상의 HRE 부위에 결합하는 수용체 단백질들(예컨대 글루코코르티코이드 수용체, 티로이드 수용체, 미네랄로코르티코이드 수용체, 에스트로겐 관련 수용체 및 레티노산 수용체)의 부분을 의미하는 것이다. 이러한 DNA-결합 영역에 대한 경계가 스테로이드 호르몬 군에 대해 확인되고 특징지워졌다. 제8도를 보라; 기구어 일동., (1986); 홀렌베르그 일동., (1987); 그린 및 챔본(1987); 그리고 미에스피리드 일동., (1987), 에반스(1988)를 또한 보라.
다양한 스테로이드 호르몬 군 수용체에 대한 DNA-결합 영역의 경계는 제8도에 나타나 있다; 경계선은 다음과 같다:
-hGR(pRShGR) : 뉴클레오티드 1393-1590 아미노산 421-486 (ATCC #67200을 볼 것)
-hTRb(peA101) : 뉴클레오티드 604-807 아미노산 102-169 (ATCC #67244를 볼 것)
-hTRa(pherb-A8.7) : 뉴클레오티드 168-372 아미노산 50-117 (ATCC #40374를 볼 것)
아미노산 291-358 (ATCC #67281을 볼 것)
-ERR1(pE4 pHKA) : 아미노산 176-241 (ATCC #67309 #67310을 볼 것)
-ERR2(phH3) : 아미노산 103-168 (ATCC #40373을 볼 것)
-hMR(pRShMR) : 뉴클레오티도 2020-2226 아미노산 603-668 (ATCC #67201을 볼 것)
-hRARa(phRAR1) : 뉴클레오티드 364-561 아미노산 88-153 (ATCC #40392를 볼 것)
스테로이드 호르몬 수용체 군의 DNA-결합 영역은 66-88개 아미노산 길이 사이에서 변화하는 아미노 단편으로 이루어진다. 이 단편은 9개 시스테인 잔기를 함유하며, 이중 하나는 단편의 첫번째 아미노산이다. 이 첫 번째 Cys 잔기는 X가 임의의 아미노산 잔기인 Cys-X2-C-X13-15-X2-Cys로서 기술된 특색을 가지고 시작된다. DNA-결합 영역은 아미노산 Gly-Met로 변함없이 끝난다.
클로닝 절차에서 편의를 위해, DNA-결합 영역에 앞서고(/거나) 뒤따르는 1-6개의 아미노산들은 DNA-결합 영역에 따라 바뀔 수 있다.
여기 사용된 것처럼, 수용체의 리간드-결합 영역이란 구는 성장 인자 또는 호르몬과 같은 리간드에 결합하는 수용체 단백질의 부분을 말한다. 스테로이드 수용체 군에 대한 이와 같은 리간드-결합 영역의 경계가 확인되고 특징지워져 왔다. 제8도 및 에반스(1988)를 보라
다양한 수용체에 대한 리간드-결합 영역이 제8도에 나타나 있다; 이런 몇몇 영역은 다음과 같다.
-hGR(pRShGR) : 아미노산 528-777 (ATCC #67200을 볼 것)
-hTRb(peA101) : 아미노산 232-456 (ATCC #67244를 볼 것)
-hTRa(pherb-A8.7) : 아미노산 183-410 (ATCC #40374를 볼 것)
-rTR(rbeA12) : 아미노산 421-639 (ATCC #67281을 볼 것)
-ERR1(pE4 pHKA) : 아미노산 295-521 (ATCC #67309를 볼 것)
-ERR2(phH3) : 아미노산 212-433 (ATCC #40373을 볼 것)
-hMR(pRShMR) : 아미노산 734-984 (ATCC #67201을 볼 것)
-hRARa(phRAR1) : 아미노산 198-462 (ATCC #40392를 볼 것)
수용체 사이의 기능 영역을 교환시키기 위해 공통 제한 엔도뉴클레아제 부위가 수용체 cDNA 클론 내로 도입되어야만 한다. 제8도에서 언급한 임의 다양한 수용체에 있어서, 첫번째 공통 부위는 DNA-결합 영역의 바로 앞에 도입될 수 있으며, 두번째 공통 부위는 바로 그 뒤에 도입될 수 있다. 예컨대, 제8도에서 보여준 수용체의 임의 스테로이드 호르몬 군에 있어서, 유일한 Not I 부위가 DNA-결합 영역 바로 앞에 도입될 수 있고, 유일한 Xho I 부위는 바로 그 뒤에 도입될 수 있다. 이는 수용체를 세 기능 지역 또는 카세트(casettes), 즉; (1) N-말단 카세트, (2) DNA-결합 영역 카세트 및 (3) 리간드-결합 영역 카세트로 나뉘게 한다. 임의 하나의 수용체로부터의 세 영역 또는 카세트는 다양한 키메릭 수용체를 생성시키기 위해 다른 수용체로부터 카세트와 조합될 수 있다.
여기서 사용된 것처럼, 키메릭 수용체를 확인하기 위해 사용된 명명법은 다음과 같다 : 다양한 기능 영역들(N-말단, DNA-결합 및 리간드-결합)은 이들이 유래되는 모 수용체에 따라 확인된다. 예컨대, GR로부터의 영역은 G 영역이고, TR 영역은 T 영역이고(Ts 또는 Tb 영역으로서 달리 특정화되지 않는 한); NR 영역은 N 영역이고, RAR 영역은 R 영역이고( Ra 또는 Rb 영역으로서 달리 특정화 되지 않는 한); ERR 영역은 E 영역이다(E1또는 N2영역으로 달리 특정화되지 않는 한). 이런 표현에 따라, 달리 특정화되지 않는 한, T는 일반적으로 T3Rα 또는 TR3β 수용체 중 하나를 의미하기 위해 사용되고, E는 hERR1 또는 hERR2 중 하나를 의미하며, R은 RARα 또는 RARβ 수용체 중 하나를 의미한다. 야생형 수용체는 임의 교환된 영역을 함유하지 않으므로, 이런 표현에 따라 시스템은 G-G-G(또는 GGG), Ta-Ta-Ta(또는 TaTaTa), Tb-Tb-Tb(또는 TbTbTb), M-M-M (또는 MMM), Ra-Ra-Ra(또는 RaRaRa), Rb-Rb-Rb(또는 RbRbRb), E1-E1-E1또는 E2-E2-E2로서 확인될 것이며, 여기서 기록된 첫번째 영역은 N-말단 영역이고, 중간 영역은 DNA-결합 영역이고, 마지막 영역은 리간드-결합 영역이다. 임의 키메릭 수용체는 적어도 두 야생형 또는 모급원으로 부터 기능 영역을 가질 것이다. 예컨대 키메릭 수용체 GGRa는 글루코코르티코이드 수용체로부터 N-말단 및 DNA-결합 영역을 가지며, 알파레티노산 수용체로부터 리간드-결합 영역을 가질 것이고, GTaRb는 글루코코르티코이드로부터 N-말단, 티로이드 수용체 알파로부터 DNA-결합 영역 및 레티노산 수용체 베타로부터 리간드-결합 영역을 가질 것이다.
여기 사용된 것처럼, hGRnx, hTRβnx및 hRRnx는 이런 수용체 내 DNA-결합 영역에 대한 경계에 접하는 Not I 및 Xho I에 대한 유일한 부위를 함유하도록 조작된 hGR, hTRβ 및 hRR 수용체를 말한다. 이런 돌연변이 주 수용체는 hGR, hMR, hERR1, hERR2, hTRα, hTRβ, rTRα, hTRα, hRARα및 hRARβ로부터의 아미노 말단부, DNA-결합 영역 및 리간드-결합 영역의 모든 가능한 조합으로 구성되는 잡종 수용체의 구성을 예시해 준다.
여기 사용된 것처럼, 서던 블로트 분석은, 변성된(denatured) DNA를 아가로스 젤로부터 상보적 핵산에 의해 융합될 수 있는 니트로셀룰로스 여과로 이동시키는 절차를 말한다.
여기 사용된 것처럼, 노던 블로트 분석은 RNA를 아가로스 젤로부터 상보적 DNA에 의해 융합될 수 있는 니트로 셀룰로스 여과기로 이동시키는 기술을 말한다.
여기 사용된 것처럼, 본 발명의 돌연변이는 야생형 또는 개질되지 않은 서열과는 다르도록 유전학적으로 조작된 DNA를 말한다. 이런 유전적 조작은 야생형 서열을 신규 뉴클레오티드에 삽입하거나. 야생형 서열로부터 뉴클레오티드를 결실시키거나, 야생형 서열 내에서 뉴클레오티드를 치환, 또는 하나의 수용체로부터 다른 수용체로의 기능 영역의 스와핑을 포함할 수 있다. 한 수용체로부터 다른 수용체로 기능 영역을 스와핑시켜 조작된 수용체는 키메릭 또는 잡종 수용체로서 언급된다. 키메릭 수용체는 신규 뉴클레오티드, 뉴클레오티드의 결실, 뉴클레오티드의 치환들을 포함하도록 또한 조작될 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서의 서열의 실질적 동종성이란 용어의 사용은, 여기에서 공개되고 청구된 실제 서열로부터 약간의, 또는 결정적인 것이 아닌 서열의 변화를 가지는 DNA, RNA 또는 아미노산 서열이, 첨부된 청구범위의 영역에 들어가도록 하기 위한 것을 뜻한다. 이런 점에 있어서, 약간의, 또는 결정적이 것이 아닌 서열의 변화란, 그러한 동종성을 가지는 서열이, 여기 공개되고 첨부된 핵산 및 아미노산 조성물과 본질적으로 같은 조성물을 생산하도록, 실질적으로 같은 방식으로 기능할 것이라는 사실을 의미한다.
여기 사용된 것처럼, 재조합체적으로 생산된이란 용어는 단순히 자연으로부터 정제된 것이 아니라, 유전자 조작 기술을 사용하여 만들어진 것을 의미한다.
여기에서 나타나는 다양한 아미노산 서열로 구성되는 아미노산들은 하기 3-문자 또는 1-문자 약어에 따라 확인될 수 있다.
Figure kpo00001
여기에서 나타난 다양한 뉴클레오티드 서열로 구성된 뉴클레오티드는 당 분야에서 통상적으로 사용되는 일반적인 단일 문자 표현(A,C,T,C 또는 U)을 갖는다.
여기에서 사용된 것처럼, bp는 염기 쌍을 의미하며 Kb는 킬로염기 쌍을 의미한다.
본 명세서 및 청구범위에서, 그리스 문자 알파(α), 베타(β)등은 때때로 a,b 등을 말한다.
기탁
대장균 HB101 내에 있는 플라스미드 pRShGr(hGR), pRShMR(hMR), peA101(hTβ) 및 GMCAT와 E. 콜리 HB101 및 플라스미드 rebA12(rTRα), pE및 hpKA(함께 hErr1을 암호화 함), phH(hERR2), pherb-A 8.7(hTRα), phFA 8(hTR의 부분 클론) 및 플라스미드 phRAR1은 특허 절차의 목적을 위한 미생물 기탁의 국제적 인식에 대한 부다페스트 조약 및 조약 하에 공표된 규정 하에 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(American type Culturo Collection)(미합중국, 메릴랜드주, 록크빌시)(ATCC)에 기탁되어 있다. 플라스미드 샘풀은 상기 조약 및 규정 하에, 또는 본 특허, 또는 본 출원에 대한 우선권을 주장한 출원이 출원되었거나, 이러한 출원 상에 임의의 특허가 부여된 미합중국 및 모든 다른 나라 또는 국제기관들의 특허법 및 규정에 따라, 이들을 받을 권한이 법적으로 주어진 산업 재산권 관련 관청(특허청) 및 개인에게 구입 가능하거나 가능할 것이다.
기탁물에 대한 ATCC 기탁 번호 및 기탁 날짜는 다음과 같다:
Figure kpo00002
[발명의 요약]
한 측면에서, 본 발명은 플러스(plus), 즉 센스(sense) 스트랜드가 여기서 인간의 레티노산 수용체 단백질로서 언급되는 레티노이드 수용체 단백질의 특징적인 리간드-결합 및 DNA-결합 (또는 전사-활성화) 성질을 갖는 단백질의 일차 서열을 암호화하는 트리플리트(triplets) 서열을 포함하는 것인 이중-스트랜드 DNA 단편을 포함한다. 본 발명의 이런 측면에 따라, 이중-스트랜드 DNA 단편은 레티노산 수용체 단백질로 발현될 수 있는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 레티노산 수용체 단백질을 암호화하는 이중-스트랜드 DNA의 센스 스트렌드인, 단일-스트랜드 DNA 및 이런 이중-스트랜드 DNA의 전사에 의해 만들어진 RNA로 구성된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 레티노산 수용체 단백질을 암호화하는 DNA(RARα)를 함유하는 플라스미드, phRAR1으로 구성된다. 이 플라스미드는 특허 목적을 위해 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었으며, ATCC 번호는 40392이다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 레티노산 수용체 단백질을 암호화하는 DNA를 사용하여 형질전환된 세포, 바람직하게는 포유 동물 세포로 구성된다. 본 발명의 이런 측면에 따라, 형질전환 DNA가 세포 안에서 발현되므로, 세포 내에서 이 DNA에 의하여 암호화된 레티노산 수용체의 양을 증가시킬 수 있게 된다.
또한 본 발명은 레티노산 수용체를 암호화하는 DNA의 발현 또는 이런 레티노산 수용체 암호화 DNA로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 제조된 신규 레티노산 수용체로 구성된다. 본 발명의 이런 측면에 따라, 레티노산 수용체는 개질되지 않은 레티노산 암호화 DNA 및 mRNA의 단백질 생성물이거나, 수용체 DNA서열 내에 조작된 돌연변이의 결과로서, 자연적으로 발생하는 야생형 레티노산 수용체 단백질로부터 아미노산 서열에 있어 하나 이상의 차이점을 가질, 개질되거나 유전학적으로 조작된 레티노산 수용체 단백질일 것이다. 바람직하게는 개질되지 않았거나, 조작되었거나 간에 이러한 레티노산 수용체는 자연적으로 발생하는 레티노산 수용체의 적어도 약 5%의 레티노산 결합 활성 및 또는 적어도 약 5%의 DNA-결합 또는 전사-활성화 특성을 가질 것이다.
게다가, 본 발명은 한 수용체의 기능 영역을 또 다른 형태의 기능 영역으로 교체시키므로써 만들어진 키메릭 수용체로 구성된다. 이렇게 생성된 키메릭 DNA는 그 각각의 DNA- 및 리간드-결합 영역의 근원(origin)을 기준으로 기능적 특성을 갖는 키메릭 수용체 단백질을 암호화한다. 본 발명의 키메릭 수용체는 키메릭 수용체를 암호화하는 이중-스트랜드 DNA뿐만 아니라, 이중-스트랜드 DNA의 센스스트랜드인 단일-스트랜드 DNA 및 이중-스트랜드 DNA의 전사에 의해 만들어진 mRNA를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 키메릭 수용체 암호화 DNA로써 형질전환된 세포들, 즉, 진핵 및 원핵 세포들로 구성된다.
본 발명은 키메릭 수용체 측면에 따라, 키메릭 DNA를 융합시키기 위해 수용체 DNA를 세 기능 영역 또는 지역으로 나누기 위한 두 제한 엔도뉴클레아제 부위를 DNA-결합 영역 내 또는 근처의 비교가능한 위치에서 각 수용체 cDNA로 도입한다.(예컨대, 유일한 Nox I 부위는 DNA-결합 영역 바로 앞서 도입될 수 있고, 유일한 Xho I 부위는 바로 뒤따라 도입될 수 있다. 이는 수용체를 세 기능 영역 또는 카세트; (1) N-말단 카세트, (2) DNA-결합 영역 카세트 및 (3) 리간드-결합 영역 카세트로 나누게 된다. 임의의 한 수용체로부터의 세 영역 또는 카세트는 다양한 키메릭 수용체를 생성시키기 위해 다른 수용체들로부터의 카세트와 조합될 수 있다. 본 발명은 이런 측면은 본 발명의 상세한 설명이라 표지화된 명세서 부분에서 설명된다.)
본 명세서 및 청구범위에서, 키메릭 수용체(또한 키메라 또는 잡종으로 언급됨)는 다양한 영역의 근원을 언급하는 문자에 의해 일컬어진다. hGR로부터의 영역은 G 영역이라 하고, hTR로부터의 영역은 T 영역이라고 하고, hERR로부터의 영역은 E이고, hRR로부터의 영역은 R 영역이다.
예컨대, 키메릭 수용체 RGR은 hRR의 아미노 및 카르복실 말단 및 hGR의 DNA-결합 영역을 가지며, 키메릭 수용체 TGG는 hTR로부터의 아미노 말단 및 hGR로부터의 DNA-결합 및 카르복실 말단을 갖는다.(제7도에서 보여준 도표에서, 수용체의 아미노 말단은 영역 A/B로 언급되며 카르복실 말단은 영역 E로서 언급된다.)
달리 특정화되지 않는 한, 명세서 및 청구 범위에서 사용된 표시에 따라, T는 TR또는 TR수용체 중 하나를 의미하기 위해 유전학적으로 사용되고, E는 hERR1 또는 hERR2중 하나를 의미하며, R은 RAR또는 RAR수용체 중 하나를 의미한다.
본 발명의 키메릭 수용체는 (1) hCR, hMR, hERR, hERR, rTR, hT, hRARα 및 hRAR로 이루어진 야생형 수용체 군으로부터 선택된 N-말단 영역, (2) hGR, hMR, hERR, hERR, rTR, hT, hT, hRAR및 hRAR로 이루어진 야생형 수용체군으로부터 선택된 DNA-결합 영역 및 (3) hGR, hMR, hERR, hERR, rTR, hT , hT , hRAR 및 hRAR 로 이루어진 군으로부터 선택된 리간드-결합 영역을 갖는 키메라를 포함하며, 여기서 임의 하나의 키메릭 수용체는 적어도 두 다른 야생형 수용체 급원으로부터 유례되는 N-마단, DNA-결합 및 리간드-결합 영역을 가질 것이다.
본 발명은 바람직한 키메릭 수용체 DNA는 GRR, GRG, GGR, RGG, RGR, RRG, GTT, GTG, GGT, TGG, TGT, TTG, TTR, TRT, TRR, RTT, RTR, RRT 수용체 DNA와 이런 키메릭 수용체 암화 DNA로부터 전사된 mRNA의 번역에 의한 본 발명의 키메릭 DNA의 발현에 의해 만들어진 키메릭 잡종 수용체 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 이런 키메릭 수용체는 임의의 주어진 세포 내에서, 외생의 백그라운드(background) 결합 또는 전사적 활성화 작용 수준을 능가하는 활성을 갖거나, 또는 자연적으로 발생하는 수용체 DNA-결합 영역의 적어도 약 %의 DNA-결합 또는 전사-활성화 작용 및 또는, 자연적으로 발생하는 리간드-결합 영역의 약 5%의 리간드-결합작용을 가질 것이다.
본 발명은 또한 수용체 단백질에 대한 기능 리간드(들)를 확인하는 방법으로 구성된다. 이 방법에 따라, 수용체 단백질을 암호화하고, 리간드-결합 영역 및 DNA-결합 영역의 적어도 조작적 부분을 갖는 DNA서열(여기서 샘플 서열로서 언급됨)을 분리할 수 있다(당업자들이 인식할 것처럼, 리간드-결합 영역 내 DNA서열 모두가 그 영역을 기능적으로 되게 하는데 필요한 것은 아니다. 조작적 서열, 즉, 영역이 리간드를 결합시키기 위해 존재해야만 하는 것은 임의 주어진 영역 상의 결실 연구에 의해 확인될 수 있다). 일단 샘플 DNA서열이 분리되면, 키메릭 유전자는 샘풀 DNA서열 내 DNA-결합 영역 부분을 또다른 수용체 단백질, 예컨대, 글루코코르티코이드 수용체 단백질, 티로이드 수용체 단백질, 메노랄로코르티코이드 수용체 단백질 또는 레티노산 수용체 단백질을 암호화하는 DNA서열로부터 취해진 DNA-결합 영역 부분으로 치환시켜 생성시킬 수 있다.
다음에, 적합한 수용체 결핍 숙주 세포를, (1) 바람직하게는, 발현 플라스미드 상에 운반되는 키메릭 수용체 유전자 및 (2) 또한, 바람직하게는 플라스미드 상에서 운반되고, 리포터 플라스미드로서 U.S.S.N. 제108,471호에 언급되는, CAT 유전자 또는 개똥벌레 루시퍼라제 유전자와 같은 리포터 유전자로서 형질전환시킨다. 어떤 경우에 있어서건, 리포터 유전자는 작용적 호르몬 반응 요소(HRE)(야생형이든 조작된 것이건)에 기능적으로 연결되어야 하는데, 여기서 호르몬 반응 요소는 키메릭 수용체 유전자를 만드는데 사용된 DNA-결합 영역에 의하여 활성화되게 된다(예컨대, 키메릭 수용체 유전자가 글루코코르티코이드 수용체 암호화 DNA로부터의 DNA-결합 영역 부분을 함유한다면, HRE는 야생형, 조작된 것, 또는 합성의 GRE로서, 글루코코르티코이드 수용체 단백질의 DNA-결합 지역의 조작 부분에 의해 활성화 될 수 있는 것이어야만 한다. 티로이드 수용체 DNA-결합 영역 부분이 사용된다면, 야생형 또는 조작된 HRE는 티로이드(또는 레티노산) 수용체 단백질에 반응성이어야 한다는 것 등이다. 그후 형질 전환된 숙주 세포는 키메릭 유전자에 의해 암호화된 키메릭 단백질의 리간드-결합 영역 부분과 잠재적으로 결합할 수 있는 일련의 후보 리간드와 경쟁된다. 이런 리간드들 중 어느 것이 키메릭 수용체 단백질과 기능적으로 복합될 수 있는가를 결정하기 위한 리포터 유전자의 도입은, 리포터 유전자에 의해 암호화된 단백질의 단백질 수준의 변화를 모니터하므로써 조사된다(예컨대, 루시페라제가 리포터 유전자라면, 루시페라제의 생산은 리포터로서 조절된 유전자의 전자를 지적하는 것이다). 결국, 리간드(들)가 리포터 유전자의 전사를 유도할 수 있다고 알려질 때, 이런 리간드(들)는 초기 샘플 DNA서열에 의해 암호화된 수용체 단백질에 결합할 수 있는 것이다. 이런 결론은 리포터 유전자의 발현을 유도하는 리간드에 대응하는 초기 샘플 DNA서열에 의하여 암호화 된 수용체 단백질의 결합성질을 시험하므로써 더욱 실증될 수 있다.
당업자들이 인식한 것처럼, 세포가 이미 (a) 제2수용체 서열(즉, 제2서열)의 리간드-결합 영역의 조작 부분 (2)에 연결된 제1수용체 서열(즉, 제1서열)의 DNA-결합 영역의 조작 부분 (1)을 포함하여 구성된 키메릭 DNA서열 (C)와 (b) 제1수용체 서열의 DNA-결합 영역의 조작 부분이, 리포터 서열에 기능적으로 연결된 호로몬 반응 요소에 기능적으로 결합하므로써, 활성화되는 조작적 호르몬 반응 요소에 기능적으로 연결된 리포터 핵산 서열을 함유한다면, 수용체 단백질에 대한 기능 리간드를 확인하는 방법은, 세포를 적어도 하나의 후보 리간드와 경쟁시킨 다음 리포터 서열의 발현 생성물의 양에 있어서의 변화로부터 리포터 서열의 유도를 조사하는 것으로 구성될 것이다.
신규의 기능적 리간드 확인 분석은 수용체가 야생형이든지 또는 키메릭 수용체이든지의 여부에 상관이 없이, 많은 수의 잠재적 리간드 또는 임의 주어진 수용체들을 스크리닝하는 것을 가능하게 해준다.
기능적 리간드 확인 방법은 (1) 레티노이드, 레티노산 및 그 신진대사 전구체 및 레티놀이, phRAR1 DNA에 의해 암호화된 수용체 단백질에 대한 기능적 리간드라는 사실 및 (2) DNA- 및 리간드-결합영역이 키메릭 수용체의 기능 특성을 결정한다는 사실을 보여주므로써, 여기에서 예증된다.
신규의 기능적 분석 뿐만 아니라 신규 레티노산 수용체 및 신규 키메릭 수용체는 하기에서 보다 충분히 기술된다.
[발명의 설명]
레티노산 수용체
스테로이드 호르몬 수용체 군을 탐구하려는 계속적인 노력에 있어서, 스테로이드 호르몬 수용체의 DNA-결합 영역과 현저하게 유사한 신규 게놈서열을 뜻밖에 확인하는 소득을 얻었다(데제안 일동, 1986년). 이 서열은 인간의 간세포 종양으로부터 간염 비루스(HBV)의 통합 부위에 걸쳐 있다.
이런 유전자가 전에 공지되지 않은 수용체를 암호화할 수 있다는 가정을 추적하기 위해, 이런 서열로부터 유도된 올리고뉴클레오티드는 다수의 인간 cDNA 라이브러리(Libraries)를 면밀히 조사하기 위해 표지화되고 사용되었다. 5개의 양성적 클론이 고환의 cDNA 라이브러리로부터 초기에 분리된다. 이런 클론들 중 하나(1hTIR)로부터의 삽입물이 λgt10 신장 cDNA 라이브러리로부터 부가적인 cDNA 클론을 분리시키는데 사용되었다. 가장 큰 클론(phRAR1)의 제한 지도가 제1a도에 나타나 있다. 뉴클레오티드 서열 분석은 제1b-1도에서 보여준 뉴클레오티드 103-105에 상당하는 추정의 개시 암호 메티오닌 코돈으로 시작하는 462개 아미노산의 긴 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 나타낸다. 이와 같은 ATG를 둘러싼 서열은 번역 개시 부위에 대한 코자크(1987)에 의해 기술된 콘센서스(Consensus)와 일치한다. ATG의 업스트림(upstream)은 개시암호 메티오닌에 대한 지지체를 제공하는 프레임 내 종결 암호이다. 30개 코돈 다운스트림을 발견한 또 다른 메티오닌은 일치를 확인하지 못했으며 개시 암호일 것 같지 않다. 위치 1489-1491에서의 종결 코돈 다음으로는 폴리아데닐화된 트랙의 20개 뉴클레오티드 업스트림에서 발견된 콘센서스 폴리아데닐화 신호(AATAAA)를 가지는 3'-의 번역되지 않는 부분이다(프라우드푸트 일동, 1976).
상대 분자량 50,772d(51kd)의 폴리펩티드는 번역되는 오픈 리딩 프레임 내에서 암호화된다. phRAR1의 삽입물에 의해 암호화된 단백질의 크기는 이런 삽입물로부터 유도된 RNA의 시험관 내 번역에 의해 확증되며(크리그 일동, (1984)), 54kd(나타나지 않은 자료)의 예측된 크기에 일치한다고 밝혀졌다. 이런 단백질의 아미노산 서열은 글루코코르티코이드 및 티로이드 호르몬 수용체와 비교된다. 가장 높은 정도의 유사성은 잔기 88에서 시작하는 66개 아미노산의 시스테인이 풍부한 서열에서 발견된다. hGR의 이러한 영역이 이와 같은 수용체에 대한 DNA-결합 영역을 나타낸다는 사실은 이미 설명되어 왔다. 기구어 일동(1987) 및 홀렌베르그 일동(1987)을 보라. 또한, 돌연변이 발생 및 발현 연구는 글루코코르티코이드 반응 요소(GREs)가 잠복해 있는 유전자의 전사적 활성에 있어서의 역할에 대한 직접적인 증거를 제공해 왔다. 기구어 일동(1987) 및 홀렌베르그 일동(1987)을 본다.
[영역 스위칭 및 전사적 활성]
phRAR1의 유전자 생성물에 대한 리간드가 공지되지 않았기 때문에, 그 정체를 밝히기 위한 빠르고 민감한 분석을 전개시키는 것이 바람직하다. 종전의 연구는 인간의 글루코코르티코이드 및 에스트로겐 수용체의 DNA-결합 영역은 기능적 융합 수용체를 얻기 위하여 상호 교환될 수 있다는 사실을 예증해왔다. 이런 키메라는 MMTV-LTR의 글루코코르티코이드 반응성 요소를 인식하지만 에스트로겐-의존 방식으로 전사를 촉진한다(그린 일동, (1987)). 이는 일반적인 영역-스와핑 기술이 신규 호르몬 수용체의 리간드-결합 성질을 확인하기 위해 개발될 수 있을지에 대하여 생각하게 했다. 이러한 접근을 시도하기 위해서, 우리는 맨 먼저 phRAR1 유전자 생성물의 DNA-결합 영역을 잘 기술된 hGR의 DNA-결합 영역을 치환시켰다.(제2a도).
이 키메릭 구성은 적합한 숙주 세포 안에서 발현되는 경우, 그 리간드-결합 영역 부분이 리간드/수용체 복합체가 GRE에 결합하기 전에 기능적 외생 리간드와 결합해야만 하는 융합 수용체 단백질을 생성하고, 그에 따라 글루코코르티코이드 유도성 프로모터를 활성화시키게 된다.
기능적 리간드의 존재를 분석하기 위하여, 키메릭 수용체 유전자는 GRE가 연결된 적절한 리포터 유전자와 함께 적합한 숙주 세포 내로 형질전환 된다. 분석을 위해 MMTV-CAT 리포터 유전자와 함께 CV-1 세포를 사용하였다. (MMTV-CAT는 리포터 플라스미드로서 GMCAT 상에서 운반되고, 이는 특허 목적을 위해 아메리칸 타입 컬쳐콜렉션에 기탁되었다 : 기탁이라 표지화된 본 명세서의 부분을 보라.) 당업자들이 인식할 것처럼, 혼성 티로이드 수용체 단백질, 즉 티로이드 수용체 단백질의 DNA-결합 영역을 갖는 혼성 단백질을 분석하는데 적합한 리포터 플라스미드는 플라스미드 GM-CAT 상의 GRE를 티로이드 호르몬 반응성 전사 요소로 치환시키므로써 구성될 수 있다. 예컨대, 성장 호르몬 프로모터는 세균 CAT 유전자에 기능적으로 연결될 수 있다. 성장 호르몬 프로모터는 티로이드 반응성 전사요소를 함유하기 때문에, 이런 리포터 플라스미드는 혼성 티로이드 수용체 단백질을 분석하는데 사용될 수 있다. 본 명세서의 부제 : 리포터 및 발현 플라스키드의 구성을 보라.(미네랄로코프티코이드 수용체는 GRE를 활성화시킬 수 있기 때문에, GM-CAT와 같은 리포터 플라스미드는 혼성 미네랄로 코르티코이드 수용체 단백질을 분석하는데 사용될 수 있다.)
기능적 리간드 확인 분석으로 되돌아가서, 형질전환된 세포를 일련의 후보 리간드로써 체계적으로 경쟁시켰으며, CAT 활성에 있어서의 변화에 의해 유도를 모니터하였다.
호르몬과 유사한 활성 때문에, 레티놀(비타민 A) 및 레티노산을 포함하는 레티노이드는 잠재적 유도 물질로서 평가된다. 레티노산이 현저하게 혼성 수용체의 CAT 활성의 극적 증가를 유발시킨다(제2b도). 여기서, 야생형 유전자 생성물 또는 pRShRRnx, 그리고 모 벡터를 사용함에 의해서도, 인간의 레티노산 수용체(hRARα)로서 언급되는 phRAR1으로부터의 CAT 활성에는 어떠한 영향도 미치지 않음을 알 수 있었다. 예측한 바와 같이, 혼성수용체는 글루코코프티코이드에 의해 유도되지 않으며, hGR은 레티노산에 의해 유도되지 않는다.
제3a도에서 보는 바와 같이, 레티노산은 혼성 수용체에 의해 유도된 CAT 활성에 대해 6×10 M의 ED값을 나타내며, 이는 다양한 생물학적 분석에서 레티노산에 대해 관찰된 ED값과 일치한다(스폰 및 로버트, 1984). 레티놀은 100nM 보다 큰 ED값을 갖는 약한 작용 물질로서 기능한다. 레티닐 아세테이트 및 레티닐 팔리테이트는 훨씬 더 약한 유도 물질로서 기능한다. 테스토스테론, 디히도로테스토스테론, 에스트로겐, 덱사메타손, 코르티졸, 알도스테론, 프로게스테론, TT비타민 D및 25-OH-콜레스테롤을 포함하는 다수의 중성 및 합성 리간드는 CAT 활성을 유도하지 못했다.
레티노산 수용체로서 phRAR1 유전자 생성물의 정체를 확인하기 위해서, 발현된 생성물의 결합 성질은 COS-1 세포의 형질전환에 따라 평가된다. 제3b도에서 보는 바와 같이, 형질전환된 세포는 H-레티노산과 특이하게 결합하기 위한 증가된 능력을 나타낸다. 이런 증가는 세포의 레티노이드 결합 단백질뿐만 아니라 상당한 비특이적 결합의 존재 가능성의 결과로서 내생 백그라운드에서 발생한다. 활성 연구와 일치하여, 결합은 레티노산에 의해 완전히 경쟁하게 되며, 다만 레티놀에 의해서는 부분적으로만 경쟁이 된다. 티로이드 호르몬, 덱사메타손 및 비타민 D는 레티노산의 결합에 있어서 경쟁하지 않았다.
유전자 족
신규 레티노산 유전자가 유일한 것인가의 여부를 결정하고, 또한 잠재적으로 관련된 유전자들을 확인하기 위하여, 인간의 DNA를 서던 블로트 분석에 의해 검사하였다. hRR 유전자의 암호 지역으로부터 유도된 표지화된 DNA 단편과 제한 엔도뉴클레아제로써 소화시킨 인간 DNA의 혼성화는 모든 소화에 있어서 하나의 혼성화 유전자 위치와 일치하는 세개의 밴드를 생성시켰다(제4a도). 이런 혼성화 패턴은 HBV의 예비 통합 부위에 대한 데 제안 일동(1986)에 의해 기술된 제한 엔도뉴클레아제 지도와는 관련이 없다.
그러나, 혼성화 조건이 완화되는 경우, 6개의 부가적인 밴드가 각 효소 소화 생성물에서 관찰되었다(제4b도). 이런 낙찰은 적어도 하나의 부가적인 요소, 보다 가능하게는, 인간 게놈 내에 레티노산 수용체와 관련된 요소가 있음을 시사했다. RARβ가 이제 발견되었다. 브랜드 일동, (1988)을 보라.
hRR 유전자의 발현
레티노산이 많은 종류의 상이한 세포에 영향을 미친다는 것이 공지되어 있기 때문에, hRR 유전자의 발현을 검사했다. 여러 종류의 쥐 및 인간조직으로부터 분리된 모든 세포질 RNA를 크기별로 분류하여 니트로셀룰로오스 여과기로 옮겼다. phRAR1으로부터의 600-bp 제한 단편과의 혼성화로부터, 해마, 아드레날, 소뇌, 시상하부 및 고환에서의 3,200 뉴클레오티드의 주오 RNA 종이 가장 높은 수준으로 존재함을 알았다(제5도). 보가 긴 노출은 대부분 조직들의 소량의 3.2kb 전사물을 함유함을 나타내는 반면, 간과 같은 몇몇 조직에서는 이를 발견할 수 없었다.
레티노산 수용체 자료 요약
여기 공개된 자료는 세가지 기준에 근거하여 인간의 레티노산 수용체로서의 phRAR1 유전자 생성물을 확인시켜 준다. 첫째, 스테로이드 및 티로이드 호르몬 수용체에 대한 hRR의 전체 구조적 유사성은 그것이 리간드 반응성 조절 단백질일 가능성을 제시한다. 둘째, hGR의 DNA-결합 영역 및 hRR의 가정의 리간드-결합 영역으로 이루어진 발현된 키메릭 수용체는, 레티노산의 존재 하에서만 글루코코르티코이드 유도성 리포터 유전자의 전사 조절 물질로서 작용한다. 이런 유도는 생리학적 수준으로 일어난다. 셋째. 형질전환된 세포 내에서 후보 hRR의 발현은 레티노산과 결합하는 세포의 능력을 선택적으로 증가시킨다.
발생 및 종양 형성
레티노이드는 레티노산, 레티놀(비타민 A) 및 다양한 시스템에서 발생 및 분화에 깊은 영향을 함께 미치는 일련의 천연 및 합성 및 합성 유도체를 포함하는 일군의 화합물로 구성된다. 스폰 및 로버트, (1983) ; 만델 및 코헨(1985), 올백 및 호웨, (1925) ; 로탄, (1980) ; 및 푸취 및 그린(1980)을 보라. 일찍이, 상피의 성장 및 분화에 대한 레티노이드의 영향에 대해 연구의 촛점이 맞추어졌다 하더라도, 그 작용은 전에 느끼던 것보다 더 멀리 퍼짐을 보여주고 있다. 많은 최근의 연구는 신경아세포종{하우스터 일동,(1983)}, 색소 세포{종로텐 일동,(1983)} 및 섬유 아세포{쉬로더 일동,(1982)}를 포함하는 다양한 배양 세포주 상에서 이러한 분자들의 영향을 예증하고 있다. 인간의 전골수구 백혈병 세포(HL )에 있어서, 레티노산은 과립구 분화에 효능이 있는 유도 물질이{다브라이트만 일동,(1980)}. F9 테라 암 존(tera car cinoma) 줄기 세포에 있어서, 레티노산은 죽은 생주의 낭포의 특징인, 체벽 내배엽의 분화를 유도한다{스트릭랜드 및 마다비,(1978) ; 제텐 일동(1979) ; 및 왕 일동,(1985)}. 레티노산도 발생시 동일한 유력한 영향을 미친다고 보여 왔다.
예컨대, 병아리 다리아체(bud)의 발생 시, 레티노산은 전방 및 후방 축을 세우는데 있어서 극성화 지역의 작용을 위해 대치될 수 있다{티클 및 에이첼레, (1985)}. 레티노산에 대한 노출을 조절하므로써, 새로운 패턴의 다리 구조를 발생시킬 수 있다. 레티노산이 일차적으로는 모르포겐으로 생각되더라고, 노던 블로트 분석은 성인에 있어서 그 기능의 재평가를 제안한다. 인간에게 있어서 레티놀의 결핍은 다양한 암에 대한 놀라운 증가와 관련되어 왔다{문침 이트리(1984)}. 레티노이드는 또한 동물 내 종양 발달을 저해하고 실험관 내에서 종양 프로모터의 작용을 막는다고 보여 왔다. 이런 상황에서, hRR은 종양 형성의 음성적 조절 물질로서 인식될 수 있다.
조절 유전자 군
여기 나타난 연구로부터 두가지 놀라운 결과가 나왔다. 첫째는, 밀접하게 관련된 성질을 갖는 하나 이상의 다른 단백질의 존재를 예견하는 레티노산 수용체 관련 유전자 족의 발견이다 {예컨대, 브랜드 일동에 의해 기술된 RAR,(1988).} 생리학적 연구는 레티노산 뿐 아니라 레티놀(비타민 A) 둘 다 세포 분화에 유력한 영향을 끼칠 수 있으며 이런 영향들은 종종 연관되지 않는다는 사실을 증명하고 있다. 이처럼, 적어도 하나의 관련된 유전자 생성물은 레티노이드 족의 또 다른 구성원에 대한 수용체, 또는 특이 레티놀 수용체일 수 있다고 봄직하다. 이런 결과로부터, 두번째 놀라운 관찰은 레티노이드 수용체와 티로이드 호르몬 수용체와의 밀접한 유사성이다.(아래에서 보는 바와 같이, 레티노산 수용체는 티로이드 반응 요소 또는 TRE를 활성화시킬 수 있다 ; 통상 반응 요소를 통한 레티노산 및 티로이드 호르몬 유도 유전자 발현이라 표지화된 명세서의 일부분을 보라.) 이런 관계는 티로이드 호르몬과 레티노이드의 구조적 차이점 때문에 부분적으로 놀라운 것이다. 티로이드 호르몬이 두 티로신 분자의 축합물로부터 유도되는 반면에, 레티노이드는 메바론산으로부터 유도된다. 화학적으로 뚜렷이 구별되는 분자들이 공통의 구조를 공유하고 있는 수용체와 상호 작용한다는 관찰은, 이들이 그 특정한 조절 효과를 유도해내는 작용 방식의 공통성을 반영하고 있다고 볼 수 있을 것이다. 이런 유사함을 근거로, 우리는 이제 레티노이드와 그 세포 내 수용체의 상호 작용이 호르몬/수용체 복합체에 의한 특정 유전자 세트의 활성화로부터 초래되는 조절 현상을 유도해낸다고 생각한다. 동물들이 그 발생 및 생리 현상을 조절하는 다양한 수단을 이용한다 하더라도, 레티노산 수용체가 스테로이드 수용체 군의 일부라는 사실의 입증은 형태 발생 및 동적 평형을 조절하는 메카니즘이 이에 예측했던 것보다 일반적일 수 있다는 사실을 제안하고 있다.
키메릭 수용체의 구성 및 특성화
키메릭 수용체 유전자의 구성은 정의, 발명의 요약 및 영역 스위칭 및 전사적 활성화로 표지화된 명세서의 일부에서 거론되고 있다. 다음과 같은 부분에서, 키메릭 수용체의 구성 및 특성화는 CR/TR 혼성화의 구성 및 특징들을 보여 주므로써 예증된다.
세포 배양 및 형질전환의 방법 및 물질
CV-1세포는 CAT 리포터 유전자를 운반하는 리포터 플라스미드 및 키메릭 RR/RT 수용체를 운반하는 발현 플라스미드로써 형질전환되는 수용체 결핍 숙주 세포로서 사용된다. CV-1(아프리카의 녹색 원숭이 신장) 세포의 배양 및 형질전환 조건은, 인산 칼슘 침전물이 4-8시간 동안 세포 상에 남아 있고, 그 시간 동안 매체는 T가 없는 5%의 소 혈청(스칸티바디(scantibodies))±10 MT(시그마)를 갖는 DMEM으로 교환된다는 점을 제외하고는, 앞서 설명한 바와 같다{기구어 일동, (1986)}. 세포를 T첨가 36시간 후에 수확하였고, 고르만 일동(1982)에 의해 기술된 바와 같이 CAT분석을 수행하였다. 전형적으로, 5μg의 리포터 및 1μg의 발현 벡터가 형질전환 효율을 위한 조절로서 2.5μg의 RSV-βgal과 함께 동시에 형질전환된다[ C]. 클로로암페니콜의 아세틸화 및 비 아세틸화된 형태는 얇은 층 크로마토그래피에 의해 분리되어 잘려지고, 5% DMSO를 갖는 에코노플루오르(Econofluor)(듀폰) 내에서 액체 신틸레이션 카우팅에 의해 정량화되었다. β-갈락토시다제 분석은 헬보멜 일동(1984)에 의해 기술된 대로 수행하였다. CAT 활성은 β-갈락토시다제 활성에 의해 나누어진 % 전환으로서 표현하였다.
리포터 및 발현 폴리스미드의 구성
쥐의 성장 호르몬 유전자의 -169 내지 -200에 상당하는 합성 올리고 뉴클레오티드가 위치 -190/-181에서 HindⅢ 부위를 가지는 MTV-CAT의 링거 스캐닝(scanning) 돌연변이체 내로 삽입되었다{부에티 및 쿠넬(1986)}. 티로이드 호르몬 수용체에 대한 발현 벡터는, pheA12{hTRβ, 베인베르거 일동,(1986)} 및rbeA12{rTRa, 톰프슨 일동(1987)}의 총 길이 cDNA를, pRS벡터의 Kpn I과 BamH I 부위 사이에 삽입시킴으로써 구성된다{기구어 일동, (1986) (1987)}.
키메릭 수용체의 구성
hGR의 구성이 기술되어 있다{구어 일동, (1987)}. hTRβ를 구성하기 위하여, pheA12의 cDNA 삽입물{hTRβ, 바인베르거 일동, (1985) 및 (1986)}을 M13mp19의 Kpn I 및 BamH I 부위 사이에 서브클로닝 하여 쿤겔(1985)의 방법으로 돌연변이시켰다. Not I 부위를 생성시키기 위해, 사용된 올리고 뉴클레오티드의 세개의 아미노산을 바꾼다 : Asp97은 Arg으로, Lys98은 Pro으로 Asp99는 Pro으로 바뀐다. Xho I 부위를 생성시키기 위해, 사용된 올리고 뉴클레오티드의 두개의 아미노산을 바꾼다 : Thr171은 Leu으로, Asp172는 Gly으로 바뀐다. 그런 다음, 돌연변이 수용체 cDNA는 발현 벡터 pRS로 옮겨지고 {기구어 일동, (1986) 및 (1987)}; 융합물은 RShGR및 RShTRβ사이의 Kpn I-Not I, Kpn I-Xho I, 또는 Not I-Xho I 제한 단편을 교환시키므로써 구성된다. RShGR는 약 75% 야생형 DNA-결합 활성을 갖고, RshTRβ는 약 60%의 야생형 DNA-결합 활성을 갖는다.
시스/트랜스 기능 리간드의 확인 분석
시스/트랜스 기능 리간드 확인 동시 형질전환 분석은, 글루코코르티코이드, 티로이드 및 레티노산 수용체 사이의 영역을 스와핑 시키므로써 구성된 키메릭 수용체를 연구하기 위해 사용된다.(당업자들이 인식할 것처럼, 시스/트랜스 동시 형질전환 분석은 임의의 야생형 또는 유전학적으로 조작된 수용체들 사이의 기능을 스와핑시켜 제조된 키메릭 수용체를 연구하기 위해 사용될 수 있다.). 시스/트랜스 분석에서, 바람직하게는 두 플라스미드는 수용체 결핍 세포주로 형질전환돤다. 첫번째 플라스미드는 수용체 단백질(야생형, 키메릭, 또는 유전학적으로 조작되든지 간에)을 발현시키는데 사용된다. 두번째 플라스미드는 리간드 또는 호르몬 반응성 프로모터로부터의 전자를 모니터하기 위해 사용된다. 티로이드 호르몬 수용체의 분석에 있어서, 발현 플라스미드는 티로이드 호르몬 수용체를 암호화하는 cDNA의 발현에 관한 로우스 사르코마(Rous Sarcoma) 비루스의 긴 말단 반복자(RSV-LTR)로 이루어 진다. hGR에 있어서, 리포터 플라스미드는 세균의 클로로암페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 유전자로 혼성화된 생쥐의 유암 비루스의 긴 말단 반복자(MTV-LTR)이다. MTV-CAT를 티로이드 호르몬 반응성 리포터로 전환시키기 위해서, 티로이드 호르몬 반응 요소(TRE)를 함유하는 올리고 뉴클레이티드가 MTV-LTR의 -191위치에 삽입된다. 쥐의 성장 호르몬(rGH) 유전자의 이와 같은 서열 -169 ∼ -200은 티로이드 호르몬 수용체에 특이하게 결합하며, 이종 프로모터에 대해 T반응성을 줄 수 있다{글래스 일동(1987)}.
발현 및 리포터 플라스미드는 CV-1 세포로 동시 형질전환되고, CAT 활성은 T의 부재 및 존재 하에 즉정된다. 이 분석은 T의 부재 또는 존재 하에, 알파 또는 베타 티로이드 호르몬 수용체 중 그 어떤 것도 MTV-CAT로부터의 전자를 활성화시키지 않는다고 나타낸다(자료는 나타나 있지 않음). 그러나, TRE를 첨가하며, 티로이드 호르몬 반응성인 MTV 프로모터를 생성시킨다. CAT 활성의 유도는 기능적 알파 또는 베타 티로이드 호르몬 수용체의 동시 형질전환 및 T의 첨가에 따라 좌우된다. T의 존재 하에, 알파수용체(rTRα)는 약 15배로 CAT 활성을 유도하는 반면, 베타 수용체(hTRβ)는 약 5배의 활성을 유도한다.
혼성 티로이드 호르몬/글루코코르티코이드 수용체는, 티로이드 및 글루코코르티코이드 호르몬 수용체의 기능 성질을 비교하기 위해 구성된다. 키메릭 혼성 수용체의 구성을 용이하게 하기 위해서, 제한 효소 Not I 및 Xho I에 대한 유일한 부위가 삽입되어 hGR 및 hTRβ의 DNA 결합 영역에 접하게 된다. hGR및 hTRβ로 불리우는 이런 돌연변이 수용체들은, 이러한 수용체에 대한 아미노 말단, DNA-결합 영역 및 리간드-결합 영역의 모든 가능한 조합을 가지도록 융합시키는데 사용될 수 있다.(당업자들이 인식할 것처럼, pRATα또는 pMR와 같은 비교 가능한 플라스미드는 예컨대. 스테로이드 호르몬 수용체 군 내의 다양한 수용체로부터 모든 기능 영역의 모든 가능한 조합으로 이루어진 키메릭 수용체를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 다양한 기능 영역의 위치 및 수용체는 제8도에 나타나 있다.) 혼성 및 모수용체는 T또는 합성 글루코코르티코이드 덱사메타손의 부재 또는 존재 하에, 티로이드 호르몬 및 글루코코르티코이드 반응성 프로모터 둘다를 사용하여 분석된다.
혼성 티로이드/글루코코르티코이드 수용체의 구조 및 활성이 제9도에 나와 있다. 수용체는 세 부분으로 나누어지고, 혼성은 그 영역의 근원(origin)으로 불리우는 문자에 의해 불리워진다 ; 예컨대, T-G-T는 hTRβ(T-,-T)의 아미노 및 카르복실 말단 및 hGR(-G-)의 DNA 결합 영역을 갖는다. 추정 상의 hTRβ의 DNA 결합 영역(TTG, GTT, GTG)을 갖는 혼성이 TRE-CAT로부터의 전사를 활성화시키는 반면, hGR의 DNA 결합 영역(GGT, TGG, TGT)을 갖는 혼성은 GRE-CAT로부터의 전사를 활성화시킨다. 이는, 이와 같은 hTRβ의 영역이 hGR의 DNA 결합 영역과 유사하며, 프로모터 인식의 원인이 된다는 사실을 예증하고 있다. hTRβ의 카르복실 말단을 갖는 혼성 수용체가 T에 의해 활성화되는 반면, hGR의 카르복실 말단을 갖는 것들은 덱사메타손에 의해 활성화된다. 이는 호르몬 결합 및 활성화 특이성의 원인이 되는 수용체의 일부로서의 카르복실 말단의 확인과 일치한다. 함께 취해지는 경우, 이런 혼성의 기능 성질은 hTRβ의 DNA- 및 리간드-결합 영역의 임무를 뒷받침해 준다.
공통의 반응성 요소를 통한 레티노산 및 티로이드 호르몬 유도 유전자의 발현
기능적인 레티노산 반응성 요소(RARE)를 확인하는 것은, 레티노산 수용체가 유전자 발현을 활성화하고 세포 분화를 조절하는 메카니즘을 이해하는데 있어서 중요한다. 이런 연구에 대한 장애는, 임의의 확인된 유전자가 존재하지 않는다는 것으로서, 그 전사는 레티노산 수용체-호르몬 복합체에 따라 직접 좌우된다. RARE를 국한시키는 하나의 대안적인 방법은, 공지의 호르몬 반응성 프로모터의 유도성을 클로닝된 cDNA로부터 생성된 레티노산 수용체와 체계적으로 경쟁시키는 것이다(표제 시스/트랜스 분석에서 기술한 바와 같이, 이와 같은 시스템에서, HRE를 함유하는 프로모터로 부터의 전사적 활성화는 CV-1과 같은 수용체 결핍 세포 내에서 동시 형질전환된 발현 폴리스미드로부터의 기능 수용체의 발현에 따라 좌우된다.) 레티노산 및 티로이드 호르몬 수용체의 DNA-결합 영역은 밀접하게 관련되어 있기 때문에(그 아미노산 서열이 62% 동일함. 제6도를 보라.), 레티노산 수용체가 TRE를 통한 유전자 발현을 활성화시킬 수 있을 것이라는 가능성이 연구되고 있다.
TRE는 공지되어 있다 : 예컨대, 글래스 일동(1987) 티로이드 호르몬(3,5,3'-트리이오드-L-티로닌, T) 조절에 필요한 게놈 서열에 접해 있는 쥐성장 호르몬 5' 내 시스-작용 요소를 거론하는데 있어서, TRE가 RARE로서 효과적으로 기능할 수 있을지의 여부를 시험하기 위하여, 신규 T반응성 프로모터는 쥐의 유암 비루스의 긴 말단 반복자(MTV-LTR)에 존재하는 글루코코르티코이드 반응성 요소를 천연 TRE를 암호화하는 올리고 뉴클레오티드로 대치시키므로써 구성된다. 그런 다음, 이 프로모터는 세균의 클로로암페티콜 아세틸 크랜스퍼라제(CAT) 유전자에 융합되어 리포터 플라스미드 △MTV-TRE-CAT를 생성시킨다. CV-1 세포로의 순간적인 형질 전환 후에, 프로모터의 유도성은 CAT 활성을 측정하므로써 결정된다. CV-1 세포가 인간의 티로이드 호르몬 수용체 베타(pRShTR)를 함유하는 발현 벡터 및 리포터 플라스미드 △MTV-TRE-CAT로 동시 형질전환되는 경우, CAT 활성에 있어서의 유도는 T의 존재 하에 관찰된다. 비교시, 인간의 글루코코르티코이드 수용체(pRShGRα) 및 같은 리포터 플라스미드를 암호화하는 발현 벡터의 동시 형질전환은 합성 글루코코르티코이드 덱사메타손에 대한 반응에 있어서 이러한 프로모터로부터 CAT활성을 자극하지 못한다. 이런 결과들은 야생형 MTV-LTR 구성물이 반응적이지 못하기 때문에, RARα에 의한 CAT활성의 유도가 TRE에 의해 주어진다는 사실을 명백히 설명하고 있다(자료는 나타나지 않음). 이런 결과들은 또한 hRARα가 TRE을 함유하는 촉진제로부터 유전자 발현을 특이하게 유도할 수 있음을 보여준다.
RAR 및 GR 키메릭 수용체
상기와 같이, 스테로이드 호르몬 수용체의 모듈(modular) 구조는 기능적 키메릭 수용체를 생성시키기 위해 하나의 수용체로부터 또 다른 수용체 기능 영역을 교차시키는 일을 가능하게 한다. 이런 기술은 RAR의 DNA-결합 영역 및 GR의 리간드-결합 영역을 갖는 hGR/hRARα 키메라를 생성시키기 위해 사용된다. CV-1세포가 hGRG를 암호화하는 발현 플라스미드 및 리포터 △MTV-TRE-CAT로 동시 형질 전환되는 경우, 덱사메타손은 특이하게 CAT 활성을 유도한다(자료는 나타나지 않음). 이런 실험은 hRARα의 DNA-결합 영역이 목적 유전자 활성화의 특이성을 결정한다는 직접적인 증거를 제공한다.
도면의 상세한 설명
제1도 phRAR1의 DNA 및 일차 아미노산 서열.
A, phRAR1 클론의 도시적 표현 및 제한 효소 지도. 점묘(stippled) 표시된 박스는 예측된 오픈 리딩 프레임을 나타낸다.
B, (b-1, b-2 및 b-3으로 나타냄.) 상기 주어진 아미노산 서열을 갖는 phRAR1의 완전한 뉴클레오티드 서열은 긴 오픈 리딩 프레임을 보인다. 뉴클레오티드 85-87 및 플리아데닐화 시그널에서 프레임 내 업스트림 정지 코돈은 밑줄을 그었다.
제1도의 방법. 데제안(Dekean) 일동에 의해 공개된(1986) 게놈 서열의 뉴클레오티드 408-477에 상당하는 63-mer 올리고 뉴클레오티드를 인간고환λgt10 라이브러리를 스크리닝하는 혼성화 탐침물로 사용하였다. 혼성화 혼합물은 35% 포름아미드, 1×덴하르트(Denhardt's), 5×SSPE, 0.1% 나트륨도데실 설페이트(SDS), 100μgml 의 변성된 연어 혈청 DNA 및 10 c.p.m. ml 의 P-표지화된 올리고 뉴클레오티드를 함유한다. 한쌍의 니트로셀룰로우스 필터를 42℃에서 16시간 동안 융합시키고, 2×SSC, 0.1% SDS(1×SSC=150mM NaCl, 15mM 나트륨 시트레이트)로 각각 20분 동안 55℃에서 3번 씻고, -70℃에서 증감 스크린으로 방사선 사진을 찍는다. 이 스크리닝으로부터 얻어진 클론 1hTIR을 부분적으로 특성화시킨 후, 인간 신장의 λgt10cDNA 라이브러리를 스크리닝시키기 위한 융합 탐침물로서 사용한다(벨 일동(1986) 참조). 이 스크리닝을 위한 세척 조건은 68℃에서 0.1% SDS가 1×SSC로 변경된다. 몇 개의 cDNA 클론을 분리하고, 가장 긴 클론, phRAR1을 다수의 제한 효소로 소화시키고, 결과 단편을 양쪽 방향에서 M13 서열화 벡터 mp18과 mp19로 서브 클로닝시키고, 대데옥시 절차에 의해 서열화한다(생거 일동(1977) 참조). DNA 서열을 수집하고 데버럭스 일동(1984)과 스타덴(1982)의 프로그램에 따라 분석한다.
제2도 (a) 키메릭 수용체 hRGR의 구성
다양한 구성의 영역 구조를 도식적으로 나타내었으며, 숫자는 각 영역의 아미노산 위치에 상당한다. DNA-결합 영역은 DNA로 나타내며, 리간드 결합 영역은 이들 대표적 유도 물질로서 나타내었다. 수용체들 사이의 DNA-결합 영역의 교체를 가능하게 하는 특정 부위 돌연변이 발생(site-directed mutagenesis)에 의해 생성된 Not I 및 Xho I 부위가 지시된다.
(b) 레티노산에 의한 CAT 활성 유도
발현 벡터를, 리포터 플라스미드 MTVCAT를 갖는 CV-1 세포로 동시 형질전환시키고, 100nM 덱사메타손(DEX) 또는 레티노산(RA)의 부재 또는 존재 하에 2일 동안 배양했다. 발현 벡터에 삽입되는 수용체는, pRShGR, 인간 글루코코르티코이드 수용체 ; pRShRR, 인간 레티노산 수용체 ; pRShRRnx, Not I 및 Xho I을 사용하여 돌연변이된 인간 레티노산 수용체 ; pRShRGR, DNA-결합 영역이 인간 글루코코르티코이드 수용체 DNA-결합 영역에 의해 대치된 인간 레티노산 수용체로 구성된 키메릭 수용체이다.
제2도 방법
(a) phRAR1 및 hGR{홀렌베르그 일동(1985)}의 cDNA 삽입물의 제한 효소 단편을 mp19 벡터의 Kpn I 및 BamH I 부위로 서브 클로닝시키고, 쿤겔(1985) 방법에 따라 돌연변이시킨다. hGR과 hRR 사이의 Not I 부위의 형성을 위해 사용되는 올리고 뉴클레오티드는 각각 28 및 31 뉴클레오티드인 반면, hGR 과 hRR 사이의 Xho I 부위의 생성을 위해 사용되는 올리고 뉴크레오티드는 24 및 23 뉴클레오티드이다. Not I 부위의 생성은 hGR에 있어서 Pro의 Arg 잔기로의 돌연변이와 hRR에 있어서 I le및 Tyr의 Pro 잔기로의 돌연변이를 초래한다. Xho I 부위의 도입은 hGR아미노산 서열을 변경시키지는 않지만, hRR에서 Leu 잔기로의 돌연변이를 초래한다. 그런 다음, 돌연변이 수용체를 발현 벡터 pRS로 형질전환시키고 {기구어 일동(1986) 참조}, hGR의 DNA-결합 영역을 함유하는 pRShGR의 Not I/Xho I 제한 단편을 Not I 및 Xho I 부위 사이의 pRShRR에 도입하여 pRShRGR을 생성한다.
(b) 세포 형질전환 및 CAT 분석.
재조합 DNA 구성물(각각 5μg)을 칼슘 포스페이트 공침전(위글러 일동. (1977) 참조)에 의해 CV-1 세포에 도입했다. 그리고 나서, 세포를 이틀 동안 유도 물질의 존재 또는 부재 하에 뉴트리도마(Nurtidoma)(뵈링거 만하임)로 보충된 혈청 없는 배지 내에서 배양했다. 그 후 CV-1 세포를 골맨(Golman)일동 (1982)에 의해 기술된 CAT 분석을 위해 준비하고, 단백질 추출물 25μg을 사용하여 3시간 동안 분석을 수행한다. 레티놀을 사용한 모든 실험은 잔잔한 광(light)에서 수행된다.
제3도, (a) 레티노이드에 대한 투여량 반응
pRShRGR 및 pNTVCAT로 동시 형질 전환된 CV-1 세포를 증가 농도의 레티노이드 또는 단일 1μM 투여량(*)의 테스토스테론, 디히드로테스토스테론, 에스트로겐, 코르리졸, 알도스레롤, 프로게스테론. 트리이오도티오닌(T), 티록신(T), 디히드록시 비타민 D(VD) 및 25-OH-콜레스테롤로 처리한다. CAT 활성 수준을 이 실험에서 관찰되는 최대 반응의 백분율로 플로링한다.
(b) 형질전환된 COS-1 세포의 시토졸 추출물에 결합하는 레티노산
바아(Bars)는 1000배 과량의 다양한 경쟁물질(competitore)의 부재(경은색 바아) 또는 존재(점묘 표시된 바아) 하에 측정된 바운드(bound) H-레티노산을 나타낸다. 이 값은 4번 반복 측정한 값의 평균이다. 경쟁 물질은 레티노산(RA), 레티놀(R), T4, 덱사메타손(DEX) 및 비타민 D(VD)이다.
제3도 방법. (a) CV-1 세포 동시 형질전환 및 CAT 분석을 제2도에서 기술된 바와 같이 수행한다. 레티노산을 최소로부터 디메틸설폭시드에 용해시키고 에탄올로 희석시켰다. 다른 모든 생성물은 에탄올에 희석시키고, 대조 배양물은 배지 내 0.1% 용매(v/v)를 얻었다. 레티노이드 처리의 투여량 반응 곡선을 3회 반복하여 수행했다.
(b) 서브컨플루언트(ubconfluent). COS-1 세포를 DEAE-덱스트란 방법(디인 일행(1984) 참조)에 의해 10μg/접시의 대조 플라스미드(pRS) 또는 pRShRR로 형질전환시켰다. 세포를 5% 목탄 처리된 소태아 혈청과 함께 DMEM 내에서 2일간 유지시키고, TNS(40mM 트리스-HC pH 7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA) 내에서 수확하고, 저장(hypotonic) 완충액(50mM 트리스-HC pH 7.4, 0.1mM EDTA, 5mM 디티오트레이톨, 10mM NaMoO, 10% 글리세롤, 0.5mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드) 내에서 도운스 균질화(Dounce homogenization)에 의해 용해시키고, 30분 동안 100,000×g에서 원심 분리시켜 시토졸 분류물을 얻는다. 시토졸 분류물로부터 얻은 단백질 105μg과 2×10 M H-레티노산(NEN, 52.5Ci/mmole)을 총 부피를 200μℓ로 하여 저장 완충액 내에서 항온 처리를 수행한다. 2×10 M의 경쟁 물질을 첨가하므로써 특이적 결합을 측정한다. 반응은 4℃에서 16시간 동안 수행된다. 바운드 H-레티노산을 DE-81 여과기를 서서 정량한다. 반응물을 1분 동안 여과기 상에 놓은 후, 5mℓ 세척 완충액(50mM 트리스-HCl pH 7.4, 0.1mM EDTA, 0.1% 트리톤 X-100)으로 헹구어 준다. 여과기를 건조시키고 액체 섬광 분광법으로 계산했다.
제4도, 인간 게놈 DNA의 서던 블롯 분석.
(a) 인간의 태반 DNA를 지시된 제한 효소로 소화시켰다. 0.8% 아가로스겔(10μg/레인(lane)). 내에서 소화된 DNA를 분리하고, 니트로셀룰로우스 여과기에 옮긴 후 (서던(1987) 참조), 매우 엄격한 조건(50% 포름아미드, 5×SSPE, 1×덴하르트, 0.1% SDS, 100μgml 연어 혈청 DNA) 하에 hRR의 DNA-결합 영역을 에워싼 pHRAR1(600bp)으로부터 EcoR 1× Pvu II 단편으로 블롯을 융합시켰다. 여과기를 0.1×SSC, 0.1% SDS로 65℃에서 세척했다. 람다 Hind III DNA 마아커(kb의 크기)는 방사선 사진의 왼쪽에 정렬된다.
(b) 엄격하지 않은 조건 하에서 (a)에서와 동일한 탐침물을 사용한 인간 태반 DNA의 분석.
동일한 표본을 함유하는 평행 블롯을 35% 포름아미드를 사용하는 것을 제외하고는 (a)서와 같이 융합시켰다. 여과기를 25℃에서 2% SSC, 0.1% SDS로 세척했다.
제5도. 쥐 및 인간 조직의 레티노산 수용체 mRNA의 노던 블록분석.
제5도 방법. 1% 아가로스-포름알데히드 겔로 분리하고, 니트로셀룰로우스에 옮기고, 제4도에 기술된 탐침물을 사용하여 엄격한 조건 하에서 잡종화시킨 구아니딘 디오시아네이트(키트그읜 일행(1980) 참조)를 사용하여 다양한 조직으로부터 총 RNA를 분리했다. 20μg의 총 RNA를 모든 레인에서 사용했다. 리보솜 RNA의 이동(28S 및 18S)은 크기 마아커로 표시된다. 니트로셀룰로우스 여과기를 1주 동안 증감 스크린으로 -70℃에서 방사선 사진을 찍는다.
제6도. hGR, hRR 및 hTRβ 구조의 아미노산의 도식적인 비교. 아미노산 서열은 점선 사이의 간격으로 각 영역의 동종에 대한 % 아미노산 동일성에 따라 조직적으로 정렬된다.
제7도는 영역 A/B,C,D 및 E로 유전자의 분할을 보여주는 일반적인 스테로이드/티로이드/레티노산 수용체의 도면이다. A/B 지역의 기능은 설명하고자 하는 시작 지역이며, C지역은 DNA- 결합 영역을 암호화하며, D지역은 힌지(hinge) 지역인 것으로 보며, E지역은 리간드 결합 영역을 암호화한다.
제8도는 스테로이드 호르몬 수용체 군 구성원들의 아미노산 비교를 보여주는 도면이다. 일차 아미노산 서열은 hGR과 관련하여 각 지역에 대해 지지된 백분율 아미노산 동일성을 사용하여(밀러 일행(1985)) 최대 아미노산 유사성의 지역을 기준으로 정렬된다. 보여지는 영역은 최대 활성에 요구되는 NH-종결 말단에서의 영역, 66-내지 68-아미노산 DNA-결합 영역코어(DNA) 및 250-아미노산 리간드-결합 영역(또는 호르몬-결합 영역)(호르몬)이다. 각 영역 경계의 아미노산 위치가 나타나 있다. 모든 수용체에 대한 아미노산 번호는 V-erb-A 및 E75(세그라베스, 1988)를 제외하고는 인간 형태의 것을 나타낸다. 기능적 담당은 글루코코르티코이드와 에스트로겐 수용체의 특성화에 의해 결정된다. 명칭은 다음과 같다. GR, 글루코코르티코이드 수용체, MR 미네랄로코르티코이드 수용체, PR 프로게스테론 수용체, ER 에스트로겐 수용체. ERR1 또는 ERR2, 에스트로겐 관련 1 또는 2, VDR, 비타민 D수용체 및 TRβ 및 TRα, 티로이드 호르몬 수용체, (+) 또는 (-)는 특정 성질이 클로닝된 수용체 cDNA의 생성물에 대한 것인가 또는 정제된 수용체로서 예증되는가의 여부를 나타낸다. HRE, 즉 호르몬 반응 요소, 이것은 결합 부위가 구조적으로 동일한지의 여부와 그 향상 성질이 유전자 전이 연구에 의해 예증되는가의 여부와 관련된다. PR에 있어서, DNA-결합 성질은 오직 천연으로부터 정제된 수용체에서만 나타났다. 시험관 내 호르몬 결합은 , 이 성질이 토끼 망상 적혈구 용해질 시스템(홀렌베르그 일동, 1985)의 해석에 의해 예증되는지의 여부를 지시한다. 생체 내 호르몬 결합은 형질전환된 세포에서 클로닝된 수용체의 발현을 언급한다. 크로모좀은 인간 크로모좀 위치를 지시한다. 종은 다음과 같다. h : 인간, r : 쥐, m : 생쥐, c : 닭 및 d : 드로조필라.
제9도. 키메릭 티로이드/글루코코르티코이드 수용체의 구조 및 합성.
제9도의 방법. 혼성 수용체를 구성하기 위해서, 유일한 Not I 및 Xho I 부위를 hGR 및 hTRβ의 DNA 결합 영역에 접하도록 삽입했다. 수용체 cDNA의 적절한 단편을 변화시키므로써, 혼성화를 형성한다.
DNA는 DNA 결합 영역을 나타내며 T/T및 코르티졸은 각각 hTRβ 및 hGR의 리간드 결합 영역을 나타낸다. 박스 위의 숫자는 아미노산 잔기를 지시한다.
혼성화는 영역의 근원을 언급하는 문자에 의해 명명되는데, 예컨대 TGT는 hTRβ의 아미노 및 카르복실 말단과 hGR의 DNA 결합 영역을 갖는다. T및 합성 글루코코르티코이드 덱사메타손(dex)의 부재 또는 존재 하에 TRE-MCAT 및 GRE-MCAT 상에서 모든 수용체를 분석한다. 보여준 모든 조합물은 상기 백그라운드의 활성화를 제공한다.
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본 명세서는 하기 출판물들을 참고하고 있으며, 그 각각은 명백히 여기에 참고로서 포함되어 있다.
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Claims (23)

  1. 센스(sense) 스트랜드가, 제1b-1도, 제1b-2도 및 제1b-3도에 나타난 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산을 갖는 단백질의 일차 서열을 암호화하는 트리플리트 서열을 가지는 단편을 포함하여 구성되며, 레티노산 수용체 단백질의 특징적인 리간드-결합 및 전사-활성화 성질을 가지는 단백질로 발현될 수 있는 이중 스트랜드 DNA.
  2. 제1항에 있어서, 단편 내 트리플리트의 서열이 인간의 레티노산 수용체 단백질의 특징적인 리간드-결합 및 전사-활성화 성질을 갖는 단백질의 일차 서열을 암호화하는 이중 스트랜드 DNA.
  3. 플라스미드 phRAR1(ATCC #40392)
  4. 제1b-1도, 제1b-2도 및 제1b-3도에 도시된 염기서열 중 뉴클레오티드 잔기 제103번부터 제1491번까지의 뉴클레오티드의 암호 배열로서 이루어진 (a) 번역 개시 코돈에 해당하는 트리플리트와 이 개시 코돈 트리플리트의 다운스트림(downstream)과 함께 프레임 내에 있는 번역 중지 코돈에 해당하는 하나의 트리플리트 및 (b) 가장 긴 오픈 리딩 프레임으로서, 레티노산 수용체 단백질의 일차 서열을 암호화하는 트리플리트 서열을 가지는 단편으로 구성된 DNA 단편.
  5. 제1항에 청구된 DNA서열로부터 전사된 mRNA.
  6. 단백질의 아미노산 서열이 제1b-1도, 제1b-2도 및 제1b-3도에 도시된 아미노산 서열과 50% 이상의 유사성을 가지는 아미노산으로 이루어지며, 레티노산 수용체 단백질의 특징적인 리간드 결합 및 전사 활성화 성질을 가지는 단백질.
  7. 제1항에 청구된 DNA서열에 의해 암호화된 단백질.
  8. 제1항에 청구된 DNA에 의해 형질전환된 세포.
  9. N-말단 영역, DNA-결합 영역 및 리간드-결합 영역이 GR, MR, TR, ERR 및 RR로 이루어진 모(parental) 수용체들의 일반 군으로부터 선택된 공지의 수용체로부터 어래되고, 키메라가 (1) hGR, hMR, hERR1, hERR2, rTRα, hT3|α, hT3 β, hRARα및 hRARβ로 이루어진 모 수용체의 군으로부터 선택된 N-말단 영역, (2) hGR, hMR, hERR1, hERR2, rTRα, hT3 α, hT3|β, hRARα및 hRARβ로 이루어진 모 수용체의 군으로부터 선택된 DNA-결합 영역 및 (2) hGR, hMR, hERR1, hERR2, rT3α, rT|3β, hRARα및 hRARβ로 이루어진 모 수용체의 군으로부터 선택된 리간드-결합 영역을 가지며, 임의 하나의 키메릭 수용체가 두 개 이상의 다른 모 급원으로부터 유래되는 N-말단 영역. DNA-결합 영역 및 리간드-결합 영역을 가지므로 결코 임의 야생형 수용체와는 동일하지 않은, N-말단 영역, DNA-결합 영역및 리간드-결합 영역을 갖는 키메릭 수용체.
  10. GRR,GRG, GGR, RGG, RGR, RRG, TTR, TRT, TRR, RTT, RTR, RRT GTT, GTG, GGT, TGG, TGT 및 TTG로 이루어진 군으로부터 선택된 키메릭 수용체를 암호화하는 DNA서열.
  11. 임의의 주어진 세포 내에서 외생의 백그라운드 결합 또는 전사적 활성화 작용 수준을 능가하는 활성을 갖거나, 자연적으로 발생한 수용체 DNA-결합 영역의 DNA-결합 또는 전사-활성화 작용의 5% 이상을 가지거나, 자연적으로 발생한 리간드-결합 영역의 리간드-결합 활성의 5% 이상을 가지거나, 또는 이들 활성을 모두 가지는, 그러한 키메릭 수용체 암호화 DNA로부터 전사된 mRNA의 번역물인 본 발명의 키메릭 DNA의 발현에 의해 제조된 키메릭 수용체 단백질.
  12. (a) 추정되는 리간드-결합 영역 및 DNA-결합 영역을 갖는DNA서열을 분리해 내고, (b) 단계 (a)의 DNA서열 중 DNA-결합 영역 부분을, 공지의 리간드-반응성 수용체 단백질의 DNA-결합 영역 부분으로 대치시키므로써 키메릭 유전자를 구성하고, (c) (i)단계 (b)로부터의 키메릭 유전자 및 (ii) 단계 (b)의 키메릭 유전자에 의해 암호화된 수용체 단백질의 DNA-결합 영역 부분에 의해 활성화될 수 있는 조작적 호르몬 반응 요소에 기능적으로 연결된 리포터 유전자를 임의의 수용체 결핍 숙주 세포 내로 형질전환시키고, (d) 단계(c)로부터 형질전환 숙주 세포를 단계 (b)의 키메릭 유전자에 의해 암호화된 키메릭 수용체 단백질의 리간드-결합 영역 부분과 잠재적으로 결합할 수 있는 일련의 후보 리간드와 경쟁시키고, (e) 리포터 유전자에 의해 암호화된 단백질의 단백질 수준 변화에 따라 리포터 유전자의 유도를 모니터하고, (f) 리포터 유전자의 단백질 생성물의 생산을 유도할 수 있는 리간드(들)를 기능 리간드(들)로서 선택하는 것으로 구성되는, 수용체 단백질에 대한 기능 리간드를 확인하는 방법.
  13. 제12항 (b)에 있어서, 공지된 리간드-반응성 수용체 단백질이 글루코코르티코이드 수용체, 미네랄로코프티코이드 수용체, 인간의 티로이드 수용체 α 및 β, 쥐의 티로이드 수용체 알파, 에스트로겐-관련 수용체 hERR1및 hERR2, 그리고 레티노산 수용체 알파 및 베타로 이루어진 균으로부터 선택되는 방법.
  14. 제12항(c)에 있어서, 숙주 세포가 COS세포인 방법.
  15. 제12항(c)의 단계 (ii)에 있어서, 리포터 유전자가 클로로암페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자 및 개똥벌레 루시퍼라제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  16. 제12항(c)의 단계 (ii)에 있어서, 호르몬 반응 요소가 야생형, 조작 또는 합성의 (1) 글루코코르티코이드 반응 요소, (2) 티로이드 반응 요소, (3) 미네랄로코르티코이드 반응 요소, (4) 에스트로겐-관련 반응 요소, (5) 레티노산 반응 요소 및 (6) 비타민 D3반응 요소로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 글루코코르티코이드 반응 요소가 유암 비루스의 긴 말단 반복 서열(MTV-LTR)의 일부이고, 티로이드 반응 요소가 성장호르몬 프로모터 서열의 일부인 방법.
  18. 제12항에 있어서, 단계(f)에서 확인된 리간드(들)가, 단계(f)에서 확인된 리간드(들) 및 단계(a)의 DNA서열의 발현 생성물의 결합 성질은 평가하므로써 확증되는 방법.
  19. (i) 제2수용체 서열의 리간드-결합 영역의 조작부분(b)에 연결된 제1수용체 서열의 DNA-결합 영역의 조작 부분(a)로 구성된 키메릭 DNA서열 (c) 및 (ii) 조작적 호르몬 반응 요소에 기능적으로 연결된 리포터 핵산 서열을 함유하는 세포로서, 여기서 제1수용체 서열의 DNA-결합 영역의 조작 부분은, 리포터 서열에 기능적으로 연결된 호르몬 반응 요소와 기능적으로 결합하여 이를 활성화시킬 수 있는 것인, 세포 내 수용체 단백질에 대한 기능 리간드를 확인하기 위한 방법으로서 상기 방법은 세포를 하나 이상의 후보 리간드와 경쟁시킨 다음, 리포터 서열의 발현 생성물의 양의 변화에 의한 리포터 핵산 서열의 유도를 모니터 하는 것을 포함하여 구성되는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 세포가 COS 세포인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 리포터 유전자가 클로로암페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 유전자 및 개똥벌레 루시퍼라제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  22. 제19항에 있어서, 호르몬 반응 요소가 야생형, 조작 또는 합성 (1) 글루코코르티코이드 반응 요소, (2) 티로이드 반응 요소. (3) 미네랄로 코르티코이드 반응 요소, (4) 에스트로겐-관련 반응 요소. (5) 레티노산 반응 요소 및 (6) 비타민 D3반응 요소로 이루어진 군으로 부터 선택되는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 글루코코르티코이드 반응 요소가 유암 비루스의 긴 말단 반복 서열(MTV-LTR)의 일부이고, 티로이드 반응 요소가 성장호르몬 프로모터 서열의 일부인 방법.
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