JP4328094B2

JP4328094B2 - 新規置換突然変異体受容体および核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用

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Publication number: JP4328094B2
Application number: JP2002566319A
Authority: JP
Inventors: パリ，スバ・レディ; クマー，モハン・バサバラジュ; クレス，デーン・アービン; フジモト，テッド・ツトム
Original assignee: Intrexon Corp
Current assignee: Precigen Inc
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2002-02-20
Publication date: 2009-09-09
Anticipated expiration: 2022-02-20
Also published as: US20060100416A1; AU2002306550B2; US8715959B2; US9322026B2; US20160257964A1; DK1373470T3; MXPA03007496A; US20070300313A1; CA2445796A1; US8691527B2; US20130117872A1; EP1373470A4; JP5227757B2; CA2445796C; US9029152B2; US8669051B2; US10190124B2; US20080301825A1; US20130244330A1; EP2275558A3

Description

本発明はバイオテクノロジーまたは遺伝子工学の分野に関する。具体的には、本発明は遺伝子発現の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は置換突然変異を含む新規核受容体および核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用ならびにこの誘導性遺伝子発現システムを用いて宿主細胞内で遺伝子の発現を変調する方法に関する。

種々の刊行物が本明細書中で引用され、その開示は引用によりその全体を本明細書の一部とみなす。しかしながら、本明細書中におけるいずれの文献の引用も、かかる文献が本出願に対する「先行技術」として利用できることを認めたものと理解されるべきではない。

遺伝子工学の分野においては、遺伝子発現の正確な制御は、発生および他の生理学的プロセスを研究し、操作し、および制御するための価値があるツールである。遺伝子発現は、多数の特異的蛋白質−蛋白質相互作用に関連する複雑な生物学的プロセスである。遺伝子発現が蛋白質合成における最初の工程として必要なＲＮＡを生産するように遺伝子発現がトリガーされるためには、転写アクチベーターが、遺伝子転写を制御するプロモーターの近くに運ばれなければならない。典型的には、転写アクチベーターそれ自体は、遺伝子のプロモーター領域に存在するＤＮＡ結合部位に結合する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを有する蛋白質に関連する。かくして、遺伝子発現が起こるためには、ＤＮＡ結合ドメインおよび該ＤＮＡ結合ドメインから適当な距離をおいて位置するトランス活性化ドメインを含む蛋白質が遺伝子のプロモーター領域中の正しい位置に運ばれなければならない。

伝統的なトランスジェニックアプローチは、細胞型特異的プロモーターを利用して、設計されたトランスジーンの発現を駆動させる。トランスジーンを含有するＤＮＡ構築体が、まず、宿主ゲノムに組み込まれる。転写アクチベーターによってトリガーされると、与えられた細胞型でトランスジーンの発現が起こる。

細胞中での外来性遺伝子の発現を調節する他の手段は誘導性プロモーターを介するものである。そのような誘導性プロモーターの使用の例は、ＰＲ１−ａプロモーター、原核生物リプレッサー−オペレーターシステム、免疫抑制−イムノフィリンシステム、およびステロイドホルモン受容体システムといった高等真核生物転写活性化システムを含み、これは後述する。

病原体の攻撃後の全身獲得抵抗性応答（ｓｙｓｔｅｍｉｃａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｒｅｓｐｏｎｓｅ）の間に、タバコからのＰＲ１−ａプロモーターが誘導される。ＰＲ１−ａの使用は限定されるであろう。何故ならば、それは、しばしば、内因性物質、ならびに病原体、ＵＶ−Ｂ放射線および汚染物といった外来因子に応答するからである。熱ショック、インターフェロンおよび重金属によって誘導されたプロモーターに基づく遺伝子調節システムが記載されてきた（Ｗｕｒｎら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：５４１４−５４１８；Ａｒｎｈｅｉｔｅｒら、１９９０、Ｃｅｌｌ６２：５１−６１；Ｆｉｌｍｕｓら、１９９２、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２０：２７５５０−２７５６０）。しかしながら、これらのシステムは、非−標的遺伝子の発現に対するその効果のため制限を有する。これらのシステムは遺漏性（ｌｅａｋｙ）でもある。

原核生物リプレッサー−オペレーターシステムは細菌リプレッサー蛋白質およびそれらが結合する独自のオペレーターＤＮＡ配列を利用する。細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉからのテトラサイクリン（「Ｔｅｔ」）およびラクトース（「Ｌａｃ」）リプレッサー−オペレーターシステムが、遺伝子発現を制御するために植物および動物で用いられてきた。Ｔｅｔシステムにおいて、テトラサイクリンはＴｅｔＲリプレッサー蛋白質に結合し、立体配座の変化をもたらし、これはオペレーターからリプレッサー蛋白質を放出させ、その結果、転写が起こる。Ｌａｃシステムでは、ラクトース、またはイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトシドといった合成アナログの存在に応答してｌａｃオペロンが活性化される。あいにく、そのようなシステムの使用は、リガンド、すなわち、テトラサイクリンおよびラクトース、の不安定な化学、それらの毒性、それらの天然の存在、または誘導もしくは抑制に比較的高レベル必要であることよって制限される。同様の理由により、動物へのこのようなシステムの使用も制限される。

ＦＫ５０６、ラパマイシンおよびシクロスポリンＡのような免疫抑制分子は、イムノフィリンＦＫＢＰ１２、シクロフィリン等に結合することができる。この情報を用い、単に、ＦＫ５０６を２つの蛋白質の各々の上に置くことによって、またはＦＫ５０６を１つの上に、およびシクロスポリンＡをもう１つの上に置くことによって、任意の２つの蛋白質を一緒に運ぶ一般的戦略が工夫されてきた。次いで、ＦＫ５０６の合成ホモダイマー（ＦＫ１０１２）またはＦＫ５０６−シクロスポリンの融合から得られた化合物（ＦＫＣｓＡ）を用いて、これらの分子の二量体化を誘導することができる（Ｓｐｅｎｃｅｒら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１０１９−２４；Ｂｅｌｓｈａｗら、１９９６、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９３：４６０４−７）。ＦＫＢＰ１２に融合したＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインおよびシクロフィリンに融合したＶＰ１６アクチベータードメイン、ならびにＦＫＣｓＡ化合物を用いて、Ｇａｌ４結合部位を含有するプロモーターの制御下でレポーター遺伝子のヘテロ二量体化および活性化が示された。あいにく、このシステムは、望まない副作用を有しかねない免疫抑制剤を含み、従って、種々の哺乳動物遺伝子のスイッチ適用でのその使用が制限される。

ステロイドホルモン受容体システムのような高等真核生物転写活性化システムも使用されてきた。ステロイドホルモン受容体は核受容体スーパーファミリーのメンバーであり、脊椎動物および無脊椎動物細胞で見出される。あいにく、特に植物および哺乳動物における遺伝子発現の調節のために受容体を活性化するステロイド化合物の使用は、そのような生物における多くの他の元来の生物学的経路におけるその関与のため制限される。そのような困難を克服するために、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）を用いる代替システムが開発されている。

昆虫における成長、脱皮および発生はエクジソンステロイドホルモン（脱皮ホルモン）および幼若ホルモンによって調節される（Ｄｈａｄｉａｌｌａら、１９９８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４３：５４５−５６９）。昆虫におけるエクジソンに対する分子標的は少なくともエクジソン受容体（ＥｃＲ）およびウルトラスピラクル蛋白質（ＵＳＰ）よりなる。ＥｃＲは、シグニチャーＤＮＡおよびリガンド結合ドメイン、ならびに活性化ドメインによって特徴付けられる核ステロイド受容体スーパーファミリーのメンバーである（Ｋｏｅｌｌｅら、１９９１、Ｃｅｌｌ、６７：５９−７７）。ＥｃＲ受容体はポナステロンＡおよびムリステロンＡといった多数のステロイド化合物に対して応答性である。最近、エクジステロイドアゴニスト活性を持つ非−ステロイド化合物が記載されており、これは、ＲｏｈｍａｎｄＨａａｓ社によって世界的に販売されている市販の殺虫剤テブフェノジドおよびメトキシフェノジドを含む（国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９６／００６８６号および米国特許第５，５３０，０２８号参照）。両アナログは他の生物に対して例外的な安全性プロフィールを有する。

昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）はウルトラスピラクル（ＵＳＰ）、哺乳動物ＲＸＲの昆虫ホモログとでヘテロ二量体化し、エクジステロイドおよびエクジソン受容体応答エレメントに結合し、エクジソン応答遺伝子の転写を活性化させる（Ｒｉｄｄｉｆｏｒｄら、２０００）。ＥｃＲ／ＵＳＰ／リガンド複合体は、昆虫の発生および生殖の間に重要な役割を演じる。ＥｃＲはステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーであり、５つのモジュールドメイン、Ａ／Ｂ（トランス活性化）、Ｃ（ＤＮＡ結合、ヘテロ二量体化）、Ｄ（ヒンジ、ヘテロ二量体化）、Ｅ（リガンド結合、へテロ二量体化およびトランス活性化）およびＦ（トランス活性化）ドメインを有する。Ａ／Ｂ、ＣおよびＥのようなこれらのドメインのいくつかは、それらが他の蛋白質に融合された場合にそれらの機能を保持する。

綿密に調節された誘導性遺伝子発現システムまたは「遺伝子スイッチ」は、遺伝子治療、細胞における蛋白質の大規模生産、細胞ベースの高スループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクスおよびトランスジェニック植物および動物における特性の調節のような種々の適用で有用である。

ＥｃＲベースの遺伝子スイッチの第１のバージョンはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）およびＭｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓＲＸＲ（ＭｍＲＸＲ）を用い、ステロイド、ポナステロンＡの存在下においてこれらの受容体が哺乳動物細胞系およびトランスジェニックマウス中のレポーター遺伝子をトランス活性化することを示した（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎら、１９９２；Ｎｏら、１９９６）。後に、Ｓｕｈｒら、１９９８は、外因性ヘテロダイマーパートナーの不存在下で、ＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉＥｃＲ（ＢｍＥｃＲ）を介して、非−ステロイドエクジソンアゴニストであるテブフェノジドが哺乳動物細胞においてレポーター遺伝子の高レベルのトランス活性化を誘導することを示した。

国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０号（ＷＯ９７／３８１１７号）およびＰＣＴ／ＵＳ９９／０８３８１号（ＷＯ９９／５８１５５号）は外因性遺伝子の発現を変調する方法を開示しており、ここに、外因性遺伝子およびエクジソン応答エレメントを含むＤＮＡ構築体が、そのためのリガンドの存在下、および任意に、サイレントパートナーとして作用することができる受容体の存在下で、エクジソン応答エレメントに結合して遺伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む第２のＤＮＡ構築体によって活性化される。選択されたエクジソン受容体はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから単離された。典型的には、そのようなシステムは、最適な活性化を提供するためにサイレントパートナー、好ましくはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の存在を必要とする。哺乳動物細胞では、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とでヘテロ二量体化し、リガンド依存的に標的遺伝子の発現を調節する。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５号（ＷＯ９９／０２６８３号）は、カイコガＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉから単離されたエクジソン受容体が、外因性ダイマーパートナーの必要性なくして哺乳動物系で機能できることを開示する。

米国特許第６，２６５，１７３Ｂ１号は、受容体のステロイド／甲状腺スーパーファミリーの種々のメンバーを、遺伝子発現システムにおける使用のために、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒウルトラスピラクル受容体（ＵＳＰ）または少なくともＵＳＰの二量体化ドメインを含むその断片と組み合わせることができることを開示する。米国特許第５，８８０，３３３号は、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインが２つの異なるハイブリッド蛋白質上に位置する植物で使用されるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＥｃＲおよびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）ヘテロダイマーシステムを開示する。あいにく、これらのＵＳＰ−ベースのシステムは動物細胞において構成的であり、従って、レポーター遺伝子発現を調節するのに効果的ではない。

これらの場合の各々において、（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５号におけるように天然ＥｃＲとして、または国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０号におけるように修飾されたＥｃＲとして）トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインが単一の分子に組み込まれ、ＵＳＰまたはＲＸＲいずれかの他のヘテロダイマーパートナーは、その天然状態で用いられた。

前記ＥｃＲ−ベースの遺伝子調節システムの欠点は、リガンドの不存在下におけるかなりのバックグラウンド活性ならびに植物および動物双方において用いるためのこれらのシステムの非−適用性が挙げられる（米国特許第５，８８０，３３３号参照）。従って、植物および動物双方において外因性遺伝子の発現を正確に変調するための改良されたＥｃＲ−ベースのシステムに対する要望が当該分野に存在する。そのような改良されたシステムは、遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模生産、細胞−ベースの高スループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクスおよびトランスジェニック動物における特性（ｔｒａｉｔ）の調節のような適用で有用であろう。遺伝子治療のような特定の適用において、合成非−ステロイドリガンドによく応答し、天然のステロイドに感受性でない誘導性遺伝子発現システムを有することが望まれる場合がある。同時に単純であり、コンパクトであり、かつ比較的安価で、容易に入手でき、かつ宿主に対して低毒性であるリガンドに依存する改良されたシステムは、生物学的システムを調節するのに有用なことが判明するであろう。

最近、出願人は、トランス活性化およびＤＮＡ結合ドメインが、それらを２つの異なる蛋白質上に置くことによって相互に分離されたエクジソン受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムが結果として、リガンドの不存在下においてバックグラウンド活性を大いに低下させ、リガンドの存在下においてバックグラウンドを超えて活性をかなり増加させたことを示した（ここに引用してその全体を本明細書の一部としてみなす係属中の出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０号）。この２−ハイブリッドシステムは、出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０号およびＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５号に開示された２つのシステムと比較してかなり改良された誘導性遺伝子発現変調システムである。該２−ハイブリッドシステムは、ＤＮＡ結合ドメインが遺伝子上のＤＮＡ結合部位に結合すると、トランス活性化ドメインがプロモーターをより効果的に活性化するように、トランス活性化ドメインをＤＮＡ結合ドメインに対してより好都合な位置に運び込む相互作用蛋白質の対の能力を開発する（例えば、米国特許第５，２８３，１７３号参照）。簡単に述べれば、該２−ハイブリッド遺伝子発現システムは２つの遺伝子発現カセットを含む；第１のカセットは核受容体ポリペプチドに融合したＤＮＡ結合ドメインドメインをコードし、第２のカセットは異なる核受容体ポリペプチドに融合したトランス活性化ドメインをコードする。リガンドの存在において、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの相互作用は、ＤＮＡ結合ドメインをトランス活性化ドメインに効果的に連結させる。ＤＮＡ結合およびトランス活性化ドメインは２つの異なる分子に存在するので、リガンドの不存在下におけるバックグラウンド活性は大いに低下する。

また、２−ハイブリッドシステムは、ステロイドリガンド、例えば、ポナステロンＡ（「ＰｏｎＡ」）またはムリステロンＡ（「ＭｕｒＡ」）と比較した場合、非−ステロイドリガンド、例えば、ジアシルヒドラジンに対する改良された感受性を提供する。すなわち、ステロイドと比較すると、非−ステロイドリガンドはより低い濃度においてより高い活性を提供する。加えて、ＥｃＲ遺伝子スイッチに基づくトランス活性化はしばしば細胞系依存性であるので、各適用につき最大トランス活性化能力を得るためにスイッチングシステムを仕立てるのはより容易である。さらに、２−ハイブリッドシステムは、未修飾ＲＸＲがスイッチングパートナーとして用いられた場合にしばしば起こるＲＸＲの過剰発現によるいくつかの副作用を回避する。好ましい２−ハイブリッドシステムにおいては、ＥｃＲまたはＲＸＲの天然ＤＮＡ結合およびトランス活性化ドメインは排除され、その結果、これらのハイブリッド分子は、細胞に存在する他のステロイドホルモン受容体と相互作用するチャンスは低く、その結果、副作用は低下する。

ＥｃＲは核受容体スーパーファミリーのメンバーであって、サブファミリー１、グループＨ（ここでは「グループＨ核受容体」ともいう）に分類される。各グループのメンバーはＥ（リガンド結合）ドメインにおいて４０−６０％アミノ酸同一性を共有する（Ｌａｕｄｅｔら、ＡＵｎｉｆｉｅｄＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＳｙｓｔｅｍｆｏｒｔｈｅＮｕｃｌｅａｒＲｅｃｅｐｔｏｒＳｕｂｆａｍｉｌｙ、１９９９；Ｃｅｌｌ９７：１６１−１６３）。エクジソン受容体に加えて、この核受容体サブファミリー１、グループＨの他のメンバーはユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン受容体１（ＯＲ−１）、ステロイドホルモン核受容体１（ＮＥＲ−１）、ＲＸＲ相互作用蛋白質−１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様蛋白質（ＲＬＤ−１）、肝臓ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイドｘ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用蛋白質１４（ＲＩＰ−１４）、およびファルネゾール受容体（ＨＲＲ−１）を含む。

国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９６／００６８６号明細書米国特許第５，５３０，０２８号明細書国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０号（ＷＯ９７／３８１１７号）明細書国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０８３８１号（ＷＯ９９／５８１５５号）明細書国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５号（ＷＯ９９／０２６８３号）明細書米国特許第６，２６５，１７３Ｂ１号明細書Ｗｕｒｎら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：５４１４−５４１８Ａｒｎｈｅｉｔｅｒら、１９９０、Ｃｅｌｌ６２：５１−６１Ｆｉｌｍｕｓら、１９９２、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２０：２７５５０−２７５６０）Ｓｐｅｎｃｅｒら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１０１９−２４Ｂｅｌｓｈａｗら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：４６０４−７Ｄｈａｄｉａｌｌａら、１９９８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４３：５４５−５６９Ｋｏｅｌｌｅら、１９９１、Ｃｅｌｌ、６７：５９−７７）

リガンド結合またはリガンド特異性が修飾された改良されたグループＨ核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムを開発するために、出願人らは、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に置換されたアミノ酸残基を含むいくつかの置換突然変異体ＥｃＲを創製した。相同性モデリングおよびドッキングアプローチを用いて、エクジステロイドおよび非−エクジステロイドのＥｃＲＬＢＤへの結合を媒介する臨界的残基を予測した。リガンド結合およびトランス活性化アッセイにおいて、これらの置換突然変異体ＥｃＲを評価した。本明細書中にて提示するように、出願人らの新規な置換突然変異体核受容体および核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用は、リガンド感受性およびトランス活性化の大きさを、適用に応じて、所望により選択することができる原核生物および真核生物宿主細胞双方における改良された誘導性遺伝子発現システムを提供する。

出願人らは、ここに、リガンド感受性およびグループＨ核受容体の誘導の大きさに影響するグループＨ核受容体リガンド結合ドメインへのリガンド結合に関与するアミノ酸残基における置換突然変異を含むグループＨ核受容体の構築物（ここでは「置換突然変異体」）、およびこれらの置換突然変異体核受容体が遺伝子発現を変調する方法で有用であるという証明を記載する。

具体的には、出願人らは、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む新規な核受容体−べースの誘導性遺伝子発現システムを開発した。出願人らは、そのような置換突然変異の効果がリガンド結合活性またはリガンド感受性を増加または減少させることができ、リガンドはステロイドまたは非−ステロイド特異的であり得ることを示した。かくして、出願人らの発明は、宿主細胞において注目する遺伝子の発現を変調するのに有用なグループＨ核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムを提供する。特に望ましい実施形態において、出願人らの発明は、ステロイドリガンドまたは非−ステロイドリガンドいずれかのみに応答するエクジソン受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムを提供する。加えて、本発明は、改良された非−ステロイドリガンド応答性エクジソン受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムも提供する。かくして、出願人らの新規な誘導性遺伝子発現システムおよび宿主細胞における遺伝子発現を変調する方法におけるその使用は、現在利用可能な誘導性発現システムの制限を克服し、当業者に遺伝子発現を制御する効果的な手段を提供する。

本発明は、遺伝子発現レベルの制御が望ましい、遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模生産、細胞−ベースの高スループットスクリーニングアッセイ、直交リガンドスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、およびトランスジェニック生物における特性の調節といった適用で有用である。出願人らの発明の利点は、それが、遺伝子発現を調節し、発現レベルを適合させて、使用者の要求に適合させる手段を提供することにある。

（定義）
本開示においては、多数の用語および略語が用いられる。以下の定義が設けられ、それは、本発明の範囲および実施を理解するのに助けとなるはずである。

特定の実施形態において、用語「約」または「ほぼ」は与えられた値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内、なおより好ましくは１％以内を意味する。

用語「実質的に含まない」は、組成物中（ＡおよびＢが属する種のカテゴリーに応じて）少なくとも約７５重量％の蛋白質、ＤＮＡ、ベクターが「Ａ」である場合に、「Ａ」を含む組成物（「Ａ」は単一の蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクター、組換え宿主細胞等である）が「Ｂ」（ここに、「Ｂ」は１以上の混入蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクター等を含む）を実質的に含まないことを意味する。好ましくは、「Ａ」は、組成物においてＡ＋Ｂ種の少なくとも約９０重量％、最も好ましくは少なくとも約９９重量％を含む。また、混入物を実質的に含まない組成物が、注目する種の活性または特徴を有する単一分子量の種のみを含有するのも好ましい。

本発明の目的では、用語「単離された」は、その元来の環境（それが天然に存在する環境）から取り出された生物学的物質（核酸または蛋白質）を示す。例えば、植物または動物中にて天然状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、それが天然で存在する隣接核酸から分離された同一ポリヌクレオチドは「単離された」と考えられる。用語「精製された」は、他の化合物の存在を排除して、物質が絶対的純粋さを呈する形態で存在することを要しない。それはむしろ相対的な定義である。

ポリヌクレオチドは、少なくとも１桁の大きさ、好ましくは２または３桁、より好ましくは４または５桁の大きさだけ出発物質または天然物質が精製された後に「精製された」状態にあるものである。

「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれるサブユニットが共有結合したものを含んでなる高分子化合物である。核酸はポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、共に一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは限定されるものではないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび半合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは直鎖状、環状またはスーパーコイルであり得る。

「核酸分子」とは、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、あるいはホスホロチオエートおよびチオエステルといったそれらの任意のホスホエステルアナログもいう。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。用語核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子とは、分子の一次および二次構造のみをいい、それをいずれかの特定の三次形態に限定しない。かくして、この用語は、とりわけ、直鎖状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミドおよび染色体に見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論するにおいて、本明細書中では、ＤＮＡの非−転写ストランド（すなわち、ｍＲＮＡに対して相同な配列を有するストランド）に沿って５’から３’への方向の配列のみを与える通常の慣例に従って配列を記載することができる。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。

用語「断片」は参照核酸に対して減少した長さのヌクレオチド配列を意味し、共通の部分にわたって、参照核酸と同一のヌクレオチド配列を含むと理解されるであろう。本発明に従うそのような核酸断片は、適切には、それが構成要素であるより大きなポリヌクレオチドに含まれ得る。そのような断片は、本発明による核酸の少なくとも６、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３９、４０、４２、４５、４８、５０、５１、５４、５７、６０、６３、６６、７０、７５、７８、８０、９０、１００、１０５、１２０、１３５、１５０、２００、３００、５００、７２０、９００、１０００または１５００の連続的ヌクレオチドの長さの範囲のオリゴヌクレオチドを含むかあるいはそれよりなる。

本明細書中で用いるように「単離された核酸断片」は、任意に合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有してもよい、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態である単離された核酸断片はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１以上のセグメントを含んでなることができる。

「遺伝子」とは、ポリペプチドをコードするヌクレオチドのアセンブリーをいい、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸を含む。また、「遺伝子」とは、コーディング配列に先立つ調節配列（５’非−コーディング配列）およびコーディング配列に続く調節配列（３’非−コーディング配列）を含めた、特定の蛋白質またはポリペプチドを発現する核酸断片をいう。「天然遺伝子」とは、それ自身の調節配列を持つ天然で見出される遺伝子をいう。「キメラ遺伝子」とは、天然では一緒に見出されない調節配列および／またはコーディング配列を含む、天然遺伝子ではないいずれの遺伝子もいう。従って、キメラ遺伝子は、異なる源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同一源に由来するが、天然で見出されるものと異なる方法で配列した調節配列およびコーディング配列を含むことができる。キメラ遺伝子は、異なる源に由来するコーディング配列および／または異なる源に由来する調節配列を含むことができる。「内因性遺伝子」とは、生物のゲノムにおけるその天然の位置での天然遺伝子をいう。「外来性」遺伝子または「異種」遺伝子とは、宿主生物に通常は見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子をいう。外来性遺伝子は非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「トランスジーン」は、形質転換手法によってゲノムに導入された遺伝子である。

「異種」ＤＮＡとは、細胞、または細胞の染色体部位に天然では位置しないＤＮＡをいう。好ましくは、異種ＤＮＡは細胞に対して外来性である遺伝子を含む。

用語「ゲノム」は染色体ならびにミトコンドリア、葉緑体およびウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを含む。

核酸分子は、当該核酸分子の一本鎖形態が、温度および溶液イオン強度の適当な条件下で他の核酸分子にアニールすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのようなもう１つの核酸分子に「ハイブリダイズすることができる」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、後掲参照）。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ（１９８９）、特にその中の第１１章および表１１．１（引用によりその全体を本明細書の一部とみなす）に例示されている。温度およびイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。

ストリンジェンシー条件は、密接に関連する生物から機能性酵素を複製する遺伝子といった高度に同様な断片に対して、あまり関連の無い生物からの相同配列といった中程度に同様な断片に対して、スクリーニングするように調整することができる。相同核酸についての予備的スクリーニングでは、５５°のＴ_ｍに対応する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を用いることができる。例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、およびホルムアミド無し；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いＴ_ｍ、例えば、５×または６×ＳＣＣにての４０％ホルムアミドに対応する。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は最高のＴ_ｍ、例えば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに対応する。

ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが可能であるが、２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とする。用語「相補的」は、相互にハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基の間の関係を記載するのに用いる。例えばＤＮＡに関しては、アデノシンはチミジンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。従って、本発明は、本明細書中で開示するまたは用いる完全な配列ならびにそれらの実質的に同様な核酸配列に相補的な単離された核酸断片も含む。

本発明の特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、前記した条件を利用する５５℃のＴ_ｍにおけるハイブリダイゼーション工程を含むハイブリダイゼーション条件を使用することによって検出される。好ましい実施形態において、Ｔ_ｍは６０℃である；より好ましい実施形態においては、Ｔ_ｍは６３℃である；さらにより好ましい実施形態においては、Ｔ_ｍは６５℃である。

ポスト−ハイブリダイゼーション洗浄もストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の１つの組は室温にて１５分間の６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで出発し、次いで、４５℃にて３０分間２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを反復し、次いで、５０℃にて３０分間０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを２回反復する一連の洗浄を用いる。ストリンジェントな条件のより好ましい組はより高い温度を用い、そこでは、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳにおける最後の２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に上昇させる以外は洗浄は前記のものと同一である。高度にストリンジェントな条件の他の好ましい組は、６５℃における０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの２回の最終洗浄を用いる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して塩基の間のミスマッチが可能であるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的な配列を含むことを必要とする。

核酸をハイブリダイズさせるための適当なストリンジェンシーは核酸の長さ、相補性の程度、当該分野でよく知られた変数に依存する。２つのヌクレオチド配列の間の同様性または相同性の程度が大きくなれば、それらの配列を有する核酸のハイブリッドについてのＴ_ｍの値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴ_ｍに対応する）は以下の順序で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドについては、Ｔ_ｍを計算するための方程式が誘導されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、９．５０−０．５１参照）。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置はより重要であり、オリゴヌクレオチドの長さはその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、１１．７−１１．８参照）。

本発明の特定の実施形態においては、５００ｍＭ未満の塩における、少なくとも３７℃でのハイブリダイゼーション工程、および２×ＳＳＰＥでの少なくとも６３℃における洗浄工程を含むハイブリダイゼーション条件を用いることによってポリヌクレオチドが検出される。好ましい実施形態においては、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション工程では、２００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７℃を含む。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程双方につき２×ＳＳＰＥおよび６３℃を含む。

１つの実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸についての長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸についての好ましい最小長さは少なくとも約１５ヌクレオチドであり；より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり；最も好ましくは、該長さは少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、当業者であれば、温度および洗浄溶液塩の濃度は、プローブの長さといったファクターに従って必要に応じて調整することができる。

用語「プローブ」とは、相補的一本鎖標的核酸とで塩基対を形成して、二本鎖分子を形成することができる一本鎖核酸分子をいう。

本明細書中で用いるように、用語「オリゴヌクレオチド」とは、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、プラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができる、一般に少なくとも１８ヌクレオチドの核酸をいう。オリゴヌクレオチドは、例えば、^３２Ｐ−ヌクレオチド、またはビオチンといったラベルが共有結合したヌクレオチドで標識することができる。標識オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、核酸の存在を検出することができる。オリゴヌクレオチド（その一方または双方を標識することができる）を、核酸の全長または断片をクローニングするために、あるいは核酸の存在を検出するためにＰＣＲプライマーとして用いることができる。また、オリゴヌクレオチドを用いて、ＤＮＡ分子とで三重ヘリックスを形成することができる。一般に、好ましくは核酸合成器でオリゴヌクレオチドを合成により調製する。従って、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合などといった天然に生じないホスホエステルアナログ結合を有するように調製することができる。

「プライマー」は、適当な条件下でＤＮＡ合成のための開始点として働くことができる二本鎖核酸領域を生じさせるために標的核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。そのようなプライマーはポリメラーゼ連鎖反応で用いることができる。

「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略され、酵素により特定の核酸配列を増幅するためのイン・ビトロ方法を意味する。ＰＣＲは、３つの段階：標的分子のストランドを分離するための鋳型核酸の変性、一本鎖ＰＣＲオリゴヌクレオチドのプライマーの鋳型核酸へのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼによるアニールされたプライマーの伸長を含む各サイクルに伴う一連の繰り返し温度サイクルを含む。ＰＣＲは、標的分子の存在を検出し、および定量的または半定量的条件下で、核酸の出発プール内のその標的分子の相対量を決定する手段を提供する。

「逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応」はＲＴ−ＰＣＲと省略され、ＲＮＡ分子から標的ｃＤＮＡ分子を酵素的に生産し、続いて、前記したように標的ｃＤＮＡ分子内で特定の核酸配列の酵素的増幅を行うイン・ビトロ方法を意味する。また、ＲＴ−ＰＣＲは、標的分子の存在を検出し、および定量的または半定量的条件下で、核酸の出発プール内のその標的分子の相対量を決定する手段を提供する。

ＤＮＡの「コーディング配列」は、適当な調節配列の制御下においた場合に、イン・ビトロまたはイン・ビボにて、細胞中にて転写されて、ポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。「適当な調節配列」とは、コーディング配列の上流（５’非−コーディング配列）、その中、または下流（３’非−コーディング配列）に位置し、かつ関連するコーディング配列の転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または翻訳に影響するヌクレオチド配列をいう。調節配列はプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を含むことができる。コーディング配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端における翻訳停止コドンによって決定される。コーディング配列は、限定されるものではないが、原核生物配列、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえ含むことができる。もしコーディング配列が真核生物細胞における発現を意図するならば、ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列は、通常、コーディング配列に対して３’側に位置するであろう。

「オープンリーディングフレーム」はＯＲＦと省略され、ＡＴＧまたはＡＵＧといった翻訳開始シグナルまたは開始コドン、および終止コドンを含み、かつ潜在的にポリペプチド配列に翻訳されることができるある長さのＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡいずれかの核酸配列を意味する。

本明細書中では、用語「ヘッド−対−ヘッド」は、相互に対して２つのポリヌクレオチド配列の向きを記載するために用いる。１つのポリヌクレオチドのコーディングストランドの５’末端が他のポリヌクレオチドのコーディングストランドの５’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向が他のポリヌクレオチドの５’末端から遠ざかるように進行する場合、２つのポリヌクレオチドはヘッド−対−ヘッド向きに位置する。用語「ヘッド−対−ヘッド」は、（５’）−対−（５’）と省略でき、また、記号（←→）または（３’←５’５’→３’）によって示すこともできる。

本明細書中では、用語「テール−対−テール」は、相互に対して２つのポリヌクレオチド配列の向きを記載するのに用いる。１つのポリヌクレオチドのコーディングストランドの３’末端が他のポリヌクレオチドのコーディングストランドの３’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の向きが他のポリヌクレオチドに向かって進行する場合、２つのポリヌクレオチドはテール−対−テール向きに位置する。用語「テール−対−テール」は（３’）−対−（３’）と省略することができ、また、記号（→←）または（５’→３’３’←５’）によって示すこともできる。

本明細書中では、用語「ヘッド−対−テール」は、相互に対して２つのポリヌクレオチド配列の向きを記載するのに用いる。１つのポリヌクレオチドのコーディングストランドの５’末端が他のポリヌクレオチドのコーディングストランドの３’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向が他のポリヌクレオチドのそれと同一向きに進行する場合、２つのポリヌクレオチドはヘッド−対−テール向きに位置する。用語「ヘッド−対−テール」は（５’）−対−（３’）と省略することができ、また、記号（→→）または（５’→３’５’→３’）によって示すこともできる。

用語「下流」とは参照ヌクレオチド配列に対して３’側に位置するヌクレオチド配列をいう。特に、下流ヌクレオチド配列は、一般に、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写の開始部位の下流に位置する。

用語「上流」とは、参照ヌクレオチド配列に対して５’側に位置するヌクレオチド配列をいう。特に、上流ヌクレオチド配列は、一般に、コーディング配列または転写の開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは転写の開始点の上流に位置する。

用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」とは、二本鎖ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列内に結合し、それを切断する酵素をいう。

「相同組換え」とは、他のＤＮＡ分子への外来性ＤＮＡ配列の挿入、例えば、染色体へのベクターの挿入をいう。好ましくは、ベクターは相同組換え用の特定の染色体部位を標的とする。特定の相同組換えでは、ベクターは、染色体の配列に対して相同性である十分に長い領域を含有して、相補的結合および染色体へのベクターの組み込みを可能とするであろう。相同性であるより長い領域、および配列同様性のより大きな程度は、相同組換えの効率を増加させることができる。

当該分野で知られたいくつかの方法を用いて、本発明によるポリヌクレオチドを増幅させることができる。一旦適当な宿主系および増殖条件が確立されれば、組換え発現ベクターを増幅させ、定量的に調製することができる。本明細書中に記載するように、用いることができる発現ベクターは、限定されるものではないが、少数の名前を挙げれば、以下のベクターまたはその誘導体：ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスといったヒトまたは動物ウイルス；バキュロウイルスといった昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、およびプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクターを含む。

「ベクター」は、核酸の宿主細胞へのクローニングおよび／または導入のためのいずれかの手段である。ベクターは、他のＤＮＡセグメントを結合させて、結合したセグメントの複製を行うことができるレプリコンであり得る。「レプリコン」は、イン・ビボでＤＮＡ複製の自律ユニットとして機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製することができるいずれかの遺伝的エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。用語「ベクター」は、イン・ビトロ、エクス・ビボまたはイン・ビボにて核酸を細胞に導入するためのウイルスおよび非ウイルス手段の両方を含む。当該分野で知られた非常に多数のベクターを用いて、核酸を操作し、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子に組み込むなどすることができる。可能なベクターは、例えば、ラムダ誘導体といったバクテリオファージ、またはｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体といったプラスミド、またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターなどの、例えばプラスミドまたは修飾ウイルスを含む。例えば、適当なベクターへの応答エレメントおよびプロモーターに対応するＤＮＡ断片の挿入は、相補的粘着末端を有する選択されたベクターへ適当なＤＮＡ断片を連結することによって達成することができる。別法として、ＤＮＡ分子の末端は酵素的に修飾することができるか、またはヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端に連結することによっていずれの部位も生じさせることができる。そのようなベクターは、マーカーを細胞ゲノムに組み込んだ細胞の選択を供する選択マーカー遺伝子を含有するように作成することができる。そのようなマーカーは、マーカーによってコードされた蛋白質を組み込み、それを発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能とする。

ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、細胞、ならびに生きた動物対象における広く種々の遺伝子送達適用で用いられてきた。用いることができるウイルスベクターは、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノ−随伴ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、ワクシニア、単純ヘルペス、エプスタン−バール、アデノウイルス、ジェミニウイルスおよびカウリモウイルスベクターを含む。非−ウイルスベクターはプラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−蛋白質複合体、およびバイオポリマーを含む。核酸に加え、ベクターは、１以上の調節領域、および／または核酸導入の結果（いずれの組織への導入、発現の持続など）を選択し、測定し、およびモニターするのに有用な選択マーカーを含むこともできる。

用語「プラスミド」とは、細胞の中心的代謝の一部ではなく、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である、遺伝子をしばしば運ぶ染色体外エレメントをいう。そのようなエレメントは任意の源に由来する、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡの自律複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列（直鎖状、環状またはスーパーコイル）であってよく、ここに、多数のヌクレオチド配列が、適当な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片および選択された遺伝子産物についてのＤＮＡ配列を細胞に導入することができる独自の構築物に合体または組み換えられている。

「クローニングベクター」は、他の核酸セグメントを結合させて、結合されたセグメントの複製を行うことができる、プラスミド、ファージまたはコスミドといった、順次複製する核酸、好ましくは、ＤＮＡの単位長さであって、複製起点を含む「レプリコン」である。クローニングベクターは１つの細胞型で複製することができ、もう１つにおいて発現することができる（「シャトルベクター」）。

ベクターは、当該分野で知られた方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターによって、所望の宿主細胞に導入されることができる（例えば、Ｗｕら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；ＷｕおよびＷｕ、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４；およびＨａｒｔｍｕｔら、１９９０年３月１５日に出願されたカナダ特許出願第２，０１２，３１１号参照）。

また、本発明によるポリヌクレオチドはリポフェクションによってイン・ビボによって導入することもできる。過去１０年間、イン・ビトロでの核酸のカプセル化およびトランスフェクションのためのリポソームの使用が増大してきた。リポソーム−媒介トランスフェクションが遭遇する困難および危険を制限するように設計された合成カチオン脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のイン・ビボトランスフェクション用のリポソームを調製することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３；Ｍａｃｋｅｙら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７−８０３１；およびＵｌｍｅｒら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１７４５−１７４８）。カチオン脂質の使用は負に荷電した核酸のカプセル化を促進し、また、負に荷電した細胞膜との融合も促進することができる（ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７：３８７−３８８）。核酸の導入のための特に有用な脂質化合物および組成物は国際特許公開ＷＯ９５／１８８６３号およびＷＯ９６／１７８２３号、および米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。外来性遺伝子をイン・ビボで特定の器官に導入するためのリポフェクションの使用はある現実的な利点を有する。特定の細胞へのリポソームの分子標的化は利点の１つの領域を表す。トランスフェクションを特定の細胞型に向けるのは、膵臓、肝臓、腎臓および脳といった細胞異種性を持つ組織において特に好ましいであろうことが明らかである。脂質は、標的化の目的で他の分子に化学的にカップリングさせることができる（Ｍａｃｋｅｙら、１９８８、前掲）。標的化されたペプチド、例えば、ホルモンもしくは神経伝達物質、および抗体のような蛋白質、または非−ペプチド分子を化学的にリポソームにカップリングさせることができよう。

また、カチオンオリゴペプチド（例えばＷＯ９５／２１９３１号）、ＤＮＡ結合蛋白質に由来するペプチド（例えば、ＷＯ９６／２５５０８号）、またはカチオンポリマー（例えばＷＯ９５／２１９３１号）といった他の分子も、イン・ビボにて核酸のトランスフェクションを容易とするのに有用である。

また、裸のＤＮＡプラスミドとしてイン・ビボにてベクターに導入することも可能である（米国特許第５，６９３，６２２号、第５，５８９，４６６号および第５，５８０，８５９号参照）。また、受容体−媒介ＤＮＡ送達アプローチも用いることができる（Ｃｕｒｉｅｌら、１９９２、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．３：１４７−１５４；ならびにＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２）。

用語「トランスフェクション」は、細胞による外来性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡの取り込みを意味する。外来性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡが細胞内部に導入された場合、細胞はそのようなＲＮＡまたはＤＮＡによって「トランスフェクトされている」。トランスフェクトされたＲＮＡまたはＤＮＡが表現型の変化をもたらす場合、細胞は外来性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡによって「形質転換されている」。形質転換ＲＮＡまたはＤＮＡは染色体ＤＮＡに（共有結合的に）組み込まれ、細胞のゲノムを形成することができる。

「形質転換」とは、宿主の生物のゲノムへの核酸断片の導入をいい、その結果、遺伝的に安定な遺伝がもたらされる。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物を「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物という。

用語「遺伝子領域」とは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む核酸分子またはヌクレオチド配列の領域をいう。

加えて、本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、その増幅またはその発現が求められる細胞宿主における複製用の１以上の起点、マーカーまたは選択マーカーを含むことができる。

用語「選択マーカー」は、同定因子、マーカー遺伝子の効果、すなわち、抗生物質に対する抵抗性、除草剤に対する抵抗性、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づいて選択することができる因子を意味し、通常は、抗生物質または化学的抵抗性遺伝子であり、ここに、該効果を用いて、注目する核酸の遺伝を追跡し、および／または注目する核酸を受け継いだ細胞または生物を同定する。当該分野で知られ、用いられる選択マーカー遺伝子の例は、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、ビアラフォス除草剤、スルホンアミドなどに対する抵抗性を供する遺伝子；および表現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などを含む。

用語「レポーター遺伝子」は、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定することができる同定因子をコードする核酸を意味し、ここに、該効果を用いて、注目する核酸の遺伝を追跡し、注目する核酸を受け継いだ細胞または生物を同定し、および／または遺伝子発現の誘導または転写を測定する。当該分野で知られ、用いられるレポーター遺伝子の例はルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などを含む。選択マーカー遺伝子はレポーター遺伝子と考えることもできる。

「プロモーター」とは、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列をいう。一般に、コーディング配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは天然遺伝子からその全体が由来してもよく、あるいは天然で見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されてよく、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなるものでさえよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞型において、または発生の異なる段階において、または異なる環境または生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることが当業者に理解される。遺伝子をほとんどの機会、ほとんどの細胞型で発現させるプロモーターは通常「構成的プロモーター」といわれる。遺伝子を特定の細胞型で発現させるプロモーターは、通常、「細胞−特異的プロモーター」または「組織−特異的プロモーター」といわれる。遺伝子を発生または細胞分化の特定の段階で発現させるプロモーターは、通常、「発生−特異的プロモーター」または「細胞分化−特異的プロモーター」といわれる。当該プロモーターを誘導する物質、生物学的分子、化学物質、リガンド、光などでの細胞の暴露または処理に続いて誘導され、遺伝子を発現させるプロモーターは、通常、「誘導性プロモーター」または「調節性プロモーター」といわれる。ほとんどの場合、調節配列の精密な境界は完全には画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有することができることはさらに認識されている。

「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）コーディング配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的では、プロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端において境があり、上流（５’方向）に伸びて、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始させるのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内には、（例えば、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングによって便宜的に画定される）転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担う蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出されるであろう。

コーディング配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列をｍＲＮＡに転写し、次いで、それが（もしコーディング配列がイントロンを含むならば）トランス−ＲＮＡスプライシングされ、コーディング配列によってコードされた蛋白質に翻訳される場合、細胞中での転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。

「転写および翻訳制御配列」は、宿主細胞におけるコーディング配列の発現を供する、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどといったＤＮＡ調節配列である。真核生物細胞においては、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。

用語「応答エレメント」は、第１のキメラ遺伝子のＤＮＡ−結合ドメインとの相互作用を介して媒介されたプロモーターに対する応答性を付与する１以上のシス−作用性ＤＮＡエレメントを意味する。このＤＮＡエレメントはその配列が回文構造（完全または不完全）であるか、あるいは可変数のヌクレオチドによって分離された配列モチーフまたはハーフ部位よりなることからできる。該ハーフ部位は同様または同一であり、直接または逆転反復いずれかとして、あるいは単一ハーフ部位またはタンデムな隣接ハーフ部位のマルチマーとして配列できる。応答エレメントは、当該応答エレメントが組み込まれる細胞または生物の性質に応じて異なる生物から単離された最小プロモーターを含むことができる。第１のハイブリッド蛋白質のＤＮＡ結合ドメインは、リガンドの存在下または不存在下で、応答エレメントのＤＮＡ配列に結合して、この応答エレメントの調節下で下流の遺伝子の転写を開始または抑制する。天然エクジソン受容体の応答エレメントについてのＤＮＡ配列の例はＲＲＧＧ／ＴＴＣＡＮＴＧＡＣ／ＡＣＹＹ（ＣｈｅｒｂａｓＬ．ら、（１９９１）、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．５、１２０−１３１参照）；ＡＧＧＴＣＡＮ_（ｎ）ＡＧＧＴＣＡ（ここに、Ｎ_（ｎ）は１以上のスペーサーヌクレオチドであり得る）（Ｄ’ＡｖｉｎｏＰＰ．ら、（１９９５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１１３、１−９）；およびＧＧＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴ（ＡｎｔｏｎｉｅｗｓｋｉＣ．ら、（１９９４）、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１４、４４６５−４４７４）を含む。

用語「作動可能に連結した」とは、一方の機能が他方によって影響されるような、単一核酸断片に対する核酸配列の関連をいう。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現に影響できる（すなわち、コーディング配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコーディング配列に作動可能に連結している。コーディング配列はセンスまたはアンチセンス向きに調節配列に作動可能に連結することができる。

本明細書中で用いられる、用語「発現」とは、核酸またはポリヌクレオチドに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積をいう。また、発現はｍＲＮＡの蛋白質またはポリペプチドへの翻訳をいうこともできる。

用語「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」とは、特定の制限部位において、あるいは相同組換えによって、核酸またはポリヌクレオチドに挿入することができるＤＮＡのセグメントをいう。ＤＮＡのセグメントは注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳のために適切なリーディングフレームにてカセットの挿入を確実とするように設計される。「形質転換カセット」とは、注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、当該ポリヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を容易とするエレメントを有する特定のベクターをいう。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセットおよび形質転換カセットは、宿主細胞における注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの増強された発現を可能とするエレメントも含むことができる。これらのエレメントは、限定されるものではないが、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などを含むことができる。

本発明の目的では、用語「遺伝子スイッチ」とは、プロモーターと関連した応答エレメント、および１以上のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターが組み込まれる遺伝子の発現を変調するＥｃＲベースのシステムの組合せをいう。

用語「変調する」は、核酸または遺伝子の発現を誘導し、減少させ、または阻害し、その結果、蛋白質またはポリペプチド生産をそれぞれ誘導し、減少させまたは阻害すること意味する。

本発明によるプラスミドまたはベクターは、さらに、宿主細胞において遺伝子の発現を駆動するのに適当な少なくとも１つのプロモーターを含むことができる。用語「発現ベクター」は、宿主への形質転換に続いて挿入された核酸配列の発現を可能とするように設計されたベクター、プラスミドまたはビヒクルを意味する。クローン化遺伝子、すなわち、挿入された核酸配列は、通常、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサーなどといった制御エレメントの制御下におかれる。所望の宿主細胞において核酸の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは数多くあり、当業者によく知られている。これらの遺伝子を駆動することができる実質的にいずれのプロモーターも本発明で適当であり、限定されるものではないが、ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、動物プロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導性プロモーター、光調節プロモーター；ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現で有用な）アルカリホスファターゼプロモーター；（Ｐｉｃｈｉａにおける発現で有用な）ＡＯＸ１プロモーター；（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉにおける発現で有用な）β−ラクタマーゼ、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰ_Ｌ、ｌＰ_Ｒ、Ｔ７、ｔａｃおよびｔｒｃプロモーター；光調節−、種子特異的−、花粉特異的−、子房特異的−、病原または病気関連−、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ、ＣＭＶ３５Ｓ最小、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）、クロロフィルａ／ｂ結合蛋白質、リブロース１，５−ビスフォスフェートカルボキシラーゼ、茎−特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導性、イネツングロバシリフォームウイルス、植物スーパー−プロモーター、ジャガイモロイシンアミノペプチダーゼ、ニトレートレダクターゼ、マンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ、ユビキチン、ゼイン蛋白質、およびアントシアニンプロモーター（植物細胞における発現で有用）を含む；当該分野で知られた動物および哺乳動物プロモーターは、限定されるものではないが、ＳＶ４０早期（ＳＶ４０ｅ）プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）に含まれたプロモーター、アデノウイルス（Ａｄ）のＥ１Ａのプロモーターまたは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）早期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、バキュロウイルスＩＥ１プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモーターの調節配列および転写制御領域、ユビキタスプロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α−アクチン、チューブリンなど）、中間フィラメント（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰなど）のプロモーター、（ＭＤＲ、ＣＦＴＲまたは第ＶＩＩＩ型因子などの）治療遺伝子のプロモーター、病因または病気関連−プロモーター、および組織特異性を呈しトランスジェニック動物で利用されてきたプロモーターで；例えば膵臓腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域、膵臓ベータ細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパ系および肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域；肝臓で活性な、アルブミン遺伝子、ＡｐｏＡＩおよびＡｐｏＡＩＩ制御領域、肝臓で活性なアルファ−フェト蛋白質遺伝子制御領域、肝臓で活性なアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域、骨髄系細胞で活性なベータ−グロビン遺伝子制御領域、脳中の稀突起神経膠細胞で活性なミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域、骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域および視床下部で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域；ピルベートキナーゼプロモーター、ビリンプロモーター、脂肪酸結合腸蛋白質のプロモーター、平滑筋細胞α−アクチンのプロモーターなどを含む。加えて、これらの発現配列は、エンハンサーまたは調節配列などの付加によって修飾することもできる。

本発明の実施形態で用いることができるエンハンサーは、限定されるものではないが、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、伸長因子１（ＥＦ１）エンハンサー、酵母エンハンサー、ウイルス遺伝子エンハンサーなどを含む。

終止制御領域、すなわち、ターミネーターまたはポリアデニル化配列もまた好ましい宿主本来の種々の遺伝子に由来することができる。任意には、終止部位は必要ではないが、もし含まれれば最も好ましい。本発明の好ましい実施形態において、終止制御領域は合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ウイルスターミネーター配列などを含むことができるか、またはそれに由来することができる。

用語「３’非−コーディング配列」または「３’非翻訳領域（ＵＴＲ）」とは、コーディング配列の下流（３’側）に位置するＤＮＡ配列をいい、それは、ポリアデニル化［ポリ（Ａ）］認識配列およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響することができる調節シグナルをコードする他の配列を含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することによって特徴付けられる。

「調節領域」は、第２の核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。調節領域は、特定の核酸（相同領域）を発現することを天然で担う配列を含むことをできるか、あるいは異なる蛋白質または合成蛋白質（異種領域）でさえ発現することを担う異なる起源の配列を含むことができる。特に、該配列が原核生物、真核生物またはウイルス遺伝子の配列であり得るか、または特異的もしくは非特異的に、かつ誘導または非誘導様式で遺伝子の転写を刺激または抑制する誘導配列であり得る。調節領域は複製起点、ＲＮＡスプライス部位、プロモーター、エンハンサー、転写終止配列、およびポリペプチドを標的細胞の分泌経路へと向かわせるシグナル配列を含む。

「異種源」からの調節領域は、発現された核酸と天然では関連しない調節領域である。異種調節領域内には、異なる種からの調節領域、異なる遺伝子からの調節領域、ハイブリッド調節配列および天然では生じないが当業者によって設計される調節配列が含まれる。

「ＲＮＡ転写体」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ−触媒転写に由来する産物をいう。ＲＮＡ転写体がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写体といい、あるいはそれは一次転写体の転写後プロセッシングに由来するＲＮＡ配列であってよく、これは成熟ＲＮＡという。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンが無く、細胞によって蛋白質に翻訳することができるＲＮＡをいう。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに相補的であり、それに由来する二本鎖ＤＮＡをいう。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、従って、細胞によって蛋白質に翻訳することができるＲＮＡ転写体をいう。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写体またはｍＲＮＡの全てまたは一部に相補的であって、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写体をいう。アンチセンスＲＮＡの相補性は特定の遺伝子転写体のいずれかの部分、すなわち、５’非−コーディング配列、３’非−コーディング配列、またはコーディング配列におけるものであり得る。「機能的ＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されていないが、細胞プロセスに対して影響を有する他のＲＮＡをいう。

「ポリペプチド」は、共有結合したアミノ酸残基を含んでなるポリマー化合物である。アミノ酸は以下の一般構造式を有する。

アミノ酸は側鎖Ｒに基づいて７つの群に分類される：（１）脂肪族側鎖、（２）ヒドロキシル（ＯＨ）基を含む側鎖、（３）硫黄原子を含む側鎖、（４）酸性基またはアミド基を含む側鎖、（５）塩基性基を含む側鎖、（６）芳香族環を含む側鎖、および（７）側鎖がアミノ基に融合したイミノ酸、プロリン。本発明のポリペプチドは、好ましくは、少なくとも約１４のアミノ酸を含む。

「蛋白質」は、生きた細胞において構造的または機能的役割を行うポリペプチドである。

「単離されたポリペプチド」または「単離された蛋白質」とは、通常はその天然状態においてそれと関連する化合物（例えば、他の蛋白質またはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質）を実質的に含まないポリペプチドまたは蛋白質である。「単離された」とは、他の化合物との人工的または合成的混合物、または生物学的活性に干渉せず、かつ例えば、不完全な精製、安定化剤の添加、または医薬上許容される製剤への調合のため存在し得る不純物の存在を排除することを意味しない。

「置換突然変異体ポリペプチド」または「置換突然変異体」は、野生型または天然に生じるポリペプチドに対して異なるアミノ酸を持つ少なくとも１つの野生型または天然に生じるアミノ酸の置換を含む置換突然変異体ポリペプチドを意味すると理解されるであろう。置換突然変異体ポリペプチドは、１つの野生型または天然に生じるアミノ酸置換のみを含むことができ、これは、「点突然変異体」または「単一点突然変異体」ポリペプチドということができる。あるいは、置換突然変異体ポリペプチドは、野生型または天然に生じるポリペプチドに対する２以上のアミノ酸による、２以上の野生型または天然に生じるアミノ酸の置換を含むことができる。本発明によれば、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインポリペプチドは、野生型または天然に生じるグループＨ核受容体リガンド結合ドメインポリペプチドに対して異なるアミノ酸による、少なくとも１つの野生型または天然に生じるアミノ酸の置換を含む。

置換突然変異体ポリペプチドが、２以上の野生型または天然に生じるアミノ酸の置換を含む場合、この置換は、置換につき欠失されたのと同等数の野生型または天然に生じるアミノ酸、すなわち、２つの非−野生型または非−天然に生じるアミノ酸で置換された２つの野生型または天然に生じるアミノ酸、または置換につき欠失された非−同等数の野生型アミノ酸、すなわち、１つの非−野生型アミノ酸で置換された２つの野生型アミノ酸（置換＋欠失突然変異）、または、３つの非−野生型アミノ酸で置換された２つの野生型アミノ酸（置換＋挿入突然変異）のいずれかを含むことができる。置換突然変異体は、参照ポリペプチド配列内で置換されたアミノ酸の残基および数ならびに置換された新しいアミノ酸残基を示す省略命名システムを用いて記載することができる。例えば、ポリペプチドの２０番目のアミノ酸残基が置換された置換突然変異体は、「ｘ２０ｚ」と略することができ、ここに、「ｘ」は置換されるべきアミノ酸であり、「２０」はポリペプチド内のアミノ酸残基の位置または数であって、「ｚ」は新しい置換されたアミノ酸である。従って、相互交換可能に「Ｅ２０Ａ」または「Ｇｌｕ２０Ａｌａ」と略された置換突然変異体は、当該突然変異体が、ポリペプチドの位置２０において（当該分野において通常は「Ｅ」または「Ｇｌｕ」と略される）グルタミン酸の代わりに（当該分野では通常「Ａ」または「Ａｌａ」と略される）アラニン残基を含むことを示す。

置換突然変異は、限定されるものではないが、イン・ビトロ部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ、Ｃ．ら、１９７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、１９８４、ＤＮＡ３：４７９−４８８；Ｏｌｉｐｈａｎｔら、１９８６、Ｇｅｎｅ４４：１７７；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：７１０）、ＴＡＢ（登録商標）リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用、制限エンドヌクレアーゼ消化／断片欠失および置換、ＰＣＲ−媒介／オリゴヌクレオチド特異的変異誘発等を含めた、当該分野で知られた突然変異誘発についてのいずれかの技術によってなすことができる。ＰＣＲ−ベースの技術は部位特異的変異誘発につき好ましい（Ｈｉｇｕｃｈｉ、１９８９、「ＵｓｉｎｇＰＣＲｔｏＥｎｇｉｎｅｅｒＤＮＡ」、ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ中：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ編、ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ、第６章、ページ６１−７０参照）。

本発明によるポリペプチドの「断片」は、そのアミノ酸配列が参照ポリペプチドの配列よりも短く、かつこれらの参照ポリペプチドに関する全部分にわたり、同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味すると理解されるであろう。そのような断片は、適切には、それらがその一部であるより大きなポリペプチドに含まれることができる。本発明によるポリペプチドのそのような断片は、少なくとも２、３、４、５、６、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２５、２６、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、２４０または３００のアミノ酸の長さを有することができる。

ポリペプチドまたは蛋白質の「変種」は、ポリペプチドまたは蛋白質に由来し、かつ当該ポリペプチドまたは蛋白質の少なくとも１つの生物学的特性を保持する全てのアナログ、断片、誘導体または突然変異体である。ポリペプチドまたは蛋白質の異なる変種は天然に存在することができる。これらの変種は、蛋白質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の差によって特徴付けられる対立遺伝子変種であってもよく、あるいはディファレンシャルスプライシング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓｐｌｉｃｉｎｇ）または翻訳後修飾を含むことができる。当業者は、単数または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または置き換えを有する変種を生じさせることができる。これらの変種は、とりわけ、（ａ）１以上のアミノ酸残基が保存的または非−保存的アミノ酸で置き換えられた変種、（ｂ）１以上のアミノ酸がポリペプチドまたは蛋白質に付加された変種、（ｃ）１以上のアミノ酸が置換基を含む変種、および（ｄ）ポリペプチドまたは蛋白質が血清アルブミンといった別のポリペプチドと融合した変種を含むことができる。遺伝的（抑制、欠失、突然変異等）、化学的および酵素的技術を含めた、これらの変種を得るための技術は当業者に知られている。変種ポリペプチドは、好ましくは、少なくとも約１４のアミノ酸を含む。

「異種蛋白質」とは、細胞中で天然では生じない蛋白質をいう。

「成熟蛋白質」とは、翻訳後に加工されたポリペプチド；すなわち、それから、一次翻訳産物中に存在する任意のプレまたはプロペプチドが除去されたものをいう。「前駆体」蛋白質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物をいう；すなわち、プレおよびプロペプチドが依然として存在する。プレおよびプロペプチドは、限定されるものではないが、細胞内局在シグナル（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ）であり得る。

用語「シグナルペプチド」とは分泌される成熟蛋白質に先行するアミノ末端ポリペプチドをいう。シグナルペプチドは切断され、従って、成熟蛋白質には存在しない。シグナルペプチドは、分泌される蛋白質を細胞膜を横切るように向け、移動させる機能を有する。シグナルペプチドはシグナル蛋白質ともいう。

「シグナル配列」は、細胞の表面に発現されるべき蛋白質のコーディング配列の始めに含まれる。この配列は成熟ポリペプチドに対してＮ−末端側にあり、宿主細胞に指令してポリペプチドを移動させるシグナルペプチドをコードする。用語「移動（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）シグナル配列」は、ここでは、この種類のシグナル配列をいうのに用いられる。移動シグナル配列は真核生物および原核生物に対して天然の種々の蛋白質と関連することが分かっており、しばしば、双方のタイプの生物で機能できる。

用語「相同性」とは、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分の間の同一性のパーセントをいう。１つの部分からの配列およびもう１つからの配列の間の対応性は、当該分野で知られた技術によって決定することができる。例えば、相同性は、配列情報を整列させ、かつ容易に入手できるコンピュータプログラムを用いることによって、２つのポリペプチド分子の間の配列情報の直接的比較によって決定することができる。別法として、相同性は、相同領域の間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリライゼーション、続いての、一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化および消化された断片のサイズ測定によって決定することができる。

本明細書中で用いるように、全てのその文法の形式およびスペリングの変形における用語「相同な」とは、スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）からの蛋白質および異なる種からの相同蛋白質（例えば、ミオシン軽鎖等）を含めた、「共通の進化起源」を保有する蛋白質の間の関係をいう（Ｒｅｅｃｋら、１９８７、Ｃｅｌｌ５０：６６７）。そのような蛋白質（およびそのコーディング遺伝子）は、その高い配列同様性の程度によって反映される配列相同性を有する。しかしながら、通常の用法および本出願においては、用後「相同な」は、「高度に」といった副詞で修飾された場合、配列同様性をいうことができ、共通の進化起源をいわない。

従って、全てのその文法的形式における用語「配列同様性」とは、共通の進化起源を有しても有さなくてもよい蛋白質の核酸もしくはアミノ酸配列の間の同一性または対応性の程度をいう（Ｒｅｅｃｋら、１９８７、Ｃｅｌｌ５０：６６７参照）。

特定の実施形態においては、ヌクレオチドの少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）がＤＮＡ配列の画定された長さにわたってマッチする場合、２つのＤＮＡ配列は「実質的に相同」または「実質的に同様」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで入手できる標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することによって、あるいは、その特定のシステムにつき定義された、例えば、ストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件の画定は当業者の技術範囲内のものである。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前掲参照。

本明細書中で用いるように「実質的に同様な」とは、１以上のヌクレオチド塩基の変化の結果、１以上のアミノ酸が置換されるが、ＤＮＡ配列によってコードされる蛋白質の機能的特性には影響しない核酸断片をいう。また、「実質的に同様な」とは、１以上のヌクレオチド塩基の変化が、アンチセンスまたは共抑制技術による遺伝子発現の改変を媒介する核酸断片の能力に影響しない核酸断片もいう。また、「実質的に同様な」とは、得られた転写体の機能的特性に実質的に影響しない１以上のヌクレオチド塩基の欠失または挿入といった本発明の核酸断片の修飾もいう。従って、本発明は特定の具体的配列を超えて含むことが理解される。提案された修飾の各々は、コードされた産物の生物学的活性の保持の測定のように、十分に当業者のルーチン的技量内のものである。

さらに、当業者であれば、本発明に含まれる実質的に同様な配列は、ストリンジェントな条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃および洗浄２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、続いての０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）下で、本明細書中に例示した配列にハイブリダイズするそれらの能力によって、画定されることを認識するであろう。本発明の実質的に同様な核酸断片は、そのＤＮＡ配列がここに報告した核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも７０％同一であるものである。本発明の実質的に好ましい核酸断片は、そのＤＮＡ配列が、ここに報告した核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である核酸断片である。より好ましい核酸断片は、ここに報告する核酸断片のＤＮＡ配列に少なくとも９０％同一である。なおより好ましいのは、ここに報告する核酸断片のＤＮＡ配列に対して少なくとも９５％同一である核酸断片である。

約４０％を超えるアミノ酸が同一であるか、あるいは６０％を超えて同様である（機能的に同一である）場合に、２つのアミノ酸配列は「実施的に相同」または「実質的に同様」である。好ましくは、同様または相同な配列は、例えば、ＧＣＧ（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、ＰｒｏｇｒａｍＭａｎｕａｌｆｏｒｔｈｅＧＣＧＰａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ７、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムを用いるアラインメントによって同定される。

用語「に対応する」は、ここでは、正確な位置が同様性または相同性が測定される分子と同一であるかまたは異なるかを問わず、同様なまたは相同な配列をいうのに用いられる。核酸またはアミノ酸配列アラインメントはスペースを含むことができる。かくして、用語「に対応する」とは、配列同様性をいい、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基のナンバリングをいわない。

アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、当業者による配列の手動評価によるか、またはＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら、（１９９３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；またｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／参照）といったアルゴリズムを用いるコンピュータ−自動配列比較および同定によって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む。一般に、１０以上の連続アミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列が、ポリペプチドまたは核酸配列が既知の蛋白質または遺伝子に相同であるかを推定的に同定するのに必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、２０−３０の連続ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのイン・サイチュハイブリダイゼーション）の配列−依存的方法で用いることができる。加えて、１２−１５塩基の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲにおける増幅プライマーとして用いて、プライマーを含む特定の核酸断片を得ることができる。従って、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、該配列を含む核酸断片を特異的に同定しおよび／または単離するのに十分な配列を含む。

当該分野で知られたように、用語「同一性パーセント」は、配列を比較することによって決定されるように、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該分野においては、「同一性」とは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度を意味し、この場合には、かかる配列のストリングの間のマッチによって決定され得る。「同一性」および「同様性」は、ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：ＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９３）；ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａ、ＰａｒｔＩ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ（１９９４）；ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎＨｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９１）に記載されたものを含めた公知の方法によって容易に計算することができるが、これに限定されるものではない。同一性を決定するための好ましい方法は、テストする配列の間で最良のマッチを与えるように設計される。同一性および同様性を決定する方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムに編修されている。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティックスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲＩｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて行うことができる。配列の多重アラインメントは、デフォルトパラメーター（ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰＬＥＮＧＴＨＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を備えたアラインメントのＣｌｕｓｔａｌ方法（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）を用いて行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ方法を用いる対様式のアラインメントについてのデフォルトパラメーターを選択することができる：ＫＴＵＰＬＥ１、ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳＳＡＶＥＤ＝５。

用語「配列分析ソフトウェア」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析で有用ないずれのコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムもいう。「配列分析ソフトウェア」は、市販により入手できるか、あるいは独立して開発することができる。典型的な配列分析ソフトウェアは、限定されるものではないが、プログラムのＧＣＧスイート（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅＶｅｒｓｉｏｎ９．０、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８Ｓ．ＰａｒｋＳｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７１５ＵＳＡ）を含むであろう。本出願の文脈内では配列分析ソフトウェアを分析に用いる場合、特に断りのない限り、分析の結果は参照されたプログラムの「デフォルト値」に基づくであろう。本明細書中で用いられる「デフォルト値」とは、最初に初期化した時に最初にソフトウェアにロードされた値またはパラメーターのいずれの組も意味するであろう。

「合成遺伝子」は、当業者に知られた手法を用いて化学的に合成されたオリゴヌクレオチドビルディングブロックから組み立てることができる。これらのビルディングブロックを連結し、アニールして、遺伝子セグメントを形成させ、次いで、これを酵素的に組み立てて全遺伝子を構築する。ＤＮＡの配列に関連する「化学的に合成された」とは、構成要素ヌクレオチドがイン・ビトロで組み立てられたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成はよく確立された手法を用いて達成することができるか、あるいは多数の市販のマシーンのうちの１つを用いて自動化学合成を行うことができる。従って、遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づく最適遺伝子発現となるように仕立てることができる。もし、コドン利用が宿主に好都合なコドンに偏るならば、当業者であれば首尾よい遺伝子発現の確率を認識するであろう。好ましいコドンの決定は、配列の情報が入手可能な場合には、宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。

本明細書で用いるように、２以上の個々に作動できる遺伝子調節システムは、ａ）選択された濃度において、その各リガンドによる与えられたシステムの各々の変調の結果、そのシステムの遺伝子の発現の大きさが測定可能に変化し、およびｂ）該変化が、現実の変調の同時性または順次性に関わらず、細胞、組織または生物において同時に作動することができる全ての他のシステムの発現の変化とは統計学的に有意に異なる場合、「直交している」と言われる。好ましくは、各々が独自で作動できる遺伝子調節システムの変調は、細胞、組織または生物における全ての他の作動可能なシステムよりも少なくとも２倍より大きく遺伝子発現の変化に影響する。より好ましくは、該変化は少なくとも５倍大きい。なおより好ましくは、該変化は少なくとも１０倍大きい。さらにより好ましくは、該変化は少なくとも１００倍大きい。さらになおより好ましくは、該変化は少なくとも５００倍大きい。理想的には、選択された濃度におけるその各リガンドによる与えられたシステムの各々の変調の結果、そのシステムの遺伝子の発現の大きさの測定可能な変化が起こり、細胞、組織または生物において作動できる全ての他のシステムの発現の測定可能な変化は起きない。そのような場合、多重誘導性遺伝子調節システムは「十分に直交している」と言われる。本発明は、ここに引用してその全体を本明細書の一部とみなす係属中の米国出願第６０／２３７，４４６号に記載されたもののような直交リガンドおよび直交受容体−ベースの遺伝子発現システムにつきサーチするのに有用である。

（本発明の遺伝子発現変調システム）
出願人らは、エクジソン受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおいてリガンド感受性および誘導の大きさに影響するグループＨ核受容体リガンド結合ドメインへのリガンド結合に関与するアミノ酸残基をここに同定した。出願人らは、ここに、これらの臨界的残基における置換突然変異を含むグループＨ核受容体の構築（ここでは「置換突然変異体」という）、およびこれらの置換突然変異体核受容体が遺伝子発現を変調する方法で有用である証明を記載する。本明細書に提示するように、出願人らの新規な置換突然変異体核受容体および核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるそれらの使用は、原核生物および真核生物宿主細胞双方において、リガンド感受性およびトランス活性化の大きさが、適用に応じて、所望により選択することができる改良された誘導性遺伝子発現システムを提供する。

かくして、本発明は、新規な置換突然変異体グループＨ核受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、そのような突然変異されたグループＨ核受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システム、ならびにそのような核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムを用いて宿主細胞内の遺伝子の発現を変調する方法に関する。

特に、本発明は、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞で発現させることができる少なくとも１つの遺伝子発現カセットを含む遺伝子発現変調システムに関する。好ましくは、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用蛋白質−１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様蛋白質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用蛋白質１４、およびファルネゾール受容体からのものである。より好ましくは、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体からのものである。

特定の実施形態において、遺伝子発現変調システムは、トランス活性化ドメイン、その発現を変調すべき遺伝子に関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、および置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットを含む。該遺伝子発現変調システムは、さらに、ｉ）第１の遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメインによって認識される応答エレメント；ｉｉ）第１の遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびｉｉｉ）その発現が変調されるべき遺伝子を含む第２の遺伝子発現カセットを含むことができる。

他の特定の実施形態において、遺伝子発現変調システムは、ａ）トランス活性化ドメイン、その発現が変調されるべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、および置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびｂ）脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、ウルトラスピラクル蛋白質リガンド結合ドメイン、および２つのポリペプチド断片を含むキメラリガンド結合ドメインよりなる群から選択される第２の核受容体リガンド結合ドメインを含む遺伝子発現カセットを含み、ここに、第１のポリペプチド断片は脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、またはウルトラスピラクル蛋白質リガンド結合ドメインからのものであり、第２のポリペプチド断片は異なる脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、またはウルトラスピラクル蛋白質リガンド結合ドメインからのものである。該遺伝子発現変調システムは、さらに、ｉ）第１の遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメインによって認識される応答エレメント；ｉｉ）第１の遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびｉｉｉ）その発現が変調されるべき遺伝子を含む第２の遺伝子発現カセットを含むことができる。

他の特定の実施形態において、遺伝子発現変調システムは、その発現を変調すべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメインおよび核受容体リガンド結合ドメインを含む第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１の遺伝子発現カセット、およびトランス活性化ドメインおよび核受容体リガンド結合ドメインを含む第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第２の遺伝子発現カセットを含み、ここに、核受容体リガンド結合ドメインの１つは、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインである。好ましい実施形態において、第１のポリペプチドはトランス活性化ドメインを実質的に含まず、第２のポリペプチドはＤＮＡ結合ドメインを実質的に含まない。本発明の目的では、「実質的に含まない」とは、問題の蛋白質が、活性化または結合活性を供するために問題のドメインの十分な配列を含まないことを意味する。該遺伝子発現変調システムは、さらに、ｉ）第１の遺伝子発現カセットの第１のポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメインによって認識される応答エレメント；ｉｉ）第２の遺伝子発現カセットの第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびｉｉｉ）その発現を変調すべき遺伝子を含む第３の遺伝子発現カセットを含むことができる。

ただ１つの核受容体リガンド結合ドメインが置換突然変異を含むグループＨリガンド結合ドメインである場合、他の核受容体リガンド結合ドメインは、置換突然変異を含むグループＨリガンド結合ドメインとダイマーを形成するいずれかの他の核受容体からのものであってよい。例えば、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインが置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインである場合、他の核受容体リガンド結合ドメイン（「パートナー」）はエクジソン受容体、脊椎動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）、無脊椎動物ＲＸＲ、ウルトラスピラクル蛋白質（ＵＳＰ）、または脊椎動物ＲＸＲ、無脊椎動物ＲＸＲ、およびＵＳＰよりなる群から選択される少なくとも２つの異なる核受容体リガンド結合ドメインポリペプチド断片を含むキメラ核受容体からのものである（ここに引用してその全体を本明細書の一部とみなす係属中の出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０号、ＵＳ６０／２９４，８１４号およびＵＳ６０／２９４，８１９号参照。「パートナー」核受容体リガンド結合ドメインは、さらに、トランケーション突然変異、欠失突然変異、置換突然変異または他の修飾を含むことができる。

好ましくは、脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインはヒトＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）（ＨｓＲＸＲ）、マウスＭｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ（ハツカネズミ）（ＭｍＲＸＲ）、ラットＲａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）（ＲｎＲＸＲ）、ニワトリＧａｌｌｕｓｇａｌｌｕｓ（チャボ）（ＧｇＲＸＲ）、家畜ブタＳｕｓｓｃｒｏｆａｄｏｍｅｓｔｉｃａ（ブタ）（ＳｘＲＸＲ）、カエルＸｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ（アフリカツメガエル）（ＸｌＲＸＲ）、ゼブラフィッシュＤａｎｉｏｒｅｒｉｏ（ゼブラダニオ）（ＤｒＲＸＲ）、ホヤＰｏｌｙａｎｄｒｏｃａｒｐａｍｉｓａｋｉｅｎｓｉｓ（ミサキマメイタボヤ）（ＰｍＲＸＲ）、またはクラゲＴｒｉｐｅｄａｌｉａｃｙｓｏｐｈｏｒａＲＸＲからのものである。

好ましくは、無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインはバッタＬｏｃｕｓｔａｍｉｇｒａｔｏｒｉａ（トノサマバッタ）ウルトラスピラクルポリペプチド（「ＬｍＵＳＰ」）、マダニＡｍｂｌｙｏｍｍａａｍｅｒｉｃａｎｕｍＲＸＲホモログ１（「ＡｍａＲＸＲ１」）、マダニＡｍｂｌｙｏｍｍａａｍｅｒｉｃａｎｕｍＲＸＲホモログ２（「ＡｍａＲＸＲ２」）、シオマネキＣｅｌｕｃａｐｕｇｉｌａｔｏｒＲＸＲホモログ（「ＣｐＲＸＲ」）、甲虫Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ（チャイロコメノゴミムシダマシ）ＲＸＲホモログ（「ＴｍＲＸＲ」）、ミツバチＡｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ（ヨーロッパミツバチ）ＲＸＲホモログ（「ＡｍＲＸＲ」）、アブラムシＭｙｚｕｓｐｅｒｓｉｃａｅ（モモアカアブラムシ）ＲＸＲホモログ（「ＭｐＲＸＲ」）、または非−双翅目（ｎｏｎ−Ｄｉｐｔｅｒａｎ）／非−鱗翅目（ｎｏｎ−Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）ＲＸＲホモログからのものである。

好ましくは、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、無脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、および非−双翅目／非−鱗翅目無脊椎動物種ＲＸＲホモログポリペプチド断片よりなる群から選択される少なくとも２つのポリペプチド断片を含む。本発明で用いるキメラＲＸＲリガンド結合ドメインは少なくとも２つの異なる種のＲＸＲポリペプチド断片を含むことができるか、種が同一である場合、２以上のポリペプチド断片はその種のＲＸＲポリペプチド断片の２以上の異なるアイソフォームからのものであり得る。

好ましい実施形態において、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは少なくとも１つの脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片および１つの無脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片を含む。

より好ましい実施形態において、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは少なくとも１つの脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片および１つの非−双翅目／非−鱗翅目無脊椎動物種ＲＸＲホモログポリペプチド断片を含む。

特定の実施形態において、その発現を変調すべき遺伝子は宿主細胞に関して同種遺伝子である。他の特定の実施形態において、その発現を変調すべき遺伝子は宿主細胞に関して異種遺伝子である。

遺伝子に連結した応答エレメントに結合する、核受容体のリガンド結合ドメインと組み合わせた場合、後述する本発明で用いるリガンドは遺伝子の発現の外部一時的調節用の手段を提供する。本発明の種々の構成要素が相互に結合する結合メカニズムまたは順序、すなわち、例えば、リガンドに対してリガンド結合ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメインに対して応答エレメント、トランス活性化ドメインに対してプロモーター等は重要でない。

特定の例においては、グループＨ核受容体および、所望により、その核受容体リガンド結合ドメインパートナーのリガンド結合ドメインへの該リガンドの結合は、遺伝子の発現または抑制を可能とする。このメカニズムは、グループＨ核受容体（ＧＨＮＲ）またはそのパートナーへのリガンド結合に対するポテンシャル、および活性ホモダイマー複合体（例えば、ＧＨＮＲ＋ＧＨＮＲまたはパートナー＋パートナー）の形成が得られることを排除しない。好ましくは、１以上の受容体ドメインが変化し、ハイブリッド遺伝子スイッチを生じる。典型的には３つのドメイン、ＤＢＤ、ＬＢＤおよびトランス活性化ドメインのうちの１以上は、他のドメインの源とは異なる源から選択することができ、従ってハイブリッド遺伝子および得られるハイブリッド蛋白質は、トランス活性化活性、リガンドの相補的結合、および特定の応答エレメントの認識につき、選択された宿主細胞または生物において最適化される。加えて、応答エレメントそれ自体は、酵母からのＧＡＬ−４蛋白質（Ｓａｄｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ、３３５：５６３−５６４参照）もしくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉからのＬｅｘＡ蛋白質（ＢｒｅｎｔおよびＰｔａｓｈｎｅ（１９８５）、Ｃｅｌｌ、４３：７２９−７３６）をはじめとする他のＤＮＡ結合蛋白質ドメインについての応答エレメントで、または特定の相互作用（例えば、Ｋｉｍら（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：３６１６−３６２０参照）のために設計され、修飾されおよび選択された蛋白質との標的化相互作用につき特異的な合成応答エレメントで、修飾または置換されることができ、ハイブリッド受容体を適応させる。２−ハイブリッドシステムの他の利点は、それらが、所望の最終目的に従って遺伝子発現を駆動するのに用いるプロモーターの選択を可能とすることである。そのような二重制御は、特に細胞毒性蛋白質が生産される場合に、遺伝子治療の領域で特に重要であり得る。なぜならば、発現のタイミングならびに発現が起こる細胞の両方が制御できるからである。適当なプロモーターに作動可能に連結した遺伝子が対象の細胞に導入されると、本発明のシステムの存在によって外因性遺伝子の発現が制御される。プロモーターは構成的または誘導的に調節することができるか、あるいは組織特異的（すなわち、特定タイプの細胞でのみ発現される）、または生物のある発生段階に対して特異的であり得る。

エクジソン受容体は核受容体スーパーファミリーのメンバーであって、サブファミリー１、グループＨ（ここでは「グループＨ核受容体」という）に分類される。各グループのメンバーはＥ（リガンド結合）ドメインにおいて４０−６０％のアミノ酸同一性を有する（Ｌａｕｄｅｔら、ＡＵｎｉｆｉｅｄＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＳｙｓｔｅｍｆｏｒｔｈｅＮｕｃｌｅａｒＲｅｃｅｐｔｏｒＳｕｂｆａｍｉｌｙ、１９９９Ｃｅｌｌ９７：１６１−１６３）。エクジソン受容体に加え、この核受容体サブファミリ−１、グループＨの他のメンバーはユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン受容体１（ＯＲ−１）、ステロイドホルモン核受容体１（ＮＥＲ−１）、レチノイドＸ受容体相互作用蛋白質ー１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓Ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様蛋白質（ＲＬＤ−１）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓Ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用蛋白質１４（ＲＩＰ−１４）、およびファルネゾール受容体（ＨＲＲ−１）を含む。

出願人らは、ＣｆＥｃＲ相同性モデルを開発し、公開されたＣｈｉｒｏｎｏｍｏｕｓｔｅｔａｎｓエクジソン受容体（「ＣｔＥｃＲ」）相同性モデル（Ｗｕｒｔｚら、２０００）と一緒にこの相同性モデルを用いて、ステロイドおよび非−ステロイドへの結合に関与する臨界的残基を同定した。合成非−ステロイドのジアシルヒドラジンは高い親和性をもって鱗翅目ＥｃＲに結合し、これらの昆虫において早めの不完全な脱皮を誘導（Ｗｉｎｇら、１９８８）することを示し、これらの化合物のいくつかは現在殺虫剤として市販されている。ＥｃＲのリガンド結合キャビティまたは「ポケット」は、２０−ヒドロキシエクジソン（２０Ｅ）といったエクジステロイドの長い骨格構造に適合するように進化している。該ジアシルヒドラジンはステロイドと比較してコンパクトな構造を有し、ＥｃＲ結合ポケットの底部のみを占有する。これは、ステロイドと接触するが、ビスアシルヒドラジンといった非−ステロイドと接触しない結合ポケットの頂部に数個の臨界的残基を残す。出願人らは、本明細書に、これらの結合ポケット残基において置換突然変異を含む突然変異体エクジソン受容体の構築を記載し、修飾されたリガンド結合およびトランス活性化特性を持つ置換突然変異体エクジソン受容体のいくつかのクラスを同定した。

他のグループＨ核受容体に対するエクジソン受容体の密接な関連性を仮定して、出願人らの同定されたエクジソン受容体リガンド結合ドメイン置換突然変異は、他のグループＨ核受容体のリガンド結合ドメインの類似の位置に導入された場合、働いてそれらのリガンド結合またはリガンド感受性を修飾すると予測される。出願人らの新規な置換突然変異したグループＨ核受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子治療、宿主細胞における注目する蛋白質の発現、トランスジェニック生物の生産、および細胞−ベースのアッセイを含めた種々の適用のための核受容体−ベースの誘導性遺伝子変調システムで有用である。

特に、出願人らは、ここに、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む新規な遺伝子発現変調システムを記載する。この遺伝子発現システムは、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメインおよびリガンド結合ドメインが１つのコードされたポリペプチド上にある「単一スイッチ」−ベースの遺伝子発現システムであってよい。別法として、遺伝子発現変調システムは、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ−結合ドメインが２つの異なるコードされたポリペプチド上にある「デュアルスイッチ」−または「２−ハイブリッド」−ベースの遺伝子発現変調システムであってよい。出願人らは、初めて、置換突然変異した核受容体を核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムの構成要素として用いて、原核生物および真核生物細胞双方においてリガンド結合活性および／またはリガンド特異性を修飾することができることを示した。ここに議論するように、出願人らの知見は予期せぬかつ驚くべきことである。

本発明のエクジソン受容体−ベースの遺伝子発現変調システムはヘテロダイマーおよびホモダイマーのいずれであってもよい。機能的ＥｃＲ複合体は、一般に、ステロイド受容体ファミリー、種々の昆虫から得られたエクジソン受容体蛋白質、およびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）蛋白質もしくはＵＳＰの脊椎動物ホモログ、レチノイドＸ受容体蛋白質の２つのメンバーよりなるヘテロダイマー蛋白質複合体をいう（Ｙａｏら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６６：４７６−４７９；Ｙａｏら（１９９２）Ｃｅｌｌ７１：６３−７２参照）。しかしながら、後述するように、該複合体はホモダイマーであってもよい。機能的エクジステロイド受容体複合体はイムノフィリンといったさらなる蛋白質を含むこともできる。（ＤＨＲ３８またはベータＦＴＺ−１といった）転写因子として知られている蛋白質のステロイド受容体ファミリーのさらなるメンバーは、ＥｃＲ、ＵＳＰおよび／またはＲＸＲに対してリガンド依存的または非依存的パートナーであってもよい。加えて、一般に（アダプターまたはメディエーターともいう）コアクチベーターとして知られている蛋白質といった他の補因子も必要であろう。これらの蛋白質は配列特異的にＤＮＡに結合せず、基礎的な転写に関与しない。それらは、クロマチン構造に影響することによって、またはアクチベーター−開始複合体相互作用を媒介することによって、アクチベーターのＤＮＡ−結合の刺激を含めた種々のメカニズムを通じて転写活性化に対してそれらの効果を発揮することができる。そのようなコアクチベーターの例はＲＩＰ１４０、ＴＩＦ１、ＲＡＰ４６／Ｂａｇ−１、ＡＲＡ７０、ＳＲＣ−１／ＮＣｏＡ−１、ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ／ＮＣｏＡ−２、ＡＣＴＲ／ＡＩＢ１／ＲＡＣ３／ｐＣＩＰならびに乱交雑（ｐｒｏｍｉｓｃｏｕｓ）コアクチベーターＣ応答エレメントＢ結合蛋白質、ＣＢＰ／ｐ３００を含む（レビューについては、Ｇｌａｓｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．９：２２２−２３２、１９９７参照）。また、（リプレッサー、サイレンサーまたはサイレンシングメディエーターとしても知られている）一般にコリプレッサーとして知られた蛋白質補因子が、リガンドの不存在下で転写活性化を効果的に阻害するのに必要であろう。これらのコリプレッサーは非リガンド化エクジソン受容体と相互作用して、応答エレメントにおける活性をサイレントとすることができる。現在の証拠は、リガンドの結合が受容体の立体配座を変化させ、その結果、コリプレッサーが放出され、前記コアクチベーターが動員され、それにより、それらのサイレンシング活性がなくなることを示唆する。コリプレッサーの例はＮ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴを含む（レビューについては、Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０：１１６７−１１７７、１９９６参照）。これらの補因子は細胞または生物内で内因性であってよいか、あるいは、調節または非調節いずれかの様式にて発現されるべきトランスジーンとして外因的に添加することができる。エクジソン受容体蛋白質、ＵＳＰまたはＲＸＲのホモダイマー複合体はいくつかの状況下で機能的であり得る。

エクジソン受容体複合体は、典型的には、核受容体スーパーファミリーのメンバーである蛋白質を含み、ここに、全てのメンバーは、一般に、アミノ−末端トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」）、およびヒンジ領域によってＤＢＤから分離されたリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）の存在によって特徴付けられる。本明細書中で用語「ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＤＮＡ結合ドメインが特定の応答エレメントと関連するように機能する限り、ＤＮＡ結合蛋白質の全長までのＤＮＡ結合蛋白質の最小ポリペプチド配列を含む。また、核受容体スーパーファミリーのメンバーは４つまたは５つのドメイン：Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびあるメンバーではＦの存在によって特徴付けられる（米国特許第４，９８１，７８４号およびＥｖａｎｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：８８９−８９５（１９８８）参照）。該「Ａ／Ｂ」ドメインはトランス活性化ドメインに対応し、「Ｃ」はＤＮＡ結合ドメインに対応し、「Ｄ」はヒンジ領域に対応し、「Ｅ」はリガンド結合ドメインに対応する。また、該ファミリーのいくつかのメンバーは、「Ｆ」に対応するＬＢＤのカルボキシ−末端側にもう１つのトランス活性化ドメインを有することもできる。

ＤＢＤは、エクジソン応答エレメントに対する特異性を付与する、２つのアミノ酸モチーフ、Ｐ−ボックスおよびＤ−ボックスの間の２つのシステイン亜鉛フィンガーの存在によって特徴付けられる。これらのドメインは天然のものであり、修飾されており、または異種受容体蛋白質の異なるドメインのキメラであってよい。また、ステロイド受容体ファミリーのサブセットのように、ＥｃＲ受容体はヘテロ二量体化特性を担うあまりよくは画定されていない領域も保有する。核受容体のドメインは本来モジュールであるので、ＬＢＤ、ＤＢＤおよびトランス活性化ドメインを相互に交換することができる。

エクジソン受容体複合体からの構成要素を取り込む遺伝子スイッチシステムが知られている。しかしながら、これらの公知のシステムにおいては、ＥｃＲが用いられる場合は常に、それは、同一分子上の天然もしくは修飾されたＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインに関連する。ＵＳＰまたはＲＸＲは、典型的には、サイレントパートナーとして用いられる。出願人らは、以前に、ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインが同一分子上にあると、リガンドの不存在下におけるバックグラウンド活性は高いこと、およびＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインが異なる分子上に、すなわち、ヘテロダイマーまたはホモダイマー複合体の２つのパートナーの各々の上にあると、そのような活性は劇的に低下することを示した（ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０号参照）。

（本発明の遺伝子発現カセット）
本発明の新規な核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムは、宿主細胞で発現させることができる少なくとも１つの遺伝子発現カセットを含み、ここに、該遺伝子発現カセットは置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。かくして、出願人らの発明は、本発明の遺伝子発現システムで用いる新規な遺伝子発現カセットも提供する。

特定の実施形態において、宿主細胞で発現させることができる遺伝子発現カセットはａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン、および置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ−結合ドメイン、および置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド；およびｃ）トランス活性化ドメイン、および置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

他の特定の実施形態において、本発明は、宿主細胞で発現させることができる遺伝子発現カセットを提供し、ここに、該遺伝子発現カセットはａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン、および置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ−結合ドメイン、および置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド；およびｃ）トランス活性化ドメイン、および置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドよりなる群から選択されるハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明によるハイブリッドポリペプチドは、少なくとも２つのポリペプチド断片を含み、ここに、各ポリペプチド断片は異なる源、すなわち、異なるポリペプチド、異なる核受容体、異なる種等からのものである。本発明によるハイブリッドポリペプチドは少なくとも２つのポリペプチドドメインを含み、ここに、各ポリペプチドドメインは異なる源からのものである。

特定の実施形態において、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用蛋白質−１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様蛋白質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用蛋白質１４、およびファルネゾール受容体からのものである。好ましい実施形態において、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体からのものである。

かくして、本発明は、ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン、および置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ−結合ドメイン、および置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド；およびｃ）トランス活性化ドメイン、および置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットも提供する。好ましくは、該遺伝子発現カセットはａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン、および置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ−結合ドメイン、および置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド；およびｃ）トランス活性化ドメイン、および置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドよりなる群から選択されるハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ここに、該コードされたハイブリッドポリペプチドは少なくとも２つのポリペプチド断片を含み、ここに、各ポリペプチド断片は異なる源からのものである。

エクジソン受容体（ＥｃＲ）リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は、無脊椎動物ＥｃＲからのものであってよく、好ましくは節足動物（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄ）網ＥｃＲから選択される。好ましくは、ＥｃＲは鱗翅目ＥｃＲ、双翅目ＥｃＲ、直翅目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａｎ）ＥｃＲ、同翅目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａｎ）ＥｃＲおよび半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ）ＥｃＲよりなる群から選択される。より好ましくは、本発明で用いるＥｃＲリガンド結合ドメインは、ハマキガ科のガＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａｆｕｍｉｆｅｒａｎａ（トウヒシントメハマキ）ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）、甲虫Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ（チャイロコメノゴミムシダマシ）ＥｃＲ（「ＴｍＥｃＲ」）、Ｍａｎｄｕｃａｓｅｘｔａ（タバコスズメガ）ＥｃＲ（「ＭｓＥｃＲ」）、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｅｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（オオタバコガ）ＥｃＲ（「ＨｖＥｃＲ」）、ユスリカＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓｔｅｎｔａｎｓ（キミドリユスリカ）ＥｃＲ（「ＣｔＥｃＲ」）、カイコガＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉＥｃＲ（「ＢｍＥｃＲ」）、ヤブニラミブッシュブラウンＢｉｃｙｃｌｕｓａｎｙｎａｎａＥｃＲ（「ＢａｎＥｃＲ」）、トチノキＪｕｎｏｎｉａｃｏｅｎｉａ（アメリカタテハモドキ）ＥｃＲ（「ＪｃＥｃＲ」）、ミバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（キイロショウジョウバエ）ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）、カＡｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ（ネッタイシマカ）ＥｃＲ（「ＡａＥｃＲ」）、クロバエＬｕｃｉｌｉａｃａｐｉｔａｔａ（「ＬｃＥｃＲ」）、クロバエＬｕｃｉｌｉａｃｕｐｒｉｎａ（ヒツジキンバエ）ＥｃＲ（「ＬｕｃＥｃＲ」）、クロバエＣａｌｌｉｐｈｏｒａｖｉｃｉｎｉａ（ホホアカクロバエ）ＥｃＲ（「ＣｖＥｃＲ」）、地中海ミバエＣｅｒａｔｉｔｉｓｃａｐｉｔａｔａ（チチュウカイミバエ）ＥｃＲ（「ＣｃＥｃＲ」）、バッタＬｏｃｕｓｔａｍｉｇｒａｔｏｒｉａ（トノサマバッタ）ＥｃＲ（「ＬｍＥｃＲ」）、アブラムシＭｙｚｕｓｐｅｒｓｉｃａｅ（モモアカアブラムシ）ＥｃＲ（「ＭｐＥｃＲ」）、シオマネキＣｅｌｕｃａｐｕｇｉｌａｔｏｒＥｃＲ（「ＣｐＥｃＲ」）、マダニＡｍｂｌｙｏｍｍａａｍｅｒｉｃａｎｕｍＥｃＲ（「ＡｍａＥｃＲ」）、コナジラミＢａｍｅｃｉａａｒｇｅｎｔｉｆｏｌｉ（シルバーリーフコナジラミ）ＥｃＲ（「ＢａＥｃＲ」、配列番号：１１２）またはヨコバイＮｅｐｈｏｔｅｔｉｘｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ（ツマグロヨコバイ）ＥｃＲ（「ＮｃＥｃＲ」、配列番号：１１３）よりなる群から選択される。より好ましくは、ＬＢＤはＣｆＥｃＲ、ＤｍＥｃＲまたはＡｍａＥｃＲからのものである。

特定の実施形態においては、ＬＢＤはトランケートされたＥｃＲポリペプチドからのものである。ＥｃＲポリペプチドトランケーションの結果少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０または２６５アミノ酸の欠失をもたらす。好ましくは、ＥｃＲポリペプチドのトランケーションの結果、少なくとも部分的なポリペプチドドメインの欠失がもたらされる。より好ましくは、ＥｃＲポリペプチドのトランケーションの結果、少なくとも全ポリペプチドドメインの欠失がもたらされる。特定の実施形態においてはＥｃＲポリペプチドのトランケーションの結果、少なくともＡ／Ｂ−ドメイン、Ｃ−ドメイン、Ｄ−ドメイン、Ｆ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ−ドメイン、Ａ／Ｂ／１／２−Ｃ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｆ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｆ−ドメイン、部分的Ｅドメイン、または部分的Ｆドメインの欠失をもたらす。いくつかの完全なおよび／または部分的ドメイン欠失の組合せも行うことができる。

特定の実施形態において、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、９６、１０７、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、１７５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４または２３８、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９５および１１０、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１７５、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１２７、ｇ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１２７、および１７５、ｈ）配列番号：１のアミノ酸残基５２、１０７および１７５、ｉ）配列番号：１のアミノ酸残基９６、１０７および１７５、ｊ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１１０および１７５、ｋ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３、または２１７、あるいはｌ）配列番号：３のアミノ酸残基９１もしくは１０５の置換をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる。好ましい実施形態において、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体からのものである。

他の特定の実施形態において、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、１０９、１２０、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、または２３８と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるアラニン、バリン、イソロイシンまたはロイシン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるアラニン、スレオニン、アスパラギン酸またはメチオニン残基、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン、セリン、メチオニンまたはロイシン残基、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基１２３と同等または類似の位置におけるフェニルアラニン残基、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基９５と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン残基、ｇ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｈ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、ｉ）配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｊ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｋ）配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｌ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１２７と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｍ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｎ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるバリン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｏ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｐ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｑ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｒ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｓ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるプロリン、ｔ）配列番号：２のアミノ酸残基１２１と同等または類似の位置におけるアルギニンまたはロイシン、ｕ）配列番号：２のアミノ酸残基２１３と同等または類似の位置におけるアラニン、ｖ）配列番号：２のアミノ酸残基２１７と同等または類似の位置におけるアラニンまたはセリン、ｗ）配列番号：３のアミノ酸残基９１と同等または類似の位置におけるアラニンまたはｘ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるプロリンの置換をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる。好ましい実施形態において、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体からのものである。

他の特定の実施形態において、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５２Ｌ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｌ６１Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｉ、Ｆ１０９Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｍ、Ａ１１０Ｌ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｒ１７５Ｅ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、Ｍ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ｔ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５ＥまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＧ９１ＡまたはＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインである。

他の特定の実施形態において、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のＴ５８Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｌ、Ａ１１０ＳまたはＡ１１０Ｍ、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、およびｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐよりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドに、５００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７℃におけるハイブリダイゼーション工程および少なくとも６３℃における２×ＳＳＰＥでの洗浄工程を含むハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインポリペプチドである。好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーション条件はハイブリダイゼーション工程につき２００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７℃を含む。他の好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーション条件はハイブリダイゼーションおよび洗浄工程の双方につき２×ＳＳＰＥおよび６３℃を含む。他の好ましい実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは２０−ヒドロキシエクジソン結合活性、ポナステロンＡ結合活性、またはムリステロンＡ結合活性といったステロイド結合活性を欠く。

他の特定の実施形態において、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインはａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、９６、１０７、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、１７５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、または２３８、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９５および１１０、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１７５、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１２７、ｇ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１２７および１７５、ｈ）配列番号：１のアミノ酸残基５２、１０７および１７５、ｉ）配列番号：１のアミノ酸残基９６、１０７および１７５、ｊ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１１０および１７５、ｋ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３または２１７、あるいはｌ）配列番号：３のアミノ酸残基９１もしくは１０５と同等または類似の位置における置換突然変異を含む。好ましい実施形態において、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体からのものである。

好ましくは、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、１０９、１２０、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、または２３８と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるアラニン、バリン、イソロイシンまたはロイシン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるアラニン、スレオニン、アスパラギン酸またはメチオニン残基、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン、セリン、メチオニンまたはロイシン残基、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基１２３と同等または類似の位置におけるフェニルアラニン残基、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基９５と同等または類似の位置におけるアラニン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン残基、ｇ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｈ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、ｉ）配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｊ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｋ）配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｌ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１２７と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｍ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｎ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるバリン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｏ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｐ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｑ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｒ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｓ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるプロリン、ｔ）配列番号：２のアミノ酸残基１２１と同等または類似の位置におけるアルギニンまたはロイシン、ｕ）配列番号：２のアミノ酸残基２１３と同等または類似の位置におけるアラニン、ｖ）配列番号：２のアミノ酸残基２１７と同等または類似の位置におけるアラニンまたはセリン、ｗ）配列番号：３のアミノ酸残基９１と同等または類似の位置におけるアラニン、またはｘ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるプロリンの置換を含む。好ましい実施形態において、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体からのものである。

他の特定の実施形態において、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインは置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインポリペプチドであり、ここに、該置換突然変異はａ）配列番号：１のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５２Ｌ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｌ６１Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｉ、Ｆ１０９Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｍ、Ａ１１０Ｌ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｒ１７５Ｅ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、Ｍ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ｔ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５ＥまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＧ９１ＡまたはＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される。

ＤＮＡ結合ドメインは合成およびキメラＤＮＡ結合ドメイン、またはそのアナログ、組合せまたは修飾体を含めた、既知の応答エレメントを持つ任意のＤＮＡ結合ドメインとすることもできる。好ましくは、ＤＢＤはＧＡＬ４ＤＢＤ、ＬｅｘＡＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、グループＨ核受容体メンバーＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、または細菌ＬａｃＺＤＢＤである。より好ましくは、ＤＢＤはＥｃＲＤＢＤ［配列番号：４（ポリヌクレオチド）または配列番号：５（ポリペプチド）］、ＧＡＬ４ＤＢＤ［配列番号：６（ポリヌクレオチド）または配列番号：７（ポリペプチド）］、またはＬｅｘＡＤＢＤ［配列番号：８（ポリヌクレオチド）または配列番号：９（ポリペプチド）］である。

トランス活性化ドメイン（「ＡＤ」または「ＴＡ」と略する）は任意のグループＨ核受容体メンバーＡＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体ＡＤ、合成またはキメラＡＤ、ポリグルタミンＡＤ、塩基性または酸性アミノ酸ＡＤ、ＶＰ１６ＡＤ、ＧＡＬ４ＡＤ、ＮＦ−κＢＡＤ、ＢＰ６４ＡＤ、Ｂ４２酸性活性化ドメイン（Ｂ４２ＡＤ）、ｐ６５トランス活性化ドメイン（ｐ６５ＡＤ）、またはそのアナログ、組合せまたは修飾体であってもよい。特定の実施形態において、ＡＤは合成またはキメラＡＤであるか、あるいはＥｃＲ、グルココルチコイド受容体、ＶＰ１６、ＧＡＬ４、ＮＦ−κＢ、またはＢ４２酸性活性化ドメインＡＤから得られる。好ましくは、ＡＤはＥｃＲＡＤ［配列番号：１０（ポリヌクレオチド）または配列番号：１１（ポリペプチド）］、ＶＰ１６ＡＤ［配列番号：１２（ポリヌクレオチド）または配列番号：１３（ポリペプチド）］、Ｂ４２ＡＤ［配列番号：１４（ポリヌクレオチド）または配列番号：１５（ポリペプチド）］、またはｐ６５ＡＤ［配列番号：１６（ポリヌクレオチド）または配列番号：１７（ポリペプチド）］である。

特定の実施形態において、遺伝子発現カセットは、ａ）配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたＤＮＡ−結合ドメイン、またはｂ）配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４または配列番号：１６の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたトランス活性化ドメインのいずれか；および本発明によるポリヌクレオチドによってコードされた置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。好ましくは、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、本発明によるポリヌクレオチドによってコードされた突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインである。

他の特定の実施形態において、遺伝子発現カセットは、ａ）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９のアミノ酸配列を含むＤＮＡ−結合ドメイン、またはｂ）配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５または配列番号：１７のアミノ酸配列を含むトランス活性化ドメインのいずれか；および本発明による置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。好ましくは、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、本発明による置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインである。

また、本発明は、ｉ）ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドによって認識されるドメインを含む応答エレメント；ｉｉ）トランス活性化ドメインを含むポリペプチドによって活性化されるプロモーター；およびｉｉｉ）その発現が変調されるべき遺伝子を含む遺伝子発現カセットを提供する。

応答エレメント（「ＲＥ」）は既知のＤＮＡ結合ドメインを持つ任意の応答エレメント、またはそのアナログ、組合せまたは修飾体であってもよい。単一のＲＥを使用することができ、あるいは複数ＲＥ、同一ＲＥもしくは２以上の異なるＲＥの複数コピーのいずれかを本発明で用いることができる。特定の実施形態において、ＲＥはＧＡＬ４からのＲＥ（「ＧＡＬ４ＲＥ」）、ＬｅｘＡからのＲＥ、グループＨ核受容体ＲＥ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体ＲＥ、または合成ＤＮＡ結合ドメインを認識する合成ＲＥである。好ましくは、ＲＥは配列番号：１８のポリヌクレオチド配列を含むエクジソン応答エレメント（ＥｃＲＥ）、配列番号：１９のポリヌクレオチド配列を含むＧＡＬ４ＲＥ、または配列番号：２０のポリヌクレオチド配列を含むＬｅｘＡＲＥ（オペロン、「ｏｐ」）（「２ＸＬｅｘＡｏｐＲＥ」）である。

本発明によるステロイド／甲状腺ホルモン核受容体ＤＮＡ結合ドメイン、活性化ドメインまたは応答エレメントは、甲状腺ホルモン受容体α（ＴＲα）、甲状腺受容体１（ｃ−ｅｒｂＡ−１）、甲状腺ホルモン受容体β（ＴＲβ）、レチノイン酸受容体α（ＲＡＲα）、レチノイン酸受容体β（ＲＡＲβ、ＨＡＰ）、レチノイン酸受容体γ（ＲＡＲγ）、レチノイン酸受容体ガンマ−様（ＲＡＲＤ）、ペルオキシソームプロリファレーター−活性化受容体α（ＰＰＡＲα）、ペルオキシソームプロリファレーター−活性化受容体β（ＰＰＡＲβ）、ペルオキシソームプロリファレーター−活性化受容体δ（ＰＰＡＲδ、ＮＵＣ−１）、ペルオキシソームプロリファレーター−アクチベーター関連受容体（ＦＦＡＲ）、ペルオキシソームプロリファレーター−活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、甲状腺ホルモン受容体αの非−コーディングストランドによってコードされたオーファン受容体（ＲＥＶＥＲＢα）、Ｖ−ｅｒｂＡ関連受容体（ＥＡＲ−１）、ｖ−ｅｒｂ関連受容体（ＥＡＲ−１Ａ）、γ）、甲状腺ホルモン受容体βの非−コーディングストランドによってコードされたオーファン受容体（ＲＥＶＥＲＢβ）、ｖ−ＥＲＢ関連受容体（ＥＡＲ−１β）、オーファン核受容体ＢＤ７３（ＢＤ７３）、ｒｅｖ−ｅｒｂＡ−関連受容体（ＲＶＲ）、亜鉛フィンガー蛋白質１２６（ＨＺＦ２）、エクジソン−誘導性蛋白質Ｅ７５（Ｅ７５）、エクジソン−誘導性蛋白質Ｅ７８（Ｅ７８）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ受容体７８（ＤＲ−７８）、レチノイド−関連オーファン受容体α（ＲＯＲα）、レチノイドＺ受容体α（ＲＺＲα）、レチノイド関連オーファン受容体β（ＲＯＲβ）、レチノイドＺ受容体β（ＲＺＲβ）、レチノイド−関連オーファン受容体γ（ＲＯＲγ）、レチノイドＺ受容体γ（ＲＺＲγ）、レチノイド−関連オーファン受容体（ＴＯＲ）、ホルモン受容体３（ＨＲ−３）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａホルモン受容体３（ＤＨＲ−３）、Ｍａｎｄｕｃａホルモン受容体（ＭＨＲ−３）、Ｇａｌｌｅｒｉａホルモン受容体３（ＧＨＲ−３）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ核受容体３（ＣＮＲ−３）、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａホルモン受容体３（ＣＨＲ−３）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ核受容体１４（ＣＮＲ−１４）、エクジソン受容体（ＥＣＲ）、ユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン核受容体（ＯＲ−１）、ＮＥＲ−１、受容体−相互作用蛋白質１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓Ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様蛋白質（ＲＬＤ−１）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓Ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、受容体−相互作用蛋白質１４（ＲＩＰ−１４）、ＨＲＲ−１、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）、オーファン核受容体（ＯＮＲ−１）、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）、ステロイドおよび生体内異物受容体（ＳＸＲ）、ベンゾエートＸ受容体（ＢＸＲ）、核受容体（ＭＢ−６７）、構成的アンドロスタン受容体１（ＣＡＲ−１）、構成的アンドロスタン受容体α（ＣＡＲα）、構成的アンドロスタン受容体２（ＣＡＲ−２）、構成的アンドロスタン受容体β（ＣＡＲβ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａホルモン受容体９６（ＤＨＲ−９６）、核ホルモン受容体１（ＮＨＲ−１）、肝細胞核因子４（ＨＮＦ−４）、肝細胞核因子４Ｇ（ＨＮＦ−４Ｇ）、肝細胞核因子４Ｂ（ＨＮＦ−４Ｂ）、肝細胞核因子４Ｄ（ＨＮＦ−４Ｄ、ＤＨＮＦ−４）、レチノイドＸ受容体α（ＲＸＲα）、レチノイドＸ受容体β（ＲＸＲβ）、Ｈ−２領域ＩＩ結合蛋白質（Ｈ−２ＲＩＩＢＰ）、核受容体コレギュレーター−１（ＲＣｏＲ−１）、レチノイドＸ受容体γ（ＲＸＲγ）、ウルトラスピラクル（ＵＳＰ）、２Ｃ１核受容体、漿膜因子（ｃｈｏｒｉｏｎｆａｃｔｏｒ）１（ＣＦ−１）、精巣受容体２（ＴＲ−２）、精巣受容体２−１１（ＴＲ２−１１）、精巣受容体４（ＴＲ４）、ＴＡＸ−１、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａホルモン受容体（ＤＨＲ７８）、テールレス（ＴＬＬ）、テールレスホモログ（ＴＬＸ）、ＸＴＬＬ、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子Ｉ（ＣＯＵＰ−ＴＦＩ）、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子Ａ（ＣＯＵＰ−ＴＦＡ）、ＥＡＲ−３、ＳＶＰ−４４、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子ＩＩ（ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ）、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子Ｂ（ＣＯＵＰ−ＴＦＢ）、ＡＲＰ−１、ＳＶＰ−４０、ＳＶＰ、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子ＩＩＩ（ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩＩ）、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子Ｇ（ＣＯＵＰ−ＴＦＧ）、ＳＶＰ−４６、ＥＡＲ−２、エストロゲン受容体α（ＥＲα）、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）、エストロゲン関連受容体１（ＥＲＲ１）、エストロゲン関連受容体α（ＥＲＲα）、エストロゲン関連受容体２（ＥＲＲ２）、エストロゲン関連受容体β（ＥＲＲβ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ミネラロコルチコイド受容体（ＭＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、神経成長因子誘導遺伝子Ｂ（ＮＧＦＩ−Ｂ）、Ｎｕｒ−７７と同様の核受容体（ＴＲＳ）、Ｎ１０、オーファン受容体（ＮＵＲ−７７）、ヒト初期応答遺伝子（ＮＡＫ−１）、Ｎｕｒｒ関連因子１（ＮＵＲＲ−１）、ヒト即時型−初期応答遺伝子（ＮＯＴ）、再生肝臓核受容体１（ＲＮＲ−１）、造血亜鉛フィンガー３（ＨＺＦ−３）、Ｎｕｒ関連蛋白質−１（ＴＩＮＯＲ）、核オーファン受容体１（ＮＯＲ−１）、ＮＯＲ１関連受容体（ＭＩＮＯＲ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａホルモン受容体３８（ＤＨＲ−３８）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ核受容体８（ＣＮＲ−８）、Ｃ４８Ｄ５、ステロイド生成因子１（ＳＦ１）、エンドゼピン−様ペプチド（ＥＬＰ）、ｆｕｓｈｉｔａｒａｚｕ因子１（ＦＴＺ−Ｆ１）、副腎４結合蛋白質（ＡＤ４ＢＰ）、肝臓受容体ホモログ（ＬＲＨ−１）、Ｆｔｚ−Ｆ１−関連オーファン受容体Ａ（ｘＦＦｒＡ）、Ｆｔｚ−Ｆ１−関連オーファン受容体Ｂ（ｘＦＦｒＢ）、ＬＲＨ−１に関連した核受容体（ＦＦＬＲ）、ＬＲＨ−１に関連した核受容体（ＰＨＲ）、フェト蛋白質転写因子（ＦＴＦ）、グラム細胞核因子（ＧＣＮＦＭ）、レチノイド受容体−関連精巣−関連受容体（ＲＴＲ）、クニルプス（ｋｎｉｒｐｓ）（ＫＮＩ）、クニルプス関連（ＫＮＲＬ）、胚性生殖腺（ＥＧＯＮ）、リガンド依存性核受容体についてのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子（ＥＡＧＬＥ）、トリソラックス（ｔｒｉｔｈｏｒａｘ）と同様な核受容体（ＯＤＲ７）、トリソラックス、用量感受性性逆転副腎発育不全先天性臨界領域染色体Ｘ遺伝子（ＤＡＸ−１）、副腎発育不全先天性および下垂体性機能不全生殖機能不全（ＡＨＣＨ）、および短いヘテロダイマーパートナー（ＳＨＰ）よりなる群から選択されるステロイド／甲状腺ホルモン核受容体から得ることができる。

本発明の目的では、核受容体およびグループＨ核受容体は合成およびキメラ核受容体ならびにグループＨ核受容体およびそれらのホモログも含む。

出願人らの遺伝子発現カセットで用いる注目する遺伝子は内因性遺伝子または異種遺伝子であってよい。所望の遺伝子または蛋白質についての核酸またはアミノ酸配列の情報は多くの公的アクセスデーターベース、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔおよびＰＩＲのうちの１つ、または多くの生物関連雑誌刊行物中で見出すことができる。かくして、当業者であれば、実質的に全ての既知の遺伝子についての核酸配列情報にアクセスすることができる。従って、そのような情報を用いて、ここに記載する出願人らの方法で用いられる遺伝子発現カセット内で注目する遺伝子の挿入のための所望の構築体を構築することができる。

出願人らの遺伝子発現カセットで用いる注目する遺伝子としては、限定されるものではないが、疾患、病気、障害、機能不全、遺伝的欠陥を扱うのに使用され得る；例えば、モノクローナル抗体、酵素、プロテアーゼ、サイトカイン、インターフェロン、インスリン、エリスロポエチン、血液凝固因子、他の血液因子もしくは成分、遺伝子治療用のウイルスベクター、ワクチン用のウイルス、薬物発見用の、機能的ゲノミクス用の、ならびにプロテオミクスの分析用および適用用の標的などをはじめとする治療上望ましいポリペプチドまたは産物をコードする遺伝子が挙げられる。

（本発明のポリヌクレオチド）
本発明の新規な核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムは、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの遺伝子発現カセットを含む。これらの遺伝子発現カセット、それが含むポリヌクレオチドおよびそれがコードするポリペプチドは、宿主細胞内で遺伝子の発現を変調するための核受容体−ベースの遺伝子発現システムの構成要素として有用である。

かくして、本発明は、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。

特定の実施形態において、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、９６、１０７、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、１７５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４または２３８、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９５および１１０、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１７５、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１２７、ｇ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１２７および１７５、ｈ）配列番号：１のアミノ酸残基５２、１０７および１７５、ｉ）配列番号：１のアミノ酸残基９６、１０７および１７５、ｊ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１１０および１７５、ｋ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３または２１７、あるいはｌ）配列番号：３のアミノ酸残基９１もしくは１０５と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる。好ましい実施形態において、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体からのものである。

他の好ましい実施形態において、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、１０９、１２０、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４または２３８と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるアラニン、バリン、イソロイシンまたはロイシン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるアラニン、スレオニン、アスパラギン酸またはメチオニン残基、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン、セリン、メチオニンまたはロイシン残基、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基１２３と同等または類似の位置におけるフェニルアラニン残基、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基９５と同等または類似の位置におけるアラニン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロニン残基、ｇ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｈ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、ｉ）配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｊ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｋ）配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｌ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１２７と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｍ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｎ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるバリン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｏ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｐ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｑ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｒ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｓ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるプロリン、ｔ）配列番号：２のアミノ酸残基１２１と同等または類似の位置におけるアルギニンまたはロイシン、ｕ）配列番号：２のアミノ酸残基２１３と同等または類似の位置におけるアラニン、ｖ）配列番号：２のアミノ酸残基２１７と同等または類似の位置におけるアラニンまたはセリン、ｗ）配列番号：３のアミノ酸残基９１と同等または類似の位置におけるアラニン、あるいはｘ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるプロリンの置換をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる。好ましい実施形態において、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体からのものである。

他の特定の実施形態において、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５２Ｌ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｌ６１Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｉ、Ｆ１０９Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｍ、Ａ１１０Ｌ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｒ１７５Ｅ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、Ｍ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ｔ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５ＥまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＧ９１ＡまたはＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされた置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインである。

他の特定の実施形態において、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のＴ５８Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｌ、Ａ１１０ＳまたはＡ１１０Ｍ、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、およびｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐよりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドに、５００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７℃におけるハイブリダイゼーション工程、および少なくとも６３℃における２×ＳＳＰＥでの洗浄工程を含むハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインである。好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーション条件はハイブリダイゼーション工程についての２００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７℃を含む。他の好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーション条件はハイブリダイゼーションおよび洗浄の両工程につき２×ＳＳＰＥおよび６３℃を含む。他の好ましい実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡまたはムリステロンＡといったステロイドに対する結合活性を欠く。

また、本発明は、ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド；ならびにｃ）トランス活性化ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。

特定の実施形態において、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド；ならびにｃ）トランス活性化ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドよりなる群から選択されるハイブリッドポリペプチドをコードする。

また、本発明は、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループＨ核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性に影響する。

特に、本発明は、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループＨ核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下させる。

特定の実施形態において、本発明は、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループＨ核受容体リガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させる。好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６２、９２、９３、９５、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、または２３８、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９５および１１０、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３または２１７、あるいはｅ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。より好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６２、９２、９３、９５、１０９、１２０、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４または２３８と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基１２３と同等または類似の位置におけるフェニルアラニン残基、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基９５と同等または類似の位置におけるアラニン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン残基、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるプロリン残基、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基１２１と同等または類似の位置におけるアルギニンまたはロイシン残基、ｈ）配列番号：２のアミノ酸残基２１３と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｉ）配列番号：２のアミノ酸残基２１７と同等または類似の位置におけるアラニンまたはセリン残基、あるいはｊ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｆ１０９Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０ＰまたはＭ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ、あるいはｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐの置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含む。

他の特定の実施形態において、本発明は、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループＨリガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性を排除する。好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドはａ）配列番号：１のアミノ酸残基５８または１１０、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１１０、および１７５、ｃ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３、または２１７、あるいはｄ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の突然変異をもたらすコドン突然変異を含む。より好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５８と同等または類似の位置におけるアラニン、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン、ロイシン、セリンもしくはメチオニン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン、配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるプロリン、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基１２１と同等または類似の位置におけるアルギニンまたはロイシン、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基２１３と同等または類似の位置におけるアラニン、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基２１７と同等または類似の位置におけるアラニンまたはセリン、ｈ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるプロリンの置換をもたらすコドン突然変異を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のＴ５８Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｌ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０ＭまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含む。

また、本発明は、置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該エクジソン受容体リガンド結合ドメインはステロイド結合活性を欠く。好ましくは、該エクジソン受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５８または１１０、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１１０および１７５、ｃ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３または２１７、あるいはｄ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似のアミノ酸残基における置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含む。より好ましくは、該エクジソン受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５８と同等または類似の位置におけるアラニン、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン、ロイシン、セリンまたはメチオニン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン、配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるプロリン、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基１２１と同等または類似の位置におけるアルギニンまたはロイシン、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基２１３と同等または類似の位置におけるアラニン、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基２１７と同等または類似の位置におけるアラニンまたはセリン、ｈ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるプロリンの置換をもたらすコドン突然変異を含む。なおより好ましくは、該単離されたエクジソン受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のＴ５８Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｌ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０ＭまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含む。特定の実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインはエクジソン結合活性、２０−ヒドロキシエクジソン結合活性、ポナステロンＡ結合活性、およびムリステロンＡ結合活性よりなる群から選択されるステロイド結合活性を欠く。

他の特定の実施形態において、本発明は、置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該エクジソン受容体リガンド結合ドメインは、ステロイド結合活性を欠き、ａ）配列番号：１のＴ５８Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｌ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０ＭまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７Ａ、またはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドに、５００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７℃におけるハイブリダイゼーション工程、および少なくとも６３℃での２×ＳＳＰＥにおける洗浄工程を含むハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーション条件はハイブリダイゼーション工程につき２００ｍＭ未満の塩及び少なくとも３７℃を含む。他の好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーション条件はハイブリダイゼーションおよび洗浄の両工程につき２×ＳＳＰＥおよび６３℃を含む。他の好ましい実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインはエクジソン結合活性、２０−ヒドロキシエクジソン結合活性、ポナステロンＡ結合活性、およびムリステロンＡ結合活性よりなる群から選択されるステロイド結合活性を欠く。

他の特定の実施形態において、本発明は、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループＨ核受容体リガンド結合ドメインの非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性を低下させる。好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、アミノ酸残基ａ）配列番号：１の２１、４８、５１、５２、５９、６２、９３、９５、９６、１０９、１２０、１２３、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、または２３８、ｂ）配列番号：２の１２１、２１３、または２１７、あるいはｃ）配列番号：３の１０５と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。より好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２１、４８、５１、５９、６２、９３、９５、９６、１０９、１２０、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、または２３８と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるロイシン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１２３と同等または類似の位置におけるフェニルアラニン残基、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基９５と同等または類似の位置におけるアラニン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン残基、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基１２１と同等または類似の位置におけるアルギニンまたはロイシン残基、ｈ）配列番号：２のアミノ酸残基２１３と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｉ）配列番号：２のアミノ酸残基２１７と同等または類似の位置におけるアラニンまたはセリン残基、あるいはｊ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のＱ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ｌ、Ｖ５９Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｆ１０９Ａ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、またはＭ２１８／Ｃ２１９Ａ、ｂ）配列番号：２のＧ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ、またはｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐの置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含む。

他の特定の実施形態において、本発明は、置換突然変異を含むグループＨ核受容体ポリペプチドリガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループＨリガンド結合ドメインの非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性を排除する。

他の特定の実施形態において、本発明は、置換突然変異を含むグループＨ核受容体ポリペプチドリガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異は、グループＨリガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性および非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性を共に低下させる。好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２１、４８、５１、５９、６２、９３、９５、１０９、１２０、１２３、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、または２３８、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９５および１１０、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基１２１、２１３または２１７、あるいはｅ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。より好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２１、４８、５１、５９、６２、９３、９５、１０９、１２０、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４または２３８と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基１２３と同等または類似の位置におけるフェニルアラニン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基９５と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン残基、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基１２１と同等または類似の位置におけるアルギニンまたはロイシン残基、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基２１３と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基２１７と同等または類似の位置におけるアラニンまたはセリン残基、あるいはｈ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のＱ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｆ１０９Ａ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０ＰまたはＭ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、ｂ）配列番号：２のＧ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ、あるいはｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐの置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含む。

加えて、本発明は、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループＨ核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性を増強する。

特定の実施形態において、本発明は、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異は、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性を増強する。好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５２または９６、ｂ）配列番号：３のアミノ酸残基９１と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。より好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるロイシン、バリンまたはイソロイシン残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるアラニン、スレオニン、アスパラギン酸またはメチオニン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、あるいはｄ）配列番号：３のアミノ酸残基９１と同等または類似の位置におけるアラニン残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。なおより好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のＴ５２Ｌ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６ＤまたはＶ９６Ｍの、あるいはｂ）配列番号：３のＧ９１Ａの置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含む。

他の特定の実施形態において、本発明は、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、置換突然変異はグループＨ核受容体リガンド結合ドメインの非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性を増強する。好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５２、５５または９６、あるいはｂ）配列番号：３のアミノ酸残基９１と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。より好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるアラニン、バリンまたはイソロイシン残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基５５と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸またはメチオニン残基、あるいはｄ）配列番号：３のアミノ酸残基９１と同等または類似の位置におけるアラニン残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のＴ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５５Ａ、Ｖ９６ＤまたはＶ９６Ｍ、あるいはｂ）配列番号：３のＧ９１Ａの置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含む。

他の特定の実施形態において、本発明は、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループＨリガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性および非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性を共に増強する。好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５２、９６、１０７または１７５、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１７５、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１２７、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１２７および１７５、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基５２、１０７および１７５、ｇ）配列番号：１のアミノ酸残基９６、１０７および１７５、あるいはｈ）配列番号：３のアミノ酸残基９１と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。より好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるバリンまたはイソロイシン残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸またはメチオニン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｇ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１２７と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｈ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｉ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるバリン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｊ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｋ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、あるいはｌ）配列番号：３のアミノ酸残基９１と同等または類似の位置におけるアラニン残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のＴ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｉ、Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５ＥまたはＴ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、あるいはｂ）配列番号：３のＧ９１Ａの置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含む。

加えて、本発明は、転写調節エレメントに作動可能に連結した、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。好ましくは、置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、発現能力のある宿主細胞における核受容体リガンド結合ドメインの発現を可能とする発現制御配列と作動可能に連結している。発現制御配列は、発現が望まれる宿主細胞において機能的なプロモーターを含むことができる。該ベクターはプラスミドＤＮＡ分子またはウイルスベクターであってよい。好ましいウイルスベクターはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ−随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスを含む。本発明は、さらに、そのゲノム中に、前記した置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む複製欠陥組換えウイルスに関する。かくして、本発明はそのような発現ベクターを含む単離された宿主細胞にも関し、ここに、転写調節エレメントは宿主細胞中で作動できる。

また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされた単離されたポリペプチドに関する。

（本発明のポリペプチド）
本発明の新規な核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムは、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの遺伝子発現カセットを含む。かくして、本発明は、本発明による置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドも提供する。

他の特定の実施形態において、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、９６、１０７、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、１７５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、または２３８、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９５および１１０、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１７５、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１２７、ｇ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１２７および１７５、ｈ）配列番号：１のアミノ酸残基５２、１０７、および１７５、ｉ）配列番号：１のアミノ酸残基９６、１０７および１７５、ｊ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１１０、および１７５、ｋ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３または２１７、あるいはｌ）配列番号：３のアミノ酸残基９１もしくは１０５と同等または類似の位置における置換突然変異を含む。好ましい実施形態においては、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、エクジソン受容体からのものである。

好ましくは、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、１０９、１２０、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、または２３８と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるアラニン、バリン、イソロイシンまたはロイシン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるアラニン、スレオニン、アスパラギン酸またはメチオニン残基、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン、セリン、メチオニンまたはロイシン残基、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基１２３と同等または類似の位置におけるフェニルアラニン残基、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基９５と同等または類似の位置におけるアラニン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン残基、ｇ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｈ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、ｉ）配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｊ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｋ）配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｌ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１２７と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｍ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基ならびに配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｎ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるバリン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｏ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｐ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｑ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｒ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｓ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるプロリン、ｔ）配列番号：２のアミノ酸残基１２１と同等または類似の位置におけるアルギニンまたはロイシン、ｕ）配列番号：２のアミノ酸残基２１３と同等または類似の位置におけるアラニン、ｖ）配列番号：２のアミノ酸残基２１７と同等または類似の位置におけるアラニンまたはセリン、ｗ）配列番号：３のアミノ酸残基９１と同等または類似の位置におけるアラニン、あるいはｘ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるプロリンの置換を含む。好ましい実施形態において、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体からのものである。

他の特定の実施形態において、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインポリペプチドであり、ここに、該置換突然変異はａ）配列番号：１のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５２Ｌ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｌ６１Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｉ、Ｆ１０９Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｍ、Ａ１１０Ｌ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｒ１７５Ｅ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、Ｍ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ｔ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５ＥまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＧ９１ＡまたはＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される。

また、本発明は、ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチド；ならびにｃ）トランス活性化ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドよりなる群から選択される単離されたポリペプチドを提供する。好ましい実施形態において、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体からのものである。

また、本発明は、ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたハイブリッドポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたハイブリッドポリペプチド；ならびにｃ）トランス活性化ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたハイブリッドポリペプチドよりなる群から選択される単離されたハイブリッドポリペプチドを提供する。好ましい実施形態において、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体からのものである。

また、本発明は、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性に影響する置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドを提供する。

特に、本発明は、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下させる置換突然変異を含むリガンド結合ドメインを含む単離されたグループＨ核受容体ポリペプチドに関する。

特定の実施形態において、本発明は、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させる置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６２、９２、９３、９５、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、または２３８、ｂ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３または２１７、あるいはｃ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換を含む。より好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６２、９２、９３、９５、１０９、１２０、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４または２３８と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基１２３と同等または類似の位置におけるフェニルアラニン残基、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基９５と同等または類似の位置におけるアラニン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン残基、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるプロリン残基、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基１２１と同等または類似の位置におけるアルギニンまたはロイシン残基、ｈ）配列番号：２のアミノ酸残基２１３と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｉ）配列番号：２のアミノ酸残基２１７と同等または類似の位置におけるアラニンまたはセリン残基、もしくはｊ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｆ１０９Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、またはＭ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ、あるいはｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐの置換突然変異を含む。

他の特定の実施形態において、本発明は、グループＨリガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性を排除する置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５８または１１０、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１１０、および１７５、ｃ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３または２１７、あるいはｄ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換を含む。より好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５８と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン、ロイシン、セリンまたはメチオニン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるプロリン、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基１２１と同等または類似の位置におけるアルギニンまたはロイシン、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基２１３と同等または類似の位置におけるアラニン、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基２１７と同等または類似の位置におけるアラニンまたはセリン、あるいはｈ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるプロリンの置換をもたらすコドン突然変異を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のＴ５８Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｌ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０ＭまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７Ａ、またはＣ２１７Ｓ置換突然変異、ならびにｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される置換突然変異を含む。

また、本発明は置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関し、ここに、該エクジソン受容体リガンド結合ドメインはステロイド結合活性を欠く。好ましくは、該エクジソン受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５８または１１０、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１１０、および１７５、ｃ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３または２１７、あるいはｄ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似のアミノ酸残基における置換突然変異を含む。より好ましくは、該エクジソン受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５８と同等または類似の位置におけるアラニン、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン、ロイシン、セリンまたはメチオニン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるプロリン、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基１２１と同等または類似の位置におけるアルギニンまたはロイシン、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基２１３と同等または類似の位置におけるアラニン、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基２１７と同等または類似の位置におけるアラニンまたはセリン、あるいはｈ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるプロリンの置換を含む。なおより好ましくは、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のＴ５８Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｌ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０ＭまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される置換突然変異を含む。特定の実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは、エクジソン結合活性、２０−ヒドロキシエクジソン結合活性、ポナステロンＡ結合活性、およびムリステロンＡ結合活性よりなる群から選択されるステロイド結合活性を欠く。

他の特定の実施形態において、該単離されたポリペプチドは、置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含み、ここに、該エクジソン受容体リガンド結合ドメインはステロイド結合活性を欠き、それは、ａ）配列番号：１のＴ５８Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｌ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０ＭまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドに、５００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７℃におけるハイブリダイゼーション工程および少なくとも６３℃での２×ＳＳＰＥにおける洗浄工程を含むハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる。好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション工程につき２００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７℃を含む。他の好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の両工程につき、２×ＳＳＰＥおよび６３℃を含む。他の好ましい実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは、エクジソン結合活性、２０−ヒドロキシエクジソン結合活性、ポナステロンＡ結合活性、およびムリステロンＡ結合活性よりなる群から選択されるステロイド結合活性を欠く。

他の特定の実施形態において、本発明は、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインの非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性を低下させる置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。好ましくは、該単離されたポリペプチドは、アミノ酸残基ａ）配列番号：１の２１、４８、５１、５２、５９、６２、９３、９５、９６、１０９、１２０、１２３、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、または２３８、ｂ）配列番号：２の１２１、２１３、または２１７、あるいはｃ）配列番号：３の１０５と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換を含む。より好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２１、４８、５１、５９、６２、９３、９５、９６、１０９、１２０、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４または２３８と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるロイシン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１２３と同等または類似の位置におけるフェニルアラニン残基、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基９５と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン残基、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基１２１と同等または類似の位置におけるアルギニンまたはロイシン残基、ｈ）配列番号：２のアミノ酸残基２１３と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｉ）配列番号：２のアミノ酸残基２１７と同等または類似の位置におけるアラニンまたはセリン残基、あるいはｊ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のＱ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ｌ、Ｖ５９Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｆ１０９Ａ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０ＰまたはＭ２１８／Ｃ２１９Ａ、ｂ）配列番号：２のＧ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７Ａ、またはＣ２１７Ｓ、あるいはｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐの置換突然変異を含む。

他の特定の実施形態において、本発明は、グループＨリガンド結合ドメインの非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性を排除する置換突然変異を含むグループＨ核受容体ポリペプチドリガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。

他の特定の実施形態において、本発明は、グループＨリガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性および非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性双方を低下させる置換突然変異を含むグループＨ核受容体ポリペプチドリガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２１、４８、５１、５９、６２、９３、９５、１０９、１２０、１２３、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、または２３８、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９５および１１０、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基１２１、２１３、または２１７、あるいはｅ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換を含む。より好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２１、４８、５１、５９、６２、９３、９５、１０９、１２０、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４、または２３８、と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基１２３と同等または類似の位置におけるフェニルアラニン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基９５と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１１０と同等または類似の位置におけるプロリン残基、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基１２１と同等または類似の位置におけるアルギニンまたはロイシン残基、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基２１３と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基２１７と同等または類似の位置におけるアラニンまたはセリン残基、あるいはｈ）配列番号：３のアミノ酸残基１０５と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のＱ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｆ１０９Ａ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、またはＭ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、ｂ）配列番号：２のＧ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ、あるいはｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐの置換突然変異を含む。

加えて、本発明は、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性を増強する置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。

特定の実施形態において、本発明は、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性を増強する置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５２または９６、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９６、１０７および１７５、あるいはｃ）配列番号：３のアミノ酸残基９１と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換を含む。より好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるロイシン、バリンまたはイソロイシン残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるアラニン、スレオニン、アスパラギン酸またはメチオニン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、あるいはｄ）配列番号：３のアミノ酸残基９１と同等または類似の位置におけるアラニン残基の置換を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のＴ５２Ｌ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６ＭまたはＶ９６Ｔ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、あるいはｂ）配列番号：３のＧ９１Ａの置換突然変異を含む。

他の特定の実施形態において、本発明は、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインの非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性を増強する置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。好ましくは、該単離されたポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸残基５２、５５または９６、あるいはｂ）配列番号：３のアミノ酸残基９１と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換を含む。より好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるアラニン、バリンまたはイソロイシン残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基５５と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸またはメチオニン残基、あるいはｄ）配列番号：３のアミノ酸残基９１と同等または類似の位置におけるアラニン残基の置換を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のＴ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５５Ａ、Ｖ９６ＤまたはＶ９６Ｍ、あるいはｂ）配列番号：３のＧ９１Ａの置換突然変異を含む。

他の特定の実施形態において、本発明は、グループＨリガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性および非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性を共に増強する置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５２、９６、１０７または１７５、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１７５、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１２７、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１２７および１７５、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基５２、１０７および１７５、ｇ）配列番号：１のアミノ酸残基９６、１０７および１７５、あるいはｈ）配列番号：３のアミノ酸残基９１と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換を含む。より好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるバリンまたはイソロイシン残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸またはメチオニン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｇ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１２７と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｈ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基ならびに配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｉ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるバリン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｊ）配列番号：１のアミノ酸残基９６と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｋ）配列番号：１のアミノ酸残基５２と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：１のアミノ酸残基１０７と同等または類似の位置におけるイソロイシン残基、および配列番号：１のアミノ酸残基１７５と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、あるいはｌ）配列番号：３のアミノ酸残基９１と同等または類似の位置におけるアラニン残基の置換を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のＴ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｉ、Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５ＥまたはＴ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、あるいはｂ）配列番号：３のＧ９１Ａの置換突然変異を含む。

また、本発明は、本発明による単離されたポリペプチドを含む組成物に関する。

（本発明の遺伝子発現を変調する方法）
また、出願人らの発明は、本発明による遺伝子発現変調システムを用いて宿主細胞中で遺伝子発現を変調する方法に関する。具体的には、出願人らの発明は、ａ）本発明の遺伝子発現変調システムを宿主細胞に導入し；次いで、ｂ）宿主細胞にリガンドを導入することを含み、変調すべき遺伝子は、ｉ）遺伝子発現システムのＤＮＡ結合ドメインによって認識されるドメインを含む応答エレメント；ｉｉ）遺伝子発現システムのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびｉｉｉ）その発現を変調すべき遺伝子を含む遺伝子発現カセットの構成要素であり、それにより、リガンドの宿主細胞への導入に際して遺伝子の発現が変調される工程を含む、宿主細胞中で遺伝子の発現を変調する方法を提供する。

また、本発明は、ａ）本発明の遺伝子発現変調システムを宿主細胞に導入し；ｂ）本発明の遺伝子発現カセットを宿主細胞に導入し、遺伝子発現カセットはｉ）遺伝子発現システムからのＤＮＡ結合ドメインによって認識されるドメインを含む応答エレメント；ｉｉ）遺伝子発現システムのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびｉｉｉ）その発現が変調されるべき遺伝子を含み；次いで、ｃ）宿主細胞にリガンドを導入する工程を含み、それにより、リガンドの宿主細胞への導入に際して、遺伝子の発現は変調されることを特徴とする宿主細胞において遺伝子の発現を変調する方法を提供する。

また、出願人らの発明は、遺伝子発現変調システムの第１のハイブリッドポリペプチドからのＤＮＡ結合ドメインが結合するドメインを含む応答エレメント；遺伝子発現変調システムの第２のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびその発現を変調すべき遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む宿主細胞中で遺伝子の発現を変調する方法であって、ａ）本発明の遺伝子発現変調システムを宿主細胞に導入し、次いで、ｂ）宿主細胞にリガンドを導入する工程を含み、それにより、リガンドの宿主への導入に際して、遺伝子の発現が変調されることを特徴とする該方法を提供する。

出願人らの方法を用いる宿主細胞での発現用の注目する遺伝子は、内因性遺伝子または異種遺伝子であってよい。所望の遺伝子または蛋白質についての核酸またはアミノ酸配列は、多くの公的アクセスデータベースのうちの１つ、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔおよびＰＩＲにおいて、あるいは多くの生物学関連雑誌刊行物に見出すことができる。かくして、当業者であれば、実質的に全ての公知の遺伝子についての核酸配列情報にアクセスすることができる。従って、そのような情報を用いて、本明細書中に記載する出願人らの方法で用いる遺伝子発現カセット内で注目する遺伝子の挿入用の所望の構築体を構築することができる。

出願人らの方法を用いる宿主細胞での発現用の注目する遺伝子の例は、限定されるものではないが、ワクチン、アルファ−アミラーゼ、フィターゼ、グルカン、キシラーゼおよびキシラナーゼのような酵素として植物で生産される抗原、昆虫、線虫、真菌類、細菌、ウイルス、および無生物ストレス、栄養補給食品、医薬、ビタミンに対する抵抗性についての遺伝子、アミノ酸含有量、除草剤抵抗性、寒気、日照りおよび熱許容性、産業製品、油、蛋白質、炭水化物、抗酸化剤、雄性不稔植物、花、燃料、他の出力特性を修飾する遺伝子；疾患、病気、障害、機能不全、遺伝的欠陥を扱うのに用いることができる；例えばモノクローナル抗体、酵素、プロテアーゼ、サイトカイン、インターフェロン、インスリン、エリスロポエチン、血液凝固因子、他の血液因子または構成成分、遺伝子治療用のウィルスベクター、ワクチン用のウィルス、薬物発見用、機能的ゲノミクス用、およびプロテオミクスの分析および適用等の標的のような、治療上望ましいポリペプチドをコードする遺伝子を含む。

許容されるリガンドは、リガンドの存在下における応答エレメントへの本発明の遺伝子発現システムのＤＮＡ結合ドメインの結合の結果、遺伝子の発現の活性化または抑制がもたらされる場合に、遺伝子の発現を変調する任意のものでもある。好ましいリガンドはエクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡ等といったエクジステロイド、その各々をここに引用して本明細書の一部とみなす、米国特許第６，０１３，８３６号、第５，１１７，０５７号、第５，５３０，０２８号および第５，３７８，７２６号に開示されたものといった９−シス−レチノイン酸、レチノイン酸の合成アナログ、Ｎ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン；欧州出願第４６１，８０９号に開示されたものといったジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン；米国特許第５，２２５，４４３号に開示されたものといったＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン；欧州出願第２３４，９９４号に開示されたものといったＮ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン；米国特許第４，９８５，４６１号に記載されたものといったＮ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン；３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパジド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−スルフェート、ファルネゾール、胆汁酸、１，１−ビフォスフォネートエステル、幼若ホルモンＩＩＩ等を含めた他の同様の物質を含む。

好ましい実施形態において、遺伝子の発現を変調する出願人らの方法で用いるリガンドは式：

（式中、Ｅは第三級炭素を含有する（Ｃ_４−Ｃ_６）アルキルまたは第三級炭素を含有するシアノ（Ｃ_３−Ｃ_５）アルキルであり；
Ｒ^１はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ_３、ＣＨＦ_２、ＣＨＣｌ_２、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨ_２Ｃｌ、ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨ_２ＯＭｅ、ＣＨ_２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ^０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ_２ＣＦ_３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣＮまたはＳＣＨＦ_２であり；
Ｒ^２はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ホルミル、ＣＦ_３、ＣＨＦ_２、ＣＨＣｌ_２、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨ_２Ｃｌ、ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨ_２ＯＭｅ、ＣＨ_２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ^０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ_２、ＮＥｔ_２、ＳＭｅ、ＳＥｔ、ＳＯＣＦ_３、ＯＣＦ_２ＣＦ_２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ_２ＣＦ_３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ_３、ＯＣＨＦ_２、Ｏ−ｉ−Ｐｒ、ＳＣＮ、ＳＣＨＦ_２、ＳＯＭｅ、ＮＨ−ＣＮであるか、またはＲ^３、ならびにＲ^２およびＲ^３が結合したフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ^３はＨ、Ｅｔであるか、またはＲ^２、ならびにＲ^２およびＲ^３が結合したフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は独立してＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル、ＣＦ_３、ＣＨＦ_２、ＣＨＣｌ_２、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨ_２Ｃｌ、ＣＨ_２ＯＨ、ＣＮ、Ｃ^０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅまたはＳＥｔである。）
の化合物である。

他の好ましい実施形態において、遺伝子の発現を変調する出願人らの方法で用いるリガンドはエクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡ、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−スルフェート、ファルネゾール、胆汁酸、１，１−ビホスホネートエステル、または幼若ホルモンＩＩＩである。

他の好ましい実施形態において、遺伝子の発現を変調する出願人らの方法において前記で議論した第１のリガンドに加えて第２のリガンドを用いることができる。好ましくは、この第２のリガンドは９−シス−レチノイン酸またはレチノイン酸の合成アナログである。

（本発明の宿主細胞および非−ヒト生物）
前記したように、本発明の遺伝子発現変調システムを用いて、宿主細胞において遺伝子発現を変調することができる。トランスジェニック宿主細胞における発現は、注目する種々の遺伝子の発現で有用であり得る。出願人らの発明は、原核生物および真核生物宿主細胞における遺伝子発現の変調を提供する。トランスジェニック宿主細胞における発現は、限定されるものではないが、ワクチンとして植物で生産される抗原、アルファ−アミラーゼ、フィターゼ、グルカン、キシラーゼおよびキシラナーゼのような酵素、昆虫、線虫、真菌類、細菌、ウィルスおよび無生物ストレス、抗原、栄養補給食品、医薬、ビタミンに対する抵抗性についての遺伝子、アミノ酸含有量、除草剤抵抗性、寒気、日照りおよび熱許容性、産業製品、油、蛋白質、炭水化物、抗酸化剤、雄性不稔植物、花、燃料、他の出力特性、治療ポリペプチド、経路中間体を修飾する遺伝子を含めた注目する種々のポリペプチドの発現に有用であり；宿主を用いて以前には可能で無かった新しい産物の合成のための宿主に既に存在する経路の変調；細胞ベースのアッセイ；機能的ゲノミクスアッセイ、バイオ治療蛋白質生産、プロテオミクスアッセイ等の変調に有用である。加えて、遺伝子産物は、宿主のより高い増殖量を付与するのに、あるいは利用すべき別の増殖様式を可能とするのに有用であろう。

かくして、出願人らの発明は、本発明による遺伝子発現システムを含む単離された宿主細胞を提供する。また、本発明は、本発明による遺伝子発現カセットを含む単離された宿主細胞を提供する。また、出願人らの発明は、本発明によるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む単離された宿主細胞を提供する。また本発明は、本発明による発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は細菌細胞、真菌類細胞、線虫細胞、昆虫細胞、魚類細胞、植物細胞、鳥類細胞、動物細胞または哺乳動物細胞であり得る。なおさらなる他の実施形態において、本発明は、置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインの生産方法に関し、ここに、該方法は、上記のように置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの発現を可能とする条件下で、培地中で前記宿主細胞を培養し、次いで、該培養物から置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインを単離することを含む。

特定の実施形態において、単離された宿主細胞は原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞である。他の特定の実施形態において単離された宿主細胞は無脊椎動物宿主細胞または脊椎動物宿主細胞である。好ましくは、宿主細胞は細菌細胞、真菌類細胞、酵母細胞、線虫細胞、昆虫細胞、魚類細胞、植物細胞、鳥類細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞よりなる群から選択される。より好ましくは、宿主細胞は、酵母細胞、線虫細胞、昆虫細胞、植物細胞、ゼブラフィッシュ細胞、ニワトリ細胞、ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、メスウシ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、類人猿細胞、サル細胞、チンパンジー細胞、またはヒト細胞である。好ましい宿主細胞の例は、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａといった真菌類または酵母種、またはＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属におけるものといった細菌種、リンゴ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、パールミレット、バナナ、大麦、豆類、ビート、ブラックグラム、ヒヨコマメ、トウガラシ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、オート麦、オクラ、Ｐａｎｉｃｕｍ、パパイヤ、落花生、エンドウ、コショウ、ハトマメ、パイナップル、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、ジャガイモ、カボチャ、米、ソルガム、大豆、スカッシュ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、および小麦よりなる群から選択される植物種、動物および哺乳動物宿主細胞を含む。

特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＣａｎｄｉｄａ宿主細胞よりなる群から選択される酵母細胞である。

他の特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｅｌｅｇａｎｓ線虫細胞である。

他の特定の実施形態において、宿主細胞は昆虫細胞である。

他の特定の実施形態において、宿主細胞はリンゴ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、パールミレット、バナナ、大麦、豆類、ビート、ブラックグラム、ヒヨコマメ、トウガラシ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、オート麦、オクラ、Ｐａｎｉｃｕｍ、パパイヤ、落花生、エンドウ、コショウ、ハトマメ、パイナップル、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、ジャガイモ、カボチャ、米、ソルガム、大豆、スカッシュ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、および小麦細胞よりなる群から選択される植物細胞である。

他の特定の実施形態において、宿主細胞はゼブラフィッシュ細胞である。

他の特定の実施形態において、宿主細胞はニワトリ細胞である。

他の特定の実施形態において、宿主細胞はハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、メウシ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、サル細胞、チンパンジー細胞およびヒト細胞よりなる群から選択される哺乳動物細胞である。

宿主細胞の形質転換は当該分野でよく知られており、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、ウイルス感染、プラスミド／ベクタートランスフェクション、非−ウイルスベクター媒介トランスフェクション、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−媒介形質転換、パーティクル衝撃等を含めた種々の方法によって達成することができる。所望の遺伝子産物の発現は、適当な条件下で形質転換宿主細胞を培養し、形質転換遺伝子の発現を誘導することを含む。原核生物および真核生物細胞における培養条件および遺伝子発現プロトコルは当該分野でよく知られている（実施例の一般的方法セクション参照）。遺伝子産物に特異的なプロトコルに従い、細胞を回収し、遺伝子産物を単離することができる。

加えて、挿入されたポリヌクレオチドの発現を変調するか、または所望の特定の様式にてポリペプチド産物を修飾および加工する宿主細胞を選択することができる。異なる宿主細胞は、蛋白質の翻訳および翻訳後のプロセッシングおよび修飾［例えば、グリコシル化、（例えば、シグナル配列の）切断］についての特徴的かつ特異的メカニズムを有する。適当な細胞系または宿主システムを選択して、発現される外来性蛋白質の所望の修飾およびプロセッシングを確実とすることができる。例えば、細菌システムにおける発現を用いて、非−グリコシル化コア蛋白質産物を生産することができる。しかしながら、細菌で発現されたポリペプチドは適切には折り畳まれていないであろう。酵母における発現はグリコシル化産物を生じさせることができる。真核生物細胞における発現は、「天然」グリコシル化の確立および異種蛋白質の折り畳みを増加させることができる。さらに、哺乳動物細胞における発現はポリペプチドの活性を復元または構成するためのツールを提供することができる。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、蛋白質分解切断といったプロセッシング反応に異なる程度影響し得る。

出願人らの発明は、本発明による単離された宿主細胞を含む非−ヒト生物にも関する。特定の実施形態において、非−ヒト生物は原核細胞生物または真核生物である。他の特定の実施形態において、非−ヒト生物は無脊椎動物生物または脊椎動物生物である。

好ましくは、非−ヒト生物は細菌、真菌類、酵母、線虫、昆虫、魚類、植物、鳥類、動物および哺乳動物よりなる群から選択される。より好ましくは、非−ヒト生物は酵母、線虫、昆虫、植物、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ハムスター、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヤギ、メウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、類人猿、サルまたはチンパンジーよりなる群から選択される。

特定の実施形態において、非−ヒト生物はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＣａｎｄｉｄａよりなる群から選択される酵母である。

他の特定の実施形態において、非−ヒト生物はＣａｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｅｌｅｇａｎｓ線虫である。

他の特定の実施形態において、非−ヒト生物は、リンゴ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、パールミレット、バナナ、大麦、豆類、ビート、ブラックグラム、ヒヨコマメ、トウガラシ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、オート麦、オクラ、Ｐａｎｉｃｕｍ、パパイヤ、落花生、エンドウ、コショウ、ハトマメ、パイナップル、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、ジャガイモ、カボチャ、米、ソルガム、大豆、スカッシュ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、および小麦よりなる群から選択される植物である。

他の特定の実施形態において、非−ヒト生物は、Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓマウスである。

（遺伝子発現／転写の測定）
本発明の出願人らの方法の１つの有用な測定は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ種の同一性および存在量を含めた細胞の転写状態の測定である。そのような測定は、いくつかの現存する遺伝子発現技術のうちのいずれかによってｃＤＮＡの存在量を測定することによって簡便に行われる。

核酸アレイ技術は異なるｍＲＮＡ発現を決定するための有用な技術である。そのような技術は、例えば、オリゴヌクレオチドチップおよびＤＮＡマイクロアレイを含む。これらの技術は、固体支持体に固定化し、細胞、組織または生物全体から抽出された全ｍＲＮＡプールから調製され、ｃＤＮＡに変換されたプローブにハイブリダイズする異なる遺伝子またはｃＤＮＡに対応するＤＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドに頼る。オリゴヌクレオチドチップは、フォトリソグラフィー技術を用いて基材上で合成されたオリゴヌクレオチドのアレイである。１７００までの遺伝子につき分析することができるチップが製造されている。ＤＮＡマイクロアレイは、機械的に顕微鏡スライドグラスにプリントされるＤＮＡ試料、典型的には、ＰＣＲ産物のアレイである。各遺伝子は、全長または部分長の標的ＤＮＡ配列によって分析される。１０，０００までの遺伝子を持つマイクロアレイは、今日、ルーチン的に商業生産される。これらの２つの技術の間の主な差は、オリゴヌクレオチドチップが、典型的には、短いＤＮＡ分子の分画を可能とする２５−量体オリゴヌクレオチドを利用するのに対し、マイクロアレイのより大きなＤＮＡ標的（ほぼ１０００塩基対）は複雑なＤＮＡ混合物を分画するにおいてより大きな感受性を提供できることである。

本発明の出願人らの方法の他の有用な測定は、当該分野でよく知られたプロセスを用いて、細胞に存在する構成蛋白質種の存在量を測定することによって細胞の翻訳状態を決定するものである。

種々の生理学的機能に関連する遺伝子の同定が望まれる場合、アッセイを使用することができ、ここに、細胞増殖、アポトーシス、老化、分化、接着、特定の分子への結合、他の細胞への結合、細胞組織化、器官形成、細胞内輸送、輸送促進、エネルギー変換、代謝、筋発生、神経発生および／または造血といった機能の変化が測定される。

加えて、選択マーカーまたはレポーター遺伝子発現を用いて、出願人らの発明を用いた遺伝子発現変調を測定することができる。

遺伝子発現の産物を検出する他の方法は当該分野でよく知られており、サザンブロット（ＤＮＡ検出）、ドットまたはスロットブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ノーザンブロット（ＲＮＡ）、ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＮＡ）、ウェスタンブロット（ポリペプチド検出）、およびＥＬＩＳＡ（ポリペプチド）分析を含む。余り好ましくはないが、標識された蛋白質を用いて、それにハイブリダイズする特定の核酸配列を検出することができる。

いくつかの場合において、核酸配列の量を増幅する必要がある。これは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）、ストランド置換増幅（「ＳＤＡ」）、転写−ベースの増幅等を含めた多数の適当な方法のうちの１以上を用いて行なうことができる。ＰＣＲは公知の技術に従って行われ、例えば、ハイブリダイズする条件下で、熱安定ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、核酸試料をオリゴヌクレオチドプライマーの１つの対で処理し、１つのプライマーは検出されるべき特定の配列の１つのストランド（鋳型）にハイブリダイズする。プライマーは、それにハイブリダイズする特定の配列の各鋳型ストランドに対して十分に相補的である。各プライマーの伸長産物を合成し、それは、それにハイブリダイズする核酸鋳型ストランドに対して相補的である。各プライマーから合成された伸長産物は、同一プライマーを用いる伸長産物のさらなる合成のための鋳型としても働くことができる。十分な数のラウンドの伸長産物の合成に続き、前記したように試料を分析して、検出すべき配列が存在するか否かを分析することができる。

（リガンドスクリーニングアッセイ）
また、本発明は、核受容体リガンド結合ドメインを候補分子と接触させ、リガンドの存在下でレポーター遺伝子の活性を測定することによる、細胞において置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインのトランス活性化を誘導または抑制する化合物につきスクリーニングする方法に関する。候補化合物は、核受容体リガンド結合ドメインのアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。好ましい実施形態においては、核受容体リガンド結合ドメインは細胞中のポリヌクレオチドから発現され、トランス活性化活性（すなわち、レポーター遺伝子の発現または抑制）または化合物の結合活性が測定される。

従って、核受容体リガンド結合ドメインの構造に基づくアゴニストおよびアンタゴニストの合理的な設計に加え、本発明では、当該分野で知られた種々のスクリーニングアッセイを用いて核受容体リガンド結合ドメインの特異的リガンドを同定するための別法が考えられる。

当該分野で知られたいずれものスクリーニング技術を用いて、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインのアゴニストまたはアンタゴニストにつきスクリーニングすることができる。例えば、本発明による核受容体−ベースの遺伝子発現システムを含む適当な細胞系を、誘導性または抑制性プロモーターに作動可能に連結したマーカー遺伝子をコードする遺伝子発現カセットでトランスフェクトすることができる。次いで、トランスフェクトされた細胞を、候補アゴニストまたはアンタゴニスト化合物を含むテスト溶液に暴露し、次いで、マーカー遺伝子の発現または抑制につきアッセイする。テスト溶液に暴露されなかった対照細胞に対するより多くのマーカー遺伝子発現の存在は、テスト溶液中におけるアゴニスト化合物の存在の指標である。逆に、テスト溶液に暴露されなかった対照細胞に対するより少ないマーカー遺伝子発現の存在は、テスト溶液中におけるアンタゴニスト化合物の指標である。

本発明では、小さな分子リガンドまたはリガンドアナログおよびミミックについてのスクリーニング、ならびにイン・ビボにおける本発明によるグループＨ核受容体リガンド結合ドメインに結合し、かつ作動もしくは拮抗する天然リガンドについてのスクリーニングが考えられる。例えば、天然産物ライブラリーは、核受容体−ベースの遺伝子発現システムの活性に作動または拮抗する分子につき、本発明のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。

アンタゴニストの同定およびスクリーニングは、例えば、Ｘ−線結晶回析、中性子回折、核磁気共鳴分光分析、および構造決定のための他の技術を用いて蛋白質の構造特徴を決定することによってさらに容易とされる。これらの技術はアゴニストおよびアンタゴニストの合理的設計または同定を提供する。

他のアプローチは、大きなライブラリーを生産するために組換えバクテリオファージを用いる。「ファージ方法」［ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８７：６３７８−６３８２（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４−４０６（１９９０）］を用い、非常に大きなライブラリーを構築することができる（１０^６−１０^８化学存在）。第２のアプローチは主として化学的方法を用い、そのうち、Ｇｅｙｓｅｎ方法［Ｇｅｙｓｅｎら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２３：７０９−７１５（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃＭｅｔｈｏｄ１０２：２５９−２７４（１９８７）］およびＦｏｄｏｒらの方法［Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：７６７−７７３（１９９１）］がその例である。Ｆｕｒｋａら［１４ｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｇｒｅｓｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌｕｍｅ５、ＡｂｓｔｒａｃｔＦＲ：０１３（１９８８）；Ｆｕｒｋａ，Ｉｎｔ．Ｊ．ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１）］、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ［１９８６年１２月に発行された米国特許第４，６３１，２１１号］およびＲｕｔｔｅｒら［１９９１年４月２３日に発行された米国特許第５，０１０，１７５号］は、アゴニストまたはアンタゴニストとしてテストすることができるペプチドの混合物を製造する方法を記載する。

他の態様において、合成ライブラリー［Ｎｅｅｄｅｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０７００−４（１９９３）；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０９２２−１０９２６（１９９３）；Ｌａｍら、その各々をここに引用してその全体を本明細書の一部とみなす、国際特許出願公開第ＷＯ９２／００２５２号；Ｋｏｃｉｓら、国際特許出願公開第ＷＯ９４２８０２８号］等を用いて、本発明に従って候補リガンドにつきスクリーニングすることができる。

該スクリーニングは、本発明に従い核受容体リガンド結合ドメインを発現する組換え細胞で、あるいは別法として、例えば、前記したように組換えにより製造された精製蛋白質を用いて、行うことができる。例えば、標識された可溶性核受容体リガンド結合ドメインを用いて、これまでの引例に記載されたように、ライブラリーをスクリーニングすることができる。

１つの実施形態において、本発明によるグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを直接的に標識することができる。他の実施形態において、標識された二次試薬を用いて、注目する分子、例えば、固相支持体に結合した分子への本発明の核受容体リガンド結合ドメインの結合を検出することができる。結合は、酵素標識による発色団のイン・サイチュ形成によって検出することができる。適当な酵素は、限定されるものではないが、アルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼを含む。さらなる実施形態において、注目する異なるアクセプター分子上に２つの酵素標識を持つ２つの発色性基材を用いる２色アッセイを用いることができる。交差−反応性および単一−反応性リガンドを２色アッセイで同定することができる。

本発明で用いられる他の標識は、着色ラテックスビーズ、磁性ビーズ、蛍光標識（例えば、数個のフルオロフォアの名前を挙げれば、蛍光イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、ローダミン、遊離またはキレート化ランタニド族塩、特にＥｕ^３＋）、ケミルミネセント分子、放射性同位体、または磁気共鳴イメージング標識を含む。２色アッセイは、２以上の着色ラテックスビーズ、または異なる波長において発光するフルオロフォアで行うことができる。標識された分子または細胞は、視覚により、または機械的／光学的手段によって検出することができる。機械的／光学的手段は、ＦＡＣＳに類似の蛍光活性化ソーティング、およびミクロマニピュレーター除去手段を含む。

以下の非限定的実施例によって本発明はより良好に理解でき、これは本発明の例示として提供する。

（実施例）
出願人らは、ＣｆＥｃＲ相同性モデルを開発し、公開されたＣｈｉｒｏｎｏｍｏｕｓｔｅｔａｎｓエクジソン受容体（「ＣｔＥｃＲ」）相同性モデル（Ｗｕｒｔｚら、２０００）と一緒にこの相同性モデルを用いて、ステロイドおよび非−ステロイドへの結合に関与する臨界的残基を同定した。合成非−ステロイド、ジアシルヒドラジンは、高い親和性をもって鱗翅目ＥｃＲに結合し、これらの昆虫において早めの不完全な脱皮を誘導することが示されており（Ｗｉｎｇら、１９８８）、これらの化合物のうち数個は現在殺虫剤として市販されている。ＥｃＲのリガンド結合キャビティは、２０Ｅといったエクジステロイドの長い骨格構造に適合するように進化している。該ジアシルヒドラジンはステロイドと比較してコンパクトな構造を有し、ＥｃＲ結合ポケットの底部のみを占有する。これは、ステロイドと接触するが、ジアシルヒドラジンといった非−ステロイドとは接触しない結合ポケットの頂部に数個の臨界的残基を残す。出願人らは、ステロイドおよび／または非−ステロイドと接触する残基の置換突然変異を作成し、リガンド結合に対する突然変異の効果を測定した。出願人らは、ここに、それらの残基の数個における置換突然変異を記載し、それらの結合およびトランス活性化特徴に基づいて置換突然変異体受容体のいくつかのクラスを同定した。出願人らの新規な置換突然変異した核受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子治療、宿主細胞における注目する蛋白質の発現、トランスジェニック生物の生産、および細胞−ベースのアッセイを含めた種々の適用のための核受容体−ベースの誘導性遺伝子変調システムで有用である。

（一般的方法）
ここに用いる標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野でよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）によって、およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．ＢｅｎｎａｎおよびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｉｔｈＧｅｎｅＦｕｓｉｏｎｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８４）によって、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）によって記載されている。

細菌培養の維持および増殖に適当な材料および方法は当該分野でよく知られている。以下の実施例で用いるのに適した技術は、ＭａｎｕａｌｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＧｅｎｅｒａｌＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（ＰｈｉｌｌｉｐｐＧｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、ＲａｌｐｈＮ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、ＥｕｇｅｎｅＷ．Ｎｅｓｔｅｒ、ＷｉｌｌｉｓＡ．Ｗｏｏｄ、ＮｏｅｌＲ．ＫｒｉｅｇおよびＧ．ＢｒｉｇｇｓＰｈｉｌｌｉｐｓ編）、ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９４））、またはＴｈｏｍａｓＤ．ＢｒｏｃｋによるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ中：ＡＴｅｘｔｂｏｏｋｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、ＳｉｎａｕｅｒＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ（１９８９）に記載されているのを見出すことができる。宿主細胞の増殖および維持で用いる全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＤＩＦＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）またはＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。

遺伝子配列の操作は、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐＩｎｃ．（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅＶｅｒｓｉｏｎ９．０、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手できるプログラムのスイートを用いて達成することができる。ＧＣＧプログラム「Ｐｉｌｅｕｐ」を用いる場合、１２のギャップ創製デフォルト値、および４のギャップ伸長デフォルト値を用いることができるＣＧＣ「Ｇａｐ」または「Ｂｅｓｔｆｉｔ」プログラムを用いる場合、５０のデフォルトギャップ創製ペナルティおよび３のデフォルトギャップ伸長ペナルティを用いることができる。ＧＣＧプログラムパラメーターを指令しないいずれの場合にも、これらまたはいずれかの他のＧＣＧプログラムにおいては、デフォルト値を用いることができる。

略語の意味は以下の通りである：「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモラーを意味し、「ｍＭ」はミリモラーを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「Ａ」はアデニンまたはアデノシンを意味し、「Ｔ」はチミンまたはチミジンを意味し、「Ｇ」はグアニンまたはグアノシンを意味し、「Ｃ」はシチジンまたはシトシンを意味し、「ｘｇ」は重力の倍数を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ａａ」はアミノ酸を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｋ」はキロを意味し、「μ」はマイクロを意味し、および「℃」は摂氏度を意味する。

本実施例は、核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムで用いる本発明の新規な置換突然変異したグループＨ核受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むいくつかの遺伝子発現カセットの構築を記載する。出願人らは、ハマキガＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａｆｕｍｉｆｅｒａｎａＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）、ミバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）、マダニＡｍｂｌｙｏｍｍａａｍｅｒｉｃａｎｕｍＥｃＲ（「ＡｍａＥｃＲ」）、バッタＬｏｃｕｓｔａｍｉｇｒａｔｏｒｉａウルトラスピラクル蛋白質（「ＬｍＵＳＰ」）、脊椎動物ＲＸＲの無脊椎動物ＲＸＲホモログ、およびＣ．ｆｕｍｉｆｅｒａｎａＵＳＰ（「ＣｆＵＳＰ」）に基づいて数個の遺伝子発現カセットを構築した。調製された受容体構築体は、ＥｃＲ、無脊椎動物ＵＳＰ、または無脊椎動物ＲＸＲいずれかのリガンド結合ドメイン；およびＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）またはＶＰ１６トランス活性化ドメイン（ＡＤ）を含む。レポーター構築体は、それにＧａｌ４ＤＢＤが結合するＧＡＬ４応答エレメントを含む合成プロモーター構築体に作動可能に連結した、レポーター遺伝子、ルシフェラーゼまたはＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）を含む。これらの受容体およびレポーター構築体の種々の組合せを、後述実施例２−１０に記載したように、哺乳動物細胞にコトランスフェクトした。

遺伝子発現カセット：エクジソン受容体−ベースの遺伝子発現カセット（スイッチ）は、当該分野で入手できる標準的なクローニング方法を用いて以下のように構築した。以下に、本明細書中に記載する実施例で用いる各スイッチの調製および組成を簡単に記載する。

１．１−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：ハマキガＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａｆｕｍｉｆｅｒａｎａＥｃＲからの野生型Ｄ．ＥおよびＦドメイン（「ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ」；配列番号：２１）をＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（「Ｇａｌ４ＤＮＡＢＤ」または「Ｇａｌ４ＤＢＤ」；配列番号：６）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：２２）の制御下に置いた。バッタＬｏｃｕｓｔａｍｉｇｒａｔｏｒｉａウルトラスピラクル蛋白質からのＥおよびＦドメイン（「ＬｍＵＳＰ−ＥＦ」；配列番号：２３）をＶＰ１６からのトランス活性化ドメイン（「ＶＰ１６ＡＤ」；配列番号：１２）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：２２）の制御下に置いた。５つのコンセンサスＧＡＬ４応答エレメント結合部位（配列番号：１９を含むＧＡＬ４ＲＥの５つのコピーを含む「５ＸＧＡＬ４ＲＥ」）を合成Ｅ１ｂ最小プロモーター（配列番号：２４）に融合させ、ルシフェラーゼ遺伝子（配列番号：２５）の上流に置いた。

１．２−ＧＡＬ４／突然変異体ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：野生型ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦを、下記表１から選択された置換突然変異を含むリガンド結合ドメインを含む突然変異体ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦで置き換える以外は、スイッチ１．１と同様にしてこの構築体を調製した。

１．３−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：全長ハマキガＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａｆｕｍｉｆｅｒａｎａＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦ」；配列番号：２７）をＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（「Ｇａｌ４ＤＮＡＢＤ」または「Ｇａｌ４ＤＢＤ」；配列番号：６）に融合し、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：２２）の制御下に置いた。ＬｏｃｕｓｔａｍｉｇｒａｔｏｒｉａウルトラスピラクルからのＥおよびＦドメイン（「ＬｍＵＳＰ−ＥＦ」；配列番号：２３）をＶＰ１６からのトランス活性化ドメイン（「ＶＰ１６ＡＤ」；配列番号：１２）に融合し、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：２２）の制御下においた。５つのコンセンサスＧＡＬ４応答エレメント結合部位（「５ＸＧＡＬ４ＲＥ」；配列番号：１９を含むＧＡＬ４ＲＥの５つのコピーを含む）を合成Ｅ１ｂ最小プロモーター（配列番号：２４）に融合し、ルシフェラーゼ遺伝子（配列番号：２５）の上流においた。

１．４−ＧＡＬ４／Ａ１１０Ｐ突然変異体ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：前記表１に記載されたＡ１１０Ｐ置換突然変異を含むリガンド結合ドメインを含む突然変異体ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦで野生型ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦを置き換える以外は、前記スイッチ１．３と同様にしてこの構築体を調製した。

１．５−ＶＰ１６／ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ：ＶＰ１６からのトランス活性化ドメイン（「ＶＰ１６ＡＤ」；配列番号：１２）でＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインを置き換え、バキュロウイルスＩＥ１プロモーター（配列番号：２８）の制御下に置く以外は、スイッチ１．１と同様にしてこの構築体を調製した。６つのコンセンサスエクジソン受容体エレメント結合部位（「６ＸＥｃＲＥ」；配列番号：１８を含むエクジソンＲＥの６つのコピーを含む）を合成Ｅ１ｂ最小プロモーター（配列番号：２４）に融合させ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（配列番号：２９）の上流に置いた。この構築体はヘテロ二量体化パートナーとして内因性ウルトラスピラクル蛋白質を用いる。

１．６−ＶＰ１６／Ａ１１０Ｐ突然変異体ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ：前記表１に記載されたＡ１１０Ｐ置換突然変異を含むリガンド結合ドメインを含む突然変異体ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦで野生型ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦを置き換える以外は、前記スイッチ１：５と同様にしてこの構築体を調製した。

１．７−細菌により発現されたＣｆＵＳＰ−Ａ／ＢＣＤＥＦ：ハマキガＣ．ｆｕｍｉｆｅｒａｎａＵＳＰからのＡ／ＢＣＤＥＦドメイン（「ＣｆＵＳＰ−Ａ／ＢＣＤＥＦ」；配列番号：３０）でこの構築体を調製した。

１．８−ＧＡＬ４／ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：ミバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＥｃＲからの野生型Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦドメイン（「ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ」；配列番号：３１）をＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（「Ｇａｌ４ＤＮＡＢＤ」または「Ｇａｌ４ＤＢＤ」；配列番号：６）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：２２）の制御下に置いた。バッタＬｏｃｕｓｔａｍｉｇｒａｔｏｒｉａウルトラスピラクル蛋白質からのＥおよびＦドメイン（「ＬｍＵＳＰ−ＥＦ」；配列番号：２３）をＶＰ１６からのトランス活性化ドメイン（「ＶＰ１６ＡＤ」；配列番号：１２）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：２２）の制御下に置いた。５つのコンセンサスＧＡＬ４応答エレメント結合部位（「５ＸＧＡＬ４ＲＥ」；配列番号：１９を含むＧＡＬ４ＲＥの５つのコピーを含む）を合成Ｅ１ｂ最小プロモーター（配列番号：２４）に融合させ、ルシフェラーゼ遺伝子（配列番号：２５）の上流に置いた。

１．９−ＧＡＬ４／突然変異体ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：後述表２から選択された置換突然変異を含むリガンド結合ドメインを含む突然変異体ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦで野生型ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦを置き換える以外は、前記スイッチ１．８と同様にしてこの構築体を調製した。

１．１０−ＶＰ１６／ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ：ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインをＶＰ１６からのトランス活性化ドメイン（「ＶＰ１６ＡＤ」；配列番号：１２）で置き換え、バキュロウイルスＩＥ１プロモーター（配列番号：２８）の制御下に置く以外は、スイッチ１．８と同様にしてこの構築体を調製した。６つのコンセンサスエクジソン応答エレメント結合部位（「６ＸＥｃＲＥ」；配列番号：１８を含むエクジソンＲＥの６つのコピーを含む）を合成Ｅ１ｂ最小プロモーター（配列番号：２４）に融合させ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（配列番号：２９）の上流に置いた。この構築体は、ヘテロ二量体化パートナーとして内因性ウルトラスピラクル蛋白質を用いる。

１．１１−ＶＰ１６／突然変異体ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ：前記表２から選択された置換突然変異を含むリガンド結合ドメインを含む突然変異体ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦで野生型ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦを置き換える以外は、前記スイッチ１．１０と同様にしてこの構築体を調製した。

１．１２−ＧＡＬ４／ＡｍａＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：マダニＡｍｂｌｙｏｍｍａａｍｅｒｉｃａｎｕｍＥｃＲからの野生型Ｄ、ＥおよびＦドメイン（「ＡｍａＥｃＲ−ＤＥＦ」；配列番号：３３）をＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（「Ｇａｌ４ＤＮＡＢＤ」または「Ｇａｌ４ＤＢＤ」；配列番号：６）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：２２）の制御下に置いた。バッタＬｏｃｕｓｔａｍｉｇｒａｔｏｒｉａウルトラスピラクル蛋白質からのＥおよびＦドメイン（「ＬｍＵＳＰ−ＥＦ」；配列番号：２３）をＶＰ１６からのトランス活性化ドメイン（「ＶＰ１６ＡＤ」；配列番号：１２）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：２２）の制御下に置いた。５つのコンセンサスＧＡＬ４応答エレメント結合部位（「５ＸＧＡＬ４ＲＥ」；配列番号：１９を含むＧＡＬ４ＲＥの５つのコピーを含む）を合成Ｅ１ｂ最小プロモーター（配列番号：２４）に融合させ、ルシフェラーゼ遺伝子（配列番号：２５）の上流に置いた。

１．１３−ＧＡＬ４／突然変異体ＡｍａＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：下記表３から選択された置換突然変異を含むリガンド結合ドメインを含む突然変異体ＡｍａＥｃＲ−ＤＥＦで野生型ＡｍａＥｃＲ−ＤＥＦを置き換える以外は、前記スイッチ１．１２と同様にしてこの構築体を調製した。

置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインの構築：
ＥｃＲリガンド結合を修飾する努力において、分子モデリング分析に基づいてリガンド結合に対して重要であると予測されたＥｃＲリガンド結合ドメイン内の残基を、生物の３つの異なるクラスからのＥｃＲにおいて突然変異させた。表１−３は、各々、ステロイドおよび非−ステロイド結合の修飾につき突然変異させ、調べたＣｆＥｃＲ（鱗翅目ＥｃＲ）、ＤｍＥｃＲ（双翅目ＥｃＲ）およびＡｍａＥｃＲ（節足動物ＥｃＲ）のリガンド結合ドメイン内のアミノ酸残基を示す。

表１−３にリストしたアミノ酸置換突然変異の各々の１つを、アラニンへの（あるいは、各々、野生型アラニン残基、例えば、ＣｆＥｃＲのＡ１１０およびＡ１２３残基の場合にはプロリンまたはフェニルアラニンへの）ＰＣＲ媒介部位特異的突然変異誘発によって、ＥｃＲｃＤＮＡにおいて構築した。ＣｆＥｃＲのアミノ酸Ｔ５２、Ｖ９６およびＡ１１０を４つの異なるアミノ酸に突然変異させた。５つの異なる二重点突然変異体ＣｆＥｃＲも作成した：１つはＲ９５ＡおよびＡ１１０Ｐの双方の置換（Ｒ９５Ａ＋Ａ１１０Ｐ、「ＤＭ」）を含み、第２のものはＭ２１８ＡおよびＣ２１９Ａの双方の置換（Ｍ２１８Ａ＋Ｃ２１９Ａ）を含み、第３のものはＶ１０７ＩおよびＲ１７５Ｅの双方の置換（Ｖ１０７Ｉ＋Ｒ１７５Ｅ）を含み、第４のものはＹ１２７ＥおよびＲ１７５Ｅの置換（Ｙ１２７Ｅ＋Ｒ１７５Ｅ）を含み、ならびに第５のものはＶ１０７ＩおよびＹ１２７Ｅの置換（Ｖ１０７Ｉ＋Ｙ１２７Ｅ）を含む。また、６つの異なる三重点突然変異体ＣｆＥｃＲも作成した：１つはＶ１０７ＩおよびＲ１７５Ｅの置換ならびにＹ１２７Ｅの置換を共に含み（Ｖ１０７Ｉ＋Ｙ１２７Ｅ＋Ｒ１７５Ｅ）、第２のものはＴ５２Ｖの置換ならびにＶ１０７ＩおよびＲ１７５Ｅの置換を含み（Ｔ５２Ｖ＋Ｖ１０７Ｉ＋Ｒ１７５Ｅ）、第３のものはＶ９６Ａ、Ｖ１０７ＩおよびＲ１７５Ｅの置換を含み（Ｖ９６Ａ＋Ｖ１０７Ｉ＋Ｒ１７５Ｅ）、第４のものはＴ５２Ａ、Ｖ１０７ＩおよびＲ１７５Ｅの置換を含み（Ｔ５２Ａ＋Ｖ１０７Ｉ＋Ｒ１７５Ｅ）、第５のものはＶ９６Ｔの置換ならびにＶ１０７ＩおよびＲ１７５Ｅの置換を含み（Ｖ９６Ｔ＋Ｖ１０７Ｉ＋Ｒ１７５Ｅ）、さらに第６のものはＡ１１０Ｐ、Ｖ１０７ＩおよびＲ１７５Ｅの置換を含む。

以下のような反応条件およびサイクリングパラメーターを用いるＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を用いてＰＣＲ部位特異的突然変異誘発を行った。ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発は、５０μＬの最終反応容量中の１ｘ反応緩衝液（製造業者によって供給）、５０ｎｇのｄｓＤＮＡ鋳型、１２５ｎｇの順方向プライマー（ＦＰ）、１２５ｎｇの逆方向相補性プライマー（ＲＣＰ）、および１μＬのｄＮＴＰミックス（製造業者によって供給）を用いて行った。各ＥｃＲ突然変異体を製造するのに用いた順方向プライマーおよび逆方向相補性プライマーを表４−６に提示する。用いたサイクリングパラメーターは１サイクルの３０秒間の９５℃における変性、続いての１６サイクルの３０秒間の９５℃における変性、１分間の５５℃におけるアニーリング、および２２分間の６８℃における伸長よりなるものであった。

突然変異体ＥｃＲリガンド結合ドメインをコードする得られたＰＣＲ核酸産物を、次いで、各々、前記実施例１．２、１．４、１．９および１．１３に記載したＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインに融合させた。ＧＡＬ４／突然変異体ＥｃＲ受容体構築体を、ステロイドまたは非−ステロイドリガンドの存在下にて、ＶＰ１６／ＬｍＵＳＰ−ＥＦおよびｐＦＲＬｕｃと共にそれらをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトすることによって、活性につきテストした。

また、突然変異体ＥｃＲリガンド結合ドメインをコードする得られた核酸を、各々、前記実施例１．６および１．１１に記載したＶＰ１６トランス活性化ドメインに融合させた。ＶＰ１６／突然変異体ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦおよびＶＰ１６／突然変異体ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ受容体構築体を、２０−ヒドロキシエクジソン（２０Ｅ）の存在下にて、６ＸＥｃＲＥ／β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子と共にそれらをＬ５７昆虫細胞にトランスフェクトすることによって、活性につきテストした。

リガンド：ステロイドリガンドのムリステロンＡ、ポナステロンＡ、α−エクジソンおよび２０−ヒドロキシエクジソンはＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。非−ステロイドリガンド：Ｎ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン（ＧＳ（登録商標）−Ｅ非−ステロイドリガンド）；Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−３−メトキシ−２−メチルベンゾヒドラジド（ＲＨ−２４８５）；Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−（４−エチルベンゾイル）−３，５−ジメチルベンゾヒドラジド（ＲＨ−５９９２）、およびＮ’−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−３，４−（１，２−エチレンジオキシ）−２−メチルベンゾヒドラジド（ＲＨ−１２５０２０）はＲｏｈｍａｎｄＨａａｓＣｏｍｐａｎｙで合成された合成安定エクジステロイドリガンドである。全てのリガンドをＤＭＳＯに溶解させ、ＤＭＳＯの最終濃度は対照および処理双方において０．１％に維持した。^３Ｈ−ＰｏｎＡおよび^３Ｈ−α−エクジソンはＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒから購入した。^３Ｈ−ＲＨ２４８５はＲｏｈｍａｎｄＨａａｓＣｏｍｐａｎｙで合成した。

トランスフェクション：実施例１に概説した種々のスイッチ構築物、具体的には、スイッチ１．１−１．１３に対応するＤＮＡを以下のようにマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ）またはＬ５７細胞（ＰｅｔｅｒＣｈｅｒｂａｓ博士；ＩｎｄｉａｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）にトランスフェクトした。細胞の培養および維持についての標準的な方法は以下の通りであった。細胞が５０％密集に到達すると、それを回収し、各々、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有する２．５、１．０または０．５ｍｌの増殖培地中で、各々、１２５，０００、５０，０００または２５，０００細胞にて６−、１２−または２４−ウェルプレートで平板培養した。翌日、細胞を増殖培地ですすぎ、４時間トランスフェクトした。トランスフェクション試薬として、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）（ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．）を３Ｔ３細胞に用い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＬ５７細胞に用いた。１２−ウェルプレートでは、４μｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）を１００μｌの増殖培地と混合した。１μｇのレポーター構築体および分析すべき受容体対の０．２５μｇの各受容体構築体をトランスフェクションミックスに添加した。チミジンキナーゼ（ＴＫ）構成的プロモーターに作動可能に連結し、その制御下に置かれたＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を含む第２のレポーター構築体を添加し［ｐＴＫＲＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．１μｇ／トランスフェクションミックス］、これを標準化で用いた。トランスフェクションミックスの内容物を攪拌ミキサーで混合し、室温にて３０分間放置した。インキュベーションの最後に、トランスフェクションミックスを、４００μｌの増殖培地中に維持した細胞に添加した。細胞を３７℃および５％ＣＯ_２にて４時間維持した。インキュベーションの最後に、２０％ＦＢＳおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；対照）またはステロイドもしくは非−ステロイドリガンドのＤＭＳＯ溶液いずれかを含有する５００μｌの増殖培地を添加し、細胞を３７℃および５％ＣＯ_２にて４８時間維持した。細胞を回収し、レポーター活性をアッセイした。全ての試薬を６ウェルプレートで２倍とし、２４−ウェルプレートで半分にする以外は、同一の手法を６および２４ウェルプレートで同様に行った。

レポーターアッセイ：リガンドを添加して４０時間後に細胞を回収した。１２５μｌの受動溶解緩衝液（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＤｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（商標）レポーターアッセイシステムの一部）を２４−ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートをロータリーシェーカー上に１５分間置いた。２０μｌの溶解物をアッセイした。製造業者の指示に従い、ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＤｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（商標）レポーターアッセイシステムを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。製造業者の指示に従い、ＴＲＯＰＩＸからのＧａｌａｃｔｏ−Ｓｔａｒ（商標）アッセイキットを用い、β−ガラクトシダーゼを測定した。標準としてＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを用い、全てのルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を標準化した。リガンド処理細胞における標準化された相対光単位（「ＲＬＵ」）をＤＭＳＯ処理細胞（未処理対照）における標準化されたＲＬＵで割ることによって、活性の倍数を計算した。

本実施例は、非−ステロイドリガンドに応答して増大した活性、およびステロイドリガンドに応答して低下した活性を呈する改良された非−ステロイド応答性ＣｆＥｃＲリガンド結合ドメイン置換突然変異体の同定を記載する。簡単に述べれば、出願人らは、エクジステロイド結合につき臨界的であると予測されるアミノ酸残基をアラニンへ突然変異させ、ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅＰＣＲ−媒介部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を用い、前記実施例１に記載したようにＧＡＬ４／突然変異体ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦｃＤＮＡ遺伝子発現カセットを創製した。該突然変異させた、およびＷＴｃＤＮＡをＧＡＬ４−駆動ルシフェラーゼレポーターアッセイでテストした。

トランスフェクション：実施例１に概説した種々のスイッチ構築体、具体的には、スイッチ１．１−１．２に対応するＤＮＡを以下のようにマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。細胞が５０％密集に到達すると、それを回収し、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有する０．５ｍｌの増殖倍地中で１２，５００細胞／ウェルにて２４ウェルプレートで平板培養した。翌日、細胞を増殖培地ですすぎ、４時間トランスフェクトした。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）（ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．）は３Ｔ３細胞に対して最良のトランスフェクション試薬であることが判明した。２μｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）を１００μｌの増殖培地と混合し、５０ｎｇのＧＡＬ４／野生型ＥｃＲまたはＧａｌ４／突然変異体ＥｃＲカセットいずれか、５０ｎｇのＶＰ１６／ＬｍＵＳＰ−ＥＦおよび２００ｎｇのｐＦＲＬｕｃをトランスフェクションミックスに添加した。チミジンキナーゼ（ＴＫ）構成的プロモータに作動可能に連結され、その制御下に置かれたＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を含む第２のレポーター構築体を添加し［ｐＴＫＲＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．０５μｇ／トランスフェクションミックス］、これを標準化で用いた。トランスフェクションミックスの内容物を攪拌ミキサーで混合し、室温にて３０分間放置した。インキュベーションの最後に、２００μｌの増殖培地中に維持した細胞にトランスフェクションミックスを添加した。細胞を３７℃および５％ＣＯ_２にて４時間維持した。インキュベーションの最後に、２０％ＦＢＳおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；対照）または１０ｎＭもしくは２．５μＭのＰｏｎＡステロイドリガンドもしくはＧＳ（商標）−Ｅ［Ｎ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン］非−ステロイドリガンドのＤＭＳＯ溶液いずれかを含有する２５０μｌの増殖培地を添加し、細胞を３７℃および５％ＣＯ_２にて４０時間維持した。細胞を回収し、前記したようにレポーター活性をアッセイした。リガンド処理細胞における標準化された相対光単位（「ＲＬＵ」）をＤＭＳＯ処理細胞（未処理対照）における標準化されたＲＬＵで割ることによって、活性の倍数を計算した。

置換すると、非−ステロイドリガンドに応答して増大した活性、およびステロイドリガンドに応答して低下した活性を呈する突然変異体エクジソン受容体を生じる２つのアミノ酸残基が同定された。突然変異したＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ受容体の活性における配列番号：１のアミノ酸残基５２または５５におけるアラニン置換の効果を、Ｇａｌ４／野生型ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ（ＷＴ）スイッチ活性に対する増加倍数として表７に示す。

本実施例は、ステロイドリガンドに応答して増大した活性、および非−ステロイドリガンドに応答して有意に低下した活性を呈するステロイド応答性ＣｆＥｃＲリガンド結合ドメイン置換突然変異体の同定を記載する。ステロイドリガンド活性を増加させるが、非−ステロイドリガンド活性を低下させるＣｆＥｃＲにおける置換突然変異を同定する努力において、出願人らは、エクジステロイド結合に対して臨界的であると予測されるアミノ酸残基を突然変異させ、ＰＣＲ−媒介部位特異的突然変異誘発キットを用い、前記実施例１に記載したようにＧＡＬ４／突然変異体ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦｃＤＮＡ遺伝子発現カセットを創製した。上記実施例１．１および１．２にて概説した種々のスイッチ構築体に対応する突然変異したおよび野生型ｃＤＮＡを作成し、前記実施例２に記載したようにＧＡＬ４−駆動ルシフェラーゼレポーターアッセイでテストした。リガンドの存在下におけるＲＬＵをリガンドの不存在下におけるＲＬＵで割ることによって、活性倍数を計算した。

置換されると、ステロイドリガンドに応答して増大した活性、および非−ステロイドリガンドに応答して低下した活性を呈する突然変異体エクジソン受容体を生じる特定のアミノ酸残基を同定した。突然変異したＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ受容体の活性に対する、配列番号：１のアミノ酸残基５２または９６におけるアミノ酸置換、および配列番号：１のアミノ酸残基９６、１０７および１７５におけるアミノ酸置換の影響を、Ｇａｌ４／野生型ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ（野生型）スイッチ活性に対する増加倍数として表８に掲げる。

本実施例は、ステロイドリガンドおよび非−ステロイドリガンド双方に応答して増大した活性を呈する改良されたステロイドおよび非−ステロイド応答性ＣｆＥｃＲリガンド結合ドメイン置換突然変異体の同定を記載する。ステロイドおよび非−ステロイドリガンド活性双方を増加させるＣｆＥｃＲにおける置換突然変異を同定する努力において、出願人らは、ステロイド結合に対して臨界的であると予測されるアミノ酸残基を突然変異させ、ＰＣＲ−媒介部位特異的突然変異誘発を用い、前記実施例１に記載したようにＧＡＬ４／突然変異体ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦｃＤＮＡ遺伝子発現カセットを創製した。前記実施例１．１および１．２において概説した種々のスイッチ構築体に対応する突然変異したおよび野生型ｃＤＮＡを作成し、前記実施例２に記載したようにＧＡＬ４−駆動ルシフェラーゼレポーターアッセイでテストした。リガンドの存在下におけるＲＬＵをリガンドの不存在下におけるＲＬＵで割ることによって、活性の倍数を計算した。

置換すると、非−ステロイドおよびステロイドリガンド双方に応答して増大した活性を呈する突然変異体エクジソン受容体を生じる特定のアミノ酸残基を同定した。突然変異したＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ受容体の活性における、配列番号：１のアミノ酸残基５２、９６、１０７または１７５におけるアミノ酸置換、配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１７５におけるアミノ酸置換、配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５におけるアミノ酸置換、配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１２７におけるアミノ酸置換、配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１２７および１７５におけるアミノ酸置換、配列番号：１のアミノ酸残基５２、１０７および１７５におけるアミノ酸置換、または配列番号：１のアミノ酸残基９６、１０７および１７５におけるアミノ酸置換の影響を、Ｇａｌ４／野生型ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ（野生型）スイッチ活性に対する増加倍数として、表９に示す。

本実施例は、ステロイドリガンドに応答して有意に低下した活性を呈するが、非−ステロイドリガンドに応答して活性に影響しない非−ステロイド応答性ＣｆＥｃＲリガンド結合ドメイン置換突然変異体の同定を記載する。ステロイドリガンド活性を低下させるが、非−ステロイドリガンド活性に影響しないＣｆＥｃＲにおける置換突然変異を同定する努力において、出願人らは、エクジステロイド結合に対して臨界的であると予測されるアミノ酸残基を突然変異させ、ＰＣＲ−媒介部位特異的突然変異誘発を用い、前記実施例１に記載したようにＧＡＬ４／突然変異体ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦｃＤＮＡ遺伝子発現カセットを創製した。実施例１．１および１．２において前記で概説した種々のスイッチ構築体に対応する突然変異したおよび野生型ｃＤＮＡを作成し、前記実施例２に記載したようにＧａＬ４−駆動ルシフェラーゼレポーターアッセイでテストした。リガンドの存在下におけるＲＬＵをリガンドの不存在下におけるＲＬＵで割ることによって、活性の倍数を計算した。

置換すると、ステロイドリガンドに応答して低下した活性、および非−ステロイドリガンドに応答して活性に対して最小効果を呈する突然変異体エクジソン受容体を生じる４つのアミノ酸残基を同定した。突然変異したＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ受容体の活性において、配列番号：１のアミノ酸残基２０、５８、９２または１１０におけるアミノ酸置換の効果を、Ｇａｌ４／野生型ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ（野生型）スイッチ活性に対する増加倍数として、表１０に示す。

表１０に記載するように、出願人らは、ステロイド結合活性を有意に低下させるＣｆＥｃＲのリガンド結合ドメインにおける点突然変異を同定した。ＣｆＥｃＲ点突然変異体Ｔ５８ＡおよびＡ１１０Ｐはステロイド結合活性を実質的に排除した。興味深いことには、これらの点突然変異体の非−ステロイド活性は有意に影響されなかった。

出願人らは、さらに、前記実施例５で同定した非−ステロイドＡ１１０ＰＣｆＥｃＲ受容体を特徴付けた。本実施例は、臨界的アラニン残基（Ａ１１０）の突然変異がステロイド結合、よって、ステロイドの存在下におけるＥｃＲによるトランス活性化の破壊に導くことを証明する。しかしながら、非−ステロイドによる結合ならびにトランス活性化は損なわれない。

リガンド結合アッセイ
出願人らは、ステロイドおよび非−ステロイドリガンド結合アッセイにおいてＡ１１０Ｐ突然変異体ＣｆＥｃＲ受容体をテストして、ステロイド結合が排除されたことを確認した。簡単に述べれば、イン・ビトロリガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）を用いてＰｏｎＡ結合活性を測定した。^３Ｈ−ＰｏｎＡ（２００Ｃｉ／ミリモル）を用いてステロイドリガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）を行った。イン・ビトロで翻訳されたＧａｌ４／野生型またはＡ１１０Ｐ突然変異体ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦおよび細菌で発現されたＧＳＴ−ＣｆＵＳＰ−Ａ／ＢＣＤＥＦを該アッセイで用いた。該アッセイは、Ｔ緩衝液［製造業者の指示（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）に従って用いたＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む９０ｍＭトリスｐＨ８．０、１０μＭのＤＴＴ］の存在下において、８μＬのＧａｌ４／野生型またはＡ１１０Ｐ突然変異体ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ、２．５μＬのＧＳＴ−ＣｆＵＳＰ−Ａ／ＢＣＤＥＦ、１μＬの^３Ｈ−ＰｏｎＡおよびコンペティターとしての２μＬの未標識（「コールド」）ＰｏｎＡで行った。該反応は室温にて１時間行い、続いてデキストラン−被覆チャコール（ｃｈａｒｃｏａｌ）（Ｓｉｇｍａ）を添加した。混合物を７０００×ｇにて１０分間遠心し、上清中の^３Ｈ−ＰｏｎＡの量を測定した。該反応は三連で行った。また、全長野生型ＥｃＲまたはそのＡ１１０Ｐ突然変異体をイン・ビトロで翻訳し、製造業者の指示に従ってＴＮＴシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて転写し、コンペティターとしてのコールド２０Ｅまたは非−ステロイド（ＲＨ２４８５およびＧＳ（商標）−Ｅ）を用いて、^３Ｈ−ＲＨ２４８５を用いてイン・ビトロリガンド結合アッセイでテストした。加えて、標準的な方法に従うＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９）を用い、５μＬのイン・ビトロ翻訳を翻訳効率につきアッセイした。野生型およびＡ１１０Ｐ突然変異体ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ受容体の双方についてのリガンド結合結果を計算し、それを図１に示す。

テストした２つの非−ステロイドリガンド、ＲＨ２４８５およびＧＳ（商標）−Ｅ、およびステロイドリガンド２０Ｅは結合した^３Ｈ−ＲＨ２４８５と効果的に競合することができ、これは、それらが野生型全長ＥｃＲに効果的に結合することができることを示唆する（図１参照）。しかしながら、Ａ１１０Ｐ突然変異体による同一リガンドの結合を調べると、ステロイド２０Ｅの結合は完全に破壊されたが、非−ステロイドの結合は影響されなかった（図１参照）。これらの結果は、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ融合蛋白質の場合におけるステロイド結合の欠如がトランケーションまたは融合のアーティファクトではないことを示し、Ａ１１０Ｐ突然変異体ＣｆＥｃＲが選択的非−ステロイド受容体であることを示す。

種々のステロイドおよび非−ステロイドリガンドに対する突然変異体Ａ１１０ＰＣｆＥｃＲのリガンド親和性：^３Ｈ−ＲＨ２４８５に結合させ、それを、異なる濃度のコールドステロイドまたは非−ステロイドと競合させることによって、Ａ１１０ＰＧＡＬ４／ＣｆＥｃＲ突然変異体のリガンド結合親和性を測定した。簡単に述べれば、^３Ｈ−ＲＨ２４８５をイン・ビトロ翻訳された全長ＣｆＥｃＲおよび細菌発現ＣｆＵＳＰに結合させ、コールドステロイドもしくは非−ステロイドリガンドの濃度を増大させて競合させた。反応は室温で１時間行い、続いて、活性化されたデキストラン被覆チャコールを添加し、７０００×ｇにて４℃で１０分間遠心した。遠心後における上清中の残存^３Ｈ−ＲＨ２４８５を、シンチレーションカウンターを用いて測定した。結合分率（ｆ結合）値を決定し、リガンドの濃度（ｍＭで表した）に対してプロットした。ステロイドＰｏｎＡおよびＭｕｒＡ、非−ステロイドＮ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン（ＧＳ（登録商標）−Ｅ非−ステロイドリガンド）；Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−３−メトキシ−２−メチルベンゾヒドラジド（ＲＨ−２４８５）；Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−（４−エチルベンゾイル）−３，５−ジメチルベンゾヒドラジド（ＲＨ−５９９２）、およびＮ’−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−３，５−ジメチルベンゾイル）−３，４−（１，２−エチレンジオキシ）−２−メチルベンゾヒドラジド（ＲＨ−１２５０２０）リガンドの各々につきＩＣ５０値を測定し、野生型および突然変異体について、各リガンドの濃度に対して結合分率をプロットすることによって決定した。

表１１に示すように、ステロイドＰｏｎＡおよびＭｕｒＡについてのＩＣ５０値は、野生型受容体についての観察されたナノモラー値と比較してＡ１１０Ｐ突然変異体の場合に増加し（１ｍＭを超える）、これは、ステロイドの結合がＡ１１０Ｐ突然変異体ＣｆＥｃＲにおいて損なわれたことを示唆する。他方、非−ステロイドＩＣ５０値はＡ１１０Ｐ突然変異体および野生型受容体双方で同様であった（表１１参照）。これらの結果は、Ａ１１０Ｐ置換突然変異の結果、ステロイドリガンドに結合する能力を喪失した非−ステロイドエクジソン受容体リガンド結合ドメインがもたらされる前記実施例５に掲げた出願人らの知見を確認する。

（トランケートされたＣｆＥｃＲまたは全長ＣｆＥｃＲバックグラウンドにおけるＡ１１０Ｐ）
ステロイド活性の喪失がトランケートされたＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ受容体またはＧＡＬ４融合蛋白質のアーティファクトによるであろう可能性を排除するために、出願人らはＡ１１０Ｐ突然変異を全長（ＦＬ）ＣｆＥｃＲ（ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦ）に導入し、実施例１．４に記載したようにそれをＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインに融合させ、ＶＰ１６／ＬｍＵＳＰ−ＥＦ、ならびにエクジソン応答エレメントの６コピー（６×ＥｃＲＥ）および合成ＴＡＴＡＡに作動可能に連結したルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を含むｐＦＲＥｃＲＥＬｕｃと組み合わせた、全長野生型ＣｆＥｃＲ（実施例１．３）と比較して、上記実施例２に記載したように２４−ウェルプレートにてＮＩＨ３Ｔ３細胞中でそれをアッセイした。トランスフェクトされた細胞を０．２５または１０μＭのＰｏｎＡまたはＧＳ（商標）−Ｅの存在下で増殖させ、リガンド添加から４０時間後に、レポーター活性を測定した。細胞を回収し、抽出物をルシフェラーゼ活性につきアッセイした。結果を図２に示す。棒線の頂部の数は、ＤＭＳＯレベルに対する増加倍数を示す。

図２に示すように、ＥｃＲＥ−駆動レポーター遺伝子の状況で、全長エクジソン受容体に導入されると、Ａ１１０Ｐ突然変異は同様の効果を有した。具体的には、ＰｏｎＡ活性は、全長Ａ１１０ＰＣｆＥｃＲ突然変異体では完全に喪失した。しかしながら、ＧＳ（商標）−Ｅの存在下にて、全長野生型ＣｆＥｃＲおよび全長Ａ１１０Ｐ突然変異体ＣｆＥｃＲの間で非−ステロイド活性における有意な差はなかった。これらの結果は、実施例５においてＧＡＬ４−融合ＣｆＥｃＲで観察されたステロイドに対するＡ１１０Ｐ突然変異体の非−応答性が、ＧＡＬ４−融合またはＥｃＲのトランケーションのアーティファクトではなかったことを示す。かくして、出願人らは、Ａ１１０アミノ酸残基が全長エクジソン受容体においてステロイド活性で臨界的であると決定した。

Ａ１１０残基は昆虫細胞においてステロイド活性で臨界的である。
哺乳動物細胞においては、ＥｃＲの天然リガンドである２０−ヒドロキシエクジソン（２０Ｅ）はＣｆＥｃＲ−ベースの遺伝子発現システムを通じてトランス活性化を誘導しない。Ａ１１０Ｐ突然変異体が２０Ｅに応答できるか否かを決定するために、出願人らは昆虫Ｌ５７細胞（ＥｃＲアイソフォームＢ、それからＡ１１０Ｐ突然変異体が由来するＣｆＥｃＲアイソフォームＢのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＥｃＲアイソフォームホモログを欠くＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ細胞系、ただし、Ｌ５７細胞は依然としてＥｃＲアイソフォームＡを含有する）にてのＥｃＲＥ−駆動レポーターアッセイでこのＡ１１０Ｐ突然変異体−ベースの遺伝子発現システムをテストした。該突然変異をＶＰ１６／ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ融合蛋白質に導入し、バキュロウイルスＩＥ１プロモーターに作動可能に連結させ、２４−ウェルプレート中で、６×エクジソン応答エレメント（「６×ＥｃＲＥ」；ｐＭＫ４３．２構築体はＳｔａｎｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＭｉｃｈａｅｌＫｏｅｌｌｅから得た）の制御下にあるｐＭＫ４３．２β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子と共にＩＥ１ＶＰ１６ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ（実施例１．５）またはそのＡ１１０Ｐ突然変異体バージョンＤＮＡ（実施例１．６）でＬ５７細胞をトランスフェクトした。４０時間の０、１、１０、１００または１０００ｎＭの２０ＥまたはＧＳ（商標）−Ｅでのトランスフェクト細胞の処理後に、Ａ１１０Ｐ突然変異体−ベースの遺伝子発現システムトランス活性化についてのレポーター活性を測定した。細胞を回収し、抽出物をβ−ガラクトシダーゼ（β−ＧＡＬ）およびルシフェラーゼ活性につきアッセイした。β−ガラクトシダーゼは、製造業者の指示に従い、ＴＲＯＰＩＸからのＧａｌａｃｔｏ−Ｓｔａｒ（商標）アッセイキットを用いて測定した。棒線の頂部の数はＤＭＳＯレベルに対する増加倍数を示す。結果を図３に示す。

昆虫細胞においては、野生型ＣｆＥｃＲ−ベースの遺伝子発現システムは２０ＥおよびＧＳ（商標）−Ｅ双方に応答して用量依存的にβ−ＧＡＬ活性を誘導したのに対し、Ａ１１０Ｐ突然変異体−ベースの遺伝子発現システムはＧＳ（商標）−Ｅの存在下でレポーター遺伝子の発現をトランス活性化させ、しかしながら、Ａ１１０Ｐ突然変異体でトランスフェクトしたＬ５７細胞は２０Ｅの存在下でわずかに増加したレポーター遺伝子活性を示した（図３参照）。出願人らは、ＣｆＥｃＲアイソフォームＢに由来するＡ１１０Ｐ突然変異体は２０Ｅをそうしないことを証明したので（データは示さず）、２０Ｅの存在下におけるこの低レベルの活性はＬ５７細胞内のＥｃＲアイソフォームＡの内因性活性にほとんどよるであろう。

Ｌ５７細胞におけるＥｃＲＥ−駆動レポーター遺伝子の状況で、全長受容体に導入した場合にＡ１１０Ｐ突然変異は同様の効果を有し、これは、該突然変異が、恐らくは、昆虫転写補因子存在下で昆虫細胞において類似の効果を有することを示す（データは示さず）。これらのデータは、哺乳動物細胞からの出願人らの結果を確認し、Ａ１１０Ｐ突然変異の結果、ＣｆＥｃＲのステロイド応答性に対する劇的な効果をもたらすが、ＣｆＥｃＲの非−ステロイド応答性には影響しないことを確立する。

実施例５および６で示した出願人らの結果は、ＣｆＥｃＲリガンド結合ドメインのステロイド活性については臨界的な残基であるが、非−ステロイド活性についてはそうではない位置１１０におけるアラニン残基の同定を記載する。レポーター遺伝子のＣｆＥｃＲステロイドおよび非−ステロイドトランス活性化におけるＡ１１０残基の役割をさらに特徴付けするために、縮重プライマーを用いてＡ１１０を突然変異することによって、ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦレポーターのミニライブラリーを調製した。これらの縮重ＰＣＲプライマー（配列番号：８３および配列番号：８４または配列番号：８５および配列番号：８６いずれかを含むＡ１１０Ｐランダムプライマー対；表４参照）を、Ａ１１０を種々のアミノ酸残基で置き換えるように設計した。用いたＰＣＲ突然変異誘発条件は実施例１にて前記した通りである。得られたクローンを配列決定して、突然変異体を同定した。

Ａ１１０突然変異体のレポーター遺伝子トランス活性化
４つの突然変異：Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０ＬおよびＡ１１０Ｍを得た。これらの４つの突然変異体および野生型受容体をＮＩＨ３Ｔ３細胞でアッセイした。４つの突然変異体または野生型ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ受容体、ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦおよびｐＦＲＬＵＣの各々のＧＡＬ４融合物をＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトし、０、０．０４、０．２、１、５または２５μＭのＰｏｎＡ、ＭｕｒＡ、Ｎ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン（ＧＳ（商標）−Ｅ非−ステロイドリガンド）、またはＮ’−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−３，４−（１，２−エチレンジオキシ）−２−メチルベンゾヒドラジド（ＲＨ−１２５０２０）の存在下にて細胞を４８時間増殖させ、レポーター活性を測定した。図４に示すように、野生型エクジソンレポーターは、ステロイドおよび非−ステロイド双方の存在下にてレポーター活性を示した。しかしながら、全ての突然変異体受容体は非−ステロイドリガンドの存在下でのみレポーター活性を示したが、ステロイドリガンドの存在下では示さなかった。Ａ１１０Ｐ突然変異体は野生型受容体と比較して同様の非−ステロイド活性を呈したが、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０ＬおよびＡ１１０Ｍ突然変異体は２つの最低濃度においてより低い感受性を示し、検出可能なトランス活性化は示さなかった。これらの結果は、Ａ１１０置換突然変異体ＥｃＲリガンド結合ドメインがステロイドに対する有意に低下した応答によって特徴付けられるが、依然として非−ステロイドに対して応答性であることを確認する。

Ａ１１０突然変異体によるリガンド結合；出願人らは、^３Ｈ−ＰｏｎＡまたは^３Ｈ−ＲＨ２４８５（Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−３−メトキシ−２−メチルベンゾヒドラジド）放射性標識リガンドを用いてリガンド結合アッセイを行って、置換突然変異体および野生型エクジソン受容体のリガンド応答性の差がリガンド結合のレベルにおける差によるものかを判断した。ＣｆＥｃＲ野生型および突然変異体受容体をイン・ビトロ転写し、翻訳し、細菌で発現されたＧＳＴ−ＣｆＵＳＰ−Ａ／ＢＣＤＥＦ（全長）の存在下でアッセイした。Ａ１１０Ｐ突然変異体へのＰｏｎＡ結合は検出できず、他方、他のＡ１１０置換突然変異体は野生型受容体結合の５−１０％を示した（図５参照）。テストした野生型ＥｃＲおよび全ての突然変異体はＲＨ−２４８５、ＧＳ（商標）−Ｅの密接なアナログに対して同様な結合を示した（図６参照）。恐らくは、Ａ１１０Ｐ突然変異体の柔軟性のないプロリン残基がステロイドリガンドの結合を妨げるが、非−ステロイドリガンドの結合を妨げない。

イン・ビトロ翻訳された蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、野生型受容体と同様に翻訳されることが判明し、これは、突然変異体および野生型受容体の間で観察された結合の差がアッセイで存在する蛋白質の量の変動によるものではないことを示唆する（データは示さず）。ほとんどの場合、リガンド結合活性はレポーター遺伝子の活性と相関し、これは、Ａ１１０残基がエクジステロイドの結合で臨界的な役割を果たすが、非−ステロイドの結合では果たさないという出願人らの発見のさらなる証拠を提供する。

Ａ１１０置換突然変異体の全ては、哺乳動物および昆虫細胞において、ステロイドの存在下で、ステロイド結合ならびにレポーター遺伝子をトランス活性化するその能力が損なわれた。これらの突然変異体は、非−ステロイドの存在下で、野生型レベルの非−ステロイド結合およびレポーター遺伝子トランス活性化を維持した。

ヘリックス５および６の間の予測されたβ−シートに隣接して見出されたＡ１１０残基は、昆虫の種々の種からのＥｃＲにおいて、およびＲＸＲ、プロゲステロン受容体（ＰＲ）およびエストロゲン受容体（ＥＲ）において高度に保存されており、これは、この残基がリガンド結合および、かくして、トランス活性化で臨界的であることをさらに基礎づける。加えて、Ａ１１０残基は他の高度に保存された残基によって挟まれており、そのいくつかはリガンド結合および／またはトランス活性化で臨界的であり得る。核受容体の３次元構造の密接な比較は、異なる核受容体の間で保存されたＬＢＤにおいてさえ主要な構造変化があることを示す。異なる核受容体構造の間のみならず、ＥＲの場合のように天然および合成リガンドに結合した場合の同一受容体の複合体でも重要な変化が観察される。ステロイドおよび非−ステロイドの結合は同様な状況を反映し得る。作成された相同性モデルは、２つのリガンドの結合が関連するヘリックスおよび接触残基の点で異なることを示唆する。トランス活性化アッセイの結果の綿密な調査は、２つの状況において用量応答がわずかに異なることを示唆する。ステロイドはより低い濃度において活性が低いが、非−ステロイド誘導活性は数倍高い。しかしながら、より高い用量においては、ステロイドおよび非−ステロイド活性は同様である。より低い濃度での非−ステロイドのより高い活性は、非−ステロイドのＥｃＲに対するより高い親和性を反映し得る。ｔｅｒｔ−ブチル基の存在がいくつかの非−ステロイドがＥｃＲＬＢＤとで広いファン・デア・ワールス接触を形成するのを可能とし、かくして、エクジステロイドによって占有されていない溝にフィットすることが示唆されている。これは、低いリガンド濃度においてレポーター遺伝子アッセイでステロイドおよび非−ステロイドの活性で観察された差を幾分説明するであろう。結合が立体配座の変化、かくして、トランス活性化のポテンシャルに影響するメカニズムは未だ知られていない。しかしながら、ＥＲの場合には、アゴニストおよびアンタゴニストの結合は異なる立体配座の変化を誘導し、ヘリックス１２の変位をもたらすことが示されている。ヘリックス１２はコアクチベーターの受容体に対する動員および相互作用で積極的な役割を演じる。ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）のようなアゴニストの場合には、コアクチベーターＧＲＩＰ１は、ヘリックス３、４、５および１２、ならびにヘリックス３および４の間のターンによって形成されたＬＢＤの表面の疎水性溝に、結合する。他方、部分的アンタゴニスト４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）の存在下では、ＧＲＩＰＮＲボックスとＬＢＤとの相互作用を模倣することによって、ヘリックス１２はコアクチベーター認識溝をブロックする。また、ステロイドおよび非−ステロイドの結合は、コアクチベーターの動員、かくして、トランス活性化に影響する微妙な立体配座の変化を誘導できるであろう。

Ａ１１０残基はステロイドリガンドの側鎖と相互作用すると思われる。この位置におけるよりバルキーなまたは柔軟性のない残基の導入は潜在的にこれらの相互作用を破壊し、かくして、リガンドのＬＢＤへのドッキングを破壊する。これは、今度は、ＥｃＲの非−活性化をもたらす。非−エクジステロイドの結合および活性化に影響することのないエクジステロイド結合の破壊をもたらす突然変異体の同定は、哺乳動物系で用いるために正確に調節することができるエクジソン誘導性システムを開発するためのＥｃＲの系列的進化についての手段を提供する。

本実施例は、ステロイドリガンドおよび非−ステロイドリガンド双方に応答して減少した活性を呈するＣｆＥｃＲリガンド結合ドメイン置換突然変異体の同定を記載する。これらの置換突然変異体は、直交リガンド同定のためのリガンドスクリーニングアッセイで有用である。ステロイドおよび非−ステロイドリガンド活性双方を減少させるＣｆＥｃＲにおける置換突然変異を同定する努力において、出願人らは、エクジステロイド結合に対して臨界的であると予測されるアミノ酸残基を突然変異させ、ＰＣＲ−媒介部位特異的突然変異誘発を用い、前記実施例１に記載したようにＧＡＬ４／突然変異体ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦｃＤＮＡ遺伝子発現カセットを創製した。実施例１．１および１．２にて前記で概説した種々のスイッチ構築体に対応する突然変異したおよび野生型ｃＤＮＡを作成し、前記実施例２に記載したようにＧＡＬ４−駆動ルシフェラーゼレポーターアッセイでテストした。リガンドの存在下におけるＲＬＵをリガンドの不存在下におけるＲＬＵで割ることによって、活性の倍数を計算した。

置換されると、非−ステロイドおよびステロイドリガンド双方に応答して減少した活性を呈する突然変異体エクジソン受容体を生じる１７のアミノ酸残基を同定した。突然変異したＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ受容体の活性において、配列番号：１のアミノ酸残基２１、４８、５１、５９、６２、９３、９５、１０９、１２０、１２３、１２５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４または２３８におけるアミノ酸置換の影響を、Ｇａｌ４／野生型ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ（野生型）スイッチ活性に対する増加倍数として表１２に示す。加えて、２つの二重突然変異体（Ｒ９５Ａ／Ａ１１０ＰおよびＭ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ）および一つの三重突然変異体（Ｖ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ）を作成し、また、非−ステロイドおよびステロイドリガンド双方に応答して減少した活性を呈する突然変異したＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ受容体として同定した（表１２参照）。

本実施例は、前記にて同定したＣｆＥｃＲリガンド結合ドメイン置換突然変異体と類似するＤｍＥｃＲリガンド結合ドメイン内のアミノ酸残基においてＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）内への置換突然変異の導入を記載する。具体的には、各々、ＣｆＥｃＲの配列番号：１のアミノ酸残基１１０、１２４、２１１および２１９に対応するＤｍＥｃＲの配列番号：２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３および２１７において置換突然変異を導入した。

出願人らは、エクジステロイド結合に対して臨界的であると予測されるアミノ酸残基を突然変異させ、ＰＣＲ−媒介部位特異的突然変異誘発を用い、前記実施例１に記載したようにＧＡＬ４／突然変異体ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦｃＤＮＡ遺伝子発現カセットを創製した。実施例１．８および１．９にて前記で概説した種々のスイッチ構築体に対応する突然変異したおよび野生型ｃＤＮＡを作成し、実施例２に記載したようにＮＩＨ３Ｔ３細胞にてレポーターアッセイでテストした。各ＧＡＬ４／ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ構築体、ＶＰ１６／ＬｍＵＳＰ−ＥＦ、およびｐＦＲＬＵＣをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を２．５μＭのＧＳ（商標）−ＥまたはポナステロンＡで処理した。細胞を回収し、リガンドの添加から４８時間後にレポーター活性を測定した。リガンドの存在下におけるレポーター活性をリガンドの不存在下におけるレポーター活性で割ることによって、誘導倍数を計算した。誘導倍数から、野生型活性パーセントを各突然変異体につき計算した。結果を表１３に示す。

表１３で分かるように、ＤｍＥｃＲリガンド結合ドメインをアミノ酸残基１２１または２１７で突然変異させた場合、非−ステロイドおよびステロイド活性双方が有意に減少し、これは、これらの残基がＤｍＥｃＲのリガンド結合ポケットにおいて重要な残基であることを示す。

また、実施例１．１０および１．１１に記載したように、野生型および突然変異体ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ受容体を用いて、ＶＰ１６／野生型または突然変異体ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ構築体を作成した。ＶＰ１６ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦおよび６×ＥｃＲＥβ−ｇａｌレポーターをＬ５７細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を１μＭの２０−ヒドロキシエクジソン（２０Ｅ）またはＧＳ（商標）−Ｅで処理した。細胞を回収し、溶解させ、次いで、上記実施例６に記載したようにレポーター活性を測定した。リガンドの存在下におけるレポーター活性をリガンドの不存在下におけるレポーター活性で割ることによって、誘導倍数を計算した。誘導倍数から、野生型活性パーセントを各突然変異体につき計算した。結果を表１４に示す。

ＤｍＥｃＲのＡ１０７Ｐ突然変異はほとんどのステロイド活性の喪失を引き起こしたが、非−ステロイド活性に対してはほとんど効果を有しなかった。ＤｍＥｃＲのＧ１２１ＲおよびＣ２１７Ｓ突然変異の結果、ステロイド活性において、各々、５０％および６１％低下がもたらされたが、非−ステロイド活性に対しては最小の効果しかもたらされなかった。ＤｍＥｃＲのＣ２１７Ａの突然変異の結果、非−ステロイドおよびステロイド活性が低下し、ＤｍＥｃＲ突然変異体Ｇ１２１ＬおよびＮ２１３Ａはステロイドおよび非−ステロイド双方に対する感受性を喪失し、これは、これらの残基がステロイドおよび非−ステロイド双方に対する結合に関与することを示す。

（実施例１０）
本実施例は、前記にて同定したＣｆＥｃＲリガンド結合ドメイン置換突然変異体に類似するＡｍａＥｃＲリガンド結合ドメイン内のアミノ酸残基においてＡｍｂｌｙｏｍｍａａｍｅｒｉｃａｎｕｍＥｃＲ（ＡｍａＥｃＲ）内への置換突然変異の導入を記載する。具体的には、各々、ＣｆＥｃＲの配列番号：１のアミノ酸残基９６および１１０に対応するＡｍａＥｃＲの配列番号：３のアミノ酸残基９１および１０５において置換突然変異を導入した。

出願人らは、エクジステロイド結合に対して臨界的であると予測されるアミノ酸残基を突然変異させ、ＰＣＲ−媒介部位特異的突然変異誘発を用い、前記実施例１に記載したようにＧＡＬ４／突然変異体ＡｍａＥｃＲ−ＤＥＦｃＤＮＡ遺伝子発現カセットを創製した。実施例１．１２および１．１３において前記で概説した種々のスイッチ構築体に対応する突然変異したおよび野生型ｃＤＮＡを、実施例２に記載したようにＮＩＨ３Ｔ３細胞においてＧＡＬ４−駆動ルシフェラーゼレポーター活性でテストした。ＧＡＬ４／ＡｍａＥｃＲ−ＤＥＦ、ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦおよびｐＦＲＬＵＣをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を０．２μＭのポナステロンＡステロイドリガンドまたは１μＭのＧＳ（商標）−Ｅ非−ステロイドリガンドいずれかで処理した。細胞を回収し、リガンドの添加から４８時間後にレポーター活性を測定した。リガンドの存在下におけるレポーター活性をリガンドの不存在下におけるレポーター活性で割ることによって、誘導倍数を計算した。誘導倍数から、野生型活性パーセントを各突然変異体につき計算した。結果を表１５に示す。

ＣｆＥｃＲにおけるＶ９６の相同アミノ酸残基の位置におけるＡｍａＥｃＲのＧ９１Ａ突然変異の結果、ステロイドおよび非−ステロイド活性が増大した。ＣｆＥｃＲのＡ１１０の相同アミノ酸残基の位置におけるＡｍａＥｃＲのＡ１０５Ｐ突然変異はほとんどのステロイド活性の喪失を引き起こし、非−ステロイド活性を実質的に排除した。

本発明は本明細書中に記載した特定の実施形態によってその範囲が制限されるものではない。事実、本明細書中に記載したものに加えて本発明の種々の修飾は、これまでの記載および添付の図面から当業者に明らかであろう。そのような修飾は添付の特許請求の範囲の範囲内にあることを意図する。

全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および核酸またはポリペプチドについて与えられた全ての分子量または分子質量値は近似的なものであり、説明のために与えられる。

図１は、ステロイド結合が完全に破壊された場合の全長Ａ１１０ＰＣｆＥｃＲ突然変異体のイン・ビトロ^３Ｈ−ＲＨ２４８５リガンド結合を示す。リガンド結合値は特異的カウント（特異的ｄｐｍ）として表す。図２は、ＰｏｎＡまたはＧＳ（商標）−ＥによりＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦおよびｐＦＲＥｃＲＥと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＧＡＬ４／ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦ（全長ＣｆＥｃＲ）またはそのＧＡＬ４／Ａ１１０Ｐ突然変異体バージョン構築体を通じてのレポーター遺伝子のトランス活性化を示す。棒線の頂部の数はＤＭＳＯレベルに対する増加倍数を示す。図３は、２０ＥまたはＧＳ（登録商標）−ＥによりｐＭＫ４３．２レポーターと共にＬ５７細胞にトランスフェクトされたＩＥ１ＶＰ１６／ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ（実施例１．５）またはそのＶＰ１６／Ａ１１０Ｐ突然変異体バージョン構築体（実施例１．６）を通じてのレポーター遺伝子のトランス活性化を示す。棒線の頂部の数はＤＭＳＯレベルに対する増加倍数を示す。図４は、ＰｏｎＡまたはＧＳ（商標）−ＥによりＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦおよびｐＦＲＥｃＲＥと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＧＡＬ４／ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦ（全長ＣｆＥｃＲ）またはそのＧＡＬ４／Ａ１１０突然変異体バージョン（Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０ＬおよびＡ１１０Ｍ）構築体を通じてのレポーター遺伝子のトランス活性化を示す。棒線の頂部の数はＤＭＳＯレベルに対する増加倍数を示す。図５は、野生型ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦ（全長ＣｆＥｃＲ）またはそのＡ１１０突然変異体バージョン（Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０ＬおよびＡ１１０Ｍ）のイン・ビトロ^３Ｈ−ＰｏｎＡリガンド結合を示す。リガンド結合値は特異的カウント（特異的ｄｐｍ）として表す。図６は、野生型ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦ（全長ＣｆＥｃＲ）またはそのＡ１１０突然変異体バージョン（Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０ＬおよびＡ１１０Ｍ）のイン・ビトロ^３Ｈ−ＲＨ２４８５リガンド結合を示す。これらの値は特異的カウント（特異的ｄｐｍ）として表した。

Claims

ａ）ｉ）その発現を変調すべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン；および
ｉｉ）核受容体リガンド結合ドメイン
を含む第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞中で発現させることができる遺伝子発現カセット：および
ｂ）ｉ）トランス活性化ドメイン；および
ｉｉ）核受容体リガンド結合ドメイン
を含む第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞中で発現させることができる遺伝子発現カセット、
ここで、核受容体リガンド結合ドメインのうちの１つが、アミノ酸残基の置換をもたらす置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインであり、該アミノ酸残基はａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６２、９２、９３、９５、９６、１０７、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、１７５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４または２３８、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９５および１１０、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１７５、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１２７、ｇ）アミノ酸残基１０７、１２７および１７５、ｈ）配列番号：１のアミノ酸残基５２、１０７および１７５、ｉ）配列番号：１のアミノ酸残基９６、１０７および１７５、ｊ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１１０および１７５、ｋ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３または２１７、あるいはｌ）配列番号：３のアミノ酸残基９１もしくは１０５の位置におけるものであり、
前記置換突然変異はａ）配列番号：１のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５２Ｌ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｉ、Ｆ１０９Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｍ、Ａ１１０Ｌ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｒ１７５Ｅ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、Ｍ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ｔ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５ＥまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＧ９１ＡまたはＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される、ならびに
ｃ）ｉ）ＤＮＡ結合ドメインによって認識される応答エレメント；
ｉｉ）トランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；および
ｉｉｉ）その発現が変調されるべき遺伝子
を含む遺伝子発現カセット
を含む遺伝子発現変調システム。
該ＤＮＡ−結合ドメインがエクジソン受容体ＤＮＡ−結合ドメイン、ＧＡＬ４ＤＮＡ−結合ドメイン、およびＬｅｘＡＤＮＡ−結合ドメインよりなる群から選択される請求項１に記載の遺伝子発現変調システム。
トランス活性化ドメインがエクジソン受容体トランス活性化ドメイン、ＶＰ１６トランス活性化ドメイン、Ｂ４２酸性アクチベータトランス活性化ドメイン、およびｐ６５トランス活性化ドメインよりなる群から選択される請求項１に記載の遺伝子発現変調システム。
ａ）請求項１に記載の遺伝子発現変調システムを宿主細胞に導入し；さらに、
ｂ）宿主細胞にリガンドを導入する；
工程を含む、宿主細胞において遺伝子の発現を変調する方法。
該リガンドが、
ａ）式：

（式中、Ｅは第三級炭素を含有する（Ｃ_４−Ｃ_６）アルキルまたは第三級炭素を含有するシアノ（Ｃ_３−Ｃ_５）アルキルであり；
Ｒ^１はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ_３、ＣＨＦ_２、ＣＨＣｌ_２、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨ_２Ｃｌ、ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨ_２ＯＭｅ、ＣＨ_２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ^０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ_２ＣＦ_３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣＮまたはＳＣＨＦ_２であり；
Ｒ^２はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ホルミル、ＣＦ_３、ＣＨＦ_２、ＣＨＣｌ_２、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨ_２Ｃｌ、ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨ_２ＯＭｅ、ＣＨ_２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ^０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ_２、ＮＥｔ_２、ＳＭｅ、ＳＥｔ、ＳＯＣＦ_３、ＯＣＦ_２ＣＦ_２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ_２ＣＦ_３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ_３、ＯＣＨＦ_２、Ｏ−ｉ−Ｐｒ、ＳＣＮ、ＳＣＨＦ_２、ＳＯＭｅ、ＮＨ−ＣＮであるか、またはＲ^３、ならびにＲ^２およびＲ^３が結合したフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ^３はＨ、Ｅｔであるか、またはＲ^２、ならびにＲ^２およびＲ^３が結合したフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は独立してＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル、ＣＦ_３、ＣＨＦ_２、ＣＨＣｌ_２、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨ_２Ｃｌ、ＣＨ_２ＯＨ、ＣＮ、Ｃ^０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅまたはＳＥｔである）
の化合物；または
ｂ）エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡ、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート、７−ケトコレステロール−３−スルフェート、ファルネゾール、胆汁酸、１，１−ビスフォスフォネートエステル、または幼若ホルモンＩＩＩ
である請求項４に記載の方法。
さらに、宿主細胞に第２のリガンドを導入することを含み、第２のリガンドが９−シス−レチノイン酸またはレチノイン酸の合成アナログである請求項４に記載の方法。
請求項１に記載の遺伝子発現変調システムを含む単離された宿主細胞。
請求項７に記載の宿主細胞を含む非−ヒト生物。