JP2002510790A - 指向的進化バイオセンサ - Google Patents

指向的進化バイオセンサ

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JP2002510790A JP2000542488A JP2000542488A JP2002510790A JP 2002510790 A JP2002510790 A JP 2002510790A JP 2000542488 A JP2000542488 A JP 2000542488A JP 2000542488 A JP2000542488 A JP 2000542488A JP 2002510790 A JP2002510790 A JP 2002510790A
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アール． ラーナー，マイケル
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ブンセン ラッシュ ラボラトリーズ インコーポレーテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明はスペクトル域が広い一般有臭剤の検知器の開発に責任を負う進化原理に役立つものであり、数千の化学品を検知、識別することができるＧタンパク質共役受容体(GPCR)系のシステムを創出する。その方法はＧタンパク質受容体、チロシンキナーゼ受容体および／またはイオンチャンネルなどの受容体の規定されたセットを高等動物が一般的嗅覚に用いてきた約千個の天然の受容体を創出した進化力の影響下に置くことにある。目標は極めて迅速な突然変異と極めて厳格な選択基準を課すことによる「試験管内指向性進化」でセンサを創出することで達成される。新規なセンサは敏感な黒色素胞系の機能性バイオアッセイを用いて選択される。規定から導き出された化学的命名を持つ相互作用でセンサが刺激されることで、カルシウムイオンのフラックスが蛍光シグナルとして迅速に検知される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 [関連出願] 本出願は第35米国成文法、119条に基づき、1998年4月6日に提出した暫定米国
特許出願番号第60／080,915号の「指向性進化バイオセンサ（DIRECTED EVOLUTIO
N BIOSENSORS）」から優先権を主張するものである。上記に特定した出願内容は
参照により明示的に本出願の一部とする。
【０００２】 [産業上の利用分野] 本発明は関心のある化学的合成品を検知するためのバイオセンサに関する。かか
るバイオセンサは突然変異誘発を介して選択されたＧタンパク質共役受容体、チ
ロシンキナーゼ受容体および／またはイオンチャンネルなどの受容体である。さ
らに具体的には、本発明のバイオセンサは関心のある低レベル化学的合成品の検
知に極めて特異的であり高感度である。
【０００３】 [発明の背景] 関心のある化学的化合物を質量分析計およびクロマトグラフィーなど最大の感
度で検知するための現状の方法は定期的なメインテナンスとキャリブレーション
を必要とする扱いにくく、壊れやすい機器を必要とする。これらの通常の検定に
は、方法の特異性、構造的関連のある化合物を誤って陽性に検知する可能性、化
学的検知速度などの制約がある。
【０００４】 天然ののバイオセンサは化学構造を識別し、少数の分子を感知し、細胞内シグ
ナルを増幅して一秒以内で応答して記録するために数十億年にわたって進化して
きた複雑な生物学的システムである。これらの天然のバイオセンサはタンパク質
受容体を介して働く。
【０００５】 かかる高識別センサの最も一般的な例はＧタンパク質共役受容体(GPCR)スーパ
ーファミリーのメンバーである嗅覚受容体である[Buck. LおよびAxel R.(1991)
、Cell 65：175−87]。鼻は従来からの最も精緻な化学センサである。鼻は三秒
以内に膨大な数の化学品を検知し、識別する。進化のパラダイムである適者生存
への選択的圧力に対する天然のの確固とした適用がこの機能を完全に研ぎ澄まし
たのである。例えば、鮭はバイオセンサを利用してその特定な誕生した河に戻り
、オスの蛾は三種類の特殊なフェロモン受容体の一つを用いて数マイル離れた一
匹のメスを追跡してその位置を知る。その他の動物は約1000種類の受容体の補体
を用いて数千の異種分子を識別する能力を発展させてきた。イヌは爆発物、違法
な物質の検知、天災または人災による瓦礫に埋まった犠牲者の居場所の確定に日
常的に利用される。
【０００６】 嗅覚への寄与のほかにヒトを含めた高等動物に対するGPCRの重要性には、ヒト
ゲノムにコードされた約十万個の遺伝子のうち2,500個（嗅覚のための1000個を
含め）がGPCRの遺伝子であるという事実を挙げることができる。構造的に異なる
リガンドの極めて広い範囲がGPCRによって検知される。天然のに産するまたは合
成化学品からなる発臭剤の数千種類に加えGPCRリガンドには、糖（スクロース）
、脂質（プロスタグランジン、ロイコトリエン）、ペプチド（ジペプチド−ヌー
トラスイートから10kDプロテインまで）、イオン(カルシウム)、小芳香族分子（
メラトニン、カテコールアミンなど）までが、プロトンさえもが包含される。周
知なリガンドのこの多様性は適切に進化した受容体によって検知される化学構造
が無制限であることを示唆する。
【０００７】 小分子がGPCRを活性化する場合、その貫膜領域の奥に位置するアミノ酸に結合
することで活性化されるであろうことは驚くに当たらない。今日見られるGPCRの
陣立て(panoply)は大雑把に類似な構造モチーフを有する。例えば、バクテリオ
ロドプシンの７つの膜スパン領域が楕円形ポケットを画定する[Roper D、Jacoby
Eら(1994)、Journal of Receptor Research 14：167−86]。光感受性レチナー
ル(リガンド)が位置するのもこの中央のくぼみの中である。レチナールは貫膜ド
メイン７上でリシンに共有結合的に結びつく。このタンパク質はその類縁である
ハロロドプシン、センサーロドプシンと共に細菌タンパク質の古クラス(ancient
class)を構成し、この細菌タンパク質はそれぞれプロトンと塩素をくみ出すこ
と、第二たんぱく質を活性化することで光に応答する。近代のGPCRは全て７つの
貫膜領域と対応する細胞内および細胞外ドメインの両方を含むこれら光応答分子
の構造を明白に共有する。
【０００８】 レチナールまたはロドプシンなどの小リガンドはGPCRの７貫膜スパンドメイン
によって画定された窪みの中でGPCRに結合する。これはβ１アドレナリン性受容
体に説明されたような事例などの数例に念入りに描写されている[Strader C. D
ら(1989)、Amer.J. Resp. Cell ＆ Molec. Biol. 1：81−85]。
【０００９】 GPCRの７つの貫膜ドメイン構成は全体的な疎水性の必要性によって制約を受け
るが、貫膜領域内のアミノ酸の変動範囲は受容体ごとに大きく変動する。全ての
場合において、配列のαへリックスに必要な疎水性および親水性アミノ酸の全体
的パターンが存在する。殆どの部分において、疎水性アミノ酸が脂質二重層に向
かって外側に面するそれぞれの貫膜領域の面に必要である。内側に面するアミノ
酸はさらに大きな変動を示す。当然のことながら、β1〜3などの同一リガンドを
持つ受容体は嗅覚またはガストリン放出ペプチド(GRP)などの異種受容体に対す
るよりも大きな配列相同性を互いに有する。特殊な化合物での免疫感作の後に選
択された抗体の場合のように、物理学的および化学的性質の意味でのリガンドの
構造と受容体の一般的な構造特徴との間には明白な優先する相関はない。
【００１０】 一千個におよぶ嗅覚受容体はそれらを一緒に用いて化学産業で開発された種々
の有臭有機分子などの多くの合成および非天然の産の化学品を含む10,000を超え
る異種化学品を認識する。ドーパミン１および２受容体などの異なるGPCRは同じ
リガンドを共有するが、この二つの受容体はいくらかだけが関連している。一方
、片方の受容体は類似性の程度が異なる一つ以上のリガンドによって活性化され
る。センサに使用される受容体セットの選択を決めるのに用いられる化学品のセ
ット数と多様性(または焦点を当てる程度)が最終的センサの範囲と特異性に影響
を及ぼす。
【００１１】 化学的合成品の範囲を検知するための高度に特異的で高感度なセンサが求めら
れている。
【００１２】 化学的合成品の範囲を短時間で検知するためのセンサに関するニーズが存在す
る。
【００１３】 生成物の信憑性または基準の遵守を監視するための標準分析法に関するさらな
るニーズがある。
【００１４】 [発明の要約] 本発明は突然変異した受容体を同定するための新規な方法、リガンドの存在に
つき試料を試験するための新規な方法、リガンドのフィンガープリントを産出し
、同定するための新規な方法、細胞表面の受容体に結合するリガンドの存在を同
定するための新規な検知器を提供する。本発明はまた生成物の構成成分である生
成物中のリガンドの存在に基づき生成物を分析するための方法に関する。これら
の方法は生成物に「署名(signature)」を与えることを可能にし、生成物の安全
性、保証不正のモニタリングおよび認証、及び品質制御を可能にする。本発明の
他の態様は本発明を詳細に読むことで通常の当業者に容易に明らかになるであろ
う。
【００１５】 本発明の一態様に拠ると、リガンドに結合する突然変異した受容体を同定する
方法が提供される。最初に複数の突然変異受容体をコードする複数の核酸が得ら
れ、或いは生成される。複数の核酸は次に複数の細胞内に導入される。細胞はリ
ガンドと接触したときに自然状態でシグナルを発生しないことが好ましい。異な
る核酸が複数の細胞に異なって存在する。複数の細胞が次にリガンドと接触する
。複数の突然変異受容体の一つに結合するリガンドによって生じた細胞内シグナ
ルが検知される。突然変異受容体が突然変異Ｇタンパク質共役受容体、チロシン
キナーゼ受容体およびイオンチャンネルからなる群から選択された場合、シグナ
ルはリガンドに結合する突然変異受容体の存在を示す指標である。
【００１６】 一実施例では、検知されたシグナルは突然変異受容体と同種類の非変異受容体
を発現する細胞が発生したシグナルと比較され、それによって非変異受容体に対
しリガンド結合特異性が変わった突然変異受容体の同定が可能になる。他の実施
例では、シグナルがリガンドを結合させる別の突然変異受容体を発現する細胞と
比較される。一実施例では、リガンドは受容体の天然のリガンドでない。
【００１７】 発生したシグナルは第二メッセンジャーシグナルでもよく、これは当業者に周
知である。かかるシグナルは色素分散をもたらすシグナル、細胞内のカルシウム
レベルの変化を起こすシグナルが含まれる。したがって、幾つかの実施例で検知
されたシグナルは色素分散および／または凝集、或いはカルシウム媒介蛍光であ
る。かかるアッセイは当業者に周知である。シグナルが色素分散および／または
凝集である場合、細胞はメラニン含有であることが好ましく、最も好ましくは下
等動物の色素細胞である。シグナルがカルシウム媒介蛍光の場合、細胞は先行受
容体の結果としてカルシウムレベルを変化させた実際上当業者に周知な如何なる
細胞でもよい。繊維芽細胞、3T3細胞、リンパ球、ケラチン細胞などが使用され
る。突然変異受容体を酵母細胞内にクローニングすることもでき、通常の当業者
に周知な酵母菌の増殖を含むアッセイが検知可能なシグナルとして用いられる。
同様に、1998年１月13日にＢｒａｎｎ ＭＲに発行された米国特許第5,707,798号
、「受容体でトランスフェクトされた細胞の選択的増幅によるリガンドの同定（
Identification of ligand by selective amplification of cells transfected
with receptors）」に記述されたようなRSATシステムを用いることもできる。
【００１８】 本発明の別の態様に拠ると、リガンドの存在につき試料を試験する方法が提供
される。この方法には、受容体を突然変異させて天然のリガンドの結合を変化さ
せた外因性細胞表面受容体に試料を接触させること、リガンドが外因性細胞表面
受容体に結合したときに発生する予め選択されたシグナルを検知することが含ま
れる。好ましくは、突然変異受容体は受容体を発現する組換え体細胞の一部であ
る。一実施例では、組換え体細胞は少なくとも二個の組換え体細胞であり、それ
ぞれが異なって突然変異して天然のリガンドへの結合を異なるように変化させた
異種外因性表面受容体を発現する。別の重要な実施例では、組換え体細胞は異な
って突然変異した外因性細胞表面受容体のアレイを発現する組換え体細胞のアレ
イである。
【００１９】 重要な受容体、細胞の種類、シグナルなどを上記に説明した。
【００２０】 本発明のさらに別の態様に拠ると、リガンドのフィンガープリントを産出し、
同定する方法が提供される。この方法には、外因性突然変異細胞表面受容体のア
レイを発現する組換え体細胞のアレイを接触させることによって複数のシグナル
を発生させることが含まれ、その受容体のそれぞれがリガンドにつき異なる選択
性または特異性、フィンガープリントを包含する複数のシグナルを有す。フィン
ガープリントは種々の形態のいずれかを呈することができる。フィンガープリン
トは蛍光読み出しでも、特殊なパターンでも、グラフなどであってもよい。重要
なのはシグナルの組み合わせがリガンドのアレイへの結合に由来すること、いず
れの特殊なリガンドも組換え体細胞のアレイと接触したときに異なるパターンを
産出することだけである。
【００２１】 本発明のさらに別の態様に拠ると、細胞表面受容体に結合するリガンドの存在
を同定する検知器が提供される。検知器には、細胞培養媒体を収納するコンテナ
が含まれる。細胞はコンテナに収容され、細胞はリガンドを結合させる受容体を
発現し、リガンドが受容体を結合させたときに検知可能な細胞内シグナルを発生
する。コンテナはリガンド含有試料を受容体に導入するための入口ポートを有す
る。センサはコンテナに取り付けられ細胞内シグナルを検知する。重要な一実施
例では、受容体は外因性細胞表面受容体である。別の重要な実施例では、受容体
は突然変異して天然のリガンドへの結合を変化させた外因性細胞表面受容体であ
る。特に重要な実施例では、細胞は突然変異受容体のアレイを発現する細胞のア
レイである。
【００２２】 本発明のさらなる態様に拠ると、基準(authentic)であると知られたまたは基
準物質の少なくとも一つの選択された特性を持つと知られた標準品に対する試料
の関連性を決定するための方法が提供される。この方法には、外因性突然変異細
胞表面受容体のアレイを発現する組換え体細胞のアレイを接触させることによっ
てリガンド含有標準品につき複数のシグナルを発生させることが含まれる。それ
ぞれの受容体はリガンド含有標準品に対し異なる選択性と特異性を有する。複数
のシグナルはリガンド含有標準品につき標準品のフィンガープリントを含む。
【００２３】 この方法はさらに外因性突然変異細胞表面受容体のアレイを発現する組換え体
細胞のアレイを接触させることによってリガンド含有標準品につき複数のシグナ
ルを発生させるることを含む。それぞれの受容体はリガンド含有標準品に対し異
なる選択性と特異性を有する。複数のシグナルはリガンド含有試料につき試料の
フィンガープリントを含む。リガンド含有試料によって接触させられた外因性突
然変異細胞表面受容体のアレイを発現する組換え体細胞のアレイがリガンド含有
標準品によって接触させられた外因性突然変異細胞表面受容体のアレイを発現す
る組換え体細胞のアレイと同一であることも一つの要件である。
【００２４】 この方法は最後に試料のフィンガープリントを標準品のフィンガープリントと
比較することを含み、リガンド含有試料が基準であるかを決定する。
【００２５】 幾つかの実施例では、リガンド含有標準品の化学組成は未知である。ある実施
例では、リガンド含有標準品は複数のリガンドを含み、それぞれのリガンドが外
因性突然変異細胞表面受容体のアレイを発現する組換え体細胞の異なるアレイに
結合する。好ましい実施例では、試料のフィンガープリントからのシグナルパタ
ーンが標準品のフィンガープリントからのシグナルパターンと対比され、信憑性
(authenticity)には試料フィンガープリントからのシグナルパターンが標準品の
フィンガープリントからのシグナルパターンから計算されたシグナルパターンの
範囲を規定する予め選択された信頼限界内であることを必要とする。さらなる実
施例では、比較ステップがマイクロプロセッサで行なわれる。他のさらなる実施
例では、それぞれのフィンガープリントが蛍光読み出し、空間的パターン、或い
はグラフである。
【００２６】 本発明のその他の態様に拠ると、生成物の素性を決定するコンピュータ実装方
法が提供される。この方法には、外因性突然変異細胞表面受容体のアレイを発現
する組換え体細胞のアレイを接触させることによるリガンド含有標準品に関する
複数のシグナル発生で産出した標準のフィンガープリントを受け取ることが含ま
れ、受容体のそれぞれはリガンド含有標準品におけるリガンドに対し異なる選択
性と特異性を有する。複数のシグナルは基準のリガンド含有標準品に関する標準
フィンガープリントを含む。
【００２７】 この方法はさらに外因性突然変異細胞表面受容体のアレイを発現する組換え体
細胞のアレイを接触させることによるリガンド含有試料につき複数のシグナル発
生によって産出した試料のフィンガープリントを受け取ること含み、受容体のそ
れぞれはリガンド含有試料におけるリガンドに対し異なる選択性と特異性を有す
る。複数のシグナルは基準のリガンド含有試料に関する試料のフィンガープリン
トを含む。試料のフィンガープリントのデータが標準品のフィンガープリントの
データを産出するリガンド含有標準品によって接触させられた外因性突然変異細
胞表面受容体のアレイを発現する組換え体細胞と同じアレイを用いて産出される
ことも一つの要件である。
【００２８】 この方法は最後にリガンド含有試料からの試料のフィンガープリントのデータ
をリガンド含有標準品からの標準品フィンガープリントと比較することを含み、
同一性にはリガンド含有試料からの試料のフィンガープリントのデータが標準品
のフィンガープリントから計算された数値範囲を規定する予め選択された信頼限
界内であることを必要とする。
【００２９】 重要な実施例では、コンピュータ実装プロセスはさらに基準の生成物の標準の
フィンガープリントデータに関する情報を保存し、利用可能にするコンピュータ
データベースを利用すること、コンピュータが読める論理を保存したコンピュー
タ判読可能媒体を含む。コンピュータ判読可能論理は外因性突然変異細胞表面受
容体のアレイを発現する組換え体細胞のアレイを接触させることで生じたリガン
ド含有標準品につき複数のシグナル測定値を示す基準の生成物に関する複数の記
録を含む。受容体のそれぞれはリガンド含有標準品におけるリガンドにつき異な
る選択性と特異性を持つ。複数のシグナルは基準のリガンド含有標準品に関する
標準品のフィンガープリントおよび生成物の指標を包含する。記録は生成物の指
標を用いてアクセス可能であり、ここで基準の生成物に関する標準品のフィンガ
ープリントデータを受け取るステップはコンピュータ判読可能媒体にアクセスす
るステップを含み、生成物の指標を用いて記録を検索することができる。
【００３０】 本発明のさらに別の態様に拠ると、真の生成物の標準フィンガープリントデー
タに関する情報を保存し、利用可能にするコンピュータデータベースが提供され
る。このコンピュータデータベースはコンピュータが判読できる論理を保存した
コンピュータ判読可能媒体を含む。コンピュータ判読可能論理は外因性突然変異
細胞表面受容体のアレイを発現する組換え体細胞のアレイを接触させることで生
じたリガンド含有標準品につき複数のシグナル測定値を示す基準の生成物に関す
る複数の記録を含み、それぞれの受容体はリガンド含有標準品におけるリガンド
につき異なる選択性と特異性、基準のリガンド含有標準に関する標準のフィンガ
ープリントからなる複数のシグナルおよび生成物の指標を持つ。生成物の指標を
用いてコンピュータ判読可能媒体にアクセスし、記録を検索する手段も提供され
る。
【００３１】 上記の考察において、受容体、アッセイおよび検知器を組換え体細胞との関係
で説明した。これは単に好ましい実施例を代表するものであると理解すべきであ
り、組換え体細胞受容体は別の方法ではマイクロチップなどの基板上のアレイで
供給される。受容体は電子伝送ポリマーまたは導電ポリマーなどの感受性材料と
共役させることもできる。リガンドの結合は導電材料における結合によって誘発
された二次変化で検知することができる。リガンドは簡単にラベル付けされ、結
合のパターンはラベルによって検知される。通常の当業者は本発明になる受容体
のアレイを如何に基板上にアセンブルし、本発明の利点の実現に使用するかを容
易に認識することができるであろう。
【００３２】 上述した実施例のいずれにおいても、リガンドは非限定的に化学兵器(chemica
l warefare agent)、爆薬、薬物、芳香、不純物、環境毒物および／または汚染
物質を含むことができる。
【００３３】 本発明になるこれらの態様およびその他の態様を以下に詳細に説明する。
【００３４】 [発明の詳細な説明] 本発明は常に有用であり、受容体を結合させて細胞内シグナルを発生させるリ
ガンドの検知に有望である。リガンドは受容体にとって天然ののリガンドである
必要はなく、本発明の特徴は別の状況では非突然変異受容体のリガンドでない分
子から突然変異受容体を創出することにある。
【００３５】 本発明は特に低濃度で検知することが困難なリガンドの検知に有用である。本
発明はその性質上かかる分子に対する特異性と選択性の増加をもたらす。換言す
れば、所望の特異性と選択性を持つ受容体を創出することができる。
【００３６】 本発名は生成物の構成成分である生成物中のリガンドの存在に基づき生成物を
分析するのに有益である。その結果として、生成物が贋物であるかの監視と信憑
性、品質管理を可能にする。
【００３７】 検知可能な分子の種類には、とりわけ化学的、生物学的および／または放射線
学の戦争薬剤(warefare agents)、爆薬、薬物、芳香、不純物、環境毒物および
汚染物質が含まれる。その他に包含されるのは、血清またはその他の体液中の薬
物濃度などの検知、或いはホルモン、サイトカイン、神経伝達物質、タンパク質
、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、病原体およびウィルス性粒子などその
構成成分など、体液中の極めて低濃度の分子レベルの検知に臨床的に所望される
分子である。薬物の包括的なリストは1998年8月18日にShashouaらに発行された
米国特許第5,795,909号に記述があり、その開示の全体は参照して本明細書の一
部とする。病原体のリストは1996年7月25日に公開されたPCT WO 96／22024に記
載があり、1995年12月29日に出願された米国出願番号第08／578,171号、Blumber
gらに対し優先権が主張されている。これらの開示は参照して本明細書の一部と
する。化学戦争薬品は当業者に周知であり、非限定的にコリンエステラーゼ、持
続性VX（Ｏ−エチル−Ｓ−２−ジイソプロピルアミノエチル−メチルホスホのチ
オレート）、非持続性サリン(GB)（イソプロピルメチルホスホノフルオリデート
）、タブン(GA)（エチル−Ｎ、Ｎ−ジメチルホスホールアミドシアニデート）、
マスタードガス（ビス−(２−クロロエチル)スルフィドまたはHD）などの有機硫
黄薬品、GDとして知られるピナコリルメチルホスホノフルオリデート、HDまたは
GDのストレート態および濃縮態、酸素原子に二重結合し炭素原子に単結合したリ
ンを含有する有機リン化合物、ジクロロ(２−クロロビニル)ヒ素（ルイサイトま
たはＬ剤）、ビス(２(２−クロロエチルチオ)エチル)エステル（Ｔ剤）、へミマ
スタード誘導体(HMO)などが含まれる。爆薬には、非限定的にニトログリセリン(
NG)、エチレングリコールジナイトレート(EGDN)、2、4、6−トリニトロトルエン
(TNT)、シクロ−1、3、5−トリメチレン−２、４、６−トリニトロアミン（RDX
またはサイクロナイト）、高融解爆薬(HMX)、ピクリン酸など、或いは硝酸アン
モニウムなどの爆薬前駆体、２−エチルヘキシルナイトレートおよび顆粒状の固
形酸化剤を含む多成分爆薬組成物が含まれる（米国特許第5,811,726号、第4,253
,889号および第5,226,986号参照）。環境毒物および汚染物質は当業者にとって
周知である。かかる薬剤の例は米国保健および社会福祉省(US Department of He
alth and Human Services)（ベセスダ、メリーランド州）、「毒性物質および疾
病登録庁(Agency for Toxic Substances ＆ Disease Registry)」の1989−90隔
年報告書付録ＤおよびTRC環境コンサルタント（イーストハートフォード、コネ
クチカット州）の刊行物「制定産業保健基準での化学品の臭気閾値（Odor Thres
holds for Chemicals with Established Occupational Health Standards）」に
記載がある。
【００３８】 本発明は試験サイトで実験室外アッセイを行なう際のスピードと能力を提供す
る。本発明に拠り製作された機器はハンディータイプである。
【００３９】 本発明の方法は外因性細胞表面受容体が細胞内シグナル経路に共役されること
および発生したシグナルが検知されることを示す従来技術に部分的に基づくもの
である。この方法は1995年10月31日に発行されたE.A.Lerner、M.R.Lernerらの米
国特許第5,462,856号「Ｇタンパク質を利用する経路を介するシグナル変換に含
まれる受容体およびその他のタンパク質にアゴニストまたはアンタゴニストとし
て作用する化学品を同定する方法（Methods for Identifying Chemicals that A
ct As Agonists or Antagonists for Receptors and other Proteins Involved
in Signal Transduction Via Pathway that Utilize G−Proteins）」を嚆矢と
するものであり、その開示は参照して本明細書の一部とする。先行技術および本
発明に拠る有用なその他の態様は1997年２月11日発行のM.R.Lerner、C.K.Jayawi
ckremeおよび.A.Lernerの米国特許第5,601,992号「ペプチドライブラリーフォー
マットおよびそれらの関連する方法（Peptide Library Format and Methods Rel
ating Thereto）」および1998年5月18日発行のRichard Selinfreundの米国特許
第5,753,511号「生成物の信憑性および監視のための自動化フィンガープリント
法と化学（Automated Fingerprint Methods and Chemistry for Product Authen
tication and Monitoring）」に記述があり、これらの開示は参照して本明細書
の一部とする。
【００４０】 本発明に拠る特に有用な受容体は二量体形成経由で機能するチロシンキナーゼ
受容体などの貫膜受容体である。かかる貫膜受容体はインターロイキン、成長因
子由来血小板、表皮成長因子、繊維芽成長因子およびエリスロポエチンの受容体
を含む。
【００４１】 本発明に拠るその他の有用な受容体クラスはイオンチャンネルであり、具体的
にはヒスタミンゲートチャンネル、カルシウムチャンネル、セロトニンゲートチ
ャンネル、アセチルコリン(ニコチン性)イオンチャンネル、カリウムイオンチャ
ンネル、グルタメートイオンチャンネルである。
【００４２】 本発明に拠るその他の有用な受容体クラスはＧタンパク質共役受容体である。
Ｇタンパク質共役受容体ファミリーには、 ファミリーＡ：ロドプシン関連受容体およびβ２アドレナリン性受容体、 ファミリーＢ：カルシトニン関連受容体およびPTH／PTHrP受容体、 ファミリーＣ：メタボトロピック(metabotropic)グルタメート受容体関連受容体
、 ファミリーＤ：STE2フェロモン受容体関連受容体、 ファミリーＥ：STE３フェロモン受容体関連受容体、 ファミリーＦ：cAMP受容体関連受容体 がある。
【００４３】 大半のＧタンパク質共役受容体はそのリガンドによって命名される。リガンド
には、プリン、ヌクレオチド、メラトニン(アデノシン、cAMP、メラトニン、NTP
および関連化合物)アドレナリン、ドーパミン、ヒスタミン、アセチルコリン、
ノルアドレナリン、セロトニンおよび他の関連化合物などの生物アミン（および
関連天然のリガンド）、アンジオテンシン、ブラジキニン、カルシトニン、エン
ドセリン、ガラニン(galanin)、成長ホルモン関連ホルモン、グルカゴン、ニュ
ーロテンシン、バソプレッシンおよび他の関連化合物、エイコサノイド、レチナ
ール系化合物、カンナビノイド、血小板活性因子、ロイコトリエンおよび他の関
連化合物などの脂質系化合物、グルタメート、カルシウムおよびGABAなどの興奮
性アミノ酸およびイオン、種々のファミリーおよびグループ内のオーファン受容
体が包含される。Ｇタンパク質共役受容体をクラス分けするその他の方法はその
組織特異性と機能による。重要な一つのかかるクラスはＧタンパク質共役受容体
の嗅覚クラスであり、そのうち100程度が既にクローニングされている。
【００４４】 本発明の一具体的な態様に拠ると、突然変異受容体のアレイを発現する細胞ア
レイが用いられる。ここで用いられるアレイは少なくとも一つ、好ましくは少な
くとも10個、幾つかの実施例では25、100またはそれ以上の異なる突然変異受容
体が包含される。突然変異受容体のアレイが選択されると、それによって如何な
る特殊なリガンドも他のリガンドと異なる方法でアレイと反応する。したがって
、嗅覚と殆ど同じように受容体のアレイは如何なる特殊なリガンドのフィンガー
プリントとして作用するシグナルパターンを発生させるために用いられる。
【００４５】 本発明の一態様では、センサが提供される。センサはその最も基本的な素子に
おいて、リガンドを含む試料を導入して細胞と接触させる入口ポートを備えた細
胞収納コンテナからなるデバイスである。コンテナは細胞または食物などの培地
の生存および／または培養を促進するための基質を収納することができる。収納
は出口ポートで提供することもできる。細胞が休止するコンテナの低部は清浄で
あり、細胞によって産出されたシグナルを検知するためのセンサがコンテナ底部
に取り付けられていることが好ましい。センサはCCDカメラなどの電磁放射を検
知するための通常のセンサでよい。センサは次にLCDまたは他の信号表示手段な
どのシグナルディスプレイに取り付けられる。このようにして、リガンドを含有
する試料が細胞を収容する部屋に導入されると、リガンドは細胞と接触する。リ
ガンドが細胞上の受容体に結合すれば、シグナルが発生する。センサがシグナル
を検知してシグナルをシグナルディスプレイ上に表示する。このようにして、試
料がリガンドを含有するか否かを迅速に確定することができる。
【００４６】 センサは分光光度計、ファイバーオプチックスプローブ、既に述べたCCDカメ
ラ、或いは当業者に周知なその他の電磁センサでよい。シグナルディスプレイは
シグナルを収束、増幅、ディジタル化し、シグナルを判読可能な形に再生する。
細胞が受容体のアレイを担持する細胞のアレイの場合、デバイスにシグナルを所
望する表示形式のフィンガープリントに加工するためのプロセッサを装着するこ
とができる。上記のデバイスの改良は通常の当業者に周知であろう。
【００４７】 突然変異受容体は本発明に関連して説明される。DNAを突然変異させて突然変
異受容体を産生する方法論は通常の当業者に周知である。ここで有用な受容体は
既にクローンされたものかクローンされるもののいずれかである。数多くのＧタ
ンパク質共役受容体がクローンされ、従来技術で用いられてきた。かかる受容体
をエンコードするDNAの突然変異は今日では日常的であり、例えば反復PCRベース
突然変異誘発を用いる。従来技術に記述された部位指向性突然変異誘発も用いる
ことができる。組換え体技術の方法論の関してはSambrookらの「分子クローニン
グ、実験室手法（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」第二版（Cold S
pring Harber Laboratory Press、1989）を参照することができ、これは当業者
に周知である。同様にかかるDNAを細胞内にクローニングする方法は当業者に周
知であり、参照して本明細書の一部とした特許に記述されている。これらは技術
的に認識された方法であるので、これ以上の詳述は不必要である。同じように、
細胞の生育条件などは選択された細胞依存性であり、当業者にとって周知である
。
【００４８】 従来黒色素胞ベースのバイオ技術が薬学産業によって発見、発展されてきた。
それは感度のよい読み出しシステムとしてカエル由来の黒色素胞を用いる。この
細胞の表面に存在する受容体に刺激を与えると、第二メッセンジャーシグナルが
産出されてメラノソーム色素顆粒の凝縮または分散をもたらし、細胞が「黒色ま
たは白色」に見える。この色変化は種々のイメージ処理方法で容易に検知するこ
とができる。受容体は細胞内因性であり、通常の分子生物学的方法で細胞内にト
ランスフェクトされたソースからの外因性受容体をエンコードするプラスミドcD
NAからなると思われる。
【００４９】 本発明は黒色素胞方法を進歩させたものであり、関心のある化学品を認識する
検知システムを創出する。この目標は選択されたＧタンパク質共役受容体をその
特異性を変えるように突然変異させることによって達成される。突然変異体受容
体は高い特異性と選択性を持って特定化学品を認識する。例えば、爆薬の化学的
特徴の検知をターゲットとする。
【００５０】 本発明はスペクトルの広い一般的臭気検知器システムの開発に責任のある進化
的原理を用いて数千の化学品を感知、識別することができるＧタンパク質共役受
容体(GPCR)システムを創出する。この方法は規定のＧタンパク質共役受容体のセ
ットを高等動物が一般的嗅覚作用に用いてきた約千個の天然の受容体のアレイを
創出した進化の力の影響下に置くことにある。この目標は「試験管内での指向的
進化」によって実現される。進化の力は突然変異と選択である。極めて速度の速
い突然変異と極端に厳密な選択基準を課すことで実験室内の進化の速度を大きく
増加させることができる。最近まで、天然のバイオセンサがない物質を検知する
ために天然のの方法を用いるこの目標は程遠いように思われた。しかしながら、
事象の組み合わせがこの図式を変えた。第一に、GPCR受容体の分子構造が決定さ
れた[Trumpp−Kallmeyer.Sら(1992)、J.Med.Chem.35：3448−62、Hibert.M.Fら(
1991)、Molec.Pharm.40：8−15、Roper.ＤおよびJacoby.Eら(1994)、Journal of
Receptor Research 14：167−86]。第二に、極めて数多く突然変異体受容体を
創出する方法が開発された[Winter.Gら(1994)、Annual Review of Immunology 1
2：433−55、Waterhouse.Pら(1993)、Nucleic Acids Research 11：2265−6、Ho
ogenboom.H.Rら(1992)、Immunological Reviews 130：41−68]。幾つかの実施例
では、受容体分子全長に広がる突然変異が産生する。他の重要な実施例では突然
変異を受容体分子の特定部位、例えばGPCRの貫膜領域内のアミノ酸に内側に面し
て産出させて受容体に新しい特異性を持たせる。βセロトニンおよびドーパミン
受容体では、貫膜領域3−6は突然変異に好適な領域であると考えられる。
【００５１】 一般目的のバイオセンサの開発は「試験管内指向性進化」によって達成される。
アセチルグリセロールおよびカルシウムの産生を介して信号を送る10個の天然の
発生Ｇタンパク質共役受容体をエンコードするDNAを広範囲な突然変異の影響下
に置くことで、分子置換によって極めて大多数の新規で関連のある受容体遺伝子
が産生する。これらの受容体を黒色素胞細胞に発現させると、この黒色素胞細胞
は直結デジタルビデオ画像処理で検地される迅速で容易に判読可能な色変化を起
こすことで受容体の活性化に応答する。黒色素胞が活性化されて色素が濃くなる
例には、組換え体マウスのボンベシン受容体、カルシウムを介してシグナル伝達
する代表的GPCRの活性化が含まれる。受容体は広い構造変化を持つ化学品と応答
するその長所によって選択される。原則として、突然変異体受容体のプールに適
用されると思われる化学品の数に制限はない。異なる化学品によって活性化され
る受容体の配列は化学的特異性の増加を授与すると思われる構造的特長を特定す
るために比較、決定される。これらの特徴はさらなる突然変異および選択が起こ
る度に選択的に保持される。
【００５２】 一個でなく１０個のカルシウムシグナル伝達GPCRでスタートする理由は一次配
列の塩基の多様性であり、それを利用して受容体の突然変異誘発を開始すること
ができる。受容体はカルシウム（リガンドがカルシウムであり、カルシウムを介
してのシグナル伝達と取り違えてはいけない）、トロンボキサン、血小板活性因
子、アセチルコリン、グルタメート（メタボトロピック受容体）、エピネフリン
（α−１アドレナリン性受容体）、サブスタンスＰ、ボンベシン、サブスタンス
Ｋおよびコレキトシニンの受容体である。受容体10個でのスタートで40から約4,
000ダルトンの広い範囲の分子量を持つ化学構造の広い、イオン、脂質、小さな
有機分子、小さなペプチドまでを検知することができる。上にリストした受容体
のリガンド中最大の33アミノ酸天然のリガンドを持つコレキトシニンでも天然の
のペプチドリガンドと関係のない構造を持つベンゾジアジンタイプの小分子に応
答することができるので[Aquino.C.Jら(1996)、Journal of Medical Chemistry
39(2)：562−9]、これら受容体の全てが爆薬など分子量数百ダルトンの大きさを
持つ分子を検知できると期待される。
【００５３】 [クローンの産出、検知および単離の根拠] 二つの重要なファクタは、(１)数多くの突然変異体受容体を産出する能力、(
２)関心のある化学品に応答する受容体を厳格に選択する能力である。
【００５４】 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の出現が突然変異体の殆ど無制限なアレイを産出
させることを可能にした。さらに、分子の選択された部分を突然変異誘発させ、
他の部分を完全なままに残す技術を利用することができる。したがって突然変異
体の創出は無制限である。しかしながら、適切な応答性受容体をスクリーニング
する努力は突然変異体の数とともに直線的に増加するので、突然変異誘発の戦略
を注意深くデザインすることは必要である。
【００５５】 プロセスの選択はカエル黒色素胞に受容体を発現させるために確立した方法に
基づくもので、プロトコルは細胞浴培地中にフェムトモル量で存在するリガンド
に対する応答の検知に直ちに利用可能である。
【００５６】 極僅かなクローンを同定する方法は本発明に拠る検定の二つの特徴である低ノ
イズと反復能を基礎とする。フィージビリティー研究[McClintock.T.Sら(1993)
、Analytical Biochemistry 209：298−305およびその他に実験、その幾つかは
本明細書中のいずれかに記述がある]は2000,000部中に１部存在する受容体をコ
ードするプラスミドが存在すると、30,000の黒色素胞細胞を検知することができ
る（24ウェル培養皿中一個のウェルを覆った細胞の20％）。上述の対照実験のプ
ラスミドはβ２アドレナリン性受容体をコードするcDNA含有プラスミドであった
。陽性細胞の染色（分散色素の形態での）はβ２アドレナリン性受容体アゴニス
トであるサルブタモールに30分曝露中に観察された。刺激剤(サルブタモール)を
除き、細胞内色素をリセットした後に、サルブタモールの第二の対抗量に対する
細胞の応答を観測した。結果は最初のサルブタモール対抗量に応答した (すなわ
ち染色された) 同じ細胞が第二の対抗量にも応答することを示した。さらなる実
験で上述の結果の再現性が確認された。アッセイの高い再現性のほかにこれらの
結果はアッセイが極めて低いバックグランドで高感度であることを実証した。例
えば上記の対照実験では所与の30分の試験期間中に0〜1個の非特異的応答個体が
観察された。希少なクローンを検知するシステムの安定性に関するさらなる証拠
がβ2アドレナリン性受容体を発現しない細胞(野生型)を用いたさらなる実験か
ら産出された。この二つの連続した試験では、細胞はサルブタモール対抗量に応
答しなかった。
【００５７】 選択には所望の性質、すなわち一つまたはそれ以上、例えば192の化学品に対
する応答によって受容体を分離することが含まれる。他の例では、cDNAライブラ
リーからのヒトプロスタサイクリン受容体のクローニングを試みることでシステ
ムの感度を試験した。ライブラリーはプロスタサイクリンを発現することが既知
なヒト赤白血病細胞株から抽出されたポリA＋RNAから転写されたcDNAで構成した
。この特殊な実験では、それぞれがcDNAライブラリーからランダムに選択された
約5000のプラスミドを含有する２６プールのプラスミドが黒色素胞を発現した。
約5000の黒色素胞を含有するイメージをアゴニストであるプロスタサイクリンの
処理の前後で撮った。陽性(黒色)プラスミドのプールをそれぞれが1000のプラス
ミドを含有する５セットのサブプールに分けた後、シグナルを濃縮するためにこ
のプロセスを繰り返した。陽性プールのサブプールへの分離は受容体をコードす
る純クローンが単離されるまで反復された。純クローンからのcDNA配列決定を用
いてクローンがヒトプロスタサイクリン受容体であることを確認した。
【００５８】 [突然変異誘発戦略] ＰＲＣ突然変異誘発によって各受容体の107個の突然変異体を創出した。リガ
ンドに向かって内側に面した貫膜領域のアミノ酸を選択的に変化させた。大規模
な指向性突然変異誘発の方法は記述があり、特異的リガンドの合成抗体の創出お
よび選択に広範囲に使用された[Winter.Gら(1994)、Annual Review of Immunolo
gy 12：433−55、Waterhouse.Pら(1993)、Nucleic Acids Research 11：2265−6
、Hoogenboom.H.Rら(1992)、Immunological Reviews 130：41−68]。概説すると
、それぞれの貫膜領域に広がるオリゴヌクレオチドおよび偽無作為非保存性アミ
ノ酸置換を創出するためにデザインされた塩基の変化をPCRの基本として用いる
。アニーリング、鎖の伸長、連結反応の面で縮重した種々のオリゴヌクレオチド
を同時に用いることに関連する複雑性のために、所期のPCR突然変異誘発では領
域3と４に突然変異が起こると思われる。暫定的なライブラリーが構築されると
、それはさらなる突然変異が領域５と６に導入される最終的なライブラリー構築
の基礎として役立つ。
【００５９】 [定量的考察] 実用上の見地から、トランスフェクトされた黒色素胞を含有する単一ウェルを
用いて新しいリガンドに応答する106個のクローンをスクリーンすることが可能
である。既に説明した例では、β２アドレナリン性受容体クローンを２00,000か
らなる他のクローンのバックグランドに対し検知することが行なわれた。この実
験に用いられたCCDカメラは百三十万ピクセルから構成された集光領域をもつ。
【００６０】 それぞれの化学品に対してスクリーンされる突然変異体受容体の数（10出発受
容体のそれぞれ107に加えて108）は因子の数および免疫システムなど他のリガン
ド結合生物システムとの比較を基礎とする。任意の分子、それが古典的ハプテン
ジニトロフェノールまたはTNTなどの化学品であれば、それのモノクローナルな
抗体の産生は比較的簡単な作業である。抗体のレパートリーは対抗量(108)が効
果的な抗体の産生に充分である場合に明らかにマウスの免疫系に利用することが
できる。抗体は抗体ファージ表示方法を用いてインビトロで完全に育成すること
ができる。親和力の高い抗体を生じるチャンスを上げるためには106から108のク
ローンがスクリーンされる必要がある。
【００６１】 [突然変異体受容体ライブラリーの構築とスクリーニング] 突然変異体受容体のPCR生成物は黒色素胞アッセイに利用するために特別に開
発されたベクタI.G.3.6中でプラスミドライブラリーを創出するのに用いられる[
Potenza.M.N.およびLerner.M.R.(1994)、Nauyn−Schmiedeberge’s Archives of
Pharmacology 349：11−19]。市販の高効率能力細胞がベクタ構築DNAから108ま
でのクローンを創出するために使用される。
【００６２】 ｃDNAライブラリーは400cm2のプレート上にプレート当たりの密度250,000まで
に平板培養される。それぞれのプレートはプールを代表し、百万クローンからな
る時点で4セットとしてスクリーンされる。クローンは第一ラウンドで合計107に
各受容体にスクリーンされ、原種受容体プラスミドライブラリー当たり10ウェル
を必要とする。プレートのレプリカを準備して、個々のクローンを後で検索でき
るように−80℃で保存する。DNAを各プレートから調製し4ｘ106までの黒色素胞
をトランスフェクトするために使用する。黒色素胞を12ウェルマイクロプレート
のウェル内に連続的に固着した菌叢として約4ｘ104細胞／ｃｍ2（エレクトロポ
レーション生存細胞の約25％、残りの黒色素胞は廃棄する）に平板培養する。リ
ガンドを細胞浴培地に加える。リガンドの添加前および30分のリガンド曝露後に
それぞれのウェルから300,000までの細胞のフィールドを得る走査ステージを用
いてウェルのイメージを撮る。イメージを取り去るとリガンドに応答して色素分
散を受けた細胞の存在が現われる。細胞を洗浄してリガンドに再曝露する。リガ
ンドにばらつきがなく応答した10細胞以上を含む菌叢は「陽性」と考えられる。
【００６３】 [陽性プールの解析] プロスタサイクリン受容体をコードするクローンを単離する上述の例のように
、それぞれの陽性プール（1,000,000クローンのうちの）を250,000の４原プール
に亜分類してスクリーンする。このプロセスを後のラウンドに10倍の小プールを
用いて単一の純クローンが得られるまで繰り返す。
【００６４】 [さらなる突然変異誘発戦略] 新しいリガンド、例えば1〜10μＭ範囲のTNTに応答する受容体をコードする一
次クローンが得られると、そのDNAと演繹アミノ酸配列を解析することができる
。基本的に同じ配向でリガンドを結合させる受容体はある特異的なアミノ酸置換
を共有すると期待される。したがって、受容体分子は配列の類似性につき分類で
きると思われる。一方、著しく異なる配向で特定リガンドを結合させる受容体は
恐らく極めて異なる、一定のアミノ酸置換を示す。したがって、この情報は受容
体を異なるサブクラス（10始原原種受容体を反映する）に分離するのに用いられ
る。異なる貫膜領域上の異なる位置でアミノ酸の異なる組み合わせを用いること
によって異なる配向でリガンドを結合させる受容体を見出すことは大いに望まし
い。配向が異なる同じ小分子を結合「ポケット」の中で認識するバイオセンサは
親和力の等しい他の単一分子を認識しないと思われる。したがって究極的には、
一つ以上の変異型受容体から構成されたバイオセンサは問題のリガンドに関し増
加した選択性を持ち、他の分子で間違った陽性の検知を与えることはない。換言
すると、異なる受容体の組み合わせでは、その幾つかまたは全部が特殊なリガン
ドの存在を示すための誘引となるはずであり、神経網を高度に識別する入力と一
次センサシグナルの解析が提供される。
【００６５】 受容体をサブクラスに割り当てることはありふれた識別配列機能を基礎とする
。それぞれが異質なサブクラスは突然変異誘発および選択の第二ラウンドに別個
の基質を提供する。特殊なサブクラスのメンバー間に保存されたアミノ酸は一定
に保たれるが、分子の他の部分はさらに修飾を受ける。スクリーニングの第二ラ
ウンドは、選択の厳密性が100〜1,000ｎM TNTおよび他のリガンドに対し10倍に
増加されることを別にして、第一ラウンドのように行なわれる。新しい基準を満
たす受容体が選択されると、プロセスは繰り返される。目標はTNTおよび他のリ
ガンドを1〜10ｎM範囲で認識することができる受容体を開発することである。
【００６６】 化学的に特異なリガンドが産出すると、バイオセンサを実装した機器の構築が
開始される。現状ではCalcium Greenなどのカルシウム感受性化学品を用いて、
生きた細胞におけるカルシウム増加を数ミリ秒で検知することができる[Eberhar
d M.Eme P(1991)、Biochemical ＆ Biophysical Research Communications、 18
0(1)：209−15、Kong. S. K. 、Choy, Y. M.およびLee C. Y. (1994) 、Biochem
ical ＆ Biophysical Research Communications、199 (1) ：234−40]。検知器
の思い当たる一形式はそれぞれの直径が1mmの1000ウェルを含み、かつ合成受容
体の一つを発現する繊維芽細胞を含む4x4配列である。受容体刺激に応答して上
昇するウェル内のカルシウムレベルのパターンはCCDカメラでイメージすること
ができる化学的に特異なフィンガープリントを与える。Calcium Greenシグナル
方法論に関する技術は記述があり市販されている。細胞内上昇に基づくリガンド
仲介GPCRによって発生したシグナルを基準にしたCalcium GreenのCCDカメラによ
る蛍光光度計スクリーニングは薬剤産業の発見先導新プログラムにおいてMolecu
lar Devices社（カリホルニア州）製のFLIPRなどの機器を用いて実施されている
。
【００６７】 [同等物] 当業者は単に決まりきった実験を利用して本明細書に記述した発明の特殊な実
施例に同等な多くのものを認識、或いは確認することができると思われる。かか
る同等物は本発明のクレームに網羅されるものである。
【００６８】 本明細書に開示された全ての文献は参照によって全て本明細書の一部をなすも
のである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 FB03 JA01 4B024 AA11 BA63 CA04 DA02 EA04 GA14 HA20 4B063 QA18 QQ08 QQ13 QQ61 QQ79 QQ89 QQ91 QR51 QR77 QR80 QR82 QS36 QS39 QX02

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】リガンドを結合させる突然変異受容体を同定する方法であって
    、 複数の突然変異受容体をコードする複数の核酸を生成させること、 複数の細胞に複数の核酸を導入することであって異なる核酸が複数の細胞で異な
    って存在すること、 複数の細胞をリガンドに接触させること、及び 複数の突然変異受容体の一つに結合するリガンドによって発生した細胞の中で細
    胞内シグナルを検知すること、ここでシグナルはリガンドを結合させる突然変異
    受容体の存在の指標であり、突然変異受容体は突然変異Gタンパク質共役受容体
    、チロシンキナーゼ受容体、イオンチャンネルからなる群から選択される、 を含む前記方法。
  2. 【請求項2】検知されたシグナルを、突然変異受容体と同じ種類の非突然変
    異受容体を発現する細胞によって生じたシグナルと比較し、それによって非突然
    変異受容体に対するリガンドの結合特異性が変化した突然変異受容体の同定を可
    能にする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】シグナルを、リガンドを結合させる異なる突然変異受容体を発
    現する細胞と比較することができる、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】リガンドが、受容体の天然のリガンドでない、請求項１に記載
    の方法。
  5. 【請求項５】リガンドが、化学兵器、爆薬、薬品、芳香、不純物、環境毒物
    、汚染物質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】発生したシグナルが、第二メッセンジャーシグナルである、請
    求項1から5のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】第二メッセンジャーシグナルが、色素の分散または凝集をもた
    らす、請求項6に記載の方法。
  8. 【請求項８】細胞がメラニンを含有する、請求項7に記載の方法。
  9. 【請求項９】細胞が下等動物の色素細胞である、請求項8に記載の方法。
  10. 【請求項10】第二メッセンジャーシグナルが細胞内のカルシウムレベルの変
    化を引き起し、シグナルがカルシウム媒介蛍光である、請求項6に記載の方法。
  11. 【請求項11】リガンドの存在につき試料を試験する方法であって、 天然のリガンドへの結合を変化させた突然変異外因性細胞表面受容体を発現する
    組換え体細胞に試料を接触させること、 リガンドが外因性細胞表面受容体に結合した場合、発生する予め選択されたシグ
    ナルの存在を確定すること、 を含む、前記方法。
  12. 【請求項12】組換え体細胞が、少なくとも二つの組換え体細胞であり、それ
    ぞれが異なる突然変異による夫々の外因性細胞表面受容体を発現して夫々異なる
    天然のリガンドへの結合を有する、請求項11に記載の方法。
  13. 【請求項13】組換え体細胞が、異なる突然変異による外因性細胞表面受容体
    のアレイを発現する組換え体細胞のアレイである、請求項11に記載の方法。
  14. 【請求項14】突然変異外因性細胞表面受容体が、突然変異Gタンパク質共役
    受容体、チロシンキナーゼ受容体、イオンチャンネルからなる群から選択される
    、請求項11に記載の方法。
  15. 【請求項15】シグナルを、リガンドを結合させる異なる突然変異の受容体を
    発現する細胞と比較することができる、請求項１１に記載の方法。
  16. 【請求項16】リガンドが、受容体の天然のリガンドでない、請求項11に記載
    の方法。
  17. 【請求項17】リガンドが、化学兵器、爆薬、薬品、芳香、不純物、環境毒物
    、汚染物質からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
  18. 【請求項18】発生したシグナルが、第二メッセンジャーシグナルである請求
    項11から17のいずれかに記載の方法
  19. 【請求項19】第二メッセンジャーシグナルが、色素の分散または凝集をもた
    らす請求項18に記載の方法。
  20. 【請求項20】細胞がメラニンを含有する、請求項19に記載の方法。
  21. 【請求項21】細胞が下等動物の色素細胞である、請求項20に記載の方法。
  22. 【請求項22】第二メッセンジャーシグナルが細胞内のカルシウムレベルの変
    化を引き起し、シグナルがカルシウム媒介蛍光である、請求項11に記載の方法。
  23. 【請求項23】リガンドに対てし同定するフィンガープリントを生じさせる方
    法であって、 外因性突然変異細胞表面受容体のアレイを発現する組換え体細胞のアレイを接触
    させることによって複数のシグナルを発生させること、ここでその受容体のそれ
    ぞれはリガンドに対し異なる選択性または特異性を持ち、複数のシグナルはフィ
    ンガープリントを包含する、 を含む前記方法。
  24. 【請求項24】フィンガープリントが、蛍光読み出し、空間的パターンまたは
    グラフである、請求項23に記載の方法。
  25. 【請求項25】リガンドが、化学兵器、爆薬、薬品、芳香、不純物、環境毒物
    、汚染物質からなる群から選択される、請求項23に記載の方法。
  26. 【請求項26】細胞表面受容体に結合するリガンドの存在を同定する検知器で
    あって、リガンドを結合させる受容体を発現しリガンドが受容体に結合したとき
    に検知可能な細胞内シグナルを産生する細胞を収容するコンテナと、 リガンドを含有する試料をコンテナの中へ導入するためのコンテナ内の入口ポー
    トと、 細胞間シグナルを検知するためにコンテナに取り付けられたセンサを含む、前記
    検知器。
  27. 【請求項27】受容体が、外因性細胞表面受容体である、請求項26に記載の検
    知器。
  28. 【請求項28】受容体が、天然のリガンドへの結合を変化させた突然変異外因
    性細胞表面受容体である、請求項26に記載の検知器。
  29. 【請求項29】細胞が、突然変異受容体のアレイを発現する細胞のアレイであ
    る、請求項26に記載の検知器。
  30. 【請求項30】リガンドが、化学兵器、爆薬、薬品、芳香、不純物、環境毒物
    、汚染物質からなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
  31. 【請求項31】基準であることが知られた、或いは基準材料の少なくとも一つ
    の選択された性質を持つことが知られた標準品に対する試料の関連性を決定する
    ための方法であって、その方法が 外因性突然変異細胞表面受容体のアレイを発現する組換え体細胞のアレイを接触
    させることによってリガンド含有標準品につき複数のシグナルを発生させること
    、ここでその受容体のそれぞれはリガンド含有標準品におけるリガンドにつき異
    なる選択性または特異性を有し、複数のシグナルはリガンド含有標準品につき標
    準品のフィンガープリントを包含する、 外因性突然変異細胞表面受容体のアレイを発現する組換え体細胞のアレイを接触
    させることによってリガンド含有試料につき複数のシグナルを発生させること、
    ここでその受容体のそれぞれは、リガンド含有試料におけるリガンドにつき異な
    る選択性または特異性を有し、複数のシグナルは、リガンド含有試料につき試料
    フィンガープリントを包含する、ここでリガンド含有試料によって接触させられ
    た外因性突然変異細胞表面受容体のアレイを発現する組換え体細胞のアレイは、
    リガンド含有標準品によって接触させられた外因性突然変異細胞表面受容体のア
    レイを発現する組換え体細胞のアレイと同一である、及び 試料のフィンガープリントを標準品フィンガープリントと比較してリガンド含有
    試料が基準であるかを決定すること、を含む前記方法。
  32. 【請求項32】生成物の同一性を決定するためのコンピュータ実装方法であっ
    て、 外因性突然変異細胞表面受容体のアレイを発現する組換え体細胞のアレイを接触
    させることによって、リガンド含有標準品につき複数のシグナルを発生させるこ
    とで産生した標準品フィンガープリントデータを受け取ること、ここでその受容
    体のそれぞれはリガンド含有標準品におけるリガンドにつき異なる選択性または
    特異性を有し、複数のシグナルがリガンド含有標準品につき標準品フィンガープ
    リントを包含する、 外因性突然変異細胞表面受容体のアレイを発現する組換え体細胞のアレイを接触
    させることによって、リガンド含有試料につき複数のシグナルを発生させること
    で産生した試料フィンガープリントデータを受け取ること、ここでその受容体の
    それぞれは、リガンド含有試料におけるリガンドにつき異なる選択性または特異
    性を有し、複数のシグナルはリガンド含有試料につき試料のフィンガープリント
    を包含し、ここで試料のフィンガープリントデータが標準品のフィンガープリン
    トデータを発生させるためにリガンド含有標準品で接触させられた外因性突然変
    異細胞表面受容体のアレイを発現する組換え体細胞の同じアレイを用いて生じる
    、 リガンド含有試料からの試料のフィンガープリントデータをリガンド含有標準品
    からの標準品フィンガープリントと比較すること、ここで同一性には、標準品の
    フィンガープリントデータから計算された値の範囲を規定した予め選択された信
    頼限界以内であるリガンド含有試料からの試料のフィンガープリントデータが要
    求される、 を含む、前記方法。
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