CN102460150B - 囊泡系统及其用途 - Google Patents
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Abstract
本文公开了一种囊泡系统,所述囊泡系统包含表面,所述表面上固定化有囊泡。该固定化囊泡具有两亲聚合物周膜。通过具有非极性部分的分子将所述囊泡偶联至表面。所述非极性部分包含3到约30个碳原子和0到约12个杂原子的主链,所述杂原子选自Si、O、S和Se。通过共价键或非共价键将所述具有非极性部分的分子偶联至所述表面。所述非极性部分的局部被整合到所述周膜中。
Description
相关申请的交叉引用
本申请引用并要求于2009年4月20日向美国专利商标局提交的序号为61/202,920的临时申请“Vesicular Platform For High ThroughputMembrane Protein Expression(用于高通量膜蛋白表达的囊泡平台)”的优先权。依据PCT细则第4条第18款,为了所有目的,将2009年4月20日提交的所述申请的内容援引加入,包括援引PCT细则第20条第5款第(a)项中所提及的未包含在本文中的说明书、权利要求书或附图的任意要素或部分。
技术领域
本发明涉及囊泡系统及其用途。该系统由表面(该表面上固定化有囊泡)所限定。还公开了将膜蛋白与所述囊泡的膜结合的方法,包括将所述膜蛋白整合到所述囊泡的膜中。在某些实施方式中,该系统由布置有容纳膜蛋白的固定化囊泡的表面所限定。
背景技术
细胞膜是活细胞或其内部区室的自组装边界,由基于脂质的双层构造所限定。膜蛋白为大的两亲部分,具有精妙的功能-结构依赖性。膜蛋白可与膜不同程度地结合。经典的区分方法根据溶解膜蛋白所需的条件来将这些膜蛋白分类。外周膜蛋白可通过相对温和的条件(例如提高的离子强度或pH的改变)从膜上解离。内在膜蛋白(“integral”membraneproteins)只能通过去污剂或有机溶剂从膜上解离。该内在膜蛋白包括目前已知的跨越整个膜的蛋白、已知的部分嵌于膜的外部局部的蛋白(如前列腺素H2合酶-1)以及一些通过疏水性翻译后修饰与膜相互作用的蛋白(如异三聚体G蛋白)。
提供能够维持膜蛋白功能结构(在体内所述功能结构含有包含于细胞膜中的局部)的仿生结构是一项极具挑战性的任务。常规的基于去污剂的膜蛋白分离方法及加入到表面造成膜蛋白并入(incorporation)后的无规则取向。该常规方法不能够以保持蛋白有效性和功能性的形式并入复合物膜蛋白。这对于任意应用、特别是生物传感和药物发现而言十分关键。此外,由传统的磷脂材料在表面上形成的常规膜层很难保持稳固。
膜蛋白在涉及与细胞环境相互作用(包括通讯)的多种功能中起到关键作用,这对具有该膜蛋白的个体细胞以及器官和生物体来说通常是重要的。突出的实例为细胞信号传送、选择性地运输成分进出细胞或细胞-细胞相互作用。约50%的药物靶点为膜蛋白。举例来说,膜蛋白与视知觉、嗅觉和味觉的接收有关。具有跨膜域的蛋白的重要实例,G蛋白-偶联受体(GPCRs)、酪氨酸激酶受体、受体通道(通常称为促离子型受体,例如谷氨酸受体通道)和TOLL样受体为细胞内的关键信号传送受体。尽管其具有重要性,由于它们的敏感性以及分离和功能性重建的方法极其困难,关于膜蛋白详细功能的研究仍然缺乏。
虽然同时还有许多测定法技术可用于膜受体筛选(综述见例如Cooper,MA,J.Mol.Recognit.(2004)17,286-315),但仍然没有易于处理这些膜受体的重建系统。本领域分析膜蛋白功能的可用策略包括基于膜的模型系统和基于细胞的模型系统。通常遵循的标准方案在过去的几十年没有本质上的变化,涉及由去污剂形成的囊泡、或者从生物细胞膜中获得的片段(出处同上)。
在一种模拟生物膜情况的方法中,已经形成了合成的、具有极性末端基团的两亲直链嵌段共聚物的囊泡(参照例如Disher,DE等,Science(2002)297,967-973)。在另一种方法中,在金基板上形成了包含二肉豆蔻磷脂酰乙醇胺层和磷脂酰胆碱层的人工膜(国际专利申请WO2007/048459,参照图1)。为了分析所述膜包含的膜蛋白的功能,通过充当大分子间隔物的亲水性肽层避免膜蛋白和固相载体之间的直接接触(出处同上)。可通过表面等离子体增强荧光光谱学(SPFS)、免疫测定法(蛋白印迹)、表面增强红外光谱学(SEIRAS)和放射性标记监测膜蛋白在该栓系的(tethered)双层膜构造上的合成和并入。使用这一系统,可在人工环境中直接合成膜,并在分子水平表征膜蛋白。然而,由于磷脂形成的膜的脆弱特性,机械强度受到损害。此外,很难将这技术纳入多孔模式。因此,仍然存在着对提供人工膜的替代方法的需求。
因此,本发明的目的是提供适合测定法开发、分析和筛选目的的人工膜的稳固构造或具有该人工膜的稳固构造。
发明内容
本发明提供了一种化学上和机械上稳固的、与表面结合的人工膜构造,该构造结合有表面,所述表面具有体相材料(bulk-phase materials)大表面的强度。此外,本发明通过允许采用合成材料(如嵌段共聚物),克服了基于磷脂的膜作为蛋白嵌入材料的固有困难。显示了这些合成材料与体外合成的复合膜蛋白的相容性。
根据第一方面,本发明提供了囊泡系统。所述囊泡系统包含表面,所述表面上固定化有囊泡。所述固定化囊泡具有两亲聚合物周膜(circumferencial membrane)。通过具有非极性部分的分子将所述囊泡偶联至表面。所述非极性部分选自脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分和芳基脂肪族部分。所述非极性部分包含3到约30个碳原子和0到约12个杂原子的主链。所述杂原子选自Si、O、S和Se。通过共价键或非共价键将所述具有非极性部分的分子偶联至所述表面。该非极性部分的局部被整合到所述囊泡的周膜中。
在某些实施方式中,所述囊泡系统为含水系统。在该实施方式中,所述表面与含水介质接触,在表面上固定化的囊泡包含于(例如浸没于)该含水介质中。
根据第二方面,本发明提供了形成如第一方面所述的囊泡系统的方法。所述方法包括提供囊泡。所述囊泡具有两亲聚合物周膜。所述方法还包括提供具有非极性部分的分子。所述非极性部分为脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分和芳基脂肪族部分中的一种。所述分子中的非极性部分包含3到约30个碳原子和0到约12个杂原子的主链。所述杂原子选自Si、O、S和Se。此外,所述方法包括提供表面。所述方法还包括:在极性溶剂中,将该具有非极性部分的分子偶联至所述表面。该具有非极性部分的分子在所述囊泡存在下偶联至所述表面。如第二方面所述的方法由此也可作为囊泡的固定化方法。所述固定化囊泡具有两亲聚合物周膜。
根据第三方面,本发明提供了形成结合有膜蛋白的固定化囊泡的方法。所述方法包括提供如第一方面所述的囊泡系统中的固定化囊泡。所述方法还包括:在适宜条件下,将所述固定化囊泡与无细胞表达系统和核酸分子接触。所述核酸分子编码所述膜蛋白。此外,所述方法包括使所述膜蛋白表达。所述方法还包括使所述膜蛋白与所述囊泡的膜结合。
根据第四方面,本发明提供了对能够与膜受体蛋白形成复合物的化合物进行体外鉴定的方法。所述方法包括:提供如第一方面所述的囊泡系统。所述囊泡系统的固定化囊泡包含膜蛋白。这种膜蛋白与所述固定化囊泡的两亲聚合物周膜结合。所述膜蛋白为膜受体蛋白。所述方法包括将固定化囊泡与候选化合物接触。所述候选化合物被怀疑能够与所述膜受体蛋白形成复合物。所述方法还包括检测所述候选化合物与膜受体蛋白间复合物的形成。所述膜受体蛋白可为细胞膜的受体(即细胞表面受体)蛋白或细胞器膜的受体蛋白。
根据第五方面,本发明提供了对能够调节离子通道蛋白功能的化合物进行体外鉴定的方法。所述离子通道蛋白能够允许已知离子通过。所述方法包括提供如第一方面所述的囊泡系统。所述囊泡系统的固定化囊泡包含膜蛋白。这种膜蛋白与所述固定化囊泡的两亲聚合物周膜结合。所述膜蛋白为能够允许已知离子通过的离子通道蛋白。所述方法包括将固定化囊泡与候选化合物接触。所述候选化合物被怀疑调节所述离子通道蛋白的功能。所述方法还包括检测离子进出囊泡的通路。所述离子通道蛋白可为细胞膜的离子通道(即细胞表面离子通道)蛋白或细胞器膜的离子通道蛋白。
附图说明
当与非限制性实施例和附图结合考虑时,参照具体的说明,将更好地理解本发明。
图1描述了如PCT/EP2006/008318中所公开的、栓系在金基板上的人工脂质平面双层膜上展示的功能蛋白的直接合成以及并入(12:模型膜;13:间隔物(肽);14:金属或准金属基板;15:核糖体;16:质粒DNA)。
图2A描述了用于膜蛋白合成的、基于多孔板的平台的示意图。利用聚丙烯酰胺基质将该多孔板官能化,所述聚丙烯酰胺基质含有聚合物A作为锚定物,且聚合物囊泡被固定化在该基质上(1:聚合物囊泡;2:连接部分;3:聚丙烯酰胺作为载体基质;9:多孔板)。图2B描述了可用来形成聚合物囊泡的人工膜的嵌段共聚物的实例。
图3说明了α-溶血素插入锚定在多孔板上的聚合物囊泡的方案(1:含有钙黄绿素的聚合物囊泡;2:连接部分;3:聚丙烯酰胺作为载体基质;4:α-溶血素;9:多孔板)。
图4描述了由于从自猝灭环境中(正方形)稀释引起的钙黄绿素荧光强度的提高(圆圈)。稀释是因为通过α-溶血素的向囊泡外部的扩散。作为对照实验,加入MOPS/NaCl缓冲液并未显示出荧光的任何提高。
图5是膜蛋白(5)直接合成到聚合物囊泡(1)中的示意图(2:连接部分;3:聚丙烯酰胺作为载体基质;7:RNA聚合酶;8:mRNA;9:多孔板;15:核糖体)。
图6描述了在多孔板的孔中特异性结合的抗小鼠Cy5抗的荧光强度。
图7描述了基于化学发光测定法,利用各自的抗体对所表达的蛋白进行的免疫染色(1:GPCR OR5;2:无囊泡)。在每个孔中,在分别完成无细胞表达或对照后,加入抗VSV的一抗。将抗小鼠抗体(来自于Westernbreeze试剂盒)选作二抗,孵育40min。随后加入化学发光底物。显示了多孔板的孔中的化学发光。
图8描述了利用如图7中所示例的相同抗体,稳固的聚合物囊泡中的膜蛋白的蛋白印迹与对照实验的比较(泳道1:OR5;泳道2:Claudin2;泳道3:无cDNA的聚合物囊泡(BD21);泳道4:无cDNA的聚合物囊泡(BD37);泳道5:有OR5的聚合物囊泡(BD21);泳道6:有OR5的聚合物囊泡(BD37);泳道7:有Claudin 2的聚合物囊泡(BD21);泳道8:有Claudin 2的聚合物囊泡(BD37);聚合物囊泡(BD21)=21个重复单元的疏水嵌段共聚物;聚合物囊泡(BD37)=37个重复单元的疏水嵌段共聚物)。
图9描述了利用如图7中所示例的相同抗体,包含具有cDNA的聚合物囊泡和没有cDNA的聚合物囊泡的孔中样品的蛋白印迹。
具体实施方式
本发明提供了固定化囊泡。通常,提供多个固定化囊泡。所述一个或多个囊泡固定化于表面上。它/它们可固定化于任意所需的表面上。通常,所述表面为固体。所述表面可用于限定壁。它可以为任意几何形状。只要它们允许用于具有所需尺寸以及周膜的囊泡的固定,便可具有任意的内表面特征。所述表面例如可为弯曲的、圆形的、笔直的或平坦的。它可以为弧形(如凹面或凸面)、波形或包含凹痕(dent)、凹角(nook)或任意其他几何形状的元件。通常所述表面或各自的壁可分别为另一个较大的表面或壁的一部分。所述表面可具有任意所需的尺寸和规格。在某些实施方式中,所述表面为纳米颗粒(如纳米晶体)的表面。所述囊泡通过被偶联至表面的分子偶联到所述表面,因而对润湿性(wettability)和极性不施加任何特殊限制。所述表面或其任意局部由此可为极性且亲水性的、或者非极性且疏水性的。此外,所述表面的不同局部可提供不同的表面特征。因此,表面/壁的某些局部可为极性的,而表面/壁的其它局部可为非极性的。
可以下述方式处理所述表面/壁的任意部分:所述表面/壁的任意部分提供了其各自的亲水性表面特征或疏水性表面特征。例如,可期望这样的处理,以提供与所选液滴的液体具有改变的(例如降低的或可忽略的)相互作用的表面。例如,可分别处理储存器的底部区(base region of thereservoir)。此外,在某些实施方式中,所述储存器的内壁对期望容纳于其中的介质而言是非活性的。这种实施方式允许装置多次重复使用。对大多数腐蚀介质而言为非活性材料的示意性实例为含氟聚合物,如氟化乙丙烯(FEP)、聚四氟乙烯(PFTE,Teflon)、乙烯-四氟乙烯(ETFE)、四氟乙烯-全氟甲基乙烯基醚(MFA)、偏氟乙烯-六氟丙烯共聚物、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物、偏氟乙烯-六氟丙烯-四氟乙烯三元共聚物、全氟甲基乙烯基醚-四氟乙烯共聚物、全氟烷氧基共聚物(PFA)、聚氟乙烯、聚氯三氟乙烯、氟硅氧烷类或氟代膦腈类(fluorophosphazenes)。
所述表面可包含任意所需的材料。在某些实施方式中,所述表面为聚合物表面,特别是固体聚合物表面。在某些实施方式中,所述表面为金属表面、金属氧化物表面、准金属表面或准金属氧化物表面,或所述表面可包含金属、准金属、金属氧化物或准金属氧化物的任意混合物。适宜的准金属的实例包括但不限于硅、硼、锗、锑及它们的复合材料(composites)。适宜的金属的实例包括但不限于铁(例如钢)、铝、金、银、铬、锡、铜、铟、钛、锌、钽、铝、铅、锶及它们的复合材料。任意这些准金属以及金属的各自的氧化物可分别作为准金属氧化物或金属氧化物来使用。作为示意性的实例,所述表面可为石英或玻璃。作为示意性的实例,可利用食人鱼洗液(piranha solution)(即摩尔比为7∶3的硫酸和过氧化氢溶液的混合物)分别蚀刻硅基板或锗基板获得氧化硅表面或氧化锗表面。
在某些实施方式中,所述表面由周壁限定,所述周壁限定了凹部。所述各凹部能够包含预定体积的介质,包括含水介质。在某些实施方式中,所述表面为多孔板的孔的周壁。
所述囊泡具有通常由单个区室所限定的内腔(interior)及周膜。各囊泡可具有核壳型结构。通常所述囊泡为球形,并可为胶束型的。所述内腔通常由亲水性液体所限定。亲水性的(“亲水的”)液体,也称疏脂性的(“憎脂的”)液体,含有能与水分子形成偶极-偶极相互作用的分子并由此溶于水分子中。这样的液体由此通常为极性的。疏水性的(“憎水的”)液体,也称亲脂性的液体,趋于从水中分离出来。因而这些液体通常为非极性的。亲水性液体的实例包括但不限于水、丙酮、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、四氢呋喃、吡啶、氯仿、乙二醇单丁醚、吡啶、乙酸乙酯、乙腈、二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、甲酸、甲酰胺以及极性离子液体。极性离子液体的实例包括但不限于1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、N-丁基-4-甲基吡啶四氟硼酸盐、1,3-二烷基咪唑四氟硼酸盐、1,3-二烷基咪唑六氟硼酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑双(五氟乙基)亚膦酸酯、1-丁基-3-甲基咪唑四(3,5-双(三氟甲基苯基)硼酸盐、四丁基铵双(三氟甲基)酰亚胺、乙基-3-甲基咪唑三氟甲烷磺酸酯、1-丁基-3-甲基咪唑甲基硫酸盐、1-正丁基-3-甲基咪唑([bmim])辛基硫酸盐以及1-正丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。非极性液体的实例包括但不限于矿物油、己烷、庚烷、环己烷、苯、甲苯、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二硫化碳、二噁烷、二乙醚、二异丙醚、甲基丙基酮、甲基异戊基酮、甲基异丁基酮、环己酮、异丁酸异丁酯、乙二醇二乙酸酯以及非极性离子液体。非极性离子液体的实例包括但不限于1-乙基-3-甲基咪唑双[(三氟甲基)磺酰基]酰胺双(三氟甲磺酰基)酰胺、1-乙基-3-甲基咪唑双[(三氟甲基)磺酰基]酰胺三氟醋酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-己基-3-甲基咪唑双(三氟甲基磺酰基)酰亚胺、1-丁基-3-甲基咪唑双(三氟甲基磺酰基)酰亚胺、三己基(十四烷基)膦双(草酸(2-)]硼酸盐、1-己基-3-甲基咪唑三(五氟乙基)三氟磷酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、三(五氟乙基)三氟磷酸盐、三己基(十四烷基)膦、N″-乙基-N,N,N′,N′-四甲基胍盐、1-丁基-1-甲基吡咯烷三(五氟乙基)三氟磷酸盐、1-丁基-1-甲基吡咯烷双(三氟甲基磺酰基)酰亚胺、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑双(三氟甲基磺酰基)酰亚胺以及1-正丁基-3-甲基咪唑鎓盐。
因此,所述囊泡具有内腔,所述内腔通常由极性液体所限定。适宜的液体可为极性液体,如极性质子液体。质子液体(例如溶剂)是具有在羟基中与氧结合的氢原子、或在氨基中与氮结合的氢原子的液体。更一般而言,包含可解离的H+的任意分子液体(如氟化氢)都称为质子液体。这些液体的分子可以提供H+(质子)。所述极性质子液体的实例可以是但不限于水、甲醇、乙醇或乙酸。本发明的一个实施方式中可使用水。
在某些实施方式中,所述囊泡的内腔可包含水溶液。各水溶液中还可包含其它物质,其它物质例如溶解或悬浮于水溶液中。作为示意性的实例,水溶液可包含一种或多种缓冲化合物。大量缓冲化合物被用于本领域中,并可用于实现本文描述的多种方法。缓冲液的实例包括但不限于磷酸盐溶液、碳酸盐溶液、琥珀酸盐溶液、碳酸盐溶液、柠檬酸盐溶液、醋酸盐溶液、甲酸盐溶液、巴比妥酸盐溶液、草酸盐溶液、乳酸盐溶液、邻苯二甲酸盐溶液、顺丁烯二酸盐溶液、二甲胂酸盐溶液、硼酸盐溶液、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基-乙烷磺酸盐溶液(也称为ACES)、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N′-2-乙磺酸溶液(也称为HEPES)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪-丙磺酸溶液(也称为HEPPS)、哌嗪-1,4-双(2-乙烷磺酸)溶液(也称为PIPES)、2-[三(羟甲基)甲基氨基]-1-乙烷磺酸溶液(也称为TES)、2-环己基氨基-乙烷磺酸溶液(也称为CHES)和N-(2-乙酰氨基)-亚氨基二乙酸盐溶液(也称为ADA)。在这些盐中可应用任意反离子;铵、钠、钾可作为示意性的实例。更多的缓冲液实例包括但不限于三乙醇胺、二乙醇胺、乙基胺、三乙基胺、甘氨酸、双甘氨肽、组氨酸、三(羟甲基)氨基甲烷(也称为TRIS)、双(2-羟乙基)-亚氨基-三(羟甲基)甲烷(也称为双TRIS)和N-[三(羟甲基)-甲基]-甘氨酸(也称为TRICINE),在此仅列举一部分。所述缓冲液可为或可包含于所述缓冲化合物的水溶液、或适宜极性有机溶剂中的溶液。更多可存在的物质的实例包括盐类、去污剂或螯合化合物。作为另一个示意性实例,水溶液可包含一种或多种对某种离子的存在敏感的化合物,例如染料或荧光指示剂。作为示意性的实例,在所述囊泡内腔中可包含钙敏感的荧光指示剂,如fura-2、fluo-3、indo-1、BCECF及钙黄绿素。作为另外两个实例,在所述囊泡内腔中可包含钠敏感的指示剂(如结合钠的苯并呋喃间苯二甲酸酯或CoroNa Green)或钾敏感的指示剂(如结合钾的苯并呋喃间苯二甲酸酯)(参照下文)。水溶液中可包含的指示剂的另一个示意性实例是氧化还原电势的指示剂,如对氧化还原作用敏感的染料,例如六甲基碱性副品红氯化物(结晶紫)。
正如下文也解释的,在某些实施方式中,所述囊泡内腔中的量子点或染料的存在可用于监测或辅助监测囊泡的完整性。因此,例如在体外合成的过程中,有可能立刻监测到所述囊泡是否为完整的。在某些实施方式中,所述囊泡中包含药物活性化合物。如果通道蛋白、转运体蛋白或受体通道被整合到所述囊泡的膜中,囊泡环境条件发生的改变可引起通道的开放或转运体的活化,从而触发所述药物活性化合物的释放。这样的实施方式例如可应用于体内,如应用于将本发明的系统转移到生物体(如人体或动物体)这样的实施方式中。
所述囊泡的内腔还可包含样品。该样品可来自任意来源。它可以来自于人、动物、植物、细菌、病毒、孢子、真菌或原生动物,但不限于此,或来自合成的或生物学来源的有机材料或无机材料。相应地,本方法可以加工选自于由下列样品组成的组中的样品:土壤样品、空气样品、环境样品、细胞培养物样品、骨髓样品、降雨样品、沉降物样品、污水样品、地下水样品、磨蚀样品(abrasion sample)、考古学样品、食物样品、血液样品、血清样品、血浆样品、尿样品、粪便样品、精液样品、淋巴液样品、脑脊髓液样品、鼻咽清洗样品、痰液样品、口腔抹片样品、咽喉抹片样品、鼻抹片样品、支气管肺泡灌洗样品、支气管分泌物样品、乳样品、羊水样品、活组织检查样品、癌样品、肿瘤样品、组织样品、细胞样品、细胞培养物样品、细胞裂解物样品、病毒培养物样品、指甲样品、毛发样品、皮肤样品、法医样品、感染样品、医院感染样品、产品样品、药物制剂样品、生物学分子制备样品、蛋白制剂样品、脂质制剂样品、碳水化合物制剂样品、太空样品、地球外样品或它们的任意组合,但不限于此。若需要,各样品可被预处理到任意程度。作为示意性的实例,在用于本发明的装置前,组织样品可被消化、匀浆或离心。此外,所述样品还可制备成流体形式,如溶液。实例包括但不限于如下物质的溶液或浆液:核苷酸、多核苷酸、核酸、肽、多肽、氨基酸、蛋白质、合成聚合物、生物化学组合物、有机化学组合物、无机化学组合物、金属、脂类、碳水化合物、组合化学产品、药物候选分子、药物分子、药物代谢产物或它们的任意组合。其它的实例包括但不限于金属悬浮液、金属合金悬浮液以及金属离子溶液或它们的任意组合,以及细胞悬浮液、病毒悬浮液、微生物悬浮液、病原体悬浮液、放射性化合物悬浮液或它们的任意组合。可以理解的是,样品还可包括前述实例的任意组合。
所述囊泡的内腔和周膜限定了两个不可溶混的相,外相(膜)和内相(囊泡的内腔)。所述外相与所述内相不可溶混。通常所述外相的流体与所述内相的流体是不可溶混的(如上所述)。通常为了表征与其它液体的性质(如可溶性(solubility)和溶混性(miscibility)),将液体分为极性液体和非极性液体。通常极性液体含有电子密度分布不均匀的分子。分子的极性由它的介电常数或它的偶极矩反映。通常极性分子被进一步分为质子分子和非质子(或质子惰性的(aprotic))分子。包含很大程度的极性质子分子的流体(例如液体)可认为是极性质子流体。包含很大程度的极性非质子分子的流体(例如液体)可认为是极性非质子流体。当质子分子溶解于如水或醇中时,质子分子包含可为酸性氢的氢原子。质子惰性分子不包含这种氢原子。
非极性液体的实例包括但不限于己烷、庚烷、环己烷、苯、甲苯、二氯甲烷、四氯化碳、二硫化碳、二噁烷、二乙醚或二异丙醚。偶极质子惰性液体的实例为甲基乙基酮、氯仿、四氢呋喃、乙二醇单丁醚、吡啶、甲基异丁基酮、丙酮、环己酮、乙酸乙酯、异丁酸异丁酯、乙二醇二乙酸酯、二甲基甲酰胺、乙腈、N,N-二甲基乙酰胺、硝基甲烷、乙腈、N-甲基吡咯烷酮、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、N,N-二异丙基乙胺和二甲亚砜。极性质子液体的实例为水、甲醇、异丙醇、叔丁醇、甲酸、盐酸、硫酸、乙酸、三氟乙酸、二甲基次胂酸[(CH3)2AsO(OH)]、乙腈、苯酚或氯苯酚。通常离子液体具有有机阳离子和阴离子,所述阴离子可以是有机的或者无机的。已知所述离子液体的极性(参照如下实例)主要由相关阴离子决定。例如卤化物、拟卤化物、BF4 -、硫酸甲酯、NO3 -或ClO4 -为极性液体,而六氟磷酸盐、AsF6 -、双(全氟烷基)酰亚胺和[C4F6SO3]-为非极性液体。
所述囊泡的膜由一种或多种两亲聚合物所限定。术语“两亲”指的是在极性和非极性流体中均可溶的化合物。它还包括多相化合物。所述聚合物的两亲性质是由于在相同分子内同时存在极性部分和非极性部分。就这一点而言,所述聚合物可具有表面活性剂的性质。因此,所述聚合物的极性性质是基于极性部分。这样的部分的两个实例为-COOH侧基(特别是带电COO-基团形式的-COOH侧基)以及SO4H基团(特别是SO4 -基团形式的SO4H基团)。表面活性剂分子通常包含与非极性(通常为烃)部分结合的极性(通常为亲水的)首基(headgroup)。聚合物的非极性部分包含不带有官能团的烃链。
所述周膜中包含的聚合物可以为合成的聚合物、天然存在的聚合物或它们的组合。本文使用的术语“合成的聚合物”代表未在自然界发现的聚合物,包括由天然存在的生物材料生产的聚合物。两亲聚合物的应用使得例如在筛选法中能够选择囊泡,所述囊泡具有稳固特性(即在贮存方面具有特别高的稳定性,对剪切力及机械阻力具有抗性)。与基于脂质的囊泡(也称为脂质体)相比,例如嵌段共聚物囊泡的聚合物囊泡(也称为“聚合物体(polymersomes)”)具有更出色的机械性能和物理性能。例如,与脂质囊泡相比,在断裂前,聚合物囊泡通常能够经受更高一级的临界区域应变(critical areal strain)。因此,可提供所并入的膜蛋白的高稳定性来抵抗机械的、化学的和微生物的侵害。这可以满足工业应用所需的工艺兼容性。可易于贮存和运输所述固定化囊泡;这是具有易碎特性的天然膜结构所不具备的。这就使得所述固定化囊泡(聚合物体)能够工业生产,并使得利用基于膜的传感应用成为可能。
本发明所述囊泡的膜可包含多种两亲聚合物,包括多种嵌段共聚物。例如,所述囊泡的膜中包含的两亲聚合物可包含单体单元,如羧酸、酰胺、胺、亚烷基、二烷基硅氧烷、醚以及烯化硫。在某些实施方式中,它可以包含或可以是聚羧酸、聚酰胺、聚胺、聚亚烷基、聚二烷基硅氧烷、聚醚、聚烯化硫及它们的任意组合。在某些实施方式中,所述两亲聚合物为嵌段共聚物。如前述实例所提及的任意聚合物也可限定各自的嵌段共聚物中的嵌段。例如,本领域已知多种两亲嵌段共聚物在水溶液中经历自组装,由此使得能量上不利的疏水物-水相互作用最小化。其中一些聚合物为刺激-应答嵌段共聚物。任意这些聚合物都可用于限定本发明所述的系统中的固定化囊泡的周膜。关于这一点,注意到在本领域中还已知两亲均聚物也可经历自组装而成为稳定的囊泡。
例如,所述两亲聚合物可为二嵌段共聚物(A-B)或三嵌段共聚物(A-B-A或A-B-C)。在某些实施方式中,所述两亲聚合物包含聚醚嵌段,如寡聚氧乙烯嵌段、聚氧乙烯嵌段、寡聚氧丙烯嵌段、聚氧丙烯嵌段、寡聚氧丁烯嵌段以及聚氧丁烯嵌段。聚合物中可包含的嵌段的实例还可包括但不限于聚丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚丁二烯、聚(2-甲基噁唑啉)、聚二甲基硅氧烷、聚ε-己内酯、聚硫化丙烯、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(2-乙烯吡啶)、聚[甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯]、聚[甲基丙烯酸-2-(二异丙氨基)乙酯]、聚(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)以及聚乳酸。适宜的两亲聚合物的实例包括但不限于聚乙基乙烯-b-聚环氧乙烷(PEE-b-PEO)、聚丁二烯-b-聚环氧乙烷(PBD-b-PEO)、聚苯乙烯-b-聚丙烯酸(PS-PAA)、聚(2-甲基噁唑啉)-b-聚二甲基硅氧烷-b-聚(2-甲基噁唑啉)(PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA)、聚(2-甲基噁唑啉)-b-聚二甲基硅氧烷-b-聚环氧乙烷(PMOXA-b-PDMS-b-PEO)、聚环氧乙烷-b-聚硫化丙烯-b-聚环氧乙烷(PEO-b-PPS-b-PEO)以及聚环氧乙烷-聚环氧丁烷嵌段共聚物。可通过共聚物中各自包含的嵌段的平均嵌段长度进一步规定嵌段共聚物。因此,PBMPEON表示存在长度为M的聚丁二烯嵌段(PB)以及长度为N的聚环氧乙烷嵌段(PEO)。M和N为例如在从约6到约60范围内独立选择的整数。因此,PB35PEO18表示存在平均长度为35的聚丁二烯嵌段和平均长度为18的聚环氧乙烷嵌段。同样地,PB10PEO24表示存在平均长度为10的聚丁二烯嵌段和平均长度为24的聚环氧乙烷嵌段。作为另一个实例,EOBP表示存在长度为O的乙烯嵌段(E)和长度为P的丁烯嵌段(B)。O和P为例如在从约10到约120的范围内独立选择的整数。因此,E16B22表示存在平均长度为16的乙烯嵌段和平均长度为22的丁烯嵌段。
根据所使用的聚合物,所述膜可组装成多种囊泡形态。当所述膜中包含嵌段共聚物时,可发生嵌段共聚物的分聚(segregation)。在任意这样的形态中,聚合物分子的非极性且因而疏水的局部通常位于膜内,而不是位于膜的面上;它们可能桥接所述膜。所述聚合物的极性局部可排列在含有囊泡的介质(例如含水介质)的界面上。举例来说,AB二嵌段共聚物可形成交错对称的膜(interdigitated symmetric membrane)。AB二嵌段共聚物和BC二嵌段共聚物的二元混合物可引起所述膜内的AB嵌段和BC嵌段发生至少局部空间分聚的形态。同样地,ABC三嵌段共聚物可以形成至少局部空间分聚的形态。
举例来说,适宜的聚醚可包含寡聚氧乙烯嵌段或链段(segment)、聚氧乙烯嵌段(或链段)、寡聚氧丙烯嵌段、聚氧丙烯嵌段、寡聚氧丁烯嵌段和聚氧丁烯嵌段中的一种。各三嵌段共聚物的示意性实例为泊洛沙姆。泊洛沙姆为端接伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂。它通常具有例如聚氧丙烯(聚环氧丙烷)的中心非极性链,两侧为两个亲水链,例如聚氧乙烯(聚环氧乙烷)。因此,在某些实施方式中,所述聚醚可为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷(PEO-PPO-PEO)三嵌段共聚物。所述聚合物嵌段的长度是可定制的,从而可以购买性质略有不同的多种泊洛沙姆。对于通用术语“泊洛沙姆”,这些共聚物通常以字母“P”(代表泊洛沙姆)及其后面的三个数字命名,开头两个数字乘以100得到聚氧丙烯核心的近似分子量,最后的一个数字乘以10得到聚氧乙烯含量的百分比(例如P407=聚氧丙烯的分子量为4,000g/mol且聚氧乙烯的含量为70%的泊洛沙姆)。对于普流尼克(Pluronic)这一商品名,这些共聚物的编码以字母开始,限定其在室温下的物理形态(L=液体,P=糊状物,F=薄片(固体)),字母后面是两个或三个数字,开头的数字表示聚氧丙烯核心的分子量(由BASF的普流尼克网格图(Pluronic grid)确定),最后一个数字乘以10得到聚氧乙烯含量的百分比(例如F127=聚氧丙烯的分子量为4,000g/mol且聚氧乙烯含量为70%的普流尼克)。所述聚醚例如可为环氧乙烷与2-甲基-环氧乙烷的三嵌段共聚物,化学文摘登记号为691397-13-4。该聚醚的示意性的实例为可商购的三嵌段共聚物AdekaPluronic F 68、Nissan Plonon 104、Novanik 600/50、Lutrol 127、Pluriol PE1600、Plonon 104、Plonon 407、Pluronic 103、Pluronic 123、Pluronic 127、Pluronic A 3、Pluronic F-127、Pluronic F 168、Pluronic 17R2、Pluronic P 38、Pluronic P 75、Pluronic PE 103、Pluronic L 45、Pluronic SF 68、Slovanik310、Synperonic P 94或Synperonic PE-F 127,在此仅列举一部分。
在某些实施方式中,包含在所述囊泡的周膜中的两亲聚合物可具有在标准大气压下低于环境温度(例如约22℃以下)的玻璃化转变(Tg)温度。如果聚合物的温度降低,所述玻璃化转变温度相当于聚合物的非晶态域在刚度(rigidity)、硬度(stiffness)和刚度(rigidity)方面具有类似玻璃的特征时的温度。比如,该玻璃化转变温度可选择为约0℃以下,如约-40℃以下,例如约-60℃以下、约-80℃以下或约-90℃以下,如例如约-93℃、约-100℃、约-125℃或约-130℃。
在某些实施方式中,包含在所述囊泡的周膜中的聚合物是生物相容的,包括药学上可接受的。各嵌段的示意性实例为例如包含于聚合物普流尼克-聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)中的聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)。本文所使用的术语“生物相容的”(也可称为“组织相容的”)是指在体内应用时,即使产生有害的生物学应答其程度也极小的聚合物或聚合物嵌段。因此该术语泛指在动物(包括人)的细胞、包括机体中,这些嵌段或聚合物不会引起可测的有害生物学应答。生物相容的聚合物嵌段或聚合物可具有一个或多个下列性质:非毒性的、非致突变的、非引起过敏的、非致癌的和/或非刺激性的。生物相容的聚合物嵌段或聚合物至少对各自的细胞和/或机体而言是无害的且可耐受的。生物相容的聚合物嵌段或聚合物自身也可改善机体中的一种或多种功能。
适宜的生物相容的聚合物嵌段的实例包括不可吸收的聚合物嵌段和可吸收的聚合物嵌段,不可吸收的聚合物嵌段如聚丙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚对苯二甲酸丁二酯、聚四氟乙烯、聚芳醚酮、尼龙、氟化乙丙烯、聚丁酯和硅酮;可吸收的聚合物嵌段如聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯和聚羟基烷酸酯。
通过具有非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分的分子,将所述囊泡偶联至表面。除非另有说明,术语“脂肪族的”指的是直链或支链烃链,所述直链或支链烃链可为饱和的或单不饱和的或多不饱和的,并可含有杂原子。本文所使用的术语“杂原子”指的是除碳或氢以外的任意元素的原子。不饱和脂肪族基团具有一个或多个双键和/或三键(烯基或炔基部分)。所述烃链的支链可包含直链和非芳香族的环要素(non-aromatic cyclic elements)。除非另有说明,所述烃链可为任意长度并含有任意数量的支链。通常,所述烃(主)链包含1到5个、1到10个、1到15个或1到20个碳原子。烯基基团的实例为具有一个或多个双键的直链或支链烃基团。烯基基团通常含有约2个到约20个碳原子以及一个或多个(如2个)双键,如约2个到约10个碳原子以及一个双键。炔基基团通常具有约2个到约20个碳原子以及一个或多个(例如两个三键),优选具有例如2个到10个碳原子以及1个三键。炔基基团的实例为具有一个或多个三键的直链或支链烃基团。烷基的实例为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、这些基团的正异构体(n isomers)、异丙基、异丁基、异戊基、仲丁基、叔丁基、新戊基、3,3-二甲基丁基。主链和支链均可含杂原子,即与碳和氢不同的原子,比如N、O、S、Se或Si,或碳原子可被这些杂原子所取代。当本发明所述方法的反应物或产品的部分中存在若干杂原子时,这些杂原子为独立选择的。
术语“脂环族的”也可称为“环脂肪族的”,除非另有说明,它指的是非芳香族的环部分(例如烃部分),所述非芳香族的环部分可为饱和的或单不饱和的或多不饱和的。该环烃部分也可包含稠环系(如十氢化萘),还可被非芳香族的环要素以及链要素所取代。除非另有说明,所述环烃部分的主链可为任意长度并含有任意数量的非芳香族的环要素以及链要素。通常,在一个环中,所述烃(主)链包含3、4、5、6、7或8个主链原子。这样的部分的实例包括但不限于环戊基、环己基、环庚基或环辛基。环烃部分以及任意环的取代基和链的取代基(如果存在的话)都可含有杂原子,如N、O、S、Se或Si,或碳原子可被这些杂原子取代。术语“脂环族的”也包括环烯基部分,所述环烯基部分为不饱和的环烃,通常具有约3个到约8个环碳原子,比如5个或6个环碳原子。通常,在各环系中环烯基基团具有双键。环烯基基团可被取代。
与之相反的是,术语“芳香族的”指的是共轭双键的至少基本上为平面的环烃部分,所述环烃部分可为单环、或包含多个稠环(condensedrings)(稠合环(fused rings))或共价连接的环,比如2元、3元或4元稠合环。术语“芳香族的”也包括烷基芳基。通常,在一个环中,烃(主)链包含5、6、7或8个主链原子。这样的部分的实例包括但不限于环戊二烯基、苯基、萘基、[10]轮烯基(1,3,5,7,9-环癸五烯基)、[12]轮烯基、[8]轮烯基、非那烯(周萘)、1,9-二氢芘、(1,2-苯并菲)。烷基芳基部分的实例为苄基。除非另有说明,所述环烃部分的主链可为任意长度并含有任意数量的杂原子,例如N、O和S。这样的杂芳族部分例如可为5-7元非饱和杂环,所述杂环具有一个或多个从O、N、S中选择的杂原子。这样的杂芳族部分的实例(本领域技术人员已知)包括但不限于呋喃基部分、苯硫基部分、萘基部分、萘并呋喃基部分、蒽并苯硫基(anthrathiophenyl)部分、吡啶基部分、吡咯基部分、喹啉基部分、萘并喹啉基部分、喹喔啉基部分、吲哚基部分、苯并吲哚基部分、咪唑基部分、噁唑基部分、氧杂环壬四烯基(oxoninyl)部分、氧杂环庚三烯基(oxepinyl)部分、苯并氧杂环庚三烯基部分、氮杂环庚三烯基部分、硫杂环庚三烯基部分、硒杂环庚三烯基部分、硫杂环壬四烯基部分、氮杂环辛烯基部分、(氮杂环癸五烯基)部分、二氮杂环辛烯基部分、氮杂环十二-1,3,5,7,9,11-六烯-5,9-二基部分、偶氮杂辛烯基部分、二偶氮杂环辛烯基部分、苯并偶氮杂环辛烯基部分、氮杂环辛烯基部分、氮杂环十一烯基部分、硫杂[11]轮烯基部分、氧杂环十三-2,4,6,8,10,12-己烯基部分或三氮杂蒽基部分。
术语“芳基脂肪族的”指的是其中的一个或多个芳香族部分被一个或多个脂肪族基团所取代的烃部分。因此,所述术语“芳基脂肪族的”也包括其中的两个或多个芳基基团通过一个或多个任意长度的脂肪族链(如亚甲基基团)相连的烃部分。通常,在芳香族部分的每个环中,烃(主)链含有5、6、7或8个主链原子。芳基脂肪族部分的实例包括但不限于1-乙基-萘、1,1′-亚甲基二苯、9-异丙基蒽、1,2,3-三甲基苯、4-苯基-2-丁烯-1-醇、7-氯-3-(1-甲基乙基)-喹啉、3-庚基呋喃、6-[2-(2,5-二乙基苯基)乙基]-4-乙基喹唑啉或7,8-二丁基-5,6-二乙基异喹啉。
本文所使用的每个术语“脂肪族的”、“脂环族的”、“芳香族的”和“芳基脂肪族的”旨在包括各部分被取代的形式和未被取代的形式。脂肪族部分可以被一种或多种官能团取代或未被取代。取代基可为任意官能团,实例为-COOH(羧基)、-OH(羟基)、-SH(巯基)、二噻烷基、-SeH(硒代)、-CHO(醛基)、-CO-(羰基)、-OSO-(磺酰基)、硫代(sulfo-)、硫桥(sulfido-)、-O-(氧代)、硫酸基(-OSO3H)、-NH2(氨基)、-NO(硝基)、-NS、-NSe、卤素(如-Br(溴代)、-Cl(氯代)或-F(氟代))、氨基、亚氨基、酰胺基、酰亚胺基、叠氮基、重氮基、氰基、异氰基、硫氰基、硝基、亚硝基、磺酰基(例如三氟甲基磺酰基、对甲苯磺酰基、溴苯磺酰基、硝基苯磺酰基、甲磺酰基)、甲硅烷基、硅烷醇基或甲硅烷氧基基团,但不限于此。
各分子的非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分可含有直链或支链的主链。该非极性部分的主链含有2到约30个碳原子的主链,如3到约30个、4到约30个、5到约30个、3到约25个、4到约25个、3到约20个、4到约20个、3到约18个、3到约15个或3到约10个,例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个碳原子。所述非极性部分的主链还可包含一个或多个杂原子,如Si、O、S或Se。例如,所述主链可含有0到约16个杂原子,如0到约14个、0到约12个、0到约10个、0到约7个、0到约5个或0到约3个杂原子,如例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个杂原子。
所述非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分可为包含于任意所需分子中的任意相应的部分(如下所述)。作为示意性的实例,它可以为脂质(如二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺)的非极性脂肪族局部、硫脂(thiolipid)(如2,3-二-O-植烷基-sn-甘油-1-四乙二醇-D,L-R-硫辛酸酯脂质、胆固醇或鞘磷脂)的非极性脂肪族局部。
具有所述非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分的分子将所述囊泡偶联到所述表面。在某些实施方式中,所述具有非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分的分子通过其它物质(如其它分子,包括聚合物)偶联到所述表面。在某些实施方式中,所述具有非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分的分子通过非共价相互作用或共价相互作用固定于所述表面。这样的相互作用可以是但不限于配位键、卡西米尔相互作用(Casimir interaction)、疏水相互作用、氢键、溶剂化力和范德华相互作用。
所述具有非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分的分子还可被共价结合至所述表面。作为另一个示意性的实例,连接部分(如亲合标签)可用于固定所述各分子。所述连接部分可以是包括含氮基团、含磷基团、含硫基团、含碳(carben-)基团、卤素基团或拟卤素基团或其局部的分子(例如基于烃(包括聚合的烃)的分子)。作为示意性的实例,所选择的表面可包含刷状聚合物(如具有短侧链的聚合物),例如用该聚合物包被所选择的表面。用于固定的表面还可包含例如通过接枝方式而含有的刷状结构的聚合物。所述表面例如可包含允许分子的共价结合的官能团。各官能团的实例包括但不限于氨基、醛基、巯基、羧基、酯、酐、磺酸根、磺酸酯、酰亚胺酯、甲硅烷基卤化物、环氧化物、氮丙啶、亚磷酰胺以及重氮烷。
在某些实施方式中,所述具有非极性部分的分子通过其它与所述表面连接的物质偶联到表面。例如,所述分子可包含于水凝胶(即其中水为分散介质的聚合物网络)中。所述水凝胶结合或连接到所述表面。例如,它可以通过非共价相互作用或共价相互作用结合到所述表面。如上所述,这种相互作用的实例包括但不限于配位键、卡西米尔相互作用、疏水相互作用、氢键、溶剂化力以及范德华相互作用。所述具有非极性部分的分子可具有第一局部和第二局部。所述第一局部可被整合到固定化囊泡的周膜中。所述非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分可包含该第一局部。在某些实施方式中,所述非极性部分相当于各自的第一局部。因此,在这样的实施方式中,整个非极性部分都被整合到所述固定化囊泡的周膜中。在某些实施方式中,所述第一局部(具有非极性部分的分子的第一局部)完全由所述非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分的局部限定。然而,所述非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分的其余局部可以不被整合到所述囊泡的周膜中。所述非极性部分的其余局部例如可包含于各分子的第二局部中。所述非极性部分的其余局部还可包含于各分子另外的局部中,该另外的局部可作为具有非极性部分的分子的第三局部。在某些实施方式中,如Hara等人所描述的,可使用十八烷基-丙烯酰胺和N,N-二甲基-丙烯酰胺共聚物的凝胶(Materials Science andEngineering C(2000)13,117-121)。
在某些实施方式中,另外的物质(例如水凝胶)被固定在表面(例如塑料、金属或准金属的表面)的凹部壁上(上文中),所述另外的物质与具有所述非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分的分子偶联,或者所述另外的物质中含有具有所述非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分的分子。作为示意性的实例,水凝胶可以覆盖凹部(如多孔板的孔的周壁)的局部。所述水凝胶可部分占据由所述凹部限定的空间。因此,凹部可被限定为其中可填充例如流体(如液体),所述凹部部分地或全部地由水凝胶的周壁限定。
在这样的实施方式中,具有非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分的分子的第二局部可包含于所述水凝胶中。该局部可具有可比的极性或在结构上类似于所述水凝胶。所述具有非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分的分子的第二局部可具有允许产生非共价相互作用(如疏水相互作用、离子相互作用或氢键)的极性,从而使所述水凝胶的聚合物与具有非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分的分子偶联。在某些实施方式中,所述具有非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分的分子包含于所述水凝胶中。例如,它可包含于限定了所述水凝胶的聚合物中。在某些实施方式中,所述具有非极性部分的分子是限定了水凝胶的聚合物,且所述非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分可为该聚合物的侧链。该侧链或该侧链的局部可被整合到囊泡的周膜内。
所述具有非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分的分子的其余局部(即,除了所述非极性部分之外的局部)可包含任意所需的化学实体。在某些实施方式中,该其余局部为以下化学实体之一的局部或包含以下化学实体之一的局部:肽(例如硫肽)(包括如蜂毒肽和短杆菌肽)、蛋白、PEG、糖部分、硅烷部分、硅烷/硫醇部分、聚合物部分(如聚亚乙基亚胺、聚环氧乙烷部分、或聚乙基噁唑啉-stat-亚乙基亚胺聚合物部分)或脂质。肽局部例如可用于限定栓系脂质膜或两亲聚合物膜的亲水性间隔分子。例如,适宜的肽部分的长度为约3个到约100个氨基酸,如约4个到约30个,如约5个到约25个或约15个到约20个氨基酸。所述肽部分如在其末端可包含半胱氨酸残基。当使用金表面时,会发生由所述肽部分内的半胱氨酸的强的金-硫相互作用所引起的自组装。作为示意性的实例,肽部分可为或可包含α-层粘连蛋白亚基的19-mer的肽CSRARKQAASIKVAVSADR。例如,Sinner等给出了能作为表面和脂质膜间的间隔物的适宜的分子或分子部分的综述(ADVANCES IN CLINICAL CHEMISTRY(2009)49,159-179)。这些实例同样适用于本发明所使用的两亲聚合物膜。另一种可用于本发明的适宜的聚合物是两性的(amphilic)(表示具有极性部分和非极性部分的聚合物(其中后者可作为锚定物)),该两性聚合物例如可为如Knoll等在Reviews in Molecular Biotechnology 74,(2000),137-158中所记载的聚乙基噁唑啉-stat-亚乙基亚胺。
如上所述,在金表面的情况下,若将囊泡偶联至表面的分子中包含巯基,该巯基能够提供稳定的键合(linkage)。在所述表面为金属氧化物(如SiO2、Ta2O5和TiO2)或包含金属氧化物(如SiO2、Ta2O5和TiO2)的实施方式中,如硅烷氧化物可用于提供稳定的键合。
所述分子的非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分的局部包含于囊泡的周膜中,通过该分子将所述囊泡偶联至表面。因此,通过非共价相互作用,将该非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分的局部偶联至脂质的非极性局部或两亲聚合物的非极性局部。所述相互作用通常是疏水相互作用,并可包括溶剂化力、范德华相互作用以及卡西米尔相互作用。只要囊泡以及将所述囊泡偶联至表面的分子的非极性部分的各局部包含于极性溶剂中,特别是包含于含水介质中,通常这种非共价相互作用将不受影响。
所述囊泡可为固定化的,也就是说,在囊泡已经形成后偶联至表面。因此,制备如本发明所述的固定化囊泡可包括提供具有脂质周膜或两亲聚合物周膜的囊泡。如上所述,所述囊泡通过被偶联至表面的分子偶联到所述表面。这种具有非极性部分的分子在所述囊泡存在下与所述表面偶联。将所述分子偶联至表面可将该分子的非极性部分暴露。由于非极性部分的疏水性,特别是偶联在极性溶剂中进行时,该非极性部分具有整合到囊泡周膜中的趋势。在所述具有非极性部分的分子被整合到其它的物质(如水凝胶)中的某些实施方式中,这些其它的物质(例如所述水凝胶)可原位形成(例如表面上)。因此,在某些实施方式中,可在所述具有非极性部分的分子被偶联至表面时,将所述囊泡偶联至所述表面。在某些实施方式中,可在所述具有非极性部分的分子被偶联至表面后,将所述囊泡偶联至所述表面。
在某些实施方式中,本发明的系统包含表面,所述表面上固定化有多个囊泡。固定化在所述表面上的各个囊泡可具有相同的两亲聚合物的周膜。可利用相同的分子或不同的分子,将所述囊泡栓系至所述表面。在某些实施方式中,多个囊泡中的每个囊泡可通过具有非极性部分的分子偶联(包括结合)至表面,所述具有非极性部分的分子与其它囊泡所借助的其它分子(包括任意其它分子)中的各分子具有相同的结构,其它囊泡借助所述其它分子偶联至表面。在某些实施方式中,相同结构的分子将多个囊泡中的每个囊泡偶联到所述表面。当多个囊泡被固定化在表面上时,所述囊泡可按任意所需的顺序或样式排列。它们可随机地分布于整个表面,或仅排列在表面的一个或多个局部上。多个囊泡的囊泡可具有相同的、至少基本上相同的、类似的、或不同的膜规格和膜宽度。
在某些实施方式中,提供了能够形成水凝胶的一种或多种单体。可由所述一种或多种单体形成水凝胶。将所述具有非极性部分的分子在所述囊泡存在下偶联至所述表面还可包括由所述一种或多种单体形成水凝胶。作为所述水凝胶形成的结果,所述具有非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分的分子的第一局部可被整合到固定化囊泡的周膜中,第二局部可包含于所述水凝胶中(上文中)。如前所述,所述非极性脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分或芳基脂肪族部分可包含所述分子中的、被整合到所述固定化囊泡周膜中的所述局部。
在某些实施方式中,膜蛋白与所述囊泡周膜结合,包括整合到所述囊泡周膜中。所述被结合/整合到所述囊泡周膜中的膜蛋白可为任意膜蛋白。它可为外周膜蛋白或内在膜蛋白。在某些实施方式中,它可具有一个或多个跨膜域。具有跨膜域的适宜的膜蛋白的实例包括但不限于G蛋白偶联受体,如气味受体,视紫红质受体,视紫红质信息素受体,肽激素受体,味觉受体,GABA受体,阿片受体(opiate receptor),5-羟色胺受体,Ca2+受体,感光视蛋白(melanopsin),神经递质受体,如配体门控受体,电压门控受体或机械门控受体,包括以下神经递质的受体:乙酰胆碱、烟碱、肾上腺素、去甲肾上腺素、儿茶酚胺、左旋多巴(L-DOPA),多巴胺以及5-羟色胺(生物胺,内啡肽/脑啡肽)神经肽受体,促离子型受体(ionotropic receptor)如谷氨酸受体,受体激酶如丝氨酸/苏氨酸激酶,酪氨酸激酶,膜孔蛋白/通道如氯化物通道,钾通道,钠通道,OMP蛋白,ABC转运体(ATP结合盒转运体)如氨基酸转运体,Na-葡萄糖转运体,Na+/碘化物转运体,离子转运体如细胞色素C氧化酶,Na/KATP酶,H/K ATP酶,Ca ATP酶,细胞粘附受体如金属蛋白酶,整联蛋白或钙粘蛋白(catherin)。
所述膜蛋白可通过无细胞表达系统与所述周膜结合,包括在可适用的时候被整合到所述周膜中。所述无细胞表达系统允许编码所选择的膜蛋白的核酸被转录和翻译。因此,所选择的膜蛋白在原位形成且立即并入周膜中。这种无细胞表达系统通常是体外转录和翻译系统。在某些实施方式中,将真核无细胞提取物作为表达系统。适宜的表达系统是可商购的,例如Promega的TNT转录/翻译偶联系统。在某些实施方式中,使用原核无细胞表达系统(例如Roche Applied Science生产的RTS 100E.coli hy kitTM)或古细胞无细胞表达系统。
本文所使用的术语“核酸分子”指的是任意可能构型的核酸,如单链的、双链的或它们的组合。核酸包括例如DNA分子、RNA分子、利用核苷酸类似物或核酸化学产生的DNA或RNA类似物、锁核酸分子(LNA)、PNA分子(上文中)和tecto-RNA分子(例如Liu,B.等,J.Am.Chem.Soc.(2004)126,4076-4077)。PNA分子是具有假肽骨架的合成的核酸类似物,其中,存在于例如DNA或RNA中的磷酸二酯骨架被具有氨基末端和羧基末端的短的脂肪族部分的重复单元替换,在寡聚物或聚合物中形成酰胺键。LNA分子具有被修饰的、带有位于C4′和O2′之间的亚甲基桥的RNA骨架,亚甲基桥锁定了呋喃糖环的N构型,为各个分子提供了更高的双链稳定性和核酸酶耐受性。与PNA分子不同,LNA分子具有带电骨架。DNA或RNA可来自于基因组的或合成的,可为单链或双链的。所述核酸可为例如mRNA、cRNA、合成的RNA、基因组DNA、cDNA、合成的DNA、DNA和RNA的共聚物、寡核苷酸等。此外,各核酸还可包含非天然的核苷酸类似物和/或与亲和标签或标记连接。
膜蛋白与所述周膜的结合包括它的整合/并入可通过本领域中可用的任意适宜的检测方法进行监测。作为示意性的实例,可通过表面等离子体共振光谱学来实时监测,所述表面等离子体共振光谱学可与表面等离子体增强荧光光谱学结合应用(综述见Wiltschi,B等,Methods 39(2006)134-146)。
在某些实施方式中,膜蛋白与将要进行测定法或筛选方法的囊泡的周膜结合或被整合到周膜中。举例来说,可期望鉴定出能够调节(如刺激或抑制,包括阻断)膜蛋白的化合物。可表达各膜蛋白(可为任意膜蛋白),并将其结合或整合到如本发明所述的固定化囊泡的周膜中。若已知膜蛋白的可测效应(如细胞应答)时,可将完成这一应答所需的元件整合到所述囊泡中。在膜蛋白对外部分子具有应答性的实施方式中,所述膜蛋白可被称为受体蛋白。环境中相应的分子可与该受体蛋白形成复合物。因此,所述受体蛋白可经历从活性状态到非活性状态的变化(如构象变化),反之亦然。作为第一个步骤,可期望鉴定出能够与这一受体蛋白形成复合物的化合物。一旦鉴定到这种复合物,就可通过例如表达效应蛋白并将该效应蛋白整合到囊泡中对细胞效应进行分析。然后可确定所述效应蛋白产生的是刺激作用或抑制作用。
与二维系统相比(例如WO 2007/048459中的系统),本发明的构造利用固定化囊泡提供了更大的表面区域,膜蛋白可被结合到该表面区域。基于红外技术,这对例如优化传感应用的信噪比具有重要性,且对结构解析方法具有潜在价值。
在某些实施方式中,结合有或整合有膜蛋白的固定化囊泡可用于对调节膜蛋白功能有用的潜在化合物进行体外筛选,包括利用自动化工作站在多孔板微板上对化合物文库进行同步筛选。
在某些实施方式中,确定了候选化合物和膜受体蛋白间是否形成复合物。在该实施方式中,可提供结合有/整合有膜受体蛋白的固定化囊泡。使候选化合物与所述囊泡接触,从而与所述膜受体蛋白接触。例如可在加入候选化合物的水溶液中提供所述囊泡。随后检测复合物的形成。在某些实施方式中,候选化合物具有标记,如放射性标记或感光性标记(例如发光标记),使得可以在例如洗脱步骤后进行复合物的检测(本领域的标准程序)。测定上述复合物形成的其它实例例如可依赖于光谱学手段、光化学手段、光度测量手段、荧光测量手段、放射学手段、酶手段或热力学手段。光谱学检测方法的实例是荧光相关光谱法(Thompson NL等,Curr Opin Struct Biol.12(5),2002,634-641)。光化学方法是例如光化学交联(Steen H,Jensen ON,Mass Spectrom Rev.21(3),2002,163-182)。光度测量、荧光测量、放射学及酶检测方法的实例分别为感光标记、荧光标记、放射性标记或酶标记的使用(综述见:Rippe RA等,Methods MolBiol.160,2001,459-479)。热力学检测方法的实例是等温滴定热量测定法(ITC,综述见Velazquez-Campoy A等,Methods Mol Biol.261,2004,35-54)。这些方法中的一些方法可包括额外的分离技术,如电泳或HPLC。标记应用的实例包括结合有酶的作为探针或抗体的化合物,该酶所催化的反应产生可检测的信号。利用放射性标记和电泳分离的方法的实例为电泳迁移率变动分析法。
在某些实施方式中,各方法可为对能够调节(细胞的)受体蛋白功能的化合物进行体外鉴定的方法。所述受体蛋白能够诱导已知的细胞应答。该方法包括提供如上所述的固定化囊泡。所述固定化囊泡包含膜蛋白。该膜蛋白与所述固定化囊泡的两亲聚合物周膜或脂质周膜结合。所述膜蛋白是能够诱导已知的细胞应答的细胞受体蛋白。所述方法包括将所述固定化囊泡与候选化合物接触。怀疑所述候选化合物调节该细胞受体蛋白的功能。所述方法还包括检测该已知的细胞应答。
整合到所述囊泡周膜中的各膜蛋白也可为离子通道、离子转运体或促离子型受体。可以测定候选化合物是否能够调节离子通道或离子转运体蛋白的功能。在这种实施方式中,所述囊泡的内腔相中可含有对离子的存在敏感的指示剂,所述离子通道/转运体蛋白能够允许该离子通过。在某些实施方式中,所述离子通道或转运体对该离子有选择性。具有所述离子通道/转运体蛋白的固定化囊泡可与候选化合物接触(上文中)。例如可以通过上述的指示剂方法检测离子进出所述固定化囊泡的通路。
在某些实施方式中,上述鉴定(候选)化合物的方法中的一种还可包括对细胞应答的检测(包括测量)结果进行比较。例如,所述结果可与对照测量相比较。对于各对照测量,可使用已知不影响细胞受体蛋白功能的化合物。在典型的实施方式中,与对照测量相比,改变的细胞应答表明候选化合物能够调节细胞受体蛋白的功能。
在分析离子通道、离子泵、离子转运体或促离子型受体的功能的实施方式中,可利用对照实验来分析所用固定化囊泡的完整性。通过对离子敏感的指示剂(包括对各离子通道、离子泵或离子转运体而言具有特异性的离子敏感的指示剂),可以方便地检测到渗漏通过所述固定化囊泡的聚合物膜的离子。
在某些实施方式中,各方法可为对与膜蛋白(例如受体、离子通道或离子转运体蛋白)的功能尤其相关的膜蛋白的局部(例如膜蛋白的域或氨基酸)进行体外鉴定的方法。作为示意性的实例,可在可比的或相同的条件下,通过所述固定化囊泡对感兴趣的膜蛋白突变体进行比较。在某些实施方式中,可并行分析多个这样的突变体。例如,可比较所述膜蛋白在执行其生物学功能(例如允许通过的离子的量)方面的能力,包括比较所述膜蛋白在执行其生物学功能时对环境条件(例如温度、pH、离子浓度等)的敏感度。在一个实施方式中,可检查通过体外合成产生的膜蛋白文库(包括单个蛋白的变体文库)。
对于某些如本发明所述的候选化合物的鉴定方法的实施方式,可使用文库形式的候选化合物。这种文库的实例为:化学合成的、作为模型化合物的多种小的有机分子的集合;或包含大量序列变体的核酸分子的集合。如本发明所述的化合物的鉴定方法可作为筛选方法(包括高通量的方法)进行。在各方法中,例如可对化合物文库进行筛选,以鉴定能够与膜蛋白(如受体蛋白)形成复合物的候选化合物。在根据本发明的方法对多个候选化合物进行分析以鉴定能够调节膜蛋白功能的化合物的实施方式中,这种实施方式通常被称为筛选方法。可对这些候选化合物进行彼此独立的分析,例如同时地、接连地或以任何异相(out of phase)的方式进行。在某些实施方式中,分析多个候选化合物的任意数量的步骤都可通过例如如可商购的机器人自动地并重复地进行。基于这一目的,可采用任意数量的自动化装置,例如自动化读出系统、移液机器人、漂洗机器人或全自动化筛选系统。作为示意性的实例,该方法可为例如利用一个或多个自动化工作站在多孔微板(例如传统的48孔、96孔、384孔或1536孔板)中进行的体外筛选方法。因此,在某些实施方式中,本发明提供高通量筛选的方法。
在某些实施方式中,本发明所述的固定化囊泡可作为脂质体的稳定的替代物,可并入与表面结合的构造中,所述构造包含通过两亲聚合物锚定到载体基质上的囊泡。这种构造可用作进行膜蛋白详细功能分析的生化反应室。特别是,将膜蛋白体外插入到囊泡/球状构造中提高了“活性物质”(如蛋白部分)的含量。基于红外技术,这使得能够优化信号应用中的信噪比,并在结构解析方法中具有潜在价值。这种构造的其它应用包括但不限于基于与特异性受体结合的生物化学传感器。作为示意性的实例,基于气味的传感器可包含多个带有各自气味受体的固定化囊泡。本发明的囊泡还可被固定在待应用于体内的基板上。所述囊泡的内腔中可包含在特定组织信号下释放的药物活性化合物,从而允许触发药物递送。基于一种或多种固定化囊泡的构造还可用于食物质量或水质测试。作为另外的实例,一种或多种固定化囊泡可应用于病原体检测。作为其它的实例,染料或纳米晶体(如量子点)可被并入到固定化囊泡的内腔中,从而例如有利于检测。
此前在本领域中使用的作为蛋白嵌入材料的基于磷脂的膜(图1)所存在的固有困难可通过利用合成材料(如与体外合成的复合膜蛋白相容的嵌段共聚物)来弥补。所述包含聚合材料的囊泡结构适合于工业方法开发,并对机械的、化学的以及微生物的侵害具有稳定性。此外,这种囊泡易于储藏和运输。
所提议的构造提供的其它显著优点包括但不限于以下方面:1)在含水环境和气体环境、有机溶剂及多种环境条件(如温度变化和微生物侵害)中具有功能的稳固平台。2)用于构建各构造的稳固的制备方法。3)与如下的并行读出策略具有相容性:电化学阻抗或电流测定法、场效应/CMOS晶体管电流调制测定法、光学厚度测定法、利用表面声学或机械振动装置的调频测定法以及通过抗体结合的生物化学传感。4)通过利用膜蛋白来完成对膜蛋白的高通量合成以及传感的能力。
此外,本发明提供了用于膜蛋白合成的基于多孔板的平台的用途。将多孔板官能化以作为基质,并结合了两亲聚合物作为锚定物。如图2所示,所述聚合囊泡锚定到基质上。这种构造纳入了所栓系的生物膜以及作为生物化学反应器的聚合物囊泡的有利特征。
为了使本发明可容易理解并产生实际效果,将通过下列非限制性实施例的方式描述具体的实施方式。
实施例
实施例1:聚合物囊泡的制备
聚丁二烯-聚环氧乙烷(PB21-PEO12)二嵌段共聚物由Jan van Hest教授(Radboud University Nijmegen,Netherlands)友情提供。
将10mg PB21-PEO12二嵌段共聚物溶于300μl THF中,然后加入到700μl的MilliQ H2O中。采用50,000MW的即用膜(Spectrum Labs),利用MilliQ H2O对所述溶液透析24小时。
实施例2:多孔板上的锚定的聚合物囊泡的制备
根据Hara等人所述的方法(Supramolecular Science(1998)5,777-781),以99∶1的摩尔比合成十八烷基丙烯酰胺和N,N-二甲基丙烯酰胺(聚合物A)。使用BD Biosciences的Microtiter板。
制备含有或不含聚合物A的丙烯酰胺溶液(3.5ml的50mM Tris-HCl(pH 7.2),0.5ml的40%丙烯酰胺,5μl的N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED),35μl的过硫酸铵(APS))。在Microtiter板的每孔中加入100μl上述溶液。在丙烯酰胺聚合前,在这些孔中加入75μl实施例1中制备的聚合物囊泡。为使聚合物囊泡均匀散布在聚丙烯酰胺凝胶上,将Microtiter板在室温下轻轻振摇两个小时。为除去未锚定的聚合物囊泡,将Microtiter板的孔用MilliQ水漂洗若干次。
实施例3:钙黄绿素渗漏测定法
为了研究膜蛋白对聚合物囊泡的插入(所述聚合物囊泡嵌入在Microtiter板的孔上),以自猝灭的浓度将钙黄绿素包封于所述聚合物囊泡中。图3说明了该方案的概要。这种基于钙黄绿素的测定法提供了测试球状结构完整性的快速测定法。标准的基于钙黄绿素的测定法可用于测试聚合物体的完整性。
将30mM钙黄绿素包封于所述聚合物体内。采用50,000MW的即用膜(Spectrum Labs),用MilliQ H2O对所述溶液透析24h,以去除未包封的钙黄绿素,并将所述聚合物体结合在聚丙烯酰胺基质上。将这种包封有钙黄绿素的聚合物囊泡加入到所述微量滴定板,在室温下轻轻地振摇,使之锚定到所述聚丙烯酰胺基质上。孵育后,用MilliQ水漂洗所述微量滴定板,以去除未结合的聚合物囊泡。在所述包含具有钙黄绿素的聚合物囊泡的Microtiter板的孔中,加入20μl的α-溶血素单体溶液(NaCl/MOPS缓冲液中,0.5mg/ml),该α-溶血素是一种孔形成蛋白。
通过Tecan荧光读板仪(激发波长495nm,发射波长515nm)监测由聚合物囊泡膜中的孔形成所引起的聚合物囊泡中钙黄绿素的渗漏。如图4所示,在聚合物囊泡中加入α-溶血素可引起钙黄绿素从聚合物囊泡高浓度(自猝灭)的内腔扩散到外部,从而引起荧光强度提高。通过加入(NaCl/MOPS)缓冲液完成对照反应,证实荧光强度并未提高。
实施例4:将膜蛋白体外合成到嵌段共聚物囊泡中
研究了作为模型膜蛋白的气味受体5蛋白(OR5蛋白)。为使OR5表达(cDNA由Max-Planck Institute,Mainz提供),按照供应商的方案(Robelek 2007),准备利用‘T7 TNT Quick’体外无细胞混合物的反应。将反应混合物加入到所述微量滴定板中,30℃孵育90min。反应后,用PBS充分漂洗板的孔。制备PB-PEO囊泡,将其固定化于Microtiter板上。在分离的孔中进行三种不同的测试:1)在有PB-PEO囊泡的孔中加入含有OR5的cDNA的‘T7TNT Quick coupled’体外反应混合物;2)在不含PB-PEO囊泡的孔中加入含有cDNA的‘T7TNT Quick coupled’体外反应混合物;3)在含有聚合物囊泡的孔中加入没有cDNA的‘T7TNTQuick coupled’体外反应混合物。
图5说明了体外合成的膜蛋白并入锚定的聚合物囊泡的简图,所述聚合物囊泡锚定在Microtiter孔中的基质上。在体外混合物孵育后,将Microtiter板用抗vsv一抗以及缀合有Cy5的抗小鼠二抗进行免疫染色。用PBS洗去非特异性结合的二抗,然后在波长(激发波长650nm/发射波长680nm)下检测特异性结合的抗体的荧光强度。图6显示了有OR5cDNA的样品的荧光强度高于没有OR5cDNA的样品的荧光强度。
此外,如图7所示,有cDNA而没有聚合物囊泡的样品显示出较低的免疫染色强度,说明所述聚合物囊泡对于OR5的合适取向是必需的。然而,图8和图9说明,在蛋白印迹上,有cDNA的所有样品均显示出各自分子量的条带,而没有cDNA的对照未显示出条带。
由此证实了本发明的下列方面:
a)通过PB-PEO嵌段共聚物可形成囊泡并可结合在表面上;
b)膜蛋白可并入所述囊泡中;
c)将膜蛋白直接体外合成到所述聚合物囊泡上是可能的。
这种方法使得能够进行由体外合成产生的膜蛋白突变文库的筛选。此外,所有步骤(合成、点样和读出)都能够通过基于机器人的移液、微流体及合适的读出策略(电子学和/或光学)而与自动化完全兼容。
如实施例3中所示范的钙黄绿素的包封能够被氧化还原电势染料替代,该氧化还原电势染料随后与合成并插入到所述聚合物囊泡壁上的膜蛋白相互作用。这使得能够开发出类似于pH试纸/染料的颜色变化的传感器。
实施例4:荧光测定法
为了验证OR5的表达,用含有2%(w/v)BSA的PBS稀释抗-vsv一抗和缀合有Cy5的抗小鼠二抗,将其加入到所述微量滴定板中。各个步骤之后,用PBS漂洗Microtiter板,去除非特异性抗体。在激发波长(650nm)和发射波长(680nm)下读取Microtiter板,分析二抗的存在。
除了荧光测定法外,将样品上样至SDS聚丙烯酰胺凝胶,并按照供应商(Invitrogen)的蛋白印迹方案进行免疫蛋白印迹。
本申请文件中对在先公开的文件的列举或讨论均不应被认为是承认所述文件是本领域中现有技术的一部分或公知常识。
本文所述的发明可适宜地在缺少本文未特别公开的任意单个要素或多个要素、单个限制因素或多个限制因素时加以实施。因此,例如,术语“包含/包括/含有”(comprising/including/containing)等应该开放地及非限制性地理解。此外,本文使用的术语和表述被用作描述性的术语,而非限制性的术语,所述术语和表述的使用并不旨在排除这些术语和表述显示或记载的特征的任何等同特征或其一部分,但是应该认识到,在本发明请求保护的范围内的任何修改都是可以的。因此,应当明白,尽管已通过优选的实施方式和可选的特征具体公开了本发明,本领域技术人员仍可以采用此处所公开的其所包含的本发明的修改和变化,并且这些修改和变化被视为落入本发明的范围内。
本文已经对本发明进行了宽泛和一般性的描述。落入该一般性公开内容的每种范围较窄的形式和下位群组也构成本发明的一部分。这包括了利用但书和否定式限定从大类中排除了任何主题的本发明的上位说明,无论本文中是否对所排除的材料进行了具体叙述。
其它实施方式也落入下述权利要求和非限制性实施例内。此外,一旦本发明的特征和方面是以马库什组的方式进行描述,本领域技术人员将认识到,本发明也因此将以马库什组中任意的单个成员或成员亚组的方式进行描述。
Claims (33)
1.包含表面的囊泡系统,所述表面上固定化有囊泡,
所述固定化囊泡具有两亲聚合物周膜,通过具有非极性部分的分子将所述囊泡偶联至表面,所述非极性部分为脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分和芳基脂肪族部分中的一种;
其中,所述非极性部分包含3到30个碳原子和0到12个杂原子的主链,所述杂原子选自Si、O、S和Se;
其中,通过共价键或非共价键将所述具有非极性部分的分子偶联至所述表面;以及
其中,所述非极性部分的局部被整合到所述固定化囊泡的周膜中。
2.如权利要求1所述的囊泡系统,其中,所述非极性部分为直链的。
3.如权利要求1或2所述的囊泡系统,其中,所述具有非极性部分的分子具有第一局部和第二局部,所述第一局部被整合到所述固定化囊泡的周膜中,所述第二局部包含于水凝胶中;
其中,所述非极性部分包含所述分子中的、被整合到所述固定化囊泡周膜中的所述第一局部。
4.如权利要求3所述的囊泡系统,其中,将所述水凝胶连接至所述表面。
5.如权利要求1或2所述的囊泡系统,其中,所述两亲聚合物具有低于环境温度的玻璃化转变温度。
6.如权利要求1或2所述的囊泡系统,其中,所述两亲聚合物包含羧酸、酰胺、胺、亚烷基、二烷基硅氧烷、醚和烯化硫中的至少一种单体单元。
7.如权利要求6所述的囊泡系统,其中,所述两亲聚合物为二嵌段共聚物或三嵌段共聚物,其中,所述二嵌段共聚物为A-B的形式,所述三嵌段共聚物为A-B-A或A-B-C的形式。
8.如权利要求7所述的囊泡系统,其中,所述两亲聚合物包含聚醚嵌段,所述聚醚嵌段选自寡聚氧乙烯嵌段、聚氧乙烯嵌段、寡聚氧丙烯嵌段、聚氧丙烯嵌段、寡聚氧丁烯嵌段和聚氧丁烯嵌段。
9.如权利要求8所述的囊泡系统,其中,所述两亲聚合物为聚丁二烯-聚环氧乙烷二嵌段共聚物。
10.如权利要求1或2所述的囊泡系统,其中,所述表面为金属表面、金属氧化物表面、准金属表面、准金属氧化物表面、塑料表面及这些表面的组合。
11.如权利要求1或2所述的囊泡系统,其中,所述固定化囊泡包含与所述固定化囊泡的两亲聚合物周膜结合的膜蛋白。
12.如权利要求11所述的囊泡系统,其中,所述膜蛋白的局部被整合到所述固定化囊泡的周膜中。
13.形成如权利要求1-12中任一项所述的囊泡系统的方法,所述方法包括:
-提供具有两亲聚合物周膜的囊泡;
-提供具有非极性部分的分子;
所述非极性部分为脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分和芳基脂肪族部分中的一种,
其中,所述非极性部分包含3到30个碳原子和0到12个杂原子的主链,所述杂原子选自Si、O、S和Se,
-提供表面;
-在极性溶剂中,将所述具有非极性部分的分子在所述囊泡存在下偶联至所述表面,从而将所述非极性部分的局部整合到所述固定化囊泡的周膜中。
14.如权利要求13所述的方法,其中,所述极性溶剂为含水介质。
15.如权利要求14所述的方法,该方法还包括:
-提供能够形成水凝胶的一种或多种单体,
其中,将所述具有非极性部分的分子在所述囊泡存在下偶联至所述表面还包括由所述一种或多种单体形成水凝胶,由此,所述具有非极性部分的分子的第一局部被整合到所述固定化囊泡的周膜中,第二局部包含于所述水凝胶中,其中,所述非极性部分包含所述分子中的、被整合到所述固定化囊泡周膜中的所述第一局部。
16.形成结合有膜蛋白的固定化囊泡的方法,所述方法包括:
-提供如权利要求1-10中任一项所述的囊泡系统中的固定化囊泡;以及
-在适宜编码所述膜蛋白的核酸分子转录和翻译的条件下,将所述固定化囊泡与无细胞表达系统和所述核酸分子接触,由此,所述膜蛋白原位形成并与所述囊泡的两亲聚合物周膜结合。
17.如权利要求16所述的方法,其中,所述膜蛋白具有能够被整合到生物膜中的局部,其中,所述局部能够被整合到所述固定化囊泡的周膜中。
18.如权利要求17所述的方法,其中,所述膜蛋白为跨膜蛋白。
19.一种对能够与膜受体蛋白形成复合物的化合物进行体外鉴定的方法,所述方法包括:
-提供如权利要求11或12所述的囊泡系统,其中,所述膜蛋白为所述膜受体蛋白;
-使所述固定化囊泡与候选化合物接触,所述候选化合物被怀疑能够与所述膜受体蛋白形成复合物;以及
-检测所述复合物的形成。
20.一种对能够调节离子通道蛋白功能的化合物进行体外鉴定的方法,其中,所述离子通道蛋白能够允许已知离子通过,所述方法包括:
-提供如权利要求11或12所述的囊泡系统,其中,所述膜蛋白为所述离子通道蛋白;
-使所述固定化囊泡与候选化合物接触,所述候选化合物被怀疑调节所述离子通道蛋白的功能;以及
-检测离子进出所述固定化囊泡的通路。
21.形成结合有膜蛋白的囊泡的方法,所述方法包括:
-提供具有两亲聚合物周膜的囊泡,
所述聚合物包含具有非极性部分的分子,其中,所述分子的所述非极性部分的局部被整合到所述囊泡的周膜中,其中,所述具有非极性部分的分子能够通过共价键或非共价键将所述囊泡偶联至表面,
所述非极性部分为脂肪族部分、脂环族部分、芳香族部分和芳基脂肪族部分中的一种,
其中,所述非极性部分包含3到30个碳原子和0到12个杂原子的主链,所述杂原子选自Si、O、S和Se;
以及
-在适宜编码所述膜蛋白的核酸分子转录和翻译的条件下,将所述囊泡与无细胞表达系统和所述核酸分子接触,由此,所述膜蛋白原位形成并与所述囊泡的两亲聚合物周膜结合。
22.如权利要求21所述的方法,其中,所述膜蛋白的局部被整合到所述囊泡的两亲聚合物周膜中。
23.如权利要求21或22所述的方法,其中,所述无细胞表达系统选自由真核无细胞表达系统、原核无细胞表达系统及古细胞无细胞表达系统组成的组。
24.如权利要求21或22所述的方法,其中,所述膜蛋白包含跨膜蛋白。
25.如权利要求24所述的方法,其中,所述跨膜蛋白选自由G蛋白偶联受体、视紫红质受体、视紫红质信息素受体、肽激素受体、味觉受体、GABA受体、阿片受体、5-羟色胺受体、Ca2+受体、感光视蛋白、神经递质受体、电压门控受体或机械门控受体、生物胺、神经肽受体、促离子型受体、受体激酶、酪氨酸激酶、膜孔蛋白/通道、钠通道、OMP蛋白、ABC转运体、离子转运体、孔形成毒素及细胞粘附受体组成的组。
26.如权利要求25所述的方法,其中,所述生物胺为多巴胺或5-羟色胺。
27.如权利要求21或22所述的方法,其中,所述两亲聚合物具有低于环境温度的玻璃化转变温度。
28.如权利要求21或22所述的方法,其中,所述两亲聚合物包含羧酸、酰胺、胺、亚烷基、二烷基硅氧烷、醚和烯化硫中的至少一种单体单元。
29.如权利要求28所述的方法,其中,所述两亲聚合物为二嵌段共聚物或三嵌段共聚物,其中,所述二嵌段共聚物为A-B的形式,所述三嵌段共聚物为A-B-A或A-B-C的形式。
30.如权利要求29所述的方法,其中,所述两亲聚合物包含聚醚嵌段,所述聚醚嵌段选自寡聚氧乙烯嵌段、聚氧乙烯嵌段、寡聚氧丙烯嵌段、聚氧丙烯嵌段、寡聚氧丁烯嵌段和聚氧丁烯嵌段。
31.如权利要求30所述的方法,其中,所述两亲聚合物为聚丁二烯-聚环氧乙烷二嵌段共聚物。
32.由权利要求21-31中任一项所述的方法得到的结合有膜蛋白的囊泡。
33.如权利要求32所述的结合有膜蛋白的囊泡在药物筛选中的用途。
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