KR102650153B1 - 블록 공중합체로부터 형성된 베지클, 및 신규 블록 공중합체 - Google Patents

블록 공중합체로부터 형성된 베지클, 및 신규 블록 공중합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 블록 공중합체로부터 베지클 형성, 및 새로운 불록 공중합체에 관한 것으로, 적어도 하나의 (폴리)-2-C1-3 알킬-2-옥사졸린 ((poly)2-C1-3alkyl-2-oxazoline block))및 적어도 하나의 폴리부타디엔을 포함하는 블록 공중합체로부터 형성된 베지클; 및 그러한 베지클을 포함하는 멤브레인. 적어도 하나의 (폴리)-2-C1-3 알킬-2-옥사졸린 ((poly)2-C1-3alkyl-2-oxazoline block))및 적어도 하나의 폴리부타디엔 블록을 포함하는 블록 공중합체는, 공중합체가 40 부타디엔 유닛트 및 190 2-메틸-2-옥사졸린 유닛트으로 구성된 디불록 공중합체가 아닌 한 신규한 것이며, 및 또한 본 발명의 일부를 구성한다.

Description

블록 공중합체로부터 형성된 베지클, 및 신규 블록 공중합체
본 발명은 블록 공중합체로부터 만들어진 베지클에 관한 것으로, 특히 부타디엔 및 2-C1-3알킬-2-옥사졸린의 블록 공중합체로부터 형성된 베지클에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 베지클로부터 형성된 막에 관한 것이다. 대부분의 폴리 부타디엔/(폴리)2-C1-3알킬-2-옥사졸린 블록 공중합체는 새로운 것이며, 이들 신규 블록 공중합체 또한 본 발명의 한 부분에 포함된다.
자연에서 베지클 및 세포는 양친매성 지질로 구성되고 콜레스테롤에 의해 지지 되는 나노-용기이다. 양친매성 블록 공중합체는 인공 베지클의 생산에 사용되는 합성 대체물로서 연구되어 왔다, 그러나 연구되어 온 블록 공중합체의 수는 매우 적으며, 주로 (폴리)2-메틸-옥사졸린(PMOXA)/폴리(디메틸실록산)(PDMS); 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)/PMOXA; 및 PEG/ 폴리부타디엔(PB)의 공중합체에 집중되어 있다.
WO 00/37541는 친수성 부분과 소수성 부분으로 구성된 신규 블록 공중합체인 것과 관련 되는것 인 반면에, US 6,916,488는 양친매성 블록 공중합체로부터 만들어진 베지클을 공시한다. US 6,916,488 에서 보여주는 베지클은 약물전달을 위해 또는 나노반응기로서 사용될 수 있으며, 및 이 벽에 병합된 막 단백질들을 갖을 수도 있다; 공중합체는 AB 또는 ABA 블록 공중합체가될 수 있으며, 이때 A 와 B 중 하나는 친수성이고 다른 하나는 소수성이다. US 6,916,488의 저자들은 A 와 B로 가능한 다양한 후보들에 대해 언급하고 있으나, 예를 든 폴리머는 단지 폴리(2-메톡사졸린)-폴리(디메틸실록산)-폴리(2-메톡사졸린)뿐이다. US 6,723,814 는 양친매성 공중합체로부터 만들어진 평면 멤브레인에 관한 것이다. US 2008/0305149는 약물의 점막전달을 위해 점막부착성 그룹을 가진 블록 공중합체 베지클의 용도를 공시하고 있다.
WO 2004/011600 는 다른 모든 오염물질은 제외하고 단지 물만 통과시키는 멤브레인을 형성하기 위해 세개-블록 공중합체에 아쿠아포린 (aquaporins)이 병합될 수 있음을 공시한다. 이 공시 이래, 막 통과 단백질을 병합한 멤브레인을 개발하기 위해 많은 연구가 수행되었으며, 이들 중 몇몇은 블록 공중합체 베지클을 사용하려고 시도 하였다. 예를 들어, WO 2013/043118 는 아쿠어포린을 포함하든 아니든, 지지 멤브레인의 폴리아마이드 층에 박혀 있는 베지클의 용도를 공시한다. 공중합체는 PMOXA-PDMS-PMOXA 이거나 또는 여러 다른 공중합체 일수 있다, 즉, EO-PO, EO-Bd, EO-PDMS 및 EO-BO가될 수 있으며, 여기서 EO 는 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide), PO 는 프로필렌 옥사이드 (propylene oxide), Bd 는 부타디엔(butadiene), 및 BO 부틸렌 옥사이드 (butylene oxide)이다.
폴리에틸렌 글리콜 및 부타디엔의 양친매성 공중합체는 잘 알려져있으며, 예를 들어 M.A. Hillmyer and F.S. Bates, "Synthesis and Characterization of Model Polyalkane-Poly(ethyleneoxide) Block Copolymers", Macromolecules, 29, 6994 (1996)] 를 보시오. 그러나 이들은 많은 단점을 가지고 있다. 예를 들어, 에틸엔 옥사이드는 가스이어서 취급하기 어렵고, 가연성이고, 매우 독성이 있고 및 매우 제한적인 화합물이므로 특히 많은 양을 사용할 때는 취급하기 어렵다. 더 나아가 에틸렌 옥사이드를 기능화시키거나 또는 크로스-링크하기 쉽지 않다.
막스플랑크 연구소 콜로이드 및 경계연구소(Max Plank Institute for Colloid and Interface Research) 와 http://www.mpikg.mpg.de/48071/HORDYJEWICZ-BARAN_Dissertation 에서 구할 수 있는 포스담 대학 (University of Potsdam)의 Zofia Hordyjewicz-Baran의 박사학위 논문인 "친수성으로 수정된 폴리부타디엔의 합성 및 응집성에 대한연구 (Synthesis and Study of the Aggregation Behavior of Hydrophilically Modified Polybutadienes)" 에서는 친수성으로 수정된 폴리부타디엔의 호모폴리머 및 블록 공중합체에 대하여 서술하고 있다. 제조된 공중합체 중 히드록시기-말단의 PB40-b-PMOXA190 (Hydroxy-terminated PB40-b-PMOXA1900)공중합체가 있으며 이 공중합체는 폴리부타디엔 블록에 있는 이중결합과 반응하는 2-머르캅토에틸아민 하드로클로라이드(2-mercaptoethylamine hydrochloride)와 반응한다. 베지클이 이 공중합체로부터 만들어질 수 있거나 또는 만들어져야 한다는 제안은 없으며, 이 공중합체의 말단 그룹이 어떤 방법으로든 수정되어야 한다는 어떤 제안도 없다.
우리들은 적어도 하나의 (폴리)2-C1-3알킬-2-옥사졸린 블록, 및 적어도 하나의 폴리부타디엔 블록을 포함하는 블록 공중합체들, 및 특히 특정한 말단기들을 갖는 상기 블록 공중합체는 베지클 형성을 위해 사용될 때 및 멤브레인에서 많은 장점이 있다는 것을 발견했다. 특히, 블록 공중합체는 베지클을 매우 쉽게 형성한다; 베지클 크기를 맞추기 쉽고;베지클을 안정화하기 쉽고; 및 이 중합체들은 여러 범위의 반응을 하도록 쉽게 기능화 하게 할 수 있다. 더 나이가, 블록 공중합체의 투과성은 원천적으로 낮고, 아주 낮도록 조절도 가능하게 하여, 중합체를 예를 들어 약물들 및 화장품들을 포함하는 물질들을 전달하는 베지클에 사용 및 멤브레인에 사용하는 것을 포함하는 여러 가지로 응용하는데 유용하도록 한다.
본 발명의 목적은 적어도 하나의 (폴리)2-C1-3알킬-2-옥사졸린 블록, 및 적어도 하나의 폴리부타디엔 블록을 포함하는 블록 공중합체, 및 특히 특정한 말단기들을 갖는 상기 블록 공중합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 블록 공중합체를 포함하는 베지클, 및 멤브레인을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 블록 공중합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 베질클, 및 멤브레인의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 적어도 하나의 (폴리)2-C1-3알킬-2-옥사졸린 ((poly)2-C1-3alkyl-2-oxazoline )) 블록 및 적어도 하나의 폴리부타디엔 블록을 포함하는 블록 공중합체들로부터 베지클을 형성함을 제공한다.
이때, 적어도 하나의 (폴리)2-C1-3알킬-2-옥사졸린 블록 및 적어도 하나의 폴리부타디엔 블록을 포함하는 대부분의 블록 공중합체들은 신규 한 것이다.
본 발명은 더 나아가 이 신규 블록 공중합체들 그 자체를 제공한다.
특히, 본 발명은 이 중합체가, 40개 부타디엔 단량체 및 히드록시기그룹으로 말단의 190개 2-메틸-2-옥사졸린 단량체로 구성된 디블록 중합체가 아닌, 즉 히드록시기-말단의 PB40-b-PMOXA190 (hydroxy-terminated PB40-b-PMOXA190)디블록 중합체가 아닌 중합체인 한, 적어도 하나의 (폴리)2-C1-3알킬-2-옥사졸린 블록 및 적어도 하나의 폴리부타디엔 블록을 포함하는 블록 공중합체를 제공한다.
본 발명에 따른 블록 공중합체는 베지클을 매우 쉽게 형성한다. 또한, 베지클 크기를 조절하기 요이하고, 베지클을 안정화하기 쉽고, 및 이 중합체들은 여러 범위의 반응을 하도록 쉽게 기능화될 수 있다.
더 나이가, 본 발명의 블록 공중합체의 투과성은 원천적으로 낮고, 아주 낮도록 조절도 가능하게 하여, 중합체를 예를 들어 약물들 및 화장품들을 포함하는 물질들을 전달하는 베지클에 사용할 수 있고, 멤브레인에 사용하는 것을 포함하는 여러 가지로 응용하는데 유용하다.
도 1A 및 1B는 본 발명 베지클의 LSM 이미징 마이크로그래프이다.
도 2 및 도 3은 실시예 2 의 stopped-flow 실험의 결과를 보여 준다.
도 4는 실시예 2 의 DLS 실험의 결과를 보여준다.
도 5는 실시예 3 에서 서술된 바와 같은, 본 발명에 따른 베지클에 아쿠아포린 Z(Aquaporin Z) 단백질이 병합된 효과를 보여준다.
도 6는 실시예 5의 멤브레인의 마이크로그래프이다.
도 7은 실시예 5에서 멤브레인에 내부적으로 폴리부타디엔을 크로스-링킹하는 효과를 보여준다.
도 8은 실시예 6에서 서술된 피막형성 효율의 결과를 보여준다.
블록 공중합체
본 발명에서 사용된 블록 공중합체들은 적어도 하나의 (폴리)2-C1-3알킬-2-옥사졸린((poly)2-C1-3alkyl-2-oxazoline; PAOXA) 블록 및 적어도 하나의 폴리부타디엔(PB) 블록을 포함한다. 상기 중합체들은 적절하게 디블록 중합체 AB 또는 특히 BA, 또는 트리블록 중합체 ABA 일 수 있고, 여기서 PAOXA는 A 블록을 형성하고, PB 는 B 블록을 형성한다.
적어도 하나의 (폴리)2-C1-3알킬-2-옥사졸린(PAOXA) 블록 및 적어도 하나의 폴리부타디엔(PB) 블록을 포함하는 블록 공중합체들은 여러 가지 특성을 가지고 있어, 특히 베지클을 형성하는데 사용하기 적절하게 만든다. 히드록시기-말단의 PB40-b-PMOXA190를 지닌 모든 상기 공중합체들은 새로운 것이며, 본 발명의 일부분이다. 본 발명에 따른 적절한 블록 중합체는 PAOXA 블록에 190 미만의 2-알킬-2-옥사졸린 단량체를 포함한다. 상기 언급한 Hordyjewicz-Baran 의 학위 논문에서 밝혀진 특별한 히드록시기-말단의 PB40-b-PMOXA190 중합체는 매우 친수성으로, 소수성인 부타디엔 단량체에 비해 친수성 MOXA 단량체가 훨씬 더 많이 포함되는 경향이 있다. 본 발명에서 용도로서 특히 가치가 있는 것은 소수성 부타디엔 단량체가 더 많은 부분이 포함된 중합체이다. 한 예로, PB 블록에서 부타디엔 단량체 수가 적어도 PAOXA 블록의 2-알킬-2-옥사졸린 단량체 수의 반은 되는 중합체, 한 예로 PB 블록에서 부타디엔 단량체 수가 적어도 PAOXA 블록의 2-알킬-2-옥사졸린 단량체 수와 동일한 중합체, 특히 PB 블록에서 부타디엔 단량체 수가 PAOXA 블록의 2-알킬-2-옥사졸린 단량체 수보다 2배 더 큰 중합체가 있다. 예를 들어, PB 블록에서 부타디엔 단량체 수와 PAOXA 블록의 2-알킬-2-옥사졸린 단량체 수의 비율이 1:1.75 보다 클 수 있으며, 이는 친수성 대비 친유성의 비율이 17.64 인 것에 해당한다.
절대적인 용어로는, 본 발명의 공중합체는 바람직하게는 적어도 5개의 부타디엔 단량체를, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 부타디엔 단량체들, 한 예로 200까지, 특히 160까지 및 가장 특이하게는 120 부타디엔 단량체를 포함하며; 및 적어도 5개, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 2-C1-3알킬-2-옥사졸린 단량체(2-C1-3alkyl-2-oxazoline unit), 예를 들어, 189개까지, 특히 180개까지, 예를 들어, 160개까지, 및 가장 특이하게 120개까지 2-C1-3알킬-2-옥사졸린 단량체를 포함할 수 있다.
상기 형상 하나 또는 그 이상의 어느 것과는 별도로 또는 추가로, 특정한 예시들에서, 중합체가 -OH이 아닌 말단기를 가지는 한, 특히 (폴리)2-C1-3알킬-2-옥사졸린 블록 말단에 -OH이 아닌 다른 적어도 하나의 말단기를 가진 공중합체 인한; 및/또는 공중합체가 트리블록 인한; 및/또는 PAOXA 블록이 190 미만인 한; 및/또는 부타디엔 단량체의 수 대비 2-C1-3알킬-2-옥사졸린 단량체의 수의 비율이 4:19 보다 큰 중합체인 한; 및/또는 PAOXA 블록에 C1-3알킬기가 C2-3알킬인 중합체인 한, 본 발명은 적어도 하나의 PAOXA 블록과 적어도 하나의 PB 블록을 포함하는 공중합체를 제공한다.
상기 (폴리)2-C1-3알킬-2-옥사졸린 블록의 C1-3알킬기는 메틸, 에틸, 또는 프로필, 또는 이들의 혼합이될 수 있다. 바람직하게는 (폴리)2-C1-3알킬-2-옥사졸린 블록 또는 각 (폴리)2-C1-3알킬-2-옥사졸린 블록은 (폴리)2-메틸-옥사졸린 블록이다. 본 명세서 전반에 걸쳐, 본문에 달리 요구되지 않는 한, C1-3알킬에 대한 어떤 언급에서든 메틸이 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
상기 언급된 Hordyjewicz-Baran의 학위 논문에서는 블록 공중합체를 제조하는 하나의 특별한 방법을 공개한다. 중합에 의한 블록 공중합체 합성은 잘 알려져 있으며, 시작 단편에 공중합 될 하나 또는 그 이상의 단편의 길이는 공중합체에 첨가되는 모노머의 양을 조절함으로써, 및/또는 체인-종결 캡핑(capping) 제제를 첨가함으로써 쉽게 조절될 수 있다. 이 방법으로 단편의 크기 및 이들의 비율은 쉽게 조절될 수 있다.
이 분야에서 블록의 절대적인 및 상대적인 길이는 공중합체의 베지클 형성 적합성((소위 중합체 소수성 비율)을 결정하는데 중요하다는 것이 알려져 있다. 더 나아가, 본 발명에 따른 베지클의 의도적인 용도 중의 하나가 아래에 논의된 대로 막통과 단백질이 병합된 베지클로부터 멤브레인을 형성하는 것이므로, 이런 적용의도가 있는 중합체에서 블록의 길이는 단백질이 채널을 막지 않고 쉽게 베지클 벽에 병합되도록 베지클 벽의 두께가 막통과 단백질의 길이와 대체로 비슷한 것이 바람직하다. 한 예로 베지클 벽의 두께는 1nm 에서 50nm 의 범위에 있을 수 있다. 소수성 폴리부타디엔 블록의 길이는 특히 중요하며, 이는 200 반복 단위체보다 적어야 하는 것이 바람직하다.
중합체의 두 개의 말단기는 서로 같거나 또는 다를 수 있다. 만약 BA 디블록 공중합체의 B 블록이 폴리부타디엔이면, 이 블록의 말단기는 합성에 따라 PB 중합에 사용된 시작제에 의존한 그룹을 일반적으로 포함할 것이다. 예를 들어, 만약 알킬 리티움 시작제 R-Li이 사용된다면, 블록 말단기는 알킬기 R을 포함할 것이다. 시작제는 예를 들어 2차-부틸(sec-butyl) 리티움이될 수 있으며, 이 경우 말단기는 2차-부틸기일 것이다. PB 블록의 각 반복 단량체는 물론 C=C 이중결합을 포함할 것이다. A (PAOXA)기의 말단기는 성장하는 중합체 체인을 종결시키는데 사용되는 방법에 의존적일 것이다. ABA 트리블록 공중합체에서는, 양쪽 말단기는 PAOXA기에 있을 것이며, 반면에 가운데 B 블록은, 크로스-링킹이 없으면, C=C 이중결합을 포함할 것이다.
본 발명의 바람직한 예시에서, 블록 공중합체의 PAOXA 블록은 -OH 기가 아닌 다른 말단기를 포함한다. 적절한 말단기의 선택은 베지클 형성을 촉진하거나, 또는 중합체의 전진 반응 (onward reaction)에서 기능성을 제공하기도 한다. 특히, 바람직한 말단기는 카르복실기 및 활성화된 카르복실기; 아민기; 메타크릴레이트기; 티올기; 아지드기; 및 알킨기를 포함한다. 한 바람직한 예시에서, 블록 공중합체는 PAOXA 블록 말단에 적어도 하나의 카르복실 말단기를 포함한다. 다른 바람직한 예시에서, 블록 공중합체는 POXA기 말단에 -NH2 기를 포함하는 말단기를 포함한다. 특히, 바람직한 말단기는 -NH2 및 -NH- 둘 다 포함하는 말단기이다, 즉 말단기는 1차 및 2차 아민기 둘 다 포함한다.
중합체 초기 합성 후에 요구되는 말단기들이 존재하게 할 수 있거나, 또는 공중합체 합성 후 넣을 수도 있다. 초기 합성 후에 존재하지 않게 한다면, 적절한 반응으로 해당 블록 끝에 적절한 말단기를 도입시키는 것도 가능하다. 이런 목적으로, 적절한 체인 길이에 도달하고 체인 말단에 있는 시작기에 캡이 된 후 성장하는 단편의 중합을 종결시킬 수 있다. 예를 들어, 물을 이용한 캡핑은 -OH 말단기를 가져오게 하며, 반면에 적절한 아민으로의 캡핑은 아민 말단기를 가져오게 할 것이다. 다른 한편으로는, 캡핑은 다른 어떤 원하는 종결제를 사용하여 수행될 수 있으며, 요구되는 말단기는 알려진 화학을 사용하여 도입될 수 있다. 예를 들어, 종결은 성장 단편의 말단에 KOH/MeOH 또는 불포화기를 사용하여 수행될 수 있다. 말단기(들)는 요구되는 기(그룹)들을 도입시키기 위해 그 후 통상적인 화학 반응을 사용하여 반응시킬 수 있다.
본 발명의 특별히 바람직한 한 예시에서, 블록 공중합체는 적어도 한 말단기 X 가 -NHR 구조를 가진 것으로 종결되는데, 여기서 R은 적어도 하나는, 예를 들어, 1, 2 또는 3개는 -NH2 기로 대체된 탄소 원자 1 내지 6 를 가진 직쇄 이거나 분지쇄를 가진 알킬기를 나타낸다. X는 -NH-CH-(NH2)2 , 또는 바람직하게는, -NH-(CH2)n-NH2, 의 구조를 가지며, 여기서 n은 2 에서 6의 정수로서, 바람직하게는 2 에서 4, 특히 2 이다. 그러한 말단기들은 -OH 말단기를 가진 중합체를 적절한 활성이 있는 아민 NH2R, 예를 들어 디아민, 예를 들어, H2N-(CH2)n-NH2, 특히 H2N-(CH2)2-NH2, 또는 트리아민, 예를 들어 N.([CH2]nNH2)3 또는 CH.([CH2]nNH2)3, 예를 들어, CH(NH2)3 또는 트리스 (3-아미노프로필)아민((tris(3-aminopropyl)amine))과 반응시켜 도입시킬 수 있다. 가지형 올리고메릭 이민(branched oligomeric imines)들도 또한 사용될 수 있다. 다른 한편으로는, 상기 언급된 대로, 성장하는 중합체 체인은 적절한 아민을 사용하여 캡핑될 수 있다.
말단기(그룹)에 대한 더 많은 정보는 하기 "멤브레인" 부분에서 보여준다.
베지클
적어도 하나의 (폴리)2-C1-3 알킬-2-옥사졸린 블록 및 적어도 하나의 폴리부타디엔 블록을 포함하는 블록 공중합체들은 특히 베지클 형성에 적합한 것으로 규명되었으며, 본 발명은 상기 공중합체로부터 형성된 베지클을 제공한다.
본 발명의 베지클들은 이 분야에서 잘 알려진 방법으로 블록 공중합체로부터 제조될 수 있다. 일반적으로, 이 방법들은 용매 대체 또는 무-용매 재수화가 관련된다. 용매 대체방법에서는, 블록 공중합체가 물과 섞이기 전에 유기용매에 용해된다. 섞인 후, 및 선택적으로 유기 용매가 제거된 후, 베지클의 자동적인 자가-조립 결과가 나타난다. 무-용매 재수화에서는, 건조한 블록 공중합체를 수용성 매체에 접촉하게 하여 이때 수화가 되면서 베지클의 자동적인 자가-조립 결과가 나타난다. 무-용매 재-수화의 특별한 경우인, 얇은-필름 재수화 공정에서는, 블록 공중합체가 유기용매에 용해되고 이어서 얇은 필름이 형성되는 이러한 조건하에서 유기 용매가 제거된다. 이 필름은 이어서 물과 접촉시켜 수화시키며, 베지클은 자가-조립으로 형성된다. 베지클 제조하는 다른 알려진 방법에는 초음파 사용이 관련되며, 초음파의 정도가 베지클 형성의 초기 크기를 결정한다.
본 발명의 블록 공중합체는 때로는 처음에 상대적으로 큰 베지클을((이는 "거대한 단일 박막 베지클(Giant Unilamellar Vesiclses", GUVs)로 서술되기도 한다)) 형성하는 경향이 있다. GUV들은 일반적으로 직경이 약 1에서 20 마이크론을 갖는다. 원하는 크기 및 낮은 다분산성을 가진 베지클은 알려진 방법에 의해, 예를 들어 하나 또는 그 이상의 구멍크기가 알려진 멤브레인을 통해 커다란 단일- 및 복수-박막 다분산성 베지클을 제외시켜, 초기 형성된 베지클 집단으로부터 얻을수 있다. 트랙이 식각된 폴리카보네이트 멤브레인들은, 예를 들어 밀리포아(Millipore)로부터 구할 수 있는 이소포아((Isopore (Trade Mark)) 멤브레인은, 이런 목적으로 적절하다. 본 발명의 공중합체로부터 만든 베지클의 크기를 맞추기가 알려진 공중합체로부터 베지클을 만들 때보다 쉽다는 것이 발견되었다. 특히, 알려진 공중합체를 사용할 때보다 본 발명의 공중합체를 사용하여 GUVs 를 만드는 것이 더 쉽다. 본 발명에서 제조되고 사용되는 베지클의 최적의 크기는 적용의도에 의존할 것이다. 예를 들어, 베지클은 평균 직경이 30 에서 10,000nm 범위, 바람직하게는 50 에서 1000nm, 더 바람직하게는 100에서 400nm, 특히 150에서 250nm 범위를 가질수 있다.
블록 공중합체가 베지클을 형성하는 경향은, 미셀 (micelles)과 같은 다른 자가-조립(self-assembly) 구조보다, 블록의 절대적이고 상대적인 크기에 의존한다; 이는 이 분야에서 알려졌다. 이는 또한 중합체의 말단기의 성질에 의존하며, 이는 이 분야에서는 잘 알려져 있지 않다. 예를 들어, 중합체가 -OH 기로 끝이 날 때, 및 블록이 상대적으로 높은 분자량일 때, 미셀이 형성되는 경향이 있으며, 이는 만약 베지클이 요구된다면 저 분자량의 중합체가 바람직함을 의미한다. 놀랍게도, 카르복실기 또는 아민기가, 특히 -NH2 및 -NH- 기 모두를 포함하는 아민기, 가 말단기에 존재하면, 베지클 형성이 촉진된다.
필요하다면, 본 발명에 따른 베지클은 내부적으로 PB 블록에 이중결합을 통해 크로스-링크될 수 있다. 이는 시작제 사용 또는 UV 빛을 사용하는 것과 같은 알려진 방법들과 유사한 방법들을 사용하여 수행될 수 있다. 이는 베지클의 안정성을 증가시켜, 이들이 특별히, 예를 들어, 물질들의 전달 같은, 여러 가지 다른 응용에유용 하도록 한다. 다른 한편으로, 적절한 기능적 말단기들을 사용하여 중합체 체인을 크로스-링킹하여 베지클의 안정성을 증가시킬 수 있다. 또한 PB 블록에 이중결합으로 크로스-링킹시키면 공중합체로부터 형성된 베지클의 투과성이 감소하게 된다는 것이 발견되었으며, 그러므로 크로스-링킹은 베지클의 투과성을 조절하고 맞춤 재단하는 쉬운 방법을 제공한다.
본 발명의 한 바람직한 예시에서는 적어도 하나의 (폴리)2-C1-3 알킬-2-옥사졸린 블록 및 적어도 하나의 폴리부타디엔 블록으로 구성된 블록 공중합체로부터 형성된 베지클을 제공하며, 상기 베지클은 그 벽에 막통과 단백질을 가지고 있다. 상기 베지클은 막통과 단백질, 특히 아쿠아포린(aquaporins)의 존재하에 베지클 형성 과정을 수행함으로써 형성하게 할 수 있으며, 여기서 막통과 단백질은 베지클의 벽에 병합된다. 일반적으로, 그러한 베지클을 형성하는 과정은 단백질의 온전성 및 생물학적 기능을 유지하는 것을 도와주는 세제의 존재하에서 수행된다. 따라서, 상기 재수화 단계는 막통과 단백질의 수용액, 바람직하게는 또한 세제를 포함한 수용액을 사용하여 수행될 수 있다. 아쿠아포린의 사용이 바람직하며, 아쿠아포린은 넓은 범위의 공정 조건하에서 견고하다. 더 나아가, 막통과 단백질에대한 상세한 것은 하기 "막통과 단백질(Transmembrane proteins)" 부분에서 제공된다.
막통과 단백질이 베지클에 병합된 베지클들은 멤브레인 형성의 용도를 가진다. 이는 하기 "멤브레인(Membranes)" 부분에서 논의한다.
멤브레인 형성에의 용도를 가진 것은 물론이고, 베지클은 다르게 응용되어 사용될 수도 있다. 본 발명에 따른 베지클의 더 다른 용도는 물질들, 예를 들어 약물이나 화장품들의 전달에 있으며, 본 발명의 블럭 공중합체는 높은 캡슐화 효율을 가진 베지클을 유도 하기 때문에 본 발명에 따른 베지클은 특히 이런 용도로 적절하다.
추가로, 본 발명의 공중합체로부터 형성된 베지클은, 세제에 접촉될 때 구조를 잃어버리는 경향이 있는 알려진 공중합체로부터 형성된 베지클 보다 세제에 대한 저항성이 더 커서, 본 발명은 특히 세제-유사 분자를 포함하고 있는 화장품 제제의 전달에 특히 적절하다. 여러 가지 다양한 물질들을 여러 다른 경로로, 예를 들어, 베지클 제조하는 동안 공중합체에 물질을 첨가하여, 베지클 형성하는 동안에 공중합체에 물질을 도입시켜, 또는 물질이 베지클 안에 흡수될 때까지 물질의 용액을 베제클과 함께 처리하여, 베지클의 벽으로 정의된 베지클의 구멍에 포함 시킬 수 있다. 고려 대상이 될 물질들 중에는 약물, 화장품 제제, 향수, 염료, 색소, 광활성 화합물, 금속 입자, 나노입자, 생물학적 중합체(폴리머), 생물학적 기관, 세포 기괸 및 다른 화학 제제들이 있다. 특히 바람직한 것은 약물 또는 화장품 전달 분야에서의 배지클의 용도이며, 본 발명은 더 나아가 특히 베지클의 벽으로 정의된 베지클의 구멍 내에 약물 또는 화장품을 포함하는, 본 발명에 따른 약물 또는 화장품을 포함하는 베지클을 제공한다. 여러 다양한 약물 또는 화장품 제제들이 사용될 수 있다, 예를 들어 적절한 약물들에는 소분자 약물, 톡신, 세포독성 약물, 유전자 또는 RNA, 및 단백질, 예를 들어 치료 단백질 또는 효소들이 포함된다.
본 발명에 따른 베지클은 말단 기능기를 가진 공중합체로부터 만들어질 수 있으므로, 베지클은 이 말단기들을 통해 타겟 분자와, 예를 들어 타겟의 결합 파트너에 결합할 수 있는 능력이 있는 결합 단백질, 예를 들어 항체 또는 항체 단편과, 공유결합으로 연결 시킬 수 있다. 그러므로 본 발명은 표적 약물 전달 분야에서의 용도를 가진다.
멤브레인
본 발명은 더 나아가 베지클에 막통과 단백질이 병합된 본 발명에 따른 다수의 베지클을 포함하는 여과막을 제공한다. 상기 멤브레인의 바람직한 구조는 2014 년 3월 26일 UK 출원 1405390 으로부터 우선권을 주장하는 우리가 동시계류 출원한 참조 번호 P021889WO에 에 서술되어 있으며, 이는 다공성 지지체 및 이의 표면에 공유결합으로 결합된, 병합된 막통과 단백질을 가진 다수의 베지클을 포함하는 층으로 구성 된 여과막에 관련된 것이며, 상기 베지클은 양수친매성 블록 공중합체로부터 형성된 것이다; 상기 층 내에서 베지클들은 공유결합으로 서로 연결되어 일관성 있는 덩어리를 구성하고 있는 특징이 있다. 본 발명의 베지클들은 그런 멤브레인에 특별한 용도를 가진다. 상기 멤브레인에서, 지지체는 다수의 베지클이 서로 가깝게 팩킹된 베지클 층을 가진다. 층에 팩킹은 한 예로 육방 밀집 팩킹(hexagonal close packing)일 수 있다. 지지체 표면에 있는 베지클 층은 베지클의 평균 직경보다 두껍다, 즉, 단일 층의 베지클에 의해 제공되는 두께보다 더 두껍다. 층은 베지클의 평균 직경의 적어도 2배, 예를 들어 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 50배, 더 바람직하게는 적어도 150배, 및 가장 바람직하게는 적어도 200배에 해당하는 두께를 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게는 층은 베지클의 평균 직경의 500배 이하, 예를 들어 300 배 이하이다. 그러므로 예를 들어, 층의 두께는 베지클의 평균 직경의 2 에서 500배, 예를 들어 50에서 300배, 특히 예를 들어 200에서 300배를 가질 수 있다. 절대적인 용어로서, 베지클 층의 두께는 바람직하게는 적어도 0.04, 예를 들어 적어도 0.1, 예를 들어 적어도 0.2, 예를 들어 적어도 2, 바람직하게는 적어도 10, 더 바람직하게는 적어도 30, 및 가장 바람직하게는 적어도 40, 마이크론이다. 층의 특별히 바람직한 최대 두께는 없다. 층의 두께는 예를 들어 100마이크론까지, 예를 들어 60마이크론까지 가질 수 있다. 그러므로, 예를 들어 층은 두께가 0.04 에서 100 마이크론까지, 예를 들어 0.2 에서 100까지, 바람직하게는 10에서 60까지, 특히 바람직하게는 40에서 60 마아크론까지 가질 수 있다.
견고성을 증가시키기 위해, 완성된 멤브레인에서 베지클의 층은 보호적인 상층 코팅층, 또는 지지층의 반대쪽에 두 번째 지지층이 제공되는 것이 바람직하다. 이 상층 코팅은 예를 들어 롤링과정(rolling process) 동안의 기계적인 손상으로부터 추가적으로 보호해 준다. 이는 예를 들어 폴리비닐 알콜과 같은 친수성 중합체를 예를 들어 포함할 수 있다.
우리의 동시계류 출원서에서 서술된 여과막의 구조는, 본 발명에 따라 블록 공중합체로 부터 형성된 상기 베지클에, 병합된 막통과 단백질을 가진 베지클의 수용성 현탁액을 제공하고; 상기 베지클의 현탁액을 다공성 지지체에 침착시키고; 및 다른 베지클들 사이 및 베지크들과 상기 표면 사이에 공유결합이 형성되도록 하는 반응조건을 제공하는 것을 포함하는 공정으로 제조될 수 있다.
바람직하게는, 여과막은 물 여과막이며, 막통과 단백질은 바람직하게는 아쿠아포린이다. 이 명세서와 청구항 전체를 통해, 전후 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 여과막에 대한 어떤 언급은 물 여과막에 대한 특별한 언급을 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 막 통과 단백질에 대한 언급은 아쿠아포린에 대한 특별한 언급을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
멤브레인 제조공정은 여러 가지 다른 방법으로 수행될 수 있다. 첫 번째 바람직한 예시에서는, 상기 공정은 다음을 포함한다:
(a) 활성화된 말단기 X를 가진 블록 공중합체로부터 형성된 상기 베지클에, 병합된 막통과 단백질을 가진 본 발명에 따른 베지클의 수용성 현탁액을 제공하는 단계;
(b) 중합체의 말단기 X 와 반응하는 두 개의 반응기 Y를 가진 복합기능 링킹제를 제공하는 단계;
(c)상기 베지클 현탁액 및 상기 복합기능 링커를 중합체의 말단기 X 또는 활성기 Y 와 반응하는 표면을 가진 지지체에 침착시키는 단계; 및
(d) 말단기 X가 Y와 반응을 하게 하며, 및 말단기 X 또는 Y기가 지지체의 표면에 반응하게 하는 단계;를 포함한다.
두 번째 바람직한 예시에서는, 상기 공정은 다음을 포함한다:
(a) 활성화된 말단기 X를 가진 블록 공중합체로부터 형성된 상기 베지클에, 병합된 막통과 단백질을 가진 본 발명에 따른 베지클의 첫 번째 수용성 현탁액을 제공하는 단계;
(b)중합체 말단기 X와 반응하는 활성화된 말단기 Y를 가진 블록 공중합체로부터 형성된 상기 베지클에, 병합된 막통과 단백질을 가진 본 발명에 따른 베지클의 2차 수용성 현탁액을 제공하는 단계;
(c) 상기 베지클 현탁액을 중합체의 말단기 X 또는 Y 와 반응하는 표면을 가진 지지체에 침착시키는 단계; 및
(d) 말단기 X가 Y와 반응을 하게 하며, 및 말단기 X 또는 말단기 Y기가 지지체의 표면에 반응하게 하는 단계;를 포함한다.
상기 공정들은 본 발명에 따른 중합체 베지클들이 각각 서로 연결되고, 선택적으로 링커를 통하고, 및 또한 지지체의 표면에 링크되어, 물리적으로 견고한 층을 이루는 결과를 가져온다.
블록 공중합체 말단기들 하나 또는 두 개 다가 상기 언급된 말단기 중 하나가될 수 있다. 바람직하게는, 하나 또는 두 개의 말단기는 -NH2 및 -NH- 기 두 개를 포함하는 X기이다. 멤브레인 제조 공정에 사용되는 블록 공중합체 분자 모두가 활성 말단기를 가져야 할 필요는 없다. 일관성 있는 덩어리를 형성하기 위해 베지클의 2차 집단에서나 또는 복합기능 링커에서나 활성기들과 반응하는 충분한 그룹들이 있기만 한다면, 활성 말단기를 가진 블록 공중합체 분자의 비율은 그리 중요하지는 않다. 일반적으로, 베지클을 형성하는데 사용되는 블록 공중합체 분자는 적어도 10%, 예를 들어 적어도 20%, 예를 들어 적어도 30%, 예를 들어 적어도 40%, 예를 들어 60%까지, 또는 100%까지 기능적 말단기 X 또는 Y를 가질 수 있다. 비슷하게, 단지 한 타입의 말단기 X 또는 Y만이 존재하는 것이 요구되는 것은 아니다. 예를 들어 하나는 한 활성 말단기 X (1), 예를 들어 -NH2 기를 포함하는 한 말단기, 및 두 번째는 다른 활성 말단기 X (2)를 포함하는 블록 공중합체들을 섞어 사용하는 것이 바람직할 수도 있다.
어느 특정 블록 공중합체 분자에 있는 말단기들은 서로 같거나 또는 다를 수 있다.
예를 들어, 한 말단기는 활성 말단기 X이고, 반면에 다른 말단기는 비-활성 기(그룹)이될 수도 있다. 그룹들의 정확한 성질은 물론 멤브레인 제조 공정의 성질 및 지지체의 표면의 성질에 의존할 것이다.
적절한 활성 그룹들에는 아민기(예를 들어 카복실릭 에시드, 활성화된 카복실릭 에시드 및/또는 아지드기들과 반응성이 있다), 카복실릭 에시드, 활성화된 카복실릭 에시드 및/또는 아지드기들 (예를 들어 아민기 Y와 반응성이 있다), 및 "클릭 케미스트리(click chemistry)" 그룹 (예를 들어 각각 알킨과 아지드기Y 와 반응성을 갖는 아지드 또는 알킨기들)이 포함 되며; PB 블록에 존재하는 C=C 이중 결합도 물론 포함된다. 아민기들을 사용하는 것이 특별히 바람직하다.
여러 다양한 아민-근거한 말단기들이 가능하며, 이들에는 -NH2 및/또는 -NH- 그룹들이 포함될 수 있다. 그러한 말단기를 가진 적어도 하나의 PAOXA 블록과 적어도 하나의 PB 블록을 포함하는 블록 공중합체가 제공될 때는, 베지클로 자가-조립되는 블록 공중합체의 능력은 증강된다는 것이 발견되었다: 이는 놀라운 사실이다, 왜냐하면 일반적으로 베지클 형성에 가장 영향을 주는 양수친매성 블록 공중합체의 성질들은 (i) 블록의 크기와 성질; 및 (ii) 중합체의 다분산성으로 기대되기 때문이다.
복합기능 링킹제제를 사용할 때는, 이 제제에 존재하는 활성 그룹들은 서로 같을 수도 있고, 또는 다를 수도 있다. 이들은 베지클에 존재하는 상보성 활성 그룹과 및/또는 지지체 표면과 반응하도록 해야 한다. 적절한 그룹들은 상기 언급한 대로다. 복합기능 제제를 사용할 때는, 이 제제는 예를 들어 3 또는 4 활성기를 포함할 수있다, 그러나 바람직하게는 두 개의 활성기를 포함하며, 및 여기서 어떤 복합기능 제제에 대한 언급은 이중기능 제제에 관한 특정한 언급을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 바람직한 예시에서, 베지클들은 아민기를 포함하는 활성 그룹을 포함한다; 및 활성화된 카르복실 에시드기 또는 아지드, 예를 들어 페닐아지드, 그룹인 상보성 활성 그룹이 제공된다.
상기에 서술된 대로 멤브레인을 제조할 때는, 상보성 활성기 X (즉, -NH2 및-NH- 둘다 포함하는 그룹) 및/ 또는 Y와 반응 능력이 있는 특별한 활성기 Z를 도입하는 하나 또는 그 이상의 방법으로 지지체의 표면을 기능화 할 수 있다. 적절한 그룹들에는 아민기(그룹) (예를 들어 카르복실릭 에시드 또는 활성화된 카르복실릭 에시드기 X 및/또는 Y과 반응 한다);카르복실릭 에시드 또는 활성화된 카르복실릭 에시드기 (예를 들어 아민기 X 및/또는 Y 와 반응한다); 및 "클릭 케미스트리 (click chemistry)" 그룹 (예를 들어 알킨 또는 아지드기 X 및/또는 Y 와 반응하는 아지드 또는 알킨기)이 포함된다. 표면의 다-단계 기능화의 한 예로는 산 (acid), 예를 들어 염산, 을 사용하여 폴리아클릴로니트릴 (polyacrylonitrile) 표면을 가수분해시켜 표면에 카르복실기를 도입시키고, 이어서 이를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 ((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide))(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(N-Hydroxysuccinimide)(NHS)를 사용하여 활성화 시키고, 이어서 예를 들어 프로파르길아민 (propargylamine)울 사용하여 알킨기로, 또는 예를 들어 아미노-트리에틸렌글리콜-아지드(amino-triethyleneglycol-azide)를 사용하여 아지드기로 전환시키는 예가 있다. 그러나 본 발명의 다른 예시에서는, 지지체의 표면을 기능화하는 것이 필요하지 않을 수 있다, 왜냐하면 X 및/또는 Y 는 지지체를 형성하는 재료에 이미 있는 그룹들과 반응을 할 수 있기 때문이다. 한 예로, Y는 아지드기일 수 있다; 그런 그룹들은 UV 빛을 사용하여 일단 활성화 시키면 매우 반응성이 높고, 지지체 재료에 있는 많은 폴리머들에 존재하는 C-H 결합과 반응하는 능력이 있다. 특히, 아지드, 특별히 페닐아지드(phenylazide), 그룹은 폴리설폰(polysulfones)들과 공유적으로 결합할 능력이 있어, 하기에 논의 한대로, 본 발명에서 사용되는 바람직한 지지체 재료이다.
활성화된 카르복실릭 에시드기에 대한 언급이 될 때는, 예를 들어 N-하이드록시석신이미드(N-Hydroxysuccinimide)에스터와 같은 활성화된 에스터, 또는 에시드 할라이드 (acid halide)와 같은, 전통적으로 활성화된 어느 카르복실릭 에시드기를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 그러한 활성화 기술들은 이 분야에서 잘 알려져 있다. 한 바람직한 예시에서는, 활성화된 카르복실릭 에시드 말단기들은 카르복실릭 에시드기를 EDC 및 NHS와 반응시켜 생산하게 한다. 이는 단백질 접합 및 고정화 분야에서 자주 사용되는 잘-알려진 기술이다. 카르복실기의 EDC 및 NHS와 반응은 아민 반응성 NHS 에스터를 형성하는 결과를 가져온다.
복합기능 링커를 사용할 때는, X 및 Y 그룹들의 반응으로 베지클들이 서로 연결되도록 충분히 반응할 수 있기만 하면 링커의 정확한 성질은 결정적이지 않다.
적절한 복합기능 링커들에는 동종두기능 크로스링커 (homobifunctional crosslinkers), 즉 양쪽 말단들에 같은 기능기를 가진 크로스링커, 가 포함된다. 아민기에 결합 능력이 있는 예들에는 다음이 포함된다:
(i) NHS 에스터들. 전형적인 에스터들은 다음을 포함한다:
디숙신이미딜 글루타레이트(disuccinimidyl glutarate);
비스(숙신이미딜) 폴리에틸렌 글리콜((bis(succinimidyl) polyethylene glycol)):
예를 들어 비스(숙신이미딜 펜타(에틸렌 글리콜)((bis(succinimidyl penta(ethylene glycol);
에틸렌 글리콜 비스(설포숙신이미딜숙시네이트)((ethylene glycol bis(sulfosuccinimidylsuccinate)):
3.3'-디티오비스(설포숙신이미딜프로피오네이트)
((3,3'-dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate):
비스(설포숙신이미딜)수버레이트((bis(sulfosuccinimidyl)suberate):
디숙신이미딜 타르타레이트(disuccinimidyl tartrate):
를 포함한다.
이런 타입이 시약들은 약간의 알카라인 조건, 예를 들어, pH 7.2-8.5, 예를 들어 7.2-8.0, 에서 일차 아민과 반응하여, 안정된 아미드 결합을 생산한다. 반응온도는 전형적으로 0 에서 30℃ 범위, 예를 들어 4 에서 25 ℃ 범위이다. 이 반응은 N-하이드록시숙신이미드(N-hydoxysuccinimide)를 생산하며 이는 투석(dialysis) 또는 탈염 (desalting)으로 제거될 수 있다. 이 반응은 예를 들어 pH 7.2-8.0 PBS 버퍼에서 0.5 내지 4 시간 동안 실온 또는 4℃에서 수행될 수 있다.
설포 NHS 에스터들은 NHS 링에 -SO3 기를 포함한다. 이는 반응 화학에는 아무런 영향이 없으나, 그런 시약들은 수용성을 증가시키는 경향이 있다.
(ii) 이미도에스터들. 전형적인 이미도에스터들에는 다음(종종 디하이드로클로라이드 염으로 얻어진다)이 포함된다:
디메틸 아디피미데이트(dimethyl adipimidate):
;
디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate):
디메틸 수버리미데이트(dimethyl suberimidate):
;
디메틸 피메리미데이트(dimethyl pimelimidate):
;
디메틸 아디피미데이트(dimethyl adipimidate):
;를 포함한다.
이미도에스터들은 일차 아민들과 반응하여 아미딘 결합을 형성한다. 일차 아민에 대한 특성을 확실히 하기 위해, 반응은 아민이 없는 알카라인 조건(pH 9-11, 예를 들어 pH10), 보레이트 버퍼(borate buffer)에서 수행된다.
(iii)게니핀(genipin), 다음 구조를 가진다:
(iv) 에폭사이(epoxides), 예를 들어 트리글리시딜아민(triglycidylamine):
(v) 디알데하이드 화합물들, 예를 들어 HOC.(CH2)x.CHO, 여기서 x 는 1 에서 6이다. 전형적인 디알데하이드들에는 글루타르알데하이드, 석신디알데하이드, 글리옥살, 말론디알데하이드, 및 프탈알데하이드가 포함된다.
(vi) COOH-PEG-COOH. 이 시약은 수용성이며, 필요하면 아민과의 반응성을 제공하기 위해 EDC/NHS로 활성화시킬 수 있다.
적절한 복합기능 링커들에는 또한 헤테로 2작용성 크로스링커(heterobifunctional crosslinkers), 즉 양쪽 말단에 다른 기능기를 가진 크로스링커들이 포함된다. 예들에는 다음이 포함된다:
1- 에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 ((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (보통 염산염 형태로 얻어진다):
;
카르비톨(carbitol)
에폭사이드(epoxides), 예를 들어 트리글리시달아민(triglycidalamine);
COOH-PEG-NH2;
설포숙신이미딜 6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트 ((sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate));
폴리(2-하이드록시에틸-co-2-메타아크릴옥시에틸 아스파르타미드)
((poly(2-hydroxyethyl-co-2-methacryloxyethyl aspartamide);
N,N'-디석신이미딜 카보네이트(N,N'-disuccinimidyl carbonate):
p-아지도벤조일 하이드라지드(p-azidobenzoyl hydrazide):
멤브레인 제조 공정에는 "클릭 케미스트리(click chemistry)"를 사용할 수 있으며, 이는 한 예로 아지드와 알킨의 반응을 사용할 수 있다. 예를 들어, 일차 아민을 NHS 에스터와 반응시켜 한 알킨기를 Y 그룹으로서 도입시킬 수 있다. 많은 아지드-PEG-아지드 링커들이 상업적으로 구할 수 있다.
바람직하게는 복합기능 링커는 (CH2)m 체인을 포함하며 여기서 m 은 2에서 20이며, 바람직하게는 3 에서 10, 특히 3에서 9이다. 특히 바람직한 이중기능 링커는 상업적으로 구할 수 있는 생성물인 N-설포숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트((N-sulfosuccinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate))이다. 이 생성물들은 다음의 구조를 갖는다:
설포숙신이미드기는 활성그룹 Y 이며, 이는 활성화된 카르복시릭 에시드 에스터이며, 아민기들과 스스로 반응할 수 있는 능력이 있다. 페닐아지드기는 그룹 Y로 빛-없는 조건하에서는 불활성이지만, UV 빛을 사용하여 활성화되면 매우 반응적으로 되어 아민기들과 바로 반응을 한다. 아민기들이 없을 때는, 활성화된 그룹은 더 낮은 반응성이 있는 그룹들과 반응하는 능력이 또한 있으며, 어떤 경우에서는 C-H 결합까지 와도 반응한다; 특히, 폴리설폰(polysulfone)의 방향족 C-H 그룹들과 반응하는 능력이 있다.
상기 서술된 멤브레인 제조 공정의 (d) 단계가, 즉 상보성 활성 그룹 X 및 Y, 및 X 또는 Y가 지지체 표면과 반응을 하게 하는 단계가, 수행되는 조건들은 물론 여러 다양한 활성 그룹들의 성질에 의존적일 것이다. 어떤 예시들에서는, 활성 그룹들은 적절한 조건들하에서 서로 일단 접촉이 되면 서로 스스로 반응할 것이다. 다른 예시들에서, 광-활성화 가능한(photo-activatable) ) 그룹들이 존재할 수 있으며, 이 경우에는 반응물들은 서로 접촉되고, 이어서 광조사 되어 (photoirradiated) 반응이 시작되도록 할 수 있다. 바람직한 예시에서는, 말단기 X와 접촉시 반응하는 첫 번째 그룹 Y, 및 UV 빛으로 조사(irradiation) 할 때 말단기 X 및 지지체의 표면과 반응하는 두 번째 그룹 Y를 가진 복합기능 시약을 사용하여 두 기전 모두 혼합된다.
따라서, 상기 공정의 한 예시의 단계들은 다음과 같이 수행될 수 있다:
(a) 활성화된 말단기 X를 가진 블록 공중합체로부터 형성된 상기 베지클에, 병합된 막통과 단백질을 가진 본 발명에 따른 베지클의 수용액이 제공되는 단계;
(b) 복합기능적인, 바람직하게는 중합체 말단기 X와 반응하는 활성화된 그룹 Y를 적어도 두 개, 첫 번째 반응 조건 셋트 하에서 중합체 말단기 X와 반응할 수 있는 첫 번째 활성화된 그룹 Y(1), 및 상기 첫 번째 반응 조건 셋트 하에서는 중합체 말단기 X와 반응하지 않으나 두 번째 반응 조건 셋트 하에서는 중합체 말단기 X와 반응하는 두 번째 활성화된 그룹 Y(2)를 포함 하여, 두 그룹을 가지고 있는, 두 기능적인, 링킹 제제를 제공하는 단계;
(b') 상기 베지클 수용액을 상기 복합기능 링킹 제제와 상기 첫 번째 반응 조건 셋트 하에서 혼합하여 활성화된 그룹 Y(1)이 중합체 말단기 X와 반응할 수 있도록 하는 단계;
(c) 결과로 얻어지는 용액을, 바라는 베지클 층이 생산되기에 충분한 양으로, 두 번째 활성화된 그룹 Y(2)와 반응성이 있는 지지체에 침착시키는 단계; 및
(d) 말단기 X가 상기 두 번째 활성화된 그룹 Y(2)와 반응을 하게 하며, 및 상기 두 번째 반응 조건 셋트를 적용하여 두 번째 활성화된 말단 그룹 Y(2)가 지지체의 표면에 반응하게 하는 단계;를 포함한다.
두 반응 단계들을 구별 짓는 어느 적절한 반응 조건들도 사용될 수 있다. 예를 들어, 첫 번째 반응 조건 셋트는 첫 번째 온도에서 반응하는 그룹들 X 및 Y(1)이 관련될 수 있고, 반면에 두 번째 반응 조건 셋트는 두 번째, 높은 온도에서 반응하는 그룹 X 및 Y가 관여될 수 있다. 그러나, 바람직한 예시에서는, X 및 Y (1)는 접촉시, 또는 필요하면 가열하여, 자동적으로 반응하도록 하고, 반면에 X 및 Y(2) 광조사에 의해 활성화될 때만이 반응하도록 한다. 따라서, 특히 바람직한 공정은 다음을 포함한다:
(a)활성화된 말단기 X를 가진 블록 공중합체로부터 형성된 상기 베지클에, 병합된 막통과 단백질을 가진 본 발명에 따른 베지클의 수용액이 제공되는 단계;
(b)복합기능적인, 바람직하게는 중합체 말단기 X와 반응하는 활성화된 그룹 Y를 적어도 두 개, 접촉시 중합체 말단기 X와 반응할 수 있는 첫 번째 활성화된 그룹 Y(1), 및 광조사 시 중합체 말단기 X와 반응하는 활성화된 그룹 Y(2)를 포함하는, 두 그룹을 가지고 있는, 두 기능적인, 링킹 제제를 제공하는 단계;
(b') 상기 베지클 수용액과 상기 복합기능 링킹 제제를 상기 첫 번째 반응그룹 Y(2)가 중합체 말단기 X와 반응할 수 있는 조건하에서 혼합하는 단계;
(c) 결과로 얻어지는 용액을, 바라는 베지클 층이 생산되기에 충분한 양으로, 두 번째 활성화된 그룹 Y(2)와 반응성이 있는 지지체에 침착시키는 단계; 및
(d) 광조사를 적용하여 말단기 X가 상기 두 번째 활성화된 그룹 Y(2)와 반응을 하게 하며, 및 두 번째 활성화된 말단 그룹 Y(2)가 지지체의 표면에 반응하도록 하는 단계;를 포함한다.
상기 모든 예시들에서, (c) 단계에서 침착된 현탁액의 양은 지지체 표면에 베지클의 연속적인 층을 제공하기에 충분하다. 일반적으로, (d) 단계가 수행된 후에, 이층은 베지클의 평균 직경보다 더 큰 두께를 갖는 일관성 있는 덩어리 형태가 될 것이다; 또는, 절대적인 용어로, 적어도 0.01 마이크론, 특히 0.04 마이크론의 두께를 갖는다.
상기 공정이 효과적이기 위해 여러 다양한 범위의 반응 조건들이 사용될 수 있다. 한 예시에서는, 복합기능 링커를 사용할 때는, 사용될 복합기능 링커의 양은 충분한 크로스-링킹이될 수 있도록, 존재하는 활성화된 그룹 Y의 총량이 존재하는 중합체 말단기 X의 총량을 초과하는 양으로 사용되도록 할 것이다. pH, 온도 및 다른 반응 조건들은 전통적인 것이며 숙련된 사람이 보통 행하는 범위 내에 있다.
전체적으로, 상보성 복합기능 링킹 제제와 함께 본 발명에 따른 베지클의 사용은 작용 여과 멤브레인 (여과막)(working filtration membranes)을 제조하는데 알려진 공정에 비해 큰 장점이 있다. 지지체는 어느 적절한 미소공성 재료로 만들어질 수 있다. 이는 예를 들어 역삼투압(reverse osmosis) 또는 초여과 막 (ultrafiltration membranes)에서 사용되는 것과 같은 전통적인 멤브레인 지지체에 근거할 수 있다. 그러한 지지체들은 예를 들어 폴리올레핀, 셀루로즈, 재생 셀루로즈, 셀루로즈 아세테이트, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에테르설폰, 또는 폴리설폰으로부터 만들어질 수 있다. 본 발명의 바람직한 예시에서는 지지체는 폴리설폰으로부터 만들어진다.
지지체 멤브레인의 화학적 기능성은 저분자 또는 폴리머인 첨가제의 형태로 캐스팅 약(casting dope)에 전달될 수 있게 하거나, 또는 예를 들어 화학적 처치, 이식적 중합 또는 플라즈마 중합으로 지지체 표면의 기능화로 전달될 수 있다. 이런 방법들로, 지지체의 다음과 같은 화학적 변형이 한 예로 성취될 수 있다; 아민기가 카르복시릭 에시드기로, 또는 반대로 전환: 알데히드가 아민으로 전환; 및 하이드록실기가 카르복시릭 에시드기로 전환. 모든 그런 반응들은 이 분야에서 잘 알려져 있다.
다공성인 초여과 막은 예를 들어, 용해된 중합체(폴리머) 용액을 용매의 휘발을 매우 느린 방법으로 조절하는 공기 흐름 관 시리즈 하에 통과시키는, 공기 캐스팅 (air casting)으로; 용해된 폴리머를 움직이는 벨트 위에 펴고 용액 조에 통과시키고, 용액 조에 있는 액체를 래커(lacquer)에 있는 용매로 바꿔 기공을 형성하게 하는, 용매 또는 에머션 캐스팅 (emersion casting)으로; 주어진 용매 시스템에서 폴리머의 용해성을 유도하도록 열을 사용하는, 열 캐스팅 방법으로 제조될 수 있다. 래커는 냉각되는 움직이는 벨트에서 없어진다(cast out). 랙커에 있는 열의 냉각은 침전을 시작하게 하고 구멍을 형성하게 한다. 이 공정에서 전형적으로 사용되는 재료들에는 이것만 국한하지 않으나, 재생 셀루로즈, 셀루로즈 나이트레이트, 셀루로즈 아세테이트, 폴리아미드, 폴리설폰, 폴리(에테르 설폰), 폴리카보네이트, 폴리(에테르 이미드), 폴리(2,6,-디메틸-1,4-페닐렌 옥사이드), 폴리이미드, 폴리(비닐리덴 풀루오라이드), 폴리테트라풀루오로에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴로니트릴, 폴리(메틸 메타크릴레이트 (poly(methyl methacrylate), 폴리비닐 알콜 및 폴리디메틸실록산이 포함된다. 캐스트의 형태는 마지막 모둘의 모양에 의해 조절된다. 예를 들어 나선-감기 (spiral wound) 요소로는 평면-쉬트(flat-sheet)를 포함하고; 구멍뚤어진-섬유 (hollow-fibre) 요소에서는 구멍뚤어진-섬유: 또는 투브 (tubular)형태를 포함할 수도 있다.
일정한 두께를 가진 상기 층인, 베지클의 일관성 있는 덩어리를 포함하는 층을 가진 멤브레인의 제조는 지지체에 적용하는 베지클 용액에 존재하는 베지클의 농도를 조절하거나 및/또는 지지체 침착시키는 용액의 부피로 달성 할 수 있다.
본 발명의 멤브레인의 장점은 중합체 베지클의 벽에 묻혀 있는 막통과 단백질을 통하지 않은 다른 멤브레인을 통한 통과의 어떤 가능성은 최소화된다는 것이며, 반면에 지지체 멤브레인의 유닛트 표면 넓이당 가능한 많은 막통과 단백질을 제공하여, 멤브레인을 통한 흐름을 최대화한다. 멤브레인을 제조하는 공정은 기술적으로는 단순하며, 결과로 얻어지는 멤브레인은 물리적으로 견고하다.
막 통과 단백질
본 발명에 따른 베지클 및 멤브레인은 막통과 단백질들을 포함할 수 있다. 아쿠아포린은 생물학적 세포 막통과 단백질이며 이의 기능은 다른 분자는 통과시키지 않고 물을 선택적으로 운반한다; 단백질의 운반 채널은 물이 양쪽으로 흐를 수 있는 쌍방향 (two-way) 채널이다. 이들은 많은 사람 세포 타입에서 발현되며, 및 또한 박테리아 및 식물 세포에 의해 발현된다. 본 발명에서는 아쿠아포린 계열의 어떤 다른 멤버들이 사용될 수 있다. 적절한 아쿠아포린에는 Aqp 4, Aqp1 및 특히, Aqp Z 가 포함 된다. 아쿠아포린은 모노머, 다이머, 테트라머 및 더 높은 올리고머(higher oligomeric) 형태로 존재할 수 있으며, 물론 일차 서열의 변이된, 접합된, 및 절단된 형태로도 존재할 수 있다. 아쿠아포린의 생물학적 기능, 즉 선택적인 물의 수송, 이 유지된다면, 이들 중 어떤 것도 본 발명에 따른 블록 공중합체로 부터 형성되는 멤브레인에 사용될 수 있다.
바람직한 수송 성질을 가진 어떤 다른 막통과 단백질도 본 발명에서 사용될 수 있다. 자연적으로 또는 비-자연적으로 나타나는 변이체들을 포함하는 그러한 막통과 단백질의 변이체들, 및 그러한 단백질들의 이종상동성 (orthologs) 또는 유사 (paralogs)단백질들이 사용될 수 있다. 그런 단백질은 한 예로;
● 모노토픽 멤브레인 단백질 (Monotopic Membrane Proteins)
○ 사이클로옥시네이즈 (Cyclooxygenases)
■ 램 프로스타글란딘 H2 신테이즈-1 (사이클로옥시게네이즈-1 또는CoX1)
((Ram Prostaglandin H2 synthase-1(cyclooxygenase-1 or COX-1)):
양(Ovis aries)
■ 램 프로스타글란딘 H2 신테이즈-1 (COX-1) R120Q/Native 헤테로다이머
((Ram Prostaglandin H2 synthase-1 (COX-1) R120Q/Native Heterodimer)):
양(Ovis aries)
■ 아스피린 아세틸레이티드 COX-1 (Aspirin Acetylated COX-1)
■ 사이클로옥시게네이즈-2 (Cyclooxygenase-2): 생쥐(Mus musculus)
○ 스쿠아렌- 호펜 사이클레이즈 (Squalene-Hopene Cyclases)
■ 스쿠아렌-호펜 사이클레이즈(Squalene-hopene cyclase):
알리사이클로바실러스 아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius)
○ 모노아민 옥시데이즈(Monoamine Oxidases)
■모노아민 옥시데이즈 B (Monoamine Oxidase B): 인간 미토콘드리아 외막(Human mitochondrial outer membrane)
■ 모노아민 옥시데이즈 A (Monoamine Oxidase A): 랫트 미토콘드리아 외막
■ 모노아민 옥시데이즈 A (Monoamine Oxidase A): 인간 미토콘드리아 외막
● G110A 돌연변이
○ 하이드롤레이즈(Hydrolases)
■ 지방산 아미드 하이드롤레이즈 (Fatty acid amide hydrolase):
시궁쥐(Rattus norvegicus)(무스 노르베기쿠스)
○ 옥시도리덕테이즈 (모노토픽) (Oxidoreductases (Monotopic))
■ 설피드(Sulfide):데실유비퀴논과 복합되어 있는 퀴논 옥시고리덕테이즈
(quinone oxidoreductase in complex with decylubiquinone):
극호열균(Aquifex aeolicus)
■ 전자 수송 후라보프로테인-유비퀴논 옥시도리덕테이즈(Electron Transfer Flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase) (ETF-QO):
멧돼지(Sus scrofa)
○ 펩티도글리칸 글리코실트란스페라제
(Peptidoglycan Glycosyltransferases)
■ 펩티도글리칸 글리코실트란스페라제:
황색포도상구균(황색포도상구균(Staphylococcus aureus))
■ 펩티도글리칸 글리코실트란스페라제 페니실린-결합 단백질 1a(PBP1a):
극호열 세균(Aquifex aeolicus)
■ 펩티도글리칸 글리코실트란스페라제 페니실린-결합 단백질 1b(PBP1b):
대장균(Escherichia coli)
○ 펩티데이즈(Peptidases)
■ 시그날 펩티데이즈(Signal Peptidase)(SPase): 대장균(Escherichia coli)
■ 시그날 펩티드 펩티데이즈(Signal Peptide Peptidase) (SppA), 생단백질(native protein): 대장균(Escherichia coli)
○ 디하이드로게네이즈 (Dehydrogenases)
■ 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게네이즈 (Glycerol-3-phosphate dehydrogenase) (GlpD, 생단백질(native)): 대장균(Escherichia coli)
○ 디하이드로오로테이트 디하이드로게네이즈(DHODH, class 2)
■디하이드로오로테이트 디하이드로게네이즈: 대장균(Escherichia coli)
■ 디하이드로오로테이트 디하이드로게네이즈: 곰쥐(Rattus rattus)
■ 디하이드로오로테이트 디하이드로게네이즈 apo 형: 호모 사피엔스
■ 디하이드로오로테이트 디하이드로게네이즈: 열대열원충 3d7
(Plasmodium falciparum 3d7 )
○ 폴리머레이즈 (Polymerases)
■ TagF 테이코산 폴리머라제: 표피포도구균 (Staphylococcus epidermidis)
○ ADP-라이보실레이션 인자(ADP-Ribosylation Factors)
■ ADP-라이보실레이션 인자 (ARF1), 미리스토일레이티드: 맥주효모균
(Saccharomyces cerevisiae )
■ ADP-라이보실 인자 (ARF1*GTP), 미리스토일레이티드: 맥주효모균
(Saccharomyces cerevisiae )
○ 아이소머레이즈 (Isomerases)
■ RPE65 시각 사이클 레티노이드 아이소머레이즈: 소(Bos Taurus)
● 막 통과 단백질: 베타-바렐 (Transmembrane Proteins: Beta-Barrel)
○ 베타-바렐 멤브레이 단백질(Beta-Barrel Membrane Proteins): 다합체(Multimeric)
■ 포린 (Porin): 홍색비유황세균(Rhodobacter Capsulatus)
■ 포림 (Porin): 로도슈도모나스 블라스티카(Rhodopeudomonas blastica)
■ OmpK36 오스모포린(OmpK36 osmoporin): 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia)
■ Omp32 음이온-선택적인 포린 (Omp32 anion-selective porin):
코마모나스 액시드보란(Comamonas acidovorans)
■ Omp32 음이온-선택적인 포린 (Omp32 anion-selective porin):
델프티아 애시도보란스(Delftia acidovorans)
■ OmpF 마트릭스 포린 (OmpF Matrix Porin): 대장균(Escherichia coli)
■ OmpC 오스모포린 (OmpC Osmoporin): 대장균(Escherichia coli)
■ OmpG *모노모* 포린 (OmpG *monomeric* porin): 대장균(Escherichia coli)
■ PhoE: 대장균(Escherichia coli)
■ LamB 말토포린 (LamB Maltoporin): 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium)
■ LamB 말토포린 (LamB Maltoporin): 대장균(Escherichia coli)
■ LamB 말토포린(LamB Maltoporin): 대장균(Escherichia coli)
■ ScrY 슈크로즈 -특이 포린 (ScrY sucrose-specific porin):
쥐티푸스균(Salmonella typhimurium)
■ MspA 마이코박테리아 포린 (MspA mycobacterial porin): 치구균(Mycobacterium smegmatis)
■ OprP 포스페이트-특이 수송체(OprP phosphate-specific transporter):
녹농균(Pseudomonas aeruginosa)
■ OprD 염기성 아미노산 엎테이크 채널 (OprD basic amino aciduptake channel): 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)
■ OpdK 하이드로 카본 수송체 (OpdK hydrocarbon transporter:녹농균(Pseudomonas aeruginosa)
■ PorB 외막 단백질, 자연구조 (PorB outer membrane protein, native structure): 수막염균(수막염균(Neisseria meningitidis) )
○ 베타-바렐 멤브레인 단백질:모노머/다이머(Beta-Barrel MembraneProteins: Monomeric/Dimeric)
■ TolC 외막 단백질 (TolC outer membrane protein): 대장균(Escherichia coli)
■ TolC 외막 단백질, 리간드 차단된(TolC outer membrane protein,ligand blocked): 대장균(Escherichia coli)
■ TolC 외막 단백질 (TolC outer membrane protein) (Y362F, R367E): 대장균(Escherichia coli)
● C2 형 (C2 Form)
● P2:2:2 형(P2:2:2 form)
■ VceC 외막 단백질 (VceC outer membrane protein): 비브리오 콜레라
■ OprM 약물 방출 외막 단백질 (OprM drug discharge outer membrane protein): 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)
■ CusC 중금속 방출 외막 단백질 (CusC heavy metal discharge outer membrane protein): 대장균(Escherichia coli)
■ CusBA 중금속 유출 복합체 외막 단백질 (CusBA heavy-metal efflux complex outer membrane protein): 대장균(Escherichia coli)
■ BenF-유사 포린 (잠정적인)(BenF-like Porin) (putative): 슈도모나스 플루오레스센스
■ OprM 약물 방출 외막 단백질 (OprM drug discharge outer membraneprotein): 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)
■ apo BtuB 코발아민 수송체 (apo BtuB cobalamin transporter): 대장균(Escherichia coli)
■ BtuB: 대장균(Escherichia coli)
■ 중간 결정화에 의한 apo BtuB (apo BtuB by in meso crystallization): 대장균(Escherichia coli)
■ 콜리신 I 수용체 (Colicin I receptor): 대장균(Escherichia coli)
■ OmpA: 대장균(Escherichia coli), 2.5Å
■ 4개의 짧아진 루프를 가진 OmpA(OmpA with four shortened loops): 대장균(Escherichia coli)
● ß-바렐 플렛폼 (BBP)라고 불리움
■ OmpT 외막 프로테이즈 (outer membrane protease): 대장균(Escherichia coli)
■ Pla 풀라즈미노겐 활성제 (자연 1)(Pla Plasminogen activator (native 1): 페스트균(Yersinia pestis)
■ OmpW 외막 멤브레인 단백질(OmpW outer membrane protein): 대장균(Escherichia coli)
● 사방정계형(Orthorhomibic Form)
● 삼방정계형 (Trigonal Form)
■ OprG 외막 단백질 (OprG outer membrane protein): 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)
■ OmpX: 대장균(Escherichia coli)
■ TtoA 외막 단백질 (OMP)(TtoA Outer Membrane Protein) (OMP): 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus) HB27
■ OmpLA (PldA) 외막 포스포 리파제 A 모노머((OmpLA (PldA) outer membrane phospholipase A monomer)): 대장균(Escherichia coli)
■ OmpLA (PldA) 활성-부위 돌연변이 (N156A)((OmpLA (PldA) (active-site 돌연변이) (N156A)): 대장균(Escherichia coli)
■ OpcA 부착 단백질 (OpcA adhesin protein): 수막염균(Neisseria meningitidis)
■ NspA 표면 단백질 (NspA surface protein): 수막염균(Neisseria meningitides)
■ NalP 자동수송체 전위 도메인(NalP autotransporter translocator domain): 수막염균(Neisseria meningitides)
■ NanC 포린, KdgM 포린계의 모델 (NanC Porin, model for KdgM porin family): 대장균(Escherichia coli)
■ Hia1022-1098 트라이머 자동수송체 (Hia1022-1098 trimeric autotransporter): 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus 인플루엔자)
● Hia992-1098
■ EspP 자동수송체, 절개 후 상태 (EspP autotransporter, postcleavage state): 대장균(Escherichia coli)
■ EstA 자동수송체, 전장 ( EstA Autotransporter, full length): 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)
■ PagP 외막 팔미토일 트란스페라제 (PagP outer membrane palimitoyl transferease): 대장균(Escherichia coli))
■ FadL 장-쇄 지방산 수송체 (FadL long-chain fatty acid transporter): 대장균(Escherichia coli)
■ FadL 장-쇄 지방산 수송체 A77E/S100R 돌연변이: 대장균(Escherichia coli)
● ΔS3 뒤틀림(ΔS3 kink)
● P34A 돌연변이 (P34A 돌연변이)
● N33A돌연변이 (N33A 돌연변이)
● ΔNPA 돌연변이 (ΔNPA 돌연변이)
● G212E 돌연변이 (G212E 돌연변이)
■ FadL 유사 장-쇄 지방산 수송체 (FadL homologue long-chain fatty acid transporter): 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)
■ FauA 알카리긴 외막 수송체 (FauA alcaligin outer membrane transporter): 백일해균(Bordetella pertussis)
■ TodX 하이드로카본 수송체 (hydrocarbon transporter): 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida)
■ TbuX 하이드로카본 수송체 : 랄스토니아 피케티(Ralstonia pickettii)
■ Tsx 뉴클레오사이드 수송체(nucleoside transporter)(apoprotein): 대장균(Eschericia coli)
■ FhuA, 페리크롬-철 수용체(FhuA, Ferrichrome-iron receptor) : 대장균(Escherichia coli)
■ FepA, 페릭 엔테로박신 수용체 (FepA, Ferric enterobactin receptor) 대장균(Escherichia coli)
■ FecA, siderophore 수송체: 대장균(Escherichia coli)
■ HasR 햄-엎테이크 수용체 (HasR heme-uptake receptor): 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)
● Ile671Gly 돌연변이
■ FptA, 피요챌린 외막 수용체 (FptA, pyochelin outer membrane receptor): 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)
■ FpvA, 피요베르딘 수용체(FpvA, Pyoverdine receptor): 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)
■ FpvA, 피요베르딘 수용체(FpvA, Pyoverdine receptor) (apo 형): 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)
■ P 선모 안내 전위 도메인,PapC130-640 (P pilus usher translocation domain, PapC130-640): 대장균(Escherichia coli)
○베타-배렐 막 단백질 :미토콘드리아 외막 (Beta-Barrel Membrane Proteins: Mitochondrial Outer Membrane)
■ VDAC-1 전압 의존적 음이온 채널(VDAC-1 voltage dependent anion channel): 사람(Human)
■ VDAC-1 전압 의존적 음이온 채널 (VDAC-1 voltage dependent anion channel): 쥐과(Murine)
○ Omp85-TpsB 외막 수송체 수퍼패밀리 (Outer Membrane Transporter Superfamily)
■ FhaC 필라멘토스 헤마글루티닌 수송체(FhaC Filamentous Hemagglutinin Transporter): 백일해균(Bordetella pertussis)
■ TeOmp85-N POTRA 도메인 (TeOmp85-N POTRA domains): Thermosynechococcus anaOmp85-N Anabaena sp. PCC7120
■ BamA: 대장균(Escherichia coli)
■ BamE: 대장균(Escherichia coli)
○ 비-연속적인, 베타-쉬트 포아-형성 톡신 (Non-constitutive. Beta-sheet pore-forming Toxins)
■ 알파-헤모라이신 (Alpha-hemolysin): 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)
■ LukF: 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)
■ 퍼프린고라이신 O (PFO) 프로모토 (((Perfringolysin O)(PFO) protomer)): 가스괴저균(Clostridium perfringens)
■ 탄저병 방어 항원 (PA)((Anthrax Protective Antigen (PA)) 및 치사 인자 (LF) 프리채널 복합체((Lethal Factor (LF) Prechannel)Complex )): 탄저균(Bacillus anthracis)
■ 림포싸이트 프리포린 모노머(Lymphocyte preforin monomer): 생쥐(Mus musculus)
● Transmembrane Proteins: Alpha-Helical
막통과 단백질: 알파-헬리칼
○ 비-연속적. 알파-헬리칼 포아-형성 톡신 (Non-constitutive. Alpha-helical Pore-forming Toxins).
■ 사이토리신 A (Cytolysin A) (ClyA, aka HlyE): 대장균(Escherichia coli)
■ 말미잘에서 온 FraC 진핵세포 포아-형성 톡신(FraC eukaryotic pore-forming toxin from sea anemone): 딸기 말미잘(Actinia fragacea)
○ 외막 멤브레인 단백질 (Outer Membrane Proteins)
■ Wza 트란스로콘 캡슐라 폴리삭카라이드를 위한 Wza 트란스로콘(Wza translocon for capsular polysaccharides: 대장균(Escherichia coli)
■ 포린 B 모노머 (Porin B monomer): 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)
■ 타입 IV 외막 멤브레인 분비 복합체(Type IV outer membrane secretion complex): 대장균(Escherichia coli)
■ 박테리오로돕신 ((Bacteriorhodopsin) (BR): 염생세균(Halobacterium salinarium)
■ 할로로돕신 (Halorhodopsin) (HR): 염생세균(Halobacterium salinarium)
■ 할로로돕신 (Halorhodopsin) (HR): 나트로노모나스 개미(Natronomonas pharaonis)
■ 감각 로돕신 I (Sensory Rhodopsin I)(SRI): 아나베나(Anabaena) (Nostoc) sp. PCC7120
■ 감각 로돕신 II(Sensory Rhodopsin II) (SRII): 나트로노모나스 개미(Natronomonas pharaonis)
■ 아케아로돕신-1 (Archaerhodopsin-1)(aR-1): 할로루브롬(Halorubrum) sp. aus-1
■ 아케아로돕신-2 (Archaerhodopsin-2)(aR-2): 할로루브롬(Haloroubrum) sp. aus-2
■ 잔토로돕신 (Xanthorhodopsin): 살리니박터 루버(Salinibacter ruber)
○ G 단백질- 공역 수용체 (G Protein-Coupled Receptors) (GPCRs)
■ 로돕신 (Rhodopsin): 소 간상체 외부 절편( Bovine Rod Outer Segment (Bos Taurus)
■ 로돕신 (Rhodopsin): 오징어 (Squid) (Todarodes pacificus)
■ β1 아드레너직 수용체(adrenergic receptor) (engineered): 칠면조(Meleagris gallopavo) (turkey)
■ β2 아드레너직 수용체: 호모 사피엔스(Homo sapiens)
■ 메틸화된 β2 아드레너직 수용체 (Methylated β2 adrenergic receptor): 호모 사피엔스(Homo sapiens)
■ A2A 아데노신 수용체 (adenosine receptor): 호모 사피엔스(Homo sapiens)
■ CXCR4 케모카인 수용체 (Chemokine Receptor): 호모 사피엔스(Homo sapiens)
■ 도파민 D3 수용체 (Dopamine D3 Receptor): 호모 사피엔스(Homo sapiens)
○ 자동 접힘" 막단백질" (Sec-비의존적)(Autonomously Folding "Membrane Proteins"(Sec-independent)
■ 미스틱 멤브레인-인테그레이팅 단백질 (Mistic membrane-integrating protein): 고초균(Bacillus subtilis)
○ 당단백질 (Glycoproteins)
■ 글리코포린 A 막통과-도메인 다이머 (Glycophorin A transmembrane-domain dimer): 호모 사피엔스(Homo sapiens)
○ SNARE 단백질 부류 (SNARE Protein Family)
■ 신탁신 1A/SNAP-25/시납토브레빈-2 복합체 (Syntaxin 1A/SNAP-25/Synaptobrevin-2 Complex): 곰쥐(ratus ratus)
○ 인테그린 어드헤신 수용체 (Integrin Adhesion Receptors)
■ 인간 인테그린 αIIbβ3 막통과-사이토플라즈믹 헤테로다이머(Human Integrin αIIbβ3 transmembrane-cytoplasmic heterodimer): 호모 사피엔스(Homo sapiens)
○ 히스티딘 키나제 수용체(Histidine Kinase Receptors)
■ ArcB (1-115) 호기성 호흡 조절 센서 멤브레인 도메인 ((ArcB (1-115) Aerobic Respiration Control sensor membrane domain)): 대장균(Escherichia coli)
■ QseC (1-185) 센서 단백질 멤브레인 도메인 (( QseC (1-185) Sensor protein membrane domain): 대장균(Escherichia coli)
■ KdpD (397-502)센서 단백질 멤브레인 도메인 ((KdpD (397-502) Sensor protein membrane domain)): 대장균(Escherichia coli)
○ 면역 수용체(Immune Receptors)
■TCR-CD3 복합체의 막통과ζ-ζ다이머(Transmembrane ζ-ζdimer of the TCR-CD3 complex): 호모 사피엔스(Homo sapiens)
■ DAP12 dimeric: 호모 사피엔스(Homo sapiens)
○ 채널 (Channels): 포타슘 및 소듐 이온-선택적 (Potassium and Sodium Ion-Selective)
■ KcsA 포타슘 채널, H+ gated: 스트렙미세스 리비단(Streptomyces lividans)
■ KcsA 포타슘 채널 E71H-F103A 불활성화-상태 돌연변이 (닫힌 상태) (inactivated-state 돌연변이)(closed state): 스트렙미세스 리비단(Streptomyces lividans)
■ KcsA 포타슘 채널 E71I 모달-게이트 돌연변이 (modal-gating 돌연변이): 스트렙미세스 리비단(Streptomyces lividans)
■ KvAP 볼테이지-게이티드 포타슘 채널 (Voltage-gated potassium Channel): 에로피룸 페르닉스(Aeropyrum pernix)
■ Kv1.2 볼테이지-게이티드 포타슘 채널: 시궁쥐(Rattus norvegicus)
■ Kv1.2/Kv2.1 볼테이지-게이티드 포타슘 채널 카이메라(chimera): 시궁쥐(Rattus norvegicus)
● F233W 돌연변이
■ MthK 포타슘 채널 Ca++ 게이티드(Ca++ gated): 메타생성 고온균(Methanothermobacter thermautotrophicus )
■ 인간 BK 채널 Ca2+ 활성 장치 (Human BK Channel Ca2+-activation apparatus): 호모 사피엔스(Homo sapiens)
■ Kir3.1-비진핵세포 Kir 키메라 (Kir3.1-Prokaryotic Kir Chimera): 생쥐(Mus musculus) & 버크홀데리아 제노보나스(Burkholderia xenovornas)
■ Kir2.2 내부쪽-정류 포타슘 채널(Kir2.2 Inward-Rectifier Potassium Channel): 닭(Gallus gallus)
■ KirBac1.1 내부쪽-정류 포타슘 채널: 유비저균(Burkholderia pseudomallei)
■ MlotiK1 사이클릭 뉴클레오티드-조절 K+-채널(MlotiK1 cyclic nucleotide-regulated K+-channel): 메소리조븀 로티(Mesorhizobium loti)
■ mGIRK1 G-단백질 게이티드 내부쪽 정류 포타슘채널(mGIRK1 G-Protein Gated Inward Rectifying Potassium Channel): 생쥐(Mus musculus)
■ NaK 채널 (Na+ 복합체) ((NaK channel)(Na+complex)): 세레우스균(Bacillus cereus)
● D66/S70E 돌연변이
● D66N 돌연변이
● D66E 돌연변이
■CNG-모방 NaK 채널 돌연변이(CNG-mimicking NaK channel 돌연변이): 세레우스균(Bacillus cereus)
■ NaK 채널; K+ 선택적 돌연변이: 세레우스균(Bacillus cereus)
○ 채널 (Channels): 다른 이온 채널(Other Ion Channels)
■ GluA2 글루타메이트 수용체 (Glutamate receptor) (AMPA-subtype): 시궁쥐(Rattus norvegicus)
■ M2 프로톤 채널 (proton channel): 인플루엔자 A
■ M2 프로톤 채널: 인플루엔자 B
■ ASIC1 애시드-감지 이온 채널 (ASIC1 Acid-Sensing Ion Channel) : 닭(Gallus gallus)
■ ATP-게이티드 P2X4 이온 채널(ATP-gated P2X4 ion channel) (apo 단 백질): 제브라 다니오(Danio rerio) (zebra fish)
■ 니코티닉 아세틸콜린 리셉터 포아 (Nicotinic Acetylcholine Receptor Pore): 얼룩전기 가오리(Torpedo marmorata)
■ 비진핵세포 펜타머 리간드-게이티드 이온채널 (Prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel) (pLGIC): 에르비니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi)
■ 비진핵세포 펜타머 리간드-게이티드 이온채널 (GLIC): 그로박터 바이에레투스(Gloebacter violaceus)
● E221A 돌연변이
■ 비진핵세포 펜타머 리간드-게이티드 이온채널 (GLIC), 야생형(Wild type)-TBSb 복합체: 그로박터 바이에레투스(Gloebacter violaceus)
● 야생형-TEAs 복합체
● 221D-TEAs 복합체
● 야생형-TMAs 복합체
● 야생형-bromo-lidocaine 복합체
● 야생형-Cd2+ 복합체
●야생형 -Zn2+ 복합체
● 야생형-Cs+ 복합체
■ MscL 메카노샌시티브 채널(Mechanosensitive channel): Mycobacterium tuberculosis
■ MscS 볼티지-모듈레이티드 메카노샌시티브 채널 (voltage-modulated mechanosensitive channel): 대장균(Escherichia coli)
■ CorA Mg2+ 수송체: Thermotoga maritime
■ MgtE Mg2+ 수송체: 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus)
■ SLAC1 음이온 채널 (anion channel), TehA 호모로그(homolog)(야생형): 헤모필루스 인플루엔자(헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus 인플루엔자))
● F262A 돌연변이
● F262L 돌연변이
● F262V 돌연변이t
● G15D 돌연변이
○채널 (Channels) : 단백질-전도(Protein-Conducting)
■ SecYEβ 단백질-전도 채널: Methanococcus jannaschii
○채널(Channels): 아쿠아포린 및 글리세로포린 (Aquaporins and Glyceroporins
■ AQP0 아쿠아포린 물 채널 (water channel): Bovine lens
■ AQP1 아쿠아포린 물 채널 : 인간 적혈구 세포
■ AQP1 아쿠아포린 물 채널:소 적혈구세포(Bovine red blood cell)
■ AQP4 아쿠아포린 물 채널: 쥐 교질세포 (rat glial cells)
● S180D 돌연변이
■ AQP4 아쿠아포린 물 채널: 인간
■ AQP5 아쿠아포린 물 채널(HsAQP5):인간
■ AqpM 아쿠아포린 물 채널: Methanothermobacter marburgensis■ AqpZ 아쿠아포린 물 채널: 대장균(Escherichia coli)
■ AqpZ 아쿠아포린 (C9S/C20S), T183C 돌연변이: 대장균(Escherichia coli)
● L170C 돌연변이
■ AqpZ 아쿠아포린 돌연변이 F43W : 대장균(Escherichia coli)
● H17G/T183F 돌연변이
● F43WH174G/T183F 돌연변이
■ SoPIP2;1 식물 아쿠아포린 (plant aquaporin): Spinacia oleracea
■ GlpF 글리세롤 촉진자 채널 (glycerol facilitator channel): 대장균(Escherichia coli)
■ GlpF, 글리세롤 촉진자 채널, W84F/F200T-돌연변이: 대장균(Escherichia coli)
■ PfAQP 아쿠아글리세로포린 (aquaglyceroporin): Plasmodium falciparum
■ Aqy1 이스트 아쿠아포린 (yeast aquaporin) (pH 3.5): Pischia pastoris
○채널 (Channels) : 포르메이트 나이트레이트 수송체(FNT)부류((Formate Nitrate Transporter (FNT) Family))
■ FocA, 펜타머 아쿠아포린-유사 포르메이트 수송체(pentameric aquaporin-like formate transporter): Escherichia coli
■ FocA 포르메이트 없는 포르메이트 수송체 (formate transporter without formate): 비브리오 콜레라
■ FocA 포르메이트 수송체: Salmonela typhimurium
○ 채널 (Channels): 우레아 수송체 (Urea Transporters)
■ 우레아 수송체 : Desulfovibrio vulgaris
■ Connexin 26 (Cx26; GJB2) gap junction: Human
○ 채널 (Channels): Amt/Rh 단백질
■ AmtB 암모니아 채널 (ammonia channel) (돌연변이): Escherichia coli
■ AmtB 암모니아 채널 (야생형 wild-type): 대장균(Escherichia coli)
● H168E 돌연변이
● H168A 돌연변이
● H168F 돌연변이
● H318A 돌연변이
● H318 돌연변이
● H318F 돌연변이
● H168A/H318A 돌연변이
■ Amt-1 암모니아 채널: Archaeoglobus fulgidus
■ Rh 단백질, 가능한 암모니아 또는 CO2 채널(possible ammonia or CO2 channel): Nitrosomonas europaea
■ Human Rh C 당단백질 암모니아 수송체 (glycoprotein ammonia transporter): 호모 사피엔스(Homo sapiens)
○ 내막 프로테아제 (Intramembrane Proteases)
■ GlpG 롬보이드-부류 내막프로테아제 (GlpG rhomboid-family intramembrane protease): 대장균(Eschericia coli)
● W136A 돌연변이
● S201T Active-Site 돌연변이
■ GlpG 롬보이드-부류 내막 펩티데이즈 (GlpG rhomboid-family intramembrane peptidase_: 헤모필루스 인플루엔자(헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus 인플루엔자))
■ Site-2 프로테아제 (S2P). 내막 메탈로프로테아제 ((Site-2 Protease (S2P), Intramembrane Metalloprotease)): Methanocaldococcus jannaschii
■ 신호 펩티드 펩티데이즈 (SppA), 원래형 단백질 ((Signal Peptide eptidase) (SppA), native protein: 대장균(Escherichia coli)
○ 멤브레인-결합된 메탈로프로테아제 (Membrane-Bound Metalloproteases)
■ apo-FtsH ATP-의존적 메탈로프로테아제 (apo-FtsH ATP-dependent metalloprotease): Thermotoga maritima
○ H+/Cl- 교환 수송체(H+/Cl- Exchange Transporters)
■ H+/Cl- 교환 수송체: 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium)
■ H+/Cl- 교환 수송체: 대장균(Escherichia coli)
● E148A 돌연변이
● E148Q 돌연변이
● S107A/E148Q/445A 돌연변이
■ Monomeric H+/Cl- 교환 수송체: 대장균(Escherichia coli)
■ +/Cl- 진핵세포 교환 수송체(+/Cl- Eukaryotic Exchange Transporter): Cyanidioschyzon merolae
■ H+/Cl- 진핵세포 교환 수송체: Synechocystis sp. pcc 6803
○박테리아 머큐리 해독 단백질 (Bacterial Mercury Detoxification Proteins)
■ MerF Hg(II) 수송체 (transporter): Morganella morganii
○다중-약물 유출 수송체 (Multi-Drug Efflux Transporters)
■ AcrB 박테리아 다중-약물 유출 수송체 (bacterial multi-drug efflux transporter): 대장균(Escherichia coli)
■ AcrB 박테리아 다중-약물 유출 수송체, apo 단백질, ``````` N109A 돌연변이: 대장균(Escherichia coli)
■ AcrB 박테리아 다중-약물 유출 수송체, D407A 돌연변이t: 대장균(Escherichia coli)
■ MexB 다중-약물 유출 수송체: Pseudomonas aeruginosa
■ CusA 메탈-이온 유출 펌프 (CusA metal-ion efflux pump): 대장균(Escherichia coli)
■ EmrE 박테리아 다중-약물 유출 수송체: 대장균(Escherichia coli)
■ NorM 다중-약물 및 톡신 화합물 분출 (MATE)수송체(NorM Multidrug and Toxin Compound Extrusion (MATE) transporter ) (apo 형): 비브리오 콜레라o
○ 이코사노이드 및 글루타티온 대사에서의 멤브레인-연관된 단백질(MAPEG) (Membrane-Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione Metabolism)(MAPEG)
■ 마이크로조말 프로스타글란딘 E 신테이즈 1 (Microsomal Prostaglandin E Synthase 1): Human
■ MK-591 억제제가 결합된 5- 리포옥시게네이즈-활성화 단백질(FLAP) ((5-Lipoxygenase-Activating Protein (FLAP) with Bound MK-591 Inhibitor)): Human
■ 류코트리엔 LTC4 신테이즈(Leukotriene LTC4 Synthase): Human
○ 메저 훠시리테이터 수퍼패밀리(MFS)수송체((Major Facilitator Superfamily) (MFS) Transporters))
■ LacY 락토즈 퍼미에이즈 수송체 (Lactose Permease Transporter (C154G 돌연변이): 대장균(Escherichia coli)
■ LacY 락토즈 퍼미에이즈(야생형) TDG와 함께 ((LacY Lactose Permease (wild-type) with TDG)): 대장균(Escherichia coli)
■ FucP 밖으로-향한 구조의 후코즈 수송체 (Fucose Transporter in outward-facing conformation): 대장균(Escherichia coli)
● N162A 돌연변이
■ GlpT 글리세롤-3-포스페이트 수송체 (Glycerol-3-Phosphate Transporter): 대장균(Escherichia coli)
■ EmrD 다중 약물 수송체 (Multidrug Transporter): Escherichia coli
■ PepTSo 올리고펩티드-프로톤 동시수송체 (Oligopeptide-proton symporter): Shewanella oneidensis
○ 용질 소듐 동시 수송체 (SSS) 부류 ((Solute Sodium Symporter (SSS) Family))
■ vSGLT Sodium Galactose Transporter: Vibrio parahaemolyticus
● K294A 돌연변이
○ 뉴클레오베이스-양이온-동시수송-1 부류(((Nucleobase-Cation-Symport-1 (NCS1) Family))
■ Mhp1 벤질-히단토인 수송체 (Mhp1 Benzyl-hydantoin transporter) : Microbacterium liquefaciens
○ 베테인/콜린/카르니틴 수송체 (BCCT)부류 ((Betaine/Choline/Carnitine Transporter) (BCCT) Family))
■ BetP 글리신 베타인 수송체(BetP glycine betaine transporter): 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)
■ CaiT 카르니틴 수송체 (CaiT carnitine transporter): Escherichia coli
■ CaiT 카르니틴 수송체 : Proteus mirabilis
○ 아미노산/폴리마민/오르가노카티온 (APC) 수퍼패밀리(((Amino Acid/Polyamine/Organocation (APC) Superfamily))
■ AdiC 아르기닌:아가마틴 역수송체(AdiC Arginine:Agmatine Antiporter): 대장균(Escherichia coli)
● N22A, L123W 돌연변이
● N101A 돌연변이
■ apo ApcT Na+ -독립적 아미노산 수송체(apo ApcT Na+-independent Amino Acid Transporter): Methanocaldococcus jannaschii
○ 아미노산 2차 수송체 (Amino Acid Secondary Transporters)
■ LeuTAa 루인신 수송체(LeuTAa Leucine transporter): Aquifex aeolicus
■ 야생형 LeuT 수송체 (Wild-type LeuT transporter): Aquifex a eolicus
● E290S 돌연변이
■ 나이트로옥사이드 스핀 레블된 돌연변이 LeuT 수송체 (F177R1)((돌연변이 LeuT transporter with Nitroxide Spin Label) (F177R1): Aquifex aeolicus
● I204R1 돌연변이
■ 글루타메이트 수송체 호모로그(GltPh) ((Glutamate Transporter Homologue (GltPh)): Pyrococcus horikoshii
■ 아스파르테이트 수송체 Li+-결합 상태(GltPh)((Aspartate Transporter Li+-Bound State(GltPh)): Pyrococcus horikoshii
○ 양이온 확산 촉진제 (CDF) 부류 ((Cation Diffusion Facilitator (CDF) Family))
■ YiiP 아연 수송체(YiiP Zinc Transporter): 대장균(Escherichia coli)
○ 역수송체 (Antiporters)
■ NhaA Na+/H+ 역수송체: 대장균(Escherichia coli)
■ 미토콘드리아 ADP/ATP 운반체 (Mitochondrial ADP/ATP Carrier): Bovine heart mitochondria
○ 에너지-커플링 팩터(ECF)수송체 ((Energy-Coupling Factor)(ECF) Transporters))
■ RibU, 리보후라빈 수송체 S 성분 (RibU, S Component of the Riboflavin Transporter): 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)
○ ATP결합 카셋트 (ABC) 수송체 ((ATP Binding Cassette (ABC) Transporters))
■ BtuCD 비타민 B12 수송체: 대장균(Escherichia coli)
■ Sav1866 다중약물 수송체 (Multidrug Transporter) 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)
■ 몰리부테이트 수송체 ModB2C2 (Molybdate Transporter ModB2C2): Archaeoglobus fulgidus
■ ModBC 몰리부데이트 ABC 수송체 (ModBC Molybdate ABC Trnsporter): Methanosarcina acetivorans
■ HI1470/1 잠정적 메탈-킬레이트-타입 ABC 수송체 (HI1470/1 Putative Metal-Chelate-type ABC Transporter): Haemophilus 인플루엔자
■ 결합된 AMPPNP를 가진 MsbA 리피드 "후립페이즈" (MsbA Lipid "flippase" with bound AMPPNP): 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium)
■ P-당단백질(P-Glycoprotein): 생쥐(Mus musculus) (mouse)
■ MalFGK2-MBP 말토즈 업테이크 수송체 복합체(MalFGK2-MBP Maltose uptake transporter complex): 대장균(Escherichia coli)
■ MetNI 메티오닌 업테이크 수송체 복합체 (MetNI Methionine uptake transporter complex): 대장균(Escherichia coli)
■ FbpC 훼릭 철-흡수 수송체 뉴클레오타이드-결합 도메인(FbpC ferric iron-uptake transporter nucleotide-binding domain): Neisseria gonorrhoeae
○ K+ 수송체 수퍼패밀리 (SKT 단백질)((Superfamily of K+ Transporters (SKT proteins))
■ TrkH 포타슘 이온 수송체 (potassium ion transporter): Vibrio parahaemolyticus
■ 칼슘 ATPase Calcium ATPase): 토끼 근소포체 (Rabbit sarcoplasmic reticulum)
■ Na,K-ATPase: 돼지 신장(Pig Kidney)
■ Na,K-ATPase: 상어 (Shark)
■ Na,K-ATPase 조절 단백질 FXYD1(Na,K-ATPase Regulatory Protein F XYD1): Human
■ 포스포람벤 호모펜타머(Phospholamban homopentamer): 인간 근소포 체(Human sarcoplasmic reticulum)
■ 플라즈마 멤브레인 H+-ATPase (Plasma Membrane H+-ATPase): Arabidopsis thaliana
○ V-형 ATPase (V-type ATPase)
■ V-형 Na+-ATPased의 로터(Rotor of V-type Na+-ATPase): Enterococcus hirae
■ V1-ATPase 복합체: Thermus thermophiles
■ V1-ATPase의 A3B3 복합체(A3B3 complex of V1-ATPase): Thermus thermophilus
○ F-형 ATPase (F-type ATPase)
■ 소 심장 미토콘드리아로 부터 온 F1-ATPase (F1-ATPase from bovine heart mitochondria): Bos Taurus
■ ATP 신테이즈 (F1c10)((ATP synthase (F1c10)): S. cerevisiae
■ F1 ATPase: S. cerevisiae
■ Na+-의존 F-ATP 신테이즈의 로터 (c11)((Rotor (c11) of Na+-dependent F-ATP Synthase)): Ilyobacter tartaricus
■ 시금치 클로로플라스트의 H+-의존 F-ATP 시테이즈의 로터 (c14) ((Rotor (c14) of H+-dependent F-ATP Synthase of spinach chloroplasts)): Spinacia oleracea
■ 알카리필릭 시아노박테리움의 H+-의존 F-ATP 신테이즈의 로터 (c15) ((Rotor (c15) of H+-dependent F-ATP Synthase of an alkaliphilic cyanobacterium)): Spirulina platensis
■ H+-의존 F-ATP 신테이즈의 로터 (c13) ((Rotor (c13) of H+-dependent F-ATP Synthase)): Bacillus pseudofirmus
■ H+-의존 F-ATP 신테이즈의 말초 줄기 (Peripheral stalk of H+-dependent F-ATP Synthase): 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus)
○ 포스포트란스페라제 (Phosphotransferases)
■ 디아실글리세롤 키나제 (DAGK)((Diacylglycerol kinase) (DAGK)): 대장균(Escherichia coli)
○ 하이드롤레이즈 (Hydrolases)
■ 에스트론 설파타제 (Estrone Sulfatase): Human placenta
○ 옥시게네이즈 (Oxygenases)
■ 미립자 메탄 모노옥시게네이즈 (pMMO) ((Particulate methane monooxgenase (pMMO)): Methylococcus capsulatus
■ 미립자 메탄 모노옥시게네이즈 (pMMO) ((Particulate methane monooxgenase (pMMO)): Methylosinus trichosporium OB3b
○ 옥시도리덕테이즈 (Oxidoreductases)
■ 설피드:퀴논 옥시도리덕테이즈 (Sulfide:quinone oxidoreductase): Aquifex aeolicus
■ 전자 수송 후라보프로테인-유비퀴논 옥시도리덕테이즈 (ETF-QO): Sus scrofa ((Electron Transfer Flavoprotein-ubiquinone oxidore uctase(ETF-QO)))
■ 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게네이즈 (GlpD, 원래형) (Glycerol-3-phosphate dehydrogenase) (GlpD, native): 대장균(Escherichia coli)
■ NarGHI 나이트레이트 리덕테이즈 A (NarGHI Nitrate Reductase A): 대장균(Escherichia coli)
● K86A 돌연변이
● H66Y 돌연변이
■ NrfH 사이토크롬 C 퀴놀 디하이드로게네이즈(NrfH Cytochrome C Quinol Dehydrogenase): Desulfovibrio vulgaris
■ DsbB-DsbA 페리플라즈믹 옥시데이즈 복합체 (DsbB-DsbA Periplasmic Oxidase Complex): E. coli
■ DsbB-Fab 복합체: 대장균(Eschericia coli)
■ wtDsbB-DsbA(Cys133A)-Q8 복합체: E. coli
■ 비타민 K 에폭사이드 리덕테이즈 (Vitamin K epoxide reductase): Synechococcus sp.
○ Mo/W bis-MGD 옥시도리덕테이즈 (Mo/W bis-MGD Oxidoreductases)
■ 폴리설피드 리덕테이즈 PsrABC (원래형)((Polysulfide Reductase PsrABC (native)): Thermus thermophiles
○ 전자 수송 체인 복합체(Electron Transport Chain Complexes): 복합체 I (Complex I)
■ 복합체 1 멤브레이 도메인 (Complex I membrane domain): 대장균(Escherichia coli)
■ 복합체 1 캄프리트 (Complex I complete): Thermus thermophiles
○ 전자 수송 체인 복합체 (Electron Transport Chain Complexes): 복합체 II (Complex II)
■ 네이티브 후말레이트 리덕테이즈 복합체 (Native Fumarate Reductase Complex): 대장균(Escherichia coli)
■ 후말레이트 리덕테이즈 복합체 (Fumarate Reductase Complex): Wolinella succinogenes
■포르메이트 디하이드로게네이즈-N (Formate dehydrogenase-N): E scherichia coli
■ 숙시네이트 디하이드로게네이즈 (복합체 II)((Succinate dehydrogenase (Complex II)): 대장균(Escherichia coli)
■ 숙시네이트: 유비퀴논 옥시도리덕테이즈 (SQR, 복합체 II) ((Succinate:ubiquinone oxidoreductase (SQR, Complex II)): porcine heart mitochondria
■ 숙시네이트:( 유비퀴논 옥시도리덕테이즈 (SQR, 복합체 II
((Su ccinate:ubiquinone oxidoreductase (SQR, Complex II): chicken heart mitochondria
○ 전자 수송 체인 복합체 (Electron Transport Chain Complexes) : 복합체 III (사이토크롬 bcl) ((Complex III (Cytochrome bc1))
■ 사이토크롬 bcl (Cytochrome bc1): Bos Taurus
■ 사이토크롬 bcl (Cytochrome bc1): 닭(Gallus gallus)
■ 사이토크롬 bcl (Cytochrome bc1): Sarcomyces cerevisiae
■ 사이토크롬 bcl (Cytochrome bc1): Rhodobacter Sphaeroidos
○ 전자 수송 체인 복합체(Electron Transport Chain Complexes) : 옥시제닉 포토신테시스의 사이토크롬 b6f (Cytochrome b6f of Oxygenic Photosynthesis)
■사이토크롬 b6f 복합체 (Cytochrome b6f Complex):Mastigocladus laminosus
■ 사이토크롬 b6f 복합체 (Cytochrome b6f Complex): Chlamydomonas reinhardtii
■ 사이토크롬 b6f 복합체 (Cytochrome b6f Complex): Nostoc sp. PCC 7120
○ 전자 수송 체인 복합체 (Electron Transport Chain Complexes): 복합체 IV (사이토크롬 C 옥시데이즈)((Complex IV (Cytochrome C Oxidase))
■ 사이토크롬 C 옥시데이즈 aa3 (Cytochrome C Oxidase, aa3): Bos taurus (bovine) heart mitochondria
■ 사이토크롬 C 옥시데이즈 aa3 (Cytochrome C Oxidase, aa3): Paracoccus denitrificans
● N131D 변이
■ 사이토크롬 C 옥시데이즈 cbb3(Cytochrome Oxidase, cbb3): Pseudomonas stutzer
■ 사이토크롬 ba3 (Cytochrome ba3): 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus)
■ 사이토크롬 C 옥시데이즈 야생형(Cytochrome C Oxidase wild-type): Rhodobacter sphaeroides
■ 유비퀴놀 옥시데이즈 사이토크롬 bo3 (Ubiquinol Oxidase, cytochrome bo3): E. coli
○ 니트릭 옥사이드 리덕테이즈 (Nitric Oxide Reductases)
■ 니트릭 옥사이드 리덕테이즈 (Nitric Oxide Reductase): 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)
○ 포토시스팀 (Photosystems)
■ 포토시스팀 I(Photosystem I): Thermosynechococcus elongates
■ 포토시스팀 I (식물)((Photosystem I(plant)): Psium sativum
■ 포토시스팀 II (Photosystem II): Thermosynechococcus elongates
■ 포토시스팀 II(Photosystem II): Thermocynechococcus vulcanus
○ 라이트-하베스팅 복합체 (Light-Harvesting Complexes)
■라이트-하베스팅 복합체 ( Light-Harvesting Complexes): Rhodopseudomonas acidophila
■ 라이트-하베스팅 복합체(Light-Harvesting Complexes): Rhodospirillum molischianum
■ 라이트-하베스팅 복합체 LHC-II, 시금치 포토시스템 -II (Light-Harvesting omplexes LHC-II, Spinach Photosystem II): Spinacia oleracia
■라이트-하베스팅 복합체 CP29, 시금치 포토시스템 II(Light-Harvesting Complex CP29, Spinach Photosystem II): Spinacia oleracia
■ 라이트-하베스팅 복합체 LHC-II, 완드콩 포토시스템 II (Light-Harvesting Complex LHC-II, Pea Photosystem II): Pisum sativum
○ 광합성 반응 센타 (Photosynthetic Reaction Centers)
■ 광합성 반응 센터 (Photosynthetic Reaction Center): Blastochloris viridis
■ 광합성 반응 센터 (Photosynthetic Reaction Center): Rhodobacter sphaeroides
■광합성 반응 센터 (Photosynthetic Reaction Center): Thermochromatium tepidum
실시예 1: 폴리머 제조
단계 (a);PB 합성
폴리부타디엔은 Hillmyer, M. A.; Bates, F. S. 1996,　9297, 6994-7002
의 프로토콜에 따라 일부 수정하여 합성되었다. 부타디엔의 음이온적 중합은 2차-부틸-부틸리티움 (sec-butyl-butyllithium)을 시작제로서 사용하여 THF 에서 -60 에서 -50°C 에서 수행되었다. 건조된 2 넥 플라스크(2 neck flask) 하룻밤 동안 오븐에서 건조되었고 다른 한쪽에 격막을 가진 한 포트에 라인(line)을 부착시켰다. 이 플라스크는 불꽃으로 건조 시키고 교반 바를 첨가하였다. 건조 Solv THF (DRY Solv THF) 30 ml를 2 넥 플라스크(2 neck flask)에 카눌라를 사용하여 넣었다. 11ml의 부타디엔 (0.13 mol)이 응축 플라스크에서 응축되었다. 폴리부타디엔을 응축하기 위해 액체 질소가 처음 사용되었으며 그 후 건조 아이스-아세톤 베스(ice-aceton bath)를 사용하여 녹였다. 이를 카눌라를 사용하여 2 넥 플라스크(2 neck flask)에 옮겼다. 7 ml(0.0098 moles)의 1.4 M 2차-부틸-부틸리티움 (sec-butyl-butyllithium) 시작제를 재빨리 첨가시켰다. 중합반응이 3시간 동안 진행되도록 하였다. 부타디엔으로 완전히 전환되었을 때 -60°C 에틸렌 옥사이드 2ml(0.051 moles)을 첨가하여 말단 캡핑을 완성 시켰다. 그 후 산성 메탄올 (5 ml HCl:50 ml 메탄올)을 사용하여 폴리부타디엔 알코올을 방출시키고 용매를 증발시켜 폴리부타디엔 알코올을 분리하였다. 폴리머의 사이클로핵산 용액을 증류수로 추출하여 무기 염들을 제거 하였다.
단계 (b): PB-PMOXA 합성
20 g (0.0260M)의 폴리부타디엔 (Mn 769 g/mol)을 2.63g (0.0260M)의 트리 에틸아민 (triethylamine)(SigmaAldrich T0886) 존재하에 7.33g (0.0260M)의 무수 트리필릭 에시드 (triflic acid anhydride) (SigmaAldrich 176176-5G) 로 -10 deg C 에서 아르곤 (argon) 하에서 기능화시켰다. 유기 염들은 더 나아가 여과되었다. 트라이플레이트-기능화된 PB는 2-메틸-2-옥사졸린 (2-methyl-2-oxazoline)(SigmaAldrich 137448)의 양이온적 링 열기 중합의 마크로-시작제(macro-initiator)로서의 역할을 한다. 중합은 무수 에틸 아세테이트(SigmaAldrich 270989)에서 40 deg C 에서 12시간 동안 진행되도록 두었다. 반응은 에틸렌 디아민 0.4g (SigmaAldrich 03550)으로 종결시켰다. 이는 일차- 및 2차-아민 으로 끝나는 PB-PMOXA 폴리머를 제공한다.
폴리머 특성 분석:
PB12-OH
NMR
5.45 ppm -CH=CH2 (repeating unit), 4.94 ppm -CH=CH 2 (repeating unit), 2.12 ppm CH (repeating unit - backbone), 1.27 ppm CH2 (repeating unit - backbone), CH2 and CH3 3.65 ppm 0.82 ppm - end groups.
폴리머 용매 Mn Mw PDI
PB12 CHCl3 526 602 1.14
PB12PMOXA5 CHCl3 632 738 1.19
PB12-PMOXA5-NH-(CH2)-NH2
NMR
PB: 5.45 ppm -CH=CH2 (repeating unit), 4.94 ppm -CH=CH 2 (repeating unit), 2.12 ppm CH (repeating unit - backbone), 1.27 ppm CH2 (repeating unit - backbone), CH2 and CH3 3.65 ppm 0.82 ppm - end groups. PMOXA: 3.45 ppm (-CH 2 -CH 2 -N-), 2.11ppm (-N-CO-CH 3 )
실시예 2: 베지클 제조
PB12-PMOXA5-NH-(CH2)2-NH2 폴리머 (50 mg)를 둥근 바닥 플라스크(Pyrex 200ml)에서 1ml 클로로포름에 용해 시켰다. 용매는 로타리 증발기에서 감압하에서 증발시켜 얇은 필름의 폴리머를 얻었다. 이어서 3시간 동안의 고도의 진공 처치로 잔여 클로로포름을 제거시켰다. 5ml의 물을 더 나아가 첨가하고 600rpm 에서 교반하였다. 이 방법으로 10mg/ml의 베지클 현탁액이 제조되었다. 성질을 규명하기 위한 (LSM, Stopped-Flow, DLS) 샘풀링 할 때, 현탁액은 1 μm, 800nm, 400nm, 200nm의 폴리카보네이트 트랙 에치드 필터 (Track ached filters)(Millipore)를 통해 성공적으로로 압출 성형 (extrude) 되었다. 각각의 압출성형 (extrusion)에서 현탁액은 성질규명을 위해 샘플 되었다.
베지클은 다음과 같이 성질이 규명되었다. 입자 이미징을 위해 극저온 전파 전자 현미경(cryo-TEM)이 사용되었으며, 및 LSM 이미징을 사용하여 표면 기능화가 연구되었다.
cryo-TEM을 위해, 현미경은 FEI TecnaiG2, TF20 이었다. 샘플들은 유리화 (vitrification) 로보트, VitrobotTMFEI, 를 사용하여 유리처럼 만들어졌다. 사용된 확대율은 25000x (31625x 검정된)=스케일 바 200μm 이었다.
LSM 이미징을 위해, 상기처럼 제조된 베지클의 표면에 존재하는 아민 말단기들은 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 플루오레센트 염료(tetramethylrhodamine isothiocyanate fluorescent dye)와 (1:1000 몰비) 반응하게 하였으며, 탈염수(deionized water)로 투석하였다. 투석은 투석물에 형광 신호가 보이지 않을때까지 수행되었으며, 이어서 DI 물로 추가로 교환하여 비특이적인 결합을 제거하였다.
베지클은 Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27 objective 및 561nm Laser line 을 가진 Zeiss LSM 710 Inverted Confocal Microscope 를 사용하여 가시화하였다. 핀홀은 (Pinhole)은 50 um 에서 70 um로 변화시켰다. 이로써 콘포컬 플랜 (confocal plane)이 베지클을 " 통과하여 보게 (see through)" 하도록 하며, 그러므로써 베지클이 촛점의 안과 밖에서 동적으로 떠있는 현탁액에서 빛의 테두리 (콘포칼 포인트 센터에 베지클 센터) 또는 빛의 디스크(컨포칼 포인트에 베지클의 탑)처럼 보이게 한다. 도 1A 및 1B는 베지클을 깨끗하게 보여주는 두 개의 샘풀 마이크로그래프이다.
베지클 구조 조사의 두 번째 방법은 투과성을 측정하는 스탑-풀로 (stopped-flow) 실험을 사용하는 것이다. 스탑-플로 스펙트로스코피를 사용하여 베지클 현탁액을 삼투압이 높은 용액 또는 저삼투압 용액과 섞고 정지-주사기 (스탑-시린지)(stop syringe)를 배치했을 때의 빛 산란 신호를 모았다. 이는 폴리머 이중 층 맞은 편에 농도의 구배를 초래하며 구배 방향 쪽으로 물이 침투하는 결과를 가져온다.
삼투압이 높은 용액인 경우에는 폴리머 베지클이 줄어들고 저 삼투압 용액인 경우 에는 폴리머 베지클이 팽창하는 것이 관찰된다. 크기가 변화하는 것은 빛 산란을 통해 모니터링 할 수 있으며 변화가 일어나는 비율은 주어진 크기의 베지클에서 물이 침투하는 결과에 의한다. 이는 또한 응집된 모양을 평가하기 위해서도 보여졌다 (아쿠아포린에 근거한 생체모방 멤브레인의 가능성을 정확한 평가를 위한 체계 M. Grzelakowski, M. F. Cherenet, Y. Shen, M. Kumar Journal of Membrane Science doi:10.1016/j.memsci.2015.01.023.
베지클 현탁액은 등장 용액과 1:1 비율로 16°C 에서 빨리 섞고 빛 산란 신호는 365　nm 에서 및 8　mL/s의 흐름 속도로 모아졌다. 삼투 물르ㅣ 침투성(Pf)은 다음에서부터 계산되었다:
여기서 k 는 빛 산란 커브의 초기 기울기로 시간에 따른 베지클 직경의 변화에 해당하며, S 는 베지클의 초기 표면 면적이며, V0 는 베지클의 초기 부피이며, Vw 는 물의 몰 부피이며, 및 Δosm 은 베지클의 위축을 가져오게 하는 삼투압의 차이이다.
일정한 양의 NaCl을 주어진 수화버퍼(hydration buffer) (0.1M NaMOPS)에 첨가하여 구배 600mM, 300 mM, 150mM , 75 mM, 0 mM (수화 버퍼, hydration buffer) 및 -100mM (순수 DI water)가 되는 일련의 범위의 고삼투압 용액들이 제조되었다. 예상한 대로 및 도 2 에서 보여준 대로 고삼투압성으로 인한 위축은 반대로 저삼투압 용액으로 팽창되어, 베지클의 모양이 확인되었다.
추가로, 각 압출 성형 과정 매 단계마다 베지클 모양을 확인하는데 스탑-훌로 (stopped flow)도 또한 사용되었다. 물 침투 시간은 고삼투압 조건에 노출된 베지클의 크기에 비례한다. 이중 층의 침투성은 일정하게 유지되어 있으므로 큰 면적의 멤브레인을 통해 침투되는 다량의 물은 더 긴 기간을 만든다. 도 3은 구멍 크기가 감소함에 따른 베지클의 휠터를 통한 압출성형의 스탑-훌로 그래프를 보여준다.
Malvern ZetraSizerTM Nano-S 역동성 빛 산란 (DLS) ((Malvern ZetraSizerTM Nano-S dynamic light scattering (DLS))이 입자의 직경 및 크기 다분산성 인덱스를 결정하기 위해 사용되었다. 베지클 현탁액들은 DLS 측정하기 전에 평형을 이루게 하기 위해 하룻밤 동안 놓아두었다. 그 후, 샘풀들을 구멍 크기가 800, 400, 200 및 100 nm 인 멤브레인을 통해 압출 성형되도록 하였다. DLS 측정은 압출 성형 후 6 시간 동안 수행되었다. 폴리스티렌 라텍스는 참조 재료로 (RI: 1.590; 흡수: 633　nm에서 0.010), 및 물은 분산제 (점도:0.9781 cP; RI:1.330)로서 사용되었다. 측정은 사이언스 브랜드 (Science Brand)의 일회용 마이크로큐벳에서 샘플 부피 100 μl로 21℃ 에서 수행되었다. 각 샘플은 5번 측정되었으며, 각 측정은 평균 11 번이었다. 그 결과들이 아래 테이블 및 도 4에 보여진다.
압출 성형 PDI 평균 피크 크기 (d.nm)
강도 부피 수
Pre 0.337 1521 1327 931
0.8 um 0.203 585.7 750.8 439.8
0.4 um 0.169 433.8 520.1 312.3
0.2 um 0.15 238.1 239.2 137.1
0.1 um 0.093 165.4 151.7 107.2
실시예 3: 베지클 내로의 단백질 삽입
폴리머 베지클 의 물 침투성은 물 채널 멤브레인 단백질-아쿠아포린 Z의 재구성으로 강화된다. 필름 수화 (hydration)과정은 PoPr 400 에서 단백질 첨가를 수용하기 위해 수정되었다: 간단하게, 수화된 베지클 단백질 용액에 PoPr 400 이 첨가 된다. 다음 단계는 베지클 형성의 표준 프로토콜에 따른다.
PB12-PMOXA5-NH-(CH2)2-NH2 폴리머 (50 mg)를 둥근 바닥 플라스크(Pyrex 200ml)에서 1ml 클로로포름에 용해 시켰다. 용매는 로타리 증발기에서 감압하에서 증발시켜 얇은 필름의 폴리머를 얻었다. 이어서 3시간 동안의 진공 처치로 잔여 클로로포름을 제거시켰다. 0.1245 mg 의 아쿠아포린 Z (Applied Biomimetic) 및 0.5% 옥틸 글루코사이드(octyl glucoside )(O311 - n-옥틸-β-D-글루코피라노사이드, Anagrade, Anatrace)를 포함하는 100 mM Na-MOPS 버퍼 5 ml을 더 나아가 첨가하고 600rpm 에서 교반 시켰다. 10mg/ml의 단백질-베지클 (proteo-vesicles) 현탁액을 200nm 폴리카보네이트 트랙 에치드 필터(Track ached filter) (Millipore)를 통해 압출 성형시켰다. 침투성 측정은 스탑-훌로 스펙트로메터 (stopped-flow spectrometer)를 사용하여 수행되었다.
단백질 삽입을 평가하기 위해 스탑-훌로 스펙트로스코피가 사용되었다. 이는 아쿠아포린 물 채널로 재구성된 베지클의 물 침투성 증가로서 측정 되었다. 첨가된 단백질의 양이 PoPR (폴리머 대비 단백질 비율) 400 처럼 적어도 대조군 베지클보다 물 침투성이 46배나 증가 된 것으로 측정되었다. 이 결과들을 도 5 에서 보여 준다.
실시예 4: 자유-라디칼을 사용한 PB-PMOXA 베지클의 코아 크로스-링킹
PB 코아를 크로스-링킹하여 침투성이 덜하고/좀더 거칠은 구조롤 갖도록 하기 위하여 등장 용액하에서 예 2에서와 같이 제조된 PB-PMOXA 베지클을 일정량의 자유-라디칼이 발생 되는 용액에 있게 하였다.
PB-PMOXA는 예 1에서와 같이 제조되었으며 100mM NaMOPS pH7.5 에서 얇은-필름 재수화를 사용하여 베지클로 만들었다. 베지클은 그후 구멍 크기가 0.2 μm 인 Millipore IsoporeTM 멤브레인을 통해 압출 성형시켰으며 KintekTM SFLS 및 ZetasizerNANOTM DLS (Malvern)에서 테스트하였다. 모든 화학약품 및 버퍼는 시그마 말드리치 (Sigma Aldrich)로 부터 구입하였다.
제조된 PB-PMOXA 베지클은 4개의 4ml 투명한 유리 바이알에 분주하고 (250μl) 평형이 되도록 실온에 놓아두었다. 크로스-링킹 과정을 위하여 NanoPur 물에 3가지 용액을 제조하였다. 3.699mL NanoPur 물에 100mg 포타슘 퍼설페이트 (Potassium Persulfate)(K2SO4)를 녹여 100mM 포타슘 퍼설페이트를 제조하였으며, 5.26mL NanoPur 물에 100mg의 소듐 메타비스설피트(Sodium Metabisulfite) (Na2S2O5)녹여 100mM 소듐 메타비스설피트를, 및 3.597mL NanoPur 물에 100mg의 철 (II) 설페이트 헵타하이드레이트 ((Iron(II) Sulfate Heptahydrate)) (FeSO4·7H2O)를 녹여 100mM 철 (II) 설페이트 헵타하이드레이트를 제조하였다. 베지클 바이알 2개에 100mM 포타슘 퍼설페이트 50μL, 100mM 소듐 메타비스설피트 25μL 및 100mM 철 (II) 설페이트 헵타하이드레이트 1μL를 넣었고, 다른 2개 바이알에는 100μL, 50μL 및 2μL를 각각 넣었다. 이 쌍들은 그 후 둘로 나누어;하나는 실온에서 반응시키고, 반면에 다른 하나는 70℃ 에서 반응시켰다. 샘플들은 한시간 동안 반응하도록 놓아두고 그 후 실온으로 평형 되게 한 후 DLS 및 SFLS 에서 크기 및 침투성에 대한 검사를 하였다.
소수성 코아의 크로스-링킹의 효율은 크로스-링크된 폴리머의 유기용매에 대한 용해도 변화로 나타내었다. 크로스-링킹 전에는, 폴리머는 에탄올과 클로로포름 두 개 모두에 용해된다. 크로스-링킹 후에는, 폴리머는 두 개 모두에서 용해도가 감소 된다. 첨가된 라디칼 시작 용액의 양은 클로로포름에서 크로스-링크된 재료들의 용해도 감소와 직접적으로 비례한다.
실시예 5: 멤브레인 제조
이 예에서, 침착된 베지클의 농도는 일정하게 유지되고 역동 빛 산란 (Dynamic Light Scattering)(Malvern Zetasizer Nano)에서 계산 속도를 (count rate)(250kcps) 스테틱 어테뉴에이터(static attenuator)에 맞추어 모니터링 하였다.
빛이 없는 곳에서 Sulfo-SANPAH (SS) 용액 (10mM, 100mM NaMOPS pH 7.5 에서)을 앞에서 제조된 PB-PMOXA-NH-(CH2)2-NH2 베지클과 반응하도록 놓아두었다 (50μL SS 과 혼합된 베지클 용액 250μL 를 15 분 동안). 47mm 폴리설폰 멤브레인(수동으로 캐스팅한) 시리즈를 펀치 프레스 (punch press)로 자르고, Teflon® 멤브레인 홀더에 놓고 탈염수로(deionized water) 씻었다. 과량의 물은 압축된 공기로 제거되고 300 μL(각)의 SS-활성화된 베지클 현탁액을 폴리설폰 지지 멤브레인에놓아 두었다. 멤브레인 홀더를 UV 빛 하에 소스로부터 약 5cM 아래 놓아 두고, 호일로 덮어 30분동안 보호하였다.
그 후 과량의 반응물은 1 ml 파이펫을 사용하여 멤브레인 표면에 접촉되지 않도록 하여 멤브레인 표면으로부터 제거되었다. 상기 단계들은 3번 반복되고, 그 후 멤브레인은 홀더로부터 제거되고 펀치 프레스를 사용하여 코팅된 면적으로부터 25mm 직경의 멤브레인 샘플을 잘랐다. 이들은 그 후 테스트하기 전에 흔들리는 테이블에서 과량의 100 mM NaMOPS ph7.5 로 적어도 한 시간동안 씻었다.
도 6 은 결과로 얻어진 멤브레인의 마이크로그래프로, 지지 멤브레인 표면에 크로스-링크된 수 많은 베지클을 포함하는 일관성 있는 덩어리를 보여준다.
상기 서술된 단계로 제조된 멤브레인은 자유-라디칼 시작 용액 ;
25mM 철(II) 설페이트 헵타하이드레이트 (Iron(II) Sulfate Heptahydrate)),
25mM 소듐 메타비스설피트(Sodium Metabisulfite),
25mM 포타슘 퍼설페이트 (Potassium Persulfate) 로 구성된 용액
10 또는 150μL로 처리하게 하였다.
이 처치는 PB 소수성 코아의 크로스-링킹 결과를 가져오게 하였다.
결과적으로 얻어지는 멤브레인 샘플은 표준 분자량 캇-오프( cut-off) 분석기술을 사용하여 구멍크기 분포 검사를 하였다. 전 단계에서 제조된 25mm 샘플은 분자량 컷오프를 측정하여, 즉 주어진 분자량의 적어도 90%의 분자가 멤브레인에 남아 있는 포인트를 측정하여, 고분자량 물질을 유지하는 능력에 대한 검사를하였다.
인산 버퍼 (0.03M Na2HPO4 + 0.03M KH2PO4)는 0.2 um 멤브레인을 사용하여 사전-여과 시키고, 용액 제조에 사용하기 전에 pH는 7.2로 조정하였다. 표준 덱스트란 (Dextran) (DXT)은 인산 버퍼에 용해 시켰다 (DXT 165 kDa, 325 kDa, 548 kDa, 1300 kDa, 및 5000 kDa, DXT 0.505 kDa, 4 kDa, 6 kDa, 11 kDa, 20 kDa, 및 28 kDa).
모든 덱스트란 용액은 0.5 mg/ml 이 되도록 인산 버퍼로 희숙시키고 사용하기 전에 0.2 um 폴리에테르설폰(polyethersulfone) 멤브레인을 사용하여 사전-여과시켰다. 모든 여과 실험들은 10 ml 아미콘 (Amicon) 교반 초여과 셀(Model 8010, Millipore Corp.)에서 진행되었다. 모든 샘플들은 하기 서술된 프로토콜대로 평가되었다:
□ 구멍 구조 및 전체 시스템을 적시기 위해 여과된 10ml 부피의 탈염수로 20psi에서 여과 하였다.
□ 덱스트란 용액 주입된 주입 라인을 디지탈 페리스탈틱 펌프(Thermal Fisher Science Inc.) 와 연결하고, 셀을 20psi로 재-압력을 가하여 여과액의 흐름이 5 μm/s이 되도록 셋트하였다.
□ 평형을 위해 2,000μL 의 물로 여과하고 멤브레인 아래의 데드 볼륨 (dead volume)을 씻어낸 후 여과액 용액 800μL 샘플을 얻었다.
□ 여과 후 셀로부터 직접 침투된 샘플 1ml를 얻었다.
□ 전체 시스템을 탈염수로 씻고 헹구었다.
□ 교반 속도는 600 rpm으로 유지했으며 모든 실험들은 실온(22±3 °C)에서 수행 되었다.
침투액(permeate)은 더 나아가 고압-액체 크로마토그래피(HPLC columns PL1149-6840, MW 10,000 에서 200,000, PL1120-6830, MW 100 에서 30,000, PL1149-6860, MW 200,000 에서 > 10,000,000)를 사용하여 평가되었다. 주입된 것 대비 침투액의 크로마토그램의 비교는 잔류 계수 및 멤브레인의 분자량 컷-오프를 계산하게 한다. 결과는 도 7에 보여주며, 컨트롤 멤브레인이 베지클로 코딩되었을 때는 분자량 컷-오프는 반으로 줄어드는 것을 보여준다. 베지클-코팅된 멤브레인의 분자량 컷-오프는 시작제를 사용하여 폴리부타디엔을 코아-크로스 링킹 했을 때 4000 Ka 으로 줄어들었다. 분자량 컷-오프의 감소는 사용된 크로스-링커의 양에 의존하는 것으로 나타났다.
실시예 6: 베지클의 피막형성(encapsulation) 효율
풀루오레신 (Fluorescein)(Sigma-Aldrich F6377) 용액 1mM을 100mM sodium-MOPS (GFS 5440)에 제조하였다. 풀루오레신 Na-Mops 용액을 수화 미디어로서 사용하여 예 2에 따라 폴리머 베지클을 제조하였다. 폴리머 베지클은 더 나아가 폴리카보네이트 트랙 에치드 필터(Millipore)를 통해 200nm에서 압출성형 되었다. 피막에 쌓이지 않은 염료는 100mM sodium-MOPS (1:1000 부피 비율로, 3번 교환으로)에 대항하여 투석(Thermo Fisher Scientific 66383 10 kDa)으로 제거되었다.
한 베지클 당 피막에 쌓인 염료 분자 수의 측량을 위해 풀루오레센스 코리레이션 스펙트로스코피 (Fluorescence Correlation Spectroscopy)(FCS)가 사용되었다. 실험은 time correlated single photon counting (TCSPC) 모듈 (Becker-Hickl GmbH, Berlin, Germany)에서 수행되었다. 상세한 기기 셋업은 Gullapalli et al, "Integrated multimodal microscopy, time-resolved fluorescence, and optical-trap rheometry: toward single molecule mechanobiology", J. Biomedical Optics, 2007 Jan-Feb;12(1):014012. PubMed PMID: 17343487. Pubmed Central PMCID: PMC3251961. Epub 2007/03/09. eng 에 서술되었다.
사용된 빛의 소스는 532 nm에서 최대 방출을 가진 Nd:YAG 펄스드 레이져였다. 레이져 빔을 샘플내의 커버 슬립에서 40μm 위에 있는 분산-제한적인 촛점에 촛점을 맞추기 위해 개구수 1.2 를 가진 60x 침수 대물렌즈 (water immersion objective)가 사용되었다. 레이져 파워는 대물렌즈 조리개 뒤쪽에의 빛의 강도를 측정하여 30μW/m2 에 맞추었다.
FCS 실험에서는, 작은 관측(컨포칼) 부피 내에서 플루오레센스 강도의 시간에 따른 변화가 모니터 되고 그 변동은 이래 서술된(방정식 1) 자동상관 관계 기능에 맞추어 졌다.
여기서, G(τ)는 노말라이즈된 자동상관 기능이다: δF(t)는 시간 t 에서 플루오레센스 강도 변동;δF(t +τ)는 시간 연장 τ 후에 플루오레센스 강도 변동; 및 F(t)는 시간 t 에서의 평균 플루오레센스 강도이다. τ=0 일때, 방정식 1의 오른쪽에 있는 용어는 플루오레센스 강도 변동의 변화와 똑같으며, G(0)=1/N로 나타낸다. N은 컨포칼 부피에서의 형광물질(fluorophores)의 평균 수를 나타낸다. 이들의 원리들은 FCS 실험에서 관찰된 자동상관관계 커브를 하기 방정식 2 및 상기 Gullapalli et al, 에서 서술된 3D 확산 모델에 맞추어 수용액에서의 플루로레신 농도 및 폴리머 베지클의 농도를 구하는데 사용된다.
여기서 r 및 z 는 컨포칼 부피의 직경과 높이의 반이며, 이는 자주 3D Gaussian 조명 프로화일을 가진 것으로 가정된다, Maiti et al, Proc. Nat. Acad. Sci., 1997;94(22):11753-7를 보시오. τDi 플루오레센스 스피시스 i 의 콘포칼 부피를 통과하는 2D 측면의 확산 시간이다. fi 는 플루오레센스 스피시스 i의 일부분 이다. 우리는 유리 풀루오레신 염료 및 염료로 피막된 폴리머 베지클 두 개 모두에 단일 스피시스 맞춤을 사용하였다.
한 베지클당 플루오레센 분자의 수, Nencap-fluor, 를 계산하기 위해 분자 밝기는 Rigler et al, Correlation Spectroscopy, 2006 (9):367-73, 에 서술된 대로 FCS에 근거한 방법을 사용하여 측정되었다. 이 방법에서 0.1M Na MOPS 버퍼 (pH= 7.5)에 있는 유리 플루오레센 분자 (free fluorescein molecule)가 표준으로서 사용되었다. 풀루오레신의 분자 밝기(표준 흥분 비율에서 한 분자당 방출 되는 광양자),εfluorescein, 는 실험을 통해 수집된 광양자들의 총수를 측정 기간으로 나누고 이 수를 시간-이동된 자동상관관계 커브를 3D 확산 모델에 맞추어 얻은 대로, 컨포칼 부피에 있는 풀루오레신 분자의 수, N free-fluor, 로 나누어 측정하였다 (방정식 2). 풀루오레신 피막된 폴리머 베지클의 분자 밝기, εpolymersome, 도 비슷하게 측정되었다. 폴리머 베지클의 분자 밝기 대비 유리-플루오로레신 분자 밝기의 비율 (εpolymersome/εfluorecein) 은 폴리머좀 하나 당 플루오로레신 분자의 수, Nencap-flour μ를 예측하게 하였다.
얻은 결과는 도 8에 보여준다. 플루오로레신 분자 밝기 εfluorescein, 는 29 광양자/분자/초 (photons/molecule/second) 이었다. 0.2 μm 에서의 폴리머좀의 분자 밝기는,εpolymersome , 는 11244 광양자/분자/초이었다. 그러므로 한 폴리머좀 당 피막된 플루오로레신 분자의 수, Nfluorescein= εpolymersome/εfluorecein , 는 387 분자이었다. 직경 200nm 베지클은 벽두께를 교정을 하였으며 (cryo-TEM, R effective = 9.09 x E-08 m) 및 베지클의 피막 부피는 3.14 x E-18 dm3 로 계산되었다. 1mM 용액이 폴리머 베지클의 수화에 사용되었으며, 베지클 내부에서 측정된 플루오로레신의 농도는 0.204196992 mM 이었다. 그러므로 이 결과들은 25% 의 피막 효율을 보여주며, 이는 높은 숫자이다.

Claims (20)

  1. 적어도 하나 이상의 (폴리) 2-C1-3알킬-2-옥사졸린 블록 및 적어도 하나 이상의 폴리부타디엔 블록을 포함하며, AB 또는 BA 디블록 공중합체이고, 여기서 (폴리)2-C1-3알킬-2-옥사졸린이 A 블록을 형성하고, 폴리부타디엔이 B 블록을 형성하는 블록 공중합체이되,
    상기 공중합체는 히드록시기 말단의, 190개의 2-메틸-2-옥사졸린 단위체 및 40개의 부타디엔 단위체로 구성되는 디블록 공중합체가 아닌 것을 특징으로 하는 블록 공중합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 부타디엔 단량체의 수는 적어도 2-C1-3알킬-2-옥사졸린 단량체의 절반 이상인 것을 특징으로 하는 블록 공중합체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 부타디엔 단량체의 수는 적어도 2-C1-3알킬-2-옥사졸린 단량체의 두배 이상인 것을 특징으로 하는 블록 공중합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 블록 공중합체는 5 내지 200개의 부타디엔 단량체 및 5 내지 180개의 2-C1-3알킬-2-옥사졸린 단량체를 함유하는 것을 특징으로 하는 블록 공중합체.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 블록 공중합체는 -OH 이외에, (폴리) 2-C1-3알킬-2-옥사졸린의 말단에 적어도 하나 이상의 말단기를 가지는 것을 특징으로 하는 블록 공중합체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 말단기는 카르복시, 활성화된 카르복시, 아민, 메타크릴레이트, 티올, 아지드, 및 알킨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 블록 공중합체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 말단기는 카르복시, 활성화된 카르복시, 또는 -NHR 구조식을 가지는 아민 말단기로부터 선택되는 말단기이되, 상기 R은 적어도 하나가 -NH2로 치환된, 1 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 알킬기인 것을 특징으로 하는 블록 공중합체.
  8. 삭제
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (폴리) 2-C1-3알킬-2-옥사졸린은 (폴리) 2-메틸-2-옥사졸린인 것을 특징으로 하는 블록 공중합체.
  10. 제1항의 블록 공중합체로부터 형성되는 베지클(vesicles).
  11. 삭제
  12. 제10항에 있어서,
    각각의 다른 블록 공중합체 사슬의 폴리부타디엔 블록에 존재하는 C=C 이중 결합이 서로 가교 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 베지클.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 베지클은 내부에 막 관통 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 베지클.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 막 관통 단백질은 아쿠아포린(aquaporin)인 것을 특징으로 하는 베지클.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 베지클은 약물 또는 화장제를 함유하는 것을 특징으로 하는 베지클.
  16. 제13항 또는 제14항에 따른 베지클을 포함하는 여과막.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 여과막은 다공성 지지체, 및 이의 표면에 공유 결합된 다수의 베지클을 포함하는 층을 포함하는 여과막이되, 여기서 상기 다수의 베지클은 상기 블록 공중합체로부터 형성되며, 그 내부에 막 관통 단백질을 포함하고;
    상기 층 내에, 베지클이 서로 공유결합되어 응집체를 형성하는 것을 특징으로 하는 여과막.
  18. 상기 블록 공중합체로부터 형성되며, 그 내부에 막 관통 단백질을 포함하는 베지클의 수성 현탁액을 제공하는 단계;
    다공성 지지체의 표면 상에 상기 베지클의 현탁액을 침착시키는 단계; 및
    각각의 다른 베지클 사이 및 베지클과 상기 표면 사이에 공유 결합이 형성되도록 반응 조건을 제공하는 단계;를 포함하는, 제17항에 따른 여과막의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 제조방법은,
    (a) 상기 블록 공중합체로부터 형성되며, 그 내부에 막 관통 단백질을 포함하는 베지클의 수성 현탁액을 제공하는 단계이되, 상기 베지클은 반응성 말단기 X를 갖는 블록 공중합체로 형성되고;
    (b) 중합체 말단기 X와 반응성인 적어도 2개 이상의 반응기 Y를 갖는 다관능 결합제를 제공하는 단계;
    (c) 중합체 말단기 X 또는 반응기 Y 중 어느 하나와 반응하는 표면을 갖는 지지체 상에 상기 다관능 결합제와 상기 베지클 현탁액을 침착시키는 단계; 및
    (d) 말단기 X와 반응기Y를, 및 말단기 X 또는 반응기 Y와 상기 지지체의 표면을 반응시키는 단계;를 포함하거나, 또는
    　　
    (aa) 상기 블록 공중합체로부터 형성되며, 그 내부에 막 관통 단백질을 포함하는 베지클의 제1 수성 현탁액을 제공하는 단계이되, 상기 베지클은 반응성 말단기 X를 갖는 블록 공중합체로 형성되고;
    (bb) 상기 블록 공중합체로부터 형성되며, 그 내부에 막 관통 단백질을 포함하는 베지클의 제2 수성 현탁액을 제공하는 단계이되, 상기 베지클은 중합체 말단기 X와 반응성인, 반응성 말단기 Y를 갖는 블록 공중합체로부터 형성되고;
    (cc) 중합체 말단기 X 또는 Y와 반응성인 표면을 갖는 지지체 상에 상기 베지클의 현탁액을 침착시키는 단계; 및
    (dd) 말단기 X와 말단기 Y를, 및 말단기 X 또는 말단기 Y 중 어느 하나와 상기 지지체의 표면을 반응시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 다관능 결합제는 N-설포숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트인 것을 특징으로 하는 제조방법.


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