CN107667133A

CN107667133A - 由嵌段共聚物形成的囊泡、以及新型嵌段共聚物

Info

Publication number: CN107667133A
Application number: CN201680030369.4A
Authority: CN
Inventors: M·P·格热拉科夫斯基; M·库马尔; I·赛恩斯
Original assignee: Application Of Bionics Co Ltd; Penn State Research Foundation
Current assignee: Application Of Bionics Co Ltd; Penn State Research Foundation
Priority date: 2015-03-24
Filing date: 2016-03-24
Publication date: 2018-02-06
Anticipated expiration: 2036-03-24
Also published as: EP3274396A1; CN107667133B; WO2016151073A1; KR102650153B1; US20180079869A1; US10865278B2; JP2018515636A; EP3274396B1; JP6882183B2; KR20180004715A; CA2980641C; DK3274396T3; CA2980641A1

Abstract

由包含至少一种(聚)2‑C_1‑3烷基‑2‑噁唑啉嵌段和至少一种聚丁二烯嵌段的嵌段共聚物形成的囊泡；和包含这种囊泡的膜。包含至少一种(聚)2‑C_1‑3烷基‑2‑噁唑啉嵌段和至少一种聚丁二烯嵌段的嵌段共聚物，其条件是该共聚物不是由40个丁二烯单元和190个2‑甲基‑2‑恶唑啉单元组成的羟基封端的二嵌段共聚物，该共聚物是新型的，并且也构成本发明的一部分。

Description

由嵌段共聚物形成的囊泡、以及新型嵌段共聚物

技术领域

本发明涉及由嵌段共聚物、特别是由丁二烯和2-C_1-3烷基-2-噁唑啉的嵌段共聚物形成的囊泡。本发明还涉及由该囊泡形成的膜。大多数聚丁二烯/(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉嵌段共聚物是新型的，并且这些新型嵌段共聚物也形成本发明的一部分。

背景技术

自然界中的囊泡和细胞是由两亲性脂质构建并由胆固醇支撑的纳米容器。已经对两亲性嵌段共聚物作为在制备人工囊泡中使用的合成替代物进行了研究，但是研究的嵌段共聚物数目非常少，主要集中在(聚)2-甲基-2-噁唑啉(PMOXA)/聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)、聚(乙二醇)(PEG)/PMOXA、和PEG/聚丁二烯(PB)的共聚物上。WO 00/37541涉及新型的两亲性嵌段共聚物，其包含亲水片段(segment)和疏水片段，而US 6,916,488公开了由两亲性共聚物制备的囊泡。US 6,916,488的囊泡可用于药物递送或用作纳米反应器，并且可将膜蛋白混入到其壁中；该共聚物可以是AB或ABA嵌段共聚物，其中A和B之一是亲水的，并且另一个是疏水的。US 6,916,488的作者提及了广泛的A和B的可能候选物，但唯一例举的聚合物是聚(2-甲基噁唑啉)-聚(二甲基硅氧烷)-聚(2-甲基噁唑啉)(PMOXA-PDMS-PMOXA)。US 6,723,814涉及由两亲性共聚物形成的平面膜。US 2008/0305149公开了具有粘膜粘附基团的嵌段共聚物囊泡用于药物的粘膜递送的用途。

WO 2004/011600公开了可将水通道蛋白包含到三嵌段共聚物中以形成仅通过水的膜，排除了所有污染物。由于该公开，已经开展了许多工作来开发包含跨膜蛋白的膜，并且其中一些已经尝试使用嵌段共聚物囊泡。例如，WO 2013/043118公开了含有或不含有水通道蛋白、嵌入在支撑膜上的聚酰胺层中的囊泡的使用。共聚物可以是PMOXA-PDMS-PMOXA或许多其它共聚物，即EO-PO、EO-Bd、EO-PDMS和EO-BO，其中EO是环氧乙烷，PO是环氧丙烷，Bd是丁二烯，并且BO是环氧丁烷。

聚乙二醇和丁二烯的两亲性共聚物是公知的，参见例如M.A.Hillmyer和F.S.Bates,“Synthesis and Characterization of Model Polyalkane-Poly(ethyleneoxide)Block Copolymers”,Macromolecules,29,6994(1996)。然而，它们有一些缺点。例如，环氧乙烷是气态的，这使得它难于处理，尤其是在使用较大量时，因为它是易燃、高毒性和高度管制的化合物。此外，其不易于官能化或与环氧乙烷交联。

从Max Plank胶体和界面研究所(Max Plank Institute for Colloid andInterface Research)、并在http://www.mpikg.mpg.de/48071/HORDYJEWICZ-BARAN_Dissertation.pdf可获得的波茨坦大学的Zofia Hordyjewicz-Baran的论文，题目为“Synthesis and Study of the Aggregation Behavior of Hydrophilically ModifiedPolybutadienes”，描述了疏水修饰的丁二烯均聚物和嵌段共聚物。羟基封端的PB₄₀-b-PMOXA₁₉₀共聚物是制备的共聚物之一，并且该共聚物与2-巯基乙胺盐酸盐反应，2-巯基乙胺盐酸盐与聚丁二烯嵌段中存在的双键反应。没有暗示囊泡可以或应该由该共聚物制成，也没有任何暗示该共聚物的端基应该以任何方式进行修饰。

现在我们发现包含至少一种(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉嵌段和至少一种聚丁二烯嵌段的嵌段共聚物、以及特别是具有特定端基的这种共聚物，当用于囊泡形成和用在膜中时具有主要优点。具体地说，嵌段共聚物非常容易形成囊泡；容易定制囊泡的大小；容易使囊泡稳定；并且聚合物能够易于官能化以进行一系列反应。此外，嵌段共聚物固有地渗透性低，并且能够调节到非常低，这使得聚合物对于许多应用是有价值的，包括用在用于递送包含例如药物和美容剂在内的物质的囊泡中以及用在膜中。

发明内容

本发明提供由包含至少一种(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉嵌段和至少一种聚丁二烯嵌段的嵌段共聚物形成的囊泡。还提供其中混入跨膜蛋白的囊泡和包含这种含有蛋白质的囊泡的过滤膜。大多数包含至少一种(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉嵌段和至少一种聚丁二烯嵌段的嵌段共聚物是新型的，并且本发明还提供这些新型聚合物本身。具体地说，本发明提供包含至少一种(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉嵌段和至少一种聚丁二烯嵌段的嵌段共聚物，其条件是该共聚物不是由40个丁二烯单元和190个2-甲基-2-噁唑啉单元组成的羟基封端的二嵌段共聚物(即不是羟基封端的二嵌段PB₄₀-b-PMOXA₁₉₀)。

具体实施方式

嵌段共聚物

用于本发明的嵌段共聚物包含至少一种(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉(PAOXA)嵌段和至少一种聚丁二烯(PB)嵌段。聚合物合适地是二嵌段共聚物AB或特别是BA，或者三嵌段共聚物ABA，其中PAOXA形成A嵌段，并且PB形成B嵌段。

包含至少一种(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉(PAOXA)嵌段和至少一种聚丁二烯(PB)嵌段的嵌段共聚物具有许多使其特别适用于形成囊泡的性质。

所有这些共聚物(除去羟基封端的PB₄₀-b-PMOXA₁₉₀)是新型的，并形成本发明的一部分。根据本发明的合适的共聚物在PAOXA嵌段中含有少于190个2-烷基-2-噁唑啉单元。上述Hordyjewicz-Baran论文中公开的具体的羟基封端的PB₄₀-b-PMOXA₁₉₀聚合物是高亲水性的，与疏水性丁二烯单元相比，含有大的亲水性MOXA单元的数量优势。特别有价值的用于本发明的是含有较大比例的疏水性丁二烯单元的共聚物，例如其中PB嵌段中的丁二烯单元数至少为PAOXA嵌段中2-烷基-2-噁唑啉单元数的一半的共聚物，例如其中PB嵌段中的丁二烯单元数至少等于PAOXA嵌段中的2-烷基-2-噁唑啉单元数的共聚物，特别是其中PB中的丁二烯单元数是PAOXA嵌段中2-C_1-3烷基-2-噁唑啉单元数目的两倍以上的共聚物。例如，PB嵌段中的丁二烯单元数与PAOXA嵌段中的2-C_1-3烷基-2-噁唑啉单元数之比可大于1:1.75，这相当于亲水性与亲脂性之比为17.64。

按绝对值计算，本发明的共聚物优选含有至少5个，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个丁二烯单元，例如至多200个、特别是至多160个、并且最特别是至多120个丁二烯单元；和至少5个，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个2-C_1-3烷基-2-噁唑啉单元，例如至多189个、特别是至多180个、例如至多160个、并且最特别是至多120个2-C_1-3烷基-2-噁唑啉单元。

独立于上述任何一个或多个特征或者除其之外，在具体实施方式中，本发明提供包含至少一种PAOXA嵌段和至少一种PB嵌段的共聚物，其条件是聚合物具有不是-OH的端基，特别是，其条件是聚合物在(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉嵌段末端具有至少一个不是-OH的端基；和/或其中共聚物是三嵌段共聚物；和/或其中PAOXA嵌段小于190个；和/或其中丁二烯单元数与2-C_1-3烷基-2-噁唑啉单元数之比大于4:19；和/或PAOXA嵌段中的C_1-3烷基是C_2-3烷基。

(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉嵌段中的C_1-3烷基可以是甲基、乙基或丙基、或者它们的混合。优选地，该(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉嵌段或者每个(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉嵌段为(聚)2-甲基-2-噁唑啉嵌段。贯穿本说明书，除非上下文需要，否则任何提到的C_1-3烷基应当理解为包括具体提到的甲基。

上文提到的Hordyjewicz-Baran的论文公开了一种制备嵌段共聚物的具体方法。通过聚合合成嵌段共聚物是公知的，并且，在起始片段上共聚的一个或多个片段的长度能够通过控制为了共聚加入的单体的量和/或通过加入合适的链终止封端剂而容易地进行控制。以这种方式，可以容易地控制片段的大小和它们的比例。

本领域已知，在确定用于形成囊泡的共聚物的适用性(所谓的聚合物疏水比)时，嵌段的绝对和相对长度是重要的。此外，由于根据本发明的囊泡的预期用途之一是如下所述由其中混入跨膜蛋白的囊泡形成膜，所以预期用于该应用的聚合物中的嵌段的长度优选使得囊泡壁的厚度与跨膜蛋白的长度大致相当，使得蛋白质可以容易地混入囊泡壁，而不会阻塞通道。例如，泡囊壁的厚度可在1nm到50nm的范围内。疏水性聚丁二烯嵌段的长度特别重要，并且其应优选不大于200个重复单元。

聚合物链上的两个端基可彼此相同或不同。如果BA二嵌段共聚物的B嵌段是聚丁二烯，该嵌段的端基通常将在合成后含有一个基团，该基团取决于用于PB聚合的引发剂。例如，如果使用烷基锂引发剂R-Li，则其将含有烷基R。引发剂可以是例如仲丁基锂，在这种情况下端基将是仲丁基。PB嵌段的每个重复单元当然将包含C＝C双键。A(PAOXA)基团的端基将取决于用于使生长的聚合物链终止的方法。在ABA三嵌段共聚物中，两个端基都将在PAOXA基团处，同时中间B嵌段在不存在交联的情况下将包含C＝C双键。

在本发明的优选实施方式中，嵌段共聚物的PAOXA嵌段含有不是-OH基团的端基。合适的端基的选择可促进囊泡形成，或者可提供聚合物的向前反应的功能。具体地，优选的端基包括羧基和活化的羧基；胺基；甲基丙烯酸酯基；巯基；叠氮基和炔基。在一个优选的实施方式中，嵌段共聚物在PAOXA嵌段的末端含有至少一个羧基端基。在另一个优选的实施方式中，嵌段共聚物在PAOXA基团的末端含有端基，其包含-NH₂基团。特别优选的是含有-NH₂和-NH-基团的端基，即端基包含伯胺基和仲胺基。

在初始合成共聚物之后可以存在所需的端基，或者可以在合成共聚物之后混入。如果在初始合成后不存在，可以在相关嵌段的末端通过合适的反应混入适当的端基。为此，生长片段的聚合可以在达到合适的链长度并且链端封端处存在引发剂基团之后终止。例如，使用水封端将产生-OH端基，而用合适的胺封端将产生胺端基。或者，可以使用任何其它所需的终止剂进行封端，并且可以使用已知化学物质混入所需的端基。例如，可以在生长片段末端使用KOH/MeOH或不饱和基团进行终止。然后可使用常规化学物质与端基进行反应以混入所需的基团。

在本发明的一个特别优选的实施方式中，嵌段共聚物由至少一个具有式-NHR的端基X封端，其中R表示可具有1-6个碳原子的直链或支链的烷基，该碳原子由至少一个(例如1、2或3个)-NH₂基团取代。优选地，这种端基X具有式-NH-CH-(NH₂)₂、或优选地具有式-NH-(CH₂)_n-NH₂，其中n是2至6、优选2至4的整数、特别是2。这样的端基可通过使具有-OH端基的聚合物与合适的反应性胺NH₂R，例如二胺，例如H₂N-(CH₂)_n-NH₂、特别是H₂N-(CH₂)₂-NH₂，或三胺，例如N.([CH₂]_nNH₂)₃或CH.([CH₂]_nNH₂)₃、例如CH(NH₂)₃或三(3-氨丙基)胺进行反应而混入。也可使用支链低聚亚胺。或者，如上所述，生长的聚合物链能够使用合适的胺封端。

更多关于端基的信息在下面的“膜”部分给出。

囊泡

已经发现包含至少一种(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉嵌段和至少一种聚丁二烯嵌段的嵌段共聚物特别适用于形成囊泡，本发明提供了由这些共聚物形成的囊泡。

本发明的囊泡可以通过本领域公知的方法由嵌段共聚物制备。通常，这些方法涉及溶剂置换或无溶剂的再水合。在溶剂置换方法中，在与水混合之前将嵌段共聚物溶解在有机溶剂中。混合后，任选地除去有机溶剂，导致了囊泡的自发自组装。在无溶剂再水合中，使干嵌段共聚物在水合时与水性介质接触，导致囊泡的自发自组装。在无溶剂再水合的特殊情况(薄膜再水合过程)中，将嵌段共聚物溶解在有机溶剂中，然后在形成薄膜的条件下将溶剂除去。然后通过与水接触使该膜水合，并通过自组装形成囊泡。囊泡制备的另一种已知的方法涉及使用超声处理，超声处理的程度决定形成的囊泡的初始尺寸。

本发明的嵌段共聚物通常最初形成相对较大的囊泡(可以将其描述为“巨型单层囊泡”，GUV)。GUV通常具有约1至20微米的直径。具有期望尺寸和低多分散性的囊泡可以通过已知方法从最初形成的囊泡群获得，例如通过一个或多个已知孔径的膜挤出大的单层和多层多分散囊泡。径迹蚀刻(Track etched)的聚碳酸酯膜，例如可从Millipore获得的Isopore(商标)膜适用于此目的。已经发现，由本发明的共聚物制成的囊泡的尺寸比由已知共聚物制造囊泡时更容易调整。具体而言，使用本发明的共聚物比使用已知的共聚物更容易制备GUV。在本发明中制备和使用的囊泡的最佳尺寸将取决于其预期应用。例如，囊泡的平均直径可以在30至10,000nm的范围内，优选50至1000nm，更优选100至400nm，特别是150至250nm。

嵌段共聚物形成囊泡、而不是其它自组装结构如胶束的倾向取决于嵌段的绝对和相对尺寸；这在本领域中是已知的。它还取决于聚合物端基的性质，这在本领域中是未知的。例如，当聚合物用-OH基团封端时，并且当嵌段分子量较高时，易于形成胶束，这意味着如果需要囊泡，较低分子量的聚合物是优选的。令人惊奇的是，羧基或胺基作为端基、特别是含有-NH₂和-NH-基团的胺基的存在有助于形成囊泡。

如果需要，根据本发明的囊泡可以通过PB嵌段中的双键进行内部交联。这可以使用类似于已知方法的方法来完成，例如使用引发剂或使用UV光。这增加了囊泡的稳定性，使得它们在许多不同的应用中特别有用，例如物质的递送。或者，也可以通过使用合适的功能性端基使聚合物链交联来增加囊泡的稳定性。还发现通过PB嵌段中的双键进行交联降低了由共聚物形成的囊泡的渗透性，因此交联提供了控制和调整囊泡渗透性的简单方法。

本发明的一个优选实施方式提供由嵌段共聚物形成的囊泡，该嵌段共聚物包含至少一种(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉嵌段和至少一种聚丁二烯嵌段，所述囊泡具有混入其壁中的跨膜蛋白。这样的囊泡可以通过在跨膜蛋白、特别是水通道蛋白的存在下进行囊泡形成过程而形成，由此跨膜蛋白质混入囊泡的壁中。通常，形成这种囊泡的方法在有助于维持蛋白质的完整性和生物学功能的洗涤剂的存在下进行。因此，上述再水合步骤可以使用跨膜蛋白的水溶液进行，优选还包括洗涤剂。水通道蛋白的使用是优选的，并且水通道蛋白在广泛的工艺条件下是稳定的。跨膜蛋白的进一步细节在下面的“跨膜蛋白”部分中给出。

其中混入跨膜蛋白的囊泡在膜形成中是有用的。这在下面的“膜”部分中进行了讨论。

除了在膜的形成中具有实用性，囊泡还可以用于其它应用。根据本发明的囊泡的进一步用途是递送物质，例如药物或美容剂，本发明的嵌段共聚物特别适用于此用途，因为它们导致囊泡具有高的包封效率。此外，由本发明的共聚物形成的囊泡比由已知的共聚物形成的囊泡(其在与洗涤剂接触时倾向于失去其结构)具有更大的洗涤剂抗性，使得本发明特别适用于递送包含洗涤剂类分子的美容剂。可以通过许多不同的途径将多种物质包含在由囊泡壁限定的囊泡的空腔中，例如通过在制备过程中将物质加入到嵌段共聚物中，通过在囊泡形成期间将物质混入嵌段共聚物，或者通过用该物质的溶液处理囊泡直到物质已被吸收到囊泡中。其中可以考虑的物质是药物、美容剂、香料、染料、颜料、光活性化合物、金属颗粒、纳米颗粒、生物聚合物、生物细胞器、细胞器和化学试剂。特别优选的是在药物或美容剂递送领域中使用囊泡，并且本发明还提供根据本发明的囊泡，其包含药物或美容剂，其特征在于在由囊泡壁限定的腔内含有药物或美容剂。可以使用各种各样的药物或美容剂，例如包括小分子药物、毒素、细胞毒性药物、基因或RNA在内的合适的小分子药物，以及蛋白质，例如治疗性蛋白质或酶。

因为根据本发明的囊泡可以由具有末端官能团的共聚物制成，囊泡可以通过这些末端基团共价连接到靶向分子上，例如能够与靶标上的结合配偶体结合的结合蛋白，例如抗体或抗体片段。因此，本发明可用于靶向药物递送领域。

膜

本发明还提供一种过滤膜，其包含根据本发明的多个囊泡，其中混入有跨膜蛋白。这种膜的优选结构描述在我们的文献号第P021889WO的共同未决申请中，其要求2014年3月26日的英国申请1405390的优先权，其涉及一种包括多孔支撑体以及共价键合到其表面的层的过滤膜，所述层包含多个混入有跨膜蛋白的囊泡，所述囊泡由两亲嵌段共聚物形成；其特征在于，在所述层内，囊泡共价连接在一起以形成粘附物(coherent mass)。本发明的囊泡在这种膜中具有特别的用途。在这种膜中，支撑体携带一层囊泡，其中多个囊泡紧密堆积在一起。层中的堆积可以例如是六边形紧密堆积。存在于支撑体表面上的囊泡层比囊泡的平均直径厚，即比由单层泡囊提供的厚度大。优选地，该层应该具有等于囊泡平均直径的至少2倍、例如至少10倍、优选至少50倍、更优选至少150倍、最优选至少200倍的厚度。优选地，该层不超过囊泡的平均直径的500倍、例如不超过300倍。因此，例如，该层可以具有囊泡平均直径2至500倍、例如50至300倍、特别是200至300倍的厚度。就绝对值而言，囊泡层的厚度优选为至少0.04微米、例如至少0.1微米、例如至少0.2微米、例如至少2微米、优选至少10微米、更优选至少30微米、最优选至少为40微米。层的最大厚度没有特别优选。该层可以例如具有高达100微米，例如高达60微米的厚度。因此，例如，该层可以具有0.04至100微米、例如0.2至100微米、优选10至60微米、特别是40至60微米的厚度。

为了提高坚固性，成品膜中的囊泡层优选在与支撑体层相反一侧设置有保护性顶部涂层或第二支撑体层。这种顶部涂层可以例如在轧制过程中提供额外的机械损伤保护。其可以例如包括亲水性聚合物，例如聚乙烯醇。

我们共同未决申请中描述的结构的过滤膜可以通过包括提供混入有跨膜蛋白的囊泡的水性悬浮液的方法制备，所述囊泡由根据本发明的嵌段共聚物形成；将所述囊泡的悬浮液沉积在多孔支撑体的表面上；并提供反应条件，使得在不同囊泡之间以及囊泡与所述表面之间形成共价键。

优选地，过滤膜是水过滤膜，优选地，跨膜蛋白是水通道蛋白。在本说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则任何对过滤膜的引用应理解为包括对水过滤膜的具体引用，并且任何涉及跨膜蛋白的引用应理解为包括对水通道蛋白的具体引用。

膜制备方法可以以多种不同的方式进行。在第一优选实施方式中，该方法包括：

(a)提供根据本发明的其中混入有跨膜蛋白的囊泡的水性悬浮液，所述囊泡由具有反应性端基X的嵌段共聚物形成；

(b)提供具有至少两个与聚合物端基X反应的反应性基团Y的多官能连接剂；

(c)将所述囊泡的悬浮液和所述多官能连接物沉积在具有与聚合物端基X或反应性基团Y反应的表面的支撑体上；和

(d)引起端基X与基团Y、以及端基X或基团Y与支撑体的表面的反应。

在第二个优选实施方式中，该方法包括：

(a)提供根据本发明的其中混入有跨膜蛋白的囊泡的第一水性悬浮液，所述囊泡由具有反应性端基X的嵌段共聚物形成；

(b)提供根据本发明的其中混入有跨膜蛋白的囊泡的第二水性悬浮液，所述囊泡由具有与聚合物端基X反应的反应性端基Y的嵌段共聚物形成；

(c)将所述囊泡的悬浮液沉积在具有与聚合物端基X或Y反应的表面的支撑体上；和

(d)引起端基X与端基Y、以及端基X或端基Y与支撑体的表面的反应。

上述过程导致根据本发明的物理上坚固的聚合物囊泡层任选地通过连接物彼此连接，并且还连接到支撑体的表面。

嵌段共聚物端基中的一个或两个可以是上述端基之一。优选地，端基中的一个或两个是包括-NH₂和-NH-基团二者的基团X。膜制造过程中使用的所有嵌段共聚物分子不必都具有反应性端基。具有反应性端基的嵌段共聚物分子的比例不是关键的，条件是有足够的基团与第二囊泡群体或多官能连接物中的反应性基团反应以形成粘附物。通常，至少10％、例如至少20％、例如至少30％、例如至少40％、例如至多60％、或至多100％的用于形成囊泡的嵌段共聚物分子将具有功能性端基X或Y。类似地，不要求仅存在一种类型的端基X或Y。例如，可以期望使用嵌段共聚物的共混物，其一含有一个反应性端基X(1)(例如包含-NH₂基团的端基)，而第二个包含不同的反应性端基X(2)。

任何特定嵌段共聚物分子上的端基可以彼此相同，或者它们可以不同。例如，一个端基可以是反应性端基X，而另一个端基可以是非反应性基团。基团的确切性质当然将依赖于膜制造过程的性质，也依赖于支撑体表面的性质。

合适的反应性基团包括胺基(与例如羧酸、活化的羧酸和/或叠氮基反应)、羧酸、活化的羧酸和/或叠氮基(与例如胺基Y反应)和“点击化学(click chemistry)”基团(例如叠氮基或炔基，其分别与炔和叠氮基Y反应)；以及PB嵌段中存在的C＝C双键。特别优选使用胺基。

各种各样的胺基端基是可用的，并且它们可以含有-NH₂和/或-NH-基团。已经发现，当提供含有至少一种PAOXA嵌段和至少一种PB嵌段的具有这种端基的嵌段共聚物时，嵌段共聚物自组装成囊泡的能力增强：这是令人惊讶的，因为通常预期的最能影响囊泡形成的两亲嵌段共聚物的性质是(i)嵌段的大小和性质；和(ii)聚合物的多分散性。

当使用多官能连接剂时，该试剂中存在的反应性基团可以彼此相同，或者它们可以不同。它们必须与存在于囊泡中的补充反应性基团和/或与支撑体表面反应。合适的基团如上所述。当使用多官能试剂时，试剂可以例如包含3或4个反应性基团，但优选含有两个反应性基团，并且本文中对多官能试剂的任何参考应理解为包括对双官能试剂的具体参考。

在本发明的优选实施方式中，囊泡包含含有胺基的反应性基团；并且提供补充的反应性基团，其是活化的羧酸基团或叠氮基、例如叠氮苯基。

当如上所述制备膜时，支撑体的表面可以在一个或多个步骤中官能化，以混入能够与补充的反应性基团X(即包含-NH₂和-NH-的基团)和/或Y反应的具体反应性基团Z。合适的基团包括胺基(与例如羧酸或活化的羧酸基团X和/或Y反应)；羧酸或活化的羧酸基团，(与例如胺基X和/或Y反应)；和“点击化学”基团(例如与炔基或叠氮基X和/或Y反应的叠氮基或炔基)。表面多步官能化的一个实例是使用酸(例如盐酸)对聚丙烯腈表面进行水解，以混入表面羧酸基团，随后可以使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)对其进行活化，随后例如使用炔丙胺转化成炔基，或者例如使用氨基-三乙二醇-叠氮化物转化成叠氮基。然而，在本发明的另一个实施方式中，由于X和/或Y可能与形成支撑体的材料中已经存在的基团反应，所以可能不需要对支撑体的表面进行官能化。例如，Y可以是叠氮基：这些基团一旦使用UV光激活就具有高反应性，并且能够与存在于支撑体材料中的许多聚合物中存在的C-H键反应。具体来说，叠氮基、特别是叠氮苯基能够与聚砜共价键合，如下所述，它们是用于本发明的优选的支撑体材料。

在提及活化的羧酸基团时，应理解为包括任何常规的活化羧酸基团，例如活化的酯如N-羟基琥珀酰亚胺酯或酰基卤。这种活化技术是本领域公知的。在优选的实施方式中，活化的羧酸端基通过羧酸基与EDC和NHS的反应来制备。这是一种常见于蛋白质结合(conjugation)和固定化领域的已知技术。羧基与EDC和NHS的反应导致胺反应性NHS酯的形成。

当使用多官能连接物时，其确切的性质不是关键的，条件是它能够有效地反应以通过X和Y基团的反应引起囊泡连接在一起。

合适的多官能连接物包括同双官能交联剂，即在两端具有相同官能团的交联剂。能够与胺基结合的实例包括：

(i)NHS酯。典型的酯包括：

二琥珀酰亚胺基醇戊二酸酯：

双(琥珀酰亚胺基)聚乙二醇：

例如双(琥珀酰亚胺基)五(乙二醇)；

乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)：

3,3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基醇丙酸酯)：

双(磺基琥珀酰亚胺基)醇辛二酸酯：

二琥珀酰亚胺基醇酒石酸酯：

这种类型的试剂在弱碱性条件下，例如在7.2-8.5、例如7.2-8.0的pH下与伯胺反应，并产生稳定的酰胺键。反应温度通常在0至30℃的范围内，例如4至25℃。该反应产生N-羟基琥珀酰亚胺，其可通过透析或脱盐除去。该反应可以在室温或4℃下例如在pH 7.2-8.0的PBS缓冲液中进行0.5-4小时。

磺基NHS酯在NHS环上含有-SO₃基团。这对反应的化学物质没有影响，但是这些试剂倾向于具有增加的水溶性。

(ii)亚胺酸酯。典型的亚氨酸酯包括以下(通常以二盐酸盐形式获得)：

己二亚氨酸二甲酯：

3,3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯：

辛二亚氨酸二甲酯：

庚二亚氨酸二甲酯：

己二亚氨酸二甲酯：

亚氨酸酯与伯胺反应形成脒键。为了确保伯胺的特异性，反应通常在无胺的碱性条件(pH 9-11，例如pH 10)中用硼酸盐缓冲液进行。

(ⅲ)栀子苷元，其具有式：

(ⅳ)环氧化物，例如三缩水甘油基胺(triglycidylamine)：

(v)二醛化合物，例如HOC.(CH₂)_x.CHO，其中x为1至6。典型的二醛包括戊二醛、琥珀醛、乙二醛、丙二醛和邻苯二甲醛。

(ⅵ)COOH-PEG-COOH。该反应物是水溶性的，并且如果需要，可以用EDC/NHS活化以提供与胺的反应性。

合适的多官能连接物还包括异双官能交联剂，即在两端具有不同官能团的交联剂。实例包括：

1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(通常以盐酸盐的形式获得)：

卡必醇

环氧化物，例如三缩水甘油基胺；

COOH-PEG-NH₂；

N-磺基琥珀酰亚胺基-6-(4’-叠氮基-2’-硝基苯基氨基)己酸酯；

聚(2-羟乙基-共-2-甲基丙烯酰氧乙基天冬酰胺)；

N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯：

对叠氮苯甲酰肼：

膜制备方法可以利用“点击化学”，其可以例如利用叠氮化物与炔的反应。例如，可以通过伯胺与NHS酯的反应将炔基作为基团Y混入。许多叠氮化物-PEG-叠氮化物连接物可商购。

优选地，多官能连接物包括其中m为2至20、优选3至10、特别是3至9的(CH₂)_m链。特别优选的双官能连接物是市售产品N-磺基琥珀酰亚胺基-6-(4’-叠氮基-2’-硝基苯基氨基)己酸酯。本产品具有下式：

磺基琥珀酰亚胺基团是能够自发与胺基反应的活化羧酸酯的反应性基团Y。叠氮苯基在无光条件下是惰性的基团Y，但是当使用UV光活化时变成高反应性，容易与胺基反应。在不存在胺基的情况下，即使在一些具有C-H键的情况下，也能够与低反应性的基团反应；具体地说，它能够与聚砜中的芳族C-H基团反应。

上述膜制备方法(即引起互补反应性基团X和Y的反应、以及X或Y与支撑体表面的反应)的步骤(d)在何种条件下进行当然将取决于各种反应性基团的性质。在一些实施方式中，反应性基团在合适的条件下一旦一起接触将自发地彼此反应。在其它实施方式中，可存在可光活化的基团，在这种情况下，反应物可以一起接触，随后进行光照射以引发反应。在优选的实施方式中，两种机理通过以下方式相结合：使用具有与端基X接触反应的第一基团Y、以及在UV光照射下与端基X和支撑体表面反应的第二基团Y的多官能试剂。

因此，该方法的一个实施方式的步骤可以如下进行：

(a)提供根据本发明的其中混入有跨膜蛋白的囊泡水溶液，所述囊泡由具有反应性端基X的嵌段共聚物形成；

(b)提供具有至少两个与聚合物端基X反应的反应性基团Y的多官能(优选双官能)连接剂，该反应性基团Y包括能够在第一组反应条件下与聚合物端基X反应的第一反应性基团Y(1)、和在第一组反应条件下与聚合物端基X不反应但在第二组反应条件下与聚合物端基X反应的第二反应性基团Y(2)；

(b’)在所述第一组反应条件下将所述囊泡水溶液与所述多官能连接剂混合，使得反应性基团Y(1)与聚合物端基X反应；

(c)将所得溶液沉积在与第二反应性基团Y(2)反应的支撑体上，其量足以产生所需的囊泡层；以及

(d)通过施加所述第二组反应条件引发端基X与所述第二反应性基团Y(2)、以及第二反应性端基Y(2)与支撑体的表面的反应。

可以使用区分两个反应步骤的任何合适的反应条件。例如，第一组反应条件可能包括在第一温度下反应的基团X和Y(1)，而第二组反应条件可能包括在第二个较高温度下反应的基团X和Y(2)。然而，在优选的实施方式中，X和Y(1)它们一旦接触即(或者如果需要进行加热)自发反应，而X和Y(2)它们仅在通过光照射活化时才进行反应。因此，特别优选的方法包括：

(b)提供具有至少两个与聚合物端基X反应的反应性基团Y的多官能(优选双官能)连接剂，该反应性基团Y包括在接触时能够与聚合物端基X反应的第一反应性基团Y(1)，和在光照射下能够与聚合物端基X反应的第二反应性基团Y(2)；

(b’)在所述第一反应性基团Y(2)与聚合物端基X反应的条件下将所述囊泡水溶液与所述多官能连接剂混合；

(d)施加光照射以引起端基X与所述第二反应性基团Y(2)、以及第二反应性端基Y(2)与支撑体表面的反应。

在所有上述实施方式中，在步骤(c)中沉积的悬浮液的量足以提供具有连续的囊泡层的支撑体表面。通常，在步骤(d)已经进行之后，该层将是厚度大于囊泡平均直径的粘附物的形式；或者以绝对值计，其厚度为至少0.01微米，特别是0.04微米。

可以使用非常宽泛的反应条件来实现上述方法。在一个实施方式中，当使用多官能连接物时，使用的多官能连接物的量将使得存在的反应性基团Y的总量超过存在的聚合物端基X的总量，以确保充分的交联。pH、温度和其它反应条件的控制是常规的并且属于本领域技术人员的惯例。

总之，将根据本发明的囊泡与补充的多官能连接剂一起使用，与用于制备工作过滤膜的已知方法相比，具有重要优点。

支撑体可以由任何合适的微孔材料制成。它可以例如基于常规的膜支撑体，如在反渗透膜或超滤膜中使用的支撑体。这种支撑体可以例如由聚烯烃、纤维素、再生纤维素、乙酸纤维素、聚丙烯腈、聚醚砜或聚砜制成。在本发明的优选实施方式中，支撑体由聚砜制成。

支撑体膜的化学官能度可以以添加物的形式(其可以是低分子量或聚合物)而传送到铸造涂料或通过例如化学处理、接枝聚合或等离子体聚合使支撑体的表面功能化。通过这些方法，可以例如完成支撑体的以下化学转化：将胺基转化成羧酸基团，反之亦然；醛转化成胺；并将羟基转化为羧酸基团。所有这些反应都是本领域公知的。

多孔超滤膜可以例如通过以下方式制备：空气铸造，其中溶解的聚合物溶液通过一系列气流管道，所述管道以非常缓慢的方式控制溶剂的蒸发；溶剂或浸入铸造(emersioncasting)，其中溶解的聚合物散布在传送带上并穿过液体浴，浴中的液体与漆中的溶剂交换并引起孔的形成；热铸造，其中使用热量来驱动聚合物在给定溶剂体系中的溶解度。然后将漆浇铸到被冷却的移动带上。将漆中的热量淬火导致沉淀开始并形成孔。通常在该方法中使用的材料包括但不限于再生纤维素、硝酸纤维素、乙酸纤维素、聚酰胺、聚砜、聚(醚砜)、聚碳酸酯、聚(醚酰亚胺)、聚(2,6-二甲基-1,4-聚苯乙烯)、聚酰亚胺、聚(偏二氟乙烯)、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚丙烯腈、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚乙烯醇和聚二甲基硅氧烷。铸件的形态由最终模块的构造调节。其可以例如包括用于螺旋缠绕元件的平板；用于中空纤维元件的中空纤维；或者它可以是管状的。

通过控制施加到支撑体上的囊泡溶液中存在的囊泡浓度和/或通过沉积在支撑体上的溶液体积，可实现具有包含囊泡的粘附物的层的膜的制备，所述层具有确定的厚度。

本发明膜的优点在于，除了通过嵌入聚合物囊泡壁中的跨膜蛋白之外，通过膜的任何可能的通路都最小化，同时在支撑体膜的每单位表面积上提供大量可能的跨膜蛋白，从而使通过膜的通量最大化。制备膜的方法在技术上是简单的，并且所得膜在物理上是牢固的。

跨膜蛋白

根据本发明的囊泡和膜可以含有跨膜蛋白。水通道蛋白是生物细胞跨膜蛋白，其功能是选择性输送水而非其它分子；蛋白质的运输通道是水可以沿任一方向流动的双向通道。它们由许多人类细胞类型以及细菌和植物细胞表达。蛋白质水通道蛋白家族中的任何不同成员均可用于本发明。合适的水通道蛋白包括Aqp 4、Aqp1、特别是Aqp Z。水通道蛋白可以以单体、二聚、四聚和更高级的寡聚形式、以及一级序列的突变、缀合和截短形式存在。条件是维持水通道蛋白的生物学功能，即水的选择性输送，其中任何一种都可以用在根据本发明的嵌段共聚物形成的膜中。

在本发明中可以使用具有期望的转运性质的任何其它跨膜蛋白。可以使用这种跨膜蛋白的变体，包括天然或非天然存在的变体和这些蛋白质的直系同源物或旁系同源物。这样的蛋白质包括例如：

·复合膜蛋白

○环氧化酶

■前列腺素H2合酶-1(环氧化酶-1或COX-1)：绵羊

■前列腺素H2合酶-1(COX-1)R120Q/天然异源二聚体：绵羊

■脯氨酸乙酰化COX-1

■环氧化酶-2：小家鼠

○角鲨烯何帕烯环化酶

■角鲨烯何帕烯环化酶：脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)

○单胺氧化酶

■单胺氧化酶B：人线粒体外膜

■单胺氧化酶A：大鼠线粒体外膜

■单胺氧化酶A：人线粒体外膜

·G110A突变体

○水解酶

■脂肪酸酰胺水解酶：褐鼠(Rattus norvegicus)

○氧化还原酶(单向转变)

■硫化物(Sulfide)：醌氧化还原酶与癸基泛醌复合物：超嗜热菌(AquifexAeolicus)

■电子转移黄素蛋白-泛醌氧化还原酶(ETF-QO)：野猪(Sus scrofa)

○肽聚糖糖基转移酶

■肽聚糖糖基转移酶：金黄色葡萄球菌(Staphylococccus aureus)

■肽聚糖糖基转移酶青霉素结合蛋白1a(PBP1a)：超嗜热菌(Aquifex aeolicus)

■肽聚糖糖基转移酶青霉素结合蛋白1b(PBP1b)：大肠杆菌(Escherichia coli)

○肽酶

■信号肽酶(SPase)：大肠杆菌(Escherichia coli)

■信号肽肽酶(SppA)，天然蛋白质：大肠杆菌(Escherichia coli)

○脱氢酶

■甘油-3-磷酸脱氢酶(GlpD，天然)：大肠杆菌(Escherichia coli)

○二氢乳清酸脱氢酶(DHODH，2类)

■二氢乳清酸脱氢酶：大肠杆菌(Escherichia coli)

■二氢乳清酸脱氢酶：黑家鼠(Rattus rattus)

■二氢乳清酸脱氢酶，apo形式：智人(Homo sapiens)

■二氢乳清酸脱氢酶：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)3d7

○聚合酶

■Tagf磷壁酸聚合酶：表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)

○ADP-核糖基化因子

■ADP-核糖基化因子(ARF1)，豆蔻酰化：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

■ADP-核糖基化因子(ARF1*GTP)，豆蔻酰化：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)

○异构酶

■RPE65视觉循环视黄醇异构酶：牛(Bos Taurus)

·跨膜蛋白：β-桶形

○β-桶形膜蛋白：多聚体

■孔蛋白：荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)

■孔蛋白：Rhodopeudomonas blastica

■OmpK36渗透孔蛋白(osmoporin)：肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumonia)

■Omp32阴离子选择性孔蛋白：食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)

■Omp32阴离子选择性孔蛋白：戴尔夫特食酸菌(Delftia acidovorans)

■OmpF基质孔蛋白：大肠杆菌(Escherichia coli)

■OmpC渗透孔蛋白：大肠杆菌(Escherichia coli)

■OmpG*单体*孔蛋白：大肠杆菌(Escherichia coli)

■PhoE：大肠杆菌(Escherichia coli)

■LamB麦芽糖孔蛋白(Maltoporin)：鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)

■LamB麦芽糖孔蛋白：大肠杆菌(Escherichia coli)

■ScrY蔗糖特异性孔蛋白：鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)

■MspA分枝杆菌孔蛋白：耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)

■OprP磷酸酯特异性转运蛋白：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

■OprD碱性氨基酸摄取通道：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

■OpdK烃转运蛋白：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

■PorB外膜蛋白，天然结构：脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)

○β-桶形膜蛋白：单体/二聚体

■TolC外膜蛋白：大肠杆菌(Escherichia coli)

■TolC外膜蛋白，配体阻断：大肠杆菌(Escherichia coli)

■TolC外膜蛋白(Y362F，R367E)：大肠杆菌(Escherichia coli)

■C2形式

■P2:2:2形式

■VceC外膜蛋白：霍乱弧菌(Vibrio cholera)

■OprM药物排出外膜蛋白：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

■CusC重金属排出外膜蛋白：大肠杆菌(Escherichia coli)

■CusBA重金属流出物复合外膜蛋白：大肠杆菌(Escherichia coli)

■BenF样孔蛋白(推定)：荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)

■OprM药物排出外膜蛋白：铜绿假单胞菌

■apo BtuB维生素B12转运蛋白：大肠杆菌(Escherichia coli)

■BtuB：大肠杆菌(Escherichia coli)

■内消旋结晶apo BtuB：大肠杆菌(Escherichia coli)

■大肠杆菌素I受体：大肠杆菌(Escherichia coli)

■OmpA：大肠杆菌，

■具有四个缩短的环的OmpA：大肠杆菌(Escherichia coli)

■被称为β-桶形平台(BBP)

■OmpT外膜蛋白酶：大肠杆菌(Escherichia coli)

■Pla纤维蛋白溶酶原激活剂(天然1)：鼠疫耶尔辛杆菌(Yersinia pestis)

■OmpW外膜蛋白：大肠杆菌(Escherichia coli)

■正交型

■三方型

■OprG外膜蛋白：铜绿假单胞菌

■OmpX：大肠杆菌(Escherichia coli)

■TtoA外膜蛋白(OMP)：嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB27

■OmpLA(PldA)外膜磷脂酶A单体：大肠杆菌(Escherichia coli)

■OmpLA(PldA)活性位点突变体(N156A)：大肠杆菌(Escherichia coli)

■OpcA粘附蛋白：脑膜炎奈瑟氏菌

■NspA表面蛋白：脑膜炎奈瑟氏菌

■NalP自动转运蛋白转位结构域：脑膜炎奈瑟氏菌

■NanC孔蛋白，KdgM孔蛋白家族的模型：大肠杆菌

■Hia1022-1098三聚自动转运蛋白：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)

■Hia992-1098

■EspP自动转运蛋白，后切割状态：大肠杆菌(Escherichia coli)

■EstA自动转运蛋白，全长：铜绿假单胞菌

■PagP外膜蛋白棕榈酰转移酶(palimitoyl transferease)：大肠杆菌(Escherichia coli)

■FadL长链脂肪酸转运蛋白：大肠杆菌(Escherichia coli)

■FadL长链脂肪酸转运蛋白A77E/S100R变体：大肠杆菌(Escherichia coli)

■ΔS3扭结

■P34A突变体

■N33A突变体

■ΔNPA突变体

■G212E突变体

■FadL同系物长链脂肪酸转运蛋白：铜绿假单胞菌

■FauA alcaligin外膜转运蛋白：百日咳杆菌(Bordetella pertusssis)TodX烃转运蛋白：恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)

■TbuX烃转运蛋白：皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)

■Tsx核苷转运蛋白(脱辅基蛋白)：大肠杆菌(Escherichia coli)

■FhuA，铁色素-铁受体：大肠杆菌(Escherichia coli)

■FepA，铁肠菌素受体：大肠杆菌(Escherichia coli)

■FecA，铁载体转运蛋白：大肠杆菌(Escherichia coli)

■HasR heme摄取受体：粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)

■Ile671Gly突变体

■FptA，绿脓杆菌螯铁蛋白外膜受体：铜绿假单胞菌

■FpvA，荧光铁载体受体：铜绿假单胞菌

■FpvA，荧光铁载体受体(apo形式)：铜绿假单胞菌

■P纤毛引导转运结构域：PapC130-640：大肠杆菌(Escherichia coli)

○β-桶形膜蛋白：线粒体外膜

■VDAC-1电压依赖性银离子通道：人

■VDAC-1电压依赖性银离子通道：鼠

○Omp85-TpsB外膜转运蛋白超家族

■FhaC丝状血凝蛋白转运蛋白：：百日咳杆菌(Bordetella pertusssis)

■TeOmp85-N POTRA结构域：Thermosynechococcus anaOmp85-N鱼腥藻(Anabaenasp.)PCC7120

■BamA：大肠杆菌(Escherichia coli)

■BamE：大肠杆菌(Escherichia coli)

○非构成性.β-片状孔形成毒素

■α-溶血素：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

■LukF：金黄色葡萄球菌

■产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)启动子：产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridiumperfringens)

■炭疽保护性抗原(PA)和致死因素(LF)前置通道络合物：炭疽杆菌(Bacillusanthraciss)

■淋巴细胞穿孔蛋白(preforin)单体：小家鼠(Mus musculus)

·跨膜蛋白：α-螺旋状

○非构成性.α-螺旋状孔形成毒素

■溶细胞素A(ClyA，aka HlyE)：大肠杆菌(Escherichia coli)

■来自海葵的FraC真核孔形成毒素：Actinia fragacea

○外膜蛋白：

■用于荚膜多糖的Wza异位子：大肠杆菌(Escherichia coli)

■孔蛋白B单体：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)

■IV型外膜分泌络合物：大肠杆菌(Escherichia coli)

■细菌视紫红质(BR)：嗜盐菌(Halobacterium salinarium)

■嗜盐菌紫质(HR)：嗜盐菌

■嗜盐菌紫质(HR)：盐碱古菌(Natronomonas pharaonis)

■视紫红质(SRI)：鱼腥藻属(Nostoc)PCC7120

■视紫红质(SRII)：盐碱古菌(Natronomonas pharaonis)

■古紫质-1(aR-1)：Halorubrum sp.aus-1

■古紫质-2(aR-2)：Halorubrum sp.aus-2

■Xanthorhodopsin：Salinibacterruber

○G蛋白偶联受体(GPCRs)

■视紫红质：牛视杆细胞外节(牛)

■视紫红质：乌贼(太平洋褶柔鱼(Todarodes pacificus))

■β1肾上腺素受体(改造的)：火鸡(土耳其)

■β2肾上腺素能受体：智人(Homo sapiens)

■甲基化β2肾上腺素能受体：智人(Homo sapiens)

■A2A腺苷受体：智人(Homo sapiens)

■CXCR4趋化因子受体：智人(Homo sapiens)

■多巴胺D3受体：智人(Homo sapiens)

○自主折叠“膜蛋白”(Sec-独立的)

■Mistic膜整合蛋白：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

○糖蛋白

■糖蛋白A跨膜结构域二聚体：智人(Homo sapiens)

○SNARE蛋白家族

■突触融合蛋白1A/SNAP-25/突触小泡蛋白-2络合物：家鼠

○整合素粘附受体

■人整合素αIIbβ3跨膜细胞质异源二聚体：智人(Homo sapiens)

○组氨酸激酶受体

■ArcB(1-115)有氧呼吸控制传感器膜结构域：大肠杆菌(Escherichia coli)

■QseC(1-185)传感器蛋白膜结构域：大肠杆菌(Escherichia coli)

■KdpD(397-502)传感蛋白膜结构域：大肠杆菌(Escherichia coli)

○免疫受体

■TCR-CD3络合物的跨膜ζ-ζ二聚体：智人(Homo sapiens)

■DAP12二聚体：智人(Homo sapiens)

○通道：钾和钠离子选择性

■KcsA钾通道，H+门控的：变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)

■KcsA钾通道E71H-F103A灭活状态突变体(闭合状态)：变铅青链霉菌

■KcsA钾通道E71I模式门控突变体：变铅青链霉菌

■KvAP电压门控钾通道：敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)

■Kv1.2电压门控钾通道：褐家鼠

■Kv1.2/Kv2.1电压门控钾通道嵌合体：褐家鼠

■F233W突变体

■MthK钾通道，Ca++门控：Methanothermobacter thermautotrophicus

■人类BK通道Ca2+激活装置：智人(Homo sapiens)

■Kir3.1-原核Kir嵌合体：小家鼠和Burkholderiaxenovornas

■Kir2.2向内整流钾通道：原鸡

■KirBac1.1向内整流钾通道：类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderianpseudomallei)

■MlotiK1环核苷酸调节的K+通道：百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)

■mGIRK1G蛋白门控整流钾通道：小家鼠

■NaK通道(Na+络合物)：蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)

■D66/S70E突变体

■D66N突变体

■D66E突变体

■CNG模拟NaK通道突变体：蜡状芽孢杆菌

■NaK渠道K+选择性突变体：蜡状芽孢杆菌

○通道：其它离子通道

■GluA2谷氨酸受体(AMPA亚型)：褐鼠

■M2质子通道：流感A

■M2质子通道：流感B

■ASIC1酸敏感测离子通道：原鸡

■ATP门控P2X4离子通道(载脂蛋白)：斑马鱼

■烟碱乙酰胆碱受体孔：石纹电鳐

■原核五聚体配体门控离子通道(pLGIC)：菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)

■原核五聚体配体门控离子通道(GLIC)：无类囊体蓝藻(Gloebacter violaceus)

■E221A突变体

■原核五聚体配体门控离子通道(GLIC)，野生型-TBSb络合物：无类囊体蓝藻

■野生型-TEA络合物

■E221D-TEA络合物

■野生型-TMA络合物

■野生型-溴-利多卡因络合物

■野生型-Cd2+络合物

■野生型-Zn2+络合物

■野生型-Cs+络合物

■MscL机械敏感通道：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

■MscS电压调节机械敏感通道：大肠杆菌

■CorA Mg2+转运蛋白：海栖热袍菌(Thermotoga maritime)

■MgtE Mg2+转运蛋白：嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)

■SLAC1阴离子通道，TehA同系物(野生型)：流感嗜血杆菌属

■F262A突变体

■F262L突变体

■F262V突变体

■G15D突变体

○通道：蛋白质引导

■SecYEβ蛋白引导通道：甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)

○通道：水通道蛋白和分泌甘油的蛋白通道

■AQP0水通道蛋白水通道：牛晶状体

■AQP1水通道蛋白水通道：人体红细胞

■AQP1水通道蛋白水通道：牛红细胞

■AQP4水通道蛋白水通道：大鼠胶质细胞

■S180D突变体

■AQP4水通道蛋白水通道：人

■AQP5水通道蛋白水通道(HsAQP5)：人

■AqpM水通道蛋白水通道：Methanothermobacter marburgensis

■AqpZ水通道蛋白水通道：大肠杆菌

■AqpZ水通道蛋白(C9S/C20S)，T183C突变体：大肠杆菌

■L170C突变体

■AqpZ水通道蛋白突变体F43W：大肠杆菌

■H17G/T183F突变体

■F43WH174G/T183F突变体

■SoPIP2；1植物水通道蛋白：菠菜

■GlpF甘油促进通道：大肠杆菌

■GlpF甘油促进通道，W84F/F200T突变体：大肠杆菌

■PfAQP水-甘油通道蛋白：恶性疟原虫

■Aqy1酵母水通道蛋白(pH 3.5)：毕赤酵母(Pischia pastoris)

○通道：甲酸盐硝酸盐转运蛋白(FNT)家族

■FocA，五聚水通道蛋白样甲酸盐转运蛋白：大肠杆菌

■没有甲酸盐的FocA甲酸盐转运蛋白：霍乱弧菌

■FocA甲酸盐转运蛋白：鼠伤寒沙门氏杆菌

○通道：尿素转运蛋白

■尿素转运蛋白：普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)

■连接蛋白26(Cx26；GJB2)间隙连接：人

○通道：Amt/Rh蛋白

■AmtB氨通道(突变体)：大肠杆菌

■AmtB氨通道(野生型)：大肠杆菌

■H168E突变体

■H168A突变体

■H168F突变体

■H318A突变体

■H318突变体

■H318F突变体

■H168A/H318A突变体

■Amt-1铵通道：闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)

■Rh蛋白，可能的氨或CO₂通道：欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)

■人Rh C糖蛋白氨转运蛋白：智人(Homo sapiens)

○膜内蛋白酶

■GlpG菱形家族内膜蛋白酶：大肠杆菌

■W136A突变体

■S201T活性位点突变体

■GlpG菱形家族内膜肽酶：流感嗜血杆菌

■Site-2蛋白酶(S2P)。膜内金属蛋白酶：詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcusjannaschii)

■信号肽肽酶(SppA)，天然蛋白质：大肠杆菌

○膜结合金属蛋白酶

■apo-FtsH ATP依赖性金属蛋白酶：海栖热袍菌

○H+/Cl-交换转运蛋白

■H+/Cl-交换转运蛋白：鼠伤寒沙门氏菌

■H+/Cl-交换转运蛋白：大肠杆菌

■E148A突变体

■E148Q突变体

■S107A/E148Q/445A突变体

■单体H+/Cl-交换转运蛋白：大肠杆菌

■+/Cl-真核交换转运蛋白：红藻(Cyanidioschyzonmerolae)

■H+/Cl-真核交换转运蛋白：集胞藻(Synechocystis sp.)pcc 6803

○细菌汞解毒蛋白

■MerF Hg(II)转运蛋白：摩根氏菌(Morganella morganii)

○多药物流出转运蛋白

■AcrB细菌多药物流出转运蛋白：大肠杆菌

■AcrB细菌多药物流出运蛋白，apo蛋白，N109A突变体：大肠杆菌

■AcrB细菌多药物流出转运蛋白，D407A突变体：大肠杆菌

■MexB细菌多药物流出转运蛋白：铜绿假单胞菌

■CusA金属离子流出泵：大肠杆菌

■EmrE细菌多药物流出转运蛋白：大肠杆菌

■NorM多药物和毒素化合物挤出(MATE)转运蛋白(载脂蛋白)：霍乱弧菌

○类花生酸和谷胱甘肽代谢中的膜相关蛋白(MAPEG)

■微粒体前列腺素E合酶1：人

■具有结合的MK-591抑制剂的5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)：人

■白细胞三烯LTC4合成酶：人类

○主要促进超家族(MFS)转运蛋白

■LacY乳糖渗透酶转运蛋白(C154G突变体)：大肠杆菌

■具有TDG的LacY乳糖渗透酶(野生型)：大肠杆菌

■外向型构象中的FucP岩藻糖转运蛋白：大肠杆菌

■N162A突变体

■GlpT甘油-3-磷酸酯转运蛋白：大肠杆菌

■EmrD多药转运蛋白：大肠杆菌

■PepTSo寡肽-质子转运蛋白：希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)

○溶质钠同向运输蛋白(SSS)家族

■vSGLT钠半乳糖转运蛋白：副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

■K294A突变体

○核碱基-阳离子-同向运输蛋白-1(NCS1)家族

■Mhp1苄基-乙内酰脲转运蛋白：液化微杆菌(Microbacterium liquefaciens)

○甜菜碱/胆碱/肉碱转运蛋白(BCCT)家族

■BetP甘氨酸甜菜碱转运蛋白：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)

■CaiT肉碱转运蛋白：大肠杆菌

■CaiT肉碱转运蛋白：奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)

○氨基酸/多胺/金属阳离子有机物(APC)超家族

■AdiC精氨酸：胍丁胺逆向转运蛋白：大肠杆菌

■N22A，L123W突变体

■N101A突变体

■apo ApcT Na+-独立氨基酸转运蛋白：詹氏甲烷球菌

○氨基酸次级转运蛋白

■LeuTAa亮氨酸转运蛋白：超嗜热菌(Aquifex aeolicus)

■野生型LeuT转运蛋白：超嗜热菌(Aquifex aeolicus)

■E290S突变体

■具有硝基自旋标记的突变型LeuT转运蛋白(F177R1)：超嗜热菌(Aquifexaeolicus)

■I204R1突变体

■谷氨酸转运蛋白同系物(GltPh)：Pyrococcus horikoshii

■天冬氨酸转运蛋白Li+-结合状态(GltPh)：Pyrococcus horikoshii

○阳离子扩散促进剂(CDF)家族

■YiiP锌转运蛋白：大肠杆菌

○逆向转运蛋白

■NhaA Na+/H+反向转运蛋白：大肠杆菌

■线粒体ADP/ATP反向转运体：牛心脏线粒体

○能量耦合因子(ECF)转运蛋白

■RibU，核黄素转运蛋白的S组分：金黄色葡萄球菌

○ATP结合盒(ABC)转运蛋白

■BtuCD维生素B12转运蛋白：大肠杆菌

■Sav1866多药物转运蛋白：金黄色葡萄球菌

■钼酸盐转运蛋白ModB2C2：闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)

■ModBC钼酸盐ABC转运蛋白：Methanosarcina acetororans

■HI1470/1推定的金属螯合型ABC转运蛋白：流感嗜血杆菌

■与AMPPNP结合的MsbA脂质“翻转酶”：鼠伤寒沙门氏菌

■P-糖蛋白：小家鼠(小鼠)

■MalFGK2-MBP麦芽糖摄取转运蛋白络合物：大肠杆菌

■MetNI甲硫氨酸摄取转运蛋白络合物：大肠杆菌

■FbpC高价铁铁-摄取转运蛋白核苷酸结合域：淋病奈瑟氏球菌

○K+转运蛋白超家族(SKT蛋白)

■TrkH钾离子转运蛋白：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

■钙ATP酶：兔肌浆网

■Na,K-ATP酶：猪肾

■Na,K-ATP酶：鲨鱼

■Na,K-ATP酶调节蛋白FXYD1：人

■受磷蛋白同源五聚体：人类肌浆网

■等离子膜H+-ATP酶：拟南芥

○V型ATP酶

■转子V型Na+-ATP酶：肠球菌(Enterococcus hirae)

■V1-ATP酶络合物：嗜热栖热菌

■V1-ATP酶的A3B3复合物：嗜热栖热菌

○F型ATP酶

■来自牛心脏线粒体的F1-ATP酶：牛

■ATP合成酶(F1c10)：酿酒酵母

■F1ATP酶：酿酒酵母

■Na+依赖性F-ATP合成酶的转子(c11)：Ilyobacter tartaricus

■菠菜叶绿体中H+依赖性F-ATP合成酶的转子(c14)：菠菜

■碱性蓝细菌的H+依赖性F-ATP合成酶的转子(c15)：钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)

■H+依赖性F-ATP合成酶的转子(c13)：假单胞菌

■H+依赖性F-ATP合成酶的外周柄茎：嗜热栖热菌

○磷酸转移酶

■二酰基甘油激酶(DAGK)：大肠杆菌

○水解酶

■雌酮硫酸酯酶：人胎盘

○氧化酶

■颗粒状甲烷单氧化酶(pMMO)：荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)

■颗粒状甲烷单氧化酶(pMMO)：发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)OB3b

○氧化还原酶

■硫化物：醌氧化还原酶：超嗜热菌(Aquifex aeolicus)

■电子转移黄素蛋白-泛醌氧化还原酶(ETF-QO)：猪

■甘油-3-磷酸脱氢酶(GlpD，天然)：大肠杆菌

■NarGHI硝酸盐还原酶A：大肠杆菌

■K86A突变体

■H66Y突变体

■NrfH细胞色素C对苯二酚脱氢酶：普通脱硫弧菌

■DsbB-DsbA周质氧化酶络合物：大肠杆菌

■DsbB-Fab络合物：大肠杆菌

■wtDsbB-DsbA(Cys133A)-Q8络合物：大肠杆菌

■维生素K环氧化物还原酶：聚球藻(Synechococcus sp.)

○Mo/W双-MGD氧化还原酶

■多硫化物还原酶PsrABC(天然)：嗜热栖热菌

○电子转运链络合物：络合物I

■络合物I膜结构域：大肠杆菌

■完整的络合物I：嗜热栖热菌

○电子转运链络合物：络合物II

■天然富马酸盐还原酶络合物：大肠杆菌

■富马酸盐还原酶络合物：产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)

■甲酸盐脱氢酶-N：大肠杆菌

■琥珀酸盐脱氢酶(络合物II)：大肠杆菌

■琥珀酸盐:泛醌氧化还原酶(SQR，络合物II)：猪心脏线粒体

■琥珀酸盐：泛醌氧化还原酶(SQR，络合物II)：鸡心脏线粒体

○电子转运链络合物：络合物III(细胞色素bc1)

■细胞色素bc1：牛

■细胞色素bc1：原鸡

■细胞色素bc1：酿酒酵母

■细胞色素bc1：类球红细菌(Rhodobacter Sphaeroides)

○电子转运链络合物：生氧光合作用的细胞色素b6f

■细胞色素b6f络合物：层理鞭枝藻(Mastigocladus laminosus)

■细胞色素b6f络合物：衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)

■细胞色素b6f络合物：鱼腥藻PCC 7120

○电子转运链络合物：络合物IV(细胞色素C氧化酶)

■细胞色素C氧化酶，aa3：牛(牛的)心脏线粒体

■细胞色素C氧化酶，aa3：脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)

■N131D突变体

■细胞色素氧化酶，cbb3：施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)

■细胞色素ba3：嗜热栖热菌

■细胞色素C氧化酶野生型：类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)

■泛醇氧化酶，细胞色素bo3：大肠杆菌

○一氧化氮还原酶

■一氧化氮还原酶：铜绿假单胞菌

○光合系统

■光合系统I：Thermosynechococcus elongates

■光合系统I(植物)：豌豆(Pisum sativum)

■光合系统II：Thermosynechococcus elongates

■光合系统II：Thermocynechococcus vulcanus

○光捕获络合物

■光捕获络合物：嗜酸红假单胞菌(Rhodopseudomonas acidophila)

■光捕获络合物：Rhodospirillum molischianum

■光捕获络合物LHC-II，菠菜光合系统II：菠菜

■光捕获络合物CP29，菠菜光合系统II：菠菜

■光捕获络合物LHC-II，豌豆光合系统II：豌豆

光合反应中心

■光合反应中心：芽生绿菌属(Blastochloris viridis)

■光合反应中心：类球红细菌

■光合反应中心：嗜热紫色光合细菌(Thermochromatium tepidum)

附图说明

图1A和1B示出根据本发明的囊泡的LSM成像显微照片。

图2和3示出实施例2的停流实验的结果。

图4示出实施例2的DLS实验的结果。

图5示出如实施例3所述将水通道蛋白Z蛋白混入根据本发明的囊泡的效果。

图6是实施例5的膜的显微照片。

图7示出在实施例5的膜中聚丁二烯内部交联的效果。

图8示出实施例6中所述的包封效率实验的结果。

以下实施例对本发明进行说明。

实施例1：聚合物制备

步骤(a)：PB合成

按照Hillmyer,M.A.；Bates,F.S.1996,9297,6994-7002的方案，进行一些修改，合成聚丁二烯。在-60℃至-50℃，丁二烯的阴离子聚合在THF中进行，使用仲丁基丁基锂作为引发剂。将干燥的双颈烧瓶在烘箱中干燥过夜，并将一条管线连接到一个口并用隔膜连接到另一个口。将烧瓶烧干并加入搅拌棒。使用套管将30ml干溶剂THF加入到双颈烧瓶中。将11ml丁二烯(0.13mol)在冷凝瓶中冷凝。首先使用液氮冷凝聚丁二烯，然后使用干冰-丙酮浴熔化。使用套管将其转移到双颈烧瓶中。迅速加入7ml(0.0098摩尔)1.4M的仲丁基锂引发剂。使聚合进行3小时。通过在丁二烯完全转化时在-60℃下加入2ml(0.051摩尔)环氧乙烷来完成封端。然后使用酸性甲醇(5ml HCl:50ml甲醇)来释放通过蒸发溶剂而分离的聚丁二烯醇。通过用蒸馏水提取聚合物的环己烷溶液来除去无机盐。将聚合物置于高真空下以除去水。通过在索氏(soxhlet)提取器中使用分子筛将聚合物在干燥己烷中回流来进一步干燥。

步骤(b)：PB-PMOXA合成

在-10℃氩气下，用7.33g(0.0260M)三氟甲磺酸酐(SigmaAldrich 176176-5G)，在2.63g(0.0260M)三乙胺(SigmaAldrich T0886)的存在下，将20g(0.0260M)聚丁二烯(Mn769g/mol)进行功能化。进一步将有机盐过滤出去。三氟甲磺酸酯官能化的PB用作2-甲基-2-噁唑啉(SigmaAldrich 137448)阳离子开环聚合的大引发剂。聚合在40℃下在无水乙酸乙酯(SigmaAldrich 270989)中进行12小时。用乙二胺0.4g(SigmaAldrich 03550)终止反应。这提供伯胺和仲胺终止的PB-PMOXA聚合物。

聚合物表征：

PB₁₂-OH

NMR

5.45ppm–CH＝CH₂(重复单元)，4.94ppm–CH＝CH₂(重复单元)，2.12ppm CH(重复单元-主链)，1.27ppm CH₂(重复单元-主链)，CH₂和CH₃ 3.65ppm 0.82ppm–端基。

聚合物	溶剂	Mn	Mw	PDI
					PB₁₂	CHCl₃	526	602	1.14
PB₁₂PMOXA₅	CHCl₃	632	738	1.19

PB₁₂-PMOXA₅-NH-(CH₂)-NH₂

NMR

PB:5.45ppm–CH＝CH₂(重复单元)，4.94ppm–CH＝CH₂ (重复单元)，2.12ppm CH(重复单元-主链)，1.27ppm CH₂(重复单元-主链)，CH₂和CH₃ 3.65ppm 0.82ppm–端基。PMOXA:3.45ppm(-CH₂-CH₂ -N-)，2.11ppm(-N-CO-CH₃ )。

实施例2：囊泡制备

将PB₁₂-PMOXA₅-NH-(CH₂)₂-NH₂聚合物(50mg)溶解在圆底烧瓶(Pyrex 200ml)中的1ml氯仿中。在旋转蒸发器上减压蒸发溶剂，产生聚合物薄膜。随后3小时高真空处理除去痕量的氯仿。进一步加入5ml水并在600rpm下搅拌。这种方式制备10mg/ml的囊泡悬浮液。在采样表征(LSM、停流(Stopped-Flow)、DLS)时，悬浮液依次通过1μm、800nm、400nm、200nm的聚碳酸酯径迹蚀刻过滤器(Track ached filter)(Millipore)挤出。在每次挤出中，对悬浮液进行取样以进行表征。

囊泡的特征如下。使用低温透射电子显微镜(cryo-TEM)进行颗粒成像，并使用LSM成像研究表面官能化。

对于cryo-TEM，显微镜是FEI TecnaiG2，TF20。使用玻璃化自动仪(vitrificationrobot)Vitrobot^TMFEI将样品玻璃化。使用的放大倍率为25000x(校准的31625x)＝比例尺200μm。

对于LSM成像，使存在于如上制备的囊泡表面上的胺端基与四甲基罗丹明异硫氰酸酯荧光染料(摩尔比1:1000)反应，并相对去离子水进行透析。透析进行直到透析液显示无荧光迹象，然后另外更换去离子水以消除非特异性结合。使用具有复消色差透镜(Apochromat)63x/1.4Oil DIC M27物镜和561nm激光线的Zeiss LSM 710倒置共焦显微镜使囊泡可视化。针孔从50μm变化到70μm。这允许共焦平面“透视”囊泡，因此囊泡在悬浮液中呈现为光圈(囊泡中心在共焦点中央)或光盘(囊泡顶部在共焦点中)，囊泡漂浮在悬浮液中并动态地失焦。图1A和1B示出清楚显示囊泡的两个样品的显微照片。

调查囊泡结构的次要方法是使用停流实验来测量渗透性。使用停流分光镜将囊泡悬浮液与高渗或低渗溶液混合，并在部署停止注射时收集光散射信号。这导致横跨聚合物双层的浓度梯度，导致水在梯度方向上的渗透。在低渗溶液的情况下观察到聚合物囊泡的收缩，并且在高渗的情况下观察到聚合物囊泡的溶胀。可以通过光散射的方法来监测尺寸变化，并且发生变化的速率可以归因于在给定尺寸的囊泡处的水的渗透。已经显示这也验证聚集形态(A framework for accurate evaluation of the promise of aquaporinbased biomimetic membranes M.Grzelakowski，M.F.Cherenet，Y.Shen，M.Kumar Journalof Membrane Science doi：10.1016/j.memsci.2015.01.023)。

在16℃下将囊泡悬浮液与渗透溶液以1:1的比例快速混合，并在365nm和8mL/s的流速下收集光散射信号。渗透水渗透率(P_f)由下式计算：

其中k是对应于囊泡直径随时间变化的光散射曲线的初始斜率，S是囊泡的初始表面积，V₀是囊泡的初始体积，V_w是水的摩尔体积，以及Δ_osm是促使囊泡收缩的渗透压差。

通过将给定量的NaCl加入到水合缓冲液(0.1M NaMOPS)中，得到600mM、300mM、150mM、75mM、0mM(水合缓冲液)和-100mM(纯DI水)的梯度，制备一系列高渗溶液。如所预计且如图2所示，由于高渗性(hyportonicity)引起的收缩反转为借助低渗溶液的溶胀，从而确认囊泡的形态。

此外，停流也用于在挤压过程的每个步骤中确认囊泡形态。水渗透的时间与暴露于高渗条件的囊泡的尺寸成比例。双层的渗透性保持恒定，因此渗透通过较大面积的膜的较大量的水产生更长的时间周期。图3示出通过孔径减小的过滤器挤出的囊泡的停流图。

Malvern ZetraSizer^TM Nano-S动态光散射(DLS)用于确定粒径和尺寸多分散指数。在DLS测量之前，将囊泡悬浮液平衡过夜。然后，将样品通过孔径为800、400、200和100nm的膜挤出。挤出6小时后进行DLS测量。使用聚苯乙烯胶乳作为参照材料(RI：1.590；633nm处的吸收：0.010)，以及水作为分散剂(粘度：0.9781cP；RI：1.330)。在21℃下在样品体积为100μL的Science Brand一次性微量吸液管中进行测量。每个样品测量5次，每次测量为11次运行的平均。结果示于下表和图4中。

实施例3：将蛋白质嵌入囊泡中

通过水通道膜蛋白-水通道蛋白Z的重构，提高了聚合物囊泡的透水性。修饰膜水合程序以适应蛋白质在PoPr 400处的添加。简短地：在PoPr 400处向水合囊泡添加蛋白质溶液。接下来的步骤按照标准囊泡形成方案。

将PB₁₂-PMOXA₅-NH-(CH₂)₂-NH₂聚合物(50mg)溶解在圆底烧瓶(Pyrex 200ml)中的1ml氯仿中。在旋转蒸发器上减压蒸发溶剂，产生聚合物薄膜。随后3小时高真空处理除去痕量的氯仿。进一步加入5ml含有0.1245mg水通道蛋白Z(Applied Biomimetic)和0.5％辛基葡糖苷(O311-正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷，Anagrade，Anatrace)的100mM Na-MOPS缓冲液，并以600rpm搅拌。通过200nm聚碳酸酯径迹蚀刻过滤器(Millipore)将10mg/ml蛋白质囊泡的悬浮液挤出。使用停流光谱仪进行渗透性测量。

使用停流光谱评估蛋白质嵌入。这作为用水通道蛋白的水通道重构的囊泡的透水性的增加来测量。由于蛋白质的添加量与400的PoPR(聚合物与蛋白质的比例)一样少，所以与对照囊泡相比，透水性的增加测定为46倍。结果示于图5。

实施例4：使用自由基的PB-PMOXA囊泡的核交联

将如实施例2所制备的PB-PMOXA囊泡在等渗条件下经过已知量的自由基产生溶液，以便使PB核交联并产生可渗透较少/刚性更多的结构。

如实施例1制备PB-PMOXA，并在100mM NaMOPS pH7.5中使用薄膜再水合制成囊泡。然后通过孔径为0.2μm的Millipore Isopore^TM膜挤出囊泡，并在Kintek^TM SFLS和ZetasizerNANO^TM DLS(Malvern)上进行测试。所有化学品和缓冲液均购自Sigma Aldrich。

将制备的PB-PMOXA囊泡等分(250μL)至四个4mL透明玻璃小瓶中，并在室温下放在一边至平衡。在NanoPur水中制备三种溶液用于交联过程。通过将100mg溶解在3.699mLNanoPur水中制备100mM过硫酸钾(K₂SO₄)，通过将100mg溶解在5.26mL NanoPur水中制备100mM焦亚硫酸钠(Na₂S₂O₅)，以及通过将100mg溶解在3.597mLNanoPur水中制备100mM硫酸铁(II)七水合物(FeSO₄·7H₂O)。给予2瓶囊泡50μL100mM过硫酸钾、25μL100mM焦亚硫酸钠和1μL100mM硫酸铁(II)七水合物，而另外两个分别给予100μL、50μL和2μL。然后将这些对分开；一对在室温下反应，另一对在70℃反应。使样品反应1小时，然后在平衡至室温后在DLS和SFLS上测试尺寸和渗透性。

疏水性核交联的有效性通过交联聚合物囊泡在有机溶剂中的溶解度的变化表现出来。在交联之前，聚合物可溶于乙醇和氯仿。交联后，在二者中囊泡的溶解度降低。自由基引发溶液的添加量与交联材料在氯仿中的溶解度降低成正比。

实施例5：膜制备

在本实施例中，沉积的囊泡的浓度通过将动态光散射(MalvernZetasizer Nano)中的计数率(250kcps)与静态衰减器相匹配来保持恒定并监测。

将Sulfo-SANPAH(SS)溶液(在100mM NaMOPS pH 7.5中为10mM)与预先制备的PB-PMOXA-NH-(CH₂)₂-NH₂囊泡在不存在光的条件下反应(250μL囊泡溶液与50μL的SS反应15分钟)。通过冲压机切割一系列47mm聚砜膜(手工铸造)，并放置在膜支架中，并用去离子水冲洗。通过压缩空气除去过量的水，并将300μL(各自)的SS活化的囊泡悬浮液置于聚砜支撑体膜上。然后将膜支架置于距离光源大约5cm的UV光下，并用箔覆盖保护30分钟。然后使用1ml移液管从膜表面除去过量的反应物，而不接触膜表面。将上述步骤重复三次，然后从支架中取出膜，使用冲压机从涂覆区域切割直径为25mm的膜样品。然后在测试前将它们在振荡台上用过量的100mM NaMOPS ph7.5冲洗至少1小时。

图6是得到的膜的显微照片，示出包括支撑膜表面上交联的多个囊泡的粘附物。

用上述步骤制备的膜用10μL或150μL的自由基引发溶液进行处理，该自由基引发溶液由以下组成：

25mM硫酸铁(II)七水合物，

25mM焦亚硫酸钠，

25mM过硫酸钾。

该处理导致PB疏水核的交联。

使用标准分子量截留分析技术测试所得膜样品的孔径分布。通过测量其截留分子量(即给定分子量分子的至少90％被膜保留的点)，测试在前一步骤中制备的25mm样品保留高分子量材料的能力。使用0.2μm膜将磷酸盐缓冲液(0.03M Na₂HPO₄+0.03M KH₂PO₄)预过滤，并在用于制备溶液之前将pH调节至7.2。将葡聚糖(DXT)标准品溶解在磷酸盐缓冲液(DXT 165kDa、325kDa、548kDa、1300kDa和5000kDa，DXT 0.505kDa、4kDa、6kDa、11kDa、20kDa和28kDa)中。所有的葡聚糖溶液用磷酸缓冲液稀释至0.5mg/ml，并在使用前使用0.2μm聚醚砜膜进行预过滤。所有过滤实验在10ml Amicon搅拌的超滤单元(8010型，MilliporeCorp.)中进行。所有样品根据下述方案进行评估：

在20psi下过滤体积为10ml的去离子水，以润湿孔结构和整个系统。

将具有葡聚糖溶液料流的进料管线连接至数字蠕动泵(Thermal Fisher ScienceInc.)，将单元重新加压至20psi，将滤液通量设定为5μm/s。

过滤2,000μL水后，获得800μL滤液溶液样品用于平衡并清洗膜下游的死区体积。

过滤后，直接从单元中获得1ml渗透物样品。

用去离子水清洁并冲洗整个系统。

搅拌速度保持在600rpm，并且所有实验均在室温(22±3℃)下进行。

使用高压液相色谱(HPLC柱PL1149-6840，MW 10,000至200,000，PL1120-6830，MW100至30,000，PL1149-6860，MW 200,000至>10,000,000)进一步评估渗透物。进料与渗透物色谱图的比较允许计算保留系数和膜截留分子量。结果示于图7中，其示出当以囊泡涂覆时，对照膜的截留分子量减少到一半。当使用引发剂进行聚丁二烯核交联时，囊泡涂覆膜的截留分子量降至4000Ka。截留分子量的减少显示取决于所使用的交联剂的量。

实施例6：囊泡包封效率

在100mM钠-MOPS(GFS 5440)中制备1mM荧光素溶液(Sigma-Aldrich F6377)。根据实施例2用荧光素钠-Mops溶液作为水合介质制备聚合物囊泡。聚合物囊泡进一步通过聚碳酸酯径迹蚀刻过滤器(Millipore)在200nm处挤出。通过透析(Thermo Fisher Scientific66383 10kDa)相对100mM钠-MOPS(体积比1:1000，更换三次)除去未包封的染料。

使用荧光相关光谱(FCS)来定量每个囊泡包封的染料分子的数量。实验在时间相关单光子计数(TCSPC)模块(Becker-Hickl GmbH，Berlin，Germany)上进行。详细的仪器设置在Gullapalli等人，“Integrated multimodal microscopy,time-resolvedfluorescence,and optical-trap rheometry:toward single moleculemechanobiology”(J.Biomedical Optics,2007Jan-Feb；12(1):014012.PubMed PMID:17343487.Pubmed Central PMCID:PMC3251961.Epub 2007/03/09.eng)中有述。使用的光源是发射最大值为532nm的Nd:YAG脉冲激光。使用数值孔径为1.2的60x水浸物镜将激光束聚焦到样品内盖玻片上方40μm的衍射限制焦点中。通过测量物镜孔背面的光强度将激光功率设定为30μW/m²。

在FCS实验中，监测在小观察(共焦)体积(大约1飞升)内的荧光强度的时间依赖性变化，并且波动适合于下述自相关函数(等式1)。

在此，G(τ)是归一化的自相关函数；δF(t)是时间t时的荧光强度波动；δF(t+τ)是时间延迟τ后的荧光强度波动，F(t)是时间t时的平均荧光强度。当τ＝0时，等式1右侧的项等于荧光强度波动的方差，这产生了G(0)＝1/N。N表示共焦体积中荧光团的平均数。通过将观察到的FCS实验的自相关曲线拟合到下面等式2中所示以及在上面Gullapalli等人所述的3D扩散模型中，将这些原理用于获得水溶液和聚合物囊泡中荧光素的浓度。

在此，r和z是共焦体积的半径和半高度，其通常被假设为具有3D高斯照度分布，参见Maiti等人,Proc.Nat.Acad.Sci.,1997；94(22):11753-7。是荧光类型i横跨共焦体积的2D横向扩散时间。f_i是荧光类型i的分数。我们使用单一类型拟合游离的荧光素染料和具有包封的染料的聚合物囊泡。

使用Rigler等人,Correlation Spectroscopy,2006(9):367-73中描述的基于FCS的方法测量分子亮度，以计算每个囊泡的荧光素分子数N_encap-fluor。在该方法中，使用0.1MNa MOPS缓冲液(pH＝7.5)中的游离荧光素分子作为标准。通过将整个实验中收集的光子总数除以测量持续时间、并将该数除以共焦体积中的荧光素分子数(N_free-fluor)来测量荧光素的分子亮度(在标准激发速率下每个分子发射的光子)(ε_fluorescein)，如通过将时间偏移的自相关曲线拟合到3D扩散模型(等式2)所获得。同样测定聚合物囊泡所包封的荧光素的分子亮度ε_polymersome。聚合物囊泡的分子亮度与游离荧光素的分子亮度的比(ε_polymersome/ε_fluorecein)，产生估算的每个聚合物囊泡的荧光素分子数N_{encap-flour.μ}。

得到的结果如图8所示。荧光素的分子亮度(ε_fluorescein)为29光子/分子/秒。0.2μm聚合物囊泡的分子亮度ε_polmersome为11244个光子/分子/秒。因此，每个聚合物囊泡包封的荧光素分子数N_fluorescein＝ε_polmersome/ε_fluorescein是387个分子。根据壁厚校正200nm囊泡的半径(cryo-TEM，R有效＝9.09×E^-08m)，并且囊泡的包封体积计算为3.14×E^-18dm³。1mM溶液用于聚合物囊泡的水合，并且在囊泡内测量的荧光素浓度为0.204196992mM。因此，这些结果显示25％的包封效率，这是一个很高的数字。

Claims

1.包含至少一种(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉嵌段和至少一种聚丁二烯嵌段的嵌段共聚物，其条件是所述共聚物不是由羟基封端的由40个丁二烯单元和190个2-甲基-2-噁唑啉单元组成的二嵌段共聚物。

2.如权利要求1所述的嵌段共聚物，其中丁二烯单元的数目为2-C_1-3烷基-2-噁唑啉单元数目的至少一半。

3.如权利要求2所述的嵌段共聚物，其中丁二烯单元的数目为2-C_1-3烷基-2-噁唑啉单元数目的至少两倍。

4.如权利要求1-3中任一项所述的嵌段共聚物，其包含5-200个丁二烯单元和5-180个2-C_1-3烷基-2-噁唑啉单元。

5.如权利要求1-4中任一项所述的嵌段共聚物，其在(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉嵌段的末端具有不是-OH的至少一个端基。

6.如权利要求5所述的嵌段共聚物，其中所述端基选自羧基、活化的羧基、胺基、甲基丙烯酸酯基、巯基、叠氮基和炔基。

7.如权利要求6所述的嵌段共聚物，其中所述端基选自羧基、活化的羧基、或者具有式-NHR的胺基端基，其中R表示具有1-6个碳原子的烷基，所述碳原子由至少一个-NH₂基团取代。

8.如权利要求1-7中任一项所述的嵌段共聚物，其是二嵌段共聚物或者三嵌段共聚物ABA，其中(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉形成A嵌段并且聚丁二烯形成B嵌段。

9.如权利要求1-8中任一项所述的嵌段共聚物，其中(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉为(聚)2-甲基-2-噁唑啉。

10.囊泡，其由包含至少一种(聚)2-C_1-3烷基-2-噁唑啉嵌段和至少一种聚丁二烯嵌段的嵌段共聚物形成。

11.如权利要求10所述的囊泡，其包含如权利要求1-9中任一项所述的嵌段共聚物。

12.如权利要求10或权利要求11所述的囊泡，其中存在于不同嵌段共聚物链中的聚丁二烯嵌段中的C＝C双键交联在一起。

13.如权利要求10-12中任一项所述的囊泡，其具有混入其中的跨膜蛋白。

14.如权利要求13所述的囊泡，其中所述跨膜蛋白是水通道蛋白。

15.如权利要求10-12中任一项所述的囊泡，其包含药物或美容剂。

16.一种过滤膜，其包含如权利要求13或权利要求14所述的囊泡。

17.如权利要求16所述的膜，其包含多孔支撑体和，与所述多孔支撑体的表面共价键合的层，所述层包含多个如权利要求13或权利要求14所述的囊泡；并且其中在所述层中，囊泡共价连接在一起以形成粘附物。

18.一种用于制备如权利要求17所述的膜的方法，其包括提供如权利要求13或权利要求14所述的囊泡的水性悬浮液；将所述囊泡的悬浮液沉积在多孔支撑体的表面上；并提供使得在不同的囊泡之间以及囊泡与所述表面之间形成共价键的反应条件。

19.如权利要求18所述的方法，其包括：

(a)提供如权利要求13或权利要求14所述的囊泡的水性悬浮液，所述囊泡由具有反应性端基X的嵌段共聚物形成；

(d)引起端基X与基团Y、以及端基X或基团Y与支撑体的表面的反应；

或者其包括：

(aa)提供如权利要求13或权利要求14所述的囊泡的第一水性悬浮液，所述囊泡由具有反应性端基X的嵌段共聚物形成；

(bb)提供如权利要求13或权利要求14所述的囊泡的第二水性悬浮液，所述囊泡由具有与聚合物端基X反应的反应性端基Y的嵌段共聚物形成；

(cc)将所述囊泡的悬浮液沉积在具有与聚合物端基X或Y反应的表面的支撑体上；和

(dd)引起端基X与端基Y、以及端基X或端基Y与支撑体的表面的反应。

20.如权利要求19所述的方法，其中步骤(b)的所述多官能连接剂是N-磺基琥珀酰亚胺基-6-(4’-叠氮基-2’-硝基苯基氨基)己酸酯。